RU2843013C1 - Способы и композиции для лечения диабетической ретинопатии - Google Patents

Abstract

Группа изобретений относится к способам лечения или предотвращения диабетической ретинопатии. Предложены варианты способа лечения или предотвращения диабетической ретинопатии у нуждающегося в этом субъекта, включающие введение указанному субъекту терапевтически эффективного количества антитела против церамида или его антигенсвязывающего фрагмента, причем указанное антитело против церамида или его антигенсвязывающий фрагмент содержат вариабельную тяжелую цепь (V_H) и вариабельную легкую цепь (V_L). При этом V_H включает HCDR1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, HCDR2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 45, и HCDR3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3, а V_L содержит LCDR1, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, LCDR2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5, и LCDR3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6. Введение указанных антител против церамида или антигенсвязывающих фрагментов обеспечивает избирательное ингибирование воспалительных маркеров, неоваскуляризации и других симптомов диабетической ретинопатии в глазу без индуцирования отрицательных побочных эффектов, связанных с прямым ингибированием ASM. 4 н. и 69 з.п. ф-лы, 7 ил., 2 табл., 9 пр.

Description

Перекрестная ссылка на родственные заявки

[0001] Настоящая заявка испрашивает приоритет на основании предварительной заявки на патент США №62/907,287, поданной 27 сентября 2019 г., содержание которой полностью включено в настоящую заявку посредством ссылки.

Заявление о перечне последовательностей

[0002] Перечень последовательностей, связанных с настоящей заявкой, представлен в текстовом формате вместо бумажной копии и включен в настоящую заявку посредством ссылки. Машиночитаемая копия перечня последовательностей: имя файла: CERA-01l_01WO_SeqList_ST25.txt, дата записи: 28 сентября 2020 г., размер файла 32,9 килобайт.

Область техники

[0003] Настоящее изобретение относится к композициям против церамида и способам их применения для лечения диабетической ретинопатии.

Уровень техники

[0004] Диабетическая ретинопатия (ДР) поражает кровеносные сосуды в светочувствительной ткани, называемой сетчаткой, которая выстилает заднюю часть глаза. Она является наиболее распространенной причиной потери зрения среди людей с диабетом и основной причиной нарушения зрения и слепоты среди взрослых трудоспособного возраста. Следствием диабетической ретинопатии является отек в области сетчатки, называемой макулой, который называется диабетическим макулярным отеком (ДМО).

[0005] Существующие способы лечения ДР и ДМО включают иммунотерапию против VEGF, которая имеет некоторую эффективность как в лечении неоваскулярной диабетической ретинопатии (ДР), так и диабетического макулярного отека (ДМО). Однако несколько крупных клинических исследований показывают, что приблизительно 40% пациентов не отвечают на терапию против VEGF. Кроме того, лечение против VEGF направлено на очень позднюю стадию заболевания, когда полное восстановление поражения сетчатки является сложным.

[0006] Сохраняется неудовлетворенная потребность в безопасном и эффективном лечении ДР и ДМО.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

[0007] На Фиг. 1 показан пример дизайна эксперимента для измерения эффекта интравитреального введения scFv против церамида в мышиной модели диабетической ретинопатии, включающей ишемически-реперфузионное (I/R) повреждение.

[0008] На Фиг. 2А Фиг. 2В показаны результаты интравитреального введения scFv против церамида у мышей с ишемически-реперфузионным (I/R) повреждением сетчатки на мышиной модели диабетической ретинопатии. На Фиг. 2А показано изменение экспрессии для TNFα, IL-1β, IL6, ICAM-1, VCAM-1 и MCP1 в следующем порядке: глаза в качестве контроля (белые столбцы), глаза с I/R (черные столбцы) и глаза с I/R при введении scFv против церамида (серые столбцы) по сравнению с экспрессией циклофилина А. На Фиг. 2 В показана сосудистая проницаемость сетчатки, продемонстрированная с помощью изображений флуоресцентной микроскопии и количественного анализа гистограмм в глазах в качестве контроля (левая панель, левый столбец), глазах с VR (средняя панель, средний столбец) и глазах с I/R при введении scFv против церамида (правая панель, правый столбец). Масштаб столбцов на изображениях составляет 50 мкм.

[0009] На Фиг. 3 показан пример дизайна эксперимента для измерения эффекта интравитреального введения scFv против церамида в мышиной модели диабета.

[0010] На Фиг. 4 показаны результаты введения scFv против церамида у крыс с диабетом.

[0011] На Фиг. 5 показан пример дизайна эксперимента для сравнения эффектов интравитреального и системного введения scFv против церамида в мышиной модели диабетической ретинопатии.

[0012] На Фиг. 6 показан пример дизайна эксперимента для сравнения эффектов введения scFv против церамида и введения ДГК в мышиной модели диабетической ретинопатии.

[0013] На Фиг. 7 показаны бесклеточные капилляры у мышей, выступавших в качестве контроля, получавших ДГК.

Краткое описание

[0014] Настоящее изобретение относится к способам лечения диабетической ретинопатии, включающим окулярное введение антитела против церамида или его антигенсвязывающего фрагмента. Также предложены способы лечения субъектов, которые получал предшествующее лечение диабетической ретинопатии. В некоторых вариантах реализации в настоящем изобретении дополнительно предложены способы лечения диабетической ретинопатии с помощью однократной дозы антитела против церамида или его антигенсвязывающего фрагмента. Дополнительно предложен способ лечения диабетической ретинопатии двумя или более дозами антитела против церамида или его антигенсвязывающего фрагмента, разделенными периодом от по меньшей мере двух недель до по меньшей мере одного года. Другой аспект настоящего изобретения относится к способу лечения воспалительного заболевания глаза с помощью антитела против церамида или его антигенсвязывающего фрагмента.

[0015] В некоторых вариантах реализации настоящее изобретение относится к способу лечения или предотвращения диабетической ретинопатии у нуждающегося в этом субъекта, включающему окулярное введение субъекту антитела против церамида или его антигенсвязывающего фрагмента. В некоторых вариантах реализации антитело против церамида или его антигенсвязывающий фрагмент представляет собой одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv).

[0016] В некоторых вариантах реализации окулярное введение выбрано из группы, состоящей из местного введения, интраокулярного введения, субконъюнктивального введения, внутрикамерного введения, инъекции в переднюю камеру через височный край, интрастромального введения, внутрироговичного введения, субретинального введения, инъекции во внутриглазную жидкость, субтенонового введения, введения в супрахориоидное пространство (SCS), введения в супрацилиарное пространство и интравитреального введения. В некоторых вариантах реализации введение представляет собой интравитреальное введение.

[0017] В некоторых вариантах реализации указанный субъект получал предшествующее лечение диабетической ретинопатии. В некоторых вариантах реализации указанный субъект не отвечал на предшествующее лечение диабетической ретинопатии. В некоторых вариантах реализации предшествующее лечение представляет собой терапевтическую процедуру, выбранную из витрэктомии и лазерной хирургии, или терапевтический агент, выбранный из терапии стероидами и терапии против фактора роста эндотелия сосудов (VEGF). В некоторых вариантах реализации терапия против VEGF представляет собой антитело против VEGF, выбранное из группы, состоящей из бевацизумаба, ранибизумаба и афлиберцепта.

[0018] В некоторых вариантах реализации антитело против церамида или его антигенсвязывающий фрагмент вводят в виде однократной дозы. В некоторых вариантах реализации антитело против церамида или его антигенсвязывающий фрагмент вводят в двух или более дозах, разделенных по меньшей мере двумя неделями, по меньшей мере тремя неделями или по меньшей мере четырьмя неделями. В некоторых вариантах реализации антитело против церамида или его антигенсвязывающий фрагмент вводят в двух или более дозах, разделенных периодом приблизительно от двух недель до приблизительно четырех недель. В некоторых вариантах реализации антитело против церамида или его антигенсвязывающий фрагмент вводят в двух или более дозах, разделенных по меньшей мере одним месяцем, по меньшей мере двумя месяцами, по меньшей мере тремя месяцами, по меньшей мере четырьмя месяцами, по меньшей мере пятью месяцами, по меньшей мере шестью месяцами, по меньшей мере семью месяцами, по меньшей мере восемью месяцами, по меньшей мере девятью месяцами, по меньшей мере десятью месяцами или по меньшей мере одиннадцатью месяцами. В некоторых вариантах реализации антитело против церамида или его антигенсвязывающий фрагмент вводят в двух или более дозах, разделенных периодом от приблизительно одного месяца до приблизительно шести месяцев. В некоторых вариантах реализации антитело против церамида или его антигенсвязывающий фрагмент вводят в двух или более дозах, разделенных по меньшей мере одним годом. В некоторых вариантах реализации антитело против церамида или его антигенсвязывающий фрагмент вводят до возникновения одного или более симптомов диабетической ретинопатии. В некоторых вариантах реализации антитело против церамида или его антигенсвязывающий фрагмент вводят после возникновения одного или более симптомов диабетической ретинопатии. В некоторых вариантах реализации антитело против церамида или его антигенсвязывающий фрагмент вводят во время непролиферативной стадии диабетической ретинопатии. В некоторых вариантах реализации антитело против церамида или его антигенсвязывающий фрагмент вводят во время пролиферативной стадии диабетической ретинопатии.

[0019] В некоторых вариантах реализации предложен способ лечения или предотвращения диабетической ретинопатии у нуждающегося в этом субъекта, включающий введение антитела против церамида или его антигенсвязывающего фрагмента субъекту, где указанный субъект получал предшествующее лечение диабетической ретинопатии. В некоторых вариантах реализации указанный субъект не отвечал на предшествующее лечение диабетической ретинопатии. В некоторых вариантах реализации антитело против церамида или его антигенсвязывающий фрагмент представляет собой одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv).

[0020] В некоторых вариантах реализации введение представляет собой окулярное введение. В некоторых вариантах реализации окулярное введение выбрано из группы, состоящей из местного введения, интраокулярного введения, субконъюнктивального введения, внутрикамерного введения, инъекции в переднюю камеру через височный край, интрастромального введения, внутрироговичного введения, субретинального введения, инъекции во внутриглазную жидкость, субтенонового введения, введения в супрахориоидное пространство (SCS), введения в супрацилиарное пространство и интравитреального введения. В некоторых вариантах реализации окулярное введение представляет собой интравитреальное введение.

[0021] В некоторых вариантах реализации предшествующее лечение представляло собой витрэктомию, лазерную хирургию, стероид и/или терапию против фактора роста эндотелия сосудов (VEGF). В некоторых вариантах реализации терапия против VEGF представляет собой антитело против VEGF, выбранное из группы, состоящей из бевацизумаба, ранибизумаба и афлиберцепта.

[0022] В некоторых вариантах реализации антитело против церамида или его антигенсвязывающий фрагмент вводят в виде однократной дозы. В некоторых вариантах реализации антитело против церамида или его антигенсвязывающий фрагмент вводят в двух или более дозах, разделенных по меньшей мере двумя неделями, по меньшей мере тремя неделями или по меньшей мере четырьмя неделями. В некоторых вариантах реализации антитело против церамида или его антигенсвязывающий фрагмент вводят в двух или более дозах, разделенных периодом приблизительно от двух недель до приблизительно четырех недель. В некоторых вариантах реализации антитело против церамида или его антигенсвязывающий фрагмент вводят в двух или более дозах, разделенных по меньшей мере одним месяцем, по меньшей мере двумя месяцами, по меньшей мере тремя месяцами, по меньшей мере четырьмя месяцами, по меньшей мере пятью месяцами, по меньшей мере шестью месяцами, по меньшей мере семью месяцами, по меньшей мере восемью месяцами, по меньшей мере девятью месяцами, по меньшей мере десятью месяцами или по меньшей мере одиннадцатью месяцами. В некоторых вариантах реализации антитело против церамида или его антигенсвязывающий фрагмент вводят в двух или более дозах, разделенных периодом от приблизительно одного месяца до приблизительно шести месяцев. В некоторых вариантах реализации антитело против церамида или его антигенсвязывающий фрагмент вводят в двух или более дозах, разделенных по меньшей мере одним годом.

[0023] В некоторых вариантах реализации антитело против церамида или его антигенсвязывающий фрагмент вводят до возникновения одного или более симптомов диабетической ретинопатии. В некоторых вариантах реализации антитело против церамида или его антигенсвязывающий фрагмент вводят после возникновения одного или более симптомов диабетической ретинопатии. В некоторых вариантах реализации антитело против церамида или его антигенсвязывающий фрагмент вводят во время непролиферативной стадии диабетической ретинопатии. В некоторых вариантах реализации антитело против церамида или его антигенсвязывающий фрагмент вводят во время пролиферативной стадии диабетической ретинопатии.

[0024] В некоторых вариантах реализации предложен способ лечения или предотвращения диабетической ретинопатии у субъекта, включающий введение субъекту однократной дозы антитела против церамида или его антигенсвязывающего фрагмента.

[0025] В некоторых вариантах реализации предложен способ лечения или предотвращения диабетической ретинопатии у субъекта, включающий введение субъекту двух или более доз антитела против церамида или его антигенсвязывающего фрагмента, причем две или более доз разделены по меньшей мере двумя неделями. В некоторых вариантах реализации антитело против церамида или его антигенсвязывающий фрагмент вводят в двух или более дозах, разделенных по меньшей мере двумя неделями, по меньшей мере тремя неделями или по меньшей мере четырьмя неделями. В некоторых вариантах реализации антитело против церамида или его антигенсвязывающий фрагмент вводят в двух или более дозах, разделенных периодом приблизительно от двух недель до приблизительно четырех недель. В некоторых вариантах реализации антитело против церамида или его антигенсвязывающий фрагмент вводят в двух или более дозах, разделенных по меньшей мере одним месяцем, по меньшей мере двумя месяцами, по меньшей мере тремя месяцами, по меньшей мере четырьмя месяцами, по меньшей мере пятью месяцами, по меньшей мере шестью месяцами, по меньшей мере семью месяцами, по меньшей мере восемью месяцами, по меньшей мере девятью месяцами, по меньшей мере десятью месяцами или по меньшей мере одиннадцатью месяцами. В некоторых вариантах реализации антитело против церамида или его антигенсвязывающий фрагмент вводят в двух или более дозах, разделенных периодом от приблизительно одного месяца до приблизительно шести месяцев. В некоторых вариантах реализации антитело против церамида или его антигенсвязывающий фрагмент вводят в двух или более дозах, разделенных по меньшей мере одним годом.

[0026] В некоторых вариантах реализации антитело против церамида или его антигенсвязывающий фрагмент представляет собой одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv).

[0027] В некоторых вариантах реализации введение представляет собой окулярное введение. В некоторых вариантах реализации окулярное введение выбрано из группы, состоящей из местного введения, интраокулярного введения, субконъюнктивального введения, внутрикамерного введения, инъекции в переднюю камеру через височный край, интрастромального введения, внутрироговичного введения, субретинального введения, инъекции во внутриглазную жидкость, субтенонового введения, введения в супрахориоидное пространство (SCS), введения в супрацилиарное пространство или интравитреального введения. В некоторых вариантах реализации окулярное введение представляет собой интравитреальное введение.

[0028] В некоторых вариантах реализации указанный субъект получал предшествующее лечение диабетической ретинопатии. В некоторых вариантах реализации указанный субъект не отвечал на предшествующее лечение диабетической ретинопатии. В некоторых вариантах реализации предшествующее лечение представляло собой витрэктомию, лазерную хирургию, стероид и/или терапию против фактора роста эндотелия сосудов (VEGF). В некоторых вариантах реализации терапия против VEGF представляет собой антитело против VEGF, выбранное из группы, состоящей из бевацизумаба, ранибизумаба и афлиберцепта.

[0029] В некоторых вариантах реализации антитело против церамида или его антигенсвязывающий фрагмент вводят до возникновения одного или более симптомов диабетической ретинопатии. В некоторых вариантах реализации антитело против церамида или его антигенсвязывающий фрагмент вводят после возникновения одного или более симптомов диабетической ретинопатии. В некоторых вариантах реализации антитело против церамида или его антигенсвязывающий фрагмент вводят во время непролиферативной стадии диабетической ретинопатии. В некоторых вариантах реализации антитело против церамида или его антигенсвязывающий фрагмент вводят во время пролиферативной стадии диабетической ретинопатии.

[0030] В некоторых вариантах реализации в настоящем изобретении предложен способ лечения воспалительного заболевания глаза, включающий окулярное введение антитела против церамида или его антигенсвязывающего фрагмента. В некоторых вариантах реализации антитело против церамида или его антигенсвязывающий фрагмент представляет собой одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv).

[0031] В некоторых вариантах реализации окулярное введение выбрано из группы, состоящей из местного введения, интраокулярного введения, субконъюнктивального введения, внутрикамерного введения, инъекции в переднюю камеру через височный край, интрастромального введения, внутрироговичного введения, субретинального введения, инъекции во внутриглазную жидкость, субтенонового введения, введения в супрахориоидное пространство (SCS), введения в супрацилиарное пространство или интравитреального введения. В некоторых вариантах реализации указанное воспалительное заболевание глаза выбрано из группы, состоящей из неоваскуляризации сетчатки, хориоидальной неоваскуляризации, неоваскуляризации роговицы, макулярной дегенерации, возрастной макулярной дегенерации, диабетической ретинопатии, кровоизлияния в стекловидное тело, кровоизлияния в сетчатку, хориоидита, неоваскулярной глаукомы, заболевания сосудистой оболочки, телеангиэктазиия, окклюзии артерии сетчатки, окклюзии вены сетчатки, хориоретинита, эпиретинальной мембраны, новообразования сосудистой оболочки, ретинопатии недоношенных, кистозного макулярного отека, отека диска зрительного нерва, рецидивирующей ишемии, кровоизлияния в глаза и пролиферативной витреоретинопатии.

[0032] В некоторых вариантах реализации окулярное введение представляет собой интравитреальное введение.

[0033] В некоторых вариантах реализации указанный субъект получал предшествующее лечение диабетической ретинопатии. В некоторых вариантах реализации указанный субъект не отвечал на предшествующее лечение диабетической ретинопатии. В некоторых вариантах реализации предшествующее лечение представляло собой терапевтическую процедуру, выбранную из витрэктомии и лазерной хирургии, или терапевтический агент, выбранный из терапии стероидами и терапии против фактора роста эндотелия сосудов (VEGF). В некоторых вариантах реализации терапия против VEGF терапия представляет собой антитело против VEGF, выбранное из группы, состоящей из бевацизумаба, ранибизумаба и афлиберцепта.

[0034] В некоторых вариантах реализации антитело против церамида или его антигенсвязывающий фрагмент вводят в виде однократной дозы. В некоторых вариантах реализации антитело против церамида или его антигенсвязывающий фрагмент вводят в двух или более дозах, разделенных по меньшей мере двумя неделями, по меньшей мере тремя неделями или по меньшей мере четырьмя неделями. В некоторых вариантах реализации антитело против церамида или его антигенсвязывающий фрагмент вводят в двух или более дозах, разделенных периодом приблизительно от двух недель до приблизительно четырех недель. В некоторых вариантах реализации антитело против церамида или его антигенсвязывающий фрагмент вводят в двух или более дозах, разделенных по меньшей мере одним месяцем, по меньшей мере двумя месяцами, по меньшей мере тремя месяцами, по меньшей мере четырьмя месяцами, по меньшей мере пятью месяцами, по меньшей мере шестью месяцами, по меньшей мере семью месяцами, по меньшей мере восемью месяцами, по меньшей мере девятью месяцами, по меньшей мере десятью месяцами или по меньшей мере одиннадцатью месяцами. В некоторых вариантах реализации антитело против церамида или его антигенсвязывающий фрагмент вводят в двух или более дозах, разделенных периодом от приблизительно одного месяца до приблизительно шести месяцев. В некоторых вариантах реализации антитело против церамида или его антигенсвязывающий фрагмент вводят в двух или более дозах, разделенных по меньшей мере одним годом.

[0035] В некоторых вариантах реализации антитело против церамида или его антигенсвязывающий фрагмент вводят до возникновения одного или более симптомов воспалительного заболевания глаза. В некоторых вариантах реализации антитело против церамида или его антигенсвязывающий фрагмент вводят после возникновения одного или более симптомов воспалительного заболевания глаза.

[0036] В некоторых вариантах реализации антитело против церамида или его антигенсвязывающий фрагмент содержит вариабельную тяжелую цепь (V_H) и вариабельную легкую цепь (V_L), где V_H содержит определяющий комплементарность участок 1 тяжелой цепи (HCDR1), содержащий аминокислотную последовательность GYTFTDHTIH (SEQ ID NO: 1), HCDR2, содержащий аминокислотную последовательность YNYPRDGSTKYNEKFKG (SEQ ID NO: 2), и HCDR3, содержащий аминокислотную последовательность GFITTVVPSAY (SEQ ID NO: 3), и где V_L содержит определяющий комплементарность участок 1 легкой цепи (LCDR1), содержащий аминокислотную последовательность RASKSISKYLA (SEQ ID NO: 4), LCDR2, содержащий аминокислотную последовательность SGSTLQS (SEQ ID NO: 5), и LCDR3, содержащий аминокислотную последовательность QQHNEYPWT (SEQ ID NO: 6). В некоторых вариантах реализации V_H содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7, и при этом V_L содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8. В некоторых вариантах реализации антитело против церамида или его антигенсвязывающий фрагмент представляет собой антитело 6 В5. В некоторых вариантах реализации антитело против церамида или его антигенсвязывающий фрагмент представляет собой scFv 6В5.

[0037] В некоторых вариантах реализации антитело против церамида или его антигенсвязывающий фрагмент представляет собой гуманизированное антитело 6 В5 (h6B5). В некоторых вариантах реализации антитело против церамида или его антигенсвязывающий фрагмент представляет собой scFv h6B5. В некоторых вариантах реализации антитело h6B5, scFv или его антигенсвязывающий фрагмент содержит вариабельную тяжелую цепь (VH) и вариабельную легкую цепь (VL), где VH содержит определяющий комплементарность участок 1 тяжелой цепи (HCDR1), содержащий или состоящий из аминокислотной последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 1 и 43, HCDR2, содержащий или состоящий из аминокислотной последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 44-47, и HCDR3, содержащий или состоящий из аминокислотной последовательности GFITTVVPSAY (SEQ ID NO: 3), и где VL содержит определяющий комплементарность участок 1 легкой цепи (LCDR1), содержащий или состоящий из аминокислотной последовательности RASKSISKYLA (SEQ ID NO: 4), LCDR2, содержащий или состоящий из аминокислотной последовательности SGSTLQS (SEQ ID NO: 5), и LCDR3, содержащий или состоящий из аминокислотной последовательности QQHNEYPWT (SEQ ID NO: 6). В некоторых вариантах реализации HCDR1 содержит или состоит из аминокислотной последовательности GYTFTDHTIH (SEQ ID NO: 1), и HCDR2 содержит или состоит из аминокислотной последовательности YNYPRDGSTKYNEKFQG (SEQ ID NO: 44). В некоторых вариантах реализации HCDR1 содержит или состоит из аминокислотной последовательности GYTFTDHTIH (SEQ ID NO: 1), и HCDR2 содержит или состоит из аминокислотной последовательности YNYPREGSTKYNEKFQG (SEQ ID NO: 45). В некоторых вариантах реализации HCDR1 содержит или состоит из аминокислотной последовательности GYTFTDHTIH (SEQ ID NO: 1), и HCDR2 содержит или состоит из аминокислотной последовательности YNYPRDVSTKYNEKFQG (SEQ ID NO: 46). В некоторых вариантах реализации HCDR1 содержит или состоит из аминокислотной последовательности GYTFTDHTIH (SEQ ID NO: 1), и HCDR2 содержит или состоит из аминокислотной последовательности YN YPRDGS TKYAEKFQG (SEQ ID NO: 47). В некоторых вариантах реализации HCDR1 содержит или состоит из аминокислотной последовательности GYTFTDHTMH (SEQ ID NO: 43), и HCDR2 содержит или состоит из аминокислотной последовательности YNYPRDGSTKYNEKFQG (SEQ ID NO: 44). В некоторых вариантах реализации HCDR1 содержит или состоит из аминокислотной последовательности GYTFTDHTMH (SEQ ID NO: 43), и HCDR2 содержит или состоит из аминокислотной последовательности YNYPREGSTK YNEKFQG (SEQ ID NO: 45). В некоторых вариантах реализации HCDR1 содержит или состоит из аминокислотной последовательности GYTFTDHTMH (SEQ ID NO: 43), и HCDR2 содержит или состоит из аминокислотной последовательности YNYPRDVSTK YNEKFQG (SEQ ID NO: 46). В некоторых вариантах реализации HCDR1 содержит или состоит из аминокислотной последовательности GYTFTDHTMH (SEQ ID NO: 43), и HCDR2 содержит или состоит из аминокислотной последовательности YNYPRDGSTKYAEKFQG (SEQ ID NO: 47). В некоторых вариантах реализации VH содержит или состоит из аминокислотной последовательности, которая по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 97% идентична или на 100% идентична SEQ ID NO: 48, и VL содержит или состоит из аминокислотной последовательности, которая по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 97% идентична или на 100% идентична SEQ ID NO: 53. В некоторых вариантах реализации VH содержит или состоит из аминокислотной последовательности, которая по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 97% идентична или на 100% идентична SEQ ID NO: 48, и VL содержит или состоит из аминокислотной последовательности, которая по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 97% идентична или на 100% идентична SEQ ID NO: 54. В некоторых вариантах реализации VH содержит или состоит из аминокислотной последовательности, которая по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 97% идентична или на 100% идентична SEQ ID NO: 48, и VL содержит или состоит из аминокислотной последовательности, которая по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 97% идентична или на 100% идентична SEQ ID NO: 55. В некоторых вариантах реализации VH содержит или состоит из аминокислотной последовательности, которая по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 97% идентична или на 100% идентична SEQ ID NO: 49, и VL содержит или состоит из аминокислотной последовательности, которая по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 97% идентична или на 100% идентична SEQ ID NO: 53. В некоторых вариантах реализации VH содержит или состоит из аминокислотной последовательности, которая по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 97% идентична или на 100% идентична SEQ ID NO:

