RU2843185C1 - Способ оценки противолейкозной активности препаратов - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к области ветеринарной иммунологии, а именно к способу оценки противолейкозной активности препаратов. Способ оценки противолейкозной активности препаратов, включающий выделение культуры клеток, внесение в поддерживающую среду вируссодержащей суспензии, ее титрование в 96-луночных иммунологических планшетах методом двукратных последовательных разведений, внесение в опытные ряды лунок испытуемых препаратов в разной концентрации, инкубацию планшетов в термостате, определение титра вируса и коэффициента ингибирования вируса, отличающийся тем, что в поддерживающую среду вносят культуру лимфоцитов из свежеполученной периферической крови от больной лейкозом коровы, инкубацию осуществляют 24 часа, с помощью реакции иммунофлюоресценции по 4-крестовой системе устанавливают минимальную ингибирующую концентрацию препарата по титру вируса, а для определения коэффициента ингибирования (Ки) полученные значения титров переводят в логарифмы с основанием 2, высокую противолейкозную активность препарата отмечают при значениях Ки от 100 до 63,5, среднюю - от 36,3 до 63,49, низкую - при значениях до 36,29. Изобретение позволяет проводить оперативное одновременное тестирование большого количества химических соединений и имеет высокую достоверность. 4 табл., 3 пр.

Description

Изобретение относится к ветеринарной иммунологии, а именно к лабораторным методам исследований, и может найти свое применение для прогнозирования профилактической и/или иммунотерапевтической эффективности различных химических соединений при лейкозной инфекции in vitro.

Вирус лейкоза крупного рогатого скота (ВЛКРС) представляет собой онкогенный ретровирус, относящийся к роду Deltaretrovirus (семейство Retroviridae), который поражает преимущественно В-лимфоциты и вызывает персистирующую инфекцию с различными клиническими исходами у крупного рогатого скота. Болезнь широко распространена во всем мире, нанося значительные экономические потери, связанные с сокращением производства молока, невозможностью экспорта животных, семени и эмбрионов [Bartlett P.C., Ruggiero V.J., Hutchinson H.C., Droscha C.J. et al. Current developments in the epidemiology and control of enzootic bovine leukosis as caused by bovine leukemia virus // Pathogens. - 2020. - Vol. 9(12). - P. 1058.]. В последние годы появляется все больше свидетельств о присутствии вируса у людей, подтверждая гипотезу о том, что ВЛКРС является зоонозным агентом [Olaya-Galán N.N., Blume S., Tong K., Shen H., Gutierrez M.F., Buehring G.C. In vitro susceptibility of human cell lines infection by bovine leukemia virus // Front. Microbiol. - 2022. - Vol. 13. - A. 793348].

Из-за отсутствия эффективных методов лечения и вакцинации борьба с лейкозной инфекцией основана на профилактических мерах, направленных на снижение передачи вируса, которые не всегда дают положительный результат, так как требуют огромных экономических затрат, необходимых для их реализации [Rodríguez S.M., Florins A., Gillet N., de Brogniez A. et al. Preventive and therapeutic strategies for bovine leukemia virus: lessons for HTLV // Viruses. 2011. 3(7). P. 1210-48.]. Поэтому актуальным направлением исследований является поиск новых химических соединений, эффективно снижающих уровень противовирусной нагрузки при инфекции ВЛКРС, а также методов контроля их эффективности.

Известен способ определения чувствительности опухолевых лимфоцитов к химиопрепаратам [Кравченко Д.В., Свирновский А.И. Хронический лимфоцитарный лейкоз: клиника, диагностика, лечение. - Гомель: ГУ «РНПЦ РМ и ЭЧ», 2017. - С. 55-62]. Метод предназначен для мониторинга в процессе лечения формирования лекарственной резистентности клеток к отдельным препаратам и их сочетаниям, что позволяет прогнозировать ответ на последующую терапию и, в случаях развития лекарственной нечувствительности, оперативно их изменять для конкретного пациента на основании исследования лекарственной чувствительности его клеток в тесте с метилтиазол тетразолием бромидом (МТТ). Недостатком данного способа является длительность проведения исследований (48 часов культивирования клеток в питательной среде с необходимыми добавками, затем 44-часовая инкубация с тестируемыми препаратами и дополнительная 4-часовая экспозиция с МТТ), а также трудоемкость и высокая стоимость реактивов, необходимых для постановки реакции.

