RU2843773C2

RU2843773C2 - Method for evaluating rheumatoid arthritis activity

Info

Publication number: RU2843773C2
Application number: RU2023128406A
Authority: RU
Inventors: Дарья Игоревна Козлова; Алексей Леонидович Маслянский; Анастасия Александровна Королькова; Виталий Валентинович Хижа; Станислава Сергеевна Беневоленская; Арсений Валентинович Рыбаков
Original assignee: Дарья Игоревна Козлова
Filing date: 2023-11-02
Publication date: 2025-07-18

Abstract

FIELD: medicine.

SUBSTANCE: invention relates to medicine, specifically to rheumatology, and can be used to assess rheumatoid arthritis activity. Patients’ blood is sampled and the number of swollen joints is determined. Content of protein 14-3-3η is determined in blood plasma, pg/ml; and calprotectin, pg/ml. Inflammatory process activity coefficient in rheumatoid arthritis (PAC) is calculated by PAC formula: PAC = 0.0036M1 + 0.137M2 + 0.14 , where M1 is protein content 14-3-3η in blood plasma; M2 is blood plasma calprotectin content; NSJ is number of swollen joints. If the COA is more than 0.99, aggravation is diagnosed. If COA is 0.71 to 0.99, low activity of rheumatoid arthritis is diagnosed. COA falling within range of 0.28 to 0.71 enables diagnosing the remission.

EFFECT: method provides a highly reliable assessment of the degree of activity of rheumatoid arthritis to make a decision on continuing or changing the treatment regimen and prescribing a supporting therapy by estimating the estimated degree of activity of rheumatoid arthritis, based on the combined use of indicators of the number of swollen joints and the protein content of 14-3-3η and blood plasma calprotectin.

1 cl, 4 ex

Description

Изобретение относится к области медицины, а именно к ревматологии, и может быть использовано для оценки активности ревматоидного артрита (РА), а именно стадий обострения, выхода из ремиссии и устойчивую ремиссию, позволяет оценивать активность РА, базируясь на классификации, основанной на необходимости смены лечения.The invention relates to the field of medicine, namely rheumatology, and can be used to assess the activity of rheumatoid arthritis (RA), namely the stages of exacerbation, exit from remission and stable remission, allows assessing the activity of RA based on a classification based on the need to change treatment.

Особенностью заявляемого способа является то, что помимо общепринятого показателя ЧПС в качестве биомаркеров используются белок 14-3-3η и кальпротектин плазмы крови, имеющие более высокую чувствительность и специфичность, как для диагностики, так и для оценки активности РА, в том числе при отрицательных результатах по общепринятым диагностическим маркерам. Полученный на основании показателей содержания данных маркеров в плазме крови пациентов расчетный индекс позволяет с высокой чувствительностью и специфичностью дифференцировать устойчивую ремиссию и выход из ремиссии, а также установить необходимость замены части лекарственных препаратов или выбор новой терапевтической стратегии.The peculiarity of the claimed method is that in addition to the generally accepted NPV indicator, the protein 14-3-3η and plasma calprotectin are used as biomarkers, which have a higher sensitivity and specificity both for diagnostics and for assessing the activity of RA, including with negative results for generally accepted diagnostic markers. The calculated index obtained on the basis of the content of these markers in the blood plasma of patients allows with high sensitivity and specificity to differentiate stable remission and exit from remission, as well as to establish the need to replace some drugs or choose a new therapeutic strategy.

Ревматоидный артрит (РА) – это аутоиммунное ревматическое заболевание неизвестной этиологии, характеризующееся развитием хронического эрозивного артрита (синовита) и системным воспалительным поражением внутренних органов. (ДИАГНОСТИКА И ЛЕЧЕНИЕ ОТДЕЛЬНЫХ ФОРМ РЕВМАТИЧЕСКИХ ЗАБОЛЕВАНИЙ С ПОЗИЦИИ ДОКАЗАТЕЛЬНОЙ МЕДИЦИНЫ, Учебно-методическое пособие, ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздрава России, Москва – 2013, стр.6).Rheumatoid arthritis (RA) is an autoimmune rheumatic disease of unknown etiology, characterized by the development of chronic erosive arthritis (synovitis) and systemic inflammatory lesions of internal organs. (DIAGNOSIS AND TREATMENT OF CERTAIN FORMS OF RHEUMATIC DISEASES FROM THE POSITION OF EVIDENCE-BASED MEDICINE, Textbook, State Budgetary Educational Institution of Higher Professional Education Pirogov Russian National Research Medical University, Moscow – 2013, p. 6).

Существуют различные классификации оценки степени активности РА, основанные на различных показателях. There are various classifications for assessing the degree of RA activity based on different indicators.