49, и VL содержит или состоит из аминокислотной последовательности, которая по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 97% идентична или на 100% идентична SEQ ID NO: 54. В некоторых вариантах реализации VH содержит или состоит из аминокислотной последовательности, которая по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 97% идентична или на 100% идентична SEQ ID NO: 49, и VL содержит или состоит из аминокислотной последовательности, которая по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 97% идентична или на 100% идентична SEQ ID NO: 55. В некоторых вариантах реализации VH содержит или состоит из аминокислотной последовательности, которая по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 97% идентична или на 100% идентична SEQ ID NO: 50, и VL содержит или состоит из аминокислотной последовательности, которая по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 97% идентична или на 100% идентична SEQ ID NO: 53. В некоторых вариантах реализации VH содержит или состоит из аминокислотной последовательности, которая по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 97% идентична или на 100% идентична SEQ ID NO:

50, и VL содержит или состоит из аминокислотной последовательности, которая по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 97% идентична или на 100% идентична SEQ ID NO: 54. В некоторых вариантах реализации VH содержит или состоит из аминокислотной последовательности, которая по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 97% идентична или на 100% идентична SEQ ID NO: 50, и VL содержит или состоит из аминокислотной последовательности, которая по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 97% идентична или на 100% идентична SEQ ID NO: 55. В некоторых вариантах реализации VH содержит или состоит из аминокислотной последовательности, которая по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 97% идентична или на 100% идентична SEQ ID NO: 51, и VL содержит или состоит из аминокислотной последовательности, которая по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 97% идентична или на 100% идентична SEQ ID NO: 53. В некоторых вариантах реализации VH содержит или состоит из аминокислотной последовательности, которая по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 97% идентична или на 100% идентична SEQ ID NO: 51, и VL содержит или состоит из аминокислотной последовательности, которая по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 97% идентична или на 100% идентична SEQ ID NO: 54. В некоторых вариантах реализации VH содержит или состоит из аминокислотной последовательности, которая по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 97% идентична или на 100% идентична SEQ ID NO: 51, и VL содержит или состоит из аминокислотной последовательности, которая по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 97% идентична или на 100% идентична SEQ ID NO: 55. В некоторых вариантах реализации VH содержит или состоит из аминокислотной последовательности, которая по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 97% идентична или на 100% идентична SEQ ID NO: 52, и VL содержит или состоит из аминокислотной последовательности, которая по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 97% идентична или на 100% идентична SEQ ID NO: 53. В некоторых вариантах реализации VH содержит или состоит из аминокислотной последовательности, которая по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 97% идентична или на 100% идентична SEQ ID NO: 52, и VL содержит или состоит из аминокислотной последовательности, которая по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 97% идентична или на 100% идентична SEQ ID NO: 54. В некоторых вариантах реализации VH содержит или состоит из аминокислотной последовательности, которая по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 97% идентична или на 100% идентична SEQ ID NO: 52, и VL содержит или состоит из аминокислотной последовательности, которая по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 97% идентична или на 100% идентична SEQ ID NO: 55. В некоторых вариантах реализации антитело h6B5 или его антигенсвязывающий фрагмент содержит вариабельную тяжелую цепь (VH) и вариабельную легкую цепь (VL), где VH содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 48, и где VL содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 53. В некоторых вариантах реализации антитело h6B5 или его антигенсвязывающий фрагмент содержит вариабельную тяжелую цепь (VH) и вариабельную легкую цепь (VL), где VH содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 48, и где VL содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 55. В некоторых вариантах реализации антитело h6B5 или его антигенсвязывающий фрагмент содержит вариабельную тяжелую цепь (VH) и вариабельную легкую цепь (VL), где VH содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 49, и где VL содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 53. В некоторых вариантах реализации антитело h6B5 или его антигенсвязывающий фрагмент содержит вариабельную тяжелую цепь (VH) и вариабельную легкую цепь (VL), где VH содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 49, и где VL содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 54. В некоторых вариантах реализации антитело h6B5 или его антигенсвязывающий фрагмент содержит вариабельную тяжелую цепь (VH) и вариабельную легкую цепь (VL), где VH содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 50, и где VL содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 53. В некоторых вариантах реализации антитело h6B5 или его антигенсвязывающий фрагмент содержит вариабельную тяжелую цепь (VH) и вариабельную легкую цепь (VL), где VH содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 50, и где VL содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 54. В некоторых вариантах реализации антитело h6B5 или его антигенсвязывающий фрагмент содержит вариабельную тяжелую цепь (VH) и вариабельную легкую цепь (VL), где VH содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 51, и где VL содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 53. В некоторых вариантах реализации антитело h6B5 или его антигенсвязывающий фрагмент содержит вариабельную тяжелую цепь (VH) и вариабельную легкую цепь (VL), где VH содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 52, и где VL содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 53.

[0038] В некоторых вариантах реализации антитело против церамида или его антигенсвязывающий фрагмент содержит вариабельную тяжелую цепь (V_H) и вариабельную легкую цепь (V_L), где V_H содержит определяющий комплементарность участок 1 тяжелой цепи (HCDR1), содержащий аминокислотную последовательность GYTFTNYWMH (SEQ ID NO: 33), HCDR2, содержащий аминокислотную последовательность AIYPGDSDTSYNQKFKG (SEQ ID NO: 34), и HCDR3, содержащий аминокислотную последовательность GLYYGYD (SEQ ID NO: 35), и где V_L содержит определяющий комплементарность участок 1 легкой цепи (LCDR1), содержащий аминокислотную последовательность KSSQSLIDSDGKTFLN (SEQ ID NO: 36), LCDR2, содержащий аминокислотную последовательность LVSKLDS (SEQ ID NO: 37), и LCDR3, содержащий аминокислотную последовательность WQGTHFPYT (SEQ ID NO: 38). В некоторых вариантах реализации V_H содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 39, и при этом V_L содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 40. В некоторых вариантах реализации антитело против церамида или его антигенсвязывающий фрагмент представляет собой антитело 2А2. В некоторых вариантах реализации антитело против церамида или его антигенсвязывающий фрагмент представляет собой scFv 2А2.

[0039] В некоторых вариантах реализации предотвращение диабетической ретинопатии или воспалительного заболевания глаза включает отсрочку начала диабетической ретинопатии или воспалительного заболевания глаза. В некоторых вариантах реализации один или более симптомов диабетической ретинопатии или воспалительного заболевания глаза у субъекта уменьшаются по сравнению с субъектом в контроле или по сравнению с субъектом до лечения антителом против церамида или его антигенсвязывающим фрагментом. В некоторых вариантах реализации один или более симптомов диабетической ретинопатии или воспалительного заболевания глаза выбраны из воспаления сетчатки, образования бесклеточного капилляра, неоваскуляризации сетчатки, гибели эндотелиальных клеток сетчатки, проницаемости сосудов сетчатки, ишемически-реперфузионного повреждения сетчатки, области протечки сетчатки и нарушения окклюдина. В некоторых вариантах реализации один или более симптомов диабетической ретинопатии или воспалительного заболевания глаза уменьшаются по меньшей мере на 10%, по меньшей мере на 20%, по меньшей мере на 30%, по меньшей мере на 40% или по меньшей мере на 50% по сравнению с субъектом в контроле или по сравнению с субъектом до лечения антителом против церамида или его антигенсвязывающим фрагментом.

[0040] В некоторых вариантах реализации уровень экспрессии одного или более воспалительных маркеров в глазу снижается по сравнению с уровнем экспрессии в глазу субъекта в контроле или по сравнению с уровнем экспрессии в глазу субъекта до лечения антителом против церамида или его антигенсвязывающим фрагментом. В некоторых вариантах реализации один или более воспалительных маркеров выбран из цитокина, фактора роста и молекулы адгезии. В некоторых вариантах реализации цитокин выбран из TNFα, IL-1β, IL-6 или МСР1. В некоторых вариантах реализации фактор роста представляет собой VEGF. В некоторых вариантах реализации молекула адгезии представляет собой ICAM-1 или VCAM-1. В некоторых вариантах реализации уровень экспрессии одного или более воспалительных маркеров в глазу субъекта снижается по меньшей мере на 10%, по меньшей мере на 20%, по меньшей мере на 30%, по меньшей мере на 40% или по меньшей мере на 50% по сравнению с уровнем экспрессии в глазу субъекта в контроле или по сравнению с уровнем экспрессии в глазу субъекта до лечения антителом против церамида или его антигенсвязывающим фрагментом.

[0041] В некоторых вариантах реализации у субъекта увеличивается один или более параметров зрения по сравнению с параметрами зрения субъекта в контроле или по сравнению с параметрами зрения субъекта до лечения антителом против церамида или его антигенсвязывающим фрагментом. В некоторых вариантах реализации один или более параметров зрения выбран из периферийного зрения; ночного зрения; цветового зрения; дальнего зрения; ближнего зрения; и четкости зрения.

[0042] В некоторых вариантах реализации сосудистая проницаемость сетчатки в глазу субъекта снижается по меньшей мере на 10%, по меньшей мере на 20%, по меньшей мере на 30%, по меньшей мере на 40% или по меньшей мере на 50% по сравнению с сосудистой проницаемостью сетчатки в глазу субъекта в контроле или по сравнению с уровнем экспрессии в глазу субъекта до лечения антителом против церамида или его антигенсвязывающим фрагментом.

[0043] В некоторых вариантах реализации средний балл оценки ранней диабетической ретинопатии (ETDRS) в группе субъектов снижается по меньшей мере на 0,2, по меньшей мере на 0,5, по меньшей мере на 1, по меньшей мере на 1,5, по меньшей мере на 2 или по меньшей мере на 2,5 по сравнению со средним баллом оценки ETDRS в группе субъектов в контроле или по сравнению со средним баллом оценки ETDRS в группе субъектов до лечения антителом против церамида или его антигенсвязывающим фрагментом.

Подробное описание

Обзор

[0044] Настоящее изобретение относится к композициям и способам лечения диабетической ретинопатии. В некоторых вариантах реализации предложены композиции антител против церамида и их антигенсвязывающих фрагментов (например, scFvs) и способы применения для лечения или предотвращения диабетической ретинопатии. Такие композиции и способы можно применять для лечения диабетической ретинопатии у пациентов, которые ранее не получали другого лечения диабетической ретинопатии, например, терапии антителами против VEGF. Кроме того, предложен способ интравитреального введения scFv против церамида.

Определения

[0045] Употребление предметов в единственном числе в настоящей заявке и прилагаемой формуле изобретения включает множественное число указанных предметов, если иное явно не следует из контекста.

[0046] В контексте настоящего описания термин «и/или» используется в настоящем описании для обозначения «и» или «или», если не указано иное.

[0047] Во всем тексте описания, если контекст явно не требует иного, слова «содержать (включать)» или их вариации, такие как «содержит» или «содержащий», будут подразумевать включение указанного элемента или целого числа или группы элементов или целых чисел, но не исключая любой другой элемент или целое число или группу элементов или целых чисел.

[0048] При использовании в настоящей заявке термины «около» и «приблизительно» используются в качестве эквивалентов. Любые цифры, используемые в настоящей заявке совместно или без около/приблизительно, предназначены для покрытия любых нормальных колебаний, понятных специалисту в соответствующей области техники. В некоторых вариантах реализации термин «приблизительно» или «около» относится к диапазону значений, которые находятся в пределах 10% или менее в любом направлении (больше или меньше) от указанного эталонного значения, если иное не указано или не следует из контекста (за исключением случаев, когда такое число превышает 100% от возможного значения или опускается ниже 0% от возможного значения).

[0049] Термин «образец» относится к биологической композиции (например, клетке или части ткани), которая подвергается анализу и/или модификации. Согласно некоторым вариантам реализации образец представляет собой «первичный образец», поскольку он получен непосредственно от субъекта; согласно некоторым вариантам реализации «образец» представляет собой результат обработки первичного образца, например, для удаления определенных компонентов и/или выделения или очистки определенных компонентов, представляющих интерес.

[0050] Термин «субъект» включает животных, таких как, например, млекопитающие. В некоторых вариантах реализации млекопитающее представляет собой примата. В некоторых вариантах реализации млекопитающее представляет собой человека. В некоторых вариантах реализации субъекты представляют собой домашний скот, такой как крупный рогатый скот, овцы, козы, коровы, свиньи и тому подобное; или домашних животных, таких как собаки и кошки. В некоторых вариантах реализации (например, в частности, в контексте исследований) субъектами являются грызуны (например, мыши, крысы, хомяки), кролики, приматы или свиньи, такие как инбредные свиньи и т.д. Термины «субъект» и «пациент» используются в настоящей заявке взаимозаменяемо. В некоторых вариантах реализации субъект может быть новорожденным, несовершеннолетним или взрослым. Особый интерес представляют субъекты-млекопитающие. Виды млекопитающих, которые можно лечить с помощью настоящих способов, включают собак и кошек; лошадей; крупный рогатый скот; овец; и т.д. и приматов, в частности людей. Модели животных, особенно мелких млекопитающих (например, мышей, крыс, морских свинок, хомяков, кроликов и т.д.), могут использоваться для экспериментальных исследований.

[0051] В контексте настоящей заявки термины «лечение», «лечить» или «облегчение» относятся либо к терапевтическому лечению, либо к профилактическому/превентивному лечению. Лечение является терапевтическим, если по меньшей мере один симптом заболевания у индивидуума, получающего лечение, улучшается или лечение может замедлить ухудшение прогрессирующего заболевания у индивидуума или предотвратить возникновение дополнительных сопутствующих заболеваний.

[0052] В контексте настоящей заявки термин «эффективное количество» относится к минимальному количеству агента или композиции, необходимому для достижения конкретного физиологического эффекта. Эффективное количество конкретного агента может быть представлено различными способами в зависимости от природы агента, такими как масса/объем, количество клеток/объем, частицы/объем, (масса агента)/(масса субъекта), количество клеток/(масса субъекта) или частицы/(масса субъекта). Эффективное количество конкретного агента также может быть выражено как полумаксимальная эффективная концентрация (ЕС₅₀), которая относится к концентрации агента, которая приводит к величине конкретного физиологического ответа, которая является серединой между эталонным уровнем и максимальным уровнем ответа.

[0053] Термин «антитело» относится к молекуле иммуноглобулина (Ig), способной связываться с конкретной мишенью, такой как углевод, полинуклеотид, липид или полипептид, по меньшей мере через один сайт распознавания эпитопов, расположенный в вариабельной области молекулы Ig. Используемый в настоящей заявке термин охватывает интактные поликлональные или моноклональные антитела и их антигенсвязывающие фрагменты. Например, нативная молекула иммуноглобулина состоит из двух полипептидов тяжелой цепи и двух полипептидов легкой цепи. Каждый из полипептидов тяжелой цепи ассоциируется с полипептидом легкой цепи посредством межцепочечных дисульфидных связей между полипептидами тяжелой и легкой цепи с образованием двух гетеродимерных белков или полипептидов (т.е. белка, состоящего из двух гетерологичных полипептидных цепей). Затем два гетеродимерных белка связываются посредством дополнительных межцепочечных дисульфидных связей между полипептидами тяжелой цепи с образованием белка или полипептида иммуноглобулина.

[0054] В настоящей заявке термин «антигенсвязывающий фрагмент» обозначает полипептидный фрагмент, который содержит по меньшей мере один определяющий комплементарность участок (CDR) тяжелой и/или легкой цепи иммуноглобулина, который связывается по меньшей мере с одним эпитопом антигена, представляющего интерес. В связи с этим, антигенсвязывающий фрагмент описанных в данной заявке антител может содержать 1, 2, 3, 4, 5 или все 6 CDR последовательности вариабельной тяжелой цепи (VH) и вариабельной легкой цепи (VL) из антител, которые специфично связывают церамид. Антигенсвязывающие фрагменты включают белки, которые содержат часть полноразмерного антитела, в целом, его антигенсвязывающую или вариабельную область, такие как Fab, F(ab')2, Fab', Fv-фрагменты, мини-антитела, диатела, однодоменное антитело (dAb), одноцепочечные вариабельные фрагменты (scFv), мультиспецифичные антитела, образованные из фрагментов антител, и любую другую модифицированную конфигурацию молекулы иммуноглобулина, которая содержит антигенсвязывающий сайт или фрагмент с требуемой специфичностью. Согласно определенным вариантам реализации антигенсвязывающий фрагмент, а не интактное антитело, используют для увеличения проникновения в ткань или проникновения в опухоль. В других вариантах реализации антигенсвязывающие фрагменты дополнительно модифицируют для увеличения периода полужизни в сыворотке.

[0055] «Fc-область» или «Fc-домен» относится к полипептидной последовательности, соответствующей или полученной из части антитела, которая способна связываться с Fc-рецепторами на клетках и/или компоненте C1q комплемента, тем самым опосредуя эффекторную функцию антитела. Fc означает «кристаллический фрагмент», фрагмент антитела, который легко образует белковый кристалл. Отдельные фрагменты белка, которые изначально были описаны с помощью протеолитического расщепления, могут определять общую структуру белка иммуноглобулина. Как первоначально определено в литературе, Fc-область представляет собой гомодимерный белок, содержащий два полипептида, которые связаны дисульфидными связями, и каждый из которых содержит шарнирную область, домен СН2 и домен СН3. Однако в последнее время этот термин применяется к одноцепочечному мономерному компоненту, состоящему из СН3, СН2 и по меньшей мере части шарнира, достаточной для образования дисульфид-связанного димера со второй такой цепью. Таким образом, и в зависимости от контекста, использование терминов «Fc-область» или «Fc-домен» будет относиться в настоящей заявке либо к димерной форме, либо к отдельным мономерам, которые ассоциируются с образованием димерного белка. Для обзора структуры и функции иммуноглобулина см. Putnam, The Plasma Proteins, Vol.V (Academic Press, Inc., 1987), pp.49-140; и Padlan, Mol. Immunol. 31:169-217, 1994. При использовании в настоящей заявке термин Fc-домен включает варианты встречающихся в природе последовательностей.

[0056] Термин «константная область иммуноглобулина» или «константная область» относится к пептидной или полипептидной последовательности, которая соответствует или получена из части или всех одного или более константных доменов иммуноглобулина (например, CH1, СН2, СН3). В отдельных вариантах реализации константная область не содержит СН1 домен. В отдельных вариантах реализации константные домены, составляющие константную область, представляют собой человеческие.

[0057] Термины «вариабельная область легкой цепи» (также называемая «вариабельным доменом легкой цепи» или «VL») и «вариабельная область тяжелой цепи» (также называемая «вариабельным доменом тяжелой цепи» или «VH») относятся к вариабельной области связывания из легкой и тяжелой цепи антитела, соответственно. Вариабельные связывающие области состоят из дискретных, четко определенных подобластей, известных как «определяющие комплементарность участки» (CDR) и «каркасные области» (FR).

[0058] Термин «константная область легкой цепи иммуноглобулина» (также называемая «константной областью легкой цепи» или «CL») представляет собой константную область из легкой цепи антитела.

[0059] Термин «константная область тяжелой цепи иммуноглобулина» (также называемая «константной областью тяжелой цепи» или «СН») относится к константной области из тяжелой цепи антитела. СН дополнительно делится, в зависимости от изотипа антитела, на домены CH1, СН2 и СН3 (IgA, IgD, IgG) или CH1, СН2, СН3 и СН4 (IgE, IgM).

[0060] Термин «F(ab)» относится к двум белковым фрагментам, полученным в результате протеолитического расщепления молекул IgG ферментом папаином. Каждый F(ab) содержит ковалентный гетеродимер VH-цепи и VL-цепи и содержит интактный антигенсвязывающий сайт. Каждый F(ab) представляет собой одновалентный антигенсвязывающий фрагмент. Термин «Fab'» относится к фрагменту, полученному из F(ab')2, и может содержать небольшую часть Fc. Каждый Fab'-фрагмент представляет собой одновалентный антигенсвязывающий фрагмент.

[0061] Термин «F(ab')2» относится к белковому фрагменту IgG, полученному путем протеолитического расщепления ферментом пепсином. Каждый Е(ab')2-фрагмент содержит два Е(ab')-фрагмента и, следовательно, представляет собой бивалентный антигенсвязывающий фрагмент.

[0062] «Fd-фрагмент» содержит домены VH и СН1.

[0063] «Fv-фрагмент» относится к нековалентному гетеродимеру VH::VL, который включает антигенсвязывающий сайт, который сохраняет большую часть возможностей распознавания и связывания антигена молекулы нативного антитела, но не содержит доменов СН1 и CL, содержащихся в Fab. Inbar et al. (1972) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 69:2659-2662; Hochman et al. (1976) Biochem 15:2706-2710; и Ehrlich et al. (1980) Biochem 19:4091-4096. В некоторых вариантах реализации Fv-фрагмент может быть получен путем преимущественного протеолитического расщепления IgM и в редких случаях молекулы иммуноглобулина IgG или IgA. Fv-фрагменты, однако, чаще получают с использованием рекомбинантных методов, известных в данной области техники.

[0064] «dAb-фрагмент» (Ward et al., Nature 341:544 546, 1989) содержит домен VH.

[0065] «Одноцепочечное антитело» или «scFv» представляет собой слитый белок вариабельных областей тяжелой (VH) и легкой цепей (VL) иммуноглобулинов, соединенный с коротким линкерным пептидом из десяти до приблизительно 25 аминокислот. Линкер может быть богат глицином для гибкости, а также серином или треонином для растворимости, и может либо соединять N-конец VH с С-концом VL, либо наоборот.ScFv сохраняет специфичность исходного иммуноглобулина, несмотря на удаление константных областей и введение линкера. В настоящем изобретении любое упоминание антител или фрагментов антител или их применение предназначено для того, чтобы содержать молекулы scFv и их применение.

[0066] «Мини-антитела» относятся к слитому белку, содержащему scFv, присоединенный к домену СНЗ, и также включены в настоящую заявку (S. Ни et al., Cancer Res., 56, 3055-3061, 1996). См., например, Ward, Е. S. et al, Nature 341, 544-546 (1989); Bird et al., Science, 242, 423-426, 1988; Huston et al., PNAS USA, 85, 5879-5883, 1988); PCT/US92/09965; WO94/13804; P. Holliger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 6444-6448, 1993; Y. Reiter et al., Nature Biotech, 14, 1239-1245, 1996; S. Ни et al., Cancer Res., 56, 3055-3061, 1996.

[0067] Термин «диатело» относится к биспецифичному антителу, в котором домены VH и VL экспрессируются в одной полипептидной цепи с использованием линкера, слишком короткого для возможности спаривания между двумя доменами на одной цепи, тем самым вынуждая домены спариваться с комплементарными доменами другой цепи и создавая два антигенсвязывающих сайта (см., например, Holliger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-48 (1993) и Poljak et al., Structure 2:1121-23 (1994)).

[0068] Термин «нанотело» или «однодоменное антитело» относится к антигенсвязывающему фрагменту, состоящему из одного мономерного вариабельного домена антитела. Способ Nanoclone представляет собой способ для получения нанотел против желаемой цели, основанный на автоматизированном высокопроизводительном выборе В-клеток. (См. WO 2006/079372).

[0069] Термин «моноклональное антитело» при использовании в настоящей заявке относится к антителу, полученному из популяции по существу гомогенных антител, т.е. отдельные антитела, входящие в состав популяции, являются идентичными, за исключением возможных природных мутаций, которые могут присутствовать в незначительном количестве.

[0070] Термин «химерное антитело» в настоящей заявке относится к моноклональному антителу, в котором часть тяжелой и/или легкой цепи идентична или гомологична соответствующим последовательностям в антителах, полученных от конкретного вида или принадлежащих к конкретному классу или подклассу антител, в то время как остальная часть цепи(цепей) идентична или гомологична соответствующим последовательностям в антителах, полученных от другого вида или принадлежащих к другому классу или подклассу антител, а также фрагментам таких антител, при условии, что они проявляют желаемую биологическую активность.

[0071] Термин «одноцепочечный вариабельный фрагмент» или «scFv» относится к слитому белку вариабельных областей тяжелой (VH) и легкой цепей (VL) иммуноглобулинов, соединенному с коротким линкерным пептидом из десяти до около 25 аминокислот.Huston et at. (1988) Proc. Nat. Acad. Sci. USA S5(16):5879-5883. Линкер может соединять N-конец VH с С-концом VL или наоборот. Описан ряд способов для определения химических структур для превращения естественно агрегированных, но химически разделенных легких и тяжелых полипептидных цепей из V-области антитела в молекулу scFv, которая будет складываться в трехмерную структуру, по существу схожую со структурой антигенсвязывающего сайта. См., например, патент США №5,091,513 и 5,132,405, Huston et at; и патент США №4,946,778, Ladner et al.

[0072] При использовании в настоящей заявке термин «CDR» относится к «определяющему комплементарность участку» молекулы иммуноглобулина (антитела). CDR являются частью вариабельного домена в антителе, где антитело связывается со своим специфичным антигеном. Существует три CDR на вариабельный домен (т.е. CDR1, CDR2 и CDR3 в вариабельном домене легкой цепи и CDR1, CDR2 и CDR3 в вариабельном домене тяжелой цепи). В пределах вариабельного домена CDR1 и CDR2 находятся в вариабельной (V) области полипептидной цепи, CDR3 демонстрирует наибольшую вариабельность, поскольку кодируется рекомбинацией VJ в случае области легкой цепи и VDJ в случае областей тяжелой цепи.

[0073] «Выделенное антитело» представляет собой антитело, которое (1) не связано с естественными компонентами, включая другие естественные антитела, которые сопровождают его в нативном состоянии, (2) не содержит других белков оттого же вида, (3) экспрессируется клеткой другого вида или (4) не встречается в природе.

[0074] Термин «антитело человека» включает все антитела, которые имеют одну или более вариабельных и константных областей, полученных из последовательностей иммуноглобулина человека. В предпочтительном варианте реализации все вариабельные и константные домены получены из последовательностей иммуноглобулина человека (полностью человеческое антитело). Эти антитела могут быть получены различными способами, как описано ниже.