Доклинические исследования новых химических соединений, в том числе оценка их противолейкозной активности, могут быть также проведены при экспериментальном инфицировании морских свинок ВЛКРС [Патент RU 2802150 С1 Способ моделирования лейкозной инфекции у животных. Патентообладатель ФГБНУ «Омский АНЦ», опубл.22.08.2023, Бюл. №24]. Способ пригоден для изучения специфической противовирусной активности различных химических соединений, биологически активных веществ и иммуномодуляторов, при этом контроль за эффективностью профилактического или терапевтического воздействия испытуемых препаратов in vivo может быть осуществлен с помощью реакции иммунофлюоресценции (РИФ) [Миронов А.Н., Бунятян Н.Д. и др. Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Часть первая. - М.: Гриф и К, 2012. - С. 533-535]. Оценка противовирусного действия веществ, особенно когда необходимы одновременные испытания нескольких производных химического соединения, при экспериментальной вирусной инфекции на животных имеют недостатки, связанные с необходимостью использования большого числа морских свинок в опыте, а также с продолжительностью получения экспериментальных данных.

Наиболее близким техническим решением к заявленному является метод исследования противовирусных препаратов в культуре клеток микрометодом, который предусматривает: выращивание культур клеток в 96-луночных пластиковых планшетах; внесение в каждую лунку по 0,1 мл вируссодержащей суспензии; по 0,1 мл поддерживающей среды, содержащей исследуемые вещества с кратностью разведения 1:2, начиная с концентрации 1000 мкг/мл; микроскопию культур клеток для определения титра по цитопатическому действию и вычисление индекса селективности препаратов [Миронов А.Н., Бунятян Н.Д. и др. Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Часть первая. - М.: Гриф и К, 2012. - С. 526]. Несмотря на то, что этот способ позволяет проводить одновременное исследование большого количества соединений при минимальном расходе питательных сред и изучаемых веществ, он, как и предыдущий метод, длителен в постановке, а также требует многочасового наблюдения за клетками под микроскопом.

Техническим результатом изобретения является создание способа оценки противолейкозной активности препаратов на основе иммунофлюоресцентного метода, позволяющего проводить оперативное одновременное тестирование большого количества химических соединений с минимальными материальными затратами и имеющего высокую достоверность.

Техническим решением способа оценки противолейкозной активности препаратов является выделение культуры лимфоцитов из свежеполученной периферической крови от больной лейкозом коровы с помощью центрифугирования в градиенте плотности рентгеноконтрастного вещества (тразографа или его аналога), внесение в лунки 96-луночного планшета для иммунологических исследований по 100 мкл поддерживающей среды (раствор Хенкса), внесение в первую лунку каждого ряда по 100 мкл вируссодержащей взвеси, получая разведение 1:2, затем из первых лунок из разведения 1:2 вносят по 100 мл во вторые лунки каждого ряда, получая разведение 1:4, из этого разведения готовят разведение 1:8, перенося из одной лунки 100 мкл жидкости, затем методом последовательных разведений готовят разведения 1:16, 1:32 и так далее. Из лунок последнего ряда (1:4096) излишек жидкости 100 мкл удаляют. Затем в лунки 1-го (контрольного) ряда вносят по 100 мкл раствора Хенкса, а в лунки, начиная со 2-го ряда и заканчивая 5-м рядом (опытные ряды), вносят по 100 мкл разных концентраций испытуемого препарата, разведенного в растворе Хенкса. С этой целью берут 1000 мг препарата и разводят в 1 мл раствора Хенкса и делают ряд последовательных 10-кратных разведений: 100, 10 и 1 мг/мл. В клеточных взвесях, находящихся в лунках контрольного ряда, оценивают активность вируса по титру до инкубации и после 24-часовой инкубации в термостате при температуре 37°С планшетов с закрытой крышкой, помещенных в эксикатор для создания условий пониженного доступа воздуха путем приготовления мазков типа «высушенной капли» и постановки реакции иммунофлюоресценции (РИФ) [Патент RU 2810589 С1 Способ постановки реакции иммунофлюоресценции для диагностики лейкоза крупного рогатого скота. Патентообладатель ФГБНУ «Омский АНЦ», опубл.27.12.2023, Бюл. №36]. В клеточных взвесях опытных рядов (со 2-го по 5-й ряды) активность вируса по титру осуществляют только после 24-часовой инкубации. Для оценки интенсивности свечения используют четырех крестовую систему: (++++) - очень яркая люминесценция, четко контрастирующая на темном фоне; (+++) - яркая люминесценция; (++) или (+) - слабое свечение; (-) - отсутствие люминесценции. За положительную реакцию принимают свечение в три, четыре креста. Устанавливают минимальную ингибирующую концентрацию препарата по титру вируса, затем полученные значения титров переводят в логарифмы с основанием 2 (титр вируса 1:2 принимают равным 1,0, 1:4 - 2,0 и т.д.) и определяют коэффициент ингибирования (К_и) вируса по формуле