В 1979 г. принята рабочая классификация РА, адаптированная для практического использования. По клинико-анатомической характеристике РА делится на полиартрит, олигоартрит, моноартрит. Указывается также наличие внесуставных проявлений (узелки, васкулит, нейропатия, плеврит, перикардит, сухой синдром, поражение глаз и др.). По клинико-иммунологической характеристике – серопозитивный и серонегативный. К особым клиническим формам относят: вероятный артрит, синдром Фелти, болезнь Стилла у взрослых. Характеризуя активность РА, выделяют четыре степени: 0 – ремиссия, I – минимальная, II – средняя, III – максимальная. Их определение основывается на совокупности клинических признаков (выраженности экссудативного компонента, числа пораженных суставов, наличия внесуставных проявлений) и лабораторных показателей (СОЭ, С-реактивного белка и др.). Кроме того, в последнее годы выделяют два варианта РА по наличию или отсутствию антител к циклическому цитруллинированному пептиду (АЦЦП). По наличию или отсутствию эрозий суставных поверхностей при рентгенологическом или магнитно-резонансном исследовании РА подразделяется на эрозивный и неэрозивный. РА имеет четыре клинические стадии: очень ранняя (длительность клинической симптоматики менее 6 мес), ранняя (6 мес–1 год), развернутая (более года) и поздняя (более 2 лет). (ДИАГНОСТИКА И ЛЕЧЕНИЕ ОТДЕЛЬНЫХ ФОРМ РЕВМАТИЧЕСКИХ ЗАБОЛЕВАНИЙ С ПОЗИЦИИ ДОКАЗАТЕЛЬНОЙ МЕДИЦИНЫ, Учебно-методическое пособие, ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н. И. Пирогова Минздрава России, Москва – 2013).In 1979, a working classification of RA was adopted, adapted for practical use. According to the clinical and anatomical characteristics, RA is divided into polyarthritis, oligoarthritis, monoarthritis. The presence of extra-articular manifestations (nodules, vasculitis, neuropathy, pleurisy, pericarditis, dry syndrome, eye damage, etc.) is also indicated. According to the clinical and immunological characteristics - seropositive and seronegative. Special clinical forms include: probable arthritis, Felty's syndrome, Still's disease in adults. Characterizing the activity of RA, four degrees are distinguished: 0 - remission, I - minimal, II - average, III - maximum. Their definition is based on a set of clinical signs (severity of the exudative component, number of affected joints, presence of extra-articular manifestations) and laboratory parameters (ESR, C-reactive protein, etc.). In addition, in recent years, two types of RA have been distinguished by the presence or absence of antibodies to cyclic citrullinated peptide (ACP). Based on the presence or absence of articular surface erosions during X-ray or magnetic resonance imaging, RA is divided into erosive and nonerosive. RA has four clinical stages: very early (duration of clinical symptoms less than 6 months), early (6 months–1 year), advanced (more than a year), and late (more than 2 years). (DIAGNOSIS AND TREATMENT OF CERTAIN FORMS OF RHEUMATIC DISEASES FROM THE POSITION OF EVIDENCE-BASED MEDICINE, Textbook, State Budgetary Educational Institution of Higher Professional Education Pirogov Russian National Research Medical University, Ministry of Health of the Russian Federation, Moscow – 2013).

Некоторые авторы различают среднюю и высокую степень активности РА (Каратеев Д.Е., Олюнин Ю. А. О классификации ревматоидного артрита // Научно-практическая ревматология, 2008, №1, стр.13).Some authors distinguish between moderate and high degrees of RA activity (Karateev D.E., Olyunin Yu.A. On the classification of rheumatoid arthritis // Scientific and practical rheumatology, 2008, No. 1, p. 13).

Проведенными исследованиями по научно-медицинской и патентной литературе найдены различные способы как дифференциальной диагностики степени активности ревматоидного артрита, так и оценки степени активности ревматоидного артрита по различным критериям и основаниям.The conducted research on scientific, medical and patent literature has found various methods of both differential diagnosis of the degree of activity of rheumatoid arthritis and assessment of the degree of activity of rheumatoid arthritis according to various criteria and grounds.

На сегодняшний день существует множество способов оценки степени активности РА, однако не все эти методы соответствуют существующим реалиям и используют последние достижения науки в частности новые биомаркеры (индексы) [1], позволяющие оценить активность РА, избегая субъективных методов оценки, неспецифичных диагностических критериев (СОЭ, ЦРБ, РФ), а также без использования определения содержания АНА-антител и АЦЦП-антител, поскольку при применении используемых для лечения РА препаратов они могут снижаться, что далеко не всегда сопровождается уменьшением активности РА.Today, there are many ways to assess the degree of RA activity, but not all of these methods correspond to current realities and use the latest scientific achievements, in particular new biomarkers (indices) [1], which allow assessing RA activity, avoiding subjective assessment methods, non-specific diagnostic criteria (ESR, CRP, RF), and also without using the determination of the content of ANA antibodies and ACPA antibodies, since when using drugs used to treat RA, they can decrease, which is not always accompanied by a decrease in RA activity.

Из уровня техники известны различные способы диагностики и оценки активности ревматоидного артрита (РА).Various methods for diagnosing and assessing the activity of rheumatoid arthritis (RA) are known from the prior art.

Общепринятым стандартом дифференциальной диагностики ревматоидного артрита (РА) с остеоартритом (ОА) является использование диагностических критериев, предложенных Американской коллегией ревматологов в 2010 году (Aletaha D.Et al. 2010. «2010 rheumatoid arthritis classification criteria: an American College of Rheumatology/European League Against Rheumatism collaborative initiative». Ann. Rheum. Dis. 69 (9): 1580-8. Doi: 10. 1136/ard. 2010/138461. PMID 20699241, а также EmeryP. et al. «Early referral recommendation newly diagnosed rheumatoid arthritis: evidence-based development of a clinical guide. Ann. Rheum. Dis. 2002; 61:290-7»; «Руководство по аутоиммунным заболеваниям для врачей общей практики» под редакцией И. Шенфельда и др., СПб, Медкнига, «ЭЛБИ», 2017 г., стр.90-100) и создание на их основе индивидуальных опросников для оценки состояния пациента врачом.The generally accepted standard for differential diagnosis of rheumatoid arthritis (RA) and osteoarthritis (OA) is the use of diagnostic criteria proposed by the American College of Rheumatology in 2010 (Aletaha D.Et al. 2010. “2010 rheumatoid arthritis classification criteria: an American College of Rheumatology/European League Against Rheumatism collaborative initiative”. Ann. Rheum. Dis. 69 (9): 1580-8. Doi: 10. 1136/ard. 2010/138461. PMID 20699241, as well as Emery P. et al. “Early referral recommendation newly diagnosed rheumatoid arthritis: evidence-based development of a clinical guide. Ann. Rheum. Dis. 2002; 61:290-7”; “General Practitioner’s Guide to Autoimmune Diseases” edited by I. Shenfeld et al., St. Petersburg, Medkniga, "ELBI", 2017, pp. 90-100) and the creation on their basis of individual questionnaires for assessing the patient's condition by a doctor.

