RU2842439C2 - Modified viral particles and ways of use thereof - Google Patents
Modified viral particles and ways of use thereof Download PDFInfo
- Publication number
- RU2842439C2 RU2842439C2 RU2021133286A RU2021133286A RU2842439C2 RU 2842439 C2 RU2842439 C2 RU 2842439C2 RU 2021133286 A RU2021133286 A RU 2021133286A RU 2021133286 A RU2021133286 A RU 2021133286A RU 2842439 C2 RU2842439 C2 RU 2842439C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- aav
- protein
- capsid protein
- amino acid
- acid sequence
- Prior art date
Links
Abstract
Description
[0001] Перечень последовательностей, записанный в файле 10364WO01 ST25.txt, имеет размер 269 килобайт, создан 19 мая 2020 года и настоящим включен посредством ссылки.[0001] The sequence listing found in file 10364WO01 ST25.txt is 269 kilobytes in size and was created on May 19, 2020 and is hereby incorporated by reference.
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕFIELD OF TECHNOLOGY TO WHICH THE INVENTION RELATES
[0002] Настоящее изобретение, раскрытое в данном документе, относится к способам получения и применения рекомбинантных частиц на основе AAV, содержащих капсидные белки AAV животного, не являющегося приматом, и/или отдаленного AAV.[0002] The present invention disclosed herein relates to methods for producing and using recombinant AAV-based particles comprising capsid proteins of a non-primate AAV and/or a distant AAV.
ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯBACKGROUND OF THE INVENTION
[0003] Доставка генов в конкретные клетки-мишени стала одной из важнейших технологий в современной медицине для потенциального лечения множества хронических и генетических заболеваний. До настоящего времени прогресс в клиническом применении генной терапии ограничивало отсутствие идеальных носителей для доставки генов.[0003] Gene delivery to specific target cells has become one of the most important technologies in modern medicine for the potential treatment of many chronic and genetic diseases. Until now, progress in the clinical application of gene therapy has been limited by the lack of ideal carriers for gene delivery.
[0004] В идеальном варианте носитель для доставки генов способен (1) стабильно вводить генетический материал в необходимые клетки, (2) избегать введения генетического материала в нецелевые клетки и (3) избегать нейтрализации под действием иммунной системой пациента, например, антител пациента. Хотя в настоящее время доступны несколько непатогенных носителей, способность этих носителей осуществлять трансдукцию специфических клеток и оставаться невидимыми для иммунных ответов хозяина остается не слишком идеальной.[0004] Ideally, a gene delivery vehicle is capable of (1) stably introducing genetic material into target cells, (2) avoiding introducing genetic material into non-target cells, and (3) avoiding neutralization by the patient's immune system, such as the patient's antibodies. Although several non-pathogenic vehicles are currently available, the ability of these vehicles to transduce specific cells and remain invisible to the host's immune responses remains less than ideal.
[0005] Например, вирусные частицы на основе аденоассоциированного вируса (AAV), выделенного у приматов, в частности у человека, например AAV, относящийся к серотипам AAV2, AAV4, AAV6, AAV7, AAV8 и AAV9, были в центре внимания многих исследований, поскольку AAV способны осуществлять трансдукцию широкого спектра видов приматов и тканей in vivo без признаков токсичности или патогенности (Muzyczka, et al. (1992) Current Topics in Microbiology and Immunology, I58:97-129). Более того, AAV безопасно осуществляет трансдукцию постмитотических тканей. Хотя вирус иногда может интегрироваться в хромосомы хозяина, он осуществляет это весьма редко, встраиваясь в локус safe-harbor в хромосоме 19 человека, и только когда в транс-положении обеспечены белки репликации (Rep). Геномы AAV быстро замыкаются в кольцо и образуют конкатемеры в инфицированных клетках и существуют в стабильном эписомальном состоянии в инфицированных клетках, обеспечивая долгосрочную стабильную экспрессию своих полезных нагрузок.[0005] For example, adeno-associated virus (AAV)-based viral particles isolated from primates, particularly humans, such as AAV serotypes AAV2, AAV4, AAV6, AAV7, AAV8, and AAV9, have been the focus of much research because AAV is capable of transducing a wide range of primate species and tissues in vivo without evidence of toxicity or pathogenicity (Muzyczka, et al. (1992) Current Topics in Microbiology and Immunology, I58:97-129). Furthermore, AAV safely transduces postmitotic tissues. Although the virus can occasionally integrate into host chromosomes, it does so only rarely, integrating into the safe-harbor locus on human chromosome 19, and only when replication proteins (Rep) are provided in trans. AAV genomes rapidly circularize and form concatemers in infected cells and exist in a stable episomal state in infected cells, allowing long-term stable expression of their payloads.
[0006] Кроме того, в последние годы добились управления и перенаправления инфицирования AAV приматов на конкретные клетки. Многие достижения в направленной генной терапии с применением вирусных частиц можно кратко описать как нерекомбинационную (негенетическую) или рекомбинационную (генетическую) модификацию вирусной частицы, которая приводит к псевдотипированию, расширению тропизма и/или перенацеливанию естественного тропизма вирусной частицы (обзор в Nicklin and Baker (2002) Curr. Gene Ther. 2:273-93; Verheiji and Rottier (2012) Advances Virol 2012:1-I5).[0006] In addition, in recent years, control and redirection of AAV infection of primates to specific cells has been achieved. Many of the advances in targeted gene therapy using viral particles can be summarized as non-recombinational (non-genetic) or recombinational (genetic) modification of the viral particle that results in pseudotyping, tropism expansion, and/or retargeting of the natural tropism of the viral particle (reviewed in Nicklin and Baker (2002) Curr. Gene Ther. 2:273–93; Verheiji and Rottier (2012) Advances Virol 2012:1–I5).
[0007] При прямом рекомбинационном подходе к нацеливанию нацеливающий лиганд непосредственно вставляется в вирусный капсид или соединяется с ним, то есть гены белков вирусных капсидов модифицируют для экспрессии капсидных белков, содержащих гетерологичный нацеливающий лиганд. Затем нацеливающий лиганд перенаправляет, например, связывает рецептор или маркер, преимущественно или исключительно экспрессируемый на клетке-мишени (Stachler et al. (2006) Gene Ther. 13:926 931; White et al. (2004) Circulation 109:513 519; см. также Park et al., (2007) Frontiers in Bioscience 13:2653-59; Girod et al. (1999) Nature Medicine 5:1052-56; Grifman et al. (2001) Molecular Therapy 3:964 75; Shi et al. (2001) Human Gene Therapy 12:1697-1711; Shi and Bartlett (2003) Molecular Therapy 7:5I5-525).[0007] In a direct recombinational targeting approach, the targeting ligand is directly inserted into or linked to the viral capsid, i.e., the viral capsid protein genes are modified to express capsid proteins containing a heterologous targeting ligand. The targeting ligand then redirects, for example by binding to a receptor or marker predominantly or exclusively expressed on the target cell (Stachler et al. (2006) Gene Ther. 13:926–931; White et al. (2004) Circulation 109:513–519; see also Park et al. (2007) Frontiers in Bioscience 13:2653–59; Girod et al. (1999) Nature Medicine 5:1052–56; Grifman et al. (2001) Molecular Therapy 3:964–75; Shi et al. (2001) Human Gene Therapy 12:1697–1711; Shi and Bartlett (2003) Molecular Therapy 7:5I5–525).
[0008] При непрямых рекомбинационных подходах вирусный капсид модифицируют с помощью гетерологичного «каркаса», который затем связывается с адаптером, который включает нацеливающий лиганд. Адаптор связывается с каркасом и клеткой-мишенью (Arnold et al. (2006) Mol. Ther. 5:125 132; Ponnazhagen et al. (2002) J. Virol. 76:12900-907; см. также WO 97/05266). Каркасы, такие как (1) Fc-связывающие молекулы (например, Fc-рецепторы, белок А и т.д.), которые связываются с Fc антител-адаптеров, (2) (стрепт)авидин, который связывается с биотинилированными адаптерами, (3) биотин, который связывается с адаптерами, слитыми со (стрепт)авидином, (4) детектируемая метка, которая пригодна для обнаружения и/или выделения вирусных частиц, связанных биспецифическим адаптером, способным нековалентно связывать детектируемую метку и молекулу-мишень, и недавно открытые (5) связывающиеся пары белок:белок, которые образуют изопептидные связи, были описаны для множества вирусных частиц (см., например, Gigout et al. (2005) Molecular Therapy 11:856-865; Stachler et al. (2008) Molecular Therapy 16:I467 I473; Quetglas et al. (2010) Virus Research I53:179 196; Ohno et al. (1997) Nature Biotechnology I5:763-767; Klimstra et al. (2005) Virology 338:9 21).[0008] In indirect recombinational approaches, the viral capsid is modified with a heterologous "scaffold" which is then linked to an adaptor that includes a targeting ligand. The adaptor binds to the scaffold and the target cell (Arnold et al. (2006) Mol. Ther. 5:125 132; Ponnazhagen et al. (2002) J. Virol. 76:12900-907; see also WO 97/05266). Scaffolds such as (1) Fc-binding molecules (e.g., Fc receptors, protein A, etc.) that bind to Fc of antibody adapters, (2) (strept)avidin that binds to biotinylated adapters, (3) biotin that binds to adapters fused to (strept)avidin, (4) a detectable label that is useful for detecting and/or isolating viral particles linked by a bispecific adapter capable of non-covalently linking a detectable label and a target molecule, and the more recently discovered (5) protein:protein binding pairs that form isopeptide bonds have been described for a variety of viral particles (see, e.g., Gigout et al. (2005) Molecular Therapy 11:856–865; Stachler et al. (2008) Molecular Therapy 16:I467 I473; Quetglas et al. (2010) Virus Research I53:179 196; Ohno et al. (1997) Nature Biotechnology I5:763-767; Klimstra et al. (2005) Virology 338:9 21).
[0009] Несмотря на достижения, обеспечивающие возможность направлять инфекцию AAV, перенацеленный AAV в качестве носителя для доставки генов остается не слишком идеальным вследствие наличия нейтрализующих антител против капсидов AAV (NAb). Наличие NAb к AAV у детей позволяет предположить, что инфицирование AAV происходит в раннем возрасте (Calcedo et al. (2011) ASGCT; Huser et al. (2017) J. Virol. 91:e02137 16). Было показано, что антитела, образуемые при инфицировании AAV в раннем возрасте, могут поставить под угрозу последующее применение вектора для генной терапии на основе AAV, полученного из AAV, который распознается и нейтрализуется этими предсуществующими антителами (Hurlbut et al. (2010) Mol. Ther. 18:1983-94; Jiang et al. (2006) Blood 108:3321-8; Manno et al. (2006) Nat. Med. 12:342-7; Scallan et al. (2006) Blood 107:1810-7; Wang et al. (2010) Mol. Ther. 18:126-34). Более того, наличие титров нейтрализующих антител против некоторого серотипа AAV является клинически значимым, поскольку пациенты с высокими титрами считаются не подходящими для любого средства лечения, содержащего вирус данного серотипа (Jeune et al. (2013) Hum Gene Ther Methods 24:59-67).[0009] Despite advances in the ability to target AAV infection, retargeted AAV as a gene delivery vehicle remains less than ideal due to the presence of neutralizing antibodies against AAV capsids (NAbs). The presence of anti-AAV NAbs in children suggests that AAV infection occurs early in life (Calcedo et al. (2011) ASGCT; Huser et al. (2017) J. Virol. 91:e02137 16). It has been shown that antibodies produced during early life AAV infection can compromise subsequent use of an AAV-based gene therapy vector derived from AAV that is recognized and neutralized by these pre-existing antibodies (Hurlbut et al. (2010) Mol. Ther. 18:1983-94; Jiang et al. (2006) Blood 108:3321-8; Manno et al. (2006) Nat. Med. 12:342-7; Scallan et al. (2006) Blood 107:1810-7; Wang et al. (2010) Mol. Ther. 18:126-34). Moreover, the presence of neutralizing antibody titers against a particular AAV serotype is clinically significant, as patients with high titers are considered ineligible for any treatment containing the virus of that serotype (Jeune et al. (2013) Hum Gene Ther Methods 24:59–67).
[0010] Таким образом, сохраняется потребность в вирусных системах, которые являются непатогенными, адаптируемыми для целенаправленного переноса представляющих интерес нуклеиновых кислот в различные клетки-мишени, и которые преодолевают препятствия, создаваемые предсуществующими антителами у пациентов, нуждающихся в лечении.[0010] Thus, there remains a need for viral systems that are non-pathogenic, adaptable for targeted delivery of nucleic acids of interest to a variety of target cells, and that overcome the barriers posed by pre-existing antibodies in patients in need of treatment.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯBRIEF DESCRIPTION OF THE INVENTION
[0011] В данном документе описана стратегия, которая может смягчить одновременно несколько проблем, ассоциированных с предыдущими и современными подходами к лечению с помощью частиц на основе аденоассоциированного вируса (AAV). Не желая быть связанными теорией, ожидается, что у большинства людей не будут присутствовать предсуществующие NAb против AAV, с которыми люди ранее взаимодействовали на низком уровне. Однако возможность успешного манипулирования с такими серотипами AAV для применения их в качестве вектора для генной терапии, способного нацеливаться и инфицировать определенные клетки и/или избегать перекрестной реактивности с любыми предсуществующими антителами в человеческой популяции, до сих пор оставалась неизвестной.[0011] This document describes a strategy that may simultaneously mitigate several problems associated with previous and current approaches to adeno-associated virus (AAV)-based particle therapy. Without wishing to be bound by theory, it is expected that most individuals will not have pre-existing NAbs against AAV with which they have previously interacted at low levels. However, the ability to successfully manipulate such AAV serotypes to serve as a gene therapy vector capable of targeting and infecting specific cells and/or avoiding cross-reactivity with any pre-existing antibodies in the human population has remained unknown.
[0012] В данном документе показано, что капсидный белок AAV вида животного, не являющегося приматам, можно модифицировать, чтобы обеспечить целенаправленное введение представляющего интерес нуклеотида в клетки млекопитающего другого вида животных. Более того, в данном документе продемонстрировано доказательство того, что модифицированная таким образом частица на основе AAV животного, не являющегося приматом, по-прежнему с меньшей вероятностью распознается и/или обнаруживается предсуществующими антителами, которые встречаются в человеческой популяции, чем существующие терапевтические методы лечения на основе AAV, которые базируются на хорошо изученных серотипах AAV человека. Соответственно, в данном документе описаны рекомбинантные вирусные частицы AAV, которые способны инфицировать выбранную клетку и лучше способны избегать нейтрализации под действием предсуществующих антител.[0012] This document demonstrates that the capsid protein of an AAV of a non-primate species can be modified to allow for the targeted delivery of a nucleotide of interest to cells of a mammal of another species. Moreover, this document demonstrates that the non-primate AAV particle so modified is still less likely to be recognized and/or detected by pre-existing antibodies that occur in the human population than existing AAV-based therapeutics that are based on well-characterized human AAV serotypes. Accordingly, this document describes recombinant AAV viral particles that are capable of infecting a cell of choice and are better able to evade neutralization by pre-existing antibodies.
[0013] В данном документе описаны рекомбинантные вирусные частицы AAV, содержащие (i) капсид AAV, содержащий капсидные белки VP1, VP2 и VP3 AAV, и (ii) упакованную в капсид AAV последовательность нуклеиновой кислоты, содержащую последовательность инвертированного концевого повтора (ITR) AAV,[0013] Disclosed herein are recombinant AAV viral particles comprising (i) an AAV capsid comprising the AAV capsid proteins VP1, VP2, and VP3, and (ii) a nucleic acid sequence packaged within the AAV capsid comprising an AAV inverted terminal repeat (ITR) sequence,
где по меньшей мере одно из:where at least one of:
a) капсидного белка VP1 AAV,a) AAV capsid protein VP1,
b) любой части капсидного белка VP1 AAV,b) any part of the AAV VP1 capsid protein,
c) капсидного белка VP2 AAV,c) AAV capsid protein VP2,
d) любой части капсидного белка VP2 AAV,d) any part of the AAV VP2 capsid protein,
e) капсидного белка VP3 AAV иe) AAV capsid protein VP3 and
f) любой части капсидного белка VP3 AAVf) any part of the VP3 capsid protein of AAV
содержит аминокислотную последовательность, характеризующуюся значительной идентичностью последовательности, например по меньшей мере 95% идентичностью, с аминокислотной последовательностью капсидного белка AAV животного, не являющегося приматом, или его части, или отдаленного AAV или его части,comprises an amino acid sequence having substantial sequence identity, such as at least 95% identity, to the amino acid sequence of a non-primate AAV capsid protein or portion thereof, or a distant AAV or portion thereof,
гдеWhere
I. по меньшей мере один из капсидных белков VP1, VP2 и VP3 AAV содержит модификацию, выбранную из группы, состоящей из:I. at least one of the AAV capsid proteins VP1, VP2 and VP3 comprises a modification selected from the group consisting of:
(a) первого партнера из связывающейся пары белок:белок, где связывающаяся пара белок:белок направляет тропизм вирусной частицы AAV,(a) the first partner of a protein:protein binding pair, where the protein:protein binding pair directs the tropism of the AAV viral particle,
(b) детектируемой метки,(b) the detectable label,
(c) точечной мутации, предпочтительно где точечная мутация снижает естественный тропизм вирусной частицы AAV и/или создает детектируемую метку,(c) a point mutation, preferably wherein the point mutation reduces the natural tropism of the AAV viral particle and/or creates a detectable label,
(d) химерной аминокислотной последовательности и(d) a chimeric amino acid sequence and
(e) любой комбинации (а), (b), (с) и (d), и/или(e) any combination of (a), (b), (c) and (d), and/or
II. последовательность ITR или ее часть содержат последовательность нуклеиновой кислоты, характеризующуюся значительной идентичностью последовательности, например по меньшей мере 95% идентичностью, с последовательностью ITR второго AAV или его части, где второй AAV отличается от AAV животного, не являющегося приматом, или отдаленного AAV, иII. the ITR sequence or a portion thereof comprises a nucleic acid sequence having substantial sequence identity, such as at least 95% identity, to the ITR sequence of a second AAV or a portion thereof, wherein the second AAV is distinct from a non-primate AAV or a distant AAV, and
где рекомбинантная вирусная частица AAV способна инфицировать млекопитающего-хозяина, предпочтительно примата-хозяина.wherein the recombinant AAV viral particle is capable of infecting a mammalian host, preferably a primate host.
[0014] В некоторых вариантах осуществления рекомбинантная вирусная частица AAV содержит (i) кап си д AAV, содержащий капсидные белки VP1, VP2 и VP3 AAV, и (ii) упакованную в капсид AAV последовательность нуклеиновой кислоты, содержащую последовательность инвертированного концевого повтора (ITR) AAV,[0014] In some embodiments, the recombinant AAV viral particle comprises (i) an AAV capsid comprising the AAV capsid proteins VP1, VP2, and VP3, and (ii) a nucleic acid sequence packaged into an AAV capsid comprising an AAV inverted terminal repeat (ITR) sequence,
где по меньшей мере одно из:where at least one of:
a) капсидного белка VP1 AAV,a) AAV capsid protein VP1,
b) капсид ного белка VP2 AAV иb) capsid protein VP2 AAV and
c) капсидного белка VP3 AAVc) AAV capsid protein VP3
содержит аминокислотную последовательность, характеризующуюся значительной идентичностью последовательности, например по меньшей мере 95% идентичностью, с аминокислотной последовательностью капсидного белка AAV животного, не являющегося приматом, или отдаленного AAV,comprises an amino acid sequence having significant sequence identity, such as at least 95% identity, to the amino acid sequence of a capsid protein of a non-primate AAV or a distant AAV,
гдеWhere
I. по меньшей мере один из капсидных белков VP1, VP2 и VP3 AAV содержит модификацию, выбранную из группы, состоящей из:I. at least one of the AAV capsid proteins VP1, VP2 and VP3 comprises a modification selected from the group consisting of:
(a) первого партнера из связывающейся пары белок:белок, где связывающаяся пара белок:белок направляет тропизм вирусной частицы AAV,(a) the first partner of a protein:protein binding pair, where the protein:protein binding pair directs the tropism of the AAV viral particle,
(b) детектируемой метки,(b) the detectable label,
(c) точечной мутации, предпочтительно где точечная мутация снижает естественный тропизм вирусной частицы AAV и/или создает детектируемую метку,(c) a point mutation, preferably wherein the point mutation reduces the natural tropism of the AAV viral particle and/or creates a detectable label,
(d) химерной аминокислотной последовательности и(d) a chimeric amino acid sequence and
(e) любой комбинации (а), (b), (с) и (d), и/или(e) any combination of (a), (b), (c) and (d), and/or
II. последовательность ITR или ее часть содержат последовательность нуклеиновой кислоты, характеризующуюся значительной идентичностью последовательности, например по меньшей мере 95% идентичностью, с последовательностью ITR второго AAV или его части, где второй AAV отличается от AAV животного, не являющегося приматом, или отдаленного AAV, иII. the ITR sequence or a portion thereof comprises a nucleic acid sequence having substantial sequence identity, such as at least 95% identity, to the ITR sequence of a second AAV or a portion thereof, wherein the second AAV is distinct from a non-primate AAV or a distant AAV, and
где рекомбинантная вирусная частица AAV способна инфицировать млекопитающего-хозяина, предпочтительно примата-хозяина.wherein the recombinant AAV viral particle is capable of infecting a mammalian host, preferably a primate host.
[0015] В некоторых вариантах осуществления рекомбинантная вирусная частица AAV содержит (i) капсид AAV, содержащий капсидные белки VP1, VP2 и VP3 AAV, и (ii) упакованную в капсид AAV последовательность нуклеиновой кислоты, содержащую последовательность инвертированного концевого повтора (ITR) AAV,[0015] In some embodiments, the recombinant AAV viral particle comprises (i) an AAV capsid comprising the AAV capsid proteins VP1, VP2, and VP3, and (ii) a nucleic acid sequence packaged into the AAV capsid comprising an AAV inverted terminal repeat (ITR) sequence,
где по меньшей мере одно из:where at least one of:
a. любой части капсидного белка VP1 AAV,a. any part of the AAV VP1 capsid protein,
b. любой части капсидного белка VP2 AAV иb. any part of the AAV VP2 capsid protein and
c. любой части капсидного белка VP3 AAVc. any part of the AAV VP3 capsid protein
содержит аминокислотную последовательность, характеризующуюся значительной идентичностью последовательности, например по меньшей мере 95% идентичностью, с аминокислотной последовательностью капсидного белка AAV животного, не являющегося приматом, или его части, или отдаленного AAV или его части,comprises an amino acid sequence having substantial sequence identity, such as at least 95% identity, to the amino acid sequence of a non-primate AAV capsid protein or portion thereof, or a distant AAV or portion thereof,
гдеWhere
I. по меньшей мере один из капсидных белков VP1, VP2 и VP3 AAV содержит модификацию, выбранную из группы, состоящей из:I. at least one of the AAV capsid proteins VP1, VP2 and VP3 comprises a modification selected from the group consisting of:
(a) первого партнера из связывающейся пары белок:белок, где связывающаяся пара белок:белок направляет тропизм вирусной частицы AAV,(a) the first partner of a protein:protein binding pair, where the protein:protein binding pair directs the tropism of the AAV viral particle,
(b) детектируемой метки,(b) the detectable label,
(c) точечной мутации, предпочтительно где точечная мутация снижает естественный тропизм вирусной частицы AAV и/или создает детектируемую метку,(c) a point mutation, preferably wherein the point mutation reduces the natural tropism of the AAV viral particle and/or creates a detectable label,
(d) химерной аминокислотной последовательности и(d) a chimeric amino acid sequence and
(e) любой комбинации (а), (b), (с) и (d), и/или(e) any combination of (a), (b), (c) and (d), and/or
II. последовательность ITR или ее часть содержат последовательность нуклеиновой кислоты, характеризующуюся значительной идентичностью последовательности, например по меньшей мере 95% идентичностью, с последовательностью ITR второго AAV или его части, где второй AAV отличается от AAV животного, не являющегося приматом, или отдаленного AAV, иII. the ITR sequence or a portion thereof comprises a nucleic acid sequence having substantial sequence identity, such as at least 95% identity, to the ITR sequence of a second AAV or a portion thereof, wherein the second AAV is distinct from a non-primate AAV or a distant AAV, and
где рекомбинантная вирусная частица AAV способна инфицировать млекопитающего-хозяина, предпочтительно примата-хозяина.wherein the recombinant AAV viral particle is capable of infecting a mammalian host, preferably a primate host.
[0016] В некоторых вариантах осуществления рекомбинантной вирусной частицы AAV данная рекомбинантная вирусная частица содержит (i) капсид AAV, содержащий капсидные белки VP1, VP2 и VP3 AAV, и (ii) упакованную в капсид AAV последовательность нуклеиновой кислоты, содержащую последовательность инвертированного концевого повтора (ITR) AAV, где по меньшей мере один из капсидного белка VP1 AAV, любой части капсидного белка VP1 AAV, капсидного белка VP2 AAV, любой части капсидного белка VP2 AAV, капсидного белка VP3 AAV и любой части капсидного белка VP3 AAV содержит аминокислотную последовательность, характеризующуюся значительной идентичностью последовательности, например по меньшей мере 95% идентичностью, с аминокислотной последовательностью капсидного белка AAV животного, не являющегося приматом, или его части, и где по меньшей мере один из капсидных белков VP1, VP2 и VP3 AAV содержит модификацию, выбранную из группы, состоящей из:[0016] In some embodiments of the recombinant AAV viral particle, the recombinant viral particle comprises (i) an AAV capsid comprising AAV capsid proteins VP1, VP2, and VP3, and (ii) a nucleic acid sequence packaged within an AAV capsid comprising an AAV inverted terminal repeat (ITR) sequence, wherein at least one of the AAV capsid protein VP1, any portion of the AAV capsid protein VP1, the AAV capsid protein VP2, any portion of the AAV capsid protein VP2, the AAV capsid protein VP3, and any portion of the AAV capsid protein VP3 comprises an amino acid sequence having substantial sequence identity, such as at least 95% identity, to an amino acid sequence of an AAV capsid protein of a non-primate animal, or a portion thereof, and wherein at least one of the AAV capsid proteins VP1, VP2, and VP3 comprises a modification selected from the group consisting of:
(a) первого партнера из связывающейся пары белок:белок, где связывающаяся пара белок:белок направляет тропизм вирусной частицы AAV,(a) the first partner of a protein:protein binding pair, where the protein:protein binding pair directs the tropism of the AAV viral particle,
(b) детектируемой метки,(b) the detectable label,
(c) точечной мутации, предпочтительно где точечная мутация снижает естественный тропизм вирусной частицы AAV и/или создает детектируемую метку,(c) a point mutation, preferably wherein the point mutation reduces the natural tropism of the AAV viral particle and/or creates a detectable label,
(d) химерной аминокислотной последовательности и(d) a chimeric amino acid sequence and
(е) любой комбинации (а), (b), (с) и (d),(e) any combination of (a), (b), (c) and (d),
где полная последовательность ITR или часть последовательности ITR содержит последовательность нуклеиновой кислоты, характеризующуюся значительной идентичностью последовательности, например по меньшей мере 95% идентичностью, с ITR AAV животного, не являющегося приматом, где необязательно последовательность ITR содержит химерную последовательность нуклеиновой кислоты, и где часть химерной последовательности нуклеиновой кислоты, характеризующаяся значительной идентичностью последовательности, например по меньшей мере 95% идентичностью, с ITR AAV животного, не являющегося приматом, или его части, функционально связана с частью химерной последовательности нуклеиновой кислоты, характеризующейся значительной идентичностью последовательности, например по меньшей мере 95% идентичностью, с ITR второго AAV или его части, где второй AAV отличается от AAV животного, не являющегося приматом, и где рекомбинантная вирусная частица AAV способна инфицировать млекопитающего-хозяина, предпочтительно примата-хозяина.wherein the entire ITR sequence or a portion of the ITR sequence comprises a nucleic acid sequence having substantial sequence identity, such as at least 95% identity, to an ITR of an AAV of a non-primate animal, wherein optionally the ITR sequence comprises a chimeric nucleic acid sequence, and wherein the portion of the chimeric nucleic acid sequence having substantial sequence identity, such as at least 95% identity, to an ITR of an AAV of a non-primate animal or a portion thereof is operably linked to a portion of the chimeric nucleic acid sequence having substantial sequence identity, such as at least 95% identity, to an ITR of a second AAV or a portion thereof, wherein the second AAV is different from the AAV of a non-primate animal, and wherein the recombinant AAV viral particle is capable of infecting a mammalian host, preferably a primate host.
[0017] В некоторых вариантах осуществления рекомбинантная вирусная частица AAV содержит (i) капсид AAV, содержащий капсидные белки VP1, VP2 и VP3 AAV, и (ii) упакованную в капсид AAV последовательность нуклеиновой кислоты, содержащую последовательность инвертированного концевого повтора (ITR) AAV, где по меньшей мере один из капсидного белка VP1 AAV, любой части капсидного белка VP1 AAV, капсидного белка VP2 AAV, любой части капсидного белка VP2 AAV, капсидного белка VP3 AAV и любой части капсидного белка VP3 AAV содержит аминокислотную последовательность, характеризующуюся значительной идентичностью последовательности, например по меньшей мере 95% идентичностью, с аминокислотной последовательностью капсидного белка AAV животного, не являющегося приматом, или его части,[0017] In some embodiments, a recombinant AAV viral particle comprises (i) an AAV capsid comprising the AAV capsid proteins VP1, VP2, and VP3, and (ii) a nucleic acid sequence packaged within an AAV capsid comprising an AAV inverted terminal repeat (ITR) sequence, wherein at least one of the AAV capsid protein VP1, any portion of the AAV capsid protein VP1, the AAV capsid protein VP2, any portion of the AAV capsid protein VP2, the AAV capsid protein VP3, and any portion of the AAV capsid protein VP3 comprises an amino acid sequence having substantial sequence identity, such as at least 95% identity, to an amino acid sequence of an AAV capsid protein of a non-primate animal, or a portion thereof,
где последовательность ITR или ее часть содержат последовательность нуклеиновой кислоты, характеризующуюся значительной идентичностью последовательности, например по меньшей мере 95% идентичностью, с последовательностью ITR второго AAV или его части, где второй AAV отличается от AAV животного, не являющегося приматом,wherein the ITR sequence or a portion thereof comprises a nucleic acid sequence having substantial sequence identity, such as at least 95% identity, to the ITR sequence of a second AAV or a portion thereof, wherein the second AAV is distinct from the non-primate AAV,
где рекомбинантная вирусная частица AAV способна инфицировать млекопитающего-хозяина, предпочтительно примата-хозяина, иwherein the recombinant AAV viral particle is capable of infecting a mammalian host, preferably a primate host, and
где необязательно по меньшей мере один из капсидных белков VP1, VP2 и VP3 AAV содержит модификацию, выбранную из группы, состоящей из:wherein optionally at least one of the AAV capsid proteins VP1, VP2 and VP3 comprises a modification selected from the group consisting of:
(a) первого партнера из связывающейся пары белок:белок, где связывающаяся пара белок:белок направляет тропизм вирусной частицы AAV,(a) the first partner of a protein:protein binding pair, where the protein:protein binding pair directs the tropism of the AAV viral particle,
(b) детектируемой метки,(b) the detectable label,
(c) точечной мутации, предпочтительно где точечная мутация снижает естественный тропизм вирусной частицы AAV и/или создает детектируемую метку, и(c) a point mutation, preferably wherein the point mutation reduces the natural tropism of the AAV viral particle and/or creates a detectable label, and
(d) любой комбинации (а)-(с).(d) any combination of (a)-(c).
[0018] В некоторых вариантах осуществления рекомбинантная вирусная частица AAV содержит (i) капсид AAV, содержащий капсидные белки VP1, VP2 и VP3 AAV, и (ii) упакованную в капсид AAV последовательность нуклеиновой кислоты, содержащую последовательность инвертированного концевого повтора (ITR) AAV, где по меньшей мере один из капсидного белка VP1 AAV, любой части капсидного белка VP1 AAV, капсидного белка VP2 AAV, любой части капсидного белка VP2 AAV, капсидного белка VP3 AAV и любой части капсидного белка VP3 AAV содержит химерную аминокислотную последовательность, содержащую (А) аминокислотную последовательность, характеризующуюся значительной идентичностью последовательности, например по меньшей мере 95% идентичностью, с аминокислотной последовательностью капсидного белка AAV животного, не являющегося приматом, или его части, функционально связанную с (В) аминокислотной последовательностью, характеризующейся значительной идентичностью последовательности, например по меньшей мере 95% идентичностью, с аминокислотной последовательностью капсидного белка второго AAV или его части, где второй AAV отличается от AAV животного, не являющегося приматом, где рекомбинантная вирусная частица AAV способна инфицировать млекопитающего-хозяина, предпочтительно примата-хозяина, и где необязательно по меньшей мере один из капсидного белка VP1 AAV, любой части капсидного белка VP1 AAV, капсидного белка VP2 AAV, любой части капсидного белка VP2 AAV, капсидного белка VP3 AAV и любой части капсидного белка VP3 AAV, содержащий химерную аминокислотную последовательность, дополнительно содержит модификацию, выбранную из группы, состоящей из:[0018] In some embodiments, a recombinant AAV viral particle comprises (i) an AAV capsid comprising the AAV capsid proteins VP1, VP2, and VP3, and (ii) a nucleic acid sequence packaged within the AAV capsid comprising an AAV inverted terminal repeat (ITR) sequence, wherein at least one of the AAV capsid protein VP1, any portion of the AAV capsid protein VP1, the AAV capsid protein VP2, any portion of the AAV capsid protein VP2, the AAV capsid protein VP3, and any portion of the AAV capsid protein VP3 comprises a chimeric amino acid sequence comprising (A) an amino acid sequence having substantial sequence identity, such as at least 95% identity, to an amino acid sequence of an AAV capsid protein of a non-primate animal, or a portion thereof, operably linked to (B) an amino acid sequence having substantial sequence identity sequences, such as at least 95% identity, with an amino acid sequence of a capsid protein of a second AAV or a portion thereof, wherein the second AAV is different from an AAV of a non-primate animal, wherein the recombinant AAV viral particle is capable of infecting a mammalian host, preferably a primate host, and wherein optionally at least one of an AAV capsid protein VP1, any portion of an AAV capsid protein VP1, an AAV capsid protein VP2, any portion of an AAV capsid protein VP2, an AAV capsid protein VP3 and any portion of an AAV capsid protein VP3 comprising the chimeric amino acid sequence further comprises a modification selected from the group consisting of:
(a) первого партнера из связывающейся пары белок:белок,(a) the first partner of a protein:protein binding pair,
(b) детектируемой метки и(b) the detectable label and
(c) комбинации (а) и (b).(c) combinations of (a) and (b).
[0019] В некоторых вариантах осуществления рекомбинантной вирусной частицы AAV данная рекомбинантная вирусная частица содержит (i) капсид AAV, содержащий капсидные белки VP1, VP2 и VP3 AAV, и (ii) упакованную в капсид AAV последовательность нуклеиновой кислоты, содержащую последовательность инвертированного концевого повтора (ITR) AAV, где по меньшей мере один из капсидного белка VP1 AAV, любой части капсидного белка VP1 AAV, капсидного белка VP2 AAV, любой части капсидного белка VP2 AAV, капсидного белка VP3 AAV и любой части капсидного белка VP3 AAV содержит аминокислотную последовательность, характеризующуюся значительной идентичностью последовательности, например по меньшей мере 95% идентичностью, с аминокислотной последовательностью капсидного белка отдаленного AAV или его части, и где по меньшей мере один из капсидных белков VP1, VP2 и VP3 AAV содержит модификацию, выбранную из группы, состоящей из:[0019] In some embodiments of the recombinant AAV viral particle, the recombinant viral particle comprises (i) an AAV capsid comprising AAV capsid proteins VP1, VP2, and VP3, and (ii) a nucleic acid sequence packaged within an AAV capsid comprising an AAV inverted terminal repeat (ITR) sequence, wherein at least one of the AAV capsid protein VP1, any portion of the AAV capsid protein VP1, the AAV capsid protein VP2, any portion of the AAV capsid protein VP2, the AAV capsid protein VP3, and any portion of the AAV capsid protein VP3 comprises an amino acid sequence having substantial sequence identity, such as at least 95% identity, to an amino acid sequence of a distant AAV capsid protein or a portion thereof, and wherein at least one of the AAV capsid proteins VP1, VP2, and VP3 comprises a modification selected from the group consisting of, consisting of:
(a) первого партнера из связывающейся пары белок:белок, где связывающаяся пара белок:белок направляет тропизм вирусной частицы AAV,(a) the first partner of a protein:protein binding pair, where the protein:protein binding pair directs the tropism of the AAV viral particle,
(b) детектируемой метки,(b) the detectable label,
(c) точечной мутации, предпочтительно где точечная мутация снижает естественный тропизм вирусной частицы AAV и/или создает детектируемую метку,(c) a point mutation, preferably wherein the point mutation reduces the natural tropism of the AAV viral particle and/or creates a detectable label,
(d) химерной аминокислотной последовательности и(d) a chimeric amino acid sequence and
(e) любой комбинации (а), (b), (с) и (d),(e) any combination of (a), (b), (c) and (d),
где полная последовательность ITR или часть последовательности ITR содержит последовательность нуклеиновой кислоты, характеризующуюся значительной идентичностью последовательности, например по меньшей мере 95% идентичностью, с ITR отдаленного AAV, где необязательно последовательность ITR содержит химерную последовательность нуклеиновой кислоты, и где часть химерной последовательности нуклеиновой кислоты, характеризующаяся значительной идентичностью последовательности, например по меньшей мере 95% идентичностью, с ITR отделенного AAV или его части, функционально связана с частью химерной последовательности нуклеиновой кислоты, характеризующейся значительной идентичностью последовательности, например по меньшей мере 95% идентичностью, с ITR второго AAV или его части, где второй AAV отличается от отдаленного AAV, и где рекомбинантная вирусная частица AAV способна инфицировать млекопитающего-хозяина, предпочтительно примата-хозяина.wherein the entire ITR sequence or a portion of the ITR sequence comprises a nucleic acid sequence having significant sequence identity, such as at least 95% identity, to the ITR of a distant AAV, wherein optionally the ITR sequence comprises a chimeric nucleic acid sequence, and wherein a portion of the chimeric nucleic acid sequence having significant sequence identity, such as at least 95% identity, to the ITR of the separated AAV or a portion thereof, is operably linked to a portion of the chimeric nucleic acid sequence having significant sequence identity, such as at least 95% identity, to the ITR of a second AAV or a portion thereof, wherein the second AAV is different from the distant AAV, and wherein the recombinant AAV viral particle is capable of infecting a mammalian host, preferably a primate host.
[0020] В некоторых вариантах осуществления рекомбинантная вирусная частица AAV содержит (i) капсид AAV, содержащий капсидные белки VP1, VP2 и VP3 AAV, и (ii) упакованную в капсид AAV последовательность нуклеиновой кислоты, содержащую последовательность инвертированного концевого повтора (ITR) AAV, где по меньшей мере один из капсидного белка VP1 AAV, любой части капсидного белка VP1 AAV, капсидного белка VP2 AAV, любой части капсидного белка VP2 AAV, капсидного белка VP3 AAV и любой части капсидного белка VP3 AAV содержит аминокислотную последовательность, характеризующуюся значительной идентичностью последовательности, например по меньшей мере 95% идентичностью, с аминокислотной последовательностью капсидного белка от отделенного AAV или его части,[0020] In some embodiments, a recombinant AAV viral particle comprises (i) an AAV capsid comprising the AAV capsid proteins VP1, VP2, and VP3, and (ii) a nucleic acid sequence packaged within an AAV capsid comprising an AAV inverted terminal repeat (ITR) sequence, wherein at least one of the AAV capsid protein VP1, any portion of the AAV capsid protein VP1, the AAV capsid protein VP2, any portion of the AAV capsid protein VP2, the AAV capsid protein VP3, and any portion of the AAV capsid protein VP3 comprises an amino acid sequence having substantial sequence identity, such as at least 95% identity, to the amino acid sequence of a capsid protein from a separated AAV or portion thereof,
где последовательность ITR или ее часть содержат последовательность нуклеиновой кислоты, характеризующуюся значительной идентичностью последовательности, например по меньшей мере 95% идентичностью, с последовательностью ITR второго AAV или его части, где второй AAV отличается от отдаленного AAV,wherein the ITR sequence or a portion thereof comprises a nucleic acid sequence having significant sequence identity, such as at least 95% identity, to the ITR sequence of a second AAV or a portion thereof, wherein the second AAV is distinct from the distant AAV,
где рекомбинантная вирусная частица AAV способна инфицировать млекопитающего-хозяина, предпочтительно примата-хозяина, иwherein the recombinant AAV viral particle is capable of infecting a mammalian host, preferably a primate host, and
где необязательно по меньшей мере один из капсидных белков VP1, VP2 и VP3 AAV содержит модификацию, выбранную из группы, состоящей из:wherein optionally at least one of the AAV capsid proteins VP1, VP2 and VP3 comprises a modification selected from the group consisting of:
(a) первого партнера из связывающейся пары белок:белок, где связывающаяся пара белок:белок направляет тропизм вирусной частицы AAV,(a) the first partner of a protein:protein binding pair, where the protein:protein binding pair directs the tropism of the AAV viral particle,
(b) детектируемой метки,(b) the detectable label,
(c) точечной мутации, предпочтительно где точечная мутация снижает естественный тропизм вирусной частицы AAV и/или создает детектируемую метку, и(c) a point mutation, preferably wherein the point mutation reduces the natural tropism of the AAV viral particle and/or creates a detectable label, and
(d) любой комбинации (а)-(с).(d) any combination of (a)-(c).
[0021] В некоторых вариантах осуществления рекомбинантная вирусная частица AAV содержит (i) капсид AAV, содержащий капсидные белки VP1, VP2 и VP3 AAV, и (ii) упакованную в капсид AAV последовательность нуклеиновой кислоты, содержащую последовательность инвертированного концевого повтора (ITR) AAV, где по меньшей мере один из капсидного белка VP1 AAV, любой части капсидного белка VP1 AAV, капсидного белка VP2 AAV, любой части капсидного белка VP2 AAV, капсидного белка VP3 AAV и любой части капсидного белка VP3 AAV содержит химерную аминокислотную последовательность, содержащую (А) аминокислотную последовательность, характеризующуюся значительной идентичностью последовательности, например по меньшей мере 95% идентичностью, с аминокислотной последовательностью капсидного белка отдаленного AAV или его части, функционально связанную с (В) аминокислотной последовательностью, характеризующейся значительной идентичностью последовательности, например по меньшей мере 95% идентичностью, с аминокислотной последовательностью капсидного белка второго AAV или его части, где второй AAV отличается от отделенного AAV, где рекомбинантная вирусная частица AAV способна инфицировать млекопитающего-хозяина, предпочтительно примата-хозяина, и где необязательно по меньшей мере один из капсидного белка VP1 AAV, любой части капсидного белка VP1 AAV, капсидного белка VP2 AAV, любой части капсидного белка VP2 AAV, капсидного белка VP3 AAV и любой части капсидного белка VP3 AAV, содержащий химерную аминокислотную последовательность, дополнительно содержит модификацию, выбранную из группы, состоящей из:[0021] In some embodiments, a recombinant AAV viral particle comprises (i) an AAV capsid comprising the AAV capsid proteins VP1, VP2, and VP3, and (ii) a nucleic acid sequence packaged within the AAV capsid comprising an AAV inverted terminal repeat (ITR) sequence, wherein at least one of the AAV capsid protein VP1, any portion of the AAV capsid protein VP1, the AAV capsid protein VP2, any portion of the AAV capsid protein VP2, the AAV capsid protein VP3, and any portion of the AAV capsid protein VP3 comprises a chimeric amino acid sequence comprising (A) an amino acid sequence having substantial sequence identity, such as at least 95% identity, to an amino acid sequence of a distant AAV capsid protein or portion thereof, operably linked to (B) an amino acid sequence having substantial sequence identity, such as at least 95% identity, with the amino acid sequence of a capsid protein of a second AAV or a portion thereof, wherein the second AAV is different from the separated AAV, wherein the recombinant AAV viral particle is capable of infecting a mammalian host, preferably a primate host, and wherein optionally at least one of an AAV capsid protein VP1, any portion of an AAV capsid protein VP1, an AAV capsid protein VP2, any portion of an AAV capsid protein VP2, an AAV capsid protein VP3 and any portion of an AAV capsid protein VP3 comprising a chimeric amino acid sequence further comprises a modification selected from the group consisting of:
(a) первого партнера из связывающейся пары белок:белок,(a) the first partner of a protein:protein binding pair,
(b) детектируемой метки и(b) the detectable label and
(с) комбинации (а) и (b).(c) combinations of (a) and (b).
[0022] В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения вирусная частица AAV содержит капсид AAV, где по меньшей мере один капсидный белок AAV (например, капсидный белок VP1 AAV, капсидный белок VP2 AAV и/или капсидный белок VP3 AAV) указанного капсида AAV содержит по меньшей мере часть аминокислотной последовательности капсидного белка, выбранного из группы, состоящей из капсидного белка AAV животного, не являющегося приматом, капсидного белка отдаленного AAV и их комбинации, и где по меньшей мере один капсидный белок AAV указанного капсида AAV модифицирован с включением (а) по меньшей мере первого партнера из связывающейся пары белок:белок, (b) детектируемой метки, (с) точечной мутации, (d) химерной аминокислотной последовательности, содержащей часть аминокислотной последовательности капсидного белка другого, например второго, AAV, которая функционально связана с указанной аминокислотной последовательностью капсидного белка, выбранного из группы, состоящей из капсидного белка AAV животного, не являющегося приматом, капсидного белка отдаленного AAV или их комбинации, и (е) любой комбинации (а), (b), (с) и (d). В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения вирусная частица AAV содержит капсид AAV, где по меньшей мере один капсидный белок AAV (например, капсидный белок VP1 AAV, капсидный белок VP2 AAV и/или капсидный белок VP3 AAV) указанного капсида AAV или его часть характеризуется значительной идентичностью последовательности, например по меньшей мере 95% идентичностью, с капсидным белком, выбранным из группы, состоящей из капсидного белка AAV животного, не являющегося приматом, части капсидного белка AAV животного, не являющегося приматом, капсидного белка отдаленного AAV, части капсидного белка отдаленного AAV и их комбинации, и где по меньшей мере один капсидный белок AAV указанного капсида AAV модифицирован с включением (а) по меньшей мере первого партнера из связывающейся пары белок:белок, (b) детектируемой метки, (с) точечной мутации, (d) химерной аминокислотной последовательности, содержащей часть аминокислотной последовательности капсидного белка другого, например второго, AAV, которая функционально связана с указанной аминокислотной последовательностью капсидного белка, выбранного из группы, состоящей из капсидного белка AAV животного, не являющегося приматом, капсидного белка отдаленного AAV или их комбинации, и (е) любой комбинации (а), (b), (с) и (d). В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения вирусная частица AAV содержит капсид AAV, где по меньшей мере один капсидный белок AAV (например, капсидный белок VP1 AAV, капсидный белок VP2 AAV и/или капсидный белок VP3 AAV) указанного капсида AAV содержит по меньшей мере часть аминокислотной последовательности капсидного белка AAV животного, не являющегося приматом, (например, где по меньшей мере один капсидный белок AAV содержит аминокислотную последовательность, характеризующуюся значительной идентичностью последовательности, например по меньшей мере 95% идентичностью, с капсидным белком AAV животного, не являющегося приматом), где по меньшей мере один капсидный белок AAV указанного капсида AAV модифицирован с включением (а) по меньшей мере первого партнера из связывающейся пары белок:белок, (b) детектируемой метки, (с) точечной мутации, (d) химерной аминокислотной последовательности, содержащей часть аминокислотной последовательности капсидного белка другого, например второго, AAV, которая функционально связана с указанной аминокислотной последовательностью капсида AAV животного, не являющегося приматом, и (е) любой комбинации (а), (b), (с) и (d).[0022] In some embodiments of the present invention, an AAV viral particle comprises an AAV capsid, wherein at least one AAV capsid protein (e.g., an AAV capsid protein VP1, an AAV capsid protein VP2, and/or an AAV capsid protein VP3) of said AAV capsid comprises at least a portion of an amino acid sequence of a capsid protein selected from the group consisting of an AAV capsid protein of a non-primate animal, a capsid protein of a distant AAV, and a combination thereof, and wherein the at least one AAV capsid protein of said AAV capsid is modified to include (a) at least a first partner of a protein:protein binding pair, (b) a detectable label, (c) a point mutation, (d) a chimeric amino acid sequence comprising a portion of an amino acid sequence of a capsid protein of another, such as a second, AAV that is operably linked to said amino acid sequence of a capsid protein selected from the group consisting of a capsid protein of a an AAV of a non-primate animal, a capsid protein of a distant AAV, or a combination thereof, and (e) any combination of (a), (b), (c), and (d). In some embodiments of the present invention, an AAV viral particle comprises an AAV capsid, wherein at least one AAV capsid protein (e.g., an AAV capsid protein VP1, an AAV capsid protein VP2, and/or an AAV capsid protein VP3) of said AAV capsid or a portion thereof has substantial sequence identity, such as at least 95% identity, to a capsid protein selected from the group consisting of an AAV capsid protein of a non-primate animal, a portion of an AAV capsid protein of a non-primate animal, a capsid protein of a distant AAV, a portion of a capsid protein of a distant AAV, and a combination thereof, and wherein the at least one AAV capsid protein of said AAV capsid is modified to include (a) at least a first partner of a protein:protein binding pair, (b) a detectable label, (c) a point mutation, (d) a chimeric amino acid sequence comprising a portion of the amino acid sequence of a capsid protein another, such as a second, AAV that is operably linked to said amino acid sequence of a capsid protein selected from the group consisting of a capsid protein of a non-primate AAV, a capsid protein of a distant AAV, or a combination thereof, and (e) any combination of (a), (b), (c), and (d). In some embodiments of the present invention, an AAV viral particle comprises an AAV capsid, wherein at least one AAV capsid protein (e.g., an AAV capsid protein VP1, an AAV capsid protein VP2, and/or an AAV capsid protein VP3) of said AAV capsid comprises at least a portion of an amino acid sequence of an AAV capsid protein of a non-primate animal (e.g., wherein the at least one AAV capsid protein comprises an amino acid sequence having substantial sequence identity, such as at least 95% identity, to an AAV capsid protein of a non-primate animal), wherein the at least one AAV capsid protein of said AAV capsid is modified to include (a) at least a first partner of a protein:protein binding pair, (b) a detectable label, (c) a point mutation, (d) a chimeric amino acid sequence comprising a portion of an amino acid sequence of a capsid protein of another, such as a second, AAV, which is operably linked to the specified amino acid sequence of an AAV capsid from a non-primate animal, and (e) any combination of (a), (b), (c), and (d).
[0023] В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения вирусная частица AAV содержит капсид AAV, где по меньшей мере один капсидный белок AAV (например, капсидный белок VP1 AAV, капсидный белок VP2 AAV и/или капсидный белок VP3 AAV) указанного капсида AAV содержит по меньшей мере часть аминокислотной последовательности капсидного белка отдаленного AAV (например, где по меньшей мере один капсидный белок AAV содержит аминокислотную последовательность, характеризующуюся значительной идентичностью последовательности, например по меньшей мере 95% идентичностью, с капсидным белком отдаленного AAV), где по меньшей мере один капсидный белок AAV указанного капсида AAV модифицирован с включением (а) по меньшей мере первого партнера из связывающейся пары белок:белок, (b) детектируемой метки, (с) точечной мутации, (d) химерной аминокислотной последовательности, содержащей часть аминокислотной последовательности капсидного белка другого, например второго, AAV, которая функционально связана с указанной аминокислотной последовательностью капсидного белка отдаленного AAV, и (е) любой комбинации (а), (b), (с) и (d).[0023] In some embodiments, an AAV viral particle comprises an AAV capsid, wherein at least one AAV capsid protein (e.g., an AAV capsid protein VP1, an AAV capsid protein VP2, and/or an AAV capsid protein VP3) of said AAV capsid comprises at least a portion of an amino acid sequence of a capsid protein of a distant AAV (e.g., wherein the at least one AAV capsid protein comprises an amino acid sequence having substantial sequence identity, such as at least 95% identity, to a capsid protein of a distant AAV), wherein the at least one AAV capsid protein of said AAV capsid is modified to include (a) at least a first partner of a protein:protein binding pair, (b) a detectable label, (c) a point mutation, (d) a chimeric amino acid sequence comprising a portion of an amino acid sequence of a capsid protein of another, such as a second, AAV that is operably linked to said amino acid sequence, the capsid protein sequence of a distant AAV, and (e) any combination of (a), (b), (c), and (d).
[0024] В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения вирусная частица AAV содержит (А) по меньшей мере один капсидный белок AAV, например капсидный белок VP1 AAV, капсидный белок VP2 AAV и/или капсидный белок VP3 AAV, содержащий аминокислотную последовательность, идентичную или характеризующуюся значительной идентичностью, например по меньшей мере 95% идентичностью последовательности, с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из (i) аминокислотной последовательности капсидного белка AAV животного, не являющегося приматом, (ii) аминокислотной последовательности капсидного белка AAV отдаленного примата и (iii) аминокислотной последовательности их комбинации, и (В) геном AAV, содержащий представляющий интерес нуклеотид и ITR AAV, содержащий по меньшей мере часть последовательности ITR другого, например второго, AAV, где другой AAV не идентичен AAV животного, не являющегося приматом, и также не идентичен AAV отдаленного примата.[0024] In some embodiments of the invention, an AAV viral particle comprises (A) at least one AAV capsid protein, such as an AAV capsid protein VP1, an AAV capsid protein VP2, and/or an AAV capsid protein VP3, comprising an amino acid sequence that is identical to or has substantial identity, such as at least 95% sequence identity, with an amino acid sequence selected from the group consisting of (i) an amino acid sequence of an AAV capsid protein of a non-primate animal, (ii) an amino acid sequence of an AAV capsid protein of a distant primate, and (iii) an amino acid sequence of a combination thereof, and (B) an AAV genome comprising a nucleotide of interest and an AAV ITR comprising at least a portion of an ITR sequence of another, such as a second, AAV, wherein the other AAV is not identical to the AAV of the non-primate animal and is also not identical to the AAV of the distant primate.
[0025] В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения вирусная частица AAV содержит (А) по меньшей мере один капсидный белок AAV (например, капсидный белок VP1 AAV, капсидный белок VP2 AAV и/или капсидный белок VP3 AAV), содержащий аминокислотную последовательность, идентичную или характеризующуюся значительной идентичностью, например по меньшей мере 95% идентичностью последовательности, с аминокислотной последовательностью капсидного белка AAV животного, не являющегося приматом, и (В) геном AAV, содержащий представляющий интерес нуклеотид и ITR AAV, содержащий по меньшей мере часть последовательности ITR другого AAV, например второго AAV, где другой AAV не идентичен AAV животного, не являющегося приматом.[0025] In some embodiments of the invention, an AAV viral particle comprises (A) at least one AAV capsid protein (e.g., an AAV capsid protein VP1, an AAV capsid protein VP2, and/or an AAV capsid protein VP3) comprising an amino acid sequence that is identical to or has substantial sequence identity, such as at least 95% sequence identity, with an amino acid sequence of an AAV capsid protein of a non-primate animal, and (B) an AAV genome comprising a nucleotide of interest and an AAV ITR comprising at least a portion of an ITR sequence of another AAV, such as a second AAV, wherein the other AAV is not identical to an AAV of a non-primate animal.
[0026] В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения вирусная частица AAV содержит (А) по меньшей мере один капсидный белок AAV (например, капсидный белок VP1 AAV, капсидный белок VP2 AAV и/или капсидный белок VP3 AAV), содержащий аминокислотную последовательность, идентичную или характеризующуюся значительной идентичностью, например по меньшей мере 95% идентичностью последовательности, с аминокислотной последовательностью капсидного белка отдаленного AAV, и (В) геном AAV, содержащий представляющий интерес нуклеотид и ITR AAV, содержащий по меньшей мере часть последовательности ITR другого AAV, например второго AAV, где другой AAV не идентичен AAV отдаленного примата.[0026] In some embodiments of the invention, an AAV viral particle comprises (A) at least one AAV capsid protein (e.g., an AAV capsid protein VP1, an AAV capsid protein VP2, and/or an AAV capsid protein VP3) comprising an amino acid sequence that is identical to or has substantial sequence identity, such as at least 95% sequence identity, with the amino acid sequence of a capsid protein of a distant AAV, and (B) an AAV genome comprising a nucleotide of interest and an AAV ITR comprising at least a portion of an ITR sequence of another AAV, such as a second AAV, wherein the other AAV is not identical to the distant primate AAV.
[0027] В некоторых вариантах осуществления вирусной частицы AAV по настоящему изобретению капсидный белок, содержащий аминокислотную последовательность, идентичную или характеризующуюся значительной идентичностью, например по меньшей мере 95% идентичностью последовательности, с аминокислотной последовательностью капсидного белка AAV животного, не являющегося приматом, капсидного белка отдаленного AAV или их комбинации, модифицирован с включением (а) по меньшей мере первого партнера из связывающейся пары белок : белок, (b) детектируемой метки, (с) точечной мутации.[0027] In some embodiments of the AAV viral particle of the present invention, a capsid protein comprising an amino acid sequence identical to or having substantial sequence identity, such as at least 95% sequence identity, with an amino acid sequence of an AAV capsid protein of a non-primate animal, a capsid protein of a distant AAV, or a combination thereof, is modified to include (a) at least a first partner of a protein:protein binding pair, (b) a detectable label, (c) a point mutation.
[0028] В некоторых вариантах осуществления вирусной частицы AAV по настоящему изобретению капсидный белок, содержащий аминокислотную последовательность, идентичную или характеризующуюся значительной идентичностью, например по меньшей мере 95% идентичностью последовательности, с аминокислотной последовательностью капсидного белка AAV животного, не являющегося приматом, капсидного белка отдаленного AAV или их комбинации, содержит аминокислотную последовательность, идентичную или характеризующуюся значительной идентичностью, например по меньшей мере 95% идентичностью последовательности, с аминокислотной последовательностью капсидного белка VP3 AAV животного, не являющегося приматом, и/или аминокислотной последовательностью капсидного белка VP3 отдаленного AAV. В некоторых вариантах осуществления капсидный белок, содержащий аминокислотную последовательность, идентичную или характеризующуюся значительной идентичностью, например по меньшей мере 95% идентичностью последовательности, с аминокислотной последовательностью капсидного белка AAV животного, не являющегося приматом, капсидного белка отдаленного AAV или их комбинации, содержит аминокислотную последовательность, идентичную или характеризующуюся значительной идентичностью, например по меньшей мере 95% идентичностью последовательности, с аминокислотной последовательностью капсидного белка VP2 AAV животного, не являющегося приматом, и/или аминокислотной последовательностью капсидного белка VP2 отдаленного AAV. В некоторых вариантах осуществления капсидный белок, содержащий аминокислотную последовательность, идентичную или характеризующуюся значительной идентичностью, например по меньшей мере 95% идентичностью последовательности, с аминокислотной последовательностью капсидного белка AAV животного, не являющегося приматом, капсидного белка отдаленного AAV или их комбинации, содержит аминокислотную последовательность, идентичную или характеризующуюся значительной идентичностью, например по меньшей мере 95% идентичностью последовательности, с аминокислотной последовательностью капсидного белка VP1 AAV животного, не являющегося приматом, и/или аминокислотной последовательностью капсидного белка VP1 отдаленного AAV.[0028] In some embodiments of the AAV viral particle of the present invention, a capsid protein comprising an amino acid sequence that is identical to or has substantial identity, such as at least 95% sequence identity, with an amino acid sequence of an AAV capsid protein of a non-primate animal, a capsid protein of a distant AAV, or a combination thereof, comprises an amino acid sequence that is identical to or has substantial identity, such as at least 95% sequence identity, with an amino acid sequence of an AAV capsid protein VP3 of a non-primate animal and/or an amino acid sequence of a VP3 capsid protein of a distant AAV. In some embodiments, a capsid protein comprising an amino acid sequence that is identical to or has substantial identity, such as at least 95% sequence identity, with an amino acid sequence of a capsid protein of a non-primate AAV, a capsid protein of a distant AAV, or a combination thereof, comprises an amino acid sequence that is identical to or has substantial identity, such as at least 95% sequence identity, with an amino acid sequence of a VP2 capsid protein of a non-primate AAV and/or an amino acid sequence of a VP2 capsid protein of a distant AAV. In some embodiments, a capsid protein comprising an amino acid sequence that is identical to or has substantial identity, such as at least 95% sequence identity, with an amino acid sequence of a capsid protein of a non-primate AAV, a capsid protein of a distant AAV, or a combination thereof, comprises an amino acid sequence that is identical to or has substantial identity, such as at least 95% sequence identity, with an amino acid sequence of a VP1 capsid protein of a non-primate AAV and/or an amino acid sequence of a VP1 capsid protein of a distant AAV.
[0029] В некоторых вариантах осуществления вирусной частицы AAV по настоящему изобретению капсид указанной частицы содержит (i) капсидный белок VP1, который представляет собой один из (а) химерного капсидного белка VP1 AAV, где необязательно химерный капсидный белок VP1 содержит уникальную область VP1 (VP1-u) другого, например второго, AAV, функционально связанную с общей областью VP1/VP2 и областью VP3 AAV животного, не являющегося приматом, или отдаленного AAV, или (b) капсидного белка VP1 AAV животного, не являющегося приматом, или отдаленного AAV, (ii) капсидный белок VP2, который представляет собой один из (а) химерного капсидного белка VP2 AAV, где необязательно химерный капсидный белок VP2 содержит общую область VP1/VP2 другого, например второго, AAV, функционально связанную с областью VP3 AAV животного, не являющегося приматом, или отдаленного AAV, или (b) капсидного белка VP2 AAV животного, не являющегося приматом, или отдаленного AAV, и (iii) капсидный белок VP3 AAV животного, не являющегося приматом, или отдаленного AAV. В некоторых вариантах осуществления капсид указанной частицы содержит (i) химерный капсидный белок VP1 AAV, где необязательно химерный капсидный белок VP1 содержит уникальную область VP1 (VP1-u) другого, например второго, AAV, функционально связанную с общей областью VP1/VP2 и областью VP3 AAV животного, не являющегося приматом, или отдаленного AAV, (ii) химерный капсидный белок VP2 AAV, где необязательно химерный капсидный белок VP2 содержит общую область VP1/VP2 другого, например второго, AAV, функционально связанную с областью VP3 AAV животного, не являющегося приматом, или отдаленного AAV, и (iii) капсидный белок VP3 AAV животного, не являющегося приматом, или отдаленного AAV. В некоторых вариантах осуществления капсид указанной частицы содержит (i) химерный капсидный белок VP1 AAV, где необязательно химерный капсидный белок VP1 содержит уникальную область VP1 (VP1-u) другого, например второго, AAV, функционально связанную с общей областью VP1/VP2 и областью VP3 AAV животного, не являющегося приматом, или отдаленного AAV, (ii) капсидный белок VP2 AAV животного, не являющегося приматом, или отдаленного AAV и (iii) капсидный белок VP3 AAV животного, не являющегося приматом, или отдаленного AAV. В некоторых вариантах осуществления капсид содержит (i) капсидный белок VP1 AAV животного, не являющегося приматом, или отдаленного AAV, (ii) капсидный белок VP2 AAV животного, не являющегося приматом, или отдаленного AAV и (iii) капсидный белок VP3 AAV животного, не являющегося приматом, или отдаленного AAV, и где необязательно частица содержит в капсиде геном AAV, содержащий ITR AAV, который содержит по меньшей мере часть последовательности ITR другого, например второго, AAV. В некоторых вариантах осуществления другой AAV не идентичен AAV животного, не являющегося приматом.[0029] In some embodiments of the AAV viral particle of the present invention, the capsid of said particle comprises (i) a VP1 capsid protein that is one of (a) a chimeric VP1 capsid protein of an AAV, wherein optionally the chimeric VP1 capsid protein comprises a unique VP1 region (VP1-u) of another, e.g., second, AAV, operably linked to the common VP1/VP2 region and the VP3 region of an AAV of a non-primate animal or a distant AAV, or (b) a VP1 capsid protein of an AAV of a non-primate animal or a distant AAV, (ii) a VP2 capsid protein that is one of (a) a chimeric VP2 capsid protein of an AAV, wherein optionally the chimeric VP2 capsid protein comprises the common VP1/VP2 region of another, e.g., second, AAV, operably linked to the VP3 region of an AAV of a non-primate animal or a distant AAV, or (b) the VP2 capsid protein of a non-primate AAV or a distant AAV, and (iii) the VP3 capsid protein of a non-primate AAV or a distant AAV. In some embodiments, the capsid of said particle comprises (i) a chimeric VP1 capsid protein of an AAV, wherein optionally the chimeric VP1 capsid protein comprises a unique VP1 region (VP1-u) of another, such as a second, AAV, operably linked to a common VP1/VP2 region and a VP3 region of an AAV of a non-primate animal or a distant AAV, (ii) a chimeric VP2 capsid protein of an AAV, wherein optionally the chimeric VP2 capsid protein comprises a common VP1/VP2 region of another, such as a second, AAV, operably linked to a VP3 region of an AAV of a non-primate animal or a distant AAV, and (iii) a VP3 capsid protein of an AAV of a non-primate animal or a distant AAV. In some embodiments, the capsid of said particle comprises (i) a chimeric VP1 capsid protein of an AAV, wherein optionally the chimeric VP1 capsid protein comprises a unique VP1 region (VP1-u) of another, such as a second, AAV, operably linked to a common VP1/VP2 region and a VP3 region of an AAV of a non-primate animal or a distant AAV, (ii) a VP2 capsid protein of an AAV of a non-primate animal or a distant AAV, and (iii) a VP3 capsid protein of an AAV of a non-primate animal or a distant AAV. In some embodiments, the capsid comprises (i) a VP1 capsid protein of a non-primate animal AAV or a distant AAV, (ii) a VP2 capsid protein of a non-primate animal AAV or a distant AAV, and (iii) a VP3 capsid protein of a non-primate animal AAV or a distant AAV, and wherein optionally the particle comprises in the capsid an AAV genome comprising an ITR of an AAV that comprises at least a portion of an ITR sequence of another, such as a second, AAV. In some embodiments, the other AAV is not identical to the AAV of the non-primate animal.
[0030] В некоторых вариантах осуществления рекомбинантной вирусной частицы AAV (i) капсидный белок VP1 содержит одну из (а) химерной аминокислотной последовательности, где необязательно уникальная область VP1 (VP1-u) химерного капсидного белка VP1 AAV содержит аминокислотную последовательность, характеризующуюся значительной идентичностью последовательности, например по меньшей мере 95% идентичностью, с аминокислотной последовательностью VP1-u второго AAV, и где общая область VP1/VP2 и область VP3 химерного капсида VP1 AAV содержит аминокислотную последовательность, характеризующуюся значительной идентичностью последовательности, например по меньшей мере 95% идентичностью, с аминокислотной последовательностью общей области VP1/VP2 и области VP3 AAV животного, не являющегося приматом, или (b) аминокислотной последовательности, характеризующейся значительной идентичностью последовательности, например по меньшей мере 95% идентичностью, с капсидным белком VP1 AAV животного, не являющегося приматом, (ii) капсидный белок VP2 содержит одну из (а) химерной аминокислотной последовательности, где необязательно общая область VP1/VP2 химерного капсидного белка VP2 AAV содержит аминокислотную последовательность, характеризующуюся значительной идентичностью последовательности, например по меньшей мере 95% идентичностью, с аминокислотной последовательностью общей области VP1/VP2 второго AAV, и где область VP3 химерного капсидного белка VP2 характеризуется по меньшей мере 95% идентичностью с областью VP3 AAV животного, не являющегося приматом, или (b) аминокислотной последовательности, характеризующейся значительной идентичностью последовательности, например по меньшей мере 95% идентичностью, с капсидным белком VP2 AAV животного, не являющегося приматом, и (iii) капсидный белок VP3 содержит аминокислотную последовательность, характеризующуюся значительной идентичностью последовательности, например по меньшей мере 95% идентичностью, с капсидным белком VP3 AAV животного, не являющегося приматом. В некоторых вариантах осуществления (i) капсидный белок VP1 содержит химерную аминокислотную последовательность, где необязательно уникальная область VP1 (VP1-u) химерного капсидного белка VP1 AAV содержит аминокислотную последовательность, характеризующуюся значительной идентичностью последовательности, например по меньшей мере 95% идентичностью, с аминокислотной последовательностью VP1-u второго AAV, и где общая область VP1/VP2 и область VP3 химерного капсида VP1 AAV содержит аминокислотную последовательность, характеризующуюся значительной идентичностью последовательности, например по меньшей мере 95% идентичностью, с аминокислотной последовательностью общей области VP1/VP2 и области VP3 AAV животного, не являющегося приматом, (ii) капсидный белок VP2 содержит химерную аминокислотную последовательность, где необязательно общая область VP1/VP2 химерного капсидного белка VP2 AAV содержит аминокислотную последовательность, характеризующуюся значительной идентичностью последовательности, например по меньшей мере 95% идентичностью, с аминокислотной последовательностью общей области VP1/VP2 второго AAV, и где область VP3 химерного капсидного белка VP2 характеризуется по меньшей мере 95% идентичностью с областью VP3 AAV животного, не являющегося приматом, и (iii) капсидный белок VP3 содержит аминокислотную последовательность, характеризующуюся значительной идентичностью последовательности, например по меньшей мере 95% идентичностью, с капсидным белком VP3 AAV животного, не являющегося приматом. В некоторых вариантах осуществления (i) капсидный белок VP1 AAV содержит химерную аминокислотную последовательность, где необязательно уникальная область VP1 (VP1-u) химерного капсидного белка VP1 AAV содержит аминокислотную последовательность, характеризующуюся значительной идентичностью последовательности, например по меньшей мере 95% идентичностью, с аминокислотной последовательностью VP1-u второго AAV, и где общая область VP1/VP2 и область VP3 химерного капсида VP1 AAV содержит аминокислотную последовательность, характеризующуюся значительной идентичностью последовательности, например по меньшей мере 95% идентичностью, с аминокислотной последовательностью общей области VP1/VP2 и области VP3 AAV животного, не являющегося приматом, (ii) капсидный белок VP2 содержит аминокислотную последовательность, характеризующуюся значительной идентичностью последовательности, например по меньшей мере 95% идентичностью, с аминокислотной последовательностью капсидного белка VP2 AAV животного, не являющегося приматом, и (iii) капсидный белок VP3 содержит аминокислотную последовательность, характеризующуюся значительной идентичностью последовательности, например по меньшей мере 95% идентичностью, с аминокислотной последовательностью капсидного белка VP3 AAV животного, не являющегося приматом. В некоторых вариантах осуществления (i) капсидный белок VP1 содержит аминокислотную последовательность, характеризующуюся значительной идентичностью последовательности, например по меньшей мере 95% идентичностью, с аминокислотной последовательностью капсидного белка VP1 AAV животного, не являющегося приматом, (ii) капсидный белок VP2 содержит аминокислотную последовательность, характеризующуюся значительной идентичностью последовательности, например по меньшей мере 95% идентичностью, с аминокислотной последовательностью капсидного белка VP2 AAV животного, не являющегося приматом, и (iii) капсидный белок VP3 содержит аминокислотную последовательность, характеризующуюся значительной идентичностью последовательности, например по меньшей мере 95% идентичностью, с аминокислотной последовательностью капсидного белка VP3 AAV животного, не являющегося приматом, и где необязательно частица содержит в капсиде геном AAV, содержащий ITR AAV, который содержит по меньшей мере часть последовательности ITR другого, например второго, AAV. В некоторых вариантах осуществления другой AAV не идентичен AAV животного, не являющегося приматом.[0030] In some embodiments of the recombinant AAV viral particle, (i) the VP1 capsid protein comprises one of (a) a chimeric amino acid sequence, wherein the optionally unique VP1 region (VP1-u) of the chimeric AAV VP1 capsid protein comprises an amino acid sequence having substantial sequence identity, such as at least 95% identity, to the VP1-u amino acid sequence of a second AAV, and wherein the common VP1/VP2 region and VP3 region of the chimeric AAV VP1 capsid comprises an amino acid sequence having substantial sequence identity, such as at least 95% identity, to the amino acid sequence of the common VP1/VP2 region and VP3 region of an AAV of a non-primate animal, or (b) an amino acid sequence having substantial sequence identity, such as at least 95% identity, to the VP1 capsid protein of an AAV of a non-primate animal. a primate, (ii) the VP2 capsid protein comprises one of (a) a chimeric amino acid sequence, wherein optionally the VP1/VP2 common region of the chimeric VP2 AAV capsid protein comprises an amino acid sequence having substantial sequence identity, such as at least 95% identity, to an amino acid sequence of the VP1/VP2 common region of a second AAV, and wherein the VP3 region of the chimeric VP2 capsid protein has at least 95% identity to the VP3 region of an AAV of a non-primate animal, or (b) an amino acid sequence having substantial sequence identity, such as at least 95% identity, to the VP2 capsid protein of an AAV of a non-primate animal, and (iii) the VP3 capsid protein comprises an amino acid sequence having substantial sequence identity, such as at least 95% identity, to the VP3 capsid protein of an AAV of a non-primate animal primate. In some embodiments, (i) the VP1 capsid protein comprises a chimeric amino acid sequence, wherein optionally the unique VP1 region (VP1-u) of the chimeric AAV VP1 capsid protein comprises an amino acid sequence having substantial sequence identity, such as at least 95% identity, to the amino acid sequence of VP1-u of a second AAV, and wherein the common VP1/VP2 region and the VP3 region of the chimeric AAV VP1 capsid protein comprises an amino acid sequence having substantial sequence identity, such as at least 95% identity, to the amino acid sequence of the common VP1/VP2 region and the VP3 region of an AAV of a non-primate animal, (ii) the VP2 capsid protein comprises a chimeric amino acid sequence, wherein optionally the common VP1/VP2 region of the chimeric AAV VP2 capsid protein comprises an amino acid sequence having substantial sequence identity, such as at least 95% identity, with an amino acid sequence of the common VP1/VP2 region of a second AAV, and wherein the VP3 region of the chimeric VP2 capsid protein has at least 95% identity with the VP3 region of an AAV of a non-primate animal, and (iii) the VP3 capsid protein comprises an amino acid sequence having significant sequence identity, such as at least 95% identity, with the VP3 capsid protein of an AAV of a non-primate animal. In some embodiments, (i) the AAV VP1 capsid protein comprises a chimeric amino acid sequence, wherein the optionally unique VP1 region (VP1-u) of the chimeric AAV VP1 capsid protein comprises an amino acid sequence having substantial sequence identity, such as at least 95% identity, to the amino acid sequence of VP1-u of a second AAV, and wherein the common VP1/VP2 region and VP3 region of the chimeric AAV VP1 capsid comprises an amino acid sequence having substantial sequence identity, such as at least 95% identity, to the amino acid sequence of the common VP1/VP2 region and VP3 region of an AAV of a non-primate animal, (ii) the VP2 capsid protein comprises an amino acid sequence having substantial sequence identity, such as at least 95% identity, to the amino acid sequence of the VP2 capsid protein of an AAV of a non-primate animal, and (iii) the capsid protein VP3 comprises an amino acid sequence having substantial sequence identity, such as at least 95% identity, to the amino acid sequence of the VP3 capsid protein of an AAV of a non-primate animal. In some embodiments, (i) the VP1 capsid protein comprises an amino acid sequence having substantial sequence identity, such as at least 95% identity, to the amino acid sequence of the VP1 capsid protein of an AAV of a non-primate animal, (ii) the VP2 capsid protein comprises an amino acid sequence having substantial sequence identity, such as at least 95% identity, to the amino acid sequence of the VP2 capsid protein of an AAV of a non-primate animal, and (iii) the VP3 capsid protein comprises an amino acid sequence having substantial sequence identity, such as at least 95% identity, to the amino acid sequence of the VP3 capsid protein of an AAV of a non-primate animal, and wherein optionally the particle comprises in the capsid an AAV genome comprising an ITR of an AAV that comprises at least a portion of the ITR sequence of another, such as a second, AAV. In some embodiments, the other AAV is not identical to the AAV of the non-primate animal.
[0031] В некоторых вариантах осуществления вирусной частицы AAV по настоящему изобретению другой, например второй, AAV представляет собой AAV примата или комбинацию AAV приматов. В некоторых вариантах осуществления другой AAV выбран из группы, состоящей из AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV13 и их комбинации. В некоторых вариантах осуществления другой AAV представляет собой AAV2.[0031] In some embodiments of the AAV viral particle of the present invention, the other, such as the second, AAV is a primate AAV or a combination of primate AAVs. In some embodiments, the other AAV is selected from the group consisting of AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV13, and a combination thereof. In some embodiments, the other AAV is AAV2.
[0032] В некоторых вариантах осуществления вирусной частицы AAV по настоящему изобретению AAV животного, не являющегося приматом, представляет собой AAV животного, не являющегося приматом, приведенный в таблице 1. В некоторых вариантах осуществления AAV животного, не являющегося приматом, представляет собой птичий AAV (AAAV), AAV морского льва или AAV бородатой агамы. В некоторых вариантах осуществления AAV животного, не являющегося приматом, представляет собой AAAV, и необязательно аминокислотная последовательность капсидного белка AAAV содержит модификацию в положении I444 или I580 капсидного белка VP1 AAAV. В некоторых вариантах осуществления AAV животного, не являющегося приматом, представляет собой AAV чешуйчатого пресмыкающегося, например AAV бородатой агамы, и необязательно аминокислотная последовательность AAV бородатой агамы содержит модификацию в положении I573 или I436 капсидного белка VP1 AAV бородатой агамы. В некоторых вариантах осуществления AAV животного, не являющегося приматом, представляет собой AAV млекопитающего, например AAV морского льва, и необязательно аминокислотная последовательность AAV морского льва содержит модификацию в положении, выбранном из группы, состоящей из I429, I430, I431, I432, I433, I434, I436, I437 и А565 капсидного белка VP1 AAV морского льва.[0032] In some embodiments of the AAV viral particle of the present invention, the non-primate AAV is a non-primate AAV listed in Table 1. In some embodiments, the non-primate AAV is an avian AAV (AAAV), a sea lion AAV, or a bearded dragon AAV. In some embodiments, the non-primate AAV is an AAAV, and optionally, the amino acid sequence of the AAAV capsid protein comprises a modification at position I444 or I580 of the AAAV capsid protein VP1. In some embodiments, the non-primate AAV is a squamate AAV, such as a bearded dragon AAV, and optionally, the amino acid sequence of the bearded dragon AAV comprises a modification at position I573 or I436 of the bearded dragon AAV capsid protein VP1. In some embodiments, the non-primate AAV is a mammalian AAV, such as a sea lion AAV, and optionally the amino acid sequence of the sea lion AAV comprises a modification at a position selected from the group consisting of I429, I430, I431, I432, I433, I434, I436, I437, and A565 of the sea lion AAV VP1 capsid protein.
[0033] В некоторых вариантах осуществления вирусной частицы AAV по настоящему изобретению связывающаяся пара белок:белок выбрана из SpyTag:SpyCatcher, SpyTag:KTag, Isopeptag:ramHH С, SnoopTag:SnoopCatcher и SpyTag002:SpyCatcher002. В некоторых вариантах осуществления первый партнер из связывающейся пары белок:белок содержит с-тус, содержащую последовательность, изложенную под SEQ ID NO:44. В некоторых вариантах осуществления детектируемая метка предусматривает эпитоп В1, содержащий аминокислотную последовательность IGTRYLTR (SEQ ID NO:45).[0033] In some embodiments of the AAV viral particle of the present invention, the protein:protein binding pair is selected from SpyTag:SpyCatcher, SpyTag:KTag, Isopeptag:ramHH C, SnoopTag:SnoopCatcher, and SpyTag002:SpyCatcher002. In some embodiments, the first partner of the protein:protein binding pair comprises a c-myc comprising the sequence set forth in SEQ ID NO:44. In some embodiments, the detectable label provides a B1 epitope comprising the amino acid sequence IGTRYLTR (SEQ ID NO:45).
[0034] В некоторых вариантах осуществления частица AAV по настоящему изобретению содержит капсидный белок VP3 AAV животного, не являющегося приматом, отдаленного AAV или их комбинации, где капсидный белок VP3 модифицирован с включением (а) по меньшей мере первого партнера из связывающейся пары белок:белок, где необязательно связывающаяся пара белок:белок выбрана из группы, состоящей из Spy Tag: Spy Catcher, SpyTag:KTag, Isopeptag:nmiHH C, SnoopTag:SnoopCatcher и SpyTag002:SpyCatcher002, (b) детектируемой метки, где необязательно детектируемая метка содержит аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO:44, или аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO:45, (с) точечной мутации или (d) любой комбинации (а), (b) и (с). В некоторых вариантах осуществления капсидный белок VP3 AAV животного, не являющегося приматом, отдаленного AAV или их комбинации модифицирован с включением (а) по меньшей мере SpyTag, содержащего аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO:43, и/или (b) детектируемой метки, содержащей аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO:45.[0034] In some embodiments, an AAV particle of the present invention comprises a VP3 capsid protein of a non-primate AAV, a distant AAV, or a combination thereof, wherein the VP3 capsid protein is modified to include (a) at least a first partner of a protein:protein binding pair, wherein optionally the protein:protein binding pair is selected from the group consisting of Spy Tag: Spy Catcher, SpyTag:KTag, Isopeptag:nmiHHC, SnoopTag:SnoopCatcher, and SpyTag002:SpyCatcher002, (b) a detectable label, wherein optionally the detectable label comprises the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO:44 or the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO:45, (c) a point mutation, or (d) any combination of (a), (b), and (c). In some embodiments, the VP3 capsid protein of a non-primate AAV, a distant AAV, or a combination thereof is modified to include (a) at least a SpyTag comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO:43 and/or (b) a detectable label comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO:45.
[0035] В некоторых вариантах осуществления частица AAV по настоящему изобретению содержит первый и/или второй линкер, функционально связывающий первого партнера из связывающейся пары белок:белок и/или детектируемую метку с капсидным белком капсида указанной частицы AAV. В некоторых вариантах осуществления первый и второй линкер не являются идентичными. В некоторых вариантах осуществления первый и второй линкер являются идентичными. В некоторых вариантах осуществления длина первого и/или второго линкера составляет 10 аминокислот.[0035] In some embodiments, an AAV particle of the present invention comprises a first and/or second linker that operably links a first partner of a protein:protein binding pair and/or a detectable label to a capsid protein of the capsid of said AAV particle. In some embodiments, the first and second linkers are not identical. In some embodiments, the first and second linkers are identical. In some embodiments, the first and/or second linker is 10 amino acids long.
[0036] В некоторых вариантах осуществления вирусной частицы по настоящему изобретению по меньшей мере один из капсидных белков VP1, VP2 и VP3, необязательно по меньшей мере капсидный белок VP3, модифицирован с включением (а) первого партнера из связывающейся пары белок:белок, (b) детектируемой метки, (с) точечной мутации или (d) любой комбинации (а), (b) и/или (с). В некоторых вариантах осуществления первый партнер из связывающейся пары белок:белок и/или детектируемая метка или точечная мутация помещены в вариабельную область капсидного белка. В некоторых вариантах осуществления первый партнер из связывающейся пары белок:белок или детектируемая метка фланкированы первым линкером и/или вторым линкером. В некоторых вариантах осуществления длина первого и/или второго линкера составляет 1-10 аминокислот. В некоторых вариантах осуществления первый и второй линкер не являются идентичными. В некоторых вариантах осуществления первый и второй линкер являются идентичными.[0036] In some embodiments of a viral particle of the present invention, at least one of the capsid proteins VP1, VP2, and VP3, optionally at least the capsid protein VP3, is modified to include (a) a first partner of a protein:protein binding pair, (b) a detectable label, (c) a point mutation, or (d) any combination of (a), (b), and/or (c). In some embodiments, the first partner of the protein:protein binding pair and/or the detectable label or point mutation are placed in the variable region of the capsid protein. In some embodiments, the first partner of the protein:protein binding pair or the detectable label are flanked by a first linker and/or a second linker. In some embodiments, the first and/or second linker are 1-10 amino acids in length. In some embodiments, the first and second linker are not identical. In some embodiments, the first and second linker are identical.
[0037] В некоторых вариантах осуществления вирусной частицы капсидный белок VP3 AAAV содержит модификацию, необязательно с включением первого партнера из связывающейся пары белок : белок, где необязательно модификация находится в положении(-ях) I444 (например, G444) и/или I580 (например, K580). В некоторых вариантах осуществления капсидный белок VP3 AAAV содержит модификацию, необязательно с включением первого партнера из связывающейся пары белок : белок, где необязательно модификация находится в положении(-ях) I444 (например, G444) и/или I580 (например, K580). В некоторых вариантах осуществления капсидный белок VP3 AAV бородатой агамы содержит модификацию, необязательно с включением первого партнера из связывающейся пары белок:белок, где необязательно модификация находится в положении(-ях) I573 (например, Т573) и/или I436 (например, G436). В некоторых вариантах осуществления капсидный белок VP3 вируса морского льва содержит модификацию, необязательно с включением первого партнера из связывающейся пары белок:белок, где необязательно модификация находится в положении, выбранном из группы, состоящей из I429 (например, N429), I430 (например, Р430), I431 (например, Т431), I432 (например, G432), I433 (например, S433), I434 (например, Т434), I436 (например, R436), I437 (например, D437) и I565 (А565).[0037] In some embodiments of the viral particle, the AAAV VP3 capsid protein comprises a modification, optionally including a first partner of a protein:protein binding pair, wherein optionally the modification is at position(s) I444 (e.g., G444) and/or I580 (e.g., K580). In some embodiments, the AAAV VP3 capsid protein comprises a modification, optionally including a first partner of a protein:protein binding pair, wherein optionally the modification is at position(s) I444 (e.g., G444) and/or I580 (e.g., K580). In some embodiments, the bearded dragon AAV VP3 capsid protein comprises a modification, optionally including a first partner of a protein:protein binding pair, wherein optionally the modification is at position(s) I573 (e.g., T573) and/or I436 (e.g., G436). In some embodiments, the sea lion virus VP3 capsid protein comprises a modification, optionally involving the first partner of a protein:protein binding pair, wherein optionally the modification is at a position selected from the group consisting of I429 (e.g., N429), I430 (e.g., P430), I431 (e.g., T431), I432 (e.g., G432), I433 (e.g., S433), I434 (e.g., T434), I436 (e.g., R436), I437 (e.g., D437), and I565 (A565).
[0038] В некоторых вариантах осуществления вирусной частицы по настоящему изобретению по меньшей мере один капсидный белок, необязательно по меньшей мере капсидный белок VP3, модифицирован с включением первого партнера из связывающейся пары белок:белок. В некоторых вариантах осуществления первый партнер из связывающейся пары белок:белок содержит первого партнера из связывающейся пары белок:белок. В некоторых вариантах осуществления первый партнер из связывающейся пары белок:белок содержит второго когнатного партнера из связывающейся пары белок:белок. В некоторых вариантах осуществления первый и второй партнер из связывающейся пары белок:белок связаны ковалентной связью, например изопептидной связью. В некоторых вариантах осуществления первый партнер из связывающейся пары белок:белок представляет собой SpyTag, и необязательно второй партнер из связывающейся пары белок:белок представляет собой SpyCatcher или KTag. В некоторых вариантах осуществления первый партнер из связывающейся пары белок:белок представляет собой KTag, и необязательно второй партнер из связывающейся пары белок:белок представляет собой SpyTag. В некоторых вариантах осуществления первый партнер из связывающейся пары белок:белок представляет собой SnoopTag, и второй партнер из связывающейся пары белок:белок представляет собой SnoopCatcher. В некоторых вариантах осуществления первый партнер из связывающейся пары белок:белок представляет собой Isopeptag, и второй партнер из связывающейся пары белок:белок представляет собой пилин-С. В некоторых вариантах осуществления первый партнер из связывающейся пары белок:белок представляет собой SpyTag002, и второй партнер из связывающейся пары белок:белок представляет собой SpyCatcher002. В некоторых вариантах осуществления второй партнер из связывающейся пары белок:белок связан с нацеливающим лигандом, например связывающим фрагментом, например антителом или его фрагментом. В некоторых вариантах осуществления нацеливающий лиганд может быть слит со вторым партнером из связывающейся пары белок:белок, например SpyCatcher, необязательно через линкер на С-конце второго партнера, и линкер слит со SpyCatcher на С-конце линкера. В некоторых вариантах осуществления линкер содержит последовательность GSGESG (SEQ ID NO:49). В некоторых вариантах осуществления первый партнер из связывающейся пары белок:белок предусматривает детектируемую метку. В некоторых вариантах осуществления первый партнер из связывающейся пары белок:белок содержит детектируемую метку с-mус.[0038] In some embodiments of a viral particle of the present invention, at least one capsid protein, optionally at least a VP3 capsid protein, is modified to include a first partner of a protein:protein binding pair. In some embodiments, the first partner of the protein:protein binding pair comprises a first partner of a protein:protein binding pair. In some embodiments, the first partner of the protein:protein binding pair comprises a second cognate partner of the protein:protein binding pair. In some embodiments, the first and second partners of the protein:protein binding pair are linked by a covalent bond, such as an isopeptide bond. In some embodiments, the first partner of the protein:protein binding pair is a SpyTag, and optionally the second partner of the protein:protein binding pair is a SpyCatcher or a KTag. In some embodiments, the first partner of the protein:protein binding pair is a KTag, and optionally the second partner of the protein:protein binding pair is a SpyTag. In some embodiments, the first partner of the protein:protein binding pair is SnoopTag and the second partner of the protein:protein binding pair is SnoopCatcher. In some embodiments, the first partner of the protein:protein binding pair is Isopeptag and the second partner of the protein:protein binding pair is pilin C. In some embodiments, the first partner of the protein:protein binding pair is SpyTag002 and the second partner of the protein:protein binding pair is SpyCatcher002. In some embodiments, the second partner of the protein:protein binding pair is linked to a targeting ligand, such as a binding moiety, such as an antibody or fragment thereof. In some embodiments, the targeting ligand can be fused to the second partner of the protein:protein binding pair, such as SpyCatcher, optionally via a linker at the C-terminus of the second partner, and the linker is fused to SpyCatcher at the C-terminus of the linker. In some embodiments, the linker comprises the sequence GSGESG (SEQ ID NO:49). In some embodiments, the first partner of the protein:protein binding pair comprises a detectable label. In some embodiments, the first partner of the protein:protein binding pair comprises a detectable c-myc label.
[0039] В некоторых вариантах осуществления вирусной частицы по настоящему изобретению по меньшей мере один капсидный белок, необязательно по меньшей мере капсидный белок VP3 модифицирован с включением детектируемой метки. В некоторых вариантах осуществления детектируемая метка предусматривает эпитоп B1 AAV, например, аминокислотную последовательность IGTRYLTR (SEQ ID NO:45).[0039] In some embodiments of a viral particle of the present invention, at least one capsid protein, optionally at least the VP3 capsid protein, is modified to include a detectable label. In some embodiments, the detectable label comprises an AAV B1 epitope, such as the amino acid sequence IGTRYLTR (SEQ ID NO:45).
[0040] В некоторых вариантах осуществления вирусной частицы по настоящему изобретению по меньшей мере один капсидный белок, необязательно по меньшей мере капсидный белок VP3 модифицирован с включением:[0040] In some embodiments of a viral particle of the present invention, at least one capsid protein, optionally at least the VP3 capsid protein, is modified to include:
(a) первого партнера из связывающейся пары белок:белок, содержащей по меньшей мере одного партнера из связывающейся пары белок:белок, где необязательно связывающаяся пара белок:белок выбрана из группы, состоящей из SpyTag: SpyCatcher, SpyTag:KTag, Isopeptag:nmrHH-C, SnoopTag:SnoopCatcher, SpyTag002:SpyCatcher002 и c-myc:антитело к с-mус,(a) a first partner of a protein:protein binding pair comprising at least one partner of a protein:protein binding pair, wherein optionally the protein:protein binding pair is selected from the group consisting of SpyTag:SpyCatcher, SpyTag:KTag, Isopeptag:nmrHH-C, SnoopTag:SnoopCatcher, SpyTag002:SpyCatcher002 and c-myc:antibody to c-myc,
(b) детектируемой метки, где необязательно детектируемая метка содержит аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO:44, или аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO:45,(b) a detectable label, wherein optionally the detectable label comprises the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO:44 or the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO:45,
(c) точечной мутации или(c) point mutation or
(d) любой комбинации (а), (b) и (с).(d) any combination of (a), (b) and (c).
[0041] В некоторых вариантах осуществления вирусной частицы по настоящему изобретению по меньшей мере один капсидный белок, необязательно по меньшей мере капсидный белок VP3 модифицирован с включением:[0041] In some embodiments of a viral particle of the present invention, at least one capsid protein, optionally at least the VP3 capsid protein, is modified to include:
(a) первого партнера из связывающейся пары белок:белок, содержащего по меньшей мере SpyTag, который содержит аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO:43, и/или(a) a first partner of a protein:protein binding pair comprising at least a SpyTag that comprises the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO:43, and/or
(b) детектируемой метки, содержащей аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO:45.(b) a detectable label comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO:45.
[0042] В некоторых вариантах осуществления частица AAV по настоящему изобретению содержит капсидный белок, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из (а) аминокислотной последовательности, изложенной под SEQ ID NO:2, (b) аминокислотной[0042] In some embodiments, an AAV particle of the present invention comprises a capsid protein comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of (a) the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO:2, (b) the amino acid
последовательности, изложенной под SEQ ID NO:4, (с) аминокислотной последовательности, изложенной под SEQ ID NO:6, (d) аминокислотной последовательности, изложенной под SEQ ID NO:8, (е) аминокислотной последовательности, изложенной под SEQ ID NO:10, (f) аминокислотной последовательности, изложенной под SEQ ID NO:12, (g) аминокислотной последовательности, изложенной под SEQ ID NO:I4, (h) аминокислотной последовательности, изложенной под SEQ ID NO:16, (i) аминокислотной последовательности, изложенной под SEQ ID NO:18, (j) аминокислотной последовательности, изложенной под SEQ ID NO:20, (k) аминокислотной последовательности, изложенной под SEQ ID NO:22, (l) аминокислотной последовательности, изложенной под SEQ ID NO:24, (m) аминокислотной последовательности, изложенной под SEQ ID NO:26, (n) аминокислотной последовательности, изложенной под SEQ ID NO:28, (о) аминокислотной последовательности, изложенной под SEQ ID NO:30, (р) аминокислотной последовательности, изложенной под SEQ ID NO:32, (q) аминокислотной последовательности, изложенной под SEQ ID NO:34, (r) аминокислотной последовательности, изложенной под SEQ ID NO:36, (s) аминокислотной последовательности, изложенной под SEQ ID NO:53, (t) аминокислотной последовательности, изложенной под SEQ ID NO:55, (u) аминокислотной последовательности, изложенной под SEQ ID NO:57, (v) аминокислотной последовательности, изложенной под SEQ ID NO:59, (w) аминокислотной последовательности, изложенной под SEQ ID NO:61, (х) аминокислотной последовательности, изложенной под SEQ ID NO:63, (у) аминокислотной последовательности, изложенной под SEQ ID NO:65, (z) аминокислотной последовательности, изложенной под SEQ ID NO:67, (аа) аминокислотной последовательности, изложенной под SEQ ID NO:69, (bb) аминокислотной последовательности, изложенной под SEQ ID NO:71, (сс) аминокислотной последовательности, характеризующейся по меньшей мере 95% идентичностью с SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:I4, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:57, SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:61, SEQ ID NO:63, SEQ ID NO:65, SEQ ID NO:67, SEQ ID NO:69 или SEQ ID NO:71, и (dd) аминокислотной последовательности любой из частей VP2 и/или VP3 из аминокислотных последовательностей, изложенных в любом из (а)-(сс).the amino acid sequence set forth as SEQ ID NO:4, (c) the amino acid sequence set forth as SEQ ID NO:6, (d) the amino acid sequence set forth as SEQ ID NO:8, (e) the amino acid sequence set forth as SEQ ID NO:10, (f) the amino acid sequence set forth as SEQ ID NO:12, (g) the amino acid sequence set forth as SEQ ID NO:I4, (h) the amino acid sequence set forth as SEQ ID NO:16, (i) the amino acid sequence set forth as SEQ ID NO:18, (j) the amino acid sequence set forth as SEQ ID NO:20, (k) the amino acid sequence set forth as SEQ ID NO:22, (l) the amino acid sequence set forth as SEQ ID NO:24, (m) the amino acid sequence set forth as SEQ ID NO:26, (n) the amino acid sequence set forth as by SEQ ID NO:28, (o) the amino acid sequence set forth by SEQ ID NO:30, (p) the amino acid sequence set forth by SEQ ID NO:32, (q) the amino acid sequence set forth by SEQ ID NO:34, (r) the amino acid sequence set forth by SEQ ID NO:36, (s) the amino acid sequence set forth by SEQ ID NO:53, (t) the amino acid sequence set forth by SEQ ID NO:55, (u) the amino acid sequence set forth by SEQ ID NO:57, (v) the amino acid sequence set forth by SEQ ID NO:59, (w) the amino acid sequence set forth by SEQ ID NO:61, (x) the amino acid sequence set forth by SEQ ID NO:63, (y) the amino acid sequence set forth by SEQ ID NO:65, (z) the amino acid sequence set forth by SEQ ID NO:67, (aa) the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO:69, (bb) the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO:71, (cc) an amino acid sequence having at least 95% identity to SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:57, SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:61, SEQ ID NO:63, SEQ ID NO:65, SEQ ID NO:67, SEQ ID NO:69 or SEQ ID NO:71, and (dd) the amino acid sequence of any of the VP2 and/or VP3 portions of the amino acid sequences set forth in any of (a) to (cc).
[0043] В некоторых вариантах осуществления вирусной частицы по настоящему изобретению, где по меньшей мере один из капсидных белков VP1, VP2 и VP3 AAV содержит модификацию, например с включением первого партнера из связывающейся пары белок:белок, вирусная частица дополнительно содержит эталонный капсидный белок, необязательно капсидный белок, соответствующий по меньшей мере одному из капсидных белков VP1, VP2 и VP3 AAV, за исключением модификации, так что капсид представляет собой мозаичный капсид. В некоторых вариантах осуществления мозаичный капсид содержит капсидный белок VP1, модифицированный с помощью первого партнера из связывающейся пары белок : белок, и эталонный капсидный белок VP1. В некоторых вариантах осуществления мозаичный капсид содержит капсидный белок VP2, модифицированный с помощью первого партнера из связывающейся пары белок:белок, и эталонный капсидный белок VP2. В некоторых вариантах осуществления мозаичный капсид содержит капсидный белок VP3, модифицированный с помощью первого партнера из связывающейся пары белок:белок, и эталонный капсидный белок VP3.[0043] In some embodiments of a viral particle of the present invention, wherein at least one of the AAV capsid proteins VP1, VP2, and VP3 comprises a modification, such as to include a first partner of a protein:protein binding pair, the viral particle further comprises a reference capsid protein, optionally a capsid protein corresponding to at least one of the AAV capsid proteins VP1, VP2, and VP3, except for the modification such that the capsid is a mosaic capsid. In some embodiments, the mosaic capsid comprises a VP1 capsid protein modified with a first partner of a protein:protein binding pair and a reference VP1 capsid protein. In some embodiments, the mosaic capsid comprises a VP2 capsid protein modified with a first partner of a protein:protein binding pair and a reference VP2 capsid protein. In some embodiments, the mosaic capsid comprises a VP3 capsid protein modified with a first partner of a protein:protein binding pair and a reference VP3 capsid protein.
[0044] Также описаны вирусные частицы по настоящему изобретению, содержащие капсидные белки AAV по настоящему изобретению. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения капсидный белок AAV по настоящему изобретению содержит аминокислотную последовательность, идентичную или характеризующуюся значительной идентичностью, например по меньшей мере 95% идентичностью последовательности, с аминокислотной последовательностью капсидного белка AAV животного, не являющегося приматом, или отдаленного AAV, где капсидный белок AAV выбран из группы, состоящей из (а) химерного капсидного белка VP1 AAV, где необязательно химерный капсидный белок VP1 AAV животного модифицирован с включением по меньшей мере первого партнера из связывающейся пары белок:белок, детектируемой метки и/или точечной мутации, (b) нехимерного капсидного белка VP1 AAV, модифицированного с включением по меньшей мере первого партнера из связывающейся пары белок:белок и/или детектируемой метки, (с) химерного капсидного белка VP2, где необязательно химерный капсидный белок VP2 AAV модифицирован с включением по меньшей мере первого партнера из связывающейся пары белок:белок, детектируемой метки и/или точечной мутации, (d) нехимерного капсидного белка VP2 AAV, модифицированного с включением по меньшей мере первого партнера из связывающейся пары белок:белок, детектируемой метки и/или точечной мутации, (е) химерного капсидного белка VP3 AAV, модифицированного с включением по меньшей мере первого партнера из связывающейся пары белок:белок, детектируемой метки и/или точечной мутации, и (f) нехимерного капсидного белка VP3 AAV, модифицированного с включением по меньшей мере первого партнера из связывающейся пары белок:белок, детектируемой метки и/или точечной мутации.[0044] Also described are viral particles of the present invention comprising the AAV capsid proteins of the present invention. In some embodiments, an AAV capsid protein of the invention comprises an amino acid sequence that is identical to or has substantial sequence identity, such as at least 95% sequence identity, with an amino acid sequence of an AAV capsid protein of a non-primate animal or a distant AAV, wherein the AAV capsid protein is selected from the group consisting of (a) a chimeric AAV capsid protein VP1, wherein optionally the chimeric AAV capsid protein VP1 of an animal is modified to include at least a first partner of a protein:protein binding pair, a detectable label, and/or a point mutation, (b) a non-chimeric AAV capsid protein VP1 modified to include at least a first partner of a protein:protein binding pair and/or a detectable label, (c) a chimeric VP2 capsid protein, wherein optionally the chimeric AAV capsid protein VP2 is modified to include at least a first partner of a protein:protein binding pair, a detectable label and/or a point mutation, (d) a non-chimeric AAV VP2 capsid protein modified to include at least a first partner of the protein:protein binding pair, a detectable label and/or a point mutation, (e) a chimeric AAV VP3 capsid protein modified to include at least a first partner of the protein:protein binding pair, a detectable label and/or a point mutation, and (f) a non-chimeric AAV VP3 capsid protein modified to include at least a first partner of the protein:protein binding pair, a detectable label and/or a point mutation.
[0045] В некоторых вариантах осуществления капсидного белка AAV по настоящему изобретению первый партнер из связывающейся пары белок:белок и/или детектируемая метка фланкированы с одной или обеих сторон соответственно первым и/или вторым линкером, который(-ые) соединяет(-ют) первого партнера из связывающейся пары белок:белок и/или детектируемую метку с капсидным белком, где длина каждого из первого и/или второго линкера независимо составляет по меньшей мере одну аминокислоту. В некоторых вариантах осуществления первый и второй линкеры не являются идентичными. В некоторых вариантах осуществления первый и второй линкеры являются идентичными, и их длина составляет 10 аминокислот.[0045] In some embodiments of the AAV capsid protein of the present invention, the first partner of the protein:protein binding pair and/or the detectable label are flanked on one or both sides, respectively, by a first and/or second linker that connects(s) the first partner of the protein:protein binding pair and/or the detectable label to the capsid protein, wherein each of the first and/or second linkers is independently at least one amino acid in length. In some embodiments, the first and second linkers are not identical. In some embodiments, the first and second linkers are identical and are 10 amino acids in length.
[0046] В некоторых вариантах осуществления капсидный белок AAV по настоящему изобретению содержит детектируемую метку, где необязательно детектируемая метка содержит эпитоп В1, содержащий аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO:45. В некоторых вариантах осуществления детектируемая метка предусматривает с-myc.[0046] In some embodiments, the AAV capsid protein of the present invention comprises a detectable label, wherein optionally the detectable label comprises a B1 epitope comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO:45. In some embodiments, the detectable label comprises c-myc.
[0047] В некоторых вариантах осуществления капсидный белок AAV по настоящему изобретению содержит одновременно первого партнера и второго когнатного партнера из связывающейся пары белок:белок, где необязательно первый и второй партнеры связаны ковалентной связью, необязательно изопептидной связью. В некоторых вариантах осуществления первый партнер из связывающейся пары белок:белок представляет собой SpyTag, и необязательно второй когнатный партнер представляет собой SpyCatcher или KTag. В некоторых вариантах осуществления первый партнер представляет собой KTag, и второй когнатный партнер представляет собой SpyTag. В некоторых вариантах осуществления первый партнер представляет собой SnoopTag, и второй когнатный партнер представляет собой SnoopCatcher. В некоторых вариантах осуществления первый партнер представляет собой Isopeptag, и второй когнатный партнер представляет собой пилин-С. В некоторых вариантах осуществления первый партнер представляет собой SpyTag002, и второй когнатный партнер представляет собой SpyCatcher002. В некоторых вариантах осуществления первый партнер предусматривает детектируемую метку, такую как без ограничения с-myc, при этом ее партнер из связывающейся пары представляет собой антитело к с-myc или его часть. В некоторых вариантах осуществления второй партнер функционально связан с нацеливающим лигандом, где необязательно нацеливающий лиганд представляет собой связывающий фрагмент, который необязательно нацеливается на клеточный маркер. В некоторых вариантах осуществления связывающий фрагмент представляет собой антитело или его часть. В некоторых вариантах осуществления связывающий фрагмент функционально связан со вторым партнером из связывающейся пары белок:белок, необязательно с помощью ковалентной связи (такой как, без ограничения изопептидная связь) или линкера. В некоторых вариантах осуществления связывающий фрагмент слит со вторым партнером из связывающейся пары белок:белок с помощью линкера, слитого с С-концом связывающего фрагмента, где линкер слит со вторым партнером посредством С-конца линкера, где необязательно линкер содержит последовательность, изложенную под SEQ ID NO:49 (GSGESG). В некоторых вариантах осуществления первый партнер из связывающейся пары белок:белок расположен в аминокислотном положении, находящемся в VR I, VR II, VR III, VR IV, VR V, VR VI, VR VII, VR VIII, VR IX или петле HI капсидного белка, необязательно в VR VIII или VR IV капсидного белка.[0047] In some embodiments, an AAV capsid protein of the present invention comprises both a first partner and a second cognate partner of a protein:protein binding pair, wherein optionally the first and second partners are linked by a covalent bond, optionally by an isopeptide bond. In some embodiments, the first partner of the protein:protein binding pair is SpyTag, and optionally the second cognate partner is SpyCatcher or KTag. In some embodiments, the first partner is KTag and the second cognate partner is SpyTag. In some embodiments, the first partner is SnoopTag and the second cognate partner is SnoopCatcher. In some embodiments, the first partner is Isopeptag and the second cognate partner is pilin C. In some embodiments, the first partner is SpyTag002 and the second cognate partner is SpyCatcher002. In some embodiments, the first partner comprises a detectable label, such as, but not limited to, c-myc, wherein the binding pair partner thereof is an anti-c-myc antibody or a portion thereof. In some embodiments, the second partner is operably linked to a targeting ligand, wherein optionally the targeting ligand is a binding moiety that optionally targets a cellular marker. In some embodiments, the binding moiety is an antibody or a portion thereof. In some embodiments, the binding moiety is operably linked to the second partner of the protein:protein binding pair, optionally via a covalent bond (such as, but not limited to, an isopeptide bond) or a linker. In some embodiments, the binding moiety is fused to the second partner of the protein:protein binding pair via a linker fused to the C-terminus of the binding moiety, wherein the linker is fused to the second partner via the C-terminus of the linker, wherein optionally the linker comprises the sequence set forth in SEQ ID NO:49 (GSGESG). In some embodiments, the first partner of the protein:protein binding pair is located at an amino acid position located in VR I, VR II, VR III, VR IV, VR V, VR VI, VR VII, VR VIII, VR IX, or the HI loop of the capsid protein, optionally in VR VIII or VR IV of the capsid protein.
[0048] В некоторых вариантах осуществления капсидного белка AAV по настоящему изобретению AAV животного, не являющегося приматом, представляет собой AAV животного, не являющегося приматом, приведенный в таблице 1. В некоторых вариантах осуществления AAV животного, не являющегося приматом, представляет собой птичий AAV (AAAV), AAV морского льва или AAV бородатой агамы. В некоторых вариантах осуществления AAV животного, не являющегося приматом, представляет собой AAAV, и необязательно аминокислотная последовательность капсидного белка AAAV содержит модификацию, находящуюся в положении I444 или I580 капсидного белка VP1 AAAV. В некоторых вариантах осуществления AAV животного, не являющегося приматом, представляет собой AAV чешуйчатого пресмыкающегося, например AAV бородатой агамы, и необязательно аминокислотная последовательность AAV бородатой агамы содержит модификацию, находящуюся в положении I573 или I436 капсидного белка VP1 AAV бородатой агамы. В некоторых вариантах осуществления AAV животного, не являющегося приматом, представляет собой AAV млекопитающего, например AAV морского льва, и необязательно аминокислотная последовательность AAV морского льва содержит модификацию в положении, выбранном из группы, состоящей из I429, I430, I431, I432, I433, I434, I436, I437 и А565 капсидного белка VP1 AAV морского льва.[0048] In some embodiments of the AAV capsid protein of the present invention, the non-primate AAV is a non-primate AAV listed in Table 1. In some embodiments, the non-primate AAV is an avian AAV (AAAV), a sea lion AAV, or a bearded dragon AAV. In some embodiments, the non-primate AAV is AAAV, and optionally, the amino acid sequence of the AAAV capsid protein comprises a modification located at position I444 or I580 of the AAAV VP1 capsid protein. In some embodiments, the non-primate AAV is a scaly reptile AAV, such as a bearded dragon AAV, and optionally the amino acid sequence of the bearded dragon AAV comprises a modification located at position I573 or I436 of the bearded dragon AAV VP1 capsid protein. In some embodiments, the non-primate AAV is a mammalian AAV, such as a sea lion AAV, and optionally the amino acid sequence of the sea lion AAV comprises a modification at a position selected from the group consisting of I429, I430, I431, I432, I433, I434, I436, I437, and A565 of the sea lion AAV VP1 capsid protein.
[0049] Капсидные белки VP3 вируса животного, не являющегося приматом, по настоящему изобретению включают капсидные белки VP3 вируса животного, не являющегося приматом, (а) которые инкапсидируют геном другого, например второго, AAV, и/или (b) которые являются мутированными. В некоторых вариантах осуществления капсидный белок VP3 AAV животного, не являющегося человеком, по настоящему изобретению инкапсидирует геном второго AAV, который не является вирусом животного, не являющегося приматом. В некоторых вариантах осуществления капсидный белок VP3 AAV животного, не являющегося приматом, по настоящему изобретению может быть функционально связан с первым партнером из связывающейся пары белок:белок (необязательно с помощью первого и/или второго линкера) и/или содержит точечную мутацию, например такую, что естественный тропизм капсидного белка снижен вплоть до устранения, и/или такую, что капсидный белок содержит детектируемую метку. В некоторых вариантах осуществления первый партнер из связывающейся пары белок:белок содержит детектируемую метку. В некоторых вариантах осуществления первый партнер из связывающейся пары белок:белок содержит детектируемую метку, которая предусматривает c-myc (SEQ ID NO:44). В некоторых вариантах осуществления первый партнер из связывающейся пары белок:белок содержит первого партнера и необязательно второго партнера из связывающейся пары белок:белок, которая образует ковалентную связь. В некоторых вариантах осуществления связывающаяся пара белок:белок выбрана из группы, состоящей из (a) SpyTag:SpyCatcher, (b) SpyTag:KTag, (с) Isopeptag:пилин С, (d) SnoopTag: SnoopCatcher и (e) SpyTag002:SpyCatcher002. В некоторых вариантах осуществления капсидный белок VP3 AAV животного, не являющегося приматом, может содержать (а) эпитоп B1 (SEQ ID NO:45), (b) SpyTag, (с) SpyCatcher или любую комбинацию (а)-(с).[0049] The VP3 capsid proteins of a non-primate animal virus of the present invention include VP3 capsid proteins of a non-primate animal virus (a) that encapsidate the genome of another, such as a second, AAV, and/or (b) that are mutated. In some embodiments, the VP3 capsid protein of a non-human AAV of the present invention encapsidates the genome of a second AAV that is not a non-primate animal virus. In some embodiments, the VP3 capsid protein of a non-primate animal AAV of the present invention may be operably linked to a first partner of a protein:protein binding pair (optionally via a first and/or second linker) and/or comprise a point mutation, such as such that the natural tropism of the capsid protein is reduced to the point of being eliminated, and/or such that the capsid protein comprises a detectable label. In some embodiments, the first partner of the protein:protein binding pair comprises a detectable label. In some embodiments, the first partner of the protein:protein binding pair comprises a detectable label that provides c-myc (SEQ ID NO:44). In some embodiments, the first partner of the protein:protein binding pair comprises a first partner and optionally a second partner of the protein:protein binding pair that forms a covalent bond. In some embodiments, the protein:protein binding pair is selected from the group consisting of (a) SpyTag:SpyCatcher, (b) SpyTag:KTag, (c) Isopeptag:pilin C, (d) SnoopTag:SnoopCatcher, and (e) SpyTag002:SpyCatcher002. In some embodiments, the VP3 capsid protein of a non-primate AAV may comprise (a) epitope B1 (SEQ ID NO:45), (b) SpyTag, (c) SpyCatcher, or any combination of (a)-(c).
[0050] В некоторых вариантах осуществления капсидный белок VP3 AAV животного, не являющегося приматом, по настоящему изобретению содержит первого партнера из связывающейся пары белок:белок, функционально связанного с ним, необязательно с помощью первого или второго линкера. В некоторых вариантах осуществления первый партнер из связывающейся пары белок:белок функционально связан с капсидом VP3 AAV животного, не являющегося приматом, по аминокислотному положению, находящемуся в вариабельной области (VR) или ее части капсидного белка VP3, где необязательно первый партнер из связывающейся пары белок:белок связан с капсидном VP3 с помощью первого и/или второго линкера. В некоторых вариантах осуществления первый партнер из связывающейся пары белок:белок функционально связан с капсидом VP3 AAV животного, не являющегося приматом, по аминокислотному положению, находящемуся в VR I, VR II, VR III, VR IV, VR V, VR VI, VR VII, VR VIII, VR IX или петле HI капсидного белка VP3, где необязательно первый партнер из связывающейся пары белок:белок связан с капсидом VP3 с помощью первого и/или второго линкера. В некоторых вариантах осуществления первый партнер из связывающейся пары белок:белок функционально связан с капсидом VP3 AAV животного, не являющегося приматом, по аминокислотному положению, находящемуся в VR VIII или VR IV капсидного белка VP3, где необязательно первый партнер из связывающейся пары белок:белок связан с капсидом VP3 с помощью первого и/или второго линкера. В некоторых вариантах осуществления капсидный белок VP3 AAV животного, не являющегося приматом, представляет собой капсидный белок VP3 AAV животного, не являющегося приматом, выбранный из AAV животного, не являющегося приматом, приведенного в таблице 1. В некоторых вариантах осуществления капсидный белок VP3 AAV животного, не являющегося приматом, представляет собой капсидный белок VP3 птичьего AAV (AAAV). В некоторых вариантах осуществления капсидный белок VP3 AAAV содержит первого партнера из связывающейся пары белок:белок (например, SpyTag), функционально связанного, необязательно с помощью первого или второго линкера, по положению I444 или I580. В некоторых вариантах осуществления капсидный белок VP3 AAV животного, не являющегося приматом, представляет собой капсидный белок VP3 AAV бородатой агамы. В некоторых вариантах осуществления капсидный белок VP3 AAV бородатой агамы содержит первого партнера из связывающейся пары белок:белок (например, SpyTag), функционально связанного, необязательно с помощью первого или второго линкера, по положению I573 или I436. В некоторых вариантах осуществления капсидный белок VP3 AAV животного, не являющегося приматом, представляет собой капсидный белок VP3 AAV морского льва. В некоторых вариантах осуществления капсидный белок VP3 AAV морского льва содержит первого партнера из связывающейся пары белок:белок (например, SpyTag), функционально связанного, необязательно с помощью первого или второго линкера, по положению, выбранному из группы, состоящей из I429, I430, I431, I432, I433, I434, I436, I437 и I565, и необязательно по положению, выбранному из группы, состоящей из I429, I430, I431, I432, I433, I436 и I437; необязательно по I432.[0050] In some embodiments, the non-primate AAV VP3 capsid protein of the present invention comprises a first partner of a protein:protein binding pair operably linked thereto, optionally via a first or second linker. In some embodiments, the first partner of the protein:protein binding pair is operably linked to the non-primate AAV VP3 capsid at an amino acid position located within the variable region (VR) or a portion thereof of the VP3 capsid protein, wherein optionally the first partner of the protein:protein binding pair is linked to the VP3 capsid via a first and/or second linker. In some embodiments, the first partner of the protein:protein binding pair is operably linked to the VP3 capsid of the non-primate AAV at an amino acid position located within VR I, VR II, VR III, VR IV, VR V, VR VI, VR VII, VR VIII, VR IX, or the HI loop of the VP3 capsid protein, wherein optionally the first partner of the protein:protein binding pair is linked to the VP3 capsid via a first and/or second linker. In some embodiments, the first partner of the protein:protein binding pair is operably linked to the VP3 capsid of the non-primate AAV at an amino acid position located within VR VIII or VR IV of the VP3 capsid protein, wherein optionally the first partner of the protein:protein binding pair is linked to the VP3 capsid via a first and/or second linker. In some embodiments, the non-primate AAV VP3 capsid protein is a non-primate AAV VP3 capsid protein selected from the non-primate AAVs listed in Table 1. In some embodiments, the non-primate AAV VP3 capsid protein is an avian AAV (AAAV) VP3 capsid protein. In some embodiments, the AAAV VP3 capsid protein comprises a first partner of a protein:protein binding pair (e.g., SpyTag) operably linked, optionally by a first or second linker, at position I444 or I580. In some embodiments, the non-primate AAV VP3 capsid protein is a bearded dragon AAV VP3 capsid protein. In some embodiments, a bearded dragon AAV VP3 capsid protein comprises a first partner of a protein:protein binding pair (e.g., SpyTag) operably linked, optionally via a first or second linker, at position I573 or I436. In some embodiments, a non-primate AAV VP3 capsid protein is a sea lion AAV VP3 capsid protein. In some embodiments, the sea lion AAV VP3 capsid protein comprises a first partner of a protein:protein binding pair (e.g., SpyTag) operably linked, optionally via a first or second linker, at a position selected from the group consisting of I429, I430, I431, I432, I433, I434, I436, I437, and I565, and optionally at a position selected from the group consisting of I429, I430, I431, I432, I433, I436, and I437; optionally at I432.
[0051] Капсидные белки VP2 вируса животного, не являющегося приматом, по настоящему изобретению включают капсидные белки VP2 вируса животного, не являющегося приматом, (а) которые инкапсидируют геном другого, например второго, AAV, и/или (b) которые являются мутированными. В некоторых вариантах осуществления капсидный белок VP2 AAV животного, не являющегося приматом, по настоящему изобретению инкапсидирует геном другого, например второго, AAV. В некоторых вариантах осуществления капсидный белок VP2 AAV животного, не являющегося приматом, по настоящему изобретению может быть функционально связан с первым партнером из связывающейся пары белок:белок и/или содержит точечную мутацию, например такую, что естественный тропизм капсидного белка снижен вплоть до устранения, и/или такую, что капсидный белок содержит детектируемую метку. В некоторых вариантах осуществления первый партнер из связывающейся пары белок:белок содержит детектируемую метку. В некоторых вариантах осуществления первый партнер из связывающейся пары белок:белок содержит детектируемую метку, содержащую c-myc (SEQ ID NO:44). В некоторых вариантах осуществления первый партнер из связывающейся пары белок:белок содержит первого партнера и необязательно второго партнера из связывающейся пары белок:белок, которая образует ковалентную связь. В некоторых вариантах осуществления связывающаяся пара белок:белок выбрана из группы, состоящей из (а) SpyTag: SpyCatcher, (b) SpyTag:KTag, (с) Isopeptag:nmniH С, (d) SnoopTag: SnoopCatcher и (e) SpyTag002:SpyCatcher002. В некоторых вариантах осуществления капсидный белок VP2 AAV животного, не являющегося приматом, может содержать (а) эпитоп Bl (SEQ ID NO:45), (b) SpyTag, (с) SpyCatcher или любую комбинацию (а)-(с).[0051] The non-primate animal virus VP2 capsid proteins of the present invention include non-primate animal virus VP2 capsid proteins (a) that encapsidate the genome of another, such as a second, AAV, and/or (b) that are mutated. In some embodiments, the non-primate animal AAV VP2 capsid protein of the present invention encapsidates the genome of another, such as a second, AAV. In some embodiments, the non-primate animal AAV VP2 capsid protein of the present invention can be operably linked to a first partner of a protein:protein binding pair and/or comprise a point mutation, such as such that the natural tropism of the capsid protein is reduced to the point of being eliminated, and/or such that the capsid protein comprises a detectable label. In some embodiments, the first partner of the protein:protein binding pair comprises a detectable label. In some embodiments, the first partner of the protein:protein binding pair comprises a detectable label comprising c-myc (SEQ ID NO:44). In some embodiments, the first partner of the protein:protein binding pair comprises a first partner and optionally a second partner of the protein:protein binding pair that forms a covalent bond. In some embodiments, the protein:protein binding pair is selected from the group consisting of (a) SpyTag:SpyCatcher, (b) SpyTag:KTag, (c) Isopeptag:nmniHC, (d) SnoopTag:SnoopCatcher, and (e) SpyTag002:SpyCatcher002. In some embodiments, the VP2 capsid protein of a non-primate AAV may comprise (a) a B1 epitope (SEQ ID NO:45), (b) SpyTag, (c) SpyCatcher, or any combination of (a)-(c).
[0052] В некоторых вариантах осуществления капсидный белок VP2 AAV животного, не являющегося приматом, по настоящему изобретению содержит первого партнера из связывающейся пары белок:белок, функционально связанного с ним, необязательно с помощью первого и второго линкера. В некоторых вариантах осуществления первый партнер из связывающейся пары белок:белок функционально связан с капсидом VP2 AAV животного, не являющегося приматом, по аминокислотному положению, находящемуся в вариабельной области (VR) или ее части капсидного белка VP2, где необязательно первый партнер из связывающейся пары белок:белок связан с капсидном VP2 с помощью первого и/или второго линкера. В некоторых вариантах осуществления первый партнер из связывающейся пары белок:белок функционально связан с капсидом VP2 AAV животного, не являющегося приматом, по аминокислотному положению, находящемуся в VR I, VR II, VR III, VR IV, VR V, VR VI, VR VII, VR VIII, VR IX или петле HI капсидного белка VP2, где необязательно первый партнер из связывающейся пары белок:белок связан с капсидом VP2 с помощью первого и/или второго линкера. В некоторых вариантах осуществления первый партнер из связывающейся пары белок:белок функционально связан с капсидом VP2 AAV животного, не являющегося приматом, по аминокислотному положению, находящемуся в VR VIII или VR IV капсидного белка VP2, где необязательно первый партнер из связывающейся пары белок:белок связан с капсидом VP2 с помощью первого и/или второго линкера. В некоторых вариантах осуществления капсидный белок VP2 AAV животного, не являющегося приматом, представляет собой капсидный белок VP2 AAV животного, не являющегося приматом, выбранный из AAV животного, не являющегося приматом, приведенного в таблице 1. В некоторых вариантах осуществления капсидный белок VP2 AAV животного, не являющегося приматом, представляет собой капсидный белок VP2 птичьего AAV (AAAV). В некоторых вариантах осуществления капсидный белок VP2 AAAV содержит первого партнера из связывающейся пары белок:белок (например, SpyTag), функционально связанного, необязательно с помощью первого или второго линкера, по положению I444 или I580. В некоторых вариантах осуществления капсидный белок VP2 AAV животного, не являющегося приматом, представляет собой капсидный белок VP2 AAV бородатой агамы. В некоторых вариантах осуществления капсидный белок VP2 AAV бородатой агамы содержит первого партнера из связывающейся пары белок:белок (например, SpyTag), функционально связанного, необязательно с помощью первого или второго линкера, по положению I573 или I436. В некоторых вариантах осуществления капсидный белок VP2 AAV животного, не являющегося приматом, представляет собой капсидный белок VP2 AAV морского льва. В некоторых вариантах осуществления капсидный белок VP2 AAV морского льва содержит первого партнера из связывающейся пары белок:белок (например, SpyTag), функционально связанного, необязательно с помощью первого или второго линкера, по положению, выбранному из группы, состоящей из I429, I430, I431, I432, I433, I434, I436, I437 и I565, необязательно по положению, выбранному из группы, состоящей из I429, I430, I431, I432, I433, I436 и I437; необязательно по I431.[0052] In some embodiments, the non-primate AAV VP2 capsid protein of the present invention comprises a first partner of a protein:protein binding pair operably linked thereto, optionally via a first and a second linker. In some embodiments, the first partner of the protein:protein binding pair is operably linked to the non-primate AAV VP2 capsid at an amino acid position located within the variable region (VR) or a portion thereof of the VP2 capsid protein, wherein optionally the first partner of the protein:protein binding pair is linked to the VP2 capsid via a first and/or second linker. In some embodiments, the first partner of the protein:protein binding pair is operably linked to the VP2 capsid of the non-primate AAV at an amino acid position located within VR I, VR II, VR III, VR IV, VR V, VR VI, VR VII, VR VIII, VR IX, or the HI loop of the VP2 capsid protein, wherein optionally the first partner of the protein:protein binding pair is linked to the VP2 capsid via a first and/or second linker. In some embodiments, the first partner of the protein:protein binding pair is operably linked to the VP2 capsid of the non-primate AAV at an amino acid position located within VR VIII or VR IV of the VP2 capsid protein, wherein optionally the first partner of the protein:protein binding pair is linked to the VP2 capsid via a first and/or second linker. In some embodiments, the non-primate AAV VP2 capsid protein is a non-primate AAV VP2 capsid protein selected from the non-primate AAVs listed in Table 1. In some embodiments, the non-primate AAV VP2 capsid protein is an avian AAV (AAAV) VP2 capsid protein. In some embodiments, the AAAV VP2 capsid protein comprises a first partner of a protein:protein binding pair (e.g., SpyTag) operably linked, optionally by a first or second linker, at position I444 or I580. In some embodiments, the non-primate AAV VP2 capsid protein is a bearded dragon AAV VP2 capsid protein. In some embodiments, a bearded dragon AAV VP2 capsid protein comprises a first partner of a protein:protein binding pair (e.g., SpyTag) operably linked, optionally via a first or second linker, at position I573 or I436. In some embodiments, a non-primate AAV VP2 capsid protein is a sea lion AAV VP2 capsid protein. In some embodiments, the sea lion AAV VP2 capsid protein comprises a first partner of a protein:protein binding pair (e.g., SpyTag) operably linked, optionally via a first or second linker, at a position selected from the group consisting of I429, I430, I431, I432, I433, I434, I436, I437, and I565, optionally at a position selected from the group consisting of I429, I430, I431, I432, I433, I436, and I437; optionally at I431.
[0053] В некоторых вариантах осуществления капсидный белок VP2 по настоящему изобретению может представлять собой химерный капсидный белок VP2, который содержит в функциональной связи часть капсидного белка VP2 AAV животного, не являющегося приматом, и часть капсидного белка VP2 другого, например второго, AAV. В некоторых вариантах осуществления химерный капсидный белок VP2 содержит от N-конца к С-концу: (а) часть капсидного белка VP2 другого, например второго, AAV, функционально связанную с (b) частью капсида VP2 AAV животного, не являющегося приматом, которая содержит по меньшей мере аминокислотную последовательность капсидного белка VP3 AAV животного, не являющегося приматом. В некоторых вариантах осуществления химерный капсидный белок VP2 может содержать от N-конца к С-концу: (а) аминокислотную последовательность общей области VP1/VP2 другого AAV, функционально связанную с (b) аминокислотной последовательностью капсидного белка VP3 AAV животного, не являющегося приматом. В некоторых вариантах осуществления другой AAV представляет собой AAV животного, не являющегося приматом. В некоторых других вариантах осуществления другой AAV представляет собой AAV примата.[0053] In some embodiments, the VP2 capsid protein of the present invention may be a chimeric VP2 capsid protein that comprises, in operable association, a portion of a VP2 capsid protein of an AAV of a non-primate animal and a portion of a VP2 capsid protein of another, such as a second, AAV. In some embodiments, the chimeric VP2 capsid protein comprises, from N-terminus to C-terminus: (a) a portion of a VP2 capsid protein of another, such as a second, AAV, operably linked to (b) a portion of a VP2 capsid of an AAV of a non-primate animal that comprises at least the amino acid sequence of a VP3 capsid protein of the non-primate animal AAV. In some embodiments, the chimeric VP2 capsid protein may comprise, from N-terminus to C-terminus: (a) the amino acid sequence of the VP1/VP2 common region of another AAV operably linked to (b) the amino acid sequence of the VP3 capsid protein of a non-primate AAV. In some embodiments, the other AAV is a non-primate AAV. In some other embodiments, the other AAV is a primate AAV.
[0054] В некоторых вариантах осуществления химерный капсидный белок VP2 по настоящему изобретению содержит (а) часть капсидного белка VP2 AAV примата, функционально связанную с (b) частью капсида VP2 AAV животного, не являющегося приматом, которая содержит по меньшей мере аминокислотную последовательность капсидного белка VP3 AAV животного, не являющегося приматом. В некоторых вариантах осуществления химерный капсидный белок VP2 может содержать от N-конца к С-концу: (а) аминокислотную последовательность общей области VP1/VP2 AAV примата, функционально связанную с (b) аминокислотной последовательностью капсидного белка VP3 AAV животного, не являющегося приматом. В некоторых вариантах осуществления AAV примата представляет собой AAV1. В некоторых вариантах осуществления AAV примата представляет собой AAV2. В некоторых вариантах осуществления AAV примата представляет собой AAV3. В некоторых вариантах осуществления AAV примата представляет собой AAV4. В некоторых вариантах осуществления AAV примата представляет собой AAV5. В некоторых вариантах осуществления AAV примата представляет собой AAV6. В некоторых вариантах осуществления AAV примата представляет собой AAV7. В некоторых вариантах осуществления AAV примата представляет собой AAV8. В некоторых вариантах осуществления AAV примата представляет собой AAV9. В некоторых вариантах осуществления AAV животного, не являющегося приматом, выбран из группы AAV животных, не являющихся приматом, представленных в таблице 1. В некоторых вариантах осуществления AAV животного, не являющегося приматом, представляет собой птичий AAV, AAV бородатой агамы или AAV морского льва.[0054] In some embodiments, a chimeric VP2 capsid protein of the present invention comprises (a) a portion of a primate AAV VP2 capsid protein operably linked to (b) a portion of a VP2 capsid protein of a non-primate animal that comprises at least the amino acid sequence of a VP3 capsid protein of the non-primate animal AAV. In some embodiments, a chimeric VP2 capsid protein may comprise, from N-terminus to C-terminus: (a) an amino acid sequence of a primate AAV VP1/VP2 common region operably linked to (b) an amino acid sequence of a VP3 capsid protein of a non-primate animal AAV. In some embodiments, the primate AAV is AAV1. In some embodiments, the primate AAV is AAV2. In some embodiments, the primate AAV is AAV3. In some embodiments, the primate AAV is AAV4. In some embodiments, the primate AAV is AAV5. In some embodiments, the primate AAV is AAV6. In some embodiments, the primate AAV is AAV7. In some embodiments, the primate AAV is AAV8. In some embodiments, the primate AAV is AAV9. In some embodiments, the non-primate AAV is selected from the group of non-primate AAVs presented in Table 1. In some embodiments, the non-primate AAV is an avian AAV, a bearded dragon AAV, or a sea lion AAV.
[0055] В некоторых вариантах осуществления химерный капсидный белок VP2 по настоящему изобретению содержит (а) часть капсидного белка VP2 AAV2, функционально связанную с (b) частью капсида VP2 AAV животного, не являющегося приматом, которая содержит по меньшей мере аминокислотную последовательность капсидного белка VP3 AAV животного, не являющегося приматом. В некоторых вариантах осуществления химерный капсидный белок VP2 может содержать от N-конца к С-концу: (а) аминокислотную последовательность общей области VP1/VP2 AAV2, функционально связанную с (b) аминокислотной последовательностью капсидного белка VP3 AAV животного, не являющегося приматом.[0055] In some embodiments, the chimeric VP2 capsid protein of the present invention comprises (a) a portion of an AAV2 VP2 capsid protein operably linked to (b) a portion of an AAV VP2 capsid protein of a non-primate animal that comprises at least the amino acid sequence of an AAV VP3 capsid protein of the non-primate animal. In some embodiments, the chimeric VP2 capsid protein may comprise, from N-terminus to C-terminus: (a) an amino acid sequence of an AAV2 VP1/VP2 common region operably linked to (b) an amino acid sequence of an AAV VP3 capsid protein of a non-primate animal.
[0056] В некоторых вариантах осуществления химерный капсидный белок VP2 AAV2/AAAV по настоящему изобретению содержит (а) часть капсидного белка VP2 AAV2, функционально связанную с (b) частью капсидного белка VP2 птичьего AAV (AAAV), которая содержит по меньшей мере аминокислотную последовательность капсидного белка VP3 AAAV. В некоторых вариантах осуществления химерный капсидный белок VP2 AAV2/AAAV может содержать от N-конца к С-концу: (а) аминокислотную последовательность общей области VP1/VP2 AAV2, функционально связанную с (b) аминокислотной последовательностью капсидного белка VP3 AAAV.[0056] In some embodiments, the AAV2/AAAV chimeric capsid protein VP2 of the present invention comprises (a) a portion of an AAV2 VP2 capsid protein operably linked to (b) a portion of an avian AAV (AAAV) VP2 capsid protein that comprises at least the amino acid sequence of an AAAV VP3 capsid protein. In some embodiments, the AAV2/AAAV chimeric capsid protein VP2 may comprise, from N-terminus to C-terminus: (a) an amino acid sequence of an AAV2 VP1/VP2 common region operably linked to (b) an amino acid sequence of an AAAV VP3 capsid protein.
[0057] В некоторых вариантах осуществления химерный капсидный белок VP2 AAV2/AAV морского льва по настоящему изобретению содержит (а) часть капсидного белка VP2 AAV2, функционально связанную с (b) частью капсидного белка VP2 AAV морского льва, которая содержит по меньшей мере аминокислотную последовательность капсидного белка VP3 AAV морского льва. В некоторых вариантах осуществления химерный капсидный белок VP2 AAV2/AAV морского льва может содержать от N-конца к С-концу: (а) аминокислотную последовательность общей области VP1/VP2 AAV2, функционально связанную с (b) аминокислотной последовательностью капсидного белка VP3 AAV морского льва.[0057] In some embodiments, the AAV2/sea lion AAV chimeric VP2 capsid protein of the present invention comprises (a) a portion of an AAV2 VP2 capsid protein operably linked to (b) a portion of a sea lion AAV VP2 capsid protein that comprises at least the amino acid sequence of a sea lion AAV VP3 capsid protein. In some embodiments, the AAV2/sea lion AAV chimeric VP2 capsid protein may comprise, from N-terminus to C-terminus: (a) an amino acid sequence of an AAV2 VP1/VP2 common region operably linked to (b) an amino acid sequence of a sea lion AAV VP3 capsid protein.
[0058] В некоторых вариантах осуществления химерный капсидный белок VP2 AAV2/AAV бородатой агамы по настоящему изобретению содержит (а) часть капсидного белка VP2 AAV2, функционально связанную с (b) частью капсидного белка VP2 AAV бородатой агамы, которая содержит по меньшей мере аминокислотную последовательность капсидного белка VP3 AAV бородатой агамы. В некоторых вариантах осуществления химерный капсидный белок VP2 AAV2/AAV бородатой агамы может содержать от N-конца к С-концу: (а) аминокислотную последовательность общей области VP1/VP2 AAV2, функционально связанную с (b) аминокислотной последовательностью капсидного белка VP3 AAV бородатой агамы.[0058] In some embodiments, the chimeric AAV2/bearded dragon AAV VP2 capsid protein of the present invention comprises (a) a portion of an AAV2 VP2 capsid protein operably linked to (b) a portion of a bearded dragon AAV VP2 capsid protein that comprises at least the amino acid sequence of a bearded dragon AAV VP3 capsid protein. In some embodiments, the chimeric AAV2/bearded dragon AAV VP2 capsid protein may comprise, from N-terminus to C-terminus: (a) an amino acid sequence of an AAV2 VP1/VP2 common region operably linked to (b) an amino acid sequence of a bearded dragon AAV VP3 capsid protein.
[0059] В некоторых вариантах осуществления химерный капсидный белок VP2 по настоящему изобретению может быть функционально связан с первым партнером из связывающейся пары белок:белок и/или содержит точечную мутацию, например такую, что естественный тропизм капсидного белка снижен вплоть до устранения, и/или такую, что капсидный белок содержит детектируемую метку. В некоторых вариантах осуществления первый партнер из связывающейся пары белок:белок содержит детектируемую метку. В некоторых вариантах осуществления первый партнер из связывающейся пары белок:белок содержит детектируемую метку, которая предусматривает c-myc (SEQ ID NO:44). В некоторых вариантах осуществления первый партнер из связывающейся пары белок:белок содержит первого партнера и необязательно второго партнера из связывающейся пары белок:белок, которая образует ковалентную связь. В некоторых вариантах осуществления связывающаяся пара белок:белок выбрана из группы, состоящей из (а) SpyTag: SpyCatcher, (b) SpyTag:KTag, (с) Isopeptag:nmmH С, (d) SnoopTag: SnoopCatcher и (e) SpyTag002:SpyCatcher002. В некоторых вариантах осуществления химерный капсидный белок VP2 может содержать (а) эпитоп Bl (SEQ ID NO:45), (b) SpyTag, (с) SpyCatcher или любую комбинацию (а)-(с).[0059] In some embodiments, a chimeric VP2 capsid protein of the present invention may be operably linked to a first partner of a protein:protein binding pair and/or comprise a point mutation, such as such that the natural tropism of the capsid protein is reduced to the point of being eliminated, and/or such that the capsid protein comprises a detectable label. In some embodiments, the first partner of the protein:protein binding pair comprises a detectable label. In some embodiments, the first partner of the protein:protein binding pair comprises a detectable label that provides c-myc (SEQ ID NO:44). In some embodiments, the first partner of the protein:protein binding pair comprises a first partner and, optionally, a second partner of the protein:protein binding pair that forms a covalent bond. In some embodiments, the protein:protein binding pair is selected from the group consisting of (a) SpyTag:SpyCatcher, (b) SpyTag:KTag, (c) Isopeptag:nmmHC, (d) SnoopTag:SnoopCatcher, and (e) SpyTag002:SpyCatcher002. In some embodiments, the chimeric VP2 capsid protein may comprise (a) the B1 epitope (SEQ ID NO:45), (b) SpyTag, (c) SpyCatcher, or any combination of (a)-(c).
[0060] В некоторых вариантах осуществления химерный капсидный белок VP2 вируса примата/животного, не являющегося приматом, по настоящему изобретению (например, химерный капсидный белок VP2 AAV2/AAAV, химерный капсидный белок VP2 AAV2/AAV морского льва, химерный капсидный белок VP2 AAV2/AAV бородатой агамы и т.д.) содержит первого партнера из связывающейся пары белок:белок, функционально связанного с ним, необязательно с помощью первого или второго линкера. В некоторых вариантах осуществления первый партнер из связывающейся пары белок:белок функционально связан с химерным капсидным белком VP2 вируса примата/животного, не являющегося приматом, (например, химерным капсидным белком VP2 AAV2/AAAV, химерным капсидным белком VP2 AAV2/AAV морского льва, химерным капсидным белком VP2 AAV2/AAV бородатой агамы и т.д.) по аминокислотному положению, находящемуся в вариабельной области (VR) или ее части химерного капсидного белка VP2 вируса примата/животного, не являющегося приматом, где необязательно первый партнер из связывающейся пары белок:белок связан с химерным капсидным белком VP2 вируса примата/животного, не являющегося приматом, с помощью первого и/или второго линкера. В некоторых вариантах осуществления первый партнер из связывающейся пары белок:белок функционально связан с химерным капсидным белком VP2 вируса примата/животного, не являющегося приматом, по аминокислотному положению,находящемуся в VR I, VR II, VR III, VR IV, VR V, VR VI, VR VII, VR VIII, VR IX или петле HI химерного капсидного белка VP2 вируса примата/животного, не являющегося приматом, где необязательно первый партнер из связывающейся пары белок:белок связан с капсидным белком VP2 с помощью первого и/или второго линкера. В некоторых вариантах осуществления первый партнер из связывающейся пары белок:белок функционально связан с химерным капсидным белком VP2 вируса примата/животного, не являющегося приматом, (например, химерным капсидным белком VP2 AAV2/AAAV, химерным капсидным белком VP2 AAV2/AAV морского льва, химерным капсидным белком VP2 AAV2/AAV бородатой агамы и т.д.) по аминокислотному положению, находящемуся в VR VIII или VR IV химерного капсидного белка VP2 вируса примата/животного, не являющегося приматом, где необязательно первый партнер из связывающейся пары белок:белок связан с химерным капсидным белком VP2 вируса примата/животного, не являющегося приматом, с помощью первого и/или второго линкера. В некоторых вариантах осуществления химерный капсидный белок VP2 AAV2/ AAAV содержит первого партнера из связывающейся пары белок:белок (например, SpyTag), функционально связанного, необязательно с помощью первого или второго линкера, по положению I444 или I580. В некоторых вариантах осуществления химерный капсидный белок VP2 AAV2/AAV бородатой агамы содержит первого партнера из связывающейся пары белок:белок (например, SpyTag), функционально связанного, необязательно с помощью первого или второго линкера, по положению I573 или I436. В некоторых вариантах осуществления химерный капсидный белок VP2 AAV2/AAV морского льва содержит первого партнера из связывающейся пары белок:белок (например, SpyTag), функционально связанного, необязательно с помощью первого или второго линкера, по положению, выбранному из группы, состоящей из I429, I430, I431, I432, I433, I434, I436, I437 и I565, необязательно по положению, выбранному из группы, состоящей из I429,I430,I431,I432,I433,I436 и I437; необязательно по I431.[0060] In some embodiments, a primate/non-primate virus chimeric VP2 capsid protein of the present invention (e.g., an AAV2/AAAV chimeric VP2 capsid protein, a sea lion AAV2/AAV chimeric VP2 capsid protein, a bearded dragon AAV2/AAV chimeric VP2 capsid protein, etc.) comprises a first partner of a protein:protein binding pair operably linked thereto, optionally via a first or second linker. In some embodiments, the first partner of the protein:protein binding pair is operably linked to a primate/non-primate virus chimeric capsid protein VP2 (e.g., an AAV2/AAAV chimeric capsid protein VP2, a sea lion AAV2/AAV chimeric capsid protein VP2, a bearded dragon AAV2/AAV chimeric capsid protein VP2, etc.) at an amino acid position located within the variable region (VR) or a portion thereof of the primate/non-primate virus chimeric capsid protein VP2, wherein optionally the first partner of the protein:protein binding pair is linked to the primate/non-primate virus chimeric capsid protein VP2 via a first and/or second linker. In some embodiments, the first partner of the protein:protein binding pair is operably linked to the chimeric primate/non-primate virus capsid protein VP2 at an amino acid position located within VR I, VR II, VR III, VR IV, VR V, VR VI, VR VII, VR VIII, VR IX, or the HI loop of the chimeric primate/non-primate virus capsid protein VP2, wherein optionally the first partner of the protein:protein binding pair is linked to the VP2 capsid protein via a first and/or second linker. In some embodiments, the first partner of the protein:protein binding pair is operably linked to a primate/non-primate virus chimeric capsid protein VP2 (e.g., an AAV2/AAAV chimeric capsid protein VP2, a sea lion AAV2/AAV chimeric capsid protein VP2, a bearded dragon AAV2/AAV chimeric capsid protein VP2, etc.) at an amino acid position located within VR VIII or VR IV of the primate/non-primate virus chimeric capsid protein VP2, wherein optionally the first partner of the protein:protein binding pair is linked to the primate/non-primate virus chimeric capsid protein VP2 via a first and/or second linker. In some embodiments, the AAV2/AAAV chimeric capsid protein VP2 comprises a first partner of a protein:protein binding pair (e.g., SpyTag) operably linked, optionally via a first or second linker, at position I444 or I580. In some embodiments, the AAV2/bearded dragon AAV chimeric capsid protein VP2 comprises a first partner of a protein:protein binding pair (e.g., SpyTag) operably linked, optionally via a first or second linker, at position I573 or I436. In some embodiments, the AAV2/sea lion AAV chimeric VP2 capsid protein comprises a first partner of a protein:protein binding pair (e.g., SpyTag) operably linked, optionally via a first or second linker, at a position selected from the group consisting of I429, I430, I431, I432, I433, I434, I436, I437, and I565, optionally at a position selected from the group consisting of I429, I430, I431, I432, I433, I436, and I437; optionally at I431.