К_и = ((А_к - А₀)/А_к) * 100,

где А_к - титр вируса в контрольном ряду (без внесения в поддерживающую среду изучаемого средства);

А_о - титр вируса в опытном ряду (с внесением в поддерживающую среду испытуемого препарата).

В зависимости от концентрации препарата высокую противолейкозную активность отмечают при значениях К_и от 100 до 63,5, среднюю - от 36,3 до 63,49, низкую - при значениях до 36,29.

Отличительными признаками предложенного способа являются: использование культуры лимфоцитов периферической крови, имеющей высокую концентрацию ВЛКРС, 24-часовая инкубация вируссодержащей суспензии в поддерживающей среде и оценка активности по титру вируса в РИФ с последующим расчетом коэффициента ингибирования вируса.

Сущность изобретения поясняется на конкретных примерах выполнения способа.

Пример 1. Проводят испытание противолейкозной активности предлагаемым способом нескольких препаратов, обладающих потенциальной противовирусной активностью:

- бетулин (пентациклический тритерпеноид группы лупана, имеет широкий спектр биологической активности, в т.ч. противовирусную);

- декстраналь (природный биополимер, полученный в результате модифицирования декстрана, противовирусная активность не изучена);

- фуллерен С60 (аллотропная молекулярная форма углерода).

Оценку активности вируса по титру с помощью РИФ в контрольном (без препарата) и опытных рядах (с испытуемыми препаратами) лунок осуществляют с использованием разных экспозиций инкубации: 3, 6, 24 и 48 часов, а контрольном ряду лунок также до начала инкубации.

Результаты исследований представлены в таблице 1.

Таблица 1 - Минимальные ингибирующие титры вируса в РИФ в разные сроки после инкубации культуры лимфоцитов периферической крови с разными препаратами

Препарат	Концентрация препарата в растворе Хенкса, мг/мл	Время инкубации, часов
		3	6	24	48
Бетулин	1000	1:256	1:64	1:32	-
	100	1:512	1:512	1:512	-
	10	1:1024	1:1024	1:1024	-
	1	1:2048	1:1024	1:1024	-
Декстраналь	1000	1:64	1:32	-	-
	100	1:128	1:64	1:32	1:32
	10	1:512	1:512	1:512	1:64
	1	1:2048	1:1024	1:1024	1:128
Фуллерен	1000	1:64	1:32	1:32	-
	100	1:128	1:128	1:128	-
	10	1:256	1:128	1:16	1:16
	1	1:512	1:128	1:128	1:32
Контроль после инкубации	Раствор Хенкса без препарата	1:2048	1:2048	1:2048	1:256
Контроль до инкубации		1:2048

Как видно из таблицы 1, в контрольных рядах лунок как до инкубации, так после инкубации в течение 3-х, 6- и 24-х часов активность вируса в РИФ была одинаковой (титр вируса 1:2048). После 48-часовой инкубации титр вируса падал до 1:256, что указывало на существенное снижение его активности, а, следовательно, нецелесообразности испытания химических соединений при такой экспозиции.

Наиболее выраженную противолейкозную активность испытуемые препараты бетулин и декстраналь проявляли при их инкубации в максимальной концентрации (1000 мг/мл) с вируссодержащей суспензией в течение 24-х часов, при применении которых к этому времени титр вируса достигал минимума или происходило полное подавление вирусной активности. В более низких концентрациях противовирусная эффективность препаратов снижалась.

Фуллерен, в отличие от других соединений, при 24-часовой инкубации проявлял противолейкозную активность в концентрации 1000 мг/мл и, особенно, в концентрации 10 мг/мл. В концентрации 1,0 мг/мл этот препарат также оказывал противовирусное действие, на что указывал титр вируса 1:128.

