RU2845088C2 - Soluble ph20 polypeptide cleaved at n-end and/or c-end and use thereof - Google Patents
Soluble ph20 polypeptide cleaved at n-end and/or c-end and use thereofInfo
- Publication number
- RU2845088C2 RU2845088C2 RU2024117969A RU2024117969A RU2845088C2 RU 2845088 C2 RU2845088 C2 RU 2845088C2 RU 2024117969 A RU2024117969 A RU 2024117969A RU 2024117969 A RU2024117969 A RU 2024117969A RU 2845088 C2 RU2845088 C2 RU 2845088C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- insdqualifier
- polypeptide
- insdfeature
- amino acid
- insdseq
- Prior art date
Links
Abstract
Description
Область техники, к которой относится изобретениеField of technology to which the invention relates
Настоящее изобретение относится к расщепленному с N-конца и/или C-конца растворимому полипептиду PH20 и его применению. The present invention relates to a soluble PH20 polypeptide cleaved at the N-terminus and/or C-terminus and its use.
Уровень техники State of the art
Постоянно предпринимаются попытки с помощью способов генной инженерии повысить уровень экспрессии промышленно полезных белков, секретируемых из рекомбинантных клеток.There are ongoing efforts to use genetic engineering techniques to increase the expression levels of industrially useful proteins secreted from recombinant cells.
Было опробовано несколько традиционных способов, и каждый способ имеет свои преимущества и недостатки. Например, на этапе клонирования были выбраны подходящие промоторы для повышения уровня экспрессии, однако, если сворачивание белка представляло собой стадию, ограничивающую скорость, то количество экспрессируемого белка не соответствовало ожидаемому при выбранном промоторе (Su Xiao et al., Curr Opin Struct Biol. 2014, June 32-38). Several traditional methods have been tried, and each method has its own advantages and disadvantages. For example, during the cloning step, suitable promoters were selected to increase the expression level, but if protein folding was the rate-limiting step, the amount of protein expressed was not as expected with the selected promoter (Su Xiao et al., Curr Opin Struct Biol. 2014, June 32-38).
Для увеличения экспрессии белков, секретируемых клеткой, сигнальные пептиды белка-мишени на N-конце были заменены сигнальными пептидами других белков (Kober, L., Zehe, C. & Bode, J., 2013. Optimized Signal Peptides for the Development of High Expressing CHO Cell Lines. Biotechnology and bioengineering, 110(4), pp. 1164-1173). При этом экспрессия белка иногда увеличивалась по сравнению со случаем применения собственного сигнального пептида, но если сигнальная пептидаза расщепляла экспрессируемый белок при прохождении через мембрану эндоплазматического ретикулума в клетке, то сигнальной пептидазе иногда не удавалось произвести расщепление именно между сигнальным пептидом и N-концевой аминокислотой зрелого белка. To increase the expression of proteins secreted by the cell, the signal peptides of the target protein at the N-terminus were replaced by signal peptides of other proteins (Kober, L., Zehe, C. & Bode, J., 2013. Optimized Signal Peptides for the Development of High Expressing CHO Cell Lines. Biotechnology and bioengineering, 110(4), pp. 1164-1173). In this case, protein expression sometimes increased compared to the case of using the native signal peptide, but if the signal peptidase cleaved the expressed protein when passing through the endoplasmic reticulum membrane in the cell, then the signal peptidase sometimes failed to cleave precisely between the signal peptide and the N-terminal amino acid of the mature protein.
Другие попытки увеличить экспрессию белка включают совместную экспрессию с шапероном, чтобы помочь сворачиванию рекомбинантного белка и предотвратить агрегацию белков, подлежащих экспрессии. Однако этот способ не часто применяют в промышленности из-за технической проблемы, заключающейся в одновременной экспрессии целевого белка и мембраносвязанного шаперона в рекомбинантной клетке, а также внутриклеточных физиологических проблем, вызванных экспрессией шаперона.Other attempts to increase protein expression include co-expression with a chaperone to aid in recombinant protein folding and prevent aggregation of the proteins to be expressed. However, this method is not often used in industry due to the technical challenge of simultaneously expressing the target protein and a membrane-bound chaperone in a recombinant cell, as well as the intracellular physiological problems caused by chaperone expression.
Замена аминокислот в рекомбинантном белке с применением сайт-направленного мутагенеза в определенном сайте представляет собой еще одну попытку увеличить экспрессию белка. Белок, состоящий из полипептидов, при продуцировании в клетке сворачивается в трехмерную структуру. Замещение аминокислот может обеспечить благоприятную среду для сворачивания белка, что может привести к увеличению экспрессии белка. Было много успешных случаев, но практические проблемы, такие как увеличение иммуногенности из-за модификации аминокислот, неизбежны. Substitution of amino acids in a recombinant protein using site-directed mutagenesis at a specific site is another attempt to increase protein expression. Protein, which consists of polypeptides, folds into a three-dimensional structure when produced in a cell. Substitution of amino acids can provide a favorable environment for protein folding, which can lead to increased protein expression. There have been many successful cases, but practical problems such as increased immunogenicity due to amino acid modification are inevitable.
Гиалуронан (гиалуроновая кислота: ГК) представляет собой гликозаминогликан, обнаруживаемый во внеклеточном матриксе многих клеток, особенно в соединительных тканях. Гиалуронан также содержится преимущественно в коже, хрящах и синовиальной жидкости млекопитающих. Гиалуронан также представляет собой основной компонент стекловидного тела глаза. Гиалуронан играет роль в различных физиологических процессах, таких как гомеостаз воды и белков плазмы (Laurent T.C. et al. (1992) FASEB J. 6: 2397-2404). Некоторые заболевания связаны с экспрессией и/или выработкой гиалуронана. Гиалуронидаза представляет собой фермент, расщепляющий гиалуронан. Гиалуронидазу можно применять для лечения заболеваний или нарушений, связанных с накоплением гиалуронана или другого гликозаминогликана путем катализа гидролиза гиалуронана. Кроме того, поскольку гиалуронан представляет собой основной компонент подкожного барьера, гиалуронидазу можно применять для увеличения проницаемости тканей и, следовательно, для увеличения дисперсии и доставки терапевтических средств при подкожной инъекции. Hyaluronan (hyaluronic acid: HA) is a glycosaminoglycan found in the extracellular matrix of many cells, especially connective tissues. Hyaluronan is also found predominantly in the skin, cartilage, and synovial fluid of mammals. Hyaluronan is also a major component of the vitreous humor of the eye. Hyaluronan plays a role in various physiological processes such as water and plasma protein homeostasis (Laurent T.C. et al. (1992) FASEB J. 6: 2397-2404). Several diseases are associated with the expression and/or production of hyaluronan. Hyaluronidase is an enzyme that degrades hyaluronan. Hyaluronidase can be used to treat diseases or disorders associated with the accumulation of hyaluronan or other glycosaminoglycans by catalyzing the hydrolysis of hyaluronan. Furthermore, since hyaluronan is a major component of the subcutaneous barrier, hyaluronidase can be used to increase tissue permeability and hence enhance the dispersion and delivery of therapeutic agents upon subcutaneous injection.
Различные гиалуронидазы на основе нативного полипептида PH20 (например, Hydase™, Vitrase™, Wydase™) применяют в сочетании с другими терапевтическими средствами, обычно в качестве диспергирующих средств. Многие из этих гиалуронидаз включают PH20, полученный из овечьих или бычьих яичек. Various hyaluronidases based on the native PH20 polypeptide (e.g., Hydase™, Vitrase™, Wydase™) are used in combination with other therapeutic agents, usually as dispersing agents. Many of these hyaluronidases include PH20 derived from ovine or bovine testicles.
Человеческий белок PH20 состоит из 509 аминокислот и известен как белок с прикрепленным гликофосфоинозитол-липидом, присутствующий в плазматической мембране сперматозоидов. В то время как гиалуронидазы Hyal1, Hyal2, Hyla3 или Hyal4, присутствующие в крови, активны только при кислом pH, PH20 активен даже при нейтральном pH, поэтому PH20 был разработан для смешивания с лекарственными средствами для подкожных инъекций и применения в промышленности. Human PH20 protein consists of 509 amino acids and is known as a protein with attached glycophosphoinositol lipid present in the plasma membrane of spermatozoa. While hyaluronidases Hyal1, Hyal2, Hyla3 or Hyal4 present in blood are active only at acidic pH, PH20 is active even at neutral pH, so PH20 was developed for mixing with drugs for subcutaneous injection and industrial use.
Недавно, Hylenex™, был применен рекомбинантный человеческий полипептид PH20 из 447 аминокислот, модифицированный для обеспечения растворимости путем отщепления аминокислот на С-конце PH20, которые отвечают за прикрепление гликофосфоинозитола. Кроме того, разрабатываются средства с применением варианта полипептида человеческого PH20. Recently, Hylenex™, a recombinant human 447 amino acid PH20 polypeptide modified to provide solubility by cleavage of the amino acids at the C-terminus of PH20 that are responsible for the attachment of glycophosphoinositol, has been used. In addition, products using a variant of the human PH20 polypeptide are being developed.
Между тем, человеческий PH20, гликопротеин, N-гликозилированный в шести сайтах, имеет очень сложную трехмерную структуру и для производства промышленно полезного фермента требует сложного процесса очистки после экспрессии в клетках животных, таких как клетки CHO. Поэтому для промышленного применения человеческого PH20 очень важно повысить продуктивность животных клеток, содержащих гены человеческого PH20, в зависимости от уровня их экспрессии в ферментационной среде. Meanwhile, human PH20, a glycoprotein N-glycosylated at six sites, has a very complex three-dimensional structure and requires a complex purification process after expression in animal cells such as CHO cells to produce an industrially useful enzyme. Therefore, for the industrial application of human PH20, it is very important to improve the productivity of animal cells containing human PH20 genes depending on their expression level in the fermentation medium.
В рамках этого технического уровня авторы настоящего изобретения определили, что расщепление с N-конца или с N- и C-концов может повысить выход растворимого рекомбинантного полипептида PH20, что лежит в основе настоящего изобретения. Within this technical level, the present inventors have determined that cleavage at the N-terminus or at the N- and C-terminus can increase the yield of soluble recombinant PH20 polypeptide, which forms the basis of the present invention.
Краткое описание изобретения Brief description of the invention
Настоящее изобретение направлено на создание расщепленного с N-конца и/или C-конца растворимого полипептида PH20 с улучшенным выходом. The present invention is directed to the creation of a soluble PH20 polypeptide cleaved at the N-terminus and/or C-terminus with improved yield.
Настоящее изобретение направлено на обеспечение нуклеиновой кислоты, кодирующей расщепленный с N-конца и/или C-конца растворимый полипептид PH20. The present invention is directed to providing a nucleic acid encoding an N-terminally and/or C-terminally cleaved soluble PH20 polypeptide.
Настоящее изобретение направлено на обеспечение рекомбинантного вектора экспрессии, содержащего нуклеиновую кислоту. The present invention is directed to providing a recombinant expression vector containing a nucleic acid.
Настоящее изобретение направлено на создание клетки-хозяина, трансформированной рекомбинантным вектором экспрессии. The present invention is directed to the creation of a host cell transformed with a recombinant expression vector.
Настоящее изобретение относится к способу получения расщепленного с N-конца и/или C-конца растворимого полипептида PH20, включающему стадию культивирования клетки-хозяина. The present invention relates to a method for producing a soluble PH20 polypeptide cleaved at the N-terminus and/or C-terminus, comprising the step of culturing a host cell.
Настоящее изобретение обеспечивает рекомбинантный полипептид PH20, в котором от 1 до 7 аминокислотных остатков удалены с N-конца зрелого PH20 дикого типа животного происхождения. The present invention provides a recombinant PH20 polypeptide in which 1 to 7 amino acid residues are removed from the N-terminus of mature wild-type PH20 of animal origin.
Конкретно, рекомбинантный полипептид PH20, в котором аминокислотный остаток (остатки) удален (удалены) с N-конца зрелого PH20 дикого типа животного происхождения в соответствии с настоящим изобретением, может быть охарактеризован как выбранный из группы, состоящей, но без ограничений, из: Specifically, a recombinant PH20 polypeptide in which amino acid residue(s) is(are) removed from the N-terminus of mature wild-type PH20 of animal origin according to the present invention may be characterized as selected from the group consisting of, but not limited to:
(a) из рекомбинантного полипептида PH20, в котором N-концевой аминокислотный остаток (N-концевые аминокислотные остатки) удален (удалены) путем расщепления перед аминокислотным остатком, выбранным из группы, состоящей из N37-P42 в человеческом PH20 дикого типа, имеющем аминокислотную последовательность SEQ ID № 1; (a) from a recombinant PH20 polypeptide in which the N-terminal amino acid residue(s) is(are) removed by cleavage prior to an amino acid residue selected from the group consisting of N37-P42 in wild-type human PH20 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1;
(b) из рекомбинантного полипептида PH20, в котором N-концевой аминокислотный остаток (N-концевые аминокислотные остатки) удален (удалены) путем расщепления перед аминокислотным остатком, выбранным из группы, состоящей из от N37 до P42 у PH20 дикого типа от примата, имеющего аминокислотную любую последовательность из SEQ ID №№ 2-8; (b) from a recombinant PH20 polypeptide in which the N-terminal amino acid residue(s) is(are) removed by cleavage prior to an amino acid residue selected from the group consisting of N37 to P42 of wild-type PH20 from a primate having any amino acid sequence of SEQ ID NOs. 2-8;
(c) из рекомбинантного полипептида PH20, в котором N-концевой аминокислотный остаток (N-концевые аминокислотные остатки) удален (удалены) путем расщепления перед аминокислотным остатком, выбранным из группы, состоящей из от D37 до P42 у бычьего PH20 дикого типа, имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID № 9; и (c) from a recombinant PH20 polypeptide in which the N-terminal amino acid residue(s) is(are) removed by cleavage prior to an amino acid residue selected from the group consisting of D37 to P42 in wild-type bovine PH20 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9; and
(d) из рекомбинантного полипептида PH20, в котором N-концевой аминокислотный остаток (N-концевые аминокислотные остатки) удален (удалены) путем расщепления перед аминокислотным остатком, выбранным из группы, состоящей из D37 до P42 у PH20 дикого типа от овцы, имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID № 10. (d) from a recombinant PH20 polypeptide in which the N-terminal amino acid residue(s) is(are) removed by cleavage prior to an amino acid residue selected from the group consisting of D37 to P42 in wild-type PH20 from sheep having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10.
Настоящее изобретение обеспечивает нуклеиновую кислоту, кодирующую рекомбинантный полипептид PH20, и рекомбинантный вектор экспрессии, включающий нуклеиновую кислоту. The present invention provides a nucleic acid encoding a recombinant PH20 polypeptide and a recombinant expression vector comprising the nucleic acid.
Изобретение также обеспечивает клетку-хозяин, трансформированную рекомбинантным вектором экспрессии, и способ получения расщепленного с N-конца и/или C-конца растворимого полипептида PH20, включающий стадию культивирования клетки-хозяина. The invention also provides a host cell transformed with a recombinant expression vector and a method for producing a soluble PH20 polypeptide cleaved at the N-terminus and/or C-terminus, comprising the step of culturing the host cell.
Описание чертежей Description of drawings
Фиг. 1 представляет собой диаграмму, показывающую ферментативные активности в культурах полипептидов PH20, в которых C-конец SEQ ID № 1 представляет собой Y482 или F468, а N-конец начинается с L36, N37, F38, R39 или A40, согласно воплощениям настоящего изобретения. Каждая активность выражена в виде относительного процента активности, на основе L36-Y482, имеющего наибольшую длину последовательности аминокислот. Fig. 1 is a diagram showing the enzymatic activities in cultures of PH20 polypeptides in which the C-terminus of SEQ ID NO: 1 is Y482 or F468 and the N-terminus begins with L36, N37, F38, R39 or A40, according to embodiments of the present invention. Each activity is expressed as a relative percentage of activity, based on L36-Y482, which has the longest amino acid sequence.
Фиг. 2 представляет собой диаграмму, показывающую ферментативные активности, выраженные как специфические активности, при pH 5,3 очищенных полипептидов PH20, в которых C-конец SEQ ID № 1 представляет собой Y482 или F468, а N-конец начинается с L36, N37, F38, R39 или A40 согласно воплощениям настоящего изобретения. Каждая активность выражена в виде относительного процента активности на основе L36-Y482, имеющего наибольшую длину аминокислоты. Fig. 2 is a graph showing the enzymatic activities, expressed as specific activities, at pH 5.3 of purified PH20 polypeptides in which the C-terminus of SEQ ID NO: 1 is Y482 or F468 and the N-terminus begins with L36, N37, F38, R39 or A40 according to embodiments of the present invention. Each activity is expressed as a relative percentage of activity based on L36-Y482, which has the longest amino acid length.