[0061] Капсидные белки VP1 вируса животного, не являющегося приматом, по настоящему изобретению включают капсидные белки VP1 вируса животного, не являющегося приматом, (а) которые инкапсидируют геном другого, например второго, AAV, и/или (b) которые являются мутированными. В некоторых вариантах осуществления капсидный белок VP1 AAV животного, не являющегося приматом, по настоящему изобретению инкапсидирует геном другого, например второго, AAV. В некоторых вариантах осуществления капсидный белок VP1 вируса животного, не являющегося приматом, по настоящему изобретению может быть функционально связан с первым партнером из связывающейся пары белок:белок и/или содержит точечную мутацию, например такую, что естественный тропизм капсидного белка снижен вплоть до устранения, и/или такую, что капсидный белок содержит детектируемую метку. В некоторых вариантах осуществления первый партнер из связывающейся пары белок:белок содержит детектируемую метку. В некоторых вариантах осуществления первый партнер из связывающейся пары белок:белок содержит детектируемую метку, которая предусматривает c-myc (SEQ ID NO:44). В некоторых вариантах осуществления первый партнер из связывающейся пары белок:белок содержит первого партнера и необязательно второго партнера из связывающейся пары белок:белок, которая образует ковалентную связь. В некоторых вариантах осуществления связывающаяся пара белок:белок выбрана из группы, состоящей из (a) SpyTag:SpyCatcher, (b) SpyTag:KTag, (с) Isopeptag:пилин С, (d) SnoopTag: SnoopCatcher и (e) SpyTag002:SpyCatcher002. В некоторых вариантах осуществления капсидный белок VP3 AAV животного, не являющегося приматом, может содержать (а) эпитоп B1 (SEQ ID NO:45), (b) SpyTag, (с) SpyCatcher или любую комбинацию (а)-(с).[0061] The VP1 capsid proteins of a non-primate animal virus of the present invention include VP1 capsid proteins of a non-primate animal virus (a) that encapsidate the genome of another, such as a second, AAV, and/or (b) that are mutated. In some embodiments, the VP1 capsid protein of a non-primate animal AAV of the present invention encapsidates the genome of another, such as a second, AAV. In some embodiments, the VP1 capsid protein of a non-primate animal virus of the present invention may be operably linked to a first partner of a protein:protein binding pair and/or comprise a point mutation, such as such that the natural tropism of the capsid protein is reduced to the point of being eliminated, and/or such that the capsid protein comprises a detectable label. In some embodiments, the first partner of the protein:protein binding pair comprises a detectable label. In some embodiments, the first partner of the protein:protein binding pair comprises a detectable label that provides c-myc (SEQ ID NO:44). In some embodiments, the first partner of the protein:protein binding pair comprises a first partner and optionally a second partner of the protein:protein binding pair that forms a covalent bond. In some embodiments, the protein:protein binding pair is selected from the group consisting of (a) SpyTag:SpyCatcher, (b) SpyTag:KTag, (c) Isopeptag:pilin C, (d) SnoopTag:SnoopCatcher, and (e) SpyTag002:SpyCatcher002. In some embodiments, the VP3 capsid protein of a non-primate AAV may comprise (a) epitope B1 (SEQ ID NO:45), (b) SpyTag, (c) SpyCatcher, or any combination of (a)-(c).
[0062] В некоторых вариантах осуществления первый партнер из связывающейся пары белок:белок функционально связан с капсидом VP1 AAV животного, не являющегося приматом, по настоящему изобретению по аминокислотному положению, находящемуся в вариабельной области (VR) или ее части капсидного белка VP1, где необязательно первый партнер из связывающейся пары белок:белок связан с капсидом VP1 с помощью первого и/или второго линкера. В некоторых вариантах осуществления первый партнер из связывающейся пары белок:белок функционально связан с капсидом VP1 AAV животного, не являющегося приматом, по аминокислотному положению, находящемуся в VR I, VR II, VR III, VR IV, VR V, VR VI, VR VII, VR VIII, VR IX или петле HI капсидного белка VP1, где необязательно первый партнер из связывающейся пары белок:белок связан с капсидом VP1 с помощью первого и/или второго линкера. В некоторых вариантах осуществления первый партнер из связывающейся пары белок:белок функционально связан с капсидом VP1 AAV животного, не являющегося приматом, по аминокислотному положению, находящемуся в VR VIII или VR IV капсидного белка VP1, где необязательно первый партнер из связывающейся пары белок:белок связан с капсидом VP1 с помощью первого и/или второго линкера. В некоторых вариантах осуществления капсидный белок VP1 AAV животного, не являющегося приматом, представляет собой капсидный белок VP1 AAV животного, не являющегося приматом, выбранного из группы AAV животных, не являющихся приматом, приведенной в таблице 1. В некоторых вариантах осуществления капсидный белок VP1 AAV животного, не являющегося приматом, представляет собой капсидный белок VP1 птичьего AAV (AAAV). В некоторых вариантах осуществления капсидный белок VP1 AAAV содержит первого партнера из связывающейся пары белок:белок (например, SpyTag), функционально связанного, необязательно с помощью первого или второго линкера, по положению I444 или I580. В некоторых вариантах осуществления капсидный белок VP1 AAV животного, не являющегося приматом, представляет собой капсидный белок VP31 AAV бородатой агамы. В некоторых вариантах осуществления капсидный белок VP1 AAV бородатой агамы содержит первого партнера из связывающейся пары белок:белок (например, SpyTag), функционально связанного, необязательно с помощью первого или второго линкера, по положению I573 или I436. В некоторых вариантах осуществления капсидный белок VP1 AAV животного, не являющегося приматом, представляет собой капсидный белок VP1 AAV морского льва. В некоторых вариантах осуществления капсидный белок VP1 AAV морского льва содержит первого партнера из связывающейся пары белок:белок (например, SpyTag), функционально связанного, необязательно с помощью первого или второго линкера, по положению, выбранному из группы, состоящей из I429, I430, I431, I432, I433, I434, I436, I437 и I565, необязательно по положению, выбранному из группы, состоящей из I429, I430, I431, I432,I433, I436 и I437; необязательно по I431.[0062] In some embodiments, the first partner of the protein:protein binding pair is operably linked to the VP1 capsid of the non-primate AAV of the present invention at an amino acid position located within the variable region (VR) or a portion thereof of the VP1 capsid protein, wherein optionally the first partner of the protein:protein binding pair is linked to the VP1 capsid via a first and/or second linker. In some embodiments, the first partner of the protein:protein binding pair is operably linked to the VP1 capsid of the non-primate AAV at an amino acid position located within VR I, VR II, VR III, VR IV, VR V, VR VI, VR VII, VR VIII, VR IX, or the HI loop of the VP1 capsid protein, wherein optionally the first partner of the protein:protein binding pair is linked to the VP1 capsid via a first and/or second linker. In some embodiments, the first partner of the protein:protein binding pair is operably linked to the VP1 capsid of the non-primate AAV at an amino acid position located within VR VIII or VR IV of the VP1 capsid protein, wherein optionally the first partner of the protein:protein binding pair is linked to the VP1 capsid via a first and/or second linker. In some embodiments, the VP1 capsid protein of the non-primate AAV is a VP1 capsid protein of a non-primate AAV selected from the group of non-primate AAVs listed in Table 1. In some embodiments, the VP1 capsid protein of the non-primate AAV is an avian AAV (AAAV) VP1 capsid protein. In some embodiments, the AAAV VP1 capsid protein comprises a first partner of a protein:protein binding pair (e.g., SpyTag) operably linked, optionally via a first or second linker, at position I444 or I580. In some embodiments, the VP1 capsid protein of a non-primate animal AAV is a bearded dragon AAV VP31 capsid protein. In some embodiments, the bearded dragon AAV VP1 capsid protein comprises a first partner of a protein:protein binding pair (e.g., SpyTag) operably linked, optionally via a first or second linker, at position I573 or I436. In some embodiments, the VP1 capsid protein of a non-primate animal AAV is a sea lion AAV VP1 capsid protein. In some embodiments, the sea lion AAV VP1 capsid protein comprises a first partner of a protein:protein binding pair (e.g., SpyTag) operably linked, optionally via a first or second linker, at a position selected from the group consisting of I429, I430, I431, I432, I433, I434, I436, I437, and I565, optionally at a position selected from the group consisting of I429, I430, I431, I432, I433, I436, and I437; optionally at I431.
[0063] В некоторых других вариантах осуществления капсидный белок VP1 по настоящему изобретению может представлять собой химерный капсидный белок VP1, который содержит в функциональной связи часть капсидного белка VP1 AAV животного, не являющегося приматом, и часть капсидного белка VP1 другого AAV, где другой AAV не представляет собой AAV животного, не являющегося приматом. В некоторых вариантах осуществления химерный капсидный белок VP1 содержит от N-конца к С-концу: (а) часть капсидного белка VP1 другого AAV, которая содержит по меньшей мере домен PLA2 другого AAV, и (b) часть капсида VP1 AAV животного, не являющегося приматом, которая содержит по меньшей мере аминокислотную последовательность капсидного белка VP3 AAV животного, не являющегося приматом. В некоторых вариантах осуществления химерный капсидный белок VP1 содержит от N-конца к С-концу: (а) часть капсидного белка VP1 другого AAV, которая содержит по меньшей мере домен VP1-u другого AAV, и (b) часть капсида VP1 AAV животного, не являющегося приматом, которая содержит по меньшей мере аминокислотную последовательность капсидного белка VP3 AAV животного, не являющегося приматом. В некоторых вариантах осуществления химерный капсидный белок VP1 содержит от N-конца к С-концу: (а) аминокислотную последовательность домена VP1-u и общую область VP1/VP2 другого, например второго, AAV и (b) аминокислотную последовательность капсидного белка VP3 AAV животного, не являющегося приматом. В некоторых вариантах осуществления другой AAV представляет собой AAV животного, не являющегося приматом. В некоторых других вариантах осуществления другой AAV представляет собой AAV примата.[0063] In some other embodiments, the VP1 capsid protein of the present invention may be a chimeric VP1 capsid protein that comprises, in operative association, a portion of a VP1 capsid protein of an AAV of a non-primate animal and a portion of a VP1 capsid protein of another AAV, wherein the other AAV is not an AAV of a non-primate animal. In some embodiments, the chimeric VP1 capsid protein comprises, from N-terminus to C-terminus: (a) a portion of a VP1 capsid protein of another AAV that comprises at least a PLA2 domain of the other AAV, and (b) a portion of a VP1 capsid of an AAV of a non-primate animal that comprises at least the amino acid sequence of a VP3 capsid protein of a non-primate animal. In some embodiments, the chimeric VP1 capsid protein comprises, from N-terminus to C-terminus: (a) a portion of a VP1 capsid protein of another AAV that comprises at least a VP1-u domain of the other AAV, and (b) a portion of a VP1 capsid protein of a non-primate AAV that comprises at least the amino acid sequence of a VP3 capsid protein of the non-primate AAV. In some embodiments, the chimeric VP1 capsid protein comprises, from N-terminus to C-terminus: (a) the amino acid sequence of the VP1-u domain and the VP1/VP2 common region of another, such as a second, AAV, and (b) the amino acid sequence of a VP3 capsid protein of a non-primate AAV. In some embodiments, the other AAV is a non-primate AAV. In some other embodiments, the other AAV is a primate AAV.
[0064] В некоторых вариантах осуществления химерный капсидный белок VP1 содержит от N-конца к С-концу: (а) часть капсидного белка VP1 AAV примата, которая содержит по меньшей мере домен PLA2 AAV примата, и (b) часть капсида VP1 AAV животного, не являющегося приматом, которая содержит по меньшей мере аминокислотную последовательность капсидного белка VP3 AAV животного, не являющегося приматом. В некоторых вариантах осуществления химерный капсидный белок VP1 содержит от N-конца к С-концу: (а) часть капсидного белка VP1 AAV примата, которая содержит по меньшей мере домен VP1-u AAV примата, и (b) часть капсида VP1 AAV животного, не являющегося приматом, которая содержит по меньшей мере аминокислотную последовательность капсидного белка VP3 AAV животного, не являющегося приматом. В некоторых вариантах осуществления химерный капсидный белок VP1 содержит от N-конца к С-концу: (а) аминокислотную последовательность домена VP1-u и общую область VP1/VP2 AAV примата и (b) аминокислотную последовательность капсидного белка VP3 AAV животного, не являющегося приматом. В некоторых вариантах осуществления AAV примата представляет собой AAV1. В некоторых вариантах осуществления AAV примата представляет собой AAV2. В некоторых вариантах осуществления AAV примата представляет собой AAV3. В некоторых вариантах осуществления AAV примата представляет собой AAV4. В некоторых вариантах осуществления AAV примата представляет собой AAV5. В некоторых вариантах осуществления AAV примата представляет собой AAV6. В некоторых вариантах осуществления AAV примата представляет собой AAV7. В некоторых вариантах осуществления AAV примата представляет собой AAV8. В некоторых вариантах осуществления AAV примата представляет собой AAV9. В некоторых вариантах осуществления AAV животного, не являющегося приматом, выбран из группы AAV животных, не являющихся приматом, представленных в таблице 1. В некоторых вариантах осуществления AAV животного, не являющегося приматом, представляет собой птичий AAV, AAV бородатой агамы или AAV морского льва.[0064] In some embodiments, the chimeric VP1 capsid protein comprises, from N-terminus to C-terminus: (a) a portion of a primate AAV VP1 capsid protein that comprises at least a primate AAV PLA2 domain, and (b) a portion of a non-primate AAV VP1 capsid that comprises at least the amino acid sequence of a non-primate AAV VP3 capsid protein. In some embodiments, the chimeric VP1 capsid protein comprises, from N-terminus to C-terminus: (a) a portion of a primate AAV VP1 capsid protein that comprises at least a primate AAV VP1-u domain, and (b) a portion of a non-primate AAV VP1 capsid that comprises at least the amino acid sequence of a non-primate AAV VP3 capsid protein. In some embodiments, the chimeric VP1 capsid protein comprises, from N-terminus to C-terminus: (a) the amino acid sequence of the VP1-u domain and VP1/VP2 common region of a primate AAV and (b) the amino acid sequence of the VP3 capsid protein of a non-primate AAV. In some embodiments, the primate AAV is AAV1. In some embodiments, the primate AAV is AAV2. In some embodiments, the primate AAV is AAV3. In some embodiments, the primate AAV is AAV4. In some embodiments, the primate AAV is AAV5. In some embodiments, the primate AAV is AAV6. In some embodiments, the primate AAV is AAV7. In some embodiments, the primate AAV is AAV8. In some embodiments, the primate AAV is AAV9. In some embodiments, the non-primate AAV is selected from the group of non-primate AAVs presented in Table 1. In some embodiments, the non-primate AAV is an avian AAV, a bearded dragon AAV, or a sea lion AAV.
[0065] В некоторых вариантах осуществления химерный капсидный белок VP1 содержит от N-конца к С-концу: (а) часть капсидного белка VP1 AAV2, которая содержит по меньшей мере домен PLA2 AAV2, и (b) часть капсида VP1 AAV животного, не являющегося приматом, которая содержит по меньшей мере аминокислотную последовательность капсидного белка VP3 AAV животного, не являющегося приматом. В некоторых вариантах осуществления химерный капсидный белок VP1 содержит от N-конца к С-концу: (а) часть капсидного белка VP1 AAV2, которая содержит по меньшей мере домен VP1-u AAV2, и (b) часть капсида VP1 AAV животного, не являющегося приматом, которая содержит по меньшей мере аминокислотную последовательность капсидного белка VP3 AAV животного, не являющегося приматом. В некоторых вариантах осуществления химерный капсидный белок VP1 содержит от N-конца к С-концу: (а) аминокислотную последовательность домена VP1-u и общую область VP1/VP2 AAV2 и (b) аминокислотную последовательность капсидного белка VP3 AAV животного, не являющегося приматом.[0065] In some embodiments, the chimeric VP1 capsid protein comprises, from N-terminus to C-terminus: (a) a portion of an AAV2 VP1 capsid protein that comprises at least the PLA 2 domain of AAV2, and (b) a portion of an AAV VP1 capsid of a non-primate animal that comprises at least the amino acid sequence of an AAV VP3 capsid protein of a non-primate animal. In some embodiments, the chimeric VP1 capsid protein comprises, from N-terminus to C-terminus: (a) a portion of an AAV2 VP1 capsid protein that comprises at least the VP1-u domain of AAV2, and (b) a portion of an AAV VP1 capsid of a non-primate animal that comprises at least the amino acid sequence of an AAV VP3 capsid protein of a non-primate animal. In some embodiments, the chimeric VP1 capsid protein comprises, from N-terminus to C-terminus: (a) the amino acid sequence of the VP1-u domain and VP1/VP2 common region of AAV2 and (b) the amino acid sequence of the VP3 capsid protein of an AAV of a non-primate animal.
[0066] В некоторых вариантах осуществления химерный капсидный белок VP1 AAV2/AAAV содержит от N-конца к С-концу: (а) часть капсидного белка VP1 AAV2, которая содержит по меньшей мере домен PLA2 AAV2, и (b) часть капсида VP1 птичьего AAV (AAAV), которая содержит по меньшей мере аминокислотную последовательность капсидного белка VP3 AAAV. В некоторых вариантах осуществления химерный капсидный белок VP1 AAV2/AAAV содержит от N-конца к С-концу: (а) часть капсидного белка VP1 AAV2, которая содержит по меньшей мере домен VP1-u AAV2, и (b) часть капсида VP1 AAAV, которая содержит по меньшей мере аминокислотную последовательность капсидного белка VP3 AAAV. В некоторых вариантах осуществления химерный капсидный белок VP1 AAV2/AAAV содержит от N-конца к С-концу: (а) аминокислотную последовательность домена VP1-u и общую область VP1/VP2 AAV2 и (b) аминокислотную последовательность капсидного белка VP3 AAAV. В некоторых вариантах осуществления химерный капсидный белок VP 1 AAV2/AAAV содержит аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO:2.[0066] In some embodiments, the AAV2/AAAV chimeric capsid protein VP1 comprises, from N-terminus to C-terminus: (a) a portion of an AAV2 VP1 capsid protein that comprises at least the PLA 2 domain of AAV2, and (b) a portion of an avian AAV (AAAV) VP1 capsid that comprises at least the amino acid sequence of an AAAV VP3 capsid protein. In some embodiments, the AAV2/AAAV chimeric capsid protein VP1 comprises, from N-terminus to C-terminus: (a) a portion of an AAV2 VP1 capsid protein that comprises at least the VP1-u domain of AAV2, and (b) a portion of an AAAV VP1 capsid that comprises at least the amino acid sequence of an AAAV VP3 capsid protein. In some embodiments, the AAV2/AAAV chimeric capsid protein VP1 comprises, from N-terminus to C-terminus: (a) the amino acid sequence of the VP1-u domain and VP1/VP2 common region of AAV2 and (b) the amino acid sequence of the VP3 capsid protein of AAAV. In some embodiments, the AAV2/AAAV chimeric capsid protein VP1 comprises the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO:2.
[0067] В некоторых вариантах осуществления химерный капсидный белок VP1 AAV2/вируса морского льва содержит от N-конца к С-концу: (а) часть капсидного белка VP1 AAV2, которая содержит по меньшей мере домен PLA2 AAV2, и (b) часть капсида VP1 AAV морского льва, которая содержит по меньшей мере аминокислотную последовательность капсидного белка VP3 вируса морского льва. В некоторых вариантах осуществления химерный капсидный белок VP1 AAV2/вируса морского льва содержит от N-конца к С-концу: (а) часть капсидного белка VP1 AAV2, которая содержит по меньшей мере домен VP1-u AAV2, и (b) часть капсида VP1 вируса морского льва, которая содержит по меньшей мере аминокислотную последовательность капсидного белка VP3 вируса морского льва. В некоторых вариантах осуществления химерный капсидный белок VP1 AAV2/вируса морского льва содержит от N-конца к С-концу: (а) аминокислотную последовательность домена VP1-u и общую область VP1/VP2 AAV2 и (b) аминокислотную последовательность капсидного белка VP3 вируса морского льва. В некоторых вариантах осуществления химерный капсидный белок VP1 AAV2/вируса морского льва содержит аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO:4.[0067] In some embodiments, the AAV2/sea lion virus chimeric capsid protein VP1 comprises, from N-terminus to C-terminus: (a) a portion of an AAV2 VP1 capsid protein that comprises at least an AAV2 PLA 2 domain, and (b) a portion of a sea lion AAV VP1 capsid that comprises at least an amino acid sequence of a sea lion virus VP3 capsid protein. In some embodiments, the AAV2/sea lion virus chimeric capsid protein VP1 comprises, from N-terminus to C-terminus: (a) a portion of an AAV2 VP1 capsid protein that comprises at least an AAV2 VP1-u domain, and (b) a portion of a sea lion virus VP1 capsid that comprises at least an amino acid sequence of a sea lion virus VP3 capsid protein. In some embodiments, the AAV2/sea lion virus chimeric capsid protein VP1 comprises, from N-terminus to C-terminus: (a) the amino acid sequence of the VP1-u domain and VP1/VP2 common region of AAV2 and (b) the amino acid sequence of the VP3 capsid protein of sea lion virus. In some embodiments, the AAV2/sea lion virus chimeric capsid protein VP1 comprises the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO:4.
[0068] В некоторых вариантах осуществления химерный капсидный белок VP1 AAV2/вируса бородатой агамы содержит от N-конца к С-концу: (а) часть капсидного белка VP1 AAV2, которая содержит по меньшей мере домен PLA2 AAV2, и (b) часть капсида VP1 вируса бородатой агамы, которая содержит по меньшей мере аминокислотную последовательность капсидного белка VP3 вируса бородатой агамы. В некоторых вариантах осуществления химерный капсидный белок VP1 AAV2/вируса бородатой агамы содержит от N-конца к С-концу: (а) часть капсидного белка VP1 AAV2, которая содержит по меньшей мере домен VP1-u AAV2, и (b) часть капсида VP1 вируса бородатой агамы, которая содержит по меньшей мере аминокислотную последовательность капсидного белка VP3 вируса бородатой агамы. В некоторых вариантах осуществления химерный капсидный белок VP1 AAV2/вируса бородатой агамы содержит от N-конца к С-концу: (а) аминокислотную последовательность домена VP1-u и общую область VP1/VP2 AAV2 и (b) аминокислотную последовательность капсидного белка VP3 вируса бородатой агамы. В некоторых вариантах осуществления химерный капсидный белок VP1 AAV2/вируса бородатой агамы содержит аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO:6.[0068] In some embodiments, the AAV2/bearded dragon virus chimeric capsid protein VP1 comprises, from N-terminus to C-terminus: (a) a portion of an AAV2 VP1 capsid protein that comprises at least the PLA 2 domain of AAV2, and (b) a portion of a bearded dragon virus VP1 capsid that comprises at least the amino acid sequence of a bearded dragon virus VP3 capsid protein. In some embodiments, the AAV2/bearded dragon virus chimeric capsid protein VP1 comprises, from N-terminus to C-terminus: (a) a portion of an AAV2 VP1 capsid protein that comprises at least the VP1-u domain of AAV2, and (b) a portion of a bearded dragon virus VP1 capsid that comprises at least the amino acid sequence of a bearded dragon virus VP3 capsid protein. In some embodiments, the AAV2/bearded dragon virus chimeric capsid protein VP1 comprises, from N-terminus to C-terminus: (a) the amino acid sequence of the VP1-u domain and VP1/VP2 common region of AAV2 and (b) the amino acid sequence of the VP3 capsid protein of bearded dragon virus. In some embodiments, the AAV2/bearded dragon virus chimeric capsid protein VP1 comprises the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO:6.
[0069] В некоторых вариантах осуществления химерный капсидный белок VP1 может быть функционально связан с первым партнером из связывающейся пары белок:белок и/или содержит точечную мутацию, например такую, что естественный тропизм капсидного белка снижен вплоть до устранения, и/или такую, что капсидный белок содержит детектируемую метку. В некоторых вариантах осуществления первый партнер из связывающейся пары белок:белок содержит детектируемую метку. В некоторых вариантах осуществления первый партнер из связывающейся пары белок:белок содержит детектируемую метку, которая предусматривает c-myc (SEQ ID NO:44). В некоторых вариантах осуществления первый партнер из связывающейся пары белок:белок содержит первого партнера и необязательно второго партнера из связывающейся пары белок:белок, которая образует ковалентную связь. В некоторых вариантах осуществления связывающаяся пара белок:белок выбрана из группы, состоящей из (a) SpyTag:SpyCatcher, (b) SpyTag:KTag, (с) Isopeptag:пилин С, (d) SnoopTag: SnoopCatcher и (e) SpyTag002:SpyCatcher002. В некоторых вариантах осуществления химерный капсидный белок VP1 может содержать (а) эпитоп B1 (SEQ ID NO:45), (b) SpyTag, (с) SpyCatcher и любую комбинацию (а)-(с).[0069] In some embodiments, the chimeric VP1 capsid protein may be operably linked to a first partner of a protein:protein binding pair and/or comprise a point mutation, such as such that the natural tropism of the capsid protein is reduced to the point of being eliminated, and/or such that the capsid protein comprises a detectable label. In some embodiments, the first partner of the protein:protein binding pair comprises a detectable label. In some embodiments, the first partner of the protein:protein binding pair comprises a detectable label that provides c-myc (SEQ ID NO:44). In some embodiments, the first partner of the protein:protein binding pair comprises a first partner and, optionally, a second partner of the protein:protein binding pair that forms a covalent bond. In some embodiments, the protein:protein binding pair is selected from the group consisting of (a) SpyTag:SpyCatcher, (b) SpyTag:KTag, (c) Isopeptag:pilin C, (d) SnoopTag:SnoopCatcher, and (e) SpyTag002:SpyCatcher002. In some embodiments, the chimeric VP1 capsid protein may comprise (a) epitope B1 (SEQ ID NO:45), (b) SpyTag, (c) SpyCatcher, and any combination of (a)-(c).
[0070] В некоторых вариантах осуществления химерный капсидный белок VP1 вируса примата/животного, не являющегося приматом (например, химерный капсидный белок VP1 AAV2/AAAV, химерный капсидный белок VP1 AAV2/AAV морского льва, химерный капсидный белок VP1 AAV2/AAV бородатой агамы и т.д.) содержит первого партнера из связывающейся пары белок:белок, функционально связанного с ним, необязательно с помощью первого или второго линкера. В некоторых вариантах осуществления первый партнер из связывающейся пары белок:белок функционально связан с химерным капсидным белком VP1 вируса примата/животного, не являющегося приматом, (например, химерным капсидным белком VP1 AAV2/AAAV, химерным капсидным белком VP1 AAV2/AAV морского льва, химерным капсидным белком VP1 AAV2/AAV бородатой агамы и т.д.) по аминокислотному положению, находящемуся в вариабельной области (VR) или ее части химерного капсидного белка VP1 вируса примата/животного, не являющегося приматом, где необязательно первый партнер из связывающейся пары белок:белок связан с химерным капсидным белком VP1 вируса примата/животного, не являющегося приматом, с помощью первого и/или второго линкера. В некоторых вариантах осуществления первый партнер из связывающейся пары белок:белок функционально связан с капсидом VP1 из химерного капсидного белка VP1 вируса примата/вируса животного, не являющегося приматом, по аминокислотному положению, находящемуся в VR I, VR II, VR III, VR IV, VR V, VR VI, VR VII, VR VIII, VR IX или петле HI химерного капсидного белка VP1 вируса примата/вируса животного, не являющегося приматом, где необязательно первый партнер из связывающейся пары белок:белок связан с химерным капсидным белком VP1 вируса примата/вируса животного, не являющегося приматом, с помощью первого и/или второго линкера. В некоторых вариантах осуществления первый партнер из связывающейся пары белок:белок функционально связан с химерным капсидным белком VP1 вируса примата/животного, не являющегося приматом, (например, химерным капсидным белком VP1 AAV2/AAAV, химерным капсидным белком VP1 AAV2/AAV морского льва, химерным капсидным белком VP1 AAV2/AAV бородатой агамы и т.д.) по аминокислотному положению, находящемуся в VR VIII или VR IV химерного капсидного белка VP1 вируса примата/животного, не являющегося приматом, где необязательно первый партнер из связывающейся пары белок:белок связан с химерным капсидным белком VP1 вируса примата/животного, не являющегося приматом, с помощью первого и/или второго линкера.[0070] In some embodiments, a chimeric primate/non-primate virus VP1 capsid protein (e.g., an AAV2/AAAV chimeric VP1 capsid protein, a sea lion AAV2/AAV chimeric VP1 capsid protein, a bearded dragon AAV2/AAV chimeric VP1 capsid protein, etc.) comprises a first partner of a protein:protein binding pair operably linked thereto, optionally via a first or second linker. In some embodiments, the first partner of the protein:protein binding pair is operably linked to a primate/non-primate virus chimeric capsid protein VP1 (e.g., an AAV2/AAAV chimeric capsid protein VP1, a sea lion AAV2/AAV chimeric capsid protein VP1, a bearded dragon AAV2/AAV chimeric capsid protein VP1, etc.) at an amino acid position located within the variable region (VR) or a portion thereof of the primate/non-primate virus chimeric capsid protein VP1, wherein optionally the first partner of the protein:protein binding pair is linked to the primate/non-primate virus chimeric capsid protein VP1 via a first and/or second linker. In some embodiments, the first partner of the protein:protein binding pair is operably linked to the VP1 capsid of the chimeric primate/non-primate animal virus VP1 capsid protein at an amino acid position located within VR I, VR II, VR III, VR IV, VR V, VR VI, VR VII, VR VIII, VR IX, or the HI loop of the chimeric primate/non-primate animal virus VP1 capsid protein, wherein optionally the first partner of the protein:protein binding pair is linked to the chimeric primate/non-primate animal virus VP1 capsid protein via a first and/or second linker. In some embodiments, the first partner of the protein:protein binding pair is operably linked to a primate/non-primate virus chimeric capsid protein VP1 (e.g., an AAV2/AAAV chimeric capsid protein VP1, a sea lion AAV2/AAV chimeric capsid protein VP1, a bearded dragon AAV2/AAV chimeric capsid protein VP1, etc.) at an amino acid position located within VR VIII or VR IV of the primate/non-primate virus chimeric capsid protein VP1, wherein optionally the first partner of the protein:protein binding pair is linked to the primate/non-primate virus chimeric capsid protein VP1 via a first and/or second linker.
[0071] В некоторых вариантах осуществления химерный капсидный белок VP1 AAV2/ AAAV содержит первого партнера из связывающейся пары белок:белок, функционально связанного, необязательно с помощью первого или второго линкера, по положению I444 или I580. В некоторых вариантах осуществления химерный капсидный белок VP1 AAV2/AAAV содержит SpyTag, функционально связанного, необязательно с помощью первого или второго линкера, по положению I444. В некоторых вариантах осуществления химерный капсидный белок VP1 AAV2/AAAV содержит аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO:8. В некоторых вариантах осуществления химерный капсидный белок VP1 AAV2/AAAV содержит SpyTag, функционально связанного, необязательно с помощью первого или второго линкера, по положению I580. В некоторых вариантах осуществления химерный капсидный белок VP1 AAV2/AAAV содержит аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO:10.[0071] In some embodiments, the AAV2/AAAV chimeric VP1 capsid protein comprises a first partner of a protein:protein binding pair operably linked, optionally by a first or second linker, at position I444 or I580. In some embodiments, the AAV2/AAAV chimeric VP1 capsid protein comprises a SpyTag operably linked, optionally by a first or second linker, at position I444. In some embodiments, the AAV2/AAAV chimeric VP1 capsid protein comprises the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO:8. In some embodiments, the AAV2/AAAV chimeric VP1 capsid protein comprises a SpyTag operably linked, optionally by a first or second linker, at position I580. In some embodiments, the AAV2/AAAV chimeric capsid protein VP1 comprises the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO:10.
[0072] В некоторых вариантах осуществления химерный капсидный белок VP1 AAV2/AAV морского льва содержит первого партнера из связывающейся пары белок:белок, функционально связанного, необязательно с помощью первого или второго линкера, по положению, выбранному из группы, состоящей из I429, I430, I431, I432, I433, I434, I436, I437 и I565, необязательно по положению, выбранному из группы, состоящей из I429, I430, I431, I432, I433, I436 и I437; необязательно по I432. В некоторых вариантах осуществления химерный капсидный белок VP1 AAV2/AAV морского льва содержит SpyTag, функционально связанного, необязательно с помощью первой и второй линкерной последовательности, по положению I432. В некоторых вариантах осуществления химерный капсидный белок VP1 AAV2/AAV морского льва содержит аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO:12. В некоторых вариантах осуществления химерный капсидный белок VP1 AAV2/AAV морского льва содержит SpyTag, функционально связанного, необязательно с помощью первой и второй линкерной последовательности, по положению I565. В некоторых вариантах осуществления химерный капсидный белок VP1 AAV2/AAV морского льва содержит аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO:I4. В некоторых вариантах осуществления химерный капсидный белок VP1 AAV2/AAV морского льва содержит SpyTag, функционально связанного, необязательно с помощью первой и второй линкерной последовательности, по положению I429. В некоторых вариантах осуществления химерный капсидный белок VP1 AAV2/AAV морского льва содержит аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO:16. В некоторых вариантах осуществления химерный капсидный белок VP1 AAV2/AAV морского льва содержит SpyTag, функционально связанного, необязательно с помощью первой и второй линкерной последовательности, по положению I430. В некоторых вариантах осуществления химерный капсидный белок VP1 AAV2/AAV морского льва содержит аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO:18. В некоторых вариантах осуществления химерный капсидный белок VP1 AAV2/AAV морского льва содержит SpyTag, функционально связанного, необязательно с помощью первой и второй линкерной последовательности, по положению I431. В некоторых вариантах осуществления химерный капсидный белок VP1 AAV2/AAV морского льва содержит аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO:20. В некоторых вариантах осуществления химерный капсидный белок VP1 AAV2/AAV морского льва содержит SpyTag, функционально связанного, необязательно с помощью первой и второй линкерной последовательности, по положению I433. В некоторых вариантах осуществления химерный капсидный белок VP1 AAV2/AAV морского льва содержит аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO:22. В некоторых вариантах осуществления химерный капсидный белок VP1 AAV2/AAV морского льва содержит SpyTag, функционально связанного, необязательно с помощью первой и второй линкерной последовательности, по положению I434. В некоторых вариантах осуществления химерный капсидный белок VP1 AAV2/AAV морского льва содержит аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO:24. В некоторых вариантах осуществления химерный капсидный белок VP1 AAV2/AAV морского льва содержит SpyTag, функционально связанного, необязательно с помощью первой и второй линкерной последовательности, по положению I435. В некоторых вариантах осуществления химерный капсидный белок VP1 AAV2/AAV морского льва содержит аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO:26. В некоторых вариантах осуществления химерный капсидный белок VP1 AAV2/AAV морского льва содержит SpyTag, функционально связанного, необязательно с помощью первой и второй линкерной последовательности, по положению I436. В некоторых вариантах осуществления химерный капсидный белок VP1 AAV2/AAV морского льва содержит аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO:28. В некоторых вариантах осуществления химерный капсидный белок VP1 AAV2/AAV морского льва содержит SpyTag, функционально связанного, необязательно с помощью первой и второй линкерной последовательности, по положению I437. В некоторых вариантах осуществления химерный капсидный белок VP1 AAV2/AAV морского льва содержит аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO:30. В некоторых вариантах осуществления химерный капсидный белок VP1 AAV2/AAV морского льва содержит SpyTag, функционально связанного, необязательно с помощью первой и второй линкерной последовательности, по положению I432. В некоторых вариантах осуществления химерный капсидный белок VP1 AAV2/AAV морского льва содержит аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO:32. В некоторых вариантах осуществления химерный капсидный белок VP1 AAV2/AAV морского льва содержит аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO:53. В некоторых вариантах осуществления химерный капсидный белок VP1 AAV2/AAV морского льва содержит аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO:55. В некоторых вариантах осуществления химерный капсидный белок VP1 AAV2/AAV морского льва содержит аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO:57. В некоторых вариантах осуществления химерный капсидный белок VP1 AAV2/AAV морского льва содержит аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO:59. В некоторых вариантах осуществления химерный капсидный белок VP1 AAV2/AAV морского льва содержит аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO:61. В некоторых вариантах осуществления химерный капсидный белок VP1 AAV2/AAV морского льва содержит аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO:63. В некоторых вариантах осуществления химерный капсидный белок VP1 AAV2/AAV морского льва содержит аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO:65. В некоторых вариантах осуществления химерный капсидный белок VP1 AAV2/AAV морского льва содержит аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO:67. В некоторых вариантах осуществления химерный капсидный белок VP1 AAV2/AAV морского льва содержит аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO:69. В некоторых вариантах осуществления химерный капсидный белок VP1 AAV2/AAV морского льва содержит аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO:71.[0072] In some embodiments, the AAV2/sea lion AAV chimeric VP1 capsid protein comprises a first partner of a protein:protein binding pair operably linked, optionally by a first or second linker, at a position selected from the group consisting of I429, I430, I431, I432, I433, I434, I436, I437, and I565, optionally at a position selected from the group consisting of I429, I430, I431, I432, I433, I436, and I437; optionally at I432. In some embodiments, the AAV2/sea lion AAV chimeric VP1 capsid protein comprises a SpyTag operably linked, optionally by a first and second linker sequence, at position I432. In some embodiments, the AAV2/sea lion chimeric VP1 capsid protein comprises the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO:12. In some embodiments, the AAV2/sea lion chimeric VP1 capsid protein comprises a SpyTag operably linked, optionally via first and second linker sequences, at position I565. In some embodiments, the AAV2/sea lion chimeric VP1 capsid protein comprises the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO:I4. In some embodiments, the AAV2/sea lion chimeric VP1 capsid protein comprises a SpyTag operably linked, optionally via first and second linker sequences, at position I429. In some embodiments, the AAV2/sea lion chimeric VP1 capsid protein comprises the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO:16. In some embodiments, the sea lion AAV2/AAV chimeric capsid protein VP1 comprises a SpyTag operably linked, optionally via a first and second linker sequence, at position I430. In some embodiments, the sea lion AAV2/AAV chimeric capsid protein VP1 comprises the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO:18. In some embodiments, the sea lion AAV2/AAV chimeric capsid protein VP1 comprises a SpyTag operably linked, optionally via a first and second linker sequence, at position I431. In some embodiments, the sea lion AAV2/AAV chimeric capsid protein VP1 comprises the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO:20. In some embodiments, the sea lion AAV2/AAV chimeric capsid protein VP1 comprises a SpyTag operably linked, optionally via a first and second linker sequence, at position I433. In some embodiments, the sea lion AAV2/AAV chimeric capsid protein VP1 comprises the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO:22. In some embodiments, the sea lion AAV2/AAV chimeric capsid protein VP1 comprises a SpyTag operably linked, optionally via a first and second linker sequence, at position I434. In some embodiments, the sea lion AAV2/AAV chimeric capsid protein VP1 comprises the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO:24. In some embodiments, the AAV2/sea lion chimeric VP1 capsid protein comprises a SpyTag operably linked, optionally via a first and second linker sequence, at position I435. In some embodiments, the AAV2/sea lion chimeric VP1 capsid protein comprises the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO:26. In some embodiments, the AAV2/sea lion chimeric VP1 capsid protein comprises a SpyTag operably linked, optionally via a first and second linker sequence, at position I436. In some embodiments, the AAV2/sea lion chimeric VP1 capsid protein comprises the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO:28. In some embodiments, the sea lion AAV2/AAV chimeric capsid protein VP1 comprises a SpyTag operably linked, optionally via a first and second linker sequence, at position I437. In some embodiments, the sea lion AAV2/AAV chimeric capsid protein VP1 comprises an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO:30. In some embodiments, the sea lion AAV2/AAV chimeric capsid protein VP1 comprises a SpyTag operably linked, optionally via a first and second linker sequence, at position I432. In some embodiments, the sea lion AAV2/AAV chimeric capsid protein VP1 comprises an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO:32. In some embodiments, the sea lion AAV2/AAV chimeric capsid protein VP1 comprises an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO:53. In some embodiments, the sea lion AAV2/AAV chimeric capsid protein VP1 comprises the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO:55. In some embodiments, the sea lion AAV2/AAV chimeric capsid protein VP1 comprises the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO:57. In some embodiments, the sea lion AAV2/AAV chimeric capsid protein VP1 comprises the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO:59. In some embodiments, the sea lion AAV2/AAV chimeric capsid protein VP1 comprises the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO:61. In some embodiments, the sea lion AAV2/AAV chimeric capsid protein VP1 comprises the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO:63. In some embodiments, the sea lion AAV2/AAV chimeric capsid protein VP1 comprises the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO:65. In some embodiments, the sea lion AAV2/AAV chimeric capsid protein VP1 comprises the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO:67. In some embodiments, the sea lion AAV2/AAV chimeric capsid protein VP1 comprises the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO:69. In some embodiments, the sea lion AAV2/AAV chimeric capsid protein VP1 comprises the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO:71.
[0073] В некоторых вариантах осуществления химерный капсидный белок VP1 AAV2/AAV бородатой агамы содержит первого партнера из связывающейся пары белок:белок, функционально связанного, необязательно с помощью первого и/или второго линкера, по положению I436 или I573. В некоторых вариантах осуществления химерный капсидный белок VP1 AAV2/AAV бородатой агамы содержит SpyTag, функционально связанного, необязательно с помощью первой и второй линкерной последовательности, по положению I436. В некоторых вариантах осуществления химерный капсидный белок VP1 AAV2/AAV бородатой агамы содержит аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO:34. В некоторых вариантах осуществления химерный капсидный белок VP1 AAV2/AAV бородатой агамы содержит SpyTag, функционально связанного, необязательно с помощью первой и второй линкерной последовательности, по положению I573. В некоторых вариантах осуществления химерный капсидный белок VP1 AAV2/AAV бородатой агамы содержит аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO:36.[0073] In some embodiments, the AAV2/bearded dragon AAV chimeric capsid protein VP1 comprises a first partner of a protein:protein binding pair operably linked, optionally via a first and/or second linker, at position I436 or I573. In some embodiments, the AAV2/bearded dragon AAV chimeric capsid protein VP1 comprises a SpyTag operably linked, optionally via a first and second linker sequence, at position I436. In some embodiments, the AAV2/bearded dragon AAV chimeric capsid protein VP1 comprises the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO:34. In some embodiments, the AAV2/bearded dragon AAV chimeric capsid protein VP1 comprises a SpyTag operably linked, optionally via a first and second linker sequence, at position I573. In some embodiments, the bearded dragon AAV2/AAV chimeric capsid protein VP1 comprises the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO:36.
[0074] В некоторых вариантах осуществления капсидный белок по настоящему изобретению дополнительно содержит первого партнера и второго партнера из связывающейся пары белок:белок, где необязательно второй партнер функционально связан с нацеливающим лигандом, где необязательно нацеливающий лиганд представляет собой связывающий фрагмент. В некоторых вариантах осуществления связывающий фрагмент представляет собой антитело или его часть. В некоторых вариантах осуществления антитело или его часть слиты со вторым партнером, например SpyCatcher. В некоторых вариантах осуществления антитело или его часть слиты на своем С-конце с линкером, необязательно линкером, содержащим последовательность, изложенную под SEQ ID NO:49 (GSGESG), и линкер слит со вторым партнером, например SpyCatcher, на С-конце линкера.[0074] In some embodiments, the capsid protein of the present invention further comprises a first partner and a second partner of a protein:protein binding pair, wherein optionally the second partner is operably linked to a targeting ligand, wherein optionally the targeting ligand is a binding moiety. In some embodiments, the binding moiety is an antibody or a portion thereof. In some embodiments, the antibody or portion thereof is fused to a second partner, such as SpyCatcher. In some embodiments, the antibody or portion thereof is fused at its C-terminus to a linker, optionally a linker comprising the sequence set forth in SEQ ID NO:49 (GSGESG), and the linker is fused to the second partner, such as SpyCatcher, at the C-terminus of the linker.
[0075] В некоторых вариантах осуществления капсидный белок по настоящему изобретению может содержать детектируемую метку, при этом детектируемая метка необязательно может выступать в качестве первого партнера из связывающейся пары белок:белок и/или для обнаружения и/или выделения капсидного белка. В некоторых вариантах осуществления детектируемая метка представляет собой с-myc. В некоторых вариантах осуществления детектируемая метка предусматривает эпитоп B1 AAV, например, аминокислотную последовательность IGTRYLTR (SEQ ID NO:45).[0075] In some embodiments, the capsid protein of the present invention may comprise a detectable label, wherein the detectable label may optionally serve as the first partner of a protein:protein binding pair and/or for detecting and/or isolating the capsid protein. In some embodiments, the detectable label is c-myc. In some embodiments, the detectable label provides an AAV B1 epitope, such as the amino acid sequence IGTRYLTR (SEQ ID NO:45).
[0076] Капсидный белок AAV по настоящему изобретению может содержать аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из (а) аминокислотной последовательности, изложенной под SEQ ID NO:2, (b) аминокислотной последовательности, изложенной под SEQ ID NO:4, (с) аминокислотной последовательности, изложенной под SEQ ID NO:6, (d) аминокислотной последовательности, изложенной под SEQ ID NO:8, (е) аминокислотной последовательности, изложенной под SEQ ID NO:10, (f) аминокислотной последовательности, изложенной под SEQ ID NO:12, (g) аминокислотной последовательности, изложенной под SEQ ID NO:I4, (h) аминокислотной последовательности, изложенной под SEQ ID NO:16, (i) аминокислотной последовательности, изложенной под SEQ ID NO:18, (j) аминокислотной последовательности, изложенной под SEQ ID NO:20, (к) аминокислотной последовательности, изложенной под SEQ ID NO:22, (1) аминокислотной последовательности, изложенной под SEQ ID NO:24, (m) аминокислотной последовательности, изложенной под SEQ ID NO:26, (n) аминокислотной последовательности, изложенной под SEQ ID NO:28, (о) аминокислотной последовательности, изложенной под SEQ ID NO:30, (р) аминокислотной последовательности, изложенной под SEQ ID NO:32, (q) аминокислотной последовательности, изложенной под SEQ ID NO:34, (г) аминокислотной последовательности, изложенной под SEQ ID NO:36, (s) аминокислотной последовательности, изложенной под SEQ ID NO:53, (t) аминокислотной последовательности, изложенной под SEQ ID NO:55, (u) аминокислотной последовательности, изложенной под SEQ ID NO:57, (v) аминокислотной последовательности, изложенной под SEQ ID NO:59, (w) аминокислотной последовательности, изложенной под SEQ ID NO:61, (х) аминокислотной последовательности, изложенной под SEQ ID NO:63, (у) аминокислотной последовательности, изложенной под SEQ ID NO:65, (z) аминокислотной последовательности, изложенной под SEQ ID NO:67, (аа) аминокислотной последовательности, изложенной под SEQ ID NO:69, (bb) аминокислотной последовательности, изложенной под SEQ ID NO:71, (сс) аминокислотной последовательности, характеризующейся значительной идентичностью последовательности, например по меньшей мере 95% идентичностью, с SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:I4, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:34,SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:57, SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:61, SEQ ID NO:63, SEQ ID NO:65, SEQ ID NO:67, SEQ ID NO:69 или SEQ ID NO:71, и (dd) аминокислотной последовательности любой из частей VP2 и/или VP3 из аминокислотных последовательностей, изложенных в любом из (а)-(сс).[0076] The AAV capsid protein of the present invention may comprise an amino acid sequence selected from the group consisting of (a) the amino acid sequence set forth as SEQ ID NO:2, (b) the amino acid sequence set forth as SEQ ID NO:4, (c) the amino acid sequence set forth as SEQ ID NO:6, (d) the amino acid sequence set forth as SEQ ID NO:8, (e) the amino acid sequence set forth as SEQ ID NO:10, (f) the amino acid sequence set forth as SEQ ID NO:12, (g) the amino acid sequence set forth as SEQ ID NO:14, (h) the amino acid sequence set forth as SEQ ID NO:16, (i) the amino acid sequence set forth as SEQ ID NO:18, (j) the amino acid sequence set forth as SEQ ID NO:20, (k) the amino acid sequence set forth as SEQ ID NO:22, (1) the amino acid sequence set forth as SEQ ID NO:24, (m) the amino acid sequence set forth as SEQ ID NO:26, (n) the amino acid sequence set forth as SEQ ID NO:28, (o) the amino acid sequence set forth as SEQ ID NO:30, (p) the amino acid sequence set forth as SEQ ID NO:32, (q) the amino acid sequence set forth as SEQ ID NO:34, (z) the amino acid sequence set forth as SEQ ID NO:36, (s) the amino acid sequence set forth as SEQ ID NO:53, (t) the amino acid sequence set forth as SEQ ID NO:55, (u) the amino acid sequence set forth as SEQ ID NO:57, (v) the amino acid sequence set forth as SEQ ID NO:59, (w) the amino acid sequence set forth as SEQ ID NO:61, (x) the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO:63, (y) the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO:65, (z) the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO:67, (aa) the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO:69, (bb) the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO:71, (cc) an amino acid sequence having substantial sequence identity, such as at least 95% identity, with SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:57, SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:61, SEQ ID NO:63, SEQ ID NO:65, SEQ ID NO:67, SEQ ID NO:69 or SEQ ID NO:71, and (dd) the amino acid sequence of any of the VP2 and/or VP3 portions of the amino acid sequences set forth in any of (a) to (cc).
[0077] В некоторых вариантах осуществления капсидный белок по настоящему изобретению кодируется молекулой нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению. В данном документе также предусмотрены молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие капсидные белки по настоящему изобретению.[0077] In some embodiments, a capsid protein of the present invention is encoded by a nucleic acid molecule of the present invention. Also provided herein are nucleic acid molecules encoding capsid proteins of the present invention.
[0078] В данном документе описаны молекулы нуклеиновой кислоты, содержащие ген cap AAV, который кодирует капсидный белок VP1 AAV, капсидный белок VP2 AAV и/или капсидный белок VP3 AAV, где ген cap AAV или его часть содержат последовательность нуклеиновой кислоты, характеризующуюся значительной идентичностью последовательности, например по меньшей мере 95% идентичностью, с последовательностью нуклеиновой кислоты гена cap AAV животного, не являющегося приматом, или его части, или отдаленного AAV или его части, и где ген cap AAV дополнительно модифицирован с включением (а) нуклеотидной последовательности, кодирующей первого партнера из связывающейся пары белок:белок, (b) нуклеотидной последовательности, кодирующей детектируемую метку, (с) точечной мутации, (d) химерной нуклеотидной последовательности или (е) любой комбинации (а), (b), (с) и (d). В некоторых вариантах осуществления молекулы нуклеиновой кислоты данная нуклеиновая кислота содержит ген rep AAV и ген cap AAV, где полный ген cap AAV содержит первую последовательность нуклеиновой кислоты, характеризующуюся значительной идентичностью последовательности, например по меньшей мере 95% идентичностью, с последовательностью нуклеиновой кислоты гена cap AAV животного, не являющегося приматом, или отдаленного AAV, и где ген rep AAV или его часть содержат вторую последовательность нуклеиновой кислоты, характеризующуюся значительной идентичностью последовательности, например по меньшей мере 95% идентичностью, с последовательностью нуклеиновой кислоты гена rep второго AAV или его части, где AAV животного, не являющегося приматом, не идентичен второму AAV. В некоторых вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению содержит ген cap AAV, который кодирует капсидный белок AAV, где ген cap AAV содержит нуклеотидную последовательность, идентичную или характеризующуюся значительной идентичностью последовательности, например по меньшей мере 95% идентичностью, с по меньшей мере частью нуклеотидной последовательности гена cap, выбранного из группы, состоящей из (i) гена cap AAV животного, не являющегося приматом, (ii) гена cap отдаленного AAV или (iii) их комбинации, где указанный ген cap AAV дополнительно модифицирован с включением (а) нуклеотидной последовательности, кодирующей первого партнера из связывающейся пары белок:белок, (b) нуклеотидной последовательности, кодирующей детектируемую метку, (с) точечной мутации, (d) химерной нуклеотидной последовательности, содержащей часть нуклеотидной последовательности гена cap другого, например второго, AAV, которая функционально связана с указанной нуклеотидной последовательностью гена cap AAV, выбранного из группы, состоящей из гена cap AAV животного, не являющегося приматом, отдаленного AAV или их комбинации, (е) любой комбинации (а), (b), (с) и (d).[0078] Disclosed herein are nucleic acid molecules comprising an AAV cap gene that encodes an AAV capsid protein VP1, an AAV capsid protein VP2, and/or an AAV capsid protein VP3, wherein the AAV cap gene or a portion thereof comprises a nucleic acid sequence having substantial sequence identity, such as at least 95% identity, to a nucleic acid sequence of a non-primate AAV cap gene or portion thereof, or a distant AAV or portion thereof, and wherein the AAV cap gene is further modified to include (a) a nucleotide sequence encoding a first partner of a protein:protein binding pair, (b) a nucleotide sequence encoding a detectable label, (c) a point mutation, (d) a chimeric nucleotide sequence, or (e) any combination of (a), (b), (c), and (d). In some embodiments of the nucleic acid molecule, the nucleic acid comprises an AAV rep gene and an AAV cap gene, wherein the complete AAV cap gene comprises a first nucleic acid sequence having significant sequence identity, such as at least 95% identity, with a nucleic acid sequence of an AAV cap gene of a non-primate animal or a distant AAV, and wherein the AAV rep gene or a portion thereof comprises a second nucleic acid sequence having significant sequence identity, such as at least 95% identity, with a nucleic acid sequence of a second AAV rep gene or a portion thereof, wherein the non-primate AAV is not identical to the second AAV. In some embodiments, a nucleic acid molecule of the present invention comprises an AAV cap gene that encodes an AAV capsid protein, wherein the AAV cap gene comprises a nucleotide sequence that is identical to or has substantial sequence identity, such as at least 95% identity, with at least a portion of the nucleotide sequence of a cap gene selected from the group consisting of (i) an AAV cap gene of a non-primate animal, (ii) a distant AAV cap gene, or (iii) a combination thereof, wherein said AAV cap gene is further modified to comprise (a) a nucleotide sequence encoding a first partner of a protein:protein binding pair, (b) a nucleotide sequence encoding a detectable label, (c) a point mutation, (d) a chimeric nucleotide sequence comprising a portion of the nucleotide sequence of a cap gene of another, such as a second, AAV that is operably linked to said nucleotide sequence of an AAV cap gene selected from the group consisting of the cap gene of a non-primate AAV, a distant AAV, or a combination thereof, (e) any combination of (a), (b), (c), and (d).
[0079] В некоторых вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению содержит ген cap AAV, который кодирует капсидный белок AAV, где ген cap AAV содержит нуклеотидную последовательность, идентичную или характеризующуюся значительной идентичностью последовательности, например по меньшей мере 95% идентичностью, с по меньшей мере частью нуклеотидной последовательности гена cap AAV животного, не являющегося приматом, где указанный ген cap AAV дополнительно модифицирован с включением (а) нуклеотидной последовательности, кодирующей первого партнера из связывающейся пары белок:белок, (b) нуклеотидной последовательности, кодирующей детектируемую метку, (с) точечной мутации, (d) химерной нуклеотидной последовательности, содержащей часть нуклеотидной последовательности гена cap другого, например второго, AAV, которая функционально связана с указанной нуклеотидной последовательностью гена cap AAV животного, не являющегося приматом, (е) любой комбинации (а), (b), (с) и (d).[0079] In some embodiments, a nucleic acid molecule of the present invention comprises an AAV cap gene that encodes an AAV capsid protein, wherein the AAV cap gene comprises a nucleotide sequence that is identical to or has substantial sequence identity, such as at least 95% identity, with at least a portion of the nucleotide sequence of an AAV cap gene of a non-primate animal, wherein said AAV cap gene is further modified to include (a) a nucleotide sequence encoding a first partner of a protein:protein binding pair, (b) a nucleotide sequence encoding a detectable label, (c) a point mutation, (d) a chimeric nucleotide sequence comprising a portion of the nucleotide sequence of a cap gene of another, such as a second, AAV that is operably linked to said nucleotide sequence of an AAV cap gene of a non-primate animal, (e) any combination of (a), (b), (c), and (d).
[0080] В некоторых вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению содержит ген cap AAV, который кодирует капсидный белок AAV, где ген cap AAV содержит нуклеотидную последовательность, идентичную или характеризующуюся значительной идентичностью последовательности, например по меньшей мере 95% идентичностью, с по меньшей мере частью нуклеотидной последовательности гена cap отдаленного AAV, где указанный ген cap AAV дополнительно модифицирован с включением (а) нуклеотидной последовательности, кодирующей первого партнера из связывающейся пары белок:белок, (b) нуклеотидной последовательности, кодирующей детектируемую метку, (с) точечной мутации, (d) химерной нуклеотидной последовательности, содержащей часть нуклеотидной последовательности другого гена cap AAV, которая функционально связана с указанной нуклеотидной последовательностью гена cap отдаленного AAV, (е) любой комбинации (а), (b), (с) и (d).[0080] In some embodiments, a nucleic acid molecule of the present invention comprises an AAV cap gene that encodes an AAV capsid protein, wherein the AAV cap gene comprises a nucleotide sequence that is identical to or has substantial sequence identity, such as at least 95% identity, with at least a portion of the nucleotide sequence of a distant AAV cap gene, wherein said AAV cap gene is further modified to include (a) a nucleotide sequence encoding a first partner of a protein:protein binding pair, (b) a nucleotide sequence encoding a detectable label, (c) a point mutation, (d) a chimeric nucleotide sequence comprising a portion of the nucleotide sequence of another AAV cap gene that is operably linked to said nucleotide sequence of a distant AAV cap gene, (e) any combination of (a), (b), (c), and (d).
[0081] В некоторых вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению содержит ген rep AAV и ген cap AAV, где ген cap AAV содержит первую нуклеотидную последовательность, идентичную или характеризующуюся значительной идентичностью, например по меньшей мере 95% идентичностью последовательности, с нуклеотидной последовательностью гена cap, выбранного из группы, состоящей из (i) гена cap AAV животного, не являющегося приматом, (ii) гена cap AAV отдаленного примата и (iv) их комбинации, где ген rep AAV содержит вторую нуклеотидную последовательность гена rep AAV другого, например второго, AAV.[0081] In some embodiments, a nucleic acid molecule of the present invention comprises an AAV rep gene and an AAV cap gene, wherein the AAV cap gene comprises a first nucleotide sequence that is identical to or has substantial identity, such as at least 95% sequence identity, with a nucleotide sequence of a cap gene selected from the group consisting of (i) an AAV cap gene of a non-primate animal, (ii) an AAV cap gene of a distant primate, and (iv) a combination thereof, wherein the AAV rep gene comprises a second nucleotide sequence of an AAV rep gene of another, such as a second, AAV.
[0082] В некоторых вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению содержит ген rep AAV и ген cap AAV, где ген cap AAV содержит первую нуклеотидную последовательность, причем нуклеотидная последовательность идентична или характеризуется значительной идентичностью, например по меньшей мере 95% идентичностью последовательности, с нуклеотидной последовательностью гена cap AAV животного, не являющегося приматом, где ген rep AAV содержит вторую нуклеотидную последовательность, причем нуклеотидная последовательность идентична или характеризуется значительной идентичностью, например по меньшей мере 95% идентичностью последовательности, с нуклеотидной последовательностью гена rep AAV другого, например второго, AAV.[0082] In some embodiments, a nucleic acid molecule of the present invention comprises an AAV rep gene and an AAV cap gene, wherein the AAV cap gene comprises a first nucleotide sequence, wherein the nucleotide sequence is identical or has substantial identity, such as at least 95% sequence identity, to a nucleotide sequence of an AAV cap gene of a non-primate animal, wherein the AAV rep gene comprises a second nucleotide sequence, wherein the nucleotide sequence is identical or has substantial identity, such as at least 95% sequence identity, to a nucleotide sequence of an AAV rep gene of another, such as a second, AAV.
[0083] В некоторых вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению содержит ген rep AAV и ген cap AAV, где ген cap AAV содержит нуклеотидную последовательность, идентичную или характеризующуюся значительной идентичностью, например по меньшей мере 95% идентичностью последовательности, с первой нуклеотидной последовательностью гена cap AAV отдаленного животного, где ген rep AAV содержит нуклеотидную последовательность, идентичную или характеризующуюся значительной идентичностью, например по меньшей мере 95% идентичностью последовательности, со второй нуклеотидной последовательностью гена rep AAV другого, например второго AAV.[0083] In some embodiments, a nucleic acid molecule of the present invention comprises an AAV rep gene and an AAV cap gene, wherein the AAV cap gene comprises a nucleotide sequence that is identical to or has substantial identity, such as at least 95% sequence identity, with a first nucleotide sequence of an AAV cap gene of a distant animal, wherein the AAV rep gene comprises a nucleotide sequence that is identical to or has substantial identity, such as at least 95% sequence identity, with a second nucleotide sequence of an AAV rep gene of another, such as a second AAV.
[0084] В некоторых вариантах осуществления молекулы нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению нуклеотидная последовательность гена cap содержит нуклеотидную последовательность, идентичную или характеризующуюся значительной идентичностью, например по меньшей мере 95% идентичностью последовательности, с нуклеотидной последовательностью AAV животного, не являющегося приматом, при этом нуклеотидная последовательность гена cap, идентичная или характеризующаяся значительной идентичностью, например по меньшей мере 95% идентичностью последовательности, с нуклеотидной последовательностью отдаленного AAV, или их комбинации модифицирована с включением (а) нуклеотидной последовательности, кодирующей по меньшей мере первого партнера из связывающейся пары белок:белок, (b) нуклеотидной последовательности, кодирующей детектируемую метку, и/или (с) нуклеотидной последовательности, кодирующей точечную мутацию.[0084] In some embodiments of a nucleic acid molecule of the present invention, a nucleotide sequence of a cap gene comprises a nucleotide sequence that is identical to or has substantial identity, such as at least 95% sequence identity, with a nucleotide sequence of an AAV of a non-primate animal, wherein the nucleotide sequence of a cap gene that is identical to or has substantial identity, such as at least 95% sequence identity, with a nucleotide sequence of a distant AAV, or a combination thereof, is modified to include (a) a nucleotide sequence encoding at least a first partner of a protein:protein binding pair, (b) a nucleotide sequence encoding a detectable label, and/or (c) a nucleotide sequence encoding a point mutation.
[0085] В некоторых вариантах осуществления нуклеиновой кислоты связывающаяся пара белок:белок выбрана из SpyTag: Spy Catcher, SpyTag:KTag, Isopeptag:nmiHH-C, SnoopTag:SnoopCatcher и SpyTag002:SpyCatcher002. В некоторых вариантах осуществления первый партнер из связывающейся пары белок:белок содержит детектируемую метку, например с-myc, содержащую последовательность, изложенную под SEQ ID NO:44.[0085] In some embodiments of the nucleic acid, the protein:protein binding pair is selected from SpyTag: Spy Catcher, SpyTag:KTag, Isopeptag:nmiHH-C, SnoopTag:SnoopCatcher, and SpyTag002:SpyCatcher002. In some embodiments, the first partner of the protein:protein binding pair comprises a detectable label, such as c-myc, comprising the sequence set forth in SEQ ID NO:44.
[0086] В некоторых вариантах осуществления нуклеиновой кислоты нуклеотидная последовательность гена cap AAV животного, не являющегося приматом, гена cap отдаленного AAV или их комбинации модифицирована с включением эпитопа В1, содержащего аминокислотную последовательность IGTRYLTR (SEQ ID NO:45).[0086] In some embodiments of the nucleic acid, the nucleotide sequence of a non-primate AAV cap gene, a distant AAV cap gene, or a combination thereof is modified to include a B1 epitope comprising the amino acid sequence IGTRYLTR (SEQ ID NO:45).
[0087] В некоторых вариантах осуществления молекулы нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению нуклеотидная последовательность гена cap AAV животного, не являющегося приматом, гена cap отдаленного AAV или их комбинации содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую капсидный белок VP3 или его часть, содержащие аминокислотную последовательность, идентичную или характеризующуюся значительной идентичностью, например по меньшей мере 95% идентичностью последовательности, с аминокислотной последовательностью капсидного белка VP3 AAV животного, не являющегося приматом, и/или аминокислотной последовательностью капсидного белка VP3 отдаленного AAV. В некоторых вариантах осуществления нуклеотидная последовательность гена cap AAV животного, не являющегося приматом, гена cap отдаленного AAV или их комбинации содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую капсидный белок VP2 или его часть, содержащие аминокислотную последовательность, идентичную или характеризующуюся значительной идентичностью, например по меньшей мере 95% идентичностью последовательности, с аминокислотной последовательностью капсидного белка VP2 AAV животного, не являющегося приматом, и/или аминокислотной последовательностью капсидного белка VP2 отдаленного AAV. В некоторых вариантах осуществления нуклеотидная последовательность гена cap AAV животного, не являющегося приматом, гена cap отдаленного AAV или их комбинации содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую капсидный белок VP1 или его часть, содержащие аминокислотную последовательность, идентичную или характеризующуюся значительной идентичностью, например по меньшей мере 95% идентичностью последовательности, с аминокислотной последовательностью капсидного белка VP1 AAV животного, не являющегося приматом, и/или аминокислотной последовательностью капсидного белка VP1 отдаленного AAV.[0087] In some embodiments of a nucleic acid molecule of the present invention, the nucleotide sequence of a non-primate AAV cap gene, a distant AAV cap gene, or a combination thereof comprises a nucleotide sequence encoding a VP3 capsid protein or a portion thereof comprising an amino acid sequence identical to or having substantial identity, such as at least 95% sequence identity, with an amino acid sequence of a non-primate AAV VP3 capsid protein and/or an amino acid sequence of a distant AAV VP3 capsid protein. In some embodiments, the nucleotide sequence of the non-primate AAV cap gene, the distant AAV cap gene, or a combination thereof comprises a nucleotide sequence encoding a VP2 capsid protein or a portion thereof comprising an amino acid sequence identical to or having substantial identity, such as at least 95% sequence identity, with the amino acid sequence of the VP2 capsid protein of the non-primate AAV and/or the amino acid sequence of the VP2 capsid protein of the distant AAV. In some embodiments, the nucleotide sequence of the non-primate AAV cap gene, the distant AAV cap gene, or a combination thereof comprises a nucleotide sequence encoding a VP1 capsid protein or a portion thereof comprising an amino acid sequence identical to or having substantial identity, such as at least 95% sequence identity, with the amino acid sequence of the VP1 capsid protein of the non-primate AAV and/or the amino acid sequence of the VP1 capsid protein of the distant AAV.
[0088] В некоторых вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую капсидный белок VP3 AAV животного, не являющегося приматом, по настоящему изобретению. В некоторых вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую капсидный белок VP3 вируса животного, не являющегося приматом, по настоящему изобретению и капсидный белок VP2 вируса животного, не являющегося приматом, по настоящему изобретению. В некоторых вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую капсидный белок VP3 AAV животного, не являющегося приматом, по настоящему изобретению, капсидный белок VP2 по настоящему изобретению и капсидный белок VP1 по настоящему изобретению.[0088] In some embodiments, a nucleic acid molecule of the present invention comprises a nucleotide sequence encoding a VP3 capsid protein of a non-primate animal AAV of the present invention. In some embodiments, a nucleic acid molecule of the present invention comprises a nucleotide sequence encoding a VP3 capsid protein of a non-primate animal virus of the present invention and a VP2 capsid protein of a non-primate animal virus of the present invention. In some embodiments, a nucleic acid molecule of the present invention comprises a nucleotide sequence encoding a VP3 capsid protein of a non-primate animal AAV of the present invention, a VP2 capsid protein of the present invention, and a VP1 capsid protein of the present invention.
[0089] В некоторых вариантах осуществления ген cap из молекулы нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению кодирует (i) капсидный белок VP1, который представляет собой один из (а) химерного капсидного белка VP1 AAV, где необязательно химерный капсидный белок VP1 содержит уникальную область VP1 (VP1-u), содержащую аминокислотную последовательность, идентичную или характеризующуюся значительной идентичностью, например по меньшей мере 95% идентичностью последовательности, с аминокислотной последовательностью другого, например второго, AAV, функционально связанную с общей областью VP1/VP2 и областью VP3, содержащими аминокислотную последовательность, идентичную или характеризующуюся значительной идентичностью, например по меньшей мере 95% идентичностью последовательности, с аминокислотной последовательностью AAV животного, не являющегося приматом, или отдаленного AAV, или (b) капсидного белка VP1, содержащего аминокислотную последовательность, идентичную или характеризующуюся значительной идентичностью, например по меньшей мере 95% идентичностью последовательности, с аминокислотной последовательностью капсидного белка VP1 AAV животного, не являющегося приматом, или отдаленного AAV, (ii) капсидный белок VP2, который представляет собой один из (а) химерного капсидного белка VP2 AAV, где необязательно химерный капсидный белок VP2 содержит общую область VP1/VP2, содержащую аминокислотную последовательность, идентичную или характеризующуюся значительной идентичностью, например по меньшей мере 95% идентичностью последовательности, с аминокислотной последовательностью другого, например второго, AAV, функционально связанную с областью VP3, содержащей аминокислотную последовательность, идентичную или характеризующуюся значительной идентичностью, например по меньшей мере 95% идентичностью последовательности, с аминокислотной последовательностью AAV животного, не являющегося приматом, или (b) капсидного белка VP2, содержащего аминокислотную последовательность, идентичную или характеризующуюся значительной идентичностью, например по меньшей мере 95% идентичностью последовательности, с аминокислотной последовательностью капсидного белка VP2 AAV животного, не являющегося приматом, и/или (iii) капсидный белок VP3, содержащий аминокислотную последовательность, идентичную или характеризующуюся значительной идентичностью, например по меньшей мере 95% идентичностью последовательности, с аминокислотной последовательностью капсидного белка VP3 AAV животного, не являющегося приматом, или отдаленного AAV.[0089] In some embodiments, the cap gene of a nucleic acid molecule of the present invention encodes (i) a VP1 capsid protein that is one of (a) a chimeric VP1 capsid protein of an AAV, wherein optionally the chimeric VP1 capsid protein comprises a unique VP1 region (VP1-u) comprising an amino acid sequence that is identical to or has substantial identity, e.g., at least 95% sequence identity, with an amino acid sequence of another, e.g., a second, AAV, operably linked to a common VP1/VP2 region and a VP3 region comprising an amino acid sequence that is identical to or has substantial identity, e.g., at least 95% sequence identity, with an amino acid sequence of a non-primate AAV or a distant AAV, or (b) a VP1 capsid protein comprising an amino acid sequence that is identical to or has substantial identity, e.g., at least 95% sequence identity to the amino acid sequence of the VP1 capsid protein of an AAV of a non-primate animal or a distant AAV, (ii) a VP2 capsid protein that is one of (a) a chimeric VP2 capsid protein of an AAV, wherein optionally the chimeric VP2 capsid protein comprises a VP1/VP2 common region comprising an amino acid sequence identical to or having substantial identity, such as at least 95% sequence identity, with an amino acid sequence of another, such as a second, AAV, operably linked to a VP3 region comprising an amino acid sequence identical to or having substantial identity, such as at least 95% sequence identity, with an amino acid sequence of an AAV of a non-primate animal, or (b) a VP2 capsid protein comprising an amino acid sequence identical to or having substantial identity, such as at least 95% sequence identity, with an amino acid sequence of a VP2 capsid protein of a non-primate AAV, and/or (iii) a VP3 capsid protein comprising an amino acid sequence that is identical to or has substantial sequence identity, such as at least 95% sequence identity, with the amino acid sequence of a VP3 capsid protein of a non-primate AAV or a distant AAV.
[0090] В некоторых вариантах осуществления ген cap из молекулы нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению кодирует (i) химерный капсидный белок VP1 AAV, где необязательно химерный капсидный белок VP1 содержит уникальную область VP1 (VP1-u), содержащую аминокислотную последовательность, идентичную или характеризующуюся значительной идентичностью, например по меньшей мере 95% идентичностью последовательности, с аминокислотной последовательностью другого, например AAV, функционально связанную с общей областью VP1/VP2 и областью VP3, содержащими аминокислотную последовательность, идентичную или характеризующуюся значительной идентичностью, например по меньшей мере 95% идентичностью последовательности, с аминокислотной последовательностью AAV животного, не являющегося приматом, или отдаленного AAV, (ii) химерный капсидный белок VP2 AAV, где необязательно химерный капсидный белок VP2 содержит общую область VP1/VP2, содержащую аминокислотную последовательность, идентичную или характеризующуюся значительной идентичностью, например по меньшей мере 95% идентичностью последовательности, с аминокислотной последовательностью другого, например AAV, функционально связанную с областью VP3 AAV животного, не являющегося приматом, или отдаленного AAV, и/или (iii) капсидный белок VP3, содержащий аминокислотную последовательность, идентичную или характеризующуюся значительной идентичностью, например по меньшей мере 95%) идентичностью последовательности, с аминокислотной последовательностью AAV животного, не являющегося приматом, или отдаленного AAV.[0090] In some embodiments, the cap gene of a nucleic acid molecule of the present invention encodes (i) a chimeric AAV capsid protein VP1, wherein optionally the chimeric VP1 capsid protein comprises a unique VP1 region (VP1-u) comprising an amino acid sequence identical to or having substantial identity, such as at least 95% sequence identity, with an amino acid sequence of another, such as an AAV, operably linked to a common VP1/VP2 region and a VP3 region comprising an amino acid sequence identical to or having substantial identity, such as at least 95% sequence identity, with an amino acid sequence of an AAV of a non-primate or distant AAV, (ii) a chimeric AAV capsid protein VP2, wherein optionally the chimeric VP2 capsid protein comprises a common VP1/VP2 region comprising an amino acid sequence identical to or having characterized by significant identity, such as at least 95% sequence identity, with an amino acid sequence of another, such as an AAV, operably linked to the VP3 region of a non-primate AAV or a distant AAV, and/or (iii) a VP3 capsid protein comprising an amino acid sequence identical to or having significant identity, such as at least 95% sequence identity, with an amino acid sequence of a non-primate AAV or a distant AAV.
[0091] В некоторых вариантах осуществления ген cap из молекулы нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению кодирует (i) химерный капсидный белок VP1 AAV, где необязательно химерный капсидный белок VP1 содержит уникальную область VP1 (VP1-u), содержащую аминокислотную последовательность, идентичную или характеризующуюся значительной идентичностью, например по меньшей мере 95% идентичностью последовательности, с аминокислотной последовательностью другого AAV, функционально связанную с общей областью VP1/VP2 и областью VP3, содержащими аминокислотную последовательность, идентичную или характеризующуюся значительной идентичностью, например по меньшей мере 95% идентичностью последовательности, с аминокислотной последовательностью AAV животного, не являющегося приматом, или отдаленного AAV, (ii) капсидный белок VP2, содержащий аминокислотную последовательность, идентичную или характеризующуюся значительной идентичностью, например по меньшей мере 95% идентичностью последовательности, с аминокислотной последовательностью AAV животного, не являющегося приматом, или отдаленного AAV, и (iii) капсидный белок VP3, содержащий аминокислотную последовательность, идентичную или характеризующуюся значительной идентичностью, например по меньшей мере 95% идентичностью последовательности, с аминокислотной последовательностью AAV животного, не являющегося приматом, или отдаленного AAV.[0091] In some embodiments, the cap gene of a nucleic acid molecule of the present invention encodes (i) a chimeric AAV capsid protein VP1, wherein optionally the chimeric VP1 capsid protein comprises a VP1 unique region (VP1-u) comprising an amino acid sequence that is identical to or has substantial identity, such as at least 95% sequence identity, with an amino acid sequence of another AAV, operably linked to a VP1/VP2 common region and a VP3 region comprising an amino acid sequence that is identical to or has substantial identity, such as at least 95% sequence identity, with an amino acid sequence of a non-primate AAV or a distant AAV, (ii) a VP2 capsid protein comprising an amino acid sequence that is identical to or has substantial identity, such as at least 95% sequence identity, with an amino acid sequence of a non-primate AAV or a distant AAV, primate or distant AAV, and (iii) a VP3 capsid protein comprising an amino acid sequence that is identical to or has substantial identity, such as at least 95% sequence identity, with an amino acid sequence of a non-primate AAV or distant AAV.
[0092] В некоторых вариантах осуществления ген cap из молекулы нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению кодирует (i) капсидный белок VP1, содержащий аминокислотную последовательность, идентичную или характеризующуюся значительной идентичностью, например по меньшей мере 95% идентичностью последовательности, с аминокислотной последовательностью AAV животного, не являющегося приматом, или отдаленного AAV, (ii) капсидный белок VP2, содержащий аминокислотную последовательность, идентичную или характеризующуюся значительной идентичностью, например по меньшей мере 95% идентичностью последовательности, с аминокислотной последовательностью AAV животного, не являющегося приматом, или отдаленного AAV, и/или (iii) капсидный белок VP3, содержащий аминокислотную последовательность, идентичную или характеризующуюся значительной идентичностью, например по меньшей мере 95% идентичностью последовательности, с аминокислотной последовательностью AAV животного, не являющегося приматом, или отдаленного AAV.[0092] In some embodiments, the cap gene of a nucleic acid molecule of the present invention encodes (i) a VP1 capsid protein comprising an amino acid sequence that is identical to or has substantial identity, such as at least 95% sequence identity, with an amino acid sequence of a non-primate AAV or a distant AAV, (ii) a VP2 capsid protein comprising an amino acid sequence that is identical to or has substantial identity, such as at least 95% sequence identity, with an amino acid sequence of a non-primate AAV or a distant AAV, and/or (iii) a VP3 capsid protein comprising an amino acid sequence that is identical to or has substantial identity, such as at least 95% sequence identity, with an amino acid sequence of a non-primate AAV or a distant AAV.
[0093] В некоторых вариантах осуществления молекулы нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению другой, второй AAV представляет собой AAV примата или комбинацию AAV приматов. В некоторых вариантах осуществления другой AAV выбран из группы, состоящей из AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV13 и их комбинации. В некоторых вариантах осуществления другой AAV представляет собой AAV2.[0093] In some embodiments of a nucleic acid molecule of the present invention, the other, second AAV is a primate AAV or a combination of primate AAVs. In some embodiments, the other AAV is selected from the group consisting of AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV13, and a combination thereof. In some embodiments, the other AAV is AAV2.
[0094] В некоторых вариантах осуществления молекулы нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению AAV животного, не являющегося приматом, представляет собой AAV животного, не являющегося приматом, приведенный в таблице 1. В некоторых вариантах осуществления AAV животного, не являющегося приматом, представляет собой птичий AAV (AAAV), AAV морского льва или AAV бородатой агамы. В некоторых вариантах осуществления AAV животного, не являющегося приматом, представляет собой AAAV, и необязательно, нуклеотидная последовательность капсидного белка AAAV содержит модификацию в положении I444 или I580 капсидного белка VP1 AAAV. В некоторых вариантах осуществления AAV животного, не являющегося приматом, представляет собой AAV чешуйчатого пресмыкающегося, например AAV бородатой агамы, и необязательно нуклеотидная последовательность AAV бородатой агамы содержит модификацию, находящуюся в положении I573 или I436 капсидного белка VP1 AAV бородатой агамы. В некоторых вариантах осуществления AAV животного, не являющегося приматом, представляет собой AAV млекопитающего, например AAV морского льва, и необязательно нуклеотидная последовательность AAV морского льва содержит модификацию в положении, выбранном из группы, состоящей из I429, I430, I431, I432, I433, I434, I436, I437 и А565 капсидного белка VP1 AAV морского льва.[0094] In some embodiments of a nucleic acid molecule of the present invention, the non-primate AAV is a non-primate AAV listed in Table 1. In some embodiments, the non-primate AAV is an avian AAV (AAAV), a sea lion AAV, or a bearded dragon AAV. In some embodiments, the non-primate AAV is an AAAV, and optionally, the nucleotide sequence of the AAAV capsid protein comprises a modification at position I444 or I580 of the AAAV VP1 capsid protein. In some embodiments, the non-primate AAV is a scaly reptile AAV, such as a bearded dragon AAV, and optionally the nucleotide sequence of the bearded dragon AAV comprises a modification located at position I573 or I436 of the bearded dragon AAV VP1 capsid protein. In some embodiments, the non-primate AAV is a mammalian AAV, such as a sea lion AAV, and optionally the nucleotide sequence of the sea lion AAV comprises a modification at a position selected from the group consisting of I429, I430, I431, I432, I433, I434, I436, I437, and A565 of the sea lion AAV VP1 capsid protein.
[0095] Варианты осуществления молекулы нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению могут содержать нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из (а) нуклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO:l, (b) нуклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO:3, (с) нуклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO:5, (d) нуклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO:7, (е) нуклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO:9, (f) нуклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO:11, (g) нуклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO:13, (h) нуклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO:15, (i) нуклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO:17, (j) нуклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO:19, (k) нуклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO:21, (l) нуклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO:23, (m) нуклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO:25, (n) нуклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO:27, (о) нуклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO:29, (р) нуклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO:31, (q) нуклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO:33, (r) нуклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO:35, (s) нуклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO:52, (t) нуклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO:54, (u) нуклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO:56, (v) нуклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO:58, (w) нуклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO:60, (х) нуклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO:62, (у) нуклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO:64, (z) нуклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO:66, (аа) нуклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO:68, (bb) нуклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO:70, (сс) нуклеотидной последовательности, характеризующейся по меньшей мере 95% идентичностью с нуклеотидной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO:1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33,35, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68 или 70, (dd) любой части нуклеотидной последовательности из (а)-(сс), кодирующей капсидный белок VP2 и/или капсидный белок VP3.[0095] Embodiments of a nucleic acid molecule of the present invention may comprise a nucleotide sequence selected from the group consisting of (a) the nucleotide sequence set forth as SEQ ID NO:1, (b) the nucleotide sequence set forth as SEQ ID NO:3, (c) the nucleotide sequence set forth as SEQ ID NO:5, (d) the nucleotide sequence set forth as SEQ ID NO:7, (e) the nucleotide sequence set forth as SEQ ID NO:9, (f) the nucleotide sequence set forth as SEQ ID NO:11, (g) the nucleotide sequence set forth as SEQ ID NO:13, (h) the nucleotide sequence set forth as SEQ ID NO:15, (i) the nucleotide sequence set forth as SEQ ID NO:17, (j) the nucleotide sequence set forth as SEQ ID NO:19, (k) the nucleotide sequence set forth as SEQ ID NO:21, (l) the nucleotide sequence set forth as SEQ ID NO:23, (m) the nucleotide sequence set forth as SEQ ID NO:25, (n) the nucleotide sequence set forth as SEQ ID NO:27, (o) the nucleotide sequence set forth as SEQ ID NO:29, (p) the nucleotide sequence set forth as SEQ ID NO:31, (q) the nucleotide sequence set forth as SEQ ID NO:33, (r) the nucleotide sequence set forth as SEQ ID NO:35, (s) the nucleotide sequence set forth as SEQ ID NO:52, (t) the nucleotide sequence set forth as SEQ ID NO:54, (u) the nucleotide sequence set forth as SEQ ID NO:56, (v) the nucleotide sequence set forth as SEQ ID NO:58, (w) the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO:60, (x) the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO:62, (y) the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO:64, (z) the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO:66, (aa) the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO:68, (bb) the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO:70, (cc) a nucleotide sequence having at least 95% identity to the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO:1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33,35, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68 or 70, (dd) any part of the nucleotide sequence from (a) to (cc) encoding the capsid protein VP2 and/or the capsid protein VP3.
[0096] В некоторых вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность, изложенную под SEQ ID NO:1, ее часть, которая кодирует капсидный белок VP2 и/или VP3, и их вырожденные варианты. В некоторых вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность, изложенную под SEQ ID NO:3, ее часть, которая кодирует капсидный белок VP2 и/или VP3, и их вырожденные варианты. В некоторых вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность, изложенную под SEQ ID NO:5, ее часть, которая кодирует капсидный белок VP2 и/или VP3, и их вырожденные варианты. В некоторых вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность, изложенную под SEQ ID NO:7, ее часть, которая кодирует капсидный белок VP2 и/или VP3, и их вырожденные варианты. В некоторых вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность, изложенную под SEQ ID NO:9, ее часть, которая кодирует капсидный белок VP2 и/или VP3, и их вырожденные варианты. В некоторых вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность, изложенную под SEQ ID NO:11, ее часть, которая кодирует капсидный белок VP2 и/или VP3, и их вырожденные варианты. В некоторых вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность, изложенную под SEQ ID NO:13, ее часть, которая кодирует капсидный белок VP2 и/или VP3, и их вырожденные варианты. В некоторых вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность, изложенную под SEQ ID NO:15, ее часть, которая кодирует капсидный белок VP2 и/или VP3, и их вырожденные варианты. В некоторых вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность, изложенную под SEQ ID NO:17, ее часть, которая кодирует капсидный белок VP2 и/или VP3, и их вырожденные варианты. В некоторых вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность, изложенную под SEQ ID NO:19, ее часть, которая кодирует капсидный белок VP2 и/или VP3, и их вырожденные варианты. В некоторых вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность, изложенную под SEQ ID NO:21, ее часть, которая кодирует капсидный белок VP2 и/или VP3, и их вырожденные варианты. В некоторых вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность, изложенную под SEQ ID NO:23, ее часть, которая кодирует капсидный белок VP2 и/или VP3, и их вырожденные варианты. В некоторых вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность, изложенную под SEQ ID NO:25, ее часть, которая кодирует капсидный белок VP2 и/или VP3, и их вырожденные варианты. В некоторых вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность, изложенную под SEQ ID NO:27, ее часть, которая кодирует капсидный белок VP2 и/или VP3, и их вырожденные варианты. В некоторых вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность, изложенную под SEQ ID NO:29, ее часть, которая кодирует капсидный белок VP2 и/или VP3, и их вырожденные варианты. В некоторых вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность, изложенную под SEQ ID NO:31, ее часть, которая кодирует капсидный белок VP2 и/или VP3, и их вырожденные варианты. В некоторых вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность, изложенную под SEQ ID NO:33, ее часть, которая кодирует капсидный белок VP2 и/или VP3, и их вырожденные варианты. В некоторых вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность, изложенную под SEQ ID NO:35, ее часть, которая кодирует капсидный белок VP2 и/или VP3, и их вырожденные варианты. В некоторых вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность, изложенную под SEQ ID NO:52, ее часть, которая кодирует капсидный белок VP2 и/или VP3, и их вырожденные варианты. В некоторых вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность, изложенную под SEQ ID NO:54, ее часть, которая кодирует капсидный белок VP2 и/или VP3, и их вырожденные варианты. В некоторых вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность, изложенную под SEQ ID NO:56, ее часть, которая кодирует капсидный белок VP2 и/или VP3, и их вырожденные варианты. В некоторых вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность, изложенную под SEQ ID NO:58, ее часть, которая кодирует капсидный белок VP2 и/или VP3, и их вырожденные варианты. В некоторых вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность, изложенную под SEQ ID NO:60, ее часть, которая кодирует капсидный белок VP2 и/или VP3, и их вырожденные варианты. В некоторых вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность, изложенную под SEQ ID NO:62, ее часть, которая кодирует капсидный белок VP2 и/или VP3, и их вырожденные варианты. В некоторых вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность, изложенную под SEQ ID NO:64, ее часть, которая кодирует капсидный белок VP2 и/или VP3, и их вырожденные варианты. В некоторых вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность, изложенную под SEQ ID NO:66, ее часть, которая кодирует капсидный белок VP2 и/или VP3, и их вырожденные варианты. В некоторых вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность, изложенную под SEQ ID NO:68, ее часть, которая кодирует капсидный белок VP2 и/или VP3, и их вырожденные варианты. В некоторых вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность, изложенную под SEQ ID NO:70, ее часть, которая кодирует капсидный белок VP2 и/или VP3, и их вырожденные варианты.[0096] In some embodiments, the nucleic acid molecule comprises the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO:1, the portion thereof that encodes the VP2 and/or VP3 capsid protein, and degenerate variants thereof. In some embodiments, the nucleic acid molecule comprises the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO:3, the portion thereof that encodes the VP2 and/or VP3 capsid protein, and degenerate variants thereof. In some embodiments, the nucleic acid molecule comprises the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO:5, the portion thereof that encodes the VP2 and/or VP3 capsid protein, and degenerate variants thereof. In some embodiments, the nucleic acid molecule comprises the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO:7, the portion thereof that encodes the VP2 and/or VP3 capsid protein, and degenerate variants thereof. In some embodiments, the nucleic acid molecule comprises the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO:9, the portion thereof that encodes the VP2 and/or VP3 capsid protein, and degenerate variants thereof. In some embodiments, the nucleic acid molecule comprises the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO:11, the portion thereof that encodes the VP2 and/or VP3 capsid protein, and degenerate variants thereof. In some embodiments, the nucleic acid molecule comprises the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO:13, the portion thereof that encodes the VP2 and/or VP3 capsid protein, and degenerate variants thereof. In some embodiments, the nucleic acid molecule comprises the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO:15, the portion thereof that encodes the VP2 and/or VP3 capsid protein, and degenerate variants thereof. In some embodiments, the nucleic acid molecule comprises the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO:17, the portion thereof that encodes the VP2 and/or VP3 capsid protein, and degenerate variants thereof. In some embodiments, the nucleic acid molecule comprises the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO:19, the portion thereof that encodes the VP2 and/or VP3 capsid protein, and degenerate variants thereof. In some embodiments, the nucleic acid molecule comprises the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO:21, the portion thereof that encodes the VP2 and/or VP3 capsid protein, and degenerate variants thereof. In some embodiments, the nucleic acid molecule comprises the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO:23, the portion thereof that encodes the VP2 and/or VP3 capsid protein, and degenerate variants thereof. In some embodiments, the nucleic acid molecule comprises the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO:25, the portion thereof that encodes the VP2 and/or VP3 capsid protein, and degenerate variants thereof. In some embodiments, the nucleic acid molecule comprises the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO:27, the portion thereof that encodes the VP2 and/or VP3 capsid protein, and degenerate variants thereof. In some embodiments, the nucleic acid molecule comprises the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO:29, the portion thereof that encodes the VP2 and/or VP3 capsid protein, and degenerate variants thereof. In some embodiments, the nucleic acid molecule comprises the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO:31, the portion thereof that encodes the VP2 and/or VP3 capsid protein, and degenerate variants thereof. In some embodiments, the nucleic acid molecule comprises the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO:33, the portion thereof that encodes the VP2 and/or VP3 capsid protein, and degenerate variants thereof. In some embodiments, the nucleic acid molecule comprises the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO:35, the portion thereof that encodes the VP2 and/or VP3 capsid protein, and degenerate variants thereof. In some embodiments, the nucleic acid molecule comprises the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO:52, the portion thereof that encodes the VP2 and/or VP3 capsid protein, and degenerate variants thereof. In some embodiments, the nucleic acid molecule comprises the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO:54, the portion thereof that encodes the VP2 and/or VP3 capsid protein, and degenerate variants thereof. In some embodiments, the nucleic acid molecule comprises the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO:56, the portion thereof that encodes the VP2 and/or VP3 capsid protein, and degenerate variants thereof. In some embodiments, the nucleic acid molecule comprises the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO:58, the portion thereof that encodes the VP2 and/or VP3 capsid protein, and degenerate variants thereof. In some embodiments, the nucleic acid molecule comprises the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO:60, the portion thereof that encodes the VP2 and/or VP3 capsid protein, and degenerate variants thereof. In some embodiments, the nucleic acid molecule comprises the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO:62, the portion thereof that encodes the VP2 and/or VP3 capsid protein, and degenerate variants thereof. In some embodiments, the nucleic acid molecule comprises the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO:64, the portion thereof that encodes the VP2 and/or VP3 capsid protein, and degenerate variants thereof. In some embodiments, the nucleic acid molecule comprises the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO:66, the portion thereof that encodes the VP2 and/or VP3 capsid protein, and degenerate variants thereof. In some embodiments, the nucleic acid molecule comprises the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO:68, the portion thereof that encodes the VP2 and/or VP3 capsid protein, and degenerate variants thereof. In some embodiments, the nucleic acid molecule comprises the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO:70, the portion thereof that encodes the VP2 and/or VP3 capsid protein, and degenerate variants thereof.
[0097] В некоторых вариантах осуществления нуклеотидная последовательность, кодирующая капсидный белок VP1 по настоящему изобретению и необязательно капсидный белок VP2 и/или VP3 по настоящему изобретению, функционально связана с промотором. В некоторых вариантах осуществления промотор выбран из вирусного промотора, бактериального промотора, промотора гена млекопитающего (например, человеческого или не являющегося человеческим), промотора гена птицы, промотора гена рыбы, промотора гена насекомого и любой их комбинации. В некоторых вариантах осуществления промотор выбран из р40, SV40, EF, CMV, В19р6 и CAG. В некоторых вариантах осуществления промотор представляет собой промотор р40 AAV. В некоторых вариантах осуществления при этом промотор управляет экспрессией капсидного(-ых) белка(-ов) в упаковывающей клетке.[0097] In some embodiments, a nucleotide sequence encoding a VP1 capsid protein of the present invention and optionally a VP2 and/or VP3 capsid protein of the present invention is operably linked to a promoter. In some embodiments, the promoter is selected from a viral promoter, a bacterial promoter, a mammalian (e.g., human or non-human) gene promoter, an avian gene promoter, a fish gene promoter, an insect gene promoter, and any combination thereof. In some embodiments, the promoter is selected from p40, SV40, EF, CMV, B19p6, and CAG. In some embodiments, the promoter is the AAV p40 promoter. In some embodiments, the promoter directs expression of the capsid protein(s) in the packaging cell.
[0098] В некоторых вариантах осуществления ген cap из молекулы нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению функционально связан с промотором. В некоторых вариантах осуществления промотор управляет экспрессией капсидного(-ых) белка(-ов) в упаковывающей клетке. В некоторых вариантах осуществления промотор выбран из р40, SV40, EF, например EF1α CMV, В19р6 и CAG.[0098] In some embodiments, the cap gene of a nucleic acid molecule of the present invention is operably linked to a promoter. In some embodiments, the promoter directs expression of the capsid protein(s) in a packaging cell. In some embodiments, the promoter is selected from p40, SV40, EF, such as CMV EF1α, B19p6, and CAG.
[0099] В некоторых вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению дополнительно содержит вторую нуклеотидную последовательность, кодирующую один или более белков Rep AAV, где необязательно вторая нуклеотидная последовательность функционально связана с промотором. В некоторых вариантах осуществления один или более белков Rep представляют собой белки Rep AAV примата. В некоторых вариантах осуществления один или более белков Rep представляют собой белки Rep AAV животного, не являющегося приматом. В некоторых вариантах осуществления один или более белков Rep выбраны из Rep78, Rep68, Rep52 и Rep40, необязательно один или более белков Rep предусматривают Rep78. В некоторых вариантах осуществления промотор, функционально связанный со второй нуклеотидной последовательностью, кодирующей один или более белков Rep AAV, выбран из вирусного промотора, бактериального промотора, промотора гена млекопитающего (например, человеческого или не являющегося человеческим), промотора гена птицы, промотора гена рыбы, промотора гена насекомого и любой их комбинации. В некоторых вариантах осуществления промотор, функционально связанный со второй нуклеотидной последовательностью, кодирующей один или более белков Rep AAV, выбран из р19, р5, р40, SV40, EF, например EF1α CMV, В19р6 и CAG. В некоторых вариантах осуществления промотор управляет экспрессией капсидного(-ых) белка(-ов) в упаковывающей клетке. В некоторых вариантах осуществления промотор, функционально связанный со второй нуклеотидной последовательностью, кодирующей один или более белков Rep AAV, выбран из р19 и/или р5.[0099] In some embodiments, a nucleic acid molecule of the present invention further comprises a second nucleotide sequence encoding one or more AAV Rep proteins, wherein optionally the second nucleotide sequence is operably linked to a promoter. In some embodiments, the one or more Rep proteins are primate AAV Rep proteins. In some embodiments, the one or more Rep proteins are non-primate AAV Rep proteins. In some embodiments, the one or more Rep proteins are selected from Rep78, Rep68, Rep52, and Rep40, optionally the one or more Rep proteins comprise Rep78. In some embodiments, the promoter operably linked to the second nucleotide sequence encoding the one or more AAV Rep proteins is selected from a viral promoter, a bacterial promoter, a mammalian (e.g., human or non-human) gene promoter, an avian gene promoter, a fish gene promoter, an insect gene promoter, and any combination thereof. In some embodiments, a promoter operably linked to a second nucleotide sequence encoding one or more AAV Rep proteins is selected from p19, p5, p40, SV40, EF, such as CMV EF1α, B19p6, and CAG. In some embodiments, the promoter directs expression of the capsid protein(s) in a packaging cell. In some embodiments, a promoter operably linked to a second nucleotide sequence encoding one or more AAV Rep proteins is selected from p19 and/or p5.
[00100] Композиции и упаковывающие клетки, содержащие капсидные белки, кодируемые молекулами нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению, также являются частью настоящего изобретения. Также описаны вирусные частицы, экспрессируемые упаковывающими клетками по настоящему изобретению.[00100] Compositions and packaging cells containing capsid proteins encoded by the nucleic acid molecules of the present invention are also part of the present invention. Viral particles expressed by the packaging cells of the present invention are also described.
[00101] В некоторых вариантах осуществления композиции и упаковывающие клетки для получения вирусных частиц AAV по настоящему изобретению содержат молекулу нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению, например содержащую ген cap по настоящему изобретению, кодирующий капсидный белок AAV по настоящему изобретению. В некоторых вариантах осуществления композиция и/или упаковывающая клетка по настоящему изобретению содержит молекулу нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению. В некоторых вариантах осуществления ген cap содержит нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из нуклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO:l, нуклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO:3, нуклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO:5, нуклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO:7, нуклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO:9, нуклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO:11, нуклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO:13, нуклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO:I5, нуклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO:17, нуклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO:19, нуклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO:21, нуклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO:23, нуклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO:25, нуклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO:27, нуклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO:29, нуклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO:31, нуклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO:33, нуклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO:35, нуклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO:52, нуклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO:54, нуклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO:56, нуклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO:58, нуклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO:60, нуклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO:62, нуклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO:64, нуклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO:66, нуклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO:68, нуклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO:70, любой части нуклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO:1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68 или 70, кодирующей капсид VP2, любой части нуклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO:1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68 или 70, кодирующей капсид VP3, и любой их комбинации.[00101] In some embodiments, the compositions and packaging cells for producing AAV viral particles of the present invention comprise a nucleic acid molecule of the present invention, such as one comprising a cap gene of the present invention encoding an AAV capsid protein of the present invention. In some embodiments, the composition and/or packaging cell of the present invention comprises a nucleic acid molecule of the present invention. In some embodiments, the cap gene comprises a nucleotide sequence selected from the group consisting of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO:1, the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO:3, the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO:5, the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO:7, the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO:9, the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO:11, the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO:13, the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO:15, the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO:17, the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO:19, the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO:21, the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO:23, the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO:25, the nucleotide sequence set forth as SEQ ID NO:27, the nucleotide sequence set forth as SEQ ID NO:29, the nucleotide sequence set forth as SEQ ID NO:31, the nucleotide sequence set forth as SEQ ID NO:33, the nucleotide sequence set forth as SEQ ID NO:35, the nucleotide sequence set forth as SEQ ID NO:52, the nucleotide sequence set forth as SEQ ID NO:54, the nucleotide sequence set forth as SEQ ID NO:56, the nucleotide sequence set forth as SEQ ID NO:58, the nucleotide sequence set forth as SEQ ID NO:60, the nucleotide sequence set forth as SEQ ID NO:62, the nucleotide sequence set forth as SEQ ID NO:64, the nucleotide sequence set forth as SEQ ID NO:66, the nucleotide the sequence set forth as SEQ ID NO:68, the nucleotide sequence set forth as SEQ ID NO:70, any portion of the nucleotide sequence set forth as SEQ ID NO:1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68 or 70 encoding the VP2 capsid, any portion of the nucleotide sequence set forth as SEQ ID NO:1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68 or 70, encoding the VP3 capsid, and any combination thereof.
[00102] В некоторых вариантах осуществления композиции и упаковывающие клетки дополнительно содержат молекулу нуклеиновой кислоты, содержащую ген rep, кодирующий один или более белков Rep AAV, где указанный ген rep функционально связан с промотором, где необязательно ген rep и ген cap принадлежат двум разным AAV. В некоторых вариантах осуществления промотор, функционально связанный с геном rep, управляет экспрессией белка(-ов) Rep в упаковывающей клетке, например промотор, выбранный из р5, р19 SV40, EF, CMV, В19р6 и CAG. В некоторых вариантах осуществления один или более белков Rep выбраны из Rep78, Rep68, Rep52 и Rep40, необязательно один или более белков Rep предусматривают Rep78. В некоторых вариантах осуществления один или более белков Rep представляют собой белки Rep AAV примата. В некоторых других вариантах осуществления один или более белков Rep представляют собой белки Rep AAV животного, не являющегося приматом. В некоторых вариантах осуществления один или более белков Rep предусматривают и то, и другое.[00102] In some embodiments, the compositions and packaging cells further comprise a nucleic acid molecule comprising a rep gene encoding one or more AAV Rep proteins, wherein said rep gene is operably linked to a promoter, wherein optionally the rep gene and the cap gene belong to two different AAVs. In some embodiments, the promoter operably linked to the rep gene directs the expression of the Rep protein(s) in the packaging cell, such as a promoter selected from p5, SV40 p19, EF, CMV, B19p6, and CAG. In some embodiments, the one or more Rep proteins are selected from Rep78, Rep68, Rep52, and Rep40, optionally the one or more Rep proteins comprise Rep78. In some embodiments, the one or more Rep proteins are primate AAV Rep proteins. In some other embodiments, the one or more Rep proteins are non-primate AAV Rep proteins. In some embodiments, the one or more Rep proteins comprise both.
[00103] В некоторых вариантах осуществления композиции и упаковывающие клетки по настоящему изобретению дополнительно содержат молекулу нуклеиновой кислоты, содержащую нуклеотидную последовательность представляющего интерес нуклеотида, фланкированную с по меньшей мере одной стороны по меньшей мере одним инвертированным концевым повтором (ITR) AAV, который распознается одним или более белками Rep.В некоторых вариантах осуществления представляющий интерес нуклеотид фланкирован с другой стороны вторым ITR того же AAV, что и по меньшей мере один ITR. В некоторых вариантах осуществления представляющий интерес нуклеотид фланкирован с другой стороны вторым ITR, при этом второй ITR и по меньшей мере один ITR принадлежат разным AAV.[00103] In some embodiments, the compositions and packaging cells of the present invention further comprise a nucleic acid molecule comprising a nucleotide sequence of a nucleotide of interest flanked on at least one side by at least one inverted terminal repeat (ITR) of an AAV that is recognized by one or more Rep proteins. In some embodiments, the nucleotide of interest is flanked on the other side by a second ITR of the same AAV as the at least one ITR. In some embodiments, the nucleotide of interest is flanked on the other side by a second ITR, wherein the second ITR and the at least one ITR belong to different AAVs.
[00104] В некоторых вариантах осуществления композиция и/или упаковывающая клетка по настоящему изобретению дополнительно содержат молекулу нуклеиновой кислоты, содержащую представляющий интерес нуклеотид (например, нуклеотидную последовательность трансгена), фланкированный 5'- и 3'-инвертированными концевыми повторами (ITR) AAV, так что представляющие интерес вирусные частицы дополнительно содержат геном, который содержит представляющий интерес нуклеотид, фланкированный 5'- и 3'-ITR AAV.[00104] In some embodiments, the composition and/or packaging cell of the present invention further comprises a nucleic acid molecule comprising a nucleotide of interest (e.g., a nucleotide sequence of a transgene) flanked by 5' and 3' inverted terminal repeats (ITRs) of an AAV, such that the viral particles of interest further comprise a genome that comprises a nucleotide of interest flanked by 5' and 3' ITRs of an AAV.
[00105] В некоторых вариантах осуществления композиция и/или упаковывающая клетка по настоящему изобретению дополнительно содержат нуклеотидную последовательность, кодирующую эталонный капсидный белок.[00105] In some embodiments, the composition and/or packaging cell of the present invention further comprises a nucleotide sequence encoding a reference capsid protein.
[00106] Соответственно, в некоторых вариантах осуществления композиция, упаковывающая клетка и/или вирусная частица по настоящему изобретению дополнительно содержат геном, содержащий от 5'- к 3'-концу: 5'-ITR, представляющий интерес нуклеотид и 3'-ITR. В некоторых вариантах осуществления геном дополнительно содержит промотор, функционально связанный с представляющим интерес нуклеотидом. В некоторых вариантах осуществления 5'- и 3'-ITR происходят из AAV одного и того же вида. В некоторых вариантах осуществления 5'- и 3'-ITR происходят из AAV двух разных видов.[00106] Accordingly, in some embodiments, the composition, packaging cell, and/or viral particle of the present invention further comprises a genome comprising, from 5' to 3', a 5' ITR, a nucleotide of interest, and a 3' ITR. In some embodiments, the genome further comprises a promoter operably linked to the nucleotide of interest. In some embodiments, the 5' and 3' ITRs are from an AAV of the same species. In some embodiments, the 5' and 3' ITRs are from an AAV of two different species.
[00107] В некоторых вариантах осуществления представляющий интерес нуклеотид представляет собой репортерный ген. В некоторых вариантах осуществления репортерный ген кодирует (3-галактозидазу, зеленый флуоресцентный белок (GFP), усиленный зеленый флуоресцентный белок (eGFP), MmGFP, синий флуоресцентный белок (BFP), усиленный синий флуоресцентный белок (eBFP), mPlum, mCherry, tdTomato, mStrawberry, J-Red, DsRed, mOrange, mKO, mCitrine, Venus, YPet, желтый флуоресцентный белок (YFP), усиленный желтый флуоресцентный белок (eYFP), Emerald, CyPet, голубой флуоресцентный белок (CFP), Cerulean, Т-Sapphire, люциферазу, щелочную фосфатазу или их комбинацию.[00107] In some embodiments, the nucleotide of interest is a reporter gene. In some embodiments, the reporter gene encodes (3-galactosidase, green fluorescent protein (GFP), enhanced green fluorescent protein (eGFP), MmGFP, blue fluorescent protein (BFP), enhanced blue fluorescent protein (eBFP), mPlum, mCherry, tdTomato, mStrawberry, J-Red, DsRed, mOrange, mKO, mCitrine, Venus, YPet, yellow fluorescent protein (YFP), enhanced yellow fluorescent protein (eYFP), Emerald, CyPet, cyan fluorescent protein (CFP), Cerulean, T-Sapphire, luciferase, alkaline phosphatase, or a combination thereof.
[00108] В некоторых вариантах осуществления представляющий интерес нуклеотид кодирует терапевтический белок, суицидный ген, антитело или его фрагмент, систему CRISPR/Cas или ее часть(-и), антисмысловой олигонуклеотид, рибозим, молекулу для RNAi или shRNA.[00108] In some embodiments, the nucleotide of interest encodes a therapeutic protein, a suicide gene, an antibody or fragment thereof, a CRISPR/Cas system or portion(s) thereof, an antisense oligonucleotide, a ribozyme, an RNAi molecule, or an shRNA.
[00109] В данном документе описан способ получения вирусной частицы AAV по настоящему изобретению, при этом способ предусматривает культивирование упаковывающей клетки в условиях, достаточных для продуцирования вирусных частиц, при этом упаковывающая клетка содержит (1) по меньшей мере одну нуклеотидную последовательность, кодирующую один или более белков Rep AAV, например ген rep, и (2) первую нуклеотидную последовательность, кодирующую капсидный белок VP1 AAV, необязательно вторую нуклеотидную последовательность, кодирующую капсидный белок VP2 AAV, и третью нуклеотидную последовательность, кодирующую капсидный белок VP3 AAV животного, не являющегося приматом (например, первую, вторую и третью нуклеотидную молекулу по настоящему изобретению), и необязательно (3) представляющий интерес нуклеотид, фланкированный первым и/или вторым ITR второго AAV, где один или более белков Rep AAV распознают сайт распознавания первого и/или второго ITR второго AAV, где третья нуклеотидная последовательность кодирует капсидный белок VP3 AAV животного, не являющегося приматом, по настоящему изобретению, и где необязательно первая нуклеотидная последовательность кодирует капсидный белок VP1 AAV по настоящему изобретению, и/или вторая нуклеотидная последовательность кодирует капсидный белок VP2 AAV по настоящему изобретению. В некоторых вариантах осуществления один ген cap по настоящему изобретению содержит первую, вторую и третью нуклеотидные последовательности. В некоторых вариантах осуществления отдельная упаковывающая плазмида содержит по меньшей мер одну нуклеотидную последовательность, кодирующую один или более белков Rep AAV, и любую комбинацию первого, второго и третьего нуклеотидов, кодирующих капсидный белок VP1 AAV, капсидный белок VP2 AAV и капсидный белок VP3 соответственно AAV животного, не являющегося приматом.[00109] Described herein is a method for producing an AAV viral particle of the present invention, the method comprising culturing a packaging cell under conditions sufficient to produce viral particles, wherein the packaging cell comprises (1) at least one nucleotide sequence encoding one or more AAV Rep proteins, such as a rep gene, and (2) a first nucleotide sequence encoding an AAV capsid protein VP1, optionally a second nucleotide sequence encoding an AAV capsid protein VP2, and a third nucleotide sequence encoding an AAV capsid protein VP3 of a non-primate animal (e.g., a first, second, and third nucleotide molecule of the present invention), and optionally (3) a nucleotide of interest flanked by a first and/or second ITR of a second AAV, wherein the one or more AAV Rep proteins recognize a recognition site of the first and/or second ITR of the second AAV, wherein the third nucleotide sequence encodes a capsid a non-primate AAV VP3 protein of the present invention, and wherein optionally the first nucleotide sequence encodes an AAV capsid protein VP1 of the present invention and/or the second nucleotide sequence encodes an AAV capsid protein VP2 of the present invention. In some embodiments, a single cap gene of the present invention comprises the first, second and third nucleotide sequences. In some embodiments, a single packaging plasmid comprises at least one nucleotide sequence encoding one or more AAV Rep proteins and any combination of the first, second and third nucleotides encoding an AAV capsid protein VP1, an AAV capsid protein VP2 and a AAV capsid protein VP3, respectively, of a non-primate AAV.
[00110] В некоторых вариантах осуществления способ предусматривает культивирование упаковывающей клетки по настоящему изобретению. В некоторых вариантах осуществления способ предусматривает культивирование упаковывающей клетки по настоящему изобретению, содержащей молекулу нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению, где упаковывающая клетка необязательно дополнительно содержит плазмиду-помощника и/или плазмиду-переносчика, содержащую представляющий интерес нуклеотид.[00110] In some embodiments, the method comprises culturing a packaging cell of the present invention. In some embodiments, the method comprises culturing a packaging cell of the present invention comprising a nucleic acid molecule of the present invention, wherein the packaging cell optionally further comprises a helper plasmid and/or a transfer plasmid comprising a nucleotide of interest.
[00111] Некоторые варианты осуществления способа дополнительно предусматривают выделение самокомплементарных частиц аденоассоциированного вируса из культурального супернатанта и/или клеточного лизата. Некоторые варианты осуществления способа дополнительно предусматривают осуществление лизиса упаковывающей клетки и выделение частиц на основе однонитевого аденоассоциированного вируса из культурального супернатанта и/или клеточного лизата. Некоторые варианты осуществления дополнительно предусматривают: а. удаление клеточного дебриса, b. обработку супернатанта, содержащего вирусные частицы, бензоназой или ДНКазой I и MgCl2, с. концентрирование вирусных частиц, d. очистку вирусных частиц и е. любую комбинацию a-d.[00111] Some embodiments of the method further comprise isolating the self-complementary adeno-associated virus particles from the culture supernatant and/or the cell lysate. Some embodiments of the method further comprise lysing the packaging cell and isolating the single-stranded adeno-associated virus particles from the culture supernatant and/or the cell lysate. Some embodiments further comprise: a. removing cellular debris, b. treating the supernatant containing the viral particles with benzonase or DNase I and MgCl2, c. concentrating the viral particles, d. purifying the viral particles, and e. any combination of a-d.
[00112] В некоторых вариантах осуществления путем трансфекции смесей первого гена cap, кодирующего капсидный белок VP, содержащий первого партнера из связывающейся пары белок:белок, и по меньшей мере одного эталонного гена cap, кодирующего эталонный капсидный белок VP, в упаковывающие клетки при определенном соотношении получают мозаичные вирусные частицы. В некоторых вариантах осуществления мозаичную вирусную частицу по настоящему изобретению можно получить с помощью смесей, содержащих модифицированный ген сар:эталонный(-ые) ген(-ы) cap.В некоторых вариантах осуществления модифицированный ген cap кодирует по меньшей мере один из капсидных белков VP1, VP2 и VP3 AAV, который содержит модификацию, например первого партнера из связывающейся пары белок:белок, и эталонный ген cap кодирует эталонный капсидный белок, соответствующий по меньшей мере одному из модифицированных капсидных белков VP1, VP2 и VP3 AAV, за исключением модификации. В некоторых вариантах осуществления модифицированный ген cap кодирует капсидный белок VP1, модифицированный с помощью первого партнера из связывающейся пары белок:белок, и эталонный ген cap кодирует эталонный капсидный белок VP1 без модификации. В некоторых вариантах осуществления модифицированный ген cap кодирует капсидный белок VP2, модифицированный с помощью первого партнера из связывающейся пары белок:белок, и эталонный ген cap кодирует эталонный капсидный белок VP2 без модификации. В некоторых вариантах осуществления модифицированный ген cap кодирует капсидный белок VP3, модифицированный с помощью первого партнера из связывающейся пары белок:белок, и эталонный ген cap кодирует эталонный капсидный белок VP3 без модификации.[00112] In some embodiments, mosaic virus particles are produced by transfecting mixtures of a first cap gene encoding a VP capsid protein comprising a first partner of a protein:protein binding pair and at least one reference cap gene encoding a reference VP capsid protein into packaging cells at a certain ratio. In some embodiments, a mosaic virus particle of the present invention can be produced using mixtures comprising a modified cap gene:reference cap gene(s). In some embodiments, the modified cap gene encodes at least one of the AAV capsid proteins VP1, VP2, and VP3 that comprises a modification, such as a first partner of a protein:protein binding pair, and the reference cap gene encodes a reference capsid protein corresponding to at least one of the modified AAV capsid proteins VP1, VP2, and VP3, except for the modification. In some embodiments, the modified cap gene encodes a VP1 capsid protein modified with the first partner of the protein:protein binding pair, and the reference cap gene encodes the reference VP1 capsid protein without modification. In some embodiments, the modified cap gene encodes a VP2 capsid protein modified with the first partner of the protein:protein binding pair, and the reference cap gene encodes the reference VP2 capsid protein without modification. In some embodiments, the modified cap gene encodes a VP3 capsid protein modified with the first partner of the protein:protein binding pair, and the reference cap gene encodes the reference VP3 capsid protein without modification.
[00113] Как правило, вирусные частицы, описанные в данном документе, содержат вирусный капсид, содержащий вирусный капсидный белок, описанный в данном документе, включая мозаичные вирусные капсиды, где вирусный капсид инкапсидирует представляющий интерес нуклеотид. В некоторых вариантах осуществления представляющий интерес нуклеотид находится под контролем промотора, выбранного из группы, состоящей из вирусного промотора, бактериального промотора, промотора гена млекопитающего, промотора гена птицы, промотора гена рыбы, промотора гена насекомого и любой их комбинации. В некоторых вариантах осуществления представляющий интерес нуклеотид находится под контролем промотора, отличного от человеческого. В некоторых вариантах осуществления промотор представляет собой цитомегаловирусный (CMV) промотор. В некоторых вариантах осуществления промотор представляет собой промотор EF, например EF1α. В некоторых вариантах осуществления промотор представляет собой промотор CAG. В некоторых вариантах осуществления промотор представляет собой промотор гена убиквитина С (UbC).[00113] Typically, the viral particles described herein comprise a viral capsid comprising a viral capsid protein described herein, including mosaic viral capsids, wherein the viral capsid encapsidates a nucleotide of interest. In some embodiments, the nucleotide of interest is under the control of a promoter selected from the group consisting of a viral promoter, a bacterial promoter, a mammalian gene promoter, an avian gene promoter, a fish gene promoter, an insect gene promoter, and any combination thereof. In some embodiments, the nucleotide of interest is under the control of a non-human promoter. In some embodiments, the promoter is a cytomegalovirus (CMV) promoter. In some embodiments, the promoter is an EF promoter, such as EF1α. In some embodiments, the promoter is a CAG promoter. In some embodiments, the promoter is a ubiquitin C (UbC) gene promoter.
[00114] Как правило, представляющий интерес нуклеотид может представлять собой один или более генов, которые могут кодировать детектируемый маркер, например репортер, или терапевтический полипептид. В некоторых вариантах осуществления представляющий интерес нуклеотид представляет собой репортерный ген. В некоторых вариантах осуществления представляющий интерес нуклеотид представляет собой репортерный ген, который кодирует детектируемый маркер, выбранный из группы, состоящей из зеленого флуоресцентного белка, люциферазы, β-галактозидазы и т.д. В некоторых вариантах осуществления детектируемый маркер представляет собой зеленый флуоресцентный белок. В других вариантах осуществления представляющий интерес нуклеотид выбран из группы, состоящей из суицидного гена, нуклеотида, кодирующего антитело или его фрагмент, нуклеотида, кодирующего систему CRISPR/Cas или ее часть(-и), нуклеотида, кодирующего антисмысловую РНК, нуклеотида, кодирующего siRNA, секретируемый фермент, гена, кодирующего терапевтический белок и т.д. В одном варианте осуществления представляющий интерес нуклеотид кодирует полидоменное терапевтическое средство, например белок, который содержит по меньшей мере два домена, обеспечивающие две разные функции.[00114] Typically, the nucleotide of interest may be one or more genes that can encode a detectable marker, such as a reporter, or a therapeutic polypeptide. In some embodiments, the nucleotide of interest is a reporter gene. In some embodiments, the nucleotide of interest is a reporter gene that encodes a detectable marker selected from the group consisting of green fluorescent protein, luciferase, β-galactosidase, etc. In some embodiments, the detectable marker is green fluorescent protein. In other embodiments, the nucleotide of interest is selected from the group consisting of a suicide gene, a nucleotide encoding an antibody or fragment thereof, a nucleotide encoding a CRISPR/Cas system or portion(s) thereof, a nucleotide encoding an antisense RNA, a nucleotide encoding an siRNA, a secreted enzyme, a gene encoding a therapeutic protein, etc. In one embodiment, the nucleotide of interest encodes a multidomain therapeutic agent, such as a protein that contains at least two domains that provide two different functions.
[00115] Композиции, описанные в данном документе, как правило, содержат вирусную частицу, которая содержит вирусный капсидный белок, описанный в данном документе, например, содержит капсид, содержащий вирусный капсидный белок (в том числе мозаичный капсид), где капсид инкапсидирует представляющий интерес нуклеотид. В некоторых вариантах осуществления композиция, описанная в данном документе, содержит (1) вирусную частицу, имеющую капсид, содержащий вирусный капсидный белок, описанный в данном документе, и (2) фармацевтически приемлемый носитель.[00115] The compositions described herein typically comprise a viral particle that comprises a viral capsid protein described herein, such as comprising a capsid that comprises a viral capsid protein (including a mosaic capsid), wherein the capsid encapsidates a nucleotide of interest. In some embodiments, a composition described herein comprises (1) a viral particle that has a capsid that comprises a viral capsid protein described herein, and (2) a pharmaceutically acceptable carrier.
[00116] Также в данном документе описаны способы применения вирусных капсидных белков, вирусных частиц, содержащих их, композиций и т.д. В некоторых вариантах осуществления способы предусматривают приведение клетки-мишени (которая может находиться in vitro (например, ex vivo) или in vivo, например, в человеке) в контакт с вирусной частицей, содержащей вирусный капсидный белок, описанный в данном документе, где вирусный капсид или вирусная частица содержит нацеливающий лиганд, который специфически связывает белок, экспрессируемый на поверхности клетки-мишени.[00116] Also described herein are methods of using viral capsid proteins, viral particles containing them, compositions, etc. In some embodiments, the methods involve contacting a target cell (which may be in vitro (e.g., ex vivo) or in vivo, such as in a human) with a viral particle containing a viral capsid protein described herein, wherein the viral capsid or viral particle comprises a targeting ligand that specifically binds a protein expressed on the surface of the target cell.
[00117] Вирусные частицы, описанные в данном документе, особенно подходят для целенаправленного введения представляющего интерес нуклеотида в конкретную клетку, поскольку вирусный(-ые) капсидный(-ые) белок(белки), описанный(-ые) в данном документе, содержит первого партнера из связывающейся пары белок:белок для его когнатного второго партнера, необязательно связанного с нацеливающим лигандом. В некоторых вариантах осуществления нацеливающий лиганд функционально связан с белком (вторым партнером), например, слит с белком, необязательно с помощью линкера. В некоторых вариантах осуществления нацеливающий лиганд может представлять собой связывающий фрагмент, например природный лиганд, антитело, полиспецифическую связывающую молекулу и т.д. В некоторых вариантах осуществления нацеливающий лиганд представляет собой антитело или его часть. В некоторых вариантах осуществления нацеливающий лиганд представляет собой антитело, содержащее вариабельный домен, который связывает белок клеточной поверхности на клетке-мишени, и константный домен тяжелой цепи. В некоторых вариантах осуществления нацеливающий лиганд представляет собой антитело, содержащее вариабельный домен, который связывает белок клеточной поверхности на клетке-мишени, и константный домен тяжелой цепи IgG. В некоторых вариантах осуществления нацеливающий лиганд представляет собой антитело, содержащее вариабельный домен, который связывает белок клеточной поверхности на клетке-мишени, и константный домен тяжелой цепи IgG, где константный домен тяжелой цепи IgG функционально связан, например посредством линкера, с белком (например, вторым партнером из связывающейся пары белок:белок), который образует изопептидную ковалентную связь с первым партнером. В некоторых вариантах осуществления капсидный белок, описанный в данном документе, содержит первого партнера, предусматривающего SpyTag, который функционально связан с вирусным капсидным белком и ковалентно связан со SpyTag, второго партнера, предусматривающего SpyCatcher, который связан с нацеливающим лигандом, содержащим вариабельный домен антитела и домен тяжелой цепи IgG, где SpyCatcher и домен тяжелой цепи IgG связаны посредством аминокислотного линкера, например, GSGESG (SEQ ID NO:49). В некоторых вариантах осуществления второй партнер содержит последовательность, изложенную под SEQ ID NO:47, которая содержит часть тяжелой цепи человеческого IgG4, при этом указанная часть IgG4 имеет последовательность, изложенную под SEQ ID NO:51, связанную посредством линкера (SEQ ID NO:49) со SpyCatcher (SEQ ID NO:43).[00117] The viral particles described herein are particularly suitable for targeted delivery of a nucleotide of interest to a specific cell because the viral capsid protein(s) described herein comprise a first partner of a protein:protein binding pair for its cognate second partner, optionally linked to a targeting ligand. In some embodiments, the targeting ligand is operably linked to the protein (second partner), e.g., fused to the protein, optionally via a linker. In some embodiments, the targeting ligand can be a binding moiety, e.g., a natural ligand, an antibody, a multispecific binding molecule, etc. In some embodiments, the targeting ligand is an antibody or a portion thereof. In some embodiments, the targeting ligand is an antibody comprising a variable domain that binds a cell surface protein on a target cell and a heavy chain constant domain. In some embodiments, the targeting ligand is an antibody comprising a variable domain that binds a cell surface protein on a target cell and a constant domain of an IgG heavy chain. In some embodiments, the targeting ligand is an antibody comprising a variable domain that binds a cell surface protein on a target cell and a constant domain of an IgG heavy chain, wherein the constant domain of the IgG heavy chain is operably linked, such as via a linker, to a protein (e.g., a second partner of a protein:protein binding pair) that forms an isopeptide covalent bond with the first partner. In some embodiments, the capsid protein described herein comprises a first partner comprising a SpyTag that is operably linked to a viral capsid protein and covalently linked to the SpyTag, a second partner comprising a SpyCatcher that is linked to a targeting ligand comprising an antibody variable domain and an IgG heavy chain domain, wherein the SpyCatcher and the IgG heavy chain domain are linked via an amino acid linker, such as GSGESG (SEQ ID NO:49). In some embodiments, the second partner comprises the sequence set forth at SEQ ID NO:47, which comprises a portion of a human IgG4 heavy chain, wherein said portion of IgG4 has the sequence set forth at SEQ ID NO:51, linked via a linker (SEQ ID NO:49) to the SpyCatcher (SEQ ID NO:43).
[00118] Как правило, нацеливающий лиганд специфически связывает молекулу клеточной поверхности, например олигосахарид, рецептор, маркер клеточной поверхности и т.д., экспрессируемую на поверхности эукариотической клетки млекопитающего (например, человека), например клетки-мишени.[00118] Typically, the targeting ligand specifically binds a cell surface molecule, such as an oligosaccharide, a receptor, a cell surface marker, etc., expressed on the surface of a mammalian (e.g., human) eukaryotic cell, such as a target cell.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВBRIEF DESCRIPTION OF GRAPHIC MATERIALS
[00119] На фиг.1 представлен иллюстративный (без соблюдения масштаба), неограничивающий и типичный вариант осуществления плазмиды для экспрессии Rep-Cap по настоящему изобретению, которую можно использовать для получения химерной вирусной частицы AAV. Последовательности AAV примата показаны в виде незакрашенных прямоугольников, а последовательности AAV животного, не являющегося приматом, показаны как закрашенные прямоугольники. Также только в качестве иллюстрации изображены типичные неограничивающие положения (без соблюдения масштаба) для вставки (1) первого партнера из связывающейся пары белок:белок, предназначенного для направления тропизма собранного капсида, содержащего закодированные белки VP1, VP2 и VP3 (сплошная линия в пределах последовательностей капсида AAV животного, не являющегося приматом), и (2) детектируемой метки для обнаружения закодированных белков VP1, VP2 и VP3 (пунктирная линия в пределах последовательностей капсида AAV животного, не являющегося приматом). Плазмиду экспрессии Rep-Cap, показанную на фиг.1, можно применять для продуцирования вирусных частиц AAV, содержащих представляющий интерес нуклеотид, который фланкирован последовательностями инвертированных 5'- и 3'-концевых повторов (ITR) AAV примата.[00119] Figure 1 shows an illustrative (not drawn to scale), non-limiting, and exemplary embodiment of a Rep-Cap expression plasmid of the present invention that can be used to produce a chimeric AAV viral particle. Primate AAV sequences are shown as open boxes and non-primate AAV sequences are shown as filled boxes. Also shown, for illustrative purposes only, are exemplary non-limiting positions (not drawn to scale) for insertion of (1) a first partner of a protein:protein binding pair designed to direct the tropism of an assembled capsid containing the encoded VP1, VP2, and VP3 proteins (solid line within non-primate AAV capsid sequences) and (2) a detectable label for detecting the encoded VP1, VP2, and VP3 proteins (dashed line within non-primate AAV capsid sequences). The Rep-Cap expression plasmid shown in Fig. 1 can be used to produce AAV viral particles containing a nucleotide of interest that is flanked by primate AAV 5' and 3' inverted terminal repeat (ITR) sequences.
[00120] На фиг.2 представлены результаты вестерн-блоттинга с использованием антитела к В1, которое распознает эпитоп В1, сконструированный в химерном гене cap AAV примата/животного, не являющегося приматом (см. фиг.1), для анализа полученного химерного белка VP1 AAV примата/животного, не являющегося приматом, белка VP2 AAV животного, не являющегося приматом, и белка VP3 AAV животного, не являющегося приматом. AAV примата представлял собой AAV2, a AAV животного, не являющегося приматом, представлял собой: (А) птичий AAV, (В) AAV морского льва или (C)AAV бородатой агамы. С помощью вестерн-блоттинга анализировали образцы белка, собранные на различных стадиях очистки частиц AAV посредством аффинной хроматографии, включая вводимый образец, проточную (FT) фракцию и элюируемую фракцию из колонки для аффинной хроматографии.[00120] Figure 2 shows the results of a Western blot using an anti-B1 antibody that recognizes a B1 epitope engineered in a primate/non-primate AAV chimeric cap gene (see Figure 1) to analyze the resulting primate/non-primate AAV chimeric VP1 protein, non-primate AAV VP2 protein, and non-primate AAV VP3 protein. The primate AAV was AAV2 and the non-primate AAV was (A) avian AAV, (B) sea lion AAV, or (C) bearded dragon AAV. Western blotting was used to analyze protein samples collected from various stages of AAV particle affinity chromatography purification, including the input sample, flow-through (FT) fraction, and elution fraction from the affinity chromatography column.
[00121] На фиг.3А представлена неограничивающая предсказанная ленточная структура VP3 птичьего AAV с выделением K580 и G444 в качестве неограничивающих сайтов вставки для первого партнера из связывающейся пары белок:белок. На фиг.3В представлена количественная оценка вирусного титра методом qPCR на основе неочищенных вирусных препаратов из панели химерных вирусных частиц AAV2/птичьего AAV либо без SpyTag, либо содержащих вставку SpyTag в указанном положении, или мозаичных частиц, состоящих из частиц AAV2/птичьего AAV без SpyTag в смеси с частицами AAV2/птичьего AAV, несущими вставку пептида SpyTag в указанном положении. На фиг.3С представлен результат вестерн-блоттинга с использованием антитела к В1, которое распознает линейный эпитоп, сконструированный в химерных капсидных белках VP1, VP2 и VP3 AAV2/птичьего AAV, выполненного для анализа реакции между антителом к ASGR1, слитым со SpyCatcher «SpyC-mAb к ASGR1», и панелью химерных вирусных частиц AAV2/птичьего AAV, которые либо содержат вставку SpyTag в указанном положении, либо не содержат ее, или мозаичных частиц, содержащих химерные частицы AAV2/птичьего AAV без SpyTag в смеси с химерными частицами AAV2/птичьего AAV, несущими вставку пептида SpyTag в указанном положении.[00121] Figure 3A shows the non-restrictive predicted band structure of avian AAV VP3 highlighting K580 and G444 as non-restrictive insertion sites for the first partner of the protein:protein binding pair. Figure 3B shows qPCR quantification of viral titer based on crude viral preparations from a panel of AAV2/avian AAV chimeric viral particles either lacking SpyTag or containing a SpyTag insert at the indicated position, or mosaic particles consisting of AAV2/avian AAV particles lacking SpyTag mixed with AAV2/avian AAV particles bearing a SpyTag insert peptide at the indicated position. Figure 3C shows the result of a Western blot using an anti-B1 antibody that recognizes a linear epitope engineered in the AAV2/avian AAV chimeric capsid proteins VP1, VP2, and VP3, performed to analyze the reaction between the anti-ASGR1 antibody fused to the SpyCatcher "SpyC-anti-ASGR1 mAb" and a panel of AAV2/avian AAV chimeric viral particles that either contained or lacked a SpyTag insert at the indicated position, or mosaic particles containing SpyTag-less AAV2/avian AAV chimeric particles mixed with SpyTag-inserted AAV2/avian AAV chimeric particles at the indicated position.
[00122] На фиг.4А представлена неограничивающая предсказанная ленточная структура VP3 AAV морского льва с выделением А565 и G432 в качестве неограничивающих сайтов вставки для первого партнера из связывающейся пары белок:белок. На фиг.4В представлена количественная оценка вирусного титра методом qPCR на основе неочищенных вирусных препаратов из панели химерных вирусных частиц AAV2/AAV морского льва, либо без SpyTag, либо содержащих вставку SpyTag в указанном положении, или мозаичных частиц, состоящих из частиц AAV2/AAV морского льва без SpyTag в смеси с частицами AAV2/AAV морского льва, несущими вставку пептида SpyTag в указанном положении. На фиг.4С представлен результат вестерн-блоттинга с использованием антитела к В1, которое распознает линейный эпитоп, сконструированный в химерных капсидных белках VP1, VP2 и VP3 AAV2/AAV морского льва, выполненного для анализа реакции между антителом к HER2 (HERCEPTIN®), слитым со SpyCatcher «SpyC-mAb к HER2», и панелью химерных вирусных частиц AAV2/AAV морского льва, которые либо содержат вставку SpyTag в указанном положении, либо не содержат ее, или мозаичных частиц AAV2/AAV морского льва, содержащих химерные частицы AAV2/AAV морского льва без SpyTag в смеси с химерными частицами AAV2/AAV морского льва, несущими вставку пептида SpyTag в указанном положении.[00122] Figure 4A shows the non-restrictive predicted band structure of sea lion AAV VP3 highlighting A565 and G432 as non-restrictive insertion sites for the first partner of the protein:protein binding pair. Figure 4B shows qPCR quantification of viral titer based on crude viral preparations from a panel of sea lion AAV2/AAV chimeric viral particles, either lacking SpyTag or containing a SpyTag insert at the indicated position, or mosaic particles consisting of sea lion AAV2/AAV particles lacking SpyTag mixed with sea lion AAV2/AAV particles bearing a SpyTag insert peptide at the indicated position. Figure 4C shows the result of a Western blot using an anti-B1 antibody that recognizes a linear epitope engineered in the sea lion AAV2/AAV chimeric capsid proteins VP1, VP2 and VP3, performed to analyze the reaction between an anti-HER2 antibody (HERCEPTIN®) fused to the SpyCatcher "SpyC-mAb to HER2" and a panel of sea lion AAV2/AAV chimeric viral particles that either contain or do not contain a SpyTag insert at the indicated position, or mosaic AAV2/AAV particles containing SpyTag-less sea lion AAV2/AAV chimeric particles mixed with SpyTag-inserted sea lion AAV2/AAV chimeric particles at the indicated position.
[00123] На фиг.5 представлена (А) количественная оценка вирусного титра методом qPCR на основе неочищенных вирусных препаратов из панели вирусных частиц AAV2/AAV морского льва либо без SpyTag, либо несущих вставку SpyTag в указанном положении, и (В) результат вестерн-блоттинга с использованием антитела к В1, которое распознает линейный эпитоп, сконструированный в химерных капсидных белках VP1, VP2 и VP3 AAV2/AAV морского льва, выполненного для анализа реакции между антителом к HER2 (HERCEPTIN®), слитым со SpyCatcher «SpyC-mAb», и панелью вирусных частиц AAV морского льва либо без SpyTag, либо несущих вставку SpyTag в указанном положении.[00123] Figure 5 shows (A) a quantitative qPCR assay of viral titer based on crude viral preparations from a panel of sea lion AAV2/AAV viral particles either lacking SpyTag or bearing a SpyTag insert at the indicated position, and (B) the result of a Western blot using an anti-B1 antibody that recognizes a linear epitope engineered in the sea lion AAV2/AAV chimeric capsid proteins VP1, VP2, and VP3, performed to analyze the reaction between an anti-HER2 antibody (HERCEPTIN®) fused to a SpyCatcher "SpyC-mAb" and a panel of sea lion AAV viral particles either lacking SpyTag or bearing a SpyTag insert at the indicated position.
[00124] На фиг.6А представлена неограничивающая предсказанная ленточная структура VP3 AAV бородатой агамы с выделением Т573 и G436 в качестве неограничивающих сайтов вставки для первого партнера из связывающейся пары белок:белок. На фиг.6В представлена количественная оценка вирусного титра методом qPCR на основе неочищенных вирусных препаратов из панели химерных вирусных частиц AAV2/AAV бородатой агамы либо без SpyTag, либо содержащих вставку SpyTag в указанном положении, или мозаичных частиц, состоящих из частиц AAV2/AAV бородатой агамы без SpyTag в смеси с частицами AAV2/AAV бородатой агамы, несущими вставку пептида SpyTag в указанном положении. На фиг.6С представлен результат вестерн-блоттинга с использованием антитела к В1, которое распознает линейный эпитоп, сконструированный в химерных капсидных белках VP1, VP2 и VP3 AAV2/AAV бородатой агамы, выполненного для анализа реакции между антителом к HER2 (HERCEPTIN®), слитым со SpyCatcher «SpyC-mAb к HER2», и панелью химерных вирусных частиц AAV2/AAV бородатой агамы, которые либо содержат вставку SpyTag в указанном положении, либо не содержат ее, или мозаичных частиц AAV2/AAV бородатой агамы, содержащих химерные частицы AAV2/AAV бородатой агамы без SpyTag в смеси с химерными частицами AAV2/AAV бородатой агамы, несущими вставку пептида SpyTag в указанном положении.[00124] Figure 6A shows the non-restrictive predicted band structure of bearded dragon AAV VP3 highlighting T573 and G436 as the non-restrictive insertion sites for the first partner of the protein:protein binding pair. Figure 6B shows qPCR quantification of viral titer based on crude viral preparations from a panel of chimeric bearded dragon AAV2/AAV viral particles either lacking SpyTag or containing a SpyTag insert at the indicated position, or mosaic particles consisting of bearded dragon AAV2/AAV particles lacking SpyTag mixed with bearded dragon AAV2/AAV particles bearing a SpyTag insert peptide at the indicated position. Figure 6C shows the result of a Western blot using an anti-B1 antibody that recognizes a linear epitope engineered in the bearded dragon AAV2/AAV chimeric capsid proteins VP1, VP2, and VP3, performed to analyze the reaction between an anti-HER2 antibody (HERCEPTIN®) fused to the SpyCatcher "SpyC-anti-HER2 mAb" and a panel of bearded dragon AAV2/AAV chimeric viral particles that either contain or do not contain a SpyTag insert at the indicated position, or mosaic AAV2/bearded dragon AAV particles containing SpyTag-less AAV2/bearded dragon chimeric particles mixed with SpyTag-inserted AAV2/bearded dragon chimeric particles at the indicated position.
[00125] На фиг.7А представлены диаграммы рассеяния, полученные по результатам проточной цитометрии, оценивающей экспрессию зеленого флуоресцентного белка (GFP) НЕР2-положительными (+) клетками 293 hErbB2, инфицированными химерными частицами AAV2/AAAV без SpyTag, химерными частицами AAV2/AAAV G444 линкер-6 SpyTag или химерными частицами AAV2/AAAV K580 линкер-6 SpyTag. Химерные частицы AAV2/AAAV G444 линкер-6 SpyTag и химерные частицы AAV2/AAAV К580 линкер-6 SpyTag конъюгировали с одним из нерелевантного контрольного изотипического антитела против GLP1R или антитела к HER2 (HERCEPTIN®), слитого со SpyCatcher (SEQ ID NO:43), посредством SpyTag (SEQ ID NO:42). Вирусы экспрессируют GFP в качестве маркера трансдукции. На фиг.7 В представлены диаграммы рассеяния, полученные по результатам проточной цитометрии, оценивающей экспрессию зеленого флуоресцентного белка (GFP) исходными ASGR1-отрицательными (-) клетками 293 или ASGRl-положительными (+) клетками 293 hASGRl, инфицированными химерными частицами AAV2/AAAV без SpyTag или химерными частицами AAV2/AAAV K580 линкер-6 SpyTag. Химерные частицы AAV2/AAAV K580 линкер-6 SpyTag конъюгировали с одним из нерелевантного контрольного изотипического антитела против GLP1R, слитого со SpyCatcher посредством SpyTag, или конъюгировали со слитым со SpyCatcher антителом, которое специфически связывает ASGR1, посредством SpyTag. Вирусы экспрессируют GFP в качестве маркера трансдукции.[00125] Figure 7A shows scatterplots obtained from flow cytometry analysis of green fluorescent protein (GFP) expression by HEP2-positive (+) 293 hErbB2 cells infected with AAV2/AAAV chimeric particles without SpyTag, AAV2/AAAV G444 linker-6 SpyTag chimeric particles, or AAV2/AAAV K580 linker-6 SpyTag chimeric particles. AAV2/AAAV G444 linker-6 SpyTag chimeric particles and AAV2/AAAV K580 linker-6 SpyTag chimeric particles were conjugated to one of an irrelevant isotype control antibody against GLP1R or an antibody against HER2 (HERCEPTIN®) fused to SpyCatcher (SEQ ID NO:43) via SpyTag (SEQ ID NO:42). The viruses express GFP as a transduction marker. Figure 7B shows scatterplots obtained from flow cytometry assessing green fluorescent protein (GFP) expression by parental ASGR1-negative (-) 293 cells or ASGR1-positive (+) 293 hASGR1 cells infected with SpyTag-less AAV2/AAAV chimeric particles or SpyTag-free AAV2/AAAV K580 linker-6 chimeric particles. The AAV2/AAAV K580 linker-6 SpyTag chimeric particles were conjugated to one of an irrelevant anti-GLP1R isotype control antibody fused to SpyCatcher via SpyTag or conjugated to a SpyCatcher-fused antibody that specifically binds ASGR1 via SpyTag. The viruses express GFP as a transduction marker.
[00126] На фиг.8А представлены диаграммы рассеяния, полученные по результатам проточной цитометрии, оценивающей экспрессию зеленого флуоресцентного белка (GFP) HER2-положительными (+) клетками 293 hErbB2 или HER2-отрицательными (-) исходными клетками 293, инфицированными химерными частицами AAV2/вируса морского льва без SpyTag или химерными частицами AAV2/вируса морского льва G432 линкер-6 SpyTag. Химерные частицы AAV2/вируса морского льва G432 линкер-6 SpyTag конъюгировали с одним из нерелевантного контрольного изотипического антитела против GLP1R, слитого со SpyCatcher посредством SpyTag, или конъюгировали с антителом к HER2 (HERCEPTIN®), слитым со SpyCatcher (SEQ ID NO:43), посредством SpyTag. Вирусы экспрессируют GFP в качестве маркера трансдукции. На фиг.8В представлены диаграммы рассеяния, полученные по результатам проточной цитометрии, оценивающей экспрессию зеленого флуоресцентного белка (GFP) ASGR1-положительными (+) клетками 293 hASGR1 или ASGR1-отрицательными (-) исходными клетками 293, инфицированными химерными частицами AAV2/вируса морского льва без SpyTag, или клетками, инфицированными химерными частицами AAV2/вируса морского льва G432 линкер-6 SpyTag. Химерные частицы AAV2/вируса морского льва G432 линкер-6 SpyTag конъюгировали с одним из нерелевантного контрольного изотипического антитела против GLP1R, слитого со SpyCatcher посредством SpyTag, или конъюгировали со слитым со SpyCatcher антителом, которое специфически связывает ASGR1, посредством SpyTag. Вирусы экспрессируют GFP в качестве маркера трансдукции.[00126] Figure 8A shows scatterplots obtained from flow cytometry assessing green fluorescent protein (GFP) expression by HER2-positive (+) 293 hErbB2 cells or HER2-negative (-) parental 293 cells infected with AAV2/sea lion virus chimeric particles without SpyTag or AAV2/sea lion virus G432 linker-6 SpyTag chimeric particles. AAV2/sea lion virus G432 linker-6 SpyTag chimeric particles were conjugated to either an irrelevant isotype control anti-GLP1R antibody fused to SpyCatcher via SpyTag or an anti-HER2 antibody (HERCEPTIN®) fused to SpyCatcher (SEQ ID NO:43) via SpyTag. The viruses express GFP as a transduction marker. Figure 8B shows scatterplots obtained from flow cytometry analysis of green fluorescent protein (GFP) expression by ASGR1-positive (+) 293 hASGR1 cells or ASGR1-negative (-) parental 293 cells infected with AAV2/sea lion virus chimeric particles without SpyTag or cells infected with AAV2/sea lion virus G432 linker-6 SpyTag chimeric particles. The AAV2/sea lion virus G432 linker-6 SpyTag chimeric particles were conjugated to one of an irrelevant isotype control anti-GLP1R antibody fused to SpyCatcher via SpyTag or conjugated to a SpyCatcher-fused antibody that specifically binds ASGR1 via SpyTag. Viruses express GFP as a transduction marker.
[00127] На фиг.9 представлены диаграммы рассеяния, полученные по результатам проточной цитометрии, оценивающей экспрессию зеленого флуоресцентного белка (GFP) HER2-положительными (+) клетками 293, инфицированными панелью химерных вирусных частиц AAV2/AAV морского льва, либо частицами AAV2/AAV морского льва без SpyTag, либо содержащими вставку SpyTag в указанном положении. SpyTag, вставленную в химерные частицы AAV2/вируса морского льва, конъюгировали с антителом к HER2 (HERCEPTIN®), слитым со SpyCatcher (SEQ ID NO:43), посредством SpyTag. Вирусы экспрессируют GFP в качестве маркера трансдукции.[00127] Figure 9 shows scatterplots obtained from flow cytometry assessing the expression of green fluorescent protein (GFP) by HER2-positive (+) 293 cells infected with a panel of chimeric AAV2/sea lion AAV virus particles, or with AAV2/sea lion AAV particles lacking SpyTag or containing a SpyTag insert at the indicated position. SpyTag inserted into the chimeric AAV2/sea lion virus particles was conjugated to an anti-HER2 antibody (HERCEPTIN®) fused to SpyCatcher (SEQ ID NO:43) via SpyTag. The viruses express GFP as a transduction marker.
[00128] На фиг.10А представлены диаграммы рассеяния, полученные по результатам проточной цитометрии, оценивающей экспрессию зеленого флуоресцентного белка (GFP) HER2-положительными (+) клетками 293 hErbB2, либо «неинфицированными», либо инфицированными химерными частицами AAV2/AAV бородатой агамы без SpyTag, химерными мозаичными частицами AAV2/вируса бородатой агамы Т573 линкер-6 SpyTag или химерными мозаичными частицами AAV2/вируса бородатой агамы-0436-линкер-6-SpyTag. Химерные мозаичные частицы AAV2/вируса бородатой агамы Т573 линкер-6 SpyTag и химерные мозаичные частицы AAV2/вируса бородатой агамы G436 линкер-6 SpyTag конъюгировали с антителом к HER2 (HERCEPTIN®), слитым со SpyCatcher (SEQ ID NO:43), посредством SpyTag. Вирусы экспрессируют GFP в качестве маркера трансдукции. На фиг.10 В представлены диаграммы рассеяния, полученные по результатам проточной цитометрии, оценивающей экспрессию зеленого флуоресцентного белка (GFP) ASGR1-положительными (+) клетками 293 hASGR1 или ASGR1-отрицательными (-) исходными клетками 293, инфицированными химерными частицами AAV2/AAV бородатой агамы без SpyTag, химерными частицами AAV2/вируса бородатой агамы Т573 линкер-6 SpyTag или химерными частицами AAV/2/вируса бородатой агамы Т573 линкер-6 SpyTag антитело к ASGR1. Химерные частицы AAV2/вируса бородатой агамы Т573 линкер-6 SpyTag антитело к ASGR1 конъюгировали со слитым со SpyCatcher антителом, которое специфически связывает ASGR1, посредством SpyTag. Вирусы экспрессируют GFP в качестве маркера трансдукции.[00128] Figure 10A shows scatterplots obtained from flow cytometry assessing green fluorescent protein (GFP) expression by HER2-positive (+) 293 hErbB2 cells, either uninfected or infected with AAV2/bearded dragon AAV chimeric particles without SpyTag, AAV2/bearded dragon virus T573 linker-6 SpyTag mosaic chimeric particles, or AAV2/bearded dragon virus-0436-linker-6-SpyTag mosaic chimeric particles. Chimeric AAV2/bearded dragon virus T573 linker-6 SpyTag mosaic particles and chimeric AAV2/bearded dragon virus G436 linker-6 SpyTag mosaic particles were conjugated to an anti-HER2 antibody (HERCEPTIN®) fused to SpyCatcher (SEQ ID NO:43) via SpyTag. The viruses express GFP as a transduction marker. Figure 10B shows scatterplots obtained from flow cytometry analysis of green fluorescent protein (GFP) expression by ASGR1-positive (+) 293 hASGR1 cells or ASGR1-negative (-) parental 293 cells infected with AAV2/bearded dragon AAV chimeric particles without SpyTag, AAV2/bearded dragon virus T573 linker-6 SpyTag chimeric particles, or AAV/2/bearded dragon virus T573 linker-6 SpyTag anti-ASGR1 chimeric particles. Chimeric AAV2/bearded dragon virus T573 linker-6 SpyTag anti-ASGR1 antibody particles were conjugated to a SpyCatcher fusion antibody that specifically binds ASGR1 via SpyTag. The viruses express GFP as a transduction marker.