Таким образом, наиболее целесообразна 24-х часовая инкубация испытуемых препаратов в поддерживающей среде, так как при такой экспозиции можно осуществлять наиболее достоверную оценку их противолейкозной активности.

Также необходимо отметить, что многократные исследования выделенных лимфоцитов периферической крови от разных больных лейкозом коров в РИФ (до инкубации) показывали примерно одинаковый результат, при этом средний титр вируса составлял 1:2048, а самое максимальное значение составило 1:4096.

В дальнейшем для количественной оценки степени противолейкозной активности значения титров вируса, установленные нами при 24-х часовой экспозиции препаратов, переводят в логарифмы с основанием 2 (титр вируса 1:2 принимают равным 1,0, 1:4 - 2,0 … 1:32 - 5,0 и т.д.) и высчитывают коэффициент ингибирования вируса по формуле

К_и = ((А_к - А₀)/А_к) * 100,

где А_к - титр вируса в контрольном ряду (без внесения в поддерживающую среду изучаемого средства);

А_о - титр вируса в опытном ряду (с внесением в поддерживающую среду испытуемого препарата).

Например, подставим в формулу значения, полученные при использовании бетулина в концентрации 1000 мг/мл. Установленный титр вируса 1:32 при переводе в логарифм принимают равным 5, а в контроле - 1:2048 равным 11.

К_и = ((11- 5)/11) * 100 = 54,5

Коэффициент ингибирования составил 54,5.

При применении бетулина в концентрации 100 мг/мл К_и равен 18,2, а в концентрациях 10 и 1,0 мг/мл - 9,1 (табл. 2).

Таблица 2 - Коэффициенты ингибирования вируса при использовании препаратов в разной концентрации

Препарат	Концентрация препарата в растворе Хенкса, мг/мл	Коэффициент ингибирования
Бетулин	1000	54,5
	100	18,2
	10	9,1
	1	9,1
Декстраналь	1000	100,0
	100	100,0
	10	18,2
	1	9,1
Фуллерен	1000	54,5
	100	36,4
	10	63,6
	1	36,4

Как представлено в таблице 2, наибольшей противолейкозной эффективностью обладал декстраналь, у которого в концентрациях 1000 и 100 мг/мл К_и составил 100,0, затем фуллерен в концентрации 10 мг/мл (К_и=63,6). Средний уровень подавляющей эффективности в отношении ВЛКРС показал бетулин в концентрации 1000 мг/мл и фуллерен в концентрациях 1000, 100 и 1,0 мг/мл (К_и от 36,4 до 54,5).

Пример 2. Проводят испытание противолейкозной активности новых химических соединений in vitro и in vivo. С этой целью берут две структурные модификации производных 3-ацетилпиридина (соединение I и II), некоторые соединения которых имеют выраженную противовирусную активность [Stalinskaya A.L., Martynenko N.V., Shulgau Z.T., Shustov A.V., Keyer V.V., Kulakov I.V. Synthesis and antiviral properties against SARS-CoV-2 of epoxybenzooxocino[4,3-b]pyridine derivatives // Molecules. - 2022. - Vol. 27(12). - P. 3701].

Исследование противовирусной активности in vitro.

При испытании противолейкозной активности предлагаемым способом (in vitro) в качестве известного препарата сравнения берут римантадина гидрохлорид (препарат, применяемый для лечения и профилактики гриппа).

Результаты исследований представлены в таблице 3.

Таблица 3 - Минимальные ингибирующие титры вируса в РИФ и коэффициенты ингибирования после 24-х часовой инкубации культуры лимфоцитов периферической крови с испытуемыми препаратами

Препарат	Концентрация препарата в растворе Хенкса, мг/мл	Титр вируса в РИФ	Коэффициент ингибирования
Соединение I	1000	-	100,0
	100	1:8	72,7
	10	1:256	27,3
	1	1:256	27,3
Соединение II	1000	1:16	63,6
	100	1:256	27,3
	10	1:256	27,3
	1	1:256	27,3
Римантадина гидрохлорид	1000	1:32	54,5
	100	1:256	27,3
	10	1:512	9,1
	1	1:2048	0
Контроль после инкубации	Раствор Хенкса без препарата	1:2048	-
Контроль до инкубации		1:2048	-

Как показано в таблице 3, наиболее высокой противолейкозной активностью обладало соединение I в концентрациях 1000 и 100 мг/мл (К_и соответственно 100,0 и 72,7), а также соединение II в максимальной концентрации (К_и =63,6). При инкубации с вируссодержащей взвесью римантадина гидрохлорида наблюдали более слабую ингибирующую эффективность.