Однако, описанный выше способ дифференциальной диагностики ревматоидного артрита от остеоартрита с помощью опросника и определения содержания факторов неспецифического воспаления (СОЭ, ЦРБ, РФ), имеет ряд недостатков, связанных с тем, что используемые в опроснике критерии крайне субъективны, а СОЭ, ЦРБ и РФ не являются специфичными только для ревматоидного артрита и могут давать ложноположительный результат при любых заболеваниях, сопровождающихся воспалительными процессами различного происхождения и локализации, не связанными с ревматоидным артритом, например, ОРВИ (острая респираторная вирусная инфекция), инфаркты, сифилис и даже у 5 % относительно здоровых людей положителен РФ, а также и при других аутоиммунных заболеваниях, например, псориазе или системной красной волчанке (Руководство по аутоиммунным заболеваниям для врачей общей практики / Под ред. И. Шенфельда, П.Л. Мерони, Л.П. Чурилова, пер. с англ. Л.П. Чурилова. – СПб.: Медкнига «ЭЛБИ», 2017. С. 96-97).However, the above-described method of differential diagnosis of rheumatoid arthritis from osteoarthritis using a questionnaire and determination of the content of non-specific inflammation factors (ESR, CRH, RF) has a number of disadvantages associated with the fact that the criteria used in the questionnaire are extremely subjective, and ESR, CRH and RF are not specific only to rheumatoid arthritis and can give a false positive result in any diseases accompanied by inflammatory processes of various origins and localizations not associated with rheumatoid arthritis, for example, ARVI (acute respiratory viral infection), infarctions, syphilis, and even 5% of relatively healthy people have a positive RF, as well as in other autoimmune diseases, such as psoriasis or systemic lupus erythematosus (Guide to Autoimmune Diseases for General Practitioners / Edited by I. Shenfeld, P.L. Meroni, L.P. Churilov, translated from English by L.P. Churilov. – SPb.: Medkniga "ELBI", 2017. P. 96-97).

Например, из уровня техники известны методы измерения и мониторинга активности воспалительных аутоиммунных заболеваний на примере ревматоидного артрита, основанный на математическом подборе и оценке эффективности применения комбинаций биомаркеров для последующего создания диагностических панелей не только для ревматоидного артрита, а для любых аутоиммунных заболеваний, сопровождающихся воспалением (патент США, публ. US № 2011/0137851 А1, дата публ. 09 июнь 2011, правообладатель CRESCENDO BIOSCIENCE, South San Francisco, CA (US); OKLAHOMA MEDICAL RESEARCH FOUNDATION, Oklahoma City, OK (US)). Однако данный метод не является диагностическим и полезен только с целью последующего использования для подбора оптимальных панелей биомаркеров и создания на их основе диагностических наборов. Нет конкретных диагностических интервалов, которые бы говорили о наличии ли отсутствии диагноза или об активности заболевания.For example, the prior art discloses methods for measuring and monitoring the activity of inflammatory autoimmune diseases using rheumatoid arthritis as an example, based on the mathematical selection and evaluation of the effectiveness of using combinations of biomarkers for the subsequent creation of diagnostic panels not only for rheumatoid arthritis, but for any autoimmune diseases accompanied by inflammation (US patent, published US No. 2011/0137851 A1, published date June 09, 2011, copyright holder CRESCENDO BIOSCIENCE, South San Francisco, CA (US); OKLAHOMA MEDICAL RESEARCH FOUNDATION, Oklahoma City, OK (US)). However, this method is not diagnostic and is useful only for subsequent use in selecting optimal biomarker panels and creating diagnostic kits based on them. There are no specific diagnostic intervals that would indicate the presence or absence of a diagnosis or the activity of the disease.

Из уровня техники также известен способ диагностики и оценки активности ревматоидного артрита, основанный на определения аутоантител к цитрулинированному белку 14-3-3η или его фрагменту (патент на изобретение JP 20190014527, 2019.01.30, опубл. 30 марта 2019). Недостатками данных способах является необходимость синтеза целого ряда высокоспецифичных биологических молекул, с последующей разработкой набора на их основе. Данный процесс требует больших материальных и временных затрат. Кроме того, в описываемых способах также отсутствуют четкие диагностические интервалы, характеризующие ту или иную степень активности РА.The prior art also includes a method for diagnosing and assessing the activity of rheumatoid arthritis based on the determination of autoantibodies to the citrullinated protein 14-3-3η or its fragment (patent for invention JP 20190014527, 2019.01.30, published March 30, 2019). The disadvantages of these methods are the need to synthesize a number of highly specific biological molecules, followed by the development of a set based on them. This process requires large material and time costs. In addition, the described methods also lack clear diagnostic intervals characterizing a particular degree of RA activity.

Известен способ прогнозирования активности заболевания у пациентов с ревматоидном артритом по патенту на изобретение № RU 2790525, по заявке № 2022101739 от 25.01.2022 г., выданный на имя Федерального государственного бюджетного научного учреждения «Научно-исследовательский институт клинической и экспериментальной ревматологии имени А.Б. Зборовского» (RU), заключающийся в определении уровня чемерина в сыворотке крови и в зависимости концентрации чемерина прогнозируют степень активности заболевания. Содержание чемерина не является специфичным для ревматоидного артрита, поскольку известно, что его содержание повышено при раке яичников и в синовиальной жидкости пациентов при любых артритах, которые могут не иметь ничего общего с аутоиммунной природой ревматоидного артрита. Кроме того, данный хемоаттрактант основной ролью имеет активацию дифференцировки преадипоцитов в адипоциты, т.е. его содержание будет сильно зависеть от липидного обмена и может быть критично повышено при избыточной массе тела, что никак не связано с дегенеративными процессами в костях.A method for predicting disease activity in patients with rheumatoid arthritis is known under patent for invention No. RU 2790525, under application No. 2022101739 dated January 25, 2022, issued in the name of the Federal State Budgetary Scientific Institution "A.B. Zborovsky Research Institute of Clinical and Experimental Rheumatology" (RU), which consists in determining the level of chemerin in the blood serum and, depending on the concentration of chemerin, predicting the degree of disease activity. The content of chemerin is not specific for rheumatoid arthritis, since its content is known to be elevated in ovarian cancer and in the synovial fluid of patients with any arthritis, which may have nothing to do with the autoimmune nature of rheumatoid arthritis. In addition, this chemoattractant has the main role in activating the differentiation of preadipocytes into adipocytes, i.e. its content will strongly depend on lipid metabolism and can be critically increased in cases of excess body weight, which is in no way associated with degenerative processes in the bones.