[00129] На фиг.11А представлены результаты люциферазного анализа Nanoluc, оценивающего экспрессию репортера Nanoluc клетками, положительными (+) по hASGR1, после инфицирования частицами «AAV2 антитело к ASGR1», химерными частицами AAV2/AAAV антитело к ASGR1 или химерными частицами AAV2/AAV морского льва антитело к ASGR1 в присутствии очищенного человеческого IgG в указанной концентрации. Все частицы конъюгировали со слитым со SpyCatcher антителом, которое специфически связывает ASGR1, посредством SpyTag. Вирусы экспрессируют Nanoluc в качестве маркера трансдукции. На фиг.11 В представлена количественная оценка графиков на фиг.11А, но нормализованных по условию «только PBS». На фиг.11С представлена таблица значений IC50 концентрации IgG, требуемой для нейтрализации указанных вирусов на 50%.[00129] Figure 11A shows the results of a Nanoluc luciferase assay assessing the expression of a Nanoluc reporter by hASGR1 positive (+) cells following infection with AAV2 anti-ASGR1 particles, AAV2/AAAV anti-ASGR1 chimeric particles, or AAV2/sea lion AAV anti-ASGR1 chimeric particles in the presence of purified human IgG at the indicated concentrations. All particles were conjugated to a SpyCatcher fusion antibody that specifically binds ASGR1 via SpyTag. The viruses express Nanoluc as a transduction marker. Figure 11B shows the quantification of the graphs in Figure 11A but normalized to the PBS only condition. Figure 11C shows a table of IC50 values for the concentration of IgG required to neutralize the indicated viruses by 50%.
[00130] На фиг.12 представлены (А) люминесцентные фотографии генетически модифицированных мышей, которые экспрессируют ASGR1 человека в клетках печени (мыши, гуманизированные по ASGR1) через 33 дня после внутривенной инъекции фосфатно-солевого буферного раствора (PBS) или химерных частиц AAV2/AAAV с меткой SpyTag из расчета 5,0×1011 вирусных геномов (вг)/животное, которые несут представляющий интерес нуклеотид люциферазы светлячка и модифицированы посредством (1) S ру Catcher- антитело-к-ASGR1 человека или (2) SpyCatcher-антитело к GLP1R человека (контрольное mAb). Вирусы экспрессируют люциферазу светлячка в качестве маркера трансдукции. Мышей подвергали анестезии с использованием изофлурана, вводили инъекцией субстрат люциферин и подвергали визуализации через 10 минут с применением системы для визуализации In vivo IVIS Spectrum (PerkinElmer); (В) количественная оценка средней интенсивности излучения отдельных животных в рамках люминесцентных фотографий, представленных на панели А; и (С) количественная оценка средней интенсивности излучения иссеченных органов (печени и легких) животных, изображенных на панели А.[00130] Figure 12 shows (A) fluorescent photographs of genetically modified mice that express human ASGR1 in liver cells (ASGR1 humanized mice) 33 days after intravenous injection of phosphate-buffered saline (PBS) or SpyTag-tagged AAV2/AAAV chimeric particles at 5.0 x 10 11 viral genomes (vg)/animal that carry the firefly luciferase nucleotide of interest and are modified with (1) SpyCatcher-anti-human ASGR1 or (2) SpyCatcher-anti-human GLP1R (control mAb). The viruses express firefly luciferase as a transduction marker. Mice were anesthetized with isoflurane, injected with luciferin substrate, and imaged 10 min later using the IVIS Spectrum In Vivo Imaging System (PerkinElmer); (B) quantification of the mean radiance of individual animals within the fluorescent photographs shown in panel A; and (C) quantification of the mean radiance of excised organs (liver and lung) of the animals shown in panel A.
[00131] На фиг.13 представлены (А) люминесцентные фотографии генетически модифицированных мышей, которые экспрессируют ASGR1 человека в клетках печени (мыши, гуманизированные по ASGR1) через 33 дня после внутривенной инъекции фосфатно-солевого буферного раствора (PBS) или химерных частиц AAV2/AAV морского льва с меткой SpyTag из расчета 5,0×1011 вирусных геномов (вг)/животное, которые несут представляющий интерес нуклеотид люциферазы светлячка и модифицированы посредством (1) SpyCatcher-антитело-к-ASGR1 человека или (2) SpyCatcher-антитело к GLP1R человека (контрольное mAb). Вирусы экспрессируют люциферазу светлячка в качестве маркера трансдукции. Мышей подвергали анестезии с использованием изофлурана, вводили инъекцией субстрат люциферин и подвергали визуализации через 10 минут с применением системы для визуализации In vivo IVIS Spectrum (PerkinElmer); (В) количественная оценка средней интенсивности излучения отдельных животных в рамках люминесцентных фотографий, представленных на панели А; (С) количественная оценка средней интенсивности излучения иссеченных органов (печени и легких) животных, изображенных на панели А.[00131] Figure 13 shows (A) fluorescent photographs of genetically modified mice that express human ASGR1 in liver cells (ASGR1 humanized mice) 33 days after intravenous injection of phosphate-buffered saline (PBS) or SpyTag-tagged sea lion AAV2/AAV chimeric particles at 5.0 x 10 11 viral genomes (vg)/animal that carry the firefly luciferase nucleotide of interest and are modified with (1) SpyCatcher anti-human ASGR1 antibody or (2) SpyCatcher anti-human GLP1R antibody (control mAb). The viruses express firefly luciferase as a transduction marker. Mice were anesthetized with isoflurane, injected with luciferin substrate, and imaged 10 min later using the IVIS Spectrum In Vivo Imaging System (PerkinElmer); (B) quantification of the mean radiance of individual animals within the fluorescent photographs shown in panel A; (C) quantification of the mean radiance of excised organs (liver and lung) of the animals shown in panel A.
[00132] На фиг.14 представлено иммунофлуоресцентная фотография культуры эксплантата кортиева органа внутреннего уха новорожденной мыши через 3 дня после инфицирования химерными частицами AAV2/AAV морского льва без SpyTag. Вирус экспрессирует GFP в качестве маркера трансдукции (зеленый), а волосковые клетки помечены антителом, которое обнаруживает Муо7а (красный).[00132] Figure 14 shows an immunofluorescence photograph of a neonatal mouse inner ear organ of Corti explant culture 3 days after infection with sea lion AAV2/AAV chimeric particles lacking SpyTag. The virus expresses GFP as a transduction marker (green), and hair cells are labeled with an antibody that detects Myo7a (red).
[00133] На фиг.15 А представлено выравнивание 16 С-концевых аминокислот последовательности AAV2 или химерных последовательностей AAV2/вируса морского льва, включающих модификацию эпитопа В1 для его полной замены или только по остатку 730 на гомологичную последовательность AAV морского льва. Проиллюстрирован эпитоп В1 для моноклонального антитела. На фиг.15В представлена количественная оценка вирусного титра методом qPCR на основе очищенных вирусных препаратов химерных частиц AAV2/AAV морского льва без SpyTag или без SpyTag и содержащим модификацию эпитопа В1 для его полной замены или только по остатку 730 на гомологичную последовательность AAV морского льва. На фиг.15С представлено окрашивание белкового геля с использованием SYPRO Ruby для анализа экспрессии капсидных белков VP1, VP2 и VP3 из химерных частиц AAV2/AAV морского льва без SpyTag или без SpyTag и содержащих модификацию эпитопа В1 для его полной замены или только по остатку 730 на гомологичную последовательность AAV морского льва. На фиг.15D представлен график по осям XY, полученный по результатам оценки люминесценции при экспрессии люциферазы NanoLuc в лизатах клеток HEK293T, инфицированных химерными частицами AAV2/AAV морского льва без SpyTag или без SpyTag и содержащих модификации эпитопа В1 для его полной замены или только по остатку 730 на гомологичную последовательность AAV морского льва, при различной множественности заражения (MOI). Вирусы экспрессируют люциферазу NanoLuc в качестве маркера трансдукции.[00133] Figure 15A shows an alignment of the 16 C-terminal amino acids of the AAV2 sequence or AAV2/sea lion virus chimeric sequences comprising a modification of the B1 epitope to replace it completely or only at residue 730 with a homologous sea lion AAV sequence. The B1 epitope for a monoclonal antibody is illustrated. Figure 15B shows a qPCR quantification of viral titer based on purified virus preparations of AAV2/sea lion AAV chimeric particles without SpyTag or without SpyTag and comprising a modification of the B1 epitope to replace it completely or only at residue 730 with a homologous sea lion AAV sequence. Figure 15C shows SYPRO Ruby staining of protein gel for expression analysis of VP1, VP2, and VP3 capsid proteins from SpyTag-less or SpyTag-free AAV2/sea lion AAV chimeric particles containing a B1 epitope modification to replace it completely or only at residue 730 with the sea lion AAV homologous sequence. Figure 15D shows XY plots of luminescence expression of NanoLuc luciferase in HEK293T cell lysates infected with SpyTag-less or SpyTag-free AAV2/sea lion AAV chimeric particles containing B1 epitope modifications to replace it completely or only at residue 730 with the sea lion AAV homologous sequence at different multiplicities of infection (MOI). The viruses express NanoLuc luciferase as a transduction marker.
[00134] На фиг.16 представлена количественная оценка средней интенсивности излучения иссеченных органов мыши через 34 дня после внутривенной инъекции фосфатно-солевого буферного раствора (PBS) или химерных частиц AAV2/AAV морского льва из расчета 5,0×1011 вирусных геномов (вг)/животное, которые несут представляющий интерес нуклеотид люциферазы светлячка и модифицированы в виде отсутствия SpyTag или отсутствия SpyTag и содержания модификации эпитопа В1 для его полной замены или только по остатку 730 на гомологичную последовательность AAV морского льва. Вирусы экспрессируют люциферазу светлячка в качестве маркера трансдукции. Мышей подвергали анестезии с использованием изофлурана, вводили инъекцией субстрат люциферин и подвергали визуализации через 10 минут с применением системы для визуализации In Vivo IVIS Spectrum (PerkinElmer).[00134] Figure 16 shows quantification of the mean emission intensity of excised mouse organs 34 days after intravenous injection of phosphate-buffered saline (PBS) or sea lion AAV2/AAV chimeric particles at a rate of 5.0 x 10 11 viral genomes (vg)/animal that carry the firefly luciferase nucleotide of interest and are modified to lack SpyTag or to lack SpyTag and contain a modification of the B1 epitope to replace it completely or only at residue 730 with the sea lion AAV homologous sequence. The viruses express firefly luciferase as a transduction marker. Mice were anesthetized with isoflurane, injected with luciferin substrate, and imaged 10 minutes later using the IVIS Spectrum In Vivo Imaging System (PerkinElmer).
[00135] На фиг.17 представлен иллюстративный (без соблюдения масштаба), неограничивающий и типичный вариант осуществления плазмиды для экспрессии Rep-Cap по настоящему изобретению, которую можно использовать для получения химерной вирусной частицы AAV. Последовательности AAV примата показаны в виде незакрашенных прямоугольников, а последовательности AAV морского льва показаны как закрашенные прямоугольники. Также только в качестве иллюстрации изображены типичные неограничивающие положения (без соблюдения масштаба) для (1) альтернативных местоположений границы раздела между последовательностями капсида вируса примата и морского льва (пунктирные черные линии в пределах последовательности капсида AAV животного-примата) и (2) детектируемой метки для обнаружения закодированных белков VP1, VP2 и VP3 (пунктирная линия в пределах последовательностях капсида AAV животного, не являющегося приматом). Плазмиду экспрессии Rep-Cap, показанную на фиг.17, можно применять для продуцирования вирусных частиц AAV, содержащих представляющий интерес нуклеотид, который фланкирован последовательностями инвертированных 5'- и 3'-концевых повторов (ITR) AAV примата.[00135] Figure 17 shows an illustrative (not to scale), non-limiting, and exemplary embodiment of a Rep-Cap expression plasmid of the present invention that can be used to produce a chimeric AAV viral particle. The primate AAV sequences are shown as open boxes and the sea lion AAV sequences are shown as filled boxes. Also shown, for illustrative purposes only, are exemplary non-limiting positions (not to scale) for (1) alternative interface locations between the primate and sea lion virus capsid sequences (dashed black lines within the primate AAV capsid sequence) and (2) a detectable label for detecting the encoded VP1, VP2, and VP3 proteins (dashed line within the non-primate AAV capsid sequences). The Rep-Cap expression plasmid shown in Fig. 17 can be used to produce AAV viral particles containing a nucleotide of interest that is flanked by primate AAV 5' and 3' inverted terminal repeat (ITR) sequences.
[00136] На фиг.18А представлена количественная оценка вирусного титра методом qPCR на основе очищенных вирусных препаратов химерных частиц AAV2/AAV морского льва без SpyTag и содержащих альтернативные местоположения границы раздела между последовательностями капсида AAV2 и вируса морского льва. Препараты очищали из клеточного лизата (v2 - v4) или как из клеточного лизата, так и из среды (v5). На фиг.18В и фиг.18С представлены графики по осям XY, полученные по результатам оценки люминесценции при экспрессии люциферазы NanoLuc в лизатах клеток HEK293T, инфицированных частицами AAV2/AAV морского льва без SpyTag и альтернативными местоположениями границы раздела между последовательностями капсида AAV2 и вируса морского льва при различной множественности заражения (MOI). В качестве эталона использовали набор архивных данных для AAV2/AAV морского льва без SpyTag. Вирусы экспрессируют люциферазу NanoLuc в качестве маркера трансдукции. На фиг.18D представлена количественная оценка средней интенсивности излучения иссеченных органов мыши через 56 дней после внутривенной инъекции фосфатно-солевого буферного раствора (PBS) или частиц AAV2/AAV морского льва из расчета 5,0×1011 вирусных геномов (вг)/животное, которые несут представляющий интерес нуклеотид люциферазы светлячка и модифицированы в виде отсутствия SpyTag или отсутствия SpyTag и полной замены эпитопа В1 на гомологичную последовательность AAV морского льва с альтернативными местоположениями границы раздела между последовательностями капсида AAV2 и вируса морского льва или без них. Вирусы экспрессируют люциферазу светлячка в качестве маркера трансдукции. Мышей подвергали анестезии с использованием изофлурана, вводили инъекцией субстрат люциферин и подвергали визуализации через 10 минут с применением системы для визуализации In Vivo IVIS Spectrum (PerkinElmer).[00136] Figure 18A shows qPCR quantification of viral titer from purified virus preparations of sea lion AAV2/AAV chimeric particles lacking SpyTag and containing alternative locations of the AAV2 capsid/sea lion virus interface. Preparations were purified from cell lysate (v2 - v4) or from both cell lysate and medium (v5). Figures 18B and 18C show XY plots of luminescence measurements of NanoLuc luciferase expression in lysates of HEK293T cells infected with SpyTag-less AAV2/AAV particles containing alternative locations of the AAV2 capsid/sea lion virus interface at different multiplicities of infection (MOI). The archival data set for SpyTag-less sea lion AAV2/AAV was used as a reference. The viruses express NanoLuc luciferase as a transduction marker. Figure 18D shows quantification of the mean emission intensity of excised mouse organs 56 days after intravenous injection of phosphate-buffered saline (PBS) or AAV2/sea lion AAV particles at 5.0 x 10 11 viral genomes (vg)/animal that carry the firefly luciferase nucleotide of interest and are modified to lack SpyTag or to lack SpyTag and have the entire B1 epitope replaced by a homologous sea lion AAV sequence with or without alternative locations of the interface between the AAV2 and sea lion virus capsid sequences. The viruses express firefly luciferase as a transduction marker. Mice were anesthetized with isoflurane, injected with luciferin substrate, and imaged 10 min later using the IVIS Spectrum In Vivo Imaging System (PerkinElmer).
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕDETAILED DESCRIPTION
[00137] Хотя рекомбинационные подходы для нацеливания на конкретные клетки с помощью генной терапии на основе AAV в последние годы претерпели улучшение, сохраняется проблема в отношении современных рекомбинационных подходов, применяемые для разработки AAV, которые избегают обнаружения и/или нейтрализации под действием предсуществующих антител, которые предположительно вырабатываются в раннем возрасте. В данном документе описан подход, при котором используются (1) естественные способности AAV животного, не являющего приматом, или отдаленного AAV инфицировать клетки примата, (2) отсутствие у человека NAb к капсидным белкам AAV животного, не являющего приматом, и, если требуется или необходимо, (3) адаптация первого партнера из связывающейся пары белок:белок, сконструированного в капсидных белках AAV, для продуцирования вирусных частиц AAV, применимых для направленной генной терапии, например, введения представляющего интерес нуклеотида в конкретную представляющую интерес клетку. В настоящем документе описана нуклеотидная молекула, которая содержит по меньшей мере ген cap AAV, используемый в соответствии с его требуемой функцией. Нуклеотидная молекула по настоящему изобретению содержит ген cap или его часть от AAV животного, не являющегося приматом, и/или отдаленного AAV (для продуцирования вирусных капсидов, которые не так легко распознаются предсуществующими NAb). Ген cap или его часть от AAV животного, не являющегося приматом, может быть модифицирован с помощью первого партнера из связывающейся пары белок:белок, с которым второй партнер, содержащий нацеливающий лиганд, может связываться и управлять тропизмом полученных вирусных частиц AAV.[00137] Although recombinational approaches for targeting specific cells with AAV-based gene therapy have improved in recent years, a problem remains with current recombinational approaches used to develop AAVs that evade detection and/or neutralization by pre-existing antibodies that are presumably produced early in life. Described herein is an approach that utilizes (1) the natural ability of a non-primate or distant AAV to infect primate cells, (2) the lack of human NAbs to non-primate AAV capsid proteins, and, if desired or needed, (3) the adaptation of a first partner of a protein:protein binding pair engineered into the AAV capsid proteins to produce AAV viral particles useful for targeted gene therapy, such as introducing a nucleotide of interest into a specific cell of interest. The present document describes a nucleotide molecule that comprises at least an AAV cap gene used in accordance with its desired function. The nucleotide molecule of the present invention comprises a cap gene or a portion thereof from a non-primate AAV and/or a distant AAV (to produce viral capsids that are not easily recognized by pre-existing NAbs). The cap gene or a portion thereof from a non-primate AAV may be modified with a first partner of a protein:protein binding pair to which a second partner containing a targeting ligand may bind and direct the tropism of the resulting AAV viral particles.
[00138] В случае таких AAV животного, не являющегося приматом, или отдаленного AAV, которые не способны инфицировать клетки приматов, ген cap можно конструировать в виде химерного гена cap, который кодирует по меньшей мере домен фосфолипазы А2 (PLA2) капсидного белка VP1 AAV примата и по меньшей мере часть капсидного белка VP3 AAV примата, не являющегося человеком, или отдаленного AAV. Домен PLA2 содержится в капсидном белке VP1 (более конкретно, в уникальной области VP1 (VP1-u) капсида VP1) и предположительно является важным во время инфицирования AAV, опосредуя перенос вирусного генома из поздних эндосом/лизосом в ядро для запуска репликации (Zadori et al., 2001, Dev Cell, l(2):291-302). Капсидный белок VP3 представляет собой основной поверхностный капсидный белок вирусной частицы AAV, и сам по себе вирусный капсид, содержащий по меньшей мере часть капсидного белка VP3 AAV животного, не являющегося приматом, или отдаленного AAV вряд ли будет распознаваться NAb, выработанными против сероваров AAV, выделенных от приматов в ходе инфицирования с помощью AAV примата.[00138] For such non-primate AAVs or distant AAVs that are unable to infect primate cells, the cap gene can be constructed as a chimeric cap gene that encodes at least the phospholipase A2 (PLA2) domain of the primate AAV capsid protein VP1 and at least a portion of the non-human primate AAV or distant AAV capsid protein VP3. The PLA2 domain is contained in the VP1 capsid protein (more specifically, in the VP1 unique region (VP1-u) of the VP1 capsid) and is thought to be important during AAV infection by mediating the transfer of the viral genome from late endosomes/lysosomes to the nucleus to initiate replication (Zadori et al., 2001, Dev Cell, l(2):291-302). The VP3 capsid protein is the major surface capsid protein of the AAV viral particle, and a viral capsid containing at least part of the VP3 capsid protein of a non-primate AAV or a distant AAV is unlikely to be recognized by NAbs raised against AAV serovars isolated from primates during infection with primate AAV.
[00139] Неограничивающее иллюстрация молекулы нуклеиновой кислоты, содержащей ген rep AAV примата и химерный ген cap, представлено на фиг.1. В случае тех AAV примата, не являющегося человеком, или отдаленных AAV, которые способны инфицировать клетки приматов, ген rep AAV примата может быть функционально связан с химерным геном cap, описанным в данном документе, или с геном cap AAV животного, не являющегося приматом. Приведенные в данном документе примеры показывают, что такая молекула нуклеиновой кислоты при экспрессии в линии упаковывающих клеток вместе с плазмидой-помощником и геномом AAV примата, несущим представляющий интерес нуклеотид, способна кодировать соответствующие белки репликации и капсидные белки, которые осуществляют соответственно репликацию генома AAV примата и его инкапсидирование в вирусную частицу, способную инфицировать клетки in vivo. Более того, примеры показывают, что тропизм такой вирусной частицы AAV легко адаптировать путем применения первого и второго партнеров из связывающейся пары белок:белок, и, более того, такая вставка первого и второго партнера из связывающейся пары белок:белок не увеличивает вероятность распознавания со стороны NAb, выработанных против инфицирования AAV примата. Таким образом, в настоящем документе предусмотрены генетически модифицированные вирусные частицы, композиции, содержащие их, и способы их получения и применения.[00139] A non-limiting illustration of a nucleic acid molecule comprising a primate AAV rep gene and a chimeric cap gene is shown in Fig. 1. For those non-human primate AAVs or distant AAVs that are capable of infecting primate cells, the primate AAV rep gene can be operably linked to the chimeric cap gene described herein or to the non-primate AAV cap gene. The examples provided herein demonstrate that such a nucleic acid molecule, when expressed in a packaging cell line together with a helper plasmid and a primate AAV genome carrying a nucleotide of interest, is capable of encoding the corresponding replication proteins and capsid proteins that respectively replicate the primate AAV genome and encapsidate it into a viral particle capable of infecting cells in vivo. Moreover, examples show that the tropism of such an AAV viral particle is easily tailored by using the first and second partners of the protein:protein binding pair, and, furthermore, such insertion of the first and second partners of the protein:protein binding pair does not increase the likelihood of recognition by NAbs generated against AAV infection of a primate. Thus, the present document provides genetically modified viral particles, compositions containing them, and methods for producing and using them.
[00140] Если не указано иное, то все технические и научные термины, используемые в данном документе, имеют такое же значение, как его обычно понимает специалист средней квалификации в области техники, к которой принадлежит настоящее изобретение.[00140] Unless otherwise defined, all technical and scientific terms used herein have the same meaning as commonly understood by one of ordinary skill in the art to which this invention pertains.
[00141] Формы единственного числа включают определяемые объекты во множественном числе, если из контекста явно не следует иное. Таким образом, например, ссылка на «способ» включает один или более способов и/или стадий, подобных описанным в данном документе, и/или которые станут очевидными специалистам в данной области техники после прочтения данного раскрытия.[00141] The singular forms "a", "an", and "the" include plural references unless the context clearly dictates otherwise. Thus, for example, reference to "a method" includes one or more methods and/or steps similar to those described herein and/or that will become apparent to those skilled in the art after reading this disclosure.
[00142] «Процент (%) идентичности» или т.п. можно легко определить для аминокислотных или нуклеотидных последовательностей по всей длине белка или его части. Длина части может составлять по меньшей мере приблизительно 5 аминокислот или 24 нуклеотида соответственно, и может составлять вплоть до приблизительно 700 аминокислот или 2100 нуклеотидов соответственно. Обычно, если речь идет об «идентичности», «гомологии» или «сходстве» между двумя разными аденоассоциированными вирусами, «идентичность», «гомология» или «сходство» определяют с точки зрения «подвергнутых выравниванию» последовательностей. «Подвергнутые выравниванию» последовательности или «выравнивания» относятся к нескольким последовательностям нуклеиновой кислоты или белковым (аминокислотным) последовательностям, зачастую содержащим исправления в виде отсутствующих или дополнительных оснований или аминокислот по сравнению с эталонной последовательностью.[00142] "Percent (%) identity" or the like can be readily determined for amino acid or nucleotide sequences over the entire length of a protein or a portion thereof. The portion may be at least about 5 amino acids or 24 nucleotides long, respectively, and may be up to about 700 amino acids or 2100 nucleotides long, respectively. Typically, when referring to "identity", "homology", or "similarity" between two different adeno-associated viruses, the "identity", "homology", or "similarity" is determined in terms of "aligned" sequences. "Aligned" sequences or "alignments" refer to multiple nucleic acid or protein (amino acid) sequences, often containing corrections in the form of missing or additional bases or amino acids compared to a reference sequence.
[00143] Выравнивания можно выполнять с использованием любой из множества общедоступных или коммерчески доступных программ для множественного выравнивания последовательностей. Для аминокислотных последовательностей доступны такие программы выравнивания последовательностей, как, например, программы «Clustal X», «МАР», «PIMA», «MSA», «BLOCKMAKER», «МЕМЕ» и «Match-Вох». Обычно любая из данных программ используется с настройками по умолчанию, хотя специалист в данной области техники при необходимости может изменить данные настройки. В качестве альтернативы специалист в данной области техники может использовать другой алгоритм или компьютерную программу, которая обеспечивает по меньшей мере такой же уровень идентичности или выравнивания, который обеспечивают упомянутые алгоритмы и программы. См., например, J. D. Thomson et al, Nucl. Acids. Res., «A comprehensive comparison of multiple sequence alignments)), 27(13):2682-2690 (1999).[00143] Alignments can be performed using any of a variety of publicly available or commercially available multiple sequence alignment programs. For amino acid sequences, sequence alignment programs such as Clustal X, MAP, PIMA, MSA, BLOCKMAKER, MEME, and Match-Box are available. Typically, any of these programs are used with default settings, although one skilled in the art can change these settings if desired. Alternatively, one skilled in the art can use another algorithm or computer program that provides at least the same level of identity or alignment as the aforementioned algorithms and programs. See, for example, J. D. Thomson et al, Nucl. Acids. Res., "A comprehensive comparison of multiple sequence alignments", 27(13):2682-2690 (1999).
[00144] Для последовательностей нуклеиновой кислоты также доступны программы множественного выравнивания последовательностей. Примеры таких программ включают «Clustal W», «САР Sequence Assembly)), «МАР» и «МЕМЕ», которые доступны через веб-серверы в сети Интернет. Другие источники таких программ известны специалистам в данной области техники. В качестве альтернативы также используются утилиты Vector NTI. Кроме того, существует целый ряд известных в данной области техники алгоритмов, которые можно использовать для измерения идентичности нуклеотидных последовательностей, включая алгоритмы, содержащиеся в программах, описанных выше. В качестве другого примера полинуклеотидные последовательности можно сравнить с помощью FASTA™, программы в GCG версии 6.1. Fasta™ обеспечивает выравнивания и расчет процента идентичности последовательности в областях наибольшего перекрывания между запрашиваемой и поисковой последовательностями. Например, процент идентичности последовательностей между последовательностями нуклеиновой кислоты можно определять с использованием FASTA™ с параметрами по умолчанию (размер слова 6 и фактор NOPAM для матрицы замен), как предусмотрено в GCG версии 6.1, включенной в данный документ посредством ссылки.[00144] Multiple sequence alignment programs are also available for nucleic acid sequences. Examples of such programs include Clustal W, CAP Sequence Assembly), MAP, and MEME, which are all available via web servers on the Internet. Other sources of such programs are known to those skilled in the art. Alternatively, Vector NTI utilities are also used. In addition, there are a number of algorithms known in the art that can be used to measure the identity of nucleotide sequences, including the algorithms contained in the programs described above. As another example, polynucleotide sequences can be compared using FASTA™, a program in GCG version 6.1. Fasta™ provides alignments and calculations of percent sequence identity in the regions of greatest overlap between the query and search sequences. For example, the percent sequence identity between nucleic acid sequences can be determined using FASTA™ with default parameters (word size of 6 and NOPAM factor for the substitution matrix), as provided in GCG version 6.1, incorporated herein by reference.
[00145] Термин «значительная идентичность» охватывает выравнивание аминокислотных последовательностей или последовательностей нуклеиновой кислоты, характеризующиеся идентичностью по меньшей мере 90%, например по меньшей мере 93%, например по меньшей мере 95%, например по меньшей мере 96%, например по меньшей мере 97%, например по меньшей мере 98%, например по меньшей мере 99% или например по меньшей мере 100%.[00145] The term "substantial identity" encompasses an alignment of amino acid sequences or nucleic acid sequences having an identity of at least 90%, such as at least 93%, such as at least 95%, such as at least 96%, such as at least 97%, such as at least 98%, such as at least 99%, or such as at least 100%.
[00146] Термин «химерный» охватывает функциональный ген или полипептид, содержащие соответственно последовательности нуклеиновой кислоты или аминокислотные последовательности из по меньшей мере двух разных организмов, например, части гена или полипептида по меньшей мере первого и второго AAV, где по меньшей мере первая и вторая части являются функционально связанными. Нуклеотидные последовательности, гены, полипептиды и аминокислоты, если они не указаны как химерные, считаются нехимерными, например, содержащими последовательность нуклеиновой кислоты или аминокислотную последовательность только одного организма, например одного AAV.[00146] The term "chimeric" encompasses a functional gene or polypeptide comprising nucleic acid sequences or amino acid sequences, respectively, from at least two different organisms, such as portions of a gene or polypeptide of at least a first and a second AAV, wherein at least the first and second portions are operably linked. Nucleotide sequences, genes, polypeptides, and amino acids, unless specified as chimeric, are considered to be non-chimeric, such as comprising a nucleic acid sequence or amino acid sequence from only one organism, such as one AAV.
[00147] Термин «антитело» включает молекулы иммуноглобулинов, содержащие четыре полипептидные цепи, две тяжелые (Н) цепи и две легкие (L) цепи, соединенные между собой дисульфидными связями. Каждая тяжелая цепь содержит вариабельный домен тяжелой цепи (VH) и константную область тяжелой цепи (CH). Константная область тяжелой цепи содержит по меньшей мере три домена, CH1, CH2, CH3 и необязательно CH4. Каждая легкая цепь содержит вариабельный домен легкой цепи (VH) и константную область легкой цепи (CL). Вариабельные домены легких и тяжелых цепей могут быть дополнительно подразделены на области гипервариабельности, называемые определяющими комплементарность областями (CDR), чередующиеся с более консервативными областями, называемыми каркасными областями (FR). Каждый вариабельный домен тяжелой и легкой цепей содержит три CDR и четыре FR, расположенных от аминоконца к карбоксиконцу в следующем порядке: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4 (CDR тяжелой цепи могут быть сокращены как HCDR1, HCDR2 и HCDR3; CDR легкой цепи могут быть сокращены как LCDR1, LCDR2 и LCDR3). Типичные тетрамерные структуры антитела содержат два идентичных антигенсвязывающих домена, каждый из которых образован за счет ассоциации доменов VH и VL, и каждый из которых вместе с соответствующими доменами CH и CL образуют Fv-область антитела. Однодоменные антитела содержат один антигенсвязывающий домен, например VH или VL. Антиген связывающий домен антитела, например часть антитела, которая распознает и связывается с первым партнером из специфической связывающейся пары антигена, также называется «паратопом». Это небольшая область (от 5 до 10 аминокислот) Fv-области антитела, часть антигенсвязывающего фрагмента (область Fab), и она может содержать части тяжелой и/или легкой цепей антитела. Паратоп специфически связывает первого партнера из специфической связывающейся пары, если паратоп связывает первого партнера из специфической связывающейся пары с высокой аффинностью. Термин «высокоаффинное» антитело относится к антителу, которое характеризуется KD для его первого партнера-мишени из специфической связывающейся пары, составляющей приблизительно 10-9 М или меньше (например, приблизительно 1×10-9 М, 1×10-10 М, 1×10-11 М или приблизительно 1×10-12 М). В одном варианте осуществления KD измеряют с помощью поверхностного плазмонного резонанса, например BIACORE™; в другом варианте осуществления, KD измеряют с помощью ELISA.[00147] The term "antibody" includes immunoglobulin molecules comprising four polypeptide chains, two heavy (H) chains and two light (L) chains, linked together by disulfide bonds. Each heavy chain comprises a heavy chain variable domain (V H ) and a heavy chain constant region ( CH ). The heavy chain constant region comprises at least three domains, CH 1, CH 2, CH 3, and optionally CH 4. Each light chain comprises a light chain variable domain (V H ) and a light chain constant region ( CL ). The variable domains of the light and heavy chains can be further subdivided into regions of hypervariability, called complementarity determining regions (CDRs), interspersed with more conserved regions, called framework regions (FRs). Each variable domain of the heavy and light chains contains three CDRs and four FRs, arranged from amino terminus to carboxyl terminus in the following order: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4 (the heavy chain CDRs may be abbreviated as HCDR1, HCDR2, and HCDR3; the light chain CDRs may be abbreviated as LCDR1, LCDR2, and LCDR3). Typical tetrameric antibody structures contain two identical antigen-binding domains, each formed by the association of V H and V L domains, and each of which, together with the corresponding CH and CL domains, forms the Fv region of the antibody. Single-domain antibodies contain a single antigen-binding domain, such as V H or V L . The antigen-binding domain of an antibody, e.g., the portion of an antibody that recognizes and binds the first partner of a specific antigen binding pair, is also called the "paratope". This is a small region (5 to 10 amino acids) of the Fv region of an antibody, part of the antigen-binding fragment (Fab region), and may contain portions of the heavy and/or light chains of the antibody. A paratope specifically binds the first partner of a specific binding pair if the paratope binds the first partner of the specific binding pair with high affinity. The term "high affinity" antibody refers to an antibody that has a K D for its first target partner of a specific binding pair of about 10 -9 M or less (e.g., about 1 x 10 -9 M, 1 x 10 -10 M, 1 x 10 -11 M, or about 1 x 10 -12 M). In one embodiment, the K D is measured by surface plasmon resonance, such as BIACORE™; in another embodiment, the K D is measured by ELISA.
[00148] Фраза «определяющая комплементарность область» или термин «CDR» включают аминокислотную последовательность, кодируемую последовательностью нуклеиновой кислоты генов иммуноглобулина организма, которая в норме (т.е. у животного дикого типа) находится между двух каркасных областей в вариабельной области легкой или тяжелой цепи молекулы иммуноглобулина (например, антитела или Т-клеточного рецептора). CDR может кодироваться, например, последовательностью зародышевого типа, либо реаранжированной или переаранжированной последовательностью, и, например, непримированной или зрелой В-клеткой или Т-клеткой. CDR может быть подвергшейся соматической мутации (например, отличаться от последовательности, кодируемой зародышевым типом животного), гуманизированной и/или модифицированной с помощью аминокислотных замен, добавлений или делеций. В некоторых случаях (например, в случае CDR3) CDR могут кодироваться двумя или более последовательностями (например, последовательностями зародышевого типа), которые не являются смежными (например, в случае нереаранжированной последовательности нуклеиновой кислоты), но они являются смежными в последовательности нуклеиновой кислоты в В-клетке, например, как результат сплайсинга или соединения последовательностей (например, V-D-J-рекомбинация с образованием CDR3 тяжелой цепи).[00148] The phrase "complementarity determining region" or the term "CDR" includes an amino acid sequence encoded by a nucleic acid sequence of the immunoglobulin genes of an organism that is normally (i.e., in a wild-type animal) located between two framework regions in the variable region of a light or heavy chain of an immunoglobulin molecule (e.g., an antibody or a T-cell receptor). A CDR may be encoded by, for example, a germline sequence or a rearranged or rearranged sequence, and, for example, an unprimed or mature B cell or T cell. A CDR may be somatically mutated (e.g., different from the sequence encoded by the germline of the animal), humanized, and/or modified by amino acid substitutions, additions, or deletions. In some cases (e.g., CDR3), CDRs may be encoded by two or more sequences (e.g., germline sequences) that are not contiguous (e.g., in the case of an unrearranged nucleic acid sequence), but they are contiguous in the nucleic acid sequence in the B cell, e.g., as a result of splicing or joining of sequences (e.g., V-D-J recombination to form heavy chain CDR3).
[00149] Фраза «легкая цепь» включает последовательность легкой цепи иммуноглобулина из любого организма и, если не указано иное, включает легкие κ- и Х-цепи человека и VpreB, а также суррогатные легкие цепи. Вариабельные домены легкой цепи, как правило, содержат три CDR- и четыре каркасные (FR) области легкой цепи, если не указано иное. В целом, полноразмерная легкая цепь включает в направлении от аминоконца к карбоксильному концу: вариабельный домен, который включает FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4, и константный домен легкой цепи. Вариабельный домен легкой цепи кодируется последовательностью гена вариабельной области легкой цепи, который, как правило, содержит генные сегменты VL и JL, полученные из репертуара сегментов V и J, присутствующих в зародышевой линии. Последовательности, местоположения и номенклатуру для сегментов V и J легкой цепи у различных организмов можно просмотреть в базе данных IMGT, www.imgt.org. Например, легкие цепи включают такие, которые не обеспечивают селективное связывание одного из первого или второго первого партнера из специфической связывающейся пары, селективно связанной с первым партнером из специфической связывающейся пары-связывающего белка, в которых они находятся. Легкие цепи также включают такие, которые обеспечивают связывание или распознавание или содействуют тяжелой цепи или другой легкой цепи при связывании или распознавании одного или более первых партнеров из специфических связывающихся пар, селективно связанных с первым партнером из специфической связывающейся пары-связывающего белка, в которых они находятся. Традиционные или универсальные легкие цепи включают цепи, полученные из гена Vκ1-39Jκ человека или гена Vκ3-20Jκ человека, и включают их варианты, подвергшиеся соматической мутации (например, созреванию аффинности). Иллюстративные сегменты VL человека включают генный сегмент Vκ1-39 человека, генный сегмент Vκ3-20 человека, генный сегмент Vλ1-40 человека, генный сегмент Vλ1-44 человека, генный сегмент Vλ2-8 человека, генный сегмент Vλ2-14 человека, а также генный сегмент Vλ3-21 человека и включают их варианты, подвергшиеся соматической мутации (например, созреванию аффинности). Можно получать легкие цепи, которые содержат вариабельный домен от одного организма (например, человека или грызуна, например, крысы или мыши; или птицы, например, курицы) и константную область от того же или другого организма (например, человека или грызуна, например, крысы или мыши; или птицы, например, курицы).[00149] The phrase "light chain" includes an immunoglobulin light chain sequence from any organism and, unless otherwise specified, includes human κ and X light chains and VpreB, as well as surrogate light chains. Light chain variable domains typically comprise three CDRs and four framework (FR) light chain regions, unless otherwise specified. In general, a full-length light chain comprises, from amino terminus to carboxyl terminus: a variable domain, which includes FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4, and a light chain constant domain. The light chain variable domain is encoded by a light chain variable region gene sequence, which typically contains V L and J L gene segments derived from a repertoire of V and J segments present in the germline. The sequences, locations, and nomenclature for the V and J segments of the light chain in various organisms can be viewed in the IMGT database, www.imgt.org. For example, light chains include those that do not mediate selective binding of one of the first or second first partners of a specific binding pair selectively associated with the first partner of a specific binding pair-binding protein in which they are found. Light chains also include those that mediate binding to or recognition of, or assist a heavy chain or another light chain in binding to or recognition of, one or more first partners of a specific binding pair selectively associated with the first partner of a specific binding pair-binding protein in which they are found. Conventional or universal light chains include those derived from the human Vκ1-39Jκ gene or the human Vκ3-20Jκ gene, and include variants thereof that have undergone somatic mutation (e.g., affinity maturation). Exemplary human V L segments include the human Vκ1-39 gene segment, the human Vκ3-20 gene segment, the human Vλ1-40 gene segment, the human Vλ1-44 gene segment, the human Vλ2-8 gene segment, the human Vλ2-14 gene segment, and the human Vλ3-21 gene segment, and include somatically mutated (e.g., affinity maturation) variants thereof. Light chains can be produced that comprise a variable domain from one organism (e.g., a human or a rodent, such as a rat or mouse; or a bird, such as a chicken) and a constant region from the same or a different organism (e.g., a human or a rodent, such as a rat or mouse; or a bird, such as a chicken).
[00150] Термин «приблизительно» или «примерно» включает нахождение в пределах статистически значимого диапазона значения. Такой диапазон может быть в пределах порядка величины, предпочтительно в пределах 50%, более предпочтительно в пределах 20%, еще более предпочтительно в пределах 10% и еще более предпочтительно в пределах 5% от данного значения или диапазона. Допустимое отклонение, охватываемое терминами «приблизительно» или «примерно», зависит от конкретной исследуемой системы и может быть легко оценено специалистом средней квалификации в данной области техники.[00150] The term "about" or "approximately" includes being within a statistically significant range of a value. Such a range may be within an order of magnitude, preferably within 50%, more preferably within 20%, even more preferably within 10%, and still more preferably within 5% of a given value or range. The tolerance encompassed by the terms "about" or "approximately" depends on the particular system being examined and can be readily estimated by one of ordinary skill in the art.
[00151] Фраза «тяжелая цепь» или «тяжелая цепь иммуноглобулина» включает последовательность тяжелой цепи иммуноглобулина, в том числе последовательность константной области тяжелой цепи иммуноглобулина, из любого организма. Вариабельные домены тяжелой цепи содержат три CDR- и четыре FR-области тяжелой цепи, если не указано иное. Фрагменты тяжелых цепей включают CDR, CDR и FR, а также их комбинации. Типичная тяжелая цепь после вариабельного домена содержит (от N-конца к С-концу) домен CH1, шарнирную область, домен CH2 и домен CH3. Функциональный фрагмент тяжелой цепи включает фрагмент, который способен специфически распознавать первого партнера из специфической связывающейся пары (например, распознавать первого партнера из специфической связывающейся пары с KD в микромолярном, наномолярном или пикомолярном диапазоне), который способен экспрессироваться и секретироваться клеткой и который содержит по меньшей мере одну CDR. Вариабельные домены тяжелой цепи кодируются нуклеотидной последовательностью вариабельной области, которая, как правило, содержит сегменты VH, DH и JH, полученные из репертуара сегментов VH, DH и JH, присутствующих в зародышевой линии. Последовательности, местоположения и номенклатуру сегментов тяжелых цепей V, D и J для различных организмов можно найти в базе данных IMGT, которая доступна через Интернет во всемирной сети (www) по адресу «imgt.org».[00151] The phrase "heavy chain" or "immunoglobulin heavy chain" includes an immunoglobulin heavy chain sequence, including an immunoglobulin heavy chain constant region sequence, from any organism. The variable domains of a heavy chain comprise three CDRs and four FRs of a heavy chain, unless otherwise indicated. Fragments of heavy chains include CDRs, CDRs, and FRs, as well as combinations thereof. A typical heavy chain comprises, following the variable domain, a CH1 domain, a hinge region, a CH2 domain, and a CH3 domain. A functional fragment of a heavy chain includes a fragment that is capable of specifically recognizing the first partner of a specific binding pair (e.g., recognizing the first partner of a specific binding pair with a KD in the micromolar, nanomolar, or picomolar range), that is capable of being expressed and secreted by a cell, and that comprises at least one CDR. The variable domains of the heavy chain are encoded by the variable region nucleotide sequence, which typically contains V H , D H , and J H segments derived from the repertoire of V H , D H , and J H segments present in the germline. The sequences, locations, and nomenclature of the V, D, and J heavy chain segments for various organisms can be found in the IMGT database, which is accessible via the World Wide Web (www) at "imgt.org".
[00152] Термин «антитело, содержащее только тяжелую цепь», «антигенсвязывающий белок, содержащий только тяжелую цепь», «однодоменный антиген связывающий белок», «однодоменный связывающий белок» и т.п. относится к мономерной или гомодимерной молекуле иммуноглобулина, содержащей иммуноглобулиноподобную цепь, содержащую вариабельный домен, функционально связанный с константной областью тяжелой цепи, который не может ассоциироваться с легкой цепью, поскольку в константной области тяжелой цепи, как правило, отсутствует функциональный домен CH1. Соответственно, термин «антитело, содержащее только тяжелую цепь», «антигенсвязывающий белок, содержащий только тяжелую цепь», «однодоменный антигенсвязывающий белок», «однодоменный связывающий белок» и т.п. охватывает как (i) мономерный однодоменный антигенсвязывающий белок, содержащий одну иммуноглобулиноподобную цепь, содержащую вариабельный домен, функционально связанный с константной областью тяжелой цепи, в которой отсутствует функциональный домен CH1, так и (ii) гомодимерный однодоменный антигенсвязывающий белок, содержащий две иммуноглобулиноподобные цепи, каждая из которых содержит вариабельный домен, функционально связанный с константной областью тяжелой цепи, в которой отсутствует функциональный домен CH1. В различных аспектах гомодимерный однодоменный антигенсвязывающий белок содержит две идентичные иммуноглобулиноподобные цепи, каждая из которых содержит идентичный вариабельный домен, функционально связанный с идентичной константной областью тяжелой цепи, в которой отсутствует функциональный домен CH1. Кроме того, каждая иммуноглобулиноподобная цепь однодоменного антигенсвязывающего белка содержит вариабельный домен, который может быть получен из генных сегментов вариабельной области тяжелой цепи (например, VH, DH, JH), генных сегментов легкой цепи (например, VL, JL) или их комбинации, связанный с последовательностью гена константной области тяжелой цепи (Сн), содержащей делецию или инактивирующую мутацию в кодирующей последовательности CH1 (и необязательно шарнирную область) гена константной области тяжелой цепи, например IgG, IgA, IgE, IgD или их комбинации. Однодоменный антигенсвязывающий белок, содержащий вариабельный домен, полученный из генных сегментов тяжелой цепи, может называться «VH-однодоменное антитело» или «VH-однодоменный антигенсвязывающий белою), см., например, патент США №8754287; публикации заявок на патент США №№20140289876; 20150197553; 20150197554; 20150197555; 20150196015; 20150197556 и 20150197557, каждая из которых включена посредством ссылки во всей своей полноте. Однодоменный антигенсвязывающий белок, содержащий вариабельный домен, полученный из генных сегментов легкой цепи, может называться «VL-однодоменный антигенсвязывающий белою), см., например, публикацию заявки на патент США №20150289489, включенную посредством ссылки во всей своей полноте.[00152] The term "heavy chain-only antibody", "heavy chain-only antigen-binding protein", "single-domain antigen-binding protein", "single-domain binding protein", etc. refers to a monomeric or homodimeric immunoglobulin molecule comprising an immunoglobulin-like chain comprising a variable domain operably linked to a heavy chain constant region that cannot associate with a light chain because the heavy chain constant region typically lacks a functional C H 1 domain. Accordingly, the term "heavy chain-only antibody", "heavy chain-only antigen-binding protein", "single-domain antigen-binding protein", "single-domain binding protein", etc. encompasses both (i) a monomeric single-domain antigen-binding protein comprising one immunoglobulin-like chain comprising a variable domain operably linked to a heavy chain constant region that lacks a functional C H 1 domain, and (ii) a homodimeric single-domain antigen-binding protein comprising two immunoglobulin-like chains, each of which comprises a variable domain operably linked to a heavy chain constant region that lacks a functional C H 1 domain. In various aspects, a homodimeric single-domain antigen-binding protein comprises two identical immunoglobulin-like chains, each of which comprises an identical variable domain operably linked to an identical heavy chain constant region that lacks a functional C H 1 domain. Furthermore, each immunoglobulin-like chain of the single-domain antigen-binding protein comprises a variable domain that can be derived from heavy chain variable region gene segments (e.g., V H , D H , J H ), gene segments light chain (e.g., V L , J L ), or a combination thereof, linked to a heavy chain constant region (CH) gene sequence comprising a deletion or inactivating mutation in the coding sequence of the CH1 (and optionally the hinge region) of a heavy chain constant region gene, e.g., IgG, IgA, IgE, IgD, or a combination thereof. A single-domain antigen-binding protein comprising a variable domain derived from heavy chain gene segments may be referred to as a "V H single-domain antibody" or "V H single-domain antigen-binding protein"). See, e.g., U.S. Patent No. 8,754,287; U.S. Patent Application Publication Nos. 20140289876; 20150197553; 20150197554; 20150197555; 20150196015; 20150197556 and 20150197557, each of which is incorporated by reference in its entirety. A single-domain antigen-binding protein comprising a variable domain derived from light chain gene segments may be referred to as a "V L single-domain antigen-binding protein" (see, e.g., U.S. Patent Application Publication No. 20150289489, incorporated by reference in its entirety.
[00153] Фраза «легкая цепь» включает последовательность легкой цепи иммуноглобулина из любого организма и, если не указано иное, включает легкие каппа (κ)- и лямбда (λ)-цепи человека и VpreB, а также суррогатные легкие цепи. Вариабельные домены легкой цепи, как правило, содержат три CDR- и четыре каркасные (FR) области легкой цепи, если не указано иное. В целом, полноразмерная легкая цепь включает в направлении от аминоконца к карбоксильному концу: вариабельный домен, который включает FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4, и аминокислотную последовательность константной области легкой цепи. Вариабельные домены легкой цепи кодируются нуклеотидной последовательностью вариабельной области легкой цепи, которая обычно содержит генные сегменты VL и JL легкой цепи, полученные из репертуара генных сегментов VL и JL легкой цепи, присутствующих в зародышевой линии. Последовательности, местоположения и номенклатура для генных сегментов легкой цепи V и J для различных организмов можно найти в базе данных IMGT, которая доступна через Интернет во всемирной сети (www) по адресу «imgt.org». Например, легкие цепи включают такие, которые не обеспечивают селективное связывание одного из первого или второго первого партнера из специфической связывающейся пары, селективно связанной с первым партнером из специфической связывающейся пары-связывающего белка, в которых они находятся. Легкие цепи также включают такие, которые обеспечивают связывание или распознавание или содействуют цепи при связывании или распознавании одного или более первых партнеров из специфических связывающихся пар, селективно связанных с первым партнером из специфической связывающейся пары-связывающего белка, в которых они находятся. Легкие цепи также включают такие, которые обеспечивают связывание или распознавание или содействуют цепи при связывании или распознавании одного или более первых партнеров из специфических связывающихся пар, селективно связанных с первым партнером из специфической связывающейся пары-связывающего белка, в которых они находятся. Традиционные или универсальные легкие цепи включают цепи, полученные из гена Vκ1-39Jκ5 человека или гена Vκ3-20Jκ1 человека, и включают их варианты, подвергшиеся соматической мутации (например, созреванию аффинности).[00153] The phrase "light chain" includes an immunoglobulin light chain sequence from any organism and, unless otherwise specified, includes human kappa (κ) and lambda (λ) light chains and VpreB, as well as surrogate light chains. Light chain variable domains typically comprise three light chain CDRs and four light chain framework (FR) regions, unless otherwise specified. In general, a full-length light chain comprises, from amino terminus to carboxyl terminus: a variable domain, which includes FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4, and a light chain constant region amino acid sequence. Light chain variable domains are encoded by a light chain variable region nucleotide sequence that typically contains light chain V L and J L gene segments derived from a repertoire of light chain V L and J L gene segments present in the germline. The sequences, locations, and nomenclature for the V and J light chain gene segments for various organisms can be found in the IMGT database, which is accessible via the World Wide Web (www) at "imgt.org". For example, light chains include those that do not selectively bind one of the first or second first partners of a specific binding pair selectively associated with the first partner of a specific binding pair-binding protein in which they are found. Light chains also include those that bind to or recognize, or assist the chain in binding or recognizing, one or more first partners of a specific binding pair selectively associated with the first partner of a specific binding pair-binding protein in which they are found. Light chains also include those that bind to or recognize, or assist the chain in binding or recognizing, one or more first partners of a specific binding pair selectively associated with the first partner of a specific binding pair-binding protein in which they are found. Conventional or universal light chains include chains derived from the human Vκ1-39Jκ5 gene or the human Vκ3-20Jκ1 gene, and include variants thereof that have undergone somatic mutation (e.g., affinity maturation).
[00154] Используемая в данном документе фраза «функционально связанный» включает физическое наложение (например, в трехмерном пространстве) компонентов или элементов, которые прямо или косвенно взаимодействуют друг с другом или иным образом координируются друг друга для участия в биологическом событии, при этом такое наложение обеспечивает достижение или разрешает такое взаимодействие и/или координацию. В качестве лишь одного примера, говорится, что последовательность контроля (например, последовательность контроля экспрессии) в нуклеиновой кислоте «функционально связана» с кодирующей последовательностью, если она расположена относительно кодирующей последовательности таким образом, что ее присутствие или отсутствие влияет на экспрессию и/или активность кодирующей последовательности. Во многих вариантах осуществления «функциональная связь» подразумевает ковалентную связь соответствующих компонентов или элементов друг с другом. Специалисты в данной области техники легко поймут, что в некоторых вариантах осуществления ковалентная связь не требуется для достижения эффективной функциональной связи. Например, в некоторых вариантах осуществления последовательности контроля нуклеиновой кислоты, которые функционально связаны с кодирующими последовательностями, которые они контролируют, являются смежными с представляющим интерес нуклеотидом. В качестве альтернативы или дополнения в некоторых вариантах осуществления одна или более из таких последовательностей контроля действуют в транс-положении или на расстоянии для осуществления контроля представляющей интерес кодирующей последовательности. В некоторых вариантах осуществления используемый в данном документе термин «последовательность контроля экспрессии» относится к полинуклеотидным последовательностям, которые являются необходимыми и/или достаточными для осуществления экспрессии и процессинга кодирующих последовательностей, с которыми они лигированы. В некоторых вариантах осуществления «последовательности контроля экспрессии» могут представлять собой или включают соответствующие последовательности для инициации и терминации транскрипции, промоторные и/или энхансерные последовательности; сигналы для эффективного процессинга РНК, такие как сигналы сплайсинга и полиаденилирования; последовательности, стабилизирующие цитоплазматическую мРНК; последовательности, повышающие эффективность трансляции (например, консенсусную последовательность Козак); последовательности, повышающие стабильность белка; и/или в некоторых вариантах осуществления последовательности, усиливающие секрецию белка. В некоторых вариантах осуществления одна или более из последовательностей контроля активны предпочтительно или исключительно в конкретной клетке-хозяине или организме или их типе. В качестве лишь одного примера, у прокариот последовательности контроля, как правило, включают промотор, сайт связывания рибосомы и последовательность терминации транскрипции; у эукариот во многих вариантах осуществления последовательности контроля, как правило, включают промоторы, энхансеры и/или последовательности терминации транскрипции. Специалистам средней квалификации в данной области техники должно быть понятно из контекста, что во многих вариантах осуществления термин «последовательности контроля» относится к компонентам, присутствие которых является необходимым для экспрессии и процессинга, и в некоторых вариантах осуществления включает компоненты, присутствие которых является преимущественным для экспрессии (в том числе, например, лидерные последовательности, нацеливающие последовательности и/или последовательности партнеров по слиянию).[00154] As used herein, the phrase "operably linked" includes a physical superposition (e.g., in three-dimensional space) of components or elements that directly or indirectly interact with one another or otherwise coordinate with one another to participate in a biological event, wherein such superposition enables or permits such interaction and/or coordination. As just one example, a control sequence (e.g., an expression control sequence) in a nucleic acid is said to be "operably linked" to a coding sequence if it is positioned relative to the coding sequence such that its presence or absence affects the expression and/or activity of the coding sequence. In many embodiments, a "functional linkage" refers to a covalent association of the respective components or elements with one another. Those skilled in the art will readily appreciate that in some embodiments, a covalent association is not required to achieve an effective functional linkage. For example, in some embodiments, nucleic acid control sequences that are operably linked to the coding sequences they control are contiguous with the nucleotide of interest. Alternatively or additionally, in some embodiments, one or more of such control sequences act in trans or at a distance to control the coding sequence of interest. In some embodiments, as used herein, the term "expression control sequence" refers to polynucleotide sequences that are necessary and/or sufficient to effect the expression and processing of the coding sequences to which they are ligated. In some embodiments, "expression control sequences" can be or include appropriate sequences for transcription initiation and termination, promoter and/or enhancer sequences; signals for efficient RNA processing, such as splicing and polyadenylation signals; sequences that stabilize cytoplasmic mRNA; sequences that enhance translation efficiency (e.g., a Kozak consensus sequence); sequences that enhance protein stability; and/or in some embodiments, protein secretion enhancing sequences. In some embodiments, one or more of the control sequences are active preferentially or exclusively in a particular host cell or organism or type thereof. As just one example, in prokaryotes, control sequences typically include a promoter, a ribosome binding site, and a transcription termination sequence; in eukaryotes, in many embodiments, control sequences typically include promoters, enhancers, and/or transcription termination sequences. Those of ordinary skill in the art will appreciate from context that in many embodiments, the term "control sequences" refers to components whose presence is necessary for expression and processing, and in some embodiments includes components whose presence is advantageous for expression (including, for example, leader sequences, targeting sequences, and/or fusion partner sequences).
[00155] «Перенацеливание» или «перенаправление» может предусматривать сценарий, при котором частица дикого типа нацеливается на несколько клеток в пределах ткани и/или несколько органов в пределах организма, причем общее нацеливание на ткань или органы снижено или устранено за счет введения гетерологичной аминокислоты, и перенацеливание на более конкретную клетку в ткани или конкретный орган в организме достигается с помощью нацеливающего лиганда (например, с помощью нацеливающего лиганда), который связывается с маркером, экспрессируемым конкретной клеткой. Такое перенацеливание или перенаправление может также предусматривать сценарий, при котором частица дикого типа нацеливается на ткань, и нацеливание на ткань снижено вплоть до устранения за счет введения гетерологичной аминокислоты, и при этом перенацеливание на совершенно другую ткань достигается с помощью нацеливающего лиганда.[00155] "Retargeting" or "redirection" may include a scenario in which a wild-type particle is targeted to multiple cells within a tissue and/or multiple organs within an organism, wherein the overall targeting of the tissue or organs is reduced or eliminated by the introduction of a heterologous amino acid, and retargeting to a more specific cell within a tissue or a specific organ within an organism is achieved by a targeting ligand (e.g., a targeting ligand) that binds to a marker expressed by a specific cell. Such retargeting or redirection may also include a scenario in which a wild-type particle is targeted to a tissue, and the targeting of the tissue is reduced or eliminated by the introduction of a heterologous amino acid, and wherein retargeting to an entirely different tissue is achieved by a targeting ligand.
[00156] «Специфическая связывающаяся пара», «связывающаяся пара белок:белок» и т.п.включает два белка (например, первого партнера (например, первый полипептид) и второго когнатного партнера (например, второй полипептид)), которые взаимодействуют с образованием связи (например, нековалентной связи между первым партнером-эпитопом и вторым партнером-антигенсвязывающей частью антитела, которая распознает эпитоп) или ковалентной изопептидной связи в условиях, которые позволяют или облегчают образование связи. В некоторых вариантах осуществления термин «когнатный» относится к компонентам, которые функционируют совместно. Эпитопы и их когнатные антитела, в частности эпитопы, которые также могут выполнять функцию детектируемой метки (например, с-myc), хорошо известны в данной области техники. Обзор специфических связывающихся пар белок:белок, способных взаимодействовать с образованием ковалентной изопептидной связи, приведен в Veggiani et al. (2014) Trends Biotechnol. 32:506, и они включают связывающиеся пары пептид: пептид, такие как SpyTag: SpyCatcher, SpyTag002:SpyCatcher002; SpyTag:KTag; isopeptag:ramHH С, SnoopTag:SnoopCatcher и т.д. Обычно первый партнер из связывающейся пары белок:белок относится к партнеру из связывающейся пары белок:белок, длина которого обычно составляет менее 30 аминокислот и который образует ковалентную изопептидную связь со вторым когнатным белком, где второй когнатный белок обычно больше, но его длина также может составлять менее 30 аминокислот, например, в системе SpyTag:KTag.[00156] A "specific binding pair," "protein:protein binding pair," and the like, includes two proteins (e.g., a first partner (e.g., a first polypeptide) and a second cognate partner (e.g., a second polypeptide)) that interact to form a bond (e.g., a non-covalent bond between the first epitope partner and the second partner, an antigen-binding portion of an antibody that recognizes the epitope) or a covalent isopeptide bond under conditions that allow or facilitate the formation of the bond. In some embodiments, the term "cognate" refers to components that function together. Epitopes and their cognate antibodies, particularly epitopes that can also function as a detectable label (e.g., c-myc), are well known in the art. A review of specific protein:protein binding pairs capable of interacting to form a covalent isopeptide bond is provided in Veggiani et al. (2014) Trends Biotechnol. 32:506, and they include peptide:peptide binding pairs such as SpyTag:SpyCatcher, SpyTag002:SpyCatcher002; SpyTag:KTag; isopeptag:ramHH C, SnoopTag:SnoopCatcher, etc. Typically, the first partner of the protein:protein binding pair refers to a partner of the protein:protein binding pair that is usually less than 30 amino acids in length and that forms a covalent isopeptide bond with a second cognate protein, where the second cognate protein is usually larger but may also be less than 30 amino acids in length, such as in the SpyTag:KTag system.
[00157] Термин «изопептидная связь» относится к амидной связи между карбоксильной или карбоксамидной группой и аминогруппой, при этом по меньшей мере одна из этих групп не происходит из основной цепи белка или в качестве альтернативы не является частью остова белка. Изопептидная связь может образовываться в пределах одного белка или может иметь место между двумя пептидами или пептидом и белком. Таким образом, изопептидная связь может образовываться внутримолекулярно в пределах одного белка или межмолекулярно, т.е. между двумя пептидными/белковыми молекулами, например, между двумя пептидными линкерами. Как правило, изопептидная связь может находиться между остатком лизина и остатком аспарагина, аспарагиновой кислоты, глутамина или глутаминовой кислоты или концевой карбоксильной группой белковой или пептидной цепи или может находиться между альфа-аминоконцом белковой или пептидной цепи и аспарагином, аспарагиновой кислотой, глутамином или глутаминовой кислотой. Каждый остаток пары, принимающий участие в изопептидной связи, называется в данном документе реакционноспособным остатком. В предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения изопептидная связь может образовываться между остатком лизина и остатком аспарагина или между остатком лизина и остатком аспарагиновой кислоты. В частности, изопептидные связи могут находиться между аминогруппой боковой цепи лизина и карбоксамидной группой аспарагина или карбоксильной группой аспартата.[00157] The term "isopeptide bond" refers to an amide bond between a carboxyl or carboxamide group and an amino group, wherein at least one of these groups is not derived from the protein backbone or, alternatively, is not part of the protein backbone. An isopeptide bond may be formed within a single protein or may occur between two peptides or a peptide and a protein. Thus, an isopeptide bond may be formed intramolecularly within a single protein or intermolecularly, i.e., between two peptide/protein molecules, such as between two peptide linkers. Typically, the isopeptide bond may be between a lysine residue and an asparagine, aspartic acid, glutamine or glutamic acid residue or a terminal carboxyl group of a protein or peptide chain, or may be between the alpha-amino terminus of a protein or peptide chain and asparagine, aspartic acid, glutamine or glutamic acid. Each residue of the pair participating in the isopeptide bond is referred to herein as a reactive residue. In preferred embodiments of the present invention, the isopeptide bond may be formed between a lysine residue and an asparagine residue or between a lysine residue and an aspartic acid residue. In particular, the isopeptide bonds may be between the amino group of the side chain of lysine and the carboxamide group of asparagine or the carboxyl group of aspartate.
[00158] Система SpyTag: SpyCatcher описана в патенте США №9547003 и Zaveri et al. (2012) PNAS 109:E690-E697, каждый из которых включен в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте, и получена из домена CnaB2 фибронектинсвязывающего белка FbaB Streptococcus pyogenes. Путем расщепления домена Zakeri et al. получили пептид «SpyTag», имеющий последовательность AHIVMVDAYKPTK (SEQ ID NO:42), который образует амидную связь с его когнатным белком «SpyCatcher», полипептидом из 112 аминокислот, имеющим аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO:43. (Zakeri (2012), выше). Дополнительной специфической связывающейся парой, полученной из домена CnaB2, является система SpyTag:KTag, которая образует изопептидную связь в присутствии SpyLigase. (Fierer (20I4) PNAS 111:Е1176-1181). SpyLigase была сконструирована путем вырезания β-нити из SpyCatcher, которая содержит реакционноспособный лизин, с получением KTag, первого партнера из связывающейся пары белок:белок из 10 остатков, имеющего аминокислотную последовательность ATHIKFSKRD (SEQ ID NO:72). Система SpyTag002:SpyCatcher002 описана в Keeble et al (2017) Angew Chem Int Ed Engl 56:16521-25, включенном в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте. SpyTag002 имеет аминокислотную последовательность VPTIVMVDAYKRYK, изложенную под SEQ ID NO:73, и связывает SpyCatcher002.[00158] The SpyTag: SpyCatcher system is described in U.S. Patent No. 9,547,003 and Zaveri et al. (2012) PNAS 109:E690-E697, each of which is incorporated herein by reference in its entirety, and is derived from the CnaB2 domain of the fibronectin-binding protein FbaB from Streptococcus pyogenes. By cleavage of the domain, Zakeri et al. generated a "SpyTag" peptide having the sequence AHIVMVDAYKPTK (SEQ ID NO:42), which forms an amide bond with its cognate protein "SpyCatcher", a 112 amino acid polypeptide having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO:43. (Zakeri (2012), supra). An additional specific binding pair derived from the CnaB2 domain is the SpyTag:KTag system, which forms an isopeptide bond in the presence of SpyLigase. (Fierer (20I4) PNAS 111:E1176-1181). SpyLigase was constructed by cutting out the β-strand of SpyCatcher, which contains a reactive lysine, to yield KTag, the first partner of a 10-residue protein:protein binding pair with the amino acid sequence ATHIKFSKRD (SEQ ID NO:72). The SpyTag002:SpyCatcher002 system is described in Keeble et al (2017) Angew Chem Int Ed Engl 56:16521-25, incorporated herein by reference in its entirety. SpyTag002 has the amino acid sequence VPTIVMVDAYKRYK set forth under SEQ ID NO:73 and binds SpyCatcher002.
[00159] Система SnoopTag:SnoopCatcher описана в Veggiani (2016) PNAS 113:1202-07. Ig-подобный домен D4 RrgA, отвечающий за адгезию у Streptococcus pneumoniae, расщепили с образованием SnoopTag (остатки 734-745) и SnoopCatcher (остатки 749-860). Инкубация SnoopTag и SnoopCatcher приводит к спонтанному образованию изопептидной связи, которая является специфической для комплементарных белков. Veggiani (2016)), выше.[00159] The SnoopTag:SnoopCatcher system is described in Veggiani (2016) PNAS 113:1202-07. The Ig-like domain D4 of RrgA, responsible for adhesion in Streptococcus pneumoniae, was cleaved to generate SnoopTag (residues 734-745) and SnoopCatcher (residues 749-860). Incubation of SnoopTag and SnoopCatcher results in the spontaneous formation of an isopeptide bond that is specific for the complementary proteins. Veggiani (2016)), supra.
[00160] Специфическую связывающуюся пару isopeptag:пилин-C получили из основного белка пилина Spy0128 из Streptococcus pyogenes (Zakeir and Howarth (2010) J. Am. Chem. Soc. 132:4526 27). Isopeptag имеет аминокислотную последовательность TDKDMTITFTNKKDAE, изложенную под SEQ ID NO:75, и связывается с пилином-С (остатки 18-299 из Spy0128). Инкубация SnoopTag и SnoopCatcher приводит к спонтанному образованию изопептидной связи, которая является специфической для комплементарных белков. Zakeir and Howarth (2010), выше.[00160] The specific isopeptag:pilin C binding pair was derived from the essential pilin protein Spy0128 from Streptococcus pyogenes (Zakeir and Howarth (2010) J. Am. Chem. Soc. 132:4526 27). The isopeptag has the amino acid sequence TDKDMTITFTNKKDAE, set forth as SEQ ID NO:75, and binds to pilin C (residues 18-299 of Spy0128). Incubation of SnoopTag and SnoopCatcher results in spontaneous formation of an isopeptide bond that is specific for the complementary proteins. Zakeir and Howarth (2010), supra.
[00161] Термин «детектируемая метка» включает полипептидную последовательность, которая является партнером из специфической связывающейся пары, например, которая специфически связывается с высокой аффинностью посредством нековалентной связи с другой полипептидной последовательностью, например паратопом антитела. Иллюстративные и неограничивающие детектируемые метки включают гексагистидиновую метку, метку FLAG, метку Strep II, метку на основе стрептавидинсвязывающего пептида (SBP), кальмодулинсвязывающий пептид (СВР), глутатион-S-трансферазу (GST), мальтозосвязывающий белок (МВР), S-метку, НА-метку и c-myc (SEQ ID NO:44) (обзор приведен в Zhao et al. (2013) J. Analytical Meth. Chem. 1-8; включенной в данный документ посредством ссылки). Обычной детектируемой меткой для AAV примата является эпитоп Bl (SEQ ID NO:45). Капсидные белки AAV животного, не являющегося приматом, по настоящему изобретению, которые естественным образом не содержат эпитоп В1, в данном документе могут быть модифицированы с включением эпитопа В1. Обычно капсидные белки AAV животного, не являющегося приматом, могут содержать последовательность, характеризующуюся значительной гомологией с эпитопом В1, в пределах последних 10 аминокислот капсидного белка. Соответственно, в некоторых вариантах осуществления капсидный белок AAV животного, не являющегося приматом, по настоящему изобретению может быть модифицирован одной, но не более чем пятью точечными мутациями в пределах последних 10 аминокислот капсидного белка, так что капсидный белок AAV содержит эпитоп В1.[00161] The term "detectable label" includes a polypeptide sequence that is a partner of a specific binding pair, e.g., that specifically binds with high affinity through a non-covalent association to another polypeptide sequence, e.g., an antibody paratope. Exemplary and non-limiting detectable labels include a hexahistidine tag, a FLAG tag, a Strep II tag, a streptavidin-binding peptide (SBP) tag, a calmodulin-binding peptide (CBP), glutathione S-transferase (GST), maltose binding protein (MBP), an S tag, an HA tag, and c-myc (SEQ ID NO:44) (reviewed in Zhao et al. (2013) J. Analytical Meth. Chem. 1-8; incorporated herein by reference). A typical detectable label for a primate AAV is the B1 epitope (SEQ ID NO:45). Non-primate AAV capsid proteins of the present invention that do not naturally comprise the B1 epitope may be modified herein to include the B1 epitope. Typically, non-primate AAV capsid proteins may comprise a sequence having significant homology to the B1 epitope within the last 10 amino acids of the capsid protein. Accordingly, in some embodiments, a non-primate AAV capsid protein of the present invention may be modified by one, but not more than five, point mutations within the last 10 amino acids of the capsid protein such that the AAV capsid protein comprises the B1 epitope.
[00162] Термин «клетки-мишени» включает любые клетки, в которых экспрессия представляющего интерес нуклеотида является необходимой. Предпочтительно на поверхности клеток-мишеней обнаруживается рецептор, который обеспечивает нацеливание на клетку с помощью нацеливающего лиганда, как описано ниже.[00162] The term "target cells" includes any cells in which expression of the nucleotide of interest is required. Preferably, the target cells are found on the surface of a receptor that provides targeting of the cell by a targeting ligand, as described below.
[00163] Термин «трансдукция» или «инфекция» и т.п. относится к введению нуклеиновой кислоты в ядро клетки-мишени с помощью вирусной частицы. Термин «эффективность» в отношении трансдукции или т.п., например, «эффективность трансдукции», относится к доле (например, процентной величине) клеток, экспрессирующих представляющий интерес нуклеотид после инкубации с установленным числом вирусных частиц, содержащих представляющий интерес нуклеотид. Общеизвестные способы определения эффективности трансдукции включают проточную цитометрию трансдуцированных клеток с флуоресцентным репортерным геном, RT-PCR для экспрессии представляющего интерес нуклеотида и т.д.[00163] The term "transduction" or "infection" and the like refers to the introduction of a nucleic acid into the nucleus of a target cell by a viral particle. The term "efficiency" in relation to transduction or the like, for example, "transduction efficiency", refers to a proportion (e.g., percentage) of cells expressing a nucleotide of interest after incubation with a specified number of viral particles containing the nucleotide of interest. Well-known methods for determining transduction efficiency include flow cytometry of transduced cells with a fluorescent reporter gene, RT-PCR for expression of a nucleotide of interest, etc.
[00164] Обычно «эталонный» вирусные капсидный белок/капсид/частица идентичны тестируемому вирусному капсид ному белку/капсиду/частице за исключением изменения, в отношении которого следует протестировать эффект. Например, для определения влияния вставки первого партнера из специфической связывающейся пары в исследуемую вирусную частицу, например, на эффективность трансдукции, показатели эффективности трансдукции тестируемой вирусной частицы (в отсутствие или в присутствии соответствующего нацеливающего лиганда) можно сравнить с показателями эффективности трансдукции эталонной вирусной частицы (при необходимости в отсутствие или в присутствии соответствующего нацеливающего лиганда), которая идентична тестируемой вирусной частице по всем параметрам (например, дополнительные точечные мутации, представляющий интерес нуклеотид, число вирусных частиц и клеток-мишеней и т.д.), за исключением присутствия первого партнера из специфической связывающейся пары. В некоторых вариантах осуществления эталонный вирусный капсидный белок представляет собой белок, который способен образовывать капсид со вторым вирусным капсидным белком, модифицированным с включением по меньшей мере первого партнера из связывающейся пары белок:белок, где эталонный вирусный капсидный белок не содержит первого партнера из связывающейся пары белок:белок, предпочтительно, где капсид, образованный эталонным вирусным капсидным белком и модифицированным вирусным капсидным белком, представляет собой мозаичный капсид.[00164] Typically, a "reference" viral capsid protein/capsid/particle is identical to the test viral capsid protein/capsid/particle except for the change for which the effect is to be tested. For example, to determine the effect of inserting the first partner of a specific binding pair into a test viral particle on, for example, transduction efficiency, the transduction efficiency of the test viral particle (in the absence or presence of the appropriate targeting ligand) can be compared to the transduction efficiency of a reference viral particle (optionally in the absence or presence of the appropriate targeting ligand) that is identical to the test viral particle in all respects (e.g., additional point mutations, nucleotide of interest, number of viral particles and target cells, etc.) except for the presence of the first partner of the specific binding pair. In some embodiments, the reference viral capsid protein is a protein that is capable of forming a capsid with a second viral capsid protein modified to include at least a first partner of a protein:protein binding pair, wherein the reference viral capsid protein does not comprise the first partner of a protein:protein binding pair, preferably wherein the capsid formed by the reference viral capsid protein and the modified viral capsid protein is a mosaic capsid.
[00165] Аденоассоциированные вирусы (AAV)[00165] Adeno-associated viruses (AAV)
[00166] «AAV» представляет собой сокращенное название аденоассоциированного вируса и может использоваться для обозначения самого вируса или его производных. AAV являются небольшими безоболочечными вирусами с однонитевой ДНК. Обычно размер генома AAV дикого типа составляет 4,7 т.о., и для него характерны два инвертированных концевых повтора (ITR) и две открытые рамки считывания (ORF), rep и cap.Рамка считывания rep дикого типа кодирует четыре белка с молекулярной массой 78 кДа ("Rep78"), 68 кДа («Rep68»), 52 кДа («Rep52») и 40 кДа («Rep 40»). Rep78 и Rep68 транскрибируются с промотора р5, а Rep52 и Rep40 транскрибируются с промотора р19. Функцией данных белок является в основном регуляция транскрипции и репликации генома AAV. Рамка считывания cap дикого типа кодирует три структурных (капсидных) вирусных белка (VP), имеющих молекулярную массу 83-85 кДа (VP1), 72-73 кДа (VP2) и 61-62 кДа (VP3). Более 80% от всех белков в вирионе (капсиде) AAV составляет VP3; в зрелых вирионах VP1, VP2 и VP3 находятся при относительном содержании, составляющем примерно 1:1:10, хотя сообщалось о соотношении 1:1:8. Padron et al. (2005) J. Virology 79:5047-58.[00166] "AAV" is an abbreviation for adeno-associated virus and can be used to refer to the virus itself or its derivatives. AAVs are small, non-enveloped, single-stranded DNA viruses. The wild-type AAV genome is typically 4.7 kb in size and is characterized by two inverted terminal repeats (ITRs) and two open reading frames (ORFs), rep and cap. The wild-type rep reading frame encodes four proteins with molecular masses of 78 kDa ("Rep78"), 68 kDa ("Rep68"), 52 kDa ("Rep52"), and 40 kDa ("Rep 40"). Rep78 and Rep68 are transcribed from the p5 promoter, and Rep52 and Rep40 are transcribed from the p19 promoter. The function of these proteins is primarily to regulate transcription and replication of the AAV genome. The wild-type cap reading frame encodes three structural (capsid) viral proteins (VPs) with molecular masses of 83–85 kDa (VP1), 72–73 kDa (VP2), and 61–62 kDa (VP3). More than 80% of the proteins in the AAV virion (capsid) are VP3; in mature virions, VP1, VP2, and VP3 are present in a relative abundance of approximately 1:1:10, although ratios of 1:1:8 have been reported. Padron et al. (2005) J. Virology 79:5047–58.
[00167] В данной области техники известны геномные последовательности различных серотипов AAV, а также последовательности нативных инвертированных концевых повторов (ITR), белков Rep и субъединиц капсида. Такие последовательности можно найти в литературе или в общедоступных базах данных, таких как GenBank. См., например, номера доступа в GenBank NC 002077 (AAV1), AF063497 (AAV1), NC00I401 (AAV-2), AF043303 (AAV2), NC 001729 (AAV3), NC 001829 (AAV4), U89790 (AAV4), NC 006152 (AAV5), AF513851 (AAV7), AF513852 (AAV8) и NC 006261 (AAV8); раскрытия которых включены в данный документ посредством ссылки для иллюстрации последовательностей нуклеиновой кислоты и аминокислотных последовательностей AAV. См. также, например, Srivistava et al. (1983) J. Virology 45:555; Chiorini et al. (1998) J. Virology 71:6823; Chiorini et al. (1999) J. Virology 73: 1309; Bantel-Schaal et al. (1999) J. Virology 73:939; Xiao et al. (1999) J. Virology 73:3994; Muramatsu et al. (1996) Virology 221:208; Shade et al., (1986) J. Virol. 58:921; Gao et al. (2002) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 99: 11854; Moris et al. (2004) Virology 33:375-383; публикацию заявки на патент США №20170130245; публикации международных заявок WO 00/28061, WO 99/61601, WO 98/11244 и патент США №6I56303, каждый из которых включен посредством ссылки во всей своей полноте. В таблице 1 представлены последовательности различных AAV животных, не являющихся приматом.[00167] The genomic sequences of various AAV serotypes, as well as the sequences of native inverted terminal repeats (ITRs), Rep proteins, and capsid subunits, are known in the art. Such sequences can be found in the literature or in publicly available databases such as GenBank. See, for example, GenBank accession numbers NC 002077 (AAV1), AF063497 (AAV1), NC00I401 (AAV-2), AF043303 (AAV2), NC 001729 (AAV3), NC 001829 (AAV4), U89790 (AAV4), NC 006152 (AAV5), AF513851 (AAV7), AF513852 (AAV8), and NC 006261 (AAV8); the disclosures of which are incorporated herein by reference to illustrate the nucleic acid sequences and amino acid sequences of AAV. See also, e.g., Srivistava et al. (1983) J. Virology 45:555; Chiorini et al. (1998) J. Virology 71:6823; Chiorini et al. (1999) J. Virology 73: 1309; Bantel-Schaal et al. (1999) J. Virology 73:939; Xiao et al. (1999) J. Virology 73:3994; Muramatsu et al. (1996) Virology 221:208; Shade et al., (1986) J. Virol. 58:921; Gao et al. (2002) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 99: 11854; Moris et al. (2004) Virology 33:375–383; U.S. Patent Application Publication No. 20170130245; International Application Publications Nos. WO 00/28061, WO 99/61601, WO 98/11244, and U.S. Patent No. 6I56303, each of which is incorporated by reference in its entirety. Table 1 provides sequences of various non-primate AAVs.
[00168] «AAV» охватывает все подтипы, также как встречающиеся в природе, так и модифицированные формы, за исключением случаев, когда требуется иное. AAV включает AAV примата (например, AAV типа 1 (AAV1), AAV примата типа 2 (AAV2), AAV примата типа 3 (AAV3), AAV примата типа 4 (AAV4), AAV примата типа 5 (AAV5), AAV примата типа 6 (AAV6), AAV примата типа 7 (AAV7), AAV примата типа 8 (AAV8), AAV животного, не являющегося приматом, (например, птичий AAV (AAAV)) и AAV других животных, не являющихся приматом, такие как AAV млекопитающего (например, AAV летучей мыши, AAV морского льва, AAV крупного рогатого скота, AAV собаки, AAV лошади, AAV козы и AAV овцы и т.д.), AAV чешуйчатого пресмыкающегося (например, AAV змеи, AAV бородатой агамы) и т.д., и отдаленный AAV и т.д. «AAV примата» относится к AAV, обычно выделяемому из приматов. Аналогичным образом, «AAV животного, не являющегося приматом» относится к AAV, выделяемому из животных, не являющихся приматом. Используемый в данном документе «отдаленный AAV» включает:[00168] "AAV" includes all subtypes, both naturally occurring and modified forms, except where otherwise required. AAV includes primate AAV (e.g., AAV type 1 (AAV1), primate AAV type 2 (AAV2), primate AAV type 3 (AAV3), primate AAV type 4 (AAV4), primate AAV type 5 (AAV5), primate AAV type 6 (AAV6), primate AAV type 7 (AAV7), primate AAV type 8 (AAV8), non-primate AAV (e.g., avian AAV (AAAV)) and other non-primate AAVs such as mammalian AAV (e.g., bat AAV, sea lion AAV, bovine AAV, dog AAV, equine AAV, goat AAV and sheep AAV, etc.), scaled reptile AAV (e.g., snake AAV, bearded dragon AAV), etc., and distant AAV, etc. “Primate AAV” refers to an AAV typically isolated from primates. Similarly, “non-primate AAV” refers to an AAV isolated from non-primate animals. As used herein, “distant AAV” includes:
AAV, выделенный из приматов или животных, не являющихся приматами, обычно имеющих ограниченный контакт с популяцией человека в целом,AAV isolated from primates or non-primate animals that typically have limited contact with the general human population,
AAV, выделенный из животных-приматов, например AAV примата, содержащий капсидный белок VP1 дикого типа, который содержит аминокислотную последовательность, характеризующуюся менее 99%, например менее 95%, например менее 90%, например менее 85%) идентичностью аминокислотной последовательности с каждым из следующего: капсидным белком VP1 AAV1, капсидным белком VP1 AAV2, капсидным белком VP1 AAV3, капсидным белком VP1 AAV4, капсидным белком VP1 AAV5, капсидным белком VP1 AAV6, капсидным белком VP1 AAV7, капсидным белком VP1 AAV8, капсидным белком VP1 AAV9, капсидным белком VP1 AAV10, капсидным белком VP1 AAV11, капсидным белком VP1 AAV12 и капсидным белком VP1 AAV13, и/илиAn AAV isolated from a primate animal, such as a primate AAV, comprising a wild-type VP1 capsid protein that comprises an amino acid sequence having less than 99%, such as less than 95%, such as less than 90%, such as less than 85%) amino acid sequence identity to each of the following: AAV1 capsid protein VP1, AAV2 capsid protein VP1, AAV3 capsid protein VP1, AAV4 capsid protein VP1, AAV5 capsid protein VP1, AAV6 capsid protein VP1, AAV7 capsid protein VP1, AAV8 capsid protein VP1, AAV9 capsid protein VP1, AAV10 capsid protein VP1, AAV11 capsid protein VP1, AAV12 capsid protein and VP1 AAV13, and/or
AAV, выделенный из животных, не являющихся приматом, например AAV животного, не являющегося приматом, содержащий капсидный белок дикого типа, который содержит аминокислотную последовательность, характеризующуюся менее 99%, например менее 95%, например менее 90%, например менее 85% идентичностью аминокислотной последовательности с каждым из AAV, приведенных в таблице 1.An AAV isolated from a non-primate animal, such as an AAV from a non-primate animal, that comprises a wild-type capsid protein that comprises an amino acid sequence that has less than 99%, such as less than 95%, such as less than 90%, such as less than 85% amino acid sequence identity to each of the AAVs listed in Table 1.
[00169] Серо позитивность можно оценить с помощью общеизвестных способов. Например, отсутствие или наличие IgG можно определить с помощью твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA) или других общеизвестных иммунологических анализов. Для обнаружения нейтрализующих антител можно проводить анализ нейтрализации, в котором частицы AAV инкубируются с увеличивающимися количествами (серийные разведения) (i) сыворотки конкретного субъекта или смешанной сыворотки нескольких субъектов, или (ii) очищенных иммуноглобулинов (IVIG или IgG), полученных из отдельного образца или объединенных образцов сыворотки крови (например, от десятков до тысяч доноров, представляющих профиль иммуноглобулинов в данной популяции) с последующим обнаружением инфицирования клеток, например, путем отслеживания экспрессии репортерного гена (например, гена люциферазы, GFP и т.д.). 3атем уровень инфицирования сравнивают с уровнем в контрольном образце, не подвергавшемся воздействию сыворотки крови/IVIG/IgG. См., например, пример 8. Нейтрализующий титр можно определить, например, как концентрацию IVIG/IgG или самый высокую кратность разведения сыворотки крови, которая приводит к 50% или большему подавлению экспрессии репортерного гена по сравнению с контролем. В одном варианте осуществления разведение сыворотки крови, при котором наблюдается более чем 70% снижение числа инфицированных клеток по сравнению с контролем, считается положительным в отношении нейтрализующей активности. Взаимодействия с известными специфическими нейтрализующими антителами можно изучить, например, с помощью иммуноблоттинга.[00169] Seropositivity can be assessed using well-known methods. For example, the absence or presence of IgG can be determined using an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) or other well-known immunoassays. To detect neutralizing antibodies, a neutralization assay can be performed in which AAV particles are incubated with increasing amounts (serial dilutions) of (i) a single subject's serum or pooled serum from multiple subjects, or (ii) purified immunoglobulins (IVIG or IgG) obtained from a single sample or pooled serum samples (e.g., tens to thousands of donors representing the immunoglobulin profile in a given population), followed by detection of cellular infection, such as by monitoring the expression of a reporter gene (e.g., luciferase, GFP, etc.). The level of infection is then compared to the level in a control sample not exposed to serum/IVIG/IgG. See, for example, Example 8. The neutralizing titer can be defined, for example, as the IVIG/IgG concentration or the highest serum dilution that results in 50% or greater suppression of reporter gene expression compared to a control. In one embodiment, a serum dilution that results in a greater than 70% reduction in the number of infected cells compared to a control is considered positive for neutralizing activity. Interactions with known specific neutralizing antibodies can be studied, for example, by immunoblotting.
[00170] Используемое в данном документе выражение «[указанного] AAV» по отношению к гену (например, rep, cap и т.д.), капсидному белку (например, капсидному белку VP1, капсидному белку VP2, капсидному белку VP3 и т.д.), области капсидного белка указанного AAV (например, области PLA2, области VP1-u, общей области VP1/VP2, области VP3), нуклеотидной последовательности (например, последовательности ITR), например гену cap или капсидному белку AAV2 и т.д., охватывает, в дополнение к гену или полипептиду, содержащим последовательность нуклеиновой кислоты или аминокислотную последовательность соответственно, которые изложены в данном документе для указанного AAV, также варианты гена или полипептида, в том числе варианты, содержащие наименьшее число нуклеотидов или аминокислот, требуемое для поддержания одной или более биологических функций. Используемый в данном документе вариант гена или вариант полипептида включают последовательность нуклеиновой кислоты или аминокислотную последовательность, которая отличается от последовательности нуклеиновой кислоты или аминокислотной последовательности, изложенной в данном документе для гена или полипептида указанного AAV, где различие(-я) обычно не изменяет(-ют) по меньшей мере одну биологическую функцию гена или полипептида и/или филогенетическую характеристику гена или полипептида, например, если различие(-я) может(могут) быть связано(-ы) с вырожденностью генетического кода, вариациями изолятов, длиной последовательности и т.д. Например, используемые в данном документе ген rep и ген cap могут охватывать гены rep и cap, которые отличаются от гена дикого типа тем, что гены могут кодировать один или более белков Rep и белков Сар соответственно. В некоторых вариантах осуществления ген Rep кодирует по меньшей мере Rep78 и/или Rep68. В некоторых вариантах осуществления ген cap включает такие гены, которые могут отличаться от гена дикого типа тем, что удалены один или более альтернативных стартовых кодонов или последовательностей между одним или более альтернативными стартовыми кодонами, так что ген cap кодирует только один белок Сар, например, где удалены или заменены стартовые кодоны VP2 и/или VP3, так что ген cap кодирует функциональный капсидный белок VP1, но не капсидный белок VP2 или капсидный белок VP3. Соответственно, используемый в данном документе ген rep охватывает любую последовательность, которая кодирует функциональный белок Rep.Ген cap охватывает любую последовательность, которая кодирует по меньшей мере один функциональный ген cap.[00170] As used herein, the term "[said] AAV" in relation to a gene (e.g., rep, cap, etc.), a capsid protein (e.g., VP1 capsid protein, VP2 capsid protein, VP3 capsid protein, etc.), a region of a capsid protein of said AAV (e.g., PLA2 region, VP1-u region, VP1/VP2 common region, VP3 region), a nucleotide sequence (e.g., an ITR sequence), such as the cap gene or the AAV2 capsid protein, etc., encompasses, in addition to a gene or polypeptide comprising a nucleic acid sequence or amino acid sequence, respectively, as set forth herein for said AAV, also variants of the gene or polypeptide, including variants comprising the smallest number of nucleotides or amino acids required to maintain one or more biological functions. A gene variant or a polypeptide variant as used herein comprises a nucleic acid sequence or an amino acid sequence that differs from a nucleic acid sequence or an amino acid sequence set forth herein for a gene or polypeptide of said AAV, wherein the difference(s) generally does not alter at least one biological function of the gene or polypeptide and/or a phylogenetic characteristic of the gene or polypeptide, for example, where the difference(s) may be due to degeneracy of the genetic code, isolate variations, sequence length, etc. For example, a rep gene and a cap gene as used herein may encompass rep and cap genes that differ from the wild-type gene in that the genes may encode one or more Rep proteins and Cap proteins, respectively. In some embodiments, the Rep gene encodes at least Rep78 and/or Rep68. In some embodiments, the cap gene includes genes that may differ from the wild-type gene in that one or more alternative start codons or sequences between one or more alternative start codons are removed, such that the cap gene encodes only one Cap protein, such as where the VP2 and/or VP3 start codons are removed or replaced, such that the cap gene encodes a functional VP1 capsid protein, but not a VP2 capsid protein or a VP3 capsid protein. Accordingly, as used herein, the rep gene encompasses any sequence that encodes a functional Rep protein. The cap gene encompasses any sequence that encodes at least one functional cap gene.
[00171] Является общеизвестным, что ген cap дикого типа экспрессирует все три капсидных белка VP1, VP2 и VP3 с одной открытой рамки считывания гена cap под контролем промотора р40, находящегося в ORF rep. Термин «капсидный белою», «белок Сар» и т.п. включает белок, который является частью капсида вируса. В случае аденоассоциированных вирусов капсидные белки обычно обозначаются как VP1, VP2 и/или VP3 и могут кодироваться одним геном cap.В случае AAV три капсидных белка AAV продуцируются в природе перекрывающимся образом из ORF cap с использованием альтернативных стартовых кодонов трансляции, хотя все три белка используют общий стоп-кодон. В ORF гена cap дикого типа в направлении от 5'- к 3'-конца закодированы три альтернативных стартовых кодона: «стартовый кодон VP1», «стартовый кодон VP2» и «стартовый кодон VP3», а также один «общий стоп-кодон». Самый крупный вирусный белок, VP1, обычно закодирован от стартового кодона VP1 до «общего стоп-кодона». VP2 обычно закодирован от стартового кодона VP2 до общего стоп-кодона. VP3 обычно закодирован от стартового кодона VP3 до общего стоп-кодона. Соответственно, на своем N-конце VP1 содержит последовательность, которая не является общей с VP2 или VP3, называемой уникальная область VP1 (VP1-u). Область VP1-u обычно закодирована последовательностью гена cap дикого типа, начиная от стартового кодона VP1 до «стартового кодона VP2». VP1-u содержит домен фосфолипазы А2 (PLA2), который может иметь важное значение для инфицирования, а также сигналы ядерной локализации, которые могут помогать вирусу в нацеливании на ядро, удалении оболочки и высвобождении генома. Капсидные белки VP1, VP2 и VP3 имеют одинаковую С-концевую последовательность, которая составляет полный VP3, которая в данном документе также может называться областью VP3. Область VP3 кодируется от стартового кодона VP3 до общего стоп-кодона. VP2 имеет дополнительные ~60 аминокислот, которые являются общими с VP1. Эта область называется общей областью VP1/VP2.[00171] It is generally accepted that the wild-type cap gene expresses all three capsid proteins VP1, VP2, and VP3 from a single open reading frame of the cap gene under the control of the p40 promoter located in the rep ORF. The term "capsid protein,""Capprotein," etc., includes a protein that is part of the viral capsid. In the case of adeno-associated viruses, the capsid proteins are typically referred to as VP1, VP2, and/or VP3 and may be encoded by a single cap gene. In the case of AAV, the three AAV capsid proteins are naturally produced in an overlapping manner from the cap ORF using alternative translation start codons, although all three proteins share a common stop codon. The ORF of the wild-type cap gene encodes three alternative start codons from 5' to 3': the "VP1 start codon", "VP2 start codon", and "VP3 start codon", as well as one "common stop codon". The largest viral protein, VP1, is typically encoded from the VP1 start codon to the "common stop codon". VP2 is typically encoded from the VP2 start codon to the common stop codon. VP3 is typically encoded from the VP3 start codon to the common stop codon. Accordingly, at its N terminus, VP1 contains a sequence that is not shared with VP2 or VP3, called the VP1 unique region (VP1-u). The VP1-u region is typically encoded by the wild-type cap gene sequence from the VP1 start codon to the "VP2 start codon". VP1-u contains a phospholipase A2 (PLA 2 ) domain that may be important for infection, as well as nuclear localization signals that may aid in targeting the virus to the nucleus, uncoating, and releasing the genome. The VP1, VP2, and VP3 capsid proteins share a common C-terminal sequence that constitutes the entire VP3, which may also be referred to herein as the VP3 region. The VP3 region is encoded from the VP3 start codon to the common stop codon. VP2 has an additional ~60 amino acids that are common with VP1. This region is referred to as the VP1/VP2 common region.
[00172] В некоторых вариантах осуществления один или более белков Сар по настоящему изобретению могут быть закодированы одним или более генами cap, имеющими одну или более ORF. В некоторых вариантах осуществления белки VP по настоящему изобретению могут экспрессироваться с более чем одной ORF, содержащей нуклеотидную последовательность, кодирующую любую комбинацию VP1, VP2 и/или VP3, с использованием отдельных нуклеотидных последовательностей, функционально связанных с по меньшей мере одной последовательностью контроля экспрессии, для экспрессии в упаковывающей клетке, каждая из которых продуцирует один или более капсидных белков VP1, VP2 и/или VP3 по настоящему изобретению. В некоторых вариантах осуществления капсидный белок VP по настоящему изобретению может экспрессироваться отдельно с ORF, содержащей нуклеотидную последовательность, кодирующую любой из VP1, VP2 или VP3, с использованием отдельных нуклеотидных последовательностей, функционально связанных с одной последовательностью контроля экспрессии, для экспрессии в клетке, предназначенной для репликации вируса, каждая из которых продуцирует только один из капсидных белков VP1, VP2 или VP3. В другом варианте осуществления белки VP могут экспрессироваться с одной ORF, содержащей нуклеотидные последовательности, кодирующие капсидные белки VP1, VP2 и VP3, функционально связанные с по меньшей мере одной последовательностью контроля экспрессии, для экспрессии в клетке, предназначенной для репликации вируса, каждая из которых продуцирует капсидный белок VP1, VP2 и VP3. Соответственно, хотя аминокислотные положения, представленные в данном документе, могут представляться в привязке к капсидному белку VP1 эталонного AAV, квалифицированный специалист сможет соответствующим образом и легко определить положение той же аминокислоты в пределах капсидного белка VP2 и/или VP3 AAV и соответствующее положение аминокислот в различных AAV.[00172] In some embodiments, one or more Cap proteins of the present invention may be encoded by one or more cap genes having one or more ORFs. In some embodiments, VP proteins of the present invention may be expressed with more than one ORF comprising a nucleotide sequence encoding any combination of VP1, VP2, and/or VP3, using separate nucleotide sequences operably linked to at least one expression control sequence for expression in a packaging cell, each of which produces one or more VP1, VP2, and/or VP3 capsid proteins of the present invention. In some embodiments, the VP capsid protein of the present invention can be expressed separately with an ORF comprising a nucleotide sequence encoding any of VP1, VP2 or VP3, using separate nucleotide sequences operably linked to a single expression control sequence for expression in a cell intended for viral replication, each of which produces only one of the VP1, VP2 or VP3 capsid proteins. In another embodiment, the VP proteins can be expressed with a single ORF comprising nucleotide sequences encoding the VP1, VP2 and VP3 capsid proteins operably linked to at least one expression control sequence for expression in a cell intended for viral replication, each of which produces the VP1, VP2 and VP3 capsid protein. Accordingly, although the amino acid positions provided herein may be provided in relation to the VP1 capsid protein of a reference AAV, one skilled in the art will be able to readily and appropriately determine the position of the same amino acid within the VP2 and/or VP3 capsid protein of an AAV and the corresponding amino acid position in different AAVs.
[00173] Фраза «инвертированный концевой повтор» или «ITR» включает симметричные последовательности нуклеиновой кислоты в геноме аденоассоциированных вирусов, необходимые для эффективной репликации. Последовательности ITR расположены на каждом конце ДНК-генома AAV. ITR служат в качестве точек начала репликации для синтеза вирусной ДНК и являются необходимыми цис-компонентами для образования частиц AAV, например, упаковки в частицы AAV.[00173] The phrase "inverted terminal repeat" or "ITR" includes symmetrical nucleic acid sequences in the genome of adeno-associated viruses that are required for efficient replication. ITR sequences are located at each end of the AAV DNA genome. ITRs serve as origins of replication for viral DNA synthesis and are necessary cis components for the formation of AAV particles, such as packaging into AAV particles.
[00174] ITR AAV содержат сайты распознавания для белков репликации Rep78 или Rep68. «D»-область ITR включает сайт одноцепочечного разрыва ДНК, где происходит инициирование репликации ДНК, и обеспечивает направленность стадии репликации нуклеиновой кислоты. AAV, реплицирующийся в клетке млекопитающего, как правило, содержит две последовательности ITR.[00174] AAV ITRs contain recognition sites for the Rep78 or Rep68 replication proteins. The "D" region of the ITR includes the DNA single-strand break site where DNA replication initiation occurs and provides directionality for the nucleic acid replication step. An AAV replicating in a mammalian cell typically contains two ITR sequences.
[00175] Одиночный ITR можно конструировать с сайтами связывания Rep на обеих нитях «А»-областей и двумя симметричными D-областями на каждой стороне палиндрома ITR. Такая сконструированная конструкция на матрице двухнитевой кольцевой ДНК позволяет Rep78 или Rep68 инициировать репликацию нуклеиновой кислоты, которая происходит в обоих направлениях. Одиночного ITR достаточно для репликации AAV в виде кольцевой частицы. В способах получения вирусной частицы AAV по настоящему изобретению последовательность, кодирующая rep, кодирует белок Rep или эквивалент белка Rep, которые способны связывать ITR, содержащийся в плазмиде-переносчике.[00175] A single ITR can be engineered with Rep binding sites on both strands of the "A" regions and two symmetrical D regions on each side of the ITR palindrome. Such an engineered construct on a double-stranded circular DNA template allows Rep78 or Rep68 to initiate nucleic acid replication, which occurs in both directions. A single ITR is sufficient for replication of AAV as a circular particle. In the methods for producing an AAV viral particle of the present invention, the rep encoding sequence encodes a Rep protein or a Rep protein equivalent that is capable of binding an ITR contained in a transfer plasmid.
[00176] При экспрессии с соответствующими белками Rep в упаковывающей клетке белки Сар по настоящему изобретению могут инкапсидировать плазмиду-переносчика, содержащую представляющий интерес нуклеотид и четное число из двух или более последовательностей ITR. В некоторых вариантах осуществления плазмида-переносчик содержит одну последовательность ITR. В некоторых вариантах осуществления плазмида-переносчик содержит две последовательности ITR.[00176] When expressed with the appropriate Rep proteins in a packaging cell, the Cap proteins of the present invention can encapsidate a transfer plasmid comprising a nucleotide of interest and an even number of two or more ITR sequences. In some embodiments, the transfer plasmid comprises one ITR sequence. In some embodiments, the transfer plasmid comprises two ITR sequences.
[00177] Rep78 и/или Rep68 связываются с уникальными и известными сайтами в последовательности ITR-шпильки и функционируют с разрушением и раскручиванием шпильковых структур на конце генома AAV, тем самым обеспечивая доступ репликационному аппарату клетки для репликации вируса. Как хорошо известно, белки Rep могут экспрессироваться с более чем одной ORF, содержащей нуклеотидную последовательность, кодирующую любую комбинацию Rep78, Rep68, Rep52 и/или Rep40, с использованием отдельных нуклеотидных последовательностей, функционально связанных с по меньшей мере одной последовательностью контроля экспрессию, для экспрессии в клетке, предназначенной для репликации вируса, каждая из которых продуцирует один или более белков Rep - Rep78, Rep68, Rep52 и/или Rep40. В качестве альтернативы белки Rep могут экспрессироваться отдельно с ORF, содержащей нуклеотидную последовательность, кодирующую любой из Rep78, Rep68, Rep52 или Rep40, с использованием отдельных нуклеотидных последовательностей, функционально связанных с одной последовательностью, контролирующей экспрессию, для экспрессии в упаковывающей клетке, каждая из которых продуцирует только один из белков Rep - Rep78, Rep68, Rep52 или Rep40. В другом варианте осуществления белки Rep могут экспрессироваться с одной ORF, содержащей нуклеотидные последовательности, кодирующие белки Rep - Rep78 и Rep52, функционально связанные с по меньшей мере одной последовательностью контроля экспрессии, для экспрессии в клетке, предназначенной для репликации вируса, каждая из которых продуцирует белки Rep - Rep78 и Rep52.[00177] Rep78 and/or Rep68 bind to unique and known sites in the ITR hairpin sequence and function to disrupt and unwind the hairpin structures at the end of the AAV genome, thereby providing access to the cellular replication machinery for viral replication. As is well known, Rep proteins can be expressed from more than one ORF containing a nucleotide sequence encoding any combination of Rep78, Rep68, Rep52, and/or Rep40, using individual nucleotide sequences operably linked to at least one expression control sequence for expression in a cell destined for viral replication, each of which produces one or more of the Rep proteins Rep78, Rep68, Rep52, and/or Rep40. Alternatively, the Rep proteins can be expressed separately from an ORF comprising a nucleotide sequence encoding any of Rep78, Rep68, Rep52 or Rep40, using separate nucleotide sequences operably linked to a single expression control sequence for expression in a packaging cell, each of which produces only one of the Rep proteins - Rep78, Rep68, Rep52 or Rep40. In another embodiment, the Rep proteins can be expressed from a single ORF comprising nucleotide sequences encoding Rep proteins - Rep78 and Rep52, operably linked to at least one expression control sequence, for expression in a cell intended for viral replication, each of which produces Rep proteins - Rep78 and Rep52.
[00178] В способе получения вириона AAV, например вирусной частицы, по настоящему изобретению последовательность, кодирующая rep, и ген cap по настоящему изобретению могут обеспечиваться в виде одной упаковывающей плазмиды (см., например, фиг.1). Однако квалифицированный специалист поймет, что такое условие не является необходимым. Такие вирусные частицы могут включать геном или не включать его.[00178] In the method for producing an AAV virion, such as a viral particle, of the present invention, the rep coding sequence and the cap gene of the present invention may be provided in the form of a single packaging plasmid (see, for example, Fig. 1). However, one skilled in the art will appreciate that such a condition is not necessary. Such viral particles may or may not include a genome.
[00179] «Химерный капсидный белок AAV» включает капсидный белок AAV, который содержит аминокислотные последовательности, например части, из двух или более различных AAV, и который способен образовывать и/или образует вирусный капсид/вирусную частицу AAV. Химерный капсидный белок AAV кодируется химерным геном капсида AAV, например химерным нуклеотидом, содержащим совокупность, например по меньшей мере две, последовательности нуклеиновой кислоты, при этом каждая из последовательностей совокупности идентична части гена капсида, кодирующего капсидный белок отличного AAV, и данная совокупность совместно кодирует функциональный химерный капсидный белок AAV. Упоминание химерного капсидного белка в связи с конкретным AAV указывает на то, что капсидный белок содержит одну или более частей из капсидного белка данного AAV и одну или более частей из капсидного белка другого AAV. Например, химерный капсидный белок AAV2 включает капсидный белок, содержащий одну или более частей капсидного белка VP1, VP2 и/или VP3 AAV2 и одну или более частей капсидного белка VP1, VP2 и/или VP3 другого AAV.[00179] "A chimeric AAV capsid protein" includes an AAV capsid protein that comprises amino acid sequences, such as portions, from two or more different AAVs and that is capable of forming and/or does form an AAV viral capsid/viral particle. The chimeric AAV capsid protein is encoded by a chimeric AAV capsid gene, such as a chimeric nucleotide comprising a plurality, such as at least two, nucleic acid sequences, wherein each of the sequences of the plurality is identical to a portion of a capsid gene encoding a capsid protein of a different AAV, and the plurality together encodes a functional chimeric AAV capsid protein. Reference to a chimeric capsid protein in connection with a particular AAV indicates that the capsid protein comprises one or more portions from the capsid protein of that AAV and one or more portions from the capsid protein of another AAV. For example, a chimeric AAV2 capsid protein includes a capsid protein comprising one or more portions of the VP1, VP2, and/or VP3 capsid protein of an AAV2 and one or more portions of the VP1, VP2, and/or VP3 capsid protein of another AAV.
[00180] Термин «часть» относится к по меньшей мере 5 аминокислотами или по меньшей мере 15 нуклеотидам, но часть меньше полноразмерной полипептидной молекулы или молекулы нуклеиновой кислоты и характеризуется 100% идентичностью с последовательностью, из которой она получена см. Penzes (2015) J. General Virol. 2769. «Часть» охватывает любой непрерывный сегмент из аминокислот или нуклеотидов, достаточный для определения того, что полипептидная молекула или молекула нуклеиновой кислоты, из которых получена часть, относится к «[указанному] AAV» или характеризуется «значительной идентичностью» с конкретным AAV, например AAV животного, не являющегося приматом, или отдаленного AAV. В некоторых вариантах осуществления часть содержит по меньшей мере 5 аминокислот или 15 нуклеотидов, характеризующихся 100%) идентичностью с последовательностью, ассоциированной с указанным AAV. В некоторых вариантах осуществления часть содержит по меньшей мере 10 аминокислот или 30 нуклеотидов, характеризующихся 100% идентичностью с последовательностью, ассоциированной с указанным AAV. В некоторых вариантах осуществления часть содержит по меньшей мере 15 аминокислот или 45 нуклеотидов, характеризующихся 100% идентичностью с последовательностью, ассоциированной с указанным AAV. В некоторых вариантах осуществления часть содержит по меньшей мере 20 аминокислот или 60 нуклеотидов, характеризующихся 100% идентичностью с последовательностью, ассоциированной с указанным AAV. В некоторых вариантах осуществления часть содержит по меньшей мере 25 аминокислот или 75 нуклеотидов, характеризующихся 100% идентичностью с последовательностью, ассоциированной с указанным AAV. В некоторых вариантах осуществления часть содержит по меньшей мере 30 аминокислот или 90 нуклеотидов, характеризующихся 100% идентичностью с последовательностью, ассоциированной с указанным AAV. В некоторых вариантах осуществления часть содержит по меньшей мере 35 аминокислот или 105 нуклеотидов, характеризующихся 100% идентичностью с последовательностью, ассоциированной с указанным AAV. В некоторых вариантах осуществления часть содержит по меньшей мере 40 аминокислот или 120 нуклеотидов, характеризующихся 100% идентичностью с последовательностью, ассоциированной с указанным AAV. В некоторых вариантах осуществления часть содержит по меньшей мере 45 аминокислот или 135 нуклеотидов, характеризующихся 100% идентичностью с последовательностью, ассоциированной с указанным AAV. В некоторых вариантах осуществления часть содержит по меньшей мере 50 аминокислот или I50 нуклеотидов, характеризующихся 100%о идентичностью с последовательностью, ассоциированной с указанным AAV. В некоторых вариантах осуществления часть содержит по меньшей мере 60 аминокислот или 180 нуклеотидов, характеризующихся 100%о идентичностью с последовательностью, ассоциированной с указанным AAV. В некоторых вариантах осуществления часть содержит по меньшей мере 70 аминокислот или 210 нуклеотидов, характеризующихся 100% идентичностью с последовательностью, ассоциированной с указанным AAV. В некоторых вариантах осуществления часть содержит по меньшей мере 80 аминокислот или 240 нуклеотидов, характеризующихся 100%о идентичностью с последовательностью, ассоциированной с указанным AAV. В некоторых вариантах осуществления часть содержит по меньшей мере 90 аминокислот или 270 нуклеотидов, характеризующихся 100%о идентичностью с последовательностью, ассоциированной с указанным AAV. В некоторых вариантах осуществления часть содержит по меньшей мере 100 аминокислот или 300 нуклеотидов, характеризующихся 100% идентичностью с последовательностью, ассоциированной с указанным AAV.[00180] The term "portion" refers to at least 5 amino acids or at least 15 nucleotides, but the portion is smaller than a full-length polypeptide molecule or nucleic acid molecule and has 100% identity to the sequence from which it is derived, see Penzes (2015) J. General Virol. 2769. "Portion" encompasses any contiguous segment of amino acids or nucleotides sufficient to determine that the polypeptide molecule or nucleic acid molecule from which the portion is derived is "[the] AAV" or has "substantial identity" to a particular AAV, such as a non-primate AAV or a distant AAV. In some embodiments, the portion comprises at least 5 amino acids or 15 nucleotides having 100% identity to a sequence associated with the AAV. In some embodiments, the portion comprises at least 10 amino acids or 30 nucleotides having 100% identity to a sequence associated with said AAV. In some embodiments, the portion comprises at least 15 amino acids or 45 nucleotides having 100% identity to a sequence associated with said AAV. In some embodiments, the portion comprises at least 20 amino acids or 60 nucleotides having 100% identity to a sequence associated with said AAV. In some embodiments, the portion comprises at least 25 amino acids or 75 nucleotides having 100% identity to a sequence associated with said AAV. In some embodiments, the portion comprises at least 30 amino acids or 90 nucleotides having 100% identity to a sequence associated with said AAV. In some embodiments, the portion comprises at least 35 amino acids or 105 nucleotides having 100% identity to a sequence associated with said AAV. In some embodiments, the portion comprises at least 40 amino acids or 120 nucleotides having 100% identity to a sequence associated with said AAV. In some embodiments, the portion comprises at least 45 amino acids or 135 nucleotides having 100% identity to a sequence associated with said AAV. In some embodiments, the portion comprises at least 50 amino acids or 150 nucleotides having 100% identity to a sequence associated with said AAV. In some embodiments, the portion comprises at least 60 amino acids or 180 nucleotides having 100% identity to a sequence associated with said AAV. In some embodiments, the portion comprises at least 70 amino acids or 210 nucleotides having 100% identity to a sequence associated with said AAV. In some embodiments, the portion comprises at least 80 amino acids or 240 nucleotides having 100% identity to a sequence associated with said AAV. In some embodiments, the portion comprises at least 90 amino acids or 270 nucleotides having 100% identity to a sequence associated with said AAV. In some embodiments, the portion comprises at least 100 amino acids or 300 nucleotides having 100% identity to a sequence associated with said AAV.
[00181] Модифицированные вирусные капсидные белки, вирусные частицы, нуклеиновые кислоты[00181] Modified viral capsid proteins, viral particles, nucleic acids
[00182] В некоторых вариантах осуществления белок Сар по настоящему изобретению, например, капсидный белок VP1, описанный в данном документе, капсидный белок VP2, описанный в данном документе, и/или капсидный белок VP3, описанный в данном документе, модифицирован с включением, например, первого партнера из связывающейся пары белок:белок, детектируемой метки, точечной мутации и т.д.[00182] In some embodiments, a Cap protein of the present invention, such as the VP1 capsid protein described herein, the VP2 capsid protein described herein, and/or the VP3 capsid protein described herein, is modified to include, such as a first partner of a protein:protein binding pair, a detectable label, a point mutation, etc.
[00183] Химеризм представляет собой тип модификации, описанной в данном документе. Обычно модификация гена или полипептида указанного AAV или его вариантов приводит к последовательности нуклеиновой кислоты или аминокислотной последовательности, которые отличаются от последовательности нуклеиновой кислоты или аминокислотной последовательности, изложенных в данном документе для указанного AAV, где модификация изменяет, придает или удаляет одну или более биологических функций, но не изменяет филогенетическую характеристику гена или полипептида. Модификация может включать вставку, например, первого партнера из связывающейся пары белок:белок и точечную мутацию, например такую, что естественный тропизм капсидного белка снижен вплоть до устранения, и/или такую, что капсидный белок содержит детектируемую метку. Предпочтительные модификации включают такие, которые не изменяют и предпочтительно уменьшают до низкого уровня или его отсутствия распознавание модифицированного капсида предсуществующими антителами, встречающимися в общей популяции, которые были выработаны в ходе инфицирования другим AAV, например, инфицирования такими серотипами, как AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV13, AAVDJ, Anc80L65, AAV2G9, AAV-LK03, вирионами на основе таких серотипов, вирионами из современных средств генной терапии на основе AAV или их комбинацией. Другие модификации, описанные в данном документе, включают модификацию капсидного белка, так что он содержит первого партнера из связывающейся пары белок:белок, детектируемую метку и т.д., причем данные модификации обычно являются результатом модификаций на генетическом уровне, например, посредством модификации гена cap.[00183] Chimerism is a type of modification described herein. Typically, a modification of a gene or polypeptide of said AAV or variants thereof results in a nucleic acid sequence or amino acid sequence that differs from the nucleic acid sequence or amino acid sequence set forth herein for said AAV, wherein the modification alters, imparts, or removes one or more biological functions, but does not alter the phylogenetic characteristic of the gene or polypeptide. The modification may include an insertion of, for example, a first partner of a protein:protein binding pair, and a point mutation, for example, such that the natural tropism of the capsid protein is reduced to the point of being eliminated, and/or such that the capsid protein contains a detectable label. Preferred modifications include those that do not alter, and preferably reduce to low or no level, recognition of the modified capsid by pre-existing antibodies found in the general population that were developed during infection with another AAV, such as infection with serotypes such as AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV13, AAVDJ, Anc80L65, AAV2G9, AAV-LK03, virions based on such serotypes, virions from current AAV gene therapies, or a combination thereof. Other modifications described herein include modification of the capsid protein so that it contains the first partner of a protein:protein binding pair, a detectable label, etc., wherein these modifications are typically the result of modifications at the genetic level, such as through modification of the cap gene.
[00184] В некоторых вариантах осуществления вирусный капсид, содержащий модифицированный вирусный капсидный белок, описанный в данном документе, представляет собой мозаичный капсид, например, содержит по меньшей мере два набора белков VP1, VP2 и/или VP3, каждый из которых закодирован отличающимся геном cap. Мозаичный капсид в данном документе обычно относится к мозаичной структуре из первого вирусного капсидного белка, модифицированного с включением первого партнера из связывающейся пары белок:белок, и второго соответствующего вирусного капсидного белка без первого партнера из связывающейся пары белок:белок. Что касается мозаичного капсида, второй вирусный капсидный белок без первого партнера из связывающейся пары белок:белок, может называться эталонным капсидным белком, кодируемым эталонным геном cap.В некоторых вариантах осуществления мозаичного капсида, предпочтительно если капсидные белки VP1, VP2 и/или VP3, модифицированные с помощью первого партнера из связывающейся пары белок:белок, не являются химерным капсидным белком, эталонный капсидный белок VP1, VP2 и/или VP3 может содержать аминокислотную последовательность, идентичную последовательности вирусного капсидного белка VP1, VP2 и/или VP3, модифицированного с помощью первого партнера из связывающейся пары белок:белок, за исключением того, что в эталонном капсидном белке отсутствует первый партнер из связывающейся пары белок:белок. В некоторых вариантах осуществления мозаичного капсида эталонный капсидный белок VP1, VP2 и/или VP3 соответствует вирусному капсидному белку VP1, VP2 и/или VP3, модифицированному с помощью первого партнера из связывающейся пары белок:белок, за исключением того, что в эталонном капсидном белке отсутствует первый партнер из связывающейся пары белок:белок. В некоторых вариантах осуществления эталонный капсидный белок VP1 соответствует вирусному капсидному белку VP1, модифицированному с помощью первого партнера из связывающейся пары белок:белок, за исключением того, что в эталонном капсидном белке отсутствует первый партнер из связывающейся пары белок:белок. В некоторых вариантах осуществления эталонный капсидный белок VP2 соответствует вирусному капсидному белку VP2, модифицированному с помощью первого партнера из связывающейся пары белок:белок, за исключением того, что в эталонном капсидном белке отсутствует первый партнер из связывающейся пары белок:белок. В некоторых вариантах осуществления эталонный капсидный белок VP3 соответствует вирусному капсидному белку VP3, модифицированному с помощью первого партнера из связывающейся пары белок:белок, за исключением того, что в эталонном капсидном белке отсутствует первый партнер из связывающейся пары белок:белок. В некоторых вариантах осуществления мозаичного капсида, содержащего химерный капсидный белок VP1, VP2 и/или VP3, дополнительно модифицированного с включением первого партнера из связывающейся пары белок:белок, эталонным белком может быть соответствующий капсидный белок, части которого образуют часть химерного капсидного белка. В качестве неограничивающего примера в некоторых вариантах осуществления мозаичный капсид, содержащий химерный капсидный белок VP1 AAV2/AAAV, модифицированный с включением первого партнера из связывающейся пары белок:белок, может дополнительно содержать в качестве эталонного капсидного белка: капсидный белок VP1 AAV2 без первого партнера, капсидный белок VP1 AAAV без первого партнера, химерный капсидный белок VP1 AAV2/AAAV без первого партнера. Аналогичным образом, в некоторых вариантах осуществления мозаичный капсид, содержащий химерный капсидный белок VP2 AAV2/AAAV, модифицированный с включением первого партнера из связывающейся пары белок:белок, может дополнительно содержать в качестве эталонного капсидного белка: капсидный белок VP2 AAV2 без первого партнера, капсидный белок VP1 AAAV без первого партнера, химерный капсидный белок VP2 AAV2/AAAV без первого партнера. В некоторых вариантах осуществления мозаичный капсид, содержащий химерный капсидный белок VP3 AAV2/AAAV, модифицированный с включением первого партнера из связывающейся пары белок:белок, может дополнительно содержать в качестве эталонного капсидного белка: капсидный белок VP2 AAV2 без первого партнера, капсидный белок VP1 AAAV без первого партнера, химерный капсидный белок VP3 AAV2/AAAV без первого партнера. В некоторых вариантах осуществления мозаичного капсида эталонным капсидным белком может быть любой капсидный белок при условии, что в нем отсутствует первый партнер из связывающейся пары белок:белок и он способен формировать капсид с первым капсидным белком, модифицированным с помощью первого партнера из связывающейся пары белок:белок.[00184] In some embodiments, a viral capsid comprising a modified viral capsid protein described herein is a mosaic capsid, such as comprising at least two sets of VP1, VP2, and/or VP3 proteins, each encoded by a different cap gene. A mosaic capsid as used herein generally refers to a mosaic structure of a first viral capsid protein modified to include a first partner of a protein:protein binding pair, and a second corresponding viral capsid protein without the first partner of the protein:protein binding pair. With respect to the mosaic capsid, the second viral capsid protein without the first partner of the protein:protein binding pair may be called a reference capsid protein encoded by the reference gene cap. In some embodiments of the mosaic capsid, preferably if the capsid proteins VP1, VP2 and/or VP3 modified with the first partner of the protein:protein binding pair are not a chimeric capsid protein, the reference capsid protein VP1, VP2 and/or VP3 may comprise an amino acid sequence identical to the sequence of the viral capsid protein VP1, VP2 and/or VP3 modified with the first partner of the protein:protein binding pair, except that the reference capsid protein lacks the first partner of the protein:protein binding pair. In some embodiments of the mosaic capsid, the reference capsid protein VP1, VP2 and/or VP3 corresponds to the viral capsid protein VP1, VP2 and/or VP3 modified with a first partner of the protein:protein binding pair, except that the reference capsid protein lacks the first partner of the protein:protein binding pair. In some embodiments, the reference capsid protein VP1 corresponds to the viral capsid protein VP1 modified with a first partner of the protein:protein binding pair, except that the reference capsid protein lacks the first partner of the protein:protein binding pair. In some embodiments, the reference capsid protein VP2 corresponds to the viral capsid protein VP2 modified with the first partner of the protein:protein binding pair, except that the reference capsid protein lacks the first partner of the protein:protein binding pair. In some embodiments, the reference capsid protein VP3 corresponds to a viral capsid protein VP3 modified with a first partner of a protein:protein binding pair, except that the reference capsid protein lacks the first partner of the protein:protein binding pair. In some embodiments of a mosaic capsid comprising a chimeric capsid protein VP1, VP2 and/or VP3 further modified to include a first partner of a protein:protein binding pair, the reference protein may be a corresponding capsid protein, portions of which form part of the chimeric capsid protein. As a non-limiting example, in some embodiments, a mosaic capsid comprising a chimeric AAV2/AAAV capsid protein VP1 modified to include a first partner of a protein:protein binding pair can further comprise as a reference capsid protein: an AAV2 capsid protein VP1 without the first partner, an AAAV capsid protein VP1 without the first partner, a chimeric AAV2/AAAV capsid protein VP1 without the first partner. Similarly, in some embodiments, a mosaic capsid comprising a chimeric AAV2/AAAV capsid protein VP2 modified to include a first partner of a protein:protein binding pair can further comprise as a reference capsid protein: an AAV2 capsid protein VP2 without the first partner, an AAAV capsid protein VP1 without the first partner, a chimeric AAV2/AAAV capsid protein VP2 without the first partner. In some embodiments, a mosaic capsid comprising a chimeric AAV2/AAAV capsid protein VP3 modified to include a first partner of a protein:protein binding pair may further comprise as a reference capsid protein: an AAV2 capsid protein VP2 without the first partner, an AAAV capsid protein VP1 without the first partner, a chimeric AAV2/AAAV capsid protein VP3 without the first partner. In some embodiments of the mosaic capsid, the reference capsid protein may be any capsid protein, as long as it lacks the first partner of the protein:protein binding pair and is capable of forming a capsid with a first capsid protein modified with the first partner of the protein:protein binding pair.
[00185] Обычно мозаичные частицы могут быть получены путем трансфекции смесей из модифицированного и эталонного генов Сар в продуцирующие клетки при указанных соотношениях. Соотношения белковых субъединиц, например соотношения модифицированный белок УР:немодифицированный белок VP, в частице могут, но не обязательно, стехиометрически отражать соотношения по меньшей мере двух видов гена cap, кодирующего первый капсидный белок, модифицированный с помощью первого партнера из связывающейся пары белок:белок, и одного или более эталонных генов cap, например, модифицированный ген сар:эталонный(-ые) ген(-ы) cap, трансфицированных в упаковывающие клетки. В некоторых вариантах осуществления соотношения белковых субъединиц в частице не отражает стехиометрически соотношение модифицированный ген сар:эталонный(-ые) ген(-ы) cap, трансфицированных в упаковывающие клетки.[00185] Typically, mosaic particles can be produced by transfecting mixtures of modified and reference Cap genes into producer cells at the specified ratios. The ratios of protein subunits, such as a modified VP protein:unmodified VP protein ratio, in a particle may, but need not, stoichiometrically reflect the ratios of at least two species of a cap gene encoding a first capsid protein modified with a first partner of a protein:protein binding pair and one or more reference cap genes, such as a modified cap gene:reference cap gene(s), transfected into packaging cells. In some embodiments, the ratios of protein subunits in a particle do not stoichiometrically reflect the ratio of a modified cap gene:reference cap gene(s) transfected into packaging cells.
[00186] В некоторых вариантах осуществления мозаичной вирусной частицы соотношение белковых субъединиц находится в диапазоне от приблизительно 1:59 до приблизительно 59:1. В некоторых вариантах осуществления мозаичной вирусной частицы соотношение белковых субъединиц составляет по меньшей мере приблизительно 1:1 (например, мозаичная вирусная частица содержит приблизительно 30 модифицированных капсидных белков и приблизительно 30 эталонных капсидных белков). В некоторых вариантах осуществления мозаичной вирусной частицы соотношение белковых субъединиц составляет по меньшей мере приблизительно 1:2 (например, мозаичная вирусная частица содержит приблизительно 20 модифицированных капсидных белков и приблизительно 40 эталонных капсидных белков). В некоторых вариантах осуществления мозаичной вирусной частицы соотношение белковых субъединиц составляет по меньшей мере приблизительно 3:5. В некоторых вариантах осуществления мозаичной вирусной частицы соотношение белковых субъединиц составляет по меньшей мере приблизительно 1:3 (например, мозаичная вирусная частица содержит приблизительно 15 модифицированных капсидных белков и приблизительно 45 эталонных капсидных белков). В некоторых вариантах осуществления мозаичной вирусной частицы соотношение белковых субъединиц составляет по меньшей мере приблизительно 1:4 (например, мозаичная вирусная частица содержит приблизительно 12 модифицированных капсидных белков и 48 эталонных капсидных белков). В некоторых вариантах осуществления мозаичной вирусной частицы соотношение белковых субъединиц составляет по меньшей мере приблизительно 1:5 (например, мозаичная вирусная частица содержит 10 модифицированных капсидных белков и 50 эталонных капсидных белков). В некоторых вариантах осуществления мозаичной вирусной частицы соотношение белковых субъединиц составляет по меньшей мере приблизительно 1:6. В некоторых вариантах осуществления мозаичной вирусной частицы соотношение белковых субъединиц составляет по меньшей мере приблизительно 1:7. В некоторых вариантах осуществления мозаичной вирусной частицы соотношение белковых субъединиц составляет по меньшей мере приблизительно 1:8. В некоторых вариантах осуществления мозаичной вирусной частицы соотношение белковых субъединиц составляет по меньшей мере приблизительно 1:9 (например, мозаичная вирусная частица содержит приблизительно 6 модифицированных капсидных белков и приблизительно 54 эталонных капсидных белков). В некоторых вариантах осуществления мозаичной вирусной частицы соотношение белковых субъединиц составляет по меньшей мере приблизительно 1:10. В некоторых вариантах осуществления мозаичной вирусной частицы соотношение белковых субъединиц составляет по меньшей мере приблизительно 1:11 (например, мозаичная вирусная частица содержит приблизительно 5 модифицированных капсидных белков и приблизительно 55 эталонных капсидных белков). В некоторых вариантах осуществления мозаичной вирусной частицы соотношение белковых субъединиц составляет по меньшей мере приблизительно 1:12. В некоторых вариантах осуществления мозаичной вирусной частицы соотношение белковых субъединиц составляет по меньшей мере приблизительно 1:13. В некоторых вариантах осуществления мозаичной вирусной частицы соотношение белковых субъединиц составляет по меньшей мере приблизительно 1:14 (например, мозаичная вирусная частица содержит приблизительно 4 модифицированных капсидных белков и приблизительно 56 эталонных капсидных белков). В некоторых вариантах осуществления мозаичной вирусной частицы соотношение белковых субъединиц составляет по меньшей мере приблизительно 1:15. В некоторых вариантах осуществления мозаичной вирусной частицы соотношение белковых субъединиц составляет по меньшей мере приблизительно 1:19 (например, мозаичная вирусная частица содержит приблизительно 3 модифицированных капсидных белков и приблизительно 57 эталонных капсидных белков). В некоторых вариантах осуществления мозаичной вирусной частицы соотношение белковых субъединиц составляет по меньшей мере приблизительно 1:29 (например, мозаичная вирусная частица содержит приблизительно 2 модифицированных капсидных белков и приблизительно 58 эталонных капсидных белков). В некоторых вариантах осуществления мозаичной вирусной частицы соотношение белковых субъединиц составляет по меньшей мере приблизительно 1:59. В некоторых вариантах осуществления мозаичной вирусной частицы соотношение белковых субъединиц составляет по меньшей мере приблизительно 2:1 (например, мозаичная вирусная частица содержит приблизительно 40 модифицированных капсидных белков и приблизительно 20 эталонных капсидных белков). В некоторых вариантах осуществления мозаичной вирусной частицы соотношение белковых субъединиц составляет по меньшей мере приблизительно 5:3. В некоторых вариантах осуществления мозаичной вирусной частицы соотношение белковых субъединиц составляет по меньшей мере приблизительно 3:1 (например, мозаичная вирусная частица содержит приблизительно 45 модифицированных капсидных белков и приблизительно 15 эталонных капсидных белков). В некоторых вариантах осуществления мозаичной вирусной частицы соотношение белковых субъединиц составляет по меньшей мере приблизительно 4:1 (например, мозаичная вирусная частица содержит приблизительно 48 модифицированных капсидных белков и 12 эталонных капсидных белков). В некоторых вариантах осуществления мозаичной вирусной частицы соотношение белковых субъединиц составляет по меньшей мере приблизительно 5:1 (например, мозаичная вирусная частица содержит 50 модифицированных капсидных белков и 10 эталонных капсидных белков). В некоторых вариантах осуществления мозаичной вирусной частицы соотношение белковых субъединиц составляет по меньшей мере приблизительно 6:1. В некоторых вариантах осуществления мозаичной вирусной частицы соотношение белковых субъединиц составляет по меньшей мере приблизительно 7:1. В некоторых вариантах осуществления мозаичной вирусной частицы соотношение белковых субъединиц составляет по меньшей мере приблизительно 8:1. В некоторых вариантах осуществления мозаичной вирусной частицы соотношение белковых субъединиц составляет по меньшей мере приблизительно 9:1 (например, мозаичная вирусная частица содержит приблизительно 54 модифицированных капсидных белков и приблизительно 6 эталонных капсидных белков). В некоторых вариантах осуществления мозаичной вирусной частицы соотношение белковых субъединиц составляет по меньшей мере приблизительно 10:1. В некоторых вариантах осуществления мозаичной вирусной частицы соотношение белковых субъединиц составляет по меньшей мере приблизительно 11:1 (например, мозаичная вирусная частица содержит приблизительно 55 модифицированных капсидных белков и приблизительно 5 эталонных капсидных белков). В некоторых вариантах осуществления мозаичной вирусной частицы соотношение белковых субъединиц составляет по меньшей мере приблизительно 12:1. В некоторых вариантах осуществления мозаичной вирусной частицы соотношение белковых субъединиц составляет по меньшей мере приблизительно 13:1. В некоторых вариантах осуществления мозаичной вирусной частицы соотношение белковых субъединиц составляет по меньшей мере приблизительно 14:1 (например, мозаичная вирусная частица содержит приблизительно 56 модифицированных капсидных белков и приблизительно 4 эталонных капсидных белков). В некоторых вариантах осуществления мозаичной вирусной частицы соотношение белковых субъединиц составляет по меньшей мере приблизительно 15:1. В некоторых вариантах осуществления мозаичной вирусной частицы соотношение белковых субъединиц составляет по меньшей мере приблизительно 19:1 (например, мозаичная вирусная частица содержит приблизительно 57 модифицированных капсидных белков и приблизительно 3 эталонных капсидных белков). В некоторых вариантах осуществления мозаичной вирусной частицы соотношение белковых субъединиц составляет по меньшей мере приблизительно 29:1 (например, мозаичная вирусная частица содержит приблизительно 58 модифицированных капсидных белков и приблизительно 2 эталонных капсидных белков). В некоторых вариантах осуществления мозаичной вирусной частицы соотношение белковых субъединиц составляет по меньшей мере приблизительно 59:1.[00186] In some embodiments of the mosaic virus particle, the ratio of protein subunits is in the range of about 1:59 to about 59:1. In some embodiments of the mosaic virus particle, the ratio of protein subunits is at least about 1:1 (e.g., the mosaic virus particle comprises about 30 modified capsid proteins and about 30 reference capsid proteins). In some embodiments of the mosaic virus particle, the ratio of protein subunits is at least about 1:2 (e.g., the mosaic virus particle comprises about 20 modified capsid proteins and about 40 reference capsid proteins). In some embodiments of the mosaic virus particle, the ratio of protein subunits is at least about 3:5. In some embodiments of the mosaic virus particle, the ratio of protein subunits is at least about 1:3 (e.g., the mosaic virus particle comprises about 15 modified capsid proteins and about 45 reference capsid proteins). In some embodiments of the mosaic virus particle, the ratio of protein subunits is at least about 1:4 (e.g., the mosaic virus particle comprises about 12 modified capsid proteins and 48 reference capsid proteins). In some embodiments of the mosaic virus particle, the ratio of protein subunits is at least about 1:5 (e.g., the mosaic virus particle comprises 10 modified capsid proteins and 50 reference capsid proteins). In some embodiments of the mosaic virus particle, the ratio of protein subunits is at least about 1:6. In some embodiments of the mosaic virus particle, the ratio of protein subunits is at least about 1:7. In some embodiments of the mosaic virus particle, the ratio of protein subunits is at least about 1:8. In some embodiments of the mosaic virus particle, the ratio of protein subunits is at least about 1:9 (e.g., the mosaic virus particle comprises about 6 modified capsid proteins and about 54 reference capsid proteins). In some embodiments of the mosaic virus particle, the ratio of protein subunits is at least about 1:10. In some embodiments of the mosaic virus particle, the ratio of protein subunits is at least about 1:11 (e.g., the mosaic virus particle comprises about 5 modified capsid proteins and about 55 reference capsid proteins). In some embodiments of the mosaic virus particle, the ratio of protein subunits is at least about 1:12. In some embodiments of the mosaic virus particle, the ratio of protein subunits is at least about 1:13. In some embodiments of the mosaic virus particle, the ratio of protein subunits is at least about 1:14 (e.g., the mosaic virus particle comprises about 4 modified capsid proteins and about 56 reference capsid proteins). In some embodiments of the mosaic virus particle, the ratio of protein subunits is at least about 1:15. In some embodiments of the mosaic virus particle, the ratio of protein subunits is at least about 1:19 (e.g., the mosaic virus particle comprises about 3 modified capsid proteins and about 57 reference capsid proteins). In some embodiments of the mosaic virus particle, the ratio of protein subunits is at least about 1:29 (e.g., the mosaic virus particle comprises about 2 modified capsid proteins and about 58 reference capsid proteins). In some embodiments of the mosaic virus particle, the ratio of protein subunits is at least about 1:59. In some embodiments of the mosaic virus particle, the ratio of protein subunits is at least about 2:1 (e.g., the mosaic virus particle comprises about 40 modified capsid proteins and about 20 reference capsid proteins). In some embodiments of the mosaic virus particle, the ratio of protein subunits is at least about 5:3. In some embodiments of the mosaic virus particle, the ratio of protein subunits is at least about 3:1 (e.g., the mosaic virus particle comprises about 45 modified capsid proteins and about 15 reference capsid proteins). In some embodiments of the mosaic virus particle, the ratio of protein subunits is at least about 4:1 (e.g., the mosaic virus particle comprises about 48 modified capsid proteins and 12 reference capsid proteins). In some embodiments of the mosaic virus particle, the ratio of protein subunits is at least about 5:1 (e.g., the mosaic virus particle comprises 50 modified capsid proteins and 10 reference capsid proteins). In some embodiments of the mosaic virus particle, the ratio of protein subunits is at least about 6:1. In some embodiments of the mosaic virus particle, the ratio of protein subunits is at least about 7:1. In some embodiments of the mosaic virus particle, the ratio of protein subunits is at least about 8:1. In some embodiments of the mosaic virus particle, the ratio of protein subunits is at least about 9:1 (e.g., the mosaic virus particle comprises about 54 modified capsid proteins and about 6 reference capsid proteins). In some embodiments of the mosaic virus particle, the ratio of protein subunits is at least about 10:1. In some embodiments of the mosaic virus particle, the protein subunit ratio is at least about 11:1 (e.g., the mosaic virus particle comprises about 55 modified capsid proteins and about 5 reference capsid proteins). In some embodiments of the mosaic virus particle, the protein subunit ratio is at least about 12:1. In some embodiments of the mosaic virus particle, the protein subunit ratio is at least about 13:1. In some embodiments of the mosaic virus particle, the protein subunit ratio is at least about 14:1 (e.g., the mosaic virus particle comprises about 56 modified capsid proteins and about 4 reference capsid proteins). In some embodiments of the mosaic virus particle, the protein subunit ratio is at least about 15:1. In some embodiments of the mosaic virus particle, the protein subunit ratio is at least about 19:1 (e.g., the mosaic virus particle comprises about 57 modified capsid proteins and about 3 reference capsid proteins). In some embodiments of the mosaic virus particle, the protein subunit ratio is at least about 29:1 (e.g., the mosaic virus particle comprises about 58 modified capsid proteins and about 2 reference capsid proteins). In some embodiments of the mosaic virus particle, the protein subunit ratio is at least about 59:1.
[00187] В некоторых вариантах осуществления немозаичной вирусной частицы соотношение белковых субъединиц может составлять 1:0, при этом каждый капсидный белок немозаичной вирусной частицы является модифицированным с помощью первого партнера из связывающейся пары белок:белок. В некоторых вариантах осуществления немозаичной вирусной частицы соотношение белковых субъединиц может составлять 0:1, при этом каждый капсидный белок немозаичной вирусной частицы не является модифицированным с помощью первого партнера из связывающейся пары белок:белок.[00187] In some embodiments of a non-mosaic viral particle, the ratio of protein subunits may be 1:0, wherein each capsid protein of the non-mosaic viral particle is modified by the first partner of the protein:protein binding pair. In some embodiments of a non-mosaic viral particle, the ratio of protein subunits may be 0:1, wherein each capsid protein of the non-mosaic viral particle is not modified by the first partner of the protein:protein binding pair.
[00188] В некоторых вариантах осуществления капсидный белок по настоящему изобретению модифицирован с включением детектируемой метки. Многие детектируемые метки известны в данной области техники (см., например: Nilsson et al. (1997) «Affinity fusion strategies for detection, purification, and immobilization of modified proteins» Protein Expression and Purification 11: 1-16, Terpe et al. (2003) «Overview of tag protein fusions: From molecular and biochemical fundamentals to commercial systems» Applied Microbiology and Biotechnology 60:523 533, и ссылки в них). Детектируемые метки включают без ограничения полигистидиновую детектируемую метку (например, His-6, His-8 или His-10), которая связывает иммобилизованные двухвалентные катионы (например, Ni2+), биотиновый фрагмент (например, на биотинилированной in vivo полипептидной последовательности), который связывает иммобилизованный авидин, последовательность GST (глутатион-S-трансфераза), которая связывает иммобилизованный глутатион, S-метку, которая связывает иммобилизованный S-белок, антиген, который связывает иммобилизованное антитело или его домен или фрагмент (включая, например, Т7-, myc-, FLAG- и В-метки, которые связывают соответствующие антитела), FLASH-метку (метку с отличными детектируемыми свойствами, которая связывается со специфическими фрагментами на основе мышьяка), рецептор или рецепторный домен, который связывает иммобилизованный лиганд (или наоборот), белок А или его производное (например, Z), который связывает иммобилизованный IgG, мальтозосвязывающий белок (МВР), который связывает иммобилизованную амилозу, альбуминсвязывающий белок, который связывает иммобилизованный альбумин, хитинсвязывающий домен, который связывает иммобилизованный хитин, кальмодулинсвязывающий пептид, который связывает иммобилизованный кальмодулин, и целлюлозосвязывающий домен, который связывает иммобилизованную целлюлозу. Другой иллюстративной детектируемой меткой является SNAP-метка, коммерчески доступная от Covalys (www.covalys.com). В некоторых вариантах осуществления детектируемая метка, раскрытая в данном документе, включает детектируемую метку, распознаваемую только паратопом антитела. В некоторых вариантах осуществления детектируемая метка, раскрытая в данном документе, включает детектируемую метку, распознаваемую паратопом антитела и другими специфическими связывающимися парами.[00188] In some embodiments, the capsid protein of the present invention is modified to include a detectable label. Many detectable labels are known in the art (see, for example: Nilsson et al. (1997) "Affinity fusion strategies for detection, purification, and immobilization of modified proteins" Protein Expression and Purification 11: 1-16, Terpe et al. (2003) "Overview of tag protein fusions: From molecular and biochemical fundamentals to commercial systems" Applied Microbiology and Biotechnology 60:523 533, and references therein). Detectable labels include, but are not limited to, a polyhistidine detectable label (e.g., His-6, His-8, or His-10) that binds immobilized divalent cations (e.g., Ni2 + ), a biotin moiety (e.g., on a biotinylated in vivo polypeptide sequence) that binds immobilized avidin, a GST (glutathione S-transferase) sequence that binds immobilized glutathione, an S-tag that binds immobilized S-protein, an antigen that binds an immobilized antibody or domain or fragment thereof (including, for example, T7, myc, FLAG, and B-tags that bind the corresponding antibodies), a FLASH-tag (a label with excellent detectable properties that binds to specific arsenic-based moieties), a receptor or receptor domain that binds an immobilized ligand (or vice versa), protein A or a derivative thereof (e.g., Z) that binds immobilized IgG, maltose binding protein (MBP) that binds immobilized amylose, albumin binding protein that binds immobilized albumin, a chitin binding domain that binds immobilized chitin, a calmodulin binding peptide that binds immobilized calmodulin, and a cellulose binding domain that binds immobilized cellulose. Another exemplary detectable label is a SNAP label commercially available from Covalys (www.covalys.com). In some embodiments, a detectable label disclosed herein includes a detectable label recognized only by a paratope of an antibody. In some embodiments, a detectable label disclosed herein includes a detectable label recognized by a paratope of an antibody and other specific binding pairs.
[00189] В некоторых вариантах осуществления детектируемая метка образует связывающуюся пару с константным доменом иммуноглобулина. В некоторых вариантах осуществления детектируемая метка и/или детектируемая метка образует связывающуюся пару с ионом металла, например Ni2+, Со2+, Cu2+, Zn2+, Fe3+ и т.д. В некоторых вариантах осуществления детектируемая метка выбрана из группы, состоящей из стрептавидина, Strep II, НА, L14, 4C-RGD, LH и белка А.[00189] In some embodiments, the detectable label forms a binding pair with an immunoglobulin constant domain. In some embodiments, the detectable label and/or the detectable label forms a binding pair with a metal ion, such as Ni2 + , Co2 + , Cu2 + , Zn2 + , Fe3 + , etc. In some embodiments, the detectable label is selected from the group consisting of streptavidin, Strep II, HA, L14, 4C-RGD, LH, and protein A.
[00190] В некоторых вариантах осуществления детектируемая метка выбрана из группы, состоящей из FLAG, НА и c-myc (EQKLISEEDL; SEQ ID NO:44). В некоторых вариантах осуществления детектируемая метка представляет собой с-myc (SEQ ID NO:44).[00190] In some embodiments, the detectable label is selected from the group consisting of FLAG, HA, and c-myc (EQKLISEEDL; SEQ ID NO:44). In some embodiments, the detectable label is c-myc (SEQ ID NO:44).
[00191] В некоторых вариантах осуществления детектируемая метка представляет собой В-клеточный эпитоп, например, длина которого составляет от приблизительно 1 аминокислоты до приблизительно 35 аминокислот и который образует связывающуюся пару с паратопом антитела, например вариабельным доменом иммуноглобулина. В некоторых вариантах осуществления детектируемая метка предусматривает эпитоп Bl (SEQ ID NO:45). В некоторых вариантах осуществления капсидный белок модифицирован с включением эпитопа В1 в область VP3.[00191] In some embodiments, the detectable label is a B cell epitope, e.g., from about 1 amino acid to about 35 amino acids in length, that forms a binding pair with an antibody paratope, e.g., an immunoglobulin variable domain. In some embodiments, the detectable label comprises a B1 epitope (SEQ ID NO:45). In some embodiments, the capsid protein is modified to include a B1 epitope in the VP3 region.
[00192] В некоторых вариантах осуществления капсидный белок по настоящему изобретению содержит по меньшей мере первого партнера из связывающейся пары белок:белок.[00192] In some embodiments, a capsid protein of the present invention comprises at least a first partner of a protein:protein binding pair.
[00193] В некоторых вариантах осуществления капсидный белок по настоящему изобретению содержит первого партнера из связывающейся пары белок:белок, содержащего детектируемую метку, которую также можно использовать для обнаружения и/или выделения белка Сар и/или в качестве первого партнера из связывающейся пары белок:белок. В некоторых вариантах осуществления детектируемая метка выступает в качестве первого партнера из связывающейся пары белок:белок для связывания нацеливающего лиганда, содержащего полиспецифический связывающий белок, который может связывать как детектируемую метку, так и мишень, экспрессируемую представляющей интерес клеткой. В некоторых вариантах осуществления белок Сар по настоящему изобретению содержит первого партнера из связывающейся пары белок:белок, содержащего c-myc (SEQ ID NO:44). Применение детектируемой метки в качестве первого партнера из связывающейся пары белок:белок описано, например, в WO 2019006043, включенной в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте.[00193] In some embodiments, the capsid protein of the present invention comprises a first partner of a protein:protein binding pair comprising a detectable label that can also be used to detect and/or isolate the Cap protein and/or as the first partner of a protein:protein binding pair. In some embodiments, the detectable label serves as the first partner of a protein:protein binding pair for binding a targeting ligand comprising a multispecific binding protein that can bind both the detectable label and a target expressed by a cell of interest. In some embodiments, the Cap protein of the present invention comprises a first partner of a protein:protein binding pair comprising c-myc (SEQ ID NO:44). The use of a detectable label as the first partner of a protein:protein binding pair is described, for example, in WO2019006043, incorporated herein by reference in its entirety.