Исследование противовирусной активности in vivo.

Отбирают 25 морских свинок, из которых формируют 5 групп по 5 особей в каждой. Животных первых 4-х групп внутрибрюшинно инфицируют клеточной взвесью лимфоцитов, выделенной от коровы, больной лейкозом в гематологической стадии, в объеме 1 мл [Патент RU 2802150 С1 Способ моделирования лейкозной инфекции у животных. Патентообладатель ФГБНУ «Омский АНЦ», опубл. 22.08.2023, Бюл. №24]. Особям 1-й группы вводят однократно за 2 часа до инфицирования, внутрибрюшинно, соединение (I) в дозе 30 мг/кг (1:8 ЛД₅₀); 2-й группы вводят однократно за 2 часа до инфицирования, внутрибрюшинно, соединение (II) в дозе 15 мг/кг (1:8 ЛД₅₀), 3-й группы римантадина гидрохлорид тем же способом в дозе 15 мг/кг (1:8 ЛД₅₀). Морским свинкам 4-й группы препарат не вводят (позитивный контроль). Остальные 5 особей (5-я группа) являются интактными и служат в качестве негативного контроля. Оценку инфекционного статуса животных осуществляют исследованием крови с помощью РИФ на 30-е и 90-е сутки после инфицирования.

Результаты исследований представлены в таблице 4.

Таблица 4 - Противолейкозная активность испытуемых соединений на морских свинках в РИФ

Группа животных	Срок исследования после инфицирования, сутки
	30	90
1-я группа	1/5	1/5
2-я группа	1/5	0/5
3-я группа	5/5	5/5
4-я группа	5/5	5/5
Контроль	0/5	0/5

Примечание: числитель - количество положительно прореагировавших животных; знаменатель - количество животных в группе.

Как показано в таблице 4, наиболее высокую противолейкозную активность имели соединения I и II, на что указывало отсутствие специфического свечения в РИФ на 30-е и 90-е сутки после инфицирования морских свинок ВЛКРС у 80-100 % животных. У обработанных римантадином, а также у особей 4-й группы, которым после инокуляции вируса не вводили исследуемые препараты, отмечалась иммунофлюоресценция клеток в 100 % случаев.

Таким образом, установлена высокая противолейкозная эффективность соединений I и II как в опыте in vitro, так и in vivo, что свидетельствует о высокой достоверности предлагаемого способа.

Необходимо отметить, что при использовании лимфоцитов периферической крови, выделенных от больной лейкозом коровы, появляется возможность получения вируса в высокой концентрации (титр вируса в РИФ 1:2048), при этом нет необходимости длительной инкубации вируссодержащей суспензии в культуре клеток для ожидания максимального накопления вируса. Помимо этого, предлагаемый способ является экономичным, так как исключает использование некоторых дорогостоящих реактивов, а также позволяет провести предварительную одновременную оценку противолейкозной активности ряда химических соединений и их производных для отбора наиболее перспективных препаратов для дальнейших исследований на лабораторных животных. Высокая степень совпадения результатов исследования противолейкозной активности препаратов in vitro и in vivo свидетельствует о достоверности предлагаемого способа.

Claims (1)

1. Способ оценки противолейкозной активности препаратов, включающий выделение культуры клеток, внесение в поддерживающую среду вируссодержащей суспензии, ее титрование в 96-луночных иммунологических планшетах методом двукратных последовательных разведений, внесение в опытные ряды лунок испытуемых препаратов в разной концентрации, инкубацию планшетов в термостате, определение титра вируса и коэффициента ингибирования вируса, отличающийся тем, что в поддерживающую среду вносят культуру лимфоцитов из свежеполученной периферической крови от больной лейкозом коровы, инкубацию осуществляют 24 часа, с помощью реакции иммунофлюоресценции по 4-крестовой системе устанавливают минимальную ингибирующую концентрацию препарата по титру вируса, а для определения коэффициента ингибирования (К_и) полученные значения титров переводят в логарифмы с основанием 2, высокую противолейкозную активность препарата отмечают при значениях К_и от 100 до 63,5, среднюю - от 36,3 до 63,49, низкую - при значениях до 36,29.