[0075] Используемый в настоящей заявке термин «гуманизированное» относится к антителу или его антигенсвязывающему фрагменту, происходящему из вида, не относящегося к человеческому роду, который сохраняет антигенсвязывающие свойства исходного антитела, не относящегося к человеческому роду. В некоторых вариантах реализации связывающие фрагменты антитела (например, вариабельные области легкой и тяжелой цепи, Fab, scFv) являются гуманизированными. Нечеловеческие антигенсвязывающие фрагменты могут быть гуманизированы с использованием методов, известных как трансплантация CDR (Jones et al., Nature 321:522 (1986)) и их варианты, включая «изменение формы» (Verhoeyen, et al., 1988 Science 239:1534-1536; Riechmann, et al., 1988 Nature 332:323-337; Tempest, et al., Bio/Technol 1991 9:266-271), «гиперхимеризацию» (Queen, et al., 1989 Proc Natl Acad Sci USA 86:10029-10033; Co, et al., 1991 Proc Natl Acad Sci USA 88:2869-2873; Co, et al., 1992 J Immunol 148:1149-1154), и «венирование» (Mark, et al., "Derivation of therapeutically active humanized and veneered anti-CD 18 antibodies." In: Metcalf BW, Dalton BJ, eds. Cellular adhesion: molecular definition to therapeutic potential. New York: Plenum Press, 1994: 291-312). При получении из источника, отличного от человека, другие области антитела, такие как шарнирная область и домены константной области, также могут быть гуманизированы.

[0076] Используемый в настоящей заявке термин «фармацевтически приемлемый» относится к молекулярным объектам и композициям, которые обычно не вызывают аллергических или других серьезных нежелательных реакций при введении с использованием способов, хорошо известных в данной области техники. Молекулярные образования и композиции, одобренные регулирующим органом федеральной или региональной власти или приведенные в Фармакопее США или иной общепризнанной фармакопее для применения у животных, и в более конкретном случае у людей, считаются «фармацевтически приемлемыми».

[0077] Термины «предотвращение», «профилактика» и «профилактически» относятся к введению соединения, например, антитела против церамида или его антигенсвязывающего фрагмента, до начала заболевания (например, до появления определенных симптомов заболевания). Предотвращение заболевания может включать снижение вероятности того, что заболевание произойдет, замедление начала заболевания, облегчение долгосрочных симптомов или замедление возможного прогрессирования заболевания.

[0078] В настоящей заявке термин «специфично связывается» обозначает способность антитела или его антигенсвязывающего фрагмента связываться с антигеном-мишенью с аффинностью связывания (Ka), составляющей по меньшей мере 10⁵М^-1, при этом существенно не связываясь с другими компонентами или антигенами, присутствующими в смеси. Ссылка на антитело против церамида в настоящей заявке относится к антителу или его антигенсвязывающему фрагменту, которое специфично связывается с церамидом.

[0079] Используемый в настоящей заявке термин «идентичность последовательности» относится к взаимосвязи между двумя или более полинуклеотидными последовательностями или между двумя или более полипептидными последовательностями. Когда положение в одной последовательности занято тем же основанием нуклеиновой кислоты или аминокислотным остатком в соответствующем положении последовательности сравнения, последовательности называют «идентичными» в этом положении. Процент идентичности последовательности рассчитывают путем определения количества положений, в которых находится идентичное основание нуклеиновой кислоты или аминокислотный остаток в обеих последовательностях, с получением количества идентичных положений. Затем количество идентичных положений делят на общее количество положений в окне сравнения и умножают на 100, чтобы получить процент идентичности последовательности. Процент идентичности последовательностей определяют путем сравнения двух оптимально выровненных последовательностей в окне сравнения. Окно сравнения для полинуклеотидных последовательностей может составлять, например, по меньшей мере 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 или 1000 или более нуклеиновых кислот в длину. Окно сравнения для полипептидных последовательностей может составлять, например, по меньшей мере 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 300 или более аминокислот в длину. Чтобы оптимально выровнять последовательности для сравнения, часть полинуклеотидной или полипептидной последовательности в окне сравнения может содержать добавления или делеции, называемые гэпами, в то время как эталонная последовательность остается постоянной. Оптимальным выравниванием является такое выравнивание, которое, даже с гэпами, дает максимально возможное количество «идентичных» положений между эталонной и сравниваемой последовательностями. Процент «идентичности последовательностей» между двумя последовательностями может быть определен с использованием версии программы «BLAST 2 Sequences)), которая была доступна в Национальном центре биотехнологической информации по состоянию на 1 сентября 2004 года, которая включает программы BLASTN (для сравнения нуклеотидных последовательностей) и BLASTP (для сравнения полипептидных последовательностей), при этом программы основаны на алгоритме Карлина и Альтшула (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90(12):5873-5877, 1993). При использовании параметров «BLAST 2 Sequences)), которые представляли собой параметры по умолчанию по состоянию на 1 сентября 2004 года, можно использовать для размера сегмента (3), штрафа за открытие гэпа (11), штрафа за расширение гэпа (1), закрытие гэпа (50), ожидаемого значения (10) и любого другого требуемого параметра, включая, но не ограничиваясь опцией матрицы. Считается, что две последовательности нуклеотидов или аминокислот имеют «по существу сходную идентичность последовательности» или «по существу идентичность последовательности», если две последовательности имеют по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичность последовательности по отношению друг к другу.

[0080] «Ангиогенез» относится к образованию новых кровеносных сосудов.

[0081] При использовании в настоящей заявке термин «окулярный» или «глазной» относится к введению лекарственного средства в глаз и окружающую ткань. Например, в некоторых вариантах реализации изобретения окулярное введение включает: местное введение (например, введение на поверхность глаза, например, склеру), интраокулярное введение, субконъюнктивальное введение (например, под конъюнктиву глазного яблока или под конъюнктиву век), внутрикамерное введение, инъекцию в переднюю камеру через височный край, интрастромальное введение, внутрироговичное введение, субретинальное введение, инъекцию во внутриглазную жидкость, субтеноновое введение, введение в супрахориоидное пространство (SCS), введение в супрацилиарное пространство или интравитреальное введение.

Антитела против церамида, фрагменты антител и производные

[0082] Настоящее изобретение относится к антителам против церамида и их антигенсвязывающим фрагментам для лечения диабетической ретинопатии. Церамиды представляют собой семейство воскообразных липидных молекул. Церамид состоит из сфингозина и жирной кислоты. Церамиды находятся в высоких концентрациях внутри клеточной мембраны эукариотических клеток, так как они являются компонентами липидов, которые составляют сфингомиелин, один из основных липидов в липидном бислое. Церамид участвует в различных клеточных сигналах, включая регулирование дифференцировки, пролиферации и запрограммированной гибели клеток (PCD). Как биоактивный липид, церамид участвовал в различных физиологических функциях, включая апоптоз, остановку роста клеток, дифференцировку, старение клеток, миграцию клеток и адгезию. Роли церамида и его последующих метаболитов также предполагали в ряде патологических состояний, включая рак, нейродегенерацию, диабет, микробный патогенез, ожирение и воспаление.

[0083] Последовательности и свойства иллюстративных антител против церамида также раскрыты в публикациях патентных заявок США №2010/0239572 и 2017/0335014, каждая из которых включена в настоящую заявку посредством ссылки. Последовательности иллюстративных антител против церамида приведены в Таблице 1. Однако любое антитело против церамида или его антигенсвязывающий фрагмент могут быть использованы в соответствии с описанными способами и применениями.

[0084] В некоторых вариантах реализации антитело против церамида или его антигенсвязывающий фрагмент представляет собой гуманизированное антитело 6В5 (h6B5). В некоторых вариантах реализации антитело h6B5 или его антигенсвязывающий фрагмент содержит HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3. В некоторых вариантах реализации последовательности антитела h6B5 представлены в предварительной заявке на патент США 62/991,232, поданной 18 марта 2020 года, содержание которой полностью включено в настоящую заявку посредством ссылки для всех целей. Последовательности для каждого из CDR антитела h6B5 или его антигенсвязывающего фрагмента раскрыты в настоящем описании и обобщены в Таблице 2 ниже.

[0085] В некоторых вариантах реализации антитело против церамида выбрано из группы, состоящей из моноклонального антитела, химерного антитела, гуманизированного антитела, антитела человека, рекомбинантного антитела или синтетического антитела. В некоторых вариантах реализации антигенсвязывающий фрагмент антитела против церамида представляет собой антигенсвязывающий фрагмент любого из вышеперечисленных. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения фрагмент антигенсвязывающего антитела против церамида представляет собой Fab-фрагмент, Fab'-фрагмент, Р(ab')2-фрагмент, Fv-фрагмент, Fd-фрагмент, dAb-фрагмент, диатело, scFv или тому подобное. В некоторых вариантах реализации антитела против церамида и их антигенсвязывающие фрагменты получают с использованием технологий рекомбинантной ДНК. Способы экспрессии и очистки рекомбинантных белков хорошо известны в данной области техники.

[0086] В некоторых вариантах реализации антитело против церамида или его антигенсвязывающий фрагмент представляет собой одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv). В некоторых вариантах реализации scFv содержит последовательности CDR и/или последовательности вариабельной цепи антител 2А2, h2A2, 6С8, 7В10, 9Н10, h6B5 или 6 В5.

[0087] В некоторых вариантах реализации антитело против церамида или его антигенсвязывающий фрагмент представляет собой антитело 2А2 или его антигенсвязывающий фрагмент, как описано в публикации патента США №2010/0239572. В некоторых вариантах реализации антитело против церамида или его антигенсвязывающий фрагмент представляет собой антитело 6 В5 или его антигенсвязывающий фрагмент, как описано в публикации патента США №2017/0335014. В некоторых вариантах реализации антитело против церамида или его антигенсвязывающий фрагмент представляет собой антитело h6B5 или его антигенсвязывающий фрагмент согласно настоящему изобретению. В некоторых вариантах реализации антитело против церамида или его антигенсвязывающий фрагмент представляет собой scFv. В некоторых вариантах реализации scFV содержит последовательности CDR любого из антител, раскрытых в Таблице 1. В некоторых вариантах реализации scFv содержит последовательности CDR 2А2. В некоторых вариантах реализации scFv содержит последовательности CDR 6В5. В некоторых вариантах реализации scFv содержит последовательности CDR h6B5. В некоторых вариантах реализации scFv содержит вариабельные последовательности тяжелой и легкой цепи h2A2. В некоторых вариантах реализации scFv содержит вариабельные последовательности тяжелой и легкой цепи 6 В5. В некоторых вариантах реализации scFv содержит вариабельные последовательности тяжелой и легкой цепи h6B5.

[0088] В некоторых вариантах реализации антитело против церамида или его антигенсвязывающий фрагмент имеет любой изотип иммуноглобулина. Иммуноглобулин может происходить от любого из общеизвестных изотипов, включая, но не ограничиваясь ими, IgA, секреторный IgA, IgG и IgM. Изотип IgG разделен на подклассы у некоторых видов: IgGl, IgG2, IgG3 и IgG4 у людей и IgG1, IgG2a, IgG2b и IgG3 у мышей. В некоторых вариантах реализации антитела против церамида или их антигенсвязывающие фрагменты содержат одну или более модификаций в Fc-области. Некоторые модификации могут обеспечивать желаемые эффекторные функции или время полужизни в сыворотке. В некоторых вариантах реализации с соответствующими Fc-областями «голое» антитело, связанное на поверхности клетки, может индуцировать цитотоксичность, например, посредством антителозависимой клеточной цитотоксичности (АЗКЦ) или путем рекрутирования комплемента в комплемент-зависимой цитотоксичности (КЗЦ), или путем рекрутирования неспецифичных цитотоксических клеток, которые экспрессируют один или более эффекторных лигандов, которые распознают связанное антитело на клетке-мишени и впоследствии вызывают фагоцитоз клетки-мишени в антителозависимом клеточно-опосредованном фагоцитозе (АЗКФ), или с помощью некоторых других механизмов. Там, где желательно устранить или уменьшить эффекторную функцию, чтобы свести к минимуму побочные эффекты или терапевтические осложнения, можно применять некоторые другие Fc-области. Fc-область антител может быть модифицирована для повышения аффинности связывания с FcRn и, таким образом, увеличения периода полужизни в сыворотке. В альтернативном варианте Fc-область может быть конъюгирована с ПЭГ или альбумином для увеличения периода полужизни в сыворотке или некоторой другой конъюгации, которая приводит к желаемому эффекту.

[0089] В некоторых вариантах реализации антитело против церамида или его антигенсвязывающий фрагмент содержит детектируемую метку или tag. Иллюстративные детектируемые метки включают флуоресцентные метки, аффинные метки, радиоизотопы, люминесцентные маркеры, метки частиц, хромофоры, фосфоресцентные маркеры и ферментные метки. Иллюстративные флуоресцентные метки включают GFP, RFP и YFP. Иллюстративные ферментные метки включают пероксидазу хрена и щелочную фосфатазу. Иллюстративные пептидные метки включают His-метку, МВР и стрептавидин.

[0090] Средство обнаружения определяют по выбранной метке. Внешний вид метки или ее продуктов реакции может быть определен невооруженным глазом, в случае, если метка является частицей и накапливается в соответствующих количествах, или с помощью таких инструментов, как спектрофотометр, люминометр, флуориметр, или с помощью ИФА или вестерн-блоттинга.

Диабетическая ретинопатия

[0091] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложены способы и композиции для лечения диабетической ретинопатии. Диабетическая ретинопатия относится к медицинскому состоянию, при котором происходит повреждение сетчатки вследствие сахарного диабета. Хронически высокий уровень сахара в крови от диабета связан с повреждением тончайших кровеносных сосудов в сетчатке, что приводит к диабетической ретинопатии. Диабетическая ретинопатия может вызвать утечку жидкости или кровоизлияние в кровеносные сосуды сетчатки, искажая зрение. На самой поздней стадии на поверхности сетчатки пролиферируют новые аномальные кровеносные сосуды, что может привести к рубцеванию и потере клеток в сетчатке.

[0092] В некоторых вариантах реализации раскрытые способы и композиции могут быть использованы для лечения различных стадий диабетической ретинопатии. Диабетическая ретинопатия может прогрессировать через непролиферативную стадию, также называемую ранней стадией, и пролиферативную стадию, также называемую поздней стадией.

[0093] В некоторых вариантах реализации настоящее изобретение относится к способам и композициям, которые могут быть использованы для лечения диабетической ретинопатии на непролиферативной стадии. Непролиферативная диабетическая ретинопатия (NPDR) может быть легкой, умеренной или тяжелой. Легкая NPDR характеризуется микроаневризмами в кровеносных сосудах сетчатки. Эти микроаневризмы могут пропускать жидкость в сетчатку. По мере прогрессирования заболевания до средней стадии NPDR кровеносные сосуды сетчатки могут деформироваться и терять способность к транспортировке крови, что приводит к характерным изменениям внешнего вида сетчатки и может способствовать диабетическому макулярному отеку. На тяжелой стадии NPDR блокируется намного больше кровеносных сосудов, что лишает кровообращения области сетчатки. Затем эти области секретируют проангиогенные факторы роста. Ангиогенные молекулы в глазу включают VEGF, FGF, P1GF, TGF-альфа, TGF-бета, IGF, PDGF, MMPs, HGF/SF, TNF-альфа, CTGF, IL-1, IL-8, MCP-1, лептин, интегрины и ангиогенин. В некоторых вариантах реализации, способы согласно настоящему изобретению характеризуются предотвращением или уменьшением одного или более маркеров диабетической ретинопатии. В некоторых вариантах реализации настоящие способы могут предотвращать, уменьшать, ингибировать или снижать уровень микроаневризмы сетчатки, утечки жидкости из сетчатки, диабетического макулярного отека и/или проангиогенных факторов роста сетчатки. Согласно некоторым вариантам реализации один или более из VEGF, FGF, P1GF, TGF-альфа, TGF-бета, IGF, PDGF, MMPs, HGF/SF, TNF-альфа, CTGF, IL-1, IL-8, MCP-1, интегринов и ангиогенина снижены с помощью настоящих способов.

[0094] В некоторых вариантах реализации настоящее изобретение относится к способам и композициям, которые могут быть использованы для лечения диабетической ретинопатии на пролиферативной стадии. Пролиферативная диабетическая ретинопатия (PDR) является распространенной стадией заболевания. На этой стадии проангиогенные факторы роста, секретируемые сетчаткой, вызывают пролиферацию новых кровеносных сосудов, которые растут вдоль внутренней поверхности сетчатки в стекловидное тело. Новые кровеносные сосуды являются хрупкими и с большей вероятностью протекают и кровоточат. Сопутствующая рубцовая ткань может сокращаться и вызывать отслоение сетчатки (т.е. отрывание сетчатки от нижележащей ткани), что может привести к постоянной потере зрения. Согласно некоторым вариантам реализации предложенные способы могут предотвращать, уменьшать, ингибировать или снижать уровень неоваскуляризации сетчатки, кровоизлияния в сетчатку, рубцевания сетчатки, отслоения сетчатки и потери зрения.

[0095] В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения предложены способы и композиции, которые можно применять для предотвращения диабетической ретинопатии путем введения субъекту, страдающему диабетом, до возникновения диабетической ретинопатии, например, до возникновения одного или более ее симптомов. Среди наиболее последовательных факторов риска продолжительность диабета является сильным предиктором развития и прогрессирования ретинопатии. Среди пациентов молодого возраста с диабетом распространенность оценивается приблизительно в 8% через 3 года, 25% через 5 лет, 60% через 10 лет и 80% через 15 лет. Согласно некоторым вариантам реализации описанные способы и композиции могут быть использованы для задержки возникновения диабетической ретинопатии, например, более чем на 3 года, более чем на 5 лет, более чем на 10 лет или более чем на 15 лет после развития диабета.

[0096] В некоторых вариантах реализации раскрытые способы и композиции могут быть использованы для профилактики диабетической ретинопатии у субъекта, подверженного риску развития диабетической ретинопатии, например, у субъекта, имеющего один или более факторов риска, связанных с развитием диабетической ретинопатии. Значительными факторами риска являются гипергликемия, артериальная гипертензия, гиперлипидемия и заболевание почек. Дополнительными факторами, которые следует учитывать, являются мужской пол, более высокая степень тяжести диабета (на что указывает использование инсулина и пероральной терапии диабета в сравнении с монотерапией таблетками или использование монотерапии таблетками в сравнении с отсутствием лечения), более высокое среднее систолическое артериальное давление и более высокий уровень гемоглобина А1с.

Симптомы и обнаружение

[0097] Согласно некоторым вариантам реализации настоящие способы могут влиять на один или более симптомов и/или обнаруживаемых маркеров диабетической ретинопатии. Ранние, непролиферативные стадии диабетической ретинопатии обычно не имеют симптомов. В некоторых вариантах реализации способы и композиции согласно настоящему изобретению предназначены для применения у субъекта с диабетом до появления симптомов диабетической ретинопатии. Заболевание часто прогрессирует незамеченным, пока не поражает зрение. Кровотечение из кровеносных сосудов сетчатки на ранних стадиях заболевания может вызвать появление «плавающих» пятен, которые могут исчезать сами по себе. Без оперативного лечения кровотечение часто рецидивирует, увеличивая риск постоянной потери зрения. При возникновении диабетического макулярного отека это может вызвать нечеткость зрения. В некоторых вариантах реализации настоящие композиции и способы могут уменьшать частоту, тяжесть или уровень «плавающих» пятен, кровотечения из сетчатки, потери зрения и/или нечеткости зрения. В некоторых вариантах реализации один или более параметров зрения могут быть улучшены с помощью настоящих способов, включая, не ограничиваясь перечисленным, общее зрение, периферийное зрение, ночное зрение, цветовое зрение, дальнее зрение, ближнее зрение и четкость зрения.

[0098] Диабетическая ретинопатия и диабетический макулярный отек могут быть обнаружены во время комплексного осмотра глаза, который включает в себя проверку остроты зрения (глазные карты для измерения способности субъекта видеть на различных расстояниях); тонометрию (измерения давления внутри глаза); расширение зрачка; и оптическую когерентную томографию (ОКТ). Во время такого обследования врач может проверить одно или более из следующего: изменения кровеносных сосудов сетчатки, включая образование новых сосудов, отек и кровотечение; утечка из кровеносных сосудов сетчатки или предупреждающие признаки утечки из кровеносных сосудов, такие как жировые отложения, ослабленные стенки сосудов и выпуклые стенки сосудов; отек макулы; изменения хрусталика, включая изменения кривизны или образования катаракты; и повреждение нервной ткани.

[0099] В некоторых вариантах реализации настоящие композиции и способы могут быть использованы для лечения субъекта с любым одним или более из этих симптомов диабетической ретинопатии. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения композиции и способы согласно настоящему изобретению могут предотвращать, лечить или улучшать любой один или более из этих симптомов. При подозрении на диабетический макулярный отек или тяжелую диабетическую ретинопатию можно использовать флуоресцеиновую ангиограмму для поиска поврежденных или протекающих кровеносных сосудов. В этом тесте флуоресцентный краситель вводят в кровоток, часто в вену руки. Фотографии кровеносных сосудов сетчатки выполняют по мере попадания красителя в глаз. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения композиции согласно настоящему изобретению и способы согласно настоящему изобретению могут быть использованы для предотвращения или снижения частоты, распространенности или тяжести поврежденных и/или протекающих кровеносных сосудов в глазу.

[0100] Существующие методы лечения диабетической ретинопатии включают терапию против VEGF, стероиды, лазерную хирургию и витрэктомию.

[0101] Инъекционная терапия против VEGF. Направленные против VEGF лекарственные средства вводят в стекловидное тело для блокирования действия проангиогенного фактора роста VEGF. Блокирование VEGF может обратить ненормальный рост кровеносных сосудов и уменьшить количество жидкости в сетчатке. Доступные лекарственные средства против VEGF включают Авастин® (бевацизумаб), Люцентис® (ранибизумаб) и Эйлеа® (афлиберцепт). Люцентис® (ранибизумаб) и Эйлеа® (афлиберцепт) одобрены Управлением по контролю качества пищевых продуктов и лекарственных средств США (FDA) для лечения диабетического макулярного отека. Авастин® (бевацизумаб) был одобрен FDA для лечения рака, но обычно используется для лечения заболеваний глаз, включая диабетический макулярный отек. Большинство людей нуждаются в ежемесячных инъекциях терапии против VEGF в течение первых шести месяцев лечения. После этого инъекции требуются реже: обычно от трех до четырех в течение второго полугодия лечения, около четырех в течение второго года лечения, две на третьем году, одна на четвертом году и ни одной на пятом году. Недавние исследования показали, что лечение против VEGF может быть эффективным для лечения диабетического макулярного отека и для замедления прогрессирования диабетической ретинопатии, включая PDR, так что терапия против VEGF все чаще используется в качестве терапии первой линии для PDR. Однако несколько крупных клинических исследований показывают, что приблизительно 40% пациентов не отвечают на терапию против VEGF. Кроме того, лечение против VEGF направлено на очень позднюю стадию заболевания, когда полное восстановление поражения сетчатки является сложным.

[0102] Лазерная операция. В фокальной/секторальной макулярной лазерной хирургии, при протечке кровеносных сосудов в областях отека вблизи центра макулы осуществляют от нескольких до сотен небольших лазерных ожогов. Лазерные ожоги от диабетического макулярного отека замедляют протечку жидкости, уменьшая отек в сетчатке. Процедуру обычно выполняют за один сеанс, но некоторым пациентам может потребоваться более одного лечения. Фокальное/секторальное лазерное лечение можно применять в комбинации с терапией против VEGF. Например, фокальное/секторальное лазерное лечение иногда применяют перед инъекциями против VEGF, иногда в тот же день или через несколько дней после инъекции против VEGF, а иногда только тогда, когда диабетический макулярный отек не улучшается должным образом после шести месяцев терапии против VEGF.

[0103] PDR также можно лечить с помощью рассеянной лазерной хирургии, иногда называемой панретинальной лазерной хирургией или панретинальной фото коагуляцией. Лечение включает в себя от 1000 до 2000 мельчайших лазерных ожогов в областях сетчатки вдали от макулы. Эти лазерные ожоги предназначены для того, чтобы вызвать аномальное сжатие кровеносных сосудов. Хотя лечение может быть завершено за один сеанс, иногда требуется два или более сеанса. Хотя это может сохранить центральное зрение, рассеивающая лазерная хирургия может привести к некоторой потере бокового (периферического), цветового и ночного зрения. Рассеивающая лазерная хирургия работает лучше всего до того, как начнут кровоточить новые хрупкие кровеносные сосуды.

[0104] Кортикостероиды. Кортикостероиды можно использовать по отдельности или в комбинации с другими лекарственными средствами или лазерной хирургией для лечения диабетического макулярного отека. Кортикостероиды можно вводить в глаз или имплантировать в глаз. Имплантат Ozurdex® (дексаметазон) предназначен для кратковременного использования, в то время как имплантат Iluvien ® (флуоцинолона ацетонид) является более долговременным. Оба являются биоразлагаемыми и высвобождают устойчивую дозу кортикостероидов для подавления диабетического макулярного отека.

[0105] Витрэктомия. Витрэктомия представляет собой хирургическое удаление стекловидного геля в центре глаза. Процедуру применяют для лечения тяжелого кровотечения в стекловидное тело и выполняют под местной или общей анестезией. Прозрачный солевой раствор осторожно закачивают в глаз через одно или несколько отверстий для поддержания давления в глазу во время операции и замены удаленного стекловидного тела. Те же инструменты, которые используются во время витрэктомии, также могут быть использованы для удаления рубцовой ткани или для восстановления отслоенной сетчатки.

Роль церамида и ASM в диабетической ретинопатии

[0106] Не ограничиваясь какой-либо одной теорией, полагают, что настоящие способы лечения способны подавлять воспалительную передачу сигналов в сетчатке путем селективного ингибирования церамида в сетчатке с помощью офтальмологического лечения антителами против церамида или их антигенсвязывающими фрагментами.

[0107] Сфинголипиды представляют собой основной компонент мембранных микродоменов, а обогащенные церамидами микродомены, по-видимому, являются предпосылкой для воспалительной передачи сигналов цитокинов. Кислотная сфингомиелиназа (ASM) и нейтральная сфингомиелиназа (NSM) являются ключевыми регуляторными ферментами метаболизма сфинголипидов, способствующими гидролизу сфингомиелина до провоспалительного церамида. ASM является важным ранним респондером при передаче сигналов воспалительных цитокинов. Путь сфингомиелиназы важен для воспалительной сигнализации в эндотелиальных клетках сетчатки человека (HREC), резидентной сосудистой сети, пораженной диабетической ретинопатией. Воспалительные цитокины TNFa и IL-lp индуцируют экспрессию молекулы клеточной адгезии (САМ) и быстрое повышение активности ASM и NSM в HREC.