Фиг. 3 представляет собой диаграмму, показывающую ферментативные активности, выраженные как специфические активности, при pH 7,0 очищенных полипептидов PH20, у которых С-конец SEQ ID № 1 представляет собой Y482 или F468, а N-конец начинается с L36, N37, F38, R39 или A40, согласно воплощениям настоящего изобретения. Каждая активность выражена в виде относительного процента активности на основе L36-Y482, имеющего наибольшую длину последовательности аминокислот. Fig. 3 is a graph showing the enzymatic activities, expressed as specific activities, at pH 7.0 of purified PH20 polypeptides in which the C-terminus of SEQ ID NO: 1 is Y482 or F468 and the N-terminus begins with L36, N37, F38, R39 or A40, according to embodiments of the present invention. Each activity is expressed as a relative percentage of activity based on L36-Y482, which has the longest amino acid sequence.
Фиг. 4 показывает результаты множественного выравнивания последовательностей с применением Clustal Omega (https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/) аминокислотных последовательностей SEQ ID №№ 1, 2, 9 и 10. Fig. 4 shows the results of multiple sequence alignment using Clustal Omega (https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/) of the amino acid sequences of SEQ ID Nos. 1, 2, 9 and 10.
Фиг. 5 представляет собой диаграмму, показывающую ферментативные активности культуральных сред полипептидов PH20, N-конец которых начинается с L36, N37 или D37, F38, R39, A40 или P41 для SEQ ID № 2 (в которой C-конец представляет собой Y483), SEQ ID № 9 (в которой С-конец представляет собой H478) или SEQ ID № 10 (в которой C-конец представляет собой H477), соответственно, согласно воплощениям настоящего изобретения. Каждая активность выражена как измеренная величина. Fig. 5 is a diagram showing the enzymatic activities of culture media of PH20 polypeptides whose N-terminus starts from L36, N37 or D37, F38, R39, A40 or P41 for SEQ ID NO: 2 (in which the C-terminus is Y483), SEQ ID NO: 9 (in which the C-terminus is H478) or SEQ ID NO: 10 (in which the C-terminus is H477), respectively, according to embodiments of the present invention. Each activity is expressed as a measured value.
Фиг. 6 представляет собой диаграмму, показывающую ферментативные активности, выраженные как специфические активности, при pH 5,3 очищенных полипептидов PH20, N-конец которых начинается с L36, N37, F38, R39, A40 или P41 для SEQ ID № 2 (в которой C-конец представляет собой Y483), SEQ ID № 9 (в которой C-конец представляет собой H478) или SEQ ID № 10 (в которой С-конец представляет собой H477), соответственно, согласно воплощениям настоящего изобретения. Каждая активность выражена как измеренная величина. Fig. 6 is a diagram showing the enzymatic activities, expressed as specific activities, at pH 5.3 of purified PH20 polypeptides whose N-terminus begins at L36, N37, F38, R39, A40 or P41 for SEQ ID NO: 2 (in which the C-terminus is Y483), SEQ ID NO: 9 (in which the C-terminus is H478) or SEQ ID NO: 10 (in which the C-terminus is H477), respectively, according to embodiments of the present invention. Each activity is expressed as a measured value.
Фиг. 7 показывает результаты измерения ферментативных активностей при pH 5,3 полипептидов PH20 в культурах и в очищенном состоянии, имеющих разные сигнальные пептиды для L36-Y482, N37-482 и F38-Y482 SEQ ID № 1, согласно воплощениям настоящего изобретения. Ферментативные активности культуры и очищенного белка с применением сигнального пептида из сывороточного альбумина человека, ферментативные активности культуры и очищенного белка с применением сигнального пептида из человеческого PH20 и ферментативные активности культуры и очищенного белка с применением сигнального пептида из человеческого иммуноглобулина каппа представлены на фиг. 7. Шкала ферментативной активности культуры представлена на основной оси ординат в виде гистограммы, а шкала активности очищенного белка представлена на вспомогательной оси ординат в виде линейного графика. Fig. 7 shows the results of measuring the enzymatic activities at pH 5.3 of PH20 polypeptides in cultures and in a purified state having different signal peptides for L36-Y482, N37-482 and F38-Y482 of SEQ ID NO: 1, according to embodiments of the present invention. The enzymatic activities of the culture and the purified protein using the signal peptide from human serum albumin, the enzymatic activities of the culture and the purified protein using the signal peptide from human PH20 and the enzymatic activities of the culture and the purified protein using the signal peptide from human immunoglobulin kappa are shown in Fig. 7. The scale of the enzymatic activity of the culture is shown on the main ordinate axis as a histogram, and the scale of the activity of the purified protein is shown on the secondary ordinate axis as a linear graph.
Подробное описание настоящего изобретения и предпочтительных воплощений Detailed description of the present invention and preferred embodiments
Если не указано иное, все технические и научные термины, используемые в настоящей заявке, имеют те же значения, которые обычно понимаются специалистом в данной области техники, к которой относится настоящее изобретение. В целом, номенклатура, используемая в настоящей заявке, хорошо известна, и ее широко применяют в данной области техники. Unless otherwise defined, all technical and scientific terms used in this application have the same meanings as commonly understood by one of ordinary skill in the art to which this invention belongs. In general, the nomenclature used in this application is well known and widely used in the art.
Для расширения промышленных масштабов получения рекомбинантного полипептида PH20, который расщеплен на С-конце и конвертирован в растворимую форму, настоящее изобретение предлагает расщепленный с N-конца и/или C-конца полипептид PH20 со значительно улучшенным выходом за счет дополнительного расщепления с N-конца. Используемый здесь термин «растворимый» относится к форме, имеющей трехмерную структуру, которая активна в водном растворе без агрегации. In order to expand the industrial scale of production of the recombinant PH20 polypeptide, which is cleaved at the C-terminus and converted into a soluble form, the present invention provides a PH20 polypeptide cleaved at the N-terminus and/or C-terminus with a significantly improved yield due to additional cleavage at the N-terminus. The term "soluble" as used herein refers to a form having a three-dimensional structure that is active in an aqueous solution without aggregation.
Соответственно, настоящее изобретение относится к рекомбинантному полипептиду PH20, в котором от 1 до 7 аминокислотных остатков, предпочтительно, от 1 до 6 аминокислотных остатков, предпочтительно, от 1 до 5 аминокислотных остатков, предпочтительно, от 1 до 4 аминокислотных остатков, предпочтительно, от 1 до 3 аминокислотных остатков, предпочтительно, от 1 до 2 аминокислотных остатков, предпочтительно, 1 аминокислотный остаток, удаляют с N-конца зрелого PH20 дикого типа животного происхождения. Accordingly, the present invention relates to a recombinant PH20 polypeptide in which 1 to 7 amino acid residues, preferably 1 to 6 amino acid residues, preferably 1 to 5 amino acid residues, preferably 1 to 4 amino acid residues, preferably 1 to 3 amino acid residues, preferably 1 to 2 amino acid residues, preferably 1 amino acid residue, are removed from the N-terminus of mature wild-type PH20 of animal origin.
Зрелый PH20 дикого типа животного происхождения в настоящем изобретении может относиться к рекомбинантному полипептиду PH20 в форме, которая проявляет желаемую функцию. Зрелый PH20 дикого типа животного происхождения, согласно настоящему изобретению, может относиться, например, к полипептиду, в котором сигнальный пептид, который способствует секреции зрелого PH20 дикого типа животного происхождения из клетки, расщепляется во время процесса секреции. The mature wild-type PH20 of animal origin in the present invention may refer to a recombinant PH20 polypeptide in a form that exhibits the desired function. The mature wild-type PH20 of animal origin according to the present invention may refer, for example, to a polypeptide in which a signal peptide that promotes the secretion of the mature wild-type PH20 of animal origin from the cell is cleaved during the secretion process.
Животное может представлять собой, например, без ограничений, млекопитающее, грызуна и т.п., такого как человек, крыса, мышь, хомяк, кролик, свинья, корова, олень, овца, обезьяна и т.п. The animal may be, for example, without limitation, a mammal, rodent, etc., such as a human, rat, mouse, hamster, rabbit, pig, cow, deer, sheep, monkey, etc.
PH20 дикого типа животного происхождения согласно настоящему изобретению может включать, например, но без ограничений: The wild-type PH20 of animal origin according to the present invention may include, for example, but not limited to:
(a) рекомбинантный полипептид PH20, в котором N-концевой аминокислотный остаток (N-концевые аминокислотные остатки) удален (удалены) путем расщепления перед аминокислотным остатком, выбранным из группы, состоящей из от N37 до P42 в человеческом PH20 дикого типа, имеющем аминокислотную последовательность SEQ ID № 1; (a) a recombinant PH20 polypeptide in which the N-terminal amino acid residue(s) is(are) removed by cleavage prior to an amino acid residue selected from the group consisting of N37 to P42 in wild-type human PH20 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1;
(b) рекомбинантный полипептид PH20, в котором N-концевой аминокислотный остаток (N-концевые аминокислотные остатки) удален (удалены) путем расщепления перед аминокислотным остатком, выбранным из группы, состоящей из от N37 до P42 у PH20 дикого типа от примата, имеющем аминокислотную любую последовательность из SEQ ID №№ 2-8;(b) a recombinant PH20 polypeptide in which the N-terminal amino acid residue(s) is(are) removed by cleavage prior to an amino acid residue selected from the group consisting of N37 to P42 of wild-type PH20 from a primate having an amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs. 2-8;
(c) рекомбинантный полипептида PH20, в котором N-концевой аминокислотный остаток (N-концевые аминокислотные остатки) удален (удалены) путем расщепления перед аминокислотным остатком, выбранным из группы, состоящей из от D37 до P42 у бычьего PH20 дикого типа, имеющем аминокислотную последовательность SEQ ID № 9; и(c) a recombinant PH20 polypeptide in which the N-terminal amino acid residue(s) is(are) removed by cleavage prior to an amino acid residue selected from the group consisting of D37 to P42 in wild-type bovine PH20 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9; and
(d) рекомбинантный полипептида PH20, в котором N-концевой аминокислотный остаток (N-концевые аминокислотные остатки) удален (удалены) путем расщепления перед аминокислотным остатком, выбранным из группы, состоящей из от D37 до P42 у PH20 дикого типа от овцы, имеющем аминокислотную последовательность SEQ ID № 10. (d) a recombinant PH20 polypeptide in which the N-terminal amino acid residue(s) is(are) removed by cleavage prior to an amino acid residue selected from the group consisting of D37 to P42 in wild-type PH20 from sheep having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10.
Таблица 1. Информация об аминокислотных последовательностях PH20 животных Table 1. Information on the amino acid sequences of animal PH20
Таблица 2. Аминокислотные последовательности PH20 животных Table 2. Amino acid sequences of animal PH20
Гиалуронидаза в человеческом организме присутствует в плазме или других органах и включает Hyal1, Hyal2, Hyal3 и Hyal4, которые активны при кислом pH, и PH20, которая экспрессируется в акросоме сперматозоида и играет роль в оплодотворении. Hyaluronidase in the human body is present in plasma or other organs and includes Hyal1, Hyal2, Hyal3 and Hyal4, which are active at acidic pH, and PH20, which is expressed in the acrosome of sperm and plays a role in fertilization.
Полипептид PH20 человека, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID № 1, состоит из сигнальной последовательности от M1 до T35, активных сайтов гиалуронидазы от L36 до S490 и C-концевых GPI (гликозилфосфатидилинозитол)-заякоренных последовательностей от A491 до L509, и рекомбинантный полипептид PH20, преобразованный в растворимую форму, лишенную всех С-концевых GPI-заякоренных последовательностей, применяют в качестве терапевтического или диспергирующего средства in vivo. В особенности, сообщалось, что активность фермента не изменяется при сохранении растворимости, даже когда некоторую часть С-концевой аминокислотной последовательности, т.е. любую часть между I465 и L509, расщепляют. У коммерческого продукта С-конец заканчивается в положении 482. Однако в этом случае сохранена последовательность, начинающаяся с L36 N-конца, за исключением сигнальной последовательности (WO 2010/077297A и т.д.). The human PH20 polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 consists of a signal sequence from M1 to T35, hyaluronidase active sites from L36 to S490 and C-terminal GPI (glycosylphosphatidylinositol)-anchored sequences from A491 to L509, and the recombinant PH20 polypeptide converted into a soluble form lacking all C-terminal GPI-anchored sequences is used as a therapeutic or dispersing agent in vivo. In particular, it has been reported that the enzyme activity does not change while maintaining solubility even when some part of the C-terminal amino acid sequence, i.e., any part between I465 and L509, is cleaved. In the commercial product, the C-terminus ends at position 482. However, in this case, the sequence starting at L36 of the N-terminus is retained, except for the signal sequence (WO 2010/077297A etc.).
Недавно было показано, что варианты гиалуронидазы с расщепленным N-концом, начинающиеся с N37, F38, R39, A40, P41 или P42, а также с L36, представляют собой ферментативно активные варианты, и на этой основе был разработан вариант гиалуронидазы с хорошей термостабильностью и ферментативной активностью. (WO 2020/022791A и др.).Recently, N-terminally cleaved hyaluronidase variants starting at N37, F38, R39, A40, P41 or P42, as well as L36, have been shown to be enzymatically active variants, and on this basis, a hyaluronidase variant with good thermal stability and enzymatic activity was developed (WO 2020/022791A et al.).
Полипептид PH20 обезьяны (Nasalis larvatus) имеет 93,1% идентичности последовательности с полипептидом PH20 человека. Следовательно, основываясь на результатах анализа множественных последовательностей, показанных на фиг. 4, можно ожидать, что полипептид PH20 обезьяны (Nasalis larvatus) с С-концом, который заканчивается на Y483, представляет собой активный и растворимый PH20. The monkey (Nasalis larvatus) PH20 polypeptide has 93.1% sequence identity with the human PH20 polypeptide. Therefore, based on the results of the multiple sequence analysis shown in Fig. 4, it is expected that the monkey (Nasalis larvatus) PH20 polypeptide with a C-terminus that ends at Y483 is the active and soluble PH20.
Полипептид PH20 быка (Bos taurus) и полипептид PH20 овцы (Ovis aries) имеют 90,6% идентичности последовательностей друг с другом и 63,6%, и 63,5% идентичности последовательностей с полипептидом PH20 человека, соответственно. Для полипептида PH20 быка (Bos taurus) Meyer et al. (1997) сообщили, что растворимый полипептид имеет С-конец, который заканчивается H478. На основании результатов множественного выравнивания последовательностей, представленных на фиг. 4, можно ожидать, что полипептид PH20 овцы (Ovis aries) с С-концом, который заканчивается H477, представляет собой активный и растворимый PH20. Bovine (Bos taurus) PH20 polypeptide and ovine (Ovis aries) PH20 polypeptide share 90.6% sequence identity with each other and 63.6% and 63.5% sequence identity with human PH20 polypeptide, respectively. For bovine (Bos taurus) PH20 polypeptide, Meyer et al. (1997) reported that the soluble polypeptide has a C-terminus that ends with H478. Based on the multiple sequence alignment results shown in Fig. 4, the ovine (Ovis aries) PH20 polypeptide with a C-terminus that ends with H477 is expected to represent active and soluble PH20.
Настоящее изобретение обеспечивает рекомбинантный полипептид PH20, расщепленный с N-конца и/или C-конца, с улучшенным выходом за счет дальнейшего расщепления с N-конца, то есть дополнительного удаления аминокислотного остатка из зрелого нативного полипептида PH20. Используемый здесь термин «расщепленный с N-конца и/или C-конца рекомбинантный полипептид PH20» по существу относится к варианту PH20. The present invention provides a recombinant PH20 polypeptide, cleaved at the N-terminus and/or C-terminus, with improved yield due to further cleavage at the N-terminus, i.e., additional removal of an amino acid residue from the mature native PH20 polypeptide. As used herein, the term "recombinant PH20 polypeptide cleaved at the N-terminus and/or C-terminus" essentially refers to a PH20 variant.
Рекомбинантный полипептид PH20, согласно настоящему изобретению, расщеплен до аминокислотного остатка, выбранного из группы, состоящей из N37-P42, в PH20 дикого типа, имеющем аминокислотную последовательность SEQ ID No: 1, что приводит к удалению N-концевого аминокислотного остатка (N-концевых аминокислотных остатков). The recombinant PH20 polypeptide according to the present invention is cleaved to an amino acid residue selected from the group consisting of N37-P42 in wild-type PH20 having the amino acid sequence of SEQ ID No: 1, resulting in the removal of the N-terminal amino acid residue(s).
Конкретно, рекомбинантный полипептид PH20 по настоящему изобретению может включать последовательность, которая расщепляется до аминокислотного остатка, выбранного из группы, состоящей из N37-P42, и начинается с N37, F38, R39, A40, P41 или P42 аминокислотной последовательности SEQ ID No: 1. Более конкретно, рекомбинантный полипептид PH20 согласно настоящему изобретению может включать последовательность, начинающуюся с N37 или F38 аминокислотной последовательности SEQ ID No: 1. Specifically, the recombinant PH20 polypeptide of the present invention may include a sequence that is cleaved to an amino acid residue selected from the group consisting of N37-P42 and begins with N37, F38, R39, A40, P41 or P42 of the amino acid sequence of SEQ ID No: 1. More specifically, the recombinant PH20 polypeptide of the present invention may include a sequence beginning with N37 or F38 of the amino acid sequence of SEQ ID No: 1.