Из уровня техники известен способ диагностики ревматоидного артрита по патенту на изобретение № RU 2 456 611, по заявке № 2011107615/15 от 28 февраля 2011, выданному на имя ГВОУ ВПО «Ростовский государственный медицинский университет» МЗ РФ, заключающийся в анализе содержания процента различных популяций цитотоксических лимфоцитов в периферической крови и последующим вычислением на его основе индекса степени активности РА. Особенностью данного способа является использование расчетного индекса с использованием получаемых лабораторных данных. Данный способ был выбран в качестве прототипа, так как в его основе лежит вычисление индекса степени активности РА на основе выведенной формулы с использованием биохимических показателей крови. Недостатком данного способа является то, что с его помощью можно выделить только среднюю и высокую степени активности ревматоидного артрита без возможности более дробного деления, а также отсутствие возможности принятия решения о коррекции или смене лечения на основании предлагаемого расчетного индекса. Кроме того, для определения именно Т-цитотоксических лимфоцитов необходимо проделать длительную процедуру, основанную на определении ряда поверхностных антигенов данных клеток для их дифференцировки от других представителей Т-клеточной линии. Для проведения данной процедуры требуется не только время, но и большое количество дорогостоящих реактивов, поставки которых крайне нестабильны. Проведение подобного анализа доступно только высококвалифицированным специалистам, которых невозможно набрать для работы во все диагностические лаборатории, отвечающие за проведение исследований по диагностике и оценки активности РА. A method for diagnosing rheumatoid arthritis is known from the prior art under patent for invention No. RU 2 456 611, under application No. 2011107615/15 dated February 28, 2011, issued in the name of the Rostov State Medical University of the Ministry of Health of the Russian Federation, which consists in analyzing the percentage of various populations of cytotoxic lymphocytes in peripheral blood and then calculating the RA activity index based on it . A feature of this method is the use of a calculated index using the obtained laboratory data. This method was chosen as a prototype , since it is based on calculating the RA activity index based on a derived formula using biochemical blood parameters. A disadvantage of this method is that it can only identify medium and high degrees of rheumatoid arthritis activity without the possibility of a more detailed division, as well as the lack of the ability to make a decision on correction or change of treatment based on the proposed calculated index. In addition, to determine specifically T-cytotoxic lymphocytes, it is necessary to perform a lengthy procedure based on the determination of a number of surface antigens of these cells to differentiate them from other representatives of the T-cell line. This procedure requires not only time, but also a large number of expensive reagents, the supply of which is extremely unstable. Such an analysis is available only to highly qualified specialists, who cannot be recruited to work in all diagnostic laboratories responsible for conducting research on the diagnosis and assessment of RA activity.

Проблемой, на решение которой направлено данное изобретение, является создание более точного, быстрого, экономически выгодного и не требующего дополнительного обучения врачей-лаборантов способа оценки степени активности РА с учетом новых биохимических маркеров (показателей) крови, позволяющего не только выделить более дробную степень активности РА на основе нового расчетного коэффициента, но и с учетом его конкретных количественных показателей, принять решение о коррекции или смене лечения. The problem that this invention is aimed at solving is the creation of a more accurate, fast, cost-effective method for assessing the degree of RA activity, taking into account new biochemical markers (indicators) of the blood, which does not require additional training of laboratory doctors, allowing not only to identify a more fractional degree of RA activity based on a new calculation coefficient, but also, taking into account its specific quantitative indicators, to make a decision on correction or change of treatment.

Техническим результатом заявленного изобретения является возможность корректировки или смены лечения у пациентов с РА на основе оценки расчетного коэффициента степени активности РА (определенном), основанном на сочетанном использовании показателей числа припухших суставов и содержания белка 14-3-3η и кальпротектина плазмы крови.The technical result of the claimed invention is the possibility of adjusting or changing treatment in patients with RA based on an assessment of the calculated coefficient of the degree of RA activity (defined), based on the combined use of indicators of the number of swollen joints and the content of protein 14-3-3η and calprotectin in blood plasma.

Указанный технический результат достигается тем, что у пациентов определяют число припухших суставов (ЧПС), в плазме крови определяют содержание белка 14-3-3η и кальпротектина и рассчитывают коэффициент оценки активности (КОА) воспалительного процесса при ревматоидном артрите (КОА) по формуле КОА= 0.0036 ⋅ M1 + 0.137 ⋅ M2 + 0.14 , где М1 – содержание белка 14-3-3η в плазме крови, М2 – содержание кальпротектина в плазме крови, а ЧПС – число припухших суставов, и при выполнения условия о КОА > 0.99 диагностируют обострение, при выполнении условия показателях КОА в пределах от 0.71> КОА< до 0.99 диагностируют выход из ремиссии, при выполнении условия КОА <0.71 диагносцируют устойчивую ремиссию.The specified technical result is achieved by determining the number of swollen joints (NSJ) in patients, determining the content of 14-3-3η protein and calprotectin in blood plasma, and calculating the activity assessment coefficient (AAC) of the inflammatory process in rheumatoid arthritis (AAC) using the formula AAC = 0.0036 ⋅ M1 + 0.137 ⋅ M2 + 0.14 , where M1 is the content of 14-3-3η protein in blood plasma, M2 is the content of calprotectin in blood plasma, and NPS is the number of swollen joints, and if the condition of KOA> 0.99 is met, an exacerbation is diagnosed, if the condition of KOA indicators within the range from 0.71>KOA< to 0.99 is met, an exit from remission is diagnosed, if the condition of KOA <0.71 is met, stable remission is diagnosed.