[00194] В некоторых вариантах осуществления капсидный белок содержит первого партнера из связывающейся пары белок:белок, где связывающаяся пара белок:белок образует ковалентную изопептидную связь. В некоторых вариантах осуществления первый партнер из связывающейся пары белок:белок ковалентно связан посредством изопептидной связи с когнатным вторым партнером из связывающейся пары белок:белок, и где необязательно когнатный второй партнер из связывающейся пары белок:белок слит с нацеливающим лиганд ом, при этом нацеливающий лиганд связывает мишень, экспрессируемую представляющей интерес клеткой. В некоторых вариантах осуществления связывающаяся пара белок:белок может быть выбрана из группы, состоящей из SpyTag: SpyCatcher, SpyTag002:SpyCatcher002, SpyTag:KTag, Isopeptag:nmiHH-C и SnoopTag:SnoopCatcher. В некоторых вариантах осуществления, где первый партнер представляет собой SpyTag (или его биологически активную часть), белок (второй когнатный партнер) представляет собой SpyCatcher (или его биологически активную часть). В некоторых вариантах осуществления, где первый партнер представляет собой SpyTag (или его биологически активную часть), белок (второй когнатный партнер) представляет собой KTag (или его биологически активную часть). В некоторых вариантах осуществления, где первый партнер представляет собой KTag (или его биологически активную часть), белок (второй когнатный партнер) представляет собой SpyTag (или его биологически активную часть). В некоторых вариантах осуществления, где первый партнер представляет собой SnoopTag (или его биологически активную часть), белок (второй когнатный партнер) представляет собой SnoopCatcher (или его биологически активную часть). В некоторых вариантах осуществления, где первый партнер представляет собой Isopeptag (или его биологически активную часть), белок (второй когнатный партнер) представляет собой пилин-С (или его биологически активную часть). В некоторых вариантах осуществления, где первый партнер представляет собой SpyTag002 (или его биологически активную часть), белок (второй когнатный партнер) представляет собой SpyCatcher002 (или его биологически активную часть). В некоторых вариантах осуществления белок Сар по настоящему изобретению содержит SpyTag. Применение первого партнера из связывающейся пары белок:белок описано в WO 2019006046, включенной в данный документ во всей своей полноте.[00194] In some embodiments, the capsid protein comprises a first partner of a protein:protein binding pair, wherein the protein:protein binding pair forms a covalent isopeptide bond. In some embodiments, the first partner of the protein:protein binding pair is covalently linked via an isopeptide bond to a cognate second partner of the protein:protein binding pair, and wherein, optionally, the cognate second partner of the protein:protein binding pair is fused to a targeting ligand, wherein the targeting ligand binds a target expressed by a cell of interest. In some embodiments, the protein:protein binding pair can be selected from the group consisting of SpyTag: SpyCatcher, SpyTag002:SpyCatcher002, SpyTag:KTag, Isopeptag:nmiHH-C, and SnoopTag:SnoopCatcher. In some embodiments, wherein the first partner is SpyTag (or a biologically active portion thereof), the protein (second cognate partner) is SpyCatcher (or a biologically active portion thereof). In some embodiments, wherein the first partner is SpyTag (or a biologically active portion thereof), the protein (second cognate partner) is KTag (or a biologically active portion thereof). In some embodiments, wherein the first partner is KTag (or a biologically active portion thereof), the protein (second cognate partner) is SpyTag (or a biologically active portion thereof). In some embodiments, wherein the first partner is SnoopTag (or a biologically active portion thereof), the protein (second cognate partner) is SnoopCatcher (or a biologically active portion thereof). In some embodiments, wherein the first partner is Isopeptag (or a biologically active portion thereof), the protein (second cognate partner) is pilin-C (or a biologically active portion thereof). In some embodiments, where the first partner is SpyTag002 (or a biologically active portion thereof), the protein (second cognate partner) is SpyCatcher002 (or a biologically active portion thereof). In some embodiments, the Cap protein of the present invention comprises SpyTag. The use of the first partner of a protein:protein binding pair is described in WO2019006046, incorporated herein in its entirety.
[00195] В некоторых вариантах осуществления первый партнер из связывающейся пары белок:белок и/или детектируемая метка функционально связаны (транслируются в рамке считывания с ним, химически присоединены к нему и/или проявляются помощью него) с белком Сар по настоящему изобретению посредством первого или второго линкера, например аминокислотного спейсера, длина которого составляет по меньшей мере одну аминокислоту. В некоторых вариантах осуществления первый партнер из связывающейся пары белок:белок фланкирован первым и/или вторым линкером, например, первым и/или вторым аминокислотным спейсером, длина каждого из которых составляет по меньшей мере одну аминокислоту.[00195] In some embodiments, the first partner of the protein:protein binding pair and/or the detectable label are operably linked (translated in frame with it, chemically attached to it, and/or displayed by it) to the Cap protein of the present invention via a first or second linker, such as an amino acid spacer, that is at least one amino acid in length. In some embodiments, the first partner of the protein:protein binding pair is flanked by a first and/or second linker, such as a first and/or second amino acid spacer, each of which is at least one amino acid in length.
[00196] В некоторых вариантах осуществления первый и/или второй линкеры не являются идентичными. В некоторых вариантах осуществления длина каждого из первого и/или второго линкера независимо составляет одну или две аминокислоты. В некоторых вариантах осуществления длина каждого из первого и/или второго линкера независимо составляет одну, две или три аминокислоты. В некоторых вариантах осуществления длина каждого из первого и/или второго линкера независимо составляет одну, две, три или четыре аминокислоты. В некоторых вариантах осуществления длина каждого из первого и/или второго линкера независимо составляет одну, две, три, четыре или пять аминокислот. В некоторых вариантах осуществления длина каждого из первого и/или второго линкера независимо составляет одну, две, три, четыре или пять аминокислот. В некоторых вариантах осуществления длина каждого из первого и/или второго линкера независимо составляет одну, две, три, четыре, пять или шесть аминокислот. В некоторых вариантах осуществления длина каждого из первого и/или второго линкера независимо составляет одну, две, три, четыре, пять, шесть или семь аминокислот. В некоторых вариантах осуществления длина каждого из первого и/или второго линкера независимо составляет одну, две, три, четыре, пять, шесть, семь или восемь аминокислот. В некоторых вариантах осуществления длина каждого из первого и/или второго линкера независимо составляет одну, две, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь или девять аминокислот. В некоторых вариантах осуществления длина каждого из первого и/или второго линкера независимо составляет одну, две, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять или десять аминокислот. В некоторых вариантах осуществления длина каждого из первого и/или второго линкера независимо составляет одну, две, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, десять или больше аминокислот.[00196] In some embodiments, the first and/or second linkers are not identical. In some embodiments, each of the first and/or second linkers is independently one or two amino acids in length. In some embodiments, each of the first and/or second linkers is independently one, two, or three amino acids in length. In some embodiments, each of the first and/or second linkers is independently one, two, three, or four amino acids in length. In some embodiments, each of the first and/or second linkers is independently one, two, three, four, or five amino acids in length. In some embodiments, each of the first and/or second linkers is independently one, two, three, four, or five amino acids in length. In some embodiments, each of the first and/or second linkers is independently one, two, three, four, or five amino acids in length. In some embodiments, each of the first and/or second linkers is independently one, two, three, four, five, or six amino acids in length. In some embodiments, each of the first and/or second linkers is independently one, two, three, four, five, six, or seven amino acids in length. In some embodiments, the length of each of the first and/or second linker is independently one, two, three, four, five, six, seven, or eight amino acids. In some embodiments, the length of each of the first and/or second linker is independently one, two, three, four, five, six, seven, eight, or nine amino acids. In some embodiments, the length of each of the first and/or second linker is independently one, two, three, four, five, six, seven, eight, nine, or ten amino acids. In some embodiments, the length of each of the first and/or second linker is independently one, two, three, four, five, six, seven, eight, nine, ten or more amino acids.
[00197] В некоторых вариантах осуществления первый и второй линкеры являются идентичными по последовательности и/или длине, и длина каждого составляет одну аминокислоту. В некоторых вариантах осуществления первый и второй линкеры являются идентичными по длине, и длина каждого составляет одну аминокислоту. В некоторых вариантах осуществления первый и второй линкеры являются идентичными по длине, и длина каждого составляет две аминокислоты. В некоторых вариантах осуществления первый и второй линкеры являются идентичными по длине, и длина каждого составляет три аминокислоты. В некоторых вариантах осуществления первый и второй линкеры являются идентичными по длине, и длина каждого составляет четыре аминокислоты, например, линкер представляет собой GLSG (SEQ ID NO:37). В некоторых вариантах осуществления первый и второй линкеры являются идентичными по длине, и длина каждого составляет пять аминокислот. В некоторых вариантах осуществления первый и второй линкеры идентичны по длине, и длина каждого составляет шесть аминокислот, например, каждый из первого и второго линкеров содержит последовательность GLSGSG (SEQ ID NO:38). В некоторых вариантах осуществления первый и второй линкеры являются идентичными по длине, и длина каждого составляет семь аминокислот. В некоторых вариантах осуществления первый и второй линкеры идентичны по длине, и длина каждого составляет восемь аминокислот, например, каждый из первого и второго линкеров содержит последовательность GLSGLSGS (SEQ ID NO:39). В некоторых вариантах осуществления первый и второй линкеры являются идентичными по длине, и длина каждого составляет девять аминокислот.В некоторых вариантах осуществления первый и второй линкеры идентичны по длине, и длина каждого составляет десять аминокислот, например, каждый из первого и второго линкеров содержит последовательность GLSGLSGLSG (SEQ ID NO:40) или GLSGGSGLSG (SEQ ID NO:41). В некоторых вариантах осуществления первый и второй линкеры являются идентичными по длине, и длина каждого составляет более десяти аминокислот.[00197] In some embodiments, the first and second linkers are identical in sequence and/or length, and each is one amino acid in length. In some embodiments, the first and second linkers are identical in length, and each is one amino acid in length. In some embodiments, the first and second linkers are identical in length, and each is two amino acids in length. In some embodiments, the first and second linkers are identical in length, and each is three amino acids in length. In some embodiments, the first and second linkers are identical in length, and each is four amino acids in length, for example, the linker is GLSG (SEQ ID NO:37). In some embodiments, the first and second linkers are identical in length, and each is five amino acids in length. In some embodiments, the first and second linkers are identical in length, and each is six amino acids in length, for example, the first and second linkers each comprise the sequence GLSGSG (SEQ ID NO:38). In some embodiments, the first and second linkers are identical in length, and each is seven amino acids in length. In some embodiments, the first and second linkers are identical in length, and each is eight amino acids in length, such as each of the first and second linkers comprises the sequence GLSGLSGS (SEQ ID NO:39). In some embodiments, the first and second linkers are identical in length, and each is nine amino acids in length. In some embodiments, the first and second linkers are identical in length, and each is ten amino acids in length, such as each of the first and second linkers comprises the sequence GLSGLSGLSG (SEQ ID NO:40) or GLSGGSGLSG (SEQ ID NO:41). In some embodiments, the first and second linkers are identical in length, and each is more than ten amino acids in length.
[00198] Как правило, длина аминокислотной последовательности первого партнера из связывающейся пары белок:белок, описанной в настоящем документе, например, содержащей первого партнера из специфической связывающейся пары самого по себе или в комбинации с одним или более линкерами, составляет от приблизительно 5 до приблизительно 50 аминокислот. В некоторых вариантах осуществления длина аминокислотной последовательности первого партнера из связывающейся пары белок:белок составляет по меньшей мере 5 аминокислот. В некоторых вариантах осуществления длина аминокислотной последовательности первого партнера из связывающейся пары белок:белок составляет 6 аминокислот.В некоторых вариантах осуществления длина аминокислотной последовательности первого партнера из связывающейся пары белок:белок составляет 7 аминокислот. В некоторых вариантах осуществления длина аминокислотной последовательности первого партнера из связывающейся пары белок:белок составляет 8 аминокислот. В некоторых вариантах осуществления длина аминокислотной последовательности первого партнера из связывающейся пары белок:белок составляет 9 аминокислот. В некоторых вариантах осуществления длина аминокислотной последовательности первого партнера из связывающейся пары белок:белок составляет 10 аминокислот. В некоторых вариантах осуществления длина аминокислотной последовательности первого партнера из связывающейся пары белок:белок составляет 11 аминокислот. В некоторых вариантах осуществления длина аминокислотной последовательности первого партнера из связывающейся пары белок:белок составляет 12 аминокислот. В некоторых вариантах осуществления длина аминокислотной последовательности первого партнера из связывающейся пары белок:белок составляет 13 аминокислот. В некоторых вариантах осуществления длина аминокислотной последовательности первого партнера из связывающейся пары белок:белок составляет I4 аминокислот. В некоторых вариантах осуществления длина аминокислотной последовательности первого партнера из связывающейся пары белок:белок составляет I5 аминокислот. В некоторых вариантах осуществления длина аминокислотной последовательности первого партнера из связывающейся пары белок:белок составляет 16 аминокислот. В некоторых вариантах осуществления длина аминокислотной последовательности первого партнера из связывающейся пары белок:белок составляет 17 аминокислот. В некоторых вариантах осуществления длина аминокислотной последовательности первого партнера из связывающейся пары белок:белок составляет 18 аминокислот. В некоторых вариантах осуществления длина аминокислотной последовательности первого партнера из связывающейся пары белок:белок составляет 19 аминокислот. В некоторых вариантах осуществления длина аминокислотной последовательности первого партнера из связывающейся пары белок:белок составляет 20 аминокислот. В некоторых вариантах осуществления длина аминокислотной последовательности первого партнера из связывающейся пары белок:белок составляет 21 аминокислот. В некоторых вариантах осуществления длина аминокислотной последовательности первого партнера из связывающейся пары белок:белок составляет 22 аминокислот. В некоторых вариантах осуществления длина аминокислотной последовательности первого партнера из связывающейся пары белок:белок составляет 23 аминокислот. В некоторых вариантах осуществления длина аминокислотной последовательности первого партнера из связывающейся пары белок:белок составляет 24 аминокислот. В некоторых вариантах осуществления длина аминокислотной последовательности первого партнера из связывающейся пары белок:белок составляет 25 аминокислот. В некоторых вариантах осуществления длина аминокислотной последовательности первого партнера из связывающейся пары белок:белок составляет 26 аминокислот. В некоторых вариантах осуществления длина аминокислотной последовательности первого партнера из связывающейся пары белок:белок составляет 27 аминокислот. В некоторых вариантах осуществления длина аминокислотной последовательности первого партнера из связывающейся пары белок:белок составляет 28 аминокислот. В некоторых вариантах осуществления длина аминокислотной последовательности первого партнера из связывающейся пары белок:белок составляет 29 аминокислот. В некоторых вариантах осуществления длина аминокислотной последовательности первого партнера из связывающейся пары белок:белок составляет 30 аминокислот. В некоторых вариантах осуществления длина аминокислотной последовательности первого партнера из связывающейся пары белок:белок составляет 31 аминокислот. В некоторых вариантах осуществления длина аминокислотной последовательности первого партнера из связывающейся пары белок:белок составляет 32 аминокислот. В некоторых вариантах осуществления длина аминокислотной последовательности первого партнера из связывающейся пары белок:белок составляет 33 аминокислот. В некоторых вариантах осуществления длина аминокислотной последовательности первого партнера из связывающейся пары белок:белок составляет 34 аминокислот. В некоторых вариантах осуществления длина аминокислотной последовательности первого партнера из связывающейся пары белок:белок составляет 35 аминокислот. В некоторых вариантах осуществления длина аминокислотной последовательности первого партнера из связывающейся пары белок:белок составляет 36 аминокислот. В некоторых вариантах осуществления длина аминокислотной последовательности первого партнера из связывающейся пары белок:белок составляет 37 аминокислот. В некоторых вариантах осуществления длина аминокислотной последовательности первого партнера из связывающейся пары белок:белок составляет 38 аминокислот. В некоторых вариантах осуществления длина аминокислотной последовательности первого партнера из связывающейся пары белок:белок составляет 39 аминокислот. В некоторых вариантах осуществления длина аминокислотной последовательности первого партнера из связывающейся пары белок:белок составляет 40 аминокислот. В некоторых вариантах осуществления длина аминокислотной последовательности первого партнера из связывающейся пары белок:белок составляет 41 аминокислот. В некоторых вариантах осуществления длина аминокислотной последовательности первого партнера из связывающейся пары белок:белок составляет 42 аминокислот. В некоторых вариантах осуществления длина аминокислотной последовательности первого партнера из связывающейся пары белок:белок составляет 43 аминокислот. В некоторых вариантах осуществления длина аминокислотной последовательности первого партнера из связывающейся пары белок:белок составляет 44 аминокислот. В некоторых вариантах осуществления длина аминокислотной последовательности первого партнера из связывающейся пары белок:белок составляет 45 аминокислот.В некоторых вариантах осуществления длина аминокислотной последовательности первого партнера из связывающейся пары белок:белок составляет 46 аминокислот. В некоторых вариантах осуществления длина аминокислотной последовательности первого партнера из связывающейся пары белок:белок составляет 47 аминокислот. В некоторых вариантах осуществления длина аминокислотной последовательности первого партнера из связывающейся пары белок:белок составляет 48 аминокислот. В некоторых вариантах осуществления длина аминокислотной последовательности первого партнера из связывающейся пары белок:белок составляет 49 аминокислот. В некоторых вариантах осуществления длина аминокислотной последовательности первого партнера из связывающейся пары белок:белок составляет 50 аминокислот.[00198] Typically, the amino acid sequence of the first partner of a protein:protein binding pair described herein, e.g., comprising a first partner of a specific binding pair by itself or in combination with one or more linkers, is from about 5 to about 50 amino acids in length. In some embodiments, the amino acid sequence of the first partner of the protein:protein binding pair is at least 5 amino acids in length. In some embodiments, the amino acid sequence of the first partner of the protein:protein binding pair is 6 amino acids in length. In some embodiments, the amino acid sequence of the first partner of the protein:protein binding pair is 7 amino acids in length. In some embodiments, the amino acid sequence of the first partner of the protein:protein binding pair is 8 amino acids in length. In some embodiments, the amino acid sequence of the first partner of the protein:protein binding pair is 9 amino acids in length. In some embodiments, the amino acid sequence of the first partner of the protein:protein binding pair is 10 amino acids in length. In some embodiments, the amino acid sequence of the first partner of the protein:protein binding pair is 11 amino acids long. In some embodiments, the amino acid sequence of the first partner of the protein:protein binding pair is 12 amino acids long. In some embodiments, the amino acid sequence of the first partner of the protein:protein binding pair is 13 amino acids long. In some embodiments, the amino acid sequence of the first partner of the protein:protein binding pair is 14 amino acids long. In some embodiments, the amino acid sequence of the first partner of the protein:protein binding pair is 15 amino acids long. In some embodiments, the amino acid sequence of the first partner of the protein:protein binding pair is 16 amino acids long. In some embodiments, the amino acid sequence of the first partner of the protein:protein binding pair is 17 amino acids long. In some embodiments, the amino acid sequence of the first partner of the protein:protein binding pair is 18 amino acids long. In some embodiments, the amino acid sequence of the first partner of the protein:protein binding pair is 19 amino acids long. In some embodiments, the amino acid sequence of the first partner of the protein:protein binding pair is 20 amino acids long. In some embodiments, the amino acid sequence of the first partner of the protein:protein binding pair is 21 amino acids long. In some embodiments, the amino acid sequence of the first partner of the protein:protein binding pair is 22 amino acids long. In some embodiments, the amino acid sequence of the first partner of the protein:protein binding pair is 23 amino acids long. In some embodiments, the amino acid sequence of the first partner of the protein:protein binding pair is 24 amino acids long. In some embodiments, the amino acid sequence of the first partner of the protein:protein binding pair is 25 amino acids long. In some embodiments, the amino acid sequence of the first partner of the protein:protein binding pair is 26 amino acids long. In some embodiments, the amino acid sequence of the first partner of the protein:protein binding pair is 27 amino acids long. In some embodiments, the amino acid sequence of the first partner of the protein:protein binding pair is 28 amino acids long. In some embodiments, the amino acid sequence of the first partner of the protein:protein binding pair is 29 amino acids long. In some embodiments, the amino acid sequence of the first partner of the protein:protein binding pair is 30 amino acids long. In some embodiments, the amino acid sequence of the first partner of the protein:protein binding pair is 31 amino acids long. In some embodiments, the amino acid sequence of the first partner of the protein:protein binding pair is 32 amino acids long. In some embodiments, the amino acid sequence of the first partner of the protein:protein binding pair is 33 amino acids long. In some embodiments, the amino acid sequence of the first partner of the protein:protein binding pair is 34 amino acids long. In some embodiments, the amino acid sequence of the first partner of the protein:protein binding pair is 35 amino acids long. In some embodiments, the amino acid sequence of the first partner of the protein:protein binding pair is 36 amino acids long. In some embodiments, the amino acid sequence of the first partner of the protein:protein binding pair is 37 amino acids long. In some embodiments, the amino acid sequence of the first partner of the protein:protein binding pair is 38 amino acids long. In some embodiments, the amino acid sequence of the first partner of the protein:protein binding pair is 39 amino acids long. In some embodiments, the amino acid sequence of the first partner of the protein:protein binding pair is 40 amino acids long. In some embodiments, the amino acid sequence of the first partner of the protein:protein binding pair is 41 amino acids long. In some embodiments, the amino acid sequence of the first partner of the protein:protein binding pair is 42 amino acids long. In some embodiments, the amino acid sequence of the first partner of the protein:protein binding pair is 43 amino acids long. In some embodiments, the amino acid sequence of the first partner of the protein:protein binding pair is 44 amino acids long. In some embodiments, the amino acid sequence of the first partner of the protein:protein binding pair is 45 amino acids long. In some embodiments, the amino acid sequence of the first partner of the protein:protein binding pair is 46 amino acids long. In some embodiments, the amino acid sequence length of the first partner of the protein:protein binding pair is 47 amino acids. In some embodiments, the amino acid sequence length of the first partner of the protein:protein binding pair is 48 amino acids. In some embodiments, the amino acid sequence length of the first partner of the protein:protein binding pair is 49 amino acids. In some embodiments, the amino acid sequence length of the first partner of the protein:protein binding pair is 50 amino acids.
[00199] Вследствие высокой консервативности по меньшей мере крупных отрезков последовательности и большого числа близкородственных представителей семейства, соответствующие сайты вставки для AAV, отличные от перечисленных AAV, можно идентифицировать путем выполнения аминокислотного выравнивания или сравнения капсидных структур. См., например, Rutledge et al. (1998) J. Virol. 72:309-19; Mietzsch et al. (2019) Viruses 11, 362, 1-34 и патент США №9624274, в которых приведены иллюстративные выравнивания капсидных белков различных AAV, каждый из которых включен в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте. Например, в Mietzcsh et al. (2019) на фиг.7 представлено наложение ленточных структур различных представителей рода Dependoparvovirus, где изображены вариабельные области от VR I до VR IX. С использованием структурного анализа, описано в данном литературном источнике, и анализа последовательности, квалифицированный специалист может определить, какие аминокислоты в пределах вариабельной области соответствуют аминокислотной последовательности AAV, которая может вмещать вставку первого партнера из связывающейся пары белок:белок и/или детектируемой метки.[00199] Due to the high conservation of at least large stretches of sequence and the large number of closely related family members, appropriate insertion sites for AAVs other than those listed can be identified by performing amino acid alignments or comparing capsid structures. See, e.g., Rutledge et al. (1998) J. Virol. 72:309-19; Mietzsch et al. (2019) Viruses 11, 362, 1-34; and U.S. Patent No. 9,624,274 for exemplary alignments of the capsid proteins of various AAVs, each of which is incorporated herein by reference in its entirety. For example, Mietzsch et al. (2019) provides a superimposition of the band structures of various members of the genus Dependoparvovirus in Figure 7, depicting the variable regions VR I through VR IX. Using the structural analysis described in this literature and sequence analysis, one skilled in the art can determine which amino acids within the variable region correspond to an AAV amino acid sequence that can accommodate insertion of the first partner of the protein:protein binding pair and/or a detectable label.
[00200] Соответственно, в некоторых вариантах осуществления первый партнер из связывающейся пары белок:белок и/или детектируемая метка вставлены в капсидный белок VP1 AAV животного, не являющегося приматом, после аминокислотного положения, соответствующего аминокислотному положению, выбранному из группы, состоящей из G453 в капсидном белке VP1 AAV2, N587 в капсидном белке VP1 AAV2, G453 в капсидном белке VP1 AAV9 и А589 в капсидном белке VP1 AAV9. В некоторых вариантах осуществления первый партнер из связывающейся пары белок:белок и/или детектируемая метка вставлены в капсидный белок VP1 AAV животного, не являющегося приматом, между аминокислотами, которые соответствуют N587 и R588 в капсиде VP1 AAV2. Дополнительные подходящие сайты вставки в капсидном белке VP1 AAV животного, не являющегося приматом, включают сайты, соответствующие I-1, I-34, I-138, I-139, I-161, I-261, I-266, I-381, I-447, I-448, I-459, I-471, I-520, I-534, I-570, I-573, I-584, I-587, I-588, I-591, I-657, I-664, I-713 и I-716 капсидного белка VP1 AAV2 (Wu et al. (2000) J. Virol. 74:8635-8647). Модифицированный вирусный капсидный белок, описанный в данном документе, может представлять собой капсидный белок вируса животного, не являющегося приматом, содержащий первого партнера из связывающейся пары белок:белок и/или детектируемую метку, вставленные в положение, соответствующее положению капсидного белка AAV2, выбранному из группы, состоящей из I-1,I-34,I-138, I-139, I-161, I-261, I-266, I-381, I-447, I-448, I-459, I-471, I-520, I-534, I-570, I-573, I-584, I-587, I-588, I-591, I-657, I-664, I-713, I-716 и их комбинации. Дополнительные подходящие сайты вставки в AAV животного, не являющегося приматом, включают сайты, соответствующие I-587 AAV1, I-589 AAV1, I-585 AAV3, I-585 AAV4 и I-585 AAV5. В некоторых вариантах осуществления модифицированный вирусный капсидный белок, описанный в данном документе, может представлять собой капсидный белок вируса животного, не являющегося приматом, содержащий первого партнера из связывающейся пары белок:белок и/или детектируемую метку, вставленные в положение, соответствующее положению, выбранному из группы, состоящей из I-587 (AAV1), I-589 (AAV1), I-585 (AAV3), I-585 (AAV4), I-585 (AAV5) и их комбинации.[00200] Accordingly, in some embodiments, the first partner of the protein:protein binding pair and/or the detectable label are inserted into the VP1 capsid protein of the non-primate AAV after an amino acid position corresponding to an amino acid position selected from the group consisting of G453 in the VP1 capsid protein of AAV2, N587 in the VP1 capsid protein of AAV2, G453 in the VP1 capsid protein of AAV9, and A589 in the VP1 capsid protein of AAV9. In some embodiments, the first partner of the protein:protein binding pair and/or the detectable label are inserted into the VP1 capsid protein of the non-primate AAV between amino acids that correspond to N587 and R588 in the VP1 capsid of AAV2. Additional suitable insertion sites in the non-primate AAV VP1 capsid protein include sites corresponding to I-1, I-34, I-138, I-139, I-161, I-261, I-266, I-381, I-447, I-448, I-459, I-471, I-520, I-534, I-570, I-573, I-584, I-587, I-588, I-591, I-657, I-664, I-713, and I-716 of the AAV2 VP1 capsid protein (Wu et al. (2000) J. Virol. 74:8635-8647). The modified viral capsid protein described herein may be a capsid protein of a non-primate animal virus comprising a first partner of a protein:protein binding pair and/or a detectable label inserted at a position corresponding to a position of an AAV2 capsid protein selected from the group consisting of I-1, I-34, I-138, I-139, I-161, I-261, I-266, I-381, I-447, I-448, I-459, I-471, I-520, I-534, I-570, I-573, I-584, I-587, I-588, I-591, I-657, I-664, I-713, I-716, and combinations thereof. Additional suitable insertion sites in a non-primate AAV include sites corresponding to I-587 of AAV1, I-589 of AAV1, I-585 of AAV3, I-585 of AAV4, and I-585 of AAV5. In some embodiments, the modified viral capsid protein described herein may be a capsid protein of a non-primate virus comprising a first partner of a protein:protein binding pair and/or a detectable label inserted at a position corresponding to a position selected from the group consisting of I-587 (AAV1), I-589 (AAV1), I-585 (AAV3), I-585 (AAV4), I-585 (AAV5), and a combination thereof.
[00201] В некоторых вариантах осуществления первый партнер из связывающейся пары белок:белок и/или детектируемая метка вставлены в капсидный белок VP1 AAV животного, не являющегося приматом, после аминокислотного положения, соответствующего аминокислотному положению, выбранному из группы, состоящей из I444 капсидного белка VP1 птичьего AAV, I580 капсидного белка VP1 птичьего AAV, I573 капсидного белка VP1 AAV бородатой агамы, I436 капсидного белка VP1 AAV бородатой агамы, I429 капсидного белка VP1 AAV морского льва, I430 капсидного белка VP1 AAV морского льва, I431 капсидного белка VP1 AAV морского льва, I432 капсидного белка VP1 AAV морского льва, I433 капсидного белка VP1 AAV морского льва, I434 капсидного белка VP1 AAV морского льва, I436 капсидного белка VP1 AAV морского льва, I437 капсидного белка VP1 AAV морского льва и I565 капсидного белка VP1 AAV морского льва.[00201] In some embodiments, the first partner of the protein:protein binding pair and/or the detectable label are inserted into the VP1 capsid protein of the non-primate AAV after an amino acid position corresponding to an amino acid position selected from the group consisting of I444 of an avian AAV VP1 capsid protein, I580 of an avian AAV VP1 capsid protein, I573 of a bearded dragon AAV VP1 capsid protein, I436 of a bearded dragon AAV VP1 capsid protein, I429 of a sea lion AAV VP1 capsid protein, I430 of a sea lion AAV VP1 capsid protein, I431 of a sea lion AAV VP1 capsid protein, I432 of a sea lion AAV VP1 capsid protein, I433 of a sea lion AAV VP1 capsid protein, I434 of a sea lion AAV VP1 protein, sea lion AAV VP1 capsid protein I436, sea lion AAV VP1 capsid protein I437, and sea lion AAV VP1 capsid protein I565.
[00202] В данном документе номенклатура I-###, I# и т.п. относится к сайту вставки (I), при этом ### обозначает номер аминокислоты относительно белка VP1 капсидного белка AAV, однако такая вставка может быть расположена непосредственно на N- или С-конце, предпочтительно на С-конце одной аминокислоты в последовательности из 5 аминокислот, находящихся на N- или С-конце данной аминокислоты, предпочтительно 3, более предпочтительно 2, в частности 1 аминокислоте, находящейся на N- или С-конце данной аминокислоты. Кроме того, положения, упоминаемые в данном документе, приведены относительно белка VP1, кодируемого геном капсида AAV, и соответствующие положения (и их точечные мутации) можно легко идентифицировать для капсидных белков VP2 и VP3, кодируемых геном капсида, путем выполнения выравнивания последовательности белков VP1, VP2 и VP3, кодируемых соответствующим геном капсида AAV.[00202] In this document, the nomenclature I-###, I#, etc. refers to an insertion site (I), where ### denotes an amino acid number relative to the VP1 protein of the AAV capsid protein, however, such an insertion may be located immediately at the N- or C-terminus, preferably at the C-terminus of one amino acid in a sequence of 5 amino acids located at the N- or C-terminus of this amino acid, preferably 3, more preferably 2, in particular 1 amino acid located at the N- or C-terminus of this amino acid. Furthermore, the positions mentioned in this document are given relative to the VP1 protein encoded by the AAV capsid gene, and the corresponding positions (and their point mutations) can be easily identified for the VP2 and VP3 capsid proteins encoded by the capsid gene by performing a sequence alignment of the VP1, VP2 and VP3 proteins encoded by the corresponding AAV capsid gene.
[00203] Соответственно, вставка в соответствующее положение кодирующей нуклеиновой кислоты одного из этих сайтов гена cap приводит к вставке в VP1, VP2 и/или VP3, поскольку капсидные белки кодируются перекрывающимися рамками считывания одного и того же гена с разнесенными стартовыми кодонами. Следовательно, в случае AAV2, например, в соответствии с данной номенклатурой вставки между аминокислотами 1 и 138 приводят к вставке только в VP1, вставки между 138 и 203 приводят к вставке в VP1 и VP2, а вставки между 203 и С-концом приводят к вставке в VP1, VP2 и VP3, что, конечно, также относится и к сайту вставки I-587. Следовательно, настоящее изобретение охватывает структурные гены AAV с соответствующими вставками в белках VP1, VP2 и/или VP3.[00203] Accordingly, an insertion at the corresponding position of the coding nucleic acid of one of these sites of the cap gene results in an insertion in VP1, VP2 and/or VP3, since the capsid proteins are encoded by overlapping reading frames of the same gene with spaced start codons. Therefore, in the case of AAV2, for example, according to this nomenclature, insertions between amino acids 1 and 138 result in an insertion in VP1 only, insertions between 138 and 203 result in an insertion in VP1 and VP2, and insertions between 203 and the C-terminus result in an insertion in VP1, VP2 and VP3, which of course also applies to the I-587 insertion site. Therefore, the present invention encompasses AAV structural genes with corresponding insertions in the VP1, VP2 and/or VP3 proteins.
[00204] В данном документе также предусмотрены нуклеиновые кислоты, которые кодируют капсидный белок VP3 по настоящему изобретению. Капсидные белки AAV могут, но не обязательно, кодироваться перекрывающимися рамками считывания одного и того же гена с разнесенными стартовыми кодонами. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота, которая кодирует капсидный белок VP3 по настоящему изобретению, не кодирует также капсидный белок VP2 или капсидный белок VP1 по настоящему изобретению. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота, которая кодирует капсидный белок VP3 по настоящему изобретению, также может кодировать капсидный белок VP2 по настоящему изобретению, но не кодирует также капсид VP1 по настоящему изобретению. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота, которая кодирует капсидный белок VP3 по настоящему изобретению, также может кодировать капсидный белок VP2 по настоящему изобретению и капсид VP1 по настоящему изобретению.[00204] Also provided herein are nucleic acids that encode a VP3 capsid protein of the present invention. AAV capsid proteins may, but need not, be encoded by overlapping reading frames of the same gene with spaced start codons. In some embodiments, a nucleic acid that encodes a VP3 capsid protein of the present invention does not also encode a VP2 capsid protein or a VP1 capsid protein of the present invention. In some embodiments, a nucleic acid that encodes a VP3 capsid protein of the present invention may also encode a VP2 capsid protein of the present invention, but does not also encode a VP1 capsid of the present invention. In some embodiments, a nucleic acid that encodes a VP3 capsid protein of the present invention may also encode a VP2 capsid protein of the present invention and a VP1 capsid of the present invention.
[00205] В некоторых вариантах осуществления вирусный капсид, содержащий модифицированный вирусный капсидный белок, содержащий первого и второго партнеров из связывающейся пары белок:белок (например, где второй партнер функционально связан с нацеливающим лигандом, содержащим полиспецифический связывающий белок, и т.д.), способен инфицировать конкретную клетку, например, характеризуется повышенной способностью нацеливаться и связывать конкретную клетку по сравнению с контрольным вирусным капсидом, который идентичен модифицированному вирусному капсидному белку, кроме отсутствия в нем одного или обоих из первого и второго партнеров из связывающейся пары белок:белок, например, содержит контрольный капсидный белок. В некоторых вариантах осуществления вирусный капсид, содержащий модифицированный вирусный капсидный белок, описанный в данном документе, связанный с первым и вторым партнерами из связывающейся пары белок:белок, присоединенной к нацеливающему лиганду, демонстрирует обнаруживаемую эффективность трансдукции по сравнению с необнаруживаем ой эффективностью трансдукции контрольного вирусного капсида. В некоторых вариантах осуществления вирусный капсид, содержащий модифицированный вирусный капсидный белок, описанный в данном документе, связанный с первым и вторым партнерами из связывающейся пары белок:белок, присоединенной к нацеливающему лиганду, демонстрирует эффективность трансдукции, которая на 10% превышает эффективность трансдукции контрольного вирусного капсида. В некоторых вариантах осуществления вирусный капсид, содержащий модифицированный вирусный капсидный белок, описанный в данном документе, связанный с первым и вторым партнерами из связывающейся пары белок:белок, присоединенной к нацеливающему лиганду, демонстрирует эффективность трансдукции, которая на 20%о превышает эффективность трансдукции контрольного вирусного капсида. В некоторых вариантах осуществления вирусный капсид, содержащий модифицированный вирусный капсидный белок, описанный в данном документе, связанный с соответствующими первым и вторым партнерами из связывающейся пары белок:белок, присоединенной к нацеливающему лиганду, демонстрирует эффективность трансдукции, которая на 30%о превышает эффективность трансдукции контрольного вирусного капсида. В некоторых вариантах осуществления вирусный капсид, содержащий модифицированный вирусный капсидный белок, описанный в данном документе, связанный с соответствующими первым и вторым партнерами из связывающейся пары белок:белок, присоединенной к нацеливающему лиганду, демонстрирует эффективность трансдукции, которая на 40% превышает эффективность трансдукции контрольного вирусного капсида. В некоторых вариантах осуществления вирусный капсид, содержащий модифицированный вирусный капсидный белок, описанный в данном документе, связанный с соответствующими первым и вторым партнерами из связывающейся пары белок:белок, присоединенной к нацеливающему лиганду, демонстрирует эффективность трансдукции, которая на 50% превышает эффективность трансдукции контрольного вирусного капсида. В некоторых вариантах осуществления вирусный капсид, содержащий модифицированный вирусный капсидный белок, описанный в данном документе, связанный с соответствующими первым и вторым партнерами из связывающейся пары белок:белок, присоединенной к нацеливающему лиганду, демонстрирует эффективность трансдукции, которая на 60% превышает эффективность трансдукции контрольного вирусного капсида. В некоторых вариантах осуществления вирусный капсид, содержащий модифицированный вирусный капсидный белок, описанный в данном документе, связанный с соответствующими первым и вторым партнерами из связывающейся пары белок:белок, присоединенной к нацеливающему лиганду, демонстрирует эффективность трансдукции, которая на 70% превышает эффективность трансдукции контрольного вирусного капсида. В некоторых вариантах осуществления вирусный капсид, содержащий модифицированный вирусный капсидный белок, описанный в данном документе, связанный с соответствующими первым и вторым партнерами из связывающейся пары белок:белок, присоединенной к нацеливающему лиганду, демонстрирует эффективность трансдукции, которая на 75% превышает эффективность трансдукции контрольного вирусного капсида. В некоторых вариантах осуществления вирусный капсид, содержащий модифицированный вирусный капсидный белок, описанный в данном документе, связанный с соответствующими первым и вторым партнерами из связывающейся пары белок:белок, присоединенной к нацеливающему лиганду, демонстрирует эффективность трансдукции, которая на 80% превышает эффективность трансдукции контрольного вирусного капсида. В некоторых вариантах осуществления вирусный капсид, содержащий модифицированный вирусный капсидный белок, описанный в данном документе, связанный с соответствующими первым и вторым партнерами из связывающейся пары белок:белок, присоединенной к нацеливающему лиганду, демонстрирует эффективность трансдукции, которая на 85% превышает эффективность трансдукции контрольного вирусного капсида. В некоторых вариантах осуществления вирусный капсид, содержащий модифицированный вирусный капсидный белок, описанный в данном документе, связанный с соответствующими первым и вторым партнерами из связывающейся пары белок:белок, присоединенной к нацеливающему лиганду, демонстрирует эффективность трансдукции, которая на 90% превышает эффективность трансдукции контрольного капсида. В некоторых вариантах осуществления вирусный капсид, содержащий модифицированный вирусный капсидный белок, описанный в данном документе, связанный с соответствующими первым и вторым партнерами из связывающейся пары белок:белок, присоединенной к нацеливающему лиганду, демонстрирует эффективность трансдукции, которая на 95% превышает эффективность трансдукции контрольного вирусного капсида. В некоторых вариантах осуществления вирусный капсид, содержащий модифицированный вирусный капсидный белок, описанный в данном документе, связанный с первым и вторым партнерами из связывающейся пары белок:белок, присоединенной к нацеливающему лиганду, демонстрирует эффективность трансдукции, которая на 99% превышает эффективность трансдукции контрольного вирусного капсида.[00205] In some embodiments, a viral capsid comprising a modified viral capsid protein comprising a first and second partner of a protein:protein binding pair (e.g., wherein the second partner is operably linked to a targeting ligand comprising a multispecific binding protein, etc.) is capable of infecting a particular cell, e.g., has an enhanced ability to target and bind a particular cell, compared to a control viral capsid that is identical to the modified viral capsid protein except for lacking one or both of the first and second partners of the protein:protein binding pair, e.g., comprises a control capsid protein. In some embodiments, a viral capsid comprising a modified viral capsid protein described herein linked to the first and second partners of the protein:protein binding pair attached to a targeting ligand exhibits detectable transduction efficiency, compared to the undetectable transduction efficiency of the control viral capsid. In some embodiments, a viral capsid comprising a modified viral capsid protein as described herein associated with a first and second protein:protein binding pair partner attached to a targeting ligand exhibits a transduction efficiency that is 10% greater than the transduction efficiency of a control viral capsid. In some embodiments, a viral capsid comprising a modified viral capsid protein as described herein associated with a first and second protein:protein binding pair partner attached to a targeting ligand exhibits a transduction efficiency that is 20% greater than the transduction efficiency of a control viral capsid. In some embodiments, a viral capsid comprising a modified viral capsid protein as described herein associated with the respective first and second protein:protein binding pair partners attached to a targeting ligand exhibits a transduction efficiency that is 30% greater than the transduction efficiency of a control viral capsid. In some embodiments, a viral capsid comprising a modified viral capsid protein as described herein associated with the respective first and second partners of a protein:protein binding pair attached to a targeting ligand exhibits a transduction efficiency that is 40% greater than the transduction efficiency of a control viral capsid. In some embodiments, a viral capsid comprising a modified viral capsid protein as described herein associated with the respective first and second partners of a protein:protein binding pair attached to a targeting ligand exhibits a transduction efficiency that is 50% greater than the transduction efficiency of a control viral capsid. In some embodiments, a viral capsid comprising a modified viral capsid protein as described herein associated with the respective first and second partners of a protein:protein binding pair attached to a targeting ligand exhibits a transduction efficiency that is 60% greater than the transduction efficiency of a control viral capsid. In some embodiments, a viral capsid comprising a modified viral capsid protein as described herein associated with the respective first and second partners of a protein:protein binding pair attached to a targeting ligand exhibits a transduction efficiency that is 70% greater than the transduction efficiency of a control viral capsid. In some embodiments, a viral capsid comprising a modified viral capsid protein as described herein associated with the respective first and second partners of a protein:protein binding pair attached to a targeting ligand exhibits a transduction efficiency that is 75% greater than the transduction efficiency of a control viral capsid. In some embodiments, a viral capsid comprising a modified viral capsid protein as described herein associated with the respective first and second partners of a protein:protein binding pair attached to a targeting ligand exhibits a transduction efficiency that is 80% greater than the transduction efficiency of a control viral capsid. In some embodiments, a viral capsid comprising a modified viral capsid protein as described herein associated with the respective first and second partners of a protein:protein binding pair attached to a targeting ligand exhibits a transduction efficiency that is 85% greater than the transduction efficiency of a control viral capsid. In some embodiments, a viral capsid comprising a modified viral capsid protein as described herein associated with the respective first and second partners of a protein:protein binding pair attached to a targeting ligand exhibits a transduction efficiency that is 90% greater than the transduction efficiency of a control capsid. In some embodiments, a viral capsid comprising a modified viral capsid protein as described herein associated with the respective first and second partners of a protein:protein binding pair attached to a targeting ligand exhibits a transduction efficiency that is 95% greater than the transduction efficiency of a control viral capsid. In some embodiments, a viral capsid comprising a modified viral capsid protein described herein associated with a first and second protein:protein binding pair partner attached to a targeting ligand exhibits a transduction efficiency that is 99% greater than the transduction efficiency of a control viral capsid.
[00206] В некоторых вариантах осуществления вирусный капсид, содержащий модифицированный вирусный капсидный белок, содержащий первого и второго партнеров из связывающейся пары белок:белок (например, где второй партнер функционально связан с нацеливающим лигандом, содержащим полиспецифический связывающий белок, и т.д.), способен инфицировать конкретную клетку, например, характеризуется повышенной способностью нацеливаться и связывать конкретную клетку по сравнению с контрольным вирусным капсидом, который идентичен модифицированному вирусному капсидному белку, кроме отсутствия в нем одного или обоих из первого и второго партнеров из связывающейся пары белок:белок, например, содержит контрольный капсидный белок. В некоторых вариантах осуществления вирусный капсид, содержащий модифицированный вирусный капсидный белок, описанный в данном документе, связанный с первым и вторым партнерами из связывающейся пары белок:белок, присоединенной к нацеливающему лиганду, демонстрирует обнаруживаемую эффективность трансдукции по сравнению с необнаруживаем ой эффективностью трансдукции контрольного вирусного капсида. В некоторых вариантах осуществления вирусный капсид, содержащий модифицированный вирусный капсидный белок, описанный в данном документе, связанный с первым и вторым партнерами из связывающейся пары белок:белок, присоединенной к нацеливающему лиганду, демонстрирует эффективность трансдукции, которая на 10% превышает эффективность трансдукции контрольного вирусного капсида. В некоторых вариантах осуществления вирусный капсид, содержащий модифицированный вирусный капсидный белок, описанный в данном документе, связанный с первым и вторым партнерами из связывающейся пары белок:белок, присоединенной к нацеливающему лиганду, демонстрирует эффективность трансдукции, которая на 20% превышает эффективность трансдукции контрольного вирусного капсида. В некоторых вариантах осуществления вирусный капсид, содержащий модифицированный вирусный капсидный белок, описанный в данном документе, связанный с соответствующими первым и вторым партнерами из связывающейся пары белок:белок, присоединенной к нацеливающему лиганду, демонстрирует эффективность трансдукции, которая на 30% превышает эффективность трансдукции контрольного вирусного капсида. В некоторых вариантах осуществления вирусный капсид, содержащий модифицированный вирусный капсидный белок, описанный в данном документе, связанный с соответствующими первым и вторым партнерами из связывающейся пары белок:белок, присоединенной к нацеливающему лиганду, демонстрирует эффективность трансдукции, которая на 40% превышает эффективность трансдукции контрольного вирусного капсида. В некоторых вариантах осуществления вирусный капсид, содержащий модифицированный вирусный капсидный белок, описанный в данном документе, связанный с соответствующими первым и вторым партнерами из связывающейся пары белок:белок, присоединенной к нацеливающему лиганду, демонстрирует эффективность трансдукции, которая на 50% превышает эффективность трансдукции контрольного вирусного капсида. В некоторых вариантах осуществления вирусный капсид, содержащий модифицированный вирусный капсидный белок, описанный в данном документе, связанный с соответствующими первым и вторым партнерами из связывающейся пары белок:белок, присоединенной к нацеливающему лиганду, демонстрирует эффективность трансдукции, которая на 60% превышает эффективность трансдукции контрольного вирусного капсида. В некоторых вариантах осуществления вирусный капсид, содержащий модифицированный вирусный капсидный белок, описанный в данном документе, связанный с соответствующими первым и вторым партнерами из связывающейся пары белок:белок, присоединенной к нацеливающему лиганду, демонстрирует эффективность трансдукции, которая на 70% превышает эффективность трансдукции контрольного вирусного капсида. В некоторых вариантах осуществления вирусный капсид, содержащий модифицированный вирусный капсидный белок, описанный в данном документе, связанный с соответствующими первым и вторым партнерами из связывающейся пары белок:белок, присоединенной к нацеливающему лиганду, демонстрирует эффективность трансдукции, которая на 75% превышает эффективность трансдукции контрольного вирусного капсида. В некоторых вариантах осуществления вирусный капсид, содержащий модифицированный вирусный капсидный белок, описанный в данном документе, связанный с соответствующими первым и вторым партнерами из связывающейся пары белок:белок, присоединенной к нацеливающему лиганду, демонстрирует эффективность трансдукции, которая на 80% превышает эффективность трансдукции контрольного вирусного капсида. В некоторых вариантах осуществления вирусный капсид, содержащий модифицированный вирусный капсидный белок, описанный в данном документе, связанный с соответствующими первым и вторым партнерами из связывающейся пары белок:белок, присоединенной к нацеливающему лиганду, демонстрирует эффективность трансдукции, которая на 85% превышает эффективность трансдукции контрольного вирусного капсида. В некоторых вариантах осуществления вирусный капсид, содержащий модифицированный вирусный капсидный белок, описанный в данном документе, связанный с соответствующими первым и вторым партнерами из связывающейся пары белок:белок, присоединенной к нацеливающему лиганду, демонстрирует эффективность трансдукции, которая на 90% превышает эффективность трансдукции контрольного капсида. В некоторых вариантах осуществления вирусный капсид, содержащий модифицированный вирусный капсидный белок, описанный в данном документе, связанный с соответствующими первым и вторым партнерами из связывающейся пары белок:белок, присоединенной к нацеливающему лиганду, демонстрирует эффективность трансдукции, которая на 95% превышает эффективность трансдукции контрольного вирусного капсида. В некоторых вариантах осуществления вирусный капсид, содержащий модифицированный вирусный капсидный белок, описанный в данном документе, связанный с первым и вторым партнерами из связывающейся пары белок:белок, присоединенной к нацеливающему лиганду, демонстрирует эффективность трансдукции, которая на 99% превышает эффективность трансдукции контрольного вирусного капсида. В некоторых вариантах осуществления вирусный капсид, содержащий модифицированный вирусный капсидный белок, описанный в данном документе, связанный с первым и вторым партнерами из связывающейся пары белок:белок, присоединенной к нацеливающему лиганду, демонстрирует эффективность трансдукции, которая в по меньшей мере 1,5 раза превышает эффективность трансдукции контрольного вирусного капсида. В некоторых вариантах осуществления вирусный капсид, содержащий модифицированный вирусный капсидный белок, описанный в данном документе, связанный с первым и вторым партнерами из связывающейся пары белок:белок, присоединенной к нацеливающему лиганду, демонстрирует эффективность трансдукции, которая в по меньшей мере 2 раза превышает эффективность трансдукции контрольного вирусного капсида. В некоторых вариантах осуществления вирусный капсид, содержащий модифицированный вирусный капсидный белок, описанный в данном документе, связанный с соответствующими первым и вторым партнерами из связывающейся пары белок:белок, присоединенной к нацеливающему лиганду, демонстрирует эффективность трансдукции, которая в по меньшей мере 3 раза превышает эффективность трансдукции контрольного вирусного капсида. В некоторых вариантах осуществления вирусный капсид, содержащий модифицированный вирусный капсидный белок, описанный в данном документе, связанный с соответствующими первым и вторым партнерами из связывающейся пары белок:белок, присоединенной к нацеливающему лиганду, демонстрирует эффективность трансдукции, которая в по меньшей мере 4 раза превышает эффективность трансдукции контрольного вирусного капсида. В некоторых вариантах осуществления вирусный капсид, содержащий модифицированный вирусный капсидный белок, описанный в данном документе, связанный с соответствующими первым и вторым партнерами из связывающейся пары белок:белок, присоединенной к нацеливающему лиганду, демонстрирует эффективность трансдукции, которая в по меньшей мере 5 раз превышает эффективность трансдукции контрольного вирусного капсида. В некоторых вариантах осуществления вирусный капсид, содержащий модифицированный вирусный капсидный белок, описанный в данном документе, связанный с соответствующими первым и вторым партнерами из связывающейся пары белок:белок, присоединенной к нацеливающему лиганду, демонстрирует эффективность трансдукции, которая в по меньшей мере 6 раз превышает эффективность трансдукции контрольного вирусного капсида. В некоторых вариантах осуществления вирусный капсид, содержащий модифицированный вирусный капсидный белок, описанный в данном документе, связанный с соответствующими первым и вторым партнерами из связывающейся пары белок:белок, присоединенной к нацеливающему лиганду, демонстрирует эффективность трансдукции, которая в по меньшей мере 7 раз превышает эффективность трансдукции контрольного вирусного капсида. В некоторых вариантах осуществления вирусный капсид, содержащий модифицированный вирусный капсидный белок, описанный в данном документе, связанный с соответствующими первым и вторым партнерами из связывающейся пары белок:белок, присоединенной к нацеливающему лиганду, демонстрирует эффективность трансдукции, которая в по меньшей мере 8 раз превышает эффективность трансдукции контрольного вирусного капсида. В некоторых вариантах осуществления вирусный капсид, содержащий модифицированный вирусный капсидный белок, описанный в данном документе, связанный с соответствующими первым и вторым партнерами из связывающейся пары белок:белок, присоединенной к нацеливающему лиганду, демонстрирует эффективность трансдукции, которая в по меньшей мере 9 раз превышает эффективность трансдукции контрольного вирусного капсида. В некоторых вариантах осуществления вирусный капсид, содержащий модифицированный вирусный капсидный белок, описанный в данном документе, связанный с соответствующими первым и вторым партнерами из связывающейся пары белок:белок, присоединенной к нацеливающему лиганду, демонстрирует эффективность трансдукции, которая в по меньшей мере 10 раз превышает эффективность трансдукции контрольного вирусного капсида. В некоторых вариантах осуществления вирусный капсид, содержащий модифицированный вирусный капсидный белок, описанный в данном документе, связанный с соответствующими первым и вторым партнерами из связывающейся пары белок:белок, присоединенной к нацеливающему лиганду, демонстрирует эффективность трансдукции, которая в по меньшей мере 20 раз превышает эффективность трансдукции контрольного капсида. В некоторых вариантах осуществления вирусный капсид, содержащий модифицированный вирусный капсидный белок, описанный в данном документе, связанный с соответствующими первым и вторым партнерами из связывающейся пары белок:белок, присоединенной к нацеливающему лиганду, демонстрирует эффективность трансдукции, которая в по меньшей мере 30 раз превышает эффективность трансдукции контрольного вирусного капсида. В некоторых вариантах осуществления вирусный капсид, содержащий модифицированный вирусный капсидный белок, описанный в данном документе, связанный с первым и вторым партнерами из связывающейся пары белок:белок, присоединенной к нацеливающему лиганду, демонстрирует эффективность трансдукции, которая в по меньшей мере 40 раз превышает эффективность трансдукции контрольного вирусного капсида. В некоторых вариантах осуществления вирусный капсид, содержащий модифицированный вирусный капсидный белок, описанный в данном документе, связанный с первым и вторым партнерами из связывающейся пары белок:белок, присоединенной к нацеливающему лиганду, демонстрирует эффективность трансдукции, которая в по меньшей мере 50 раз превышает эффективность трансдукции контрольного вирусного капсида. В некоторых вариантах осуществления вирусный капсид, содержащий модифицированный вирусный капсидный белок, описанный в данном документе, связанный с первым и вторым партнерами из связывающейся пары белок:белок, присоединенной к нацеливающему лиганду, демонстрирует эффективность трансдукции, которая в по меньшей мере 60 раз превышает эффективность трансдукции контрольного вирусного капсида. В некоторых вариантах осуществления вирусный капсид, содержащий модифицированный вирусный капсидный белок, описанный в данном документе, связанный с первым и вторым партнерами из связывающейся пары белок:белок, присоединенной к нацеливающему лиганду, демонстрирует эффективность трансдукции, которая в по меньшей мере 70 раз превышает эффективность трансдукции контрольного вирусного капсида. В некоторых вариантах осуществления вирусный капсид, содержащий модифицированный вирусный капсидный белок, описанный в данном документе, связанный с первым и вторым партнерами из связывающейся пары белок:белок, присоединенной к нацеливающему лиганду, демонстрирует эффективность трансдукции, которая в по меньшей мере 80 раз превышает эффективность трансдукции контрольного вирусного капсида. В некоторых вариантах осуществления вирусный капсид, содержащий модифицированный вирусный капсидный белок, описанный в данном документе, связанный с первым и вторым партнерами из связывающейся пары белок:белок, присоединенной к нацеливающему лиганду, демонстрирует эффективность трансдукции, которая в по меньшей мере 90 раз превышает эффективность трансдукции контрольного вирусного капсида. В некоторых вариантах осуществления вирусный капсид, содержащий модифицированный вирусный капсидный белок, описанный в данном документе, связанный с первым и вторым партнерами из связывающейся пары белок:белок, присоединенной к нацеливающему лиганду, демонстрирует эффективность трансдукции, которая в по меньшей мере 100 раз превышает эффективность трансдукции контрольного вирусного капсида. В некоторых вариантах осуществления вирусная частица по настоящему изобретению, содержащая вирусный капсидный белок, содержащий аминокислотную последовательность капсидного белка AAV животного, не являющегося приматом, отдаленного AAV или их комбинацию и необязательно содержащая первого и второго партнеров из связывающейся пары белок:белок (например, где второй партнер функционально связан с нацеливающим лигандом, содержащим полиспецифический связывающий белок и т.д.), лучше способна избегать нейтрализации под действием предсуществующих антител в сыворотке крови, выделенной от пациента-человека, по сравнению с соответствующей контрольной вирусной частицей (например, содержащей вирусный капсид серотипа AAV, часть которого включена в вирусный капсид по настоящему изобретению, например, как часть вирусного капсидного белка, содержащая аминокислотную последовательность капсидного белка AAV животного, не являющегося приматом, отдаленного AAV или их комбинацию), которая также необязательно содержит первого и второго партнеров из связывающейся пары белок:белок (например, где второй партнер функционально связан с нацеливающим лигандом, содержащим полиспецифический связывающий белок и т.д.). В некоторых вариантах осуществления для нейтрализации вирусной частицы по настоящему изобретению, содержащей вирусный капсидный белок, содержащий аминокислотную последовательность капсидного белка AAV животного, не являющегося приматом, отдаленного AAV или их комбинацию, требуется в по меньшей мере 2 раза больше общих IVIG или IgG (например, 50% подавления инфицирования или больше) по сравнению с соответствующей контрольной вирусной частицей (например, вирусная частица по настоящему изобретению характеризуется значением IC50, которое в по меньшей мере 2 раза превышает значение для контрольной вирусной частицы). [00206] In some embodiments, a viral capsid comprising a modified viral capsid protein comprising a first and second partner of a protein:protein binding pair (e.g., wherein the second partner is operably linked to a targeting ligand comprising a multispecific binding protein, etc.) is capable of infecting a particular cell, e.g., has an enhanced ability to target and bind a particular cell, compared to a control viral capsid that is identical to the modified viral capsid protein except for lacking one or both of the first and second partners of the protein:protein binding pair, e.g., comprises a control capsid protein. In some embodiments, a viral capsid comprising a modified viral capsid protein described herein linked to the first and second partners of the protein:protein binding pair attached to a targeting ligand exhibits detectable transduction efficiency, compared to the undetectable transduction efficiency of the control viral capsid. In some embodiments, a viral capsid comprising a modified viral capsid protein as described herein associated with a first and second protein:protein binding pair partner attached to a targeting ligand exhibits a transduction efficiency that is 10% greater than the transduction efficiency of a control viral capsid. In some embodiments, a viral capsid comprising a modified viral capsid protein as described herein associated with a first and second protein:protein binding pair partner attached to a targeting ligand exhibits a transduction efficiency that is 20% greater than the transduction efficiency of a control viral capsid. In some embodiments, a viral capsid comprising a modified viral capsid protein as described herein associated with the respective first and second protein:protein binding pair partners attached to a targeting ligand exhibits a transduction efficiency that is 30% greater than the transduction efficiency of a control viral capsid. In some embodiments, a viral capsid comprising a modified viral capsid protein as described herein associated with the respective first and second partners of a protein:protein binding pair attached to a targeting ligand exhibits a transduction efficiency that is 40% greater than the transduction efficiency of a control viral capsid. In some embodiments, a viral capsid comprising a modified viral capsid protein as described herein associated with the respective first and second partners of a protein:protein binding pair attached to a targeting ligand exhibits a transduction efficiency that is 50% greater than the transduction efficiency of a control viral capsid. In some embodiments, a viral capsid comprising a modified viral capsid protein as described herein associated with the respective first and second partners of a protein:protein binding pair attached to a targeting ligand exhibits a transduction efficiency that is 60% greater than the transduction efficiency of a control viral capsid. In some embodiments, a viral capsid comprising a modified viral capsid protein as described herein associated with the respective first and second partners of a protein:protein binding pair attached to a targeting ligand exhibits a transduction efficiency that is 70% greater than the transduction efficiency of a control viral capsid. In some embodiments, a viral capsid comprising a modified viral capsid protein as described herein associated with the respective first and second partners of a protein:protein binding pair attached to a targeting ligand exhibits a transduction efficiency that is 75% greater than the transduction efficiency of a control viral capsid. In some embodiments, a viral capsid comprising a modified viral capsid protein as described herein associated with the respective first and second partners of a protein:protein binding pair attached to a targeting ligand exhibits a transduction efficiency that is 80% greater than the transduction efficiency of a control viral capsid. In some embodiments, a viral capsid comprising a modified viral capsid protein as described herein associated with the respective first and second partners of a protein:protein binding pair attached to a targeting ligand exhibits a transduction efficiency that is 85% greater than the transduction efficiency of a control viral capsid. In some embodiments, a viral capsid comprising a modified viral capsid protein as described herein associated with the respective first and second partners of a protein:protein binding pair attached to a targeting ligand exhibits a transduction efficiency that is 90% greater than the transduction efficiency of a control capsid. In some embodiments, a viral capsid comprising a modified viral capsid protein as described herein associated with the respective first and second partners of a protein:protein binding pair attached to a targeting ligand exhibits a transduction efficiency that is 95% greater than the transduction efficiency of a control viral capsid. In some embodiments, a viral capsid comprising a modified viral capsid protein as described herein associated with a first and second protein:protein binding pair partner attached to a targeting ligand exhibits a transduction efficiency that is 99% greater than the transduction efficiency of a control viral capsid. In some embodiments, a viral capsid comprising a modified viral capsid protein as described herein associated with a first and second protein:protein binding pair partner attached to a targeting ligand exhibits a transduction efficiency that is at least 1.5-fold greater than the transduction efficiency of a control viral capsid. In some embodiments, a viral capsid comprising a modified viral capsid protein as described herein associated with a first and second protein:protein binding pair partner attached to a targeting ligand exhibits a transduction efficiency that is at least 2-fold greater than the transduction efficiency of a control viral capsid. In some embodiments, a viral capsid comprising a modified viral capsid protein as described herein associated with the respective first and second partners of a protein:protein binding pair attached to a targeting ligand exhibits a transduction efficiency that is at least 3-fold higher than the transduction efficiency of a control viral capsid. In some embodiments, a viral capsid comprising a modified viral capsid protein as described herein associated with the respective first and second partners of a protein:protein binding pair attached to a targeting ligand exhibits a transduction efficiency that is at least 4-fold higher than the transduction efficiency of a control viral capsid. In some embodiments, a viral capsid comprising a modified viral capsid protein as described herein associated with the respective first and second partners of a protein:protein binding pair attached to a targeting ligand exhibits a transduction efficiency that is at least 5-fold higher than the transduction efficiency of a control viral capsid. In some embodiments, a viral capsid comprising a modified viral capsid protein described herein associated with a respective first and second protein:protein binding pair partner attached to a targeting ligand exhibits a transduction efficiency that is at least 6-fold greater than the transduction efficiency of a control viral capsid. In some embodiments, a viral capsid comprising a modified viral capsid protein as described herein associated with the respective first and second partners of a protein:protein binding pair attached to a targeting ligand exhibits a transduction efficiency that is at least 7-fold higher than the transduction efficiency of a control viral capsid. In some embodiments, a viral capsid comprising a modified viral capsid protein as described herein associated with the respective first and second partners of a protein:protein binding pair attached to a targeting ligand exhibits a transduction efficiency that is at least 8-fold higher than the transduction efficiency of a control viral capsid. In some embodiments, a viral capsid comprising a modified viral capsid protein as described herein associated with the respective first and second partners of a protein:protein binding pair attached to a targeting ligand exhibits a transduction efficiency that is at least 9-fold higher than the transduction efficiency of a control viral capsid. In some embodiments, a viral capsid comprising a modified viral capsid protein as described herein associated with the respective first and second partners of a protein:protein binding pair attached to a targeting ligand exhibits a transduction efficiency that is at least 10-fold higher than the transduction efficiency of a control viral capsid. In some embodiments, a viral capsid comprising a modified viral capsid protein as described herein associated with the respective first and second partners of a protein:protein binding pair attached to a targeting ligand exhibits a transduction efficiency that is at least 20-fold higher than the transduction efficiency of a control capsid. In some embodiments, a viral capsid comprising a modified viral capsid protein as described herein associated with the respective first and second partners of a protein:protein binding pair attached to a targeting ligand exhibits a transduction efficiency that is at least 30-fold higher than the transduction efficiency of a control viral capsid. In some embodiments, a viral capsid comprising a modified viral capsid protein as described herein associated with a first and second protein:protein binding pair partner attached to a targeting ligand exhibits a transduction efficiency that is at least 40-fold greater than the transduction efficiency of a control viral capsid. In some embodiments, a viral capsid comprising a modified viral capsid protein as described herein associated with a first and second protein:protein binding pair partner attached to a targeting ligand exhibits a transduction efficiency that is at least 50-fold greater than the transduction efficiency of a control viral capsid. In some embodiments, a viral capsid comprising a modified viral capsid protein as described herein associated with a first and second protein:protein binding pair partner attached to a targeting ligand exhibits a transduction efficiency that is at least 60-fold greater than the transduction efficiency of a control viral capsid. In some embodiments, a viral capsid comprising a modified viral capsid protein as described herein associated with a first and second protein:protein binding pair partner attached to a targeting ligand exhibits a transduction efficiency that is at least 70-fold greater than the transduction efficiency of a control viral capsid. In some embodiments, a viral capsid comprising a modified viral capsid protein as described herein associated with a first and second protein:protein binding pair partner attached to a targeting ligand exhibits a transduction efficiency that is at least 80-fold greater than the transduction efficiency of a control viral capsid. In some embodiments, a viral capsid comprising a modified viral capsid protein as described herein associated with a first and second protein:protein binding pair partner attached to a targeting ligand exhibits a transduction efficiency that is at least 90-fold greater than the transduction efficiency of a control viral capsid. In some embodiments, a viral capsid comprising a modified viral capsid protein described herein associated with a first and second protein:protein binding pair partner attached to a targeting ligand exhibits a transduction efficiency that is at least 100-fold greater than the transduction efficiency of a control viral capsid. In some embodiments, a viral particle of the present invention comprising a viral capsid protein comprising an amino acid sequence of an AAV capsid protein of a non-primate animal, a distant AAV, or a combination thereof, and optionally comprising a first and a second partner of a protein:protein binding pair (e.g., wherein the second partner is operably linked to a targeting ligand comprising a multispecific binding protein, etc.) is better able to evade neutralization by pre-existing antibodies in serum isolated from a human patient, compared to a corresponding control viral particle (e.g., comprising a viral capsid of an AAV serotype, a portion of which is included in a viral capsid of the present invention, such as a portion of a viral capsid protein comprising an amino acid sequence of an AAV capsid protein of a non-primate animal, a distant AAV, or a combination thereof), which also optionally comprises a first and a second partner of a protein:protein binding pair (e.g., wherein the second partner is operably linked to a targeting ligand, In some embodiments, at least 2-fold more total IVIG or IgG (e.g., 50% inhibition of infection or greater) is required to neutralize a viral particle of the present invention comprising a viral capsid protein comprising the amino acid sequence of a capsid protein of a non-primate AAV, a distant AAV, or a combination thereof, compared to a corresponding control viral particle (e.g., a viral particle of the present invention has an IC50 value that is at least 2-fold higher than the value for the control viral particle).
[00207] В некоторых вариантах осуществления для нейтрализации вирусной частицы по настоящему изобретению, содержащей вирусный капсидный белок, содержащий аминокислотную последовательность капсидного белка AAV животного, не являющегося приматом, отдаленного AAV или их комбинацию, требуется в по меньшей мере 3 раза больше общих IVIG или IgG (например, 50% подавления инфицирования или больше) по сравнению с соответствующей контрольной вирусной частицей (например, вирусная частица по настоящему изобретению характеризуется значением IC50, которое в по меньшей мере 3 раза превышает значение для контрольной вирусной частицы). В некоторых вариантах осуществления для нейтрализации вирусной частицы по настоящему изобретению, содержащей вирусный капсидный белок, содержащий аминокислотную последовательность капсидного белка AAV животного, не являющегося приматом, отдаленного AAV или их комбинацию, требуется в по меньшей мере 4 раза больше общих IVIG или IgG (например, 50% подавления инфицирования или больше) по сравнению с соответствующей контрольной вирусной частицей (например, вирусная частица по настоящему изобретению характеризуется значением IC50, которое в по меньшей мере 4 раза превышает значение для контрольной вирусной частицы). В некоторых вариантах осуществления для нейтрализации вирусной частицы по настоящему изобретению, содержащей вирусный капсидный белок, содержащий аминокислотную последовательность капсидного белка AAV животного, не являющегося приматом, отдаленного AAV или их комбинацию, требуется в по меньшей мере 5 раза больше общих IVIG или IgG (например, 50% подавления инфицирования или больше) по сравнению с соответствующей контрольной вирусной частицей (например, вирусная частица по настоящему изобретению характеризуется значением IC50, которое в по меньшей мере 5 раз превышает значение для контрольной вирусной частицы). В некоторых вариантах осуществления для нейтрализации вирусной частицы по настоящему изобретению, содержащей вирусный капсидный белок, содержащий аминокислотную последовательность капсидного белка AAV животного, не являющегося приматом, отдаленного AAV или их комбинацию, требуется в по меньшей мере 6 раза больше общих IVIG или IgG (например, 50% подавления инфицирования или больше) по сравнению с соответствующей контрольной вирусной частицей (например, вирусная частица по настоящему изобретению характеризуется значением IC50, которое в по меньшей мере 6 раз превышает значение для контрольной вирусной частицы). В некоторых вариантах осуществления для нейтрализации вирусной частицы по настоящему изобретению, содержащей вирусный капсидный белок, содержащий аминокислотную последовательность капсидного белка AAV животного, не являющегося приматом, отдаленного AAV или их комбинацию, требуется в по меньшей мере 7 раз больше общих IVIG или IgG (например, 50% подавления инфицирования или больше) по сравнению с соответствующей контрольной вирусной частицей (например, вирусная частица по настоящему изобретению характеризуется значением IC50, которое в по меньшей мере 7 раз превышает значение для контрольной вирусной частицы). В некоторых вариантах осуществления для нейтрализации вирусной частицы по настоящему изобретению, содержащей вирусный капсидный белок, содержащий аминокислотную последовательность капсидного белка AAV животного, не являющегося приматом, отдаленного AAV или их комбинацию, требуется в по меньшей мере 8 раз больше общих IVIG или IgG (например, 50% подавления инфицирования или больше) по сравнению с соответствующей контрольной вирусной частицей (например, вирусная частица по настоящему изобретению характеризуется значением IC50, которое в по меньшей мере 8 раз превышает значение для контрольной вирусной частицы). В некоторых вариантах осуществления для нейтрализации вирусной частицы по настоящему изобретению, содержащей вирусный капсидный белок, содержащий аминокислотную последовательность капсидного белка AAV животного, не являющегося приматом, отдаленного AAV или их комбинацию, требуется в по меньшей мере 9 раз больше общих IVIG или IgG (например, 50% подавления инфицирования или больше) по сравнению с соответствующей контрольной вирусной частицей (например, вирусная частица по настоящему изобретению характеризуется значением IC50, которое в по меньшей мере 9 раз превышает значение для контрольной вирусной частицы). В некоторых вариантах осуществления для нейтрализации вирусной частицы по настоящему изобретению, содержащей вирусный капсидный белок, содержащий аминокислотную последовательность капсидного белка AAV животного, не являющегося приматом, отдаленного AAV или их комбинацию, требуется в по меньшей мере 10 раз больше общих IVIG или IgG (например, 50% подавления инфицирования или больше) по сравнению с соответствующей контрольной вирусной частицей (например, вирусная частица по настоящему изобретению характеризуется значением IC50, которое в по меньшей мере 10 раз превышает значение для контрольной вирусной частицы). В некоторых вариантах осуществления для нейтрализации вирусной частицы по настоящему изобретению, содержащей вирусный капсидный белок, содержащий аминокислотную последовательность капсидного белка AAV животного, не являющегося приматом, отдаленного AAV или их комбинацию, требуется в по меньшей мере 20 раз больше общих IVIG или IgG (например, 50% подавления инфицирования или больше) по сравнению с соответствующей контрольной вирусной частицей (например, вирусная частица по настоящему изобретению характеризуется значением IC50, которое в по меньшей мере 20 раз превышает значение для контрольной вирусной частицы). В некоторых вариантах осуществления для нейтрализации вирусной частицы по настоящему изобретению, содержащей вирусный капсидный белок, содержащий аминокислотную последовательность капсидного белка AAV животного, не являющегося приматом, отдаленного AAV или их комбинацию, требуется в по меньшей мере 30 раз больше общих IVIG или IgG (например, 50% подавления инфицирования или больше) по сравнению с соответствующей контрольной вирусной частицей (например, вирусная частица по настоящему изобретению характеризуется значением IC50, которое в по меньшей мере 30 раз превышает значение для контрольной вирусной частицы). В некоторых вариантах осуществления для нейтрализации вирусной частицы по настоящему изобретению, содержащей вирусный капсидный белок, содержащий аминокислотную последовательность капсидного белка AAV животного, не являющегося приматом, отдаленного AAV или их комбинацию, требуется в по меньшей мере 40 раз больше общих IVIG или IgG (например, 50% подавления инфицирования или больше) по сравнению с соответствующей контрольной вирусной частицей (например, вирусная частица по настоящему изобретению характеризуется значением IC50, которое в по меньшей мере 40 раз превышает значение для контрольной вирусной частицы). В некоторых вариантах осуществления для нейтрализации вирусной частицы по настоящему изобретению, содержащей вирусный капсидный белок, содержащий аминокислотную последовательность капсидного белка AAV животного, не являющегося приматом, отдаленного AAV или их комбинацию, требуется в по меньшей мере 50 раз больше общих IVIG или IgG (например, 50% подавления инфицирования или больше) по сравнению с соответствующей контрольной вирусной частицей (например, вирусная частица по настоящему изобретению характеризуется значением IC50, которое в по меньшей мере 50 раз превышает значение для контрольной вирусной частицы). В некоторых вариантах осуществления для нейтрализации вирусной частицы по настоящему изобретению, содержащей вирусный капсидный белок, содержащий аминокислотную последовательность капсидного белка AAV животного, не являющегося приматом, отдаленного AAV или их комбинацию, требуется в по меньшей мере 60 раз больше общих IVIG или IgG (например, 50% подавления инфицирования или больше) по сравнению с соответствующей контрольной вирусной частицей (например, вирусная частица по настоящему изобретению характеризуется значением IC50, которое в по меньшей мере 60 раз превышает значение для контрольной вирусной частицы). В некоторых вариантах осуществления для нейтрализации вирусной частицы по настоящему изобретению, содержащей вирусный капсидный белок, содержащий аминокислотную последовательность капсидного белка AAV животного, не являющегося приматом, отдаленного AAV или их комбинацию, требуется в по меньшей мере 70 раз больше общих IVIG или IgG (например, 50% подавления инфицирования или больше) по сравнению с соответствующей контрольной вирусной частицей (например, вирусная частица по настоящему изобретению характеризуется значением IC50, которое в по меньшей мере 70 раз превышает значение для контрольной вирусной частицы). В некоторых вариантах осуществления для нейтрализации вирусной частицы по настоящему изобретению, содержащей вирусный капсидный белок, содержащий аминокислотную последовательность капсидного белка AAV животного, не являющегося приматом, отдаленного AAV или их комбинацию, требуется в по меньшей мере 80 раз больше общих IVIG или IgG (например, 50% подавления инфицирования или больше) по сравнению с соответствующей контрольной вирусной частицей (например, вирусная частица по настоящему изобретению характеризуется значением IC50, которое в по меньшей мере 80 раз превышает значение для контрольной вирусной частицы). В некоторых вариантах осуществления для нейтрализации вирусной частицы по настоящему изобретению, содержащей вирусный капсидный белок, содержащий аминокислотную последовательность капсидного белка AAV животного, не являющегося приматом, отдаленного AAV или их комбинацию, требуется в по меньшей мере 90 раз больше общих IVIG или IgG (например, 50% подавления инфицирования или больше) по сравнению с соответствующей контрольной вирусной частицей (например, вирусная частица по настоящему изобретению характеризуется значением IC50, которое в по меньшей мере 90 раз превышает значение для контрольной вирусной частицы). В некоторых вариантах осуществления для нейтрализации вирусной частицы по настоящему изобретению, содержащей вирусный капсидный белок, содержащий аминокислотную последовательность капсидного белка AAV животного, не являющегося приматом, отдаленного AAV или их комбинацию, требуется в по меньшей мере 100 раз больше общих IVIG или IgG (например, 50% подавления инфицирования или больше) по сравнению с соответствующей контрольной вирусной частицей (например, вирусная частица по настоящему изобретению характеризуется значением IC50, которое в по меньшей мере 100 раз превышает значение для контрольной вирусной частицы). В некоторых вариантах осуществления вирусная частица по настоящему изобретению, содержащая вирусный капсидный белок, содержащий аминокислотную последовательность капсидного белка AAV животного, не являющегося приматом, отдаленного AAV или их комбинацию, характеризуется необнаруживаем ой IC50 при инкубации с объединенной человеческой сывороткой крови от по меньшей мере 100; 10000; 20000; 30000; 40000; 50000 или более людей-доноров. [00207] In some embodiments, at least 3 times more total IVIG or IgG (e.g., 50% inhibition of infection or greater) is required to neutralize a viral particle of the present invention comprising a viral capsid protein comprising an amino acid sequence of a capsid protein of a non-primate AAV, a distant AAV, or a combination thereof, compared to a corresponding control viral particle (e.g., a viral particle of the present invention has an IC50 value that is at least 3 times greater than the value for the control viral particle). In some embodiments, at least 4 times more total IVIG or IgG (e.g., 50% inhibition of infection or greater) is required to neutralize a viral particle of the present invention comprising a viral capsid protein comprising an amino acid sequence of a capsid protein of a non-primate AAV, a distant AAV, or a combination thereof, compared to a corresponding control viral particle (e.g., a viral particle of the present invention has an IC50 value that is at least 4 times greater than the value for the control viral particle). In some embodiments, at least 5 times more total IVIG or IgG (e.g., 50% inhibition of infection or greater) is required to neutralize a viral particle of the present invention comprising a viral capsid protein comprising an amino acid sequence of a capsid protein of a non-primate AAV, a distant AAV, or a combination thereof, compared to a corresponding control viral particle (e.g., a viral particle of the present invention has an IC50 value that is at least 5 times greater than the value for the control viral particle). In some embodiments, at least 6 times more total IVIG or IgG (e.g., 50% inhibition of infection or greater) is required to neutralize a viral particle of the present invention comprising a viral capsid protein comprising an amino acid sequence of a capsid protein of a non-primate AAV, a distant AAV, or a combination thereof, compared to a corresponding control viral particle (e.g., a viral particle of the present invention has an IC50 value that is at least 6 times greater than the value for the control viral particle). In some embodiments, at least 7 times more total IVIG or IgG (e.g., 50% inhibition of infection or greater) is required to neutralize a viral particle of the present invention comprising a viral capsid protein comprising an amino acid sequence of a capsid protein of a non-primate AAV, a distant AAV, or a combination thereof, compared to a corresponding control viral particle (e.g., a viral particle of the present invention has an IC50 value that is at least 7 times greater than the value for the control viral particle). In some embodiments, at least 8 times more total IVIG or IgG (e.g., 50% inhibition of infection or greater) is required to neutralize a viral particle of the present invention comprising a viral capsid protein comprising an amino acid sequence of a capsid protein of a non-primate AAV, a distant AAV, or a combination thereof, compared to a corresponding control viral particle (e.g., a viral particle of the present invention has an IC50 value that is at least 8 times greater than the value for the control viral particle). In some embodiments, at least 9 times more total IVIG or IgG (e.g., 50% inhibition of infection or greater) is required to neutralize a viral particle of the present invention comprising a viral capsid protein comprising an amino acid sequence of a capsid protein of a non-primate AAV, a distant AAV, or a combination thereof, compared to a corresponding control viral particle (e.g., a viral particle of the present invention has an IC50 value that is at least 9 times greater than the value for the control viral particle). In some embodiments, at least 10 times more total IVIG or IgG (e.g., 50% inhibition of infection or greater) is required to neutralize a viral particle of the present invention comprising a viral capsid protein comprising an amino acid sequence of a capsid protein of a non-primate AAV, a distant AAV, or a combination thereof, compared to a corresponding control viral particle (e.g., a viral particle of the present invention has an IC50 value that is at least 10 times greater than the value for the control viral particle). In some embodiments, at least 20 times more total IVIG or IgG (e.g., 50% inhibition of infection or greater) is required to neutralize a viral particle of the present invention comprising a viral capsid protein comprising an amino acid sequence of a capsid protein of a non-primate AAV, a distant AAV, or a combination thereof, compared to a corresponding control viral particle (e.g., a viral particle of the present invention has an IC50 value that is at least 20 times greater than the value for the control viral particle). In some embodiments, at least 30 times more total IVIG or IgG (e.g., 50% inhibition of infection or greater) is required to neutralize a viral particle of the present invention comprising a viral capsid protein comprising an amino acid sequence of a capsid protein of a non-primate AAV, a distant AAV, or a combination thereof, compared to a corresponding control viral particle (e.g., a viral particle of the present invention has an IC50 value that is at least 30 times greater than the value for the control viral particle). In some embodiments, at least 40 times more total IVIG or IgG (e.g., 50% inhibition of infection or greater) is required to neutralize a viral particle of the present invention comprising a viral capsid protein comprising an amino acid sequence of a capsid protein of a non-primate AAV, a distant AAV, or a combination thereof, compared to a corresponding control viral particle (e.g., a viral particle of the present invention has an IC50 value that is at least 40 times greater than the value for the control viral particle). In some embodiments, at least 50 times more total IVIG or IgG (e.g., 50% inhibition of infection or greater) is required to neutralize a viral particle of the present invention comprising a viral capsid protein comprising an amino acid sequence of a capsid protein of a non-primate AAV, a distant AAV, or a combination thereof, compared to a corresponding control viral particle (e.g., a viral particle of the present invention has an IC50 value that is at least 50 times greater than the value for the control viral particle). In some embodiments, at least 60 times more total IVIG or IgG (e.g., 50% inhibition of infection or greater) is required to neutralize a viral particle of the present invention comprising a viral capsid protein comprising an amino acid sequence of a capsid protein of a non-primate AAV, a distant AAV, or a combination thereof, compared to a corresponding control viral particle (e.g., a viral particle of the present invention has an IC50 value that is at least 60 times greater than the value for the control viral particle). In some embodiments, at least 70 times more total IVIG or IgG (e.g., 50% inhibition of infection or greater) is required to neutralize a viral particle of the present invention comprising a viral capsid protein comprising an amino acid sequence of a capsid protein of a non-primate AAV, a distant AAV, or a combination thereof, compared to a corresponding control viral particle (e.g., a viral particle of the present invention has an IC50 value that is at least 70 times greater than the value for the control viral particle). In some embodiments, at least 80 times more total IVIG or IgG (e.g., 50% inhibition of infection or greater) is required to neutralize a viral particle of the present invention comprising a viral capsid protein comprising an amino acid sequence of a capsid protein of a non-primate AAV, a distant AAV, or a combination thereof, compared to a corresponding control viral particle (e.g., a viral particle of the present invention has an IC50 value that is at least 80 times greater than the value for the control viral particle). In some embodiments, at least 90 times more total IVIG or IgG (e.g., 50% inhibition of infection or greater) is required to neutralize a viral particle of the present invention comprising a viral capsid protein comprising an amino acid sequence of a capsid protein of a non-primate AAV, a distant AAV, or a combination thereof, compared to a corresponding control viral particle (e.g., a viral particle of the present invention has an IC50 value that is at least 90 times greater than the value for the control viral particle). In some embodiments, at least 100-fold more total IVIG or IgG (e.g., 50% inhibition of infection or greater) is required to neutralize a viral particle of the present invention comprising a viral capsid protein comprising an amino acid sequence of an AAV capsid protein of a non-primate, a distant AAV, or a combination thereof, compared to a corresponding control viral particle (e.g., the viral particle of the present invention has an IC50 value that is at least 100-fold higher than the value of the control viral particle). In some embodiments, a viral particle of the present invention comprising a viral capsid protein comprising an amino acid sequence of an AAV capsid protein of a non-primate, a distant AAV, or a combination thereof has an undetectable IC50 when incubated with pooled human serum of at least 100; 10,000; 20,000; 30,000; 40,000; 50,000 or more human donors.
[00208] Нацеливающие лиганды[00208] Targeting ligands
[00209] Описанная в данном документе вирусная частица может дополнительно содержать нацеливающий лиганд.[00209] The viral particle described herein may further comprise a targeting ligand.
[00210] В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения, содержащих детектируемую метку, нацеливающий лиганд содержит полиспецифическую связывающую молекулу, содержащую (i) паратоп антитела, который специфически связывает детектируемую метку, и (ii) второй связывающий домен, который специфически связывает рецептор, который может быть конъюгирован с поверхностью гранулы (например, для очистки) или экспрессирован клеткой-мишенью. Соответственно, полиспецифическая связывающая молекула, содержащая (i) паратоп антитела, который специфически связывает детектируемую метку, и (ii) второй связывающий домен, который специфически связывает рецептор, нацеливает вирусную частицу. Такое «нацеливание» или «направление» может включать сценарий, при котором вирусная частица дикого типа нацеливается на несколько клеток в пределах ткани и/или несколько органов в пределах организма, при этом широкое нацеливание на ткань или органы снижено вплоть до устранения за счет вставки детектируемой метки, и это перенацеливание на более специфические клетки в ткани или более специфический орган в организме достигается с помощью полиспецифической связывающей молекулы. Такое перенацеливание или перенаправление может также включать сценарий, при котором вирусная частица дикого типа нацеливается на ткань, при этом нацеливание на ткань снижено вплоть до устранения за счет вставки детектируемой метки, и это перенацеливания на полностью другую ткань достигается с помощью полиспецифической связывающей молекулы. Паратоп антитела, описанный в данном документе, обычно содержит по меньшей мере определяющую комплементарность область (CDR), которая специфически распознает детектируемую метку, например область CDR3 вариабельного домена тяжелой и/или легкой цепи. В некоторых вариантах осуществления полиспецифическая связывающая молекула содержит антитело (или его часть), которое содержит паратоп антитела, который специфически связывает детектируемую метку. Например, поли специфическая связывающая молекула может содержать однодоменную вариабельную область тяжелой цепи или однодоменную вариабельную область легкой цепи, где однодоменная вариабельная область тяжелой цепи или однодоменная вариабельная область легкой цепи содержат паратоп антитела, который специфически связывает детектируемую метку. В некоторых вариантах осуществления полиспецифическая связывающая молекула может содержать Fv-область, например, полиспецифическая связывающая молекула может содержать scFv, содержащий паратоп антитела, который специфически связывает детектируемую метку. В некоторых вариантах осуществления полиспецифическая связывающая молекула, описанная в данном документе, содержит паратоп антитела, который специфически связывает c-myc (SEQ ID NO:44).[00210] In some embodiments of the present invention comprising a detectable label, the targeting ligand comprises a multispecific binding molecule comprising (i) an antibody paratope that specifically binds the detectable label, and (ii) a second binding domain that specifically binds a receptor that can be conjugated to the surface of the bead (e.g., for purification) or expressed by a target cell. Accordingly, a multispecific binding molecule comprising (i) an antibody paratope that specifically binds the detectable label and (ii) a second binding domain that specifically binds a receptor targets a viral particle. Such "targeting" or "directing" may include a scenario in which a wild-type viral particle is targeted to multiple cells within a tissue and/or multiple organs within an organism, wherein broad tissue or organ targeting is reduced to the point of being eliminated by insertion of a detectable label, and this retargeting to more specific cells within a tissue or a more specific organ within an organism is achieved by a multispecific binding molecule. Such retargeting or redirecting may also include a scenario in which a wild-type viral particle is targeted to a tissue, wherein tissue targeting is reduced to the point of being eliminated by insertion of a detectable label, and this retargeting to an entirely different tissue is achieved by a multispecific binding molecule. The antibody paratope described herein typically comprises at least a complementarity determining region (CDR) that specifically recognizes a detectable label, such as the CDR3 region of a heavy and/or light chain variable domain. In some embodiments, a multispecific binding molecule comprises an antibody (or a portion thereof) that comprises an antibody paratope that specifically binds a detectable label. For example, a multispecific binding molecule can comprise a single domain variable region of a heavy chain or a single domain variable region of a light chain, wherein the single domain variable region of a heavy chain or a single domain variable region of a light chain comprises an antibody paratope that specifically binds a detectable label. In some embodiments, a multispecific binding molecule can comprise an Fv region, for example, a multispecific binding molecule can comprise an scFv comprising an antibody paratope that specifically binds a detectable label. In some embodiments, a multispecific binding molecule described herein comprises an antibody paratope that specifically binds c-myc (SEQ ID NO:44).
[00211] Одним из вариантов осуществления настоящего изобретения является мультимерная структура, содержащая модифицированный вирусный капсидный белок по настоящему изобретению. Мультимерная структура содержит по меньшей мере 5, предпочтительно по меньшей мере 10, более предпочтительно по меньшей мере 30, наиболее предпочтительно по меньшей мере 60 модифицированных вирусных капсидных белков, содержащих первого партнера из специфической связывающейся пары, описанной в данном документе. Они могут образовывать правильные вирусные капсиды (пустые вирусные частицы) или вирусные частицы (капсиды, инкапсидирующие представляющий интерес нуклеотид). Образование вирусных частиц, содержащих вирусный геном, является весьма предпочтительным признаком для применения модифицированных вирусных капсидов, описанных в данном документе.[00211] One embodiment of the present invention is a multimeric structure comprising a modified viral capsid protein of the present invention. The multimeric structure comprises at least 5, preferably at least 10, more preferably at least 30, most preferably at least 60 modified viral capsid proteins comprising the first partner of the specific binding pair described herein. They can form proper viral capsids (empty viral particles) or viral particles (capsids encapsidating a nucleotide of interest). The formation of viral particles containing the viral genome is a highly preferred feature for the use of the modified viral capsids described herein.
[00212] Еще одним вариантом осуществления настоящего изобретения является применение по меньшей мере одного модифицированного вирусного капсидного белка и/или кодирующей его нуклеиновой кислоты, предпочтительно по меньшей мере одной мультимерной структуры (например, вирусной частицы) для изготовления и применения при переносе представляющего интерес нуклеотида в клетку-мишень.[00212] Another embodiment of the present invention is the use of at least one modified viral capsid protein and/or nucleic acid encoding it, preferably at least one multimeric structure (eg, a viral particle) for the manufacture and use in the transfer of a nucleotide of interest into a target cell.
[00213] Способы применения и получения[00213] Methods of use and production
[002I4] Дополнительным вариантом осуществления модифицированных вирусных капсидных белков, описанных в данном документе, является их применение для доставки представляющего интерес нуклеотида, например репортерного гена или терапевтического гена, в клетку-мишень. Обычно представляющим интерес нуклеотидом может быть плазмида-переносчик, которая обычно может содержать последовательности инвертированных 5'- и 3'-концевых повторов (ITR), фланкирующие репортерный(-ые) ген(-ы) или терапевтический(-ие) ген(ы), которые могут находиться под контролем вирусного или невирусного промотора, когда она заключена в частицу AAV. В одном из вариантов осуществления представляющий интерес нуклеотид представляет собой плазмиду-переносчика, содержащую в направлении от 5' к 3': 5'-ITR, промотор, ген (например, репортерный и/или терапевтический ген) и 3'-ITR.[002I4] An additional embodiment of the modified viral capsid proteins described herein is their use to deliver a nucleotide of interest, such as a reporter gene or a therapeutic gene, to a target cell. Typically, the nucleotide of interest may be a transfer plasmid, which may typically contain 5' and 3' inverted terminal repeat (ITR) sequences flanking the reporter gene(s) or therapeutic gene(s), which may be under the control of a viral or non-viral promoter when contained in an AAV particle. In one embodiment, the nucleotide of interest is a transfer plasmid comprising, in 5' to 3' direction: a 5' ITR, a promoter, a gene (e.g., a reporter and/or therapeutic gene), and a 3' ITR.
[002I5] Неограничивающие примеры применимых промоторов включают, например, промотор цитомегаловируса (CMV), промотор вируса некроза селезенки (SFFV), промотор фактора элонгации 1 альфа (EF1a) (промотор EF1a 1,2 т.о. или промотор EF1a 0,2 т.о.), химерный промотор EF1 a/IF4 и фосфоглицераткиназный (PGK) промотор. Для увеличения экспрессии представляющего интерес гена в составе вирусной конструкции также может присутствовать внутренний энхансер. Например, можно применять энхансер CMV (Karasuyama et al. 1989. J. Exp. Med. 169:13, который включен в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте). В некоторых вариантах осуществления энхансер CMV можно применять в комбинации с промотором гена (3-актина курицы.[002I5] Non-limiting examples of useful promoters include, for example, the cytomegalovirus (CMV) promoter, the spleen necrosis virus (SFFV) promoter, the elongation factor 1 alpha (EF1a) promoter (EF1a 1.2 kb promoter or EF1a 0.2 kb promoter), the EF1 a/IF4 chimeric promoter, and the phosphoglycerate kinase (PGK) promoter. An internal enhancer can also be present in the viral construct to increase expression of the gene of interest. For example, the CMV enhancer (Karasuyama et al. 1989. J. Exp. Med. 169:13, which is incorporated herein by reference in its entirety) can be used. In some embodiments, the CMV enhancer can be used in combination with the chicken 3-actin gene promoter.
[00216] Разнообразные репортерные гены (или детектируемые фрагменты) можно инкапсидировать в мультимерную структуру, содержащую модифицированные вирусные капсидные белки, описанные в данном документе. Иллюстративные репортерные гены включают, например, β-галактозидазу (кодируемую геном lacZ), зеленый флуоресцентный белок (GFP), усиленный зеленый флуоресцентный белок (eGFP), MmGFP, синий флуоресцентный белок (BFP), усиленный синий флуоресцентный белок (eBFP), mPlum, mCherry, tdTomato, mStrawberry, J-Red, DsRed, mOrange, mKO, mCitrine, Venus, YPet, желтый флуоресцентный белок (YFP), усиленный желтый флуоресцентный белок (eYFP), Emerald, CyPet, голубой флуоресцентный белок (CFP), Cerulean, Т-Sapphire, люциферазу, щелочную фосфатазу или их комбинацию. Способы, описанные в данном документе, демонстрируют конструирование нацеливающих частиц, при котором подразумевается применение репортерного гена, который кодирует зеленый флуоресцентный белок, однако специалисты в данной области техники после прочтении данного раскрытия поймут, что описанные в данном документе вирусные капсиды можно получить в отсутствие репортерного гена или с любым репортерным геном, известным в данной области техники.[00216] A variety of reporter genes (or detectable fragments) can be encapsidated into a multimeric structure containing the modified viral capsid proteins described herein. Exemplary reporter genes include, for example, β-galactosidase (encoded by the lacZ gene), green fluorescent protein (GFP), enhanced green fluorescent protein (eGFP), MmGFP, blue fluorescent protein (BFP), enhanced blue fluorescent protein (eBFP), mPlum, mCherry, tdTomato, mStrawberry, J-Red, DsRed, mOrange, mKO, mCitrine, Venus, YPet, yellow fluorescent protein (YFP), enhanced yellow fluorescent protein (eYFP), Emerald, CyPet, cyan fluorescent protein (CFP), Cerulean, T-Sapphire, luciferase, alkaline phosphatase, or a combination thereof. The methods described herein demonstrate the construction of targeting particles that involve the use of a reporter gene that encodes a green fluorescent protein, however, those skilled in the art, upon reading this disclosure, will appreciate that the viral capsids described herein can be produced in the absence of a reporter gene or with any reporter gene known in the art.
[00217] Разнообразные терапевтические гены также можно инкапсидировать в мультимерную структуру, содержащую модифицированные вирусные капсидные белки, описанные в данном документе, например, как часть частицы для переноса. Неограничивающие примеры терапевтического гена включают гены, которые кодируют токсин (например, суицидный ген), терапевтическое антитело или его фрагмент, систему CFJSPR/Cas или ее часть(-и), антисмысловую РНК, siRNA, shRNA и т.д.[00217] A variety of therapeutic genes can also be encapsidated into a multimeric structure comprising the modified viral capsid proteins described herein, such as part of a delivery particle. Non-limiting examples of a therapeutic gene include genes that encode a toxin (e.g., a suicide gene), a therapeutic antibody or fragment thereof, a CFJSPR/Cas system or portion(s) thereof, antisense RNA, siRNA, shRNA, etc.
[00218] Дополнительным вариантом осуществления настоящего изобретения является способ получения модифицированного капсидного белка, причем способ предусматривает стадии:[00218] A further embodiment of the present invention is a method for producing a modified capsid protein, the method comprising the steps of:
a) осуществления экспрессии нуклеиновой кислоты, кодирующей модифицированный капсидный белок, в подходящих условиях, иa) expressing a nucleic acid encoding a modified capsid protein under suitable conditions, and
b) выделение капсидного белка, экспрессированного на стадии а).b) isolation of the capsid protein expressed in step a).
[00219] В некоторых вариантах осуществления вирусная частица, описанная в данном документе, содержит мозаичный капсид, например, капсид, содержащий капсидные белки, генетически модифицированные, как описано в данном документе (в отсутствие или в присутствии ковалентной связи с нацеливающим лигандом), при определенном соотношении с эталонными капсидными белками. Способ получения такой мозаичной вирусной частицы предусматривает:[00219] In some embodiments, a viral particle described herein comprises a mosaic capsid, e.g., a capsid comprising capsid proteins genetically modified as described herein (in the absence or presence of a covalent bond to a targeting ligand), in a certain ratio to reference capsid proteins. A method for producing such a mosaic viral particle comprises:
a) осуществление экспрессии нуклеиновой кислоты, кодирующей модифицированный капсидный белок, и нуклеотида, кодирующего эталонный капсидный белок, при соотношении (вес/вес), составляющем от по меньшей мере приблизительно 60:1 до приблизительно 1:60, например 2:1, 1:1, 3:5,1:2, 1:3 и т.д. в подходящих условиях иa) expressing a nucleic acid encoding a modified capsid protein and a nucleotide encoding a reference capsid protein in a ratio (weight/weight) of at least about 60:1 to about 1:60, such as 2:1, 1:1, 3:5, 1:2, 1:3, etc. under suitable conditions, and
b) выделение капсидного белка, экспрессированного на стадии а).b) isolation of the capsid protein expressed in step a).
[00220] В некоторых вариантах осуществления композиция, описанная в данном документе, содержит или способ, описанный в данном документе, объединяет модифицированный ген cap: эталонный ген cap (или комбинацию эталонных генов cap) при соотношении, которое находится в диапазоне от по меньшей мере приблизительно 1:60 до приблизительно 60:1, например 2:1, 1:1, 3:5, 1:2, 1:3 и т.д. В некоторых вариантах осуществления соотношение составляет по меньшей мере приблизительно 1:2. В некоторых вариантах осуществления соотношение составляет по меньшей мере приблизительно 1:3. В некоторых вариантах осуществления соотношение составляет по меньшей мере приблизительно 1:4. В некоторых вариантах осуществления соотношение составляет по меньшей мере приблизительно 1:5. В некоторых вариантах осуществления соотношение составляет по меньшей мере приблизительно 1:6. В некоторых вариантах осуществления соотношение составляет по меньшей мере приблизительно 1:7. В некоторых вариантах осуществления соотношение составляет по меньшей мере приблизительно 1:8. В некоторых вариантах осуществления соотношение составляет по меньшей мере приблизительно 1:9. В некоторых вариантах осуществления соотношение составляет по меньшей мере приблизительно 1:10. В некоторых вариантах осуществления соотношение составляет по меньшей мере приблизительно 1:11. В некоторых вариантах осуществления соотношение составляет по меньшей мере приблизительно 1:12. В некоторых вариантах осуществления соотношение составляет по меньшей мере приблизительно 1:13. В некоторых вариантах осуществления соотношение составляет по меньшей мере приблизительно 1:14. В некоторых вариантах осуществления соотношение составляет по меньшей мере приблизительно 1:15. В некоторых вариантах осуществления соотношение составляет по меньшей мере приблизительно 1:16. В некоторых вариантах осуществления соотношение составляет по меньшей мере приблизительно 1:17. В некоторых вариантах осуществления соотношение составляет по меньшей мере приблизительно 1:18. В некоторых вариантах осуществления соотношение составляет по меньшей мере приблизительно 1:19. В некоторых вариантах осуществления соотношение составляет по меньшей мере приблизительно 1:20. В некоторых вариантах осуществления соотношение составляет по меньшей мере приблизительно 1:25. В некоторых вариантах осуществления соотношение составляет по меньшей мере приблизительно 1:30. В некоторых вариантах осуществления соотношение составляет по меньшей мере приблизительно 1:35. В некоторых вариантах осуществления соотношение составляет по меньшей мере приблизительно 1:40. В некоторых вариантах осуществления соотношение составляет по меньшей мере приблизительно 1:45. В некоторых вариантах осуществления соотношение составляет по меньшей мере приблизительно 1:50. В некоторых вариантах осуществления соотношение составляет по меньшей мере приблизительно 1:55. В некоторых вариантах осуществления соотношение составляет по меньшей мере приблизительно 1:60. В некоторых вариантах осуществления соотношение составляет по меньшей мере приблизительно 2:1. В некоторых вариантах осуществления соотношение составляет по меньшей мере приблизительно 3:1. В некоторых вариантах осуществления соотношение составляет по меньшей мере приблизительно 4:1. В некоторых вариантах осуществления соотношение составляет по меньшей мере приблизительно 5:1. В некоторых вариантах осуществления соотношение составляет по меньшей мере приблизительно 6:1. В некоторых вариантах осуществления соотношение составляет по меньшей мере приблизительно 7:1. В некоторых вариантах осуществления соотношение составляет по меньшей мере приблизительно 8:1. В некоторых вариантах осуществления соотношение составляет по меньшей мере приблизительно 9:1. В некоторых вариантах осуществления соотношение составляет по меньшей мере приблизительно 10:1. В некоторых вариантах осуществления соотношение составляет по меньшей мере приблизительно 11:1. В некоторых вариантах осуществления соотношение составляет по меньшей мере приблизительно 12:1. В некоторых вариантах осуществления соотношение составляет по меньшей мере приблизительно 13:1. В некоторых вариантах осуществления соотношение составляет по меньшей мере приблизительно 14:1. В некоторых вариантах осуществления соотношение составляет по меньшей мере приблизительно 15:1. В некоторых вариантах осуществления соотношение составляет по меньшей мере приблизительно 16:1. В некоторых вариантах осуществления соотношение составляет по меньшей мере приблизительно 17:1. В некоторых вариантах осуществления соотношение составляет по меньшей мере приблизительно 18:1. В некоторых вариантах осуществления соотношение составляет по меньшей мере приблизительно 19:1. В некоторых вариантах осуществления соотношение составляет по меньшей мере приблизительно 20:1. В некоторых вариантах осуществления соотношение составляет по меньшей мере приблизительно 25:1. В некоторых вариантах осуществления соотношение составляет по меньшей мере приблизительно 30:1. В некоторых вариантах осуществления соотношение составляет по меньшей мере приблизительно 35:1. В некоторых вариантах осуществления соотношение составляет по меньшей мере приблизительно 40:1. В некоторых вариантах осуществления соотношение составляет по меньшей мере приблизительно 45:1. В некоторых вариантах осуществления соотношение составляет по меньшей мере приблизительно 50:1. В некоторых вариантах осуществления соотношение составляет по меньшей мере приблизительно 55:1. В некоторых вариантах осуществления соотношение составляет по меньшей мере приблизительно 60:1.[00220] In some embodiments, a composition described herein comprises or a method described herein combines a modified cap gene: a reference cap gene (or a combination of reference cap genes) in a ratio that ranges from at least about 1:60 to about 60:1, such as 2:1, 1:1, 3:5, 1:2, 1:3, etc. In some embodiments, the ratio is at least about 1:2. In some embodiments, the ratio is at least about 1:3. In some embodiments, the ratio is at least about 1:4. In some embodiments, the ratio is at least about 1:5. In some embodiments, the ratio is at least about 1:6. In some embodiments, the ratio is at least about 1:7. In some embodiments, the ratio is at least about 1:8. In some embodiments, the ratio is at least about 1:9. In some embodiments, the ratio is at least about 1:10. In some embodiments, the ratio is at least about 1:11. In some embodiments, the ratio is at least about 1:12. In some embodiments, the ratio is at least about 1:13. In some embodiments, the ratio is at least about 1:14. In some embodiments, the ratio is at least about 1:15. In some embodiments, the ratio is at least about 1:16. In some embodiments, the ratio is at least about 1:17. In some embodiments, the ratio is at least about 1:18. In some embodiments, the ratio is at least about 1:19. In some embodiments, the ratio is at least about 1:20. In some embodiments, the ratio is at least about 1:25. In some embodiments, the ratio is at least about 1:30. In some embodiments, the ratio is at least about 1:35. In some embodiments, the ratio is at least about 1:40. In some embodiments, the ratio is at least about 1:45. In some embodiments, the ratio is at least about 1:50. In some embodiments, the ratio is at least about 1:55. In some embodiments, the ratio is at least about 1:60. In some embodiments, the ratio is at least about 2:1. In some embodiments, the ratio is at least about 3:1. In some embodiments, the ratio is at least about 4:1. In some embodiments, the ratio is at least about 5:1. In some embodiments, the ratio is at least about 6:1. In some embodiments, the ratio is at least about 7:1. In some embodiments, the ratio is at least about 8:1. In some embodiments, the ratio is at least about 9:1. In some embodiments, the ratio is at least about 10:1. In some embodiments, the ratio is at least about 11:1. In some embodiments, the ratio is at least about 12:1. In some embodiments, the ratio is at least about 13:1. In some embodiments, the ratio is at least about 14:1. In some embodiments, the ratio is at least about 15:1. In some embodiments, the ratio is at least about 16:1. In some embodiments, the ratio is at least about 17:1. In some embodiments, the ratio is at least about 18:1. In some embodiments, the ratio is at least about 19:1. In some embodiments, the ratio is at least about 20:1. In some embodiments, the ratio is at least about 25:1. In some embodiments, the ratio is at least about 30:1. In some embodiments, the ratio is at least about 35:1. In some embodiments, the ratio is at least about 40:1. In some embodiments, the ratio is at least about 45:1. In some embodiments, the ratio is at least about 50:1. In some embodiments, the ratio is at least about 55:1. In some embodiments, the ratio is at least about 60:1.
[00221] В некоторых вариантах осуществления соотношения белковых субъединиц VP в мозаичной вирусной частице может, но не обязательно, стехиометрически отражать соотношение модифицированный ген cap:эталонный ген cap.В качестве неограничивающего иллюстративного варианта осуществления можно считать, но не обязательно, что мозаичный капсид, образованный в соответствии со способом, характеризуется соотношением модифицированный капсидный белок:эталонный капсидный белок, аналогичным соотношению (вес:вес) кодирующих их нуклеиновых кислот, применяемых для получения мозаичного капсида. В некоторых вариантах осуществления мозаичный капсид содержит соотношение белковых субъединиц, составляющее от приблизительно 1:59 до приблизительно 59:1.[00221] In some embodiments, the ratio of VP protein subunits in a mosaic virus particle may, but need not, stoichiometrically reflect the ratio of modified cap gene:reference cap gene. As a non-limiting illustrative embodiment, it may, but need not, be considered that the mosaic capsid formed according to the method has a ratio of modified capsid protein:reference capsid protein that is similar to the ratio (weight:weight) of the nucleic acids encoding them used to produce the mosaic capsid. In some embodiments, the mosaic capsid comprises a ratio of protein subunits that is from about 1:59 to about 59:1.
[00222] Дополнительные варианты осуществления настоящего изобретения представляют собой способ изменения тропизма вируса, при этом способ предусматривает стадии (а) осуществления вставки нуклеиновой кислоты, кодирующей аминокислотную последовательность, в последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую вирусный капсидный белок, с образованием нуклеотидной последовательности, кодирующей генетически модифицированный капсидный белок, содержащий аминокислотную последовательность, и/или (b) культивирования упаковывающей клетки в условиях, достаточных для продуцирования вирусных частиц, где упаковывающая клетка содержит нуклеиновую кислоту. Дополнительный вариант осуществления настоящего изобретения представляет собой способ отображения нацеливающего лиганда на поверхности капсидного белка, при этом способ предусматривает стадии (а) осуществления экспрессии нуклеиновой кислоты, кодирующей модифицированный вирусный капсидный белок, описанный в данном документе (и необязательно с нуклеотидом, кодирующим эталонный капсидный белок), в подходящих условиях, где нуклеиновая кислота кодирует капсидный белок, содержащий первого партнера из специфической связывающейся пары, (b) выделения капсидного белка, содержащего первого партнера из специфической связывающейся пары, экспрессированного на стадии (а), или содержащего его капсида, и (с) инкубации капсидного белка или капсида со вторым когнатным партнером из специфической связывающейся пары в условиях, подходящих для обеспечения образования изопептидной связи между первым и вторым партнером, где второй когнатный партнер из специфической связывающейся пары слит с нацеливающим лигандом.[00222] Further embodiments of the present invention are a method of altering the tropism of a virus, the method comprising the steps of (a) inserting a nucleic acid encoding an amino acid sequence into a nucleic acid sequence encoding a viral capsid protein to form a nucleotide sequence encoding a genetically modified capsid protein comprising the amino acid sequence, and/or (b) culturing a packaging cell under conditions sufficient to produce viral particles, wherein the packaging cell comprises the nucleic acid. A further embodiment of the present invention is a method for displaying a targeting ligand on the surface of a capsid protein, the method comprising the steps of (a) expressing a nucleic acid encoding a modified viral capsid protein as described herein (and optionally with a nucleotide encoding a reference capsid protein) under suitable conditions, wherein the nucleic acid encodes a capsid protein comprising a first partner of a specific binding pair, (b) isolating a capsid protein comprising the first partner of a specific binding pair expressed in step (a) or a capsid comprising it, and (c) incubating the capsid protein or capsid with a second cognate partner of a specific binding pair under conditions suitable to allow the formation of an isopeptide bond between the first and second partner, wherein the second cognate partner of a specific binding pair is fused to the targeting ligand.
[00223] В некоторых вариантах осуществления упаковывающая клетка дополнительно содержит плазмиду-помощника и/или плазмиду-переносчика, содержащую представляющий интерес нуклеотид. В некоторых вариантах осуществления способы дополнительно предусматривают выделение самокомплементарных аденоассоциированных вирусных частиц из культурального супернатанта. В некоторых вариантах осуществления способы дополнительно предусматривают осуществление лизиса упаковывающей клетки и выделение частиц на основе однонитевого аденоассоциированного вируса из клеточного лизата. В некоторых вариантах осуществления способы дополнительно предусматривают (а) удаление клеточного дебриса, (b) обработку супернатанта, содержащего вирусные частицы, нуклеазами, например ДНКазой I, и MgCl2, (с) концентрирование вирусных частиц, (d) очистку вирусных частиц и (е) любую комбинацию (a)-(d).[00223] In some embodiments, the packaging cell further comprises a helper plasmid and/or a transfer plasmid comprising a nucleotide of interest. In some embodiments, the methods further comprise isolating the self-complementary adeno-associated virus particles from the culture supernatant. In some embodiments, the methods further comprise lysing the packaging cell and isolating the single-stranded adeno-associated virus particles from the cell lysate. In some embodiments, the methods further comprise (a) removing cellular debris, (b) treating the supernatant containing the viral particles with nucleases, such as DNase I, and MgCl 2 , (c) concentrating the viral particles, (d) purifying the viral particles, and (e) any combination of (a)-(d).
[00224] Упаковывающие клетки, применимые для продуцирования вирусных частиц, описанных в данном документе, включают, например, клетки животных, пермиссивные для вируса, или клетки, модифицированные, чтобы быть пермиссивными для вируса; или предусматривают введение конструкции для упаковывающей клетки, например, с применением трансформирующего средства, такого как фосфат кальция. Неограничивающие примеры линий упаковывающих клеток, применимых для продуцирования вирусных частиц, описанных в данном документе, включают, например, эмбриональные клетки почки человека 293 (HEK-293) (например, под № Американской коллекции типовых культур [АТСС] CRL-I573), клетки HEK-293, которые содержат большой Т-антиген SV40 (HEK-293Т или 293Т), клетки HEK293T/17, линию клеток саркомы человека НТ-1080 (CCL-121), линию лимфобластоподобных клеток Raji (CCL-86), линию эпителиоподобных клеток из глиобластомы-астроцитомы U87-MG (НТВ-I4), линию клеток Т-лимфомы HuT78 (TIB-161), клетки NIH/3T3, клетки яичника китайского хомячка (СНО) (например, под №№ АТСС CRL9618, CCL61, CRL9096), клетки HeLa (например, № АТСС CCL-2), клетки Vero, клетки NIH 3Т3 (например, № АТСС CRL-1658), клетки Huh-7, клетки BHK (например, № АТСС CCL10), клетки PC12 (№ АТСС CRL1721), клетки COS, клетки COS-7 (№ АТСС CRL1651), клетки RATI, мышиные L-клетки (№ АТСС CCLI.3), клетки HLHepG2, клетки САР, клетки САР-Т и т.п.,[00224] Packaging cells useful for producing the viral particles described herein include, for example, animal cells that are permissive for the virus, or cells modified to be permissive for the virus; or provide for the introduction of a construct to the packaging cell, for example, using a transforming agent such as calcium phosphate. Non-limiting examples of packaging cell lines useful for producing the viral particles described herein include, for example, human embryonic kidney 293 (HEK-293) cells (e.g., American Type Culture Collection [ATCC] CRL-I573), HEK-293 cells that contain the SV40 large T antigen (HEK-293T or 293T), HEK293T/17 cells, the human sarcoma cell line HT-1080 (CCL-121), the Raji lymphoblast-like cell line (CCL-86), the U87-MG glioblastoma-astrocytoma epithelial-like cell line (HTB-I4), the HuT78 T lymphoma cell line (TIB-161), NIH/3T3 cells, Chinese hamster ovary (CHO) cells (e.g., ATCC Nos. CRL9618, CCL61, CRL9096), HeLa cells (e.g., ATCC No. CCL-2), Vero cells, NIH 3T3 cells (e.g., ATCC No. CRL-1658), Huh-7 cells, BHK cells (e.g., ATCC No. CCL10), PC12 cells (ATCC No. CRL1721), COS cells, COS-7 cells (ATCC No. CRL1651), RATI cells, mouse L cells (ATCC No. CCLI.3), HLHepG2 cells, CAP cells, CAP-T cells, etc.,
[00225] клетки L929, система на основе упаковывающих клеток для вирусов FLY, описанная в Cosset et al. (1995) J. Virol 69, 7430-7436, клетки NSO (мышиная миелома), человеческие амниоциты (например, САР, САР-Т), дрожжевые клетки (в том числе без ограничения S. cerevisiae, Pichia pastoris), растительные клетки (в том числе без ограничения клетки табака NT1, BY-2), клетки насекомых (в том числе без ограничения SF9, S2, SF21, Tni (например, High 5)) или бактериальные клетки (в том числе без ограничения Е. coli).[00225] L929 cells, the FLY virus packaging cell system described in Cosset et al. (1995) J. Virol 69, 7430-7436, NSO (murine myeloma) cells, human amniocytes (e.g., CAP, CAP-T), yeast cells (including but not limited to S. cerevisiae, Pichia pastoris), plant cells (including but not limited to tobacco NT1, BY-2 cells), insect cells (including but not limited to SF9, S2, SF21, Tni (e.g., High 5)) or bacterial cells (including but not limited to E. coli).
[00226] Дополнительную информацию об упаковывающих клетках и системах, методиках упаковки и частицах для упаковки генома в виде нуклеиновой кислоты в псевдотипированную вирусную частицу см., например, Polo et al., Proc Natl Acad Sci USA, (1999) 96:4598-4603. Способы упаковки предусматривают применение упаковывающих клеток, которые постоянно экспрессируют вирусные компоненты, или путем временной трансфекции клеток плазмидами.[00226] For additional information on packaging cells and systems, packaging techniques, and particles for packaging the genome as nucleic acid into a pseudotyped viral particle, see, for example, Polo et al., Proc Natl Acad Sci USA, (1999) 96:4598-4603. Packaging methods include the use of packaging cells that continuously express viral components, or by transiently transfecting cells with plasmids.
[00227] Дополнительные варианты осуществления включают способы перенаправления вируса и/или доставки репортерного или терапевтического гена в клетку-мишень, при этом способ предусматривает способ трансдукции клеток п vitro (например, ex vivo) или in vivo, при этом способ предусматривает стадии приведения клетки-мишени в контакт с вирусной частицей, содержащей капсид, описанный в данном документе, где капсид содержит нацеливающий лиганд, который специфически связывает рецептор, экспрессируемый клеткой-мишенью. В некоторых вариантах осуществления клетка-мишень находится в условиях in vitro (например, ex vivo). В других вариантах осуществления клетка-мишень находится in vivo в субъекте, например человеке.[00227] Additional embodiments include methods of redirecting a virus and/or delivering a reporter or therapeutic gene to a target cell, wherein the method comprises a method of transducing cells in vitro (e.g., ex vivo) or in vivo, wherein the method comprises the steps of contacting the target cell with a viral particle comprising a capsid described herein, wherein the capsid comprises a targeting ligand that specifically binds a receptor expressed by the target cell. In some embodiments, the target cell is in vitro (e.g., ex vivo). In other embodiments, the target cell is in vivo in a subject, such as a human.
[00228] Клетки-мишени[00228] Target cells
[00229] На самые разнообразные клетки могут служить мишенью для доставки представляющего интерес нуклеотида с использованием модифицированной вирусной частицы, раскрытой в данном документе. Обычно клетки-мишени будут выбирать, исходя из представляющего интерес нуклеотида и требуемого эффекта.[00229] A wide variety of cells can be targeted for delivery of a nucleotide of interest using the modified viral particle disclosed herein. Typically, target cells will be selected based on the nucleotide of interest and the desired effect.
[00230] В некоторых вариантах осуществления представляющий интерес нуклеотид может доставляться для обеспечения способности клетки-мишени продуцировать белок, который восполняет дефицит в организме, такой как ферментативный дефицит или иммунный дефицит, такой как тяжелый комбинированный иммунодефицит, сцепленный с Х-хромосомой. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления мишенями служат клетки, которые в норме будут продуцировать белок у животного. В других вариантах осуществления мишенями служат клетки в участке тела, в котором белок был бы наиболее полезен.[00230] In some embodiments, a nucleotide of interest may be delivered to enable a target cell to produce a protein that corrects a deficiency in the body, such as an enzymatic deficiency or an immune deficiency, such as X-linked severe combined immunodeficiency. Thus, in some embodiments, the targets are cells that would normally produce the protein in an animal. In other embodiments, the targets are cells in a region of the body where the protein would be most useful.
[00231] В других вариантах осуществления представляющий интерес нуклеотид, такой как ген, кодирующий siRNA, может подавлять экспрессию конкретного гена в клетке-мишени. Например, представляющий интерес нуклеотид может подавлять экспрессию гена, вовлеченного в жизненный цикл патогена. Таким образом, могут служить мишенью клетки, восприимчивые к инфицированию патогеном или инфицированные патогеном. В других вариантах осуществления представляющий интерес нуклеотид может подавлять экспрессию гена, который отвечает за продуцирование токсина в клетке-мишени.[00231] In other embodiments, a nucleotide of interest, such as a gene encoding an siRNA, may suppress the expression of a particular gene in a target cell. For example, a nucleotide of interest may suppress the expression of a gene involved in the life cycle of a pathogen. Thus, cells susceptible to infection by a pathogen or infected by a pathogen may be targeted. In other embodiments, a nucleotide of interest may suppress the expression of a gene that is responsible for the production of a toxin in a target cell.
[00232] В других вариантах осуществления представляющий интерес нуклеотид может кодировать токсичный белок, который приводит к гибели клеток, в которых он экспрессируется. В данном случае мишенями могут служить опухолевые клетки или другие нежелательные клетки.[00232] In other embodiments, the nucleotide of interest may encode a toxic protein that causes death of the cells in which it is expressed. In this case, the targets may be tumor cells or other unwanted cells.
[00233] В еще одних вариантах осуществления представляющий интерес нуклеотид кодирует терапевтический белок.[00233] In yet other embodiments, the nucleotide of interest encodes a therapeutic protein.
[00234] После идентификации конкретной популяции клеток-мишеней, в которых требуется экспрессия представляющего интерес нуклеотида, выбирают рецептор-мишень, который специфически экспрессируется на данной популяции клеток-мишеней. Рецептор-мишень может экспрессироваться исключительно на данной популяции клеток или в большей степени на данной популяции клеток по сравнению с другими популяциями клеток. Чем более специфической является экспрессия, тем более специфически доставка может быть направлена в клетки-мишени. В зависимости от контекста требуемый уровень специфичности маркера (и, следовательно, генной доставки) может варьироваться. Например, в случае введения токсичного гена высокая специфичность наиболее предпочтительна, чтобы избежать гибели нецелевых клеток. В случае экспрессии белка для сбора или экспрессии секретируемого продукта, когда требуется глобальное воздействие, может быть необходима меньшая специфичность маркера.[00234] Once a particular target cell population in which expression of the nucleotide of interest is desired is identified, a target receptor that is specifically expressed on that target cell population is selected. The target receptor may be expressed exclusively on that cell population or to a greater extent on that cell population compared to other cell populations. The more specific the expression, the more specifically the delivery can be directed to the target cells. Depending on the context, the level of specificity of the marker (and hence gene delivery) required may vary. For example, in the case of introducing a toxic gene, high specificity is most preferred to avoid killing non-target cells. In the case of expressing a protein for harvesting or expressing a secreted product where global action is desired, less specificity of the marker may be needed.
[00235] Как обсуждалось выше, рецептор-мишень может представлять собой любой рецептор, для которого можно идентифицировать или создать нацеливающего лиганда. Предпочтительно рецептор-мишень представляет собой пептид или полипептид, такой как рецептор. Однако в других вариантах осуществления рецептор-мишень может представлять собой углевод или другую молекулу, которую может распознавать партнер по связыванию. Если партнер по связыванию, например лиганд, для рецептора-мишени уже известен, его можно использовать в качестве аффинной молекулы. Однако если связывающая молекула неизвестна, можно получить антитела к рецептору-мишени с применением стандартных процедур. Затем антитела можно применять в качестве нацеливающего лиганда.[00235] As discussed above, the target receptor can be any receptor for which a targeting ligand can be identified or created. Preferably, the target receptor is a peptide or polypeptide, such as a receptor. However, in other embodiments, the target receptor can be a carbohydrate or other molecule that can be recognized by the binding partner. If a binding partner, such as a ligand, for the target receptor is already known, it can be used as an affinity molecule. However, if the binding molecule is unknown, antibodies to the target receptor can be produced using standard procedures. The antibodies can then be used as a targeting ligand.
[00236] Таким образом, клетки-мишени можно выбрать, исходя из множества факторов, в том числе, например, (1) применения (например, терапия, экспрессия белка, подлежащего сбору, и придание устойчивости к заболеванию) и (2) экспрессии маркера с требуемой величиной специфичности.[00236] Thus, target cells can be selected based on a variety of factors, including, for example, (1) the application (e.g., therapy, expression of the protein to be harvested, and conferring resistance to disease) and (2) expression of a marker with a desired amount of specificity.
[00237] Клетки-мишени никоим образом не ограничены и включают как клетки и линии клеток зародышевой линии, так и соматические клетки и линии клеток. Клетки-мишени могут быть стволовыми клетками любого происхождения. Если клетки-мишени представляют собой клетки зародышевой линии, то клетки-мишени предпочтительно выбирают из группы, состоящей из одноклеточных эмбрионов и эмбриональных стволовых клеток (ES).[00237] The target cells are in no way limited and include both germline cells and cell lines and somatic cells and cell lines. The target cells may be stem cells of any origin. If the target cells are germline cells, the target cells are preferably selected from the group consisting of single-cell embryos and embryonic stem (ES) cells.
[00238] Фармацевтические композиции, лекарственные формы и введение[00238] Pharmaceutical compositions, dosage forms and administration
[00239] Дополнительный вариант осуществления предусматривает лекарственный препарат, содержащий по меньшей мере один модифицированный вирусный капсидный белок и соответствующий нацеливающий лиганд по настоящему изобретению и/или нуклеиновую кислоту по настоящему изобретению. Предпочтительно такой лекарственный препарат применим в качестве частицы для переноса генов.[00239] A further embodiment provides a medicament comprising at least one modified viral capsid protein and a corresponding targeting ligand of the present invention and/or a nucleic acid of the present invention. Preferably, such a medicament is useful as a gene transfer particle.
[00240] Также в данном документе раскрыты фармацевтические композиции, содержащие вирусные частицы, описанные в данном документе, и фармацевтически приемлемый носитель и/или вспомогательное вещество. Кроме того, в данном документе раскрыты фармацевтические лекарственные формы, содержащие вирусную частицу, описанную в данном документе.[00240] Also disclosed herein are pharmaceutical compositions comprising the viral particles described herein and a pharmaceutically acceptable carrier and/or excipient. In addition, disclosed herein are pharmaceutical dosage forms comprising the viral particle described herein.
[00241] Как обсуждается в данном документе, вирусные частицы, описанные в данном документе, можно использовать для различных терапевтических вариантов применения (in vivo и ex vivo) и в качестве инструментов для исследования.[00241] As discussed herein, the viral particles described herein can be used for a variety of therapeutic applications (in vivo and ex vivo) and as research tools.
[00242] Фармацевтические композиции на основе вирусных частиц, раскрытых в данном документе, могут быть составлены любым общепринятым способом с использованием одного или более физиологически приемлемых носителей и/или вспомогательных веществ. Вирусные частицы могут быть составлены для введения, например, путем инъекции, ингаляции или инсуляции (либо через рот, либо через нос), либо путем перорального, трансбуккального, парентерального или ректального введения, либо путем введения непосредственно в опухоль.[00242] The pharmaceutical compositions based on the viral particles disclosed herein can be formulated by any conventional method using one or more physiologically acceptable carriers and/or excipients. The viral particles can be formulated for administration, for example, by injection, inhalation or insulation (either through the mouth or through the nose), or by oral, buccal, parenteral or rectal administration, or by administration directly into the tumor.
[00243] Фармацевтические композиции могут быть составлены для различных способов введения, в том числе системного, местного или локального введения. Методики и составы можно найти, например, в Remrnington's Pharmaceutical Sciences, Meade Publishing Co., Easton, Pa. Для системного введения предпочтительна инъекция, в том числе внутримышечная, внутривенная, внутрибрюшинная и подкожная. Для целей инъекции фармацевтические композиции могут быть составлены в жидких растворах, предпочтительно в физиологически совместимых буферах, таких как раствор Хенка или раствор Рингера. Кроме того, фармацевтические композиции могут быть составлены в твердой форме и повторно растворяться или суспендироваться непосредственно перед применением. Также являются подходящими лиофилизированные формы фармацевтической композиции.[00243] The pharmaceutical compositions can be formulated for various routes of administration, including systemic, topical, or local administration. Methods and formulations can be found, for example, in Remrnington's Pharmaceutical Sciences, Meade Publishing Co., Easton, Pa. For systemic administration, injection is preferred, including intramuscular, intravenous, intraperitoneal, and subcutaneous. For injection purposes, the pharmaceutical compositions can be formulated in liquid solutions, preferably in physiologically compatible buffers such as Hank's solution or Ringer's solution. In addition, the pharmaceutical compositions can be formulated in solid form and reconstituted or suspended immediately prior to use. Lyophilized forms of the pharmaceutical composition are also suitable.
[00244] Для перорального введения фармацевтические композиции могут находиться в форме, например, таблеток или капсул, полученных традиционными способами, с фармацевтически приемлемыми вспомогательными веществами, такими как связующие средства (например, предварительно желатинизированный маисовый крахмал, поливинилпирролидон или гидроксипропилметилцеллюлоза); наполнители (например, лактоза, микрокристаллическая целлюлоза или гидрофосфат кальция); смазывающие вещества (например, стеарат магния, тальк или диоксид кремния); разрыхлители (например, картофельный крахмал или гликолят крахмала натрия) или смачивающие средства (например, лаурилсульфат натрия). Таблетки также могут быть покрыты оболочкой с помощью способов, хорошо известных в данной области техники. Жидкие препараты для перорального введения могут находиться в форме, например, растворов, сиропов или суспензий, или они могут быть представлены в виде сухого продукта для разведения водой или другой подходящей средой-носителем перед применением. Такие жидкие препараты можно получать традиционными способами с фармацевтически приемлемыми добавками, такими как суспендирующие средства (например, сорбитовый сироп, производные целлюлозы или гидрогенизированные пищевые жиры); эмульгаторы (например, лецитин или аравийская камедь); неводные среды-носители (например, масло, масляные сложные эфиры, этиловый спирт или фракционированные растительные масла) и консерванты (например, метил- или пропил-п-гидроксибензоаты или сорбиновая кислота). При необходимости препараты также могут содержать буферные соли, ароматизирующие, красящие и подслащивающие средства.[00244] For oral administration, the pharmaceutical compositions may be in the form of, for example, tablets or capsules prepared by conventional methods, with pharmaceutically acceptable excipients such as binding agents (e.g., pregelatinized maize starch, polyvinylpyrrolidone or hydroxypropyl methylcellulose); fillers (e.g., lactose, microcrystalline cellulose or calcium hydrogen phosphate); lubricants (e.g., magnesium stearate, talc or silicon dioxide); disintegrants (e.g., potato starch or sodium starch glycolate) or wetting agents (e.g., sodium lauryl sulfate). Tablets may also be coated by methods well known in the art. Liquid preparations for oral administration may be in the form of, for example, solutions, syrups or suspensions, or they may be presented as a dry product for reconstitution with water or other suitable carrier medium before use. Such liquid preparations may be prepared by conventional methods with pharmaceutically acceptable additives such as suspending agents (e.g. sorbitol syrup, cellulose derivatives or hydrogenated edible fats); emulsifying agents (e.g. lecithin or acacia); non-aqueous carrier media (e.g. oil, oily esters, ethyl alcohol or fractionated vegetable oils) and preservatives (e.g. methyl or propyl p-hydroxybenzoates or sorbic acid). If desired, the preparations may also contain buffer salts, flavouring, colouring and sweetening agents.
[00245] Фармацевтические композиции могут быть составлены для парентерального введения путем инъекции, например, путем болюсной инъекции или непрерывной инфузии. Составы для инъекций могут быть представлены в виде стандартной лекарственной формы, например, в ампулах или в многодозовых контейнерах с необязательно добавленным консервантом. Фармацевтические композиции могут быть дополнительно составлены в виде суспензий, растворов или эмульсий в масляных или водных средах-носителях и могут содержать другие средства, в том числе суспендирующие, стабилизирующие и/или диспергирующие средства.[00245] Pharmaceutical compositions can be formulated for parenteral administration by injection, for example, by bolus injection or continuous infusion. Formulations for injection can be presented in unit dosage form, for example, in ampoules or in multi-dose containers, with an optionally added preservative. Pharmaceutical compositions can further be formulated as suspensions, solutions, or emulsions in oily or aqueous carrier media, and can contain other agents including suspending, stabilizing and/or dispersing agents.
[00246] Кроме того, фармацевтические композиции также могут быть составлены в виде депо-препарата. Данные составы длительного действия можно вводить путем имплантации (например, подкожно или внутримышечно) или посредством внутримышечной инъекции. Так, например, соединения могут быть составлены с подходящими полимерными или гидрофобными материалами (например, в виде эмульсии в приемлемом масле) или ионообменными смолами или в виде труднорастворимых производных, например, в виде труднорастворимой соли. Другие подходящие системы доставки включают микросферы, которые обеспечивают возможность локальной неинвазивной доставки лекарственных средств в течение продолжительного периода времени. Данная технология может включать микросферы, имеющие прекапиллярный размер, которые можно вводить через коронарный катетер в любую выбранную часть органа, не вызывая воспаления или ишемии. Введенное терапевтическое средство медленно высвобождается из микросфер и поглощается окружающими клетками, присутствующими в выбранной ткани.[00246] In addition, the pharmaceutical compositions can also be formulated as a depot preparation. These long-acting formulations can be administered by implantation (e.g., subcutaneously or intramuscularly) or by intramuscular injection. For example, the compounds can be formulated with suitable polymeric or hydrophobic materials (e.g., as an emulsion in an acceptable oil) or ion exchange resins, or as poorly soluble derivatives, such as a poorly soluble salt. Other suitable delivery systems include microspheres, which allow for local, non-invasive delivery of drugs over an extended period of time. This technology can include microspheres having a precapillary size that can be administered through a coronary catheter to any selected part of an organ without causing inflammation or ischemia. The administered therapeutic agent is slowly released from the microspheres and taken up by surrounding cells present in the selected tissue.
[00247] Системное введение также можно осуществлять трансмукозальным или трансдермальным способами. В случае трансмукозального или трансдермального введения в составе используют проникающие вещества, подходящие для проникновения через барьер, через который требуется проникнуть. Такие проникающие вещества обычно известны в данной области техники и включают, например, в случае трансмукозального введения соли желчных кислот и производные фузидиевой кислоты. Кроме того, для облегчения проникновения можно использовать детергенты. Трансмукозальное введение можно осуществлять с использованием назальных спреев или суппозиториев. В случае местного применения вирусные частицы, описанные в данном документе, можно составлять в виде мазей, бальзамов, гелей или кремов, как в целом известно в данной области техники. Раствор для промывания также можно применять локально для лечения повреждения или воспаления с целью ускорения заживления.[00247] Systemic administration can also be carried out by transmucosal or transdermal routes. In the case of transmucosal or transdermal administration, the composition uses penetrating agents suitable for penetrating the barrier that is to be penetrated. Such penetrating agents are generally known in the art and include, for example, in the case of transmucosal administration, bile salts and fusidic acid derivatives. In addition, detergents can be used to facilitate penetration. Transmucosal administration can be carried out using nasal sprays or suppositories. In the case of topical application, the viral particles described herein can be formulated as ointments, balms, gels or creams, as is generally known in the art. A wash solution can also be applied locally to treat an injury or inflammation in order to accelerate healing.
[00248] Фармацевтические формы, подходящие для инъекционного применения, могут включать стерильные водные растворы или дисперсии; составы, включающие кунжутное масло, арахисовое масло или водный раствор пропиленгликоля; и стерильные порошки для получения стерильных инъекционных растворов или дисперсий для немедленного приема. Во всех случаях форма должна быть стерильной и должна быть текучей. Она должна быть стабильной в условиях изготовления и при определенных параметрах хранения (например, охлаждение и заморозка) и должна быть защищена от загрязняющего действия микроорганизмов, таких как бактерии и грибы.[00248] Pharmaceutical forms suitable for injectable use may include sterile aqueous solutions or dispersions; formulations including sesame oil, peanut oil, or an aqueous propylene glycol solution; and sterile powders for the preparation of sterile extemporaneous injectable solutions or dispersions. In all cases, the form must be sterile and must be fluid. It must be stable under the conditions of manufacture and under specified storage conditions (e.g., refrigeration and freezing), and must be preserved against the contaminating action of microorganisms such as bacteria and fungi.
[00249] Если составы, раскрытые в данном документе, используют в качестве терапевтического средства для усиления иммунного ответа у субъекта, терапевтическое средство можно составить в композиции в нейтральной или солевой форме. Фармацевтически приемлемые соли включают соли присоединения кислоты (образованные с помощью свободных аминогрупп белка), и при этом соли образованы с такими неорганическими кислотами, как, например, хлористоводородная или фосфорная кислоты, или такими органическими кислотами, как уксусная, щавелевая, винная, миндальная и т.п. Соли, образованные за счет свободных карбоксильных групп, также могут быть получены из таких неорганических оснований, как, например, гидроксиды натрия, калия, аммония, кальция или железа, и таких органических оснований, как изопропиламин, триметиламин, гистидин, прокаин и т.п.[00249] When the compositions disclosed herein are used as a therapeutic agent for enhancing an immune response in a subject, the therapeutic agent can be formulated in a neutral or salt form. Pharmaceutically acceptable salts include acid addition salts (formed with free amino groups of the protein), and wherein salts are formed with inorganic acids such as, for example, hydrochloric or phosphoric acids, or organic acids such as acetic, oxalic, tartaric, mandelic, and the like. Salts formed at the expense of free carboxyl groups can also be prepared from inorganic bases such as, for example, sodium, potassium, ammonium, calcium, or iron hydroxides, and organic bases such as isopropylamine, trimethylamine, histidine, procaine, and the like.
[00250] Носителем также может быть растворитель или дисперсионная среда, содержащая, например, воду, этанол, полиол (например, глицерин, пропиленгликоль и жидкий полиэтиленгликоль и т.п), их подходящие смеси и растительные масла. Надлежащую текучесть можно поддерживать, например, путем применения покрытия, такого как лецитин, путем поддержания требуемого размера частиц в случае дисперсии и путем применения поверхностно-активных веществ. Предотвращения действия микроорганизмов можно достигать с помощью различных антибактериальных и противогрибковых средств, известных в данной области техники. Во многих случаях будет предпочтительно включать изотонические средства, например сахара или хлорид натрия. Пролонгированного всасывания инъекционных композиций можно достигать путем применения в композициях средств, задерживающих всасывание, например моностеарата алюминия и желатина.[00250] The carrier can also be a solvent or dispersion medium containing, for example, water, ethanol, a polyol (for example, glycerol, propylene glycol and liquid polyethylene glycol, etc.), suitable mixtures thereof and vegetable oils. Proper fluidity can be maintained, for example, by using a coating such as lecithin, by maintaining the required particle size in the case of dispersion and by using surfactants. Prevention of the action of microorganisms can be achieved by various antibacterial and antifungal agents known in the art. In many cases, it will be preferable to include isotonic agents, for example, sugars or sodium chloride. Prolonged absorption of the injectable compositions can be achieved by using absorption delaying agents in the compositions, for example, aluminum monostearate and gelatin.
[00251] Стерильные инъекционные растворы можно получать путем включения активных соединений или конструкций в требуемом количестве в соответствующий растворитель вместе с различными другими ингредиентами, перечисленными выше, при необходимости с последующей стерилизацией путем фильтрации.[00251] Sterile injectable solutions can be prepared by incorporating the active compounds or constructs in the required amount in an appropriate solvent together with various of the other ingredients enumerated above, if necessary, followed by filtered sterilization.
[00252] После составления растворы можно вводить способом, совместимым с лекарственной формой, и в таком количестве, которое является терапевтически эффективным. Составы без труда вводят в таких разнообразных лекарственных формах, как, например, тип инъекционных растворов, описанных выше, однако также можно использовать капсулы или микрочастицы или микросферы с медленным высвобождением и т.п.[00252] Once formulated, the solutions can be administered in a manner compatible with the dosage form and in an amount that is therapeutically effective. The formulations are readily administered in such a variety of dosage forms as, for example, the type of injection solutions described above, but capsules or slow-release microparticles or microspheres, etc. can also be used.
[00253] Например, в случае парентерального введения в водном растворе при необходимости данный раствор должен быть надлежащим образом забуферен, и жидкому разбавителю сначала придают изотоничность с помощью достаточного количества физиологического раствора или глюкозы. Данные конкретные водные растворы особенно подходят для внутривенного, внутриопухолевого, внутримышечного, подкожного и внутрибрюшинного введения. В данном контексте стерильные водные среды, которые можно использовать, будут известны специалистам в данной области техники в свете настоящего изобретения. Например, одну дозу можно растворить в 1 мл изотонического раствора NaCl и либо добавить к 1000 мл жидкости для гиподермоклизиса, либо инъецировать в предполагаемое место инфузии.[00253] For example, in the case of parenteral administration in an aqueous solution, the solution should be suitably buffered if necessary, and the liquid diluent is first rendered isotonic with a sufficient amount of saline or glucose. These particular aqueous solutions are particularly suitable for intravenous, intratumoral, intramuscular, subcutaneous and intraperitoneal administration. In this context, sterile aqueous media that can be used will be known to those skilled in the art in light of the present invention. For example, a single dose can be dissolved in 1 ml of isotonic NaCl solution and either added to 1000 ml of hypodermoclysis fluid or injected into the intended infusion site.
[00254] Лицо, ответственное за введение, в любом случае будет определять соответствующую дозу для отдельного субъекта. Например, субъекту можно вводить описанные в данном документе вирусные частицы один раз в день или один раз в неделю в течение определенного периода времени или один раз в месяц, два раза в год или один раз в год, в зависимости от необходимости или воздействия патогенного организма или состояния у субъекта (например, рака).[00254] The person responsible for administration will in any event determine the appropriate dose for the individual subject. For example, the subject may be administered the viral particles described herein once daily or once weekly for a specified period of time, or once monthly, twice a year, or once a year, depending on the need or exposure to the pathogen or condition in the subject (e.g., cancer).
[00255] В дополнение к соединениям, составленным для парентерального введения, такого как внутривенная, внутриопухолевая, внутрикожная или внутримышечная инъекция, другие фармацевтически приемлемые формы включают, например, таблетки или другие твердые вещества для перорального введения; липосомные составы; капсулы с замедленным высвобождением; биоразлагаемую и любую другую форму, применяемую в настоящее время.[00255] In addition to compounds formulated for parenteral administration, such as intravenous, intratumoral, intradermal, or intramuscular injection, other pharmaceutically acceptable forms include, for example, tablets or other solids for oral administration; liposome formulations; sustained-release capsules; biodegradable and any other form currently in use.
[00256] Можно также применять интраназальные или ингаляционные растворы или спреи, аэрозоли или ингаляторы. Назальные растворы могут быть водными растворами, предназначенными для введения в носовые ходы в виде капель или спреев. Назальные растворы могут быть получены таким образом, что они во многом напоминают носовой секрет. Таким образом, водные назальные растворы обычно являются изотоническими и слегка забуференными для поддержания рН от 5,5 до 7,5. Кроме того, при необходимости в состав могут быть включены противомикробные консерванты, подобные тем, которые применяют в офтальмологических препаратах, и соответствующие стабилизаторы лекарственного средства. Известны различные коммерческие назальные препараты, которые могут включать, например, антибиотики и антигистаминные препараты, и они применяются для профилактики астмы.[00256] Intranasal or inhalation solutions or sprays, aerosols or inhalers may also be used. Nasal solutions may be aqueous solutions intended for administration into the nasal passages in the form of drops or sprays. Nasal solutions may be formulated to closely resemble nasal secretions. Thus, aqueous nasal solutions are typically isotonic and lightly buffered to maintain a pH of 5.5 to 7.5. In addition, antimicrobial preservatives similar to those used in ophthalmic preparations and appropriate drug stabilizers may be included if necessary. Various commercial nasal preparations are known, which may include, for example, antibiotics and antihistamines, and are used for the prophylaxis of asthma.
[00257] Составы для перорального применения могут включать такие вспомогательные вещества, как, например, маннит, лактоза, крахмал, стеарат магния, сахарин натрия, целлюлоза, карбонат магния и т.п., характеризующиеся фармацевтической степенью чистоты. Данным композициям придают форму растворов, суспензий, таблеток, пилюль, капсул, составов с замедленным высвобождением или порошков. В некоторых определенных вариантах осуществления фармацевтические композиции для перорального введения будут включать инертный разбавитель или усваиваемый съедобный носитель, или они могут быть заключены в капсулу с твердой или мягкой желатиновой оболочкой, или они могут быть спрессованы в таблетки, или они могут быть включены непосредственно в пищевой продукт, предусмотренный диетой. В случае перорального введения терапевтического средства активные соединения можно объединять со вспомогательными веществами и применять в форме принимаемых внутрь таблеток, буккальных таблеток, пастилок, капсул, эликсиров, суспензий, сиропов, облаток и т.п.[00257] Formulations for oral use may include such excipients as, for example, mannitol, lactose, starch, magnesium stearate, sodium saccharin, cellulose, magnesium carbonate, and the like, characterized by a pharmaceutical grade of purity. These compositions are given the form of solutions, suspensions, tablets, pills, capsules, sustained-release formulations or powders. In some specific embodiments, pharmaceutical compositions for oral administration will include an inert diluent or an assimilable edible carrier, or they can be enclosed in a capsule with a hard or soft gelatin shell, or they can be compressed into tablets, or they can be included directly in the food product provided by the diet. In the case of oral administration of the therapeutic agent, the active compounds can be combined with excipients and used in the form of oral tablets, buccal tablets, lozenges, capsules, elixirs, suspensions, syrups, wafers, etc.
[00258] Таблетки, пастилки, пилюли, капсулы и т.п. также могут содержать следующее: связующее вещество, такое как трагакантовая камедь, аравийская камедь, кукурузный крахмал или желатин; вспомогательные вещества, такие как дикальцийфосфат; разрыхлитель, такой как кукурузный крахмал, картофельный крахмал, альгиновая кислота и т.п.; смазывающее вещество, такое как стеарат магния; и может быть добавлен подсластитель, такой как сахароза, лактоза или сахарин, или ароматизатор, такой как мята перечная, масло грушанки или вишневый ароматизатор. Если стандартная лекарственная форма представляет собой капсулу, то она может содержать, помимо веществ вышеуказанного типа, жидкий носитель. Различные другие вещества могут присутствовать в качестве покрытий или иным образом модифицировать физическую форму лекарственной формы. Например, таблетки, пилюли или капсулы могут быть покрыты шеллаком, сахаром или и тем и другим. Сироп или эликсир может содержать активные соединения, сахарозу в качестве подсластителя, метил- и пропилпарабены в качестве консервантов, краситель и ароматизатор, такой как вишневый или апельсиновый ароматизатор.[00258] The tablets, troches, pills, capsules and the like may also contain the following: a binder such as gum tragacanth, acacia, corn starch or gelatin; auxiliary substances such as dicalcium phosphate; a disintegrating agent such as corn starch, potato starch, alginic acid and the like; a lubricant such as magnesium stearate; and a sweetening agent such as sucrose, lactose or saccharin, or a flavoring agent such as peppermint, oil of wintergreen or cherry flavoring may be added. When the unit dosage form is a capsule, it may contain, in addition to substances of the above type, a liquid carrier. Various other substances may be present as coatings or otherwise modify the physical form of the dosage form. For example, tablets, pills or capsules may be coated with shellac, sugar or both. A syrup or elixir may contain active compounds, sucrose as a sweetener, methyl and propylparabens as preservatives, a dye, and a flavoring such as cherry or orange flavoring.