[0108] Предыдущие исследования показали важность активности ASM при диабетической ретинопатии с использованием, например, моделей мышей ASM-/- и ингибиторов ASM, таких как ДГК и имипрамин. Такие модели нокаута гена и введение ингибитора против ASM снижали воспалительные маркеры сетчатки. См. Fox et al., Diabetes 2006;55(12):3573-80; Opreanu et al., Diabetes 2011;60(9):2370-8; Opreanu et al., Investigative Ophthalmology & Visual Science 2010;51(6):3253-63; и Chakravarthy et al., Stem Cells 2016; 34:972-83, каждая из которых включена в настоящую заявку посредством ссылки в полном объеме.

[0109] Тем не менее, ASM является необходимым ферментом, отсутствие или ингибирование которого может привести к болезни Ниманна-Пика, которая может привести к летальному исходу. Таким образом, нокаут гена ASM и прямое ингибирование фермента не являются жизнеспособными терапевтическими стратегиями для лечения диабетической ретинопатии. Напротив, введение антител против церамида и антигенсвязывающих фрагментов в настоящей заявке обеспечивает неожиданный результат избирательного ингибирования воспалительных маркеров, неоваскуляризации и других симптомов диабетической ретинопатии в глазу без индуцирования отрицательных побочных эффектов, связанных с прямым ингибированием ASM.

Дополнительные заболевания

[0110] В некоторых вариантах реализации композиции и способы по настоящему изобретению применяют для лечения диабетической ретинопатии. Согласно некоторым вариантам реализации композиции и способы согласно настоящему изобретению применяют для лечения диабетического макулярного отека. Согласно некоторым вариантам реализации композиции и способы согласно настоящему изобретению применяют для лечения макулярного отека после окклюзии вены сетчатки (RVO). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения композиции и способы согласно настоящему изобретению применяют для лечения миопической хориоидальной неоваскуляризации (mCNV).

[0111] В настоящем описании предложены способы лечения заболеваний или расстройств с лежащей в их основе неоваскуляризацией. Типичные заболевания и нарушения глаза включают: неоваскуляризацию сетчатки, хориоидальную неоваскуляризацию, неоваскуляризацию роговицы, макулярную дегенерацию, возрастную макулярную дегенерацию, диабетическую ретинопатию, кровоизлияние в стекловидное тело, кровоизлияние в сетчатку, хориоидит, неоваскулярную глаукому, заболевание сосудистой оболочки, телеангиэктазиию, окклюзию артерии сетчатки, окклюзию вены сетчатки, хориоретинит, эпиретинальную мембрану, новообразование сосудистой оболочки, ретинопатию недоношенных, кистозный макулярный отек, отек диска зрительного нерва, рецидивирующую ишемию, кровоизлияние в глаза и пролиферативную витреоретинопатию.

Фармацевтические композиции, пути введения, дозировки и схемы дозирования

[0112] В некоторых вариантах реализации в настоящем изобретении предложена фармацевтическая композиция, содержащая антитело против церамида или его антигенсвязывающий фрагмент, для лечения диабетической ретинопатии.

[0113] Для введения антитело или фрагмент согласно настоящему описанию (например, антитела против церамида и их антигенсвязывающие фрагменты) можно приготовить в виде фармацевтической композиции. Фармацевтическая композиция может содержать: (i) антитело против церамида или его антигенсвязывающий фрагмент; и (ii) фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель или вспомогательное вещество. Фармацевтическая композиция, содержащая антитело против церамида или его антигенсвязывающий фрагмент и/или scFv, может быть приготовлена в соответствии с известными способами получения фармацевтически полезных композиций, при этом терапевтическую молекулу объединяют в смеси с фармацевтически приемлемым носителем, разбавителем или вспомогательным веществом. Подходящие носители, разбавители или вспомогательные вещества хорошо известны специалистам в данной области техники. (См., например, Gennaro (ed), Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Company, 19th ed. 1995).) Составы могут дополнительно включать одно или более вспомогательных веществ, консервантов, солюбилизаторов, буферных агентов, альбумина для предотвращения потери белка на поверхностях флаконов и т.д.

[0114] В некоторых вариантах реализации фармацевтическая композиция может быть приготовлена в лекарственной форме, выбранной из группы, состоящей из: пероральной единичной лекарственной формы, внутривенной единичной лекарственной формы, интраназальной единичной лекарственной формы, суппозиторной единичной лекарственной формы, интрадермальной единичной лекарственной формы, внутримышечной единичной лекарственной формы, интраперитонеальной единичной лекарственной формы, подкожной единичной лекарственной формы, эпидуральной единичной лекарственной формы, сублингвальной единичной лекарственной формы, интрацеребральной единичной лекарственной формы, внутрикамерной единичной лекарственной формы, субконъюнктивальной единичной лекарственной формы, субтеноновой единичной лекарственной формы, ретробульбарной единичной лекарственной формы, единичной лекарственной формы для введения в заднюю околосклеральную область и интравитреальной единичной лекарственной формы. В некоторых вариантах реализации фармацевтическая композиция может быть приготовлена в интравитреальной лекарственной форме. Системные пути введения не предполагают доставки антител против церамида или их антигенсвязывающих фрагментов в глаз, поскольку не ожидают, что антитела против церамида или их антигенсвязывающие фрагменты пересекут гематоэнцефалический барьер.

[0115] Антитела против церамида и их антигенсвязывающие фрагменты, описанные в настоящей заявке, могут быть введены субъектам различными способами введения, включая, например, внутримышечный, подкожный, внутривенный, внутрипредсердный, внутрисуставный, парентеральный, интраназальный, внутрилегочный, трансдермальный, внутриплевральный, интратекальный, пероральный, местный, внутриглазный, внутрикамерный, субконъюнктивальный, субтеноновый, ретробульбарный, путем введения в заднюю околосклеральную область, введения в супрахориоидное пространство (SCS), введения в супрацилиарное пространство и интравитреальные пути введения.

[0116] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антитела против церамида и их антигенсвязывающие фрагменты, а также их фармацевтические композиции, раскрытые в настоящей заявке, можно вводить непосредственно в глаз любым известным способом введения, включая местный (например, глазные капли), местный окулярный, интравитреальный, внутрикамерный, субконъюнктивальный, субтеноновый, ретробульбарный и путем введения в заднюю околосклеральную область.

[0117] Можно использовать множество возможных способов доставки, включая, помимо прочего, интраокулярное или местное применение. В одном из вариантов реализации введение является интраокулярным и включает, но не ограничивается ими, субконъюнктивальную инъекцию, внутрикамерную инъекцию, инъекцию в переднюю камеру через височный край, интрастромальную инъекцию, внутрироговичную инъекцию, субретинальную инъекцию, инъекцию во внутриглазную жидкость, субтеноновую инъекцию или устройство для устойчивой доставки, или интравитреальную инъекцию (например, переднюю, среднюю или заднюю витреальную инъекцию). В одном варианте реализации применение является местным и включает, но не ограничивается ими, глазные капли на роговицу.

[0118] В некоторых вариантах реализации описанные антитела, их антигенсвязывающие фрагменты и их композиции получают для интравитреального введения. В некоторых вариантах реализации описанные антитела, антигенсвязывающие фрагменты и их композиции вводят интравитреально.

[0119] В целях предотвращения и лечения антитела против церамида и их антигенсвязывающие фрагменты можно вводить субъекту в виде одной болюсной доставки, в виде непрерывной доставки (например, непрерывной трансдермальной доставки) в течение длительного периода времени или в виде протокола повторного введения (например, ежечасно, ежедневно, еженедельно, ежемесячно или ежегодно).

[0120] В некоторых вариантах реализации способы, предложенные в настоящей заявке, включают введение терапевтически эффективной дозы антитела против церамида или его антигенсвязывающего фрагмента. Терапевтически эффективная доза, дозировка или количество, как определено выше, относится к минимальному количеству антитела против церамида или его антигенсвязывающего фрагмента, необходимому для достижения конкретного физиологического эффекта, например, предотвращения или облегчения одного или более симптомов диабетической ретинопатии. Определение терапевтически эффективных доз в этом контексте, как правило, основано на исследованиях на животных моделях, которые сопровождаются клиническими испытаниями на людях, и основано на определении эффективных доз и протоколов введения, которые значительно снижают частоту возникновения или тяжесть диабетической ретинопатии у модельных субъектов. Эффективные дозы композиций согласно настоящему изобретению варьируют в зависимости от многих различных факторов, включая средства введения, целевой участок, физиологическое состояние пациента, является ли пациент человеком или животным, другие вводимые лекарственные средства, является ли лечение профилактическим или терапевтическим, а также специфичную активность самой композиции и ее способность вызывать желаемый ответ у индивидуума. Как правило, схемы введения корректируют для обеспечения оптимального терапевтического ответа, т.е. для оптимизации безопасности и эффективности.

[0121] В некоторых вариантах реализации доза антитела против церамида или его антигенсвязывающего фрагмента составляет от приблизительно 0,1 мкг до 100 мг/кг или от 1 мкг/кг до приблизительно 50 мг/кг, или от 10 мкг до 5 мг/кг. В некоторых вариантах реализации эффективное количество антитела против церамида или его антигенсвязывающего фрагмента составляет от приблизительно 1 мкг/кг до приблизительно 20 мг/кг, от приблизительно 10 мкг/кг до приблизительно 10 мг/кг или от приблизительно 0,1 мг/кг до приблизительно 5 мг/кг. Антитела против церамида и их антигенсвязывающие фрагменты, описанные в настоящей заявке, также можно вводить в дозировке от приблизительно 0,001 до приблизительно 10 миллиграммов (мг) на килограмм (мг/кг) массы тела, вводимой в виде однократной дозы или в двух или более дозах. Для введения взрослому пациенту-человеку терапевтически эффективное количество можно вводить в дозах от 0,2 мг до 800 мг на дозу, включая, но не ограничиваясь ими, 0,2 мг на дозу, 0,5 мг на дозу, 1 мг на дозу, 5 мг на дозу, 10 мг на дозу, 25 мг на дозу, 100 мг на дозу, 200 мг на дозу и 400 мг на дозу, и одну или более доз можно вводить в течение курса лечения. В некоторых вариантах реализации общая суточная доза антител против церамида и их антигенсвязывающих фрагментов, описанных в настоящей заявке, может составлять от приблизительно 1 мг до приблизительно 2 г, от приблизительно 100 мг до приблизительно 1,5 г или от приблизительно 200 мг до приблизительно 1200 мг.

[0122] В некоторых вариантах реализации антитела против церамида, их антигенсвязывающие фрагменты или композиции, содержащие их, могут быть приготовлены в концентрации приблизительно ОД мг/мл, 0,5 мг/мл, 1 мг/мл, 5 мг/мл, 10 мг/мл, 15 мг/мл, 20 мг/мл, 25 мг/мл, 30 мг/мл, 35 мг/мл, 40 мг/мл, 45 мг/мл или 50 мг/мл. Концентрация может составлять 0,1-1 мг/мл, 1-5 мг/мл, 5-10 мг/мл или 10-50 мг/мл. В некоторых вариантах реализации описанные антитела, фрагменты или композиции можно вводить в дозе приблизительно 0,05 мг, 0,1 мг, 0,2 мг, 0,3 мг, 0,4 мг, 0,5 мг, 0,6 мг, 0,7 мг, 0,8 мг, 0,9 мг или 1 мг интравитреально. Объем дозы может составлять приблизительно 0,005 мл, 0,01 мл, 0,02 мл, 0,03 мл, 0,04 мл, 0,05 мл, 0,06 мл, 0,07 мл, 0,08 мл, 0,09 мл или 0,1 мл.

[0123] Антитела против церамида и их антигенсвязывающие фрагменты, описанные в настоящей заявке, могут быть введены в разное время суток. Согласно одному из вариантов реализации дозу можно вводить вечером. Согласно другому варианту реализации указанную дозу можно вводить утром. Дозировки можно вводить однократно или многократно, включая, например, многократные еженедельные, двухнедельные, ежемесячные или годовые введения. В некоторых вариантах реализации однократную дозу антитела против церамида или фрагмента антитела вводят нуждающемуся в этом субъекту. В некоторых вариантах реализации пациент может получать две или более доз антитела против церамида, разделенных периодом по меньшей мере двух недель, по меньшей мере трех недель, по меньшей мере четырех недель, по меньшей мере пяти недель, по меньшей мере шести недель, по меньшей мере семи недель, по меньшей мере восьми недель, по меньшей мере одного месяца, по меньшей мере двух месяцев, по меньшей мере трех месяцев, по меньшей мере четырех месяцев, по меньшей мере пяти месяцев, по меньшей мере шести месяцев, по меньшей мере семи месяцев, по меньшей мере восьми месяцев, по меньшей мере девяти месяцев, по меньшей мере десяти месяцев, по меньшей мере одиннадцати месяцев или по меньшей мере одного года. В некоторых вариантах реализации две или более доз могут быть введены нуждающемуся в этом пациенту, разделенными периодом времени от приблизительно одной недели до приблизительно двух недель, от приблизительно двух недель до приблизительно четырех недель, от приблизительно одного месяца до приблизительно двух месяцев, от приблизительно двух месяцев до приблизительно четырех месяцев, от приблизительно одного месяца до приблизительно шести месяцев, от приблизительно шести месяцев до приблизительно одного года или от приблизительно одного года до приблизительно двух лет. В некоторых вариантах реализации введение может быть нерегулярным, как показано путем мониторинга клинических симптомов расстройства.

[0124] Дозировка фармацевтической композиции, содержащей антитела против церамида и их антигенсвязывающие фрагменты, может быть изменена лечащим врачом для поддержания желаемой концентрации в целевом участке. Более высокие или более низкие концентрации могут быть выбраны на основе типа доставки. Антитела против церамида или их антигенсвязывающие фрагменты можно вводить в любое время в течение жизни субъекта. В некоторых вариантах реализации введение происходит до развития симптомов диабетической ретинопатии. В таких вариантах реализации введение можно применять в качестве профилактического средства для предотвращения или задержки возникновения диабетической ретинопатии. В некоторых вариантах реализации введение происходит на ранней стадии заболевания. В некоторых вариантах реализации введение происходит на поздней стадии заболевания.

Терапевтические способы и применения

[0125] В некоторых вариантах реализации настоящее изобретение относится к способам лечения, предотвращения или облегчения симптома воспалительного заболевания глаза у субъекта, включающим введение субъекту терапевтически эффективного количества антитела против церамида или его антигенсвязывающего фрагмента.

[0126] В некоторых вариантах реализации в настоящем изобретении предложены способы предотвращения и/или лечения диабетической ретинопатии у нуждающегося в этом субъекта, включающие введение указанному субъекту терапевтически эффективного количества антитела против церамида или фрагмента антитела против церамида.

[0127] Предыдущие исследования утверждали, что начальное метаболическое повреждение, приводящее к воспалению и повышенной сосудистой проницаемости в сетчатке, включает активацию кислой сфингомиелиназы (ASM), центрального фермента сфинголипидной сигнализации, превращающей сфингомиелин в церамид. ASM-/-животные были защищены от сосудистой дегенерации в модели ишемии-реперфузии сетчатки, а химеры с костным мозгом ASM-/-, трансплантированным мышам дикого типа, также были защищены от повреждения сосудов, вызванного диабетом. Было реализовано несколько стратегий ингибирования активности АСМ, включая введение рыбьего жира, богатого докозагексаеновой кислотой (ДГК), и трициклического антидепрессанта дезипрамина. Обе стратегии демонстрируют некоторую эффективность в моделях клеточной культуры. Однако дезипрамин не был хорошо переносимым животными в долгосрочном исследовании (см. Пример 8), и длительное лечение высокими дозами ДГК, хотя и улучшало здоровье сетчатки у животных с диабетом, вызывало патологию сетчатки у животных в контроле (см. Пример 9). Кроме того, ASM является важным ферментом, и отсутствие ASM приводит к нейродегенеративному заболеванию (Ниманна-Пика). Поэтому прямое ингибирование ASM не является жизнеспособной клинической стратегией в лечении ДР. Антитела против церамида и их антигенсвязывающие фрагменты являются высокоэффективными в связывании мономерного церамида, генерируемого на поверхности эндотелиальных и других клеток, тем самым предотвращая образование платформы, богатой церамидом, индуцированной АСМ, и последующую провоспалительную и апоптотическую передачу сигналов, не влияя на основную лизосомальную функцию ASM.

Субъекты

[0128] Субъекты для лечения в соответствии со способами, описанными в настоящей заявке, включают тех, кто имеет или подвержен риску развития диабетической ретинопатии. Субъекты с диабетической ретинопатией могут иметь раннюю или позднюю стадию заболевания.

[0129] В некоторых вариантах реализации субъектами являются те, кто получал один или более предшествующих видов лечения диабетической ретинопатии, но не отвечал на предыдущее лечение. В таких вариантах реализации «неспособность к ответу» указывает на то, что предыдущее лечение не облегчило и/или не улучшило один или более симптомов диабетической ретинопатии. Согласно некоторым вариантам реализации предшествующая терапия, возможно, не привела к улучшению зрения или здоровья сосудов сетчатки. В некоторых вариантах реализации предшествующая терапия может продемонстрировать некоторые результаты, но может не достичь желаемой эффективности или может перестать демонстрировать эффективность через некоторый период времени.

[0130] Существующие способы лечения диабетической ретинопатии включают терапевтические процедуры, такие как витрэктомия и лазерная хирургия, и терапевтические агенты, такие как стероиды и терапия против фактора роста эндотелия сосудов (VEGF). В некоторых вариантах реализации субъект мог частично ответить на предыдущее лечение диабетической ретинопатии: то есть один или более симптомов диабетической ретинопатии не были в достаточной степени облегчены и/или эффекты предыдущего лечения не были в достаточной степени продолжительными.

[0131] Согласно некоторым вариантам реализации указанный субъект получал предшествующее лечение против VEGF и не отвечал на лечение. В некоторых вариантах реализации лечение против VEGF выбрано из Эйлеа® (афлиберцепт), Авастин® (бевацизумаб) или Люцентис® (ранибизумаб).

Определение показателей лечения

[0132] Лечение и/или предотвращение диабетической ретинопатии можно измерить различными способами. В некоторых вариантах реализации лечение или предотвращение включает лечение или предотвращение одного или более из апоптоза, воспаления, образования бесклеточных капилляров, неоваскуляризации, гибели клеток эндотелия сетчатки, сосудистой проницаемости сетчатки, ишемически-реперфузионного повреждения и нарушения окклюдина при диабетической ретинопатии у субъекта, нуждающегося в этом. Способ включает введение эффективного количества антитела против церамида или его антигенсвязывающего фрагмента до возникновения диабетической ретинопатии у пациента с диабетом или после возникновения диабетической ретинопатии у пациента с диабетом.

[0133] Предложены способы лечения диабетической ретинопатии антителом против церамида или его антигенсвязывающим фрагментом. Эффективность такого лечения может быть охарактеризована, оценена, измерена и/или отслеживаться на основе нескольких параметров.

[0134] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложены способы, которые приводят к снижению апоптоза и/или гибели эндотелиальных клеток в глазу. Мониторинг гибели клеток может осуществляться в соответствии с известными способами. Иллюстративные способы обнаружения гибели клеток включают техники ядерного окрашивания, такие как йодид пропидия, Hoechst-33342, 4', 6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI), окрашивание акридиновым оранжевым этидием бромидом и тому подобное. Техники неядерного окрашивания включают окрашивание аннексином-V. Согласно некоторым вариантам реализации способы снижают уровень апоптоза и/или гибели эндотелиальных клеток в образце глаза, получающем указанные способы, по сравнению с образцом глаза в контроле, по меньшей мере на 5%, по меньшей мере на 10%, по меньшей мере на 15%, по меньшей мере на 20%, по меньшей мере на 25%, по меньшей мере на 30%, по меньшей мере на 40%, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 80% или по меньшей мере на 90%. В некоторых вариантах реализации способы, предложенные в настоящей заявке, уменьшают уровень апоптоза и/или гибели эндотелиальных клеток по меньшей мере на 10%. В некоторых вариантах реализации способы, предложенные в настоящей заявке, уменьшают уровень апоптоза и/или гибели эндотелиальных клеток по меньшей мере на 20%. В некоторых вариантах реализации способы, предложенные в настоящей заявке, уменьшают уровень апоптоза и/или гибели эндотелиальных клеток по меньшей мере на 30%. В некоторых вариантах реализации способы, предложенные в настоящей заявке, уменьшают уровень апоптоза и/или гибели эндотелиальных клеток по меньшей мере на 50%. В некоторых вариантах реализации способы, предложенные в настоящей заявке, уменьшают уровень апоптоза и/или гибели эндотелиальных клеток по меньшей мере на 70%.

[0135] В некоторых вариантах реализации способы, предложенные в настоящей заявке, предотвращают ишемически-реперфузионное (IR) повреждение. Дополнительные способы обнаружения IR повреждения включают анализ флуоресцеина, флуоресцентный цинковый 2,2'-дипиколиламиновый координационный комплекс PSVue®794, 99mTc глюкарат и электроретинографию.

[0136] Согласно некоторым вариантам реализации способы, предложенные в настоящей заявке, снижают уровни одного или более воспалительных маркеров. Согласно некоторым вариантам реализации один или более воспалительных маркеров выбраны из TNFα, IL-1β, IL-6, VEGF, ICAM-1, VCAM-1 и MCP1. Уровни воспалительных маркеров можно контролировать с помощью твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA), Luminex, цитокиновой гранулометрической матрицы, Proteo Plex, FAST Quant и тому подобного. Согласно некоторым вариантам реализации предложенные в настоящей заявке способы снижают уровни одного или более воспалительных маркеров в образце глаза, получающем указанные способы, по сравнению с образцом глаза в контроле, по меньшей мере на 5%, по меньшей мере на 10%, по меньшей мере на 15%, по меньшей мере на 20%, по меньшей мере на 25%, по меньшей мере на 30%, по меньшей мере на 40%, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 80% или по меньшей мере на 90%.

[0137] Согласно некоторым вариантам реализации способы снижают уровень TNFα в образце глаза, получающем указанные способы, по сравнению с образцом глаза в контроле, по меньшей мере на 5%, по меньшей мере на 10%, по меньшей мере на 15%, по меньшей мере на 20%, по меньшей мере на 25%, по меньшей мере на 30%, по меньшей мере на 40%, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 80% или по меньшей мере на 90%. В некоторых вариантах реализации способы, предложенные в настоящей заявке, снижают уровень TNFα по меньшей мере на 10%. В некоторых вариантах реализации способы, предложенные в настоящей заявке, снижают уровень TNFα по меньшей мере на 20%. В некоторых вариантах реализации способы, предложенные в настоящей заявке, снижают уровень TNFα по меньшей мере на 30%. В некоторых вариантах реализации способы, предложенные в настоящей заявке, снижают уровень TNFα по меньшей мере на 50%. В некоторых вариантах реализации способы, предложенные в настоящей заявке, снижают уровень TNFα по меньшей мере на 70%.

[0138] Согласно некоторым вариантам реализации способы снижают уровень IL-1β в образце глаза, получающем указанные способы, по сравнению с образцом глаза в контроле, по меньшей мере на 5%, по меньшей мере на 10%, по меньшей мере на 15%, по меньшей мере на 20%, по меньшей мере на 25%, по меньшей мере на 30%, по меньшей мере на 40%, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 80% или по меньшей мере на 90%. В некоторых вариантах реализации способы, предложенные в настоящей заявке, снижают уровень IL-1β по меньшей мере на 10%. В некоторых вариантах реализации способы, предложенные в настоящей заявке, снижают уровень IL-1β по меньшей мере на 20%. В некоторых вариантах реализации способы, предложенные в настоящей заявке, снижают уровень IL-1β по меньшей мере на 30%. В некоторых вариантах реализации способы, предложенные в настоящей заявке, снижают уровень IL-1β по меньшей мере на 50%. В некоторых вариантах реализации способы, предложенные в настоящей заявке, снижают уровень IL-1β по меньшей мере на 70%.

[0139] Согласно некоторым вариантам реализации способы снижают уровень IL-6 в образце глаза, получающем указанные способы, по сравнению с образцом глаза в контроле, по меньшей мере на 5%, по меньшей мере на 10%, по меньшей мере на 15%, по меньшей мере на 20%, по меньшей мере на 25%, по меньшей мере на 30%, по меньшей мере на 40%, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 80% или по меньшей мере на 90%. В некоторых вариантах реализации способы, предложенные в настоящей заявке, снижают уровень IL-6 по меньшей мере на 10%. В некоторых вариантах реализации способы, предложенные в настоящей заявке, снижают уровень IL-6 по меньшей мере на 20%. В некоторых вариантах реализации способы, предложенные в настоящей заявке, снижают уровень IL-6 по меньшей мере на 30%. В некоторых вариантах реализации способы, предложенные в настоящей заявке, снижают уровень IL-6 по меньшей мере на 50%. В некоторых вариантах реализации способы, предложенные в настоящей заявке, снижают уровень IL-6 по меньшей мере на 70%.

[0140] Согласно некоторым вариантам реализации способы снижают уровень VEGF в образце глаза, получающем указанные способы, по сравнению с образцом глаза в контроле, по меньшей мере на 5%, по меньшей мере на 10%, по меньшей мере на 15%, по меньшей мере на 20%, по меньшей мере на 25%, по меньшей мере на 30%, по меньшей мере на 40%, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 80% или по меньшей мере на 90%. В некоторых вариантах реализации способы, предложенные в настоящей заявке, снижают уровень VEGF по меньшей мере на 10%. В некоторых вариантах реализации способы, предложенные в настоящей заявке, снижают уровень VEGF по меньшей мере на 20%. В некоторых вариантах реализации способы, предложенные в настоящей заявке, снижают уровень VEGF по меньшей мере на 30%. В некоторых вариантах реализации способы, предложенные в настоящей заявке, снижают уровень VEGF по меньшей мере на 50%. В некоторых вариантах реализации способы, предложенные в настоящей заявке, снижают уровень VEGF по меньшей мере на 70%.