Заявители провели собственное исследование вышеописанных биомаркеров. Для этого проводилось всестороннее обследование пациентов на этапе исследования содержания используемых маркеров рандомно исследовались все пациенты, только потом их распределяли по группам, в соответствии с классификацией РА на основе смены лечения, которую предоставил врач, который вел пациентов. Сопоставление экспериментальных данных и классификации врача совпали на 97.3%. Определение референсов содержания 14-3-3η и кальпротектина в плазме крови всех градаций РА и контрольной группы позволило улучшить диагностику РА на ранних стадиях и стратифицировать пациентов в отношении прогноза, а также выбора терапии. Полученные результаты исследования, а именно использование комбинации содержания 14-3-3η и кальпротектина в плазме крови для создания диагностического индекса были озвучены в литературе (Кальпротектин в плазме крови как новый биомаркер в оценке активности ревматоидного артрита, Королькова А.А., Хижа В.В., Козлова Д.И., Маслянский А.Л.. , Вавилова Т.В., Бюллетень сибирской медицины. 2022; 21 (3): 59–66, Королькова А. А.; Белки 14-3-3η и кальпротектин плазмы крови как новые биомаркеры при оценке активности ревматоидного артрита, Козлова Д. И., Маслянский А. Л., тезисы Алмазовскоий молодежный медицинский форум «Трансляционная медицина» 12-15 мая 2021 года, Научно-практический рецензируемый медицинский журнал, Приложение №2, с. 250).The applicants conducted their own study of the above-described biomarkers. For this purpose, a comprehensive examination of patients was conducted at the stage of studying the content of the markers used; all patients were randomly examined, and only then were they distributed into groups in accordance with the classification of RA based on the change in treatment provided by the doctor who was treating the patients. Comparison of the experimental data and the doctor's classification coincided by 97.3%. Determination of references for the content of 14-3-3η and calprotectin in the blood plasma of all RA grades and the control group made it possible to improve the diagnosis of RA at early stages and stratify patients with respect to prognosis and choice of therapy. The obtained results of the study, namely the use of a combination of 14-3-3η and calprotectin content in blood plasma to create a diagnostic index, were reported in the literature (Calprotectin in blood plasma as a new biomarker in assessing the activity of rheumatoid arthritis, Korolkova A.A., Khizha V.V., Kozlova D.I., Maslyansky A.L., Vavilova T.V., Bulletin of Siberian Medicine. 2022; 21 (3): 59–66, Korolkova A.A.; 14-3-3η proteins and calprotectin in blood plasma as new biomarkers in assessing the activity of rheumatoid arthritis, Kozlova D.I., Maslyansky A.L., abstracts of the Almazovsky Youth Medical Forum "Translational Medicine" May 12-15, 2021, Scientific and Practical peer-reviewed medical journal, Supplement No. 2, p. 250).

На основе проведенных исследований Заявители разработали формулу, которая и легла в основу заявляемого способа оценки ревматоидного артрита. В заявляемом способе помимо использования содержания 14-3-3η и кальпротектина в плазме крови используют показатель числа припухших суставов (ЧПС). Именно такое сочетанное применение различных показателей позволяет сопоставить наблюдаемые изменения в суставах с развитием патологии на молекулярном уровне, и максимально точно определить степень выраженности данных процессов, что открывает возможность своевременной корректировки стратегии лечения для достижения максимального результата, выражающегося в замедлении процесса разрушения суставов или даже ремиссии. Это безусловно улучшает качество жизни пациента и снижает нагрузку на фонд ОМС, исключая назначение малоэффективных диагностических исследований и лекарственных препаратов.Based on the conducted research, the Applicants developed a formula that formed the basis of the claimed method for assessing rheumatoid arthritis. In the claimed method, in addition to using the content of 14-3-3η and calprotectin in the blood plasma, the index of the number of swollen joints (NSJ) is used. It is this combined use of various indicators that allows us to compare the observed changes in the joints with the development of pathology at the molecular level, and to determine the degree of severity of these processes as accurately as possible, which opens up the possibility of timely adjustment of the treatment strategy to achieve the maximum result, expressed in slowing down the process of joint destruction or even remission. This certainly improves the patient's quality of life and reduces the burden on the compulsory medical insurance fund, excluding the prescription of ineffective diagnostic tests and drugs.

Таким образом, из уровня техники не выявлен способ оценки ревматоидного артрита, основанный на использовании расчетного индекса по формуле КОА= 0.0036M1 + 0.137M2 + 0.14 , где в качестве биомаркеров используют показатели белка 14-3-3η и кальпротектина плазмы крови, а также показатель числа припухших суставов (ЧПС), поэтому заявленное изобретение соответствует критерию «новизна».Thus, the state of the art has not revealed a method for assessing rheumatoid arthritis based on the use of a calculated index according to the formula KOA = 0.0036M1 + 0.137M2 + 0.14 , where the indicators of protein 14-3-3η and plasma calprotectin, as well as the indicator of the number of swollen joints (NSJ), are used as biomarkers, therefore the claimed invention meets the criterion of “novelty”.

Кроме того, влияние существенных признаков заявленного технического решения на достижение заявленного технического результата явным образом не следует из известного уровня техники, следовательно, изобретение соответствует критерию «изобретательский уровень». Заявленный способ может быть использован в стационарном и амбулаторном лечении пациентов с заявленной формой патологии, следовательно, в связи с этим он соответствует критерию «промышленная применимость».In addition, the influence of the essential features of the claimed technical solution on achieving the claimed technical result does not clearly follow from the known level of technology, therefore, the invention meets the criterion of "inventive step". The claimed method can be used in inpatient and outpatient treatment of patients with the claimed form of pathology, therefore, in this regard, it meets the criterion of "industrial applicability".