[00259] Другие варианты осуществления, раскрытые в данном документе, могут касаться наборов для применения в соответствии со способами и композициями. Наборы могут также включать подходящий контейнер, например флаконы, пробирки, мини- или микроцентрифужные пробирки, пробирку для испытания, колбу, сосуд, шприц или другой контейнер. Если обеспечивается дополнительный компонент или средство, набор может содержать один или более дополнительных контейнеров, в которые может быть помещено данное средство или компонент. Наборы в данном документе, как правило, также включают средства для помещения вирусных частиц и любые другие контейнеры с реагентами, плотно упакованные для коммерческой продажи. Такие контейнеры могут включать пластиковые контейнеры, полученные литьем под давлением или выдувным формованием, в которые помещены требуемые флаконы. Необязательно, для описанных композиций могут потребоваться одно или более дополнительных активных средств, таких как, например, противовоспалительные средства, противовирусные средства, противогрибковые или антибактериальные средства или противоопухолевые средства.[00259] Other embodiments disclosed herein may relate to kits for use in accordance with the methods and compositions. Kits may also include a suitable container, such as vials, test tubes, mini- or microcentrifuge tubes, a test tube, a flask, a vessel, a syringe, or other container. If an additional component or agent is provided, the kit may include one or more additional containers into which the agent or component can be placed. Kits herein typically also include means for placing viral particles and any other reagent containers tightly packaged for commercial sale. Such containers may include injection molded or blow molded plastic containers into which the desired vials are placed. Optionally, the disclosed compositions may require one or more additional active agents, such as, for example, anti-inflammatory agents, antiviral agents, antifungal or antibacterial agents, or antitumor agents.
[00260] Композиции, раскрытые в данном документе, можно вводить любым способом, известным в данной области техники. Например, композиции могут предусматривать введение субъекту внутривенно, внутриопухолево, внутрикожно, внутриартериально, внутрибрюшинно, внутрь повреждения, внутричерепно, внутрисуставно, внутрипростатически, внутриплеврально, внутритрахеально, интраназально, интравитреально, интравагинально, интраректально, местно, внутриопухолево, внутримышечно, интратекально, подкожно, субконъюнктивально, интравезикулярно, мукозально, интраперикардиально, внутрипуповинно, интраокулярно, перорально, локально, с помощью ингаляции, с помощью инъекции, с помощью инфузии, с помощью непрерывной инфузии, с помощью локальной перфузии, через катетер, с помощью промывания, в креме или в липидной композиции.[00260] The compositions disclosed herein can be administered by any route known in the art. For example, the compositions can be administered to a subject intravenously, intratumorally, intradermally, intraarterially, intraperitoneally, intralesionally, intracranially, intraarticularly, intraprostatically, intrapleurally, intratracheally, intranasally, intravitreally, intravaginally, intrarectally, topically, intratumorally, intramuscularly, intrathecally, subcutaneously, subconjunctivally, intravesicularly, mucosally, intrapericardially, intraumbilically, intraocularly, orally, locally, by inhalation, by injection, by infusion, by continuous infusion, by local perfusion, via a catheter, by lavage, in a cream, or in a lipid composition.
[00261] Для крупномасштабного продуцирования вирусных частиц, упаковывающих клеток и конструкций частиц, раскрытых в данном документе, можно применять любой способ, известный специалисту в данной области техники. Например, основной и рабочий посевные материалы можно получать в условиях согласно GMP в отвечающих требованиям первичных CEF или другими способами. Упаковывающие клетки можно высевать в колбы с большой площадью поверхности, выращивать практически до достижения конфлюентности и выполнять очистку вирусных частиц. Клетки можно собирать и выделять и очищать вирусные частицы, высвобожденные в культуральную среду, или высвобождать внутриклеточные вирусные частицы путем механического разрушения (клеточный дебрис можно удалять с помощью глубинной фильтрации с крупными порами и расщеплять ДНК клетки-хозяина эндонуклеазой). Впоследствии вирусные частицы могут быть очищены и сконцентрированы путем фильтрации в тангенциальном потоке с последующей диафильтрацией. Полученную концентрированную массу можно составлять путем разбавления буфером, содержащим стабилизаторы, наполнять ею флаконы и лиофилизировать. Композиции и составы могут храниться для последующего применения. Для применения лиофилизированные вирусные частицы можно восстанавливать путем добавления разбавителя.[00261] Any method known to one skilled in the art can be used to produce the viral particles, packaging cells, and particle constructs disclosed herein on a large scale. For example, master and working seeds can be prepared under GMP conditions in compliant primary CEFs or by other means. Packaging cells can be seeded in large surface area flasks, grown to near confluence, and the viral particles purified. The cells can be harvested and the viral particles released into the culture medium isolated and purified, or the intracellular viral particles can be released by mechanical disruption (cell debris can be removed by large pore depth filtration and host cell DNA can be cleaved with an endonuclease). The viral particles can then be purified and concentrated by tangential flow filtration followed by diafiltration. The resulting concentrated mass can be formulated by diluting with a buffer containing stabilizers, filled into vials and lyophilized. The compositions and formulations can be stored for subsequent use. For use, lyophilized virus particles can be reconstituted by adding a diluent.
[00262] Определенные дополнительные средства, применяемые в комбинированных средствах терапии, можно составлять и вводить любым способом, известным в данной области техники.[00262] Certain additional agents used in combination therapies may be formulated and administered by any method known in the art.
[00263] Композиции, раскрытые в данном документе, также могут включать адъюванты, такие как соли алюминия и другие минеральные адъюванты, средства, изменяющие поверхностное натяжение, бактериальные компоненты, среды-носители и цитокины. Адъюванты также могут обладать антагонистическими иммуномодулирующими свойствами. Например, адъюванты могут стимулировать Th1- или Th2-зависимый иммунитет.Композиции и способы, раскрытые в данном документе, также могут предусматривать адъювантную терапию.[00263] The compositions disclosed herein may also include adjuvants, such as aluminum salts and other mineral adjuvants, surface tension modifiers, bacterial components, carrier media, and cytokines. Adjuvants may also have antagonist immunomodulatory properties. For example, adjuvants may stimulate Th1- or Th2-dependent immunity. The compositions and methods disclosed herein may also provide for adjuvant therapy.
[00264] Неограничивающие и иллюстративные варианты осуществления приведены ниже.[00264] Non-limiting and illustrative embodiments are provided below.
Вариант осуществления 1. Вирусная частица AAV, содержащая капсид AAV,Embodiment 1. An AAV viral particle comprising an AAV capsid,
где по меньшей мере один капсидный белок AAV указанного капсида AAV содержит по меньшей мере часть аминокислотной последовательности капсидного белка, выбранного из группы, состоящей из:wherein at least one AAV capsid protein of said AAV capsid comprises at least a portion of an amino acid sequence of a capsid protein selected from the group consisting of:
капсидного белка AAV животного, не являющегося приматом,non-primate AAV capsid protein,
капсидного белка отдаленного AAV иcapsid protein of distant AAV and
их комбинации, иtheir combinations, and
где по меньшей мере один капсидный белок AAV указанного капсида AAV модифицирован с включением:wherein at least one AAV capsid protein of said AAV capsid is modified to include:
(a) по меньшей мере первого партнера из связывающейся пары белок:белок,(a) at least the first partner of a protein:protein binding pair,
(b) детектируемой метки,(b) the detectable label,
(c) точечной мутации,(c) point mutation,
(d) химерной аминокислотной последовательности, содержащей часть аминокислотной последовательности капсидного белка другого AAV, которая функционально связана с указанной аминокислотной последовательностью капсидного белка, выбранной из группы, состоящей из капсидного белка AAV животного, не являющегося приматом, капсидного белка отдаленного AAV или их комбинации, и(d) a chimeric amino acid sequence comprising a portion of an amino acid sequence of a capsid protein of another AAV that is operably linked to said amino acid sequence of a capsid protein selected from the group consisting of a capsid protein of a non-primate AAV, a capsid protein of a distant AAV, or a combination thereof, and
(e) любой комбинации (а), (b), (с) и (d).(e) any combination of (a), (b), (c) and (d).
Вариант осуществления 2. Вирусная частица AAV, содержащая капсид AAV,Embodiment 2. An AAV viral particle comprising an AAV capsid,
где по меньшей мере один капсидный белок AAV указанного капсида AAV содержит по меньшей мере часть аминокислотной последовательности капсидного белка AAV животного, не являющегося приматом,wherein at least one AAV capsid protein of said AAV capsid comprises at least a portion of the amino acid sequence of an AAV capsid protein of a non-primate animal,
где по меньшей мере один капсидный белок AAV указанного капсида AAV модифицирован с включением:wherein at least one AAV capsid protein of said AAV capsid is modified to include:
(а) по меньшей мере первого партнера из связывающейся пары белок:белок,(a) at least the first partner of a protein:protein binding pair,
(b) детектируемой метки,(b) the detectable label,
(c) точечной мутации,(c) point mutation,
(d) химерной аминокислотной последовательности, содержащей часть аминокислотной последовательности капсидного белка другого AAV, которая функционально связана с указанной аминокислотной последовательностью капсида AAV животного, не являющегося приматом, и(d) a chimeric amino acid sequence comprising a portion of an amino acid sequence of a capsid protein of another AAV that is operably linked to said amino acid sequence of a capsid protein of an AAV of a non-primate animal, and
(e) любой комбинации (а), (b), (с) и (d).(e) any combination of (a), (b), (c) and (d).
Вариант осуществления 3. Вирусная частица AAV, содержащая капсид AAV,Embodiment 3. An AAV viral particle comprising an AAV capsid,
где по меньшей мере один капсидный белок AAV указанного капсида AAV содержит по меньшей мере часть аминокислотной последовательности капсидного белка отдаленного AAV,wherein at least one AAV capsid protein of said AAV capsid comprises at least a portion of the amino acid sequence of a capsid protein of a distant AAV,
где по меньшей мере один капсидный белок AAV указанного капсида AAV модифицирован с включением:wherein at least one AAV capsid protein of said AAV capsid is modified to include:
(a) по меньшей мере первого партнера из связывающейся пары белок:белок,(a) at least the first partner of a protein:protein binding pair,
(b) детектируемой метки,(b) the detectable label,
(c) точечной мутации,(c) point mutation,
(d) химерной аминокислотной последовательности, содержащей часть аминокислотной последовательности капсидного белка другого AAV, которая функционально связана с указанной аминокислотной последовательностью капсидного белка отдаленного AAV, и(d) a chimeric amino acid sequence comprising a portion of an amino acid sequence of a capsid protein of another AAV that is operably linked to said amino acid sequence of a capsid protein of a distant AAV, and
(e) любой комбинации (а), (b), (с) и (d).(e) any combination of (a), (b), (c) and (d).
Вариант осуществления 4. Вирусная частица AAV, содержащая:Embodiment 4. An AAV viral particle comprising:
(А) по меньшей мере один капсидный белок AAV, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:(A) at least one AAV capsid protein comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of:
(i) аминокислотной последовательности капсидного белка AAV животного, не являющегося приматом,(i) the amino acid sequence of the capsid protein of an AAV from a non-primate animal,
(ii) аминокислотной последовательности капсидного белка отдаленного AAV и(ii) the amino acid sequence of the capsid protein of the distant AAV and
(iii) аминокислотной последовательности их комбинации, и(iii) the amino acid sequence of their combination, and
(В) геном AAV, содержащий представляющий интерес нуклеотид и ITR AAV, содержащий по меньшей мере часть последовательности ITR другого AAV.(B) an AAV genome comprising a nucleotide of interest and an AAV ITR comprising at least a portion of an ITR sequence of another AAV.
Вариант осуществления 5. Вирусная частица AAV, содержащая:Embodiment 5. An AAV viral particle comprising:
(A) по меньшей мере один капсидный белок AAV, содержащий аминокислотную последовательность капсидного белка AAV животного, не являющегося приматом, и(A) at least one AAV capsid protein comprising the amino acid sequence of an AAV capsid protein of a non-primate animal, and
(B) геном AAV, содержащий представляющий интерес нуклеотид и ITR AAV, содержащий по меньшей мере часть последовательности ITR другого AAV.(B) an AAV genome comprising a nucleotide of interest and an AAV ITR comprising at least a portion of an ITR sequence of another AAV.
Вариант осуществления 6. Вирусная частица AAV, содержащая:Embodiment 6. An AAV viral particle comprising:
(A) по меньшей мере один капсидный белок AAV, содержащий аминокислотную последовательность капсидного белка отдаленного AAV, и(A) at least one AAV capsid protein comprising the amino acid sequence of a distant AAV capsid protein, and
(B) геном AAV, содержащий представляющий интерес нуклеотид и ITR AAV, содержащий по меньшей мере часть последовательности ITR другого AAV.(B) an AAV genome comprising a nucleotide of interest and an AAV ITR comprising at least a portion of an ITR sequence of another AAV.
Вариант осуществления 7. Вирусная частица AAV по любому из предыдущих вариантов осуществления, где указанная аминокислотная последовательность капсидного белка AAV животного, не являющегося приматом, капсидного белка отдаленного AAV или их комбинация модифицирована с включением:Embodiment 7. The AAV viral particle of any of the preceding embodiments, wherein said amino acid sequence of a non-primate AAV capsid protein, a distant AAV capsid protein, or a combination thereof is modified to include:
(a) по меньшей мере первого партнера из связывающейся пары белок:белок,(a) at least the first partner of a protein:protein binding pair,
(b) детектируемой метки,(b) the detectable label,
(c) точечной мутации.(c) point mutation.
Вариант осуществления 8. Частица AAV по варианту осуществления 7,Embodiment 8. The AAV particle of embodiment 7,
где связывающаяся пара белок:белок выбрана из SpyTag: SpyCatcher, SpyTag:KTag, Isopeptag:nmrHH-C, SnoopTag:SnoopCatcher и SpyTag002:SpyCatcher002.where the protein:protein binding pair is selected from SpyTag: SpyCatcher, SpyTag:KTag, Isopeptag:nmrHH-C, SnoopTag:SnoopCatcher, and SpyTag002:SpyCatcher002.
Вариант осуществления 9. Частица AAV по варианту осуществления 7,Embodiment 9. The AAV particle of embodiment 7,
где первый партнер из связывающейся пары белок:белок содержит с-тус, содержащую последовательность, изложенную под SEQ ID NO:44.wherein the first partner of the protein:protein binding pair comprises a c-myc comprising the sequence set forth under SEQ ID NO:44.
Вариант осуществления 10. Частица AAV по любому из предыдущих вариантов осуществления, где детектируемая метка предусматривает эпитоп В1, содержащий аминокислотную последовательность IGTRYLTR (SEQ ID NO:45).Embodiment 10. The AAV particle of any of the preceding embodiments, wherein the detectable label provides a B1 epitope comprising the amino acid sequence IGTRYLTR (SEQ ID NO:45).
Вариант осуществления 11. Вирусная частица AAV по любому из предыдущих вариантов осуществления, где указанная аминокислотная последовательность капсидного белка AAV животного, не являющегося приматом, капсидного белка отдаленного AAV или их комбинации содержит аминокислотную последовательность капсидного белка VP3 AAV животного, не являющегося приматом, и/или аминокислотную последовательность капсидного белка VP3 отдаленного AAV.Embodiment 11. The AAV viral particle of any of the previous embodiments, wherein said amino acid sequence of a non-primate AAV capsid protein, a distant AAV capsid protein, or a combination thereof comprises an amino acid sequence of a non-primate AAV capsid protein VP3 and/or an amino acid sequence of a distant AAV capsid protein VP3.
Вариант осуществления 12. Вирусная частица AAV по любому из предыдущих вариантов осуществления, где указанная аминокислотная последовательность капсидного белка AAV животного, не являющегося приматом, капсидного белка отдаленного AAV или их комбинации содержит аминокислотную последовательность капсидного белка VP2 AAV животного, не являющегося приматом, и/или аминокислотную последовательность капсидного белка VP2 отдаленного AAV.Embodiment 12. The AAV viral particle of any of the previous embodiments, wherein said amino acid sequence of a non-primate AAV capsid protein, a distant AAV capsid protein, or a combination thereof comprises an amino acid sequence of a non-primate AAV capsid protein VP2 and/or an amino acid sequence of a distant AAV capsid protein VP2.
Вариант осуществления 13. Вирусная частица AAV по любому из предыдущих вариантов осуществления, где указанная аминокислотная последовательность капсидного белка AAV животного, не являющегося приматом, капсидного белка отдаленного AAV или их комбинации содержит аминокислотную последовательность капсидного белка VP1 AAV животного, не являющегося приматом, и/или аминокислотную последовательность капсидного белка VP1 отдаленного AAV.Embodiment 13. The AAV viral particle of any of the previous embodiments, wherein said amino acid sequence of a non-primate AAV capsid protein, a distant AAV capsid protein, or a combination thereof comprises an amino acid sequence of a non-primate AAV capsid protein VP1 and/or an amino acid sequence of a distant AAV capsid protein VP1.
Вариант осуществления I4. Вирусная частица AAV по любому из предыдущих вариантов осуществления, где капсид указанной частицы содержит:Embodiment I4. An AAV viral particle according to any of the previous embodiments, wherein the capsid of said particle comprises:
(i) капсидный белок VP1, который представляет собой один из:(i) capsid protein VP1, which is one of:
химерного капсидного белка VP1 AAV, где необязательно химерный капсидный белок VP1 содержит уникальную область VP1 (VP1-u) другого AAV, функционально связанную с общей областью VP1/VP2 и областью VP3 AAV животного, не являющегося приматом, илиa chimeric VP1 capsid protein of an AAV, wherein optionally the chimeric VP1 capsid protein comprises a unique VP1 region (VP1-u) of another AAV operably linked to a common VP1/VP2 region and a VP3 region of a non-primate AAV, or
капсидного белка VP1 AAV животного, не являющегося приматом, или отдаленного AAV,capsid protein VP1 of a non-primate AAV or a distant AAV,
(ii) капсидный белок VP2, который представляет собой один из:(ii) capsid protein VP2, which is one of:
химерного капсидного белка VP2 AAV, где необязательно химерный капсидный белок VP2 содержит общую область VP1/VP2 другого AAV, функционально связанную с областью VP3 AAV животного, не являющегося приматом, или отдаленного AAV, илиa chimeric VP2 capsid protein of an AAV, wherein optionally the chimeric VP2 capsid protein comprises a common VP1/VP2 region of another AAV operably linked to a VP3 region of a non-primate AAV or a distant AAV, or
капсидного белка VP2 AAV животного, не являющегося приматом, или отдаленного AAV, иthe VP2 capsid protein of a non-primate AAV or a distant AAV, and
(iii) капсидный белок VP3 AAV животного, не являющегося приматом, или отдаленного AAV.(iii) the VP3 capsid protein of a non-primate AAV or a distant AAV.
Вариант осуществления I5. Вирусная частица AAV по любому из предыдущих вариантов осуществления, где капсид указанной частицы содержит:Embodiment I5. An AAV viral particle according to any of the previous embodiments, wherein the capsid of said particle comprises:
(i) химерный капсидный белок VP1 AAV, где необязательно химерный капсидный белок VP1 содержит уникальную область VP1 (VP1-u) другого AAV, функционально связанную с общей областью VP1/VP2 и областью VP3 AAV животного, не являющегося приматом,(i) a chimeric VP1 capsid protein of an AAV, wherein optionally the chimeric VP1 capsid protein comprises a unique VP1 region (VP1-u) of another AAV operably linked to a common VP1/VP2 region and a VP3 region of a non-primate AAV,
(ii) химерный капсидный белок VP2 AAV, где необязательно химерный капсидный белок VP2 содержит общую область VP1/VP2 другого AAV, функционально связанную с областью VP3 AAV животного, не являющегося приматом, или отдаленного AAV, и(ii) a chimeric VP2 capsid protein of an AAV, wherein optionally the chimeric VP2 capsid protein comprises a common VP1/VP2 region of another AAV operably linked to a VP3 region of a non-primate AAV or a distant AAV, and
(iii) капсидный белок VP3 AAV животного, не являющегося приматом, или отдаленного AAV.(iii) the VP3 capsid protein of a non-primate AAV or a distant AAV.
Вариант осуществления 16. Вирусная частица AAV по любому из предыдущих вариантов осуществления, где капсид указанной частицы содержит:Embodiment 16. An AAV viral particle according to any of the previous embodiments, wherein the capsid of said particle comprises:
(i) химерный капсидный белок VP1 AAV, где необязательно химерный капсидный белок VP1 содержит уникальную область VP1 (VP1-u) другого AAV, функционально связанную с общей областью VP1/VP2 и областью VP3 AAV животного, не являющегося приматом,(i) a chimeric VP1 capsid protein of an AAV, wherein optionally the chimeric VP1 capsid protein comprises a unique VP1 region (VP1-u) of another AAV operably linked to a common VP1/VP2 region and a VP3 region of a non-primate AAV,
(ii) капсидный белок VP2 AAV животного, не являющегося приматом, или отдаленного AAV, и(ii) the VP2 capsid protein of a non-primate AAV or a distant AAV, and
(iii) капсидный белок VP3 AAV животного, не являющегося приматом, или отдаленного AAV.(iii) the VP3 capsid protein of a non-primate AAV or a distant AAV.
Вариант осуществления 17. Вирусная частица AAV по любому из предыдущих вариантов осуществления, где капсид содержит:Embodiment 17. The AAV viral particle of any of the previous embodiments, wherein the capsid comprises:
(i) капсидный белок VP1 AAV животного, не являющегося приматом, или отдаленного AAV,(i) the VP1 capsid protein of a non-primate AAV or a distant AAV,
(ii) капсидный белок VP2 AAV животного, не являющегося приматом, или отдаленного AAV, и(ii) the VP2 capsid protein of a non-primate AAV or a distant AAV, and
(iii) капсидный белок VP3 AAV животного, не являющегося приматом, или отдаленного AAV.(iii) the VP3 capsid protein of a non-primate AAV or a distant AAV.
Вариант осуществления 18. Вирусная частица AAV по любому из предыдущих вариантов осуществления, где указанный другой AAV представляет собой AAV примата или комбинацию AAV примата.Embodiment 18. The AAV viral particle of any of the previous embodiments, wherein said other AAV is a primate AAV or a combination of primate AAVs.
Вариант осуществления 19. Вирусная частица AAV по любому из предыдущих вариантов осуществления, где указанный другой AAV выбран из группы, состоящей из AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9 и их комбинации.Embodiment 19. The AAV viral particle of any of the previous embodiments, wherein said other AAV is selected from the group consisting of AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, and a combination thereof.
Вариант осуществления 20. Вирусная частица AAV по любому из предыдущих вариантов осуществления, где указанный другой AAV представляет собой AAV2.Embodiment 20. The AAV viral particle of any of the previous embodiments, wherein said other AAV is AAV2.
Вариант осуществления 21. Вирусная частица AAV по любому из вариантов осуществления 1-2, 4-5 и 7-20, где указанный AAV животного, не являющегося приматом, представляет собой AAV животного, не являющегося приматом, приведенный в таблице 1.Embodiment 21. The AAV viral particle of any one of embodiments 1-2, 4-5, and 7-20, wherein said non-primate AAV is a non-primate AAV listed in Table 1.
Вариант осуществления 22. Вирусная частица AAV по любому из вариантов осуществления 1-2, 4-5 и 7 21, где AAV животного, не являющегося приматом, представляет собой птичий AAV, AAV морского льва или AAV бородатой агамы.Embodiment 22. The AAV viral particle of any one of embodiments 1-2, 4-5, and 7 21, wherein the non-primate AAV is an avian AAV, a sea lion AAV, or a bearded dragon AAV.
Вариант осуществления 23. Вирусная частица AAV по любому из вариантов осуществления 1-2, 4-5 и 7-22, где AAV животного, не являющегося приматом, представляет собой AAAV.Embodiment 23. The AAV viral particle of any one of embodiments 1-2, 4-5, and 7-22, wherein the non-primate AAV is AAAV.
Вариант осуществления 24. Вирусная частица AAV по любому из вариантов осуществления 1-2, 4-5 и 7-23, где модификация находится в положении I444 или I580 капсидного белка VP1 AAAV.Embodiment 24. The AAV viral particle of any one of embodiments 1-2, 4-5, and 7-23, wherein the modification is at position I444 or I580 of the AAAV capsid protein VP1.
Вариант осуществления 25. Вирусная частица AAV по любому из вариантов осуществления 1-2, 4-5 и 7-22, где AAV животного, не являющегося приматом, представляет собой AAV чешуйчатого пресмыкающегося.Embodiment 25. The AAV viral particle of any one of embodiments 1-2, 4-5, and 7-22, wherein the non-primate AAV is a scaly reptile AAV.
Вариант осуществления 26. Вирусная частица AAV по любому из вариантов осуществления 1-2, 4-5, 7-22 и 25, где AAV чешуйчатого пресмыкающегося представляет собой AAV бородатой агамы.Embodiment 26. The AAV viral particle of any one of embodiments 1-2, 4-5, 7-22, and 25, wherein the scaly reptile AAV is a bearded dragon AAV.
Вариант осуществления 27. Вирусная частица AAV по любому из вариантов осуществления 1 2, 4 5, 7-22 и 25 26, где модификация находится в положении I573 или I436 капсидного белка VP1 AAV бородатой агамы.Embodiment 27. The AAV viral particle of any one of embodiments 1-2, 4-5, 7-22 and 25-26, wherein the modification is at position I573 or I436 of the bearded dragon AAV capsid protein VP1.
Вариант осуществления 28. Вирусная частица AAV по любому из вариантов осуществления 1-2, 4-5 и 7-22, где AAV животного, не являющегося приматом, представляет собой AAV млекопитающего.Embodiment 28. The AAV viral particle of any one of embodiments 1-2, 4-5, and 7-22, wherein the non-primate AAV is a mammalian AAV.
Вариант осуществления 29. Вирусная частица AAV по любому из вариантов осуществления 1-2, 4-5, 7-22 и 28, где AAV млекопитающего представляет собой AAV морского льва.Embodiment 29. The AAV viral particle of any one of embodiments 1-2, 4-5, 7-22, and 28, wherein the mammalian AAV is a sea lion AAV.
Вариант осуществления 30. Вирусная частица AAV по любому из вариантов осуществления 1 2, 4 5, 7-22 и 28 29, где модификация находится в положении, выбранном из группы, состоящей из I429, I430, I431, I432, I433, I434, I436, I437 и А565 VP1 AAV морского льва.Embodiment 30. The AAV viral particle of any one of embodiments 1-2, 4-5, 7-22 and 28-29, wherein the modification is at a position selected from the group consisting of I429, I430, I431, I432, I433, I434, I436, I437 and A565 of sea lion AAV VP1.
Вариант осуществления 31. Частица AAV по любому из предыдущих вариантов осуществления, содержащая капсидный белок VP3 AAV животного, не являющегося приматом, отдаленного AAV или их комбинации, где капсидный белок VP3 модифицирован с включением:Embodiment 31. The AAV particle of any of the preceding embodiments comprising a VP3 capsid protein of a non-primate AAV, a distant AAV, or a combination thereof, wherein the VP3 capsid protein is modified to include:
(a) по меньшей мере первого партнера из связывающейся пары белок:белок, где необязательно связывающаяся пара белок:белок выбрана из группы, состоящей из SpyTag: SpyCatcher, SpyTag:KTag, Isopeptag:nmrHH-C, SnoopTag: SnoopCatcher и SpyTag002: SpyCatcher002,(a) at least a first partner of a protein:protein binding pair, wherein optionally the protein:protein binding pair is selected from the group consisting of SpyTag: SpyCatcher, SpyTag:KTag, Isopeptag:nmrHH-C, SnoopTag: SnoopCatcher and SpyTag002: SpyCatcher002,
(b) детектируемой метки, где необязательно детектируемая метка содержит аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO:44, или аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO:45,(b) a detectable label, wherein optionally the detectable label comprises the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO:44 or the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO:45,
(c) точечной мутации или(c) point mutation or
(d) любой комбинации (а), (b) и (с).(d) any combination of (a), (b) and (c).
Вариант осуществления 32. Частица AAV по варианту осуществления 31, где капсидный белок VP3 AAV животного, не являющегося приматом, отдаленного AAV или их комбинации модифицирован с включением:Embodiment 32. The AAV particle of embodiment 31, wherein the VP3 capsid protein of the non-primate AAV, the distant AAV, or a combination thereof is modified to include:
(a) по меньшей мере SpyTag, содержащего аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO:42, и/или(a) at least a SpyTag comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO:42, and/or
(b) детектируемой метки, содержащей аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO:45.(b) a detectable label comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO:45.
Вариант осуществления 33. Частица AAV по любому из предыдущих вариантов осуществления, содержащая первый и/или второй линкер, функционально связывающий первого партнера из связывающейся пары белок:белок и/или детектируемую метку с капсидным белком капсида указанной частицы AAV.Embodiment 33. An AAV particle according to any of the previous embodiments, comprising a first and/or second linker operably linking a first partner of a protein:protein binding pair and/or a detectable label to a capsid protein of the capsid of said AAV particle.
Вариант осуществления 34. Частица AAV по варианту осуществления 33, где первый и второй линкер не являются идентичными.Embodiment 34. The AAV particle of embodiment 33, wherein the first and second linker are not identical.
Вариант осуществления 35. Частица AAV по варианту осуществления 33 или варианту осуществления 34, где первый и второй линкер являются идентичными.Embodiment 35. The AAV particle of embodiment 33 or embodiment 34, wherein the first and second linker are identical.
Вариант осуществления 36. Частица AAV по любому из вариантов осуществления 33-35, где длина первого и/или второго линкера составляет 10 аминокислот.Embodiment 36. The AAV particle of any one of embodiments 33-35, wherein the first and/or second linker is 10 amino acids in length.
Вариант осуществления 37. Частица AAV по любому из предыдущих вариантов осуществления, содержащая первого партнера из связывающейся пары белок:белок и/или детектируемую метку, функционально связанные с вариабельной областью капсидного белка капсида указанной частицы AAV.Embodiment 37. An AAV particle according to any of the previous embodiments comprising a first partner of a protein:protein binding pair and/or a detectable label operably linked to a variable region of a capsid protein of the capsid of said AAV particle.
Вариант осуществления 38. Частица AAV по варианту осуществления 1 или варианту осуществления 2, содержащая капсидный белок, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:Embodiment 38. The AAV particle of embodiment 1 or embodiment 2 comprising a capsid protein comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of:
(a) аминокислотной последовательности, изложенной под SEQ ID NO:2,(a) the amino acid sequence set forth under SEQ ID NO:2,
(b) аминокислотной последовательности, изложенной под SEQ ID NO:4,(b) the amino acid sequence set forth under SEQ ID NO:4,
(c) аминокислотной последовательности, изложенной под SEQ ID NO:6,(c) the amino acid sequence set forth under SEQ ID NO:6,
(d) аминокислотной последовательности, изложенной под SEQ ID NO :8,(d) the amino acid sequence set forth under SEQ ID NO:8,
(e) аминокислотной последовательности, изложенной под SEQ ID NO:10,(e) the amino acid sequence set forth under SEQ ID NO:10,
(f) аминокислотной последовательности, изложенной под SEQ ID NO:12,(f) the amino acid sequence set forth under SEQ ID NO:12,
(g) аминокислотной последовательности, изложенной под SEQ ID NO:I4,(g) the amino acid sequence set forth under SEQ ID NO:I4,
(h) аминокислотной последовательности, изложенной под SEQ ID NO:16,(h) the amino acid sequence set forth under SEQ ID NO:16,
(i) аминокислотной последовательности, изложенной под SEQ ID NO:18,(i) the amino acid sequence set forth under SEQ ID NO:18,
(j) аминокислотной последовательности, изложенной под SEQ ID NO:20,(j) the amino acid sequence set forth under SEQ ID NO:20,
(k) аминокислотной последовательности, изложенной под SEQ ID NO:22,(k) the amino acid sequence set forth under SEQ ID NO:22,
(l) аминокислотной последовательности, изложенной под SEQ ID NO:24,(l) the amino acid sequence set forth under SEQ ID NO:24,
(m) аминокислотной последовательности, изложенной под SEQ ID NO:26,(m) the amino acid sequence set forth under SEQ ID NO:26,
(n) аминокислотной последовательности, изложенной под SEQ ID NO:28,(n) the amino acid sequence set forth under SEQ ID NO:28,
(о) аминокислотной последовательности, изложенной под SEQ ID NO:30,(o) the amino acid sequence set forth under SEQ ID NO:30,
(р) аминокислотной последовательности, изложенной под SEQ ID NO:32,(p) the amino acid sequence set forth under SEQ ID NO:32,
(q) аминокислотной последовательности, изложенной под SEQ ID NO:34,(q) the amino acid sequence set forth under SEQ ID NO:34,
(r) аминокислотной последовательности, изложенной под SEQ ID NO:36,(r) the amino acid sequence set forth under SEQ ID NO:36,
(s) аминокислотной последовательности, изложенной под SEQ ID NO:53,(s) the amino acid sequence set forth under SEQ ID NO:53,
(t) аминокислотной последовательности, изложенной под SEQ ID NO:55,(t) the amino acid sequence set forth under SEQ ID NO:55,
(u) аминокислотной последовательности, изложенной под SEQ ID NO:57,(u) the amino acid sequence set forth under SEQ ID NO:57,
(v) аминокислотной последовательности, изложенной под SEQ ID NO:59,(v) the amino acid sequence set forth under SEQ ID NO:59,
(w) аминокислотной последовательности, изложенной под SEQ ID NO:61,(w) the amino acid sequence set forth under SEQ ID NO:61,
(х) аминокислотной последовательности, изложенной под SEQ ID NO:63,(x) the amino acid sequence set forth under SEQ ID NO:63,
(у) аминокислотной последовательности, изложенной под SEQ ID NO:65,(y) the amino acid sequence set forth under SEQ ID NO:65,
(z) аминокислотной последовательности, изложенной под SEQ ID NO:67,(z) the amino acid sequence set forth under SEQ ID NO:67,
(аа) аминокислотной последовательности, изложенной под SEQ ID NO:69,(aa) the amino acid sequence set forth under SEQ ID NO:69,
(bb) аминокислотной последовательности, изложенной под SEQ ID NO:71,(bb) the amino acid sequence set forth under SEQ ID NO:71,
(сс) аминокислотной последовательности, характеризующейся значительной идентичностью последовательности, например по меньшей мере 95% идентичностью, с SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:I4, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:57, SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:61, SEQ ID NO:63, SEQ ID NO:65, SEQ ID NO:67, SEQ ID NO:69 или SEQ ID NO:71, и(cc) an amino acid sequence having substantial sequence identity, such as at least 95% identity, to SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:I4, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:57, SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:61, SEQ ID NO:63, SEQ ID NO:65, SEQ ID NO:67, SEQ ID NO:69 or SEQ ID NO:71, and
(dd) аминокислотной последовательности любой из частей VP2 и/или VP3 из аминокислотных последовательностей, изложенных в любом из (а)-(сс).(dd) the amino acid sequence of any of the portions of VP2 and/or VP3 from the amino acid sequences set forth in any of (a) to (cc).
Вариант осуществления 39. Частица AAV по любому из предыдущих вариантов осуществления, дополнительно содержащая эталонный капсидный белок, так что капсид представляет собой мозаичный капсид.Embodiment 39. The AAV particle of any of the preceding embodiments further comprising a reference capsid protein such that the capsid is a mosaic capsid.
Вариант осуществления 40. Частица AAV по любому из предыдущих вариантов осуществления, содержащая мозаичный капсид, который содержит капсидный белок VP3, модифицированный с помощью первого партнера из связывающейся пары белок:белок, и эталонный капсидный белок VP3.Embodiment 40. An AAV particle according to any of the previous embodiments, comprising a mosaic capsid that comprises a VP3 capsid protein modified with a first partner of a protein:protein binding pair and a reference VP3 capsid protein.
Вариант осуществления 41. Капсидный белок аденоассоциированного вируса (AAV), содержащий аминокислотную последовательность капсидного белка AAV животного, не являющегося приматом, или отдаленного AAV, где капсидный белок AAV выбран из группы, состоящей из:Embodiment 41. A capsid protein of an adeno-associated virus (AAV) comprising an amino acid sequence of a capsid protein of a non-primate AAV or a distant AAV, wherein the AAV capsid protein is selected from the group consisting of:
(a) химерного капсидного белка VP1 AAV, где необязательно химерный капсидный белок VP1 AAV животного модифицирован с включением по меньшей мере первого партнера из связывающейся пары белок:белок, детектируемой метки и/или точечной мутации,(a) a chimeric AAV VP1 capsid protein, wherein optionally the chimeric AAV VP1 capsid protein of an animal is modified to include at least a first partner of a protein:protein binding pair, a detectable label and/or a point mutation,
(b) нехимерного капсидного белка VP1 AAV, модифицированного с включением по меньшей мере первого партнера из связывающейся пары белок:белок и/или детектируемой метки,(b) a non-chimeric AAV VP1 capsid protein modified to include at least a first partner of a protein:protein binding pair and/or a detectable label,
(c) химерного капсидного белка VP2, где необязательно химерный капсидный белок VP2 AAV модифицирован с включением по меньшей мере первого партнера из связывающейся пары белок:белок, детектируемой метки и/или точечной мутации,(c) a chimeric VP2 capsid protein, wherein optionally the chimeric VP2 AAV capsid protein is modified to include at least a first partner of a protein:protein binding pair, a detectable label and/or a point mutation,
(d) нехимерного капсидного белка VP2 AAV, модифицированного с включением по меньшей мере первого партнера из связывающейся пары белок:белок, детектируемой метки и/или точечной мутации,(d) a non-chimeric AAV VP2 capsid protein modified to include at least a first partner of a protein:protein binding pair, a detectable label and/or a point mutation,
(e) химерного капсидного белка VP3 AAV, модифицированного с включением по меньшей мере первого партнера из связывающейся пары белок:белок, детектируемой метки и/или точечной мутации, и(e) a chimeric AAV VP3 capsid protein modified to include at least a first partner of a protein:protein binding pair, a detectable label and/or a point mutation, and
(f) нехимерного капсидного белка VP3 AAV, модифицированного с включением по меньшей мере первого партнера из связывающейся пары белок:белок, детектируемой метки и/или точечной мутации.(f) a non-chimeric AAV VP3 capsid protein modified to include at least a first partner of a protein:protein binding pair, a detectable label, and/or a point mutation.
Вариант осуществления 42. Капсидный белок AAV по варианту осуществления 41, где первый партнер из связывающейся пары белок:белок фланкирован первым и/или вторым линкером, который(-ые) соединяет(-ют) первого партнера из связывающейся пары белок:белок с капсидным белком, и где длина каждого из первого и/или второго линкера независимо составляет по меньшей мере одну аминокислоту.Embodiment 42. The AAV capsid protein of embodiment 41, wherein the first partner of the protein:protein binding pair is flanked by a first and/or second linker that connects(connect) the first partner of the protein:protein binding pair to the capsid protein, and wherein the length of each of the first and/or second linker is independently at least one amino acid.
Вариант осуществления 43. Капсидный белок AAV по варианту осуществления 42, где первый и второй линкеры не являются идентичными.Embodiment 43. The AAV capsid protein of embodiment 42, wherein the first and second linkers are not identical.
Вариант осуществления 44. Капсидный белок AAV по варианту осуществления 42, где первый и второй линкеры являются идентичными, и их длина составляет 10 аминокислот.Embodiment 44. The AAV capsid protein of embodiment 42, wherein the first and second linkers are identical and are 10 amino acids in length.
Вариант осуществления 45. Капсидный белок AAV по любому из вариантов осуществления 41-44, где капсидный белок дополнительно содержит второго когнатного партнера из связывающейся пары белок:белок, где необязательно первый и второй партнеры связаны ковалентной связью, необязательно изопептидной связью.Embodiment 45. The AAV capsid protein of any one of embodiments 41-44, wherein the capsid protein further comprises a second cognate partner of a protein:protein binding pair, wherein optionally the first and second partners are linked by a covalent bond, optionally an isopeptide bond.
Вариант осуществления 46. Капсидный белок AAV по любому из вариантов осуществления 41-45, где первый партнер из связывающейся пары белок:белок предусматривает SpyTag.Embodiment 46. The AAV capsid protein of any one of embodiments 41-45, wherein the first partner of the protein:protein binding pair comprises a SpyTag.
Вариант осуществления 47. Капсидный белок AAV по варианту осуществления 45 или варианту осуществления 46, где второй когнатный партнер предусматривает SpyCatcher.Embodiment 47. The AAV capsid protein of embodiment 45 or embodiment 46, wherein the second cognate partner provides a SpyCatcher.
Вариант осуществления 48. Капсидный белок AAV по любому из вариантов осуществления 45-47, где второй когнатный партнер предусматривает KTag.Embodiment 48. The AAV capsid protein of any one of embodiments 45-47, wherein the second cognate partner comprises KTag.
Вариант осуществления 49. Капсидный белок AAV по варианту осуществления 45, где первый партнер представляет собой KTag, а второй когнатный партнер предусматривает SpyTag.Embodiment 49. The AAV capsid protein of embodiment 45, wherein the first partner is a KTag and the second cognate partner is a SpyTag.
Вариант осуществления 50. Капсидный белок AAV по варианту осуществления 45, где первый партнер представляет собой SnoopTag, а второй когнатный партнер предусматривает SnoopCatcher.Embodiment 50. The AAV capsid protein of embodiment 45, wherein the first partner is a SnoopTag and the second cognate partner comprises a SnoopCatcher.
Вариант осуществления 51. Капсидный белок AAV по варианту осуществления 45, где первый партнер представляет собой Isopeptag, а второй когнатный партнер предусматривает пилин-С.Embodiment 51. The AAV capsid protein of embodiment 45, wherein the first partner is Isopeptag and the second cognate partner comprises pilin C.
Вариант осуществления 52. Капсидный белок AAV по варианту осуществления 45, где первый партнер представляет собой SpyTag002, а второй когнатный партнер предусматривает SpyCatcher002.Embodiment 52. The AAV capsid protein of embodiment 45, wherein the first partner is SpyTag002 and the second cognate partner is SpyCatcher002.
Вариант осуществления 53. Капсидный белок AAV по любому из вариантов осуществления 45-52, где второй партнер функционально связан с нацеливающим лигандом, где необязательно нацеливающий лиганд представляет собой связывающий фрагмент.Embodiment 53. The AAV capsid protein of any one of embodiments 45-52, wherein the second partner is operably linked to a targeting ligand, wherein optionally the targeting ligand is a binding moiety.
Вариант осуществления 54. Капсидный белок AAV по варианту осуществления 53, где связывающий фрагмент представляет собой антитело или его часть.Embodiment 54. The AAV capsid protein of embodiment 53, wherein the binding fragment is an antibody or a portion thereof.
Вариант осуществления 55. Капсидный белок AAV по варианту осуществления 54, где антитело или его часть слиты с SpyCatcher.Embodiment 55. The AAV capsid protein of embodiment 54, wherein the antibody or portion thereof is fused to a SpyCatcher.
Вариант осуществления 56. Капсидный белок AAV по варианту осуществления 54 или варианту осуществления 55, где антитело или его часть слиты с линкером на С-конце, и линкер слит с SpyCatcher на С-конце линкера.Embodiment 56. The AAV capsid protein of embodiment 54 or embodiment 55, wherein the antibody or portion thereof is fused to a linker at the C-terminus, and the linker is fused to a SpyCatcher at the C-terminus of the linker.
Вариант осуществления 57. Капсидный белок AAV по варианту осуществления 56, где линкер содержит последовательность, изложенную под SEQ ID NO:49 (GSGESG).Embodiment 57. The AAV capsid protein of embodiment 56, wherein the linker comprises the sequence set forth in SEQ ID NO:49 (GSGESG).
Вариант осуществления 58. Капсидный белок AAV по любому из вариантов осуществления 41 57, где детектируемая метка предусматривает эпитоп В1, содержащий аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO:45.Embodiment 58. The AAV capsid protein of any one of embodiments 41-57, wherein the detectable label provides a B1 epitope comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO:45.
Вариант осуществления 59. Капсидный белок AAV по любому из вариантов осуществления 41-58, где указанный AAV животного, не являющегося приматом, представляет собой AAV животного, не являющегося приматом, приведенный в таблице 1.Embodiment 59. The AAV capsid protein of any one of embodiments 41-58, wherein said non-primate AAV is a non-primate AAV listed in Table 1.
Вариант осуществления 60. Капсидный белок AAV по любому из вариантов осуществления 41 59, где AAV животного, не являющегося приматом, представляет собой птичий AAV, AAV морского льва или AAV бородатой агамы.Embodiment 60. The AAV capsid protein of any one of embodiments 41 to 59, wherein the non-primate AAV is an avian AAV, a sea lion AAV, or a bearded dragon AAV.
Вариант осуществления 61. Капсидный белок AAV по любому из вариантов осуществления 41 60, где AAV животного, не являющегося приматом, представляет собой AAAV.Embodiment 61. The AAV capsid protein of any one of embodiments 41 to 60, wherein the non-primate AAV is AAAV.
Вариант осуществления 62. Капсидный белок AAV по любому из вариантов осуществления 41-61, где модификация находится в положении I444 или I580 капсидного белка VP1 AAAV.Embodiment 62. The AAV capsid protein of any one of embodiments 41-61, wherein the modification is at position I444 or I580 of the AAAV capsid protein VP1.
Вариант осуществления 63. Капсидный белок AAV по любому из вариантов осуществления 41-60, где AAV животного, не являющегося приматом, представляет собой AAV чешуйчатого пресмыкающегося.Embodiment 63. The AAV capsid protein of any one of embodiments 41-60, wherein the non-primate AAV is a squamate AAV.
Вариант осуществления 64. Капсидный белок AAV по любому из вариантов осуществления 41-60 и 63, где AAV чешуйчатого пресмыкающегося представляет собой AAV бородатой агамы.Embodiment 64. The AAV capsid protein of any one of embodiments 41-60 and 63, wherein the scaled reptile AAV is a bearded dragon AAV.
Вариант осуществления 65. Капсидный белок AAV по любому из вариантов осуществления 41-60 и 63-64, где модификация находится в положении I573 или I436 капсидного белка VP1 AAV бородатой агамы.Embodiment 65. The AAV capsid protein of any one of embodiments 41-60 and 63-64, wherein the modification is at position I573 or I436 of the bearded dragon AAV capsid protein VP1.
Вариант осуществления 66. Капсидный белок AAV по любому из вариантов осуществления 41 60, где AAV животного, не являющегося приматом, представляет собой AAV млекопитающего.Embodiment 66. The AAV capsid protein of any one of embodiments 41 to 60, wherein the non-primate AAV is a mammalian AAV.
Вариант осуществления 67. Капсидный белок AAV по любому из вариантов осуществления 41 60 и 66, где AAV млекопитающего представляет собой AAV морского льва.Embodiment 67. The AAV capsid protein of any one of embodiments 41, 60 and 66, wherein the mammalian AAV is a sea lion AAV.
Вариант осуществления 68. Капсидный белок AAV по любому из вариантов осуществления 41 60 и 66 67, где модификация находится в положении, выбранном из группы, состоящей из I429, I430, I431, I432, I433, I434, I436, I437 и А565 VP1 AAV морского льва.Embodiment 68. The AAV capsid protein of any one of embodiments 41-60 and 66-67, wherein the modification is at a position selected from the group consisting of I429, I430, I431, I432, I433, I434, I436, I437 and A565 of sea lion AAV VP1.
Вариант осуществления 69. Капсидный белок AAV по любому из вариантов осуществления 41 68, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:Embodiment 69. The AAV capsid protein of any one of embodiments 41 to 68, comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of:
(а) аминокислотной последовательности, изложенной под SEQ ID NO:2,(a) the amino acid sequence set forth under SEQ ID NO:2,
(b) аминокислотной последовательности, изложенной под SEQ ID NO:4,(b) the amino acid sequence set forth under SEQ ID NO:4,
(c) аминокислотной последовательности, изложенной под SEQ ID NO:6,(c) the amino acid sequence set forth under SEQ ID NO:6,
(d) аминокислотной последовательности, изложенной под SEQ ID NO:8,(d) the amino acid sequence set forth under SEQ ID NO:8,
(e) аминокислотной последовательности, изложенной под SEQ ID NO:10,(e) the amino acid sequence set forth under SEQ ID NO:10,
(f) аминокислотной последовательности, изложенной под SEQ ID NO:12,(f) the amino acid sequence set forth under SEQ ID NO:12,
(g) аминокислотной последовательности, изложенной под SEQ ID NO:I4,(g) the amino acid sequence set forth under SEQ ID NO:I4,
(h) аминокислотной последовательности, изложенной под SEQ ID NO:16,(h) the amino acid sequence set forth under SEQ ID NO:16,
(i) аминокислотной последовательности, изложенной под SEQ ID NO:18,(i) the amino acid sequence set forth under SEQ ID NO:18,
(j) аминокислотной последовательности, изложенной под SEQ ID NO:20,(j) the amino acid sequence set forth under SEQ ID NO:20,
(k) аминокислотной последовательности, изложенной под SEQ ID NO:22,(k) the amino acid sequence set forth under SEQ ID NO:22,
(l) аминокислотной последовательности, изложенной под SEQ ID NO:24,(l) the amino acid sequence set forth under SEQ ID NO:24,
(m) аминокислотной последовательности, изложенной под SEQ ID NO:26,(m) the amino acid sequence set forth under SEQ ID NO:26,
(n) аминокислотной последовательности, изложенной под SEQ ID NO:28,(n) the amino acid sequence set forth under SEQ ID NO:28,
(о) аминокислотной последовательности, изложенной под SEQ ID NO:30,(o) the amino acid sequence set forth under SEQ ID NO:30,
(р) аминокислотной последовательности, изложенной под SEQ ID NO:32,(p) the amino acid sequence set forth under SEQ ID NO:32,
(q) аминокислотной последовательности, изложенной под SEQ ID NO:34,(q) the amino acid sequence set forth under SEQ ID NO:34,
(r) аминокислотной последовательности, изложенной под SEQ ID NO:36,(r) the amino acid sequence set forth under SEQ ID NO:36,
(s) аминокислотной последовательности, изложенной под SEQ ID NO:53,(s) the amino acid sequence set forth under SEQ ID NO:53,
(t) аминокислотной последовательности, изложенной под SEQ ID NO:55,(t) the amino acid sequence set forth under SEQ ID NO:55,
(u) аминокислотной последовательности, изложенной под SEQ ID NO:57,(u) the amino acid sequence set forth under SEQ ID NO:57,
(v) аминокислотной последовательности, изложенной под SEQ ID NO:59,(v) the amino acid sequence set forth under SEQ ID NO:59,
(w) аминокислотной последовательности, изложенной под SEQ ID NO:61,(w) the amino acid sequence set forth under SEQ ID NO:61,
(х) аминокислотной последовательности, изложенной под SEQ ID NO:63,(x) the amino acid sequence set forth under SEQ ID NO:63,
(у) аминокислотной последовательности, изложенной под SEQ ID NO:65,(y) the amino acid sequence set forth under SEQ ID NO:65,
(z) аминокислотной последовательности, изложенной под SEQ ID NO:67,(z) the amino acid sequence set forth under SEQ ID NO:67,
(аа) аминокислотной последовательности, изложенной под SEQ ID NO:69,(aa) the amino acid sequence set forth under SEQ ID NO:69,
(bb) аминокислотной последовательности, изложенной под SEQ ID NO:71,(bb) the amino acid sequence set forth under SEQ ID NO:71,
(сс) аминокислотной последовательности, характеризующейся значительной идентичностью последовательности, например по меньшей мере 95% идентичностью, с SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:I4, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:57, SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:61, SEQ ID NO:63, SEQ ID NO:65, SEQ ID NO:67, SEQ ID NO:69 или SEQ ID NO:71, и(cc) an amino acid sequence having substantial sequence identity, such as at least 95% identity, to SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:I4, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:57, SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:61, SEQ ID NO:63, SEQ ID NO:65, SEQ ID NO:67, SEQ ID NO:69 or SEQ ID NO:71, and
(dd) аминокислотной последовательности любой из частей VP2 и/или VP3 из аминокислотных последовательностей, изложенных в любом из (а)-(сс).(dd) the amino acid sequence of any of the portions of VP2 and/or VP3 from the amino acid sequences set forth in any of (a) to (cc).
Вариант осуществления 70. Капсидный белок AAV по любому из вариантов осуществления 41-69, где первый партнер из связывающейся пары белок:белок содержит детектируемую метку.Embodiment 70. The AAV capsid protein of any one of embodiments 41-69, wherein the first partner of the protein:protein binding pair comprises a detectable label.
Вариант осуществления 71. Капсидный белок AAV по варианту осуществления 70, где детектируемая метка предусматривает c-myc (SEQ ID NO:44).Embodiment 71. The AAV capsid protein of embodiment 70, wherein the detectable label comprises c-myc (SEQ ID NO:44).
Вариант осуществления 72. Частица AAV, содержащая капсидный белок AAV по любому из вариантов осуществления 41-71.Embodiment 72. An AAV particle comprising the AAV capsid protein of any one of embodiments 41-71.
Вариант осуществления 73. Нуклеиновая кислота, содержащая ген cap, кодирующий капсидный белок AAV по любому из вариантов осуществления 41-71.Embodiment 73. A nucleic acid comprising a cap gene encoding the AAV capsid protein of any one of embodiments 41-71.
Вариант осуществления 74. Молекула нуклеиновой кислоты, содержащая ген cap AAV, который кодирует капсидный белок AAV,Embodiment 74. A nucleic acid molecule comprising an AAV cap gene that encodes an AAV capsid protein,
где ген cap AAV содержит по меньшей мере часть нуклеотидной последовательности гена cap, выбранного из группы, состоящей из:wherein the AAV cap gene comprises at least a portion of the nucleotide sequence of a cap gene selected from the group consisting of:
(i) гена cap AAV животного, не являющегося приматом,(i) the cap gene of an AAV from a non-primate animal,
(ii) гена cap отдаленного AAV или(ii) the cap gene of a distant AAV or
(iii) их комбинации,(iii) their combinations,
где указанный ген cap AAV дополнительно модифицирован с включением:where the specified AAV cap gene is further modified to include:
(a) нуклеотидной последовательности, кодирующей первого партнера из связывающейся пары белок:белок,(a) a nucleotide sequence encoding the first partner of a protein:protein binding pair,
(b) нуклеотидной последовательности, кодирующей детектируемую метку,(b) a nucleotide sequence encoding a detectable label,
(c) точечной мутации,(c) point mutation,
(d) химерной нуклеотидной последовательности, содержащей часть нуклеотидной последовательности гена cap другого AAV, которая функционально связана с указанной нуклеотидной последовательностью гена cap AAV, выбранного из группы, состоящей из гена cap AAV животного, не являющегося приматом, отдаленного AAV или их комбинации,(d) a chimeric nucleotide sequence comprising a portion of a nucleotide sequence of a cap gene of another AAV that is operably linked to said nucleotide sequence of a cap gene of an AAV selected from the group consisting of a cap gene of an AAV of a non-primate animal, a distant AAV, or a combination thereof,
(e) любой комбинации (а), (b), (с) и (d).(e) any combination of (a), (b), (c) and (d).
Вариант осуществления 75. Молекула нуклеиновой кислоты, содержащая ген cap AAV, который кодирует капсидный белок AAV,Embodiment 75. A nucleic acid molecule comprising an AAV cap gene that encodes an AAV capsid protein,
где ген cap AAV содержит по меньшей мере часть нуклеотидной последовательности гена cap AAV животного, не являющегося приматом,wherein the AAV cap gene comprises at least a portion of the nucleotide sequence of an AAV cap gene of a non-primate animal,
где указанный ген cap AAV дополнительно модифицирован с включением:where the specified AAV cap gene is further modified to include:
(a) нуклеотидной последовательности, кодирующей первого партнера из связывающейся пары белок:белок,(a) a nucleotide sequence encoding the first partner of a protein:protein binding pair,
(b) нуклеотидной последовательности, кодирующей детектируемую метку,(b) a nucleotide sequence encoding a detectable label,
(c) точечной мутации,(c) point mutation,
(d) химерной нуклеотидной последовательности, содержащей часть нуклеотидной последовательности гена cap другого AAV, которая функционально связана с указанной нуклеотидной последовательностью гена cap AAV животного, не являющегося приматом,(d) a chimeric nucleotide sequence comprising a portion of a nucleotide sequence of a cap gene of another AAV that is operably linked to said nucleotide sequence of a cap gene of an AAV of a non-primate animal,
(e) любой комбинации (а), (b), (с) и (d).(e) any combination of (a), (b), (c) and (d).
Вариант осуществления 76. Молекула нуклеиновой кислоты, содержащая ген cap AAV, который кодирует капсидный белок AAV,Embodiment 76. A nucleic acid molecule comprising an AAV cap gene that encodes an AAV capsid protein,
где ген cap AAV содержит по меньшей мере часть нуклеотидной последовательности гена cap AAV отдаленного животного,wherein the AAV cap gene comprises at least a portion of the nucleotide sequence of an AAV cap gene from a distant animal,
где указанный ген cap AAV дополнительно модифицирован с включением:where the specified AAV cap gene is further modified to include:
(a) нуклеотидной последовательности, кодирующей первого партнера из связывающейся пары белок:белок,(a) a nucleotide sequence encoding the first partner of a protein:protein binding pair,
(b) нуклеотидной последовательности, кодирующей детектируемую метку,(b) a nucleotide sequence encoding a detectable label,
(c) точечной мутации,(c) point mutation,
(d) химерной нуклеотидной последовательности, содержащей часть нуклеотидной последовательности гена cap другого AAV, которая функционально связана с указанной нуклеотидной последовательностью гена cap AAV отдаленного животного,(d) a chimeric nucleotide sequence comprising a portion of a nucleotide sequence of a cap gene of another AAV that is operably linked to said nucleotide sequence of a cap gene of an AAV of a distant animal,
(e) любой комбинации (а), (b), (с) и (d).(e) any combination of (a), (b), (c) and (d).
Вариант осуществления 77. Молекула нуклеиновой кислоты, содержащая ген rep AAV и ген cap AAV,Embodiment 77. A nucleic acid molecule comprising an AAV rep gene and an AAV cap gene,
где ген cap AAV содержит первую нуклеотидную последовательность гена cap, выбранного из группы, состоящей из:wherein the AAV cap gene comprises a first nucleotide sequence of a cap gene selected from the group consisting of:
(i) гена cap AAV животного, не являющегося приматом,(i) the cap gene of an AAV from a non-primate animal,
(ii) гена cap отдаленного AAV и(ii) the cap gene of distant AAV and
(iii) их комбинации,(iii) their combinations,
где ген rep AAV содержит вторую нуклеотидную последовательность гена rep AAV другого AAV.wherein the AAV rep gene comprises a second nucleotide sequence of an AAV rep gene of another AAV.
Вариант осуществления 78. Молекула нуклеиновой кислоты, содержащая ген rep AAV и ген cap AAV,Embodiment 78. A nucleic acid molecule comprising an AAV rep gene and an AAV cap gene,
где ген cap AAV содержит первую нуклеотидную последовательность гена cap AAV животного, не являющегося приматом,where the AAV cap gene comprises the first nucleotide sequence of an AAV cap gene of a non-primate animal,
где ген rep AAV содержит вторую нуклеотидную последовательность гена rep AAV другого AAV.wherein the AAV rep gene comprises a second nucleotide sequence of an AAV rep gene of another AAV.
Вариант осуществления 79. Молекула нуклеиновой кислоты, содержащая ген rep AAV и ген cap AAV,Embodiment 79. A nucleic acid molecule comprising an AAV rep gene and an AAV cap gene,
где ген cap AAV содержит первую нуклеотидную последовательность гена cap AAV отделенного животного,where the AAV cap gene contains the first nucleotide sequence of the AAV cap gene of the isolated animal,
где ген rep AAV содержит вторую нуклеотидную последовательность гена rep AAV другого AAV.wherein the AAV rep gene comprises a second nucleotide sequence of an AAV rep gene of another AAV.
Вариант осуществления 80. Молекула нуклеиновой кислоты по любому из вариантов осуществления 73-79, где ген cap функционально связан с промотором.Embodiment 80. The nucleic acid molecule of any one of embodiments 73-79, wherein the cap gene is operably linked to a promoter.
Вариант осуществления 81. Молекула нуклеиновой кислоты по варианту осуществления 80, где указанный промотор управляет экспрессией капсидного(-ых) белка(-ов) в упаковывающей клетке.Embodiment 81. The nucleic acid molecule of embodiment 80, wherein said promoter directs expression of capsid protein(s) in a packaging cell.
Вариант осуществления 82. Молекула нуклеиновой кислоты по варианту осуществления 80 или варианту осуществления 81, где промотор выбран из р40, SV40, EF, CMV, В19р6 и СAG.Embodiment 82. The nucleic acid molecule of embodiment 80 or embodiment 81, wherein the promoter is selected from p40, SV40, EF, CMV, B19p6 and CAG.
Вариант осуществления 83. Молекула нуклеиновой кислоты по любому из вариантов осуществления 73-82, где указанная нуклеотидная последовательность гена cap AAV животного, не являющегося приматом, гена cap отдаленного AAV или их комбинации модифицирована с включением:Embodiment 83. The nucleic acid molecule of any one of embodiments 73-82, wherein said nucleotide sequence of a non-primate AAV cap gene, a distant AAV cap gene, or a combination thereof is modified to include:
(a) нуклеотидной последовательности, кодирующей по меньшей мере первого партнера из связывающейся пары белок:белок,(a) a nucleotide sequence encoding at least a first partner of a protein:protein binding pair,
(b) нуклеотидной последовательности, кодирующей детектируемую метку, и/или(b) a nucleotide sequence encoding a detectable label, and/or
(c) нуклеотидной последовательности, кодирующей точечную мутацию.(c) a nucleotide sequence encoding a point mutation.
Вариант осуществления 84. Молекула нуклеиновой кислоты по варианту осуществления 83, где связывающаяся пара белок:белок выбрана из SpyTag: SpyCatcher, SpyTag:KTag, Isopeptag:raMHH-C, SnoopTag:SnoopCatcher и SpyTag002: SpyCatcher002.Embodiment 84. The nucleic acid molecule of embodiment 83, wherein the protein:protein binding pair is selected from SpyTag:SpyCatcher, SpyTag:KTag, Isopeptag:raMHH-C, SnoopTag:SnoopCatcher, and SpyTag002:SpyCatcher002.
Вариант осуществления 85. Молекула нуклеиновой кислоты по варианту осуществления 83, где первый партнер из связывающейся пары белок:белок содержит с-myc, содержащую последовательность, изложенную под SEQ ID NO:44.Embodiment 85. The nucleic acid molecule of embodiment 83, wherein the first partner of the protein:protein binding pair comprises c-myc comprising the sequence set forth in SEQ ID NO:44.
Вариант осуществления 86. Молекула нуклеиновой кислоты по любому из вариантов осуществления 83-85, где детектируемая метка предусматривает эпитоп В1, содержащий аминокислотную последовательность IGTRYLTR (SEQ ID NO:45).Embodiment 86. The nucleic acid molecule of any one of embodiments 83-85, wherein the detectable label provides a B1 epitope comprising the amino acid sequence IGTRYLTR (SEQ ID NO:45).
Вариант осуществления 87. Молекула нуклеиновой кислоты по любому из вариантов осуществления 73-86, где указанная нуклеотидная последовательность гена cap AAV животного, не являющегося приматом, гена cap отдаленного AAV или их комбинации содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность капсидного белка VP3 AAV животного, не являющегося приматом, и/или аминокислотную последовательность капсидного белка VP3 отдаленного AAV.Embodiment 87. The nucleic acid molecule of any one of embodiments 73-86, wherein said nucleotide sequence of a non-primate AAV cap gene, a distant AAV cap gene, or a combination thereof comprises a nucleotide sequence encoding an amino acid sequence of a non-primate AAV capsid protein VP3 and/or an amino acid sequence of a distant AAV capsid protein VP3.
Вариант осуществления 88. Молекула нуклеиновой кислоты по любому из вариантов осуществления 73-87, где указанная нуклеотидная последовательность гена cap AAV животного, не являющегося приматом, гена cap отдаленного AAV или их комбинации содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность капсидного белка VP2 AAV животного, не являющегося приматом, и/или аминокислотную последовательность капсидного белка VP2 отдаленного AAV.Embodiment 88. The nucleic acid molecule of any one of embodiments 73-87, wherein said nucleotide sequence of a non-primate AAV cap gene, a distant AAV cap gene, or a combination thereof comprises a nucleotide sequence encoding an amino acid sequence of a non-primate AAV capsid protein VP2 and/or an amino acid sequence of a distant AAV capsid protein VP2.
Вариант осуществления 89. Молекула нуклеиновой кислоты по любому из вариантов осуществления 73-87, где указанная нуклеотидная последовательность гена cap AAV животного, не являющегося приматом, гена cap отдаленного AAV или их комбинации содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность капсидного белка VP1 AAV животного, не являющегося приматом, и/или аминокислотную последовательность капсидного белка VP 1 отдаленного AAV.Embodiment 89. The nucleic acid molecule of any one of embodiments 73-87, wherein said nucleotide sequence of a non-primate AAV cap gene, a distant AAV cap gene, or a combination thereof comprises a nucleotide sequence encoding an amino acid sequence of a non-primate AAV capsid protein VP1 and/or an amino acid sequence of a distant AAV capsid protein VP1.
Вариант осуществления 90. Молекула нуклеиновой кислоты по любому из вариантов осуществления 73-89, где ген cap кодирует:Embodiment 90. The nucleic acid molecule of any one of embodiments 73-89, wherein the cap gene encodes:
(i) капсидный белок VP1, который представляет собой один из:(i) capsid protein VP1, which is one of:
химерного капсидного белка VP1 AAV, где необязательно химерный капсидный белок VP1 содержит уникальную область VP1 (VP1-u) другого AAV, функционально связанную с общей областью VP1/VP2 и областью VP3 AAV животного, не являющегося приматом, илиa chimeric VP1 capsid protein of an AAV, wherein optionally the chimeric VP1 capsid protein comprises a unique VP1 region (VP1-u) of another AAV operably linked to a common VP1/VP2 region and a VP3 region of a non-primate AAV, or
капсидного белка VP1 AAV животного, не являющегося приматом, или отдаленного AAV,capsid protein VP1 of a non-primate AAV or a distant AAV,
(ii) капсидный белок VP2, который представляет собой один из:(ii) capsid protein VP2, which is one of:
химерного капсидного белка VP2 AAV, где необязательно химерный капсидный белок VP2 содержит общую область VP1/VP2 другого AAV, функционально связанную с областью VP3 AAV животного, не являющегося приматом, или отдаленного AAV, илиa chimeric VP2 capsid protein of an AAV, wherein optionally the chimeric VP2 capsid protein comprises a common VP1/VP2 region of another AAV operably linked to a VP3 region of a non-primate AAV or a distant AAV, or
капсидного белка VP2 AAV животного, не являющегося приматом, или отдаленного AAV, и/илиthe VP2 capsid protein of a non-primate AAV or a distant AAV, and/or
(iii) капсидный белок VP3 AAV животного, не являющегося приматом, или отдаленного AAV.(iii) the VP3 capsid protein of a non-primate AAV or a distant AAV.
Вариант осуществления 91. Молекула нуклеиновой кислоты по любому из вариантов осуществления 73-90, где ген cap кодирует:Embodiment 91. The nucleic acid molecule of any one of embodiments 73-90, wherein the cap gene encodes:
(i) химерный капсидный белок VP1 AAV, где необязательно химерный капсидный белок VP1 содержит уникальную область VP1 (VP1-u) другого AAV, функционально связанную с общей областью VP1/VP2 и областью VP3 AAV животного, не являющегося приматом,(i) a chimeric VP1 capsid protein of an AAV, wherein optionally the chimeric VP1 capsid protein comprises a unique VP1 region (VP1-u) of another AAV operably linked to a common VP1/VP2 region and a VP3 region of a non-primate AAV,
(ii) химерный капсидный белок VP2 AAV, где необязательно химерный капсидный белок VP2 содержит общую область VP1/VP2 другого AAV, функционально связанную с областью VP3 AAV животного, не являющегося приматом, или отдаленного AAV, и/или(ii) a chimeric VP2 capsid protein of an AAV, wherein optionally the chimeric VP2 capsid protein comprises a common VP1/VP2 region of another AAV operably linked to a VP3 region of a non-primate AAV or a distant AAV, and/or
(iii) капсидный белок VP3 AAV животного, не являющегося приматом, или отдаленного AAV.(iii) the VP3 capsid protein of a non-primate AAV or a distant AAV.
Вариант осуществления 92. Молекула нуклеиновой кислоты по любому из вариантов осуществления 73-90, где ген cap кодирует:Embodiment 92. The nucleic acid molecule of any one of embodiments 73-90, wherein the cap gene encodes:
(i) химерный капсидный белок VP1 AAV, где необязательно химерный капсидный белок VP1 содержит уникальную область VP1 (VP1-u) другого AAV, функционально связанную с общей областью VP1/VP2 и областью VP3 AAV животного, не являющегося приматом,(i) a chimeric VP1 capsid protein of an AAV, wherein optionally the chimeric VP1 capsid protein comprises a unique VP1 region (VP1-u) of another AAV operably linked to a common VP1/VP2 region and a VP3 region of a non-primate AAV,
(ii) капсидный белок VP2 AAV животного, не являющегося приматом, или отдаленного AAV, и(ii) the VP2 capsid protein of a non-primate AAV or a distant AAV, and
(iii) капсидный белок VP3 AAV животного, не являющегося приматом, или отдаленного AAV.(iii) the VP3 capsid protein of a non-primate AAV or a distant AAV.
Вариант осуществления 93. Молекула нуклеиновой кислоты по любому из вариантов осуществления 73-90, где ген cap кодирует:Embodiment 93. The nucleic acid molecule of any one of embodiments 73-90, wherein the cap gene encodes:
(i) капсидный белок VP1 AAV животного, не являющегося приматом, или отдаленного AAV,(i) the VP1 capsid protein of a non-primate AAV or a distant AAV,
(ii) капсидный белок VP2 AAV животного, не являющегося приматом, или отдаленного AAV, и/или(ii) the VP2 capsid protein of a non-primate AAV or a distant AAV, and/or
(iii) капсидный белок VP3 AAV животного, не являющегося приматом, или отдаленного AAV.(iii) the VP3 capsid protein of a non-primate AAV or a distant AAV.
Вариант осуществления 94. Молекула нуклеиновой кислоты по любому из вариантов осуществления 73-93, где указанный другой AAV представляет собой AAV примата или комбинацию AAV примата.Embodiment 94. The nucleic acid molecule of any one of embodiments 73-93, wherein said other AAV is a primate AAV or a combination of primate AAVs.
Вариант осуществления 95. Молекула нуклеиновой кислоты по любому из вариантов осуществления 73-94, где указанный другой AAV выбран из группы, состоящей из AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9 и их комбинации.Embodiment 95. The nucleic acid molecule of any one of embodiments 73-94, wherein said other AAV is selected from the group consisting of AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, and a combination thereof.
Вариант осуществления 96. Молекула нуклеиновой кислоты по любому из вариантов осуществления 73-95, где указанный другой AAV представляет собой AAV2.Embodiment 96. The nucleic acid molecule of any one of embodiments 73-95, wherein said other AAV is AAV2.
Вариант осуществления 97. Молекула нуклеиновой кислоты по любому из вариантов осуществления 73-75, 77-78 и 80-96, где указанный AAV животного, не являющегося приматом, представляет собой AAV животного, не являющегося приматом, приведенный в таблице 1.Embodiment 97. The nucleic acid molecule of any one of embodiments 73-75, 77-78, and 80-96, wherein said non-primate AAV is a non-primate AAV listed in Table 1.
Вариант осуществления 98. Молекула нуклеиновой кислоты по любому из вариантов осуществления 73-75, 77-78 и 80-97, где AAV животного, не являющегося приматом, представляет собой птичий AAV, AAV морского льва или AAV бородатой агамы.Embodiment 98. The nucleic acid molecule of any one of embodiments 73-75, 77-78, and 80-97, wherein the non-primate AAV is an avian AAV, a sea lion AAV, or a bearded dragon AAV.
Вариант осуществления 99. Молекула нуклеиновой кислоты по любому из вариантов осуществления 73-75, 77-78 и 80-98, где AAV животного, не являющегося приматом, представляет собой AAAV.Embodiment 99. The nucleic acid molecule of any one of embodiments 73-75, 77-78, and 80-98, wherein the non-primate AAV is AAAV.
Вариант осуществления 100. Молекула нуклеиновой кислоты по любому из вариантов осуществления 73-75, 77-78 и 80-99, где модификация находится в кодоне, кодирующем положение I444 или I580 капсидного белка VP1 AAAV.Embodiment 100. The nucleic acid molecule of any one of embodiments 73-75, 77-78, and 80-99, wherein the modification is in a codon encoding position I444 or I580 of the AAAV VP1 capsid protein.
Вариант осуществления 101. Молекула нуклеиновой кислоты по любому из вариантов осуществления 73-75, 77-78 и 80-98, где AAV животного, не являющегося приматом, представляет собой AAV чешуйчатого пресмыкающегося.Embodiment 101. The nucleic acid molecule of any one of embodiments 73-75, 77-78, and 80-98, wherein the non-primate AAV is a squamate AAV.
Вариант осуществления 102. Молекула нуклеиновой кислоты по любому из вариантов осуществления 73-75, 77-78, 80-98 и 101, где AAV чешуйчатого пресмыкающегося представляет собой AAV бородатой агамы.Embodiment 102. The nucleic acid molecule of any one of embodiments 73-75, 77-78, 80-98, and 101, wherein the scaly reptile AAV is a bearded dragon AAV.
Вариант осуществления 103. Молекула нуклеиновой кислоты по любому из вариантов осуществления 73-75, 76-77 и 80-98 и 101-102, где модификация находится в кодоне, кодирующем положение I573 или I436 капсидного белка VP1 AAV бородатой агамы.Embodiment 103. The nucleic acid molecule of any one of embodiments 73-75, 76-77 and 80-98 and 101-102, wherein the modification is at a codon encoding position I573 or I436 of the bearded dragon AAV VP1 capsid protein.
Вариант осуществления 104. Молекула нуклеиновой кислоты по любому из вариантов осуществления 73-75, 76-77 и 80-98, где AAV животного, не являющегося приматом, представляет собой AAV млекопитающего.Embodiment 104. The nucleic acid molecule of any one of embodiments 73-75, 76-77, and 80-98, wherein the non-primate AAV is a mammalian AAV.
Вариант осуществления 105. Молекула нуклеиновой кислоты по любому из вариантов осуществления 73-75, 77-78, 80-98 и 104, где AAV млекопитающего представляет собой AAV морского льва.Embodiment 105. The nucleic acid molecule of any one of embodiments 73-75, 77-78, 80-98, and 104, wherein the mammalian AAV is a sea lion AAV.
Вариант осуществления 106. Молекула нуклеиновой кислоты по любому из вариантов осуществления 73-75, 77-78, 80-98 и 105, где модификация находится в положении, выбранном из группы, состоящей из I429, I430, I431, I432, I433, I434, I436,I437 и А565 VP1 AAV морского льва.Embodiment 106. The nucleic acid molecule of any one of embodiments 73-75, 77-78, 80-98 and 105, wherein the modification is at a position selected from the group consisting of I429, I430, I431, I432, I433, I434, I436, I437 and A565 of sea lion AAV VP1.
Вариант осуществления 107. Молекула нуклеиновой кислоты по любому из вариантов осуществления 73-106, содержащая нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:Embodiment 107. The nucleic acid molecule of any one of embodiments 73-106, comprising a nucleotide sequence selected from the group consisting of:
(a) нуклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO:l,(a) the nucleotide sequence set forth under SEQ ID NO:l,
(b) нуклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO:3,(b) the nucleotide sequence set forth under SEQ ID NO:3,
(c) нуклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO:5,(c) the nucleotide sequence set forth under SEQ ID NO:5,
(d) нуклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO:7,(d) the nucleotide sequence set forth under SEQ ID NO:7,
(e) нуклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO:9,(e) the nucleotide sequence set forth under SEQ ID NO:9,
(f) нуклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO:11,(f) the nucleotide sequence set forth under SEQ ID NO:11,
(g) нуклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO:13,(g) the nucleotide sequence set forth under SEQ ID NO:13,
(h) нуклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO:I5,(h) the nucleotide sequence set forth under SEQ ID NO:I5,
(i) нуклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO:17,(i) the nucleotide sequence set forth under SEQ ID NO:17,
(j) нуклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO:19,(j) the nucleotide sequence set forth under SEQ ID NO:19,
(k) нуклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO:21,(k) the nucleotide sequence set forth under SEQ ID NO:21,
(l) нуклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO:23,(l) the nucleotide sequence set forth under SEQ ID NO:23,
(m) нуклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO:25,(m) the nucleotide sequence set forth under SEQ ID NO:25,
(n) нуклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO:27,(n) the nucleotide sequence set forth under SEQ ID NO:27,
(о) нуклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO:29,(o) the nucleotide sequence set forth under SEQ ID NO:29,
(р) нуклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO:31,(p) the nucleotide sequence set forth under SEQ ID NO:31,
(q) нуклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO:33,(q) the nucleotide sequence set forth under SEQ ID NO:33,
(r) нуклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO:35,(r) the nucleotide sequence set forth under SEQ ID NO:35,
(s) нуклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO:52,(s) the nucleotide sequence set forth under SEQ ID NO:52,
(t) нуклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO:54,(t) the nucleotide sequence set forth under SEQ ID NO:54,
(u) нуклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO:56,(u) the nucleotide sequence set forth under SEQ ID NO:56,
(у) нуклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO:58,(y) the nucleotide sequence set forth under SEQ ID NO:58,
(w) нуклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO:60,(w) the nucleotide sequence set forth under SEQ ID NO:60,
(х) нуклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO:62,(x) the nucleotide sequence set forth under SEQ ID NO:62,
(у) нуклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO:64,(y) the nucleotide sequence set forth under SEQ ID NO:64,
(z) нуклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO:66,(z) the nucleotide sequence set forth under SEQ ID NO:66,
(аа) нуклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO:68,(aa) the nucleotide sequence set forth under SEQ ID NO:68,
(bb) нуклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO:70,(bb) the nucleotide sequence set forth under SEQ ID NO:70,
(сс) нуклеотидной последовательности, характеризующейся значительной идентичностью последовательности, например по меньшей мере 95% идентичностью, с нуклеотидной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO:1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70 или любой из них, кодирующих капсид VP2,(cc) a nucleotide sequence having substantial sequence identity, such as at least 95% identity, to the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO:1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70 or any of them encoding the VP2 capsid,
(dd) любой части нуклеотидной последовательности из (a)-(s), кодирующей капсидный белок VP2 и/или капсидный белок VP3.(dd) any portion of the nucleotide sequence from (a) to (s) encoding the VP2 capsid protein and/or the VP3 capsid protein.
Вариант осуществления 108. Молекула нуклеиновой кислоты по любому из вариантов осуществления 73-107, дополнительно содержащая ген rep AAV, который кодирует один или более белков Rep AAV и функционально связан с промотором.Embodiment 108. The nucleic acid molecule of any one of embodiments 73-107, further comprising an AAV rep gene that encodes one or more AAV Rep proteins and is operably linked to a promoter.
Вариант осуществления 109. Молекула нуклеиновой кислоты по варианту осуществления 108, где промотор выбран из группы, состоящей из р5, р19 SV40, EF, CMV, В19р6 и CAG.Embodiment 109. The nucleic acid molecule of embodiment 108, wherein the promoter is selected from the group consisting of p5, SV40 p19, EF, CMV, B19p6, and CAG.
Вариант осуществления 110. Молекула нуклеиновой кислоты по варианту осуществления 108 или варианту осуществления 109, где один или более белков Rep выбраны из Rep78, Rep68, Rep52 и Rep40.Embodiment 110. The nucleic acid molecule of embodiment 108 or embodiment 109, wherein the one or more Rep proteins are selected from Rep78, Rep68, Rep52, and Rep40.
Вариант осуществления 111. Молекула нуклеиновой кислоты по любому из вариантов осуществления 108-110, где один или более белков Rep предусматривают Rep78.Embodiment 111. The nucleic acid molecule of any one of embodiments 108-110, wherein the one or more Rep proteins comprise Rep78.
Вариант осуществления 112. Молекула нуклеиновой кислоты по любому из вариантов осуществления 108-110, где один или более белков Rep представляют собой белки Rep AAV животного-примата.Embodiment 112. The nucleic acid molecule of any one of embodiments 108-110, wherein the one or more Rep proteins are AAV Rep proteins of a primate animal.
Вариант осуществления 113. Капсидный белок AAV, содержащий аминокислотную последовательность любой из молекул нуклеиновой кислоты по вариантам осуществления 73-112.Embodiment 113. An AAV capsid protein comprising the amino acid sequence of any of the nucleic acid molecules of embodiments 73-112.
Вариант осуществления 114. Частица AAV, содержащая капсидный белок по варианту осуществления 113.Embodiment 114. An AAV particle comprising the capsid protein of embodiment 113.
Вариант осуществления 115. Упаковывающая клетка для продуцирования частиц AAV, содержащая молекулу нуклеиновой кислоты, которая содержит ген cap по любому из вариантов осуществления 73-112.Embodiment 115. A packaging cell for producing AAV particles comprising a nucleic acid molecule that comprises the cap gene of any one of embodiments 73-112.
Вариант осуществления 116. Упаковывающая клетка по варианту осуществления 1I5, дополнительно содержащая молекулу нуклеиновой кислоты, содержащую ген rep, кодирующий один или более белков Rep AAV, где указанный ген rep функционально связан с промотором, где необязательно ген rep и ген cap принадлежат двум разным AAV.Embodiment 116. The packaging cell of embodiment 1I5, further comprising a nucleic acid molecule comprising a rep gene encoding one or more AAV Rep proteins, wherein said rep gene is operably linked to a promoter, wherein optionally the rep gene and the cap gene belong to two different AAVs.
Вариант осуществления 117. Упаковывающая клетка по варианту осуществления 116, где промотор, функционально связанный с геном rep, управляет экспрессией капсидного(-ых) белка(-ов) Rep в упаковывающей клетке.Embodiment 117. The packaging cell of embodiment 116, wherein the promoter operably linked to the rep gene directs expression of the Rep capsid protein(s) in the packaging cell.
Вариант осуществления 118. Упаковывающая клетка по варианту осуществления 116 или варианту осуществления 117, где промотор выбран из р5, р19 SV40, EF, CMV, В19р6 и С AG.Embodiment 118. The packaging cell of embodiment 116 or embodiment 117, wherein the promoter is selected from p5, p19 SV40, EF, CMV, B19p6 and CAG.
Вариант осуществления 119. Упаковывающая клетка по любому из вариантов осуществления 116-118, где один или более белков Rep выбраны из Rep78, Rep68, Rep52 nRep40.Embodiment 119. The packaging cell of any one of embodiments 116-118, wherein the one or more Rep proteins are selected from Rep78, Rep68, Rep52 nRep40.
Вариант осуществления 120. Упаковывающая клетка по любому из вариантов осуществления 116 119, где один или более белков Rep предусматривают Rep78.Embodiment 120. The packaging cell of any one of embodiments 116-119, wherein the one or more Rep proteins comprise Rep78.
Вариант осуществления 121. Упаковывающая клетка по любому из вариантов осуществления 116-120, где один или более белков Rep представляют собой белки Rep AAV животного-примата.Embodiment 121. The packaging cell of any one of embodiments 116-120, wherein the one or more Rep proteins are AAV Rep proteins of a primate animal.
Вариант осуществления 122. Упаковывающая клетка по любому из вариантов осуществления 116-120, где один или более белков Rep представляют собой белки Rep AAV животного, не являющегося приматом.Embodiment 122. The packaging cell of any one of embodiments 116-120, wherein the one or more Rep proteins are Rep proteins of an AAV of a non-primate animal.
Вариант осуществления 123. Упаковывающая клетка по любому из вариантов осуществления 116-122, дополнительно содержащая молекулу нуклеиновой кислоты, содержащую нуклеотидную последовательность представляющего интерес нуклеотида, фланкированную с по меньшей мере одной стороны по меньшей мере одним инвертированным концевым повтором (ITR) AAV, который распознается одним или более белками Rep.Embodiment 123. The packaging cell of any one of embodiments 116-122, further comprising a nucleic acid molecule comprising a nucleotide sequence of a nucleotide of interest flanked on at least one side by at least one AAV inverted terminal repeat (ITR) that is recognized by one or more Rep proteins.
Вариант осуществления 124. Упаковывающая клетка по варианту осуществления 123, где нуклеотид фланкирован с другой стороны вторым ITR того же AAV, что и по меньшей мере один ITR.Embodiment 124. The packaging cell of embodiment 123, wherein the nucleotide is flanked on the other side by a second ITR of the same AAV as the at least one ITR.
Вариант осуществления 125. Упаковывающая клетка по варианту осуществления 124, где нуклеотид фланкирован с другой стороны вторым ITR, где второй ITR и по меньшей мере один ITR принадлежат разным AAV.Embodiment 125. The packaging cell of embodiment 124, wherein the nucleotide is flanked on the other side by a second ITR, wherein the second ITR and the at least one ITR belong to different AAVs.
Вариант осуществления 126. Упаковывающая клетка по любому из вариантов осуществления 123-125, где представляющий интерес нуклеотид представляет собой репортерный ген.Embodiment 126. The packaging cell of any one of embodiments 123-125, wherein the nucleotide of interest is a reporter gene.
Вариант осуществления 127. Упаковывающая клетка по варианту осуществления 126, где репортерный ген кодирует β-галактозидазу, зеленый флуоресцентный белок (GFP), усиленный зеленый флуоресцентный белок (eGFP), MmGFP, синий флуоресцентный белок (BFP), усиленный синий флуоресцентный белок (eBFP), mPlum, mCherry, tdTomato, mStrawberry, J-Red, DsRed, mOrange, mKO, mCitrine, Venus, YPet, желтый флуоресцентный белок (YFP), усиленный желтый флуоресцентный белок (eYFP), Emerald, CyPet, голубой флуоресцентный белок (CFP), Cerulean, Т-Sapphire, люциферазу, щелочную фосфатазу или их комбинацию.Embodiment 127. The packaging cell of embodiment 126, wherein the reporter gene encodes β-galactosidase, green fluorescent protein (GFP), enhanced green fluorescent protein (eGFP), MmGFP, blue fluorescent protein (BFP), enhanced blue fluorescent protein (eBFP), mPlum, mCherry, tdTomato, mStrawberry, J-Red, DsRed, mOrange, mKO, mCitrine, Venus, YPet, yellow fluorescent protein (YFP), enhanced yellow fluorescent protein (eYFP), Emerald, CyPet, cyan fluorescent protein (CFP), Cerulean, T-Sapphire, luciferase, alkaline phosphatase, or a combination thereof.
Вариант осуществления 128. Упаковывающая клетка по любому из вариантов осуществления 123-125, где представляющий интерес нуклеотид кодирует терапевтический белок, суицидный ген, антитело или его фрагмент, систему CPJSPR/Cas или ее часть(-и), антисмысловой олигонуклеотид, рибозим, молекулу для RNAi или молекулу shRNA.Embodiment 128. The packaging cell of any one of embodiments 123-125, wherein the nucleotide of interest encodes a therapeutic protein, a suicide gene, an antibody or fragment thereof, a CPJSPR/Cas system or portion(s) thereof, an antisense oligonucleotide, a ribozyme, an RNAi molecule, or an shRNA molecule.
Вариант осуществления 129. Упаковывающая клетка по любому из вариантов осуществления 115-133, дополнительно содержащая нуклеотидную последовательность, кодирующую эталонный капсидный белок.Embodiment 129. The packaging cell of any one of embodiments 115-133, further comprising a nucleotide sequence encoding a reference capsid protein.
Вариант осуществления 130. Способ получения вирусной частицы, предусматривающий культивирование упаковывающей клетки по любому из вариантов осуществления 115-129 в условиях, достаточных для продуцирования вирусных частиц.Embodiment 130. A method for producing a viral particle comprising culturing a packaging cell according to any one of embodiments 115-129 under conditions sufficient to produce viral particles.
Вариант осуществления 131. Способ по варианту осуществления 130, где упаковывающая клетка дополнительно содержит плазмиду-помощника и/или плазмиду-переносчика, содержащую представляющий интерес нуклеотид.Embodiment 131. The method of embodiment 130, wherein the packaging cell further comprises a helper plasmid and/or a carrier plasmid comprising the nucleotide of interest.
Вариант осуществления 132. Способ по варианту осуществления 130 или варианту осуществления 131, дополнительно предусматривающий одну или более следующих стадий:Embodiment 132. The method of embodiment 130 or embodiment 131, further comprising one or more of the following steps:
a. удаление клеточного дебриса,a. removal of cellular debris,
b. обработку супернатанта, содержащего вирусные частицы, бензоназой или ДНКазой I и MgCl2,b. treatment of the supernatant containing viral particles with benzonase or DNase I and MgCl2,
c. концентрирование вирусных частиц,c. concentration of viral particles,
d. очистку вирусных частиц иd. purification of viral particles and
e. любую комбинацию ad,e. any combination of ad,
где необязательно вирусные частицы представляют собой самокомплементарные аденоассоциированные вирусные частицы и/или выделены из культурального супернатанта.wherein optionally the viral particles are self-complementary adeno-associated viral particles and/or isolated from a culture supernatant.
Вариант осуществления 133. Частица AAV, полученная в соответствии со способом по любому из вариантов осуществления 130-132.Embodiment 133. An AAV particle produced according to the method of any one of Embodiments 130-132.
Вариант осуществления 134. Частица AAV по любому из вариантов осуществления 1-40, 72, 114 и 133, дополнительно содержащая представляющий интерес нуклеотид.Embodiment 134. The AAV particle of any one of embodiments 1-40, 72, 114 and 133, further comprising a nucleotide of interest.
Вариант осуществления 135. Частица AAV по варианту осуществления 134, где представляющий интерес нуклеотид представляет собой репортерный ген.Embodiment 135. The AAV particle of embodiment 134, wherein the nucleotide of interest is a reporter gene.
Вариант осуществления 136. Частица AAV по варианту осуществления 135, где репортерный ген кодирует β-галактозидазу, зеленый флуоресцентный белок (GFP), усиленный зеленый флуоресцентный белок (eGFP), MmGFP, синий флуоресцентный белок (BFP), усиленный синий флуоресцентный белок (eBFP), mPlum, mCherry, tdTomato, mStrawberry, J-Red, DsRed, mOrange, mKO, mCitrine, Venus, YPet, желтый флуоресцентный белок (YFP), усиленный желтый флуоресцентный белок (eYFP), Emerald, CyPet, голубой флуоресцентный белок (CFP), Cerulean, Т-Sapphire, люциферазу, щелочную фосфатазу или их комбинацию.Embodiment 136. The AAV particle of embodiment 135, wherein the reporter gene encodes β-galactosidase, green fluorescent protein (GFP), enhanced green fluorescent protein (eGFP), MmGFP, blue fluorescent protein (BFP), enhanced blue fluorescent protein (eBFP), mPlum, mCherry, tdTomato, mStrawberry, J-Red, DsRed, mOrange, mKO, mCitrine, Venus, YPet, yellow fluorescent protein (YFP), enhanced yellow fluorescent protein (eYFP), Emerald, CyPet, cyan fluorescent protein (CFP), Cerulean, T-Sapphire, luciferase, alkaline phosphatase, or a combination thereof.
Вариант осуществления 137. Частица AAV по варианту осуществления 134, где представляющий интерес нуклеотид кодирует терапевтический белок, суицидный ген, антитело или его фрагмент, систему CRISPR/Cas или ее часть(-и), антисмысловой олигонуклеотид, рибозим, молекулу для RNAi или молекулу shRNA.Embodiment 137. The AAV particle of embodiment 134, wherein the nucleotide of interest encodes a therapeutic protein, a suicide gene, an antibody or fragment thereof, a CRISPR/Cas system or portion(s) thereof, an antisense oligonucleotide, a ribozyme, an RNAi molecule, or an shRNA molecule.
Вариант осуществления 138. Фармацевтическая композиция, содержащая (а) частицу AAV по любому из вариантов осуществления 1-40, 72, 114 и 133, частицу AAV, содержащую капсидный белок AAV по любому из вариантов осуществления 41-71 и 113, или частицу AAV, полученную в соответствии со способом по любому из вариантов осуществления 130-132, и (b) фармацевтически приемлемый носитель или вспомогательное вещество.Embodiment 138. A pharmaceutical composition comprising (a) an AAV particle of any one of embodiments 1-40, 72, 114 and 133, an AAV particle comprising an AAV capsid protein of any one of embodiments 41-71 and 113, or an AAV particle produced according to the method of any one of embodiments 130-132, and (b) a pharmaceutically acceptable carrier or excipient.
Вариант осуществления 139. Способ доставки представляющего интерес нуклеотида в клетку-мишень, предусматривающий приведение клетки-мишени в контакт с (а) частицей AAV по любому из вариантов осуществления 1-40, 72, 114 и 133 или (b) композицией по варианту осуществления 138.Embodiment 139. A method of delivering a nucleotide of interest to a target cell, comprising contacting the target cell with (a) an AAV particle of any one of embodiments 1-40, 72, 114 and 133 or (b) a composition of embodiment 138.
Вариант осуществления 140. Способ по варианту осуществления 139, где капсид частицы AAV содержит нацеливающий лиганд, который специфически связывает белок, экспрессируемый на поверхности клетки-мишени.Embodiment 140. The method of embodiment 139, wherein the capsid of the AAV particle comprises a targeting ligand that specifically binds a protein expressed on the surface of a target cell.
Вариант осуществления 141. Способ по варианту осуществления 139 или варианту осуществления 140, где приведение в контакт выполняют ex vivo.Embodiment 141. The method of embodiment 139 or embodiment 140, wherein the contacting is performed ex vivo.
Вариант осуществления 142. Способ по варианту осуществления 139 или варианту осуществления 140, где клетка-мишень находится в субъекте.Embodiment 142. The method of embodiment 139 or embodiment 140, wherein the target cell is in a subject.
Вариант осуществления 143. Способ по варианту осуществления 142, где субъектом является человек.Embodiment 143. The method of embodiment 142, wherein the subject is a human.
Вариант осуществления 144. Способ по любому из вариантов осуществления 139-143, где клетка-мишень представляет собой клетку человека.Embodiment 144. The method according to any one of embodiments 139-143, wherein the target cell is a human cell.
Вариант осуществления 145. Способ по любому из вариантов осуществления 139-144, где представляющий интерес нуклеотид кодирует терапевтический белок, суицидный ген, антитело или его фрагмент, систему CPJSPR/Cas или ее часть(-и), антисмысловой олигонуклеотид, рибозим, молекулу для RNAi или молекулу shRNA.Embodiment 145. The method of any one of embodiments 139-144, wherein the nucleotide of interest encodes a therapeutic protein, a suicide gene, an antibody or fragment thereof, a CPJSPR/Cas system or part(s) thereof, an antisense oligonucleotide, a ribozyme, an RNAi molecule, or an shRNA molecule.
ПРИМЕРЫEXAMPLES
[00265] Следующие примеры приведены только в иллюстративных целях и не предназначены для ограничения объема настоящего изобретения.[00265] The following examples are provided for illustrative purposes only and are not intended to limit the scope of the present invention.
[00266] Материалы и методы[00266] Materials and methods
[00267] Линии клеток и антитела[00267] Cell lines and antibodies
[00268] Все линии клеток 293 и 293Т поддерживали в DMEM, дополненной 10% FBS, 1% пенициллина/стрептавидина и 1% L-глутамина. Линии клеток 293 hErbB2 и 293hASGRl/2 получали путем лентивирусной трансдукции исходной линии клеток 293 с помощью частицы, экспрессирующей соответствующую кДНК. Все линии клеток получали из головного центра Regeneron ТС. Антитело к В1 распознает линейный эпитоп, общий для VP1, VP2 и VP3 AAV.[00268] All 293 and 293T cell lines were maintained in DMEM supplemented with 10% FBS, 1% penicillin/streptavidin, and 1% L-glutamine. The 293 hErbB2 and 293hASGRl/2 cell lines were generated by lentiviral transduction of the parental 293 cell line with a particle expressing the corresponding cDNA. All cell lines were obtained from the Regeneron TC Core Facility. The anti-B1 antibody recognizes a linear epitope shared by AAV VP1, VP2, and VP3.
[00269] Конструкции для экспрессии капсидного белка AAV[00269] Constructs for expression of AAV capsid protein
[00270] GeneBlock, кодирующие необходимые последовательности капсида AAV или праймеры для амплификации требуемых последовательностей капсида AAV с помощью полимеразной цепной реакции, включая вставки SpyTag, фланкирующие линкерные аминокислоты и дополнительные точечные мутации, приобретали в IDT и клонировали в pAAV R2C2 с использованием Gibson Assembly в соответствии с протоколом производителя (NEB).[00270] GeneBlocks encoding the required AAV capsid sequences or primers for amplification of the required AAV capsid sequences by polymerase chain reaction, including SpyTag inserts, flanking linker amino acids, and additional point mutations, were purchased from IDT and cloned into pAAV R2C2 using Gibson Assembly according to the manufacturer's protocol (NEB).
[00271] Слияние SpyCatcher с антителами[00271] SpyCatcher Fusion with Antibodies
[00272] GeneBlock, кодирующие SpyCatcher, приобретали в IDT и использовали Gibson Assembly для клонирования кодирующей последовательности в рамку считывания в плазмидах для экспрессии тяжелых цепей антитела на С-конце каждой конструкции с отделением с помощью гибкого аминокислотного линкера GSGESG (SEQ ID NO:49).[00272] GeneBlock encoding SpyCatcher was purchased from IDT and Gibson Assembly was used to clone the coding sequence in frame into antibody heavy chain expression plasmids at the C-terminus of each construct, separated by a flexible amino acid linker GSGESG (SEQ ID NO:49).
[00273] Получение вирусных частиц AAV[00273] Production of AAV viral particles
[00274] Вирус получали путем трансфекции упаковывающих клеток 293Т с применением PEI Pro или PEI Мах с помощью следующих плазмид: плазмида-помощник pAd, AAV2-ITR-содержащая геномная плазмида, кодирующая репортерный белок, и плазмида pAAV-CAP, кодирующая гены Rep и Cap AAV, либо в присутствии, либо в отсутствие дополнительных плазмид, кодирующих либо scFv, либо тяжелую и легкую цепи антитела. Все конструкции на основе scFv и тяжелой цепи антитела сливали со SpyCatcher на С-конце, как описано выше. Трансфекцию проводили в OptiMEM, и через 8 часов среду заменяли на DMEM, дополненную 10% FBS, 1% пенициллина/стрептавидина и 1% L-глутамата. Альтернативный протокол трансфекции выполняли в I50 мМ NaCl без замены среды после трансфекции.[00274] Virus was produced by transfecting 293T packaging cells with PEI Pro or PEI Max with the following plasmids: pAd helper plasmid, AAV2-ITR-containing genomic plasmid encoding the reporter protein, and pAAV-CAP plasmid encoding the AAV Rep and Cap genes, either in the presence or absence of additional plasmids encoding either the scFv or the antibody heavy and light chains. All scFv and antibody heavy chain constructs were fused to SpyCatcher at the C-terminus as described above. Transfections were performed in OptiMEM and after 8 hours the medium was changed to DMEM supplemented with 10% FBS, 1% penicillin/streptavidin, and 1% L-glutamate. An alternative transfection protocol was performed in I50 mM NaCl without changing the medium after transfection.
[00275] Трансфицированные упаковывающие клетки инкубировали в течение 3 дней при 37°С, затем вирус собирали из клеточных лизатов с применением стандартного протокола замораживания-оттаивания. Вкратце, упаковывающие клетки собирали путем соскребания и осаждали центрифугированием. Супернатант удаляли и клетки ресуспендировали в растворе 50 мМ Tris-HCl; 150 мМ NaCl и 2 мМ MgCh [рН 8,0] или 25 мМ Tris-HCl; 100 мМ NaCl; 1 мМ MgCl2; 2,5 мМ KCl; 0,001% Pluronic F68 [рН 7,4]. Внутриклеточные вирусные частицы высвобождали путем индуцирования лизиса клеток посредством трех последовательных циклов замораживания-оттаивания, состоящих из круговых перемещений суспензии клеток между баней с сухим льдом/этанолом и водяной баней при 37°С при энергичном встряхивании. Вязкость снижали путем обработки лизата с помощью бензоназы от EMD Millipore (50 ед/мл клеточного лизата) в течение 60 мин при 37°С при периодическом перемешивании. Затем дебрис осаждали центрифугированием, и полученный супернатант обрабатывали для получения неочищенного лизата или для дальнейшей очистки в градиенте йодиксанола. Для получения неочищенного лизата супернатант фильтровали через PVDF-фильтр Millex-GV с размером пор 0,22 мкм непосредственно в верхнюю камеру центрифужного фильтрующего блока Amicon Ultra-15 с мембраной Ultracel-100 (MWCO 100 кДа). Фильтрующий блок центрифугировали с интервалами 5-10 минут, пока в верхней камере не был достигнут требуемый объем, затем концентрированный неочищенный вирус пипетированием переносили в пробирку с незначительным связыванием белков и хранили при 4°С. Для очистки в градиенте йодиксанола лизат фильтровали через фильтр PES Nalgene Rapid-Flow с размером пор 0,2 мкм. Среду, содержащую AAV, отдельно концентрировали фильтрацией в тангенциальном потоке и диафильтрацией с 1xPBS, дополненным 0,001% Pluronic F-68. Очищенные лизаты или концентрированную среду загружали в дискретный градиент йодиксанола и центрифугировали при 29600 об/мин в течение 16-18 часов при 10°С с использованием Ti-ротора SW 32. Фракции вируса удаляли с границы раздела между 40- и 60-процентными растворами йодиксанола и проводили замену буфера на lxPBS, дополненный 0,001% Pluronic F-68, с использованием центрифужных фильтров Amicon Ultra с номинальным пределом молекулярной массы 100 кДа. Титр (число векторным геномов на миллилитр, вг/мл) определяли с помощью qPCR с использованием стандартной кривой для вируса с известной концентрацией.[00275] Transfected packaging cells were incubated for 3 days at 37°C, then virus was harvested from cell lysates using a standard freeze-thaw protocol. Briefly, packaging cells were collected by scraping and pelleted by centrifugation. The supernatant was removed and cells were resuspended in 50 mM Tris-HCl; 150 mM NaCl and 2 mM MgCl [pH 8.0] or 25 mM Tris-HCl; 100 mM NaCl; 1 mM MgCl2 ; 2.5 mM KCl; 0.001% Pluronic F68 [pH 7.4]. Intracellular viral particles were released by inducing cell lysis through three successive freeze-thaw cycles consisting of cycling the cell suspension between a dry ice/ethanol bath and a 37°C water bath with vigorous shaking. Viscosity was reduced by treating the lysate with EMD Millipore Benzonase (50 U/ml cell lysate) for 60 min at 37°C with occasional agitation. The debris was then pelleted by centrifugation and the resulting supernatant processed to obtain crude lysate or for further purification on an iodixanol gradient. To obtain crude lysate, the supernatant was filtered through a 0.22 μm Millex-GV PVDF filter directly into the upper chamber of an Amicon Ultra-15 centrifugal filter unit with an Ultracel-100 membrane (MWCO 100 kDa). The filter unit was centrifuged at 5-10 min intervals until the desired volume was reached in the upper chamber, then the concentrated crude virus was pipetted into a low protein binding tube and stored at 4°C. For iodixanol gradient purification, the lysate was filtered through a 0.2 μm Nalgene Rapid-Flow PES filter. AAV-containing media was separately concentrated by tangential flow filtration and diafiltration with 1xPBS supplemented with 0.001% Pluronic F-68. Cleared lysates or concentrated medium were loaded onto a discontinuous iodixanol gradient and centrifuged at 29,600 rpm for 16-18 h at 10°C using a SW 32 Ti rotor. Virus fractions were removed from the interface between 40 and 60% iodixanol solutions and buffer exchanged into lxPBS supplemented with 0.001% Pluronic F-68 using Amicon Ultra centrifuge filters with a nominal molecular weight cutoff of 100 kDa. Titer (vector genome counts per milliliter, vg/mL) was determined by qPCR using a standard curve of known virus concentration.
[00276] Инфицирование/трансдукция клеток и анализ посредством проточной цитометрии/люминесценции[00276] Cell infection/transduction and flow cytometric/luminescence analysis
[00277] В случае инфицирования клеток вирусные частицы добавляли непосредственно в среду клеток в культуре, и смесь инкубировали на протяжении ночи при 37°С. В случае трансдукции с помощью неочищенного лизата среду в каждой лунке заменяли через 24 часа и клетки инкубировали в течение 3-5 дней. Для оценки экспрессии GFP в день 3, 4 или 5 после инфицирования клетки трипсинизировали, ресуспендировали в PBS с 2% FBS, и процентное значение числа GFP+ клеток получали на проточном цитометре BD FACSCanto и анализировали с использованием программного обеспечения FlowJo. Для оценки экспрессии NanoLuc в день 2 или 3 после инфицирования клетки лизировали в 1х буфере для пассивного лизиса (Promega) и инкубировали с реагентом для люциферазного анализа Nano-Glo. Люминесценцию оценивали с использованием устройства для считывания планшетов SpectraMax.[00277] For cell infection, viral particles were added directly to the cell medium in culture and the mixture was incubated overnight at 37°C. For transduction with crude lysate, the medium in each well was replaced after 24 hours and the cells were incubated for 3-5 days. To assess GFP expression at day 3, 4, or 5 post-infection, cells were trypsinized, resuspended in PBS with 2% FBS, and the percentage of GFP+ cells was obtained on a BD FACSCanto flow cytometer and analyzed using FlowJo software. To assess NanoLuc expression at day 2 or 3 post-infection, cells were lysed in 1x Passive Lysis Buffer (Promega) and incubated with Nano-Glo Luciferase Assay Reagent. Luminescence was assessed using a SpectraMax plate reader.
[00278] Анализ нейтрализации в присутствии IgG[00278] Neutralization assay in the presence of IgG
[00279] Вирусные частицы смешивали с возрастающими концентрациями очищенного человеческого IgG, приготовленного в PBS, и смесь вирусных частиц и IgG инкубировали при 37°С в течение 30 минут для обеспечения возможности связывания. Для инфицирования клеток вирусные частицы добавляли непосредственно в среду клеток в культуре, а смесь инкубировали при 37°С в течение 2 дней. В день 2 после инфицирования экспрессию Nanoluc измеряли с использованием люциферазного анализа Nanoglo (Promega) и данные в RLU получали на устройстве для считывания планшетов (PerkinElmer).[00279] Viral particles were mixed with increasing concentrations of purified human IgG prepared in PBS, and the mixture of viral particles and IgG was incubated at 37°C for 30 minutes to allow binding. To infect cells, viral particles were added directly to the medium of the cells in culture, and the mixture was incubated at 37°C for 2 days. On day 2 post-infection, Nanoluc expression was measured using a Nanoglo luciferase assay (Promega) and data in RLU were obtained on a plate reader (PerkinElmer).
[00280] Вестерн-блоттинг анализ[00280] Western blot analysis
[00281] Реакцию между белками VP1, VP2 и VP3 AAV с меткой SpyTag и антителами или scFv с меткой SpyCatcher контролировали с помощью вестерн-блоттинг анализа. Буфер для образцов Novex® Tris-глицин SDS с восстанавливающим средством добавляли к равным объемам неочищенных вирусных препаратов, и образцы нагревали до 85°С в течение 5 минут, затем охлаждали до комнатной температуры и загружали в предварительно подготовленный 4-12% Tris-глициновый гель (Invitrogen). Белки разделяли с помощью SDS-PAGE в восстанавливающих условиях и подвергали блоттингу на PVDF с помощью влажного переноса. Мембраны блокировали с помощью 5% молока и вносили зонд, представляющий собой моноклональное мышиное антитело к B1 (ARP American Research Products, Inc.), при разведении 1:100 в TBST на протяжении ночи при 4°С. Блоты промывали в TBST, вносили зонд, представляющий собой антитело к антителу мыши, конъюгированное с HRP, и обнаруживали с использованием хемилюминесцентных реагентов для обнаружения на устройстве для визуализации Bio-Rad ChemiDoc MP.[00281] The reaction between SpyTag-tagged AAV VP1, VP2, and VP3 proteins and SpyCatcher-tagged antibodies or scFvs was monitored by Western blot analysis. Novex® Tris-glycine SDS sample buffer with reducing agent was added to equal volumes of crude virus preparations, and samples were heated to 85°C for 5 min, then cooled to room temperature and loaded onto a precast 4-12% Tris-glycine gel (Invitrogen). Proteins were separated by SDS-PAGE under reducing conditions and blotted onto PVDF by wet transfer. Membranes were blocked with 5% milk and probed with monoclonal mouse anti-B1 antibody (ARP American Research Products, Inc.) at a 1:100 dilution in TBST overnight at 4°C. Blots were washed in TBST, probed with anti-mouse antibody conjugated to HRP, and detected using chemiluminescent detection reagents on a Bio-Rad ChemiDoc MP imager.
[00282] Анализ окрашивания белков[00282] Protein Staining Analysis
[00283] Относительную экспрессию белков VP1, VP2 и VP3 AAV[00283] Relative expression of AAV VP1, VP2, and VP3 proteins
отслеживали с помощью анализа окрашивания белков в гелях SDS-PAGE. Образцы AAV получали с использованием буфера для образцов LDS NuPAGE и восстанавливающего средства (Invitrogen) в соответствии с инструкциями производителя. Образцы нагревали до 95°С в течение 10 минут, затем охлаждали до комнатной температуры и наносили на предварительно подготовленный 4-12% Bis-Tris гель NuPAGE (Invitrogen). После разделения белков гели фиксировали в 50% метаноле; 7% уксусной кислоте, окрашивали красителем для геля SYPRO Ruby (Invitrogen) и промывали в 10% метаноле; 7% уксусной кислоте. Фотографии геля получали на устройстве для визуализации Bio-Rad ChemiDoc MP.were monitored by protein staining analysis on SDS-PAGE gels. AAV samples were prepared using NuPAGE LDS sample buffer and reducing agent (Invitrogen) according to the manufacturer's instructions. Samples were heated to 95°C for 10 min, then cooled to room temperature and loaded onto a precast 4-12% Bis-Tris NuPAGE gel (Invitrogen). Following protein separation, gels were fixed in 50% methanol; 7% acetic acid, stained with SYPRO Ruby gel stain (Invitrogen) and washed in 10% methanol; 7% acetic acid. Gel images were acquired on a Bio-Rad ChemiDoc MP imager.
[00284] Пример 1. Химерные частицы AAV животного, не являющегося приматом, можно получать и очищать с помощью аффинной хроматографии.[00284] Example 1. Chimeric particles of a non-primate AAV can be produced and purified using affinity chromatography.
[00285] Каждый вирус получали, как описано выше, в одном 15 см планшете путем трансфекции упаковывающих клеток 293Т с помощью следующих плазмид и при следующих количествах, мкг:[00285] Each virus was prepared as described above in one 15 cm plate by transfecting 293T packaging cells with the following plasmids and at the following amounts, µg:
плазмида-помощник pAd - 8helper plasmid pAd - 8
pAAV-UbC-люцифераза светлячка - 4 pAAV-UbC-firefly luciferase - 4
плазмидная конструкция pRep Сар - 4 plasmid construct pRep Cap - 4
при этом плазмидная конструкция Rep Сар включает:The Rep Cap plasmid construct includes:
PRep2 Cap VP1 AAV2 VP2 VP3 AAAV;PRep2 Cap VP1 AAV2 VP2 VP3 AAAV;
pRep2 Cap VP1 AAV2 VP2 VP3 вируса морского льва;pRep2 Cap VP1 AAV2 VP2 VP3 sea lion virus;
pRep2 Cap VP1 AAV2 VP2 VP3 вируса бородатой агамы.pRep2 Cap VP1 AAV2 VP2 VP3 bearded dragon virus.
[00286] Затем неочищенные вирусные препараты очищали с помощью аффинной хроматографии, и капсидные белки, присутствующие во вводимом материале, проточной (FT) и элюированной фракциях, оценивали с помощью вестерн-блоттинга (фиг.2). Капсидные белки от всех трех вирусов присутствовали материале, вводимом в хроматографическую колонку, снизились в проточной фракции и присутствовали в элюированной фракции, что позволяет предположить, что подход аффинной колоночной хроматографии, используемый для очистки капсидов, полученных из вирусов приматов, таких как AAV2, также может быть использован для очистки AAV животного, не являющегося приматом.[00286] The crude virus preparations were then purified by affinity chromatography, and the capsid proteins present in the input, flow-through (FT), and elution fractions were assessed by Western blotting (Figure 2). Capsid proteins from all three viruses were present in the input, decreased in the flow-through fraction, and were present in the elution fraction, suggesting that the affinity column chromatography approach used to purify capsids derived from primate viruses such as AAV2 can also be used to purify non-primate AAV.
[00287] В каждом из следующих примеров плазмида pRep2 Cap VP1 AAV2 VP2 VP3 AAAV, содержащая ген rep AAV2 и химерный ген cap, кодирующий химерный капсидный белок VP1, содержащий область VP1-u AAV2, функционально связанную с общей областью VP1/VP2 AAAV, капсидный белок VP2 AAAV и капсидный белок VP3 AAAV, обозначена как «pAAV R2Cap AAV2/AAAV». Плазмида pRep2 Cap VP1 AAV2 VP2 VP3 вируса морского льва, содержащая ген rep AAV2 и химерный ген cap, кодирующий химерный капсидный белок VP1, содержащий область VP1-u AAV2, функционально связанную с общей областью VP1/VP2 AAV морского льва, капсидный белок VP2 вируса морского льва и капсидный белок VP3 вируса морского льва, обозначена как «pAAV R2Cap AAV2/BHpyca морского льва». Плазмида pRep2 Cap VP1 AAV2 VP2 VP3 вируса бородатой агамы, содержащая ген rep AAV2 и химерный ген cap, кодирующий химерный капсидный белок VP1, содержащий область VP1-u AAV2, функционально связанную с общей областью VP1/VP2 AAV бородатой агамы, капсидный белок VP2 вируса бородатой агамы и капсидный белок VP3 вируса бородатой агамы, обозначена как «pAAV R2Cap AAV2/BHpyca бородатой агамы».[00287] In each of the following examples, the pRep2 Cap VP1 AAV2 VP2 VP3 AAAV plasmid comprising an AAV2 rep gene and a chimeric cap gene encoding a chimeric VP1 capsid protein comprising an AAV2 VP1-u region operably linked to the common AAAV VP1/VP2 region, an AAAV VP2 capsid protein, and an AAAV VP3 capsid protein is designated "pAAV R2Cap AAV2/AAAV." The sea lion virus pRep2 Cap VP1 AAV2 VP2 VP3 plasmid containing the AAV2 rep gene and the chimeric cap gene encoding the chimeric VP1 capsid protein containing the AAV2 VP1-u region functionally linked to the sea lion AAV common VP1/VP2 region, the sea lion virus VP2 capsid protein, and the sea lion virus VP3 capsid protein is designated "sea lion pAAV R2Cap AAV2/BHpyca". The pRep2 Cap VP1 AAV2 VP2 VP3 bearded dragon virus plasmid containing the AAV2 rep gene and the chimeric cap gene encoding the chimeric VP1 capsid protein containing the AAV2 VP1-u region functionally linked to the bearded dragon AAV common VP1/VP2 region, the bearded dragon virus VP2 capsid protein, and the bearded dragon virus VP3 capsid protein is designated "pAAV R2Cap AAV2/BHpyca bearded dragon virus".
[00288] Пример 2. Пептидные вставки в область VP3 капсидов птичьего AAV вполне допустимы и могут опосредовать ковалентное прикрепление антител к вирусным частицам посредством Spy Catcher-SpyTag.[00288] Example 2. Peptide insertions into the VP3 region of avian AAV capsids are feasible and can mediate covalent attachment of antibodies to viral particles via Spy Catcher-SpyTag.
[00289] Потенциальные сайты пептидной вставки в пределах предполагаемой вариабельной петли IV и вариабельной петли VIII птичьего AAV предсказывали с использованием моделирования PyMol (фиг.3А), и выполняли клонирование соответствующих конструкций для вставки SpyTag. Каждый вирус получали, как описано выше, в одном 15 см планшете путем трансфекции упаковывающих клеток 293Т с помощью следующих плазмид и при следующих количествах, мкг:[00289] Potential peptide insertion sites within the predicted variable loop IV and variable loop VIII of avian AAV were predicted using PyMol modeling (Fig. 3A), and cloning of the corresponding SpyTag insertion constructs was performed. Each virus was produced as described above in one 15 cm plate by transfecting 293T packaging cells with the following plasmids and at the following amounts, μg:
плазмида-помощник pAd - 16helper plasmid pAd - 16
pAAV-CAG-GFP - 8 pAAV-CAG-GFP-8
pAAV R2CapX - 8 pAAV R2CapX - 8
при этом конструкция pAAV R2CapX включает:The pAAV R2CapX design includes:
pAAV R2Cap AAV2/AAAV без SpyTag;pAAV R2Cap AAV2/AAAV without SpyTag;
pAAV R2Cap AAV2/AAAV G444 линкер-6 SpyTag;pAAV R2Cap AAV2/AAAV G444 linker-6 SpyTag;
pAAV R2Cap AAV2/AAAV K580 линкер-6 SpyTag;pAAV R2Cap AAV2/AAAV K580 linker-6 SpyTag;
илиor
плазмид а-помощник pAd - 16 plasmid a-helper pAd - 16
pAAV-CAG-GFP - 8 pAAV-CAG-GFP-8
pAAV R2Cap AAV2/AAAV без SpyTag - 6,7 pAAV R2Cap AAV2/AAAV without SpyTag - 6.7
ВМЕСТЕ СTOGETHER WITH
pAAV R2Cap AAV2/AAAV G444 линкер-6 SpyTag - 1,3 pAAV R2Cap AAV2/AAAV G444 linker-6 SpyTag - 1.3
ИЛИOR
pAAV R2Cap AAV2/AAAV K580 линкер-6 SpyTag - 1,3 pAAV R2Cap AAV2/AAAV K580 linker-6 SpyTag - 1.3
[00290] Химерные частицы AAV2/AAAV без вставок SpyTag, а также химерные частицы AAV2/AAAV, несущие вставки SpyTag в различных положениях в пределах капсида, как указано выше, упаковывали с геномами AAV, содержащими ITR2. В попытке понять, могут ли химерные капсиды AAV2/AAAV успешно формироваться и упаковываться с геномами, содержащими ITR AAV2, проводили количественную ПЦР для измерения титра (числа геномов на миллилитр или вг/мл) химерных частиц AAV2/AAAV, несущих вставки SpyTag, по сравнению с химерными частицами AAV2/AAAV без вставок SpyTag (фиг.3В). Измеренные титры демонстрируют, что химерные частицы AAV2/AAAV могут быть упакованы с геномами ITR AAV2. Титр химерных частиц AAV2/AAAV был аналогичным у химерных частиц AAV2/AAAV без вставок SpyTag и химерных частиц AAV2/AAAV, несущих вставки SpyTag.[00290] AAV2/AAAV chimeric particles without SpyTag inserts, as well as AAV2/AAAV chimeric particles bearing SpyTag inserts at various positions within the capsid, as described above, were packaged with AAV genomes containing ITR2. In an attempt to understand whether AAV2/AAAV chimeric capsids could be successfully formed and packaged with genomes containing AAV2 ITRs, qPCR was performed to measure the titer (number of genomes per milliliter or vg/mL) of AAV2/AAAV chimeric particles bearing SpyTag inserts compared to AAV2/AAAV chimeric particles without SpyTag inserts (Figure 3B). The measured titers demonstrate that AAV2/AAAV chimeric particles can be packaged with AAV2 ITR genomes. The titer of AAV2/AAAV chimeric particles was similar for AAV2/AAAV chimeric particles without SpyTag inserts and AAV2/AAAV chimeric particles bearing SpyTag inserts.
[00291] Следующим шагом инкубировали химерные частицы AAV2/AAAV без вставок SpyTag и химерные частицы AAV2/AAAV, несущие вставки SpyTag, в присутствии антитела, которое связывается с ASGR1, несущего метку SpyCatcher, или без него. Реакцию между химерными белками VP1, VP2 и VP3 AAV2/AAAV с меткой SpyTag и тяжелыми цепями антитела к ASGR1 с меткой SpyCatcher отслеживали с помощью вестерн-блоттинга; при этом капсидные белки с меткой SpyTag, которые прореагировали с антителом с меткой SpyCatcher, демонстрируют увеличение размера при анализе SDS-PAGE. В присутствии mAb к ASGR1 с меткой SpyCatcher химерные капсидные белки AAV2/AAAV с меткой SpyTag-проявляли увеличение видимого размера при вестерн-блоттинг анализе по сравнению с капсидными белками AAAV с меткой SpyTag-отдельно (фиг.3С). Это указывает на то, что химерные частицы AAV2/AAAV с меткой SpyTag-были способны успешно образовывать ковалентную связь с mAb к ASGR1 с меткой SpyCatcher.[00291] Next, AAV2/AAAV chimeric particles lacking SpyTag inserts and AAV2/AAAV chimeric particles bearing SpyTag inserts were incubated with or without an antibody that binds to SpyCatcher-tagged ASGR1. The reaction between the SpyTag-tagged AAV2/AAAV chimeric VP1, VP2, and VP3 proteins and the heavy chains of the SpyCatcher-tagged ASGR1 antibody was monitored by Western blotting, with SpyTag-tagged capsid proteins that reacted with the SpyCatcher-tagged antibody showing an increase in size when analyzed by SDS-PAGE. In the presence of SpyCatcher-tagged anti-ASGR1 mAb, SpyTag-tagged AAV2/AAAV chimeric capsid proteins exhibited an increase in apparent size in Western blot analysis compared to SpyTag-tagged AAAV capsid proteins alone (Fig. 3C). This indicates that SpyTag-tagged AAV2/AAAV chimeric particles were able to successfully form a covalent bond with SpyCatcher-tagged anti-ASGR1 mAb.
[00292] Пример 3. Пептидные вставки в область VP3 капсидов AAV морского льва вполне допустимы и могут опосредовать ковалентное прикрепление антител к вирусным частицам посредством Spy Catcher-SpyTag.[00292] Example 3. Peptide insertions into the VP3 region of sea lion AAV capsids are feasible and can mediate covalent attachment of antibodies to viral particles via Spy Catcher-SpyTag.
[00293] Потенциальные сайты пептидной вставки в пределах предполагаемой вариабельной петли IV и вариабельной петли VIII AAV морского льва предсказывали с использованием моделирования PyMol (фиг.4А), и выполняли клонирование соответствующих конструкций для вставки SpyTag. Каждый вирус получали, как описано выше, путем трансфекции в одной 15 см чашке упаковывающих клеток 293Т с помощью следующих плазмид и при следующих количествах, мкг:[00293] Potential peptide insertion sites within the putative variable loop IV and variable loop VIII of sea lion AAV were predicted using PyMol modeling (Figure 4A), and cloning of the corresponding SpyTag insertion constructs was performed. Each virus was produced as described above by transfection into one 15 cm dish of 293T packaging cells with the following plasmids and at the following amounts, μg:
плазмида-помощник pAd - 8helper plasmid pAd - 8
pAAV-CAG-GFP - 4 pAAV-CAG-GFP-4
pAAV R2CapX - 4 pAAV R2CapX - 4
при этом конструкция pAAV R2CapX включает:The pAAV R2CapX design includes:
pAAV R2Cap AAV2/вируса морского льва без SpyTag;pAAV R2Cap AAV2/sea lion virus without SpyTag;
pAAV R2Cap AAV2/вируса морского льва N429 линкер-6 SpyTag;pAAV R2Cap AAV2/sea lion virus N429 linker-6 SpyTag;
pAAV R2Cap AAV2/вируса морского льва P430 линкер-6 SpyTag;pAAV R2Cap AAV2/sea lion virus P430 linker-6 SpyTag;
pAAV R2Cap AAV2/вируса морского льва T431 линкер-6 SpyTag;pAAV R2Cap AAV2/sea lion virus T431 linker-6 SpyTag;
pAAV R2Cap AAV2/вируса морского льва G432 линкер-6 SpyTag;pAAV R2Cap AAV2/sea lion virus G432 linker-6 SpyTag;
pAAV R2Cap AAV2/вируса морского льва S433 линкер-6 SpyTag;pAAV R2Cap AAV2/sea lion virus S433 linker-6 SpyTag;
pAAV R2Cap AAV2/вируса морского льва T434 линкер-6 SpyTag;pAAV R2Cap AAV2/sea lion virus T434 linker-6 SpyTag;
pAAV R2Cap AAV2/вируса морского льва R436 линкер-6 SpyTag;pAAV R2Cap AAV2/sea lion virus R436 linker-6 SpyTag;
pAAV R2Cap AAV2/вируса морского льва D437 линкер-6 SpyTag;pAAV R2Cap AAV2/sea lion virus D437 linker-6 SpyTag;
pAAV R2Cap AAV2/вируса морского льва A565 линкер-6 SpyTag;pAAV R2Cap AAV2/sea lion virus A565 linker-6 SpyTag;
илиor
плазмида-помощник pAd - 8 helper plasmid pAd - 8
pAAV-CMV-GFP - 4 pAAV-CMV-GFP-4
pAAV R2Cap AAV2/вируса морского льва без SpyTag - 3,3 pAAV R2Cap AAV2/sea lion virus without SpyTag - 3.3
ВМЕСТЕ СTOGETHER WITH
pAAV R2Cap AAV2/вируса морского льва G432 линкер-6 SpyTag - 0,7 pAAV R2Cap AAV2/sea lion virus G432 linker-6 SpyTag - 0.7
ИЛИOR
pAAV R2Cap AAV2/вируса морского льва А565 линкер-6 SpyTag - 0,7 pAAV R2Cap AAV2/sea lion virus A565 linker-6 SpyTag - 0.7
[00294] Химерные частицы AAV2/AAV морского льва без вставок SpyTag, а также химерные частицы AAV2/AAV морского льва, несущие вставки SpyTag в различных положениях в пределах капсида, как указано выше, упаковывали с геномами AAV, содержащими ITR2. В попытке понять, могут ли химерные капсиды AAV2/AAV морского льва успешно формироваться и упаковываться с геномами, содержащими ITR AAV2, проводили количественную ПЦР для измерения титра (числа геномов на миллилитр или вг/мл) химерных частиц AAV2/AAV морского льва, несущих вставки SpyTag, по сравнению с химерными частицами AAV2/AAV морского льва без вставок SpyTag (фиг.4В, 5А). Измеренные титры демонстрируют, что химерные частицы AAV2/AAV морского льва без вставок SpyTag могут быть упакованы с геномами ITR AAV2. Титры были аналогичными у химерных частиц AAV2/AAV морского льва без SpyTag и химерных частиц AAV2/AAV морского льва, несущих вставку SpyTag в положениях N429, Р430, Т431, G432, S433, R436 и D437, но вставки SpyTag в положении Т434 или положении А565 не допускались у химерных частиц AAV2/AAV морского льва и приводили к низким титрам.[00294] Sea lion AAV2/AAV chimeric particles lacking SpyTag inserts, as well as sea lion AAV2/AAV chimeric particles bearing SpyTag inserts at various positions within the capsid, as described above, were packaged with AAV genomes containing ITR2. In an attempt to understand whether sea lion AAV2/AAV chimeric capsids could be successfully formed and packaged with genomes containing AAV2 ITRs, qPCR was performed to measure the titer (number of genomes per milliliter or vg/mL) of sea lion AAV2/AAV chimeric particles bearing SpyTag inserts compared to sea lion AAV2/AAV chimeric particles lacking SpyTag inserts (Figures 4B, 5A). The measured titers demonstrate that sea lion AAV2/AAV chimeric particles without SpyTag insertions can be packaged with AAV2 ITR genomes. Titers were similar between sea lion AAV2/AAV chimeric particles without SpyTag and sea lion AAV2/AAV chimeric particles carrying a SpyTag insertion at positions N429, P430, T431, G432, S433, R436, and D437, but SpyTag insertions at position T434 or position A565 were not tolerated in sea lion AAV2/AAV chimeric particles and resulted in low titers.
[00295] Следующим шагом инкубировали химерные частицы AAV2/AAV морского льва без SpyTag и химерные частицы AAV2/AAV морского льва, несущие вставки SpyTag, в присутствии антитела, которое связывается с HER2, несущего метку SpyCatcher, или без него. Реакцию между химерными белками VP1, VP2 и VP3 AAV2/AAV морского льва с меткой SpyTag и тяжелыми цепями антитела к HER2 с меткой SpyCatcher отслеживали с помощью вестерн-блоттинга; при этом капсидные белки с меткой SpyTag, которые прореагировали с антителом с меткой SpyCatcher, демонстрируют увеличение размера при анализе SDS-PAGE. В присутствии mAb к HER2 с меткой SpyCatcher все обнаруживаемые химерные капсидные белки AAV2/AAV морского льва с меткой SpyTag-проявляли увеличение видимого размера при вестерн-блоттинг анализе по сравнению с химерными капсидными белками AAV2/AAV морского льва с меткой SpyTag-отдельно (фиг.4С, 5В). Это указывает на то, что химерные частицы AAV2/AAV морского льва с меткой SpyTag способны успешно образовывать ковалентную связь с mAb к HER2 с меткой SpyCatcher. Химерные частицы AAV2/AAV морского льва с меткой SpyTag-c низкими измеренными титрами (вставки SpyTag в Т434 и А565) не демонстрировали обнаруживаемого белка при вестерн-блоттинг анализе (фиг.4С, 5В).[00295] Next, the sea lion AAV2/AAV chimeric particles lacking SpyTag and the sea lion AAV2/AAV chimeric particles bearing SpyTag inserts were incubated with or without a SpyCatcher-tagged anti-HER2 antibody. The reaction between the SpyTag-tagged sea lion AAV2/AAV chimeric VP1, VP2, and VP3 proteins and the SpyCatcher-tagged anti-HER2 antibody heavy chains was monitored by Western blotting, with SpyTag-tagged capsid proteins that reacted with the SpyCatcher-tagged antibody showing an increase in size when analyzed by SDS-PAGE. In the presence of SpyCatcher-tagged anti-HER2 mAb, all detectable SpyTag-tagged sea lion AAV2/AAV chimeric capsid proteins showed an increase in apparent size in Western blot analysis compared to SpyTag-tagged sea lion AAV2/AAV chimeric capsid proteins alone (Figs. 4C, 5B). This indicates that SpyTag-tagged sea lion AAV2/AAV chimeric particles are able to successfully form a covalent bond with SpyCatcher-tagged anti-HER2 mAb. SpyTag-tagged sea lion AAV2/AAV chimeric particles with low measured titers (SpyTag inserts at T434 and A565) did not show detectable protein in Western blot analysis (Figs. 4C, 5B).
[00296] Пример 4. Пептидные вставки в область VP3 капсидов AAV бородатой агамы вполне допустимы и могут опосредовать ковалентное прикрепление антител к вирусным частицам посредством Spy Catcher-SpyTag.[00296] Example 4. Peptide insertions into the VP3 region of bearded dragon AAV capsids are feasible and can mediate covalent attachment of antibodies to viral particles via Spy Catcher-SpyTag.
[00297] Потенциальные сайты пептидной вставки в пределах предполагаемой вариабельной петли IV и вариабельной петли VIII птичьего AAV предсказывали с использованием моделирования PyMol (фиг.6А), и выполняли клонирование соответствующих конструкций для вставки SpyTag. Каждый вирус получали, как описано выше, путем трансфекции в одной 15 см чашке упаковывающих клеток 293Т с помощью следующих плазмид и при следующих количествах, мкг:[00297] Potential peptide insertion sites within the predicted variable loop IV and variable loop VIII of avian AAV were predicted using PyMol modeling (Fig. 6A), and cloning of the corresponding SpyTag insertion constructs was performed. Each virus was produced as described above by transfection into one 15 cm dish of 293T packaging cells with the following plasmids and at the following amounts, μg:
плазмида-помощник pAd - 8 helper plasmid pAd - 8
pAAV-CMV-GFP - 4 pAAV-CMV-GFP-4
pAAV R2CapX - 4 pAAV R2CapX - 4
при этом конструкция pAAV R2CapX включает:The pAAV R2CapX design includes:
pAAV R2Cap AAV2/BHpyca бородатой агамы без SpyTag;bearded dragon pAAV R2Cap AAV2/BHpyca without SpyTag;
pAAV R2Cap AAV2/BHpyca бородатой агамы G436 линкер-6 SpyTag;pAAV R2Cap AAV2/BHpyca bearded dragon G436 linker-6 SpyTag;
pAAV R2Cap AAV2/BHpyca бородатой агамы T573 линкер-6 SpyTag;pAAV R2Cap AAV2/BHpyca bearded dragon T573 linker-6 SpyTag;
илиor
плазмида-помощник pAd - 8 helper plasmid pAd - 8
pAAV-CMV-GFP - 4 pAAV-CMV-GFP-4
pAAV R2Cap AAV2/вируса бородатой агамы без SpyTag - 3,3 pAAV R2Cap AAV2/bearded dragon virus without SpyTag - 3.3
ВМЕСТЕ СTOGETHER WITH
pAAV R2Cap AAV2/вируса бородатой агамы G436 линкер-6 SpyTag - 0,7 pAAV R2Cap AAV2/bearded dragon virus G436 linker-6 SpyTag - 0.7
ИЛИOR
pAAV R2Cap AAV2/вируса бородатой агамы Т573 линкер-6 SpyTag - 0,7 pAAV R2Cap AAV2/bearded dragon virus T573 linker-6 SpyTag - 0.7
[00298] Химерные частицы AAV2/AAV бородатой агамы без SpyTag, а также химерные частицы AAV2/AAV бородатой агамы, несущие вставки SpyTag в различных положениях в пределах капсида, как указано выше, упаковывали с геномами AAV, содержащими ITR2. В попытке понять, могут ли химерные капсиды AAV2/вируса бородатой агамы успешно формироваться и упаковываться с геномами, содержащими ITR AAV2, проводили количественную ПЦР для измерения титра (числа геномов на миллилитр или вг/мл) химерных частиц AAV2/AAV бородатой агамы, несущих вставки SpyTag, по сравнению с химерными частицами AAV2/AAV бородатой агамы без SpyTag (фиг.6В). Измеренные титры демонстрируют, что химерные частицы AAV2/AAV бородатой агамы могут быть упакованы с геномами ITR AAV2. Титр химерных частиц AAV2/AAV бородатой агамы, несущих вставки SpyTag, был меньше, чем у химерных частиц AAV2/AAV бородатой агамы без SpyTag.[00298] AAV2/bearded dragon AAV chimeric particles lacking SpyTag, as well as AAV2/bearded dragon AAV chimeric particles carrying SpyTag insertions at various positions within the capsid, as described above, were packaged with AAV genomes containing ITR2. In an attempt to understand whether AAV2/bearded dragon virus chimeric capsids could be successfully formed and packaged with genomes containing AAV2 ITRs, qPCR was performed to measure the titer (number of genomes per milliliter or vg/mL) of the AAV2/bearded dragon AAV chimeric particles carrying SpyTag insertions compared to the AAV2/bearded dragon AAV chimeric particles lacking SpyTag (Figure 6B). The measured titers demonstrate that bearded dragon AAV2/AAV chimeric particles can be packaged with AAV2 ITR genomes. The titer of bearded dragon AAV2/AAV chimeric particles carrying SpyTag insertions was lower than that of bearded dragon AAV2/AAV chimeric particles without SpyTag.
[00299] Следующим шагом химерные частицы AAV2/AAV бородатой агамы без SpyTag и химерные частицы AAV2/AAV бородатой агамы, несущие вставки SpyTag, инкубировали в присутствии антитела, которое связывается с HER2, несущего метку SpyCatcher, или без него. Реакцию между химерными белками VP1, VP2 и VP3 AAV2/AAV бородатой агамы с меткой SpyTag и тяжелыми цепями антитела к HER2 с меткой SpyCatcher отслеживали с помощью вестерн-блоттинга; при этом капсидные белки с меткой SpyTag, которые прореагировали с антителом с меткой SpyCatcher, демонстрируют увеличение размера при анализе SDS-PAGE. В присутствии mAb к HER2 с меткой SpyCatcher химерные капсидные белки AAV2/AAV бородатой агамы с меткой SpyTag-проявляли увеличение видимого размера при вестерн-блоттинг анализе по сравнению с химерными капсидными белками AAV2/AAV бородатой агамы с меткой SpyTag-отдельно (фиг.6С). Это указывает на то, что химерные частицы AAV2/AAV бородатой агамы с меткой SpyTag способны успешно образовывать ковалентную связь с mAb к HER2 с меткой SpyCatcher.[00299] Next, the SpyTag-less bearded dragon AAV2/AAV chimeric particles and the SpyTag-inserted AAV2/AAV chimeric particles were incubated with or without a SpyCatcher-tagged anti-HER2 antibody. The reaction between the SpyTag-tagged bearded dragon AAV2/AAV chimeric VP1, VP2, and VP3 proteins and the SpyCatcher-tagged anti-HER2 antibody heavy chains was monitored by Western blotting, with SpyTag-tagged capsid proteins that reacted with the SpyCatcher-tagged antibody exhibiting an increase in size when analyzed by SDS-PAGE. In the presence of SpyCatcher-tagged anti-HER2 mAb, SpyTag-tagged bearded dragon AAV2/AAV chimeric capsid proteins exhibited an increase in apparent size in Western blot analysis compared to SpyTag-tagged bearded dragon AAV2/AAV chimeric capsid proteins alone (Fig. 6C). This indicates that SpyTag-tagged bearded dragon AAV2/AAV chimeric particles are able to successfully form a covalent bond with SpyCatcher-tagged anti-HER2 mAb.
[00300] Пример 5. Конъюгация антитела с пептидом, вставленным в капсид птичьего AAV по остатку G444 или К580, направляет антигенспецифическое нацеливание in vitro.[00300] Example 5. Conjugation of an antibody to a peptide inserted into the capsid of an avian AAV at residue G444 or K580 directs antigen-specific targeting in vitro.
[00301] Каждый вирус получали, как описано выше, в одном 15 см планшете путем трансфекции упаковывающих клеток 293Т с помощью следующих плазмид и при следующих количествах, мкг:[00301] Each virus was prepared as described above in one 15 cm plate by transfecting 293T packaging cells with the following plasmids and at the following amounts, µg:
плазмида-помощник pAd - 16 helper plasmid pAd - 16
pAAV-CAG-GFP - 8 pAAV-CAG-GFP-8
pAAV R2CapX - 8 pAAV R2CapX - 8
при этом конструкция pAAV R2CapX включает:The pAAV R2CapX design includes:
pAAV R2Cap AAV2/AAAV без SpyTag;pAAV R2Cap AAV2/AAAV without SpyTag;
pAAV R2Cap AAV2/AAAV G444 линкер-6 SpyTag;pAAV R2Cap AAV2/AAAV G444 linker-6 SpyTag;
pAAV R2Cap AAV2/AAAV K580 линкер-6 SpyTag;pAAV R2Cap AAV2/AAAV K580 linker-6 SpyTag;
ВМЕСТЕ С ИЛИ БЕЗWITH OR WITHOUT
плазмида с тяжелой цепью Vh антитела, слитой со SpyCatcher - 1,5 plasmid with heavy chain Vh antibody fused with SpyCatcher - 1.5
плазмид а с легкой цепью Vk антитела - 3Plasmid A with light chain Vk antibody - 3
[00302] Химерные частицы AAV2/птичьего AAV без SpyTag, а также химерные частицы AAV2/птичьего AAV, несущие вставки SpyTag в различных положениях в пределах капсида, как указано выше, получали в присутствии или в отсутствие тяжелой и легкой цепей антитела, кодирующих одно из SpyCatcher-антитело к GLP1R, антитела, которое связывает GLP1R и слито со SpyCatcher на С-конце тяжелой цепи, SpyCatcher-герцептин, антитела, которое связывает HER2 и слито со SpyCatcher на С-конце тяжелой цепи, или SpyCatcher-антитело к ASGR1, антитела, которое связывает ASGR1 и слито со SpyCatcher на С-конце тяжелой цепи. Клетки, инфицированные вирусными частицами, описанными выше, оценивали с помощью проточной цитометрии для отслеживания трансдукции. Химерные AAV2/AAAV, конъюгированные с нацеливающимся на HER2 антителом, специфически инфицировали HER2+ клетки (фиг.7А), а химерные AAV2/AAAV, конъюгированные с контрольным ненацеливающимся антителом к GLP1R, проявляли незначительное фоновое инфицирование любых типов клеток (фиг.7А, 7В). Химерные AAV2/AAAV, конъюгированные с нацеливающимся на ASGR1 антителом, специфически инфицировали ASGR1+ клетки и проявляли незначительное фоновое инфицирование ASGR1- клеток (фиг.7В).[00302] Chimeric AAV2/avian AAV particles lacking SpyTag, as well as chimeric AAV2/avian AAV particles bearing SpyTag inserts at various positions within the capsid, as described above, were produced in the presence or absence of the heavy and light chains of an antibody encoding one of SpyCatcher-anti-GLP1R, an antibody that binds GLP1R and is fused to SpyCatcher at the C-terminus of the heavy chain, SpyCatcher-Herceptin, an antibody that binds HER2 and is fused to SpyCatcher at the C-terminus of the heavy chain, or SpyCatcher-ASGR1, an antibody that binds ASGR1 and is fused to SpyCatcher at the C-terminus of the heavy chain. Cells infected with the viral particles described above were assessed by flow cytometry to monitor transduction. Chimeric AAV2/AAAV conjugated to a HER2-targeting antibody specifically infected HER2+ cells (Fig. 7A), while chimeric AAV2/AAAV conjugated to a control non-targeting GLP1R antibody showed little background infection of any cell type (Figs. 7A, 7B). Chimeric AAV2/AAAV conjugated to an ASGR1-targeting antibody specifically infected ASGR1+ cells and showed little background infection of ASGR1- cells (Fig. 7B).
[00303] Пример 6. Конъюгация антитела с пептидом, вставленным в капсид AAV морского льва по остатку G432, направляет антигенспецифическое нацеливание in vitro.[00303] Example 6. Conjugation of an antibody to a peptide inserted into the sea lion AAV capsid at residue G432 directs antigen-specific targeting in vitro.
[00304] Каждый вирус получали, как описано выше, путем трансфекции в одной 15 см чашке упаковывающих клеток 293Т с помощью следующих плазмид и при следующих количествах, мкг:[00304] Each virus was prepared as described above by transfecting one 15 cm dish of 293T packaging cells with the following plasmids and at the following amounts, µg:
плазмида-помощник pAd - 16 helper plasmid pAd - 16
pAAV-CAG-GFP - 8 pAAV-CAG-GFP-8
pAAV R2Cap AAV2/вируса морского льва без SpyTag - 8 pAAV R2Cap AAV2/sea lion virus without SpyTag - 8
илиor
плазмида-помощник pAd 16 helper plasmid pAd 16
pAAV-CAG-GFP - 8 pAAV-CAG-GFP-8
pAAV R2Cap AAV2/вируса морского льва без SpyTag - 4 pAAV R2Cap AAV2/sea lion virus without SpyTag - 4
ВМЕСТЕ СTOGETHER WITH
pAAV R2CapX - 4 pAAV R2CapX - 4
при этом конструкция pAAV R2CapX включает:The pAAV R2CapX design includes:
pAAV R2Cap AAV2/вируса морского льва N429 линкер-6 SpyTag;pAAV R2Cap AAV2/sea lion virus N429 linker-6 SpyTag;
pAAV R2Cap ААЛ/2/вируса морского льва Р430 линкер-6 SpyTag;pAAV R2Cap AAL/2/sea lion virus P430 linker-6 SpyTag;
pAAV R2Cap AAV2/вируса морского льва Т431 линкер-6 SpyTag;pAAV R2Cap AAV2/sea lion virus T431 linker-6 SpyTag;
pAAV R2Cap AAV2/вируса морского льва G432 линкер-6 SpyTag;pAAV R2Cap AAV2/sea lion virus G432 linker-6 SpyTag;
pAAV R2Cap ААЛ/2/вируса морского льва S433 линкер-6 SpyTag;pAAV R2Cap AAL/2/sea lion virus S433 linker-6 SpyTag;
pAAV R2Cap AAV2/вируса морского льва R436 линкер-6 SpyTag;pAAV R2Cap AAV2/sea lion virus R436 linker-6 SpyTag;
pAAV R2Cap AAV2/вируса морского льва D437 линкер-6 SpyTag;pAAV R2Cap AAV2/sea lion virus D437 linker-6 SpyTag;
ВМЕСТЕ С ИЛИ БЕЗWITH OR WITHOUT
плазмиды с тяжелой цепью VH антитела, слитой со SpyCatcher - 1,5 plasmids with heavy chain V H antibody fused with SpyCatcher - 1.5
плазмиды с легкой цепью Vk антитела - 3Plasmids with light chain Vk antibodies - 3
[00305] Химерные частицы AAV2/AAV морского льва без SpyTag, а также химерные частицы AAV2/AAV морского льва, несущие вставку SpyTag в положении G432 в пределах капсида, как указано выше, получали в присутствии или в отсутствие тяжелой и легкой цепей антитела, кодирующих одно из SpyCatcher-антитело к GLP1R, антитела, которое связывает GLP1R и слито со SpyCatcher на С-конце тяжелой цепи, SpyCatcher-герцептин, антитела, которое связывает HER2 и слито со SpyCatcher на С-конце тяжелой цепи, или SpyCatcher-антитело к ASGR1, антитела, которое связывает ASGR1 и слито со SpyCatcher на С-конце тяжелой цепи. Клетки, инфицированные вирусными частицами, описанными выше, оценивали с помощью проточной цитометрии для отслеживания трансдукции. Химерные AAV2/AAV морского льва, несущие SpyTag в G432 и конъюгированные с нацеливающимся на HER2 антителом, специфически инфицировали HER2+ клетки и проявляли незначительное фоновое инфицирование HER2- клеток (фиг.8А), тогда как химерные AAV2/AAAV, конъюгированные с контрольным ненацеливающимся антителом к GLP1R, демонстрировали незначительное фоновое инфицирование любых типов клеток (фиг.8А, 8В). Химерные AAV2/AAV морского льва, несущие SpyTag в G432 и конъюгированные с нацеливающимся на ASGR1 антителом, специфически инфицировали ASGR1+ клетки и демонстрировали незначительное фоновое инфицирование ASGR1- клеток (фиг.8В).[00305] Sea lion AAV2/AAV chimeric particles lacking SpyTag, as well as sea lion AAV2/AAV chimeric particles bearing a SpyTag insert at position G432 within the capsid as described above, were produced in the presence or absence of the heavy and light chains of an antibody encoding one of SpyCatcher-anti-GLP1R, an antibody that binds GLP1R and is fused to SpyCatcher at the C-terminus of the heavy chain, SpyCatcher-Herceptin, an antibody that binds HER2 and is fused to SpyCatcher at the C-terminus of the heavy chain, or SpyCatcher-ASGR1, an antibody that binds ASGR1 and is fused to SpyCatcher at the C-terminus of the heavy chain. Cells infected with the viral particles described above were assessed by flow cytometry to monitor transduction. Sea lion AAV2/AAV chimerics carrying SpyTag at G432 and conjugated to a HER2-targeting antibody specifically infected HER2+ cells and showed little background infection of HER2− cells (Fig. 8A), whereas AAV2/AAAV chimerics conjugated to a control non-targeting GLP1R antibody showed little background infection of any cell type (Figs. 8A, 8B). Sea lion AAV2/AAV chimerics carrying SpyTag at G432 and conjugated to an ASGR1-targeting antibody specifically infected ASGR1+ cells and showed little background infection of ASGR1− cells (Fig. 8B).