Расщепление перед аминокислотным остатком, выбранным из группы, состоящей из N37-P42, указывает на то, что все аминокислотные остатки, непосредственно предшествующие аминокислотному остатку, выбранному из группы, состоящей из N37-P42, на N-конце расщепляют и удаляют. Cleavage prior to an amino acid residue selected from the group consisting of N37-P42 indicates that all amino acid residues immediately preceding the amino acid residue selected from the group consisting of N37-P42 at the N-terminus are cleaved and removed.
Например, утверждение о том, что расщепление произошло перед аминокислотными остатками N37, F38, R39, A40, P41 или P42, означает, что в аминокислотной последовательности SEQ ID № 1 остатки с 1 по 36 непосредственно перед N37, остатки с 1 по 37 непосредственно перед F38, остатки с 1 по 38 непосредственно перед R39, остатки с 1 по 39 непосредственно перед A40, остатки с 1 по 40 непосредственно перед P41 и остатки с 1 по 41 непосредственно перед P42 были расщеплены и удалены, соответственно.For example, a statement that cleavage occurred before amino acid residues N37, F38, R39, A40, P41, or P42 means that in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, residues 1 to 36 immediately before N37, residues 1 to 37 immediately before F38, residues 1 to 38 immediately before R39, residues 1 to 39 immediately before A40, residues 1 to 40 immediately before P41, and residues 1 to 41 immediately before P42 were cleaved and removed, respectively.
Рекомбинантный полипептид PH20, согласно настоящему изобретению, может дополнительно включать делецию некоторых аминокислотных остатков на С-конце. Конкретно, рекомбинантный полипептид PH20 по настоящему изобретению может быть расщеплен после аминокислотного остатка, выбранного из группы, состоящей из F468-Y482 аминокислотной последовательности SEQ ID No: 1, что приводит к удалению аминокислотных остатков на С-конце. Более конкретно, рекомбинантный полипептид PH20 по настоящему изобретению может включать последовательность, которая заканчивается на F468 или Y482 аминокислотных последовательностей SEQ ID No: 1. The recombinant PH20 polypeptide according to the present invention may further comprise a deletion of some amino acid residues at the C-terminus. Specifically, the recombinant PH20 polypeptide of the present invention may be cleaved after an amino acid residue selected from the group consisting of F468-Y482 of the amino acid sequence of SEQ ID No: 1, resulting in the deletion of amino acid residues at the C-terminus. More specifically, the recombinant PH20 polypeptide of the present invention may comprise a sequence that ends at F468 or Y482 of the amino acid sequences of SEQ ID No: 1.
Расщепление после аминокислотных остатков, выбранных из группы, состоящей из с F468 по Y482, аминокислотных последовательностей SEQ ID № 1, и делеция аминокислотных остатков на С-конце означают, что все аминокислотные остатки, расположенные непосредственно после аминокислотных остатков, выбранных из группы, состоящей из F468-Y482, на С-концах, расщепляют и удаляют. Например, расщепление после остатка F468 или Y482 означает, что все остатки после F468 или Y482 аминокислотных последовательностей SEQ ID № 1 расщепляют и удаляют. Cleavage after amino acid residues selected from the group consisting of F468 to Y482 of the amino acid sequences of SEQ ID NO: 1 and deletion of amino acid residues at the C-terminus means that all amino acid residues located immediately after the amino acid residues selected from the group consisting of F468-Y482 at the C-termini are cleaved and removed. For example, cleavage after residue F468 or Y482 means that all residues after F468 or Y482 of the amino acid sequences of SEQ ID NO: 1 are cleaved and removed.
В конкретном воплощении, рекомбинантный полипептид PH20, согласно настоящему изобретению, может быть выбран из группы, состоящей из: In a specific embodiment, the recombinant PH20 polypeptide according to the present invention may be selected from the group consisting of:
(1) полипептида PH20, включающего аминокислотную последовательность, начинающуюся с N37 и заканчивающуюся Y482 (N37-Y482) последовательности SEQ ID № 1; (1) a PH20 polypeptide comprising an amino acid sequence beginning at N37 and ending at Y482 (N37-Y482) of SEQ ID NO: 1;
(2) полипептида PH20, включающего аминокислотную последовательность, начинающуюся с N37 и заканчивающуюся F468 (N37-F468) последовательности SEQ ID № 1; (2) a PH20 polypeptide comprising an amino acid sequence beginning at N37 and ending at F468 (N37-F468) of SEQ ID NO: 1;
(3) полипептида PH20, включающего аминокислотную последовательность, начинающуюся с F38 и заканчивающуюся Y482 (F38-Y482) последовательности SEQ ID № 1; или (3) a PH20 polypeptide comprising an amino acid sequence beginning at F38 and ending at Y482 (F38-Y482) of SEQ ID NO: 1; or
(4) полипептида PH20, включающего аминокислотную последовательность, начинающуюся с F38 и заканчивающуюся F468 (F38-Y468) последовательности SEQ ID № 1;(4) a PH20 polypeptide comprising an amino acid sequence beginning with F38 and ending with F468 (F38-Y468) of SEQ ID NO: 1;
(5) полипептида PH20, включающего аминокислотную последовательность, начинающуюся с N37 и заканчивающуюся L490 (N37-L490) любой из последовательностей SEQ ID №№ 2-8; (5) a PH20 polypeptide comprising an amino acid sequence beginning at N37 and ending at L490 (N37-L490) of any one of SEQ ID NOs. 2-8;
(6) полипептида PH20, включающего аминокислотную последовательность, начинающуюся с F38 и заканчивающуюся L490 (F38-L490) любой из последовательностей SEQ ID №№ 2-8; (6) a PH20 polypeptide comprising an amino acid sequence beginning with F38 and ending with L490 (F38-L490) of any one of SEQ ID NOs. 2-8;
(7) полипептида PH20, включающего аминокислотную последовательность, начинающуюся с D37 и заканчивающуюся H478 (D37-H478) последовательности SEQ ID № 9; (7) a PH20 polypeptide comprising an amino acid sequence beginning at D37 and ending at H478 (D37-H478) of SEQ ID NO: 9;
(8) полипептида PH20, включающего аминокислотную последовательность, начинающуюся с F38 и заканчивающуюся H478 (F38-H478) последовательности SEQ ID № 9; (8) a PH20 polypeptide comprising an amino acid sequence beginning with F38 and ending with H478 (F38-H478) of SEQ ID NO: 9;
(9) полипептида PH20, включающего аминокислотную последовательность, начинающуюся с D37 и заканчивающуюся H477 (D37-H477) последовательности SEQ ID № 10; (9) a PH20 polypeptide comprising an amino acid sequence beginning with D37 and ending with H477 (D37-H477) of SEQ ID NO: 10;
(10) полипептида PH20, включающего аминокислотную последовательность, начинающуюся с F38 и заканчивающуюся H477 (F38-H477) последовательности SEQ ID № 10; (10) a PH20 polypeptide comprising an amino acid sequence beginning with F38 and ending with H477 (F38-H477) of the sequence SEQ ID NO: 10;
(11) полипептида PH20, включающего аминокислотную последовательность, начинающуюся с R39 и заканчивающуюся H477 (R39-H477) последовательности SEQ ID № 10; и (11) a PH20 polypeptide comprising an amino acid sequence beginning with R39 and ending with H477 (R39-H477) of SEQ ID NO: 10; and
(12) полипептида PH20, включающего аминокислотную последовательность, начинающуюся с A40 и заканчивающуюся H477 (A40-H477) последовательности SEQ ID № 10. (12) a PH20 polypeptide comprising an amino acid sequence beginning with A40 and ending with H477 (A40-H477) of the sequence SEQ ID No. 10.
В другом аспекте настоящее изобретение предлагает композицию для лечения рака, содержащую рекомбинантный полипептид PH20, и способ лечения рака с применением этой композиции. In another aspect, the present invention provides a composition for treating cancer comprising a recombinant PH20 polypeptide and a method of treating cancer using the composition.
Раковые заболевания особо не ограничены и включают как солидные, так и гематологические раковые заболевания. Примеры таких видов рака могут быть выбраны из группы, состоящей из, без ограничений, рака кожи, включая меланому, рака печени, гепатоцеллюлярной карциномы, рака желудка, рака молочной железы, рака легких, рака яичников, рака бронхов, рака носоглотки, рака гортани, рака поджелудочной железы, рака мочевого пузыря, рака толстой кишки, рака шейки матки, рака мозга, рака простаты, рака кости, рака щитовидной железы, рака паращитовидной железы, рака почки, рака пищевода, рака желчевыводящих путей, рака яичек, рака прямой кишки, рака головы и шеи, рака шейного отдела позвоночника, рака мочеточника, остеосаркомы, нейробластомы, фибросаркомы, рабдомиосаркомы, астроцитомы и глиомы. Предпочтительно, раковые заболевания, которые можно лечить с помощью композиции по настоящему изобретению, могут быть выбраны из группы, состоящей, без ограничений, из рака толстой кишки, рака молочной железы, рака легких и рака почки. Cancers are not particularly limited and include both solid and hematological cancers. Examples of such cancers may be selected from the group consisting of, but not limited to, skin cancer including melanoma, liver cancer, hepatocellular carcinoma, stomach cancer, breast cancer, lung cancer, ovarian cancer, bronchial cancer, nasopharyngeal cancer, laryngeal cancer, pancreatic cancer, bladder cancer, colon cancer, cervical cancer, brain cancer, prostate cancer, bone cancer, thyroid cancer, parathyroid cancer, kidney cancer, esophageal cancer, biliary tract cancer, testicular cancer, rectal cancer, head and neck cancer, cervical spine cancer, ureteral cancer, osteosarcoma, neuroblastoma, fibrosarcoma, rhabdomyosarcoma, astrocytoma and glioma. Preferably, the cancers that can be treated with the composition of the present invention can be selected from the group consisting of, but not limited to, colon cancer, breast cancer, lung cancer and kidney cancer.
Композиция может представлять собой фармацевтическую композицию. Фармацевтическая композиция может дополнительно включать фармацевтически приемлемый носитель, причем носитель обычно применяют в рецептурах лекарственных средств, и он может представлять собой, по меньшей мере, один носитель, выбранный из группы, состоящей, без ограничений, из лактозы, декстрозы, сахарозы, сорбитола, маннитола, крахмал, камеди акации, фосфата кальция, альгината, желатина, силиката кальция, микрокристаллической целлюлозы, поливинилпирролидона, целлюлозы, воды, сиропа, метилцеллюлозы, метилгидроксибензоата, пропилгидроксибензоата, талька, стеарата магния и минерального масла. Фармацевтическая композиция может дополнительно включать, по меньшей мере, одно средство, выбранное из группы, состоящей из разбавителей, вспомогательных веществ, смазывающих веществ, увлажнителей, подсластителей, ароматизаторов, эмульгаторов, суспензий и консервантов, которые обычно применяют при приготовлении фармацевтических композиций. The composition may be a pharmaceutical composition. The pharmaceutical composition may further comprise a pharmaceutically acceptable carrier, wherein the carrier is commonly used in drug formulations and may be at least one carrier selected from the group consisting of, but not limited to, lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, starch, acacia, calcium phosphate, alginate, gelatin, calcium silicate, microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, cellulose, water, syrup, methylcellulose, methyl hydroxybenzoate, propyl hydroxybenzoate, talc, magnesium stearate, and mineral oil. The pharmaceutical composition may further comprise at least one agent selected from the group consisting of diluents, excipients, lubricants, humectants, sweeteners, flavorings, emulsifiers, suspensions and preservatives that are commonly used in the preparation of pharmaceutical compositions.
Фармацевтическую композицию можно вводить перорально или парентерально. При парентеральном введении ее можно вводить путем внутривенной инъекции, подкожной инъекции, внутримышечной инъекции, внутрибрюшинной инъекции, эндотелиального введения, местного введения, интраназального введения, внутрилегочного введения или ректального введения. Белки или пептиды перевариваются при пероральном введении, поэтому можно составить пероральную композицию, покрывающую активный агент или защищающую его от разложения в желудке. Кроме того, композицию можно вводить с помощью любого устройства, которое позволяет транспортировать активный агент к клетке-мишени. The pharmaceutical composition can be administered orally or parenterally. When administered parenterally, it can be administered by intravenous injection, subcutaneous injection, intramuscular injection, intraperitoneal injection, endothelial administration, local administration, intranasal administration, intrapulmonary administration or rectal administration. Proteins or peptides are digested when administered orally, so an oral composition can be formulated to coat the active agent or protect it from degradation in the stomach. In addition, the composition can be administered using any device that allows the active agent to be transported to the target cell.
Фармацевтическая композиция может быть в форме раствора, суспензии, сиропа или эмульсии в масляной или водной среде или может быть составлена в форме экстракта, порошка, гранулы, таблетки или капсулы и может дополнительно включать диспергирующее средство или стабилизирующее средство для композиции. The pharmaceutical composition may be in the form of a solution, suspension, syrup or emulsion in an oily or aqueous medium, or may be formulated in the form of an extract, powder, granule, tablet or capsule, and may further include a dispersing agent or a stabilizing agent for the composition.
В особенности, композиция для лечения рака, согласно настоящему изобретению, характеризуется применением в комбинированной терапии с другими противораковыми средствами. In particular, the composition for treating cancer according to the present invention is characterized by its use in combination therapy with other anticancer agents.
Предпочтительные противораковые средства для применения в комбинированной терапии включают, без ограничений, химиотерапевтические средства, противораковые средства типа антител, РНК-интерференцию (RNAi) или клеточную терапию. Preferred anticancer agents for use in combination therapy include, but are not limited to, chemotherapeutic agents, antibody-type anticancer agents, RNA interference (RNAi), or cell therapy.
Противораковые средства, которые можно применять в комбинированной терапии, представляют собой, помимо прочего, иммунологические противораковые средства и, более предпочтительно, ингибиторы контрольных точек иммунного ответа. Anticancer agents that can be used in combination therapy include, but are not limited to, immunological anticancer agents and, more preferably, immune checkpoint inhibitors.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к нуклеиновой кислоте, кодирующей рекомбинантный полипептид PH20, имеющий делецию аминокислотного остатка с N-конца и/или C-конца зрелого PH20 дикого типа животного происхождения, согласно настоящему изобретению. In another aspect, the present invention relates to a nucleic acid encoding a recombinant PH20 polypeptide having a deletion of an amino acid residue from the N-terminus and/or C-terminus of a mature wild-type PH20 of animal origin according to the present invention.
Нуклеиновая кислота, согласно настоящему изобретению, может присутствовать в клетках или клеточных лизатах или может присутствовать в частично очищенной или практически очищенной форме. Нуклеиновая кислота представляет собой «выделенную» или «практически очищенную» нуклеиновую кислоту, если она отделена от других клеточных компонентов или других примесей, таких как нуклеиновая кислота или белок из других клеток, с помощью стандартных способов, включая обработку щелочью/SDS, разделение в градиенте плотности CsCl, колоночную хроматографию, электрофорез в агарозном геле и другие способы, широко известные в данной области техники. Нуклеиновая кислота по настоящему изобретению может представлять собой, например, ДНК или РНК. The nucleic acid of the present invention may be present in cells or cell lysates, or may be present in a partially purified or substantially purified form. A nucleic acid is an "isolated" or "substantially purified" nucleic acid if it is separated from other cellular components or other impurities, such as nucleic acid or protein from other cells, by standard methods, including alkali/SDS treatment, CsCl density gradient separation, column chromatography, agarose gel electrophoresis, and other methods commonly known in the art. The nucleic acid of the present invention may be, for example, DNA or RNA.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к вектору, включающему нуклеиновую кислоту, в особенности, к рекомбинантному вектору экспрессии. Для экспрессии рекомбинантного полипептида PH20, согласно изобретению, ДНК, кодирующая рекомбинантный полипептид PH20, может быть получена стандартным способом молекулярной биологии (например, ПЦР-амплификацией или клонированием кДНК с применением гибридомы, экспрессирующей рекомбинантный полипептид PH20), и ДНК может быть «функционально связана» с последовательностью контроля транскрипции и трансляции и вставлена в вектор экспрессии. In another aspect, the present invention relates to a vector comprising a nucleic acid, in particular a recombinant expression vector. For expressing a recombinant PH20 polypeptide according to the invention, DNA encoding the recombinant PH20 polypeptide can be obtained by a standard molecular biology method (e.g., PCR amplification or cDNA cloning using a hybridoma expressing the recombinant PH20 polypeptide), and the DNA can be "operably linked" to a transcriptional and translational control sequence and inserted into an expression vector.
Используемый в настоящем описании термин «функционально связанная» может означать, что ген, кодирующий рекомбинантный полипептид PH20, лигируют в вектор таким образом, что последовательность контроля транскрипции и трансляции в векторе выполняет намеченную функцию регулирования транскрипции и трансляции гена, кодирующего рекомбинантный полипептид PH20. Вектор экспрессии и последовательность контроля экспрессии выбирают так, чтобы они были совместимы с клеткой-хозяином, которая будет применяться для экспрессии. Ген, кодирующий рекомбинантный полипептид PH20, встраивают в вектор экспрессии стандартным способом (например, лигированием фрагмента гена, кодирующего рекомбинантный полипептид PH20, и комплементарного сайта рестрикции вектора, или лигированием тупых концов, если сайт рестрикции отсутствует). As used herein, the term "operably linked" may mean that the gene encoding the recombinant PH20 polypeptide is ligated into a vector such that a transcriptional and translational control sequence in the vector serves the intended function of regulating the transcription and translation of the gene encoding the recombinant PH20 polypeptide. The expression vector and expression control sequence are selected to be compatible with the host cell to be used for expression. The gene encoding the recombinant PH20 polypeptide is inserted into the expression vector by a standard method (e.g., by ligating a fragment of the gene encoding the recombinant PH20 polypeptide and a complementary restriction site of the vector, or by blunt-end ligation if the restriction site is absent).