Способ осуществляется следующим образом. Врач-ревматолог проводит полное обследование пациента в соответствии с клиническими рекомендациями. В ходе обследования определяется в том числе число припухших суставов – ЧПС (если таковые имеются) у каждого обследованного пациента. Данный параметр необходим для последующего расчета КОА. В процедурном кабинете медицинского учреждения (поликлиники, стационара или специализированной медицинской диагностической лаборатории) производят забор 3 мл цельной венозной крови в вакуумные пробирки с напылением Li-гепарина у пациентов всех исследуемых групп. Забранные в пробирки с Li-гепарином образцы цельной венозной крови пациентов помещают в стандартную лабораторную центрифугу и осуществляют их центрифугирование при 20000 × g при комнатной температуре в течение 15 минут, в результате чего в пробирках образуется осадок из форменных элементов крови и надосадочной жидкости (супернатанта), представляющая собой гепаринизированную плазму крови пациента. Образцы плазмы крови центрифугируют повторно при 1000 × g и температуре 2-8°C, затем отбирают по 1 мл в пробирки типа Эппендорф, после чего пробирки типа Эппендорф замораживают и хранят до проведения исследования в низкотемпературном холодильнике (-80°С). Перед началом исследования пробирки типа Эппендорф размораживают при комнатной температуре в течение ночи. Выбор Li-гепарина в качестве антикоагулянта для получения гепаринизированной плазмы крови пациента объясняется тем, что его использование оптимально проходит для определения содержания исследуемых биомаркеров. Определение содержания 14-3-3η и кальпротектина в пробах гепаринизированной плазмы крови пациентов проводится в соответствии с протоколами коммерческих КИТов (Human 14-3-3 Eta (YWHAH) ELISA Kit, Abbexa, UK; Human Calprotectin L1/S100-A8/A9 Complex ELISA, Thermo Fisher). Планшет со внесенными реагентами и пробами помещают в иммуноферментный анализатор и при длине волны 450 нм определяют оптическую плотность. Данные оптической плотности исследуемых проб сопоставляются с приложенными к КИТам калибровочными значениями, выстроенными по градиенту содержания рекомбинантных 14-3-3η и кальпротектина человека, что позволяет по оптической плотности определить содержание каждого измаркеров в каждом образце гепаринизированной плазмы крови пациентов. Далее используя сведения о ЧПС, полученные в ходе первичного обследования и данные лабораторных исследований содержания 14-3-3η и кальпротектина в плазме крови, для каждого пациента рассчитывается КОА. Значения содержания 14-3-3η и кальпротектина подставляют в формулу КОА= 0.0036 ⋅ M1 + 0.137 ⋅ M2 + 0.14 , где М1 – экспериментально полученное содержание 14-3-3η в плазме крови конкретного пациента, а М2 – экспериментально полученное содержание кальпротектина в плазме крови конкретного пациента. Получаем значение КОА, которое соотносим с референсами и шкалой активности заболевания на основе необходимости смены лечения, определяя тем самым в какую группу попал конкретный пациент. При КОА > 0.99 диагностируют обострение, при выполнении условия показателях КОА в пределах от 0.71> КОА< до 0.99 диагностируют выход из ремиссии, при выполнении условия КОА <0.71 диагносцируют устойчивую ремиссию.The method is implemented as follows. A rheumatologist conducts a full examination of the patient in accordance with clinical recommendations. During the examination, the number of swollen joints - NSP (if any) is determined in each examined patient. This parameter is necessary for the subsequent calculation of the KOA. In the procedure room of a medical institution (outpatient clinic, hospital or specialized medical diagnostic laboratory), 3 ml of whole venous blood is collected in vacuum tubes coated with Li-heparin from patients of all study groups. Samples of whole venous blood of patients collected in tubes with Li-heparin are placed in a standard laboratory centrifuge and centrifuged at 20,000 × g at room temperature for 15 minutes, as a result of which a sediment of formed elements of the blood and supernatant (supernatant) is formed in the tubes, which is the heparinized plasma of the patient's blood. Blood plasma samples are centrifuged again at 1000 × g and a temperature of 2-8 °C, then 1 ml is collected into Eppendorf tubes, after which the Eppendorf tubes are frozen and stored in a low-temperature refrigerator (-80 °C) until the study. Before the study, Eppendorf tubes are defrosted at room temperature overnight. The choice of Li-heparin as an anticoagulant for obtaining heparinized patient blood plasma is explained by the fact that it is optimal for determining the content of the studied biomarkers. Determination of 14-3-3η and calprotectin in heparinized patient plasma samples is carried out in accordance with the protocols of commercial KITs (Human 14-3-3 Eta (YWHAH) ELISA Kit, Abbexa, UK; Human Calprotectin L1 / S100-A8 / A9 Complex ELISA, Thermo Fisher). The plate with the added reagents and samples is placed in an enzyme immunoassay analyzer and the optical density is determined at a wavelength of 450 nm. The optical density data of the studied samples are compared with the calibration values attached to the KITs, built along the gradient of the content of recombinant 14-3-3η and human calprotectin, which makes it possible to determine the content of each marker in each sample of heparinized blood plasma of patients by optical density. Then, using the information on the NPV obtained during the initial examination and the data from laboratory studies of the content of 14-3-3η and calprotectin in blood plasma, the KOA is calculated for each patient. The values of 14-3-3η and calprotectin are substituted into the formula KOA = 0.0036 ⋅ M1 + 0.137 ⋅ M2 + 0.14 , where M1 is the experimentally obtained content of 14-3-3η in the blood plasma of a specific patient, and M2 is the experimentally obtained content of calprotectin in the blood plasma of a specific patient. We obtain the KOA value, which we correlate with the references and the disease activity scale based on the need to change treatment, thereby determining which group a specific patient falls into. When KOA> 0.99, an exacerbation is diagnosed, when the condition of KOA indicators within the range from 0.71>KOA< to 0.99 is met, an exit from remission is diagnosed, when the condition of KOA <0.71 is met, stable remission is diagnosed.