[00306] Химерные частицы AAV2/AAV морского льва без SpyTag, а также панель химерных частиц AAV2/AAV морского льва, несущих вставки SpyTag в различных положениях в пределах предсказанной вариабельной петли 4 капсида, как указано выше, получали в присутствии или в отсутствие тяжелой и легкой цепей антитела, кодирующих SpyCatcher-герцептин, антитело, которое связывает HER2 и которое слито со SpyCatcher на С-конце тяжелой цепи. Клетки, инфицированные вирусными частицами, описанными выше, оценивали с помощью проточной цитометрии для отслеживания трансдукции. Химерные частицы AAV2/AAV морского льва, несущие вставки SpyTag в нескольких различных положениях в пределах капсида и конъюгированные с нацеливающимся на HER2 антителом, специфически инфицировали HER2+клетки, а химерные частицы AAV2/AAV морского льва без SpyTag демонстрировали незначительное фоновое инфицирование HER2+ клеток (фиг.9). Это свидетельствует о том, что в пределах химерного капсида AAV2/AAV морского льва несколько сайтов поддаются вставке SpyTag и перенацеливанию с использованием подхода с антителом, слитым со SpyCatcher.[00306] Sea lion AAV2/AAV chimeric particles lacking SpyTag, as well as a panel of sea lion AAV2/AAV chimeric particles bearing SpyTag insertions at various positions within the predicted variable loop 4 of the capsid, as described above, were generated in the presence or absence of the heavy and light chains of an antibody encoding SpyCatcher-Herceptin, an antibody that binds HER2 and which is fused to SpyCatcher at the C-terminus of the heavy chain. Cells infected with the viral particles described above were assessed by flow cytometry to monitor transduction. Sea lion AAV2/AAV chimeric particles carrying SpyTag insertions at several different positions within the capsid and conjugated to a HER2-targeting antibody specifically infected HER2+ cells, while sea lion AAV2/AAV chimeric particles without SpyTag showed little background infection of HER2+ cells (Fig. 9). This suggests that within the sea lion AAV2/AAV chimeric capsid, multiple sites are amenable to SpyTag insertion and retargeting using the SpyCatcher-fused antibody approach.
[00307] Пример 7. Конъюгация антитела с пептидом, вставленным в капсид AAV бородатой агамы по остатку G436 или Т573, направляет антигенспецифическое нацеливание in vitro.[00307] Example 7. Conjugation of an antibody to a peptide inserted into the bearded dragon AAV capsid at residue G436 or T573 directs antigen-specific targeting in vitro.
[00308] Каждый вирус получали, как описано выше, путем трансфекции в одной 15 см чашке упаковывающих клеток 293Т с помощью следующих плазмид и при следующих количествах, мкг:[00308] Each virus was prepared as described above by transfecting one 15 cm dish of 293T packaging cells with the following plasmids and at the following amounts, µg:
плазмида-помощник pAd - 8 helper plasmid pAd - 8
pAAV-CMV-GFP - 4 pAAV-CMV-GFP-4
pAAV R2CapX - 4 pAAV R2CapX - 4
при этом конструкция pAAV R2CapX включает:The pAAV R2CapX design includes:
pAAV R2Cap AAV/2/вируса бородатой агамы без SpyTag;pAAV R2Cap AAV/2/bearded dragon virus without SpyTag;
pAAV R2Cap AAV2/вируса бородатой агамы G436 линкер-6 SpyTag;pAAV R2Cap AAV2/bearded dragon virus G436 linker-6 SpyTag;
pAAV R2Cap AAV/2/вируса бородатой агамы Т573 линкер-6 SpyTag;pAAV R2Cap AAV/2/bearded dragon virus T573 linker-6 SpyTag;
илиor
плазмида-помощник pAd - 8 helper plasmid pAd - 8
pAAV-CMV-GFP - 4 pAAV-CMV-GFP-4
pAAV R2Cap AAV2/вируса бородатой агамы без SpyTag - 3,4 pAAV R2Cap AAV2/bearded dragon virus without SpyTag - 3.4
ВМЕСТЕ СTOGETHER WITH
pAAV R2Cap AAV2/вируса бородатой агамы G436 линкер-6 SpyTag - 0,6 pAAV R2Cap AAV2/bearded dragon virus G436 linker-6 SpyTag - 0.6
ИЛИOR
pAAV R2Cap AAV2/вируса бородатой агамы Т573 линкер-6 SpyTag - 0,6 pAAV R2Cap AAV2/bearded dragon virus T573 linker-6 SpyTag - 0.6
ВМЕСТЕ С ИЛИ БЕЗWITH OR WITHOUT
плазмиды с тяжелой цепью Vh антитела, слитой со SpyCatcher - 1,5plasmids with heavy chain Vh antibody fused with SpyCatcher - 1.5
плазмиды с легкой цепью Vk антитела - 3 Plasmids with light chain Vk antibodies - 3
[00309] Химерные частицы AAV2/AAV бородатой агамы без SpyTag, а также химерные частицы AAV2/AAV бородатой агамы, несущие вставки SpyTag в различных положениях в пределах капсида, как указано выше, получали в присутствии или в отсутствие тяжелой и легкой цепей антитела, кодирующих одно из SpyCatcher-герцептин, антитела, которое связывает HER2 и слито со SpyCatcher на С-конце тяжелой цепи, или SpyCatcher-антитело к ASGR1, антитела, которое связывает ASGR1 и слито со SpyCatcher на С-конце тяжелой цепи. Клетки, инфицированные вирусными частицами, описанными выше, оценивали с помощью проточной цитометрии для отслеживания трансдукции. Химерные AAV2/AAV бородатой агамы, конъюгированные с нацеливающимся на HER2 антителом, инфицировали HER2+ клетки (фиг.10А). Химерные AAV2/AAV бородатой агамы, конъюгированные с нацеливающимся на ASGR1 антителом, специфически инфицировали ASGR1+ клетки и проявляли незначительное фоновое инфицирование ASGR1- клеток (фиг.10В)[00309] Chimeric AAV2/bearded dragon AAV particles lacking SpyTag, as well as chimeric AAV2/bearded dragon AAV particles bearing SpyTag insertions at various positions within the capsid, as described above, were produced in the presence or absence of the heavy and light chains of an antibody encoding one of SpyCatcher-Herceptin, an antibody that binds HER2 and is fused to SpyCatcher at the C-terminus of the heavy chain, or SpyCatcher-ASGR1, an antibody that binds ASGR1 and is fused to SpyCatcher at the C-terminus of the heavy chain. Cells infected with the viral particles described above were assessed by flow cytometry to monitor transduction. Chimeric bearded dragon AAV2/AAV conjugated to a HER2-targeting antibody infected HER2+ cells (Fig. 10A). Chimeric bearded dragon AAV2/AAV conjugated to an ASGR1-targeting antibody specifically infected ASGR1+ cells and showed little background infection of ASGR1- cells (Fig. 10B).
[00310] Пример 8. Птичий AAV и AAV морского льва, конъюгированные с антителами, могут инфицировать клетки в присутствии более высоких уровней очищенных иммуноглобулинов человека, чем AAV2.[00310] Example 8. Avian AAV and sea lion AAV conjugated to antibodies can infect cells in the presence of higher levels of purified human immunoglobulins than AAV2.
[00311] Чтобы исследовать чувствительность химерных частиц AAV2/AAAV и химерных частиц AAV2/AAV морского льва к нейтрализации под действием антител, находящихся в сыворотке крови человека, проводили анализ нейтрализации, в котором частицы AAV инкубировали с возрастающими количествами IgG (hIgG), полученными из объединенных образцов сыворотки крови от десятков до тысяч доноров-людей, и представляющих профиль иммуноглобулинов в человеческой популяции.[00311] To examine the sensitivity of the AAV2/AAAV chimeric particles and the sea lion AAV2/AAV chimeric particles to neutralization by antibodies present in human serum, a neutralization assay was conducted in which the AAV particles were incubated with increasing amounts of IgG (hIgG) obtained from pooled serum samples from tens to thousands of human donors, representative of the immunoglobulin profile of the human population.
[00312] Каждый вирус получали, как описано выше, в 15 см планшетах путем трансфекции упаковывающих клеток 293Т следующими плазмидами и при следующих количествах, мкг:[00312] Each virus was produced as described above in 15 cm plates by transfecting 293T packaging cells with the following plasmids and at the following amounts, µg:
плазмида-помощник pAd - 16 helper plasmid pAd - 16
pAAV-CMV-Nanoluc - 8 pAAV-CMV-Nanoluc - 8
р-антитело к hASGRl SpyCatcher Vh - 3 r-antibody to hASGRl SpyCatcher Vh - 3
р-антитело к hASGRl Vk - 6 r-antibody to hASGRl Vk - 6
ВМЕСТЕ С ОДНИМ ИЗ:WITH ONE OF:
pAAV R2C2 N587 МУС - 7,5pAAV R2C2 N587 IUCN - 7.5
pAAV R2C2 G453 линкер-10 SpyTag - 0,5 pAAV R2C2 G453 linker-10 SpyTag - 0.5
ИЛИ:OR:
pAAV R2Cap AAV2/AAAV без SpyTag - 5 pAAV R2Cap AAV2/AAAV without SpyTag - 5
pAAV R2Cap AAV2/AAAV К580 линкер-6 SpyTag - 3 pAAV R2Cap AAV2/AAAV K580 linker-6 SpyTag - 3
ИЛИ:OR:
pAAV R2Cap AAV2/вируса морского льва без SpyTag - 5 pAAV R2Cap AAV2/sea lion virus without SpyTag - 5
pAAV R2Cap AAV2/вируса морского льва G432 линкер-10 SpyTag - 3 pAAV R2Cap AAV2/sea lion virus G432 linker-10 SpyTag - 3
[00313] Мозаичные AAV2, мозаичные химерные частицы AAV2/AAAV, несущие вставки SpyTag в пределах капсида, и мозаичные химерные частицы AAV2/AAV морского льва, несущие вставки SpyTag в пределах капсида, как указано выше, получали в присутствии тяжелой и легкой цепей антитела, кодирующих SpyCatcher-антитело к ASGR1, антитело, которое связывает hASGR1 и слито со SpyCatcher на С-конце тяжелой цепи. Затем частицы инкубировали в присутствии возрастающих концентраций hIgG в течение 30 минут при 37°С, после чего смесь вирусных частиц и hlgG добавляли к клеткам, экспрессирующим hASGR1. Клетки, инфицированные вирусными частицами, описанными выше, оценивали с помощью люциферазного анализа Nanoglo для контроля трансдукции.[00313] Mosaic AAV2, mosaic AAV2/AAAV chimeric particles bearing SpyTag inserts within the capsid, and mosaic AAV2/sea lion chimeric particles bearing SpyTag inserts within the capsid, as described above, were produced in the presence of the heavy and light chains of an antibody encoding the ASGR1 SpyCatcher antibody, an antibody that binds hASGR1 and is fused to SpyCatcher at the C-terminus of the heavy chain. The particles were then incubated in the presence of increasing concentrations of hIgG for 30 minutes at 37°C, after which the mixture of viral particles and hlgG was added to hASGR1-expressing cells. Cells infected with the viral particles described above were assessed using the Nanoglo luciferase assay to monitor transduction.
[003I4] На фиг.11А показана исходные данные по активности люциферазы Nanoluc в ASGR1+клетках, инфицированных указанными вирусными частицами, в присутствии указанных концентраций hlgG. В сравнении с мозаичными частицами AAV2, конъюгированными с антителами к ASGR1, большее количество hlgG требуется для подавления инфицирования мозаичными химерными частицами AAV2/AAAV, конъюгированными с антителами к ASGR1, и еще большее количество hlgG требуется для подавления инфицирования мозаичными химерными частицами AAV2/AAV морского льва, конъюгированными с антителами к ASGR1. На фиг.11В показаны данные люциферазного анализа Nanoluc из фиг.11А, нормализованные по условию «только PBS» (без hIgG) для каждого серотипа AAV, чтобы напрямую сравнить три серотипа AAV друг с другом. Более высокие концентрации hlgG требуются для снижения экспрессии люциферазы Nanoluc как в случае мозаичных химерных частиц AAV2/AAAV, конъюгированных с антителами к ASGR1, так и в случае мозаичных химерных частиц AAV2/AAV морского льва, конъюгированных с антителами к ASGR1. Концентрация hIgG в расчете на лунку, которая требуется для подавления инфицирования на 50% (значения IC50) для двух независимых экспериментов, показана на фиг.11С. Значения IC50 hIgG для мозаичных химерных частиц AAV2/AAAV, конъюгированных с антителами к ASGR1, и значения IC50 hIgG для мозаичных химерных частиц AAV2/AAV морского льва, конъюгированных с антителами к ASGR1, намного выше, чем значения IC50 hIgG для мозаичных частиц AAV2, конъюгированных с антителами к ASGR1. В частности, на мозаичные химерные частицы AAV2/AAV морского льва, по-видимому, не действуют человеческие антитела при все испытанных концентрациях hIgG, кроме самых высоких.[003I4] Figure 11A shows raw Nanoluc luciferase activity data in ASGR1+ cells infected with the indicated viral particles in the presence of the indicated concentrations of hlgG. Compared to anti-ASGR1 antibody-conjugated AAV2 mosaic particles, more hlgG was required to inhibit infection with anti-ASGR1 antibody-conjugated AAV2/AAAV mosaic chimeric particles, and even more hlgG was required to inhibit infection with anti-ASGR1 antibody-conjugated sea lion AAV2/AAV mosaic chimeric particles. Figure 11B shows the Nanoluc luciferase assay data from Figure 11A normalized to a PBS-only (no hIgG) condition for each AAV serotype to directly compare the three AAV serotypes to each other. Higher concentrations of hlgG were required to reduce Nanoluc luciferase expression for both anti-ASGR1-conjugated AAV2/AAAV mosaic particles and anti-ASGR1-conjugated AAV2/sea lion AAV mosaic particles. The concentration of hIgG per well required to inhibit infection by 50% (IC50 values) for two independent experiments are shown in Fig. 11C. The IC50 values of hIgG for anti-ASGR1-conjugated AAV2/AAAV mosaic particles and the IC50 values of hIgG for anti-ASGR1-conjugated AAV2/sea lion AAV mosaic particles are much higher than the IC50 values of hIgG for anti-ASGR1-conjugated AAV2 mosaic particles. In particular, sea lion AAV2/AAV mosaic chimeric particles appear to be unaffected by human antibodies at all but the highest hIgG concentrations tested.
[003I5] Пример 9. Птичий AAV может быть перенацелен на ASGR1 in vivo.[003I5] Example 9. Avian AAV can be retargeted to ASGR1 in vivo.
[00316] Чтобы определить, можно ли перенацеливать вирусные частицы, конъюгированные с антителами, специфичными к ASGR1, на клетки печени, экспрессирующие hASGRl in vivo, мышам, подвергнутым генетической модификации, так что их клетки печени экспрессируют hASGR1 на генетическом фоне C57BL/6, внутривенно вводили мозаичные химерные вирусные частицы AAV2/AAAV, несущие репортерный ген люциферазы светлячка и конъюгированные посредством SpyCatcher-SpyTag с одним из антитела, специфичного к hASGR1, или контрольного антитела, нацеливающегося на GLP1R человека. Мышь, которой вводили фосфатно-солевой буферный раствор (PBS), служила в качестве дополнительного контроля.[00316] To determine whether viral particles conjugated with ASGR1-specific antibodies could be retargeted to liver cells expressing hASGRl in vivo, mice genetically engineered to express hASGR1 in the C57BL/6 background were injected intravenously with mosaic chimeric AAV2/AAAV viral particles carrying a firefly luciferase reporter gene and conjugated via SpyCatcher-SpyTag to one of the hASGR1-specific antibodies or a control antibody targeting human GLP1R. A mouse injected with phosphate-buffered saline (PBS) served as an additional control.
[00317] Каждый вирус получали, как описано выше, в 15 см планшетах путем трансфекции упаковывающих клеток 293Т следующими плазмидами и при следующих количествах, мкг:[00317] Each virus was produced as described above in 15 cm plates by transfecting 293T packaging cells with the following plasmids and at the following amounts, µg:
Птичий AAV, антитело к GLP1R человека/антитело к ASGR1 человека, люциферазаAvian AAV, anti-human GLP1R/anti-human ASGR1, luciferase
плазмида-помощник pAd - 16 helper plasmid pAd - 16
pAAV-UbC- люцефераза светлячка - 8pAAV-UbC- firefly luciferase - 8
pAAV R2Cap AAV2/AAAV без SpyTag - 5 pAAV R2Cap AAV2/AAAV without SpyTag - 5
pAAV R2Cap AAV2/AAAV K580 линкер-6 SpyTag - 3 pAAV R2Cap AAV2/AAAV K580 linker-6 SpyTag - 3
ВМЕСТЕ С или БЕЗWITH OR WITHOUT
р-антитело к hGLP1R или антитело к hASGRl SpyCatcher Vh - 2,5 p-antibody to hGLP1R or antibody to hASGRl SpyCatcher Vh - 2.5
р-антитело к hGLP1R или антитело к hASGRl Vk - 5 p-antibody to hGLP1R or antibody to hASGRl Vk - 5
[00318] На фиг.12 показана люминесценция животных через 33 дня после инъекции либо PBS, либо описанных выше мозаичных химерных вирусных частиц AAV2/AAAV, конъюгированных с антителами, нацеливающимися на hASGR1 или hGLP1R в качестве ненацеливающегося контроля. Живых животных подвергали анестезии с использованием изофлурана, вводили инъекцией субстрат люциферин и визуализировали через 10 минут с применением системы для визуализации in vivo IVIS Spectrum (PerkinElmer). На фиг.12A показано, что инфицирование с помощью комплексов мозаичного химерного AAV2/AAAV- SpyTag- SpyCatcher-Vh обнаруживали только в печени мышей, экспрессирующих hASGRl, которым вводили перенацеленный на hASGRl мозаичный химерный AAV2/AAAV, и не обнаруживалось в печени мышей, экспрессирующих hASGR1, которым вводили PBS или контрольные ненацеливающийся перенацеленный на hGLP1R мозаичный химерный AAV2/AAAV. Средняя интенсивность излучения сигнала люциферазы светлячка, которую обнаруживали у живых мышей с использованием системы для визуализации in vivo IVIS Spectrum (PerkinElmer), количественно определена на фиг.12В, а средняя интенсивность излучения отдельных органов, которые визуализировали ex-vivo после иссечения из инфицированных мышей, количественно определена на фиг.12С. На данных фигурах продемонстрировано, что мозаичный химерный AAV2/AAAV специфически трансдуцирует печень мышей, экспрессирующих hASGR1, только при конъюгировании с hASGR1-специфическим антителом.[00318] Figure 12 shows luminescence of animals 33 days after injection with either PBS or the above-described mosaic chimeric AAV2/AAAV viral particles conjugated to antibodies targeting hASGR1 or hGLP1R as a non-targeting control. Live animals were anesthetized with isoflurane, injected with luciferin substrate, and imaged 10 minutes later using the IVIS Spectrum in vivo imaging system (PerkinElmer). Figure 12A shows that infection with the mosaic chimeric AAV2/AAAV-SpyTag-SpyCatcher-Vh complexes was detected only in the livers of hASGR1-expressing mice injected with hASGR1-retargeted mosaic chimeric AAV2/AAAV and was not detected in the livers of hASGR1-expressing mice injected with PBS or control non-targeting hGLP1R-retargeted mosaic chimeric AAV2/AAAV. The mean emission intensity of the firefly luciferase signal detected in live mice using the IVIS Spectrum in vivo imaging system (PerkinElmer) is quantified in Figure 12B, and the mean emission intensity of individual organs imaged ex-vivo after excision from infected mice is quantified in Figure 12C. These figures demonstrate that mosaic chimeric AAV2/AAAV specifically transduces the liver of hASGR1-expressing mice only when conjugated to an hASGR1-specific antibody.
[00319] Пример 10. AAV морского льва трансдуцирует печень и легкие мышей in vivo.[00319] Example 10. Sea lion AAV transduces mouse liver and lungs in vivo.
[00320] Чтобы определить, можно ли перенацеливать вирусные частицы, конъюгированные с антителами, специфичными к ASGR1, на клетки печени, экспрессирующие hASGR1 in vivo, мышам, подвергнутым генетической модификации, так что их клетки печени экспрессируют hASGR1 на генетическом фоне C57BL/6, внутривенно вводили мозаичные химерные вирусные частицы AAV2/AAV морского льва, несущие репортерный ген люциферазы светлячка и конъюгированные посредством SpyCatcher-SpyTag с одним из антитела, специфичного к hASGR1, или контрольного антитела, нацеливающегося на GLP1R человека. Мышь, которой вводили фосфатно-солевой буферный раствор (PBS), служила в качестве дополнительного контроля.[00320] To determine whether viral particles conjugated with antibodies specific for ASGR1 can be retargeted to liver cells expressing hASGR1 in vivo, mice genetically modified so that their liver cells express hASGR1 on a C57BL/6 genetic background were injected intravenously with mosaic sea lion AAV2/AAV chimeric viral particles carrying a firefly luciferase reporter gene and conjugated via SpyCatcher-SpyTag to one of the hASGR1-specific antibody or a control antibody targeting human GLP1R. A mouse injected with phosphate-buffered saline (PBS) served as an additional control.
[00321] Каждый вирус получали, как описано выше, в 15 см планшетах путем трансфекции упаковывающих клеток 293Т следующими плазмидами и при следующих количествах, мкг:[00321] Each virus was produced as described above in 15 cm plates by transfecting 293T packaging cells with the following plasmids and at the following amounts, µg:
AAV морского льва, антитело к GLP1R человека/антитело к ASGR1 человека, люциферазаSea lion AAV, anti-human GLP1R/anti-human ASGR1, luciferase
плазмида-помощник pAd - 16 helper plasmid pAd - 16
pAAV-UbC- люцефераза светлячка - 8pAAV-UbC- firefly luciferase - 8
pAAV R2Cap AAV2/вируса морского льва без SpyTag - 5 pAAV R2Cap AAV2/sea lion virus without SpyTag - 5
pAAV R2Cap AAV2/вируса морского льва G432 линкер-10 SpyTag - 3 pAAV R2Cap AAV2/sea lion virus G432 linker-10 SpyTag - 3
ВМЕСТЕ С или БЕЗWITH OR WITHOUT
р-антитело к hGLP1R или антитело к hASGRl SpyCatcher Vh - 2,5 p-antibody to hGLP1R or antibody to hASGRl SpyCatcher Vh - 2.5
р-антитело к hGLP1R или антитело к hASGR1 Vk - 5 p-antibody to hGLP1R or antibody to hASGR1 Vk - 5
[00322] На фиг.13 показана люминесценция животных через 33 дня после инъекции либо PBS, либо описанных выше мозаичных химерных вирусных частиц AAV2/AAV морского льва, конъюгированных с антителами, нацеливающимися на hASGR1 или hGLP1R в качестве ненацеливающегося контроля. Живых животных подвергали анестезии с использованием изофлурана, вводили инъекцией субстрат люциферин и визуализировали через 10 минут с применением системы для визуализации in vivo IVIS Spectrum (PerkinElmer). На фиг.13A показано, что инфицирование комплексами мозаичного химерного AAV2/AAV морского льва-SpyTag-SpyCatcher-Vh обнаруживалось у мышей, экспрессирующих hASGR1, которым вводили как перенацеленный на hASGR1 химерный AAV2/AAV морского льва, так и контрольный ненацеливающийся перенацеленный на hGLPIR мозаичный химерный AAV2/AAV морского льва. Это свидетельствует о том, что химерный AAV2/AAV морского льва способен естественным образом трансдуцировать печень и другие органы мыши без помощи перенацеливающего антитела. Средняя интенсивность излучения сигнала люциферазы светлячка, которую обнаруживали у живых мышей с использованием системы для визуализации in vivo IVIS Spectrum (PerkinElmer), количественно определена на фиг.13В, а средняя интенсивность излучения отдельных органов, которые визуализировали ex-vivo после иссечения из инфицированных мышей, количественно определена на фиг.13С. На данных фигурах продемонстрировано, что мозаичный химерный AAV2/AAV морского льва трансдуцирует печень и легкие мышей, экспрессирующих hASGR1, при конъюгировании с hASGR1-специфическим антителом или ненацеливающимся контрольным антителом, специфическим в отношении hGLP1R.[00322] Figure 13 shows luminescence of animals 33 days after injection with either PBS or the above-described mosaic chimeric sea lion AAV2/AAV virus particles conjugated to antibodies targeting hASGR1 or hGLP1R as a non-targeting control. Live animals were anesthetized with isoflurane, injected with luciferin substrate, and imaged 10 minutes later using the IVIS Spectrum in vivo imaging system (PerkinElmer). Figure 13A shows that infection with sea lion mosaic chimeric AAV2/AAV-SpyTag-SpyCatcher-Vh complexes was detected in hASGR1-expressing mice injected with both hASGR1-retargeted sea lion chimeric AAV2/AAV and a control non-targeting hGLPIR-retargeted sea lion mosaic chimeric AAV2/AAV. This demonstrates that sea lion chimeric AAV2/AAV is able to naturally transduce the liver and other organs of the mouse without the aid of a retargeting antibody. The mean emission intensity of the firefly luciferase signal detected in live mice using the IVIS Spectrum in vivo imaging system (PerkinElmer) is quantified in Fig. 13B, and the mean emission intensity of individual organs imaged ex-vivo after excision from infected mice is quantified in Fig. 13C. These figures demonstrate that the mosaic chimeric sea lion AAV2/AAV transduces the liver and lung of hASGR1-expressing mice when conjugated to an hASGR1-specific antibody or a non-targeting control antibody specific for hGLP1R.
[00323] Пример 11. Химерный AAV2/AAV морского льва проявляет некоторую степень естественного тропизма во внутреннее ухо мыши.[00323] Example 11. The chimeric sea lion AAV2/AAV exhibits some degree of natural tropism for the mouse inner ear.
[00324] Каждый вирус получали, как описано выше, в 15 см планшетах путем трансфекции упаковывающих клеток 293Т следующими плазмидами и при следующих количествах, мкг:[00324] Each virus was produced as described above in 15 cm plates by transfecting 293T packaging cells with the following plasmids and at the following amounts, µg:
плазмида-помощник pAd - 16 helper plasmid pAd - 16
pAAV-CAG-GFP - 8 pAAV-CAG-GFP-8
pAAV R2Cap AAV2/вируса морского льва без SpyTag - 8 pAAV R2Cap AAV2/sea lion virus without SpyTag - 8
[00325] Чтобы определить, обладает ли химерный AAV2/AAV морского льва естественным тропизмом в отношении определенных тканей у мыши, кортиев орган иссекали у новорожденной мыши, культивировали ex vivo, затем вирусные частицы AAV2/AAV морского льва применяли для инфицирования культуры. Через три дня после инфицирования волосковые клетки улитки окрашивали в красный цвет с помощью Муо7а, а вирус экспрессировал GFP в качестве маркера трансдукции. Наблюдали устойчивую трансдукцию нескольких типов клеток (фиг.14), что свидетельствуем о том, что химерные частицы AAV2/AAV морского льва способны естественным образом трансдуцировать внутреннее ухо.[00325] To determine whether the sea lion AAV2/AAV chimeric protein has a natural tissue tropism for certain mouse tissues, the organ of Corti was dissected from a neonatal mouse, cultured ex vivo, and then the sea lion AAV2/AAV viral particles were used to infect the culture. Three days after infection, cochlear hair cells were stained red with Myo7a and the virus expressed GFP as a transduction marker. Robust transduction of multiple cell types was observed (Figure 14), indicating that the sea lion AAV2/AAV chimeric particles are capable of naturally transducing the inner ear.
[00326] Пример 12. Частичная или полная замена эпитопа В1 химерных капсидов AAV2/AAV морского льва на гомологичную последовательность из AAV морского льва вполне допустима и повышает эффективность трансдукции.[00326] Example 12. Partial or complete replacement of the B1 epitope of sea lion AAV2/AAV chimeric capsids with a homologous sequence from sea lion AAV is entirely feasible and increases transduction efficiency.
[00327] В пределах эпитопа В1 химерных молекул AAV2/вируса морского льва вносили модификации (фиг.15А) и последовательность эпитопа В1 заменили в Y730 или от 1705 по Н712 на гомологичную последовательность капсида вируса морского льва. Каждый вирус получали, как описано выше, в пяти, десяти или двенадцати 15-см планшетах путем трансфекции упаковывающих клеток НЕК 293Т следующими плазмидами и при следующих количествах из расчета на планшет, мкг:[00327] Modifications were made within the B1 epitope of the AAV2/sea lion virus chimeric molecules (Fig. 15A) and the B1 epitope sequence was replaced at Y730 or 1705 to H712 with the homologous sea lion virus capsid sequence. Each virus was produced as described above in five, ten, or twelve 15-cm plates by transfecting HEK 293T packaging cells with the following plasmids and at the following amounts per plate, μg:
плазмида-помощник pAd - 12 helper plasmid pAd - 12
pAAV-CMV-X - 6 pAAV-CMV-X-6
при этом конструкция pAAV-CMV-X включает:The pAAV-CMV-X design includes:
pAAV-CMV- люцифераза NanoLuc;pAAV-CMV-NanoLuc luciferase;
pAAV-CMV- люцифераза светлячка;pAAV-CMV- firefly luciferase;
pAAV R2CapX - 10 pAAV R2CapX - 10
при этом конструкция pAAV R2CapX включает:The pAAV R2CapX design includes:
pAAV R2Cap AAV2/AAV морского льва без SpyTag;pAAV R2Cap AAV2/Sea Lion AAV without SpyTag;
pAAV R2Cap AAV2/AAV морского льва без SpyTag/Y730F;pAAV R2Cap AAV2/sea lion AAV without SpyTag/Y730F;
pAAV R2Cap AAV2/AAV морского льва без SpyTag/без В1.pAAV R2Cap AAV2/sea lion AAV without SpyTag/without B1.
[00328] Химерные частицы AAV2/AAV морского льва без вставок SpyTag и содержащие модификацию последовательности эпитопа В1 в пределах капсида, как указано выше, упаковывали с геномами AAV, содержащими ITR2. В попытке понять, могут ли химерные капсиды AAV2/вируса морского льва с модифицированными эпитопами В1 успешно формироваться и упаковываться с геномами, содержащими ITR AAV2, проводили количественную ПЦР для измерения титра (числа векторных геномов на миллилитр или вг/мл) химерных частиц AAV2/AAV морского льва с эпитопом В1 по сравнению с химерными частицами AAV2/AAV морского льва без модификаций эпитопа В1 (фиг.15В). Измеренные титры демонстрируют, что химерные частицы AAV2/AAV морского льва с модификациями эпитопа В1 могут быть упакованы с геномами ITR AAV2. Титр химерных частиц AAV2/вируса морского льва был аналогичным у химерными частицами AAV2/вируса морского льва с модификациями эпитопа В1 или без них.[00328] AAV2/sea lion AAV chimeric particles lacking SpyTag inserts and containing a B1 epitope sequence modification within the capsid as described above were packaged with AAV genomes containing ITR2. In an attempt to understand whether AAV2/sea lion virus chimeric capsids with modified B1 epitopes could be successfully formed and packaged with AAV2 ITR-containing genomes, qPCR was performed to measure the titer (number of vector genomes per milliliter or vg/mL) of the AAV2/sea lion AAV chimeric particles with the B1 epitope compared to the AAV2/sea lion AAV chimeric particles without the B1 epitope modifications (Figure 15B). The measured titers demonstrate that AAV2/sea lion AAV chimeric particles with B1 epitope modifications can be packaged with AAV2 ITR genomes. The titer of AAV2/sea lion virus chimeric particles was similar to that of AAV2/sea lion virus chimeric particles with or without B1 epitope modifications.
[00329] Присутствие VP1, VP2 и VP3, собранных в химерные частицы AAV2/AAV морского льва с модифицированными эпитопами В1 отслеживали с помощью SDS-PAGE и окрашивания белков. Результаты показали, что доля экспрессии VP1 относительно VP2 и VP3 была большей в случае вирусных частиц AAV2/AAV морского льва, в которых эпитоп В1 был полностью заменен на гомологичную последовательность капсида AAV морского льва, чем в случае вирусных частиц AAV2/AAV морского льва с эпитопом В1 или мутацией Y730F в эпитопе В1 (фиг.15С). Данное наблюдение коррелировало с увеличением эффективности трансдукции клеток HEK 293Т, как определено по активности люциферазы NanoLuc (фиг.15D).[00329] The presence of VP1, VP2, and VP3 assembled into the sea lion AAV2/AAV chimeric particles with modified B1 epitopes was monitored by SDS-PAGE and protein staining. The results showed that the proportion of VP1 expression relative to VP2 and VP3 was greater in the case of the sea lion AAV2/AAV viral particles in which the B1 epitope was completely replaced with the homologous sea lion AAV capsid sequence than in the case of the AAV2/AAV sea lion viral particles with the B1 epitope or the Y730F mutation in the B1 epitope (Figure 15C). This observation correlated with an increase in the transduction efficiency of HEK 293T cells, as determined by NanoLuc luciferase activity (Figure 15D).
[00330] Чтобы определить, воспроизводится ли увеличение эффективности трансдукции у частиц AAV2/AAV морского льва с полной заменой эпитопа В1 на последовательность AAV морского льва in vivo, мышам C57BL/6 внутривенно вводили химерные частицы AAV2/вируса морского льва, несущие репортерный ген люциферазы светлячка. Мышь, которой вводили фосфатно-солевой буферный раствор (PBS), служила в качестве дополнительного контроля.[00330] To determine whether the increase in transduction efficiency of AAV2/sea lion AAV particles with a complete replacement of the B1 epitope with the sea lion AAV sequence is reproduced in vivo, C57BL/6 mice were injected intravenously with chimeric AAV2/sea lion virus particles carrying a firefly luciferase reporter gene. A phosphate-buffered saline (PBS)-injected mouse served as an additional control.
[00331] На фиг.16 показаны данные люминесценции животных через 34 дня после инъекции либо PBS, либо химерных вирусных частиц AAV/2/вируса морского льва, как описано выше. Живых животных подвергали анестезии с использованием изофлурана, вводили инъекцией субстрат люциферин и визуализировали через 10 минут с применением системы для визуализации in vivo IVIS Spectrum (PerkinElmer). Подсчитывали среднюю интенсивность излучения отдельных органов, подвергнутых визуализации ex vivo после иссечения из инфицированных мышей. На фигуре показано, что химерные AAV2/AAV морского льва трансдуцируют печень и легкие. AAV2/AAV морского льва, содержащие модификации эпитопа В1, при которых он полностью заменен на гомологичную последовательность капсида AAV морского льва, обладали увеличенным тропизмом к сердцу и немного усиленной трансдукцией в печень и легкие.[00331] Figure 16 shows luminescence data from animals 34 days after injection with either PBS or chimeric AAV/2/sea lion virus particles as described above. Live animals were anesthetized with isoflurane, injected with luciferin substrate, and imaged 10 minutes later using the IVIS Spectrum in vivo imaging system (PerkinElmer). The mean emission intensity of individual organs imaged ex vivo after excision from infected mice was calculated. The figure shows that chimeric AAV2/sea lion AAV transduce the liver and lung. Sea lion AAV2/AAV containing modifications of the B1 epitope in which it is completely replaced by the homologous sequence of the sea lion AAV capsid had increased tropism for the heart and slightly increased transduction to the liver and lung.
[00332] Пример 13. Корректировка химерной границы раздела между последовательностями капсидов AAV2 и AAV морского льва или применение последовательностей капсида, полностью состоящих из последовательностей капсида AAV морского льва, вполне допускаются.[00332] Example 13. Adjustment of the chimeric interface between the AAV2 and sea lion AAV capsid sequences or the use of capsid sequences consisting entirely of sea lion AAV capsid sequences is entirely contemplated.
[00333] Выполняли модификации для корректировки химерной границы раздела между последовательностями капсидов AAV2 и вируса морского льва для создания транскриптов, в которых уникальные последовательности VP1 и VP2 получены либо из AAV2, либо из AAV морского льва, либо из их комбинации (фиг.17). Каждый вирус получали, как описано выше, в пяти, десяти или двенадцати 15-см планшетах путем трансфекции упаковывающих клеток HEK 293Т следующими плазмидами и при следующих количествах из расчета на планшет, мкг:[00333] Modifications were made to adjust the chimeric interface between the AAV2 and sea lion virus capsid sequences to generate transcripts in which the unique VP1 and VP2 sequences were derived from either AAV2 or sea lion AAV or a combination of both (Figure 17). Each virus was produced as described above in five, ten, or twelve 15-cm plates by transfecting HEK 293T packaging cells with the following plasmids and at the following amounts per plate, μg:
плазмида-помощник pAd - 12 helper plasmid pAd - 12
pAAV-CMV-люцифераза NanoLuc - 6 pAAV-CMV-luciferase NanoLuc - 6
pAAV R2CapX - 10 pAAV R2CapX - 10
при этом конструкция pAAV R2CapX включает:The pAAV R2CapX design includes:
pAAV R2Cap AAV2/AAV морского льва без SpyTag;pAAV R2Cap AAV2/Sea Lion AAV without SpyTag;
pAAV R2Cap AAV2/AAV морского льва без SpyTag v2.pAAV R2Cap Sea Lion AAV2/AAV without SpyTag v2.
pAAV R2Cap AAV2/AAV морского льва без SpyTag v3;pAAV R2Cap AAV2/Sea Lion AAV without SpyTag v3;
pAAV R2Cap AAV2/AAV морского льва без SpyTag v4;pAAV R2Cap AAV2/AAV sea lion without SpyTag v4;
pAAV R2Cap AAV2/AAV морского льва без SpyTag v5.pAAV R2Cap Sea Lion AAV2/AAV without SpyTag v5.
[00334] Химерные частицы AAV2/AAV морского льва с альтернативными[00334] Sea lion AAV2/AAV chimeric particles with alternative
границами раздела между химерными последовательностями капсидов AAV2 и AAV морского льва, как указано выше, упаковывали с геномами AAV, содержащими ITR2. В попытке понять, могут ли данные альтернативные химерные капсиды AAV2/вируса морского льва успешно формироваться и упаковываться с геномами, содержащими ITR AAV2, проводили количественную ПЦР для измерения титра (числа векторных геномов на миллилитр или вг/мл) вирусных частиц, очищенных либо из лизата, либо из супернатанта (фиг.18А). Измеренные титры демонстрируют, что химерные частицы AAV2/AAV морского льва с альтернативными химерными границами раздела могут быть упакованы с геномами ITR AAV2. Титр химерных частиц AAV2/AAV морского льва у химерных частиц AAV/2/вируса морского льва, очищенных из лизата, был аналогичным, за исключением v3. Титр частиц AAV2/AAV вируса морского льва без SpyTag v5, очищенных из среды, был несколько выше, чем титр частиц, очищенных из лизата. Эффективность трансдукции клеток HEK 293Т, определенная с помощью активности люциферазы NanoLuc, для химерных частиц AAV2/AAV морского льва была сопоставима у частиц с альтернативными местоположениями границы раздела (фиг.18В и 18С).interfaces between the chimeric AAV2 and sea lion AAV capsid sequences as described above were packaged with AAV genomes containing ITR2. In an attempt to understand whether these alternative chimeric AAV2/sea lion virus capsids could be successfully formed and packaged with AAV2 ITR-containing genomes, qPCR was performed to measure the titer (number of vector genomes per milliliter or vg/mL) of virus particles purified from either the lysate or the supernatant (Fig. 18A). The measured titers demonstrate that the AAV2/sea lion AAV chimeric particles with alternative chimeric interfaces can be packaged with AAV2 ITR genomes. The titer of sea lion AAV2/AAV chimeric particles was similar to that of lysate-purified AAV/2/sea lion virus chimeric particles, with the exception of v3. The titer of SpyTag-free v5 AAV2/sea lion virus particles purified from the medium was slightly higher than that of lysate-purified particles. The transduction efficiency of HEK 293T cells, as determined by NanoLuc luciferase activity, for the sea lion AAV2/AAV chimeric particles was comparable for particles with alternative interface locations (Figs. 18B and 18C).
[00335] Последовательность эпитопа В1 модифицировали с включением полностью гомологичной последовательности капсида вируса морского льва в химерных молекулах AAV2/вируса морского льва с альтернативными сайтами границы раздела, чтобы определить, будут ли модификации В1 аналогичным образом усиливать трансдукцию, как в случае AAV2/AAV морского льва без SpyTag. Каждый вирус получали, как описано выше, в пяти, десяти или двенадцати 15-см планшетах путем трансфекции упаковывающих клеток HEK 293Т следующими плазмидами и при следующих количествах из расчета на планшет, мкг:[00335] The B1 epitope sequence was modified to include a fully homologous sea lion virus capsid sequence in AAV2/sea lion virus chimeric molecules with alternative interface sites to determine whether the B1 modifications would similarly enhance transduction as with SpyTag-less sea lion AAV2/AAV. Each virus was produced as described above in five, ten, or twelve 15 cm plates by transfecting HEK 293T packaging cells with the following plasmids and at the following amounts per plate, μg:
плазмида-помощник pAd - 12 helper plasmid pAd - 12
pAAV-CMV-люцифераза светлячка - 6pAAV-CMV-firefly luciferase - 6
pAAV R2CapX - 10 pAAV R2CapX - 10
при этом конструкция pAAV R2CapX включает:The pAAV R2CapX design includes:
pAAV R2Cap AAV2/AAV морского льва без SpyTag;pAAV R2Cap AAV2/Sea Lion AAV without SpyTag;
pAAV R2Cap AAV2/AAV морского льва без SpyTag/без B1 v2.pAAV R2Cap AAV2/Sea Lion AAV without SpyTag/without B1 v2.
pAAV R2Cap AAV2/AAV морского льва без SpyTag/без B1 v3;pAAV R2Cap AAV2/sea lion AAV without SpyTag/without B1 v3;
pAAV R2Cap AAV2/AAV морского льва без SpyTag/без B1 v4;pAAV R2Cap AAV2/sea lion AAV without SpyTag/without B1 v4;
pAAV R2Cap AAV2/AAV морского льва без SpyTag/без B1 v5.pAAV R2Cap AAV2/Sea Lion AAV without SpyTag/without B1 v5.
[00336] Чтобы определить, приводит ли увеличение эффективности трансдукции у альтернативных химерных частиц AAV2/AAV морского льва с полной заменой эпитопа В1 на последовательность AAV морского льва к усиленной трансдукции in vivo, мышам C57BL/6 внутривенно вводили химерные частицы AAV2/вируса морского льва, несущие репортерный ген люциферазы светлячка. Мышь, которой вводили фосфатно-солевой буферный раствор (PBS), служила в качестве дополнительного контроля.[00336] To determine whether the increased transduction efficiency of alternative AAV2/sea lion AAV chimeric particles with a complete replacement of the B1 epitope with the sea lion AAV sequence results in enhanced transduction in vivo, C57BL/6 mice were injected intravenously with AAV2/sea lion virus chimeric particles carrying a firefly luciferase reporter gene. A phosphate-buffered saline (PBS)-injected mouse served as an additional control.
[00337] На фиг.18D показаны данные люминесценции животных через 46 дней после инъекции либо PBS, либо химерных вирусных частиц AAV2/вируса морского льва, описанных выше. Живых животных подвергали анестезии с использованием изофлурана, вводили инъекцией субстрат люциферин и визуализировали через 10 минут с применением системы для визуализации in vivo IVIS Spectrum (PerkinElmer). Подсчитывали интенсивность излучения отдельных органов, подвергнутых визуализации ex vivo после иссечения из инфицированных мышей. На фигуре показано, что химерные AAV2/AAV морского льва трансдуцируют печень, легкие и сердце. Способность AAV2/AAV морского льва без SpyTag/без B1 v5 (SEQ ID NO:71) трансдуцировать ткани указывает на то, что при добавлении к химерным частицам капсидов AAV2/AAV морского льва частица капсида AAV, полностью состоящая из капсида вируса морского льва (нехимерные капсидные белки), может функционировать в качестве вектора для переноса генов.[00337] Figure 18D shows luminescence data from animals 46 days after injection with either PBS or the chimeric AAV2/sea lion virus particles described above. Live animals were anesthetized with isoflurane, injected with luciferin substrate, and imaged 10 minutes later using the IVIS Spectrum in vivo imaging system (PerkinElmer). Emission intensities from individual organs imaged ex vivo after excision from infected mice were counted. The figure shows that the chimeric AAV2/sea lion AAV transduces the liver, lung, and heart. The ability of sea lion AAV2/AAV without SpyTag/without B1 v5 (SEQ ID NO:71) to transduce tissues indicates that when added to sea lion AAV2/AAV capsid chimeric particles, the AAV capsid particle consisting entirely of sea lion virus capsid (non-chimeric capsid proteins) can function as a gene transfer vector.
[00338] Хотя настоящее изобретение было конкретно показано и описано со ссылкой на ряд вариантов осуществления, специалистам в данной области техники должно быть понятно, что изменения в форме и деталях могут быть внесены в различные варианты осуществления, раскрытые в данном документе, без отступления от сущности и объема настоящего изобретения и что различные варианты осуществления, раскрытые в данном документе, не предназначены для ограничения объема формулы изобретения. Хотя при практическом осуществлении или тестировании настоящего изобретения можно применять любые способы и материалы, аналогичные описанным в данном документе или эквивалентные им, в данном документе описаны лишь некоторые предпочтительные способы и материалы. Все публикации, упомянутые в данном документе, включены в данный документ в полном объеме посредством ссылки. Если не указано иное, то все технические и научные термины, используемые в данном документе, имеют такое же значение, как его обычно понимает специалист средней квалификации в области техники, к которой принадлежит настоящее изобретение.[00338] Although the present invention has been particularly shown and described with reference to a number of embodiments, it will be understood by those skilled in the art that changes in form and detail may be made in the various embodiments disclosed herein without departing from the spirit and scope of the present invention, and that the various embodiments disclosed herein are not intended to limit the scope of the claims. Although any methods and materials similar or equivalent to those described herein can be used in the practice or testing of the present invention, only some preferred methods and materials are described herein. All publications mentioned in this document are herein incorporated by reference in their entirety. Unless defined otherwise, all technical and scientific terms used herein have the same meaning as commonly understood by one of ordinary skill in the art to which this invention belongs.
--->--->
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙSEQUENCE LIST
<110> РЕДЖЕНЕРОН ФАРМАСЬЮТИКАЛС, ИНК.<110> REGENERON PHARMACEUTICALS, INC.
САБИН, ЛЕАSABIN, LEA
КИРАЦУС, ХРИСТОС KYRATSUS, CHRIST
МОЛЛЕР-ТЕНК, СВЕН MOLLER-TENK, SVEN
<120> Модифицированные вирусные частицы и пути их применения<120> Modified viral particles and their application
<130> 10364WO01<130> 10364WO01
<150> 62/852791<150> 62/852791
<151> 2019-05-24<151> 2019-05-24
<160> 73 <160> 73
<170> PatentIn версия 3.5<170> PatentIn version 3.5
<210> 1<210> 1
<211> 2190<211> 2190
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Cap VP1 AAV2 VP2 VP3 AAAV<223> Cap VP1 AAV2 VP2 VP3 AAAV
<400> 1<400> 1
atggctgccg atggttatct tccagattgg ctcgaggaca ctctctctga aggaataaga 60atggctgccg atggttatct tccagattgg ctcgaggaca ctctctctga aggaataaga 60
cagtggtgga agctcaaacc tggcccacca ccaccaaagc ccgcagagcg gcataaggac 120cagtggtgga agctcaaacc tggcccacca ccaccaaagc ccgcagagcg gcataaggac 120
gacagcaggg gtcttgtgct tcctgggtac aagtacctcg gacccttcaa cggactcgac 180gacagcaggg gtcttgtgct tcctgggtac aagtacctcg gacccttcaa cggactcgac 180
aagggagagc cggtcaacga ggcagacgcc gcggccctcg agcacgacaa agcctacgac 240aagggagagc cggtcaacga ggcagacgcc gcggccctcg agcacgacaa agcctacgac 240
cggcagctcg acagcggaga caacccgtac ctcaagtaca accacgccga cgcggagttt 300cggcagctcg acagcggaga caacccgtac ctcaagtaca accacgccga cgcggagttt 300
caggagcgcc ttaaagaaga tacgtctttt gggggcaacc tcggacgagc agtcttccag 360caggagcgcc ttaaagaaga tacgtctttt gggggcaacc tcggacgagc agtcttccag 360
gcgaaaaaga gggttcttga acctctgggc ctggttgagg aacctgttaa gacggccggg 420gcgaaaaaga gggttcttga acctctgggc ctggttgagg aacctgttaa gacggccggg 420
accggggaga agcgtcccga acgcgtcgac gactttttcc cgaaaaagaa gaaggccaag 480accggggaga agcgtcccga acgcgtcgac gactttttcc cgaaaaagaa gaaggccaag 480
accgagcaag gcaaagcccc tgctcaaacg ggcgaagacc ccggagaagg aacctcttcc 540accgagcaag gcaaagcccc tgctcaaacg ggcgaagacc ccggagaagg aacctcttcc 540
aacgctggat caagcgcccc ctctagtgtg ggatcatctg tcatggctga aggaggtggc 600aacgctggat caagcgcccc ctctagtgtg ggatcatctg tcatggctga aggaggtggc 600
ggtccaatgg gcgatgcagg ccaaggtgcc gacggagtgg gcaattcctc gggaaattgg 660ggtccaatgg gcgatgcagg ccaaggtgcc gacggagtgg gcaattcctc gggaaattgg 660
cattgcgatt cccaatggct ggacaacgga gtcgttaccc gaaccactcg aacctgggtc 720cattgcgatt cccaatggct ggacaacgga gtcgttaccc gaaccactcg aacctgggtc 720
ctgcccagct acaacaacca cttgtacaag cggatccaag gaccgggagg aaccgacccc 780ctgcccagct acaacaacca cttgtacaag cggatccaag gaccgggagg aaccgacccc 780
aacaataaat tctttggatt cagcaccccc tgggggtact ttgactacaa ccgattccac 840aacaataaat tctttggatt cagcaccccc tgggggtact ttgactacaa ccgattccac 840
tgccacttct ccccccgaga ctggcaacga ctcatcaaca acaactgggg catccgaccc 900tgccacttct ccccccgaga ctggcaacga ctcatcaaca acaactgggg catccgaccc 900
aaagcgatgc gctttagact ctttaacatc caggttaaag aagtcactgt ccaagactcc 960aaagcgatgc gctttagact ctttaacatc caggttaaag aagtcactgt ccaagactcc 960
aacaccacca tcgccaacaa cctcaccagc acggtccaag tctttgcgga caaggactac 1020aacaccacca tcgccaacaa cctcaccagc acggtccaag tctttgcgga caaggactac 1020
cagctgccgt acgtcctcgg atcggctaca gagggcacct tcccgccgtt cccagcggat 1080cagctgccgt acgtcctcgg atcggctaca gagggcacct tcccgccgtt cccagcggat 1080
atctacacga tcccgcagta tggttactgc acgctaaact acaacaacga ggcggtggat 1140atctacacga tcccgcagta tggttactgc acgctaaact acaacaacga ggcggtggat 1140
cgttcggcct tctactgtct agactatttc ccctcagaca tgctgcggac aggaaataac 1200cgttcggcct tctactgtct agactatttc ccctcagaca tgctgcggac aggaaataac 1200
tttgaattca cttacacgtt cgaggacgtt cctttccata gcatgtttgc tcacaaccag 1260tttgaattca cttacacgtt cgaggacgtt cctttccata gcatgtttgc tcacaaccag 1260
acgctagacc ggctgatgaa tcctctcgtc gatcagtacc tgtgggcttt cagttccgtc 1320acgctagacc ggctgatgaa tcctctcgtc gatcagtacc tgtgggcttt cagttccgtc 1320
agccaaacag gctcgtctgg acgggcactc aattattcac gcgcgaccaa aaccaatatg 1380agccaaacag gctcgtctgg acgggcactc aattattcac gcgcgaccaa aaccaatatg 1380
gcaacccagt acagaaactg gttacctgga cccttcgtcc gggatcagca aatctttacg 1440gcaacccagt acagaaactg gttacctgga cccttcgtcc gggatcagca aatctttacg 1440
ggggctagca acatcaccca aaacaacgtg ttcaacgttt gggataaagg caagcagtgg 1500ggggctagca acatcaccca aaacaacgtg ttcaacgttt gggataaagg caagcagtgg 1500
gtgatagaca atcggatcaa tatgatgcag cccggccctg cagcagcgac cacctttagc 1560gtgatagaca atcggatcaa tatgatgcag cccggccctg cagcagcgac cacctttagc 1560
ggagaacccg accgtcaagc catgcaaaac acgctggcct ttagtcggac ggtctacgac 1620ggagaacccg accgtcaagc catgcaaaac acgctggcct ttagtcggac ggtctacgac 1620
cagacaacca gtacgaccga tcgtaaccag ttgctcatta ccaacgaaga tgaaatcaga 1680cagacaacca gtacgaccga tcgtaaccag ttgctcatta ccaacgaaga tgaaatcaga 1680
cccaccaact cggtcggcat cgacacgtgg ggagtagttc ccaacaacaa ccagtccaag 1740cccaccaact cggtcggcat cgacacgtgg ggagtagttc ccaacaacaa ccagtccaag 1740
gtgaccgccg gcactcgcgc ggccatcaac aaccaagggg cgcttcccgg gatggtgtgg 1800gtgaccgccg gcactcgcgc ggccatcaac aaccaagggg cgcttcccgg gatggtgtgg 1800
caaaacagag acatttacct ccaaggaccc atttgggcca aaatccccga cacagacaat 1860caaaacagag acatttacct ccaaggaccc atttggggcca aaatccccga cacagacaat 1860
cacttccatc cgtccccgct tattggcggg tttggctgca agcatccccc tccccagatt 1920cacttccatc cgtccccgct tattggcggg tttggctgca agcatccccc tccccagatt 1920
ttcattaaaa acacacccgt cccggccaac ccttcggaaa cgttccagac ggccaaggtg 1980ttcattaaaa acacacccgt cccggccaac ccttcggaaa cgttccagac ggccaaggtg 1980
gcctccttca tcaaccagta ctcgaccgga cagtgcaccg tcgaaatctt ttgggaactc 2040gcctccttca tcaaccagta ctcgaccgga cagtgcaccg tcgaaatctt ttgggaactc 2040
aagaaggaaa cctccaagcg ctggaacccc gaaatccagt tcacctccaa ctttggcaac 2100aagaaggaaa cctccaagcg ctggaacccc gaaatccagt tcacctccaa ctttggcaac 2100
gcggccgaca tccagtttgc tgtctccgac accggatcct attccgaacc tcgtcccatt 2160gcggccgaca tccagtttgc tgtctccgac accggatcct attccgaacc tcgtcccatt 2160
ggcaccagat acctgactcg tcctctgtaa 2190ggcaccagat acctgactcg tcctctgtaa 2190
<210> 2<210> 2
<211> 729<211> 729
<212> БЕЛОК<212> PROTEIN
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Cap VP1 AAV2 VP2 VP3 AAAV<223> Cap VP1 AAV2 VP2 VP3 AAAV
<400> 2<400> 2
Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Thr Leu Ser Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Thr Leu Ser
1 5 10 15 1 5 10 15
Glu Gly Ile Arg Gln Trp Trp Lys Leu Lys Pro Gly Pro Pro Pro Pro Glu Gly Ile Arg Gln Trp Trp Lys Leu Lys Pro Gly Pro Pro Pro Pro
20 25 30 20 25 30
Lys Pro Ala Glu Arg His Lys Asp Asp Ser Arg Gly Leu Val Leu Pro Lys Pro Ala Glu Arg His Lys Asp Asp Ser Arg Gly Leu Val Leu Pro
35 40 45 35 40 45
Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro
50 55 60 50 55 60
Val Asn Glu Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp Val Asn Glu Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp
65 70 75 80 65 70 75 80
Arg Gln Leu Asp Ser Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala Arg Gln Leu Asp Ser Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala
85 90 95 85 90 95
Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Lys Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Lys Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly
100 105 110 100 105 110
Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro
115 120 125 115 120 125
Leu Gly Leu Val Glu Glu Pro Val Lys Thr Ala Gly Thr Gly Glu Lys Leu Gly Leu Val Glu Glu Pro Val Lys Thr Ala Gly Thr Gly Glu Lys
130 135 140 130 135 140
Arg Pro Glu Arg Val Asp Asp Phe Phe Pro Lys Lys Lys Lys Ala Lys Arg Pro Glu Arg Val Asp Asp Phe Phe Pro Lys Lys Lys Lys Ala Lys
145 150 155 160 145 150 155 160
Thr Glu Gln Gly Lys Ala Pro Ala Gln Thr Gly Glu Asp Pro Gly Glu Thr Glu Gln Gly Lys Ala Pro Ala Gln Thr Gly Glu Asp Pro Gly Glu
165 170 175 165 170 175
Gly Thr Ser Ser Asn Ala Gly Ser Ser Ala Pro Ser Ser Val Gly Ser Gly Thr Ser Ser Asn Ala Gly Ser Ser Ala Pro Ser Ser Val Gly Ser
180 185 190 180 185 190
Ser Val Met Ala Glu Gly Gly Gly Gly Pro Met Gly Asp Ala Gly Gln Ser Val Met Ala Glu Gly Gly Gly Gly Pro Met Gly Asp Ala Gly Gln
195 200 205 195 200 205
Gly Ala Asp Gly Val Gly Asn Ser Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Gly Ala Asp Gly Val Gly Asn Ser Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser
210 215 220 210 215 220
Gln Trp Leu Asp Asn Gly Val Val Thr Arg Thr Thr Arg Thr Trp Val Gln Trp Leu Asp Asn Gly Val Val Thr Arg Thr Thr Arg Thr Trp Val
225 230 235 240 225 230 235 240
Leu Pro Ser Tyr Asn Asn His Leu Tyr Lys Arg Ile Gln Gly Pro Gly Leu Pro Ser Tyr Asn Asn His Leu Tyr Lys Arg Ile Gln Gly Pro Gly
245 250 255 245 250 255
Gly Thr Asp Pro Asn Asn Lys Phe Phe Gly Phe Ser Thr Pro Trp Gly Gly Thr Asp Pro Asn Asn Lys Phe Phe Gly Phe Ser Thr Pro Trp Gly
260 265 270 260 265 270
Tyr Phe Asp Tyr Asn Arg Phe His Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Tyr Phe Asp Tyr Asn Arg Phe His Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp
275 280 285 275 280 285
Gln Arg Leu Ile Asn Asn Asn Trp Gly Ile Arg Pro Lys Ala Met Arg Gln Arg Leu Ile Asn Asn Asn Trp Gly Ile Arg Pro Lys Ala Met Arg
290 295 300 290 295 300
Phe Arg Leu Phe Asn Ile Gln Val Lys Glu Val Thr Val Gln Asp Ser Phe Arg Leu Phe Asn Ile Gln Val Lys Glu Val Thr Val Gln Asp Ser
305 310 315 320 305 310 315 320
Asn Thr Thr Ile Ala Asn Asn Leu Thr Ser Thr Val Gln Val Phe Ala Asn Thr Thr Ile Ala Asn Asn Leu Thr Ser Thr Val Gln Val Phe Ala
325 330 335 325 330 335
Asp Lys Asp Tyr Gln Leu Pro Tyr Val Leu Gly Ser Ala Thr Glu Gly Asp Lys Asp Tyr Gln Leu Pro Tyr Val Leu Gly Ser Ala Thr Glu Gly
340 345 350 340 345 350
Thr Phe Pro Pro Phe Pro Ala Asp Ile Tyr Thr Ile Pro Gln Tyr Gly Thr Phe Pro Pro Phe Pro Ala Asp Ile Tyr Thr Ile Pro Gln Tyr Gly
355 360 365 355 360 365
Tyr Cys Thr Leu Asn Tyr Asn Asn Glu Ala Val Asp Arg Ser Ala Phe Tyr Cys Thr Leu Asn Tyr Asn Asn Glu Ala Val Asp Arg Ser Ala Phe
370 375 380 370 375 380
Tyr Cys Leu Asp Tyr Phe Pro Ser Asp Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Tyr Cys Leu Asp Tyr Phe Pro Ser Asp Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn
385 390 395 400 385 390 395 400
Phe Glu Phe Thr Tyr Thr Phe Glu Asp Val Pro Phe His Ser Met Phe Phe Glu Phe Thr Tyr Thr Phe Glu Asp Val Pro Phe His Ser Met Phe
405 410 415 405 410 415
Ala His Asn Gln Thr Leu Asp Arg Leu Met Asn Pro Leu Val Asp Gln Ala His Asn Gln Thr Leu Asp Arg Leu Met Asn Pro Leu Val Asp Gln
420 425 430 420 425 430
Tyr Leu Trp Ala Phe Ser Ser Val Ser Gln Thr Gly Ser Ser Gly Arg Tyr Leu Trp Ala Phe Ser Ser Val Ser Gln Thr Gly Ser Ser Gly Arg
435 440 445 435 440 445
Ala Leu Asn Tyr Ser Arg Ala Thr Lys Thr Asn Met Ala Thr Gln Tyr Ala Leu Asn Tyr Ser Arg Ala Thr Lys Thr Asn Met Ala Thr Gln Tyr
450 455 460 450 455 460
Arg Asn Trp Leu Pro Gly Pro Phe Val Arg Asp Gln Gln Ile Phe Thr Arg Asn Trp Leu Pro Gly Pro Phe Val Arg Asp Gln Gln Ile Phe Thr
465 470 475 480 465 470 475 480
Gly Ala Ser Asn Ile Thr Gln Asn Asn Val Phe Asn Val Trp Asp Lys Gly Ala Ser Asn Ile Thr Gln Asn Asn Val Phe Asn Val Trp Asp Lys
485 490 495 485 490 495
Gly Lys Gln Trp Val Ile Asp Asn Arg Ile Asn Met Met Gln Pro Gly Gly Lys Gln Trp Val Ile Asp Asn Arg Ile Asn Met Met Gln Pro Gly
500 505 510 500 505 510
Pro Ala Ala Ala Thr Thr Phe Ser Gly Glu Pro Asp Arg Gln Ala Met Pro Ala Ala Ala Thr Thr Phe Ser Gly Glu Pro Asp Arg Gln Ala Met
515 520 525 515 520 525
Gln Asn Thr Leu Ala Phe Ser Arg Thr Val Tyr Asp Gln Thr Thr Ser Gln Asn Thr Leu Ala Phe Ser Arg Thr Val Tyr Asp Gln Thr Thr Ser
530 535 540 530 535 540
Thr Thr Asp Arg Asn Gln Leu Leu Ile Thr Asn Glu Asp Glu Ile Arg Thr Thr Asp Arg Asn Gln Leu Leu Ile Thr Asn Glu Asp Glu Ile Arg
545 550 555 560 545 550 555 560
Pro Thr Asn Ser Val Gly Ile Asp Thr Trp Gly Val Val Pro Asn Asn Pro Thr Asn Ser Val Gly Ile Asp Thr Trp Gly Val Val Pro Asn Asn
565 570 575 565 570 575
Asn Gln Ser Lys Val Thr Ala Gly Thr Arg Ala Ala Ile Asn Asn Gln Asn Gln Ser Lys Val Thr Ala Gly Thr Arg Ala Ala Ile Asn Asn Gln
580 585 590 580 585 590
Gly Ala Leu Pro Gly Met Val Trp Gln Asn Arg Asp Ile Tyr Leu Gln Gly Ala Leu Pro Gly Met Val Trp Gln Asn Arg Asp Ile Tyr Leu Gln
595 600 605 595 600 605
Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile Pro Asp Thr Asp Asn His Phe His Pro Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile Pro Asp Thr Asp Asn His Phe His Pro
610 615 620 610 615 620
Ser Pro Leu Ile Gly Gly Phe Gly Cys Lys His Pro Pro Pro Gln Ile Ser Pro Leu Ile Gly Gly Phe Gly Cys Lys His Pro Pro Pro Gln Ile
625 630 635 640 625 630 635 640
Phe Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro Ala Asn Pro Ser Glu Thr Phe Gln Phe Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro Ala Asn Pro Ser Glu Thr Phe Gln
645 650 655 645 650 655
Thr Ala Lys Val Ala Ser Phe Ile Asn Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Cys Thr Ala Lys Val Ala Ser Phe Ile Asn Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Cys
660 665 670 660 665 670
Thr Val Glu Ile Phe Trp Glu Leu Lys Lys Glu Thr Ser Lys Arg Trp Thr Val Glu Ile Phe Trp Glu Leu Lys Lys Glu Thr Ser Lys Arg Trp
675 680 685 675 680 685
Asn Pro Glu Ile Gln Phe Thr Ser Asn Phe Gly Asn Ala Ala Asp Ile Asn Pro Glu Ile Gln Phe Thr Ser Asn Phe Gly Asn Ala Ala Asp Ile
690 695 700 690 695 700
Gln Phe Ala Val Ser Asp Thr Gly Ser Tyr Ser Glu Pro Arg Pro Ile Gln Phe Ala Val Ser Asp Thr Gly Ser Tyr Ser Glu Pro Arg Pro Ile
705 710 715 720 705 710 715 720
Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg Pro Leu Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg Pro Leu
725 725
<210> 3<210> 3
<211> 2145<211> 2145
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Cap VP1 AAV2 VP2 VP3 вируса морского льва<223> Cap VP1 AAV2 VP2 VP3 sea lion virus
<400> 3<400> 3
atggctgccg atggttatct tccagattgg ctcgaggaca ctctctctga aggaataaga 60atggctgccg atggttatct tccagattgg ctcgaggaca ctctctctga aggaataaga 60
cagtggtgga agctcaaacc tggcccacca ccaccaaagc ccgcagagcg gcataaggac 120cagtggtgga agctcaaacc tggcccacca ccaccaaagc ccgcagagcg gcataaggac 120
gacagcaggg gtcttgtgct tcctgggtac aagtacctcg gacccttcaa cggactcgac 180gacagcaggg gtcttgtgct tcctgggtac aagtacctcg gacccttcaa cggactcgac 180
aagggagagc cggtcaacga ggcagacgcc gcggccctcg agcacgacaa agcctacgac 240aagggagagc cggtcaacga ggcagacgcc gcggccctcg agcacgacaa agcctacgac 240
cggcagctcg acagcggaga caacccgtac ctcaagtaca accacgccga cgcggagttt 300cggcagctcg acagcggaga caacccgtac ctcaagtaca accacgccga cgcggagttt 300
caggagcgcc ttaaagaaga tacgtctttt gggggcaacc tcggacgagc agtcttccag 360caggagcgcc ttaaagaaga tacgtctttt gggggcaacc tcggacgagc agtcttccag 360
gcgaaaaaga gggttcttga acctctgggc ctggttgagg aaccctctca gccagattcg 420gcgaaaaaga gggttcttga acctctgggc ctggttgagg aaccctctca gccagattcg 420
tcctcggaca acacggcgcc acccgtgaaa aagtcccgtc tcgaagaagc ccagcccatt 480tcctcggaca acacggcgcc acccgtgaaa aagtcccgtc tcgaagaagc ccagcccatt 480
caaagtccag acgtttccag cagcactggc ggaggaattg ccgacgtcat gtctggagat 540caaagtccag acgtttccag cagcactggc ggaggaattg ccgacgtcat gtctggagat 540
gctgaaatgg ctgcagtggg cgggggagca ccgggcgtcg acggccaggg tgccgaggga 600gctgaaatgg ctgcagtggg cgggggagca ccgggcgtcg acggccaggg tgccgaggga 600
gtgggtactt cctcgggtaa ttggcattgc gattcccagt ggtcagaagg acacgtcaga 660gtgggtactt cctcgggtaa ttggcattgc gattcccagt ggtcagaagg acacgtcaga 660
accaccagca ccagaacctg ggtgttgccc agctacaaca accacctgta taaacggctt 720accaccagca ccagaacctg ggtgttgccc agctacaaca accacctgta taaacggctt 720
ggaagtagcg cacaatccaa tacctacaac ggattctcca ccccctgggg atacctcgac 780ggaagtagcg cacaatccaa tacctacaac ggattctcca ccccctgggg atacctcgac 780
ttcaatagat ggcactgtca cttcagtcct cggaactggc aacgtctcat caacaacaac 840ttcaatagat ggcactgtca cttcagtcct cggaactggc aacgtctcat caacaacaac 840
tggggcatca gaccaaaaag acttaatgtt aaattgttca acatacaagt caaagaggtc 900tggggcatca gaccaaaaag acttaatgtt aaattgttca acatacaagt caaagaggtc 900
acgacggaag gggggacgac gaccgtcgcc aataacctta ccagcacgat tcaggtgttt 960acgacggaag gggggacgac gaccgtcgcc aataacctta ccagcacgat tcaggtgttt 960
gcggacaacg cgtacgaact cccgtatgtt gtcgacgcgg gtcacgaggg ggcattgccg 1020gcggacaacg cgtacgaact cccgtatgtt gtcgacgcgg gtcacgaggg ggcattgccg 1020
ccgttcccaa acgacgtgtt tatgattccc caatacggat actgcgggct ggtgtctggt 1080ccgttcccaa acgacgtgtt tatgattccc caatacggat actgcgggct ggtgtctggt 1080
caaagtcagg ctcagtcgga cttgtgttcg ttttattgcc tggagtattt tccatcccag 1140caaagtcagg ctcagtcgga cttgtgttcg ttttattgcc tggagtattt tccatcccag 1140
atgctgagaa caggaaacaa ttttgaaatg aatttcaggt ttgaagacgt tccatttcac 1200atgctgagaa caggaaacaa ttttgaaatg aatttcaggt ttgaagacgt tccatttcac 1200
tccatgtacg cccacagcca gtctctagac aggctcatga atcctttaat tgatcagtat 1260tccatgtacg cccacagcca gtctctagac aggctcatga atcctttaat tgatcagtat 1260
ctgtggagtc taaaacaaac aggaaacccg actggatcaa caacgagaga cttaaaattt 1320ctgtggagtc taaaacaaac aggaaacccg actggatcaa caacgagaga cttaaaattt 1320
atcaagaaca aagttcccaa ttttgcacat tatggaaaaa attggcttcc tggacctttt 1380atcaagaaca aagttcccaa ttttgcacat tatggaaaaa attggcttcc tggacctttt 1380
attagacaac aggggtggac aacacaaaat attaataata gtgttgttaa ttttaatgac 1440attagacaac aggggtggac aacacaaaat attaataata gtgttgttaa ttttaatgac 1440
atgctgggaa aaaattcgac atttactttg gacactagat ggagttcatt agcgcctggt 1500atgctgggaa aaaattcgac atttactttg gacactagat ggagttcatt agcgcctggt 1500
ccgtgtatgg gggatgacgg acgaactcca tccaccacca agttctcaaa tgctcagctc 1560ccgtgtatgg gggatgacgg acgaactcca tccaccacca agttctcaaa tgctcagctc 1560
atgtttggat ctggaacaca acccaccgaa ggcggtgaag atgctgtaca tattacatcc 1620atgtttggat ctggaacaca acccaccgaa ggcggtgaag atgctgtaca tattacatcc 1620
gagtcggagg tcaaggcaac caacccaact gcaatcgatg aatacggacg agtggccgat 1680gagtcggagg tcaaggcaac caacccaact gcaatcgatg aatacggacg agtggccgat 1680
aatacgcaaa atgcaacaac cgccccaacc acagtgggaa atgctgcaat gggggccatg 1740aatacgcaaa atgcaacaac cgccccaacc acagtgggaa atgctgcaat gggggccatg 1740
cctgggatgg tgtggcaaga tagggatatc tatcttcaag gacccatctg gggaaaaata 1800cctgggatgg tgtggcaaga tagggatatc tatcttcaag gacccatctg gggaaaaata 1800
ccccatacag acggacattt tcatccgtct cctctcatgg gggggtttgg atacagaaaa 1860ccccatacag acggacattt tcatccgtct cctctcatgg gggggtttgg atacagaaaa 1860
ccccctccgc aaatttttat taaaaacacc cccgttcctg gaaatccggc aactacattt 1920ccccctccgc aaatttttat taaaaacacc cccgttcctg gaaatccggc aactacattt 1920
tctccaaata gaataaacaa tttcattact caatactcaa cgggacaagt gaccgttact 1980tctccaaata gaataaacaa tttcattact caatactcaa cgggacaagt gaccgttact 1980
attgactggg agctgcaaaa ggaaaactca aagagatgga acccagaagt acaatttaca 2040attgactggg agctgcaaaa ggaaaactca aagagatgga acccagaagt acaatttaca 2040
tcaaattttg gcacggtcga ttcactaaac tgggcaccgg acaacgcggg aaactacaaa 2100tcaaattttg gcacggtcga ttcactaaac tgggcaccgg acaacgcggg aaactacaaa 2100
gaaccaaggg tgattggcac cagatacctg actcgtatac tataa 2145gaaccaaggg tgattggcac cagatacctg actcgtatac tataa 2145
<210> 4<210> 4
<211> 714<211> 714
<212> БЕЛОК<212> PROTEIN
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Cap VP1 AAV2 VP2 VP3 вируса морского льва<223> Cap VP1 AAV2 VP2 VP3 sea lion virus
<400> 4<400> 4
Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Thr Leu Ser Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Thr Leu Ser
1 5 10 15 1 5 10 15
Glu Gly Ile Arg Gln Trp Trp Lys Leu Lys Pro Gly Pro Pro Pro Pro Glu Gly Ile Arg Gln Trp Trp Lys Leu Lys Pro Gly Pro Pro Pro Pro
20 25 30 20 25 30
Lys Pro Ala Glu Arg His Lys Asp Asp Ser Arg Gly Leu Val Leu Pro Lys Pro Ala Glu Arg His Lys Asp Asp Ser Arg Gly Leu Val Leu Pro
35 40 45 35 40 45
Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro
50 55 60 50 55 60
Val Asn Glu Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp Val Asn Glu Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp
65 70 75 80 65 70 75 80
Arg Gln Leu Asp Ser Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala Arg Gln Leu Asp Ser Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala
85 90 95 85 90 95
Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Lys Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Lys Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly
100 105 110 100 105 110
Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro
115 120 125 115 120 125
Leu Gly Leu Val Glu Glu Pro Ser Gln Pro Asp Ser Ser Ser Asp Asn Leu Gly Leu Val Glu Glu Pro Ser Gln Pro Asp Ser Ser Ser Asp Asn
130 135 140 130 135 140
Thr Ala Pro Pro Val Lys Lys Ser Arg Leu Glu Glu Ala Gln Pro Ile Thr Ala Pro Pro Val Lys Lys Ser Arg Leu Glu Glu Ala Gln Pro Ile
145 150 155 160 145 150 155 160
Gln Ser Pro Asp Val Ser Ser Ser Thr Gly Gly Gly Ile Ala Asp Val Gln Ser Pro Asp Val Ser Ser Ser Thr Gly Gly Gly Ile Ala Asp Val
165 170 175 165 170 175
Met Ser Gly Asp Ala Glu Met Ala Ala Val Gly Gly Gly Ala Pro Gly Met Ser Gly Asp Ala Glu Met Ala Ala Val Gly Gly Gly Ala Pro Gly
180 185 190 180 185 190
Val Asp Gly Gln Gly Ala Glu Gly Val Gly Thr Ser Ser Gly Asn Trp Val Asp Gly Gln Gly Ala Glu Gly Val Gly Thr Ser Ser Gly Asn Trp
195 200 205 195 200 205
His Cys Asp Ser Gln Trp Ser Glu Gly His Val Arg Thr Thr Ser Thr His Cys Asp Ser Gln Trp Ser Glu Gly His Val Arg Thr Thr Ser Thr
210 215 220 210 215 220
Arg Thr Trp Val Leu Pro Ser Tyr Asn Asn His Leu Tyr Lys Arg Leu Arg Thr Trp Val Leu Pro Ser Tyr Asn Asn His Leu Tyr Lys Arg Leu
225 230 235 240 225 230 235 240
Gly Ser Ser Ala Gln Ser Asn Thr Tyr Asn Gly Phe Ser Thr Pro Trp Gly Ser Ser Ala Gln Ser Asn Thr Tyr Asn Gly Phe Ser Thr Pro Trp
245 250 255 245 250 255
Gly Tyr Leu Asp Phe Asn Arg Trp His Cys His Phe Ser Pro Arg Asn Gly Tyr Leu Asp Phe Asn Arg Trp His Cys His Phe Ser Pro Arg Asn
260 265 270 260 265 270
Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn Asn Trp Gly Ile Arg Pro Lys Arg Leu Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn Asn Trp Gly Ile Arg Pro Lys Arg Leu
275 280 285 275 280 285
Asn Val Lys Leu Phe Asn Ile Gln Val Lys Glu Val Thr Thr Glu Gly Asn Val Lys Leu Phe Asn Ile Gln Val Lys Glu Val Thr Thr Glu Gly
290 295 300 290 295 300
Gly Thr Thr Thr Val Ala Asn Asn Leu Thr Ser Thr Ile Gln Val Phe Gly Thr Thr Thr Val Ala Asn Asn Leu Thr Ser Thr Ile Gln Val Phe
305 310 315 320 305 310 315 320
Ala Asp Asn Ala Tyr Glu Leu Pro Tyr Val Val Asp Ala Gly His Glu Ala Asp Asn Ala Tyr Glu Leu Pro Tyr Val Val Asp Ala Gly His Glu
325 330 335 325 330 335
Gly Ala Leu Pro Pro Phe Pro Asn Asp Val Phe Met Ile Pro Gln Tyr Gly Ala Leu Pro Pro Phe Pro Asn Asp Val Phe Met Ile Pro Gln Tyr
340 345 350 340 345 350
Gly Tyr Cys Gly Leu Val Ser Gly Gln Ser Gln Ala Gln Ser Asp Leu Gly Tyr Cys Gly Leu Val Ser Gly Gln Ser Gln Ala Gln Ser Asp Leu
355 360 365 355 360 365
Cys Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe Pro Ser Gln Met Leu Arg Thr Cys Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe Pro Ser Gln Met Leu Arg Thr
370 375 380 370 375 380
Gly Asn Asn Phe Glu Met Asn Phe Arg Phe Glu Asp Val Pro Phe His Gly Asn Asn Phe Glu Met Asn Phe Arg Phe Glu Asp Val Pro Phe His
385 390 395 400 385 390 395 400
Ser Met Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu Asp Arg Leu Met Asn Pro Leu Ser Met Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu Asp Arg Leu Met Asn Pro Leu
405 410 415 405 410 415
Ile Asp Gln Tyr Leu Trp Ser Leu Lys Gln Thr Gly Asn Pro Thr Gly Ile Asp Gln Tyr Leu Trp Ser Leu Lys Gln Thr Gly Asn Pro Thr Gly
420 425 430 420 425 430
Ser Thr Thr Arg Asp Leu Lys Phe Ile Lys Asn Lys Val Pro Asn Phe Ser Thr Thr Arg Asp Leu Lys Phe Ile Lys Asn Lys Val Pro Asn Phe
435 440 445 435 440 445
Ala His Tyr Gly Lys Asn Trp Leu Pro Gly Pro Phe Ile Arg Gln Gln Ala His Tyr Gly Lys Asn Trp Leu Pro Gly Pro Phe Ile Arg Gln Gln
450 455 460 450 455 460
Gly Trp Thr Thr Gln Asn Ile Asn Asn Ser Val Val Asn Phe Asn Asp Gly Trp Thr Thr Gln Asn Ile Asn Asn Ser Val Val Asn Phe Asn Asp
465 470 475 480 465 470 475 480
Met Leu Gly Lys Asn Ser Thr Phe Thr Leu Asp Thr Arg Trp Ser Ser Met Leu Gly Lys Asn Ser Thr Phe Thr Leu Asp Thr Arg Trp Ser Ser
485 490 495 485 490 495
Leu Ala Pro Gly Pro Cys Met Gly Asp Asp Gly Arg Thr Pro Ser Thr Leu Ala Pro Gly Pro Cys Met Gly Asp Asp Gly Arg Thr Pro Ser Thr
500 505 510 500 505 510
Thr Lys Phe Ser Asn Ala Gln Leu Met Phe Gly Ser Gly Thr Gln Pro Thr Lys Phe Ser Asn Ala Gln Leu Met Phe Gly Ser Gly Thr Gln Pro
515 520 525 515 520 525
Thr Glu Gly Gly Glu Asp Ala Val His Ile Thr Ser Glu Ser Glu Val Thr Glu Gly Gly Glu Asp Ala Val His Ile Thr Ser Glu Ser Glu Val
530 535 540 530 535 540
Lys Ala Thr Asn Pro Thr Ala Ile Asp Glu Tyr Gly Arg Val Ala Asp Lys Ala Thr Asn Pro Thr Ala Ile Asp Glu Tyr Gly Arg Val Ala Asp
545 550 555 560 545 550 555 560
Asn Thr Gln Asn Ala Thr Thr Ala Pro Thr Thr Val Gly Asn Ala Ala Asn Thr Gln Asn Ala Thr Thr Ala Pro Thr Thr Val Gly Asn Ala Ala
565 570 575 565 570 575
Met Gly Ala Met Pro Gly Met Val Trp Gln Asp Arg Asp Ile Tyr Leu Met Gly Ala Met Pro Gly Met Val Trp Gln Asp Arg Asp Ile Tyr Leu
580 585 590 580 585 590
Gln Gly Pro Ile Trp Gly Lys Ile Pro His Thr Asp Gly His Phe His Gln Gly Pro Ile Trp Gly Lys Ile Pro His Thr Asp Gly His Phe His
595 600 605 595 600 605
Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe Gly Tyr Arg Lys Pro Pro Pro Gln Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe Gly Tyr Arg Lys Pro Pro Pro Gln
610 615 620 610 615 620
Ile Phe Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro Gly Asn Pro Ala Thr Thr Phe Ile Phe Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro Gly Asn Pro Ala Thr Thr Phe
625 630 635 640 625 630 635 640
Ser Pro Asn Arg Ile Asn Asn Phe Ile Thr Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Ser Pro Asn Arg Ile Asn Asn Phe Ile Thr Gln Tyr Ser Thr Gly Gln
645 650 655 645 650 655
Val Thr Val Thr Ile Asp Trp Glu Leu Gln Lys Glu Asn Ser Lys Arg Val Thr Val Thr Ile Asp Trp Glu Leu Gln Lys Glu Asn Ser Lys Arg
660 665 670 660 665 670
Trp Asn Pro Glu Val Gln Phe Thr Ser Asn Phe Gly Thr Val Asp Ser Trp Asn Pro Glu Val Gln Phe Thr Ser Asn Phe Gly Thr Val Asp Ser
675 680 685 675 680 685
Leu Asn Trp Ala Pro Asp Asn Ala Gly Asn Tyr Lys Glu Pro Arg Val Leu Asn Trp Ala Pro Asp Asn Ala Gly Asn Tyr Lys Glu Pro Arg Val
690 695 700 690 695 700
Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg Ile Leu Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg Ile Leu
705 710 705 710
<210> 5<210> 5
<211> 2187<211> 2187
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Cap VP1 AAV2 VP2 VP3 агамы<223> Cap VP1 AAV2 VP2 VP3 agamas
<400> 5<400> 5
atggctgccg atggttatct tccagattgg ctcgaggaca ctctctctga aggaataaga 60atggctgccg atggttatct tccagattgg ctcgaggaca ctctctctga aggaataaga 60
cagtggtgga agctcaaacc tggcccacca ccaccaaagc ccgcagagcg gcataaggac 120cagtggtgga agctcaaacc tggcccacca ccaccaaagc ccgcagagcg gcataaggac 120
gacagcaggg gtcttgtgct tcctgggtac aagtacctcg gacccttcaa cggactcgac 180gacagcaggg gtcttgtgct tcctgggtac aagtacctcg gacccttcaa cggactcgac 180
aagggagagc cggtcaacga ggcagacgcc gcggccctcg agcacgacaa agcctacgac 240aagggagagc cggtcaacga ggcagacgcc gcggccctcg agcacgacaa agcctacgac 240
cggcagctcg acagcggaga caacccgtac ctcaagtaca accacgccga cgcggagttt 300cggcagctcg acagcggaga caacccgtac ctcaagtaca accacgccga cgcggagttt 300
caggagcgcc ttaaagaaga tacgtctttt gggggcaacc tcggacgagc agtcttccag 360caggagcgcc ttaaagaaga tacgtctttt gggggcaacc tcggacgagc agtcttccag 360
gcgaaaaaga gggttcttga acctctgggc ctggttgagg aacctgttaa gacggccgaa 420gcgaaaaaga gggttcttga acctctgggc ctggttgagg aacctgttaa gacggccgaa 420
aagcgaaaga cacccgaaga gtggttagct caagaaaaga ctccaaccaa acaaaggttc 480aagcgaaaga cacccgaaga gtggttagct caagaaaaga ctccaaccaa acaaaggttc 480
cagataccag ctccaggaca atctggatca gattctcctt ccacctcagg atccggcggt 540cagataccag ctccaggaca atctggatca gattctcctt ccacctcagg atccggcggt 540
actgcaggct ccagttctag cgcatcaaat acaatggctc aaggaggtgg cggaccaatg 600actgcaggct ccagttctag cgcatcaaat acaatggctc aaggaggtgg cggaccaatg 600
gcagacgata accaaggcgc cgagggagtg ggtaatgcct cgggagattg gcattgcgat 660gcagacgata accaaggcgc cgagggagtg ggtaatgcct cgggagattg gcattgcgat 660
acccaatggc tgggcgacca cgtcattaca aaatctacca gaacttgggt tctgccctct 720acccaatggc tgggcgacca cgtcattaca aaatctacca gaacttgggt tctgccctct 720
tacgggaatc atctctactc gcccatcaac tttgatggaa ccacagggaa cggaacccaa 780tacgggaatc atctctactc gcccatcaac tttgatggaa ccacagggaa cggaacccaa 780
gccgcttact gcggatacgc taccccctgg gcctactttg actttaaccg attccactgc 840gccgcttact gcggatacgc taccccctgg gcctactttg actttaaccg attccactgc 840
cacttttccc cccgagactg gcaaagactc attaacaacc ataccggaat acgaccagtc 900cacttttccc cccgagactg gcaaagactc attaacaacc ataccggaat acgaccagtc 900
ggactcaaat tcaagctgtt caacatccag gtcaaggaaa tcacagtaca agattcgacc 960ggactcaaat tcaagctgtt caacatccag gtcaaggaaa tcacagtaca agattcgacc 960
aaaacgatcg ccaacaatct caccagcacc gtacaggtct ttgcggacac ggagcaccag 1020aaaacgatcg ccaacaatct caccagcacc gtacaggtct ttgcggacac ggagcaccag 1020
ctcccgtacg tattaggaaa tgccacgcag ggcacgtttc ctccctttcc ggctgaagtc 1080ctcccgtacg tattaggaaa tgccacgcag ggcacgtttc ctccctttcc ggctgaagtc 1080
tttcagttgc ctcagtacgg ctactgtacc atccaaggcc ctcagggtaa gtttaccgac 1140tttcagttgc ctcagtacgg ctactgtacc atccaaggcc ctcagggtaa gtttaccgac 1140
agaagtgcct tctactgctt ggagtacttt ccttccaaga tgctgagaac ggggaataac 1200agaagtgcct tctactgctt ggagtacttt ccttccaaga tgctgagaac ggggaataac 1200
tttgaattta cttacaagtt cgagaaggtt cccttccatt ctggctgggc tcaaagccag 1260tttgaattta cttacaagtt cgagaaggtt cccttccatt ctggctgggc tcaaagccag 1260
tcgttggatc gattgatgaa tcccttgatc ccacagtacc tgttggccga ttatggtacg 1320tcgttggatc gattgatgaa tcccttgatc ccacagtacc tgttggccga ttatggtacg 1320
accgccagta gtgccataac atactatcgg ccaaacagca cagacttgag ctggtacttt 1380accgccagta gtgccataac atactatcgg ccaaacagca cagacttgag ctggtacttt 1380
aaaaactggc tgcctgggcc agtggaaagg cgacagcaaa tcaattctga agactcgacg 1440aaaaactggc tgcctgggcc agtggaaagg cgacagcaaa tcaattctga agactcgacg 1440
aaaaaccatg ccaatttgaa cgggaatgca cacaccaaca aatacagcat ccagcacaga 1500aaaaaccatg ccaatttgaa cgggaatgca cacaccaaca aatacagcat ccagcacaga 1500
caaaccaaga tgatgccagg ggtggctctc agtagtaaat acacaggtgc tgctgaagga 1560caaaccaaga tgatgccagg ggtggctctc agtagtaaat acacaggtgc tgctgaagga 1560
acgtcgttac tgaacggggt attgaccttt gataagatcg ccaatgacaa tactaacatc 1620acgtcgttac tgaacggggt attgaccttt gataagatcg ccaatgacaa tactaacatc 1620
acggatacaa ataatgtcaa tcggacgatc gaagatgaaa ttcaaggtac caatccttat 1680acggatacaa ataatgtcaa tcggacgatc gaagatgaaa ttcaaggtac caatccttat 1680
ggaaacgacg tacccattac cgtcgctgtc aatacacaaa acgcgaccac ttctcctacc 1740ggaaacgacg tacccattac cgtcgctgtc aatacacaaa acgcgaccac ttctcctacc 1740
atgcaaaaca gcagcacgta tgaactatta cctggtgctg tctggtccaa cagagatatt 1800atgcaaaaca gcagcacgta tgaactatta cctggtgctg tctggtccaa cagagatatt 1800
tacctgcaag gtcccatctg ggctaaaata cccgataccg atggacactt tcacccgtct 1860tacctgcaag gtcccatctg ggctaaaata cccgataccg atggacactt tcacccgtct 1860
ccacaaatgg gtggtttcgg acttaaaaac ccaccaccga tgatcctcat caaaaacaca 1920ccacaaatgg gtggtttcgg acttaaaaac ccaccaccga tgatcctcat caaaaacaca 1920
cccgttcccg ccgatccacc aacgaccttc aaaccgactc cgatgaacag cttcatcagc 1980cccgttcccg ccgatccacc aacgaccttc aaaccgactc cgatgaacag cttcatcagc 1980
gaatacagta ccggtcaggt gactgtagag atgctgtggg aggtccggaa agaagactcc 2040gaatacagta ccggtcaggt gactgtagag atgctgtggg aggtccggaa agaagactcc 2040
aagagatgga acccggaaat ccagtttacc tccaattttg gattgtccga tcctcagatc 2100aagagatgga acccggaaat ccagtttacc tccaattttg gattgtccga tcctcagatc 2100
gacggtatac cctttggtat taccaaattg ggtaattacg aggaaccacg tcctattggc 2160gacggtatac cctttggtat taccaaattg ggtaattacg aggaaccacg tcctattggc 2160
accagatacc tgactcgtca tttgtaa 2187accagatacc tgactcgtca tttgtaa 2187
<210> 6<210> 6
<211> 728<211> 728
<212> БЕЛОК<212> PROTEIN
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Cap VP1 AAV2 VP2 VP3 агамы<223> Cap VP1 AAV2 VP2 VP3 agamas
<400> 6<400> 6
Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Thr Leu Ser Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Thr Leu Ser
1 5 10 15 1 5 10 15
Glu Gly Ile Arg Gln Trp Trp Lys Leu Lys Pro Gly Pro Pro Pro Pro Glu Gly Ile Arg Gln Trp Trp Lys Leu Lys Pro Gly Pro Pro Pro Pro
20 25 30 20 25 30
Lys Pro Ala Glu Arg His Lys Asp Asp Ser Arg Gly Leu Val Leu Pro Lys Pro Ala Glu Arg His Lys Asp Asp Ser Arg Gly Leu Val Leu Pro
35 40 45 35 40 45
Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro
50 55 60 50 55 60
Val Asn Glu Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp Val Asn Glu Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp
65 70 75 80 65 70 75 80
Arg Gln Leu Asp Ser Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala Arg Gln Leu Asp Ser Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala
85 90 95 85 90 95
Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Lys Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Lys Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly
100 105 110 100 105 110
Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro
115 120 125 115 120 125
Leu Gly Leu Val Glu Glu Pro Val Lys Thr Ala Glu Lys Arg Lys Thr Leu Gly Leu Val Glu Glu Pro Val Lys Thr Ala Glu Lys Arg Lys Thr
130 135 140 130 135 140
Pro Glu Glu Trp Leu Ala Gln Glu Lys Thr Pro Thr Lys Gln Arg Phe Pro Glu Glu Trp Leu Ala Gln Glu Lys Thr Pro Thr Lys Gln Arg Phe
145 150 155 160 145 150 155 160
Gln Ile Pro Ala Pro Gly Gln Ser Gly Ser Asp Ser Pro Ser Thr Ser Gln Ile Pro Ala Pro Gly Gln Ser Gly Ser Asp Ser Pro Ser Thr Ser
165 170 175 165 170 175
Gly Ser Gly Gly Thr Ala Gly Ser Ser Ser Ser Ala Ser Asn Thr Met Gly Ser Gly Gly Thr Ala Gly Ser Ser Ser Ser Ala Ser Asn Thr Met
180 185 190 180 185 190
Ala Gln Gly Gly Gly Gly Pro Met Ala Asp Asp Asn Gln Gly Ala Glu Ala Gln Gly Gly Gly Gly Pro Met Ala Asp Asp Asn Gln Gly Ala Glu
195 200 205 195 200 205
Gly Val Gly Asn Ala Ser Gly Asp Trp His Cys Asp Thr Gln Trp Leu Gly Val Gly Asn Ala Ser Gly Asp Trp His Cys Asp Thr Gln Trp Leu
210 215 220 210 215 220
Gly Asp His Val Ile Thr Lys Ser Thr Arg Thr Trp Val Leu Pro Ser Gly Asp His Val Ile Thr Lys Ser Thr Arg Thr Trp Val Leu Pro Ser
225 230 235 240 225 230 235 240
Tyr Gly Asn His Leu Tyr Ser Pro Ile Asn Phe Asp Gly Thr Thr Gly Tyr Gly Asn His Leu Tyr Ser Pro Ile Asn Phe Asp Gly Thr Thr Gly
245 250 255 245 250 255
Asn Gly Thr Gln Ala Ala Tyr Cys Gly Tyr Ala Thr Pro Trp Ala Tyr Asn Gly Thr Gln Ala Ala Tyr Cys Gly Tyr Ala Thr Pro Trp Ala Tyr
260 265 270 260 265 270
Phe Asp Phe Asn Arg Phe His Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Phe Asp Phe Asn Arg Phe His Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln
275 280 285 275 280 285
Arg Leu Ile Asn Asn His Thr Gly Ile Arg Pro Val Gly Leu Lys Phe Arg Leu Ile Asn Asn His Thr Gly Ile Arg Pro Val Gly Leu Lys Phe
290 295 300 290 295 300
Lys Leu Phe Asn Ile Gln Val Lys Glu Ile Thr Val Gln Asp Ser Thr Lys Leu Phe Asn Ile Gln Val Lys Glu Ile Thr Val Gln Asp Ser Thr
305 310 315 320 305 310 315 320
Lys Thr Ile Ala Asn Asn Leu Thr Ser Thr Val Gln Val Phe Ala Asp Lys Thr Ile Ala Asn Asn Leu Thr Ser Thr Val Gln Val Phe Ala Asp
325 330 335 325 330 335
Thr Glu His Gln Leu Pro Tyr Val Leu Gly Asn Ala Thr Gln Gly Thr Thr Glu His Gln Leu Pro Tyr Val Leu Gly Asn Ala Thr Gln Gly Thr
340 345 350 340 345 350
Phe Pro Pro Phe Pro Ala Glu Val Phe Gln Leu Pro Gln Tyr Gly Tyr Phe Pro Pro Phe Pro Ala Glu Val Phe Gln Leu Pro Gln Tyr Gly Tyr
355 360 365 355 360 365
Cys Thr Ile Gln Gly Pro Gln Gly Lys Phe Thr Asp Arg Ser Ala Phe Cys Thr Ile Gln Gly Pro Gln Gly Lys Phe Thr Asp Arg Ser Ala Phe
370 375 380 370 375 380
Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe Pro Ser Lys Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe Pro Ser Lys Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn
385 390 395 400 385 390 395 400
Phe Glu Phe Thr Tyr Lys Phe Glu Lys Val Pro Phe His Ser Gly Trp Phe Glu Phe Thr Tyr Lys Phe Glu Lys Val Pro Phe His Ser Gly Trp
405 410 415 405 410 415
Ala Gln Ser Gln Ser Leu Asp Arg Leu Met Asn Pro Leu Ile Pro Gln Ala Gln Ser Gln Ser Leu Asp Arg Leu Met Asn Pro Leu Ile Pro Gln
420 425 430 420 425 430
Tyr Leu Leu Ala Asp Tyr Gly Thr Thr Ala Ser Ser Ala Ile Thr Tyr Tyr Leu Leu Ala Asp Tyr Gly Thr Thr Ala Ser Ser Ala Ile Thr Tyr
435 440 445 435 440 445
Tyr Arg Pro Asn Ser Thr Asp Leu Ser Trp Tyr Phe Lys Asn Trp Leu Tyr Arg Pro Asn Ser Thr Asp Leu Ser Trp Tyr Phe Lys Asn Trp Leu
450 455 460 450 455 460
Pro Gly Pro Val Glu Arg Arg Gln Gln Ile Asn Ser Glu Asp Ser Thr Pro Gly Pro Val Glu Arg Arg Gln Gln Ile Asn Ser Glu Asp Ser Thr
465 470 475 480 465 470 475 480
Lys Asn His Ala Asn Leu Asn Gly Asn Ala His Thr Asn Lys Tyr Ser Lys Asn His Ala Asn Leu Asn Gly Asn Ala His Thr Asn Lys Tyr Ser
485 490 495 485 490 495
Ile Gln His Arg Gln Thr Lys Met Met Pro Gly Val Ala Leu Ser Ser Ile Gln His Arg Gln Thr Lys Met Met Pro Gly Val Ala Leu Ser Ser
500 505 510 500 505 510
Lys Tyr Thr Gly Ala Ala Glu Gly Thr Ser Leu Leu Asn Gly Val Leu Lys Tyr Thr Gly Ala Ala Glu Gly Thr Ser Leu Leu Asn Gly Val Leu
515 520 525 515 520 525
Thr Phe Asp Lys Ile Ala Asn Asp Asn Thr Asn Ile Thr Asp Thr Asn Thr Phe Asp Lys Ile Ala Asn Asp Asn Thr Asn Ile Thr Asp Thr Asn
530 535 540 530 535 540
Asn Val Asn Arg Thr Ile Glu Asp Glu Ile Gln Gly Thr Asn Pro Tyr Asn Val Asn Arg Thr Ile Glu Asp Glu Ile Gln Gly Thr Asn Pro Tyr
545 550 555 560 545 550 555 560
Gly Asn Asp Val Pro Ile Thr Val Ala Val Asn Thr Gln Asn Ala Thr Gly Asn Asp Val Pro Ile Thr Val Ala Val Asn Thr Gln Asn Ala Thr
565 570 575 565 570 575
Thr Ser Pro Thr Met Gln Asn Ser Ser Thr Tyr Glu Leu Leu Pro Gly Thr Ser Pro Thr Met Gln Asn Ser Ser Thr Tyr Glu Leu Leu Pro Gly
580 585 590 580 585 590
Ala Val Trp Ser Asn Arg Asp Ile Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Ala Ala Val Trp Ser Asn Arg Asp Ile Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Ala
595 600 605 595 600 605
Lys Ile Pro Asp Thr Asp Gly His Phe His Pro Ser Pro Gln Met Gly Lys Ile Pro Asp Thr Asp Gly His Phe His Pro Ser Pro Gln Met Gly
610 615 620 610 615 620
Gly Phe Gly Leu Lys Asn Pro Pro Pro Met Ile Leu Ile Lys Asn Thr Gly Phe Gly Leu Lys Asn Pro Pro Pro Met Ile Leu Ile Lys Asn Thr
625 630 635 640 625 630 635 640
Pro Val Pro Ala Asp Pro Pro Thr Thr Phe Lys Pro Thr Pro Met Asn Pro Val Pro Ala Asp Pro Pro Thr Thr Phe Lys Pro Thr Pro Met Asn
645 650 655 645 650 655
Ser Phe Ile Ser Glu Tyr Ser Thr Gly Gln Val Thr Val Glu Met Leu Ser Phe Ile Ser Glu Tyr Ser Thr Gly Gln Val Thr Val Glu Met Leu
660 665 670 660 665 670
Trp Glu Val Arg Lys Glu Asp Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Ile Gln Trp Glu Val Arg Lys Glu Asp Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Ile Gln
675 680 685 675 680 685
Phe Thr Ser Asn Phe Gly Leu Ser Asp Pro Gln Ile Asp Gly Ile Pro Phe Thr Ser Asn Phe Gly Leu Ser Asp Pro Gln Ile Asp Gly Ile Pro
690 695 700 690 695 700
Phe Gly Ile Thr Lys Leu Gly Asn Tyr Glu Glu Pro Arg Pro Ile Gly Phe Gly Ile Thr Lys Leu Gly Asn Tyr Glu Glu Pro Arg Pro Ile Gly
705 710 715 720 705 710 715 720
Thr Arg Tyr Leu Thr Arg His Leu Thr Arg Tyr Leu Thr Arg His Leu
725 725
<210> 7<210> 7
<211> 2265<211> 2265
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Cap VP1 AAV2 VP2 VP3 AAAV G444 линкер-6 SpyTag<223> Cap VP1 AAV2 VP2 VP3 AAAV G444 linker-6 SpyTag
<400> 7<400> 7
atggctgccg atggttatct tccagattgg ctcgaggaca ctctctctga aggaataaga 60atggctgccg atggttatct tccagattgg ctcgaggaca ctctctctga aggaataaga 60
cagtggtgga agctcaaacc tggcccacca ccaccaaagc ccgcagagcg gcataaggac 120cagtggtgga agctcaaacc tggcccacca ccaccaaagc ccgcagagcg gcataaggac 120
gacagcaggg gtcttgtgct tcctgggtac aagtacctcg gacccttcaa cggactcgac 180gacagcaggg gtcttgtgct tcctgggtac aagtacctcg gacccttcaa cggactcgac 180
aagggagagc cggtcaacga ggcagacgcc gcggccctcg agcacgacaa agcctacgac 240aagggagagc cggtcaacga ggcagacgcc gcggccctcg agcacgacaa agcctacgac 240
cggcagctcg acagcggaga caacccgtac ctcaagtaca accacgccga cgcggagttt 300cggcagctcg acagcggaga caacccgtac ctcaagtaca accacgccga cgcggagttt 300
caggagcgcc ttaaagaaga tacgtctttt gggggcaacc tcggacgagc agtcttccag 360caggagcgcc ttaaagaaga tacgtctttt gggggcaacc tcggacgagc agtcttccag 360
gcgaaaaaga gggttcttga acctctgggc ctggttgagg aacctgttaa gacggccggg 420gcgaaaaaga gggttcttga acctctgggc ctggttgagg aacctgttaa gacggccggg 420
accggggaga agcgtcccga acgcgtcgac gactttttcc cgaaaaagaa gaaggccaag 480accggggaga agcgtcccga acgcgtcgac gactttttcc cgaaaaagaa gaaggccaag 480
accgagcaag gcaaagcccc tgctcaaacg ggcgaagacc ccggagaagg aacctcttcc 540accgagcaag gcaaagcccc tgctcaaacg ggcgaagacc ccggagaagg aacctcttcc 540
aacgctggat caagcgcccc ctctagtgtg ggatcatctg tcatggctga aggaggtggc 600aacgctggat caagcgcccc ctctagtgtg ggatcatctg tcatggctga aggaggtggc 600
ggtccaatgg gcgatgcagg ccaaggtgcc gacggagtgg gcaattcctc gggaaattgg 660ggtccaatgg gcgatgcagg ccaaggtgcc gacggagtgg gcaattcctc gggaaattgg 660
cattgcgatt cccaatggct ggacaacgga gtcgttaccc gaaccactcg aacctgggtc 720cattgcgatt cccaatggct ggacaacgga gtcgttaccc gaaccactcg aacctgggtc 720
ctgcccagct acaacaacca cttgtacaag cggatccaag gaccgggagg aaccgacccc 780ctgcccagct acaacaacca cttgtacaag cggatccaag gaccgggagg aaccgacccc 780
aacaataaat tctttggatt cagcaccccc tgggggtact ttgactacaa ccgattccac 840aacaataaat tctttggatt cagcaccccc tgggggtact ttgactacaa ccgattccac 840
tgccacttct ccccccgaga ctggcaacga ctcatcaaca acaactgggg catccgaccc 900tgccacttct ccccccgaga ctggcaacga ctcatcaaca acaactgggg catccgaccc 900
aaagcgatgc gctttagact ctttaacatc caggttaaag aagtcactgt ccaagactcc 960aaagcgatgc gctttagact ctttaacatc caggttaaag aagtcactgt ccaagactcc 960
aacaccacca tcgccaacaa cctcaccagc acggtccaag tctttgcgga caaggactac 1020aacaccacca tcgccaacaa cctcaccagc acggtccaag tctttgcgga caaggactac 1020
cagctgccgt acgtcctcgg atcggctaca gagggcacct tcccgccgtt cccagcggat 1080cagctgccgt acgtcctcgg atcggctaca gagggcacct tcccgccgtt cccagcggat 1080
atctacacga tcccgcagta tggttactgc acgctaaact acaacaacga ggcggtggat 1140atctacacga tcccgcagta tggttactgc acgctaaact acaacaacga ggcggtggat 1140
cgttcggcct tctactgtct agactatttc ccctcagaca tgctgcggac aggaaataac 1200cgttcggcct tctactgtct agactatttc ccctcagaca tgctgcggac aggaaataac 1200
tttgaattca cttacacgtt cgaggacgtt cctttccata gcatgtttgc tcacaaccag 1260tttgaattca cttacacgtt cgaggacgtt cctttccata gcatgtttgc tcacaaccag 1260
acgctagacc ggctgatgaa tcctctcgtc gatcagtacc tgtgggcttt cagttccgtc 1320acgctagacc ggctgatgaa tcctctcgtc gatcagtacc tgtgggcttt cagttccgtc 1320
agccaaacag gcggcctgag cggcagcggc gcccacatcg tgatggtgga cgcctacaag 1380agccaaacag gcggcctgag cggcagcggc gcccacatcg tgatggtgga cgcctacaag 1380
ccgacgaagg gcctgagcgg cagcggctcg tctggacggg cactcaatta ttcacgcgcg 1440ccgacgaagg gcctgagcgg cagcggctcg tctggacggg cactcaatta ttcacgcgcg 1440
accaaaacca atatggcaac ccagtacaga aactggttac ctggaccctt cgtccgggat 1500accaaaacca atatggcaac ccagtacaga aactggttac ctggaccctt cgtccgggat 1500
cagcaaatct ttacgggggc tagcaacatc acccaaaaca acgtgttcaa cgtttgggat 1560cagcaaatct ttacggggggc tagcaacatc acccaaaaca acgtgttcaa cgtttgggat 1560
aaaggcaagc agtgggtgat agacaatcgg atcaatatga tgcagcccgg ccctgcagca 1620aaaggcaagc agtgggtgat agacaatcgg atcaatatga tgcagcccgg ccctgcagca 1620
gcgaccacct ttagcggaga acccgaccgt caagccatgc aaaacacgct ggcctttagt 1680gcgaccacct ttagcggaga acccgaccgt caagccatgc aaaacacgct ggcctttagt 1680
cggacggtct acgaccagac aaccagtacg accgatcgta accagttgct cattaccaac 1740cggacggtct acgaccagac aaccagtacg accgatcgta accagttgct cattaccaac 1740
gaagatgaaa tcagacccac caactcggtc ggcatcgaca cgtggggagt agttcccaac 1800gaagatgaaa tcagacccac caactcggtc ggcatcgaca cgtggggagt agttcccaac 1800
aacaaccagt ccaaggtgac cgccggcact cgcgcggcca tcaacaacca aggggcgctt 1860aacaaccagt ccaaggtgac cgccggcact cgcgcggcca tcaacaacca aggggcgctt 1860
cccgggatgg tgtggcaaaa cagagacatt tacctccaag gacccatttg ggccaaaatc 1920cccgggatgg tgtggcaaaa cagagacatt tacctccaag gacccatttg ggccaaaatc 1920
cccgacacag acaatcactt ccatccgtcc ccgcttattg gcgggtttgg ctgcaagcat 1980cccgacacag acaatcactt ccatccgtcc ccgcttattg gcgggtttgg ctgcaagcat 1980
ccccctcccc agattttcat taaaaacaca cccgtcccgg ccaacccttc ggaaacgttc 2040ccccctcccc agattttcat taaaaacaca cccgtcccgg ccaacccttc ggaaacgttc 2040
cagacggcca aggtggcctc cttcatcaac cagtactcga ccggacagtg caccgtcgaa 2100cagacggcca aggtggcctc cttcatcaac cagtactcga ccggacagtg caccgtcgaa 2100
atcttttggg aactcaagaa ggaaacctcc aagcgctgga accccgaaat ccagttcacc 2160atcttttggg aactcaagaa ggaaacctcc aagcgctgga accccgaaat ccagttcacc 2160
tccaactttg gcaacgcggc cgacatccag tttgctgtct ccgacaccgg atcctattcc 2220tccaactttg gcaacgcggc cgacatccag tttgctgtct ccgacaccgg atcctattcc 2220
gaacctcgtc ccattggcac cagatacctg actcgtcctc tgtaa 2265gaacctcgtc ccattggcac cagatacctg actcgtcctc tgtaa 2265
<210> 8<210> 8
<211> 754<211> 754
<212> БЕЛОК<212> PROTEIN
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Cap VP1 AAV2 VP2 VP3 AAAV G444 линкер-6 SpyTag<223> Cap VP1 AAV2 VP2 VP3 AAAV G444 linker-6 SpyTag
<400> 8<400> 8
Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Thr Leu Ser Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Thr Leu Ser
1 5 10 15 1 5 10 15
Glu Gly Ile Arg Gln Trp Trp Lys Leu Lys Pro Gly Pro Pro Pro Pro Glu Gly Ile Arg Gln Trp Trp Lys Leu Lys Pro Gly Pro Pro Pro Pro
20 25 30 20 25 30
Lys Pro Ala Glu Arg His Lys Asp Asp Ser Arg Gly Leu Val Leu Pro Lys Pro Ala Glu Arg His Lys Asp Asp Ser Arg Gly Leu Val Leu Pro
35 40 45 35 40 45
Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro
50 55 60 50 55 60
Val Asn Glu Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp Val Asn Glu Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp
65 70 75 80 65 70 75 80
Arg Gln Leu Asp Ser Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala Arg Gln Leu Asp Ser Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala
85 90 95 85 90 95
Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Lys Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Lys Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly
100 105 110 100 105 110
Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro
115 120 125 115 120 125
Leu Gly Leu Val Glu Glu Pro Val Lys Thr Ala Gly Thr Gly Glu Lys Leu Gly Leu Val Glu Glu Pro Val Lys Thr Ala Gly Thr Gly Glu Lys
130 135 140 130 135 140
Arg Pro Glu Arg Val Asp Asp Phe Phe Pro Lys Lys Lys Lys Ala Lys Arg Pro Glu Arg Val Asp Asp Phe Phe Pro Lys Lys Lys Lys Ala Lys
145 150 155 160 145 150 155 160
Thr Glu Gln Gly Lys Ala Pro Ala Gln Thr Gly Glu Asp Pro Gly Glu Thr Glu Gln Gly Lys Ala Pro Ala Gln Thr Gly Glu Asp Pro Gly Glu
165 170 175 165 170 175
Gly Thr Ser Ser Asn Ala Gly Ser Ser Ala Pro Ser Ser Val Gly Ser Gly Thr Ser Ser Asn Ala Gly Ser Ser Ala Pro Ser Ser Val Gly Ser
180 185 190 180 185 190
Ser Val Met Ala Glu Gly Gly Gly Gly Pro Met Gly Asp Ala Gly Gln Ser Val Met Ala Glu Gly Gly Gly Gly Pro Met Gly Asp Ala Gly Gln
195 200 205 195 200 205
Gly Ala Asp Gly Val Gly Asn Ser Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Gly Ala Asp Gly Val Gly Asn Ser Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser
210 215 220 210 215 220
Gln Trp Leu Asp Asn Gly Val Val Thr Arg Thr Thr Arg Thr Trp Val Gln Trp Leu Asp Asn Gly Val Val Thr Arg Thr Thr Arg Thr Trp Val
225 230 235 240 225 230 235 240
Leu Pro Ser Tyr Asn Asn His Leu Tyr Lys Arg Ile Gln Gly Pro Gly Leu Pro Ser Tyr Asn Asn His Leu Tyr Lys Arg Ile Gln Gly Pro Gly
245 250 255 245 250 255
Gly Thr Asp Pro Asn Asn Lys Phe Phe Gly Phe Ser Thr Pro Trp Gly Gly Thr Asp Pro Asn Asn Lys Phe Phe Gly Phe Ser Thr Pro Trp Gly
260 265 270 260 265 270
Tyr Phe Asp Tyr Asn Arg Phe His Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Tyr Phe Asp Tyr Asn Arg Phe His Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp
275 280 285 275 280 285
Gln Arg Leu Ile Asn Asn Asn Trp Gly Ile Arg Pro Lys Ala Met Arg Gln Arg Leu Ile Asn Asn Asn Trp Gly Ile Arg Pro Lys Ala Met Arg
290 295 300 290 295 300
Phe Arg Leu Phe Asn Ile Gln Val Lys Glu Val Thr Val Gln Asp Ser Phe Arg Leu Phe Asn Ile Gln Val Lys Glu Val Thr Val Gln Asp Ser
305 310 315 320 305 310 315 320
Asn Thr Thr Ile Ala Asn Asn Leu Thr Ser Thr Val Gln Val Phe Ala Asn Thr Thr Ile Ala Asn Asn Leu Thr Ser Thr Val Gln Val Phe Ala
325 330 335 325 330 335
Asp Lys Asp Tyr Gln Leu Pro Tyr Val Leu Gly Ser Ala Thr Glu Gly Asp Lys Asp Tyr Gln Leu Pro Tyr Val Leu Gly Ser Ala Thr Glu Gly
340 345 350 340 345 350
Thr Phe Pro Pro Phe Pro Ala Asp Ile Tyr Thr Ile Pro Gln Tyr Gly Thr Phe Pro Pro Phe Pro Ala Asp Ile Tyr Thr Ile Pro Gln Tyr Gly
355 360 365 355 360 365
Tyr Cys Thr Leu Asn Tyr Asn Asn Glu Ala Val Asp Arg Ser Ala Phe Tyr Cys Thr Leu Asn Tyr Asn Asn Glu Ala Val Asp Arg Ser Ala Phe
370 375 380 370 375 380
Tyr Cys Leu Asp Tyr Phe Pro Ser Asp Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Tyr Cys Leu Asp Tyr Phe Pro Ser Asp Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn
385 390 395 400 385 390 395 400
Phe Glu Phe Thr Tyr Thr Phe Glu Asp Val Pro Phe His Ser Met Phe Phe Glu Phe Thr Tyr Thr Phe Glu Asp Val Pro Phe His Ser Met Phe
405 410 415 405 410 415
Ala His Asn Gln Thr Leu Asp Arg Leu Met Asn Pro Leu Val Asp Gln Ala His Asn Gln Thr Leu Asp Arg Leu Met Asn Pro Leu Val Asp Gln
420 425 430 420 425 430
Tyr Leu Trp Ala Phe Ser Ser Val Ser Gln Thr Gly Gly Leu Ser Gly Tyr Leu Trp Ala Phe Ser Ser Val Ser Gln Thr Gly Gly Leu Ser Gly
435 440 445 435 440 445
Ser Gly Ala His Ile Val Met Val Asp Ala Tyr Lys Pro Thr Lys Gly Ser Gly Ala His Ile Val Met Val Asp Ala Tyr Lys Pro Thr Lys Gly
450 455 460 450 455 460
Leu Ser Gly Ser Gly Ser Ser Gly Arg Ala Leu Asn Tyr Ser Arg Ala Leu Ser Gly Ser Gly Ser Ser Gly Arg Ala Leu Asn Tyr Ser Arg Ala
465 470 475 480 465 470 475 480
Thr Lys Thr Asn Met Ala Thr Gln Tyr Arg Asn Trp Leu Pro Gly Pro Thr Lys Thr Asn Met Ala Thr Gln Tyr Arg Asn Trp Leu Pro Gly Pro
485 490 495 485 490 495
Phe Val Arg Asp Gln Gln Ile Phe Thr Gly Ala Ser Asn Ile Thr Gln Phe Val Arg Asp Gln Gln Ile Phe Thr Gly Ala Ser Asn Ile Thr Gln
500 505 510 500 505 510
Asn Asn Val Phe Asn Val Trp Asp Lys Gly Lys Gln Trp Val Ile Asp Asn Asn Val Phe Asn Val Trp Asp Lys Gly Lys Gln Trp Val Ile Asp
515 520 525 515 520 525
Asn Arg Ile Asn Met Met Gln Pro Gly Pro Ala Ala Ala Thr Thr Phe Asn Arg Ile Asn Met Met Gln Pro Gly Pro Ala Ala Ala Thr Thr Phe
530 535 540 530 535 540
Ser Gly Glu Pro Asp Arg Gln Ala Met Gln Asn Thr Leu Ala Phe Ser Ser Gly Glu Pro Asp Arg Gln Ala Met Gln Asn Thr Leu Ala Phe Ser
545 550 555 560 545 550 555 560
Arg Thr Val Tyr Asp Gln Thr Thr Ser Thr Thr Asp Arg Asn Gln Leu Arg Thr Val Tyr Asp Gln Thr Thr Ser Thr Thr Asp Arg Asn Gln Leu
565 570 575 565 570 575
Leu Ile Thr Asn Glu Asp Glu Ile Arg Pro Thr Asn Ser Val Gly Ile Leu Ile Thr Asn Glu Asp Glu Ile Arg Pro Thr Asn Ser Val Gly Ile
580 585 590 580 585 590
Asp Thr Trp Gly Val Val Pro Asn Asn Asn Gln Ser Lys Val Thr Ala Asp Thr Trp Gly Val Val Pro Asn Asn Asn Gln Ser Lys Val Thr Ala
595 600 605 595 600 605
Gly Thr Arg Ala Ala Ile Asn Asn Gln Gly Ala Leu Pro Gly Met Val Gly Thr Arg Ala Ala Ile Asn Asn Gln Gly Ala Leu Pro Gly Met Val
610 615 620 610 615 620
Trp Gln Asn Arg Asp Ile Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile Trp Gln Asn Arg Asp Ile Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile
625 630 635 640 625 630 635 640
Pro Asp Thr Asp Asn His Phe His Pro Ser Pro Leu Ile Gly Gly Phe Pro Asp Thr Asp Asn His Phe His Pro Ser Pro Leu Ile Gly Gly Phe
645 650 655 645 650 655
Gly Cys Lys His Pro Pro Pro Gln Ile Phe Ile Lys Asn Thr Pro Val Gly Cys Lys His Pro Pro Pro Gln Ile Phe Ile Lys Asn Thr Pro Val
660 665 670 660 665 670
Pro Ala Asn Pro Ser Glu Thr Phe Gln Thr Ala Lys Val Ala Ser Phe Pro Ala Asn Pro Ser Glu Thr Phe Gln Thr Ala Lys Val Ala Ser Phe
675 680 685 675 680 685
Ile Asn Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Cys Thr Val Glu Ile Phe Trp Glu Ile Asn Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Cys Thr Val Glu Ile Phe Trp Glu
690 695 700 690 695 700
Leu Lys Lys Glu Thr Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Ile Gln Phe Thr Leu Lys Lys Glu Thr Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Ile Gln Phe Thr
705 710 715 720 705 710 715 720
Ser Asn Phe Gly Asn Ala Ala Asp Ile Gln Phe Ala Val Ser Asp Thr Ser Asn Phe Gly Asn Ala Ala Asp Ile Gln Phe Ala Val Ser Asp Thr
725 730 735 725 730 735
Gly Ser Tyr Ser Glu Pro Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg Gly Ser Tyr Ser Glu Pro Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg
740 745 750 740 745 750
Pro Leu About Leu
<210> 9<210> 9
<211> 2265<211> 2265
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Cap VP1 AAV2 VP2 VP3 AAAV K580 линкер-6 SpyTag<223> Cap VP1 AAV2 VP2 VP3 AAAV K580 linker-6 SpyTag
<400> 9<400> 9
atggctgccg atggttatct tccagattgg ctcgaggaca ctctctctga aggaataaga 60atggctgccg atggttatct tccagattgg ctcgaggaca ctctctctga aggaataaga 60
cagtggtgga agctcaaacc tggcccacca ccaccaaagc ccgcagagcg gcataaggac 120cagtggtgga agctcaaacc tggcccacca ccaccaaagc ccgcagagcg gcataaggac 120
gacagcaggg gtcttgtgct tcctgggtac aagtacctcg gacccttcaa cggactcgac 180gacagcaggg gtcttgtgct tcctgggtac aagtacctcg gacccttcaa cggactcgac 180
aagggagagc cggtcaacga ggcagacgcc gcggccctcg agcacgacaa agcctacgac 240aagggagagc cggtcaacga ggcagacgcc gcggccctcg agcacgacaa agcctacgac 240
cggcagctcg acagcggaga caacccgtac ctcaagtaca accacgccga cgcggagttt 300cggcagctcg acagcggaga caacccgtac ctcaagtaca accacgccga cgcggagttt 300
caggagcgcc ttaaagaaga tacgtctttt gggggcaacc tcggacgagc agtcttccag 360caggagcgcc ttaaagaaga tacgtctttt gggggcaacc tcggacgagc agtcttccag 360
gcgaaaaaga gggttcttga acctctgggc ctggttgagg aacctgttaa gacggccggg 420gcgaaaaaga gggttcttga acctctgggc ctggttgagg aacctgttaa gacggccggg 420
accggggaga agcgtcccga acgcgtcgac gactttttcc cgaaaaagaa gaaggccaag 480accggggaga agcgtcccga acgcgtcgac gactttttcc cgaaaaagaa gaaggccaag 480
accgagcaag gcaaagcccc tgctcaaacg ggcgaagacc ccggagaagg aacctcttcc 540accgagcaag gcaaagcccc tgctcaaacg ggcgaagacc ccggagaagg aacctcttcc 540
aacgctggat caagcgcccc ctctagtgtg ggatcatctg tcatggctga aggaggtggc 600aacgctggat caagcgcccc ctctagtgtg ggatcatctg tcatggctga aggaggtggc 600
ggtccaatgg gcgatgcagg ccaaggtgcc gacggagtgg gcaattcctc gggaaattgg 660ggtccaatgg gcgatgcagg ccaaggtgcc gacggagtgg gcaattcctc gggaaattgg 660
cattgcgatt cccaatggct ggacaacgga gtcgttaccc gaaccactcg aacctgggtc 720cattgcgatt cccaatggct ggacaacgga gtcgttaccc gaaccactcg aacctgggtc 720
ctgcccagct acaacaacca cttgtacaag cggatccaag gaccgggagg aaccgacccc 780ctgcccagct acaacaacca cttgtacaag cggatccaag gaccgggagg aaccgacccc 780
aacaataaat tctttggatt cagcaccccc tgggggtact ttgactacaa ccgattccac 840aacaataaat tctttggatt cagcaccccc tgggggtact ttgactacaa ccgattccac 840
tgccacttct ccccccgaga ctggcaacga ctcatcaaca acaactgggg catccgaccc 900tgccacttct ccccccgaga ctggcaacga ctcatcaaca acaactgggg catccgaccc 900
aaagcgatgc gctttagact ctttaacatc caggttaaag aagtcactgt ccaagactcc 960aaagcgatgc gctttagact ctttaacatc caggttaaag aagtcactgt ccaagactcc 960
aacaccacca tcgccaacaa cctcaccagc acggtccaag tctttgcgga caaggactac 1020aacaccacca tcgccaacaa cctcaccagc acggtccaag tctttgcgga caaggactac 1020
cagctgccgt acgtcctcgg atcggctaca gagggcacct tcccgccgtt cccagcggat 1080cagctgccgt acgtcctcgg atcggctaca gagggcacct tcccgccgtt cccagcggat 1080
atctacacga tcccgcagta tggttactgc acgctaaact acaacaacga ggcggtggat 1140atctacacga tcccgcagta tggttactgc acgctaaact acaacaacga ggcggtggat 1140
cgttcggcct tctactgtct agactatttc ccctcagaca tgctgcggac aggaaataac 1200cgttcggcct tctactgtct agactatttc ccctcagaca tgctgcggac aggaaataac 1200
tttgaattca cttacacgtt cgaggacgtt cctttccata gcatgtttgc tcacaaccag 1260tttgaattca cttacacgtt cgaggacgtt cctttccata gcatgtttgc tcacaaccag 1260
acgctagacc ggctgatgaa tcctctcgtc gatcagtacc tgtgggcttt cagttccgtc 1320acgctagacc ggctgatgaa tcctctcgtc gatcagtacc tgtgggcttt cagttccgtc 1320
agccaaacag gctcgtctgg acgggcactc aattattcac gcgcgaccaa aaccaatatg 1380agccaaacag gctcgtctgg acgggcactc aattattcac gcgcgaccaa aaccaatatg 1380
gcaacccagt acagaaactg gttacctgga cccttcgtcc gggatcagca aatctttacg 1440gcaacccagt acagaaactg gttacctgga cccttcgtcc gggatcagca aatctttacg 1440
ggggctagca acatcaccca aaacaacgtg ttcaacgttt gggataaagg caagcagtgg 1500ggggctagca acatcaccca aaacaacgtg ttcaacgttt gggataaagg caagcagtgg 1500
gtgatagaca atcggatcaa tatgatgcag cccggccctg cagcagcgac cacctttagc 1560gtgatagaca atcggatcaa tatgatgcag cccggccctg cagcagcgac cacctttagc 1560
ggagaacccg accgtcaagc catgcaaaac acgctggcct ttagtcggac ggtctacgac 1620ggagaacccg accgtcaagc catgcaaaac acgctggcct ttagtcggac ggtctacgac 1620
cagacaacca gtacgaccga tcgtaaccag ttgctcatta ccaacgaaga tgaaatcaga 1680cagacaacca gtacgaccga tcgtaaccag ttgctcatta ccaacgaaga tgaaatcaga 1680
cccaccaact cggtcggcat cgacacgtgg ggagtagttc ccaacaacaa ccagtccaag 1740cccaccaact cggtcggcat cgacacgtgg ggagtagttc ccaacaacaa ccagtccaag 1740
ggcctgagcg gcagcggcgc ccacatcgtg atggtggacg cctacaagcc gacgaagggc 1800ggcctgagcg gcagcggcgc ccacatcgtg atggtggacg cctacaagcc gacgaagggc 1800
ctgagcggca gcggcgtgac cgccggcact cgcgcggcca tcaacaacca aggggcgctt 1860ctgagcggca gcggcgtgac cgccggcact cgcgcggcca tcaacaacca aggggcgctt 1860
cccgggatgg tgtggcaaaa cagagacatt tacctccaag gacccatttg ggccaaaatc 1920cccgggatgg tgtggcaaaa cagagacatt tacctccaag gacccatttg ggccaaaatc 1920
cccgacacag acaatcactt ccatccgtcc ccgcttattg gcgggtttgg ctgcaagcat 1980cccgacacag acaatcactt ccatccgtcc ccgcttattg gcgggtttgg ctgcaagcat 1980
ccccctcccc agattttcat taaaaacaca cccgtcccgg ccaacccttc ggaaacgttc 2040ccccctcccc agattttcat taaaaacaca cccgtcccgg ccaacccttc ggaaacgttc 2040
cagacggcca aggtggcctc cttcatcaac cagtactcga ccggacagtg caccgtcgaa 2100cagacggcca aggtggcctc cttcatcaac cagtactcga ccggacagtg caccgtcgaa 2100
atcttttggg aactcaagaa ggaaacctcc aagcgctgga accccgaaat ccagttcacc 2160atcttttggg aactcaagaa ggaaacctcc aagcgctgga accccgaaat ccagttcacc 2160
tccaactttg gcaacgcggc cgacatccag tttgctgtct ccgacaccgg atcctattcc 2220tccaactttg gcaacgcggc cgacatccag tttgctgtct ccgacaccgg atcctattcc 2220
gaacctcgtc ccattggcac cagatacctg actcgtcctc tgtaa 2265gaacctcgtc ccattggcac cagatacctg actcgtcctc tgtaa 2265
<210> 10<210> 10
<211> 754<211> 754
<212> БЕЛОК<212> PROTEIN
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Cap VP1 AAV2 VP2 VP3 AAAV K580 линкер-6 SpyTag<223> Cap VP1 AAV2 VP2 VP3 AAAV K580 linker-6 SpyTag
<400> 10<400> 10
Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Thr Leu Ser Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Thr Leu Ser
1 5 10 15 1 5 10 15
Glu Gly Ile Arg Gln Trp Trp Lys Leu Lys Pro Gly Pro Pro Pro Pro Glu Gly Ile Arg Gln Trp Trp Lys Leu Lys Pro Gly Pro Pro Pro Pro
20 25 30 20 25 30
Lys Pro Ala Glu Arg His Lys Asp Asp Ser Arg Gly Leu Val Leu Pro Lys Pro Ala Glu Arg His Lys Asp Asp Ser Arg Gly Leu Val Leu Pro
35 40 45 35 40 45
Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro
50 55 60 50 55 60
Val Asn Glu Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp Val Asn Glu Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp
65 70 75 80 65 70 75 80
Arg Gln Leu Asp Ser Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala Arg Gln Leu Asp Ser Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala
85 90 95 85 90 95
Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Lys Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Lys Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly
100 105 110 100 105 110
Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro
115 120 125 115 120 125
Leu Gly Leu Val Glu Glu Pro Val Lys Thr Ala Gly Thr Gly Glu Lys Leu Gly Leu Val Glu Glu Pro Val Lys Thr Ala Gly Thr Gly Glu Lys
130 135 140 130 135 140
Arg Pro Glu Arg Val Asp Asp Phe Phe Pro Lys Lys Lys Lys Ala Lys Arg Pro Glu Arg Val Asp Asp Phe Phe Pro Lys Lys Lys Lys Ala Lys
145 150 155 160 145 150 155 160
Thr Glu Gln Gly Lys Ala Pro Ala Gln Thr Gly Glu Asp Pro Gly Glu Thr Glu Gln Gly Lys Ala Pro Ala Gln Thr Gly Glu Asp Pro Gly Glu
165 170 175 165 170 175
Gly Thr Ser Ser Asn Ala Gly Ser Ser Ala Pro Ser Ser Val Gly Ser Gly Thr Ser Ser Asn Ala Gly Ser Ser Ala Pro Ser Ser Val Gly Ser
180 185 190 180 185 190
Ser Val Met Ala Glu Gly Gly Gly Gly Pro Met Gly Asp Ala Gly Gln Ser Val Met Ala Glu Gly Gly Gly Gly Pro Met Gly Asp Ala Gly Gln
195 200 205 195 200 205
Gly Ala Asp Gly Val Gly Asn Ser Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Gly Ala Asp Gly Val Gly Asn Ser Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser
210 215 220 210 215 220
Gln Trp Leu Asp Asn Gly Val Val Thr Arg Thr Thr Arg Thr Trp Val Gln Trp Leu Asp Asn Gly Val Val Thr Arg Thr Thr Arg Thr Trp Val
225 230 235 240 225 230 235 240
Leu Pro Ser Tyr Asn Asn His Leu Tyr Lys Arg Ile Gln Gly Pro Gly Leu Pro Ser Tyr Asn Asn His Leu Tyr Lys Arg Ile Gln Gly Pro Gly
245 250 255 245 250 255
Gly Thr Asp Pro Asn Asn Lys Phe Phe Gly Phe Ser Thr Pro Trp Gly Gly Thr Asp Pro Asn Asn Lys Phe Phe Gly Phe Ser Thr Pro Trp Gly
260 265 270 260 265 270
Tyr Phe Asp Tyr Asn Arg Phe His Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Tyr Phe Asp Tyr Asn Arg Phe His Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp
275 280 285 275 280 285
Gln Arg Leu Ile Asn Asn Asn Trp Gly Ile Arg Pro Lys Ala Met Arg Gln Arg Leu Ile Asn Asn Asn Trp Gly Ile Arg Pro Lys Ala Met Arg
290 295 300 290 295 300
Phe Arg Leu Phe Asn Ile Gln Val Lys Glu Val Thr Val Gln Asp Ser Phe Arg Leu Phe Asn Ile Gln Val Lys Glu Val Thr Val Gln Asp Ser
305 310 315 320 305 310 315 320
Asn Thr Thr Ile Ala Asn Asn Leu Thr Ser Thr Val Gln Val Phe Ala Asn Thr Thr Ile Ala Asn Asn Leu Thr Ser Thr Val Gln Val Phe Ala
325 330 335 325 330 335
Asp Lys Asp Tyr Gln Leu Pro Tyr Val Leu Gly Ser Ala Thr Glu Gly Asp Lys Asp Tyr Gln Leu Pro Tyr Val Leu Gly Ser Ala Thr Glu Gly
340 345 350 340 345 350
Thr Phe Pro Pro Phe Pro Ala Asp Ile Tyr Thr Ile Pro Gln Tyr Gly Thr Phe Pro Pro Phe Pro Ala Asp Ile Tyr Thr Ile Pro Gln Tyr Gly
355 360 365 355 360 365
Tyr Cys Thr Leu Asn Tyr Asn Asn Glu Ala Val Asp Arg Ser Ala Phe Tyr Cys Thr Leu Asn Tyr Asn Asn Glu Ala Val Asp Arg Ser Ala Phe
370 375 380 370 375 380
Tyr Cys Leu Asp Tyr Phe Pro Ser Asp Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Tyr Cys Leu Asp Tyr Phe Pro Ser Asp Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn
385 390 395 400 385 390 395 400
Phe Glu Phe Thr Tyr Thr Phe Glu Asp Val Pro Phe His Ser Met Phe Phe Glu Phe Thr Tyr Thr Phe Glu Asp Val Pro Phe His Ser Met Phe
405 410 415 405 410 415
Ala His Asn Gln Thr Leu Asp Arg Leu Met Asn Pro Leu Val Asp Gln Ala His Asn Gln Thr Leu Asp Arg Leu Met Asn Pro Leu Val Asp Gln
420 425 430 420 425 430
Tyr Leu Trp Ala Phe Ser Ser Val Ser Gln Thr Gly Ser Ser Gly Arg Tyr Leu Trp Ala Phe Ser Ser Val Ser Gln Thr Gly Ser Ser Gly Arg
435 440 445 435 440 445
Ala Leu Asn Tyr Ser Arg Ala Thr Lys Thr Asn Met Ala Thr Gln Tyr Ala Leu Asn Tyr Ser Arg Ala Thr Lys Thr Asn Met Ala Thr Gln Tyr
450 455 460 450 455 460
Arg Asn Trp Leu Pro Gly Pro Phe Val Arg Asp Gln Gln Ile Phe Thr Arg Asn Trp Leu Pro Gly Pro Phe Val Arg Asp Gln Gln Ile Phe Thr
465 470 475 480 465 470 475 480
Gly Ala Ser Asn Ile Thr Gln Asn Asn Val Phe Asn Val Trp Asp Lys Gly Ala Ser Asn Ile Thr Gln Asn Asn Val Phe Asn Val Trp Asp Lys
485 490 495 485 490 495
Gly Lys Gln Trp Val Ile Asp Asn Arg Ile Asn Met Met Gln Pro Gly Gly Lys Gln Trp Val Ile Asp Asn Arg Ile Asn Met Met Gln Pro Gly
500 505 510 500 505 510
Pro Ala Ala Ala Thr Thr Phe Ser Gly Glu Pro Asp Arg Gln Ala Met Pro Ala Ala Ala Thr Thr Phe Ser Gly Glu Pro Asp Arg Gln Ala Met
515 520 525 515 520 525
Gln Asn Thr Leu Ala Phe Ser Arg Thr Val Tyr Asp Gln Thr Thr Ser Gln Asn Thr Leu Ala Phe Ser Arg Thr Val Tyr Asp Gln Thr Thr Ser
530 535 540 530 535 540
Thr Thr Asp Arg Asn Gln Leu Leu Ile Thr Asn Glu Asp Glu Ile Arg Thr Thr Asp Arg Asn Gln Leu Leu Ile Thr Asn Glu Asp Glu Ile Arg
545 550 555 560 545 550 555 560
Pro Thr Asn Ser Val Gly Ile Asp Thr Trp Gly Val Val Pro Asn Asn Pro Thr Asn Ser Val Gly Ile Asp Thr Trp Gly Val Val Pro Asn Asn
565 570 575 565 570 575
Asn Gln Ser Lys Gly Leu Ser Gly Ser Gly Ala His Ile Val Met Val Asn Gln Ser Lys Gly Leu Ser Gly Ser Gly Ala His Ile Val Met Val
580 585 590 580 585 590
Asp Ala Tyr Lys Pro Thr Lys Gly Leu Ser Gly Ser Gly Val Thr Ala Asp Ala Tyr Lys Pro Thr Lys Gly Leu Ser Gly Ser Gly Val Thr Ala
595 600 605 595 600 605
Gly Thr Arg Ala Ala Ile Asn Asn Gln Gly Ala Leu Pro Gly Met Val Gly Thr Arg Ala Ala Ile Asn Asn Gln Gly Ala Leu Pro Gly Met Val
610 615 620 610 615 620
Trp Gln Asn Arg Asp Ile Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile Trp Gln Asn Arg Asp Ile Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile
625 630 635 640 625 630 635 640
Pro Asp Thr Asp Asn His Phe His Pro Ser Pro Leu Ile Gly Gly Phe Pro Asp Thr Asp Asn His Phe His Pro Ser Pro Leu Ile Gly Gly Phe
645 650 655 645 650 655
Gly Cys Lys His Pro Pro Pro Gln Ile Phe Ile Lys Asn Thr Pro Val Gly Cys Lys His Pro Pro Pro Gln Ile Phe Ile Lys Asn Thr Pro Val
660 665 670 660 665 670
Pro Ala Asn Pro Ser Glu Thr Phe Gln Thr Ala Lys Val Ala Ser Phe Pro Ala Asn Pro Ser Glu Thr Phe Gln Thr Ala Lys Val Ala Ser Phe
675 680 685 675 680 685
Ile Asn Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Cys Thr Val Glu Ile Phe Trp Glu Ile Asn Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Cys Thr Val Glu Ile Phe Trp Glu