[0141] Согласно некоторым вариантам реализации способы снижают уровень ICAM-1 в образце глаза, получающем указанные способы, по сравнению с образцом глаза в контроле, по меньшей мере на 5%, по меньшей мере на 10%, по меньшей мере на 15%, по меньшей мере на 20%, по меньшей мере на 25%, по меньшей мере на 30%, по меньшей мере на 40%, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 80% или по меньшей мере на 90%. В некоторых вариантах реализации способы, предложенные в настоящей заявке, снижают уровень ICAM-1 по меньшей мере на 10%. В некоторых вариантах реализации способы, предложенные в настоящей заявке, снижают уровень ICAM-1 по меньшей мере на 20%. В некоторых вариантах реализации способы, предложенные в настоящей заявке, снижают уровень ICAM-1 по меньшей мере на 30%. В некоторых вариантах реализации способы, предложенные в настоящей заявке, снижают уровень ICAM-1 по меньшей мере на 50%. В некоторых вариантах реализации способы, предложенные в настоящей заявке, снижают уровень ICAM-1 по меньшей мере на 70%.

[0142] Согласно некоторым вариантам реализации способы снижают уровень VCAM-1 в образце глаза, получающем указанные способы, по сравнению с образцом глаза в контроле, по меньшей мере на 5%, по меньшей мере на 10%, по меньшей мере на 15%, по меньшей мере на 20%, по меньшей мере на 25%, по меньшей мере на 30%, по меньшей мере на 40%, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 80% или по меньшей мере на 90%. В некоторых вариантах реализации способы, предложенные в настоящей заявке, снижают уровень VCAM-1 по меньшей мере на 10%. В некоторых вариантах реализации способы, предложенные в настоящей заявке, снижают уровень VCAM-1 по меньшей мере на 20%. В некоторых вариантах реализации способы, предложенные в настоящей заявке, снижают уровень VCAM-1 по меньшей мере на 30%. В некоторых вариантах реализации способы, предложенные в настоящей заявке, снижают уровень VCAM-1 по меньшей мере на 50%. В некоторых вариантах реализации способы, предложенные в настоящей заявке, снижают уровень VCAM-1 по меньшей мере на 70%.

[0143] Согласно некоторым вариантам реализации способы снижают уровень МСР1 в образце глаза, получающем указанные способы, по сравнению с образцом глаза в контроле, по меньшей мере на 5%, по меньшей мере на 10%, по меньшей мере на 15%, по меньшей мере на 20%, по меньшей мере на 25%, по меньшей мере на 30%, по меньшей мере на 40%, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 80% или по меньшей мере на 90%. В некоторых вариантах реализации способы, предложенные в настоящей заявке, снижают уровень МСР1 по меньшей мере на 10%. В некоторых вариантах реализации способы, предложенные в настоящей заявке, снижают уровень МСР1 по меньшей мере на 20%. В некоторых вариантах реализации способы, предложенные в настоящей заявке, снижают уровень МСР1 по меньшей мере на 30%. В некоторых вариантах реализации способы, предложенные в настоящей заявке, снижают уровень МСР1 по меньшей мере на 50%. В некоторых вариантах реализации способы, предложенные в настоящей заявке, снижают уровень МСР1 по меньшей мере на 70%.

[0144] В некоторых вариантах реализации способы, предложенные в настоящей заявке, уменьшают сосудистую проницаемость сетчатки, неоваскуляризацию сетчатки или другие симптомы здоровья сетчатки. В некоторых вариантах реализации способы, предложенные в настоящей заявке, могут предотвращать типичные симптомы диабетической ретинопатии в сосудистой сети сетчатки или могут предотвращать дальнейшее ухудшение. Сосудистая проницаемость и другие показатели состояния сосудов сетчатки можно измерять, например, с помощью флуоресцеиновой ангиографии. В некоторых вариантах реализации способы, предложенные в настоящей заявке, снижают сосудистую проницаемость сетчатки у субъекта по меньшей мере на 5%, по меньшей мере на 10%, по меньшей мере на 15%, по меньшей мере на 20%, по меньшей мере на 25%, по меньшей мере на 30%, по меньшей мере на 40%, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 80% или по меньшей мере на 90% по сравнению с субъектом в контроле или по сравнению с субъектом до получения способов согласно настоящему описанию. В некоторых вариантах реализации способы, предложенные в настоящей заявке, снижают сосудистую проницаемость сетчатки по меньшей мере на 10%. В некоторых вариантах реализации способы, предложенные в настоящей заявке, снижают сосудистую проницаемость сетчатки по меньшей мере на 20%. В некоторых вариантах реализации способы, предложенные в настоящей заявке, снижают сосудистую проницаемость сетчатки по меньшей мере на 30%. В некоторых вариантах реализации способы, предложенные в настоящей заявке, снижают сосудистую проницаемость сетчатки по меньшей мере на 50%. В некоторых вариантах реализации способы, предложенные в настоящей заявке, снижают сосудистую проницаемость сетчатки по меньшей мере на 70%.

[0145] Согласно некоторым вариантам реализации способы, предложенные в настоящей заявке, улучшают один или более параметров зрения или предотвращают снижение одного или более параметров зрения. Параметры зрения включают: плохое ночное зрение, нечеткое зрение, плавающие пятна, черные пятна или мигание в поле зрения, колебания зрения, нарушение цветового зрения, темные или пустые области в поле зрения, потерю зрения, внезапную сильную безболезненную потерю зрения. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения субъекты, получающие лечение согласно способам, предложенным в настоящей заявке, могут испытывать один или более из следующих эффектов: улучшение зрения, снижение потери зрения, улучшение ночного видения, улучшение зрения при слабом освещении, улучшение способности к чтению, улучшение периферийного зрения, уменьшение пятен в поле зрения, уменьшение мигания в поле зрения, уменьшение боли и улучшение внешнего вида глаза. Многие из этих параметров можно контролировать посредством стандартного осмотра глаза.

[0146] В некоторых вариантах реализации способы, предложенные в настоящей заявке, улучшают оценку по шкале ранней терапии диабетической ретинопатии (ETDRS) у субъектов с диабетической ретинопатией. В некоторых вариантах реализации субъект представляет собой человека. Шкала оценки ETDRS использует 3 стандартные фотографии. Стандартная фотография 1 показывает умеренную степень микроаневризмы и кровоизлияния; Стандартная фотография 2А показывает промежуточную степень микроаневризмы и кровоизлияния; и Стандартная фотография 2 В показывает тяжелую степень микроаневризмы и кровоизлияния. В ETDRS микроаневризма определяется как красное пятно 125 мкм в его самом длинном измерении с острыми краями. Она отличается от кровоизлияния, которое определяется как красное пятно с неровными краями и размером, превышающим 125 мкм. Используя область сетчатки, покрытую микроаневризмами и/или кровоизлияниями, для сравнения со стандартизированными фотографиями глазного дна, шкала оценки для описания непролиферативной диабетической ретинопатии (NPDR) выглядит следующим образом: степень 0 = отсутствие микроаневризмы или кровоизлияния; степень 1 = сомнительные микроаневризмы или кровоизлияния; степень 2 = определенные микроаневризмы или кровоизлияния, меньше, чем стандартная фотография 1; степень 3 = микроаневризмы или кровоизлияния, больше или равные стандартной фотографии 1, но меньше, чем стандартная фотография 2А; степень 4 = микроаневризмы или кровоизлияния, больше или равные стандартной фотографии 2А, но меньше, чем стандартная фотография 2 В; степень 5 = микроаневризмы или кровоизлияния, больше или равные стандартной фотографии 2 В. В некоторых вариантах реализации способы, предложенные в настоящей заявке, снижают среднюю оценку по шкале ETDRS у субъектов с ДР по меньшей мере на 0,1, по меньшей мере на 0,2. по меньшей мере на 0,3, по меньшей мере на 0,4, по меньшей мере на 0,5, по меньшей мере на 0,6, по меньшей мере на 0,7, по меньшей мере на 0,8, по меньшей мере на 0,9, по меньшей мере на 1,0, по меньшей мере на 1,2, по меньшей мере на 1,5, по меньшей мере на 1,7, по меньшей мере на 2, по меньшей мере на 2,2, по меньшей мере на 2,5, по меньшей мере на 2,7, по меньшей мере на 3,0, по меньшей мере на 3,2, по меньшей мере на 3,5, по меньшей мере на 3,7 или по меньшей мере на 4 по сравнению с субъектами в контроле или по сравнению с субъектами до получения способов согласно настоящему описанию. Согласно некоторым вариантам реализации предложенные в настоящей заявке способы снижают среднюю оценку по шкале ETDRS у субъектов с ДР по меньшей мере на 0,2. Согласно некоторым вариантам реализации предложенные в настоящей заявке способы снижают среднюю оценку по шкале ETDRS у субъектов с ДР по меньшей мере на 0,5. Согласно некоторым вариантам реализации предложенные в настоящей заявке способы снижают среднюю оценку по шкале ETDRS у субъектов с ДР по меньшей мере на 1. Согласно некоторым вариантам реализации предложенные в настоящей заявке способы снижают среднюю оценку по шкале ETDRS у субъектов с ДР по меньшей мере на 1,5. Согласно некоторым вариантам реализации предложенные в настоящей заявке способы снижают среднюю оценку по шкале ETDRS у субъектов с ДР по меньшей мере на 2. Согласно некоторым вариантам реализации предложенные в настоящей заявке способы снижают среднюю оценку по шкале ETDRS у субъектов с ДР по меньшей мере на 2,5. В некоторых вариантах реализации субъекты представляют собой людей.

[0147] В некоторых вариантах реализации способы, предложенные в настоящей заявке, предотвращают диабетическую ретинопатию. Способы можно вводить пациентам с риском развития диабетической ретинопатии. У таких субъектов предотвращение диабетической ретинопатии можно контролировать поддержанием зрения или отсутствием типичных признаков диабетической ретинопатии. Например, у субъектов, которым антитела против церамида или их антигенсвязывающие фрагменты были введены профилактически, может не наблюдаться или может наблюдаться снижение частоты возникновения одного или более из следующих симптомов: микроаневризмы, кровоизлияния, внутриретинальные микрососудистые аномалии, сегментарное расширение вен сетчатки, ватоподобные пятна, образование новых кровеносных сосудов (неоваскуляризация) в другом месте и на зрительном нерве, фиброзная пролиферация в другом месте и на зрительном нерве, преретинальное кровоизлияние и кровоизлияние в стекловидное тело, отслоение сетчатки вследствие образования рубцовой ткани, глаукома, плохое ночное зрение, нечеткое зрение, плавающие пятна, черные пятна или мигание в поле зрения, колебания зрение, нарушение цветового зрения, темные или пустые области в поле зрения, потеря зрения, внезапная сильная безболезненная потеря зрения, отслоение сцепления сетчатки, макулярный отек, расширение вен и внутриретинальные микрососудистые нарушения.

[0148] В некоторых вариантах реализации способы, предложенные в настоящей заявке, предотвращают или уменьшают макулярный отек. Макулярный отек может наблюдаться при биомикроскопии при помощи щелевой лампы в виде подъема и размытия слоев сетчатки.

[0149] В некоторых вариантах реализации способы, предложенные в настоящей заявке, задерживают начало диабетической ретинопатии. Соответственно, раскрытые способы могут быть использованы для замедления среднего начала диабетической ретинопатии до более чем на 5 лет, более чем на 10 лет, более чем на 11 лет, более чем на 12 лет, более чем на 13 лет, более чем на 14 лет, более чем на 15 лет, более чем на 16 лет, более чем на 17 лет, более чем на 18 лет, более чем на 19 лет или более чем на 20 лет после первоначального диагноза диабета.

[0150] В некоторых вариантах реализации раскрытые способы могут быть использованы для уменьшения, облегчения, уменьшения тяжести или устранения одного или более симптомов диабетической ретинопатии. Согласно некоторым вариантам реализации способы лечения диабетической ретинопатии с помощью антител против церамида или их антигенсвязывающих фрагментов могут уменьшать, облегчать, уменьшать тяжесть или устранять один или более из следующих симптомов: микроаневризмы, кровоизлияния, внутриретинальные микрососудистые аномалии, сегментарное расширение вен сетчатки, ватоподобные пятна, образование новых кровеносных сосудов (неоваскуляризация) в другом месте и на зрительном нерве, фиброзная пролиферация в другом месте и на зрительном нерве, преретинальное кровоизлияние и кровоизлияние в стекловидное тело, отслоение сетчатки вследствие образования рубцовой ткани, потеря зрения, глаукома, плохое ночное зрение, нечеткое зрение, плавающие пятна, черные пятна или мигание в поле зрения, внезапная сильная безболезненная потеря зрения, отслоение сцепления сетчатки, макулярный отек, расширение вен и внутриретинальные микрососудистые нарушения.

[0151] В некоторых вариантах реализации раскрытые способы лечения диабетической ретинопатии влияют на один или более параметров сосудистой сети сетчатки, включая, но не ограничиваясь ими: проницаемость, уровни NFkB, уровни воспалительных маркеров, частоту апоптоза, метаболизм сфинголипидов и реэндотелизацию. В некоторых вариантах реализации способ лечения диабетической ретинопатии, описанный в настоящей заявке, снижает сосудистую проницаемость сетчатки. Сосудистая проницаемость сетчатки может контролироваться с помощью флуоресценции, индикаторных красителей, оптического исследования и тому подобного. В некоторых вариантах реализации способ лечения диабетической ретинопатии, раскрытый в настоящей заявке, снижает уровни NFkB и/или других воспалительных маркеров в сосудистой сети сетчатки. Как описано выше, уровни воспалительных цитокинов могут быть измерены с помощью обычных средств (например, ELISA). В некоторых вариантах реализации способ лечения диабетической ретинопатии, раскрытый в настоящей заявке, снижает частоту апоптоза в сосудистой сети сетчатки. Как описано выше, апоптоз может быть измерен с использованием обычных средств, например, методов ядерного и неядерного окрашивания. В некоторых вариантах реализации способ лечения диабетической ретинопатии, описанный в настоящей заявке, ингибирует или подавляет метаболизм сфинголипидов. В некоторых вариантах реализации способ лечения диабетической ретинопатии, раскрытый в настоящей заявке, может увеличивать реэндотелизацию здоровой ткани.

Примеры

Пример 1: scFv против церамида ингибирует I/R воспаление и сосудистую проницаемость сетчатки в мышиной модели диабетической ретинопатии.

[0152] Мышиную модель ишемически-реперфузионной (I/R) диабетической ретинопатии использовали для моделирования повреждающих эффектов диабетической ретинопатии на сосудистую сеть сетчатки, например, как показано на Фиг. 1.

[0153] Ишемия-реперфузия (I/R) сетчатки: Каждая мышь имела один глаз с I/R и один неповрежденный глаз в качестве контроля. I/R сетчатки создавали путем временного повышения внутриглазного давления (ВГД) до 90 мм рт.ст. следующим образом. Самцов мышей C57BL/6J массой от 25 до 30 г анестезировали. Переднюю камеру одного глаза канюлировали иглой 30 калибра, прикрепленной к линии, инфузирующей физиологический раствор. ВГД измеряли с помощью портативного тонометра (TONO Pen; Medtronic Solan, Джексонвилл, штат Флорида) в глазах мыши, и давление в глазу регулировали до 80-90 мм рт.ст. с помощью инфузионной помпы (mfu-surg; Ethox Corp., Баффало, штат Нью-Йорк). Другой глаз того же животного был установлен в качестве контроля. Продолжительность ишемии составляла 90 минут для мышей. После ишемии иглу извлекали, ВГД нормализовали, и визуально задокументировали рефлюкс кровообращения сетчатки. Животных умерщвляли в разное время после I/R повреждения. Сетчатку извлекали через 2 или 7 дней после I/R сетчатки.

[0154] Введение контрольного растворителя или scFv против церамида: За двадцать четыре часа до I/R мыши в контроле получали инъекции носителя (забуференного фосфатом физиологического раствора), а испытуемые мыши получали интравитреальную инъекцию 1 мкл scFv против церамида 6В5 при 1,73 мг/мл.

[0155] Уровни воспалительных цитокинов: Через 48 часов после I/R проводили измерения уровней экспрессии воспалительных маркеров для TNFα, IL-1β, IL6, ICAM-1, VCAM-1 и MCP1 с применением анализа методом количественной ПЦР.

[0156] Дополнительные измерения, которые можно произвести: В сопоставимых экспериментах с использованием этой модели измеряют проницаемость, воспалительные маркеры и метаболизм сфинголипидов через 48 часов, а через 7 дней измеряют апоптоз, бесклеточные капилляры и метаболизм сфинголипидов, как показано на Фиг. 2А-Фиг.2 В.

[0157] Сосудистая проницаемость сетчатки: Сетчатку выделяли через 48 часов после I/R. Вкратце, мышам вводили FITC-альбумин (0,5 мг в 100 мкл PBS) (Sigma-Aldrich, St. Louis, МО). Через два часа у каждой мыши отбирали кровь и центрифугировали для получения плазмы; животное перфузировали 1% формальдегидом и энуклеировали. Сетчатки удаляли, закрепляли на плоской основе с четырьмя прорезями и хранили на стеклянных предметных стеклах с фиксирующей средой Fluoromount (Sigma-Aldrich, St. Louis, МО). Изображения получали с помощью сканирующего лазерного конфокального микроскопа Olympus FluoView 1000, и выбирали по меньшей мере 5 различных областей обзора для сбора изображений для каждого образца. Сетчатку была механически разрушали и очищали путем центрифугирования. FITC-альбумин в супернатанте количественно определяли с использованием спектрофлуорометра и нормализовали к флуоресценции плазмы (Kielczewski et al., 2011).

Результаты

[0158] Как показано на Фиг. 2А, экспрессия цитокинов в I/R глазах, обработанных антицерамидом, была ниже, чем в необработанных LR глазах для каждого из тестируемых маркеров (TNFα, IL-1β, IL6, ICAM-1, VCAM-1 и MCP1). Снижение, наблюдаемое в TNFα, IL6, ICAM-1 и MCP1, было статистически значимым. Фиг. 2В демонстрирует явное различие в сосудистой проницаемости сетчатки, что продемонстрировано с помощью изображений флуоресцентной микроскопии и количественного анализа. Проницаемость была значительно выше в необработанных глазах I/R, чем в глазах в качестве контроля или в I/R глазах, обработанных антицерамидом.

[0159] Этот пример демонстрирует, что однократная интравитреальная инъекция scFv против церамида при возникновении диабета улучшает исход возможной диабетической ретинопатии, предотвращая потерю эндотелиальных клеток и последующее повреждение сетчатки.

Пример 2: Эффективность введения scFv против церамида в крысиной модели диабетической ретинопатии.

[0160] STZ-индуцированную модель диабетической ретинопатии использовали у крыс для моделирования повреждающих эффектов диабетической ретинопатии на сосудистую сеть сетчатки, например, как показано на Фиг. 3.

[0161] Животные и индукция STZ-индуцированного диабета: Самцам крыс линии Спраг-Доули массой 237-283 г индуцировали диабет с однократной внутрибрюшинной инъекцией 65 мг стрептозотоцина (STZ) на кг массы тела. Крыс содержали на лабораторном рационе Harlan-Teklad (№8640) и воде без ограничений. Прирост массы тела и уровень глюкозы в крови для группы в контроле и группы с STZ-индуцированным диабетом контролировали раз в две недели.

[0162] Введение контрольного растворителя или scFv против церамида: после подтверждения диабета (гипергликемия выше 250 мг/дл, через 7-10 дней после инъекции STZ), крысы с диабетом в контроле получали инъекции PBS носителя, а тестируемые крысы с диабетом получали интравитреальную инъекцию 2 мкл scFv против церамида 6 В5 при 1,73 мг/мл. Крысы без диабета в контроле также получали инъекцию либо контрольного растворителя, либо scFv против церамида.

[0163] Анализ сосудистой проницаемости сетчатки: Сетчатку выделяли через 48 часов после I/R. Вкратце, мышам вводили FITC-альбумин (0,5 мг в 100 мкл PBS) (Sigma-Aldrich, St. Louis, МО). Через два часа у каждой мыши отбирали кровь и центрифугировали для получения плазмы; животное перфузировали 1% формальдегидом и энуклеировали. Сетчатки удаляли, закрепляли на плоской основе с четырьмя прорезями и хранили на стеклянных предметных стеклах с фиксирующей средой Fluoromount (Sigma-Aldrich, St. Louis, МО). Изображения получали с помощью сканирующего лазерного конфокального микроскопа Olympus FluoView 1000, и выбирали по меньшей мере 5 различных областей обзора для сбора изображений для каждого образца. Сетчатку была механически разрушали и очищали путем центрифугирования. FITC-альбумин в супернатанте количественно определяли с использованием спектрофлуорометра и нормализовали к флуоресценции плазмы (Kielczewski et al., 2011).

[0164] Дополнительные измерения: В сопоставимых экспериментах эксперимент проводят на мышиной модели или диабетической моделью является дефицит лептина db/db, как показано на Фиг. 3. Кроме того, через 6-8 недель после индукции диабета в STZ-индуцированной модели сосудистую сеть сетчатки каждого животного оценивали на проницаемость, NFkB и воспалительные маркеры, апоптоз и метаболизм сфинголипидов, как показано на Фиг. 3.

Результаты

[0165] Результаты, приведенные на Фиг. 4, демонстрируют, что у крыс с диабетом, получавших интравитреальную дозу scFv против церамида, не развилась протечка сосудов, свидетельствующая о диабетической ретинопатии, таким образом демонстрируя, что одной интравитреальной инъекции scFv против церамида достаточно для устранения индуцированной гипергликемией диабетической ретинопатии на крысиной модели этого состояния.

Пример 3: Интравитреальное или системное введение scFv против церамида для лечения вызванных диабетом провоспалительных изменений при ДР.

[0166] Эксперименты выполняют для сравнения влияния интравитреальной терапии против церамида по сравнению с системной терапией против церамида на вызванные диабетом провоспалительные изменения в мышиной модели ДР. Мыши с STZ-индуцированным диабетом 1 типа получают однократное интравитреальное или системное (внутривенное) лечение посредством scFv 6В5 против церамида в начале диабета. Через 6-8 недель после введения STZ умерщвляют животных в контроле, животных с диабетом и животных с диабетом, получавших лечение против церамида. Из каждого животного выделяют сетчатку; определяют профиль воспалительных цитокинов, факторов роста и молекул адгезии; и измеряют экспрессию и активность эндотелиальной ASM в сетчатке. Эти измерения выполняют с помощью кПЦР, вестерн-блоттинга, ЭСИ-МС/МС, флуоресцентной микроскопии и экспериментов с использованием иммунозолотой электронной микроскопии. Иллюстративный протокол эксперимента показан на Фиг. 5.

[0167] Ожидается, что однократная интравитреальная инъекция scFv против церамида будет иметь больший терапевтический эффект в отношении развития ДР. Проводят дополнительные эксперименты для оценки способности одной интравитреальной дозы антитела против церамида или его антигенсвязывающего фрагмента лечить существующие патологии ДР.

Пример 4: Интравитреальное или системное введение scFv против церамида для лечения сосудистой дисфункции ДР.

[0168] Эксперименты выполняют для сравнения влияния интравитреальной и системной терапии против церамида на сосудистую проницаемость сетчатки в мышиной модели ДР. В этом примере измеряют влияние введения scFv против церамида 6В5 на вызванное диабетом повреждение сосудов сетчатки. Для оценки первоначального разрушения гемато-ретинального барьера мышам проводят однократное интравитреальное или системное (внутривенное) лечение scFv против церамида в начале диабета. Через 6-8 недель после индукции диабета оценивают сосудистую проницаемость сетчатки с использованием флуоресцеина, как описано в Примере 2. Иллюстративный протокол эксперимента показан на Фиг. 5.

[0169] Ожидается, что однократная интравитреальная инъекция scFv будет иметь больший терапевтический эффект на сосудистую дисфункцию ДР. Проводят дополнительные эксперименты для оценки способности одной интравитреальной дозы антитела против церамида или его антигенсвязывающего фрагмента лечить существующие патологии ДР.

Пример 5: scFv против церамида по сравнению с ДГК или дезипрамином для снижения провоспалительных изменений в ДР.

[0170] Эксперименты выполняют для сравнения эффектов однократного интравитреального или системного лечения посредством scFv против церамида с эффектами однократного лечения рыбьим жиром, богатым ДГК, или лечения дезипрамином на индуцированные диабетом провоспалительные изменения в мышиной модели ДР. Мыши с STZ-индуцированным диабетом 1 типа получают однократную дозу рыбьего жира, богатого ДГК, через желудочный зонд, однократную внутривенную инъекцию дезипрамина, однократную интравитреальную инъекцию scFv против церамида или системную инъекцию scFv против церамида в начале диабета. Через 6-8 недель после индукции диабета посредством STZ животных умерщвляют и выделяют их сетчатку. Определяют профиль воспалительных цитокинов, факторов роста и молекул адгезии. Измеряют экспрессию и активность эндотелиальной ASM. Эти измерения выполняют в серии экспериментов количественной ПЦР, вестерн-блоттинга, ЭСИ-МС/МС, флуоресцентной микроскопии и иммунозолотой электронной микроскопии, как описано в Примере 3. Иллюстративный протокол эксперимента показан на Фиг. 6.

[0171] Ожидается, что однократная интравитреальная инъекция scFv против церамида будет иметь больший терапевтический эффект в отношении развития ДР. Проводят дополнительные эксперименты для оценки способности одной интравитреальной дозы антитела против церамида или его антигенсвязывающего фрагмента лечить существующие патологии ДР.

Пример 6: Введение scFv против церамида по сравнению с ДГК или дезипрамином для лечения сосудистой дисфункции ДР.

[0172] Эксперименты выполняют для сравнения влияния однократного интравитреального или системного лечения scFv против церамида по сравнению с однократным лечением рыбьим жиром, богатым ДГК, или дезипрамином на сосудистую проницаемость сетчатки в мышиной модели ДР. Мыши с STZ-индуцированным диабетом 1 типа получают однократную дозу рыбьего жира, богатого ДГК, через желудочный зонд, однократную внутривенную инъекцию дезипрамина, однократную интравитреальную инъекцию scFv против церамида или системную инъекцию scFv против церамида в начале диабета. Через 6-8 недель после индукции диабета оценивают сосудистую проницаемость сетчатки с использованием флуоресцеина, как описано в Примере 4. Иллюстративный протокол эксперимента показан на Фиг 6.

[0173] Ожидается, что однократная интравитреальная инъекция scFv будет иметь больший терапевтический эффект на сосудистую дисфункцию ДР. Проводят дополнительные эксперименты для оценки способности одной интравитреальной дозы антитела против церамида или его антигенсвязывающего фрагмента лечить существующие патологии ДР.