Способ поясняется следующими примерами.The method is illustrated by the following examples.

Пациент С.А.П., 69 лет.Patient S.A.P., 69 years old.

Предварительный диагноз – ревматоидный артрит без определения степени активности заболевания. Результаты стандартных исследований: СОЭ – 47; РФ – положительно, ЦРБ – положительно, АЦЦП – положительно; DAS28 – 5.5. Анамнез: жалобы на боли в суставах, 9 припухших суставов. Проведён анализ гепаринизированной плазмы крови пациента согласно описанному выше методу, в результате которого получены следующие показатели: 14-3-3η – 72,05 пг/мл; кальпротектин – 3,01 пг/мл. При расчете использовали формулу вида:Preliminary diagnosis: rheumatoid arthritis without determining the degree of disease activity. Results of standard studies: ESR - 47; RF - positive, CRP - positive, ACPA - positive; DAS28 - 5.5. Anamnesis: complaints of joint pain, 9 swollen joints. The patient's heparinized blood plasma was analyzed according to the method described above, which yielded the following indicators: 14-3-3η - 72.05 pg / ml; calprotectin - 3.01 pg / ml. The following formula was used for the calculation:

КОА= 0.0036 ⋅ M1 + 0.137 ⋅ M2 + 0.14 (далее – формула);KOA= 0.0036 ⋅ M1 + 0.137 ⋅ M2 + 0.14 (hereinafter referred to as the formula);

КОА_roc ≥ 0.88 соответствует активности 3 на основе смены лечения (ВРАЧ) и по DAS28 (DAS); KOA _roc ≥ 0.88 corresponds to activity 3 based on treatment change (DOCTOR) and according to DAS28 (DAS);

0.69 < КОА_roc < 0.88 соответствует активности 2 на основе смены лечения (ВРАЧ) и по DAS28 (DAS); 0.69 < KOA _roc < 0.88 corresponds to activity 2 based on treatment change (DOCTOR) and according to DAS28 (DAS);

0.52 < КОА_roc < 0.69 соответствует активности 1 на основе смены лечения (ВРАЧ); 0.52 < KOA _roc < 0.69 corresponds to activity 1 based on treatment change (DOCTOR);

КОА_roc ≤ 0.52 соответствует активности 0 на основе смены лечения (ВРАЧ). A KOA _roc ≤ 0.52 corresponds to an activity of 0 based on a change in treatment (DOCTOR).

По формуле для данного пациента получено значение КОА равное 1,09, что соответствует активность 3 на основе смены лечения. Данному пациенту было диагностировано обострение РА и проведена смена системы лечения.The formula for this patient yielded a KOA value of 1.09, which corresponds to activity 3 based on treatment change. This patient was diagnosed with an exacerbation of RA and a change in treatment system was performed.

Пациентка Л.Н.В., 67 лет.Patient L.N.V., 67 years old.

Предварительный диагноз – под вопросом стабилизация состояния РА. Результаты стандартных исследований: СОЭ – 23,2; РФ – отрицательно; ЦРБ – отрицательно; АЦЦП – отрицательно; DAS28 – 2.5. Анамнез: жалобы на боли в коленных суставах, 3 припухших сустава. Проведён анализ гепаринизированной плазмы крови пациента согласно описанному выше способу, в результате которого получены следующие показатели: 14-3-3η – 59,57 пг/мл; кальпротектин – 2,13 пг/мл.Preliminary diagnosis: stabilization of RA is questionable. Results of standard studies: ESR - 23.2; RF - negative; CRH - negative; ACPA - negative; DAS28 - 2.5. Anamnesis: complaints of pain in the knee joints, 3 swollen joints. An analysis of the patient's heparinized blood plasma was performed according to the method described above, which yielded the following indicators: 14-3-3η - 59.57 pg/ml; calprotectin - 2.13 pg/ml.

По формуле для данного пациента получено значение КОА равное 0,75, что соответствует активности 2 на основе смены лечения. Данному пациенту было рекомендовано продолжать лечение по прежней схеме, поскольку объективно состояние приближается к ремиссии.The formula for this patient yielded a COA value of 0.75, which corresponds to activity 2 based on the change in treatment. This patient was advised to continue treatment according to the previous scheme, since the condition was objectively approaching remission.

Пациент К.О.У., 55 лет.Patient K.O.U., 55 years old.

Предварительный диагноз – под вопросом ремиссия ревматоидного артрита. Результаты стандартных исследований: СОЭ – 8; РФ – отрицательно; ЦРБ – отрицательно; DAS28 – 3,27.Preliminary diagnosis: remission of rheumatoid arthritis is questionable. Results of standard studies: ESR – 8; RF – negative; CRP – negative; DAS28 – 3.27.

Анамнез: жалобна момент обращения не зарегистрировано, один сустав с небольшой припухлостью, что не может быть классифицировано, как истинно припухший сустав. Проведён анализ гепаринизированной плазмы крови пациента согласно описанному выше методу, в результате которого получены следующие показатели: 14-3-3η – 59,93 пг/мл; кальпротектин – 2,55 пг/мл.Anamnesis: no complaints were registered at the time of treatment, one joint with a slight swelling, which cannot be classified as a truly swollen joint. The patient's heparinized blood plasma was analyzed according to the method described above, which yielded the following indicators: 14-3-3η - 59.93 pg/ml; calprotectin - 2.55 pg/ml.