Кроме того, рекомбинантный вектор экспрессии имеет регуляторную последовательность, которая контролирует экспрессию гена, кодирующего рекомбинантный полипептид PH20, в клетке-хозяине. «Регуляторная последовательность» может включать промоторы, энхансеры или другие элементы контроля экспрессии (например, сигналы полиаденилирования), которые контролируют транскрипцию или трансляцию гена, кодирующего рекомбинантный полипептид PH20. Специалист в данной области техники может понять, что конструкция вектора экспрессии может варьировать путем выбора другой контролирующей последовательности в зависимости от таких факторов, как тип трансформируемой клетки-хозяина или уровень экспрессии белка. In addition, the recombinant expression vector has a regulatory sequence that controls the expression of the gene encoding the recombinant PH20 polypeptide in the host cell. The "regulatory sequence" may include promoters, enhancers, or other expression control elements (e.g., polyadenylation signals) that control transcription or translation of the gene encoding the recombinant PH20 polypeptide. One skilled in the art can understand that the design of the expression vector can be varied by selecting a different control sequence depending on factors such as the type of host cell being transformed or the level of protein expression.
В другом аспекте изобретение относится к клетке-хозяину, включающей нуклеиновую кислоту или вектор. Клетка-хозяин согласно настоящему изобретению предпочтительно выбрана из группы, состоящей, без ограничений, из клеток животных, клеток растений, дрожжей, E.coli и клеток насекомых. In another aspect, the invention relates to a host cell comprising a nucleic acid or a vector. The host cell according to the present invention is preferably selected from the group consisting of, but not limited to, animal cells, plant cells, yeast, E. coli, and insect cells.
В особенности, клетка-хозяин, согласно настоящему изобретению, может представлять собой прокариотическую клетку, такую как Escherichia coli, Bacillus subtilis, Streptomyces sp., Pseudomonas sp., Proteus mirabilis или Staphylococcus sp. Это также может быть клетка грибов, таких как Aspergillus sp., дрожжей, таких как Pichia Pastoris, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces sp. или Neurospora crassa, другая низшая эукариотическая клетка или эукариотическая клетка, такая как клетка высших эукариот, например, насекомых. In particular, the host cell according to the present invention may be a prokaryotic cell such as Escherichia coli, Bacillus subtilis, Streptomyces sp., Pseudomonas sp., Proteus mirabilis or Staphylococcus sp. It may also be a cell of a fungus such as Aspergillus sp., a yeast such as Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces sp. or Neurospora crassa, another lower eukaryotic cell or a eukaryotic cell such as a cell of a higher eukaryote, such as an insect.
Кроме того, клетка-хозяин, согласно настоящему изобретению, может быть получена из растений или организма млекопитающих. Предпочтительно можно применять клетки почки обезьяны 7 (COS7), клетки NSO, SP2/0, клетки яичника китайского хомячка (CHO), W138, клетки почки новорождённого хомяка (BHK), MDCK, клеточные линии миеломы, клетки HuT 78 или клетки HEK293, но не ограничиваться ими. Особенно предпочтительно, можно применять клетки CHO. In addition, the host cell according to the present invention can be derived from plants or a mammalian organism. Preferably, monkey kidney 7 (COS7) cells, NSO cells, SP2/0 cells, Chinese hamster ovary (CHO) cells, W138 cells, baby hamster kidney (BHK) cells, MDCK cells, myeloma cell lines, HuT 78 cells or HEK293 cells can be used, but are not limited thereto. Particularly preferably, CHO cells can be used.
Нуклеиновую кислоту или вектор трансфицируют в клетку-хозяин. Для «трансфекции» можно применять ряд различных способов, обычно используемых для введения экзогенной нуклеиновой кислоты (ДНК или РНК) в прокариотическую или эукариотическую клетку-хозяин, таких как электрофорез, осаждение фосфатом кальция, трансфекция DEAE-декстраном или липофекция. Для экспрессии рекомбинантного полипептида PH20, согласно настоящему изобретению, можно применять различные комбинации хозяина/вектора экспрессии. Подходящие векторы экспрессии для эукариотического хозяина включают, без ограничений, последовательности контроля экспрессии, полученные из SV40, бычьих папилломавирусов, аденовирусов, аденоассоциированных вирусов, цитомегаловирусов и ретровирусов. Вектор экспрессии, который можно применять в бактериальном хозяине, включает бактериальные плазмиды, полученные из Escherichia coli, такие как pET, pRSET, pBluescript, pGEX2T, векторы pUC, col E1, pCR1, pBR322, pMB9 или их производные; плазмиды с более широким кругом хозяев, такие как RP4; фаговую ДНК, примером которой может служить очень широкий спектр производных фага лямбда, таких как λgt10 и λgt11 или NM989; и другие ДНК-фаги, такие как М13 или нитчатый одноцепочечный ДНК-фаг. Вектор экспрессии, пригодный для дрожжевых клеток, представляет собой 2°С-плазмиду и ее производные. Вектор, пригодный для клеток насекомых, представляет собой pVL941. The nucleic acid or vector is transfected into a host cell. For "transfection", a number of different methods commonly used to introduce exogenous nucleic acid (DNA or RNA) into a prokaryotic or eukaryotic host cell can be used, such as electrophoresis, calcium phosphate precipitation, DEAE-dextran transfection, or lipofection. Various host/expression vector combinations can be used to express the recombinant PH20 polypeptide of the present invention. Suitable expression vectors for a eukaryotic host include, but are not limited to, expression control sequences derived from SV40, bovine papillomaviruses, adenoviruses, adeno-associated viruses, cytomegaloviruses, and retroviruses. An expression vector that can be used in a bacterial host includes bacterial plasmids derived from Escherichia coli such as pET, pRSET, pBluescript, pGEX2T, pUC vectors, col E1, pCR1, pBR322, pMB9 or derivatives thereof; plasmids with a broader host range such as RP4; phage DNA such as the very broad-spectrum derivatives of lambda phage such as λgt10 and λgt11 or NM989; and other DNA phages such as M13 or filamentous single-stranded DNA phage. An expression vector suitable for yeast cells is the 2°C plasmid and its derivatives. A vector suitable for insect cells is pVL941.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу получения рекомбинантного полипептида PH20 согласно настоящему изобретению, включающему стадию культивирования клетки-хозяина для экспрессии рекомбинантного полипептида PH20 согласно настоящему изобретению. In another aspect, the present invention relates to a method for producing a recombinant PH20 polypeptide according to the present invention, comprising the step of culturing a host cell for expressing the recombinant PH20 polypeptide according to the present invention.
Когда рекомбинантный вектор экспрессии, способный экспрессировать рекомбинантный полипептид PH20, вводят в клетку-хозяин млекопитающего, то рекомбинантный полипептид PH20 можно получить путем культивирования клетки-хозяина в течение периода времени, достаточного для экспрессии в клетке-хозяине, или, что более предпочтительно, в течение периода времени, достаточного для секреции рекомбинантного полипептида PH20 в культуральную среду, в которой культивируют клетку-хозяин. When a recombinant expression vector capable of expressing a recombinant PH20 polypeptide is introduced into a mammalian host cell, the recombinant PH20 polypeptide can be produced by culturing the host cell for a period of time sufficient to allow expression in the host cell, or, more preferably, for a period of time sufficient to allow secretion of the recombinant PH20 polypeptide into the culture medium in which the host cell is cultured.
В некоторых случаях экспрессированный рекомбинантный полипептид PH20 можно выделить из клетки-хозяина и очистить до гомогенности. Выделение или очистку рекомбинантного полипептида PH20 можно проводить любыми способами выделения или очистки, обычно применяемыми для белков, такими как хроматография. Хроматография может представлять собой, например, без ограничений, одну или несколько комбинаций, выбранных из аффинной хроматографии, ионообменной хроматографии или гидрофобной хроматографии. В дополнение к хроматографии можно применять комбинацию фильтрации, ультрафильтрации, высаливания или диализа. In some cases, the expressed recombinant PH20 polypeptide can be isolated from the host cell and purified to homogeneity. The isolation or purification of the recombinant PH20 polypeptide can be carried out by any isolation or purification methods commonly used for proteins, such as chromatography. Chromatography can be, for example, without limitation, one or more combinations selected from affinity chromatography, ion exchange chromatography or hydrophobic chromatography. In addition to chromatography, a combination of filtration, ultrafiltration, salting out or dialysis can be used.
Далее в настоящем описании представлены примеры для дальнейшего раскрытия настоящего изобретения. Следующие примеры представлены только для иллюстрации настоящего изобретения, и для специалиста в данной области техники очевидно, что объем настоящего изобретения не ограничивается этими примерами. The present description further provides examples to further disclose the present invention. The following examples are provided only to illustrate the present invention, and it is obvious to a person skilled in the art that the scope of the present invention is not limited to these examples.
Пример 1. Клонирование расщепленной с N-конца и/или C-конца рекомбинантной гиалуронидазы PH20 Example 1. Cloning of N-terminally and/or C-terminally cleaved recombinant PH20 hyaluronidase
Для экспрессии полипептида PH20 последовательность, кодирующую аминокислоты от L36 до S509 человеческого полипептида PH20 дикого типа, последовательность ДНК, кодирующую аминокислоты от M1 до L510 полипептида PH20 (Uniprot ID: H2DJA7) от обезьяны (Nasalis larvatus), последовательность ДНК кодирующую аминокислоты от L36 до H478 бычьего полипептида (Bos taurus) PH20 (Uniprot ID: F1MTV1) и последовательность ДНК, кодирующую аминокислоты от L36 до H477 полипептида PH20 (Uniprot ID: W5NSU1) от овцы (Ovis aries), синтезировали с помощью Genscript (Корея). For expression of PH20 polypeptide, the sequence encoding amino acids L36 to S509 of wild-type human PH20 polypeptide, the DNA sequence encoding amino acids M1 to L510 of PH20 polypeptide (Uniprot ID: H2DJA7) from monkey (Nasalis larvatus), the DNA sequence encoding amino acids L36 to H478 of bovine (Bos taurus) PH20 polypeptide (Uniprot ID: F1MTV1), and the DNA sequence encoding amino acids L36 to H477 of PH20 polypeptide (Uniprot ID: W5NSU1) from sheep (Ovis aries) were synthesized using Genscript (Korea).
Каждый синтезированный ген полипептида PH20 амплифицировали с помощью полимеразной цепной реакции (далее «ПЦР») и встраивали в сайт фермента рестрикции XhoI или NotI вектора pcDNA3.4-TOPO. Для экспрессии в клетках ExpiCHO применяли сигнальный пептид сывороточного альбумина человека. Для очистки белка с применением колонки HisTrap последовательность ДНК His-Tag располагали на 3'-конце кДНК PH20. Расщепленный с N-конца и/или C-конца полипептид PH20 анализировали с помощью ПЦР и аминокислотные замены подтверждали секвенированием ДНК. Each synthesized PH20 polypeptide gene was amplified by polymerase chain reaction (hereinafter referred to as PCR) and inserted into the XhoI or NotI restriction enzyme site of the pcDNA3.4-TOPO vector. The human serum albumin signal peptide was used for expression in ExpiCHO cells. For protein purification using a HisTrap column, the His-Tag DNA sequence was placed at the 3' end of the PH20 cDNA. The N-terminally and/or C-terminally cleaved PH20 polypeptide was analyzed by PCR and amino acid substitutions were confirmed by DNA sequencing.
Для получения расщепленного с N-конца варианта человеческого полипептида PH20 была приготовлена плазмида, содержащая L36-Y482, которую применяли в качестве матрицы для получения четырех вариантов, в которых аминокислоты последовательно удаляли одну за другой с N-конца, и каждого варианта из четырех вариантов, в которых С-конец заканчивается F468. To obtain an N-terminally cleaved version of the human PH20 polypeptide, a plasmid containing L36-Y482 was prepared and used as a template to generate four variants in which amino acids were sequentially deleted one by one from the N-terminus and each of the four variants in which the C-terminus ends with F468.
Для получения расщепленного с N-конца варианта обезьяньего полипептида PH20 (Nasalis larvatus) получали плазмиду, содержащую от L36 до Y483, и ее применяли в качестве матрицы для получения пяти вариантов, в которых аминокислоты последовательно удаляли одну за другой с N-конца. To obtain an N-terminally cleaved version of the simian PH20 polypeptide (Nasalis larvatus), a plasmid containing L36 to Y483 was obtained and used as a template to generate five variants in which amino acids were sequentially deleted from the N-terminus.
Для получения расщепленного с N-конца варианта бычьего (Bos Taurus) полипептида PH20 получали плазмиду, содержащую от L36 до H478, и ее применяли в качестве матрицы для получения пяти вариантов, в которых аминокислоты последовательно удаляли одну за другой с N-конца. To obtain an N-terminally cleaved version of the bovine (Bos Taurus) PH20 polypeptide, a plasmid containing L36 to H478 was obtained and used as a template to generate five variants in which amino acids were sequentially deleted one by one from the N-terminus.
Для получения расщепленного с N-конца варианта овечьего (Ovis aries) полипептида PH20 получали плазмиду, содержащую от L36 до H477, и ее применяли в качестве матрицы для получения пяти вариантов, в которых аминокислоты последовательно удаляли одну за другой с N-конца. To obtain an N-terminally cleaved version of the ovine (Ovis aries) PH20 polypeptide, a plasmid containing L36 to H477 was obtained and used as a template to generate five variants in which amino acids were sequentially deleted one by one from the N-terminus.
Пример 2. Экспрессия и очистка расщепленной с N-конца и/или C-конца рекомбинантной гиалуронидазы PH20 Example 2. Expression and purification of N-terminally and/or C-terminally cleaved recombinant PH20 hyaluronidase
Экспрессию расщепленного с N-конца и/или C-конца полипептида PH20 осуществляли с применением системы экспрессии ExpiCHO. Когда плотность клеток клетки ExpiCHO достигала 6×106 клеток/мл, то плазмиду, содержащую кДНК расщепленного с N-конца и/или C-конца полипептида PH20, встроенную в вектор pcDNA3.4-TOPO, трансфицировали в клетки ExpiCHO с применением реагента ExpiFectamine CHO. В качестве среды для культивирования клеток применяли среду экспрессии ExpiCHO (от 100 до 500 мл). После трансфекции клетки ExpiCHO встряхивали и культивировали при 130 об/мин в общей сложности 6 дней, в течение которых клетки инкубировали при 37°С в течение 1-го дня и далее инкубировали при более низкой температуре 32°С в течение 5-ти дней. После завершения инкубации клеточные супернатанты собирали центрифугированием при 10000 об/мин в течение 30 минут. Expression of N-terminal and/or C-terminal cleaved PH20 polypeptide was performed using the ExpiCHO expression system. When the cell density of ExpiCHO cells reached 6× 106 cells/mL, the plasmid containing the cDNA of N-terminal and/or C-terminal cleaved PH20 polypeptide inserted into the pcDNA3.4-TOPO vector was transfected into ExpiCHO cells using the ExpiFectamine CHO reagent. ExpiCHO expression medium (100 to 500 mL) was used as the cell culture medium. After transfection, ExpiCHO cells were shaken and cultured at 130 rpm for a total of 6 days, during which the cells were incubated at 37°C for 1 day and then incubated at a lower temperature of 32°C for 5 days. After completion of incubation, cell supernatants were collected by centrifugation at 10,000 rpm for 30 min.
Полипептид PH20 с His-меткой на С-конце, полученный из клеток ExpiCHO, очищали с помощью двухстадийной колоночной хроматографии с применением оборудования AKTA Prime или аналогичного оборудования (GE Healthcare). Для человеческого PH20 и обезьяньего PH20 применяли Q-сефарозу, которая представляет собой реагент анионообменной хроматографии, поскольку их изоэлектрическая точка (pI) близка к 6. Для бычьего или овечьего полипептида PH20 pI превышает 8, поэтому первую очистку проводили с применением колонки Capto S, которая представляет собой реагент катионообменной хроматографии, а вторую очистку для каждого белка проводили с применением колонки HisTrap HP для His-Tag хроматографии. The His-tagged PH20 polypeptide obtained from ExpiCHO cells was purified by two-step column chromatography using AKTA Prime or equivalent equipment (GE Healthcare). For human PH20 and monkey PH20, Q-Sepharose, which is an anion exchange chromatography reagent, was used because their isoelectric point (pI) is close to 6. For bovine or ovine PH20 polypeptide, the pI is greater than 8, so the first purification was performed using a Capto S column, which is a cation exchange chromatography reagent, and the second purification for each protein was performed using a HisTrap HP column for His-Tag chromatography.