Пример 7: Введение scFv против церамида ингибирует апоптоз, индуцированный стрессом.

[0174] Проводят эксперименты для демонстрации того, что scFv против церамида эффективен в эндотелиальных клетках сетчатки человека (HREC) в культуре для ингибирования стресс-индуцированного апоптоза в условиях, когда антиангиогенные препараты являются неэффективными. Механизм ДР-терапии scFv против церамида и антиангиогенными лекарственными средствами отличается от ранее охарактеризованных механизмов. Не ограничиваясь теорией, полагают, что при диабете продолжается гибель и ремоделирование, которые не могут быть устранены с помощью лечения против VEGF, но которые не реагируют на антицерамид. Следовательно, в то время как терапия против VEGF может только предотвращать неоангиогенез, введение антител против церамида может предотвращать продолжающуюся гибель эндотелиальных клеток, усиливая восстановление сосудов и предотвращая гипоксию и последующий неоангиогенез. Чтобы проверить, будет ли scFv против церамида работать in vitro в условиях, когда антиангиогенные лекарственные средства неэффективны, HREC подвергают различным стрессовым условиям, которые индуцируют апоптотическую смерть, опосредованную ASM/церамидом (например, воздействиеа цитокинов IL-1β и TNF или Н₂О₂). HREC обрабатывали ингибиторами против VEGF (анти-VEGFR2 DC101 Ab или ингибитором VEGFR ТК Sorafenib) или антителами против церамида.

[0175] Ожидается, что введение scFv против церамида будет иметь больший терапевтический эффект на ингибирование гибели эндотелиальных клеток.

Пример 8: Лечение дезипрамином мышей с диабетом

[0176] Индуцировали диабет у самцов мышей C57BL/6J (20-25 г) путем внутрибрюшинных инъекций SZT (65 мг/кг) в течение пяти последовательных дней. Животные в контроле получали инъекции носителя лимонной кислоты (рН 4,5). Через две недели после последней инъекции уровень глюкозы в крови измеряли по капле крови, собранной из дорсальной вены стопы. Диабет был подтвержден уровнями глюкозы в крови ≥ 300 мг/дл. Ежедневно контролировали потерю массы, полиурию, потребление воды и пищи. В первый день, когда диабет был подтвержден, дезипрамин добавляли в воду для начала лечения, ~ через 2 недели после первой инъекции SZT. Лечение дезипрамином не оказывало влияния на животных в контроле. Тем не менее, животные с диабетом демонстрировали обезвоживание и теряли более 25% своей массы в течение 2-4 дней, после чего эксперимент должен был быть прекращен в соответствии с правилами гуманного использования животных IACUC.

[0177] Поскольку животные с диабетом имели полидипсию и полиурию, дезипрамин в воде мог повлиять на характер питья, вызывая обезвоживание. Таким образом, эксперимент повторяли с использованием внутрибрюшинных инъекций 2 мг/мл дезипрамина в дозе 20 мг/кг. Как и в случае с лечением дезипрамином в воде, животные в контроле хорошо переносили лекарственное средство. Тем не менее, у животных с диабетом наблюдался аномальный тремор, они стали слабыми, перестали ухаживать за собой, есть и пить и потеряли более 25% своей массы в течение 5-7 дней после ежедневных инъекций, после чего эксперимент должен был быть прекращен в соответствии с правилами гуманного использования животных IACUC.

Пример 9: Лечение посредством ДГК мышей дикого типа

[0178] Самцов крыс линии Спраг-Доули (237-283) кормили либо контрольной очищенной диетой для грызунов AIN-93M с потреблением 10% калорий в виде соевого масла, содержащего 50,8% линолевой кислоты от Dyets Inc. (Вифлеем, Пенсильвания), либо богатой ДГК диетой с рыбьим жиром, в которой половина составляет соевое масло, или 5% потребление калорий было заменено жиром американской сельди, содержащим 10,26% ДГК и 14,16% ЭПК. Через 9 месяцев после приема диеты сосудистую сеть сетчатки крыс выделяли путем расщепления трипсином, а бесклеточные капилляры систематически подсчитывали в середине сетчатки двумя независимыми исследователями. Как показано на Фиг. 7, обработка рыбьим жиром, богатым ДГК, была вредной для животных в контроле, вызывая развитие бесклеточных капилляров.

[0179] Хотя польза рыбьего жира для здоровья в качестве средства, снижающего триглицериды, хорошо признана, доза, необходимая для эффектов в отношение сетчатки, составляла -5% от потребления калорий, что соответствует -12 г рыбьего жира в день, что в 3 раза выше, чем рекомендовано для человека. Высокая доза ДГК у человека, особенно при диабете, связана с рядом хорошо описанных побочных эффектов, включая более высокий уровень глюкозы в крови, чрезмерное кровотечение, снижение заживления ран, частые инфекции, проблемы с желудочно-кишечным трактом и увеличение массы тела. В связи с этими проблемами ДГК не рекомендуется при диабетических осложнениях.

Дополнительные пронумерованные варианты реализации изобретения

[0180] Дополнительные варианты реализации настоящего изобретения представлены в пронумерованных вариантах реализации ниже:

[0181] Вариант реализации 1. Способ лечения или предотвращения диабетической ретинопатии у нуждающегося в этом субъекта, включающий окулярное введение субъекту антитела против церамида или его антигенсвязывающего фрагмента.

[0182] Вариант реализации 2. Способ согласно варианту реализации 1, отличающийся тем, что антитело против церамида или его антигенсвязывающий фрагмент представляет собой одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv).

[0183] Вариант реализации 3. Способ согласно варианту реализации 1 или 2, отличающийся тем, что окулярное введение выбрано из группы, состоящей из местного введения, интраокулярного введения, субконъюнктивального введения, внутрикамерного введения, инъекции в переднюю камеру через височный край, интрастромального введения, внутрироговичного введения, субретинального введения, инъекции во внутриглазную жидкость, субтенонового введения, введения в супрахориоидное пространство (SCS), введения в супрацилиарное пространство и интравитреального введения.

[0184] Вариант реализации 4. Способ согласно любому из вариантов реализации 1-3, отличающийся тем, что указанное введение представляет собой интравитреальное введение.

[0185] Вариант реализации 5. Способ согласно любому из вариантов реализации 1-4, отличающийся тем, что указанный субъект получал предшествующее лечение диабетической ретинопатии.

[0186] Вариант реализации 6. Способ согласно варианту реализации 5, отличающийся тем, что указанный субъект не отвечал на предшествующее лечение диабетической ретинопатии.

[0187] Вариант реализации 7. Способ согласно варианту реализации 5 или 6, отличающийся тем, что предшествующее лечение представляет собой терапевтическую процедуру, выбранную из витрэктомии и лазерной хирургии, или терапевтический агент, выбранный из стероида и терапии против фактора роста эндотелия сосудов (VEGF).

[0188] Вариант реализации 7. Способ согласно варианту реализации 7, отличающийся тем, что терапия против VEGF представляет собой антитело против VEGF, выбранное из группы, состоящей из бевацизумаба, ранибизумаба и афлиберцепта.

[0189] Вариант реализации 9. Способ согласно любому из вариантов реализации 1-8, отличающийся тем, что указанное антитело против церамида или его антигенсвязывающий фрагмент вводят в виде однократной дозы.

[0190] Вариант реализации 10. Способ согласно любому из вариантов реализации 1-8, отличающийся тем, что антитело против церамида или его антигенсвязывающий фрагмент вводят в двух или более дозах, разделенных по меньшей мере двумя неделями, по меньшей мере тремя неделями или по меньшей мере четырьмя неделями.

[0191] Вариант реализации 11. Способ согласно любому из вариантов реализации 1-8, отличающийся тем, что антитело против церамида или его антигенсвязывающий фрагмент вводят в двух или более дозах, разделенных периодом приблизительно от двух недель до приблизительно четырех недель.

[0192] Вариант реализации 12. Способ согласно любому из вариантов реализации 1-8, отличающийся тем, что антитело против церамида или его антигенсвязывающий фрагмент вводят в двух или более дозах, разделенных по меньшей мере одним месяцем, по меньшей мере двумя месяцами, по меньшей мере тремя месяцами, по меньшей мере четырьмя месяцами, по меньшей мере пятью месяцами, по меньшей мере шестью месяцами, по меньшей мере семью месяцами, по меньшей мере восемью месяцами, по меньшей мере девятью месяцами, по меньшей мере десятью месяцами или по меньшей мере одиннадцатью месяцами.

[0193] Вариант реализации 13. Способ согласно любому из вариантов реализации 1-8, отличающийся тем, что антитело против церамида или его антигенсвязывающий фрагмент вводят в двух или более дозах, разделенных периодом от приблизительно одного месяца до приблизительно шести месяцев.

[0194] Вариант реализации 14. Способ согласно любому из вариантов реализации 1-8, отличающийся тем, что антитело против церамида или его антигенсвязывающий фрагмент вводят в двух или более дозах, разделенных по меньшей мере одним годом.

[0195] Вариант реализации 15. Способ согласно любому из вариантов реализации 1-14, отличающийся тем, что антитело против церамида или его антигенсвязывающий фрагмент вводят до возникновения одного или более симптомов диабетической ретинопатии.

[0196] Вариант реализации 16. Способ согласно любому из вариантов реализации 1-14, отличающийся тем, что антитело против церамида или его антигенсвязывающий фрагмент вводят после возникновения одного или более симптомов диабетической ретинопатии.

[0197] Вариант реализации 17. Способ согласно любому из вариантов реализации 1-14, отличающийся тем, что антитело против церамида или его антигенсвязывающий фрагмент вводят во время непролиферативной стадии диабетической ретинопатии.

[0198] Вариант реализации 18. Способ согласно варианту реализации 17, отличающийся тем, что антитело против церамида или его антигенсвязывающий фрагмент вводят во время пролиферативной стадии диабетической ретинопатии.

[0199] Вариант реализации 19. Способ лечения или предотвращения диабетической ретинопатии у нуждающегося в этом субъекта, включающий введение антитела против церамида или его антигенсвязывающего фрагмента субъекту, где указанный субъект получал предшествующее лечение диабетической ретинопатии.

[0200] Вариант реализации 20. Способ согласно варианту реализации 19, отличающийся тем, что указанный субъект не отвечал на предшествующее лечение диабетической ретинопатии.

[0201] Вариант реализации 21. Способ согласно варианту реализации 19 или 20, отличающийся тем, что антитело против церамида или его антигенсвязывающий фрагмент представляет собой одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv).

[0202] Вариант реализации 22. Способ согласно любому из вариантов реализации 19-21, отличающийся тем, что указанное введение представляет собой окулярное введение.

[0203] Вариант реализации 23. Способ согласно варианту реализации 22, отличающийся тем, что окулярное введение выбрано из группы, состоящей из местного введения, интраокулярного введения, субконъюнктивального введения, внутрикамерного введения, инъекции в переднюю камеру через височный край, интрастромального введения, внутрироговичного введения, субретинального введения, инъекции во внутриглазную жидкость, субтенонового введения, введения в супрахориоидное пространство (SCS), введения в супрацилиарное пространство и интравитреального введения.

[0204] Вариант реализации 24. Способ согласно варианту реализации 22 или 23, отличающийся тем, что окулярное введение представляет собой интравитреальное введение.

[0205] Вариант реализации 25. Способ согласно любому из вариантов реализации 19-24, отличающийся тем, что предшествующее лечение представляло собой витрэктомию, лазерную хирургию, стероид и/или терапию против фактора роста эндотелия сосудов (VEGF).

[0206] Вариант реализации 26. Способ согласно варианту реализации 25, отличающийся тем, что терапия против VEGF представляет собой антитело против VEGF, выбранное из группы, состоящей из бевацизумаба, ранибизумаба и афлиберцепта.

[0207] Вариант реализации 27. Способ согласно любому из вариантов реализации 19-26, отличающийся тем, что указанное антитело против церамида или его антигенсвязывающий фрагмент вводят в виде однократной дозы.

[0208] Вариант реализации 28. Способ согласно любому из вариантов реализации 19-26, отличающийся тем, что антитело против церамида или его антигенсвязывающий фрагмент вводят в двух или более дозах, разделенных по меньшей мере двумя неделями, по меньшей мере тремя неделями или по меньшей мере четырьмя неделями.

[0209] Вариант реализации 29. Способ согласно любому из вариантов реализации 19-26, отличающийся тем, что антитело против церамида или его антигенсвязывающий фрагмент вводят в двух или более дозах, разделенных периодом приблизительно от двух недель до приблизительно четырех недель.

[0210] Вариант реализации 30. Способ согласно любому из вариантов реализации 19-26, отличающийся тем, что антитело против церамида или его антигенсвязывающий фрагмент вводят в двух или более дозах, разделенных по меньшей мере одним месяцем, по меньшей мере двумя месяцами, по меньшей мере тремя месяцами, по меньшей мере четырьмя месяцами, по меньшей мере пятью месяцами, по меньшей мере шестью месяцами, по меньшей мере семью месяцами, по меньшей мере восемью месяцами, по меньшей мере девятью месяцами, по меньшей мере десятью месяцами или по меньшей мере одиннадцатью месяцами.

[0211] Вариант реализации 31. Способ согласно любому из вариантов реализации 19-26, отличающийся тем, что антитело против церамида или его антигенсвязывающий фрагмент вводят в двух или более дозах, разделенных периодом от приблизительно одного месяца до приблизительно шести месяцев.

[0212] Вариант реализации 32. Способ согласно любому из вариантов реализации 19-26, отличающийся тем, что антитело против церамида или его антигенсвязывающий фрагмент вводят в двух или более дозах, разделенных по меньшей мере одним годом.

[0213] Вариант реализации 33. Способ согласно любому из вариантов реализации 19-32, отличающийся тем, что антитело против церамида или его антигенсвязывающий фрагмент вводят до возникновения одного или более симптомов диабетической ретинопатии.

[0214] Вариант реализации 34. Способ согласно любому из вариантов реализации 19-32, отличающийся тем, что антитело против церамида или его антигенсвязывающий фрагмент вводят после возникновения одного или более симптомов диабетической ретинопатии.

[0215] Вариант реализации 35. Способ согласно любому из вариантов реализации 19-32, отличающийся тем, что антитело против церамида или его антигенсвязывающий фрагмент вводят во время непролиферативной стадии диабетической ретинопатии.

[0216] Вариант реализации 36. Способ согласно любому из вариантов реализации 19-32, отличающийся тем, что антитело против церамида или его антигенсвязывающий фрагмент вводят во время пролиферативной стадии диабетической ретинопатии.

[0217] Вариант реализации 37. Способ лечения или предотвращения диабетической ретинопатии у субъекта, включающий введение субъекту однократной дозы антитела против церамида или его антигенсвязывающего фрагмента.

[0218] Вариант реализации 38. Способ лечения или предотвращения диабетической ретинопатии у субъекта, включающий введение субъекту двух или более доз антитела против церамида или его антигенсвязывающего фрагмента, причем две или более доз разделены по меньшей мере двумя неделями.

[0219] Вариант реализации 39. Способ согласно варианту реализации 38, отличающийся тем, что антитело против церамида или его антигенсвязывающий фрагмент вводят в двух или более дозах, разделенных по меньшей мере двумя неделями, по меньшей мере тремя неделями или по меньшей мере четырьмя неделями.

[0220] Вариант реализации 40. Способ согласно варианту реализации 38, отличающийся тем, что антитело против церамида или его антигенсвязывающий фрагмент вводят в двух или более дозах, разделенных периодом приблизительно от двух недель до приблизительно четырех недель.

[0221] Вариант реализации 41. Способ согласно варианту реализации 38, отличающийся тем, что антитело против церамида или его антигенсвязывающий фрагмент вводят в двух или более дозах, разделенных по меньшей мере одним месяцем, по меньшей мере двумя месяцами, по меньшей мере тремя месяцами, по меньшей мере четырьмя месяцами, по меньшей мере пятью месяцами, по меньшей мере шестью месяцами, по меньшей мере семью месяцами, по меньшей мере восемью месяцами, по меньшей мере девятью месяцами, по меньшей мере десятью месяцами или по меньшей мере одиннадцатью месяцами.

[0222] Вариант реализации 42. Способ согласно варианту реализации 38, отличающийся тем, что антитело против церамида или его антигенсвязывающий фрагмент вводят в двух или более дозах, разделенных периодом от приблизительно одного месяца до приблизительно шести месяцев.

[0223] Вариант реализации 43. Способ согласно варианту реализации 38, отличающийся тем, что антитело против церамида или его антигенсвязывающий фрагмент вводят в двух или более дозах, разделенных по меньшей мере одним годом.

[0224] Вариант реализации 44. Способ согласно любому из вариантов реализации 37-43, отличающийся тем, что антитело против церамида или его антигенсвязывающий фрагмент представляет собой одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv).

[0225] Вариант реализации 45. Способ согласно любому из вариантов реализации 37-44, отличающийся тем, что указанное введение представляет собой окулярное введение.

[0226] Вариант реализации 46. Способ согласно варианту реализации 45, отличающийся тем, что окулярное введение выбрано из группы, состоящей из местного введения, интраокулярного введения, субконъюнктивального введения, внутрикамерного введения, инъекции в переднюю камеру через височный край, интрастромального введения, внутрироговичного введения, субретинального введения, инъекции во внутриглазную жидкость, субтенонового введения, введения в супрахориоидное пространство (SCS), введения в супрацилиарное пространство или интравитреального введения.

[0227] Вариант реализации 47. Способ согласно варианту реализации 45 или 46, отличающийся тем, что окулярное введение представляет собой интравитреальное введение.

[0228] Вариант реализации 48. Способ согласно любому из вариантов реализации 37-47, отличающийся тем, что указанный субъект получал предшествующее лечение диабетической ретинопатии.

[0229] Вариант реализации 49. Способ согласно варианту реализации 48, отличающийся тем, что указанный субъект не отвечал на предшествующее лечение диабетической ретинопатии.

[0230] Вариант реализации 50. Способ согласно варианту реализации 48 или 49, отличающийся тем, что предшествующее лечение представляло собой витрэктомию, лазерную хирургию, стероид и/или терапию против фактора роста эндотелия сосудов (VEGF).

[0231] Вариант реализации 51. Способ согласно варианту реализации 50, отличающийся тем, что терапия против VEGF представляет собой антитело против VEGF, выбранное из группы, состоящей из бевацизумаба, ранибизумаба и афлиберцепта.

[0232] Вариант реализации 52. Способ согласно любому из вариантов реализации 37-51, отличающийся тем, что антитело против церамида или его антигенсвязывающий фрагмент вводят до возникновения одного или более симптомов диабетической ретинопатии.

[0233] Вариант реализации 53. Способ согласно любому из вариантов реализации 37-51, отличающийся тем, что антитело против церамида или его антигенсвязывающий фрагмент вводят после возникновения одного или более симптомов диабетической ретинопатии.

[0234] Вариант реализации 54. Способ согласно любому из вариантов реализации 37-51, отличающийся тем, что антитело против церамида или его антигенсвязывающий фрагмент вводят во время непролиферативной стадии диабетической ретинопатии.

[0235] Вариант реализации 55. Способ согласно любому из вариантов реализации 37-51, отличающийся тем, что антитело против церамида или его антигенсвязывающий фрагмент вводят во время пролиферативной стадии диабетической ретинопатии.

[0236] Вариант реализации 56. Способ лечения воспалительного заболевания глаза, включающий окулярное введение антитела против церамида или его антигенсвязывающего фрагмента.

[0237] Вариант реализации 57. Способ согласно варианту реализации 56, отличающийся тем, что антитело против церамида или его антигенсвязывающий фрагмент представляет собой одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv).

[0238] Вариант реализации 58. Способ согласно варианту реализации 56 или 57, отличающийся тем, что окулярное введение выбрано из группы, состоящей из местного введения, интраокулярного введения, субконъюнктивального введения, внутрикамерного введения, инъекции в переднюю камеру через височный край, интрастромального введения, внутрироговичного введения, субретинального введения, инъекции во внутриглазную жидкость, субтенонового введения, введения в супрахориоидное пространство (SCS), введения в супрацилиарное пространство или интравитреального введения.

[0239] Вариант реализации 59. Способ согласно любому из вариантов реализации 56-58, отличающийся тем, что указанное воспалительное заболевание глаза выбрано из группы, состоящей из неоваскуляризации сетчатки, хориоидальной неоваскуляризации, неоваскуляризации роговицы, макулярной дегенерации, возрастной макулярной дегенерации, диабетической ретинопатии, кровоизлияния в стекловидное тело, кровоизлияния в сетчатку, хориоидита, неоваскулярной глаукомы, заболевания сосудистой оболочки, телеангиэктазиия, окклюзии артерии сетчатки, окклюзии вены сетчатки, хориоретинита, эпиретинальной мембраны, новообразования сосудистой оболочки, ретинопатии недоношенных, кистозного макулярного отека, отека диска зрительного нерва, рецидивирующей ишемии, кровоизлияния в глаза и пролиферативной витреоретинопатии.

[0240] Вариант реализации 60. Способ согласно любому из вариантов реализации 56-59, отличающийся тем, что указанное окулярное введение представляет собой интравитреальное введение.

[0241] Вариант реализации 61. Способ согласно любому из вариантов реализации 56-60, отличающийся тем, что указанный субъект получал предшествующее лечение диабетической ретинопатии.

[0242] Вариант реализации 62. Способ согласно варианту реализации 61, отличающийся тем, что указанный субъект не отвечал на предшествующее лечение диабетической ретинопатии.

[0243] Вариант реализации 63. Способ согласно варианту реализации 61 или 62, отличающийся тем, что предшествующее лечение представляло собой терапевтическую процедуру, выбранную из витрэктомии и лазерной хирургии, или терапевтический агент, выбранный из терапии стероидами и терапии против фактора роста эндотелия сосудов (VEGF).

[0244] Вариант реализации 64. Способ согласно варианту реализации 63, отличающийся тем, что терапия против VEGF представляет собой антитело против VEGF, выбранное из группы, состоящей из бевацизумаба, ранибизумаба и афлиберцепта.

[0245] Вариант реализации 65. Способ согласно любому из вариантов реализации 56-64, отличающийся тем, что указанное антитело против церамида или его антигенсвязывающий фрагмент вводят в виде однократной дозы.

[0246] Вариант реализации 66. Способ согласно любому из вариантов реализации 56-64, отличающийся тем, что антитело против церамида или его антигенсвязывающий фрагмент вводят в двух или более дозах, разделенных по меньшей мере двумя неделями, по меньшей мере тремя неделями или по меньшей мере четырьмя неделями.

[0247] Вариант реализации 67. Способ согласно любому из вариантов реализации 56-64, отличающийся тем, что антитело против церамида или его антигенсвязывающий фрагмент вводят в двух или более дозах, разделенных периодом приблизительно от двух недель до приблизительно четырех недель.

[0248] Вариант реализации 68. Способ согласно любому из вариантов реализации 56-64, отличающийся тем, что антитело против церамида или его антигенсвязывающий фрагмент вводят в двух или более дозах, разделенных по меньшей мере одним месяцем, по меньшей мере двумя месяцами, по меньшей мере тремя месяцами, по меньшей мере четырьмя месяцами, по меньшей мере пятью месяцами, по меньшей мере шестью месяцами, по меньшей мере семью месяцами, по меньшей мере восемью месяцами, по меньшей мере девятью месяцами, по меньшей мере десятью месяцами или по меньшей мере одиннадцатью месяцами.

[0249] Вариант реализации 69. Способ согласно любому из вариантов реализации 56-64, отличающийся тем, что антитело против церамида или его антигенсвязывающий фрагмент вводят в двух или более дозах, разделенных периодом от приблизительно одного месяца до приблизительно шести месяцев.

[0250] Вариант реализации 70. Способ согласно любому из вариантов реализации 56-64, отличающийся тем, что антитело против церамида или его антигенсвязывающий фрагмент вводят в двух или более дозах, разделенных по меньшей мере одним годом.

[0251] Вариант реализации 71. Способ согласно любому из вариантов реализации 56-70, отличающийся тем, что антитело против церамида или его антигенсвязывающий фрагмент вводят до возникновения одного или более симптомов воспалительного заболевания глаза.

[0252] Вариант реализации 72. Способ согласно любому из вариантов реализации 56-70, отличающийся тем, что антитело против церамида или его антигенсвязывающий фрагмент вводят после возникновения одного или более симптомов воспалительного заболевания глаза.

[0253] Вариант реализации 73. Способ согласно любому из вариантов реализации 1-72, отличающийся тем, что антитело против церамида или его антигенсвязывающий фрагмент содержит вариабельную тяжелую цепь (V_H) и вариабельную легкую цепь (V_L), где V_H содержит определяющий комплементарность участок 1 тяжелой цепи (HCDR1), содержащий аминокислотную последовательность GYTFTDHTIH (SEQ ID NO: 1), HCDR2, содержащий аминокислотную последовательность YNYPRDGSTKYNEKFKG (SEQ ID NO: 2), и HCDR3, содержащий аминокислотную последовательность GFITTVVPSAY (SEQ ID NO: 3), и где V_L содержит определяющий комплементарность участок 1 легкой цепи (LCDR1), содержащий аминокислотную последовательность RASKSISKYLA (SEQ ID NO: 4), LCDR2, содержащий аминокислотную последовательность SGSTLQS (SEQ ID NO: 5), и LCDR3, содержащий аминокислотную последовательность QQHNEYPWT (SEQ ID NO: 6).

[0254] Вариант реализации 74. Способ согласно любому из вариантов реализации 1-72, отличающийся тем, что V_H содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7, и при этом V_L содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8.

[0255] Вариант реализации 75. Способ согласно любому из вариантов реализации 1-74, отличающийся тем, что антитело против церамида или его антигенсвязывающий фрагмент представляет собой антитело 6В5.

[0256] Вариант реализации 76. Способ согласно любому из вариантов реализации 1-74, отличающийся тем, что антитело против церамида или его антигенсвязывающий фрагмент представляет собой scFv 6В5.