690 695 700 690 695 700
Leu Lys Lys Glu Thr Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Ile Gln Phe Thr Leu Lys Lys Glu Thr Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Ile Gln Phe Thr
705 710 715 720 705 710 715 720
Ser Asn Phe Gly Asn Ala Ala Asp Ile Gln Phe Ala Val Ser Asp Thr Ser Asn Phe Gly Asn Ala Ala Asp Ile Gln Phe Ala Val Ser Asp Thr
725 730 735 725 730 735
Gly Ser Tyr Ser Glu Pro Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg Gly Ser Tyr Ser Glu Pro Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg
740 745 750 740 745 750
Pro Leu About Leu
<210> 11<210> 11
<211> 2220<211> 2220
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Cap VP1 AAV2 VP2 VP3 вируса морского льва G432 линкер-6 SpyTag<223> Cap VP1 AAV2 VP2 VP3 sea lion virus G432 linker-6 SpyTag
<400> 11<400> 11
atggctgccg atggttatct tccagattgg ctcgaggaca ctctctctga aggaataaga 60atggctgccg atggttatct tccagattgg ctcgaggaca ctctctctga aggaataaga 60
cagtggtgga agctcaaacc tggcccacca ccaccaaagc ccgcagagcg gcataaggac 120cagtggtgga agctcaaacc tggcccacca ccaccaaagc ccgcagagcg gcataaggac 120
gacagcaggg gtcttgtgct tcctgggtac aagtacctcg gacccttcaa cggactcgac 180gacagcaggg gtcttgtgct tcctgggtac aagtacctcg gacccttcaa cggactcgac 180
aagggagagc cggtcaacga ggcagacgcc gcggccctcg agcacgacaa agcctacgac 240aagggagagc cggtcaacga ggcagacgcc gcggccctcg agcacgacaa agcctacgac 240
cggcagctcg acagcggaga caacccgtac ctcaagtaca accacgccga cgcggagttt 300cggcagctcg acagcggaga caacccgtac ctcaagtaca accacgccga cgcggagttt 300
caggagcgcc ttaaagaaga tacgtctttt gggggcaacc tcggacgagc agtcttccag 360caggagcgcc ttaaagaaga tacgtctttt gggggcaacc tcggacgagc agtcttccag 360
gcgaaaaaga gggttcttga acctctgggc ctggttgagg aaccctctca gccagattcg 420gcgaaaaaga gggttcttga acctctgggc ctggttgagg aaccctctca gccagattcg 420
tcctcggaca acacggcgcc acccgtgaaa aagtcccgtc tcgaagaagc ccagcccatt 480tcctcggaca acacggcgcc acccgtgaaa aagtcccgtc tcgaagaagc ccagcccatt 480
caaagtccag acgtttccag cagcactggc ggaggaattg ccgacgtcat gtctggagat 540caaagtccag acgtttccag cagcactggc ggaggaattg ccgacgtcat gtctggagat 540
gctgaaatgg ctgcagtggg cgggggagca ccgggcgtcg acggccaggg tgccgaggga 600gctgaaatgg ctgcagtggg cgggggagca ccgggcgtcg acggccaggg tgccgaggga 600
gtgggtactt cctcgggtaa ttggcattgc gattcccagt ggtcagaagg acacgtcaga 660gtgggtactt cctcgggtaa ttggcattgc gattcccagt ggtcagaagg acacgtcaga 660
accaccagca ccagaacctg ggtgttgccc agctacaaca accacctgta taaacggctt 720accaccagca ccagaacctg ggtgttgccc agctacaaca accacctgta taaacggctt 720
ggaagtagcg cacaatccaa tacctacaac ggattctcca ccccctgggg atacctcgac 780ggaagtagcg cacaatccaa tacctacaac ggattctcca ccccctgggg atacctcgac 780
ttcaatagat ggcactgtca cttcagtcct cggaactggc aacgtctcat caacaacaac 840ttcaatagat ggcactgtca cttcagtcct cggaactggc aacgtctcat caacaacaac 840
tggggcatca gaccaaaaag acttaatgtt aaattgttca acatacaagt caaagaggtc 900tggggcatca gaccaaaaag acttaatgtt aaattgttca acatacaagt caaagaggtc 900
acgacggaag gggggacgac gaccgtcgcc aataacctta ccagcacgat tcaggtgttt 960acgacggaag gggggacgac gaccgtcgcc aataacctta ccagcacgat tcaggtgttt 960
gcggacaacg cgtacgaact cccgtatgtt gtcgacgcgg gtcacgaggg ggcattgccg 1020gcggacaacg cgtacgaact cccgtatgtt gtcgacgcgg gtcacgaggg ggcattgccg 1020
ccgttcccaa acgacgtgtt tatgattccc caatacggat actgcgggct ggtgtctggt 1080ccgttcccaa acgacgtgtt tatgattccc caatacggat actgcgggct ggtgtctggt 1080
caaagtcagg ctcagtcgga cttgtgttcg ttttattgcc tggagtattt tccatcccag 1140caaagtcagg ctcagtcgga cttgtgttcg ttttattgcc tggagtattt tccatcccag 1140
atgctgagaa caggaaacaa ttttgaaatg aatttcaggt ttgaagacgt tccatttcac 1200atgctgagaa caggaaacaa ttttgaaatg aatttcaggt ttgaagacgt tccatttcac 1200
tccatgtacg cccacagcca gtctctagac aggctcatga atcctttaat tgatcagtat 1260tccatgtacg cccacagcca gtctctagac aggctcatga atcctttaat tgatcagtat 1260
ctgtggagtc taaaacaaac aggaaacccg actggaggcc tgagcggcag cggcgcccac 1320ctgtggagtc taaaacaaac aggaaacccg actggaggcc tgagcggcag cggcgcccac 1320
atcgtgatgg tggacgccta caagccgacg aagggcctga gcggcagcgg ctcaacaacg 1380atcgtgatgg tggacgccta caagccgacg aagggcctga gcggcagcgg ctcaacaacg 1380
agagacttaa aatttatcaa gaacaaagtt cccaattttg cacattatgg aaaaaattgg 1440agagacttaa aatttatcaa gaacaaagtt cccaattttg cacattatgg aaaaaattgg 1440
cttcctggac cttttattag acaacagggg tggacaacac aaaatattaa taatagtgtt 1500cttcctggac cttttattag acaacagggg tggacaacac aaaatattaa taatagtgtt 1500
gttaatttta atgacatgct gggaaaaaat tcgacattta ctttggacac tagatggagt 1560gttaatttta atgacatgct gggaaaaaat tcgacattta ctttggacac tagatggagt 1560
tcattagcgc ctggtccgtg tatgggggat gacggacgaa ctccatccac caccaagttc 1620tcattagcgc ctggtccgtg tatgggggat gacggacgaa ctccatccac caccaagttc 1620
tcaaatgctc agctcatgtt tggatctgga acacaaccca ccgaaggcgg tgaagatgct 1680tcaaatgctc agctcatgtt tggatctgga acacaaccca ccgaaggcgg tgaagatgct 1680
gtacatatta catccgagtc ggaggtcaag gcaaccaacc caactgcaat cgatgaatac 1740gtacatatta catccgagtc ggaggtcaag gcaaccaacc caactgcaat cgatgaatac 1740
ggacgagtgg ccgataatac gcaaaatgca acaaccgccc caaccacagt gggaaatgct 1800ggacgagtgg ccgataatac gcaaaatgca acaaccgccc caaccacagt gggaaatgct 1800
gcaatggggg ccatgcctgg gatggtgtgg caagataggg atatctatct tcaaggaccc 1860gcaatggggg ccatgcctgg gatggtgtgg caagataggg atatctatct tcaaggaccc 1860
atctggggaa aaatacccca tacagacgga cattttcatc cgtctcctct catggggggg 1920atctggggaa aaatacccca tacagacgga cattttcatc cgtctcctct catggggggg 1920
tttggataca gaaaaccccc tccgcaaatt tttattaaaa acacccccgt tcctggaaat 1980tttggataca gaaaaccccc tccgcaaatt tttattaaaa acacccccgt tcctggaaat 1980
ccggcaacta cattttctcc aaatagaata aacaatttca ttactcaata ctcaacggga 2040ccggcaacta cattttctcc aaatagaata aacaatttca ttactcaata ctcaacggga 2040
caagtgaccg ttactattga ctgggagctg caaaaggaaa actcaaagag atggaaccca 2100caagtgaccg ttactattga ctgggagctg caaaaggaaa actcaaagag atggaaccca 2100
gaagtacaat ttacatcaaa ttttggcacg gtcgattcac taaactgggc accggacaac 2160gaagtacaat ttacatcaaa ttttggcacg gtcgattcac taaactgggc acggacaac 2160
gcgggaaact acaaagaacc aagggtgatt ggcaccagat acctgactcg tatactataa 2220gcgggaaact acaaagaacc aagggtgatt ggcaccagat acctgactcg tatactataa 2220
<210> 12<210> 12
<211> 739<211> 739
<212> БЕЛОК<212> PROTEIN
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Cap VP1 AAV2 VP2 VP3 вируса морского льва G432 линкер-6 SpyTag<223> Cap VP1 AAV2 VP2 VP3 sea lion virus G432 linker-6 SpyTag
<400> 12<400> 12
Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Thr Leu Ser Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Thr Leu Ser
1 5 10 15 1 5 10 15
Glu Gly Ile Arg Gln Trp Trp Lys Leu Lys Pro Gly Pro Pro Pro Pro Glu Gly Ile Arg Gln Trp Trp Lys Leu Lys Pro Gly Pro Pro Pro Pro
20 25 30 20 25 30
Lys Pro Ala Glu Arg His Lys Asp Asp Ser Arg Gly Leu Val Leu Pro Lys Pro Ala Glu Arg His Lys Asp Asp Ser Arg Gly Leu Val Leu Pro
35 40 45 35 40 45
Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro
50 55 60 50 55 60
Val Asn Glu Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp Val Asn Glu Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp
65 70 75 80 65 70 75 80
Arg Gln Leu Asp Ser Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala Arg Gln Leu Asp Ser Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala
85 90 95 85 90 95
Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Lys Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Lys Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly
100 105 110 100 105 110
Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro
115 120 125 115 120 125
Leu Gly Leu Val Glu Glu Pro Ser Gln Pro Asp Ser Ser Ser Asp Asn Leu Gly Leu Val Glu Glu Pro Ser Gln Pro Asp Ser Ser Ser Asp Asn
130 135 140 130 135 140
Thr Ala Pro Pro Val Lys Lys Ser Arg Leu Glu Glu Ala Gln Pro Ile Thr Ala Pro Pro Val Lys Lys Ser Arg Leu Glu Glu Ala Gln Pro Ile
145 150 155 160 145 150 155 160
Gln Ser Pro Asp Val Ser Ser Ser Thr Gly Gly Gly Ile Ala Asp Val Gln Ser Pro Asp Val Ser Ser Ser Thr Gly Gly Gly Ile Ala Asp Val
165 170 175 165 170 175
Met Ser Gly Asp Ala Glu Met Ala Ala Val Gly Gly Gly Ala Pro Gly Met Ser Gly Asp Ala Glu Met Ala Ala Val Gly Gly Gly Ala Pro Gly
180 185 190 180 185 190
Val Asp Gly Gln Gly Ala Glu Gly Val Gly Thr Ser Ser Gly Asn Trp Val Asp Gly Gln Gly Ala Glu Gly Val Gly Thr Ser Ser Gly Asn Trp
195 200 205 195 200 205
His Cys Asp Ser Gln Trp Ser Glu Gly His Val Arg Thr Thr Ser Thr His Cys Asp Ser Gln Trp Ser Glu Gly His Val Arg Thr Thr Ser Thr
210 215 220 210 215 220
Arg Thr Trp Val Leu Pro Ser Tyr Asn Asn His Leu Tyr Lys Arg Leu Arg Thr Trp Val Leu Pro Ser Tyr Asn Asn His Leu Tyr Lys Arg Leu
225 230 235 240 225 230 235 240
Gly Ser Ser Ala Gln Ser Asn Thr Tyr Asn Gly Phe Ser Thr Pro Trp Gly Ser Ser Ala Gln Ser Asn Thr Tyr Asn Gly Phe Ser Thr Pro Trp
245 250 255 245 250 255
Gly Tyr Leu Asp Phe Asn Arg Trp His Cys His Phe Ser Pro Arg Asn Gly Tyr Leu Asp Phe Asn Arg Trp His Cys His Phe Ser Pro Arg Asn
260 265 270 260 265 270
Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn Asn Trp Gly Ile Arg Pro Lys Arg Leu Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn Asn Trp Gly Ile Arg Pro Lys Arg Leu
275 280 285 275 280 285
Asn Val Lys Leu Phe Asn Ile Gln Val Lys Glu Val Thr Thr Glu Gly Asn Val Lys Leu Phe Asn Ile Gln Val Lys Glu Val Thr Thr Glu Gly
290 295 300 290 295 300
Gly Thr Thr Thr Val Ala Asn Asn Leu Thr Ser Thr Ile Gln Val Phe Gly Thr Thr Thr Val Ala Asn Asn Leu Thr Ser Thr Ile Gln Val Phe
305 310 315 320 305 310 315 320
Ala Asp Asn Ala Tyr Glu Leu Pro Tyr Val Val Asp Ala Gly His Glu Ala Asp Asn Ala Tyr Glu Leu Pro Tyr Val Val Asp Ala Gly His Glu
325 330 335 325 330 335
Gly Ala Leu Pro Pro Phe Pro Asn Asp Val Phe Met Ile Pro Gln Tyr Gly Ala Leu Pro Pro Phe Pro Asn Asp Val Phe Met Ile Pro Gln Tyr
340 345 350 340 345 350
Gly Tyr Cys Gly Leu Val Ser Gly Gln Ser Gln Ala Gln Ser Asp Leu Gly Tyr Cys Gly Leu Val Ser Gly Gln Ser Gln Ala Gln Ser Asp Leu
355 360 365 355 360 365
Cys Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe Pro Ser Gln Met Leu Arg Thr Cys Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe Pro Ser Gln Met Leu Arg Thr
370 375 380 370 375 380
Gly Asn Asn Phe Glu Met Asn Phe Arg Phe Glu Asp Val Pro Phe His Gly Asn Asn Phe Glu Met Asn Phe Arg Phe Glu Asp Val Pro Phe His
385 390 395 400 385 390 395 400
Ser Met Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu Asp Arg Leu Met Asn Pro Leu Ser Met Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu Asp Arg Leu Met Asn Pro Leu
405 410 415 405 410 415
Ile Asp Gln Tyr Leu Trp Ser Leu Lys Gln Thr Gly Asn Pro Thr Gly Ile Asp Gln Tyr Leu Trp Ser Leu Lys Gln Thr Gly Asn Pro Thr Gly
420 425 430 420 425 430
Gly Leu Ser Gly Ser Gly Ala His Ile Val Met Val Asp Ala Tyr Lys Gly Leu Ser Gly Ser Gly Ala His Ile Val Met Val Asp Ala Tyr Lys
435 440 445 435 440 445
Pro Thr Lys Gly Leu Ser Gly Ser Gly Ser Thr Thr Arg Asp Leu Lys Pro Thr Lys Gly Leu Ser Gly Ser Gly Ser Thr Thr Arg Asp Leu Lys
450 455 460 450 455 460
Phe Ile Lys Asn Lys Val Pro Asn Phe Ala His Tyr Gly Lys Asn Trp Phe Ile Lys Asn Lys Val Pro Asn Phe Ala His Tyr Gly Lys Asn Trp
465 470 475 480 465 470 475 480
Leu Pro Gly Pro Phe Ile Arg Gln Gln Gly Trp Thr Thr Gln Asn Ile Leu Pro Gly Pro Phe Ile Arg Gln Gln Gly Trp Thr Thr Gln Asn Ile
485 490 495 485 490 495
Asn Asn Ser Val Val Asn Phe Asn Asp Met Leu Gly Lys Asn Ser Thr Asn Asn Ser Val Val Asn Phe Asn Asp Met Leu Gly Lys Asn Ser Thr
500 505 510 500 505 510
Phe Thr Leu Asp Thr Arg Trp Ser Ser Leu Ala Pro Gly Pro Cys Met Phe Thr Leu Asp Thr Arg Trp Ser Ser Leu Ala Pro Gly Pro Cys Met
515 520 525 515 520 525
Gly Asp Asp Gly Arg Thr Pro Ser Thr Thr Lys Phe Ser Asn Ala Gln Gly Asp Asp Gly Arg Thr Pro Ser Thr Thr Lys Phe Ser Asn Ala Gln
530 535 540 530 535 540
Leu Met Phe Gly Ser Gly Thr Gln Pro Thr Glu Gly Gly Glu Asp Ala Leu Met Phe Gly Ser Gly Thr Gln Pro Thr Glu Gly Gly Glu Asp Ala
545 550 555 560 545 550 555 560
Val His Ile Thr Ser Glu Ser Glu Val Lys Ala Thr Asn Pro Thr Ala Val His Ile Thr Ser Glu Ser Glu Val Lys Ala Thr Asn Pro Thr Ala
565 570 575 565 570 575
Ile Asp Glu Tyr Gly Arg Val Ala Asp Asn Thr Gln Asn Ala Thr Thr Ile Asp Glu Tyr Gly Arg Val Ala Asp Asn Thr Gln Asn Ala Thr Thr
580 585 590 580 585 590
Ala Pro Thr Thr Val Gly Asn Ala Ala Met Gly Ala Met Pro Gly Met Ala Pro Thr Thr Val Gly Asn Ala Ala Met Gly Ala Met Pro Gly Met
595 600 605 595 600 605
Val Trp Gln Asp Arg Asp Ile Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Gly Lys Val Trp Gln Asp Arg Asp Ile Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Gly Lys
610 615 620 610 615 620
Ile Pro His Thr Asp Gly His Phe His Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Ile Pro His Thr Asp Gly His Phe His Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly
625 630 635 640 625 630 635 640
Phe Gly Tyr Arg Lys Pro Pro Pro Gln Ile Phe Ile Lys Asn Thr Pro Phe Gly Tyr Arg Lys Pro Pro Pro Gln Ile Phe Ile Lys Asn Thr Pro
645 650 655 645 650 655
Val Pro Gly Asn Pro Ala Thr Thr Phe Ser Pro Asn Arg Ile Asn Asn Val Pro Gly Asn Pro Ala Thr Thr Phe Ser Pro Asn Arg Ile Asn Asn
660 665 670 660 665 670
Phe Ile Thr Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val Thr Val Thr Ile Asp Trp Phe Ile Thr Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val Thr Val Thr Ile Asp Trp
675 680 685 675 680 685
Glu Leu Gln Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Val Gln Phe Glu Leu Gln Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Val Gln Phe
690 695 700 690 695 700
Thr Ser Asn Phe Gly Thr Val Asp Ser Leu Asn Trp Ala Pro Asp Asn Thr Ser Asn Phe Gly Thr Val Asp Ser Leu Asn Trp Ala Pro Asp Asn
705 710 715 720 705 710 715 720
Ala Gly Asn Tyr Lys Glu Pro Arg Val Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Ala Gly Asn Tyr Lys Glu Pro Arg Val Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr
725 730 735 725 730 735
Arg Ile Leu Arg Ile Leu
<210> 13<210> 13
<211> 2220<211> 2220
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Cap VP1 AAV2 VP2 VP3 вируса морского льва A565 линкер-6 SpyTag<223> Cap VP1 AAV2 VP2 VP3 sea lion virus A565 linker-6 SpyTag
<400> 13<400> 13
atggctgccg atggttatct tccagattgg ctcgaggaca ctctctctga aggaataaga 60atggctgccg atggttatct tccagattgg ctcgaggaca ctctctctga aggaataaga 60
cagtggtgga agctcaaacc tggcccacca ccaccaaagc ccgcagagcg gcataaggac 120cagtggtgga agctcaaacc tggcccacca ccaccaaagc ccgcagagcg gcataaggac 120
gacagcaggg gtcttgtgct tcctgggtac aagtacctcg gacccttcaa cggactcgac 180gacagcaggg gtcttgtgct tcctgggtac aagtacctcg gacccttcaa cggactcgac 180
aagggagagc cggtcaacga ggcagacgcc gcggccctcg agcacgacaa agcctacgac 240aagggagagc cggtcaacga ggcagacgcc gcggccctcg agcacgacaa agcctacgac 240
cggcagctcg acagcggaga caacccgtac ctcaagtaca accacgccga cgcggagttt 300cggcagctcg acagcggaga caacccgtac ctcaagtaca accacgccga cgcggagttt 300
caggagcgcc ttaaagaaga tacgtctttt gggggcaacc tcggacgagc agtcttccag 360caggagcgcc ttaaagaaga tacgtctttt gggggcaacc tcggacgagc agtcttccag 360
gcgaaaaaga gggttcttga acctctgggc ctggttgagg aaccctctca gccagattcg 420gcgaaaaaga gggttcttga acctctgggc ctggttgagg aaccctctca gccagattcg 420
tcctcggaca acacggcgcc acccgtgaaa aagtcccgtc tcgaagaagc ccagcccatt 480tcctcggaca acacggcgcc acccgtgaaa aagtcccgtc tcgaagaagc ccagcccatt 480
caaagtccag acgtttccag cagcactggc ggaggaattg ccgacgtcat gtctggagat 540caaagtccag acgtttccag cagcactggc ggaggaattg ccgacgtcat gtctggagat 540
gctgaaatgg ctgcagtggg cgggggagca ccgggcgtcg acggccaggg tgccgaggga 600gctgaaatgg ctgcagtggg cgggggagca ccgggcgtcg acggccaggg tgccgaggga 600
gtgggtactt cctcgggtaa ttggcattgc gattcccagt ggtcagaagg acacgtcaga 660gtgggtactt cctcgggtaa ttggcattgc gattcccagt ggtcagaagg acacgtcaga 660
accaccagca ccagaacctg ggtgttgccc agctacaaca accacctgta taaacggctt 720accaccagca ccagaacctg ggtgttgccc agctacaaca accacctgta taaacggctt 720
ggaagtagcg cacaatccaa tacctacaac ggattctcca ccccctgggg atacctcgac 780ggaagtagcg cacaatccaa tacctacaac ggattctcca ccccctgggg atacctcgac 780
ttcaatagat ggcactgtca cttcagtcct cggaactggc aacgtctcat caacaacaac 840ttcaatagat ggcactgtca cttcagtcct cggaactggc aacgtctcat caacaacaac 840
tggggcatca gaccaaaaag acttaatgtt aaattgttca acatacaagt caaagaggtc 900tggggcatca gaccaaaaag acttaatgtt aaattgttca acatacaagt caaagaggtc 900
acgacggaag gggggacgac gaccgtcgcc aataacctta ccagcacgat tcaggtgttt 960acgacggaag gggggacgac gaccgtcgcc aataacctta ccagcacgat tcaggtgttt 960
gcggacaacg cgtacgaact cccgtatgtt gtcgacgcgg gtcacgaggg ggcattgccg 1020gcggacaacg cgtacgaact cccgtatgtt gtcgacgcgg gtcacgaggg ggcattgccg 1020
ccgttcccaa acgacgtgtt tatgattccc caatacggat actgcgggct ggtgtctggt 1080ccgttcccaa acgacgtgtt tatgattccc caatacggat actgcgggct ggtgtctggt 1080
caaagtcagg ctcagtcgga cttgtgttcg ttttattgcc tggagtattt tccatcccag 1140caaagtcagg ctcagtcgga cttgtgttcg ttttattgcc tggagtattt tccatcccag 1140
atgctgagaa caggaaacaa ttttgaaatg aatttcaggt ttgaagacgt tccatttcac 1200atgctgagaa caggaaacaa ttttgaaatg aatttcaggt ttgaagacgt tccatttcac 1200
tccatgtacg cccacagcca gtctctagac aggctcatga atcctttaat tgatcagtat 1260tccatgtacg cccacagcca gtctctagac aggctcatga atcctttaat tgatcagtat 1260
ctgtggagtc taaaacaaac aggaaacccg actggatcaa caacgagaga cttaaaattt 1320ctgtggagtc taaaacaaac aggaaacccg actggatcaa caacgagaga cttaaaattt 1320
atcaagaaca aagttcccaa ttttgcacat tatggaaaaa attggcttcc tggacctttt 1380atcaagaaca aagttcccaa ttttgcacat tatggaaaaa attggcttcc tggacctttt 1380
attagacaac aggggtggac aacacaaaat attaataata gtgttgttaa ttttaatgac 1440attagacaac aggggtggac aacacaaaat attaataata gtgttgttaa ttttaatgac 1440
atgctgggaa aaaattcgac atttactttg gacactagat ggagttcatt agcgcctggt 1500atgctgggaa aaaattcgac atttactttg gacactagat ggagttcatt agcgcctggt 1500
ccgtgtatgg gggatgacgg acgaactcca tccaccacca agttctcaaa tgctcagctc 1560ccgtgtatgg gggatgacgg acgaactcca tccaccacca agttctcaaa tgctcagctc 1560
atgtttggat ctggaacaca acccaccgaa ggcggtgaag atgctgtaca tattacatcc 1620atgtttggat ctggaacaca acccaccgaa ggcggtgaag atgctgtaca tattacatcc 1620
gagtcggagg tcaaggcaac caacccaact gcaatcgatg aatacggacg agtggccgat 1680gagtcggagg tcaaggcaac caacccaact gcaatcgatg aatacggacg agtggccgat 1680
aatacgcaaa atgcaggcct gagcggcagc ggcgcccaca tcgtgatggt ggacgcctac 1740aatacgcaaa atgcaggcct gagcggcagc ggcgcccaca tcgtgatggt ggacgcctac 1740
aagccgacga agggcctgag cggcagcggc acaaccgccc caaccacagt gggaaatgct 1800aagccgacga agggcctgag cggcagcggc acaaccgccc caaccacagt gggaaatgct 1800
gcaatggggg ccatgcctgg gatggtgtgg caagataggg atatctatct tcaaggaccc 1860gcaatggggg ccatgcctgg gatggtgtgg caagataggg atatctatct tcaaggaccc 1860
atctggggaa aaatacccca tacagacgga cattttcatc cgtctcctct catggggggg 1920atctggggaa aaatacccca tacagacgga cattttcatc cgtctcctct catggggggg 1920
tttggataca gaaaaccccc tccgcaaatt tttattaaaa acacccccgt tcctggaaat 1980tttggataca gaaaaccccc tccgcaaatt tttattaaaa acacccccgt tcctggaaat 1980
ccggcaacta cattttctcc aaatagaata aacaatttca ttactcaata ctcaacggga 2040ccggcaacta cattttctcc aaatagaata aacaatttca ttactcaata ctcaacggga 2040
caagtgaccg ttactattga ctgggagctg caaaaggaaa actcaaagag atggaaccca 2100caagtgaccg ttactattga ctgggagctg caaaaggaaa actcaaagag atggaaccca 2100
gaagtacaat ttacatcaaa ttttggcacg gtcgattcac taaactgggc accggacaac 2160gaagtacaat ttacatcaaa ttttggcacg gtcgattcac taaactgggc acggacaac 2160
gcgggaaact acaaagaacc aagggtgatt ggcaccagat acctgactcg tatactataa 2220gcgggaaact acaaagaacc aagggtgatt ggcaccagat acctgactcg tatactataa 2220
<210> 14<210> 14
<211> 739<211> 739
<212> БЕЛОК<212> PROTEIN
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Cap VP1 AAV2 VP2 VP3 вируса морского льва A565 линкер-6 SpyTag<223> Cap VP1 AAV2 VP2 VP3 sea lion virus A565 linker-6 SpyTag
<400> 14<400> 14
Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Thr Leu Ser Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Thr Leu Ser
1 5 10 15 1 5 10 15
Glu Gly Ile Arg Gln Trp Trp Lys Leu Lys Pro Gly Pro Pro Pro Pro Glu Gly Ile Arg Gln Trp Trp Lys Leu Lys Pro Gly Pro Pro Pro Pro
20 25 30 20 25 30
Lys Pro Ala Glu Arg His Lys Asp Asp Ser Arg Gly Leu Val Leu Pro Lys Pro Ala Glu Arg His Lys Asp Asp Ser Arg Gly Leu Val Leu Pro
35 40 45 35 40 45
Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro
50 55 60 50 55 60
Val Asn Glu Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp Val Asn Glu Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp
65 70 75 80 65 70 75 80
Arg Gln Leu Asp Ser Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala Arg Gln Leu Asp Ser Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala
85 90 95 85 90 95
Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Lys Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Lys Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly
100 105 110 100 105 110
Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro
115 120 125 115 120 125
Leu Gly Leu Val Glu Glu Pro Ser Gln Pro Asp Ser Ser Ser Asp Asn Leu Gly Leu Val Glu Glu Pro Ser Gln Pro Asp Ser Ser Ser Asp Asn
130 135 140 130 135 140
Thr Ala Pro Pro Val Lys Lys Ser Arg Leu Glu Glu Ala Gln Pro Ile Thr Ala Pro Pro Val Lys Lys Ser Arg Leu Glu Glu Ala Gln Pro Ile
145 150 155 160 145 150 155 160
Gln Ser Pro Asp Val Ser Ser Ser Thr Gly Gly Gly Ile Ala Asp Val Gln Ser Pro Asp Val Ser Ser Ser Thr Gly Gly Gly Ile Ala Asp Val
165 170 175 165 170 175
Met Ser Gly Asp Ala Glu Met Ala Ala Val Gly Gly Gly Ala Pro Gly Met Ser Gly Asp Ala Glu Met Ala Ala Val Gly Gly Gly Ala Pro Gly
180 185 190 180 185 190
Val Asp Gly Gln Gly Ala Glu Gly Val Gly Thr Ser Ser Gly Asn Trp Val Asp Gly Gln Gly Ala Glu Gly Val Gly Thr Ser Ser Gly Asn Trp
195 200 205 195 200 205
His Cys Asp Ser Gln Trp Ser Glu Gly His Val Arg Thr Thr Ser Thr His Cys Asp Ser Gln Trp Ser Glu Gly His Val Arg Thr Thr Ser Thr
210 215 220 210 215 220
Arg Thr Trp Val Leu Pro Ser Tyr Asn Asn His Leu Tyr Lys Arg Leu Arg Thr Trp Val Leu Pro Ser Tyr Asn Asn His Leu Tyr Lys Arg Leu
225 230 235 240 225 230 235 240
Gly Ser Ser Ala Gln Ser Asn Thr Tyr Asn Gly Phe Ser Thr Pro Trp Gly Ser Ser Ala Gln Ser Asn Thr Tyr Asn Gly Phe Ser Thr Pro Trp
245 250 255 245 250 255
Gly Tyr Leu Asp Phe Asn Arg Trp His Cys His Phe Ser Pro Arg Asn Gly Tyr Leu Asp Phe Asn Arg Trp His Cys His Phe Ser Pro Arg Asn
260 265 270 260 265 270
Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn Asn Trp Gly Ile Arg Pro Lys Arg Leu Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn Asn Trp Gly Ile Arg Pro Lys Arg Leu
275 280 285 275 280 285
Asn Val Lys Leu Phe Asn Ile Gln Val Lys Glu Val Thr Thr Glu Gly Asn Val Lys Leu Phe Asn Ile Gln Val Lys Glu Val Thr Thr Glu Gly
290 295 300 290 295 300
Gly Thr Thr Thr Val Ala Asn Asn Leu Thr Ser Thr Ile Gln Val Phe Gly Thr Thr Thr Val Ala Asn Asn Leu Thr Ser Thr Ile Gln Val Phe
305 310 315 320 305 310 315 320
Ala Asp Asn Ala Tyr Glu Leu Pro Tyr Val Val Asp Ala Gly His Glu Ala Asp Asn Ala Tyr Glu Leu Pro Tyr Val Val Asp Ala Gly His Glu
325 330 335 325 330 335
Gly Ala Leu Pro Pro Phe Pro Asn Asp Val Phe Met Ile Pro Gln Tyr Gly Ala Leu Pro Pro Phe Pro Asn Asp Val Phe Met Ile Pro Gln Tyr
340 345 350 340 345 350
Gly Tyr Cys Gly Leu Val Ser Gly Gln Ser Gln Ala Gln Ser Asp Leu Gly Tyr Cys Gly Leu Val Ser Gly Gln Ser Gln Ala Gln Ser Asp Leu
355 360 365 355 360 365
Cys Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe Pro Ser Gln Met Leu Arg Thr Cys Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe Pro Ser Gln Met Leu Arg Thr
370 375 380 370 375 380
Gly Asn Asn Phe Glu Met Asn Phe Arg Phe Glu Asp Val Pro Phe His Gly Asn Asn Phe Glu Met Asn Phe Arg Phe Glu Asp Val Pro Phe His
385 390 395 400 385 390 395 400
Ser Met Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu Asp Arg Leu Met Asn Pro Leu Ser Met Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu Asp Arg Leu Met Asn Pro Leu
405 410 415 405 410 415
Ile Asp Gln Tyr Leu Trp Ser Leu Lys Gln Thr Gly Asn Pro Thr Gly Ile Asp Gln Tyr Leu Trp Ser Leu Lys Gln Thr Gly Asn Pro Thr Gly
420 425 430 420 425 430
Ser Thr Thr Arg Asp Leu Lys Phe Ile Lys Asn Lys Val Pro Asn Phe Ser Thr Thr Arg Asp Leu Lys Phe Ile Lys Asn Lys Val Pro Asn Phe
435 440 445 435 440 445
Ala His Tyr Gly Lys Asn Trp Leu Pro Gly Pro Phe Ile Arg Gln Gln Ala His Tyr Gly Lys Asn Trp Leu Pro Gly Pro Phe Ile Arg Gln Gln
450 455 460 450 455 460
Gly Trp Thr Thr Gln Asn Ile Asn Asn Ser Val Val Asn Phe Asn Asp Gly Trp Thr Thr Gln Asn Ile Asn Asn Ser Val Val Asn Phe Asn Asp
465 470 475 480 465 470 475 480
Met Leu Gly Lys Asn Ser Thr Phe Thr Leu Asp Thr Arg Trp Ser Ser Met Leu Gly Lys Asn Ser Thr Phe Thr Leu Asp Thr Arg Trp Ser Ser
485 490 495 485 490 495
Leu Ala Pro Gly Pro Cys Met Gly Asp Asp Gly Arg Thr Pro Ser Thr Leu Ala Pro Gly Pro Cys Met Gly Asp Asp Gly Arg Thr Pro Ser Thr
500 505 510 500 505 510
Thr Lys Phe Ser Asn Ala Gln Leu Met Phe Gly Ser Gly Thr Gln Pro Thr Lys Phe Ser Asn Ala Gln Leu Met Phe Gly Ser Gly Thr Gln Pro
515 520 525 515 520 525
Thr Glu Gly Gly Glu Asp Ala Val His Ile Thr Ser Glu Ser Glu Val Thr Glu Gly Gly Glu Asp Ala Val His Ile Thr Ser Glu Ser Glu Val
530 535 540 530 535 540
Lys Ala Thr Asn Pro Thr Ala Ile Asp Glu Tyr Gly Arg Val Ala Asp Lys Ala Thr Asn Pro Thr Ala Ile Asp Glu Tyr Gly Arg Val Ala Asp
545 550 555 560 545 550 555 560
Asn Thr Gln Asn Ala Gly Leu Ser Gly Ser Gly Ala His Ile Val Met Asn Thr Gln Asn Ala Gly Leu Ser Gly Ser Gly Ala His Ile Val Met
565 570 575 565 570 575
Val Asp Ala Tyr Lys Pro Thr Lys Gly Leu Ser Gly Ser Gly Thr Thr Val Asp Ala Tyr Lys Pro Thr Lys Gly Leu Ser Gly Ser Gly Thr Thr
580 585 590 580 585 590
Ala Pro Thr Thr Val Gly Asn Ala Ala Met Gly Ala Met Pro Gly Met Ala Pro Thr Thr Val Gly Asn Ala Ala Met Gly Ala Met Pro Gly Met
595 600 605 595 600 605
Val Trp Gln Asp Arg Asp Ile Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Gly Lys Val Trp Gln Asp Arg Asp Ile Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Gly Lys
610 615 620 610 615 620
Ile Pro His Thr Asp Gly His Phe His Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Ile Pro His Thr Asp Gly His Phe His Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly
625 630 635 640 625 630 635 640
Phe Gly Tyr Arg Lys Pro Pro Pro Gln Ile Phe Ile Lys Asn Thr Pro Phe Gly Tyr Arg Lys Pro Pro Pro Gln Ile Phe Ile Lys Asn Thr Pro
645 650 655 645 650 655
Val Pro Gly Asn Pro Ala Thr Thr Phe Ser Pro Asn Arg Ile Asn Asn Val Pro Gly Asn Pro Ala Thr Thr Phe Ser Pro Asn Arg Ile Asn Asn
660 665 670 660 665 670
Phe Ile Thr Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val Thr Val Thr Ile Asp Trp Phe Ile Thr Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val Thr Val Thr Ile Asp Trp
675 680 685 675 680 685
Glu Leu Gln Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Val Gln Phe Glu Leu Gln Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Val Gln Phe
690 695 700 690 695 700
Thr Ser Asn Phe Gly Thr Val Asp Ser Leu Asn Trp Ala Pro Asp Asn Thr Ser Asn Phe Gly Thr Val Asp Ser Leu Asn Trp Ala Pro Asp Asn
705 710 715 720 705 710 715 720
Ala Gly Asn Tyr Lys Glu Pro Arg Val Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Ala Gly Asn Tyr Lys Glu Pro Arg Val Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr
725 730 735 725 730 735
Arg Ile Leu Arg Ile Leu
<210> 15<210> 15
<211> 2220<211> 2220
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Cap VP1 AAV2 VP2 VP3 вируса морского льва N429 линкер-6 SpyTag<223> Cap VP1 AAV2 VP2 VP3 sea lion virus N429 linker-6 SpyTag
<400> 15<400> 15
atggctgccg atggttatct tccagattgg ctcgaggaca ctctctctga aggaataaga 60atggctgccg atggttatct tccagattgg ctcgaggaca ctctctctga aggaataaga 60
cagtggtgga agctcaaacc tggcccacca ccaccaaagc ccgcagagcg gcataaggac 120cagtggtgga agctcaaacc tggcccacca ccaccaaagc ccgcagagcg gcataaggac 120
gacagcaggg gtcttgtgct tcctgggtac aagtacctcg gacccttcaa cggactcgac 180gacagcaggg gtcttgtgct tcctgggtac aagtacctcg gacccttcaa cggactcgac 180
aagggagagc cggtcaacga ggcagacgcc gcggccctcg agcacgacaa agcctacgac 240aagggagagc cggtcaacga ggcagacgcc gcggccctcg agcacgacaa agcctacgac 240
cggcagctcg acagcggaga caacccgtac ctcaagtaca accacgccga cgcggagttt 300cggcagctcg acagcggaga caacccgtac ctcaagtaca accacgccga cgcggagttt 300
caggagcgcc ttaaagaaga tacgtctttt gggggcaacc tcggacgagc agtcttccag 360caggagcgcc ttaaagaaga tacgtctttt gggggcaacc tcggacgagc agtcttccag 360
gcgaaaaaga gggttcttga acctctgggc ctggttgagg aaccctctca gccagattcg 420gcgaaaaaga gggttcttga acctctgggc ctggttgagg aaccctctca gccagattcg 420
tcctcggaca acacggcgcc acccgtgaaa aagtcccgtc tcgaagaagc ccagcccatt 480tcctcggaca acacggcgcc acccgtgaaa aagtcccgtc tcgaagaagc ccagcccatt 480
caaagtccag acgtttccag cagcactggc ggaggaattg ccgacgtcat gtctggagat 540caaagtccag acgtttccag cagcactggc ggaggaattg ccgacgtcat gtctggagat 540
gctgaaatgg ctgcagtggg cgggggagca ccgggcgtcg acggccaggg tgccgaggga 600gctgaaatgg ctgcagtggg cgggggagca ccgggcgtcg acggccaggg tgccgaggga 600
gtgggtactt cctcgggtaa ttggcattgc gattcccagt ggtcagaagg acacgtcaga 660gtgggtactt cctcgggtaa ttggcattgc gattcccagt ggtcagaagg acacgtcaga 660
accaccagca ccagaacctg ggtgttgccc agctacaaca accacctgta taaacggctt 720accaccagca ccagaacctg ggtgttgccc agctacaaca accacctgta taaacggctt 720
ggaagtagcg cacaatccaa tacctacaac ggattctcca ccccctgggg atacctcgac 780ggaagtagcg cacaatccaa tacctacaac ggattctcca ccccctgggg atacctcgac 780
ttcaatagat ggcactgtca cttcagtcct cggaactggc aacgtctcat caacaacaac 840ttcaatagat ggcactgtca cttcagtcct cggaactggc aacgtctcat caacaacaac 840
tggggcatca gaccaaaaag acttaatgtt aaattgttca acatacaagt caaagaggtc 900tggggcatca gaccaaaaag acttaatgtt aaattgttca acatacaagt caaagaggtc 900
acgacggaag gggggacgac gaccgtcgcc aataacctta ccagcacgat tcaggtgttt 960acgacggaag gggggacgac gaccgtcgcc aataacctta ccagcacgat tcaggtgttt 960
gcggacaacg cgtacgaact cccgtatgtt gtcgacgcgg gtcacgaggg ggcattgccg 1020gcggacaacg cgtacgaact cccgtatgtt gtcgacgcgg gtcacgaggg ggcattgccg 1020
ccgttcccaa acgacgtgtt tatgattccc caatacggat actgcgggct ggtgtctggt 1080ccgttcccaa acgacgtgtt tatgattccc caatacggat actgcgggct ggtgtctggt 1080
caaagtcagg ctcagtcgga cttgtgttcg ttttattgcc tggagtattt tccatcccag 1140caaagtcagg ctcagtcgga cttgtgttcg ttttattgcc tggagtattt tccatcccag 1140
atgctgagaa caggaaacaa ttttgaaatg aatttcaggt ttgaagacgt tccatttcac 1200atgctgagaa caggaaacaa ttttgaaatg aatttcaggt ttgaagacgt tccatttcac 1200
tccatgtacg cccacagcca gtctctagac aggctcatga atcctttaat tgatcagtat 1260tccatgtacg cccacagcca gtctctagac aggctcatga atcctttaat tgatcagtat 1260
ctgtggagtc taaaacaaac aggaaacggc ctgagcggca gcggcgccca catcgtgatg 1320ctgtggagtc taaaacaaac aggaaacggc ctgagcggca gcggcgccca catcgtgatg 1320
gtggacgcct acaagccgac gaagggcctg agcggcagcg gcccgactgg atcaacaacg 1380gtggacgcct acaagccgac gaagggcctg agcggcagcg gcccgactgg atcaacaacg 1380
agagacttaa aatttatcaa gaacaaagtt cccaattttg cacattatgg aaaaaattgg 1440agagacttaa aatttatcaa gaacaaagtt cccaattttg cacattatgg aaaaaattgg 1440
cttcctggac cttttattag acaacagggg tggacaacac aaaatattaa taatagtgtt 1500cttcctggac cttttattag acaacagggg tggacaacac aaaatattaa taatagtgtt 1500
gttaatttta atgacatgct gggaaaaaat tcgacattta ctttggacac tagatggagt 1560gttaatttta atgacatgct gggaaaaaat tcgacattta ctttggacac tagatggagt 1560
tcattagcgc ctggtccgtg tatgggggat gacggacgaa ctccatccac caccaagttc 1620tcattagcgc ctggtccgtg tatgggggat gacggacgaa ctccatccac caccaagttc 1620
tcaaatgctc agctcatgtt tggatctgga acacaaccca ccgaaggcgg tgaagatgct 1680tcaaatgctc agctcatgtt tggatctgga acacaaccca ccgaaggcgg tgaagatgct 1680
gtacatatta catccgagtc ggaggtcaag gcaaccaacc caactgcaat cgatgaatac 1740gtacatatta catccgagtc ggaggtcaag gcaaccaacc caactgcaat cgatgaatac 1740
ggacgagtgg ccgataatac gcaaaatgca acaaccgccc caaccacagt gggaaatgct 1800ggacgagtgg ccgataatac gcaaaatgca acaaccgccc caaccacagt gggaaatgct 1800
gcaatggggg ccatgcctgg gatggtgtgg caagataggg atatctatct tcaaggaccc 1860gcaatggggg ccatgcctgg gatggtgtgg caagataggg atatctatct tcaaggaccc 1860
atctggggaa aaatacccca tacagacgga cattttcatc cgtctcctct catggggggg 1920atctggggaa aaatacccca tacagacgga cattttcatc cgtctcctct catggggggg 1920
tttggataca gaaaaccccc tccgcaaatt tttattaaaa acacccccgt tcctggaaat 1980tttggataca gaaaaccccc tccgcaaatt tttattaaaa acacccccgt tcctggaaat 1980
ccggcaacta cattttctcc aaatagaata aacaatttca ttactcaata ctcaacggga 2040ccggcaacta cattttctcc aaatagaata aacaatttca ttactcaata ctcaacggga 2040
caagtgaccg ttactattga ctgggagctg caaaaggaaa actcaaagag atggaaccca 2100caagtgaccg ttactattga ctgggagctg caaaaggaaa actcaaagag atggaaccca 2100
gaagtacaat ttacatcaaa ttttggcacg gtcgattcac taaactgggc accggacaac 2160gaagtacaat ttacatcaaa ttttggcacg gtcgattcac taaactgggc acggacaac 2160
gcgggaaact acaaagaacc aagggtgatt ggcaccagat acctgactcg tatactataa 2220gcgggaaact acaaagaacc aagggtgatt ggcaccagat acctgactcg tatactataa 2220
<210> 16<210> 16
<211> 739<211> 739
<212> БЕЛОК<212> PROTEIN
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Cap VP1 AAV2 VP2 VP3 вируса морского льва N429 линкер-6 SpyTag<223> Cap VP1 AAV2 VP2 VP3 sea lion virus N429 linker-6 SpyTag
<400> 16<400> 16
Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Thr Leu Ser Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Thr Leu Ser
1 5 10 15 1 5 10 15
Glu Gly Ile Arg Gln Trp Trp Lys Leu Lys Pro Gly Pro Pro Pro Pro Glu Gly Ile Arg Gln Trp Trp Lys Leu Lys Pro Gly Pro Pro Pro Pro
20 25 30 20 25 30
Lys Pro Ala Glu Arg His Lys Asp Asp Ser Arg Gly Leu Val Leu Pro Lys Pro Ala Glu Arg His Lys Asp Asp Ser Arg Gly Leu Val Leu Pro
35 40 45 35 40 45
Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro
50 55 60 50 55 60
Val Asn Glu Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp Val Asn Glu Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp
65 70 75 80 65 70 75 80
Arg Gln Leu Asp Ser Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala Arg Gln Leu Asp Ser Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala
85 90 95 85 90 95
Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Lys Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Lys Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly
100 105 110 100 105 110
Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro
115 120 125 115 120 125
Leu Gly Leu Val Glu Glu Pro Ser Gln Pro Asp Ser Ser Ser Asp Asn Leu Gly Leu Val Glu Glu Pro Ser Gln Pro Asp Ser Ser Ser Asp Asn
130 135 140 130 135 140
Thr Ala Pro Pro Val Lys Lys Ser Arg Leu Glu Glu Ala Gln Pro Ile Thr Ala Pro Pro Val Lys Lys Ser Arg Leu Glu Glu Ala Gln Pro Ile
145 150 155 160 145 150 155 160
Gln Ser Pro Asp Val Ser Ser Ser Thr Gly Gly Gly Ile Ala Asp Val Gln Ser Pro Asp Val Ser Ser Ser Thr Gly Gly Gly Ile Ala Asp Val
165 170 175 165 170 175
Met Ser Gly Asp Ala Glu Met Ala Ala Val Gly Gly Gly Ala Pro Gly Met Ser Gly Asp Ala Glu Met Ala Ala Val Gly Gly Gly Ala Pro Gly
180 185 190 180 185 190
Val Asp Gly Gln Gly Ala Glu Gly Val Gly Thr Ser Ser Gly Asn Trp Val Asp Gly Gln Gly Ala Glu Gly Val Gly Thr Ser Ser Gly Asn Trp
195 200 205 195 200 205
His Cys Asp Ser Gln Trp Ser Glu Gly His Val Arg Thr Thr Ser Thr His Cys Asp Ser Gln Trp Ser Glu Gly His Val Arg Thr Thr Ser Thr
210 215 220 210 215 220
Arg Thr Trp Val Leu Pro Ser Tyr Asn Asn His Leu Tyr Lys Arg Leu Arg Thr Trp Val Leu Pro Ser Tyr Asn Asn His Leu Tyr Lys Arg Leu
225 230 235 240 225 230 235 240
Gly Ser Ser Ala Gln Ser Asn Thr Tyr Asn Gly Phe Ser Thr Pro Trp Gly Ser Ser Ala Gln Ser Asn Thr Tyr Asn Gly Phe Ser Thr Pro Trp
245 250 255 245 250 255
Gly Tyr Leu Asp Phe Asn Arg Trp His Cys His Phe Ser Pro Arg Asn Gly Tyr Leu Asp Phe Asn Arg Trp His Cys His Phe Ser Pro Arg Asn
260 265 270 260 265 270
Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn Asn Trp Gly Ile Arg Pro Lys Arg Leu Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn Asn Trp Gly Ile Arg Pro Lys Arg Leu
275 280 285 275 280 285
Asn Val Lys Leu Phe Asn Ile Gln Val Lys Glu Val Thr Thr Glu Gly Asn Val Lys Leu Phe Asn Ile Gln Val Lys Glu Val Thr Thr Glu Gly
290 295 300 290 295 300
Gly Thr Thr Thr Val Ala Asn Asn Leu Thr Ser Thr Ile Gln Val Phe Gly Thr Thr Thr Val Ala Asn Asn Leu Thr Ser Thr Ile Gln Val Phe
305 310 315 320 305 310 315 320
Ala Asp Asn Ala Tyr Glu Leu Pro Tyr Val Val Asp Ala Gly His Glu Ala Asp Asn Ala Tyr Glu Leu Pro Tyr Val Val Asp Ala Gly His Glu
325 330 335 325 330 335
Gly Ala Leu Pro Pro Phe Pro Asn Asp Val Phe Met Ile Pro Gln Tyr Gly Ala Leu Pro Pro Phe Pro Asn Asp Val Phe Met Ile Pro Gln Tyr
340 345 350 340 345 350
Gly Tyr Cys Gly Leu Val Ser Gly Gln Ser Gln Ala Gln Ser Asp Leu Gly Tyr Cys Gly Leu Val Ser Gly Gln Ser Gln Ala Gln Ser Asp Leu
355 360 365 355 360 365
Cys Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe Pro Ser Gln Met Leu Arg Thr Cys Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe Pro Ser Gln Met Leu Arg Thr
370 375 380 370 375 380
Gly Asn Asn Phe Glu Met Asn Phe Arg Phe Glu Asp Val Pro Phe His Gly Asn Asn Phe Glu Met Asn Phe Arg Phe Glu Asp Val Pro Phe His
385 390 395 400 385 390 395 400
Ser Met Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu Asp Arg Leu Met Asn Pro Leu Ser Met Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu Asp Arg Leu Met Asn Pro Leu
405 410 415 405 410 415
Ile Asp Gln Tyr Leu Trp Ser Leu Lys Gln Thr Gly Asn Gly Leu Ser Ile Asp Gln Tyr Leu Trp Ser Leu Lys Gln Thr Gly Asn Gly Leu Ser
420 425 430 420 425 430
Gly Ser Gly Ala His Ile Val Met Val Asp Ala Tyr Lys Pro Thr Lys Gly Ser Gly Ala His Ile Val Met Val Asp Ala Tyr Lys Pro Thr Lys
435 440 445 435 440 445
Gly Leu Ser Gly Ser Gly Pro Thr Gly Ser Thr Thr Arg Asp Leu Lys Gly Leu Ser Gly Ser Gly Pro Thr Gly Ser Thr Thr Arg Asp Leu Lys
450 455 460 450 455 460
Phe Ile Lys Asn Lys Val Pro Asn Phe Ala His Tyr Gly Lys Asn Trp Phe Ile Lys Asn Lys Val Pro Asn Phe Ala His Tyr Gly Lys Asn Trp
465 470 475 480 465 470 475 480
Leu Pro Gly Pro Phe Ile Arg Gln Gln Gly Trp Thr Thr Gln Asn Ile Leu Pro Gly Pro Phe Ile Arg Gln Gln Gly Trp Thr Thr Gln Asn Ile
485 490 495 485 490 495
Asn Asn Ser Val Val Asn Phe Asn Asp Met Leu Gly Lys Asn Ser Thr Asn Asn Ser Val Val Asn Phe Asn Asp Met Leu Gly Lys Asn Ser Thr
500 505 510 500 505 510
Phe Thr Leu Asp Thr Arg Trp Ser Ser Leu Ala Pro Gly Pro Cys Met Phe Thr Leu Asp Thr Arg Trp Ser Ser Leu Ala Pro Gly Pro Cys Met
515 520 525 515 520 525
Gly Asp Asp Gly Arg Thr Pro Ser Thr Thr Lys Phe Ser Asn Ala Gln Gly Asp Asp Gly Arg Thr Pro Ser Thr Thr Lys Phe Ser Asn Ala Gln
530 535 540 530 535 540
Leu Met Phe Gly Ser Gly Thr Gln Pro Thr Glu Gly Gly Glu Asp Ala Leu Met Phe Gly Ser Gly Thr Gln Pro Thr Glu Gly Gly Glu Asp Ala
545 550 555 560 545 550 555 560
Val His Ile Thr Ser Glu Ser Glu Val Lys Ala Thr Asn Pro Thr Ala Val His Ile Thr Ser Glu Ser Glu Val Lys Ala Thr Asn Pro Thr Ala
565 570 575 565 570 575
Ile Asp Glu Tyr Gly Arg Val Ala Asp Asn Thr Gln Asn Ala Thr Thr Ile Asp Glu Tyr Gly Arg Val Ala Asp Asn Thr Gln Asn Ala Thr Thr
580 585 590 580 585 590
Ala Pro Thr Thr Val Gly Asn Ala Ala Met Gly Ala Met Pro Gly Met Ala Pro Thr Thr Val Gly Asn Ala Ala Met Gly Ala Met Pro Gly Met
595 600 605 595 600 605
Val Trp Gln Asp Arg Asp Ile Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Gly Lys Val Trp Gln Asp Arg Asp Ile Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Gly Lys
610 615 620 610 615 620
Ile Pro His Thr Asp Gly His Phe His Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Ile Pro His Thr Asp Gly His Phe His Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly
625 630 635 640 625 630 635 640
Phe Gly Tyr Arg Lys Pro Pro Pro Gln Ile Phe Ile Lys Asn Thr Pro Phe Gly Tyr Arg Lys Pro Pro Pro Gln Ile Phe Ile Lys Asn Thr Pro
645 650 655 645 650 655
Val Pro Gly Asn Pro Ala Thr Thr Phe Ser Pro Asn Arg Ile Asn Asn Val Pro Gly Asn Pro Ala Thr Thr Phe Ser Pro Asn Arg Ile Asn Asn
660 665 670 660 665 670
Phe Ile Thr Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val Thr Val Thr Ile Asp Trp Phe Ile Thr Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val Thr Val Thr Ile Asp Trp
675 680 685 675 680 685
Glu Leu Gln Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Val Gln Phe Glu Leu Gln Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Val Gln Phe
690 695 700 690 695 700
Thr Ser Asn Phe Gly Thr Val Asp Ser Leu Asn Trp Ala Pro Asp Asn Thr Ser Asn Phe Gly Thr Val Asp Ser Leu Asn Trp Ala Pro Asp Asn
705 710 715 720 705 710 715 720
Ala Gly Asn Tyr Lys Glu Pro Arg Val Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Ala Gly Asn Tyr Lys Glu Pro Arg Val Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr
725 730 735 725 730 735
Arg Ile Leu Arg Ile Leu
<210> 17<210> 17
<211> 2220<211> 2220
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Cap VP1 AAV2 VP2 VP3 вируса морского льва P430 линкер-6 SpyTag<223> Cap VP1 AAV2 VP2 VP3 Sea Lion Virus P430 Linker-6 SpyTag
<400> 17<400> 17
atggctgccg atggttatct tccagattgg ctcgaggaca ctctctctga aggaataaga 60atggctgccg atggttatct tccagattgg ctcgaggaca ctctctctga aggaataaga 60
cagtggtgga agctcaaacc tggcccacca ccaccaaagc ccgcagagcg gcataaggac 120cagtggtgga agctcaaacc tggcccacca ccaccaaagc ccgcagagcg gcataaggac 120
gacagcaggg gtcttgtgct tcctgggtac aagtacctcg gacccttcaa cggactcgac 180gacagcaggg gtcttgtgct tcctgggtac aagtacctcg gacccttcaa cggactcgac 180
aagggagagc cggtcaacga ggcagacgcc gcggccctcg agcacgacaa agcctacgac 240aagggagagc cggtcaacga ggcagacgcc gcggccctcg agcacgacaa agcctacgac 240
cggcagctcg acagcggaga caacccgtac ctcaagtaca accacgccga cgcggagttt 300cggcagctcg acagcggaga caacccgtac ctcaagtaca accacgccga cgcggagttt 300
caggagcgcc ttaaagaaga tacgtctttt gggggcaacc tcggacgagc agtcttccag 360caggagcgcc ttaaagaaga tacgtctttt gggggcaacc tcggacgagc agtcttccag 360
gcgaaaaaga gggttcttga acctctgggc ctggttgagg aaccctctca gccagattcg 420gcgaaaaaga gggttcttga acctctgggc ctggttgagg aaccctctca gccagattcg 420
tcctcggaca acacggcgcc acccgtgaaa aagtcccgtc tcgaagaagc ccagcccatt 480tcctcggaca acacggcgcc acccgtgaaa aagtcccgtc tcgaagaagc ccagcccatt 480
caaagtccag acgtttccag cagcactggc ggaggaattg ccgacgtcat gtctggagat 540caaagtccag acgtttccag cagcactggc ggaggaattg ccgacgtcat gtctggagat 540
gctgaaatgg ctgcagtggg cgggggagca ccgggcgtcg acggccaggg tgccgaggga 600gctgaaatgg ctgcagtggg cgggggagca ccgggcgtcg acggccaggg tgccgaggga 600
gtgggtactt cctcgggtaa ttggcattgc gattcccagt ggtcagaagg acacgtcaga 660gtgggtactt cctcgggtaa ttggcattgc gattcccagt ggtcagaagg acacgtcaga 660
accaccagca ccagaacctg ggtgttgccc agctacaaca accacctgta taaacggctt 720accaccagca ccagaacctg ggtgttgccc agctacaaca accacctgta taaacggctt 720
ggaagtagcg cacaatccaa tacctacaac ggattctcca ccccctgggg atacctcgac 780ggaagtagcg cacaatccaa tacctacaac ggattctcca ccccctgggg atacctcgac 780
ttcaatagat ggcactgtca cttcagtcct cggaactggc aacgtctcat caacaacaac 840ttcaatagat ggcactgtca cttcagtcct cggaactggc aacgtctcat caacaacaac 840
tggggcatca gaccaaaaag acttaatgtt aaattgttca acatacaagt caaagaggtc 900tggggcatca gaccaaaaag acttaatgtt aaattgttca acatacaagt caaagaggtc 900
acgacggaag gggggacgac gaccgtcgcc aataacctta ccagcacgat tcaggtgttt 960acgacggaag gggggacgac gaccgtcgcc aataacctta ccagcacgat tcaggtgttt 960
gcggacaacg cgtacgaact cccgtatgtt gtcgacgcgg gtcacgaggg ggcattgccg 1020gcggacaacg cgtacgaact cccgtatgtt gtcgacgcgg gtcacgaggg ggcattgccg 1020
ccgttcccaa acgacgtgtt tatgattccc caatacggat actgcgggct ggtgtctggt 1080ccgttcccaa acgacgtgtt tatgattccc caatacggat actgcgggct ggtgtctggt 1080
caaagtcagg ctcagtcgga cttgtgttcg ttttattgcc tggagtattt tccatcccag 1140caaagtcagg ctcagtcgga cttgtgttcg ttttattgcc tggagtattt tccatcccag 1140
atgctgagaa caggaaacaa ttttgaaatg aatttcaggt ttgaagacgt tccatttcac 1200atgctgagaa caggaaacaa ttttgaaatg aatttcaggt ttgaagacgt tccatttcac 1200
tccatgtacg cccacagcca gtctctagac aggctcatga atcctttaat tgatcagtat 1260tccatgtacg cccacagcca gtctctagac aggctcatga atcctttaat tgatcagtat 1260
ctgtggagtc taaaacaaac aggaaacccg ggcctgagcg gcagcggcgc ccacatcgtg 1320ctgtggagtc taaaacaaac aggaaacccg ggcctgagcg gcagcggcgc ccacatcgtg 1320
atggtggacg cctacaagcc gacgaagggc ctgagcggca gcggcactgg atcaacaacg 1380atggtggacg cctacaagcc gacgaagggc ctgagcggca gcggcactgg atcaacaacg 1380
agagacttaa aatttatcaa gaacaaagtt cccaattttg cacattatgg aaaaaattgg 1440agagacttaa aatttatcaa gaacaaagtt cccaattttg cacattatgg aaaaaattgg 1440
cttcctggac cttttattag acaacagggg tggacaacac aaaatattaa taatagtgtt 1500cttcctggac cttttattag acaacagggg tggacaacac aaaatattaa taatagtgtt 1500
gttaatttta atgacatgct gggaaaaaat tcgacattta ctttggacac tagatggagt 1560gttaatttta atgacatgct gggaaaaaat tcgacattta ctttggacac tagatggagt 1560
tcattagcgc ctggtccgtg tatgggggat gacggacgaa ctccatccac caccaagttc 1620tcattagcgc ctggtccgtg tatgggggat gacggacgaa ctccatccac caccaagttc 1620
tcaaatgctc agctcatgtt tggatctgga acacaaccca ccgaaggcgg tgaagatgct 1680tcaaatgctc agctcatgtt tggatctgga acacaaccca ccgaaggcgg tgaagatgct 1680
gtacatatta catccgagtc ggaggtcaag gcaaccaacc caactgcaat cgatgaatac 1740gtacatatta catccgagtc ggaggtcaag gcaaccaacc caactgcaat cgatgaatac 1740
ggacgagtgg ccgataatac gcaaaatgca acaaccgccc caaccacagt gggaaatgct 1800ggacgagtgg ccgataatac gcaaaatgca acaaccgccc caaccacagt gggaaatgct 1800
gcaatggggg ccatgcctgg gatggtgtgg caagataggg atatctatct tcaaggaccc 1860gcaatggggg ccatgcctgg gatggtgtgg caagataggg atatctatct tcaaggaccc 1860
atctggggaa aaatacccca tacagacgga cattttcatc cgtctcctct catggggggg 1920atctggggaa aaatacccca tacagacgga cattttcatc cgtctcctct catggggggg 1920
tttggataca gaaaaccccc tccgcaaatt tttattaaaa acacccccgt tcctggaaat 1980tttggataca gaaaaccccc tccgcaaatt tttattaaaa acacccccgt tcctggaaat 1980
ccggcaacta cattttctcc aaatagaata aacaatttca ttactcaata ctcaacggga 2040ccggcaacta cattttctcc aaatagaata aacaatttca ttactcaata ctcaacggga 2040
caagtgaccg ttactattga ctgggagctg caaaaggaaa actcaaagag atggaaccca 2100caagtgaccg ttactattga ctgggagctg caaaaggaaa actcaaagag atggaaccca 2100
gaagtacaat ttacatcaaa ttttggcacg gtcgattcac taaactgggc accggacaac 2160gaagtacaat ttacatcaaa ttttggcacg gtcgattcac taaactgggc acggacaac 2160
gcgggaaact acaaagaacc aagggtgatt ggcaccagat acctgactcg tatactataa 2220gcgggaaact acaaagaacc aagggtgatt ggcaccagat acctgactcg tatactataa 2220
<210> 18<210> 18
<211> 739<211> 739
<212> БЕЛОК<212> PROTEIN
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Cap VP1 AAV2 VP2 VP3 вируса морского льва P430 линкер-6 SpyTag<223> Cap VP1 AAV2 VP2 VP3 Sea Lion Virus P430 Linker-6 SpyTag
<400> 18<400> 18
Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Thr Leu Ser Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Thr Leu Ser
1 5 10 15 1 5 10 15
Glu Gly Ile Arg Gln Trp Trp Lys Leu Lys Pro Gly Pro Pro Pro Pro Glu Gly Ile Arg Gln Trp Trp Lys Leu Lys Pro Gly Pro Pro Pro Pro
20 25 30 20 25 30
Lys Pro Ala Glu Arg His Lys Asp Asp Ser Arg Gly Leu Val Leu Pro Lys Pro Ala Glu Arg His Lys Asp Asp Ser Arg Gly Leu Val Leu Pro
35 40 45 35 40 45
Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro
50 55 60 50 55 60
Val Asn Glu Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp Val Asn Glu Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp
65 70 75 80 65 70 75 80
Arg Gln Leu Asp Ser Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala Arg Gln Leu Asp Ser Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala
85 90 95 85 90 95
Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Lys Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Lys Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly
100 105 110 100 105 110
Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro
115 120 125 115 120 125
Leu Gly Leu Val Glu Glu Pro Ser Gln Pro Asp Ser Ser Ser Asp Asn Leu Gly Leu Val Glu Glu Pro Ser Gln Pro Asp Ser Ser Ser Asp Asn
130 135 140 130 135 140
Thr Ala Pro Pro Val Lys Lys Ser Arg Leu Glu Glu Ala Gln Pro Ile Thr Ala Pro Pro Val Lys Lys Ser Arg Leu Glu Glu Ala Gln Pro Ile
145 150 155 160 145 150 155 160
Gln Ser Pro Asp Val Ser Ser Ser Thr Gly Gly Gly Ile Ala Asp Val Gln Ser Pro Asp Val Ser Ser Ser Thr Gly Gly Gly Ile Ala Asp Val
165 170 175 165 170 175
Met Ser Gly Asp Ala Glu Met Ala Ala Val Gly Gly Gly Ala Pro Gly Met Ser Gly Asp Ala Glu Met Ala Ala Val Gly Gly Gly Ala Pro Gly
180 185 190 180 185 190
Val Asp Gly Gln Gly Ala Glu Gly Val Gly Thr Ser Ser Gly Asn Trp Val Asp Gly Gln Gly Ala Glu Gly Val Gly Thr Ser Ser Gly Asn Trp
195 200 205 195 200 205
His Cys Asp Ser Gln Trp Ser Glu Gly His Val Arg Thr Thr Ser Thr His Cys Asp Ser Gln Trp Ser Glu Gly His Val Arg Thr Thr Ser Thr
210 215 220 210 215 220
Arg Thr Trp Val Leu Pro Ser Tyr Asn Asn His Leu Tyr Lys Arg Leu Arg Thr Trp Val Leu Pro Ser Tyr Asn Asn His Leu Tyr Lys Arg Leu
225 230 235 240 225 230 235 240
Gly Ser Ser Ala Gln Ser Asn Thr Tyr Asn Gly Phe Ser Thr Pro Trp Gly Ser Ser Ala Gln Ser Asn Thr Tyr Asn Gly Phe Ser Thr Pro Trp
245 250 255 245 250 255
Gly Tyr Leu Asp Phe Asn Arg Trp His Cys His Phe Ser Pro Arg Asn Gly Tyr Leu Asp Phe Asn Arg Trp His Cys His Phe Ser Pro Arg Asn
260 265 270 260 265 270
Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn Asn Trp Gly Ile Arg Pro Lys Arg Leu Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn Asn Trp Gly Ile Arg Pro Lys Arg Leu
275 280 285 275 280 285
Asn Val Lys Leu Phe Asn Ile Gln Val Lys Glu Val Thr Thr Glu Gly Asn Val Lys Leu Phe Asn Ile Gln Val Lys Glu Val Thr Thr Glu Gly
290 295 300 290 295 300
Gly Thr Thr Thr Val Ala Asn Asn Leu Thr Ser Thr Ile Gln Val Phe Gly Thr Thr Thr Val Ala Asn Asn Leu Thr Ser Thr Ile Gln Val Phe
305 310 315 320 305 310 315 320
Ala Asp Asn Ala Tyr Glu Leu Pro Tyr Val Val Asp Ala Gly His Glu Ala Asp Asn Ala Tyr Glu Leu Pro Tyr Val Val Asp Ala Gly His Glu
325 330 335 325 330 335
Gly Ala Leu Pro Pro Phe Pro Asn Asp Val Phe Met Ile Pro Gln Tyr Gly Ala Leu Pro Pro Phe Pro Asn Asp Val Phe Met Ile Pro Gln Tyr
340 345 350 340 345 350
Gly Tyr Cys Gly Leu Val Ser Gly Gln Ser Gln Ala Gln Ser Asp Leu Gly Tyr Cys Gly Leu Val Ser Gly Gln Ser Gln Ala Gln Ser Asp Leu
355 360 365 355 360 365
Cys Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe Pro Ser Gln Met Leu Arg Thr Cys Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe Pro Ser Gln Met Leu Arg Thr
370 375 380 370 375 380
Gly Asn Asn Phe Glu Met Asn Phe Arg Phe Glu Asp Val Pro Phe His Gly Asn Asn Phe Glu Met Asn Phe Arg Phe Glu Asp Val Pro Phe His
385 390 395 400 385 390 395 400
Ser Met Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu Asp Arg Leu Met Asn Pro Leu Ser Met Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu Asp Arg Leu Met Asn Pro Leu
405 410 415 405 410 415
Ile Asp Gln Tyr Leu Trp Ser Leu Lys Gln Thr Gly Asn Pro Gly Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Trp Ser Leu Lys Gln Thr Gly Asn Pro Gly Leu
420 425 430 420 425 430
Ser Gly Ser Gly Ala His Ile Val Met Val Asp Ala Tyr Lys Pro Thr Ser Gly Ser Gly Ala His Ile Val Met Val Asp Ala Tyr Lys Pro Thr
435 440 445 435 440 445
Lys Gly Leu Ser Gly Ser Gly Thr Gly Ser Thr Thr Arg Asp Leu Lys Lys Gly Leu Ser Gly Ser Gly Thr Gly Ser Thr Thr Arg Asp Leu Lys
450 455 460 450 455 460
Phe Ile Lys Asn Lys Val Pro Asn Phe Ala His Tyr Gly Lys Asn Trp Phe Ile Lys Asn Lys Val Pro Asn Phe Ala His Tyr Gly Lys Asn Trp
465 470 475 480 465 470 475 480
Leu Pro Gly Pro Phe Ile Arg Gln Gln Gly Trp Thr Thr Gln Asn Ile Leu Pro Gly Pro Phe Ile Arg Gln Gln Gly Trp Thr Thr Gln Asn Ile
485 490 495 485 490 495
Asn Asn Ser Val Val Asn Phe Asn Asp Met Leu Gly Lys Asn Ser Thr Asn Asn Ser Val Val Asn Phe Asn Asp Met Leu Gly Lys Asn Ser Thr
500 505 510 500 505 510
Phe Thr Leu Asp Thr Arg Trp Ser Ser Leu Ala Pro Gly Pro Cys Met Phe Thr Leu Asp Thr Arg Trp Ser Ser Leu Ala Pro Gly Pro Cys Met
515 520 525 515 520 525
Gly Asp Asp Gly Arg Thr Pro Ser Thr Thr Lys Phe Ser Asn Ala Gln Gly Asp Asp Gly Arg Thr Pro Ser Thr Thr Lys Phe Ser Asn Ala Gln
530 535 540 530 535 540
Leu Met Phe Gly Ser Gly Thr Gln Pro Thr Glu Gly Gly Glu Asp Ala Leu Met Phe Gly Ser Gly Thr Gln Pro Thr Glu Gly Gly Glu Asp Ala
545 550 555 560 545 550 555 560
Val His Ile Thr Ser Glu Ser Glu Val Lys Ala Thr Asn Pro Thr Ala Val His Ile Thr Ser Glu Ser Glu Val Lys Ala Thr Asn Pro Thr Ala
565 570 575 565 570 575
Ile Asp Glu Tyr Gly Arg Val Ala Asp Asn Thr Gln Asn Ala Thr Thr Ile Asp Glu Tyr Gly Arg Val Ala Asp Asn Thr Gln Asn Ala Thr Thr
580 585 590 580 585 590
Ala Pro Thr Thr Val Gly Asn Ala Ala Met Gly Ala Met Pro Gly Met Ala Pro Thr Thr Val Gly Asn Ala Ala Met Gly Ala Met Pro Gly Met
595 600 605 595 600 605
Val Trp Gln Asp Arg Asp Ile Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Gly Lys Val Trp Gln Asp Arg Asp Ile Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Gly Lys
610 615 620 610 615 620
Ile Pro His Thr Asp Gly His Phe His Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Ile Pro His Thr Asp Gly His Phe His Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly
625 630 635 640 625 630 635 640
Phe Gly Tyr Arg Lys Pro Pro Pro Gln Ile Phe Ile Lys Asn Thr Pro Phe Gly Tyr Arg Lys Pro Pro Pro Gln Ile Phe Ile Lys Asn Thr Pro
645 650 655 645 650 655
Val Pro Gly Asn Pro Ala Thr Thr Phe Ser Pro Asn Arg Ile Asn Asn Val Pro Gly Asn Pro Ala Thr Thr Phe Ser Pro Asn Arg Ile Asn Asn
660 665 670 660 665 670
Phe Ile Thr Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val Thr Val Thr Ile Asp Trp Phe Ile Thr Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val Thr Val Thr Ile Asp Trp
675 680 685 675 680 685
Glu Leu Gln Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Val Gln Phe Glu Leu Gln Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Val Gln Phe
690 695 700 690 695 700
Thr Ser Asn Phe Gly Thr Val Asp Ser Leu Asn Trp Ala Pro Asp Asn Thr Ser Asn Phe Gly Thr Val Asp Ser Leu Asn Trp Ala Pro Asp Asn
705 710 715 720 705 710 715 720
Ala Gly Asn Tyr Lys Glu Pro Arg Val Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Ala Gly Asn Tyr Lys Glu Pro Arg Val Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr
725 730 735 725 730 735
Arg Ile Leu Arg Ile Leu
<210> 19<210> 19
<211> 2220<211> 2220
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Cap VP1 AAV2 VP2 VP3 вируса морского льва T431 линкер-6 SpyTag<223> Cap VP1 AAV2 VP2 VP3 Sea Lion Virus T431 Linker-6 SpyTag
<400> 19<400> 19
atggctgccg atggttatct tccagattgg ctcgaggaca ctctctctga aggaataaga 60atggctgccg atggttatct tccagattgg ctcgaggaca ctctctctga aggaataaga 60
cagtggtgga agctcaaacc tggcccacca ccaccaaagc ccgcagagcg gcataaggac 120cagtggtgga agctcaaacc tggcccacca ccaccaaagc ccgcagagcg gcataaggac 120
gacagcaggg gtcttgtgct tcctgggtac aagtacctcg gacccttcaa cggactcgac 180gacagcaggg gtcttgtgct tcctgggtac aagtacctcg gacccttcaa cggactcgac 180
aagggagagc cggtcaacga ggcagacgcc gcggccctcg agcacgacaa agcctacgac 240aagggagagc cggtcaacga ggcagacgcc gcggccctcg agcacgacaa agcctacgac 240
cggcagctcg acagcggaga caacccgtac ctcaagtaca accacgccga cgcggagttt 300cggcagctcg acagcggaga caacccgtac ctcaagtaca accacgccga cgcggagttt 300
caggagcgcc ttaaagaaga tacgtctttt gggggcaacc tcggacgagc agtcttccag 360caggagcgcc ttaaagaaga tacgtctttt gggggcaacc tcggacgagc agtcttccag 360
gcgaaaaaga gggttcttga acctctgggc ctggttgagg aaccctctca gccagattcg 420gcgaaaaaga gggttcttga acctctgggc ctggttgagg aaccctctca gccagattcg 420
tcctcggaca acacggcgcc acccgtgaaa aagtcccgtc tcgaagaagc ccagcccatt 480tcctcggaca acacggcgcc acccgtgaaa aagtcccgtc tcgaagaagc ccagcccatt 480
caaagtccag acgtttccag cagcactggc ggaggaattg ccgacgtcat gtctggagat 540caaagtccag acgtttccag cagcactggc ggaggaattg ccgacgtcat gtctggagat 540
gctgaaatgg ctgcagtggg cgggggagca ccgggcgtcg acggccaggg tgccgaggga 600gctgaaatgg ctgcagtggg cgggggagca ccgggcgtcg acggccaggg tgccgaggga 600
gtgggtactt cctcgggtaa ttggcattgc gattcccagt ggtcagaagg acacgtcaga 660gtgggtactt cctcgggtaa ttggcattgc gattcccagt ggtcagaagg acacgtcaga 660
accaccagca ccagaacctg ggtgttgccc agctacaaca accacctgta taaacggctt 720accaccagca ccagaacctg ggtgttgccc agctacaaca accacctgta taaacggctt 720
ggaagtagcg cacaatccaa tacctacaac ggattctcca ccccctgggg atacctcgac 780ggaagtagcg cacaatccaa tacctacaac ggattctcca ccccctgggg atacctcgac 780
ttcaatagat ggcactgtca cttcagtcct cggaactggc aacgtctcat caacaacaac 840ttcaatagat ggcactgtca cttcagtcct cggaactggc aacgtctcat caacaacaac 840
tggggcatca gaccaaaaag acttaatgtt aaattgttca acatacaagt caaagaggtc 900tggggcatca gaccaaaaag acttaatgtt aaattgttca acatacaagt caaagaggtc 900
acgacggaag gggggacgac gaccgtcgcc aataacctta ccagcacgat tcaggtgttt 960acgacggaag gggggacgac gaccgtcgcc aataacctta ccagcacgat tcaggtgttt 960
gcggacaacg cgtacgaact cccgtatgtt gtcgacgcgg gtcacgaggg ggcattgccg 1020gcggacaacg cgtacgaact cccgtatgtt gtcgacgcgg gtcacgaggg ggcattgccg 1020
ccgttcccaa acgacgtgtt tatgattccc caatacggat actgcgggct ggtgtctggt 1080ccgttcccaa acgacgtgtt tatgattccc caatacggat actgcgggct ggtgtctggt 1080
caaagtcagg ctcagtcgga cttgtgttcg ttttattgcc tggagtattt tccatcccag 1140caaagtcagg ctcagtcgga cttgtgttcg ttttattgcc tggagtattt tccatcccag 1140
atgctgagaa caggaaacaa ttttgaaatg aatttcaggt ttgaagacgt tccatttcac 1200atgctgagaa caggaaacaa ttttgaaatg aatttcaggt ttgaagacgt tccatttcac 1200
tccatgtacg cccacagcca gtctctagac aggctcatga atcctttaat tgatcagtat 1260tccatgtacg cccacagcca gtctctagac aggctcatga atcctttaat tgatcagtat 1260
ctgtggagtc taaaacaaac aggaaacccg actggcctga gcggcagcgg cgcccacatc 1320ctgtggagtc taaaacaaac aggaaacccg actggcctga gcggcagcgg cgcccacatc 1320
gtgatggtgg acgcctacaa gccgacgaag ggcctgagcg gcagcggcgg atcaacaacg 1380gtgatggtgg acgcctacaa gccgacgaag ggcctgagcg gcagcggcgg atcaacaacg 1380
agagacttaa aatttatcaa gaacaaagtt cccaattttg cacattatgg aaaaaattgg 1440agagacttaa aatttatcaa gaacaaagtt cccaattttg cacattatgg aaaaaattgg 1440
cttcctggac cttttattag acaacagggg tggacaacac aaaatattaa taatagtgtt 1500cttcctggac cttttattag acaacagggg tggacaacac aaaatattaa taatagtgtt 1500
gttaatttta atgacatgct gggaaaaaat tcgacattta ctttggacac tagatggagt 1560gttaatttta atgacatgct gggaaaaaat tcgacattta ctttggacac tagatggagt 1560
tcattagcgc ctggtccgtg tatgggggat gacggacgaa ctccatccac caccaagttc 1620tcattagcgc ctggtccgtg tatgggggat gacggacgaa ctccatccac caccaagttc 1620
tcaaatgctc agctcatgtt tggatctgga acacaaccca ccgaaggcgg tgaagatgct 1680tcaaatgctc agctcatgtt tggatctgga acacaaccca ccgaaggcgg tgaagatgct 1680
gtacatatta catccgagtc ggaggtcaag gcaaccaacc caactgcaat cgatgaatac 1740gtacatatta catccgagtc ggaggtcaag gcaaccaacc caactgcaat cgatgaatac 1740
ggacgagtgg ccgataatac gcaaaatgca acaaccgccc caaccacagt gggaaatgct 1800ggacgagtgg ccgataatac gcaaaatgca acaaccgccc caaccacagt gggaaatgct 1800
gcaatggggg ccatgcctgg gatggtgtgg caagataggg atatctatct tcaaggaccc 1860gcaatggggg ccatgcctgg gatggtgtgg caagataggg atatctatct tcaaggaccc 1860
atctggggaa aaatacccca tacagacgga cattttcatc cgtctcctct catggggggg 1920atctggggaa aaatacccca tacagacgga cattttcatc cgtctcctct catggggggg 1920
tttggataca gaaaaccccc tccgcaaatt tttattaaaa acacccccgt tcctggaaat 1980tttggataca gaaaaccccc tccgcaaatt tttattaaaa acacccccgt tcctggaaat 1980
ccggcaacta cattttctcc aaatagaata aacaatttca ttactcaata ctcaacggga 2040ccggcaacta cattttctcc aaatagaata aacaatttca ttactcaata ctcaacggga 2040
caagtgaccg ttactattga ctgggagctg caaaaggaaa actcaaagag atggaaccca 2100caagtgaccg ttactattga ctgggagctg caaaaggaaa actcaaagag atggaaccca 2100
gaagtacaat ttacatcaaa ttttggcacg gtcgattcac taaactgggc accggacaac 2160gaagtacaat ttacatcaaa ttttggcacg gtcgattcac taaactgggc acggacaac 2160
gcgggaaact acaaagaacc aagggtgatt ggcaccagat acctgactcg tatactataa 2220gcgggaaact acaaagaacc aagggtgatt ggcaccagat acctgactcg tatactataa 2220
<210> 20<210> 20
<211> 739<211> 739
<212> БЕЛОК<212> PROTEIN
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Cap VP1 AAV2 VP2 VP3 вируса морского льва T431 линкер-6 SpyTag<223> Cap VP1 AAV2 VP2 VP3 Sea Lion Virus T431 Linker-6 SpyTag
<400> 20<400> 20
Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Thr Leu Ser Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Thr Leu Ser
1 5 10 15 1 5 10 15
Glu Gly Ile Arg Gln Trp Trp Lys Leu Lys Pro Gly Pro Pro Pro Pro Glu Gly Ile Arg Gln Trp Trp Lys Leu Lys Pro Gly Pro Pro Pro Pro
20 25 30 20 25 30
Lys Pro Ala Glu Arg His Lys Asp Asp Ser Arg Gly Leu Val Leu Pro Lys Pro Ala Glu Arg His Lys Asp Asp Ser Arg Gly Leu Val Leu Pro
35 40 45 35 40 45
Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro
50 55 60 50 55 60
Val Asn Glu Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp Val Asn Glu Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp
65 70 75 80 65 70 75 80
Arg Gln Leu Asp Ser Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala Arg Gln Leu Asp Ser Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala
85 90 95 85 90 95
Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Lys Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Lys Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly
100 105 110 100 105 110
Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro
115 120 125 115 120 125
Leu Gly Leu Val Glu Glu Pro Ser Gln Pro Asp Ser Ser Ser Asp Asn Leu Gly Leu Val Glu Glu Pro Ser Gln Pro Asp Ser Ser Ser Asp Asn
130 135 140 130 135 140
Thr Ala Pro Pro Val Lys Lys Ser Arg Leu Glu Glu Ala Gln Pro Ile Thr Ala Pro Pro Val Lys Lys Ser Arg Leu Glu Glu Ala Gln Pro Ile
145 150 155 160 145 150 155 160
Gln Ser Pro Asp Val Ser Ser Ser Thr Gly Gly Gly Ile Ala Asp Val Gln Ser Pro Asp Val Ser Ser Ser Thr Gly Gly Gly Ile Ala Asp Val
165 170 175 165 170 175
Met Ser Gly Asp Ala Glu Met Ala Ala Val Gly Gly Gly Ala Pro Gly Met Ser Gly Asp Ala Glu Met Ala Ala Val Gly Gly Gly Ala Pro Gly
180 185 190 180 185 190
Val Asp Gly Gln Gly Ala Glu Gly Val Gly Thr Ser Ser Gly Asn Trp Val Asp Gly Gln Gly Ala Glu Gly Val Gly Thr Ser Ser Gly Asn Trp
195 200 205 195 200 205
His Cys Asp Ser Gln Trp Ser Glu Gly His Val Arg Thr Thr Ser Thr His Cys Asp Ser Gln Trp Ser Glu Gly His Val Arg Thr Thr Ser Thr
210 215 220 210 215 220
Arg Thr Trp Val Leu Pro Ser Tyr Asn Asn His Leu Tyr Lys Arg Leu Arg Thr Trp Val Leu Pro Ser Tyr Asn Asn His Leu Tyr Lys Arg Leu
225 230 235 240 225 230 235 240
Gly Ser Ser Ala Gln Ser Asn Thr Tyr Asn Gly Phe Ser Thr Pro Trp Gly Ser Ser Ala Gln Ser Asn Thr Tyr Asn Gly Phe Ser Thr Pro Trp
245 250 255 245 250 255
Gly Tyr Leu Asp Phe Asn Arg Trp His Cys His Phe Ser Pro Arg Asn Gly Tyr Leu Asp Phe Asn Arg Trp His Cys His Phe Ser Pro Arg Asn
260 265 270 260 265 270
Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn Asn Trp Gly Ile Arg Pro Lys Arg Leu Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn Asn Trp Gly Ile Arg Pro Lys Arg Leu
275 280 285 275 280 285
Asn Val Lys Leu Phe Asn Ile Gln Val Lys Glu Val Thr Thr Glu Gly Asn Val Lys Leu Phe Asn Ile Gln Val Lys Glu Val Thr Thr Glu Gly
290 295 300 290 295 300
Gly Thr Thr Thr Val Ala Asn Asn Leu Thr Ser Thr Ile Gln Val Phe Gly Thr Thr Thr Val Ala Asn Asn Leu Thr Ser Thr Ile Gln Val Phe
305 310 315 320 305 310 315 320
Ala Asp Asn Ala Tyr Glu Leu Pro Tyr Val Val Asp Ala Gly His Glu Ala Asp Asn Ala Tyr Glu Leu Pro Tyr Val Val Asp Ala Gly His Glu
325 330 335 325 330 335
Gly Ala Leu Pro Pro Phe Pro Asn Asp Val Phe Met Ile Pro Gln Tyr Gly Ala Leu Pro Pro Phe Pro Asn Asp Val Phe Met Ile Pro Gln Tyr
340 345 350 340 345 350
Gly Tyr Cys Gly Leu Val Ser Gly Gln Ser Gln Ala Gln Ser Asp Leu Gly Tyr Cys Gly Leu Val Ser Gly Gln Ser Gln Ala Gln Ser Asp Leu
355 360 365 355 360 365
Cys Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe Pro Ser Gln Met Leu Arg Thr Cys Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe Pro Ser Gln Met Leu Arg Thr
370 375 380 370 375 380
Gly Asn Asn Phe Glu Met Asn Phe Arg Phe Glu Asp Val Pro Phe His Gly Asn Asn Phe Glu Met Asn Phe Arg Phe Glu Asp Val Pro Phe His
385 390 395 400 385 390 395 400
Ser Met Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu Asp Arg Leu Met Asn Pro Leu Ser Met Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu Asp Arg Leu Met Asn Pro Leu
405 410 415 405 410 415
Ile Asp Gln Tyr Leu Trp Ser Leu Lys Gln Thr Gly Asn Pro Thr Gly Ile Asp Gln Tyr Leu Trp Ser Leu Lys Gln Thr Gly Asn Pro Thr Gly
420 425 430 420 425 430
Leu Ser Gly Ser Gly Ala His Ile Val Met Val Asp Ala Tyr Lys Pro Leu Ser Gly Ser Gly Ala His Ile Val Met Val Asp Ala Tyr Lys Pro
435 440 445 435 440 445
Thr Lys Gly Leu Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Thr Arg Asp Leu Lys Thr Lys Gly Leu Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Thr Arg Asp Leu Lys
450 455 460 450 455 460
Phe Ile Lys Asn Lys Val Pro Asn Phe Ala His Tyr Gly Lys Asn Trp Phe Ile Lys Asn Lys Val Pro Asn Phe Ala His Tyr Gly Lys Asn Trp
465 470 475 480 465 470 475 480
Leu Pro Gly Pro Phe Ile Arg Gln Gln Gly Trp Thr Thr Gln Asn Ile Leu Pro Gly Pro Phe Ile Arg Gln Gln Gly Trp Thr Thr Gln Asn Ile
485 490 495 485 490 495
Asn Asn Ser Val Val Asn Phe Asn Asp Met Leu Gly Lys Asn Ser Thr Asn Asn Ser Val Val Asn Phe Asn Asp Met Leu Gly Lys Asn Ser Thr
500 505 510 500 505 510
Phe Thr Leu Asp Thr Arg Trp Ser Ser Leu Ala Pro Gly Pro Cys Met Phe Thr Leu Asp Thr Arg Trp Ser Ser Leu Ala Pro Gly Pro Cys Met
515 520 525 515 520 525
Gly Asp Asp Gly Arg Thr Pro Ser Thr Thr Lys Phe Ser Asn Ala Gln Gly Asp Asp Gly Arg Thr Pro Ser Thr Thr Lys Phe Ser Asn Ala Gln
530 535 540 530 535 540
Leu Met Phe Gly Ser Gly Thr Gln Pro Thr Glu Gly Gly Glu Asp Ala Leu Met Phe Gly Ser Gly Thr Gln Pro Thr Glu Gly Gly Glu Asp Ala
545 550 555 560 545 550 555 560
Val His Ile Thr Ser Glu Ser Glu Val Lys Ala Thr Asn Pro Thr Ala Val His Ile Thr Ser Glu Ser Glu Val Lys Ala Thr Asn Pro Thr Ala
565 570 575 565 570 575
Ile Asp Glu Tyr Gly Arg Val Ala Asp Asn Thr Gln Asn Ala Thr Thr Ile Asp Glu Tyr Gly Arg Val Ala Asp Asn Thr Gln Asn Ala Thr Thr
580 585 590 580 585 590
Ala Pro Thr Thr Val Gly Asn Ala Ala Met Gly Ala Met Pro Gly Met Ala Pro Thr Thr Val Gly Asn Ala Ala Met Gly Ala Met Pro Gly Met
595 600 605 595 600 605
Val Trp Gln Asp Arg Asp Ile Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Gly Lys Val Trp Gln Asp Arg Asp Ile Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Gly Lys
610 615 620 610 615 620
Ile Pro His Thr Asp Gly His Phe His Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Ile Pro His Thr Asp Gly His Phe His Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly
625 630 635 640 625 630 635 640
Phe Gly Tyr Arg Lys Pro Pro Pro Gln Ile Phe Ile Lys Asn Thr Pro Phe Gly Tyr Arg Lys Pro Pro Pro Gln Ile Phe Ile Lys Asn Thr Pro
645 650 655 645 650 655
Val Pro Gly Asn Pro Ala Thr Thr Phe Ser Pro Asn Arg Ile Asn Asn Val Pro Gly Asn Pro Ala Thr Thr Phe Ser Pro Asn Arg Ile Asn Asn
660 665 670 660 665 670
Phe Ile Thr Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val Thr Val Thr Ile Asp Trp Phe Ile Thr Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val Thr Val Thr Ile Asp Trp
675 680 685 675 680 685
Glu Leu Gln Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Val Gln Phe Glu Leu Gln Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Val Gln Phe
690 695 700 690 695 700
Thr Ser Asn Phe Gly Thr Val Asp Ser Leu Asn Trp Ala Pro Asp Asn Thr Ser Asn Phe Gly Thr Val Asp Ser Leu Asn Trp Ala Pro Asp Asn
705 710 715 720 705 710 715 720
Ala Gly Asn Tyr Lys Glu Pro Arg Val Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Ala Gly Asn Tyr Lys Glu Pro Arg Val Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr
725 730 735 725 730 735
Arg Ile Leu Arg Ile Leu
<210> 21<210> 21
<211> 2220<211> 2220
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Cap VP1 AAV2 VP2 VP3 вируса морского льва S433 линкер-6 SpyTag<223> Cap VP1 AAV2 VP2 VP3 Sea Lion Virus S433 Linker-6 SpyTag
<400> 21<400> 21
atggctgccg atggttatct tccagattgg ctcgaggaca ctctctctga aggaataaga 60atggctgccg atggttatct tccagattgg ctcgaggaca ctctctctga aggaataaga 60
cagtggtgga agctcaaacc tggcccacca ccaccaaagc ccgcagagcg gcataaggac 120cagtggtgga agctcaaacc tggcccacca ccaccaaagc ccgcagagcg gcataaggac 120
gacagcaggg gtcttgtgct tcctgggtac aagtacctcg gacccttcaa cggactcgac 180gacagcaggg gtcttgtgct tcctgggtac aagtacctcg gacccttcaa cggactcgac 180
aagggagagc cggtcaacga ggcagacgcc gcggccctcg agcacgacaa agcctacgac 240aagggagagc cggtcaacga ggcagacgcc gcggccctcg agcacgacaa agcctacgac 240
cggcagctcg acagcggaga caacccgtac ctcaagtaca accacgccga cgcggagttt 300cggcagctcg acagcggaga caacccgtac ctcaagtaca accacgccga cgcggagttt 300
caggagcgcc ttaaagaaga tacgtctttt gggggcaacc tcggacgagc agtcttccag 360caggagcgcc ttaaagaaga tacgtctttt gggggcaacc tcggacgagc agtcttccag 360
gcgaaaaaga gggttcttga acctctgggc ctggttgagg aaccctctca gccagattcg 420gcgaaaaaga gggttcttga acctctgggc ctggttgagg aaccctctca gccagattcg 420
tcctcggaca acacggcgcc acccgtgaaa aagtcccgtc tcgaagaagc ccagcccatt 480tcctcggaca acacggcgcc acccgtgaaa aagtcccgtc tcgaagaagc ccagcccatt 480
caaagtccag acgtttccag cagcactggc ggaggaattg ccgacgtcat gtctggagat 540caaagtccag acgtttccag cagcactggc ggaggaattg ccgacgtcat gtctggagat 540
gctgaaatgg ctgcagtggg cgggggagca ccgggcgtcg acggccaggg tgccgaggga 600gctgaaatgg ctgcagtggg cgggggagca ccgggcgtcg acggccaggg tgccgaggga 600
gtgggtactt cctcgggtaa ttggcattgc gattcccagt ggtcagaagg acacgtcaga 660gtgggtactt cctcgggtaa ttggcattgc gattcccagt ggtcagaagg acacgtcaga 660
accaccagca ccagaacctg ggtgttgccc agctacaaca accacctgta taaacggctt 720accaccagca ccagaacctg ggtgttgccc agctacaaca accacctgta taaacggctt 720
ggaagtagcg cacaatccaa tacctacaac ggattctcca ccccctgggg atacctcgac 780ggaagtagcg cacaatccaa tacctacaac ggattctcca ccccctgggg atacctcgac 780
ttcaatagat ggcactgtca cttcagtcct cggaactggc aacgtctcat caacaacaac 840ttcaatagat ggcactgtca cttcagtcct cggaactggc aacgtctcat caacaacaac 840
tggggcatca gaccaaaaag acttaatgtt aaattgttca acatacaagt caaagaggtc 900tggggcatca gaccaaaaag acttaatgtt aaattgttca acatacaagt caaagaggtc 900
acgacggaag gggggacgac gaccgtcgcc aataacctta ccagcacgat tcaggtgttt 960acgacggaag gggggacgac gaccgtcgcc aataacctta ccagcacgat tcaggtgttt 960
gcggacaacg cgtacgaact cccgtatgtt gtcgacgcgg gtcacgaggg ggcattgccg 1020gcggacaacg cgtacgaact cccgtatgtt gtcgacgcgg gtcacgaggg ggcattgccg 1020
ccgttcccaa acgacgtgtt tatgattccc caatacggat actgcgggct ggtgtctggt 1080ccgttcccaa acgacgtgtt tatgattccc caatacggat actgcgggct ggtgtctggt 1080
caaagtcagg ctcagtcgga cttgtgttcg ttttattgcc tggagtattt tccatcccag 1140caaagtcagg ctcagtcgga cttgtgttcg ttttattgcc tggagtattt tccatcccag 1140
atgctgagaa caggaaacaa ttttgaaatg aatttcaggt ttgaagacgt tccatttcac 1200atgctgagaa caggaaacaa ttttgaaatg aatttcaggt ttgaagacgt tccatttcac 1200
tccatgtacg cccacagcca gtctctagac aggctcatga atcctttaat tgatcagtat 1260tccatgtacg cccacagcca gtctctagac aggctcatga atcctttaat tgatcagtat 1260
ctgtggagtc taaaacaaac aggaaacccg actggatcag gcctgagcgg cagcggcgcc 1320ctgtggagtc taaaacaaac aggaaacccg actggatcag gcctgagcgg cagcggcgcc 1320
cacatcgtga tggtggacgc ctacaagccg acgaagggcc tgagcggcag cggcacaacg 1380cacatcgtga tggtggacgc ctacaagccg acgaagggcc tgagcggcag cggcacaacg 1380
agagacttaa aatttatcaa gaacaaagtt cccaattttg cacattatgg aaaaaattgg 1440agagacttaa aatttatcaa gaacaaagtt cccaattttg cacattatgg aaaaaattgg 1440
cttcctggac cttttattag acaacagggg tggacaacac aaaatattaa taatagtgtt 1500cttcctggac cttttattag acaacagggg tggacaacac aaaatattaa taatagtgtt 1500
gttaatttta atgacatgct gggaaaaaat tcgacattta ctttggacac tagatggagt 1560gttaatttta atgacatgct gggaaaaaat tcgacattta ctttggacac tagatggagt 1560
tcattagcgc ctggtccgtg tatgggggat gacggacgaa ctccatccac caccaagttc 1620tcattagcgc ctggtccgtg tatgggggat gacggacgaa ctccatccac caccaagttc 1620
tcaaatgctc agctcatgtt tggatctgga acacaaccca ccgaaggcgg tgaagatgct 1680tcaaatgctc agctcatgtt tggatctgga acacaaccca ccgaaggcgg tgaagatgct 1680
gtacatatta catccgagtc ggaggtcaag gcaaccaacc caactgcaat cgatgaatac 1740gtacatatta catccgagtc ggaggtcaag gcaaccaacc caactgcaat cgatgaatac 1740
ggacgagtgg ccgataatac gcaaaatgca acaaccgccc caaccacagt gggaaatgct 1800ggacgagtgg ccgataatac gcaaaatgca acaaccgccc caaccacagt gggaaatgct 1800
gcaatggggg ccatgcctgg gatggtgtgg caagataggg atatctatct tcaaggaccc 1860gcaatggggg ccatgcctgg gatggtgtgg caagataggg atatctatct tcaaggaccc 1860
atctggggaa aaatacccca tacagacgga cattttcatc cgtctcctct catggggggg 1920atctggggaa aaatacccca tacagacgga cattttcatc cgtctcctct catggggggg 1920
tttggataca gaaaaccccc tccgcaaatt tttattaaaa acacccccgt tcctggaaat 1980tttggataca gaaaaccccc tccgcaaatt tttattaaaa acacccccgt tcctggaaat 1980
ccggcaacta cattttctcc aaatagaata aacaatttca ttactcaata ctcaacggga 2040ccggcaacta cattttctcc aaatagaata aacaatttca ttactcaata ctcaacggga 2040
caagtgaccg ttactattga ctgggagctg caaaaggaaa actcaaagag atggaaccca 2100caagtgaccg ttactattga ctgggagctg caaaaggaaa actcaaagag atggaaccca 2100
gaagtacaat ttacatcaaa ttttggcacg gtcgattcac taaactgggc accggacaac 2160gaagtacaat ttacatcaaa ttttggcacg gtcgattcac taaactgggc acggacaac 2160
gcgggaaact acaaagaacc aagggtgatt ggcaccagat acctgactcg tatactataa 2220gcgggaaact acaaagaacc aagggtgatt ggcaccagat acctgactcg tatactataa 2220
<210> 22<210> 22
<211> 739<211> 739
<212> БЕЛОК<212> PROTEIN
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Cap VP1 AAV2 VP2 VP3 вируса морского льва S433 линкер-6 SpyTag<223> Cap VP1 AAV2 VP2 VP3 Sea Lion Virus S433 Linker-6 SpyTag
<400> 22<400> 22
Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Thr Leu Ser Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Thr Leu Ser
1 5 10 15 1 5 10 15
Glu Gly Ile Arg Gln Trp Trp Lys Leu Lys Pro Gly Pro Pro Pro Pro Glu Gly Ile Arg Gln Trp Trp Lys Leu Lys Pro Gly Pro Pro Pro Pro
20 25 30 20 25 30
Lys Pro Ala Glu Arg His Lys Asp Asp Ser Arg Gly Leu Val Leu Pro Lys Pro Ala Glu Arg His Lys Asp Asp Ser Arg Gly Leu Val Leu Pro
35 40 45 35 40 45
Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro
50 55 60 50 55 60
Val Asn Glu Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp Val Asn Glu Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp
65 70 75 80 65 70 75 80
Arg Gln Leu Asp Ser Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala Arg Gln Leu Asp Ser Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala
85 90 95 85 90 95
Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Lys Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Lys Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly
100 105 110 100 105 110
Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro
115 120 125 115 120 125
Leu Gly Leu Val Glu Glu Pro Ser Gln Pro Asp Ser Ser Ser Asp Asn Leu Gly Leu Val Glu Glu Pro Ser Gln Pro Asp Ser Ser Ser Asp Asn
130 135 140 130 135 140
Thr Ala Pro Pro Val Lys Lys Ser Arg Leu Glu Glu Ala Gln Pro Ile Thr Ala Pro Pro Val Lys Lys Ser Arg Leu Glu Glu Ala Gln Pro Ile
145 150 155 160 145 150 155 160
Gln Ser Pro Asp Val Ser Ser Ser Thr Gly Gly Gly Ile Ala Asp Val Gln Ser Pro Asp Val Ser Ser Ser Thr Gly Gly Gly Ile Ala Asp Val
165 170 175 165 170 175
Met Ser Gly Asp Ala Glu Met Ala Ala Val Gly Gly Gly Ala Pro Gly Met Ser Gly Asp Ala Glu Met Ala Ala Val Gly Gly Gly Ala Pro Gly
180 185 190 180 185 190
Val Asp Gly Gln Gly Ala Glu Gly Val Gly Thr Ser Ser Gly Asn Trp Val Asp Gly Gln Gly Ala Glu Gly Val Gly Thr Ser Ser Gly Asn Trp
195 200 205 195 200 205
His Cys Asp Ser Gln Trp Ser Glu Gly His Val Arg Thr Thr Ser Thr His Cys Asp Ser Gln Trp Ser Glu Gly His Val Arg Thr Thr Ser Thr
210 215 220 210 215 220
Arg Thr Trp Val Leu Pro Ser Tyr Asn Asn His Leu Tyr Lys Arg Leu Arg Thr Trp Val Leu Pro Ser Tyr Asn Asn His Leu Tyr Lys Arg Leu
225 230 235 240 225 230 235 240
Gly Ser Ser Ala Gln Ser Asn Thr Tyr Asn Gly Phe Ser Thr Pro Trp Gly Ser Ser Ala Gln Ser Asn Thr Tyr Asn Gly Phe Ser Thr Pro Trp
245 250 255 245 250 255
Gly Tyr Leu Asp Phe Asn Arg Trp His Cys His Phe Ser Pro Arg Asn Gly Tyr Leu Asp Phe Asn Arg Trp His Cys His Phe Ser Pro Arg Asn
260 265 270 260 265 270
Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn Asn Trp Gly Ile Arg Pro Lys Arg Leu Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn Asn Trp Gly Ile Arg Pro Lys Arg Leu
275 280 285 275 280 285
Asn Val Lys Leu Phe Asn Ile Gln Val Lys Glu Val Thr Thr Glu Gly Asn Val Lys Leu Phe Asn Ile Gln Val Lys Glu Val Thr Thr Glu Gly
290 295 300 290 295 300
Gly Thr Thr Thr Val Ala Asn Asn Leu Thr Ser Thr Ile Gln Val Phe Gly Thr Thr Thr Val Ala Asn Asn Leu Thr Ser Thr Ile Gln Val Phe
305 310 315 320 305 310 315 320
Ala Asp Asn Ala Tyr Glu Leu Pro Tyr Val Val Asp Ala Gly His Glu Ala Asp Asn Ala Tyr Glu Leu Pro Tyr Val Val Asp Ala Gly His Glu
325 330 335 325 330 335
Gly Ala Leu Pro Pro Phe Pro Asn Asp Val Phe Met Ile Pro Gln Tyr Gly Ala Leu Pro Pro Phe Pro Asn Asp Val Phe Met Ile Pro Gln Tyr
340 345 350 340 345 350
Gly Tyr Cys Gly Leu Val Ser Gly Gln Ser Gln Ala Gln Ser Asp Leu Gly Tyr Cys Gly Leu Val Ser Gly Gln Ser Gln Ala Gln Ser Asp Leu
355 360 365 355 360 365
Cys Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe Pro Ser Gln Met Leu Arg Thr Cys Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe Pro Ser Gln Met Leu Arg Thr
370 375 380 370 375 380
Gly Asn Asn Phe Glu Met Asn Phe Arg Phe Glu Asp Val Pro Phe His Gly Asn Asn Phe Glu Met Asn Phe Arg Phe Glu Asp Val Pro Phe His
385 390 395 400 385 390 395 400
Ser Met Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu Asp Arg Leu Met Asn Pro Leu Ser Met Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu Asp Arg Leu Met Asn Pro Leu
405 410 415 405 410 415
Ile Asp Gln Tyr Leu Trp Ser Leu Lys Gln Thr Gly Asn Pro Thr Gly Ile Asp Gln Tyr Leu Trp Ser Leu Lys Gln Thr Gly Asn Pro Thr Gly
420 425 430 420 425 430
Ser Gly Leu Ser Gly Ser Gly Ala His Ile Val Met Val Asp Ala Tyr Ser Gly Leu Ser Gly Ser Gly Ala His Ile Val Met Val Asp Ala Tyr
435 440 445 435 440 445
Lys Pro Thr Lys Gly Leu Ser Gly Ser Gly Thr Thr Arg Asp Leu Lys Lys Pro Thr Lys Gly Leu Ser Gly Ser Gly Thr Thr Arg Asp Leu Lys
450 455 460 450 455 460
Phe Ile Lys Asn Lys Val Pro Asn Phe Ala His Tyr Gly Lys Asn Trp Phe Ile Lys Asn Lys Val Pro Asn Phe Ala His Tyr Gly Lys Asn Trp
465 470 475 480 465 470 475 480
Leu Pro Gly Pro Phe Ile Arg Gln Gln Gly Trp Thr Thr Gln Asn Ile Leu Pro Gly Pro Phe Ile Arg Gln Gln Gly Trp Thr Thr Gln Asn Ile
485 490 495 485 490 495
Asn Asn Ser Val Val Asn Phe Asn Asp Met Leu Gly Lys Asn Ser Thr Asn Asn Ser Val Val Asn Phe Asn Asp Met Leu Gly Lys Asn Ser Thr
500 505 510 500 505 510
Phe Thr Leu Asp Thr Arg Trp Ser Ser Leu Ala Pro Gly Pro Cys Met Phe Thr Leu Asp Thr Arg Trp Ser Ser Leu Ala Pro Gly Pro Cys Met
515 520 525 515 520 525
Gly Asp Asp Gly Arg Thr Pro Ser Thr Thr Lys Phe Ser Asn Ala Gln Gly Asp Asp Gly Arg Thr Pro Ser Thr Thr Lys Phe Ser Asn Ala Gln
530 535 540 530 535 540
Leu Met Phe Gly Ser Gly Thr Gln Pro Thr Glu Gly Gly Glu Asp Ala Leu Met Phe Gly Ser Gly Thr Gln Pro Thr Glu Gly Gly Glu Asp Ala
545 550 555 560 545 550 555 560
Val His Ile Thr Ser Glu Ser Glu Val Lys Ala Thr Asn Pro Thr Ala Val His Ile Thr Ser Glu Ser Glu Val Lys Ala Thr Asn Pro Thr Ala
565 570 575 565 570 575
Ile Asp Glu Tyr Gly Arg Val Ala Asp Asn Thr Gln Asn Ala Thr Thr Ile Asp Glu Tyr Gly Arg Val Ala Asp Asn Thr Gln Asn Ala Thr Thr
580 585 590 580 585 590
Ala Pro Thr Thr Val Gly Asn Ala Ala Met Gly Ala Met Pro Gly Met Ala Pro Thr Thr Val Gly Asn Ala Ala Met Gly Ala Met Pro Gly Met
595 600 605 595 600 605
Val Trp Gln Asp Arg Asp Ile Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Gly Lys Val Trp Gln Asp Arg Asp Ile Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Gly Lys
610 615 620 610 615 620
Ile Pro His Thr Asp Gly His Phe His Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Ile Pro His Thr Asp Gly His Phe His Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly
625 630 635 640 625 630 635 640
Phe Gly Tyr Arg Lys Pro Pro Pro Gln Ile Phe Ile Lys Asn Thr Pro Phe Gly Tyr Arg Lys Pro Pro Pro Gln Ile Phe Ile Lys Asn Thr Pro
645 650 655 645 650 655
Val Pro Gly Asn Pro Ala Thr Thr Phe Ser Pro Asn Arg Ile Asn Asn Val Pro Gly Asn Pro Ala Thr Thr Phe Ser Pro Asn Arg Ile Asn Asn
660 665 670 660 665 670
Phe Ile Thr Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val Thr Val Thr Ile Asp Trp Phe Ile Thr Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val Thr Val Thr Ile Asp Trp
675 680 685 675 680 685
Glu Leu Gln Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Val Gln Phe Glu Leu Gln Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Val Gln Phe
690 695 700 690 695 700
Thr Ser Asn Phe Gly Thr Val Asp Ser Leu Asn Trp Ala Pro Asp Asn Thr Ser Asn Phe Gly Thr Val Asp Ser Leu Asn Trp Ala Pro Asp Asn
705 710 715 720 705 710 715 720
Ala Gly Asn Tyr Lys Glu Pro Arg Val Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Ala Gly Asn Tyr Lys Glu Pro Arg Val Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr
725 730 735 725 730 735
Arg Ile Leu Arg Ile Leu
<210> 23<210> 23
<211> 2220<211> 2220
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Cap VP1 AAV2 VP2 VP3 вируса морского льва T434 линкер-6 SpyTag<223> Cap VP1 AAV2 VP2 VP3 Sea Lion Virus T434 Linker-6 SpyTag
<400> 23<400> 23
atggctgccg atggttatct tccagattgg ctcgaggaca ctctctctga aggaataaga 60atggctgccg atggttatct tccagattgg ctcgaggaca ctctctctga aggaataaga 60
cagtggtgga agctcaaacc tggcccacca ccaccaaagc ccgcagagcg gcataaggac 120cagtggtgga agctcaaacc tggcccacca ccaccaaagc ccgcagagcg gcataaggac 120
gacagcaggg gtcttgtgct tcctgggtac aagtacctcg gacccttcaa cggactcgac 180gacagcaggg gtcttgtgct tcctgggtac aagtacctcg gacccttcaa cggactcgac 180
aagggagagc cggtcaacga ggcagacgcc gcggccctcg agcacgacaa agcctacgac 240aagggagagc cggtcaacga ggcagacgcc gcggccctcg agcacgacaa agcctacgac 240
cggcagctcg acagcggaga caacccgtac ctcaagtaca accacgccga cgcggagttt 300cggcagctcg acagcggaga caacccgtac ctcaagtaca accacgccga cgcggagttt 300
caggagcgcc ttaaagaaga tacgtctttt gggggcaacc tcggacgagc agtcttccag 360caggagcgcc ttaaagaaga tacgtctttt gggggcaacc tcggacgagc agtcttccag 360
gcgaaaaaga gggttcttga acctctgggc ctggttgagg aaccctctca gccagattcg 420gcgaaaaaga gggttcttga acctctgggc ctggttgagg aaccctctca gccagattcg 420
tcctcggaca acacggcgcc acccgtgaaa aagtcccgtc tcgaagaagc ccagcccatt 480tcctcggaca acacggcgcc acccgtgaaa aagtcccgtc tcgaagaagc ccagcccatt 480
caaagtccag acgtttccag cagcactggc ggaggaattg ccgacgtcat gtctggagat 540caaagtccag acgtttccag cagcactggc ggaggaattg ccgacgtcat gtctggagat 540
gctgaaatgg ctgcagtggg cgggggagca ccgggcgtcg acggccaggg tgccgaggga 600gctgaaatgg ctgcagtggg cgggggagca ccgggcgtcg acggccaggg tgccgaggga 600
gtgggtactt cctcgggtaa ttggcattgc gattcccagt ggtcagaagg acacgtcaga 660gtgggtactt cctcgggtaa ttggcattgc gattcccagt ggtcagaagg acacgtcaga 660
accaccagca ccagaacctg ggtgttgccc agctacaaca accacctgta taaacggctt 720accaccagca ccagaacctg ggtgttgccc agctacaaca accacctgta taaacggctt 720
ggaagtagcg cacaatccaa tacctacaac ggattctcca ccccctgggg atacctcgac 780ggaagtagcg cacaatccaa tacctacaac ggattctcca ccccctgggg atacctcgac 780
ttcaatagat ggcactgtca cttcagtcct cggaactggc aacgtctcat caacaacaac 840ttcaatagat ggcactgtca cttcagtcct cggaactggc aacgtctcat caacaacaac 840
tggggcatca gaccaaaaag acttaatgtt aaattgttca acatacaagt caaagaggtc 900tggggcatca gaccaaaaag acttaatgtt aaattgttca acatacaagt caaagaggtc 900
acgacggaag gggggacgac gaccgtcgcc aataacctta ccagcacgat tcaggtgttt 960acgacggaag gggggacgac gaccgtcgcc aataacctta ccagcacgat tcaggtgttt 960
gcggacaacg cgtacgaact cccgtatgtt gtcgacgcgg gtcacgaggg ggcattgccg 1020gcggacaacg cgtacgaact cccgtatgtt gtcgacgcgg gtcacgaggg ggcattgccg 1020
ccgttcccaa acgacgtgtt tatgattccc caatacggat actgcgggct ggtgtctggt 1080ccgttcccaa acgacgtgtt tatgattccc caatacggat actgcgggct ggtgtctggt 1080
caaagtcagg ctcagtcgga cttgtgttcg ttttattgcc tggagtattt tccatcccag 1140caaagtcagg ctcagtcgga cttgtgttcg ttttattgcc tggagtattt tccatcccag 1140
atgctgagaa caggaaacaa ttttgaaatg aatttcaggt ttgaagacgt tccatttcac 1200atgctgagaa caggaaacaa ttttgaaatg aatttcaggt ttgaagacgt tccatttcac 1200
tccatgtacg cccacagcca gtctctagac aggctcatga atcctttaat tgatcagtat 1260tccatgtacg cccacagcca gtctctagac aggctcatga atcctttaat tgatcagtat 1260
ctgtggagtc taaaacaaac aggaaacccg actggatcaa caggcctgag cggcagcggc 1320ctgtggagtc taaaacaaac aggaaacccg actggatcaa caggcctgag cggcagcggc 1320
gcccacatcg tgatggtgga cgcctacaag ccgacgaagg gcctgagcgg cagcggcacg 1380gcccacatcg tgatggtgga cgcctacaag ccgacgaagg gcctgagcgg cagcggcacg 1380
agagacttaa aatttatcaa gaacaaagtt cccaattttg cacattatgg aaaaaattgg 1440agagacttaa aatttatcaa gaacaaagtt cccaattttg cacattatgg aaaaaattgg 1440
cttcctggac cttttattag acaacagggg tggacaacac aaaatattaa taatagtgtt 1500cttcctggac cttttattag acaacagggg tggacaacac aaaatattaa taatagtgtt 1500
gttaatttta atgacatgct gggaaaaaat tcgacattta ctttggacac tagatggagt 1560gttaatttta atgacatgct gggaaaaaat tcgacattta ctttggacac tagatggagt 1560
tcattagcgc ctggtccgtg tatgggggat gacggacgaa ctccatccac caccaagttc 1620tcattagcgc ctggtccgtg tatgggggat gacggacgaa ctccatccac caccaagttc 1620
tcaaatgctc agctcatgtt tggatctgga acacaaccca ccgaaggcgg tgaagatgct 1680tcaaatgctc agctcatgtt tggatctgga acacaaccca ccgaaggcgg tgaagatgct 1680
gtacatatta catccgagtc ggaggtcaag gcaaccaacc caactgcaat cgatgaatac 1740gtacatatta catccgagtc ggaggtcaag gcaaccaacc caactgcaat cgatgaatac 1740
ggacgagtgg ccgataatac gcaaaatgca acaaccgccc caaccacagt gggaaatgct 1800ggacgagtgg ccgataatac gcaaaatgca acaaccgccc caaccacagt gggaaatgct 1800
gcaatggggg ccatgcctgg gatggtgtgg caagataggg atatctatct tcaaggaccc 1860gcaatggggg ccatgcctgg gatggtgtgg caagataggg atatctatct tcaaggaccc 1860
atctggggaa aaatacccca tacagacgga cattttcatc cgtctcctct catggggggg 1920atctggggaa aaatacccca tacagacgga cattttcatc cgtctcctct catggggggg 1920
tttggataca gaaaaccccc tccgcaaatt tttattaaaa acacccccgt tcctggaaat 1980tttggataca gaaaaccccc tccgcaaatt tttattaaaa acacccccgt tcctggaaat 1980
ccggcaacta cattttctcc aaatagaata aacaatttca ttactcaata ctcaacggga 2040ccggcaacta cattttctcc aaatagaata aacaatttca ttactcaata ctcaacggga 2040
caagtgaccg ttactattga ctgggagctg caaaaggaaa actcaaagag atggaaccca 2100caagtgaccg ttactattga ctgggagctg caaaaggaaa actcaaagag atggaaccca 2100
gaagtacaat ttacatcaaa ttttggcacg gtcgattcac taaactgggc accggacaac 2160gaagtacaat ttacatcaaa ttttggcacg gtcgattcac taaactgggc acggacaac 2160
gcgggaaact acaaagaacc aagggtgatt ggcaccagat acctgactcg tatactataa 2220gcgggaaact acaaagaacc aagggtgatt ggcaccagat acctgactcg tatactataa 2220
<210> 24<210> 24
<211> 739<211> 739
<212> БЕЛОК<212> PROTEIN
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Cap VP1 AAV2 VP2 VP3 вируса морского льва T434 линкер-6 SpyTag<223> Cap VP1 AAV2 VP2 VP3 Sea Lion Virus T434 Linker-6 SpyTag
<400> 24<400> 24
Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Thr Leu Ser Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Thr Leu Ser
1 5 10 15 1 5 10 15
Glu Gly Ile Arg Gln Trp Trp Lys Leu Lys Pro Gly Pro Pro Pro Pro Glu Gly Ile Arg Gln Trp Trp Lys Leu Lys Pro Gly Pro Pro Pro Pro
20 25 30 20 25 30
Lys Pro Ala Glu Arg His Lys Asp Asp Ser Arg Gly Leu Val Leu Pro Lys Pro Ala Glu Arg His Lys Asp Asp Ser Arg Gly Leu Val Leu Pro
35 40 45 35 40 45
Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro
50 55 60 50 55 60
Val Asn Glu Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp Val Asn Glu Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp
65 70 75 80 65 70 75 80
Arg Gln Leu Asp Ser Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala Arg Gln Leu Asp Ser Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala
85 90 95 85 90 95
Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Lys Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Lys Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly
100 105 110 100 105 110
Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro
115 120 125 115 120 125
Leu Gly Leu Val Glu Glu Pro Ser Gln Pro Asp Ser Ser Ser Asp Asn Leu Gly Leu Val Glu Glu Pro Ser Gln Pro Asp Ser Ser Ser Asp Asn
130 135 140 130 135 140
Thr Ala Pro Pro Val Lys Lys Ser Arg Leu Glu Glu Ala Gln Pro Ile Thr Ala Pro Pro Val Lys Lys Ser Arg Leu Glu Glu Ala Gln Pro Ile
145 150 155 160 145 150 155 160
Gln Ser Pro Asp Val Ser Ser Ser Thr Gly Gly Gly Ile Ala Asp Val Gln Ser Pro Asp Val Ser Ser Ser Thr Gly Gly Gly Ile Ala Asp Val
165 170 175 165 170 175
Met Ser Gly Asp Ala Glu Met Ala Ala Val Gly Gly Gly Ala Pro Gly Met Ser Gly Asp Ala Glu Met Ala Ala Val Gly Gly Gly Ala Pro Gly
180 185 190 180 185 190
Val Asp Gly Gln Gly Ala Glu Gly Val Gly Thr Ser Ser Gly Asn Trp Val Asp Gly Gln Gly Ala Glu Gly Val Gly Thr Ser Ser Gly Asn Trp
195 200 205 195 200 205
His Cys Asp Ser Gln Trp Ser Glu Gly His Val Arg Thr Thr Ser Thr His Cys Asp Ser Gln Trp Ser Glu Gly His Val Arg Thr Thr Ser Thr
210 215 220 210 215 220
Arg Thr Trp Val Leu Pro Ser Tyr Asn Asn His Leu Tyr Lys Arg Leu Arg Thr Trp Val Leu Pro Ser Tyr Asn Asn His Leu Tyr Lys Arg Leu
225 230 235 240 225 230 235 240
Gly Ser Ser Ala Gln Ser Asn Thr Tyr Asn Gly Phe Ser Thr Pro Trp Gly Ser Ser Ala Gln Ser Asn Thr Tyr Asn Gly Phe Ser Thr Pro Trp
245 250 255 245 250 255
Gly Tyr Leu Asp Phe Asn Arg Trp His Cys His Phe Ser Pro Arg Asn Gly Tyr Leu Asp Phe Asn Arg Trp His Cys His Phe Ser Pro Arg Asn
260 265 270 260 265 270
Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn Asn Trp Gly Ile Arg Pro Lys Arg Leu Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn Asn Trp Gly Ile Arg Pro Lys Arg Leu
275 280 285 275 280 285
Asn Val Lys Leu Phe Asn Ile Gln Val Lys Glu Val Thr Thr Glu Gly Asn Val Lys Leu Phe Asn Ile Gln Val Lys Glu Val Thr Thr Glu Gly
290 295 300 290 295 300
Gly Thr Thr Thr Val Ala Asn Asn Leu Thr Ser Thr Ile Gln Val Phe Gly Thr Thr Thr Val Ala Asn Asn Leu Thr Ser Thr Ile Gln Val Phe
305 310 315 320 305 310 315 320
Ala Asp Asn Ala Tyr Glu Leu Pro Tyr Val Val Asp Ala Gly His Glu Ala Asp Asn Ala Tyr Glu Leu Pro Tyr Val Val Asp Ala Gly His Glu
325 330 335 325 330 335
Gly Ala Leu Pro Pro Phe Pro Asn Asp Val Phe Met Ile Pro Gln Tyr Gly Ala Leu Pro Pro Phe Pro Asn Asp Val Phe Met Ile Pro Gln Tyr
340 345 350 340 345 350
Gly Tyr Cys Gly Leu Val Ser Gly Gln Ser Gln Ala Gln Ser Asp Leu Gly Tyr Cys Gly Leu Val Ser Gly Gln Ser Gln Ala Gln Ser Asp Leu
355 360 365 355 360 365
Cys Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe Pro Ser Gln Met Leu Arg Thr Cys Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe Pro Ser Gln Met Leu Arg Thr
370 375 380 370 375 380
Gly Asn Asn Phe Glu Met Asn Phe Arg Phe Glu Asp Val Pro Phe His Gly Asn Asn Phe Glu Met Asn Phe Arg Phe Glu Asp Val Pro Phe His
385 390 395 400 385 390 395 400
Ser Met Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu Asp Arg Leu Met Asn Pro Leu Ser Met Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu Asp Arg Leu Met Asn Pro Leu
405 410 415 405 410 415
Ile Asp Gln Tyr Leu Trp Ser Leu Lys Gln Thr Gly Asn Pro Thr Gly Ile Asp Gln Tyr Leu Trp Ser Leu Lys Gln Thr Gly Asn Pro Thr Gly
420 425 430 420 425 430
Ser Thr Gly Leu Ser Gly Ser Gly Ala His Ile Val Met Val Asp Ala Ser Thr Gly Leu Ser Gly Ser Gly Ala His Ile Val Met Val Asp Ala
435 440 445 435 440 445
Tyr Lys Pro Thr Lys Gly Leu Ser Gly Ser Gly Thr Arg Asp Leu Lys Tyr Lys Pro Thr Lys Gly Leu Ser Gly Ser Gly Thr Arg Asp Leu Lys
450 455 460 450 455 460
Phe Ile Lys Asn Lys Val Pro Asn Phe Ala His Tyr Gly Lys Asn Trp Phe Ile Lys Asn Lys Val Pro Asn Phe Ala His Tyr Gly Lys Asn Trp
465 470 475 480 465 470 475 480
Leu Pro Gly Pro Phe Ile Arg Gln Gln Gly Trp Thr Thr Gln Asn Ile Leu Pro Gly Pro Phe Ile Arg Gln Gln Gly Trp Thr Thr Gln Asn Ile
485 490 495 485 490 495
Asn Asn Ser Val Val Asn Phe Asn Asp Met Leu Gly Lys Asn Ser Thr Asn Asn Ser Val Val Asn Phe Asn Asp Met Leu Gly Lys Asn Ser Thr
500 505 510 500 505 510
Phe Thr Leu Asp Thr Arg Trp Ser Ser Leu Ala Pro Gly Pro Cys Met Phe Thr Leu Asp Thr Arg Trp Ser Ser Leu Ala Pro Gly Pro Cys Met
515 520 525 515 520 525
Gly Asp Asp Gly Arg Thr Pro Ser Thr Thr Lys Phe Ser Asn Ala Gln Gly Asp Asp Gly Arg Thr Pro Ser Thr Thr Lys Phe Ser Asn Ala Gln
530 535 540 530 535 540
Leu Met Phe Gly Ser Gly Thr Gln Pro Thr Glu Gly Gly Glu Asp Ala Leu Met Phe Gly Ser Gly Thr Gln Pro Thr Glu Gly Gly Glu Asp Ala
545 550 555 560 545 550 555 560
Val His Ile Thr Ser Glu Ser Glu Val Lys Ala Thr Asn Pro Thr Ala Val His Ile Thr Ser Glu Ser Glu Val Lys Ala Thr Asn Pro Thr Ala
565 570 575 565 570 575
Ile Asp Glu Tyr Gly Arg Val Ala Asp Asn Thr Gln Asn Ala Thr Thr Ile Asp Glu Tyr Gly Arg Val Ala Asp Asn Thr Gln Asn Ala Thr Thr
580 585 590 580 585 590
Ala Pro Thr Thr Val Gly Asn Ala Ala Met Gly Ala Met Pro Gly Met Ala Pro Thr Thr Val Gly Asn Ala Ala Met Gly Ala Met Pro Gly Met
595 600 605 595 600 605
Val Trp Gln Asp Arg Asp Ile Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Gly Lys Val Trp Gln Asp Arg Asp Ile Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Gly Lys
610 615 620 610 615 620
Ile Pro His Thr Asp Gly His Phe His Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Ile Pro His Thr Asp Gly His Phe His Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly
625 630 635 640 625 630 635 640
Phe Gly Tyr Arg Lys Pro Pro Pro Gln Ile Phe Ile Lys Asn Thr Pro Phe Gly Tyr Arg Lys Pro Pro Pro Gln Ile Phe Ile Lys Asn Thr Pro
645 650 655 645 650 655
Val Pro Gly Asn Pro Ala Thr Thr Phe Ser Pro Asn Arg Ile Asn Asn Val Pro Gly Asn Pro Ala Thr Thr Phe Ser Pro Asn Arg Ile Asn Asn
660 665 670 660 665 670
Phe Ile Thr Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val Thr Val Thr Ile Asp Trp Phe Ile Thr Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val Thr Val Thr Ile Asp Trp
675 680 685 675 680 685
Glu Leu Gln Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Val Gln Phe Glu Leu Gln Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Val Gln Phe
690 695 700 690 695 700
Thr Ser Asn Phe Gly Thr Val Asp Ser Leu Asn Trp Ala Pro Asp Asn Thr Ser Asn Phe Gly Thr Val Asp Ser Leu Asn Trp Ala Pro Asp Asn
705 710 715 720 705 710 715 720
Ala Gly Asn Tyr Lys Glu Pro Arg Val Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Ala Gly Asn Tyr Lys Glu Pro Arg Val Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr
725 730 735 725 730 735
Arg Ile Leu Arg Ile Leu
<210> 25<210> 25
<211> 2220<211> 2220
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Cap VP1 AAV2 VP2 VP3 вируса морского льва T435 линкер-6 SpyTag<223> Cap VP1 AAV2 VP2 VP3 Sea Lion Virus T435 Linker-6 SpyTag
<400> 25<400> 25
atggctgccg atggttatct tccagattgg ctcgaggaca ctctctctga aggaataaga 60atggctgccg atggttatct tccagattgg ctcgaggaca ctctctctga aggaataaga 60
cagtggtgga agctcaaacc tggcccacca ccaccaaagc ccgcagagcg gcataaggac 120cagtggtgga agctcaaacc tggcccacca ccaccaaagc ccgcagagcg gcataaggac 120
gacagcaggg gtcttgtgct tcctgggtac aagtacctcg gacccttcaa cggactcgac 180gacagcaggg gtcttgtgct tcctgggtac aagtacctcg gacccttcaa cggactcgac 180
aagggagagc cggtcaacga ggcagacgcc gcggccctcg agcacgacaa agcctacgac 240aagggagagc cggtcaacga ggcagacgcc gcggccctcg agcacgacaa agcctacgac 240
cggcagctcg acagcggaga caacccgtac ctcaagtaca accacgccga cgcggagttt 300cggcagctcg acagcggaga caacccgtac ctcaagtaca accacgccga cgcggagttt 300
caggagcgcc ttaaagaaga tacgtctttt gggggcaacc tcggacgagc agtcttccag 360caggagcgcc ttaaagaaga tacgtctttt gggggcaacc tcggacgagc agtcttccag 360
gcgaaaaaga gggttcttga acctctgggc ctggttgagg aaccctctca gccagattcg 420gcgaaaaaga gggttcttga acctctgggc ctggttgagg aaccctctca gccagattcg 420
tcctcggaca acacggcgcc acccgtgaaa aagtcccgtc tcgaagaagc ccagcccatt 480tcctcggaca acacggcgcc acccgtgaaa aagtcccgtc tcgaagaagc ccagcccatt 480
caaagtccag acgtttccag cagcactggc ggaggaattg ccgacgtcat gtctggagat 540caaagtccag acgtttccag cagcactggc ggaggaattg ccgacgtcat gtctggagat 540
gctgaaatgg ctgcagtggg cgggggagca ccgggcgtcg acggccaggg tgccgaggga 600gctgaaatgg ctgcagtggg cgggggagca ccgggcgtcg acggccaggg tgccgaggga 600
gtgggtactt cctcgggtaa ttggcattgc gattcccagt ggtcagaagg acacgtcaga 660gtgggtactt cctcgggtaa ttggcattgc gattcccagt ggtcagaagg acacgtcaga 660
accaccagca ccagaacctg ggtgttgccc agctacaaca accacctgta taaacggctt 720accaccagca ccagaacctg ggtgttgccc agctacaaca accacctgta taaacggctt 720
ggaagtagcg cacaatccaa tacctacaac ggattctcca ccccctgggg atacctcgac 780ggaagtagcg cacaatccaa tacctacaac ggattctcca ccccctgggg atacctcgac 780
ttcaatagat ggcactgtca cttcagtcct cggaactggc aacgtctcat caacaacaac 840ttcaatagat ggcactgtca cttcagtcct cggaactggc aacgtctcat caacaacaac 840
tggggcatca gaccaaaaag acttaatgtt aaattgttca acatacaagt caaagaggtc 900tggggcatca gaccaaaaag acttaatgtt aaattgttca acatacaagt caaagaggtc 900
acgacggaag gggggacgac gaccgtcgcc aataacctta ccagcacgat tcaggtgttt 960acgacggaag gggggacgac gaccgtcgcc aataacctta ccagcacgat tcaggtgttt 960
gcggacaacg cgtacgaact cccgtatgtt gtcgacgcgg gtcacgaggg ggcattgccg 1020gcggacaacg cgtacgaact cccgtatgtt gtcgacgcgg gtcacgaggg ggcattgccg 1020
ccgttcccaa acgacgtgtt tatgattccc caatacggat actgcgggct ggtgtctggt 1080ccgttcccaa acgacgtgtt tatgattccc caatacggat actgcgggct ggtgtctggt 1080
caaagtcagg ctcagtcgga cttgtgttcg ttttattgcc tggagtattt tccatcccag 1140caaagtcagg ctcagtcgga cttgtgttcg ttttattgcc tggagtattt tccatcccag 1140
atgctgagaa caggaaacaa ttttgaaatg aatttcaggt ttgaagacgt tccatttcac 1200atgctgagaa caggaaacaa ttttgaaatg aatttcaggt ttgaagacgt tccatttcac 1200
tccatgtacg cccacagcca gtctctagac aggctcatga atcctttaat tgatcagtat 1260tccatgtacg cccacagcca gtctctagac aggctcatga atcctttaat tgatcagtat 1260
ctgtggagtc taaaacaaac aggaaacccg actggatcaa caacgggcct gagcggcagc 1320ctgtggagtc taaaacaaac aggaaacccg actggatcaa caacgggcct gagcggcagc 1320
ggcgcccaca tcgtgatggt ggacgcctac aagccgacga agggcctgag cggcagcggc 1380ggcgcccaca tcgtgatggt ggacgcctac aagccgacga agggcctgag cggcagcggc 1380
agagacttaa aatttatcaa gaacaaagtt cccaattttg cacattatgg aaaaaattgg 1440agagacttaa aatttatcaa gaacaaagtt cccaattttg cacattatgg aaaaaattgg 1440
cttcctggac cttttattag acaacagggg tggacaacac aaaatattaa taatagtgtt 1500cttcctggac cttttattag acaacagggg tggacaacac aaaatattaa taatagtgtt 1500
gttaatttta atgacatgct gggaaaaaat tcgacattta ctttggacac tagatggagt 1560gttaatttta atgacatgct gggaaaaaat tcgacattta ctttggacac tagatggagt 1560
tcattagcgc ctggtccgtg tatgggggat gacggacgaa ctccatccac caccaagttc 1620tcattagcgc ctggtccgtg tatgggggat gacggacgaa ctccatccac caccaagttc 1620
tcaaatgctc agctcatgtt tggatctgga acacaaccca ccgaaggcgg tgaagatgct 1680tcaaatgctc agctcatgtt tggatctgga acacaaccca ccgaaggcgg tgaagatgct 1680
gtacatatta catccgagtc ggaggtcaag gcaaccaacc caactgcaat cgatgaatac 1740gtacatatta catccgagtc ggaggtcaag gcaaccaacc caactgcaat cgatgaatac 1740
ggacgagtgg ccgataatac gcaaaatgca acaaccgccc caaccacagt gggaaatgct 1800ggacgagtgg ccgataatac gcaaaatgca acaaccgccc caaccacagt gggaaatgct 1800
gcaatggggg ccatgcctgg gatggtgtgg caagataggg atatctatct tcaaggaccc 1860gcaatggggg ccatgcctgg gatggtgtgg caagataggg atatctatct tcaaggaccc 1860
atctggggaa aaatacccca tacagacgga cattttcatc cgtctcctct catggggggg 1920atctggggaa aaatacccca tacagacgga cattttcatc cgtctcctct catggggggg 1920
tttggataca gaaaaccccc tccgcaaatt tttattaaaa acacccccgt tcctggaaat 1980tttggataca gaaaaccccc tccgcaaatt tttattaaaa acacccccgt tcctggaaat 1980
ccggcaacta cattttctcc aaatagaata aacaatttca ttactcaata ctcaacggga 2040ccggcaacta cattttctcc aaatagaata aacaatttca ttactcaata ctcaacggga 2040
caagtgaccg ttactattga ctgggagctg caaaaggaaa actcaaagag atggaaccca 2100caagtgaccg ttactattga ctgggagctg caaaaggaaa actcaaagag atggaaccca 2100
gaagtacaat ttacatcaaa ttttggcacg gtcgattcac taaactgggc accggacaac 2160gaagtacaat ttacatcaaa ttttggcacg gtcgattcac taaactgggc acggacaac 2160
gcgggaaact acaaagaacc aagggtgatt ggcaccagat acctgactcg tatactataa 2220gcgggaaact acaaagaacc aagggtgatt ggcaccagat acctgactcg tatactataa 2220
<210> 26<210> 26
<211> 739<211> 739
<212> БЕЛОК<212> PROTEIN
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Cap VP1 AAV2 VP2 VP3 вируса морского льва T435 линкер-6 SpyTag<223> Cap VP1 AAV2 VP2 VP3 Sea Lion Virus T435 Linker-6 SpyTag
<400> 26<400> 26
Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Thr Leu Ser Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Thr Leu Ser
1 5 10 15 1 5 10 15
Glu Gly Ile Arg Gln Trp Trp Lys Leu Lys Pro Gly Pro Pro Pro Pro Glu Gly Ile Arg Gln Trp Trp Lys Leu Lys Pro Gly Pro Pro Pro Pro
20 25 30 20 25 30
Lys Pro Ala Glu Arg His Lys Asp Asp Ser Arg Gly Leu Val Leu Pro Lys Pro Ala Glu Arg His Lys Asp Asp Ser Arg Gly Leu Val Leu Pro
35 40 45 35 40 45
Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro
50 55 60 50 55 60
Val Asn Glu Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp Val Asn Glu Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp
65 70 75 80 65 70 75 80
Arg Gln Leu Asp Ser Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala Arg Gln Leu Asp Ser Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala
85 90 95 85 90 95
Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Lys Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Lys Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly
100 105 110 100 105 110
Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro
115 120 125 115 120 125
Leu Gly Leu Val Glu Glu Pro Ser Gln Pro Asp Ser Ser Ser Asp Asn Leu Gly Leu Val Glu Glu Pro Ser Gln Pro Asp Ser Ser Ser Asp Asn
130 135 140 130 135 140
Thr Ala Pro Pro Val Lys Lys Ser Arg Leu Glu Glu Ala Gln Pro Ile Thr Ala Pro Pro Val Lys Lys Ser Arg Leu Glu Glu Ala Gln Pro Ile
145 150 155 160 145 150 155 160
Gln Ser Pro Asp Val Ser Ser Ser Thr Gly Gly Gly Ile Ala Asp Val Gln Ser Pro Asp Val Ser Ser Ser Thr Gly Gly Gly Ile Ala Asp Val
165 170 175 165 170 175
Met Ser Gly Asp Ala Glu Met Ala Ala Val Gly Gly Gly Ala Pro Gly Met Ser Gly Asp Ala Glu Met Ala Ala Val Gly Gly Gly Ala Pro Gly
180 185 190 180 185 190
Val Asp Gly Gln Gly Ala Glu Gly Val Gly Thr Ser Ser Gly Asn Trp Val Asp Gly Gln Gly Ala Glu Gly Val Gly Thr Ser Ser Gly Asn Trp
195 200 205 195 200 205
His Cys Asp Ser Gln Trp Ser Glu Gly His Val Arg Thr Thr Ser Thr His Cys Asp Ser Gln Trp Ser Glu Gly His Val Arg Thr Thr Ser Thr
210 215 220 210 215 220
Arg Thr Trp Val Leu Pro Ser Tyr Asn Asn His Leu Tyr Lys Arg Leu Arg Thr Trp Val Leu Pro Ser Tyr Asn Asn His Leu Tyr Lys Arg Leu
225 230 235 240 225 230 235 240
Gly Ser Ser Ala Gln Ser Asn Thr Tyr Asn Gly Phe Ser Thr Pro Trp Gly Ser Ser Ala Gln Ser Asn Thr Tyr Asn Gly Phe Ser Thr Pro Trp
245 250 255 245 250 255
Gly Tyr Leu Asp Phe Asn Arg Trp His Cys His Phe Ser Pro Arg Asn Gly Tyr Leu Asp Phe Asn Arg Trp His Cys His Phe Ser Pro Arg Asn
260 265 270 260 265 270
Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn Asn Trp Gly Ile Arg Pro Lys Arg Leu Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn Asn Trp Gly Ile Arg Pro Lys Arg Leu
275 280 285 275 280 285
Asn Val Lys Leu Phe Asn Ile Gln Val Lys Glu Val Thr Thr Glu Gly Asn Val Lys Leu Phe Asn Ile Gln Val Lys Glu Val Thr Thr Glu Gly
290 295 300 290 295 300
Gly Thr Thr Thr Val Ala Asn Asn Leu Thr Ser Thr Ile Gln Val Phe Gly Thr Thr Thr Val Ala Asn Asn Leu Thr Ser Thr Ile Gln Val Phe
305 310 315 320 305 310 315 320
Ala Asp Asn Ala Tyr Glu Leu Pro Tyr Val Val Asp Ala Gly His Glu Ala Asp Asn Ala Tyr Glu Leu Pro Tyr Val Val Asp Ala Gly His Glu
325 330 335 325 330 335
Gly Ala Leu Pro Pro Phe Pro Asn Asp Val Phe Met Ile Pro Gln Tyr Gly Ala Leu Pro Pro Phe Pro Asn Asp Val Phe Met Ile Pro Gln Tyr
340 345 350 340 345 350
Gly Tyr Cys Gly Leu Val Ser Gly Gln Ser Gln Ala Gln Ser Asp Leu Gly Tyr Cys Gly Leu Val Ser Gly Gln Ser Gln Ala Gln Ser Asp Leu
355 360 365 355 360 365
Cys Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe Pro Ser Gln Met Leu Arg Thr Cys Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe Pro Ser Gln Met Leu Arg Thr
370 375 380 370 375 380
Gly Asn Asn Phe Glu Met Asn Phe Arg Phe Glu Asp Val Pro Phe His Gly Asn Asn Phe Glu Met Asn Phe Arg Phe Glu Asp Val Pro Phe His
385 390 395 400 385 390 395 400
Ser Met Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu Asp Arg Leu Met Asn Pro Leu Ser Met Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu Asp Arg Leu Met Asn Pro Leu
405 410 415 405 410 415
Ile Asp Gln Tyr Leu Trp Ser Leu Lys Gln Thr Gly Asn Pro Thr Gly Ile Asp Gln Tyr Leu Trp Ser Leu Lys Gln Thr Gly Asn Pro Thr Gly
420 425 430 420 425 430
Ser Thr Thr Gly Leu Ser Gly Ser Gly Ala His Ile Val Met Val Asp Ser Thr Thr Gly Leu Ser Gly Ser Gly Ala His Ile Val Met Val Asp
435 440 445 435 440 445
Ala Tyr Lys Pro Thr Lys Gly Leu Ser Gly Ser Gly Arg Asp Leu Lys Ala Tyr Lys Pro Thr Lys Gly Leu Ser Gly Ser Gly Arg Asp Leu Lys
450 455 460 450 455 460
Phe Ile Lys Asn Lys Val Pro Asn Phe Ala His Tyr Gly Lys Asn Trp Phe Ile Lys Asn Lys Val Pro Asn Phe Ala His Tyr Gly Lys Asn Trp
465 470 475 480 465 470 475 480
Leu Pro Gly Pro Phe Ile Arg Gln Gln Gly Trp Thr Thr Gln Asn Ile Leu Pro Gly Pro Phe Ile Arg Gln Gln Gly Trp Thr Thr Gln Asn Ile
485 490 495 485 490 495
Asn Asn Ser Val Val Asn Phe Asn Asp Met Leu Gly Lys Asn Ser Thr Asn Asn Ser Val Val Asn Phe Asn Asp Met Leu Gly Lys Asn Ser Thr
500 505 510 500 505 510
Phe Thr Leu Asp Thr Arg Trp Ser Ser Leu Ala Pro Gly Pro Cys Met Phe Thr Leu Asp Thr Arg Trp Ser Ser Leu Ala Pro Gly Pro Cys Met
515 520 525 515 520 525
Gly Asp Asp Gly Arg Thr Pro Ser Thr Thr Lys Phe Ser Asn Ala Gln Gly Asp Asp Gly Arg Thr Pro Ser Thr Thr Lys Phe Ser Asn Ala Gln
530 535 540 530 535 540
Leu Met Phe Gly Ser Gly Thr Gln Pro Thr Glu Gly Gly Glu Asp Ala Leu Met Phe Gly Ser Gly Thr Gln Pro Thr Glu Gly Gly Glu Asp Ala
545 550 555 560 545 550 555 560
Val His Ile Thr Ser Glu Ser Glu Val Lys Ala Thr Asn Pro Thr Ala Val His Ile Thr Ser Glu Ser Glu Val Lys Ala Thr Asn Pro Thr Ala
565 570 575 565 570 575
Ile Asp Glu Tyr Gly Arg Val Ala Asp Asn Thr Gln Asn Ala Thr Thr Ile Asp Glu Tyr Gly Arg Val Ala Asp Asn Thr Gln Asn Ala Thr Thr
580 585 590 580 585 590
Ala Pro Thr Thr Val Gly Asn Ala Ala Met Gly Ala Met Pro Gly Met Ala Pro Thr Thr Val Gly Asn Ala Ala Met Gly Ala Met Pro Gly Met
595 600 605 595 600 605
Val Trp Gln Asp Arg Asp Ile Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Gly Lys Val Trp Gln Asp Arg Asp Ile Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Gly Lys
610 615 620 610 615 620
Ile Pro His Thr Asp Gly His Phe His Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Ile Pro His Thr Asp Gly His Phe His Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly
625 630 635 640 625 630 635 640
Phe Gly Tyr Arg Lys Pro Pro Pro Gln Ile Phe Ile Lys Asn Thr Pro Phe Gly Tyr Arg Lys Pro Pro Pro Gln Ile Phe Ile Lys Asn Thr Pro
645 650 655 645 650 655
Val Pro Gly Asn Pro Ala Thr Thr Phe Ser Pro Asn Arg Ile Asn Asn Val Pro Gly Asn Pro Ala Thr Thr Phe Ser Pro Asn Arg Ile Asn Asn
660 665 670 660 665 670
Phe Ile Thr Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val Thr Val Thr Ile Asp Trp Phe Ile Thr Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val Thr Val Thr Ile Asp Trp
675 680 685 675 680 685
Glu Leu Gln Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Val Gln Phe Glu Leu Gln Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Val Gln Phe
690 695 700 690 695 700
Thr Ser Asn Phe Gly Thr Val Asp Ser Leu Asn Trp Ala Pro Asp Asn Thr Ser Asn Phe Gly Thr Val Asp Ser Leu Asn Trp Ala Pro Asp Asn
705 710 715 720 705 710 715 720
Ala Gly Asn Tyr Lys Glu Pro Arg Val Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Ala Gly Asn Tyr Lys Glu Pro Arg Val Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr
725 730 735 725 730 735
Arg Ile Leu Arg Ile Leu
<210> 27<210> 27
<211> 2220<211> 2220
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Cap VP1 AAV2 VP2 VP3 вируса морского льва R436 линкер-6 SpyTag<223> Cap VP1 AAV2 VP2 VP3 Sea Lion Virus R436 Linker-6 SpyTag
<400> 27<400> 27
atggctgccg atggttatct tccagattgg ctcgaggaca ctctctctga aggaataaga 60atggctgccg atggttatct tccagattgg ctcgaggaca ctctctctga aggaataaga 60
cagtggtgga agctcaaacc tggcccacca ccaccaaagc ccgcagagcg gcataaggac 120cagtggtgga agctcaaacc tggcccacca ccaccaaagc ccgcagagcg gcataaggac 120
gacagcaggg gtcttgtgct tcctgggtac aagtacctcg gacccttcaa cggactcgac 180gacagcaggg gtcttgtgct tcctgggtac aagtacctcg gacccttcaa cggactcgac 180
aagggagagc cggtcaacga ggcagacgcc gcggccctcg agcacgacaa agcctacgac 240aagggagagc cggtcaacga ggcagacgcc gcggccctcg agcacgacaa agcctacgac 240
cggcagctcg acagcggaga caacccgtac ctcaagtaca accacgccga cgcggagttt 300cggcagctcg acagcggaga caacccgtac ctcaagtaca accacgccga cgcggagttt 300
caggagcgcc ttaaagaaga tacgtctttt gggggcaacc tcggacgagc agtcttccag 360caggagcgcc ttaaagaaga tacgtctttt gggggcaacc tcggacgagc agtcttccag 360
gcgaaaaaga gggttcttga acctctgggc ctggttgagg aaccctctca gccagattcg 420gcgaaaaaga gggttcttga acctctgggc ctggttgagg aaccctctca gccagattcg 420
tcctcggaca acacggcgcc acccgtgaaa aagtcccgtc tcgaagaagc ccagcccatt 480tcctcggaca acacggcgcc acccgtgaaa aagtcccgtc tcgaagaagc ccagcccatt 480
caaagtccag acgtttccag cagcactggc ggaggaattg ccgacgtcat gtctggagat 540caaagtccag acgtttccag cagcactggc ggaggaattg ccgacgtcat gtctggagat 540
gctgaaatgg ctgcagtggg cgggggagca ccgggcgtcg acggccaggg tgccgaggga 600gctgaaatgg ctgcagtggg cgggggagca ccgggcgtcg acggccaggg tgccgaggga 600
gtgggtactt cctcgggtaa ttggcattgc gattcccagt ggtcagaagg acacgtcaga 660gtgggtactt cctcgggtaa ttggcattgc gattcccagt ggtcagaagg acacgtcaga 660
accaccagca ccagaacctg ggtgttgccc agctacaaca accacctgta taaacggctt 720accaccagca ccagaacctg ggtgttgccc agctacaaca accacctgta taaacggctt 720
ggaagtagcg cacaatccaa tacctacaac ggattctcca ccccctgggg atacctcgac 780ggaagtagcg cacaatccaa tacctacaac ggattctcca ccccctgggg atacctcgac 780
ttcaatagat ggcactgtca cttcagtcct cggaactggc aacgtctcat caacaacaac 840ttcaatagat ggcactgtca cttcagtcct cggaactggc aacgtctcat caacaacaac 840
tggggcatca gaccaaaaag acttaatgtt aaattgttca acatacaagt caaagaggtc 900tggggcatca gaccaaaaag acttaatgtt aaattgttca acatacaagt caaagaggtc 900
acgacggaag gggggacgac gaccgtcgcc aataacctta ccagcacgat tcaggtgttt 960acgacggaag gggggacgac gaccgtcgcc aataacctta ccagcacgat tcaggtgttt 960
gcggacaacg cgtacgaact cccgtatgtt gtcgacgcgg gtcacgaggg ggcattgccg 1020gcggacaacg cgtacgaact cccgtatgtt gtcgacgcgg gtcacgaggg ggcattgccg 1020
ccgttcccaa acgacgtgtt tatgattccc caatacggat actgcgggct ggtgtctggt 1080ccgttcccaa acgacgtgtt tatgattccc caatacggat actgcgggct ggtgtctggt 1080
caaagtcagg ctcagtcgga cttgtgttcg ttttattgcc tggagtattt tccatcccag 1140caaagtcagg ctcagtcgga cttgtgttcg ttttattgcc tggagtattt tccatcccag 1140
atgctgagaa caggaaacaa ttttgaaatg aatttcaggt ttgaagacgt tccatttcac 1200atgctgagaa caggaaacaa ttttgaaatg aatttcaggt ttgaagacgt tccatttcac 1200
tccatgtacg cccacagcca gtctctagac aggctcatga atcctttaat tgatcagtat 1260tccatgtacg cccacagcca gtctctagac aggctcatga atcctttaat tgatcagtat 1260
ctgtggagtc taaaacaaac aggaaacccg actggatcaa caacgagagg cctgagcggc 1320ctgtggagtc taaaacaaac aggaaacccg actggatcaa caacgagagg cctgagcggc 1320