Для очистки белка с применением колонки с Q-сефарозой готовили буфер А (20 мМ фосфата натрия, pH 7,5) и буфер B (20 мМ фосфата натрия, pH 7,5, 0,5 М NaCl). pH и проводимость культуральной среды доводили до таких же значений, как у буфера А, и культуральную среду фильтровали через мембрану с размером пор 0,22 мкм. Белки связывали с колонкой с Q-сефарозой, затем пропускали 5CV буфера A для удаления неспецифически связанных белков и 5CV буфера B пропускали с градиентом концентрации от 0 до 100%, чтобы элюировать белки. For protein purification using a Q-Sepharose column, buffer A (20 mM sodium phosphate, pH 7.5) and buffer B (20 mM sodium phosphate, pH 7.5, 0.5 M NaCl) were prepared. The pH and conductivity of the culture medium were adjusted to the same values as those of buffer A, and the culture medium was filtered through a 0.22 μm membrane. Proteins were bound to the Q-Sepharose column, then 5CV of buffer A was passed through to remove non-specifically bound proteins, and 5CV of buffer B was passed with a concentration gradient from 0 to 100% to elute the proteins.
Для очистки белка с применением колонки Capto S готовили буфер А (20 мМ фосфат натрия, 15 мМ NaCl, pH 6,0) и буфер B (20 мМ фосфат натрия, 500 мМ NaCl, pH 6,0). pH и проводимость культуральной среды доводили до таких же, как у буфера А, и культуральную среду фильтровали через мембрану с размером пор 0,22 мкм. Затем белки связывали с колонкой Capto S и пропускали 3 объема колонки (CV) буфера А для удаления неспецифически связанных белков. Последовательно пропускали 4CV буфера B для элюирования целевого белка. For protein purification using a Capto S column, buffer A (20 mM sodium phosphate, 15 mM NaCl, pH 6.0) and buffer B (20 mM sodium phosphate, 500 mM NaCl, pH 6.0) were prepared. The pH and conductivity of the culture medium were adjusted to those of buffer A, and the culture medium was filtered through a 0.22 μm membrane. Then, the proteins were bound to the Capto S column, and 3 column volumes (CV) of buffer A were passed through to remove non-specifically bound proteins. 4CV of buffer B were passed through successively to elute the target protein.
Для очистки белка с применением колонки His-Trap HP готовили буфер А (20 мМ фосфат натрия, 500 мМ NaCl, pH 7,5) и буфер B (20 мМ фосфат натрия, 500 мМ NaCl, 500 мМ имидазол, pH 7,5). После того как образец белка был связан с колонкой His-Trap HP, пропускали 7 CV 7% буфера B для удаления неспецифически связанных белков и 3 CV 40% буфера B для элюирования целевого белка. Элюат колонки диализовали с применением диализного буфера (20 мМ фосфат натрия, 100 мМ NaCl, pH 7,0). For protein purification using the His-Trap HP column, buffer A (20 mM sodium phosphate, 500 mM NaCl, pH 7.5) and buffer B (20 mM sodium phosphate, 500 mM NaCl, 500 mM imidazole, pH 7.5) were prepared. After the protein sample was bound to the His-Trap HP column, 7 CV of 7% buffer B were passed to remove non-specifically bound proteins and 3 CV of 40% buffer B were passed to elute the target protein. The column eluate was dialyzed using dialysis buffer (20 mM sodium phosphate, 100 mM NaCl, pH 7.0).
Пример 3. N-концевое секвенирование расщепленной с N-конца и/или С-конца рекомбинантной гиалуронидазы PH20 Example 3. N-terminal sequencing of N-terminally and/or C-terminally cleaved recombinant hyaluronidase PH20
Очищенный расщепленный с N-конца и/или C-конца полипептид PH20 наносили в количестве 10 мкг на дорожку 7,5% геля для SDS-PAGE и проводили электрофорез (150 В, 1 час). Гель, содержащий разделенные электрофорезом белки, затем вводили в набор для блоттинга с PVDF мембраной и переносили при 100 В в течение 90 минут, и перенос подтверждали окрашиванием Ponceau S. Наконец, образцы, полученные путем разрезания каждой белковой полосы, секвенировали по 5 аминокислотам с N-конца с применением белкового секвенатора PPSQ-53A (Shimadzu, Япония). The purified N-terminal and/or C-terminal cleaved PH20 polypeptide was loaded at 10 μg per lane of 7.5% SDS-PAGE gel and electrophoresed (150 V, 1 h). The gel containing the separated proteins was then loaded onto a PVDF membrane blot kit and transferred at 100 V for 90 min, and the transfer was confirmed by Ponceau S staining. Finally, the samples obtained by cutting each protein band were sequenced at 5 amino acids from the N-terminus using a PPSQ-53A protein sequencer (Shimadzu, Japan).
В результате N-концевого секвенирования было подтверждено, что другие полипептиды PH20 имеют ожидаемую последовательность, но в некоторых полипептидах человеческого PH20, имеющих N37-Y482 или N37-F468, в качестве аминокислоты на N-конце был обнаружен аспартат, а не аспарагин, что приводило к дезамидированию. На основании этого результата и анализа множественного выравнивания последовательностей, показанного на фиг. 4, демонстрирующих, что аспартат был обнаружен как соответствующая аминокислота у быка и овцы, можно сделать вывод, что аспартат как аминокислота в этом положении играет роль в стабилизации структуры белка. As a result of N-terminal sequencing, it was confirmed that other PH20 polypeptides had the expected sequence, but in some human PH20 polypeptides having N37-Y482 or N37-F468, aspartate instead of asparagine was found as the amino acid at the N-terminus, which resulted in deamidation. Based on this result and the multiple sequence alignment analysis shown in Fig. 4, which showed that aspartate was found as the corresponding amino acid in bovine and ovine, it can be concluded that aspartate as an amino acid at this position plays a role in stabilizing the protein structure.
Пример 4. Измерение активности рекомбинантной расщепленной с N-конца и/или C-конца гиалуронидазы PH20 Example 4. Measurement of the activity of recombinant N-terminally and/or C-terminally cleaved hyaluronidase PH20
Активность гиалуронидазы измеряли с помощью турбидиметрического анализа, который измеряет поглощение мутности, вызванной осадками, образующимися при смешивании гиалуроновой кислоты с альбумином (БСА). Когда гиалуроновая кислота гидролизуется полипептидом PH20, мутность/поглощение осадков, образующихся при смешивании гиалуроновой кислоты и альбумина, уменьшается. Этот анализ обычно проводят при pH 5,3 следующим образом. Стандарты гиалуронидазы с известной активностью (единицы) разводят до 6, 8, 10, 12, 15 и 20 единиц/мл и готовят в каждой пробирке. Образцы очищенного белка разводят в буфере (20 мМ фосфата натрия, рН 5,3, 77 мМ хлорида натрия и 0,01% (масса/объем) бычьего сывороточного альбумина), регулируя коэффициент разведения так, чтобы он соответствовал диапазону стандартной кривой. По 50 мкл разбавленного образца распределяют в каждую лунку 96-луночного планшета и подвергают реакции нагревания при 37°С в течение 10 минут. В каждую лунку дополнительно вносят по 50 мкл 0,06% гиалуроновой кислоты. 0,06% гиалуроновую кислоту растворяют в 300 мМ натрий-фосфатном буфере, имеющем pH 5,3. Образцы и 0,06% гиалуроновой кислоты оставляли для прохождения реакции при 37°C в течение 45 минут. После реакции 40 мкл реакционного раствора фермент-субстрат распределяли в 200 мкл кислого раствора альбумина и оставляли при комнатной температуре на 19 минут. Затем измеряли поглощение при 600 нм с применением спектрофотометра. Кислый раствор альбумина состоит из 0,1% альбумина (БСА), растворенного в буфере с pH 3,75, содержащем 24 мМ ацетата натрия и 79 мМ уксусной кислоты. Значения поглощения измеренных образцов преобразовывали в активности с помощью стандартной кривой с применением стандарта активности. Hyaluronidase activity was measured using a turbidimetric assay that measures the absorbance of the turbidity caused by the precipitates formed when hyaluronic acid is mixed with albumin (BSA). When hyaluronic acid is hydrolyzed by the PH20 polypeptide, the turbidity/absorbance of the precipitates formed when hyaluronic acid and albumin are mixed is reduced. This assay is typically performed at pH 5.3 as follows. Hyaluronidase standards of known activity (units) are diluted to 6, 8, 10, 12, 15, and 20 units/mL and prepared in each tube. Purified protein samples were diluted in buffer (20 mM sodium phosphate, pH 5.3, 77 mM sodium chloride, and 0.01% (w/v) bovine serum albumin) adjusting the dilution factor to match the range of the standard curve. 50 μl of the diluted sample was dispensed into each well of a 96-well plate and subjected to a heating reaction at 37°C for 10 minutes. An additional 50 μl of 0.06% hyaluronic acid was added to each well. 0.06% hyaluronic acid was dissolved in 300 mM sodium phosphate buffer, pH 5.3. The samples and 0.06% hyaluronic acid were allowed to react at 37°C for 45 minutes. After the reaction, 40 μl of the enzyme-substrate reaction solution was distributed into 200 μl of acidic albumin solution and left at room temperature for 19 minutes. Then, the absorbance was measured at 600 nm using a spectrophotometer. The acidic albumin solution consists of 0.1% albumin (BSA) dissolved in a pH 3.75 buffer containing 24 mM sodium acetate and 79 mM acetic acid. The absorbance values of the measured samples were converted to activities using a standard curve using the activity standard.
При выполнении вышеуказанных стадий при pH 7,0 буфер для образцов белка представлял собой 20 мМ фосфат натрия с pH 7,0, 77 мМ хлорид натрия и 0,01% (масса/объем) бычьего сывороточного альбумина, а для 0,06% гиалуроновой кислоты в водном растворе гиалуроновую кислоту растворяли в 20 мМ натрий-фосфатном буфере, имеющем pH 7,0, и 70 мМ хлориде натрия. When performing the above steps at pH 7.0, the buffer for protein samples was 20 mM sodium phosphate pH 7.0, 77 mM sodium chloride and 0.01% (w/v) bovine serum albumin, and for 0.06% hyaluronic acid in aqueous solution, hyaluronic acid was dissolved in 20 mM sodium phosphate buffer pH 7.0 and 70 mM sodium chloride.
Эти измерения активности также можно проводить в культуральных средах. В этом случае, поскольку значения ниже 300 единиц/мл ненадежны, предел количественного определения (LOQ) был установлен на уровне 300 единиц/мл, а величины ниже этого значения были помечены как неактивные, 0. Кроме того, в случае измерения активности с применением образцов очищенного белка предел количественного определения (LOQ) был установлен на уровне15 единиц/мкг. These activity measurements can also be performed in culture media. In this case, since values below 300 units/mL are unreliable, the limit of quantification (LOQ) was set at 300 units/mL and values below this value were labeled as inactive, 0. Additionally, in the case of activity measurements using purified protein samples, the limit of quantification (LOQ) was set at 15 units/µg.
N-конец был скорректирован до L36, N37, F38, R39 или A40, за исключением сигнальной последовательности от M1 до T35 полипептида PH20 дикого типа, по последовательности SEQ ID № 1, а C-конец был выбран до F468 или Y482, всего 10 N-концевых и/или C-концевых расщепленных полипептидов PH20 были получены способом по примеру 1. Каждый из соответствующих клонов очищали в культуральной среде, полученной путем временной трансфекции культуры клеток животных, и ферментативные активности при pH 5,3 и pH 7,0 сравнивались способом по примеру 2. The N-terminus was adjusted to L36, N37, F38, R39 or A40, except for the signal sequence from M1 to T35 of the wild-type PH20 polypeptide, according to the sequence of SEQ ID NO: 1, and the C-terminus was selected to F468 or Y482, a total of 10 N-terminal and/or C-terminal cleaved PH20 polypeptides were obtained by the method of Example 1. Each of the respective clones was purified in a culture medium obtained by transient transfection of animal cell culture, and the enzymatic activities at pH 5.3 and pH 7.0 were compared by the method of Example 2.
Как показано на фиг. 1, удивительно, но в результате сравнения активности человеческой PH20 в каждой культуральной среде активность N37-Y482 в культуральной среде более чем в 3 раза превышала активность в культуральной среде зрелой L36-Y482, имеющей N-конец дикого типа, а активность F38-Y482 человеческой PH20, у которой дополнительно удалили два аминокислотных остатка с N-конца, в культуральной среде, также более чем в 2 раза превышала активность в культуре зрелой L36-Y482, имеющей N-конец дикого типа. As shown in Fig. 1, surprisingly, when the activity of human PH20 in each culture medium was compared, the activity of N37-Y482 in the culture medium was more than 3-fold higher than that of mature L36-Y482 having the wild-type N-terminus in the culture medium, and the activity of F38-Y482 human PH20, which had two amino acid residues additionally deleted from the N-terminus, in the culture medium was also more than 2-fold higher than that of mature L36-Y482 having the wild-type N-terminus.
Однако отсутствие трех N-концевых аминокислотных остатка в R39-Y482 приводило к незначительной экспрессии фермента и отсутствие четырех N-концевых аминокислотных остатка в A40-Y382 также приводило к незначительной экспрессии фермента в культуре. However, the absence of the three N-terminal amino acid residues in R39-Y482 resulted in little enzyme expression and the absence of the four N-terminal amino acid residues in A40-Y382 also resulted in little enzyme expression in culture.
В заключение, для человеческой гиалуронидазы PH20 было обнаружено, что варианты, в которых отсутствует один или два N-концевых аминокислотных остатка в зрелой человеческой гиалуронидазе PH20, демонстрируют значительно повышенную экспрессию в культуральной среде. В особенности, учитывая промышленную доступность человеческой гиалуронидазы PH20 для инъекций, показано, что путем получения варианта фермента, в котором расщепляется одна или две N-концевые аминокислоты, можно получить промышленно и экономически выгодные варианты. In conclusion, for human hyaluronidase PH20, it was found that variants lacking one or two N-terminal amino acid residues in mature human hyaluronidase PH20 exhibit significantly increased expression in culture medium. Especially considering the industrial availability of human hyaluronidase PH20 for injection, it was shown that by generating a variant of the enzyme in which one or two N-terminal amino acids are cleaved, industrially and economically viable variants can be obtained.
Кроме того, как показано на фиг. 2 и 3, существует небольшая разница между специфическими активностями L36-Y482, N37-Y482 и F38-Y482, подтверждающая, что различия в активности человеческой гиалуронидазы PH20 на фиг. 1, обусловлены различиями в выходе. Кроме того, среди вариантов PH20, которые были на 14 С-концевых аминокислот короче, чем белок, С-конец которого заканчивается Y482, в культуральной среде была активна только N37-F468 с удаленной одной N-концевой аминокислотой. In addition, as shown in Fig. 2 and 3, there is a slight difference between the specific activities of L36-Y482, N37-Y482, and F38-Y482, confirming that the differences in the activities of human hyaluronidase PH20 in Fig. 1 are due to differences in yield. In addition, among the PH20 variants that were 14 C-terminal amino acids shorter than the protein whose C-terminus ends with Y482, only N37-F468 with one N-terminal amino acid deleted was active in the culture medium.
В особенности, на фиг. 2 показана специфическая активность каждого очищенного полипептида при pH 5,3, подтверждая тот факт, что между L36-Y482, N37-Y482 и F38-Y482 была небольшая разница, когда С-конец представлял собой Y482, но когда С-конец представлял собой F468, то N37-F468 и F38-F468 имели удельную активность в 1,5-2 раза выше, чем L36-F468. Такую же закономерность наблюдали и в удельной активности при pH 7,0. In particular, Fig. 2 shows the specific activity of each purified polypeptide at pH 5.3, confirming the fact that there was little difference among L36-Y482, N37-Y482, and F38-Y482 when the C-terminus was Y482, but when the C-terminus was F468, N37-F468 and F38-F468 had specific activity 1.5-2 times higher than that of L36-F468. The same pattern was observed in the specific activity at pH 7.0.
То есть, основываясь на результатах, показанных на фиг. 2 и 3, более короткий вариант коммерчески применяемой PH20, L36-F468, в которой C-концевые аминокислоты были дополнительно расщеплены до положения 468, практически не экспрессировался в клетках животных. В результате очистки очень небольшого количества экспрессированного при этом варианта L36-F468 и измерения его удельной активности удельная, активность фермента составила примерно 60% по сравнению с L36-Y482. На основании этих результатов активность гиалуронидазы или выход полипептида PH20 значительно увеличивается, когда один или два дополнительных N-концевых аминокислотных остатка удаляют из зрелой человеческой гиалуронидазы PH20. That is, based on the results shown in Fig. 2 and 3, the shorter version of the commercially used PH20, L36-F468, in which the C-terminal amino acids were further cleaved at position 468, was hardly expressed in animal cells. As a result of purification of a very small amount of the expressed variant L36-F468 and measurement of its specific activity, the specific activity of the enzyme was approximately 60% compared to L36-Y482. Based on these results, the hyaluronidase activity or the yield of the PH20 polypeptide is significantly increased when one or two additional N-terminal amino acid residues are removed from the mature human hyaluronidase PH20.