[0257] Вариант реализации 77. Способ согласно любому из вариантов реализации 1-72, отличающийся тем, что антитело против церамида или его антигенсвязывающий фрагмент содержит вариабельную тяжелую цепь (V_H) и вариабельную легкую цепь (V_L), где V_H содержит определяющий комплементарность участок 1 тяжелой цепи (HCDR1), содержащий аминокислотную последовательность GYTFTNYWMH (SEQ ID NO: 33), HCDR2, содержащий аминокислотную последовательность AIYPGDSDTSYNQKFKG (SEQ ID NO: 34), и HCDR3, содержащий аминокислотную последовательность GLYYGYD (SEQ ID NO: 35), и где V_L содержит определяющий комплементарность участок 1 легкой цепи (LCDR1), содержащий аминокислотную последовательность KSSQSLIDSDGKTFLN (SEQ ID NO: 36), LCDR2, содержащий аминокислотную последовательность LVSKLDS (SEQ ID NO: 37), и LCDR3, содержащий аминокислотную последовательность WQGTHFPYT (SEQ ID NO: 38).

[0258] Вариант реализации 78. Способ согласно любому из вариантов реализации 1-72, отличающийся тем, что V_H содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 39, и при этом V_L содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 40.

[0259] Вариант реализации 79. Способ согласно любому из вариантов реализации 1-72 и 77-78, отличающийся тем, что антитело против церамида или его антигенсвязывающий фрагмент представляет собой антитело 2А2.

[0260] Вариант реализации 80. Способ согласно любому из вариантов реализации 1-72 и 77-78, отличающийся тем, что антитело против церамида или его антигенсвязывающий фрагмент представляет собой scFv 2А2.

[0261] Вариант реализации 81. Способ согласно любому из вариантов реализации 1-72, отличающийся тем, что антитело против церамида или его антигенсвязывающий фрагмент содержит вариабельную тяжелую цепь (VH) и вариабельную легкую цепь (VL),

a) где VH содержит определяющий комплементарность участок 1 тяжелой цепи (HCDR1), содержащий или состоящий из аминокислотной последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 1 и 43, HCDR2, содержащий или состоящий из аминокислотной последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 44-47, и HCDR3, содержащий или состоящий из аминокислотной последовательности GFITTVVPSAY (SEQ ID NO: 3), и

b) где VL содержит определяющий комплементарность участок 1 легкой цепи (LCDR1), содержащий или состоящий из аминокислотной последовательности RASKSISKYLA (SEQ ID NO: 4), LCDR2, содержащий или состоящий из аминокислотной последовательности SGSTLQS (SEQ ID NO: 5), и LCDR3, содержащий или состоящий из аминокислотной последовательности QQHNEYPWT (SEQ ID NO: 6).

[0262] Вариант реализации 82. Способ согласно варианту реализации 81, отличающийся тем, что HCDR1 содержит или состоит из аминокислотной последовательности GYTFTDHTIH (SEQ ID NO: 1), и HCDR2 содержит или состоит из аминокислотной последовательности YNYPRDGSTKYNEKFQG (SEQ ID NO: 44).

[0263] Вариант реализации 83. Способ согласно варианту реализации 81, отличающийся тем, что HCDR1 содержит или состоит из аминокислотной последовательности GYTFTDHTIH (SEQ ID NO: 1), и HCDR2 содержит или состоит из аминокислотной последовательности YNYPREGSTKYNEKFQG (SEQ ID NO: 45).

[0264] Вариант реализации 84. Способ согласно варианту реализации 81, отличающийся тем, что HCDR1 содержит или состоит из аминокислотной последовательности GYTFTDHTIH (SEQ ID NO: 1), и HCDR2 содержит или состоит из аминокислотной последовательности YNYPRDVSTKYNEKFQG (SEQ ID NO: 46).

[0265] Вариант реализации 85. Способ согласно варианту реализации 81, отличающийся тем, что HCDR1 содержит или состоит из аминокислотной последовательности GYTFTDHTIH (SEQ ID NO: 1), и HCDR2 содержит или состоит из аминокислотной последовательности YNYPRDGSTKYAEKFQG (SEQ ID NO: 47).

[0266] Вариант реализации 86. Способ согласно варианту реализации 81, отличающийся тем, что HCDR1 содержит или состоит из аминокислотной последовательности GYTFTDHTMH (SEQ ID NO: 43), и HCDR2 содержит или состоит из аминокислотной последовательности YNYPRDGSTKYNEKFQG (SEQ ID NO: 44).

[0267] Вариант реализации 87. Способ согласно варианту реализации 81, отличающийся тем, что HCDR1 содержит или состоит из аминокислотной последовательности GYTFTDHTMH (SEQ ID NO: 43), и HCDR2 содержит или состоит из аминокислотной последовательности YNYPREGSTK YNEKFQG (SEQ ID NO: 45).

[0268] Вариант реализации 88. Способ согласно варианту реализации 81, отличающийся тем, что HCDR1 содержит или состоит из аминокислотной последовательности GYTFTDHTMH (SEQ ID NO: 43), и HCDR2 содержит или состоит из аминокислотной последовательности YNYPRDVSTK YNEKFQG (SEQ ID NO: 46).

[0269] Вариант реализации 89. Способ согласно варианту реализации 81, отличающийся тем, что HCDR1 содержит или состоит из аминокислотной последовательности GYTFTDHTMH (SEQ ID NO: 43), и HCDR2 содержит или состоит из аминокислотной последовательности YNYPRDGSTKYAEKFQG (SEQ ID NO: 47).

[0270] Вариант реализации 90. Способ согласно варианту реализации 81, отличающийся тем, что VH содержит или состоит из аминокислотной последовательности, которая по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 97% идентична или на 100% идентична SEQ ID NO: 48, и VL содержит или состоит из аминокислотной последовательности, которая по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 97% идентична или на 100% идентична SEQ ID NO: 53.

[0271] Вариант реализации 91. Способ согласно варианту реализации 81, отличающийся тем, что VH содержит или состоит из аминокислотной последовательности, которая по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 97% идентична или на 100% идентична SEQ ID NO: 48, и VL содержит или состоит из аминокислотной последовательности, которая по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 97% идентична или на 100% идентична SEQ ID NO: 54.

[0272] Вариант реализации 92. Способ согласно варианту реализации 81, отличающийся тем, что VH содержит или состоит из аминокислотной последовательности, которая по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 97% идентична или на 100% идентична SEQ ID NO: 48, и VL содержит или состоит из аминокислотной последовательности, которая по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 97% идентична или на 100% идентична SEQ ID NO: 55.

[0273] Вариант реализации 93. Способ согласно варианту реализации 81, отличающийся тем, что VH содержит или состоит из аминокислотной последовательности, которая по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 97% идентична или на 100% идентична SEQ ID NO: 49, и VL содержит или состоит из аминокислотной последовательности, которая по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 97% идентична или на 100% идентична SEQ ID NO: 53.

[0274] Вариант реализации 94. Способ согласно варианту реализации 81, отличающийся тем, что VH содержит или состоит из аминокислотной последовательности, которая по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 97% идентична или на 100% идентична SEQ ID NO: 49, и VL содержит или состоит из аминокислотной последовательности, которая по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 97% идентична или на 100% идентична SEQ ID NO: 54.

[0275] Вариант реализации 95. Способ согласно варианту реализации 81, отличающийся тем, что VH содержит или состоит из аминокислотной последовательности, которая по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 97% идентична или на 100% идентична SEQ ID NO: 49, и VL содержит или состоит из аминокислотной последовательности, которая по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 97% идентична или на 100% идентична SEQ ID NO: 55.

[0276] Вариант реализации 96. Способ согласно варианту реализации 81, отличающийся тем, что VH содержит или состоит из аминокислотной последовательности, которая по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 97% идентична или на 100% идентична SEQ ID NO: 50, и VL содержит или состоит из аминокислотной последовательности, которая по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 97% идентична или на 100% идентична SEQ ID NO: 53.

[0277] Вариант реализации 97. Способ согласно варианту реализации 81, отличающийся тем, что VH содержит или состоит из аминокислотной последовательности, которая по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 97% идентична или на 100% идентична SEQ ID NO: 50, и VL содержит или состоит из аминокислотной последовательности, которая по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 97% идентична или на 100% идентична SEQ ID NO: 54.

[0278] Вариант реализации 98. Способ согласно варианту реализации 81, отличающийся тем, что VH содержит или состоит из аминокислотной последовательности, которая по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 97% идентична или на 100% идентична SEQ ID NO: 50, и VL содержит или состоит из аминокислотной последовательности, которая по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 97% идентична или на 100% идентична SEQ ID NO: 55.

[0279] Вариант реализации 99. Способ согласно варианту реализации 81, отличающийся тем, что VH содержит или состоит из аминокислотной последовательности, которая по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 97% идентична или на 100% идентична SEQ ID NO: 51, и VL содержит или состоит из аминокислотной последовательности, которая по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 97% идентична или на 100% идентична SEQ ID NO: 53.

[0280] Вариант реализации 100. Способ согласно варианту реализации 81, отличающийся тем, что VH содержит или состоит из аминокислотной последовательности, которая по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 97% идентична или на 100% идентична SEQ ID NO: 51, и VL содержит или состоит из аминокислотной последовательности, которая по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 97% идентична или на 100% идентична SEQ ID NO: 54.

[0281] Вариант реализации 101. Способ согласно варианту реализации 81, отличающийся тем, что VH содержит или состоит из аминокислотной последовательности, которая по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 97% идентична или на 100% идентична SEQ ID NO: 51, и VL содержит или состоит из аминокислотной последовательности, которая по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 97% идентична или на 100% идентична SEQ ID NO: 55.

[0282] Вариант реализации 102. Способ согласно варианту реализации 81, отличающийся тем, что VH содержит или состоит из аминокислотной последовательности, которая по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 97% идентична или на 100% идентична SEQ ID NO: 52, и VL содержит или состоит из аминокислотной последовательности, которая по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 97% идентична или на 100% идентична SEQ ID NO: 53.

[0283] Вариант реализации 103. Способ согласно варианту реализации 81, отличающийся тем, что VH содержит или состоит из аминокислотной последовательности, которая по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 97% идентична или на 100% идентична SEQ ID NO: 52, и VL содержит или состоит из аминокислотной последовательности, которая по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 97% идентична или на 100% идентична SEQ ID NO: 54.

[0284] Вариант реализации 104. Способ согласно варианту реализации 81, отличающийся тем, что VH содержит или состоит из аминокислотной последовательности, которая по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 97% идентична или на 100% идентична SEQ ID NO: 52, и VL содержит или состоит из аминокислотной последовательности, которая по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 97% идентична или на 100% идентична SEQ ID NO: 55.

[0285] Вариант реализации 105. Способ согласно любому из вариантов реализации 81-104, отличающийся тем, что указанное антитело против церамида или его антигенсвязывающий фрагмент представляет собой гуманизированное антитело 6В5 (h6B5).

[0286] Вариант реализации 106. Способ согласно любому из вариантов реализации 81-104, отличающийся тем, что антитело против церамида или его антигенсвязывающий фрагмент представляет собой scFv h6B5.

[0287] Вариант реализации 107. Способ согласно любому из вариантов реализации 1-72, отличающийся тем, что антитело против церамида или его антигенсвязывающий фрагмент содержит вариабельную тяжелую цепь (VH) и вариабельную легкую цепь (VL), где VH содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 48, и где VL содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 53.

[0288] Вариант реализации 108. Способ согласно любому из вариантов реализации 1-72, отличающийся тем, что антитело против церамида или его антигенсвязывающий фрагмент содержит вариабельную тяжелую цепь (VH) и вариабельную легкую цепь (VL), где VH содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 48, и где VL содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 55.

[0289] Вариант реализации 109. Способ согласно любому из вариантов реализации 1-72, отличающийся тем, что антитело против церамида или его антигенсвязывающий фрагмент содержит вариабельную тяжелую цепь (VH) и вариабельную легкую цепь (VL), где VH содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 49, и где VL содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 53.

[0290] Вариант реализации 110. Способ согласно любому из вариантов реализации 1-72, отличающийся тем, что антитело против церамида или его антигенсвязывающий фрагмент содержит вариабельную тяжелую цепь (VH) и вариабельную легкую цепь (VL), где VH содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 49, и где VL содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 54.

[0291] Вариант реализации 111. Способ согласно любому из вариантов реализации 1-72, отличающийся тем, что антитело против церамида или его антигенсвязывающий фрагмент содержит вариабельную тяжелую цепь (VH) и вариабельную легкую цепь (VL), где VH содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 50, и где VL содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 53.

[0292] Вариант реализации 112. Способ согласно любому из вариантов реализации 1-72, отличающийся тем, что антитело против церамида или его антигенсвязывающий фрагмент содержит вариабельную тяжелую цепь (VH) и вариабельную легкую цепь (VL), где VH содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 50, и где VL содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 54.

[0293] Вариант реализации 113. Способ согласно любому из вариантов реализации 1-72, отличающийся тем, что антитело против церамида или его антигенсвязывающий фрагмент содержит вариабельную тяжелую цепь (VH) и вариабельную легкую цепь (VL), где VH содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 51, и где VL содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 53.

[0294] Вариант реализации 114. Способ согласно любому из вариантов реализации 1-72, отличающийся тем, что антитело против церамида или его антигенсвязывающий фрагмент содержит вариабельную тяжелую цепь (VH) и вариабельную легкую цепь (VL), где VH содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 52, и где VL содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 53.

[0295] Вариант реализации 115. Способ согласно любому из вариантов реализации 107-114, отличающийся тем, что указанное антитело против церамида или его антигенсвязывающий фрагмент представляет собой гуманизированное антитело.

[0296] Вариант реализации 116. Способ согласно любому из вариантов реализации 107-114, отличающийся тем, что указанное антитело против церамида или его антигенсвязывающий фрагмент представляет собой гуманизированный scFv.

[0297] Вариант реализации 117. Способ согласно любому из предшествующих вариантов реализации 1-116, отличающийся тем, что предотвращение диабетической ретинопатии или воспалительного заболевания глаза включает отсрочку начала диабетической ретинопатии или воспалительного заболевания глаза.

[0298] Вариант реализации 118. Способ согласно любому из предшествующих вариантов реализации 1-117, отличающийся тем, что один или более симптомов диабетической ретинопатии или воспалительного заболевания глаза у субъекта уменьшаются по сравнению с субъектом в контроле или по сравнению с субъектом до лечения антителом против церамида или его антигенсвязывающим фрагментом.

[0299] Вариант реализации 119. Способ согласно варианту реализации 118, отличающийся тем, что один или более симптомов диабетической ретинопатии или воспалительного заболевания глаза выбраны из воспаления сетчатки, образования бесклеточного капилляра, неоваскуляризации сетчатки, гибели эндотелиальных клеток сетчатки, проницаемости сосудов сетчатки, ишемически-реперфузионного повреждения сетчатки, области протечки сетчатки и нарушения окклюдина.

[0300] Вариант реализации 120. Способ согласно варианту реализации 118 или 119, отличающийся тем, что один или более симптомов диабетической ретинопатии или воспалительного заболевания глаза уменьшаются по меньшей мере на 10%, по меньшей мере на 20%, по меньшей мере на 30%, по меньшей мере на 40% или по меньшей мере на 50% по сравнению с субъектом в контроле или по сравнению с субъектом до лечения антителом против церамида или его антигенсвязывающим фрагментом.

[0301] Вариант реализации 121. Способ согласно любому из предшествующих вариантов реализации 1-120, отличающийся тем, что уровень экспрессии одного или более воспалительных маркеров в глазу снижается по сравнению с уровнем экспрессии в глазу субъекта в контроле или по сравнению с уровнем экспрессии в глазу субъекта до лечения антителом против церамида или его антигенсвязывающим фрагментом.

[0302] Вариант реализации 122. Способ согласно варианту реализации 121, отличающийся тем, что один или более воспалительных маркеров выбран из цитокина, фактора роста и молекулы адгезии.

[0303] Вариант реализации 123. Способ согласно варианту реализации 122, отличающийся тем, что цитокин выбран из TNFα, IL-1β, IL-6 или МСР1.

[0304] Вариант реализации 124. Способ согласно варианту реализации 122, отличающийся тем, что фактор роста представляет собой VEGF.

[0305] Вариант реализации 125. Способ согласно варианту реализации 122, отличающийся тем, что молекула адгезии представляет собой ICAM-1 или VCAM-1.

[0306] Вариант реализации 126. Способ согласно любому из вариантов реализации 121-125, отличающийся тем, что уровень экспрессии одного или более воспалительных маркеров в глазу субъекта снижается по меньшей мере на 10%, по меньшей мере на 20%, по меньшей мере на 30%, по меньшей мере на 40% или по меньшей мере на 50% по сравнению с уровнем экспрессии в глазу субъекта в контроле или по сравнению с уровнем экспрессии в глазу субъекта до лечения антителом против церамида или его антигенсвязывающим фрагментом.

[0307] Вариант реализации 127. Способ согласно любому из предшествующих вариантов реализации 1-126, отличающийся тем, что у субъекта увеличивается один или более параметров зрения по сравнению с параметрами зрения субъекта в контроле или по сравнению с параметрами зрения субъекта до лечения антителом против церамида или его антигенсвязывающим фрагментом.

[0308] Вариант реализации 128. Способ по варианту реализации 127, отличающийся тем, что один или более параметров зрения выбран из периферийного зрения; ночного зрения; цветового зрения; дальнего зрения; ближнего зрения; и четкости зрения.

[0309] Вариант реализации 129. Способ по любому из предшествующих вариантов реализации 1-128, отличающийся тем, что сосудистая проницаемость сетчатки в глазу субъекта снижается по меньшей мере на 10%, по меньшей мере на 20%, по меньшей мере на 30%, по меньшей мере на 40% или по меньшей мере на 50% по сравнению с сосудистой проницаемостью сетчатки в глазу субъекта в контроле или по сравнению с уровнем экспрессии в глазу субъекта до лечения антителом против церамида или его антигенсвязывающим фрагментом.

[0310] Вариант реализации 130. Способ по любому из предшествующих вариантов реализации 1-129, отличающийся тем, что средний балл оценки ранней диабетической ретинопатии (ETDRS) в группе субъектов снижается по меньшей мере на 0,2, по меньшей мере на 0,5, по меньшей мере на 1, по меньшей мере на 1,5, по меньшей мере на 2 или по меньшей мере на 2,5 по сравнению со средним баллом оценки ETDRS в группе субъектов в контроле или по сравнению со средним баллом оценки ETDRS в группе субъектов до лечения антителом против церамида или его антигенсвязывающим фрагментом.

ВКЛЮЧЕНИЕ ПОСРЕДСТВОМ ССЫЛКИ

[0311] Все ссылки, статьи, публикации, патенты, патентные публикации и патентные заявки, цитируемые в настоящей заявке, полностью включены посредством ссылки для всех целей. Тем не менее, упоминание любой ссылки, статьи, публикации, патента, патентной публикации и патентной заявки, цитируемых в настоящей заявке, не является и не должно рассматриваться как подтверждение или любая форма предположения, что они представляют собой предшествующий уровень техники или являются частью общеизвестных знаний в любой стране мира.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> MEMORIAL SLOAN KETTERING CANCER CENTER

BOARD OF TRUSTEES OF MICHIGAN STATE UNIVERSITY

<120> СПОСОБЫ И КОМПОЗИЦИИ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ДИАБЕТИЧЕСКОЙ РЕТИНОПАТИИ

<130> 115872-1233

<150> US 62/907,287

<151> 2019-09-27

<160> 55

<170> PatentIn версии 3.5

<210> 1

<211> 10

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антитело h6B5 HCDR1

<400> 1

Gly Tyr Thr Phe Thr Asp His Thr Ile His

1 5 10

<210> 2

<211> 17

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антитело 6B5 HCDR2

<400> 2

Tyr Asn Tyr Pro Arg Asp Gly Ser Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 3

<211> 11

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антитело h6B5 HCDR3

<400> 3

Gly Phe Ile Thr Thr Val Val Pro Ser Ala Tyr

1 5 10

<210> 4

<211> 11

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антитело h6B5 LCDR1

<400> 4

Arg Ala Ser Lys Ser Ile Ser Lys Tyr Leu Ala

1 5 10

<210> 5

<211> 7

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антитело h6B5 LCDR2

<400> 5

Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser

1 5

<210> 6

<211> 9

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антитело h6B5 LCDR3

<400> 6

Gln Gln His Asn Glu Tyr Pro Trp Thr

1 5

<210> 7

<211> 120

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антитело 6B5 VH-0

<400> 7

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Asp Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp His

20 25 30

Thr Ile His Trp Met Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Asn Tyr Pro Arg Asp Gly Ser Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Lys Gly Phe Ile Thr Thr Val Val Pro Ser Ala Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala

115 120

<210> 8

<211> 107

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антитело 6B5 VL-0

<400> 8

Asp Val Gln Ile Thr Gln Ser Pro Ser Tyr Leu Ala Ala Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Thr Ile Thr Ile Asn Cys Arg Ala Ser Lys Ser Ile Ser Lys Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Glu Lys Pro Gly Lys Thr Asn Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Met Tyr Tyr Cys Gln Gln His Asn Glu Tyr Pro Trp

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 9

<211> 10

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антитело 6C8 HCDR1

<400> 9

Gly Tyr Ala Phe Ser Ser Tyr Trp Met Asn

1 5 10

<210> 10

<211> 17

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антитело 6C8 HCDR2

<400> 10

Gln Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 11

<211> 10

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антитело 6C8 HCDR3

<400> 11

Arg Cys Tyr Tyr Gly Leu Tyr Phe Asp Val

1 5 10

<210> 12

<211> 11

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антитело 6C8 LCDR1

<400> 12

Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Arg Tyr Leu Ser

1 5 10

<210> 13

<211> 7

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антитело 6C8 LCDR2

<400> 13

Arg Ala Asn Arg Leu Val Asp

1 5

<210> 14

<211> 9

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антитело 6C8 LCDR3

<400> 14

Leu Gln Tyr Asp Glu Phe Pro Tyr Thr

1 5

<210> 15

<211> 119

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антитело 6C8 VH

<400> 15

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Gln Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Thr Arg Arg Cys Tyr Tyr Gly Leu Tyr Phe Asp Val Trp Gly Thr Gly

100 105 110

Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 16

<211> 108

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антитело 6C8 VL

<400> 16

Asp Ile Lys Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Arg Tyr Ala Ser Leu Gly

1 5 10 15

Glu Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Arg Tyr

20 25 30

Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Thr Leu Ile

35 40 45

Tyr Arg Ala Asn Arg Leu Val Asp Gly Val Pro Ser Ser Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Gln Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu

65 70 75 80

Tyr Glu Asp Met Gly Ile Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Glu Phe Pro

85 90 95

Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 17

<211> 10

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антитело 7B10 HCDR1

<400> 17

Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Trp Met His

1 5 10

<210> 18

<211> 16

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антитело 7B10 HCDR2

<400> 18

Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Gly Tyr Thr Lys Tyr Asn Gln Phe Lys Asp

1 5 10 15

<210> 19

<211> 8

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антитело 7B10 HCDR3

<400> 19

Gly Gly Tyr Tyr Gly Phe Ala Tyr

1 5

<210> 20

<211> 10

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антитело 7B10 LCDR1

<400> 20

Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Tyr

1 5 10

<210> 21

<211> 7

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антитело 7B10 LCDR2

<400> 21

Leu Thr Ser Asn Leu Ala Ser

1 5

<210> 22

<211> 9

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антитело 7B10 LCDR3

<400> 22

Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr

1 5

<210> 23

<211> 117

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антитело 7B10 VH

<400> 23

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Gly Tyr Thr Lys Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Tyr Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Gly Tyr Tyr Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ala

115

<210> 24

<211> 106

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антитело 7B10 VL

<400> 24

Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Leu Met Ser Ala Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met

20 25 30

Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Arg Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr

35 40 45

Leu Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu

65 70 75 80

Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr

85 90 95

Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys

100 105

<210> 25

<211> 10

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антитело 9H10 HCDR1

<400> 25

Gly Phe Ser Leu Thr Gly Tyr Gly Val His

1 5 10

<210> 26

<211> 16

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антитело 9H10 HCDR2

<400> 26

Val Ile Trp Ser Gly Gly Ser Thr Asp Tyr Asn Ala Ala Phe Ile Ser

1 5 10 15

<210> 27

<211> 10

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антитело 9H10 HCDR3

<400> 27

Asn Tyr Gly Tyr Asp Tyr Ala Met Asp Tyr

1 5 10

<210> 28

<211> 11

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антитело 9H10 LCDR1

<400> 28

Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Ser Ile His

1 5 10

<210> 29

<211> 7

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антитело 9H10 LCDR2

<400> 29

Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser

1 5

<210> 30

<211> 9

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антитело 9H10 LCDR3

<400> 30

Gln Gln Ser Asn Ser Trp Pro Phe Thr

1 5

<210> 31

<211> 116

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антитело 9H10 VH

<400> 31

Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Gly Val Gln Pro Ser Ser Leu

1 5 10 15

Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Ser Tyr Gly Val

20 25 30

His Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val

35 40 45

Ile Trp Ser Gly Gly Ser Thr Asp Tyr Asn Ala Ala Phe Ile Ser Arg

50 55 60

Leu Ser Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Phe Lys Met

65 70 75 80

Asn Ser Leu Gln Ala Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Arg Asn

85 90 95

Tyr Gly Tyr Asp Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser

115

<210> 32

<211> 107

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антитело 9H10 VL

<400> 32

Asp Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Val Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Val Ser Phe Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Ser

20 25 30

Ile His Trp Tyr Gln Gln Arg Thr Asn Gly Ser Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Ser

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn Ser Trp Pro Phe

85 90 95

Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 33

<211> 10

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антитело 2A2 HCDR1

<400> 33

Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Trp Met His

1 5 10

<210> 34

<211> 17

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антитело 2A2 HCDR2

<400> 34

Ala Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 35

<211> 7

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антитело 2A2 HCDR3

<400> 35

Gly Leu Tyr Tyr Gly Tyr Asp

1 5

<210> 36

<211> 16

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антитело 2A2 LCDR1

<400> 36

Lys Ser Ser Gln Ser Leu Ile Asp Ser Asp Gly Lys Thr Phe Leu Asn

1 5 10 15

<210> 37

<211> 7

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антитело 2A2 LCDR2

<400> 37

Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser

1 5

<210> 38

<211> 9

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антитело 2A2 LCDR3

<400> 38

Trp Gln Gly Thr His Phe Pro Tyr Thr

1 5

<210> 39

<211> 115

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Мышиное антитело 2A2 VH

<400> 39

Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Thr Val Leu Ala Arg Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr

20 25 30

Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Val Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Lys Leu Thr Ala Val Thr Ser Thr Ser Thr Ala Phe

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Asn Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Gly Leu Tyr Tyr Gly Tyr Asp Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr

100 105 110

Val Ser Ser

115

<210> 40

<211> 112

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Мышиное антитело 2A2 VL

<400> 40

Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Thr Leu Ser Val Thr Ile Gly

1 5 10 15

Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Ile Asp Ser

20 25 30

Asp Gly Lys Thr Phe Leu Asn Trp Leu Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Leu Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly

85 90 95

Thr His Phe Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 41

<211> 463

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Тяжелая цепь гуманизированного антитела 2A2 (h2A2)

<400> 41

Met Asp Trp Thr Trp Arg Val Phe Cys Leu Leu Ala Val Ala Pro Gly

1 5 10 15

Ala His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys

20 25 30

Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe

35 40 45

Thr Asn Tyr Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu

50 55 60

Glu Trp Met Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Ser Tyr Asn

65 70 75 80

Gln Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser

85 90 95

Thr Val Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val

100 105 110

Tyr Tyr Cys Ala Arg Leu Tyr Tyr Gly Tyr Asp Trp Gly Gln Gly Thr

115 120 125

Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro

130 135 140

Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly

145 150 155 160

Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn

165 170 175

Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln

180 185 190

Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser

195 200 205

Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser

210 215 220

Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr

225 230 235 240

His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser

245 250 255

Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg

260 265 270

Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro

275 280 285

Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala

290 295 300

Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val

305 310 315 320

Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr

325 330 335

Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr

340 345 350

Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu

355 360 365

Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys

370 375 380

Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser

385 390 395 400

Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp

405 410 415

Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser

420 425 430

Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala

435 440 445

Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

450 455 460

<210> 42

<211> 239

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Легкая цепь гуманизированного антитела 2A2 (h2A2)

<400> 42

Met Arg Leu Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Met Leu Trp Val Pro

1 5 10 15

Gly Ser Ser Gly Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro

20 25 30

Val Thr Leu Gly Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser

35 40 45

Leu Ile Asp Ser Asp Gly Lys Thr Phe Leu Asn Trp Phe Gln Gln Arg

50 55 60

Pro Gly Gln Ser Pro Arg Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp

65 70 75 80

Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe

85 90 95

Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr

100 105 110

Cys Trp Gln Gly Thr His Phe Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys

115 120 125

Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro

130 135 140

Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu

145 150 155 160

Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp

165 170 175

Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp

180 185 190

Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys

195 200 205

Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln

210 215 220

Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

225 230 235

<210> 43

<211> 10

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антитело h6B5 HCDR1 (IH-MH)

<400> 43

Gly Tyr Thr Phe Thr Asp His Thr Met His

1 5 10

<210> 44

<211> 17

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антитело h6B5 HCDR2 (DG)

<400> 44

Tyr Asn Tyr Pro Arg Asp Gly Ser Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe Gln

1 5 10 15

Gly

<210> 45

<211> 17

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антитело h6B5 HCDR2 (DG-EG)

<400> 45

Tyr Asn Tyr Pro Arg Glu Gly Ser Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe Gln

1 5 10 15

Gly

<210> 46

<211> 17

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антитело h6B5 HCDR2 (DG-DV)

<400> 46

Tyr Asn Tyr Pro Arg Asp Val Ser Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe Gln

1 5 10 15

Gly

<210> 47

<211> 17

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антитело h6B5 HCDR2 (NE-AE)

<400> 47

Tyr Asn Tyr Pro Arg Asp Gly Ser Thr Lys Tyr Ala Glu Lys Phe Gln

1 5 10 15

Gly

<210> 48

<211> 120

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антитело h6B5 VH-1

<400> 48

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp His

20 25 30

Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Tyr Asn Tyr Pro Arg Asp Gly Ser Thr Lys Tyr Ala Glu Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Val Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Gly Phe Ile Thr Thr Val Val Pro Ser Ala Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 49

<211> 120

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антитело h6B5 VH-2

<400> 49

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp His

20 25 30

Thr Ile His Trp Met Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Tyr Asn Tyr Pro Arg Asp Gly Ser Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Val Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Gly Phe Ile Thr Thr Val Val Pro Ser Ala Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 50

<211> 120

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антитело h6B5 VH-3

<400> 50

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp His

20 25 30

Thr Ile His Trp Met Gln Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Tyr Asn Tyr Pro Arg Asp Gly Ser Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Gly Phe Ile Thr Thr Val Val Pro Ser Ala Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 51

<211> 120

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антитело h6B5 VH-4

<400> 51

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp His

20 25 30

Thr Ile His Trp Met Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Tyr Asn Tyr Pro Arg Glu Gly Ser Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Val Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Gly Phe Ile Thr Thr Val Val Pro Ser Ala Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 52

<211> 120

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антитело h6B5 VH-5

<400> 52

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp His

20 25 30

Thr Ile His Trp Met Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Tyr Asn Tyr Pro Arg Asp Val Ser Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Val Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Gly Phe Ile Thr Thr Val Val Pro Ser Ala Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 53

<211> 107

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антитело h6B5 VL-1

<400> 53

Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Lys Ser Ile Ser Lys Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Asn Glu Tyr Pro Trp

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 54

<211> 107

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антитело h6B5 VL-2

<400> 54

Asp Val Gln Ile Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Lys Ser Ile Ser Lys Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Asn Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Asn Glu Tyr Pro Trp

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 55

<211> 107

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Антитело h6B5 VL-3

<400> 55

Asp Val Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Lys Ser Ile Ser Lys Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Asn Glu Tyr Pro Trp

85 90 95

Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<---

Claims (85)

1. Способ лечения или предотвращения диабетической ретинопатии у нуждающегося в этом субъекта, включающий окулярное введение указанному субъекту терапевтически эффективного количества антитела против церамида или его антигенсвязывающего фрагмента,

причём указанные антитело против церамида или его антигенсвязывающий фрагмент содержат вариабельную тяжелую цепь (V_H) и вариабельную легкую цепь (V_L),

a) где V_H содержит определяющий комплементарность участок 1 тяжелой цепи (HCDR1), содержащий аминокислотную последовательность GYTFTDHTIH (SEQ ID NO: 1), HCDR2, содержащий аминокислотную последовательность YNYPREGSTKYNEKFQG (SEQ ID NO: 45), и HCDR3, содержащий аминокислотную последовательность GFITTVVPSAY (SEQ ID NO: 3), и

b) где V_L содержит определяющий комплементарность участок 1 легкой цепи (LCDR1), содержащий аминокислотную последовательность RASKSISKYLA (SEQ ID NO: 4), LCDR2, содержащий аминокислотную последовательность SGSTLQS (SEQ ID NO: 5), и LCDR3, содержащий аминокислотную последовательность QQHNEYPWT (SEQ ID NO: 6).

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанное антитело против церамида или его антигенсвязывающий фрагмент представляет собой одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv).

3. Способ по п. 1 или 2, отличающийся тем, что указанное окулярное введение выбрано из группы, состоящей из местного введения, интраокулярного введения, субконъюнктивального введения, внутрикамерного введения, инъекции в переднюю камеру через височный край, интрастромального введения, внутрироговичного введения, субретинального введения, инъекции во внутриглазную жидкость, субтенонового введения, введения в супрахориоидное пространство (SCS), введения в супрацилиарное пространство и интравитреального введения.

4. Способ по любому из пп. 1-3, отличающийся тем, что указанное введение представляет собой интравитреальное введение.

5. Способ по любому из пп. 1-4, отличающийся тем, что указанный субъект получал предшествующее лечение диабетической ретинопатии.

6. Способ по п. 5, отличающийся тем, что указанный субъект не отвечал на указанное предшествующее лечение диабетической ретинопатии.

7. Способ по п. 5 или 6, отличающийся тем, что указанное предшествующее лечение представляет собой терапевтическую процедуру, выбранную из витрэктомии и лазерной хирургии, или терапевтический агент, выбранный из стероида и терапии против фактора роста эндотелия сосудов (VEGF).

8. Способ по п. 7, отличающийся тем, что указанная терапия против VEGF представляет собой антитело против VEGF, выбранное из группы, состоящей из бевацизумаба, ранибизумаба и афлиберцепта.

9. Способ по любому из пп. 1-8, отличающийся тем, что указанные антитело против церамида или его антигенсвязывающий фрагмент вводят в виде однократной дозы.

10. Способ по любому из пп. 1-8, отличающийся тем, что указанные антитело против церамида или его антигенсвязывающий фрагмент вводят в двух или более дозах, разделенных по меньшей мере двумя неделями, по меньшей мере тремя неделями или по меньшей мере четырьмя неделями.

11. Способ по любому из пп. 1-8, отличающийся тем, что указанные антитело против церамида или его антигенсвязывающий фрагмент вводят в двух или более дозах, разделенных периодом от приблизительно двух недель до приблизительно четырех недель.

12. Способ по любому из пп. 1-8, отличающийся тем, что указанные антитело против церамида или его антигенсвязывающий фрагмент вводят в двух или более дозах, разделенных по меньшей мере одним месяцем, по меньшей мере двумя месяцами, по меньшей мере тремя месяцами, по меньшей мере четырьмя месяцами, по меньшей мере пятью месяцами, по меньшей мере шестью месяцами, по меньшей мере семью месяцами, по меньшей мере восемью месяцами, по меньшей мере девятью месяцами, по меньшей мере десятью месяцами или по меньшей мере одиннадцатью месяцами.

13. Способ по любому из пп. 1-8, отличающийся тем, что указанные антитело против церамида или его антигенсвязывающий фрагмент вводят в двух или более дозах, разделенных периодом от приблизительно одного месяца до приблизительно шести месяцев.

14. Способ по любому из пп. 1-8, отличающийся тем, что указанные антитело против церамида или его антигенсвязывающий фрагмент вводят в двух или более дозах, разделенных по меньшей мере одним годом.

15. Способ по любому из пп. 1-14, отличающийся тем, что указанные антитело против церамида или его антигенсвязывающий фрагмент вводят до возникновения одного или более симптомов диабетической ретинопатии.

16. Способ по любому из пп. 1-14, отличающийся тем, что указанные антитело против церамида или его антигенсвязывающий фрагмент вводят после возникновения одного или более симптомов диабетической ретинопатии.

17. Способ по любому из пп. 1-14, отличающийся тем, что указанные антитело против церамида или его антигенсвязывающий фрагмент вводят во время непролиферативной стадии диабетической ретинопатии.

18. Способ по п. 17, отличающийся тем, что указанные антитело против церамида или его антигенсвязывающий фрагмент вводят во время пролиферативной стадии диабетической ретинопатии.

19. Способ лечения или предотвращения диабетической ретинопатии у нуждающегося в этом субъекта, включающий введение терапевтически эффективного количества антитела против церамида или его антигенсвязывающего фрагмента указанному субъекту, причем указанный субъект получал предшествующее лечение диабетической ретинопатии,

причём указанные антитело против церамида или его антигенсвязывающий фрагмент содержат вариабельную тяжелую цепь (V_H) и вариабельную легкую цепь (V_L),

a) где V_H содержит определяющий комплементарность участок 1 тяжелой цепи (HCDR1), содержащий аминокислотную последовательность GYTFTDHTIH (SEQ ID NO: 1), HCDR2, содержащий аминокислотную последовательность YNYPREGSTKYNEKFQG (SEQ ID NO: 45), и HCDR3, содержащий аминокислотную последовательность GFITTVVPSAY (SEQ ID NO: 3), и

b) где V_L содержит определяющий комплементарность участок 1 легкой цепи (LCDR1), содержащий аминокислотную последовательность RASKSISKYLA (SEQ ID NO: 4), LCDR2, содержащий аминокислотную последовательность SGSTLQS (SEQ ID NO: 5), и LCDR3, содержащий аминокислотную последовательность QQHNEYPWT (SEQ ID NO: 6).

20. Способ по п. 19, отличающийся тем, что указанный субъект не отвечал на указанное предшествующее лечение диабетической ретинопатии.

21. Способ по п. 19 или 20, отличающийся тем, что указанное антитело против церамида или его антигенсвязывающий фрагмент представляет собой одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv).

22. Способ по любому из пп. 19-21, отличающийся тем, что указанное введение представляет собой окулярное введение.

23. Способ по п. 22, отличающийся тем, что указанное окулярное введение выбрано из группы, состоящей из местного введения, интраокулярного введения, субконъюнктивального введения, внутрикамерного введения, инъекции в переднюю камеру через височный край, интрастромального введения, внутрироговичного введения, субретинального введения, инъекции во внутриглазную жидкость, субтенонового введения, введения в супрахориоидное пространство (SCS), введения в супрацилиарное пространство и интравитреального введения.

24. Способ по п. 22 или 23, отличающийся тем, что указанное окулярное введение представляет собой интравитреальное введение.

25. Способ по любому из пп. 19-24, отличающийся тем, что указанное предшествующее лечение представляло собой витрэктомию, лазерную хирургию, стероид и/или терапию против фактора роста эндотелия сосудов (VEGF).

26. Способ по п. 25, отличающийся тем, что указанная терапия против VEGF представляет собой антитело против VEGF, выбранное из группы, состоящей из бевацизумаба, ранибизумаба и афлиберцепта.

27. Способ по любому из пп. 19-26, отличающийся тем, что указанные антитело против церамида или его антигенсвязывающий фрагмент вводят в виде однократной дозы.

28. Способ по любому из пп. 19-26, отличающийся тем, что указанные антитело против церамида или его антигенсвязывающий фрагмент вводят в двух или более дозах, разделенных по меньшей мере двумя неделями, по меньшей мере тремя неделями или по меньшей мере четырьмя неделями.

29. Способ по любому из пп. 19-26, отличающийся тем, что указанные антитело против церамида или его антигенсвязывающий фрагмент вводят в двух или более дозах, разделенных периодом от приблизительно двух недель до приблизительно четырех недель.

30. Способ по любому из пп. 19-26, отличающийся тем, что указанные антитело против церамида или его антигенсвязывающий фрагмент вводят в двух или более дозах, разделенных по меньшей мере одним месяцем, по меньшей мере двумя месяцами, по меньшей мере тремя месяцами, по меньшей мере четырьмя месяцами, по меньшей мере пятью месяцами, по меньшей мере шестью месяцами, по меньшей мере семью месяцами, по меньшей мере восемью месяцами, по меньшей мере девятью месяцами, по меньшей мере десятью месяцами или по меньшей мере одиннадцатью месяцами.

31. Способ по любому из пп. 19-26, отличающийся тем, что указанные антитело против церамида или его антигенсвязывающий фрагмент вводят в двух или более дозах, разделенных периодом от приблизительно одного месяца до приблизительно шести месяцев.

32. Способ по любому из пп. 19-26, отличающийся тем, что указанные антитело против церамида или его антигенсвязывающий фрагмент вводят в двух или более дозах, разделенных по меньшей мере одним годом.

33. Способ по любому из пп. 19-32, отличающийся тем, что указанные антитело против церамида или его антигенсвязывающий фрагмент вводят до возникновения одного или более симптомов диабетической ретинопатии.

34. Способ по любому из пп. 19-32, отличающийся тем, что указанные антитело против церамида или его антигенсвязывающий фрагмент вводят после возникновения одного или более симптомов диабетической ретинопатии.

35. Способ по любому из пп. 19-32, отличающийся тем, что указанные антитело против церамида или его антигенсвязывающий фрагмент вводят во время непролиферативной стадии диабетической ретинопатии.

36. Способ по любому из пп. 19-32, отличающийся тем, что указанные антитело против церамида или его антигенсвязывающий фрагмент вводят во время пролиферативной стадии диабетической ретинопатии.

37. Способ лечения или предотвращения диабетической ретинопатии у субъекта, включающий введение указанному субъекту однократной терапевтически эффективной дозы антитела против церамида или его антигенсвязывающего фрагмента,

причём указанные антитело против церамида или его антигенсвязывающий фрагмент содержат вариабельную тяжелую цепь (V_H) и вариабельную легкую цепь (V_L),

a) где V_H содержит определяющий комплементарность участок 1 тяжелой цепи (HCDR1), содержащий аминокислотную последовательность GYTFTDHTIH (SEQ ID NO: 1), HCDR2, содержащий аминокислотную последовательность YNYPREGSTKYNEKFQG (SEQ ID NO: 45), и HCDR3, содержащий аминокислотную последовательность GFITTVVPSAY (SEQ ID NO: 3), и

b) где V_L содержит определяющий комплементарность участок 1 легкой цепи (LCDR1), содержащий аминокислотную последовательность RASKSISKYLA (SEQ ID NO: 4), LCDR2, содержащий аминокислотную последовательность SGSTLQS (SEQ ID NO: 5), и LCDR3, содержащий аминокислотную последовательность QQHNEYPWT (SEQ ID NO: 6).

38. Способ лечения или предотвращения диабетической ретинопатии у субъекта, включающий введение указанному субъекту двух или более терапевтически эффективных доз антитела против церамида или его антигенсвязывающего фрагмента, причем указанные две или более дозы разделены по меньшей мере двумя неделями,

причём указанные антитело против церамида или его антигенсвязывающий фрагмент содержат вариабельную тяжелую цепь (V_H) и вариабельную легкую цепь (V_L),

a) где V_H содержит определяющий комплементарность участок 1 тяжелой цепи (HCDR1), содержащий аминокислотную последовательность GYTFTDHTIH (SEQ ID NO: 1), HCDR2, содержащий аминокислотную последовательность YNYPREGSTKYNEKFQG (SEQ ID NO: 45), и HCDR3, содержащий аминокислотную последовательность GFITTVVPSAY (SEQ ID NO: 3), и

b) где V_L содержит определяющий комплементарность участок 1 легкой цепи (LCDR1), содержащий аминокислотную последовательность RASKSISKYLA (SEQ ID NO: 4), LCDR2, содержащий аминокислотную последовательность SGSTLQS (SEQ ID NO: 5), и LCDR3, содержащий аминокислотную последовательность QQHNEYPWT (SEQ ID NO: 6).

39. Способ по п. 38, отличающийся тем, что указанные антитело против церамида или его антигенсвязывающий фрагмент вводят в двух или более дозах, разделенных по меньшей мере двумя неделями, по меньшей мере тремя неделями или по меньшей мере четырьмя неделями.

40. Способ по п. 38, отличающийся тем, что указанные антитело против церамида или его антигенсвязывающий фрагмент вводят в двух или более дозах, разделенных периодом от приблизительно двух недель до приблизительно четырех недель.

41. Способ по п. 38, отличающийся тем, что указанные антитело против церамида или его антигенсвязывающий фрагмент вводят в двух или более дозах, разделенных по меньшей мере одним месяцем, по меньшей мере двумя месяцами, по меньшей мере тремя месяцами, по меньшей мере четырьмя месяцами, по меньшей мере пятью месяцами, по меньшей мере шестью месяцами, по меньшей мере семью месяцами, по меньшей мере восемью месяцами, по меньшей мере девятью месяцами, по меньшей мере десятью месяцами или по меньшей мере одиннадцатью месяцами.

42. Способ по п. 38, отличающийся тем, что указанные антитело против церамида или его антигенсвязывающий фрагмент вводят в двух или более дозах, разделенных периодом от приблизительно одного месяца до приблизительно шести месяцев.

43. Способ по п. 38, отличающийся тем, что указанные антитело против церамида или его антигенсвязывающий фрагмент вводят в двух или более дозах, разделенных по меньшей мере одним годом.

44. Способ по любому из пп. 37-43, отличающийся тем, что указанное антитело против церамида или его антигенсвязывающий фрагмент представляет собой одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv).

45. Способ по любому из пп. 37-44, отличающийся тем, что указанное введение представляет собой окулярное введение.

46. Способ по п. 45, отличающийся тем, что указанное окулярное введение выбрано из группы, состоящей из местного введения, интраокулярного введения, субконъюнктивального введения, внутрикамерного введения, инъекции в переднюю камеру через височный край, интрастромального введения, внутрироговичного введения, субретинального введения, инъекции во внутриглазную жидкость, субтенонового введения, введения в супрахориоидное пространство (SCS), введения в супрацилиарное пространство или интравитреального введения.

47. Способ по п. 45 или 46, отличающийся тем, что указанное окулярное введение представляет собой интравитреальное введение.

48. Способ по любому из пп. 37-47, отличающийся тем, что указанный субъект получал предшествующее лечение диабетической ретинопатии.

49. Способ по п. 48, отличающийся тем, что указанный субъект не отвечал на указанное предшествующее лечение диабетической ретинопатии.

50. Способ по п. 48 или 49, отличающийся тем, что указанное предшествующее лечение представляло собой витрэктомию, лазерную хирургию, стероид и/или терапию против фактора роста эндотелия сосудов (VEGF).

51. Способ по п. 50, отличающийся тем, что указанная терапия против VEGF представляет собой антитело против VEGF, выбранное из группы, состоящей из бевацизумаба, ранибизумаба и афлиберцепта.

52. Способ по любому из пп. 37-51, отличающийся тем, что указанные антитело против церамида или его антигенсвязывающий фрагмент вводят до возникновения одного или более симптомов диабетической ретинопатии.

53. Способ по любому из пп. 37-51, отличающийся тем, что указанные антитело против церамида или его антигенсвязывающий фрагмент вводят после возникновения одного или более симптомов диабетической ретинопатии.

54. Способ по любому из пп. 37-51, отличающийся тем, что указанные антитело против церамида или его антигенсвязывающий фрагмент вводят во время непролиферативной стадии диабетической ретинопатии.

55. Способ по любому из пп. 37-51, отличающийся тем, что указанные антитело против церамида или его антигенсвязывающий фрагмент вводят во время пролиферативной стадии диабетической ретинопатии.

56. Способ по любому из пп. 1-55, отличающийся тем, что V_H содержит или состоит из аминокислотной последовательности, которая по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 97% идентична или на 100% идентична SEQ ID NO: 51, и V_L содержит или состоит из аминокислотной последовательности, которая по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 97% идентична или на 100% идентична SEQ ID NO: 53.

57. Способ по любому из пп. 1-55, отличающийся тем, что V_H содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 51 и V_L содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 53.

58. Способ по любому из пп. 1-57, отличающийся тем, что указанное антитело против церамида или его антигенсвязывающий фрагмент представляет собой гуманизированное антитело.

59. Способ по любому из пп. 1-57, отличающийся тем, что указанное антитело против церамида или его антигенсвязывающий фрагмент представляет собой гуманизированный scFv.

60. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что предотвращение диабетической ретинопатии или воспалительного заболевания глаза включает отсрочку начала диабетической ретинопатии или воспалительного заболевания глаза.

61. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что один или более симптомов диабетической ретинопатии или воспалительного заболевания глаза у указанного субъекта уменьшен по сравнению с субъектом в контроле или по сравнению с указанным субъектом до лечения указанным антителом против церамида или его антигенсвязывающим фрагментом.

62. Способ по п. 61, отличающийся тем, что указанные один или более симптомов диабетической ретинопатии или воспалительного заболевания глаза выбраны из воспаления сетчатки, образования бесклеточного капилляра, неоваскуляризации сетчатки, гибели эндотелиальных клеток сетчатки, проницаемости сосудов сетчатки, ишемически-реперфузионного повреждения сетчатки, области протечки сетчатки и нарушения окклюдина.

63. Способ по п. 61 или 62, отличающийся тем, что указанные один или более симптомов диабетической ретинопатии или воспалительного заболевания глаза уменьшены по меньшей мере на 10%, по меньшей мере на 20%, по меньшей мере на 30%, по меньшей мере на 40% или по меньшей мере на 50% по сравнению с субъектом в контроле или по сравнению с указанным субъектом до лечения указанным антителом против церамида или его антигенсвязывающим фрагментом.

64. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что уровень экспрессии одного или более воспалительных маркеров в глазу снижен по сравнению с уровнем экспрессии в глазу субъекта в контроле или по сравнению с уровнем экспрессии в глазу указанного субъекта до лечения указанным антителом против церамида или его антигенсвязывающим фрагментом.

65. Способ по п. 64, отличающийся тем, что один или более воспалительных маркеров выбраны из цитокина, фактора роста и молекулы адгезии.

66. Способ по п. 65, отличающийся тем, что указанный цитокин выбран из TNFα, IL-1β, IL-6 или MCP1.

67. Способ по п. 65, отличающийся тем, что указанный фактор роста представляет собой VEGF.

68. Способ по п. 65, отличающийся тем, что указанная молекула адгезии представляет собой ICAM-1 или VCAM-1.

69. Способ по любому из пп. 64-68, отличающийся тем, что уровень экспрессии одного или более воспалительных маркеров в глазу указанного субъекта снижен по меньшей мере на 10%, по меньшей мере на 20%, по меньшей мере на 30%, по меньшей мере на 40% или по меньшей мере на 50% по сравнению с уровнем экспрессии в глазу субъекта в контроле или по сравнению с уровнем экспрессии в глазу указанного субъекта до лечения указанным антителом против церамида или его антигенсвязывающим фрагментом.

70. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что у указанного субъекта увеличен один или более параметров зрения по сравнению с параметрами зрения субъекта в контроле или по сравнению с параметрами зрения указанного субъекта до лечения указанным антителом против церамида или его антигенсвязывающим фрагментом.

71. Способ по п. 70, отличающийся тем, что указанные один или более параметров зрения выбраны из периферийного зрения; ночного зрения; цветового зрения; дальнего зрения; ближнего зрения; и четкости зрения.

72. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что сосудистая проницаемость сетчатки в глазу указанного субъекта снижена по меньшей мере на 10%, по меньшей мере на 20%, по меньшей мере на 30%, по меньшей мере на 40% или по меньшей мере на 50% по сравнению с сосудистой проницаемостью сетчатки в глазу субъекта в контроле или по сравнению с уровнем экспрессии в глазу указанного субъекта до лечения указанным антителом против церамида или его антигенсвязывающим фрагментом.

73. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что средний балл оценки ранней диабетической ретинопатии (ETDRS) в группе указанных субъектов снижен по меньшей мере на 0,2, по меньшей мере на 0,5, по меньшей мере на 1, по меньшей мере на 1,5, по меньшей мере на 2 или по меньшей мере на 2,5 по сравнению со средним баллом оценки ETDRS в группе субъектов в контроле или по сравнению со средним баллом оценки ETDRS в группе указанных субъектов до лечения указанным антителом против церамида или его антигенсвязывающим фрагментом.