По формуле для данного пациента получено значение КОА равное 0,57, что соответствует активности 1 на основе смены лечения. Данному пациенту было рекомендовано продолжать лечение по прежней схеме, поскольку для поддержания ремиссии.The formula for this patient yielded a KOA value of 0.57, which corresponds to activity 1 based on the change in treatment. This patient was advised to continue treatment according to the previous regimen, since remission was maintained.

Пациентка М.О.М., 55 лет.Patient M.O.M., 55 years old.

Предварительный диагноз – под вопросом остеоартрит или ранняя стадия ревматоидного артрита. Результаты стандартных исследований: СОЭ – 2,5; РФ – отрицательно; ЦРБ – отрицательно; АЦЦП – отрицательно. Анамнез: поражений суставов нет. Проведён анализ гепаринизированной плазмы крови пациента согласно описанному выше методу, в результате которого получены следующие показатели: 14-3-3η – 7,43 пг/мл; кальпротектин – 1,88 пг/мл.Preliminary diagnosis: osteoarthritis or early stage of rheumatoid arthritis is questionable. Results of standard studies: ESR - 2.5; RF - negative; CRP - negative; ACPA - negative. History: no joint damage. Analysis of the patient's heparinized blood plasma was performed according to the method described above, which yielded the following indicators: 14-3-3η - 7.43 pg/ml; calprotectin - 1.88 pg/ml.

По формуле для данного пациента получено значение КОА равное 0,28, что соответствует активности 0 на основе смены лечения. Данный пациент был отнесен к группе контроля. Лечение не требуется.The formula for this patient yielded a KOA value of 0.28, which corresponds to an activity of 0 based on the change in treatment. This patient was assigned to the control group. No treatment required.

Заявителями проведено исследование, показавшее, что исследованные маркеры плазмы крови эффективны для диагностики РА и оценки его активности. Именно Заявитель ( авторы) предложили комбинацию 14-3-3η и кальпротектина для разработки нового диагностического коэффициента. The applicants conducted a study showing that the studied blood plasma markers are effective for diagnosing RA and assessing its activity. It was the applicant (authors) who proposed a combination of 14-3-3η and calprotectin to develop a new diagnostic coefficient.

Таким образом, заявляемый способ позволяет точно, быстро производить оценку активности ревматоидного артрита и подразделять его на стадии на основе смены лечения, тогда как стандартные индексы и методы не дают возможности производить подобное подразделение. Достоинствами данного метода так же является его малая инвазивность, использование небольшого количества тестируемого образца гепаринизированной плазмы крови – 10 мкл, простота и удобство использования, как при скрининговых обследованиях большого количества людей, так и при обследовании пациентов в стационаре. Thus, the claimed method allows for accurate, rapid assessment of rheumatoid arthritis activity and subdivision into stages based on treatment changes, whereas standard indices and methods do not allow for such subdivision. The advantages of this method also include its low invasiveness, the use of a small amount of heparinized blood plasma sample being tested – 10 μl, simplicity and ease of use, both in screening examinations of a large number of people and in examining patients in a hospital.

На настоящий момент аналогов по точности оценки активности РА в мире нет, и ревматологи очень заинтересованы в получении инструмента в виде диагностического маркера, который бы позволял судить об активности РА и необходимости менять или продолжать выбранную терапевтическую стратегию. Заявленный способ позволяет осуществлять персонализированный подход к оценке активности РА для подбора эффективной стратегии лечения с целью улучшения качества жизни пациентов, а также снижения затрат ОМС (лекарства стоят очень дорого и применяются по полгода, пока ревматологи на основе отсутствия улучшений решат сменить препараты). Рассчитанный на основе заявленного способа коэффициент показывает насколько эффективна назначенная врачом терапия, что позволяет оперативно решить нужно ли менять лекарство в конкретный момент времени, в том числе и на перспективу.At present, there are no analogues in the world in terms of the accuracy of assessing RA activity, and rheumatologists are very interested in obtaining a tool in the form of a diagnostic marker that would allow judging the activity of RA and the need to change or continue the selected therapeutic strategy. The claimed method allows for a personalized approach to assessing RA activity to select an effective treatment strategy in order to improve the quality of life of patients, as well as reduce compulsory medical insurance costs (medicines are very expensive and are used for six months until rheumatologists decide to change the drugs based on the lack of improvement). The coefficient calculated on the basis of the claimed method shows how effective the therapy prescribed by the doctor is, which allows you to quickly decide whether to change the drug at a specific point in time, including for the future.

Заявляемый способ позволяет использовать стандартное оборудование любой диагностической лаборатории как на базе государственных и частных клиник, так и на базе специализированных клинико-диагностических лабораторий.The claimed method allows the use of standard equipment of any diagnostic laboratory, both at state and private clinics, and at specialized clinical diagnostic laboratories.

ИсточникиSources

1. «Новые лабораторные биомаркеры ревматоидного артрита», Д.А. Дибров, Научно-практическая ревматология. 2021;59(2):201-207.1. "New laboratory biomarkers of rheumatoid arthritis", D.A. Dibrov, Scientific and Practical Rheumatology. 2021;59(2):201-207.

Claims

A method for assessing the activity of rheumatoid arthritis, including taking blood from patients and determining the number of swollen joints, characterized by the fact that the content of protein 14-3-3η, pg/ml, and calprotectin, pg/ml, are determined in the blood plasma, and the coefficient of assessing the activity of the inflammatory process in rheumatoid arthritis (COA) is calculated using the formula COA: COA = 0.0036M1 + 0.137M2 + 0.14 , Where

M1 – content of protein 14-3-3η in blood plasma;

M2 – the content of calprotectin in blood plasma;

SJN – number of swollen joints;

and with an AOA of more than 0.99, an exacerbation is diagnosed, with an AOA from 0.71 to 0.99, low activity of rheumatoid arthritis is diagnosed, with an AOA from 0.28 to 0.71, remission is diagnosed.