В заключение следует отметить, что хотя удельная активность варианта фермента человеческой гиалуронидазы PH20, состоящего из L36-F468, существенно не снижалась по сравнению с вариантом фермента L36-Y482 PH20, его экспрессия в рекомбинантной клетке была чрезвычайно низкой, что делало его непригодным для промышленного применения. In conclusion, although the specific activity of the human hyaluronidase PH20 enzyme variant consisting of L36-F468 was not significantly reduced compared to the L36-Y482 PH20 enzyme variant, its expression in the recombinant cell was extremely low, making it unsuitable for industrial application.
С другой стороны, для варианта N37-F468 значительно увеличилась экспрессия в клетках, что аналогично экспрессии варианта L36-Y482, но экспрессия в клетках N37-F468, у которого была дополнительно удалена одна N-концевая аминокислота, резко увеличивалась, по меньшей мере, в 100 раз по сравнению с L36-F468. On the other hand, for the N37-F468 variant, the expression in cells was significantly increased, which was similar to the expression of the L36-Y482 variant, but the expression in cells of N37-F468, which had one additional N-terminal amino acid deleted, was dramatically increased by at least 100-fold compared to L36-F468.
Принимая во внимание молекулярное моделирование PH20 и экспериментальные результаты настоящего изобретения, можно заключить, что взаимодействие между аминокислотами на N-конце и аминокислотами на C-конце PH20 влияет на стабильность, скорость сворачивания и т.д. во время транскрипции и транслокации рекомбинантного белка PH20, когда он экспрессируется в клетках, и, кроме того, сильно влияет на экспрессию рекомбинантного белка, секретируемого из клеток. Это существенно влияет на выход PH20 и ее вариантов. Эти результаты могут быть применены не только к человеческой PH20, но также к PH20, полученным из организма млекопитающих, таких как бык или овца, и, кроме того, ожидается, что они будут применимы к другим PH20 со структурными или физико-химическими свойствами, аналогичными человеческой PH20. Taking into account the molecular modeling of PH20 and the experimental results of the present invention, it can be concluded that the interaction between the amino acids at the N-terminus and the amino acids at the C-terminus of PH20 affects the stability, folding rate, etc. during transcription and translocation of the recombinant PH20 protein when it is expressed in cells, and furthermore greatly affects the expression of the recombinant protein secreted from the cells. This significantly affects the yield of PH20 and its variants. These results can be applied not only to human PH20 but also to PH20 obtained from a mammalian organism such as a bovine or ovine organism, and furthermore, they are expected to be applicable to other PH20s with structural or physicochemical properties similar to human PH20.
Кроме того, было обнаружено, что эти свойства сохраняются у PH20 млекопитающих, имеющих структуру последовательности, аналогичную полипептиду человеческой PH20, и ту же самую биологическую функцию, особенно у PH20 обезьяны (Nasalis larvatus), быка (Bos taurus) и овцы (Ovis aries), перечисленных в таблице 1, как показано на фиг. 5 и 6. В особенности, было обнаружено, что полипептид PH20 овцы имеет высокую экспрессию, когда N-конец начинается с A40. In addition, these properties were found to be conserved in mammalian PH20s having a sequence structure similar to the human PH20 polypeptide and the same biological function, especially in monkey (Nasalis larvatus), bovine (Bos taurus), and sheep (Ovis aries) PH20s listed in Table 1, as shown in Figs. 5 and 6. In particular, the sheep PH20 polypeptide was found to have high expression when the N-terminus started from A40.
Таким образом, результаты настоящего изобретения показывают, что для зрелого белка PH20, особенно PH20 животного происхождения, такого как человеческий PH20, удаление дополнительных от одного до четырех, предпочтительно, одного или двух, аминокислотных остатков на N-конце может резко увеличить скорость экспрессии в рекомбинантной клетке, тем самым увеличивая продуктивность белка. Thus, the results of the present invention show that for a mature PH20 protein, especially PH20 of animal origin such as human PH20, deletion of an additional one to four, preferably one or two, amino acid residues at the N-terminus can dramatically increase the expression rate in a recombinant cell, thereby increasing the productivity of the protein.
Для человеческого белка PH20, когда C-конец оканчивается Y482, PH20 с некоторыми дополнительными N-концевыми аминокислотными остатками, удаленными из зрелого PH20, демонстрировал значительное увеличение экспрессии без существенного изменения собственной активности гиалуронидазы, а когда С-конец заканчивался F468, вариант с одним или двумя N-концевыми аминокислотными остатками, дополнительно удаленными из зрелого PH20, скорее демонстрировал увеличение удельной активности фермента по сравнению со зрелым белком, имеющим полный N-конец. Хотя и предпринимали попытки повысить специфическую активность белка путем замены различных аминокислот в определенных участках аминокислотной последовательности человеческого PH20, не было зарегистрировано ни одного случая значительного увеличения его экспрессии в клетках за счет удаления аминокислот на N-конце при сохранении или увеличении его активности. Прогнозируется, что N-концевые удаленные варианты имеют преимущество с точки зрения иммуногенности по сравнению с PH20, в которой аминокислоту (аминокислоты) заменяют в специфическом сайте (специфических сайтах), даже после длительного введения в организм человека. For human PH20 protein, when the C-terminus ends with Y482, PH20 with some additional N-terminal amino acid residues deleted from mature PH20 showed a significant increase in expression without significant change in intrinsic hyaluronidase activity, and when the C-terminus ends with F468, the variant with one or two N-terminal amino acid residues further deleted from mature PH20 rather showed an increase in specific enzyme activity compared to the mature protein having the complete N-terminus. Although attempts have been made to increase the specific activity of the protein by replacing various amino acids at specific sites in the amino acid sequence of human PH20, no case has been reported of a significant increase in its expression in cells by deleting amino acids at the N-terminus while maintaining or increasing its activity. The N-terminal deleted variants are predicted to have an advantage in terms of immunogenicity compared to PH20, in which the amino acid(s) is substituted at a specific site(s), even after long-term administration to humans.
Были сообщения, показывающие, что экспрессия увеличивается при расщеплении N-конца в зрелом белке, например, исследования человеческого альфа-1-антитрипсина (H. Johansen et al., Mol. Biol. Med. 1987, 4:291-305) и белка L1 вируса папилломы человека (M. Wei et al., Emerging Microbes & Infections, 2018, 7:160), но трудно найти сходство друг с другом с точки зрения расположение аминокислот на N-концевом участке, по количеству усечений и т.д. Например, в альфа-1-антитрипсине человека делеция от 5 до 10 N-концевых аминокислот увеличивала экспрессию в клетках, но не меняла активность фермента, а в белке L1 вируса папилломы человека расщепление 10 или 15 N-концевых аминокислот не изменяло общую экспрессию белка, но в некоторых случаях увеличивали растворимость белка. В особенности, не было предпринято никаких подобных попыток для гиалуронидазы, такой как PH20, и не было обнаружено случаев, когда расщепление одной или двух N-концевых аминокислот резко увеличивает экспрессию и активность, как в настоящем изобретении. There have been reports showing that expression is increased by cleavage of the N-terminus in the mature protein, such as studies on human alpha-1-antitrypsin (H. Johansen et al., Mol. Biol. Med. 1987, 4:291-305) and human papillomavirus L1 protein (M. Wei et al., Emerging Microbes & Infections, 2018, 7:160), but it is difficult to find similarities with each other in terms of the amino acid arrangement at the N-terminal region, the number of truncations, etc. For example, in human alpha-1-antitrypsin, deletion of 5 to 10 N-terminal amino acids increased expression in cells but did not change the enzyme activity, and in human papillomavirus L1 protein, cleavage of 10 or 15 N-terminal amino acids did not change the overall protein expression but increased the solubility of the protein in some cases. In particular, no similar attempts have been made for hyaluronidase such as PH20, and no cases have been found where cleavage of one or two N-terminal amino acids dramatically increases expression and activity as in the present invention.
Трехмерная кристаллическая структура человеческой PH20 пока неизвестна. Однако на основании предсказания трехмерной структуры PH20 с помощью компьютерной программы было спрогнозировано, что, хотя аминокислоты F38, R39 и Y434 расположены близко к боковой цепи аспарагина в положении 37 на N-конце PH20 и имеют соответствующие взаимодействия зарядов между собой, аминокислота Leu36 в зрелом белке не образует каких-либо специфических связей с окружающими аминокислотами, а гидрофобные аминокислоты подвергаются воздействию водного раствора, тем самым, отрицательно влияя на скорость связывания или стабильность и, кроме того, на экспрессию белка. The three-dimensional crystal structure of human PH20 is not yet known. However, based on the prediction of the three-dimensional structure of PH20 using a computer program, it was predicted that although the amino acids F38, R39, and Y434 are located close to the asparagine side chain at position 37 at the N-terminus of PH20 and have corresponding charge interactions with each other, the amino acid Leu36 in the mature protein does not form any specific bonds with the surrounding amino acids, and the hydrophobic amino acids are exposed to aqueous solution, thereby negatively affecting the binding rate or stability and, furthermore, the expression of the protein.
В зрелом белке дикого типа PH20 животного происхождения вариант с аминокислотной заменой, которая существенно не изменяет трехмерную структуру белка, может показывать те же результаты, что и настоящее изобретение. Поскольку их эффекты были также подтверждены на бычьих и овечьих PH20 с 63,6% и 63,5% идентичностью человеческой PH20, соответственно, а также на PH20 примата с более чем 93,1% идентичностью человеческой PH20, то те же результаты можно предсказать для PH20 с 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичностью человеческой PH20 в пределах диапазона, в котором трехмерная структура белка существенно не изменяется. In the mature wild-type protein of PH20 of animal origin, a variant with an amino acid substitution that does not significantly change the three-dimensional structure of the protein can show the same results as the present invention. Since their effects were also confirmed on bovine and ovine PH20 with 63.6% and 63.5% identity to human PH20, respectively, as well as on primate PH20 with more than 93.1% identity to human PH20, the same results can be predicted for PH20 with 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% or 99% identity to human PH20 within the range in which the three-dimensional structure of the protein does not change significantly.
Пример 5. Получение расщепленных с N-конца и/или С-конца рекомбинантных гиалуронидаз PH20, имеющих разные сигнальные пептиды, и измерение активности Example 5. Preparation of N-terminally and/or C-terminally cleaved recombinant PH20 hyaluronidases with different signal peptides and measurement of activity
Для идентификации изменений сигнального пептида были приготовлены девять вариантов с сигнальными пептидами человеческой PH20, сывороточным гормоном человека или Ig каппа. Последовательности сигнальных пептидов перечислены в таблице 2 ниже. To identify signal peptide changes, nine variants were prepared with signal peptides of human PH20, human serum hormone, or Ig kappa. The signal peptide sequences are listed in Table 2 below.
В предыдущих примерах сигнальный пептид получали из сывороточного альбумина человека (HSA), и было протестировано, обеспечивают ли другие сигнальные пептиды, перечисленные в таблице 2, такие же результаты. In the previous examples, the signal peptide was obtained from human serum albumin (HSA), and it was tested whether other signal peptides listed in Table 2 provided the same results.
За исключением использования сигнальных пептидов из таблицы 2, L36-Y482, N37-Y482 и F38-Y482 рекомбинантной человеческой PH20 получали, как в примерах 1 и 2, и проводили анализ активности, как в примере 4. Результаты приведены на фиг. 7. Except for using the signal peptides from Table 2, L36-Y482, N37-Y482, and F38-Y482 recombinant human PH20 were prepared as in Examples 1 and 2 and activity assayed as in Example 4. The results are shown in Fig. 7.
Как показано на фиг. 7, даже когда использовали сигнальные пептиды человеческой PH20 или Ig каппа, изменения продуктивности, зависящие от N-концевой делеции в зрелой PH20, имели тенденцию быть сходными со случаем использования сигнального пептида сывороточного гормона человека. В связи с этим было подтверждено, что увеличение экспрессии и выхода зрелой PH20 при дальнейшей делеции N-концевой аминокислоты в меньшей степени связано с типом сигнального пептида. As shown in Fig. 7, even when the signal peptides of human PH20 or Ig kappa were used, the changes in productivity dependent on the N-terminal deletion in mature PH20 tended to be similar to that of the human serum hormone signal peptide. Therefore, it was confirmed that the increase in expression and yield of mature PH20 by further deletion of the N-terminal amino acid was less related to the type of signal peptide.
Промышленная применимость Industrial applicability
Расщепленный с N-конца и/или C-конца полипептид PH20 с улучшенной ферментативной активностью и выходом, представленный в настоящей заявке, демонстрирует превосходную экспрессию и более высокую ферментативную активность по сравнению с обычными рекомбинантными полипептидами PH20, что может привести к снижению терапевтических затрат за счет снижения затрат на производство для промышленного применения. The N-terminally and/or C-terminally cleaved PH20 polypeptide with improved enzymatic activity and yield provided in the present application exhibits superior expression and higher enzymatic activity compared to conventional recombinant PH20 polypeptides, which may lead to a reduction in therapeutic costs by reducing production costs for industrial use.
В изложенном выше подробно описаны некоторые аспекты настоящего изобретения. Специалисту в данной области техники очевидно, что эти конкретные примеры представляют собой всего лишь предпочтительные воплощения и не предназначены для ограничения объема настоящего изобретения. Соответственно, существенный объем изобретения определяется прилагаемой формулой изобретения и ее эквивалентами. In the foregoing, certain aspects of the present invention have been described in detail. It will be apparent to one skilled in the art that these specific examples are merely preferred embodiments and are not intended to limit the scope of the present invention. Accordingly, the substantial scope of the invention is defined by the appended claims and their equivalents.
Ссылки Links
1. H. Johansen, J. Sultiphong, G. Sathe, P. Jacobs, A. Cravador, A. Bollen, M. Rosenberg, and A. Shatzman, "High-level production of fully active human alpha 1-antitrypsin in Escherichia coli." Mol. Biol. Med. (1987) 4:291-305. 1. H. Johansen, J. Sultiphong, G. Sathe, P. Jacobs, A. Cravador, A. Bollen, M. Rosenberg, and A. Shatzman, “High-level production of fully active human alpha 1-antitrypsin in Escherichia coli.” Mol. Biol. Med. (1987) 4:291–305.
2. J.H. Dunham, R.C. Meyer, E.L. Garcia, and R.A. Hall, "GPR37 Surface Expression Enhancement via N-Terminal Truncation or Protein-Protein Interactions", Biochemistry (2009) 48:10286-10297. 2. J.H. Dunham, R.C. Meyer, E. L. Garcia, and R.A. Hall, “GPR37 Surface Expression Enhancement via N-Terminal Truncation or Protein-Protein Interactions,” Biochemistry (2009) 48:10286–10297.
3. M. Wei, D. Wang, Z. Li, S. Song, X. Kong, X. Mo, Y. Yang, M. He, Z. Li, B. Huang, Z. Lin, H. Pan, Q. Zheng, H. Yu, Y. Gu, J. Zhang, S. Li and N. Xia, "N-terminal truncations on L1 proteins of human papillomaviruses promote their soluble expression in Escherichia coli and self-assembly in vitro", Emerging Microbes & Infections (2018) 7:160. 3. M. Wei, D. Wang, Z. Li, S. Song, X. Kong, X. Mo, Y. Yang, M. He, Z. Li, B. Huang, Z. Lin, H. Pan, Q. Zheng, H. Yu, Y. Gu, J. Zhang, S. Li and N. Xia, “N-terminal truncations on L1 proteins of human papillomaviruses promote their soluble expression in Escherichia coli and self-assembly in vitro,” Emerging Microbes & Infections (2018) 7:160.
4. M. F. Meyer, G. Kreil, and H. Aschauer, "The soluble hyaluronidase from bull testes is a fragment of the membrane-bound PH-20 enzyme", FEBS letter (1997) 413:385-388. 4. M. F. Meyer, G. Kreil, and H. Aschauer, “The soluble hyaluronidase from bull tests is a fragment of the membrane-bound PH-20 enzyme,” FEBS letter (1997) 413:385-388.
--->--->
<ST26SequenceListing dtdVersion="V1_3" fileName="PP-B2945.xml" <ST26SequenceListing dtdVersion="V1_3" fileName="PP-B2945.xml"
softwareName="WIPO Sequence" softwareVersion="2.0.0" softwareName="WIPO Sequence" softwareVersion="2.0.0"
productionDate="2023-06-21">productionDate="2023-06-21">
<ApplicantFileReference>2945</ApplicantFileReference><ApplicantFileReference>2945</ApplicantFileReference>
<ApplicantName languageCode="en">Alteogen Inc.</ApplicantName><ApplicantName languageCode="en">Alteogen Inc.</ApplicantName>
<InventionTitle languageCode="en"><InventionTitle languageCode="en">
N-terminal and/or C-terminal Cleaved Soluble PH20 polypeptide and Use N-terminal and/or C-terminal Cleaved Soluble PH20 polypeptide and Use
ThereofThereof
</InventionTitle></InventionTitle>
<SequenceTotalQuantity>10</SequenceTotalQuantity><SequenceTotalQuantity>10</SequenceTotalQuantity>
<SequenceData sequenceIDNumber="1"><SequenceData sequenceIDNumber="1">
<INSDSeq><INSDSeq>
<INSDSeq_length>509</INSDSeq_length><INSDSeq_length>509</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype><INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division><INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table><INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature><INSDFeature>
<INSDFeature_key>REGION</INSDFeature_key><INSDFeature_key>REGION</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..509</INSDFeature_location><INSDFeature_location>1..509</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals><INSDFeature_quals>
<INSDQualifier id="q1"><INSDQualifier id="q1">
<INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name><INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Synthetic Sequence</INSDQualifier_value><INSDQualifier_value>Synthetic Sequence</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
</INSDFeature_quals></INSDFeature_quals>
</INSDFeature></INSDFeature>
<INSDFeature><INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key><INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..509</INSDFeature_location><INSDFeature_location>1..509</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals><INSDFeature_quals>
<INSDQualifier><INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name><INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value><INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q2"><INSDQualifier id="q2">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name><INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value><INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
</INSDFeature_quals></INSDFeature_quals>
</INSDFeature></INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table></INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence><INSDSeq_sequence>
MGVLKFKHIFFRSFVKSSGVSQIVFTFLLIPCCLTLNFRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEPLDMMGVLKFKHIFFRSFVKSSGVSQIVFTFLLIPCCLTLNFRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEPLDM
SLFSFIGSPRINATGQGVTIFYVDRLGYYPYIDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDITFYMPVDNLSLFSFIGSPRINATGQGVTIFYVDRLGYYPYIDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDITFYMPVDNL
GMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDVYKNRSIELVQQQNVQLSLTEATEKAKQEFEKAGKDFLVETIKLGKLLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDVYKNRSIELVQQQNVQLSLTEATEKAKQEFEKAGKDFLVETIKLGKLL
RPNHLWGYYLFPDCYNHHYKKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTALYPSIYLNTQQSPVAATLYVRNRPNHLWGYYLFPDCYNHHYKKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTALYPSIYLNTQQSPVAATLYVRN
RVREAIRVSKIPDAKSPLPVFAYTRIVFTDQVLKFLSQDELVYTFGETVALGASGIVIWGTLSIMRSMKSRVREAIRVSKIPDAKSPLPVFAYTRIVFTDQVLKFLSQDELVYTFGETVALGASGIVIWGTLSIMRSMKS
CLLLDNYMETILNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVCIRKNWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGKCLLLDNYMETILNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVCIRKNWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGK
PTLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKDTDAVDVCIADGVCIDAFLKPPMETEEPQIFYNASPSTLSPTLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKDTDAVDVCIADGVCIDAFLKPPMETEEPQIFYNASPSTLS
ATMFIVSILFLIISSVASLATMFIVSILFLIISSVASL
</INSDSeq_sequence></INSDSeq_sequence>
</INSDSeq></INSDSeq>
</SequenceData></SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="2"><SequenceData sequenceIDNumber="2">
<INSDSeq><INSDSeq>
<INSDSeq_length>510</INSDSeq_length><INSDSeq_length>510</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype><INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division><INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table><INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature><INSDFeature>
<INSDFeature_key>REGION</INSDFeature_key><INSDFeature_key>REGION</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..510</INSDFeature_location><INSDFeature_location>1..510</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals><INSDFeature_quals>
<INSDQualifier id="q3"><INSDQualifier id="q3">
<INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name><INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Synthetic Sequence</INSDQualifier_value><INSDQualifier_value>Synthetic Sequence</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
</INSDFeature_quals></INSDFeature_quals>
</INSDFeature></INSDFeature>
<INSDFeature><INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key><INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..510</INSDFeature_location><INSDFeature_location>1..510</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals><INSDFeature_quals>
<INSDQualifier><INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name><INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value><INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q4"><INSDQualifier id="q4">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name><INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value><INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
</INSDFeature_quals></INSDFeature_quals>
</INSDFeature></INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table></INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence><INSDSeq_sequence>
MGVIKFKHIFFRSFVKSSGVSQIVFTFLLIPCCLTLNFRAPPIIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEPLDMMGVIKFKHIFFRSFVKSSGVSQIVFTFLLIPCCLTLNFRAPPIIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEPLDM
SLFSLIGSPRINVTGQGVTIFYVDRLGYYPYIDITTGVTVHGGIPQKVSLQDHLDKAKQDIIFYMPVDNLSLFSLIGSPRINVTGQGVTIFYVDRLGYYPYIDITTGVTVHGGIPQKVSLQDHLDKAKQDIIFYMPVDNL
GMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDVYKNRSIELVQQQNVQLSLPEATDKAKQEFEKAGKDFMLETIKLGKSLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDVYKNRSIELVQQQNVQLSLPEATDKAKQEFEKAGKDFMLETIKLGKSL
RPNHLWGYYLFPDCYNHHYKKPGYNGSCFDVEIKRNDDLSWLWNESTALYPSIYLNTQQSPVAATLYVRNRPNHLWGYYLFPDCYNHHYKKPGYNGSCFDVEIKRNDDLSWLWNESTALYPSIYLNTQQSPVAATLYVRN
RVQEAIRVSKIPDAKNPLPVFVYARLVFTDQVLKFLSRDELVYTLGETVALGASGIVIWGSLSIMRSMKSRVQEAIRVSKIPDAKNPLPVFVYARLVFTDQVLKFLSRDELVYTLGETVALGASGIVIWGSLSIMRSMKS
CLLLDNYMETILNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVCIRKDWNSSDYLHLNPDNFAIQMEKGGKFTVRGKCLLLDNYMETILNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVCIRKDWNSSDYLHLNPDNFAIQMEKGGKFTVRGK
PTLEDLEEFSEKFYCSCYTTLSCKEKADVKDTDAVDVCIADGVCIDASLKPPVETEGSPPIFYNTSPSTLPTLEDLEEFSEKFYCSCYTTLSCKEKADVKDTDAVDVCIADGVCIDASLKPPVETEGSPPIFYNTSPSTL
STTMFIVSILFLIISSVVSLSTTMFIVSILFLIISSVVSL
</INSDSeq_sequence></INSDSeq_sequence>
</INSDSeq></INSDSeq>
</SequenceData></SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="3"><SequenceData sequenceIDNumber="3">
<INSDSeq><INSDSeq>
<INSDSeq_length>509</INSDSeq_length><INSDSeq_length>509</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype><INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division><INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table><INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature><INSDFeature>
<INSDFeature_key>REGION</INSDFeature_key><INSDFeature_key>REGION</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..509</INSDFeature_location><INSDFeature_location>1..509</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals><INSDFeature_quals>
<INSDQualifier id="q5"><INSDQualifier id="q5">
<INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name><INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Synthetic Sequence</INSDQualifier_value><INSDQualifier_value>Synthetic Sequence</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
</INSDFeature_quals></INSDFeature_quals>
</INSDFeature></INSDFeature>
<INSDFeature><INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key><INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..509</INSDFeature_location><INSDFeature_location>1..509</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals><INSDFeature_quals>
<INSDQualifier><INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name><INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value><INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q6"><INSDQualifier id="q6">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name><INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value><INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
</INSDFeature_quals></INSDFeature_quals>
</INSDFeature></INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table></INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence><INSDSeq_sequence>
MGVLKFKHIFFRSFVKSSGVSQIVFTFLLIPCCLTLNFRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEPLDMMGVLKFKHIFFRSFVKSSGVSQIVFTFLLIPCCLTLNFRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEPLDM
SLFSFIGSPRINVTGQDVTIFYVDRLGYYPYIDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDITFYMPVDNLSLFSFIGSPRINVTGQDVTIFYVDRLGYYPYIDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDITFYMPVDNL
GMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDVYKNRSIELVQQQNVQLSLTEATEKAKQEFEKAGKDFLVETIKLGKLLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDVYKNRSIELVQQQNVQLSLTEATEKAKQEFEKAGKDFLVETIKLGKLL
RPNHLWGYYLFPDCYNHHYKKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTALYPSIYLNTQQSPVAATLYVRNRPNHLWGYYLFPDCYNHHYKKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTALYPSIYLNTQQSPVAATLYVRN
RVQEAIRVSKIPDAKSPLPVFVYTRIVFTDQVLKFLSQDELVYTFGETVALGASGIVIWGTLSIMRSMKSRVQEAIRVSKIPDAKSPLPVFVYTRIVFTDQVLKFLSQDELVYTFGETVALGASGIVIWGTLSIMRSMKS
CLLLDNYMETILNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVCIRKNWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGKCLLLDNYMETILNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVCIRKNWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGK
PTLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKDTDAVDVCIADGVCIDAFLKPPMETEESQIFYNASPSTLSPTLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKDTDAVDVCIADGVCIDAFLKPPMETEESQIFYNASPSTLS
ATMFIVSILFLIISSVASLATMFIVSILFLIISSVASL
</INSDSeq_sequence></INSDSeq_sequence>
</INSDSeq></INSDSeq>
</SequenceData></SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="4"><SequenceData sequenceIDNumber="4">
<INSDSeq><INSDSeq>
<INSDSeq_length>509</INSDSeq_length><INSDSeq_length>509</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype><INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division><INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table><INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature><INSDFeature>
<INSDFeature_key>REGION</INSDFeature_key><INSDFeature_key>REGION</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..509</INSDFeature_location><INSDFeature_location>1..509</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals><INSDFeature_quals>
<INSDQualifier id="q7"><INSDQualifier id="q7">
<INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name><INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Synthetic Sequence</INSDQualifier_value><INSDQualifier_value>Synthetic Sequence</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
</INSDFeature_quals></INSDFeature_quals>
</INSDFeature></INSDFeature>
<INSDFeature><INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key><INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..509</INSDFeature_location><INSDFeature_location>1..509</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals><INSDFeature_quals>
<INSDQualifier><INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name><INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value><INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q8"><INSDQualifier id="q8">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name><INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value><INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
</INSDFeature_quals></INSDFeature_quals>
</INSDFeature></INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table></INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence><INSDSeq_sequence>
MGVLKFKHIFFGSFVKSSGVSQIVFTFLLIPCCLTLNFRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEPLDMMGVLKFKHIFFGSFVKSSGVSQIVFTFLLIPCCLTLNFRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEPLDM
SLFSFIGSPRINVTGQDVTIFYVDRLGYYPYIDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDITFYMPVDNLSLFSFIGSPRINVTGQDVTIFYVDRLGYYPYIDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDITFYMPVDNL
GMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDIYKNRSIELVQQQNVQLNLTEATEKAKQEFEKAGKDFLVETIKLGKLLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDIYKNRSIELVQQQNVQLNLTEATEKAKQEFEKAGKDFLVETIKLGKLL
RPNHLWGYYLFPDCYNHHYKKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTALYPSIYLNTQQSPVAATLYVRNRPNHLWGYYLFPDCYNHHYKKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTALYPSIYLNTQQSPVAATLYVRN
RVREAIRVSKIPDAKSPLPVFVYTRIVFTDQVLKFLSQDELVYTFGETVALGASGIVIWGTLSIMRSMKSRVREAIRVSKIPDAKSPLPVFVYTRIVFTDQVLKFLSQDELVYTFGETVALGASGIVIWGTLSIMRSMKS
CLLLDNYMETILNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVCIRKNWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGKCLLLDNYMETILNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVCIRKNWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGK
PTLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKDTDAVDVCIADGVCIDAFLKPPMETEESQIFYNASPSTLSPTLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKDTDAVDVCIADGVCIDAFLKPPMETEESQIFYNASPSTLS
ATMFIVSILFLIISSVASLATMFIVSILFLIISSVASL
</INSDSeq_sequence></INSDSeq_sequence>
</INSDSeq></INSDSeq>
</SequenceData></SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="5"><SequenceData sequenceIDNumber="5">
<INSDSeq><INSDSeq>
<INSDSeq_length>509</INSDSeq_length><INSDSeq_length>509</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype><INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division><INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table><INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature><INSDFeature>
<INSDFeature_key>REGION</INSDFeature_key><INSDFeature_key>REGION</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..509</INSDFeature_location><INSDFeature_location>1..509</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals><INSDFeature_quals>
<INSDQualifier id="q9"><INSDQualifier id="q9">
<INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name><INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Synthetic Sequence</INSDQualifier_value><INSDQualifier_value>Synthetic Sequence</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
</INSDFeature_quals></INSDFeature_quals>
</INSDFeature></INSDFeature>
<INSDFeature><INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key><INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..509</INSDFeature_location><INSDFeature_location>1..509</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals><INSDFeature_quals>
<INSDQualifier><INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name><INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value><INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q10"><INSDQualifier id="q10">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name><INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value><INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
</INSDFeature_quals></INSDFeature_quals>
</INSDFeature></INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table></INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence><INSDSeq_sequence>
MGVLKFKHIFFRSFVKSSGVSQIVFTFLLIPCCLTLNFRAPPVIPNVPFLWAWNAPSKFCLGKFDEPLDMMGVLKFKHIFFRSFVKSSGVSQIVFTFLLIPCCLTLNFRAPPVIPNVPFLWAWNAPSKFCLGKFDEPLDM
SLFSLIGSPRINITGQGVTIFYVDRLGYYPYIDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDITFYMPVDNLSLFSLIGSPRINITGQGVTIFYVDRLGYYPYIDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDITFYMPVDNL
GMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDVYKNRSIELVQQQNVQLSLTEATEKAKQEFEKAGKDFMVETIKLGKLLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDVYKNRSIELVQQQNVQLSLTEATEKAKQEFEKAGKDFMVETIKLGKLL
RPNHLWGYYLFPDCYNHHYKKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTALYPSIYLNTQQSPVAATLYVRNRPNHLWGYYLFPDCYNHHYKKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTALYPSIYLNTQQSPVAATLYVRN
RVQEAIRVSKIPDAKSPLPVFVYTRIVFTDQVLKFLSQDELVYTFGETVALGASGIVIWGTLSIMRSMKSRVQEAIRVSKIPDAKSPLPVFVYTRIVFTDQVLKFLSQDELVYTFGETVALGASGIVIWGTLSIMRSMKS
CLLLDNYMETILNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVCIRKDWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGKCLLLDNYMETILNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVCIRKDWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGK
PTLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADIKDTDAVDVCIADGVCIDAFLKPPMDTEESQIFYNASPSTLSPTLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADIKDTDAVDVCIADGVCIDAFLKPPMDTEESQIFYNASPSTLS
ATMLIVSILFLIISSVARLATMLIVSILFLIISSVARL
</INSDSeq_sequence></INSDSeq_sequence>
</INSDSeq></INSDSeq>
</SequenceData></SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="6"><SequenceData sequenceIDNumber="6">
<INSDSeq><INSDSeq>
<INSDSeq_length>511</INSDSeq_length><INSDSeq_length>511</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype><INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division><INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table><INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature><INSDFeature>
<INSDFeature_key>REGION</INSDFeature_key><INSDFeature_key>REGION</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..511</INSDFeature_location><INSDFeature_location>1..511</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals><INSDFeature_quals>
<INSDQualifier id="q11"><INSDQualifier id="q11">
<INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name><INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Synthetic Sequence</INSDQualifier_value><INSDQualifier_value>Synthetic Sequence</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
</INSDFeature_quals></INSDFeature_quals>
</INSDFeature></INSDFeature>
<INSDFeature><INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key><INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..511</INSDFeature_location><INSDFeature_location>1..511</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals><INSDFeature_quals>
<INSDQualifier><INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name><INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value><INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q12"><INSDQualifier id="q12">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name><INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value><INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
</INSDFeature_quals></INSDFeature_quals>
</INSDFeature></INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table></INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence><INSDSeq_sequence>
MGVLKFKHIFFRSFVKSSGVSQIVLTFLLIPCCLTLNFRAPPIIPNMPFLWAWNAPSEFCLGKFDEPLDMMGVLKFKHIFFRSFVKSSGVSQIVLTFLLIPCCLTLNFRAPPIIPNMPFLWAWNAPSEFCLGKFDEPLDM
SLFSLIGSPRINVTGQAVTIFYVDRLGYYPYIDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDILFYMPVDNLSLFSLIGSPRINVTGQAVTIFYVDRLGYYPYIDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDILFYMPVDNL
GMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDVYKNRSIELVQQQNVQLNLTEATEKAKQEFEKAGKDFMVETIKLGKLLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDVYKNRSIELVQQQNVQLNLTEATEKAKQEFEKAGKDFMVETIKLGKLL
RPNHLWGYYLFPDCYNHHYKKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTALYPSIYLNTQQSPVAATLYVRNRPNHLWGYYLFPDCYNHHYKKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTALYPSIYLNTQQSPVAATLYVRN
RVREAIRVSKIPDAKSPLPVFVYARIVFTDQVLKFLSQDELVYTFGETVALGASGIVIWGSLSIMRSMKSRVREAIRVSKIPDAKSPLPVFVYARIVFTDQVLKFLSQDELVYTFGETVALGASGIVIWGSLSIMRSMKS
CLLLDNYMETILNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVCIRKDWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGKCLLLDNYMETILNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVCIRKDWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGK
PTLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKDTDAVDVCIADGVCIDAFLKPPMETEESQIFYNASPSTLSPTLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKDTDAVDVCIADGVCIDAFLKPPMETEESQIFYNASPSTLS
ATMFIWRLEVWDQGISRMGFFATMFIWRLEVWDQGISRMGFF
</INSDSeq_sequence></INSDSeq_sequence>
</INSDSeq></INSDSeq>
</SequenceData></SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="7"><SequenceData sequenceIDNumber="7">
<INSDSeq><INSDSeq>
<INSDSeq_length>509</INSDSeq_length><INSDSeq_length>509</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype><INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division><INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table><INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature><INSDFeature>
<INSDFeature_key>REGION</INSDFeature_key><INSDFeature_key>REGION</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..509</INSDFeature_location><INSDFeature_location>1..509</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals><INSDFeature_quals>
<INSDQualifier id="q13"><INSDQualifier id="q13">
<INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name><INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Synthetic Sequence</INSDQualifier_value><INSDQualifier_value>Synthetic Sequence</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
</INSDFeature_quals></INSDFeature_quals>
</INSDFeature></INSDFeature>
<INSDFeature><INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key><INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..509</INSDFeature_location><INSDFeature_location>1..509</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals><INSDFeature_quals>
<INSDQualifier><INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name><INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value><INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q14"><INSDQualifier id="q14">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name><INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value><INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
</INSDFeature_quals></INSDFeature_quals>
</INSDFeature></INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table></INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence><INSDSeq_sequence>
MGVLKFKHIFFRSFVKSNGVSQIVFTFLLIPRCLTLNFRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEPLDMMGVLKFKHIFFRSFVKSNGVSQIVFTFLLIPRCLTLNFRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEPLDM
SLFSLIGSPRINVTGQGVTIFYVDRLGYYPYIDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKQDITFYMPVDNLSLFSLIGSPRINVTGQGVTIFYVDRLGYYPYIDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKQDITFYMPVDNL
GMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDVYKNRSIELVQQQNVQLNLTEATEKAKQEFEKAGKDFMVETIKLGKLLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDVYKNRSIELVQQQNVQLNLTEATEKAKQEFEKAGKDFMVETIKLGKLL
RPNHLWGYYLFPDCYNHHYKKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTALYPSIYLNTQQSPVAATLYVRNRPNHLWGYYLFPDCYNHHYKKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTALYPSIYLNTQQSPVAATLYVRN
RVREAIRVSKIPDAKSPLPVFVYARIVFTDQVLKFLSRDELVYTLGETVALGASGIVIWGSLSIMRSMKSRVREAIRVSKIPDAKSPLPVFVYARIVFTDQVLKFLSRDELVYTLGETVALGASGIVIWGSLSIMRSMKS
CLLLDNYMETILNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVCIRKDWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGKCLLLDNYMETILNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVCIRKDWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGK
PTPEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKDTDAVDVCIADGVCIDAFLKPPKETEESQIFYNASPSTLSPTPEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKDTDAVDVCIADGVCIDAFLKPPKETEESQIFYNASPSTLS
ATMFIVSILFPIISSVVSLATMFIVSILFPIISSVVSL
</INSDSeq_sequence></INSDSeq_sequence>
</INSDSeq></INSDSeq>
</SequenceData></SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="8"><SequenceData sequenceIDNumber="8">
<INSDSeq><INSDSeq>
<INSDSeq_length>509</INSDSeq_length><INSDSeq_length>509</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype><INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division><INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table><INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature><INSDFeature>
<INSDFeature_key>REGION</INSDFeature_key><INSDFeature_key>REGION</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..509</INSDFeature_location><INSDFeature_location>1..509</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals><INSDFeature_quals>
<INSDQualifier id="q15"><INSDQualifier id="q15">
<INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name><INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Synthetic Sequence</INSDQualifier_value><INSDQualifier_value>Synthetic Sequence</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
</INSDFeature_quals></INSDFeature_quals>
</INSDFeature></INSDFeature>
<INSDFeature><INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key><INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..509</INSDFeature_location><INSDFeature_location>1..509</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals><INSDFeature_quals>
<INSDQualifier><INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name><INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value><INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q16"><INSDQualifier id="q16">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name><INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value><INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
</INSDFeature_quals></INSDFeature_quals>
</INSDFeature></INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table></INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence><INSDSeq_sequence>
MGVLKFKHIFFRSFVKSNGISQIVFTFLLIPRCLTLNFRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEPLDMMGVLKFKHIFFRSFVKSNGISQIVFTFLLIPRCLTLNFRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEPLDM
SLFSLTGSPRINVTGQGVTIFYVDRLGYYPYIDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKQDITFYMPVDNLSLFSLTGSPRINVTGQGVTIFYVDRLGYYPYIDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKQDITFYMPVDNL
GMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDVYKNRSIELVQQQNVQLSLAEATEKAKQEFEKAGKDFMVETIKLGKLLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDVYKNRSIELVQQQNVQLSLAEATEKAKQEFEKAGKDFMVETIKLGKLL
RPNHLWGYYLFPDCYNHHYKKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTALYPSIYLNTQQSPVAATLYVRNRPNHLWGYYLFPDCYNHHYKKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTALYPSIYLNTQQSPVAATLYVRN
RVREAIRVSKIPDAKSPLPVFVYARIVFTDQVLKFLSRDELVYTLGETVALGASGIVIWGSLSIVRSMKSRVREAIRVSKIPDAKSPLPVFVYARIVFTDQVLKFLSRDELVYTLGETVALGASGIVIWGSLSIVRSMKS
CLLLDNYMETILNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVCIRKDWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGKCLLLDNYMETILNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVCIRKDWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGK
PTPEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKDTDAVDVCIADGVCIDAFLKPPKETEESQIFYNASPSTLSPTPEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKDTDAVDVCIADGVCIDAFLKPPKETEESQIFYNASPSTLS
ATMFIVSILFLIISSVVSLATMFIVSILFLIISSVVSL
</INSDSeq_sequence></INSDSeq_sequence>
</INSDSeq></INSDSeq>
</SequenceData></SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="9"><SequenceData sequenceIDNumber="9">
<INSDSeq><INSDSeq>
<INSDSeq_length>553</INSDSeq_length><INSDSeq_length>553</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype><INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division><INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table><INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature><INSDFeature>
<INSDFeature_key>REGION</INSDFeature_key><INSDFeature_key>REGION</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..553</INSDFeature_location><INSDFeature_location>1..553</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals><INSDFeature_quals>
<INSDQualifier id="q17"><INSDQualifier id="q17">
<INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name><INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Synthetic Sequence</INSDQualifier_value><INSDQualifier_value>Synthetic Sequence</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
</INSDFeature_quals></INSDFeature_quals>
</INSDFeature></INSDFeature>
<INSDFeature><INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key><INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..553</INSDFeature_location><INSDFeature_location>1..553</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals><INSDFeature_quals>
<INSDQualifier><INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name><INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value><INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q18"><INSDQualifier id="q18">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name><INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value><INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
</INSDFeature_quals></INSDFeature_quals>
</INSDFeature></INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table></INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence><INSDSeq_sequence>
MRMLRRHHISFRSFAGSSGTPQAVFTFLLLPCCLALDFRAPPLISNTSFLWAWNAPVERCVNRRFQLPPDMRMLRRHHISFRSFAGSSGTPQAVFTFLLLPCCLALDFRAPPLISNTSFLWAWNAPVERCVNRRFQLPPD
LRLFSVKGSPQKSATGQFITLFYADRLGYYPHIDEKTGKTVFGGIPQLGNLKSHLEKAKNDIAYYIPNDSLRLFSVKGSPQKSATGQFITLFYADRLGYYPHIDEKTGKTVFGGIPQLGNLKSHLEKAKNDIAYYIPNDS
VGLAVIDWENWRPTWARNWKPKDVYRDESVELVLQKNPQLSFPEASKIAKVDFETAGKSFMQETLKLGKLVGLAVIDWENWRPTWARNWKPKDVYRDESVELVLQKNPQLSFPEASKIAKVDFETAGKSFMQETLKLGKL
LRPNHLWGYYLFPDCYNHNHNQPTYNGNCPDVEKRRNDDLEWLWKESTALFPSVYLNIRLKSTQNAALYVLRPNHLWGYYLFPDCYNHNHNQPTYNGNCPDVEKRRNDDLEWLWKESTALFPSVYLNIRLKSTQNAALYV
RNRVQEAIRLSKIASVESPLPVFVYARPVFTDGSSTYLSQGDLVNSVGEIVSLGASGIIMWGSLNLSLSMRNRVQEAIRLSKIASVESPLPVFVYARPVFTDGSSTYLSQGDLVNSVGEIVSLGASGIIMWGSLNLSLSM
QSCMNLGTYLNTTLNPYIINVTLAAKMCSQVLCHNEGVCTRKHWNSSDYLHLNPMNFAIQTGEGGKYTVPQSCMNLGTYLNTTLNPYIINVTLAAKMCSQVLCHNEGVCTRKHWNSSDYLHLNPMNFAIQTGEGGKYTVP
GTVTLEDLQKFSDTFYCSCYANIHCKKRVDIKNVHSVNVCMAEDICIDSPVKLQPSDHSSSQEASTTTFSGTVTLEDLQKFSDTFYCSCYANIHCKKRVDIKNVHSVNVCMAEDICIDSPVKLQPSDHSSSQEASTTTFS
SISPSTTTATVSPCTPEKHSPECLKVRCSEVIPNVTQKACQSVKLKNISYQSPIQNIKNQTTYSISPSTTTATVSPCTPEKHSPECLKVRCSEVIPNVTQKACQSVKLKNISYQSPIQNIKNQTTY
</INSDSeq_sequence></INSDSeq_sequence>
</INSDSeq></INSDSeq>
</SequenceData></SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="10"><SequenceData sequenceIDNumber="10">
<INSDSeq><INSDSeq>
<INSDSeq_length>553</INSDSeq_length><INSDSeq_length>553</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype><INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division><INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table><INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature><INSDFeature>
<INSDFeature_key>REGION</INSDFeature_key><INSDFeature_key>REGION</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..553</INSDFeature_location><INSDFeature_location>1..553</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals><INSDFeature_quals>
<INSDQualifier id="q19"><INSDQualifier id="q19">
<INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name><INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Synthetic Sequence</INSDQualifier_value><INSDQualifier_value>Synthetic Sequence</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
</INSDFeature_quals></INSDFeature_quals>
</INSDFeature></INSDFeature>
<INSDFeature><INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key><INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..553</INSDFeature_location><INSDFeature_location>1..553</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals><INSDFeature_quals>
<INSDQualifier><INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name><INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value><INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q20"><INSDQualifier id="q20">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name><INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value><INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
</INSDFeature_quals></INSDFeature_quals>
</INSDFeature></INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table></INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence><INSDSeq_sequence>
KRMLRRRHISFRSFVGASGTPQAALAFLLLPCWLALDFRAPPLISNTSFLWAWNAPAERCVKIFKLPPDLKRMLRRRHISFRSFVGASGTPQAALAFLLLPCWLALDFRAPPLISNTSFLWAWNAPAERCVKIFKLPPDL
RLFSVKGSPQKSATGQFITLFYADRLGYYPHIDEKTGNTVYGGIPQLGNLKNHLEKAKKDIAYYIPNDSVRLFSVKGSPQKSATGQFITLFYADRLGYYPHIDEKTGNTVYGGIPQLGNLKNHLEKAKKDIAYYIPNDSV
GLAVIDWENWRPTWARNWKPKDVYRDESVELVLQKNPQLSFPEASKIAKVDFETAGKSFMQETLKLGKLLGLAVIDWENWRPTWARNWKPKDVYRDESVELVLQKNPQLSFPEASKIAKVDFETAGKSFMQETLKLGKLL
RPNHLWGYYLFPDCYNHNYNQPTYNGNCSDLEKRRNDDLDWLWKESTALFPSVYLNIKLKSTPKAAFYVRRPNHLWGYYLFPDCYNHNYNQPTYNGNCSDLEKRRNDDLDWLWKESTALFPSVYLNIKLKSTPKAAFYVR
NRVQEAIRLSKIASVESPLPVFVYHRPVFTDGSSTYLSQGDLVNSVGEIVALGASGIIMWGSLNLSLTMQNRVQEAIRLSKIASVESPLPVFVYHRPVFTDGSSTYLSQGDLVNSVGEIVALGASGIIMWGSLNLSLTMQ
SCMNLGNYLNTTLNPYIINVTLAAKMCSQVLCHDEGVCTRKQWNSSDYLHLNPMNFAIQTGKGGKYTVPGSCMNLGNYLNTTLNPYIINVTLAAKMCSQVLCHDEGVCTRKQWNSSDYLHLNPMNFAIQTGKGGKYTVPG
KVTLEDLQTFSDKFYCSCYANINCKKRVDIKNVHSVNVCMAEDICIEGPVKLQPSDHSSSQNEASTTTVSKVTLEDLQTFSDKFYCSCYANINCKKRVDIKNVHSVNVCMAEDICIEGPVKLQPSDHSSSQNEASTTTVS
SISPSTTATTVSPCTPEKQSPECLKVRCLEAIANVTQTGCQGVKWKNTSSQSSIQNIKNQTTYSISPSTTATTVSPCTPEKQSPECLKVRCLEAIANVTQTGCQGVKWKNTSSQSSIQNIKNQTTY
</INSDSeq_sequence></INSDSeq_sequence>
</INSDSeq></INSDSeq>
</SequenceData></SequenceData>
</ST26SequenceListing></ST26SequenceListing>
<---<---
Claims (14)
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR10-2022-0076030 | 2022-06-22 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2024117969A RU2024117969A (en) | 2024-12-23 |
| RU2845088C2 true RU2845088C2 (en) | 2025-08-13 |
Family
ID=
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2021150079A1 (en) * | 2020-01-23 | 2021-07-29 | (주)알테오젠 | Novel hyaluronic acid-hydrolyzing enzyme variant having improved stability and pharmaceutical composition comprising same |
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2021150079A1 (en) * | 2020-01-23 | 2021-07-29 | (주)알테오젠 | Novel hyaluronic acid-hydrolyzing enzyme variant having improved stability and pharmaceutical composition comprising same |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| KUAN-JUNG CHEN et al., Constitutive expression of recombinant human hyaluronidase PH20 by Pichia pastoris, Journal of Bioscience and Bioengineering, 2016, vol. 122, i. 6, pp. 673-678. ZHAO R. et al., Human Hyaluronidase PH20 Potentiates the Antitumor Activities of Mesothelin-Specific CAR-T Cells Against Gastric Cancer, Front. Immunol., 2021, 12:660488. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP7204729B2 (en) | Novel Hyaluronic Acid Hydrolase Mutants and Pharmaceutical Compositions Containing The Same | |
| DK2155871T3 (en) | ACE2 Polypeptide | |
| JP7594365B2 (en) | Purification of recombinant iduronate 2-sulfatase | |
| KR101598897B1 (en) | Manufacture of active highly phosphorylated human n-acetylgalactosamine-6-sulfatase and uses thereof | |
| JP2022552756A (en) | Novel hyaluronic acid hydrolase variant with improved stability and pharmaceutical composition containing the same | |
| KR20240110541A (en) | N-terminal and/or C-terminal Cleaved Soluble PH20 polypeptide and Use Thereof | |
| CZ20014383A3 (en) | Hyaluronidase from Hirudinaria manilensis, isolation thereof, purification and recombinant processes of its preparation | |
| TW202142254A (en) | Myeloid-derived growth factor for use in treating or preventing fibrosis, hypertrophy or heart failure | |
| CA2915253A1 (en) | Bacterial hyaluronidase and process for its production | |
| JP2022504400A (en) | Manipulation of DNASE Enzymes for Manufacturing and Treatment | |
| WO2016011935A1 (en) | Human fgfr2c extracellular protein as well as coding gene and application thereof | |
| EP3393501B1 (en) | Human alpha-n-acetylgalactosaminidase polypeptide | |
| WO2016102580A1 (en) | Alpha-1-antitrypsin (a1at) fusion proteins and uses thereof | |
| US20220144903A1 (en) | Recombinant ccn domain proteins and fusion proteins | |
| RU2845088C2 (en) | Soluble ph20 polypeptide cleaved at n-end and/or c-end and use thereof | |
| TWI896460B (en) | N-terminal and/or c-terminal cleaved soluble ph20 polypeptide and use thereof | |
| Papakonstantinou et al. | Synthesis, purification and bioactivity of recombinant human activin A expressed in the yeast Pichia pastoris | |
| CN120936711A (en) | Novel hyaluronidase variants and pharmaceutical compositions comprising them | |
| Bullock et al. | Expression and production of pigment epithelium-derived factor (PEDF) and PEDF receptor variants from mammalian and bacterial cells | |
| KR20250162568A (en) | Novel hyaluronic acid hydrolase variant and pharmaceutical composition comprising the same | |
| JPH02104293A (en) | Rabbit epithelial cell growth factor |