agcggcgccc acatcgtgat ggtggacgcc tacaagccga cgaagggcct gagcggcagc 1380agcggcgccc acatcgtgat ggtggacgcc tacaagccga cgaagggcct gagcggcagc 1380
ggcgacttaa aatttatcaa gaacaaagtt cccaattttg cacattatgg aaaaaattgg 1440ggcgacttaa aatttatcaa gaacaaagtt cccaattttg cacattatgg aaaaaattgg 1440
cttcctggac cttttattag acaacagggg tggacaacac aaaatattaa taatagtgtt 1500cttcctggac cttttattag acaacagggg tggacaacac aaaatattaa taatagtgtt 1500
gttaatttta atgacatgct gggaaaaaat tcgacattta ctttggacac tagatggagt 1560gttaatttta atgacatgct gggaaaaaat tcgacattta ctttggacac tagatggagt 1560
tcattagcgc ctggtccgtg tatgggggat gacggacgaa ctccatccac caccaagttc 1620tcattagcgc ctggtccgtg tatgggggat gacggacgaa ctccatccac caccaagttc 1620
tcaaatgctc agctcatgtt tggatctgga acacaaccca ccgaaggcgg tgaagatgct 1680tcaaatgctc agctcatgtt tggatctgga acacaaccca ccgaaggcgg tgaagatgct 1680
gtacatatta catccgagtc ggaggtcaag gcaaccaacc caactgcaat cgatgaatac 1740gtacatatta catccgagtc ggaggtcaag gcaaccaacc caactgcaat cgatgaatac 1740
ggacgagtgg ccgataatac gcaaaatgca acaaccgccc caaccacagt gggaaatgct 1800ggacgagtgg ccgataatac gcaaaatgca acaaccgccc caaccacagt gggaaatgct 1800
gcaatggggg ccatgcctgg gatggtgtgg caagataggg atatctatct tcaaggaccc 1860gcaatggggg ccatgcctgg gatggtgtgg caagataggg atatctatct tcaaggaccc 1860
atctggggaa aaatacccca tacagacgga cattttcatc cgtctcctct catggggggg 1920atctggggaa aaatacccca tacagacgga cattttcatc cgtctcctct catggggggg 1920
tttggataca gaaaaccccc tccgcaaatt tttattaaaa acacccccgt tcctggaaat 1980tttggataca gaaaaccccc tccgcaaatt tttattaaaa acacccccgt tcctggaaat 1980
ccggcaacta cattttctcc aaatagaata aacaatttca ttactcaata ctcaacggga 2040ccggcaacta cattttctcc aaatagaata aacaatttca ttactcaata ctcaacggga 2040
caagtgaccg ttactattga ctgggagctg caaaaggaaa actcaaagag atggaaccca 2100caagtgaccg ttactattga ctgggagctg caaaaggaaa actcaaagag atggaaccca 2100
gaagtacaat ttacatcaaa ttttggcacg gtcgattcac taaactgggc accggacaac 2160gaagtacaat ttacatcaaa ttttggcacg gtcgattcac taaactgggc acggacaac 2160
gcgggaaact acaaagaacc aagggtgatt ggcaccagat acctgactcg tatactataa 2220gcgggaaact acaaagaacc aagggtgatt ggcaccagat acctgactcg tatactataa 2220
<210> 28<210> 28
<211> 739<211> 739
<212> БЕЛОК<212> PROTEIN
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Cap VP1 AAV2 VP2 VP3 вируса морского льва R436 линкер-6 SpyTag<223> Cap VP1 AAV2 VP2 VP3 Sea Lion Virus R436 Linker-6 SpyTag
<400> 28<400> 28
Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Thr Leu Ser Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Thr Leu Ser
1 5 10 15 1 5 10 15
Glu Gly Ile Arg Gln Trp Trp Lys Leu Lys Pro Gly Pro Pro Pro Pro Glu Gly Ile Arg Gln Trp Trp Lys Leu Lys Pro Gly Pro Pro Pro Pro
20 25 30 20 25 30
Lys Pro Ala Glu Arg His Lys Asp Asp Ser Arg Gly Leu Val Leu Pro Lys Pro Ala Glu Arg His Lys Asp Asp Ser Arg Gly Leu Val Leu Pro
35 40 45 35 40 45
Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro
50 55 60 50 55 60
Val Asn Glu Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp Val Asn Glu Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp
65 70 75 80 65 70 75 80
Arg Gln Leu Asp Ser Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala Arg Gln Leu Asp Ser Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala
85 90 95 85 90 95
Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Lys Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Lys Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly
100 105 110 100 105 110
Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro
115 120 125 115 120 125
Leu Gly Leu Val Glu Glu Pro Ser Gln Pro Asp Ser Ser Ser Asp Asn Leu Gly Leu Val Glu Glu Pro Ser Gln Pro Asp Ser Ser Ser Asp Asn
130 135 140 130 135 140
Thr Ala Pro Pro Val Lys Lys Ser Arg Leu Glu Glu Ala Gln Pro Ile Thr Ala Pro Pro Val Lys Lys Ser Arg Leu Glu Glu Ala Gln Pro Ile
145 150 155 160 145 150 155 160
Gln Ser Pro Asp Val Ser Ser Ser Thr Gly Gly Gly Ile Ala Asp Val Gln Ser Pro Asp Val Ser Ser Ser Thr Gly Gly Gly Ile Ala Asp Val
165 170 175 165 170 175
Met Ser Gly Asp Ala Glu Met Ala Ala Val Gly Gly Gly Ala Pro Gly Met Ser Gly Asp Ala Glu Met Ala Ala Val Gly Gly Gly Ala Pro Gly
180 185 190 180 185 190
Val Asp Gly Gln Gly Ala Glu Gly Val Gly Thr Ser Ser Gly Asn Trp Val Asp Gly Gln Gly Ala Glu Gly Val Gly Thr Ser Ser Gly Asn Trp
195 200 205 195 200 205
His Cys Asp Ser Gln Trp Ser Glu Gly His Val Arg Thr Thr Ser Thr His Cys Asp Ser Gln Trp Ser Glu Gly His Val Arg Thr Thr Ser Thr
210 215 220 210 215 220
Arg Thr Trp Val Leu Pro Ser Tyr Asn Asn His Leu Tyr Lys Arg Leu Arg Thr Trp Val Leu Pro Ser Tyr Asn Asn His Leu Tyr Lys Arg Leu
225 230 235 240 225 230 235 240
Gly Ser Ser Ala Gln Ser Asn Thr Tyr Asn Gly Phe Ser Thr Pro Trp Gly Ser Ser Ala Gln Ser Asn Thr Tyr Asn Gly Phe Ser Thr Pro Trp
245 250 255 245 250 255
Gly Tyr Leu Asp Phe Asn Arg Trp His Cys His Phe Ser Pro Arg Asn Gly Tyr Leu Asp Phe Asn Arg Trp His Cys His Phe Ser Pro Arg Asn
260 265 270 260 265 270
Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn Asn Trp Gly Ile Arg Pro Lys Arg Leu Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn Asn Trp Gly Ile Arg Pro Lys Arg Leu
275 280 285 275 280 285
Asn Val Lys Leu Phe Asn Ile Gln Val Lys Glu Val Thr Thr Glu Gly Asn Val Lys Leu Phe Asn Ile Gln Val Lys Glu Val Thr Thr Glu Gly
290 295 300 290 295 300
Gly Thr Thr Thr Val Ala Asn Asn Leu Thr Ser Thr Ile Gln Val Phe Gly Thr Thr Thr Val Ala Asn Asn Leu Thr Ser Thr Ile Gln Val Phe
305 310 315 320 305 310 315 320
Ala Asp Asn Ala Tyr Glu Leu Pro Tyr Val Val Asp Ala Gly His Glu Ala Asp Asn Ala Tyr Glu Leu Pro Tyr Val Val Asp Ala Gly His Glu
325 330 335 325 330 335
Gly Ala Leu Pro Pro Phe Pro Asn Asp Val Phe Met Ile Pro Gln Tyr Gly Ala Leu Pro Pro Phe Pro Asn Asp Val Phe Met Ile Pro Gln Tyr
340 345 350 340 345 350
Gly Tyr Cys Gly Leu Val Ser Gly Gln Ser Gln Ala Gln Ser Asp Leu Gly Tyr Cys Gly Leu Val Ser Gly Gln Ser Gln Ala Gln Ser Asp Leu
355 360 365 355 360 365
Cys Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe Pro Ser Gln Met Leu Arg Thr Cys Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe Pro Ser Gln Met Leu Arg Thr
370 375 380 370 375 380
Gly Asn Asn Phe Glu Met Asn Phe Arg Phe Glu Asp Val Pro Phe His Gly Asn Asn Phe Glu Met Asn Phe Arg Phe Glu Asp Val Pro Phe His
385 390 395 400 385 390 395 400
Ser Met Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu Asp Arg Leu Met Asn Pro Leu Ser Met Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu Asp Arg Leu Met Asn Pro Leu
405 410 415 405 410 415
Ile Asp Gln Tyr Leu Trp Ser Leu Lys Gln Thr Gly Asn Pro Thr Gly Ile Asp Gln Tyr Leu Trp Ser Leu Lys Gln Thr Gly Asn Pro Thr Gly
420 425 430 420 425 430
Ser Thr Thr Arg Gly Leu Ser Gly Ser Gly Ala His Ile Val Met Val Ser Thr Thr Arg Gly Leu Ser Gly Ser Gly Ala His Ile Val Met Val
435 440 445 435 440 445
Asp Ala Tyr Lys Pro Thr Lys Gly Leu Ser Gly Ser Gly Asp Leu Lys Asp Ala Tyr Lys Pro Thr Lys Gly Leu Ser Gly Ser Gly Asp Leu Lys
450 455 460 450 455 460
Phe Ile Lys Asn Lys Val Pro Asn Phe Ala His Tyr Gly Lys Asn Trp Phe Ile Lys Asn Lys Val Pro Asn Phe Ala His Tyr Gly Lys Asn Trp
465 470 475 480 465 470 475 480
Leu Pro Gly Pro Phe Ile Arg Gln Gln Gly Trp Thr Thr Gln Asn Ile Leu Pro Gly Pro Phe Ile Arg Gln Gln Gly Trp Thr Thr Gln Asn Ile
485 490 495 485 490 495
Asn Asn Ser Val Val Asn Phe Asn Asp Met Leu Gly Lys Asn Ser Thr Asn Asn Ser Val Val Asn Phe Asn Asp Met Leu Gly Lys Asn Ser Thr
500 505 510 500 505 510
Phe Thr Leu Asp Thr Arg Trp Ser Ser Leu Ala Pro Gly Pro Cys Met Phe Thr Leu Asp Thr Arg Trp Ser Ser Leu Ala Pro Gly Pro Cys Met
515 520 525 515 520 525
Gly Asp Asp Gly Arg Thr Pro Ser Thr Thr Lys Phe Ser Asn Ala Gln Gly Asp Asp Gly Arg Thr Pro Ser Thr Thr Lys Phe Ser Asn Ala Gln
530 535 540 530 535 540
Leu Met Phe Gly Ser Gly Thr Gln Pro Thr Glu Gly Gly Glu Asp Ala Leu Met Phe Gly Ser Gly Thr Gln Pro Thr Glu Gly Gly Glu Asp Ala
545 550 555 560 545 550 555 560
Val His Ile Thr Ser Glu Ser Glu Val Lys Ala Thr Asn Pro Thr Ala Val His Ile Thr Ser Glu Ser Glu Val Lys Ala Thr Asn Pro Thr Ala
565 570 575 565 570 575
Ile Asp Glu Tyr Gly Arg Val Ala Asp Asn Thr Gln Asn Ala Thr Thr Ile Asp Glu Tyr Gly Arg Val Ala Asp Asn Thr Gln Asn Ala Thr Thr
580 585 590 580 585 590
Ala Pro Thr Thr Val Gly Asn Ala Ala Met Gly Ala Met Pro Gly Met Ala Pro Thr Thr Val Gly Asn Ala Ala Met Gly Ala Met Pro Gly Met
595 600 605 595 600 605
Val Trp Gln Asp Arg Asp Ile Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Gly Lys Val Trp Gln Asp Arg Asp Ile Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Gly Lys
610 615 620 610 615 620
Ile Pro His Thr Asp Gly His Phe His Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Ile Pro His Thr Asp Gly His Phe His Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly
625 630 635 640 625 630 635 640
Phe Gly Tyr Arg Lys Pro Pro Pro Gln Ile Phe Ile Lys Asn Thr Pro Phe Gly Tyr Arg Lys Pro Pro Pro Gln Ile Phe Ile Lys Asn Thr Pro
645 650 655 645 650 655
Val Pro Gly Asn Pro Ala Thr Thr Phe Ser Pro Asn Arg Ile Asn Asn Val Pro Gly Asn Pro Ala Thr Thr Phe Ser Pro Asn Arg Ile Asn Asn
660 665 670 660 665 670
Phe Ile Thr Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val Thr Val Thr Ile Asp Trp Phe Ile Thr Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val Thr Val Thr Ile Asp Trp
675 680 685 675 680 685
Glu Leu Gln Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Val Gln Phe Glu Leu Gln Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Val Gln Phe
690 695 700 690 695 700
Thr Ser Asn Phe Gly Thr Val Asp Ser Leu Asn Trp Ala Pro Asp Asn Thr Ser Asn Phe Gly Thr Val Asp Ser Leu Asn Trp Ala Pro Asp Asn
705 710 715 720 705 710 715 720
Ala Gly Asn Tyr Lys Glu Pro Arg Val Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Ala Gly Asn Tyr Lys Glu Pro Arg Val Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr
725 730 735 725 730 735
Arg Ile Leu Arg Ile Leu
<210> 29<210> 29
<211> 2220<211> 2220
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Cap VP1 AAV2 VP2 VP3 вируса морского льва D437 линкер-6 SpyTag<223> Cap VP1 AAV2 VP2 VP3 sea lion virus D437 linker-6 SpyTag
<400> 29<400> 29
atggctgccg atggttatct tccagattgg ctcgaggaca ctctctctga aggaataaga 60atggctgccg atggttatct tccagattgg ctcgaggaca ctctctctga aggaataaga 60
cagtggtgga agctcaaacc tggcccacca ccaccaaagc ccgcagagcg gcataaggac 120cagtggtgga agctcaaacc tggcccacca ccaccaaagc ccgcagagcg gcataaggac 120
gacagcaggg gtcttgtgct tcctgggtac aagtacctcg gacccttcaa cggactcgac 180gacagcaggg gtcttgtgct tcctgggtac aagtacctcg gacccttcaa cggactcgac 180
aagggagagc cggtcaacga ggcagacgcc gcggccctcg agcacgacaa agcctacgac 240aagggagagc cggtcaacga ggcagacgcc gcggccctcg agcacgacaa agcctacgac 240
cggcagctcg acagcggaga caacccgtac ctcaagtaca accacgccga cgcggagttt 300cggcagctcg acagcggaga caacccgtac ctcaagtaca accacgccga cgcggagttt 300
caggagcgcc ttaaagaaga tacgtctttt gggggcaacc tcggacgagc agtcttccag 360caggagcgcc ttaaagaaga tacgtctttt gggggcaacc tcggacgagc agtcttccag 360
gcgaaaaaga gggttcttga acctctgggc ctggttgagg aaccctctca gccagattcg 420gcgaaaaaga gggttcttga acctctgggc ctggttgagg aaccctctca gccagattcg 420
tcctcggaca acacggcgcc acccgtgaaa aagtcccgtc tcgaagaagc ccagcccatt 480tcctcggaca acacggcgcc acccgtgaaa aagtcccgtc tcgaagaagc ccagcccatt 480
caaagtccag acgtttccag cagcactggc ggaggaattg ccgacgtcat gtctggagat 540caaagtccag acgtttccag cagcactggc ggaggaattg ccgacgtcat gtctggagat 540
gctgaaatgg ctgcagtggg cgggggagca ccgggcgtcg acggccaggg tgccgaggga 600gctgaaatgg ctgcagtggg cgggggagca ccgggcgtcg acggccaggg tgccgaggga 600
gtgggtactt cctcgggtaa ttggcattgc gattcccagt ggtcagaagg acacgtcaga 660gtgggtactt cctcgggtaa ttggcattgc gattcccagt ggtcagaagg acacgtcaga 660
accaccagca ccagaacctg ggtgttgccc agctacaaca accacctgta taaacggctt 720accaccagca ccagaacctg ggtgttgccc agctacaaca accacctgta taaacggctt 720
ggaagtagcg cacaatccaa tacctacaac ggattctcca ccccctgggg atacctcgac 780ggaagtagcg cacaatccaa tacctacaac ggattctcca ccccctgggg atacctcgac 780
ttcaatagat ggcactgtca cttcagtcct cggaactggc aacgtctcat caacaacaac 840ttcaatagat ggcactgtca cttcagtcct cggaactggc aacgtctcat caacaacaac 840
tggggcatca gaccaaaaag acttaatgtt aaattgttca acatacaagt caaagaggtc 900tggggcatca gaccaaaaag acttaatgtt aaattgttca acatacaagt caaagaggtc 900
acgacggaag gggggacgac gaccgtcgcc aataacctta ccagcacgat tcaggtgttt 960acgacggaag gggggacgac gaccgtcgcc aataacctta ccagcacgat tcaggtgttt 960
gcggacaacg cgtacgaact cccgtatgtt gtcgacgcgg gtcacgaggg ggcattgccg 1020gcggacaacg cgtacgaact cccgtatgtt gtcgacgcgg gtcacgaggg ggcattgccg 1020
ccgttcccaa acgacgtgtt tatgattccc caatacggat actgcgggct ggtgtctggt 1080ccgttcccaa acgacgtgtt tatgattccc caatacggat actgcgggct ggtgtctggt 1080
caaagtcagg ctcagtcgga cttgtgttcg ttttattgcc tggagtattt tccatcccag 1140caaagtcagg ctcagtcgga cttgtgttcg ttttattgcc tggagtattt tccatcccag 1140
atgctgagaa caggaaacaa ttttgaaatg aatttcaggt ttgaagacgt tccatttcac 1200atgctgagaa caggaaacaa ttttgaaatg aatttcaggt ttgaagacgt tccatttcac 1200
tccatgtacg cccacagcca gtctctagac aggctcatga atcctttaat tgatcagtat 1260tccatgtacg cccacagcca gtctctagac aggctcatga atcctttaat tgatcagtat 1260
ctgtggagtc taaaacaaac aggaaacccg actggatcaa caacgagaga cggcctgagc 1320ctgtggagtc taaaacaaac aggaaacccg actggatcaa caacgagaga cggcctgagc 1320
ggcagcggcg cccacatcgt gatggtggac gcctacaagc cgacgaaggg cctgagcggc 1380ggcagcggcg cccacatcgt gatggtggac gcctacaagc cgacgaaggg cctgagcggc 1380
agcggcttaa aatttatcaa gaacaaagtt cccaattttg cacattatgg aaaaaattgg 1440agcggcttaa aatttatcaa gaacaaagtt cccaattttg cacattatgg aaaaaattgg 1440
cttcctggac cttttattag acaacagggg tggacaacac aaaatattaa taatagtgtt 1500cttcctggac cttttattag acaacagggg tggacaacac aaaatattaa taatagtgtt 1500
gttaatttta atgacatgct gggaaaaaat tcgacattta ctttggacac tagatggagt 1560gttaatttta atgacatgct gggaaaaaat tcgacattta ctttggacac tagatggagt 1560
tcattagcgc ctggtccgtg tatgggggat gacggacgaa ctccatccac caccaagttc 1620tcattagcgc ctggtccgtg tatgggggat gacggacgaa ctccatccac caccaagttc 1620
tcaaatgctc agctcatgtt tggatctgga acacaaccca ccgaaggcgg tgaagatgct 1680tcaaatgctc agctcatgtt tggatctgga acacaaccca ccgaaggcgg tgaagatgct 1680
gtacatatta catccgagtc ggaggtcaag gcaaccaacc caactgcaat cgatgaatac 1740gtacatatta catccgagtc ggaggtcaag gcaaccaacc caactgcaat cgatgaatac 1740
ggacgagtgg ccgataatac gcaaaatgca acaaccgccc caaccacagt gggaaatgct 1800ggacgagtgg ccgataatac gcaaaatgca acaaccgccc caaccacagt gggaaatgct 1800
gcaatggggg ccatgcctgg gatggtgtgg caagataggg atatctatct tcaaggaccc 1860gcaatggggg ccatgcctgg gatggtgtgg caagataggg atatctatct tcaaggaccc 1860
atctggggaa aaatacccca tacagacgga cattttcatc cgtctcctct catggggggg 1920atctggggaa aaatacccca tacagacgga cattttcatc cgtctcctct catggggggg 1920
tttggataca gaaaaccccc tccgcaaatt tttattaaaa acacccccgt tcctggaaat 1980tttggataca gaaaaccccc tccgcaaatt tttattaaaa acacccccgt tcctggaaat 1980
ccggcaacta cattttctcc aaatagaata aacaatttca ttactcaata ctcaacggga 2040ccggcaacta cattttctcc aaatagaata aacaatttca ttactcaata ctcaacggga 2040
caagtgaccg ttactattga ctgggagctg caaaaggaaa actcaaagag atggaaccca 2100caagtgaccg ttactattga ctgggagctg caaaaggaaa actcaaagag atggaaccca 2100
gaagtacaat ttacatcaaa ttttggcacg gtcgattcac taaactgggc accggacaac 2160gaagtacaat ttacatcaaa ttttggcacg gtcgattcac taaactgggc acggacaac 2160
gcgggaaact acaaagaacc aagggtgatt ggcaccagat acctgactcg tatactataa 2220gcgggaaact acaaagaacc aagggtgatt ggcaccagat acctgactcg tatactataa 2220
<210> 30<210> 30
<211> 739<211> 739
<212> БЕЛОК<212> PROTEIN
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Cap VP1 AAV2 VP2 VP3 вируса морского льва D437 линкер-6 SpyTag<223> Cap VP1 AAV2 VP2 VP3 sea lion virus D437 linker-6 SpyTag
<400> 30<400> 30
Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Thr Leu Ser Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Thr Leu Ser
1 5 10 15 1 5 10 15
Glu Gly Ile Arg Gln Trp Trp Lys Leu Lys Pro Gly Pro Pro Pro Pro Glu Gly Ile Arg Gln Trp Trp Lys Leu Lys Pro Gly Pro Pro Pro Pro
20 25 30 20 25 30
Lys Pro Ala Glu Arg His Lys Asp Asp Ser Arg Gly Leu Val Leu Pro Lys Pro Ala Glu Arg His Lys Asp Asp Ser Arg Gly Leu Val Leu Pro
35 40 45 35 40 45
Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro
50 55 60 50 55 60
Val Asn Glu Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp Val Asn Glu Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp
65 70 75 80 65 70 75 80
Arg Gln Leu Asp Ser Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala Arg Gln Leu Asp Ser Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala
85 90 95 85 90 95
Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Lys Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Lys Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly
100 105 110 100 105 110
Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro
115 120 125 115 120 125
Leu Gly Leu Val Glu Glu Pro Ser Gln Pro Asp Ser Ser Ser Asp Asn Leu Gly Leu Val Glu Glu Pro Ser Gln Pro Asp Ser Ser Ser Asp Asn
130 135 140 130 135 140
Thr Ala Pro Pro Val Lys Lys Ser Arg Leu Glu Glu Ala Gln Pro Ile Thr Ala Pro Pro Val Lys Lys Ser Arg Leu Glu Glu Ala Gln Pro Ile
145 150 155 160 145 150 155 160
Gln Ser Pro Asp Val Ser Ser Ser Thr Gly Gly Gly Ile Ala Asp Val Gln Ser Pro Asp Val Ser Ser Ser Thr Gly Gly Gly Ile Ala Asp Val
165 170 175 165 170 175
Met Ser Gly Asp Ala Glu Met Ala Ala Val Gly Gly Gly Ala Pro Gly Met Ser Gly Asp Ala Glu Met Ala Ala Val Gly Gly Gly Ala Pro Gly
180 185 190 180 185 190
Val Asp Gly Gln Gly Ala Glu Gly Val Gly Thr Ser Ser Gly Asn Trp Val Asp Gly Gln Gly Ala Glu Gly Val Gly Thr Ser Ser Gly Asn Trp
195 200 205 195 200 205
His Cys Asp Ser Gln Trp Ser Glu Gly His Val Arg Thr Thr Ser Thr His Cys Asp Ser Gln Trp Ser Glu Gly His Val Arg Thr Thr Ser Thr
210 215 220 210 215 220
Arg Thr Trp Val Leu Pro Ser Tyr Asn Asn His Leu Tyr Lys Arg Leu Arg Thr Trp Val Leu Pro Ser Tyr Asn Asn His Leu Tyr Lys Arg Leu
225 230 235 240 225 230 235 240
Gly Ser Ser Ala Gln Ser Asn Thr Tyr Asn Gly Phe Ser Thr Pro Trp Gly Ser Ser Ala Gln Ser Asn Thr Tyr Asn Gly Phe Ser Thr Pro Trp
245 250 255 245 250 255
Gly Tyr Leu Asp Phe Asn Arg Trp His Cys His Phe Ser Pro Arg Asn Gly Tyr Leu Asp Phe Asn Arg Trp His Cys His Phe Ser Pro Arg Asn
260 265 270 260 265 270
Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn Asn Trp Gly Ile Arg Pro Lys Arg Leu Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn Asn Trp Gly Ile Arg Pro Lys Arg Leu
275 280 285 275 280 285
Asn Val Lys Leu Phe Asn Ile Gln Val Lys Glu Val Thr Thr Glu Gly Asn Val Lys Leu Phe Asn Ile Gln Val Lys Glu Val Thr Thr Glu Gly
290 295 300 290 295 300
Gly Thr Thr Thr Val Ala Asn Asn Leu Thr Ser Thr Ile Gln Val Phe Gly Thr Thr Thr Val Ala Asn Asn Leu Thr Ser Thr Ile Gln Val Phe
305 310 315 320 305 310 315 320
Ala Asp Asn Ala Tyr Glu Leu Pro Tyr Val Val Asp Ala Gly His Glu Ala Asp Asn Ala Tyr Glu Leu Pro Tyr Val Val Asp Ala Gly His Glu
325 330 335 325 330 335
Gly Ala Leu Pro Pro Phe Pro Asn Asp Val Phe Met Ile Pro Gln Tyr Gly Ala Leu Pro Pro Phe Pro Asn Asp Val Phe Met Ile Pro Gln Tyr
340 345 350 340 345 350
Gly Tyr Cys Gly Leu Val Ser Gly Gln Ser Gln Ala Gln Ser Asp Leu Gly Tyr Cys Gly Leu Val Ser Gly Gln Ser Gln Ala Gln Ser Asp Leu
355 360 365 355 360 365
Cys Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe Pro Ser Gln Met Leu Arg Thr Cys Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe Pro Ser Gln Met Leu Arg Thr
370 375 380 370 375 380
Gly Asn Asn Phe Glu Met Asn Phe Arg Phe Glu Asp Val Pro Phe His Gly Asn Asn Phe Glu Met Asn Phe Arg Phe Glu Asp Val Pro Phe His
385 390 395 400 385 390 395 400
Ser Met Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu Asp Arg Leu Met Asn Pro Leu Ser Met Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu Asp Arg Leu Met Asn Pro Leu
405 410 415 405 410 415
Ile Asp Gln Tyr Leu Trp Ser Leu Lys Gln Thr Gly Asn Pro Thr Gly Ile Asp Gln Tyr Leu Trp Ser Leu Lys Gln Thr Gly Asn Pro Thr Gly
420 425 430 420 425 430
Ser Thr Thr Arg Asp Gly Leu Ser Gly Ser Gly Ala His Ile Val Met Ser Thr Thr Arg Asp Gly Leu Ser Gly Ser Gly Ala His Ile Val Met
435 440 445 435 440 445
Val Asp Ala Tyr Lys Pro Thr Lys Gly Leu Ser Gly Ser Gly Leu Lys Val Asp Ala Tyr Lys Pro Thr Lys Gly Leu Ser Gly Ser Gly Leu Lys
450 455 460 450 455 460
Phe Ile Lys Asn Lys Val Pro Asn Phe Ala His Tyr Gly Lys Asn Trp Phe Ile Lys Asn Lys Val Pro Asn Phe Ala His Tyr Gly Lys Asn Trp
465 470 475 480 465 470 475 480
Leu Pro Gly Pro Phe Ile Arg Gln Gln Gly Trp Thr Thr Gln Asn Ile Leu Pro Gly Pro Phe Ile Arg Gln Gln Gly Trp Thr Thr Gln Asn Ile
485 490 495 485 490 495
Asn Asn Ser Val Val Asn Phe Asn Asp Met Leu Gly Lys Asn Ser Thr Asn Asn Ser Val Val Asn Phe Asn Asp Met Leu Gly Lys Asn Ser Thr
500 505 510 500 505 510
Phe Thr Leu Asp Thr Arg Trp Ser Ser Leu Ala Pro Gly Pro Cys Met Phe Thr Leu Asp Thr Arg Trp Ser Ser Leu Ala Pro Gly Pro Cys Met
515 520 525 515 520 525
Gly Asp Asp Gly Arg Thr Pro Ser Thr Thr Lys Phe Ser Asn Ala Gln Gly Asp Asp Gly Arg Thr Pro Ser Thr Thr Lys Phe Ser Asn Ala Gln
530 535 540 530 535 540
Leu Met Phe Gly Ser Gly Thr Gln Pro Thr Glu Gly Gly Glu Asp Ala Leu Met Phe Gly Ser Gly Thr Gln Pro Thr Glu Gly Gly Glu Asp Ala
545 550 555 560 545 550 555 560
Val His Ile Thr Ser Glu Ser Glu Val Lys Ala Thr Asn Pro Thr Ala Val His Ile Thr Ser Glu Ser Glu Val Lys Ala Thr Asn Pro Thr Ala
565 570 575 565 570 575
Ile Asp Glu Tyr Gly Arg Val Ala Asp Asn Thr Gln Asn Ala Thr Thr Ile Asp Glu Tyr Gly Arg Val Ala Asp Asn Thr Gln Asn Ala Thr Thr
580 585 590 580 585 590
Ala Pro Thr Thr Val Gly Asn Ala Ala Met Gly Ala Met Pro Gly Met Ala Pro Thr Thr Val Gly Asn Ala Ala Met Gly Ala Met Pro Gly Met
595 600 605 595 600 605
Val Trp Gln Asp Arg Asp Ile Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Gly Lys Val Trp Gln Asp Arg Asp Ile Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Gly Lys
610 615 620 610 615 620
Ile Pro His Thr Asp Gly His Phe His Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Ile Pro His Thr Asp Gly His Phe His Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly
625 630 635 640 625 630 635 640
Phe Gly Tyr Arg Lys Pro Pro Pro Gln Ile Phe Ile Lys Asn Thr Pro Phe Gly Tyr Arg Lys Pro Pro Pro Gln Ile Phe Ile Lys Asn Thr Pro
645 650 655 645 650 655
Val Pro Gly Asn Pro Ala Thr Thr Phe Ser Pro Asn Arg Ile Asn Asn Val Pro Gly Asn Pro Ala Thr Thr Phe Ser Pro Asn Arg Ile Asn Asn
660 665 670 660 665 670
Phe Ile Thr Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val Thr Val Thr Ile Asp Trp Phe Ile Thr Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val Thr Val Thr Ile Asp Trp
675 680 685 675 680 685
Glu Leu Gln Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Val Gln Phe Glu Leu Gln Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Val Gln Phe
690 695 700 690 695 700
Thr Ser Asn Phe Gly Thr Val Asp Ser Leu Asn Trp Ala Pro Asp Asn Thr Ser Asn Phe Gly Thr Val Asp Ser Leu Asn Trp Ala Pro Asp Asn
705 710 715 720 705 710 715 720
Ala Gly Asn Tyr Lys Glu Pro Arg Val Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Ala Gly Asn Tyr Lys Glu Pro Arg Val Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr
725 730 735 725 730 735
Arg Ile Leu Arg Ile Leu
<210> 31<210> 31
<211> 2244<211> 2244
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Cap VP1 AAV2 VP2 VP3 вируса морского льва G432 линкер-10 SpyTag<223> Cap VP1 AAV2 VP2 VP3 sea lion virus G432 linker-10 SpyTag
<400> 31<400> 31
atggctgccg atggttatct tccagattgg ctcgaggaca ctctctctga aggaataaga 60atggctgccg atggttatct tccagattgg ctcgaggaca ctctctctga aggaataaga 60
cagtggtgga agctcaaacc tggcccacca ccaccaaagc ccgcagagcg gcataaggac 120cagtggtgga agctcaaacc tggcccacca ccaccaaagc ccgcagagcg gcataaggac 120
gacagcaggg gtcttgtgct tcctgggtac aagtacctcg gacccttcaa cggactcgac 180gacagcaggg gtcttgtgct tcctgggtac aagtacctcg gacccttcaa cggactcgac 180
aagggagagc cggtcaacga ggcagacgcc gcggccctcg agcacgacaa agcctacgac 240aagggagagc cggtcaacga ggcagacgcc gcggccctcg agcacgacaa agcctacgac 240
cggcagctcg acagcggaga caacccgtac ctcaagtaca accacgccga cgcggagttt 300cggcagctcg acagcggaga caacccgtac ctcaagtaca accacgccga cgcggagttt 300
caggagcgcc ttaaagaaga tacgtctttt gggggcaacc tcggacgagc agtcttccag 360caggagcgcc ttaaagaaga tacgtctttt gggggcaacc tcggacgagc agtcttccag 360
gcgaaaaaga gggttcttga acctctgggc ctggttgagg aaccctctca gccagattcg 420gcgaaaaaga gggttcttga acctctgggc ctggttgagg aaccctctca gccagattcg 420
tcctcggaca acacggcgcc acccgtgaaa aagtcccgtc tcgaagaagc ccagcccatt 480tcctcggaca acacggcgcc acccgtgaaa aagtcccgtc tcgaagaagc ccagcccatt 480
caaagtccag acgtttccag cagcactggc ggaggaattg ccgacgtcat gtctggagat 540caaagtccag acgtttccag cagcactggc ggaggaattg ccgacgtcat gtctggagat 540
gctgaaatgg ctgcagtggg cgggggagca ccgggcgtcg acggccaggg tgccgaggga 600gctgaaatgg ctgcagtggg cgggggagca ccgggcgtcg acggccaggg tgccgaggga 600
gtgggtactt cctcgggtaa ttggcattgc gattcccagt ggtcagaagg acacgtcaga 660gtgggtactt cctcgggtaa ttggcattgc gattcccagt ggtcagaagg acacgtcaga 660
accaccagca ccagaacctg ggtgttgccc agctacaaca accacctgta taaacggctt 720accaccagca ccagaacctg ggtgttgccc agctacaaca accacctgta taaacggctt 720
ggaagtagcg cacaatccaa tacctacaac ggattctcca ccccctgggg atacctcgac 780ggaagtagcg cacaatccaa tacctacaac ggattctcca ccccctgggg atacctcgac 780
ttcaatagat ggcactgtca cttcagtcct cggaactggc aacgtctcat caacaacaac 840ttcaatagat ggcactgtca cttcagtcct cggaactggc aacgtctcat caacaacaac 840
tggggcatca gaccaaaaag acttaatgtt aaattgttca acatacaagt caaagaggtc 900tggggcatca gaccaaaaag acttaatgtt aaattgttca acatacaagt caaagaggtc 900
acgacggaag gggggacgac gaccgtcgcc aataacctta ccagcacgat tcaggtgttt 960acgacggaag gggggacgac gaccgtcgcc aataacctta ccagcacgat tcaggtgttt 960
gcggacaacg cgtacgaact cccgtatgtt gtcgacgcgg gtcacgaggg ggcattgccg 1020gcggacaacg cgtacgaact cccgtatgtt gtcgacgcgg gtcacgaggg ggcattgccg 1020
ccgttcccaa acgacgtgtt tatgattccc caatacggat actgcgggct ggtgtctggt 1080ccgttcccaa acgacgtgtt tatgattccc caatacggat actgcgggct ggtgtctggt 1080
caaagtcagg ctcagtcgga cttgtgttcg ttttattgcc tggagtattt tccatcccag 1140caaagtcagg ctcagtcgga cttgtgttcg ttttattgcc tggagtattt tccatcccag 1140
atgctgagaa caggaaacaa ttttgaaatg aatttcaggt ttgaagacgt tccatttcac 1200atgctgagaa caggaaacaa ttttgaaatg aatttcaggt ttgaagacgt tccatttcac 1200
tccatgtacg cccacagcca gtctctagac aggctcatga atcctttaat tgatcagtat 1260tccatgtacg cccacagcca gtctctagac aggctcatga atcctttaat tgatcagtat 1260
ctgtggagtc taaaacaaac aggaaacccg actggaggcc tggggagcgg cggaggcctg 1320ctgtggagtc taaaacaaac aggaaacccg actggaggcc tggggagcgg cggaggcctg 1320
agcggcgccc acatcgtgat ggtggacgcc tacaagccga cgaagggcct gagcggcggc 1380agcggcgccc acatcgtgat ggtggacgcc tacaagccga cgaagggcct gagcggcggc 1380
agcggcctgg ggggctcaac aacgagagac ttaaaattta tcaagaacaa agttcccaat 1440agcggcctgg ggggctcaac aacgagagac ttaaaattta tcaagaacaa agttcccaat 1440
tttgcacatt atggaaaaaa ttggcttcct ggacctttta ttagacaaca ggggtggaca 1500tttgcacatt atggaaaaaa ttggcttcct ggacctttta ttagacaaca ggggtggaca 1500
acacaaaata ttaataatag tgttgttaat tttaatgaca tgctgggaaa aaattcgaca 1560acacaaaata ttaataatag tgttgttaat tttaatgaca tgctgggaaa aaattcgaca 1560
tttactttgg acactagatg gagttcatta gcgcctggtc cgtgtatggg ggatgacgga 1620tttactttgg acactagatg gagttcatta gcgcctggtc cgtgtatggg ggatgacgga 1620
cgaactccat ccaccaccaa gttctcaaat gctcagctca tgtttggatc tggaacacaa 1680cgaactccat ccaccaccaa gttctcaaat gctcagctca tgtttggatc tggaacacaa 1680
cccaccgaag gcggtgaaga tgctgtacat attacatccg agtcggaggt caaggcaacc 1740cccaccgaag gcggtgaaga tgctgtacat attacatccg agtcggaggt caaggcaacc 1740
aacccaactg caatcgatga atacggacga gtggccgata atacgcaaaa tgcaacaacc 1800aacccaactg caatcgatga atacggacga gtggccgata atacgcaaaa tgcaacaacc 1800
gccccaacca cagtgggaaa tgctgcaatg ggggccatgc ctgggatggt gtggcaagat 1860gccccaacca cagtgggaaa tgctgcaatg ggggccatgc ctgggatggt gtggcaagat 1860
agggatatct atcttcaagg acccatctgg ggaaaaatac cccatacaga cggacatttt 1920agggatatct atcttcaagg acccatctgg ggaaaaatac cccatacaga cggacatttt 1920
catccgtctc ctctcatggg ggggtttgga tacagaaaac cccctccgca aatttttatt 1980catccgtctc ctctcatggg ggggtttgga tacagaaaac cccctccgca aatttttatt 1980
aaaaacaccc ccgttcctgg aaatccggca actacatttt ctccaaatag aataaacaat 2040aaaaacaccc ccgttcctgg aaatccggca actacatttt ctccaaatag aataaacaat 2040
ttcattactc aatactcaac gggacaagtg accgttacta ttgactggga gctgcaaaag 2100ttcattactc aatactcaac gggacaagtg accgttacta ttgactggga gctgcaaaag 2100
gaaaactcaa agagatggaa cccagaagta caatttacat caaattttgg cacggtcgat 2160gaaaactcaa agagatggaa cccagaagta caatttacat caaattttgg cacggtcgat 2160
tcactaaact gggcaccgga caacgcggga aactacaaag aaccaagggt gattggcacc 2220tcactaaact gggcaccgga caacgcggga aactacaaag aaccaagggt gattggcacc 2220
agatacctga ctcgtatact ataa 2244agatacctga ctcgtatact ataa 2244
<210> 32<210> 32
<211> 747<211> 747
<212> БЕЛОК<212> PROTEIN
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Cap VP1 AAV2 VP2 VP3 вируса морского льва G432 линкер-10 SpyTag<223> Cap VP1 AAV2 VP2 VP3 sea lion virus G432 linker-10 SpyTag
<400> 32<400> 32
Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Thr Leu Ser Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Thr Leu Ser
1 5 10 15 1 5 10 15
Glu Gly Ile Arg Gln Trp Trp Lys Leu Lys Pro Gly Pro Pro Pro Pro Glu Gly Ile Arg Gln Trp Trp Lys Leu Lys Pro Gly Pro Pro Pro Pro
20 25 30 20 25 30
Lys Pro Ala Glu Arg His Lys Asp Asp Ser Arg Gly Leu Val Leu Pro Lys Pro Ala Glu Arg His Lys Asp Asp Ser Arg Gly Leu Val Leu Pro
35 40 45 35 40 45
Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro
50 55 60 50 55 60
Val Asn Glu Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp Val Asn Glu Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp
65 70 75 80 65 70 75 80
Arg Gln Leu Asp Ser Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala Arg Gln Leu Asp Ser Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala
85 90 95 85 90 95
Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Lys Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Lys Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly
100 105 110 100 105 110
Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro
115 120 125 115 120 125
Leu Gly Leu Val Glu Glu Pro Ser Gln Pro Asp Ser Ser Ser Asp Asn Leu Gly Leu Val Glu Glu Pro Ser Gln Pro Asp Ser Ser Ser Asp Asn
130 135 140 130 135 140
Thr Ala Pro Pro Val Lys Lys Ser Arg Leu Glu Glu Ala Gln Pro Ile Thr Ala Pro Pro Val Lys Lys Ser Arg Leu Glu Glu Ala Gln Pro Ile
145 150 155 160 145 150 155 160
Gln Ser Pro Asp Val Ser Ser Ser Thr Gly Gly Gly Ile Ala Asp Val Gln Ser Pro Asp Val Ser Ser Ser Thr Gly Gly Gly Ile Ala Asp Val
165 170 175 165 170 175
Met Ser Gly Asp Ala Glu Met Ala Ala Val Gly Gly Gly Ala Pro Gly Met Ser Gly Asp Ala Glu Met Ala Ala Val Gly Gly Gly Ala Pro Gly
180 185 190 180 185 190
Val Asp Gly Gln Gly Ala Glu Gly Val Gly Thr Ser Ser Gly Asn Trp Val Asp Gly Gln Gly Ala Glu Gly Val Gly Thr Ser Ser Gly Asn Trp
195 200 205 195 200 205
His Cys Asp Ser Gln Trp Ser Glu Gly His Val Arg Thr Thr Ser Thr His Cys Asp Ser Gln Trp Ser Glu Gly His Val Arg Thr Thr Ser Thr
210 215 220 210 215 220
Arg Thr Trp Val Leu Pro Ser Tyr Asn Asn His Leu Tyr Lys Arg Leu Arg Thr Trp Val Leu Pro Ser Tyr Asn Asn His Leu Tyr Lys Arg Leu
225 230 235 240 225 230 235 240
Gly Ser Ser Ala Gln Ser Asn Thr Tyr Asn Gly Phe Ser Thr Pro Trp Gly Ser Ser Ala Gln Ser Asn Thr Tyr Asn Gly Phe Ser Thr Pro Trp
245 250 255 245 250 255
Gly Tyr Leu Asp Phe Asn Arg Trp His Cys His Phe Ser Pro Arg Asn Gly Tyr Leu Asp Phe Asn Arg Trp His Cys His Phe Ser Pro Arg Asn
260 265 270 260 265 270
Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn Asn Trp Gly Ile Arg Pro Lys Arg Leu Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn Asn Trp Gly Ile Arg Pro Lys Arg Leu
275 280 285 275 280 285
Asn Val Lys Leu Phe Asn Ile Gln Val Lys Glu Val Thr Thr Glu Gly Asn Val Lys Leu Phe Asn Ile Gln Val Lys Glu Val Thr Thr Glu Gly
290 295 300 290 295 300
Gly Thr Thr Thr Val Ala Asn Asn Leu Thr Ser Thr Ile Gln Val Phe Gly Thr Thr Thr Val Ala Asn Asn Leu Thr Ser Thr Ile Gln Val Phe
305 310 315 320 305 310 315 320
Ala Asp Asn Ala Tyr Glu Leu Pro Tyr Val Val Asp Ala Gly His Glu Ala Asp Asn Ala Tyr Glu Leu Pro Tyr Val Val Asp Ala Gly His Glu
325 330 335 325 330 335
Gly Ala Leu Pro Pro Phe Pro Asn Asp Val Phe Met Ile Pro Gln Tyr Gly Ala Leu Pro Pro Phe Pro Asn Asp Val Phe Met Ile Pro Gln Tyr
340 345 350 340 345 350
Gly Tyr Cys Gly Leu Val Ser Gly Gln Ser Gln Ala Gln Ser Asp Leu Gly Tyr Cys Gly Leu Val Ser Gly Gln Ser Gln Ala Gln Ser Asp Leu
355 360 365 355 360 365
Cys Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe Pro Ser Gln Met Leu Arg Thr Cys Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe Pro Ser Gln Met Leu Arg Thr
370 375 380 370 375 380
Gly Asn Asn Phe Glu Met Asn Phe Arg Phe Glu Asp Val Pro Phe His Gly Asn Asn Phe Glu Met Asn Phe Arg Phe Glu Asp Val Pro Phe His
385 390 395 400 385 390 395 400
Ser Met Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu Asp Arg Leu Met Asn Pro Leu Ser Met Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu Asp Arg Leu Met Asn Pro Leu
405 410 415 405 410 415
Ile Asp Gln Tyr Leu Trp Ser Leu Lys Gln Thr Gly Asn Pro Thr Gly Ile Asp Gln Tyr Leu Trp Ser Leu Lys Gln Thr Gly Asn Pro Thr Gly
420 425 430 420 425 430
Gly Leu Gly Ser Gly Gly Gly Leu Ser Gly Ala His Ile Val Met Val Gly Leu Gly Ser Gly Gly Gly Leu Ser Gly Ala His Ile Val Met Val
435 440 445 435 440 445
Asp Ala Tyr Lys Pro Thr Lys Gly Leu Ser Gly Gly Ser Gly Leu Gly Asp Ala Tyr Lys Pro Thr Lys Gly Leu Ser Gly Gly Ser Gly Leu Gly
450 455 460 450 455 460
Gly Ser Thr Thr Arg Asp Leu Lys Phe Ile Lys Asn Lys Val Pro Asn Gly Ser Thr Thr Arg Asp Leu Lys Phe Ile Lys Asn Lys Val Pro Asn
465 470 475 480 465 470 475 480
Phe Ala His Tyr Gly Lys Asn Trp Leu Pro Gly Pro Phe Ile Arg Gln Phe Ala His Tyr Gly Lys Asn Trp Leu Pro Gly Pro Phe Ile Arg Gln
485 490 495 485 490 495
Gln Gly Trp Thr Thr Gln Asn Ile Asn Asn Ser Val Val Asn Phe Asn Gln Gly Trp Thr Thr Gln Asn Ile Asn Asn Ser Val Val Asn Phe Asn
500 505 510 500 505 510
Asp Met Leu Gly Lys Asn Ser Thr Phe Thr Leu Asp Thr Arg Trp Ser Asp Met Leu Gly Lys Asn Ser Thr Phe Thr Leu Asp Thr Arg Trp Ser
515 520 525 515 520 525
Ser Leu Ala Pro Gly Pro Cys Met Gly Asp Asp Gly Arg Thr Pro Ser Ser Leu Ala Pro Gly Pro Cys Met Gly Asp Asp Gly Arg Thr Pro Ser
530 535 540 530 535 540
Thr Thr Lys Phe Ser Asn Ala Gln Leu Met Phe Gly Ser Gly Thr Gln Thr Thr Lys Phe Ser Asn Ala Gln Leu Met Phe Gly Ser Gly Thr Gln
545 550 555 560 545 550 555 560
Pro Thr Glu Gly Gly Glu Asp Ala Val His Ile Thr Ser Glu Ser Glu Pro Thr Glu Gly Gly Glu Asp Ala Val His Ile Thr Ser Glu Ser Glu
565 570 575 565 570 575
Val Lys Ala Thr Asn Pro Thr Ala Ile Asp Glu Tyr Gly Arg Val Ala Val Lys Ala Thr Asn Pro Thr Ala Ile Asp Glu Tyr Gly Arg Val Ala
580 585 590 580 585 590
Asp Asn Thr Gln Asn Ala Thr Thr Ala Pro Thr Thr Val Gly Asn Ala Asp Asn Thr Gln Asn Ala Thr Thr Ala Pro Thr Thr Val Gly Asn Ala
595 600 605 595 600 605
Ala Met Gly Ala Met Pro Gly Met Val Trp Gln Asp Arg Asp Ile Tyr Ala Met Gly Ala Met Pro Gly Met Val Trp Gln Asp Arg Asp Ile Tyr
610 615 620 610 615 620
Leu Gln Gly Pro Ile Trp Gly Lys Ile Pro His Thr Asp Gly His Phe Leu Gln Gly Pro Ile Trp Gly Lys Ile Pro His Thr Asp Gly His Phe
625 630 635 640 625 630 635 640
His Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe Gly Tyr Arg Lys Pro Pro Pro His Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe Gly Tyr Arg Lys Pro Pro Pro
645 650 655 645 650 655
Gln Ile Phe Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro Gly Asn Pro Ala Thr Thr Gln Ile Phe Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro Gly Asn Pro Ala Thr Thr
660 665 670 660 665 670
Phe Ser Pro Asn Arg Ile Asn Asn Phe Ile Thr Gln Tyr Ser Thr Gly Phe Ser Pro Asn Arg Ile Asn Asn Phe Ile Thr Gln Tyr Ser Thr Gly
675 680 685 675 680 685
Gln Val Thr Val Thr Ile Asp Trp Glu Leu Gln Lys Glu Asn Ser Lys Gln Val Thr Val Thr Ile Asp Trp Glu Leu Gln Lys Glu Asn Ser Lys
690 695 700 690 695 700
Arg Trp Asn Pro Glu Val Gln Phe Thr Ser Asn Phe Gly Thr Val Asp Arg Trp Asn Pro Glu Val Gln Phe Thr Ser Asn Phe Gly Thr Val Asp
705 710 715 720 705 710 715 720
Ser Leu Asn Trp Ala Pro Asp Asn Ala Gly Asn Tyr Lys Glu Pro Arg Ser Leu Asn Trp Ala Pro Asp Asn Ala Gly Asn Tyr Lys Glu Pro Arg
725 730 735 725 730 735
Val Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg Ile Leu Val Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg Ile Leu
740 745 740 745
<210> 33<210> 33
<211> 2262<211> 2262
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Cap VP1 AAV2 VP2 VP3 агамы G436 линкер-6 SpyTag<223> Cap VP1 AAV2 VP2 VP3 agamas G436 linker-6 SpyTag
<400> 33<400> 33
atggctgccg atggttatct tccagattgg ctcgaggaca ctctctctga aggaataaga 60atggctgccg atggttatct tccagattgg ctcgaggaca ctctctctga aggaataaga 60
cagtggtgga agctcaaacc tggcccacca ccaccaaagc ccgcagagcg gcataaggac 120cagtggtgga agctcaaacc tggcccacca ccaccaaagc ccgcagagcg gcataaggac 120
gacagcaggg gtcttgtgct tcctgggtac aagtacctcg gacccttcaa cggactcgac 180gacagcaggg gtcttgtgct tcctgggtac aagtacctcg gacccttcaa cggactcgac 180
aagggagagc cggtcaacga ggcagacgcc gcggccctcg agcacgacaa agcctacgac 240aagggagagc cggtcaacga ggcagacgcc gcggccctcg agcacgacaa agcctacgac 240
cggcagctcg acagcggaga caacccgtac ctcaagtaca accacgccga cgcggagttt 300cggcagctcg acagcggaga caacccgtac ctcaagtaca accacgccga cgcggagttt 300
caggagcgcc ttaaagaaga tacgtctttt gggggcaacc tcggacgagc agtcttccag 360caggagcgcc ttaaagaaga tacgtctttt gggggcaacc tcggacgagc agtcttccag 360
gcgaaaaaga gggttcttga acctctgggc ctggttgagg aacctgttaa gacggccgaa 420gcgaaaaaga gggttcttga acctctgggc ctggttgagg aacctgttaa gacggccgaa 420
aagcgaaaga cacccgaaga gtggttagct caagaaaaga ctccaaccaa acaaaggttc 480aagcgaaaga cacccgaaga gtggttagct caagaaaaga ctccaaccaa acaaaggttc 480
cagataccag ctccaggaca atctggatca gattctcctt ccacctcagg atccggcggt 540cagataccag ctccaggaca atctggatca gattctcctt ccacctcagg atccggcggt 540
actgcaggct ccagttctag cgcatcaaat acaatggctc aaggaggtgg cggaccaatg 600actgcaggct ccagttctag cgcatcaaat acaatggctc aaggaggtgg cggaccaatg 600
gcagacgata accaaggcgc cgagggagtg ggtaatgcct cgggagattg gcattgcgat 660gcagacgata accaaggcgc cgagggagtg ggtaatgcct cgggagattg gcattgcgat 660
acccaatggc tgggcgacca cgtcattaca aaatctacca gaacttgggt tctgccctct 720acccaatggc tgggcgacca cgtcattaca aaatctacca gaacttgggt tctgccctct 720
tacgggaatc atctctactc gcccatcaac tttgatggaa ccacagggaa cggaacccaa 780tacgggaatc atctctactc gcccatcaac tttgatggaa ccacagggaa cggaacccaa 780
gccgcttact gcggatacgc taccccctgg gcctactttg actttaaccg attccactgc 840gccgcttact gcggatacgc taccccctgg gcctactttg actttaaccg attccactgc 840
cacttttccc cccgagactg gcaaagactc attaacaacc ataccggaat acgaccagtc 900cacttttccc cccgagactg gcaaagactc attaacaacc ataccggaat acgaccagtc 900
ggactcaaat tcaagctgtt caacatccag gtcaaggaaa tcacagtaca agattcgacc 960ggactcaaat tcaagctgtt caacatccag gtcaaggaaa tcacagtaca agattcgacc 960
aaaacgatcg ccaacaatct caccagcacc gtacaggtct ttgcggacac ggagcaccag 1020aaaacgatcg ccaacaatct caccagcacc gtacaggtct ttgcggacac ggagcaccag 1020
ctcccgtacg tattaggaaa tgccacgcag ggcacgtttc ctccctttcc ggctgaagtc 1080ctcccgtacg tattaggaaa tgccacgcag ggcacgtttc ctccctttcc ggctgaagtc 1080
tttcagttgc ctcagtacgg ctactgtacc atccaaggcc ctcagggtaa gtttaccgac 1140tttcagttgc ctcagtacgg ctactgtacc atccaaggcc ctcagggtaa gtttaccgac 1140
agaagtgcct tctactgctt ggagtacttt ccttccaaga tgctgagaac ggggaataac 1200agaagtgcct tctactgctt ggagtacttt ccttccaaga tgctgagaac ggggaataac 1200
tttgaattta cttacaagtt cgagaaggtt cccttccatt ctggctgggc tcaaagccag 1260tttgaattta cttacaagtt cgagaaggtt cccttccatt ctggctgggc tcaaagccag 1260
tcgttggatc gattgatgaa tcccttgatc ccacagtacc tgttggccga ttatggtggc 1320tcgttggatc gattgatgaa tcccttgatc ccacagtacc tgttggccga ttatggtggc 1320
ctgagcggca gcggcgccca catcgtgatg gtggacgcct acaagccgac gaagggcctg 1380ctgagcggca gcggcgccca catcgtgatg gtggacgcct acaagccgac gaagggcctg 1380
agcggcagcg gcacgaccgc cagtagtgcc ataacatact atcggccaaa cagcacagac 1440agcggcagcg gcacgaccgc cagtagtgcc ataacatact atcggccaaa cagcacagac 1440
ttgagctggt actttaaaaa ctggctgcct gggccagtgg aaaggcgaca gcaaatcaat 1500ttgagctggt actttaaaaa ctggctgcct gggccagtgg aaaggcgaca gcaaatcaat 1500
tctgaagact cgacgaaaaa ccatgccaat ttgaacggga atgcacacac caacaaatac 1560tctgaagact cgacgaaaaa ccatgccaat ttgaacggga atgcacacac caacaaatac 1560
agcatccagc acagacaaac caagatgatg ccaggggtgg ctctcagtag taaatacaca 1620agcatccagc acagacaaac caagatgatg ccaggggtgg ctctcagtag taaatacaca 1620
ggtgctgctg aaggaacgtc gttactgaac ggggtattga cctttgataa gatcgccaat 1680ggtgctgctg aaggaacgtc gttactgaac ggggtattga cctttgataa gatcgccaat 1680
gacaatacta acatcacgga tacaaataat gtcaatcgga cgatcgaaga tgaaattcaa 1740gacaatacta acatcacgga tacaaataat gtcaatcgga cgatcgaaga tgaaattcaa 1740
ggtaccaatc cttatggaaa cgacgtaccc attaccgtcg ctgtcaatac acaaaacgcg 1800ggtaccaatc cttatggaaa cgacgtaccc attaccgtcg ctgtcaatac acaaaacgcg 1800
accacttctc ctaccatgca aaacagcagc acgtatgaac tattacctgg tgctgtctgg 1860accacttctc ctaccatgca aaacagcagc acgtatgaac tattacctgg tgctgtctgg 1860
tccaacagag atatttacct gcaaggtccc atctgggcta aaatacccga taccgatgga 1920tccaacagag atatttacct gcaaggtccc atctgggcta aaatacccga taccgatgga 1920
cactttcacc cgtctccaca aatgggtggt ttcggactta aaaacccacc accgatgatc 1980cactttcacc cgtctccaca aatgggtggt ttcggactta aaaacccacc accgatgatc 1980
ctcatcaaaa acacacccgt tcccgccgat ccaccaacga ccttcaaacc gactccgatg 2040ctcatcaaaa acacacccgt tcccgccgat ccaccaacga ccttcaaacc gactccgatg 2040
aacagcttca tcagcgaata cagtaccggt caggtgactg tagagatgct gtgggaggtc 2100aacagcttca tcagcgaata cagtaccggt caggtgactg tagagatgct gtgggaggtc 2100
cggaaagaag actccaagag atggaacccg gaaatccagt ttacctccaa ttttggattg 2160cggaaagaag actccaagag atggaacccg gaaatccagt ttacctccaa ttttggattg 2160
tccgatcctc agatcgacgg tatacccttt ggtattacca aattgggtaa ttacgaggaa 2220tccgatcctc agatcgacgg tatacccttt ggtattacca aattgggtaa ttacgaggaa 2220
ccacgtccta ttggcaccag atacctgact cgtcatttgt aa 2262ccacgtccta ttggcaccag atacctgact cgtcatttgt aa 2262
<210> 34<210> 34
<211> 753<211> 753
<212> БЕЛОК<212> PROTEIN
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Cap VP1 AAV2 VP2 VP3 агамы G436 линкер-6 SpyTag<223> Cap VP1 AAV2 VP2 VP3 agamas G436 linker-6 SpyTag
<400> 34<400> 34
Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Thr Leu Ser Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Thr Leu Ser
1 5 10 15 1 5 10 15
Glu Gly Ile Arg Gln Trp Trp Lys Leu Lys Pro Gly Pro Pro Pro Pro Glu Gly Ile Arg Gln Trp Trp Lys Leu Lys Pro Gly Pro Pro Pro Pro
20 25 30 20 25 30
Lys Pro Ala Glu Arg His Lys Asp Asp Ser Arg Gly Leu Val Leu Pro Lys Pro Ala Glu Arg His Lys Asp Asp Ser Arg Gly Leu Val Leu Pro
35 40 45 35 40 45
Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro
50 55 60 50 55 60
Val Asn Glu Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp Val Asn Glu Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp
65 70 75 80 65 70 75 80
Arg Gln Leu Asp Ser Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala Arg Gln Leu Asp Ser Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala
85 90 95 85 90 95
Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Lys Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Lys Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly
100 105 110 100 105 110
Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro
115 120 125 115 120 125
Leu Gly Leu Val Glu Glu Pro Val Lys Thr Ala Glu Lys Arg Lys Thr Leu Gly Leu Val Glu Glu Pro Val Lys Thr Ala Glu Lys Arg Lys Thr
130 135 140 130 135 140
Pro Glu Glu Trp Leu Ala Gln Glu Lys Thr Pro Thr Lys Gln Arg Phe Pro Glu Glu Trp Leu Ala Gln Glu Lys Thr Pro Thr Lys Gln Arg Phe
145 150 155 160 145 150 155 160
Gln Ile Pro Ala Pro Gly Gln Ser Gly Ser Asp Ser Pro Ser Thr Ser Gln Ile Pro Ala Pro Gly Gln Ser Gly Ser Asp Ser Pro Ser Thr Ser
165 170 175 165 170 175
Gly Ser Gly Gly Thr Ala Gly Ser Ser Ser Ser Ala Ser Asn Thr Met Gly Ser Gly Gly Thr Ala Gly Ser Ser Ser Ser Ala Ser Asn Thr Met
180 185 190 180 185 190
Ala Gln Gly Gly Gly Gly Pro Met Ala Asp Asp Asn Gln Gly Ala Glu Ala Gln Gly Gly Gly Gly Pro Met Ala Asp Asp Asn Gln Gly Ala Glu
195 200 205 195 200 205
Gly Val Gly Asn Ala Ser Gly Asp Trp His Cys Asp Thr Gln Trp Leu Gly Val Gly Asn Ala Ser Gly Asp Trp His Cys Asp Thr Gln Trp Leu
210 215 220 210 215 220
Gly Asp His Val Ile Thr Lys Ser Thr Arg Thr Trp Val Leu Pro Ser Gly Asp His Val Ile Thr Lys Ser Thr Arg Thr Trp Val Leu Pro Ser
225 230 235 240 225 230 235 240
Tyr Gly Asn His Leu Tyr Ser Pro Ile Asn Phe Asp Gly Thr Thr Gly Tyr Gly Asn His Leu Tyr Ser Pro Ile Asn Phe Asp Gly Thr Thr Gly
245 250 255 245 250 255
Asn Gly Thr Gln Ala Ala Tyr Cys Gly Tyr Ala Thr Pro Trp Ala Tyr Asn Gly Thr Gln Ala Ala Tyr Cys Gly Tyr Ala Thr Pro Trp Ala Tyr
260 265 270 260 265 270
Phe Asp Phe Asn Arg Phe His Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Phe Asp Phe Asn Arg Phe His Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln
275 280 285 275 280 285
Arg Leu Ile Asn Asn His Thr Gly Ile Arg Pro Val Gly Leu Lys Phe Arg Leu Ile Asn Asn His Thr Gly Ile Arg Pro Val Gly Leu Lys Phe
290 295 300 290 295 300
Lys Leu Phe Asn Ile Gln Val Lys Glu Ile Thr Val Gln Asp Ser Thr Lys Leu Phe Asn Ile Gln Val Lys Glu Ile Thr Val Gln Asp Ser Thr
305 310 315 320 305 310 315 320
Lys Thr Ile Ala Asn Asn Leu Thr Ser Thr Val Gln Val Phe Ala Asp Lys Thr Ile Ala Asn Asn Leu Thr Ser Thr Val Gln Val Phe Ala Asp
325 330 335 325 330 335
Thr Glu His Gln Leu Pro Tyr Val Leu Gly Asn Ala Thr Gln Gly Thr Thr Glu His Gln Leu Pro Tyr Val Leu Gly Asn Ala Thr Gln Gly Thr
340 345 350 340 345 350
Phe Pro Pro Phe Pro Ala Glu Val Phe Gln Leu Pro Gln Tyr Gly Tyr Phe Pro Pro Phe Pro Ala Glu Val Phe Gln Leu Pro Gln Tyr Gly Tyr
355 360 365 355 360 365
Cys Thr Ile Gln Gly Pro Gln Gly Lys Phe Thr Asp Arg Ser Ala Phe Cys Thr Ile Gln Gly Pro Gln Gly Lys Phe Thr Asp Arg Ser Ala Phe
370 375 380 370 375 380
Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe Pro Ser Lys Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe Pro Ser Lys Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn
385 390 395 400 385 390 395 400
Phe Glu Phe Thr Tyr Lys Phe Glu Lys Val Pro Phe His Ser Gly Trp Phe Glu Phe Thr Tyr Lys Phe Glu Lys Val Pro Phe His Ser Gly Trp
405 410 415 405 410 415
Ala Gln Ser Gln Ser Leu Asp Arg Leu Met Asn Pro Leu Ile Pro Gln Ala Gln Ser Gln Ser Leu Asp Arg Leu Met Asn Pro Leu Ile Pro Gln
420 425 430 420 425 430
Tyr Leu Leu Ala Asp Tyr Gly Gly Leu Ser Gly Ser Gly Ala His Ile Tyr Leu Leu Ala Asp Tyr Gly Gly Leu Ser Gly Ser Gly Ala His Ile
435 440 445 435 440 445
Val Met Val Asp Ala Tyr Lys Pro Thr Lys Gly Leu Ser Gly Ser Gly Val Met Val Asp Ala Tyr Lys Pro Thr Lys Gly Leu Ser Gly Ser Gly
450 455 460 450 455 460
Thr Thr Ala Ser Ser Ala Ile Thr Tyr Tyr Arg Pro Asn Ser Thr Asp Thr Thr Ala Ser Ser Ala Ile Thr Tyr Tyr Arg Pro Asn Ser Thr Asp
465 470 475 480 465 470 475 480
Leu Ser Trp Tyr Phe Lys Asn Trp Leu Pro Gly Pro Val Glu Arg Arg Leu Ser Trp Tyr Phe Lys Asn Trp Leu Pro Gly Pro Val Glu Arg Arg
485 490 495 485 490 495
Gln Gln Ile Asn Ser Glu Asp Ser Thr Lys Asn His Ala Asn Leu Asn Gln Gln Ile Asn Ser Glu Asp Ser Thr Lys Asn His Ala Asn Leu Asn
500 505 510 500 505 510
Gly Asn Ala His Thr Asn Lys Tyr Ser Ile Gln His Arg Gln Thr Lys Gly Asn Ala His Thr Asn Lys Tyr Ser Ile Gln His Arg Gln Thr Lys
515 520 525 515 520 525
Met Met Pro Gly Val Ala Leu Ser Ser Lys Tyr Thr Gly Ala Ala Glu Met Met Pro Gly Val Ala Leu Ser Ser Lys Tyr Thr Gly Ala Ala Glu
530 535 540 530 535 540
Gly Thr Ser Leu Leu Asn Gly Val Leu Thr Phe Asp Lys Ile Ala Asn Gly Thr Ser Leu Leu Asn Gly Val Leu Thr Phe Asp Lys Ile Ala Asn
545 550 555 560 545 550 555 560
Asp Asn Thr Asn Ile Thr Asp Thr Asn Asn Val Asn Arg Thr Ile Glu Asp Asn Thr Asn Ile Thr Asp Thr Asn Asn Val Asn Arg Thr Ile Glu
565 570 575 565 570 575
Asp Glu Ile Gln Gly Thr Asn Pro Tyr Gly Asn Asp Val Pro Ile Thr Asp Glu Ile Gln Gly Thr Asn Pro Tyr Gly Asn Asp Val Pro Ile Thr
580 585 590 580 585 590
Val Ala Val Asn Thr Gln Asn Ala Thr Thr Ser Pro Thr Met Gln Asn Val Ala Val Asn Thr Gln Asn Ala Thr Thr Ser Pro Thr Met Gln Asn
595 600 605 595 600 605
Ser Ser Thr Tyr Glu Leu Leu Pro Gly Ala Val Trp Ser Asn Arg Asp Ser Ser Thr Tyr Glu Leu Leu Pro Gly Ala Val Trp Ser Asn Arg Asp
610 615 620 610 615 620
Ile Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile Pro Asp Thr Asp Gly Ile Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile Pro Asp Thr Asp Gly
625 630 635 640 625 630 635 640
His Phe His Pro Ser Pro Gln Met Gly Gly Phe Gly Leu Lys Asn Pro His Phe His Pro Ser Pro Gln Met Gly Gly Phe Gly Leu Lys Asn Pro
645 650 655 645 650 655
Pro Pro Met Ile Leu Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro Ala Asp Pro Pro Pro Pro Met Ile Leu Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro Ala Asp Pro Pro
660 665 670 660 665 670
Thr Thr Phe Lys Pro Thr Pro Met Asn Ser Phe Ile Ser Glu Tyr Ser Thr Thr Phe Lys Pro Thr Pro Met Asn Ser Phe Ile Ser Glu Tyr Ser
675 680 685 675 680 685
Thr Gly Gln Val Thr Val Glu Met Leu Trp Glu Val Arg Lys Glu Asp Thr Gly Gln Val Thr Val Glu Met Leu Trp Glu Val Arg Lys Glu Asp
690 695 700 690 695 700
Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Ile Gln Phe Thr Ser Asn Phe Gly Leu Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Ile Gln Phe Thr Ser Asn Phe Gly Leu
705 710 715 720 705 710 715 720
Ser Asp Pro Gln Ile Asp Gly Ile Pro Phe Gly Ile Thr Lys Leu Gly Ser Asp Pro Gln Ile Asp Gly Ile Pro Phe Gly Ile Thr Lys Leu Gly
725 730 735 725 730 735
Asn Tyr Glu Glu Pro Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg His Asn Tyr Glu Glu Pro Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg His
740 745 750 740 745 750
Leu Leu
<210> 35<210> 35
<211> 2262<211> 2262
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Cap VP1 AAV2 VP2 VP3 агамы T573 линкер-6 SpyTag<223> Cap VP1 AAV2 VP2 VP3 agamas T573 linker-6 SpyTag
<400> 35<400> 35
atggctgccg atggttatct tccagattgg ctcgaggaca ctctctctga aggaataaga 60atggctgccg atggttatct tccagattgg ctcgaggaca ctctctctga aggaataaga 60
cagtggtgga agctcaaacc tggcccacca ccaccaaagc ccgcagagcg gcataaggac 120cagtggtgga agctcaaacc tggcccacca ccaccaaagc ccgcagagcg gcataaggac 120
gacagcaggg gtcttgtgct tcctgggtac aagtacctcg gacccttcaa cggactcgac 180gacagcaggg gtcttgtgct tcctgggtac aagtacctcg gacccttcaa cggactcgac 180
aagggagagc cggtcaacga ggcagacgcc gcggccctcg agcacgacaa agcctacgac 240aagggagagc cggtcaacga ggcagacgcc gcggccctcg agcacgacaa agcctacgac 240
cggcagctcg acagcggaga caacccgtac ctcaagtaca accacgccga cgcggagttt 300cggcagctcg acagcggaga caacccgtac ctcaagtaca accacgccga cgcggagttt 300
caggagcgcc ttaaagaaga tacgtctttt gggggcaacc tcggacgagc agtcttccag 360caggagcgcc ttaaagaaga tacgtctttt gggggcaacc tcggacgagc agtcttccag 360
gcgaaaaaga gggttcttga acctctgggc ctggttgagg aacctgttaa gacggccgaa 420gcgaaaaaga gggttcttga acctctgggc ctggttgagg aacctgttaa gacggccgaa 420
aagcgaaaga cacccgaaga gtggttagct caagaaaaga ctccaaccaa acaaaggttc 480aagcgaaaga cacccgaaga gtggttagct caagaaaaga ctccaaccaa acaaaggttc 480
cagataccag ctccaggaca atctggatca gattctcctt ccacctcagg atccggcggt 540cagataccag ctccaggaca atctggatca gattctcctt ccacctcagg atccggcggt 540
actgcaggct ccagttctag cgcatcaaat acaatggctc aaggaggtgg cggaccaatg 600actgcaggct ccagttctag cgcatcaaat acaatggctc aaggaggtgg cggaccaatg 600
gcagacgata accaaggcgc cgagggagtg ggtaatgcct cgggagattg gcattgcgat 660gcagacgata accaaggcgc cgagggagtg ggtaatgcct cgggagattg gcattgcgat 660
acccaatggc tgggcgacca cgtcattaca aaatctacca gaacttgggt tctgccctct 720acccaatggc tgggcgacca cgtcattaca aaatctacca gaacttgggt tctgccctct 720
tacgggaatc atctctactc gcccatcaac tttgatggaa ccacagggaa cggaacccaa 780tacgggaatc atctctactc gcccatcaac tttgatggaa ccacagggaa cggaacccaa 780
gccgcttact gcggatacgc taccccctgg gcctactttg actttaaccg attccactgc 840gccgcttact gcggatacgc taccccctgg gcctactttg actttaaccg attccactgc 840
cacttttccc cccgagactg gcaaagactc attaacaacc ataccggaat acgaccagtc 900cacttttccc cccgagactg gcaaagactc attaacaacc ataccggaat acgaccagtc 900
ggactcaaat tcaagctgtt caacatccag gtcaaggaaa tcacagtaca agattcgacc 960ggactcaaat tcaagctgtt caacatccag gtcaaggaaa tcacagtaca agattcgacc 960
aaaacgatcg ccaacaatct caccagcacc gtacaggtct ttgcggacac ggagcaccag 1020aaaacgatcg ccaacaatct caccagcacc gtacaggtct ttgcggacac ggagcaccag 1020
ctcccgtacg tattaggaaa tgccacgcag ggcacgtttc ctccctttcc ggctgaagtc 1080ctcccgtacg tattaggaaa tgccacgcag ggcacgtttc ctccctttcc ggctgaagtc 1080
tttcagttgc ctcagtacgg ctactgtacc atccaaggcc ctcagggtaa gtttaccgac 1140tttcagttgc ctcagtacgg ctactgtacc atccaaggcc ctcagggtaa gtttaccgac 1140
agaagtgcct tctactgctt ggagtacttt ccttccaaga tgctgagaac ggggaataac 1200agaagtgcct tctactgctt ggagtacttt ccttccaaga tgctgagaac ggggaataac 1200
tttgaattta cttacaagtt cgagaaggtt cccttccatt ctggctgggc tcaaagccag 1260tttgaattta cttacaagtt cgagaaggtt cccttccatt ctggctgggc tcaaagccag 1260
tcgttggatc gattgatgaa tcccttgatc ccacagtacc tgttggccga ttatggtacg 1320tcgttggatc gattgatgaa tcccttgatc ccacagtacc tgttggccga ttatggtacg 1320
accgccagta gtgccataac atactatcgg ccaaacagca cagacttgag ctggtacttt 1380accgccagta gtgccataac atactatcgg ccaaacagca cagacttgag ctggtacttt 1380
aaaaactggc tgcctgggcc agtggaaagg cgacagcaaa tcaattctga agactcgacg 1440aaaaactggc tgcctgggcc agtggaaagg cgacagcaaa tcaattctga agactcgacg 1440
aaaaaccatg ccaatttgaa cgggaatgca cacaccaaca aatacagcat ccagcacaga 1500aaaaaccatg ccaatttgaa cgggaatgca cacaccaaca aatacagcat ccagcacaga 1500
caaaccaaga tgatgccagg ggtggctctc agtagtaaat acacaggtgc tgctgaagga 1560caaaccaaga tgatgccagg ggtggctctc agtagtaaat acacaggtgc tgctgaagga 1560
acgtcgttac tgaacggggt attgaccttt gataagatcg ccaatgacaa tactaacatc 1620acgtcgttac tgaacggggt attgaccttt gataagatcg ccaatgacaa tactaacatc 1620
acggatacaa ataatgtcaa tcggacgatc gaagatgaaa ttcaaggtac caatccttat 1680acggatacaa ataatgtcaa tcggacgatc gaagatgaaa ttcaaggtac caatccttat 1680
ggaaacgacg tacccattac cgtcgctgtc aatacacaaa acgcgaccgg cctgagcggc 1740ggaaacgacg tacccattac cgtcgctgtc aatacacaaa acgcgaccgg cctgagcggc 1740
agcggcgccc acatcgtgat ggtggacgcc tacaagccga cgaagggcct gagcggcagc 1800agcggcgccc acatcgtgat ggtggacgcc tacaagccga cgaagggcct gagcggcagc 1800
ggcacttctc ctaccatgca aaacagcagc acgtatgaac tattacctgg tgctgtctgg 1860ggcacttctc ctaccatgca aaacagcagc acgtatgaac tattacctgg tgctgtctgg 1860
tccaacagag atatttacct gcaaggtccc atctgggcta aaatacccga taccgatgga 1920tccaacagag atatttacct gcaaggtccc atctgggcta aaatacccga taccgatgga 1920
cactttcacc cgtctccaca aatgggtggt ttcggactta aaaacccacc accgatgatc 1980cactttcacc cgtctccaca aatgggtggt ttcggactta aaaacccacc accgatgatc 1980
ctcatcaaaa acacacccgt tcccgccgat ccaccaacga ccttcaaacc gactccgatg 2040ctcatcaaaa acacacccgt tcccgccgat ccaccaacga ccttcaaacc gactccgatg 2040
aacagcttca tcagcgaata cagtaccggt caggtgactg tagagatgct gtgggaggtc 2100aacagcttca tcagcgaata cagtaccggt caggtgactg tagagatgct gtgggaggtc 2100
cggaaagaag actccaagag atggaacccg gaaatccagt ttacctccaa ttttggattg 2160cggaaagaag actccaagag atggaacccg gaaatccagt ttacctccaa ttttggattg 2160
tccgatcctc agatcgacgg tatacccttt ggtattacca aattgggtaa ttacgaggaa 2220tccgatcctc agatcgacgg tatacccttt ggtattacca aattgggtaa ttacgaggaa 2220
ccacgtccta ttggcaccag atacctgact cgtcatttgt aa 2262ccacgtccta ttggcaccag atacctgact cgtcatttgt aa 2262
<210> 36<210> 36
<211> 753<211> 753
<212> БЕЛОК<212> PROTEIN
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Cap VP1 AAV2 VP2 VP3 агамы T573 линкер-6 SpyTag<223> Cap VP1 AAV2 VP2 VP3 agamas T573 linker-6 SpyTag
<400> 36<400> 36
Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Thr Leu Ser Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Thr Leu Ser
1 5 10 15 1 5 10 15
Glu Gly Ile Arg Gln Trp Trp Lys Leu Lys Pro Gly Pro Pro Pro Pro Glu Gly Ile Arg Gln Trp Trp Lys Leu Lys Pro Gly Pro Pro Pro Pro
20 25 30 20 25 30
Lys Pro Ala Glu Arg His Lys Asp Asp Ser Arg Gly Leu Val Leu Pro Lys Pro Ala Glu Arg His Lys Asp Asp Ser Arg Gly Leu Val Leu Pro
35 40 45 35 40 45
Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro
50 55 60 50 55 60
Val Asn Glu Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp Val Asn Glu Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp
65 70 75 80 65 70 75 80
Arg Gln Leu Asp Ser Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala Arg Gln Leu Asp Ser Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala
85 90 95 85 90 95
Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Lys Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Lys Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly
100 105 110 100 105 110
Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro
115 120 125 115 120 125
Leu Gly Leu Val Glu Glu Pro Val Lys Thr Ala Glu Lys Arg Lys Thr Leu Gly Leu Val Glu Glu Pro Val Lys Thr Ala Glu Lys Arg Lys Thr
130 135 140 130 135 140
Pro Glu Glu Trp Leu Ala Gln Glu Lys Thr Pro Thr Lys Gln Arg Phe Pro Glu Glu Trp Leu Ala Gln Glu Lys Thr Pro Thr Lys Gln Arg Phe
145 150 155 160 145 150 155 160
Gln Ile Pro Ala Pro Gly Gln Ser Gly Ser Asp Ser Pro Ser Thr Ser Gln Ile Pro Ala Pro Gly Gln Ser Gly Ser Asp Ser Pro Ser Thr Ser
165 170 175 165 170 175
Gly Ser Gly Gly Thr Ala Gly Ser Ser Ser Ser Ala Ser Asn Thr Met Gly Ser Gly Gly Thr Ala Gly Ser Ser Ser Ser Ala Ser Asn Thr Met
180 185 190 180 185 190
Ala Gln Gly Gly Gly Gly Pro Met Ala Asp Asp Asn Gln Gly Ala Glu Ala Gln Gly Gly Gly Gly Pro Met Ala Asp Asp Asn Gln Gly Ala Glu
195 200 205 195 200 205
Gly Val Gly Asn Ala Ser Gly Asp Trp His Cys Asp Thr Gln Trp Leu Gly Val Gly Asn Ala Ser Gly Asp Trp His Cys Asp Thr Gln Trp Leu
210 215 220 210 215 220
Gly Asp His Val Ile Thr Lys Ser Thr Arg Thr Trp Val Leu Pro Ser Gly Asp His Val Ile Thr Lys Ser Thr Arg Thr Trp Val Leu Pro Ser
225 230 235 240 225 230 235 240
Tyr Gly Asn His Leu Tyr Ser Pro Ile Asn Phe Asp Gly Thr Thr Gly Tyr Gly Asn His Leu Tyr Ser Pro Ile Asn Phe Asp Gly Thr Thr Gly
245 250 255 245 250 255
Asn Gly Thr Gln Ala Ala Tyr Cys Gly Tyr Ala Thr Pro Trp Ala Tyr Asn Gly Thr Gln Ala Ala Tyr Cys Gly Tyr Ala Thr Pro Trp Ala Tyr
260 265 270 260 265 270
Phe Asp Phe Asn Arg Phe His Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Phe Asp Phe Asn Arg Phe His Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln
275 280 285 275 280 285
Arg Leu Ile Asn Asn His Thr Gly Ile Arg Pro Val Gly Leu Lys Phe Arg Leu Ile Asn Asn His Thr Gly Ile Arg Pro Val Gly Leu Lys Phe
290 295 300 290 295 300
Lys Leu Phe Asn Ile Gln Val Lys Glu Ile Thr Val Gln Asp Ser Thr Lys Leu Phe Asn Ile Gln Val Lys Glu Ile Thr Val Gln Asp Ser Thr
305 310 315 320 305 310 315 320
Lys Thr Ile Ala Asn Asn Leu Thr Ser Thr Val Gln Val Phe Ala Asp Lys Thr Ile Ala Asn Asn Leu Thr Ser Thr Val Gln Val Phe Ala Asp
325 330 335 325 330 335
Thr Glu His Gln Leu Pro Tyr Val Leu Gly Asn Ala Thr Gln Gly Thr Thr Glu His Gln Leu Pro Tyr Val Leu Gly Asn Ala Thr Gln Gly Thr
340 345 350 340 345 350
Phe Pro Pro Phe Pro Ala Glu Val Phe Gln Leu Pro Gln Tyr Gly Tyr Phe Pro Pro Phe Pro Ala Glu Val Phe Gln Leu Pro Gln Tyr Gly Tyr
355 360 365 355 360 365
Cys Thr Ile Gln Gly Pro Gln Gly Lys Phe Thr Asp Arg Ser Ala Phe Cys Thr Ile Gln Gly Pro Gln Gly Lys Phe Thr Asp Arg Ser Ala Phe
370 375 380 370 375 380
Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe Pro Ser Lys Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe Pro Ser Lys Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn
385 390 395 400 385 390 395 400
Phe Glu Phe Thr Tyr Lys Phe Glu Lys Val Pro Phe His Ser Gly Trp Phe Glu Phe Thr Tyr Lys Phe Glu Lys Val Pro Phe His Ser Gly Trp
405 410 415 405 410 415
Ala Gln Ser Gln Ser Leu Asp Arg Leu Met Asn Pro Leu Ile Pro Gln Ala Gln Ser Gln Ser Leu Asp Arg Leu Met Asn Pro Leu Ile Pro Gln
420 425 430 420 425 430
Tyr Leu Leu Ala Asp Tyr Gly Thr Thr Ala Ser Ser Ala Ile Thr Tyr Tyr Leu Leu Ala Asp Tyr Gly Thr Thr Ala Ser Ser Ala Ile Thr Tyr
435 440 445 435 440 445
Tyr Arg Pro Asn Ser Thr Asp Leu Ser Trp Tyr Phe Lys Asn Trp Leu Tyr Arg Pro Asn Ser Thr Asp Leu Ser Trp Tyr Phe Lys Asn Trp Leu
450 455 460 450 455 460
Pro Gly Pro Val Glu Arg Arg Gln Gln Ile Asn Ser Glu Asp Ser Thr Pro Gly Pro Val Glu Arg Arg Gln Gln Ile Asn Ser Glu Asp Ser Thr
465 470 475 480 465 470 475 480
Lys Asn His Ala Asn Leu Asn Gly Asn Ala His Thr Asn Lys Tyr Ser Lys Asn His Ala Asn Leu Asn Gly Asn Ala His Thr Asn Lys Tyr Ser
485 490 495 485 490 495
Ile Gln His Arg Gln Thr Lys Met Met Pro Gly Val Ala Leu Ser Ser Ile Gln His Arg Gln Thr Lys Met Met Pro Gly Val Ala Leu Ser Ser
500 505 510 500 505 510
Lys Tyr Thr Gly Ala Ala Glu Gly Thr Ser Leu Leu Asn Gly Val Leu Lys Tyr Thr Gly Ala Ala Glu Gly Thr Ser Leu Leu Asn Gly Val Leu
515 520 525 515 520 525
Thr Phe Asp Lys Ile Ala Asn Asp Asn Thr Asn Ile Thr Asp Thr Asn Thr Phe Asp Lys Ile Ala Asn Asp Asn Thr Asn Ile Thr Asp Thr Asn
530 535 540 530 535 540
Asn Val Asn Arg Thr Ile Glu Asp Glu Ile Gln Gly Thr Asn Pro Tyr Asn Val Asn Arg Thr Ile Glu Asp Glu Ile Gln Gly Thr Asn Pro Tyr
545 550 555 560 545 550 555 560
Gly Asn Asp Val Pro Ile Thr Val Ala Val Asn Thr Gln Asn Ala Thr Gly Asn Asp Val Pro Ile Thr Val Ala Val Asn Thr Gln Asn Ala Thr
565 570 575 565 570 575
Gly Leu Ser Gly Ser Gly Ala His Ile Val Met Val Asp Ala Tyr Lys Gly Leu Ser Gly Ser Gly Ala His Ile Val Met Val Asp Ala Tyr Lys
580 585 590 580 585 590
Pro Thr Lys Gly Leu Ser Gly Ser Gly Thr Ser Pro Thr Met Gln Asn Pro Thr Lys Gly Leu Ser Gly Ser Gly Thr Ser Pro Thr Met Gln Asn
595 600 605 595 600 605
Ser Ser Thr Tyr Glu Leu Leu Pro Gly Ala Val Trp Ser Asn Arg Asp Ser Ser Thr Tyr Glu Leu Leu Pro Gly Ala Val Trp Ser Asn Arg Asp
610 615 620 610 615 620
Ile Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile Pro Asp Thr Asp Gly Ile Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile Pro Asp Thr Asp Gly
625 630 635 640 625 630 635 640
His Phe His Pro Ser Pro Gln Met Gly Gly Phe Gly Leu Lys Asn Pro His Phe His Pro Ser Pro Gln Met Gly Gly Phe Gly Leu Lys Asn Pro
645 650 655 645 650 655
Pro Pro Met Ile Leu Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro Ala Asp Pro Pro Pro Pro Met Ile Leu Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro Ala Asp Pro Pro
660 665 670 660 665 670
Thr Thr Phe Lys Pro Thr Pro Met Asn Ser Phe Ile Ser Glu Tyr Ser Thr Thr Phe Lys Pro Thr Pro Met Asn Ser Phe Ile Ser Glu Tyr Ser
675 680 685 675 680 685
Thr Gly Gln Val Thr Val Glu Met Leu Trp Glu Val Arg Lys Glu Asp Thr Gly Gln Val Thr Val Glu Met Leu Trp Glu Val Arg Lys Glu Asp
690 695 700 690 695 700
Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Ile Gln Phe Thr Ser Asn Phe Gly Leu Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Ile Gln Phe Thr Ser Asn Phe Gly Leu
705 710 715 720 705 710 715 720
Ser Asp Pro Gln Ile Asp Gly Ile Pro Phe Gly Ile Thr Lys Leu Gly Ser Asp Pro Gln Ile Asp Gly Ile Pro Phe Gly Ile Thr Lys Leu Gly
725 730 735 725 730 735
Asn Tyr Glu Glu Pro Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg His Asn Tyr Glu Glu Pro Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg His
740 745 750 740 745 750
Leu Leu
<210> 37<210> 37
<211> 4<211> 4
<212> БЕЛОК<212> PROTEIN
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Линкер-4<223> Linker-4
<400> 37<400> 37
Gly Leu Ser Gly Gly Leu Ser Gly
1 1
<210> 38<210> 38
<211> 6<211> 6
<212> БЕЛОК<212> PROTEIN
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Линкер-6<223> Linker-6
<400> 38<400> 38
Gly Leu Ser Gly Ser Gly Gly Leu Ser Gly Ser Gly
1 5 1 5
<210> 39<210> 39
<211> 8<211> 8
<212> БЕЛОК<212> PROTEIN
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Линкер-8<223> Linker-8
<400> 39<400> 39
Gly Leu Ser Gly Leu Ser Gly Ser Gly Leu Ser Gly Leu Ser Gly Ser
1 5 1 5
<210> 40<210> 40
<211> 10<211> 10
<212> БЕЛОК<212> PROTEIN
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Линкер-10<223> Linker-10
<400> 40<400> 40
Gly Leu Ser Gly Leu Ser Gly Leu Ser Gly Gly Leu Ser Gly Leu Ser Gly Leu Ser Gly
1 5 10 1 5 10
<210> 41<210> 41
<211> 10<211> 10
<212> БЕЛОК<212> PROTEIN
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Линкер-10<223> Linker-10
<400> 41<400> 41
Gly Leu Ser Gly Gly Ser Gly Leu Ser Gly Gly Leu Ser Gly Gly Ser Gly Leu Ser Gly
1 5 10 1 5 10
<210> 42<210> 42
<211> 13<211> 13
<212> БЕЛОК<212> PROTEIN
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> SpyTag<223> SpyTag
<400> 42<400> 42
Ala His Ile Val Met Val Asp Ala Tyr Lys Pro Thr Lys Ala His Ile Val Met Val Asp Ala Tyr Lys Pro Thr Lys
1 5 10 1 5 10
<210> 43<210> 43
<211> 113<211> 113
<212> БЕЛОК<212> PROTEIN
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Spycatcher<223> Spycatcher
<400> 43<400> 43
Val Asp Thr Leu Ser Gly Leu Ser Ser Glu Gln Gly Gln Ser Gly Asp Val Asp Thr Leu Ser Gly Leu Ser Ser Glu Gln Gly Gln Ser Gly Asp
1 5 10 15 1 5 10 15
Met Thr Ile Glu Glu Asp Ser Ala Thr His Ile Lys Phe Ser Lys Arg Met Thr Ile Glu Glu Asp Ser Ala Thr His Ile Lys Phe Ser Lys Arg
20 25 30 20 25 30
Asp Glu Asp Gly Lys Glu Leu Ala Gly Ala Thr Met Glu Leu Arg Asp Asp Glu Asp Gly Lys Glu Leu Ala Gly Ala Thr Met Glu Leu Arg Asp
35 40 45 35 40 45
Ser Ser Gly Lys Thr Ile Ser Thr Trp Ile Ser Asp Gly Gln Val Lys Ser Ser Gly Lys Thr Ile Ser Thr Trp Ile Ser Asp Gly Gln Val Lys
50 55 60 50 55 60
Asp Phe Tyr Leu Tyr Pro Gly Lys Tyr Thr Phe Val Glu Thr Ala Ala Asp Phe Tyr Leu Tyr Pro Gly Lys Tyr Thr Phe Val Glu Thr Ala Ala
65 70 75 80 65 70 75 80
Pro Asp Gly Tyr Glu Val Ala Thr Ala Ile Thr Phe Thr Val Asn Glu Pro Asp Gly Tyr Glu Val Ala Thr Ala Ile Thr Phe Thr Val Asn Glu
85 90 95 85 90 95
Gln Gly Gln Val Thr Val Asn Gly Lys Ala Thr Lys Gly Asp Ala His Gln Gly Gln Val Thr Val Asn Gly Lys Ala Thr Lys Gly Asp Ala His
100 105 110 100 105 110
Ile Ile
<210> 44<210> 44
<211> 10<211> 10
<212> БЕЛОК<212> PROTEIN
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> c-myc<223> c-myc
<400> 44<400> 44
Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu
1 5 10 1 5 10
<210> 45<210> 45
<211> 8<211> 8
<212> БЕЛОК<212> PROTEIN
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> B1<223> B1
<400> 45<400> 45
Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg
1 5 1 5
<210> 46<210> 46
<211> 1341<211> 1341
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Тяжелая цепь IgG4 человека - linker - SpyCatcher<223> Human IgG4 heavy chain - linker - SpyCatcher
<400> 46<400> 46
gcctccacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcgccct gctccaggag cacctccgag 60gcctccacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcgccct gctccaggag cacctccgag 60
agcacagccg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 120agcacagccg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 120
tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 180tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 180
ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacgaagacc 240ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacgaagacc 240
tacacctgca acgtagatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagag agttgagtcc 300tacacctgca acgtagatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagag agttgagtcc 300
aaatatggtc ccccatgccc accctgccca gcacctgagt tcctgggggg accatcagtc 360aaatatggtc ccccatgccc accctgccca gcacctgagt tcctgggggg accatcagtc 360
ttcctgttcc ccccaaaacc caaggacact ctcatgatct cccggacccc tgaggtcacg 420ttcctgttcc ccccaaaacc caaggacact ctcatgatct cccggacccc tgaggtcacg 420
tgcgtggtgg tggacgtgag ccaggaagac cccgaggtcc agttcaactg gtacgtggat 480tgcgtggtgg tggacgtgag ccadgaagac cccgaggtcc agttcaactg gtacgtggat 480
ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagttcaa cagcacgtac 540ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagttcaa cagcacgtac 540
cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaacggcaa ggagtacaag 600cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaacggcaa ggagtacaag 600
tgcaaggtct ccaacaaagg cctcccgtcc tccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 660tgcaaggtct ccaacaaagg cctcccgtcc tccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 660
gggcagcccc gagagccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccaggagga gatgaccaag 720gggcagcccc gagagccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccaggagga gatgaccaag 720
aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctacc ccagcgacat cgccgtggag 780aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctacc ccagcgacat cgccgtggag 780
tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 840tggggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 840
gacggctcct tcttcctcta cagcaggctc accgtggaca agagcaggtg gcaggagggg 900gacggctcct tcttcctcta cagcaggctc accgtggaca agagcaggtg gcaggagggg 900
aatgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac acagaagtcc 960aatgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac acagaagtcc 960
ctctccctgt ctctgggtaa aggaagcggc gaaagcggcg tggataccct gtccggactg 1020ctctccctgt ctctgggtaa aggaagcggc gaaagcggcg tggataccct gtccggactg 1020
agcagtgagc aaggccagtc cggagatatg acaattgaag aagatagcgc cacccatatt 1080agcagtgagc aaggccagtc cggagatatg acaattgaag aagatagcgc cacccatatt 1080
aaattctcca aaagagatga ggacggcaaa gagctggctg gagcaacaat ggagctgaga 1140aaattctcca aaagagatga ggacggcaaa gagctggctg gagcaacaat ggagctgaga 1140
gattcctctg gaaagactat tagtacatgg atctctgatg gccaagtgaa agatttctat 1200gattcctctg gaaagactat tagtacatgg atctctgatg gccaagtgaa agatttctat 1200
ctgtatccag gaaagtacac atttgtcgaa accgctgcac cagacggata tgaggtggct 1260ctgtatccag gaaagtacac atttgtcgaa accgctgcac cagacggata tgaggtggct 1260
acagctatta cctttacagt gaatgagcaa ggacaggtga ctgttaatgg caaagctact 1320acagctatta cctttacagt gaatgagcaa ggacaggtga ctgttaatgg caaagctact 1320
aaaggagacg ctcatattta a 1341aaaggagacg ctcatattta a 1341
<210> 47<210> 47
<211> 446<211> 446
<212> БЕЛОК<212> PROTEIN
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Тяжелая цепь IgG4 человека - линкер - SpyCatcher<223> Human IgG4 Heavy Chain - Linker - SpyCatcher
<400> 47<400> 47
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15 1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30 20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45 35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60 50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr
65 70 75 80 65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95 85 90 95
Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
100 105 110 100 105 110
Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
115 120 125 115 120 125
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
130 135 140 130 135 140
Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp
145 150 155 160 145 150 155 160
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
165 170 175 165 170 175
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
180 185 190 180 185 190
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
195 200 205 195 200 205
Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
210 215 220 210 215 220
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys
225 230 235 240 225 230 235 240
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
245 250 255 245 250 255
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
260 265 270 260 265 270
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
275 280 285 275 280 285
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
290 295 300 290 295 300
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
305 310 315 320 305 310 315 320
Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys Gly Ser Gly Glu Ser Gly Val Asp Thr Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys Gly Ser Gly Glu Ser Gly Val Asp Thr
325 330 335 325 330 335
Leu Ser Gly Leu Ser Ser Glu Gln Gly Gln Ser Gly Asp Met Thr Ile Leu Ser Gly Leu Ser Ser Glu Gln Gly Gln Ser Gly Asp Met Thr Ile
340 345 350 340 345 350
Glu Glu Asp Ser Ala Thr His Ile Lys Phe Ser Lys Arg Asp Glu Asp Glu Glu Asp Ser Ala Thr His Ile Lys Phe Ser Lys Arg Asp Glu Asp
355 360 365 355 360 365
Gly Lys Glu Leu Ala Gly Ala Thr Met Glu Leu Arg Asp Ser Ser Gly Gly Lys Glu Leu Ala Gly Ala Thr Met Glu Leu Arg Asp Ser Ser Gly
370 375 380 370 375 380
Lys Thr Ile Ser Thr Trp Ile Ser Asp Gly Gln Val Lys Asp Phe Tyr Lys Thr Ile Ser Thr Trp Ile Ser Asp Gly Gln Val Lys Asp Phe Tyr
385 390 395 400 385 390 395 400
Leu Tyr Pro Gly Lys Tyr Thr Phe Val Glu Thr Ala Ala Pro Asp Gly Leu Tyr Pro Gly Lys Tyr Thr Phe Val Glu Thr Ala Ala Pro Asp Gly
405 410 415 405 410 415
Tyr Glu Val Ala Thr Ala Ile Thr Phe Thr Val Asn Glu Gln Gly Gln Tyr Glu Val Ala Thr Ala Ile Thr Phe Thr Val Asn Glu Gln Gly Gln
420 425 430 420 425 430
Val Thr Val Asn Gly Lys Ala Thr Lys Gly Asp Ala His Ile Val Thr Val Asn Gly Lys Ala Thr Lys Gly Asp Ala His Ile
435 440 445 435 440 445
<210> 48<210> 48
<211> 18<211> 18
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Линкер для IgG-SpyCatcher<223> Linker for IgG-SpyCatcher
<400> 48<400> 48
ggaagcggcg aaagcggc 18ggaagcggcg aaagcggc 18
<210> 49<210> 49
<211> 6<211> 6
<212> БЕЛОК<212> PROTEIN
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Линкер для IgG-SpyCatcher<223> Linker for IgG-SpyCatcher
<400> 49<400> 49
Gly Ser Gly Glu Ser Gly Gly Ser Gly Glu Ser Gly
1 5 1 5
<210> 50<210> 50
<211> 981<211> 981
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> hIgG4<223> hIgG4
<400> 50<400> 50
gcctccacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcgccct gctccaggag cacctccgag 60gcctccacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcgccct gctccaggag cacctccgag 60
agcacagccg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 120agcacagccg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 120
tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 180tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 180
ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacgaagacc 240ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacgaagacc 240
tacacctgca acgtagatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagag agttgagtcc 300tacacctgca acgtagatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagag agttgagtcc 300
aaatatggtc ccccatgccc accctgccca gcacctgagt tcctgggggg accatcagtc 360aaatatggtc ccccatgccc accctgccca gcacctgagt tcctgggggg accatcagtc 360
ttcctgttcc ccccaaaacc caaggacact ctcatgatct cccggacccc tgaggtcacg 420ttcctgttcc ccccaaaacc caaggacact ctcatgatct cccggacccc tgaggtcacg 420
tgcgtggtgg tggacgtgag ccaggaagac cccgaggtcc agttcaactg gtacgtggat 480tgcgtggtgg tggacgtgag ccadgaagac cccgaggtcc agttcaactg gtacgtggat 480
ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagttcaa cagcacgtac 540ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagttcaa cagcacgtac 540
cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaacggcaa ggagtacaag 600cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaacggcaa ggagtacaag 600
tgcaaggtct ccaacaaagg cctcccgtcc tccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 660tgcaaggtct ccaacaaagg cctcccgtcc tccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 660
gggcagcccc gagagccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccaggagga gatgaccaag 720gggcagcccc gagagccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccaggagga gatgaccaag 720
aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctacc ccagcgacat cgccgtggag 780aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctacc ccagcgacat cgccgtggag 780
tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 840tggggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 840
gacggctcct tcttcctcta cagcaggctc accgtggaca agagcaggtg gcaggagggg 900gacggctcct tcttcctcta cagcaggctc accgtggaca agagcaggtg gcaggagggg 900
aatgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac acagaagtcc 960aatgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac acagaagtcc 960
ctctccctgt ctctgggtaa a 981ctctccctgt ctctgggtaa a 981
<210> 51<210> 51
<211> 327<211> 327
<212> БЕЛОК<212> PROTEIN
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> hIgG4<223> hIgG4
<400> 51<400> 51
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15 1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30 20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45 35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60 50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr
65 70 75 80 65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95 85 90 95
Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
100 105 110 100 105 110
Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
115 120 125 115 120 125
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
130 135 140 130 135 140
Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp
145 150 155 160 145 150 155 160
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
165 170 175 165 170 175
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
180 185 190 180 185 190
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
195 200 205 195 200 205
Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
210 215 220 210 215 220
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys
225 230 235 240 225 230 235 240
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
245 250 255 245 250 255
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
260 265 270 260 265 270
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
275 280 285 275 280 285
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
290 295 300 290 295 300
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
305 310 315 320 305 310 315 320
Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
325 325
<210> 52<210> 52
<211> 2145<211> 2145
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Cap VP1 AAV2 VP2 VP3 вируса морского льва Y730F<223> Cap VP1 AAV2 VP2 VP3 sea lion virus Y730F
<400> 52<400> 52
atggctgccg atggttatct tccagattgg ctcgaggaca ctctctctga aggaataaga 60atggctgccg atggttatct tccagattgg ctcgaggaca ctctctctga aggaataaga 60
cagtggtgga agctcaaacc tggcccacca ccaccaaagc ccgcagagcg gcataaggac 120cagtggtgga agctcaaacc tggcccacca ccaccaaagc ccgcagagcg gcataaggac 120
gacagcaggg gtcttgtgct tcctgggtac aagtacctcg gacccttcaa cggactcgac 180gacagcaggg gtcttgtgct tcctgggtac aagtacctcg gacccttcaa cggactcgac 180
aagggagagc cggtcaacga ggcagacgcc gcggccctcg agcacgacaa agcctacgac 240aagggagagc cggtcaacga ggcagacgcc gcggccctcg agcacgacaa agcctacgac 240
cggcagctcg acagcggaga caacccgtac ctcaagtaca accacgccga cgcggagttt 300cggcagctcg acagcggaga caacccgtac ctcaagtaca accacgccga cgcggagttt 300
caggagcgcc ttaaagaaga tacgtctttt gggggcaacc tcggacgagc agtcttccag 360caggagcgcc ttaaagaaga tacgtctttt gggggcaacc tcggacgagc agtcttccag 360
gcgaaaaaga gggttcttga acctctgggc ctggttgagg aaccctctca gccagattcg 420gcgaaaaaga gggttcttga acctctgggc ctggttgagg aaccctctca gccagattcg 420
tcctcggaca acacggcgcc acccgtgaaa aagtcccgtc tcgaagaagc ccagcccatt 480tcctcggaca acacggcgcc acccgtgaaa aagtcccgtc tcgaagaagc ccagcccatt 480
caaagtccag acgtttccag cagcactggc ggaggaattg ccgacgtcat gtctggagat 540caaagtccag acgtttccag cagcactggc ggaggaattg ccgacgtcat gtctggagat 540
gctgaaatgg ctgcagtggg cgggggagca ccgggcgtcg acggccaggg tgccgaggga 600gctgaaatgg ctgcagtggg cgggggagca ccgggcgtcg acggccaggg tgccgaggga 600
gtgggtactt cctcgggtaa ttggcattgc gattcccagt ggtcagaagg acacgtcaga 660gtgggtactt cctcgggtaa ttggcattgc gattcccagt ggtcagaagg acacgtcaga 660
accaccagca ccagaacctg ggtgttgccc agctacaaca accacctgta taaacggctt 720accaccagca ccagaacctg ggtgttgccc agctacaaca accacctgta taaacggctt 720
ggaagtagcg cacaatccaa tacctacaac ggattctcca ccccctgggg atacctcgac 780ggaagtagcg cacaatccaa tacctacaac ggattctcca ccccctgggg atacctcgac 780
ttcaatagat ggcactgtca cttcagtcct cggaactggc aacgtctcat caacaacaac 840ttcaatagat ggcactgtca cttcagtcct cggaactggc aacgtctcat caacaacaac 840
tggggcatca gaccaaaaag acttaatgtt aaattgttca acatacaagt caaagaggtc 900tggggcatca gaccaaaaag acttaatgtt aaattgttca acatacaagt caaagaggtc 900
acgacggaag gggggacgac gaccgtcgcc aataacctta ccagcacgat tcaggtgttt 960acgacggaag gggggacgac gaccgtcgcc aataacctta ccagcacgat tcaggtgttt 960
gcggacaacg cgtacgaact cccgtatgtt gtcgacgcgg gtcacgaggg ggcattgccg 1020gcggacaacg cgtacgaact cccgtatgtt gtcgacgcgg gtcacgaggg ggcattgccg 1020
ccgttcccaa acgacgtgtt tatgattccc caatacggat actgcgggct ggtgtctggt 1080ccgttcccaa acgacgtgtt tatgattccc caatacggat actgcgggct ggtgtctggt 1080
caaagtcagg ctcagtcgga cttgtgttcg ttttattgcc tggagtattt tccatcccag 1140caaagtcagg ctcagtcgga cttgtgttcg ttttattgcc tggagtattt tccatcccag 1140
atgctgagaa caggaaacaa ttttgaaatg aatttcaggt ttgaagacgt tccatttcac 1200atgctgagaa caggaaacaa ttttgaaatg aatttcaggt ttgaagacgt tccatttcac 1200
tccatgtacg cccacagcca gtctctagac aggctcatga atcctttaat tgatcagtat 1260tccatgtacg cccacagcca gtctctagac aggctcatga atcctttaat tgatcagtat 1260
ctgtggagtc taaaacaaac aggaaacccg actggatcaa caacgagaga cttaaaattt 1320ctgtggagtc taaaacaaac aggaaacccg actggatcaa caacgagaga cttaaaattt 1320
atcaagaaca aagttcccaa ttttgcacat tatggaaaaa attggcttcc tggacctttt 1380atcaagaaca aagttcccaa ttttgcacat tatggaaaaa attggcttcc tggacctttt 1380
attagacaac aggggtggac aacacaaaat attaataata gtgttgttaa ttttaatgac 1440attagacaac aggggtggac aacacaaaat attaataata gtgttgttaa ttttaatgac 1440
atgctgggaa aaaattcgac atttactttg gacactagat ggagttcatt agcgcctggt 1500atgctgggaa aaaattcgac atttactttg gacactagat ggagttcatt agcgcctggt 1500
ccgtgtatgg gggatgacgg acgaactcca tccaccacca agttctcaaa tgctcagctc 1560ccgtgtatgg gggatgacgg acgaactcca tccaccacca agttctcaaa tgctcagctc 1560
atgtttggat ctggaacaca acccaccgaa ggcggtgaag atgctgtaca tattacatcc 1620atgtttggat ctggaacaca acccaccgaa ggcggtgaag atgctgtaca tattacatcc 1620
gagtcggagg tcaaggcaac caacccaact gcaatcgatg aatacggacg agtggccgat 1680gagtcggagg tcaaggcaac caacccaact gcaatcgatg aatacggacg agtggccgat 1680
aatacgcaaa atgcaacaac cgccccaacc acagtgggaa atgctgcaat gggggccatg 1740aatacgcaaa atgcaacaac cgccccaacc acagtgggaa atgctgcaat gggggccatg 1740
cctgggatgg tgtggcaaga tagggatatc tatcttcaag gacccatctg gggaaaaata 1800cctgggatgg tgtggcaaga tagggatatc tatcttcaag gacccatctg gggaaaaata 1800
ccccatacag acggacattt tcatccgtct cctctcatgg gggggtttgg atacagaaaa 1860ccccatacag acggacattt tcatccgtct cctctcatgg gggggtttgg atacagaaaa 1860
ccccctccgc aaatttttat taaaaacacc cccgttcctg gaaatccggc aactacattt 1920ccccctccgc aaatttttat taaaaacacc cccgttcctg gaaatccggc aactacattt 1920
tctccaaata gaataaacaa tttcattact caatactcaa cgggacaagt gaccgttact 1980tctccaaata gaataaacaa tttcattact caatactcaa cgggacaagt gaccgttact 1980
attgactggg agctgcaaaa ggaaaactca aagagatgga acccagaagt acaatttaca 2040attgactggg agctgcaaaa ggaaaactca aagagatgga acccagaagt acaatttaca 2040
tcaaattttg gcacggtcga ttcactaaac tgggcaccgg acaacgcggg aaactacaaa 2100tcaaattttg gcacggtcga ttcactaaac tgggcaccgg acaacgcggg aaactacaaa 2100
gaaccaaggg tgattggcac cagattcctg actcgtatac tataa 2145gaaccaaggg tgattggcac cagattcctg actcgtatac tataa 2145
<210> 53<210> 53
<211> 714<211> 714
<212> БЕЛОК<212> PROTEIN
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Cap VP1 AAV2 VP2 VP3 вируса морского льва Y730F<223> Cap VP1 AAV2 VP2 VP3 sea lion virus Y730F
<400> 53<400> 53
Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Thr Leu Ser Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Thr Leu Ser
1 5 10 15 1 5 10 15
Glu Gly Ile Arg Gln Trp Trp Lys Leu Lys Pro Gly Pro Pro Pro Pro Glu Gly Ile Arg Gln Trp Trp Lys Leu Lys Pro Gly Pro Pro Pro Pro
20 25 30 20 25 30
Lys Pro Ala Glu Arg His Lys Asp Asp Ser Arg Gly Leu Val Leu Pro Lys Pro Ala Glu Arg His Lys Asp Asp Ser Arg Gly Leu Val Leu Pro
35 40 45 35 40 45
Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro
50 55 60 50 55 60
Val Asn Glu Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp Val Asn Glu Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp
65 70 75 80 65 70 75 80
Arg Gln Leu Asp Ser Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala Arg Gln Leu Asp Ser Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala
85 90 95 85 90 95
Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Lys Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Lys Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly
100 105 110 100 105 110
Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro
115 120 125 115 120 125
Leu Gly Leu Val Glu Glu Pro Ser Gln Pro Asp Ser Ser Ser Asp Asn Leu Gly Leu Val Glu Glu Pro Ser Gln Pro Asp Ser Ser Ser Asp Asn
130 135 140 130 135 140
Thr Ala Pro Pro Val Lys Lys Ser Arg Leu Glu Glu Ala Gln Pro Ile Thr Ala Pro Pro Val Lys Lys Ser Arg Leu Glu Glu Ala Gln Pro Ile
145 150 155 160 145 150 155 160
Gln Ser Pro Asp Val Ser Ser Ser Thr Gly Gly Gly Ile Ala Asp Val Gln Ser Pro Asp Val Ser Ser Ser Thr Gly Gly Gly Ile Ala Asp Val
165 170 175 165 170 175
Met Ser Gly Asp Ala Glu Met Ala Ala Val Gly Gly Gly Ala Pro Gly Met Ser Gly Asp Ala Glu Met Ala Ala Val Gly Gly Gly Ala Pro Gly
180 185 190 180 185 190
Val Asp Gly Gln Gly Ala Glu Gly Val Gly Thr Ser Ser Gly Asn Trp Val Asp Gly Gln Gly Ala Glu Gly Val Gly Thr Ser Ser Gly Asn Trp
195 200 205 195 200 205
His Cys Asp Ser Gln Trp Ser Glu Gly His Val Arg Thr Thr Ser Thr His Cys Asp Ser Gln Trp Ser Glu Gly His Val Arg Thr Thr Ser Thr
210 215 220 210 215 220
Arg Thr Trp Val Leu Pro Ser Tyr Asn Asn His Leu Tyr Lys Arg Leu Arg Thr Trp Val Leu Pro Ser Tyr Asn Asn His Leu Tyr Lys Arg Leu
225 230 235 240 225 230 235 240
Gly Ser Ser Ala Gln Ser Asn Thr Tyr Asn Gly Phe Ser Thr Pro Trp Gly Ser Ser Ala Gln Ser Asn Thr Tyr Asn Gly Phe Ser Thr Pro Trp
245 250 255 245 250 255
Gly Tyr Leu Asp Phe Asn Arg Trp His Cys His Phe Ser Pro Arg Asn Gly Tyr Leu Asp Phe Asn Arg Trp His Cys His Phe Ser Pro Arg Asn
260 265 270 260 265 270
Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn Asn Trp Gly Ile Arg Pro Lys Arg Leu Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn Asn Trp Gly Ile Arg Pro Lys Arg Leu
275 280 285 275 280 285
Asn Val Lys Leu Phe Asn Ile Gln Val Lys Glu Val Thr Thr Glu Gly Asn Val Lys Leu Phe Asn Ile Gln Val Lys Glu Val Thr Thr Glu Gly
290 295 300 290 295 300
Gly Thr Thr Thr Val Ala Asn Asn Leu Thr Ser Thr Ile Gln Val Phe Gly Thr Thr Thr Val Ala Asn Asn Leu Thr Ser Thr Ile Gln Val Phe
305 310 315 320 305 310 315 320
Ala Asp Asn Ala Tyr Glu Leu Pro Tyr Val Val Asp Ala Gly His Glu Ala Asp Asn Ala Tyr Glu Leu Pro Tyr Val Val Asp Ala Gly His Glu
325 330 335 325 330 335
Gly Ala Leu Pro Pro Phe Pro Asn Asp Val Phe Met Ile Pro Gln Tyr Gly Ala Leu Pro Pro Phe Pro Asn Asp Val Phe Met Ile Pro Gln Tyr
340 345 350 340 345 350
Gly Tyr Cys Gly Leu Val Ser Gly Gln Ser Gln Ala Gln Ser Asp Leu Gly Tyr Cys Gly Leu Val Ser Gly Gln Ser Gln Ala Gln Ser Asp Leu
355 360 365 355 360 365
Cys Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe Pro Ser Gln Met Leu Arg Thr Cys Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe Pro Ser Gln Met Leu Arg Thr
370 375 380 370 375 380
Gly Asn Asn Phe Glu Met Asn Phe Arg Phe Glu Asp Val Pro Phe His Gly Asn Asn Phe Glu Met Asn Phe Arg Phe Glu Asp Val Pro Phe His
385 390 395 400 385 390 395 400
Ser Met Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu Asp Arg Leu Met Asn Pro Leu Ser Met Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu Asp Arg Leu Met Asn Pro Leu
405 410 415 405 410 415
Ile Asp Gln Tyr Leu Trp Ser Leu Lys Gln Thr Gly Asn Pro Thr Gly Ile Asp Gln Tyr Leu Trp Ser Leu Lys Gln Thr Gly Asn Pro Thr Gly
420 425 430 420 425 430
Ser Thr Thr Arg Asp Leu Lys Phe Ile Lys Asn Lys Val Pro Asn Phe Ser Thr Thr Arg Asp Leu Lys Phe Ile Lys Asn Lys Val Pro Asn Phe
435 440 445 435 440 445
Ala His Tyr Gly Lys Asn Trp Leu Pro Gly Pro Phe Ile Arg Gln Gln Ala His Tyr Gly Lys Asn Trp Leu Pro Gly Pro Phe Ile Arg Gln Gln
450 455 460 450 455 460
Gly Trp Thr Thr Gln Asn Ile Asn Asn Ser Val Val Asn Phe Asn Asp Gly Trp Thr Thr Gln Asn Ile Asn Asn Ser Val Val Asn Phe Asn Asp
465 470 475 480 465 470 475 480
Met Leu Gly Lys Asn Ser Thr Phe Thr Leu Asp Thr Arg Trp Ser Ser Met Leu Gly Lys Asn Ser Thr Phe Thr Leu Asp Thr Arg Trp Ser Ser
485 490 495 485 490 495
Leu Ala Pro Gly Pro Cys Met Gly Asp Asp Gly Arg Thr Pro Ser Thr Leu Ala Pro Gly Pro Cys Met Gly Asp Asp Gly Arg Thr Pro Ser Thr
500 505 510 500 505 510
Thr Lys Phe Ser Asn Ala Gln Leu Met Phe Gly Ser Gly Thr Gln Pro Thr Lys Phe Ser Asn Ala Gln Leu Met Phe Gly Ser Gly Thr Gln Pro
515 520 525 515 520 525
Thr Glu Gly Gly Glu Asp Ala Val His Ile Thr Ser Glu Ser Glu Val Thr Glu Gly Gly Glu Asp Ala Val His Ile Thr Ser Glu Ser Glu Val
530 535 540 530 535 540
Lys Ala Thr Asn Pro Thr Ala Ile Asp Glu Tyr Gly Arg Val Ala Asp Lys Ala Thr Asn Pro Thr Ala Ile Asp Glu Tyr Gly Arg Val Ala Asp
545 550 555 560 545 550 555 560
Asn Thr Gln Asn Ala Thr Thr Ala Pro Thr Thr Val Gly Asn Ala Ala Asn Thr Gln Asn Ala Thr Thr Ala Pro Thr Thr Val Gly Asn Ala Ala
565 570 575 565 570 575
Met Gly Ala Met Pro Gly Met Val Trp Gln Asp Arg Asp Ile Tyr Leu Met Gly Ala Met Pro Gly Met Val Trp Gln Asp Arg Asp Ile Tyr Leu
580 585 590 580 585 590
Gln Gly Pro Ile Trp Gly Lys Ile Pro His Thr Asp Gly His Phe His Gln Gly Pro Ile Trp Gly Lys Ile Pro His Thr Asp Gly His Phe His
595 600 605 595 600 605
Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe Gly Tyr Arg Lys Pro Pro Pro Gln Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe Gly Tyr Arg Lys Pro Pro Pro Gln
610 615 620 610 615 620
Ile Phe Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro Gly Asn Pro Ala Thr Thr Phe Ile Phe Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro Gly Asn Pro Ala Thr Thr Phe
625 630 635 640 625 630 635 640
Ser Pro Asn Arg Ile Asn Asn Phe Ile Thr Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Ser Pro Asn Arg Ile Asn Asn Phe Ile Thr Gln Tyr Ser Thr Gly Gln
645 650 655 645 650 655
Val Thr Val Thr Ile Asp Trp Glu Leu Gln Lys Glu Asn Ser Lys Arg Val Thr Val Thr Ile Asp Trp Glu Leu Gln Lys Glu Asn Ser Lys Arg
660 665 670 660 665 670
Trp Asn Pro Glu Val Gln Phe Thr Ser Asn Phe Gly Thr Val Asp Ser Trp Asn Pro Glu Val Gln Phe Thr Ser Asn Phe Gly Thr Val Asp Ser
675 680 685 675 680 685
Leu Asn Trp Ala Pro Asp Asn Ala Gly Asn Tyr Lys Glu Pro Arg Val Leu Asn Trp Ala Pro Asp Asn Ala Gly Asn Tyr Lys Glu Pro Arg Val
690 695 700 690 695 700
Ile Gly Thr Arg Phe Leu Thr Arg Ile Leu Ile Gly Thr Arg Phe Leu Thr Arg Ile Leu
705 710 705 710
<210> 54<210> 54
<211> 2145<211> 2145
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Cap VP1 AAV2 VP2 VP3 вируса морского льва B1 заменен<223> Cap VP1 AAV2 VP2 VP3 Sea Lion Virus B1 Replaced
<400> 54<400> 54
atggctgccg atggttatct tccagattgg ctcgaggaca ctctctctga aggaataaga 60atggctgccg atggttatct tccagattgg ctcgaggaca ctctctctga aggaataaga 60
cagtggtgga agctcaaacc tggcccacca ccaccaaagc ccgcagagcg gcataaggac 120cagtggtgga agctcaaacc tggcccacca ccaccaaagc ccgcagagcg gcataaggac 120
gacagcaggg gtcttgtgct tcctgggtac aagtacctcg gacccttcaa cggactcgac 180gacagcaggg gtcttgtgct tcctgggtac aagtacctcg gacccttcaa cggactcgac 180
aagggagagc cggtcaacga ggcagacgcc gcggccctcg agcacgacaa agcctacgac 240aagggagagc cggtcaacga ggcagacgcc gcggccctcg agcacgacaa agcctacgac 240
cggcagctcg acagcggaga caacccgtac ctcaagtaca accacgccga cgcggagttt 300cggcagctcg acagcggaga caacccgtac ctcaagtaca accacgccga cgcggagttt 300
caggagcgcc ttaaagaaga tacgtctttt gggggcaacc tcggacgagc agtcttccag 360caggagcgcc ttaaagaaga tacgtctttt gggggcaacc tcggacgagc agtcttccag 360
gcgaaaaaga gggttcttga acctctgggc ctggttgagg aaccctctca gccagattcg 420gcgaaaaaga gggttcttga acctctgggc ctggttgagg aaccctctca gccagattcg 420
tcctcggaca acacggcgcc acccgtgaaa aagtcccgtc tcgaagaagc ccagcccatt 480tcctcggaca acacggcgcc acccgtgaaa aagtcccgtc tcgaagaagc ccagcccatt 480
caaagtccag acgtttccag cagcactggc ggaggaattg ccgacgtcat gtctggagat 540caaagtccag acgtttccag cagcactggc ggaggaattg ccgacgtcat gtctggagat 540
gctgaaatgg ctgcagtggg cgggggagca ccgggcgtcg acggccaggg tgccgaggga 600gctgaaatgg ctgcagtggg cgggggagca ccgggcgtcg acggccaggg tgccgaggga 600
gtgggtactt cctcgggtaa ttggcattgc gattcccagt ggtcagaagg acacgtcaga 660gtgggtactt cctcgggtaa ttggcattgc gattcccagt ggtcagaagg acacgtcaga 660
accaccagca ccagaacctg ggtgttgccc agctacaaca accacctgta taaacggctt 720accaccagca ccagaacctg ggtgttgccc agctacaaca accacctgta taaacggctt 720
ggaagtagcg cacaatccaa tacctacaac ggattctcca ccccctgggg atacctcgac 780ggaagtagcg cacaatccaa tacctacaac ggattctcca ccccctgggg atacctcgac 780
ttcaatagat ggcactgtca cttcagtcct cggaactggc aacgtctcat caacaacaac 840ttcaatagat ggcactgtca cttcagtcct cggaactggc aacgtctcat caacaacaac 840
tggggcatca gaccaaaaag acttaatgtt aaattgttca acatacaagt caaagaggtc 900tggggcatca gaccaaaaag acttaatgtt aaattgttca acatacaagt caaagaggtc 900
acgacggaag gggggacgac gaccgtcgcc aataacctta ccagcacgat tcaggtgttt 960acgacggaag gggggacgac gaccgtcgcc aataacctta ccagcacgat tcaggtgttt 960
gcggacaacg cgtacgaact cccgtatgtt gtcgacgcgg gtcacgaggg ggcattgccg 1020gcggacaacg cgtacgaact cccgtatgtt gtcgacgcgg gtcacgaggg ggcattgccg 1020
ccgttcccaa acgacgtgtt tatgattccc caatacggat actgcgggct ggtgtctggt 1080ccgttcccaa acgacgtgtt tatgattccc caatacggat actgcgggct ggtgtctggt 1080
caaagtcagg ctcagtcgga cttgtgttcg ttttattgcc tggagtattt tccatcccag 1140caaagtcagg ctcagtcgga cttgtgttcg ttttattgcc tggagtattt tccatcccag 1140
atgctgagaa caggaaacaa ttttgaaatg aatttcaggt ttgaagacgt tccatttcac 1200atgctgagaa caggaaacaa ttttgaaatg aatttcaggt ttgaagacgt tccatttcac 1200
tccatgtacg cccacagcca gtctctagac aggctcatga atcctttaat tgatcagtat 1260tccatgtacg cccacagcca gtctctagac aggctcatga atcctttaat tgatcagtat 1260
ctgtggagtc taaaacaaac aggaaacccg actggatcaa caacgagaga cttaaaattt 1320ctgtggagtc taaaacaaac aggaaacccg actggatcaa caacgagaga cttaaaattt 1320
atcaagaaca aagttcccaa ttttgcacat tatggaaaaa attggcttcc tggacctttt 1380atcaagaaca aagttcccaa ttttgcacat tatggaaaaa attggcttcc tggacctttt 1380
attagacaac aggggtggac aacacaaaat attaataata gtgttgttaa ttttaatgac 1440attagacaac aggggtggac aacacaaaat attaataata gtgttgttaa ttttaatgac 1440
atgctgggaa aaaattcgac atttactttg gacactagat ggagttcatt agcgcctggt 1500atgctgggaa aaaattcgac atttactttg gacactagat ggagttcatt agcgcctggt 1500
ccgtgtatgg gggatgacgg acgaactcca tccaccacca agttctcaaa tgctcagctc 1560ccgtgtatgg gggatgacgg acgaactcca tccaccacca agttctcaaa tgctcagctc 1560
atgtttggat ctggaacaca acccaccgaa ggcggtgaag atgctgtaca tattacatcc 1620atgtttggat ctggaacaca acccaccgaa ggcggtgaag atgctgtaca tattacatcc 1620
gagtcggagg tcaaggcaac caacccaact gcaatcgatg aatacggacg agtggccgat 1680gagtcggagg tcaaggcaac caacccaact gcaatcgatg aatacggacg agtggccgat 1680
aatacgcaaa atgcaacaac cgccccaacc acagtgggaa atgctgcaat gggggccatg 1740aatacgcaaa atgcaacaac cgccccaacc acagtgggaa atgctgcaat gggggccatg 1740
cctgggatgg tgtggcaaga tagggatatc tatcttcaag gacccatctg gggaaaaata 1800cctgggatgg tgtggcaaga tagggatatc tatcttcaag gacccatctg gggaaaaata 1800
ccccatacag acggacattt tcatccgtct cctctcatgg gggggtttgg atacagaaaa 1860ccccatacag acggacattt tcatccgtct cctctcatgg gggggtttgg atacagaaaa 1860
ccccctccgc aaatttttat taaaaacacc cccgttcctg gaaatccggc aactacattt 1920ccccctccgc aaatttttat taaaaacacc cccgttcctg gaaatccggc aactacattt 1920
tctccaaata gaataaacaa tttcattact caatactcaa cgggacaagt gaccgttact 1980tctccaaata gaataaacaa tttcattact caatactcaa cgggacaagt gaccgttact 1980
attgactggg agctgcaaaa ggaaaactca aagagatgga acccagaagt acaatttaca 2040attgactggg agctgcaaaa ggaaaactca aagagatgga acccagaagt acaatttaca 2040
tcaaattttg gcacggtcga ttcactaaac tgggcaccgg acaacgcggg aaactacaaa 2100tcaaattttg gcacggtcga ttcactaaac tgggcaccgg acaacgcggg aaactacaaa 2100
gaaccaaggg tggtggggtc tcgattcctt acgcatatac tataa 2145gaaccaaggg tggtggggtc tcgattcctt acgcatatac tataa 2145
<210> 55<210> 55
<211> 714<211> 714
<212> БЕЛОК<212> PROTEIN
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Cap VP1 AAV2 VP2 VP3 вируса морского льва B1 заменен<223> Cap VP1 AAV2 VP2 VP3 Sea Lion Virus B1 Replaced
<400> 55<400> 55
Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Thr Leu Ser Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Thr Leu Ser
1 5 10 15 1 5 10 15
Glu Gly Ile Arg Gln Trp Trp Lys Leu Lys Pro Gly Pro Pro Pro Pro Glu Gly Ile Arg Gln Trp Trp Lys Leu Lys Pro Gly Pro Pro Pro Pro
20 25 30 20 25 30
Lys Pro Ala Glu Arg His Lys Asp Asp Ser Arg Gly Leu Val Leu Pro Lys Pro Ala Glu Arg His Lys Asp Asp Ser Arg Gly Leu Val Leu Pro
35 40 45 35 40 45
Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro
50 55 60 50 55 60
Val Asn Glu Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp Val Asn Glu Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp
65 70 75 80 65 70 75 80
Arg Gln Leu Asp Ser Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala Arg Gln Leu Asp Ser Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala
85 90 95 85 90 95
Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Lys Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Lys Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly
100 105 110 100 105 110
Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro
115 120 125 115 120 125
Leu Gly Leu Val Glu Glu Pro Ser Gln Pro Asp Ser Ser Ser Asp Asn Leu Gly Leu Val Glu Glu Pro Ser Gln Pro Asp Ser Ser Ser Asp Asn
130 135 140 130 135 140
Thr Ala Pro Pro Val Lys Lys Ser Arg Leu Glu Glu Ala Gln Pro Ile Thr Ala Pro Pro Val Lys Lys Ser Arg Leu Glu Glu Ala Gln Pro Ile
145 150 155 160 145 150 155 160
Gln Ser Pro Asp Val Ser Ser Ser Thr Gly Gly Gly Ile Ala Asp Val Gln Ser Pro Asp Val Ser Ser Ser Thr Gly Gly Gly Ile Ala Asp Val
165 170 175 165 170 175
Met Ser Gly Asp Ala Glu Met Ala Ala Val Gly Gly Gly Ala Pro Gly Met Ser Gly Asp Ala Glu Met Ala Ala Val Gly Gly Gly Ala Pro Gly
180 185 190 180 185 190
Val Asp Gly Gln Gly Ala Glu Gly Val Gly Thr Ser Ser Gly Asn Trp Val Asp Gly Gln Gly Ala Glu Gly Val Gly Thr Ser Ser Gly Asn Trp
195 200 205 195 200 205
His Cys Asp Ser Gln Trp Ser Glu Gly His Val Arg Thr Thr Ser Thr His Cys Asp Ser Gln Trp Ser Glu Gly His Val Arg Thr Thr Ser Thr
210 215 220 210 215 220
Arg Thr Trp Val Leu Pro Ser Tyr Asn Asn His Leu Tyr Lys Arg Leu Arg Thr Trp Val Leu Pro Ser Tyr Asn Asn His Leu Tyr Lys Arg Leu
225 230 235 240 225 230 235 240
Gly Ser Ser Ala Gln Ser Asn Thr Tyr Asn Gly Phe Ser Thr Pro Trp Gly Ser Ser Ala Gln Ser Asn Thr Tyr Asn Gly Phe Ser Thr Pro Trp
245 250 255 245 250 255
Gly Tyr Leu Asp Phe Asn Arg Trp His Cys His Phe Ser Pro Arg Asn Gly Tyr Leu Asp Phe Asn Arg Trp His Cys His Phe Ser Pro Arg Asn
260 265 270 260 265 270
Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn Asn Trp Gly Ile Arg Pro Lys Arg Leu Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn Asn Trp Gly Ile Arg Pro Lys Arg Leu
275 280 285 275 280 285
Asn Val Lys Leu Phe Asn Ile Gln Val Lys Glu Val Thr Thr Glu Gly Asn Val Lys Leu Phe Asn Ile Gln Val Lys Glu Val Thr Thr Glu Gly
290 295 300 290 295 300
Gly Thr Thr Thr Val Ala Asn Asn Leu Thr Ser Thr Ile Gln Val Phe Gly Thr Thr Thr Val Ala Asn Asn Leu Thr Ser Thr Ile Gln Val Phe
305 310 315 320 305 310 315 320
Ala Asp Asn Ala Tyr Glu Leu Pro Tyr Val Val Asp Ala Gly His Glu Ala Asp Asn Ala Tyr Glu Leu Pro Tyr Val Val Asp Ala Gly His Glu
325 330 335 325 330 335
Gly Ala Leu Pro Pro Phe Pro Asn Asp Val Phe Met Ile Pro Gln Tyr Gly Ala Leu Pro Pro Phe Pro Asn Asp Val Phe Met Ile Pro Gln Tyr
340 345 350 340 345 350
Gly Tyr Cys Gly Leu Val Ser Gly Gln Ser Gln Ala Gln Ser Asp Leu Gly Tyr Cys Gly Leu Val Ser Gly Gln Ser Gln Ala Gln Ser Asp Leu
355 360 365 355 360 365
Cys Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe Pro Ser Gln Met Leu Arg Thr Cys Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe Pro Ser Gln Met Leu Arg Thr
370 375 380 370 375 380
Gly Asn Asn Phe Glu Met Asn Phe Arg Phe Glu Asp Val Pro Phe His Gly Asn Asn Phe Glu Met Asn Phe Arg Phe Glu Asp Val Pro Phe His
385 390 395 400 385 390 395 400
Ser Met Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu Asp Arg Leu Met Asn Pro Leu Ser Met Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu Asp Arg Leu Met Asn Pro Leu
405 410 415 405 410 415
Ile Asp Gln Tyr Leu Trp Ser Leu Lys Gln Thr Gly Asn Pro Thr Gly Ile Asp Gln Tyr Leu Trp Ser Leu Lys Gln Thr Gly Asn Pro Thr Gly
420 425 430 420 425 430
Ser Thr Thr Arg Asp Leu Lys Phe Ile Lys Asn Lys Val Pro Asn Phe Ser Thr Thr Arg Asp Leu Lys Phe Ile Lys Asn Lys Val Pro Asn Phe
435 440 445 435 440 445
Ala His Tyr Gly Lys Asn Trp Leu Pro Gly Pro Phe Ile Arg Gln Gln Ala His Tyr Gly Lys Asn Trp Leu Pro Gly Pro Phe Ile Arg Gln Gln
450 455 460 450 455 460
Gly Trp Thr Thr Gln Asn Ile Asn Asn Ser Val Val Asn Phe Asn Asp Gly Trp Thr Thr Gln Asn Ile Asn Asn Ser Val Val Asn Phe Asn Asp
465 470 475 480 465 470 475 480
Met Leu Gly Lys Asn Ser Thr Phe Thr Leu Asp Thr Arg Trp Ser Ser Met Leu Gly Lys Asn Ser Thr Phe Thr Leu Asp Thr Arg Trp Ser Ser
485 490 495 485 490 495
Leu Ala Pro Gly Pro Cys Met Gly Asp Asp Gly Arg Thr Pro Ser Thr Leu Ala Pro Gly Pro Cys Met Gly Asp Asp Gly Arg Thr Pro Ser Thr
500 505 510 500 505 510
Thr Lys Phe Ser Asn Ala Gln Leu Met Phe Gly Ser Gly Thr Gln Pro Thr Lys Phe Ser Asn Ala Gln Leu Met Phe Gly Ser Gly Thr Gln Pro
515 520 525 515 520 525
Thr Glu Gly Gly Glu Asp Ala Val His Ile Thr Ser Glu Ser Glu Val Thr Glu Gly Gly Glu Asp Ala Val His Ile Thr Ser Glu Ser Glu Val
530 535 540 530 535 540
Lys Ala Thr Asn Pro Thr Ala Ile Asp Glu Tyr Gly Arg Val Ala Asp Lys Ala Thr Asn Pro Thr Ala Ile Asp Glu Tyr Gly Arg Val Ala Asp
545 550 555 560 545 550 555 560
Asn Thr Gln Asn Ala Thr Thr Ala Pro Thr Thr Val Gly Asn Ala Ala Asn Thr Gln Asn Ala Thr Thr Ala Pro Thr Thr Val Gly Asn Ala Ala
565 570 575 565 570 575
Met Gly Ala Met Pro Gly Met Val Trp Gln Asp Arg Asp Ile Tyr Leu Met Gly Ala Met Pro Gly Met Val Trp Gln Asp Arg Asp Ile Tyr Leu
580 585 590 580 585 590
Gln Gly Pro Ile Trp Gly Lys Ile Pro His Thr Asp Gly His Phe His Gln Gly Pro Ile Trp Gly Lys Ile Pro His Thr Asp Gly His Phe His
595 600 605 595 600 605
Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe Gly Tyr Arg Lys Pro Pro Pro Gln Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe Gly Tyr Arg Lys Pro Pro Pro Gln
610 615 620 610 615 620
Ile Phe Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro Gly Asn Pro Ala Thr Thr Phe Ile Phe Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro Gly Asn Pro Ala Thr Thr Phe
625 630 635 640 625 630 635 640
Ser Pro Asn Arg Ile Asn Asn Phe Ile Thr Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Ser Pro Asn Arg Ile Asn Asn Phe Ile Thr Gln Tyr Ser Thr Gly Gln
645 650 655 645 650 655
Val Thr Val Thr Ile Asp Trp Glu Leu Gln Lys Glu Asn Ser Lys Arg Val Thr Val Thr Ile Asp Trp Glu Leu Gln Lys Glu Asn Ser Lys Arg
660 665 670 660 665 670
Trp Asn Pro Glu Val Gln Phe Thr Ser Asn Phe Gly Thr Val Asp Ser Trp Asn Pro Glu Val Gln Phe Thr Ser Asn Phe Gly Thr Val Asp Ser
675 680 685 675 680 685
Leu Asn Trp Ala Pro Asp Asn Ala Gly Asn Tyr Lys Glu Pro Arg Val Leu Asn Trp Ala Pro Asp Asn Ala Gly Asn Tyr Lys Glu Pro Arg Val
690 695 700 690 695 700
Val Gly Ser Arg Phe Leu Thr His Ile Leu Val Gly Ser Arg Phe Leu Thr His Ile Leu
705 710 705 710
<210> 56<210> 56
<211> 2145<211> 2145
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Cap VP1 AAV2 VP2 VP3 вируса морского льва v2<223> Cap VP1 AAV2 VP2 VP3 Sea Lion Virus v2
<400> 56<400> 56
atggctgccg atggttatct tccagattgg ctcgaggaca ctctctctga aggaataaga 60atggctgccg atggttatct tccagattgg ctcgaggaca ctctctctga aggaataaga 60
cagtggtgga agctcaaacc tggcccacca ccaccaaagc ccgcagagcg gcataaggac 120cagtggtgga agctcaaacc tggcccacca ccaccaaagc ccgcagagcg gcataaggac 120
gacagcaggg gtcttgtgct tcctgggtac aagtacctcg gacccttcaa cggactcgac 180gacagcaggg gtcttgtgct tcctgggtac aagtacctcg gacccttcaa cggactcgac 180
aagggagagc cggtcaacga ggcagacgcc gcggccctcg agcacgacaa agcctacgac 240aagggagagc cggtcaacga ggcagacgcc gcggccctcg agcacgacaa agcctacgac 240
cggcagctcg acagcggaga caacccgtac ctcaagtaca accacgccga cgcggagttt 300cggcagctcg acagcggaga caacccgtac ctcaagtaca accacgccga cgcggagttt 300
caggagcgcc ttaaagaaga tacgtctttt gggggcaacc tcggacgagc agtcttccag 360caggagcgcc ttaaagaaga tacgtctttt gggggcaacc tcggacgagc agtcttccag 360
gcgaaaaaga gggttcttga acctctgggc ctggttgagg aacctgttaa gacggctccg 420gcgaaaaaga gggttcttga acctctgggc ctggttgagg aacctgttaa gacggctccg 420
ggaaaaaaga ggacggcgcc acccgtgaaa aagtcccgtc tcgaagaagc ccagcccatt 480ggaaaaaaga ggacggcgcc acccgtgaaa aagtcccgtc tcgaagaagc ccagcccatt 480
caaagtccag acgtttccag cagcactggc ggaggaattg ccgacgtcat gtctggagat 540caaagtccag acgtttccag cagcactggc ggaggaattg ccgacgtcat gtctggagat 540
gctgaaatgg ctgcagtggg cgggggagca ccgggcgtcg acggccaggg tgccgaggga 600gctgaaatgg ctgcagtggg cgggggagca ccgggcgtcg acggccaggg tgccgaggga 600
gtgggtactt cctcgggtaa ttggcattgc gattcccagt ggtcagaagg acacgtcaga 660gtgggtactt cctcgggtaa ttggcattgc gattcccagt ggtcagaagg acacgtcaga 660
accaccagca ccagaacctg ggtgttgccc agctacaaca accacctgta taaacggctt 720accaccagca ccagaacctg ggtgttgccc agctacaaca accacctgta taaacggctt 720
ggaagtagcg cacaatccaa tacctacaac ggattctcca ccccctgggg atacctcgac 780ggaagtagcg cacaatccaa tacctacaac ggattctcca ccccctgggg atacctcgac 780
ttcaatagat ggcactgtca cttcagtcct cggaactggc aacgtctcat caacaacaac 840ttcaatagat ggcactgtca cttcagtcct cggaactggc aacgtctcat caacaacaac 840
tggggcatca gaccaaaaag acttaatgtt aaattgttca acatacaagt caaagaggtc 900tggggcatca gaccaaaaag acttaatgtt aaattgttca acatacaagt caaagaggtc 900
acgacggaag gggggacgac gaccgtcgcc aataacctta ccagcacgat tcaggtgttt 960acgacggaag gggggacgac gaccgtcgcc aataacctta ccagcacgat tcaggtgttt 960
gcggacaacg cgtacgaact cccgtatgtt gtcgacgcgg gtcacgaggg ggcattgccg 1020gcggacaacg cgtacgaact cccgtatgtt gtcgacgcgg gtcacgaggg ggcattgccg 1020
ccgttcccaa acgacgtgtt tatgattccc caatacggat actgcgggct ggtgtctggt 1080ccgttcccaa acgacgtgtt tatgattccc caatacggat actgcgggct ggtgtctggt 1080
caaagtcagg ctcagtcgga cttgtgttcg ttttattgcc tggagtattt tccatcccag 1140caaagtcagg ctcagtcgga cttgtgttcg ttttattgcc tggagtattt tccatcccag 1140
atgctgagaa caggaaacaa ttttgaaatg aatttcaggt ttgaagacgt tccatttcac 1200atgctgagaa caggaaacaa ttttgaaatg aatttcaggt ttgaagacgt tccatttcac 1200
tccatgtacg cccacagcca gtctctagac aggctcatga atcctttaat tgatcagtat 1260tccatgtacg cccacagcca gtctctagac aggctcatga atcctttaat tgatcagtat 1260
ctgtggagtc taaaacaaac aggaaacccg actggatcaa caacgagaga cttaaaattt 1320ctgtggagtc taaaacaaac aggaaacccg actggatcaa caacgagaga cttaaaattt 1320
atcaagaaca aagttcccaa ttttgcacat tatggaaaaa attggcttcc tggacctttt 1380atcaagaaca aagttcccaa ttttgcacat tatggaaaaa attggcttcc tggacctttt 1380
attagacaac aggggtggac aacacaaaat attaataata gtgttgttaa ttttaatgac 1440attagacaac aggggtggac aacacaaaat attaataata gtgttgttaa ttttaatgac 1440
atgctgggaa aaaattcgac atttactttg gacactagat ggagttcatt agcgcctggt 1500atgctgggaa aaaattcgac atttactttg gacactagat ggagttcatt agcgcctggt 1500
ccgtgtatgg gggatgacgg acgaactcca tccaccacca agttctcaaa tgctcagctc 1560ccgtgtatgg gggatgacgg acgaactcca tccaccacca agttctcaaa tgctcagctc 1560
atgtttggat ctggaacaca acccaccgaa ggcggtgaag atgctgtaca tattacatcc 1620atgtttggat ctggaacaca acccaccgaa ggcggtgaag atgctgtaca tattacatcc 1620
gagtcggagg tcaaggcaac caacccaact gcaatcgatg aatacggacg agtggccgat 1680gagtcggagg tcaaggcaac caacccaact gcaatcgatg aatacggacg agtggccgat 1680
aatacgcaaa atgcaacaac cgccccaacc acagtgggaa atgctgcaat gggggccatg 1740aatacgcaaa atgcaacaac cgccccaacc acagtgggaa atgctgcaat gggggccatg 1740
cctgggatgg tgtggcaaga tagggatatc tatcttcaag gacccatctg gggaaaaata 1800cctgggatgg tgtggcaaga tagggatatc tatcttcaag gacccatctg gggaaaaata 1800
ccccatacag acggacattt tcatccgtct cctctcatgg gggggtttgg atacagaaaa 1860ccccatacag acggacattt tcatccgtct cctctcatgg gggggtttgg atacagaaaa 1860
ccccctccgc aaatttttat taaaaacacc cccgttcctg gaaatccggc aactacattt 1920ccccctccgc aaatttttat taaaaacacc cccgttcctg gaaatccggc aactacattt 1920
tctccaaata gaataaacaa tttcattact caatactcaa cgggacaagt gaccgttact 1980tctccaaata gaataaacaa tttcattact caatactcaa cgggacaagt gaccgttact 1980
attgactggg agctgcaaaa ggaaaactca aagagatgga acccagaagt acaatttaca 2040attgactggg agctgcaaaa ggaaaactca aagagatgga acccagaagt acaatttaca 2040
tcaaattttg gcacggtcga ttcactaaac tgggcaccgg acaacgcggg aaactacaaa 2100tcaaattttg gcacggtcga ttcactaaac tgggcaccgg acaacgcggg aaactacaaa 2100
gaaccaaggg tgattggcac cagatacctg actcgtatac tataa 2145gaaccaaggg tgattggcac cagatacctg actcgtatac tataa 2145
<210> 57<210> 57
<211> 714<211> 714
<212> БЕЛОК<212> PROTEIN
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Cap VP1 AAV2 VP2 VP3 вируса морского льва v2<223> Cap VP1 AAV2 VP2 VP3 Sea Lion Virus v2
<400> 57<400> 57
Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Thr Leu Ser Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Thr Leu Ser
1 5 10 15 1 5 10 15
Glu Gly Ile Arg Gln Trp Trp Lys Leu Lys Pro Gly Pro Pro Pro Pro Glu Gly Ile Arg Gln Trp Trp Lys Leu Lys Pro Gly Pro Pro Pro Pro
20 25 30 20 25 30
Lys Pro Ala Glu Arg His Lys Asp Asp Ser Arg Gly Leu Val Leu Pro Lys Pro Ala Glu Arg His Lys Asp Asp Ser Arg Gly Leu Val Leu Pro
35 40 45 35 40 45
Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro
50 55 60 50 55 60
Val Asn Glu Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp Val Asn Glu Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp
65 70 75 80 65 70 75 80
Arg Gln Leu Asp Ser Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala Arg Gln Leu Asp Ser Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala
85 90 95 85 90 95
Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Lys Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Lys Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly
100 105 110 100 105 110
Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro
115 120 125 115 120 125
Leu Gly Leu Val Glu Glu Pro Val Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg Leu Gly Leu Val Glu Glu Pro Val Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg
130 135 140 130 135 140
Thr Ala Pro Pro Val Lys Lys Ser Arg Leu Glu Glu Ala Gln Pro Ile Thr Ala Pro Pro Val Lys Lys Ser Arg Leu Glu Glu Ala Gln Pro Ile
145 150 155 160 145 150 155 160
Gln Ser Pro Asp Val Ser Ser Ser Thr Gly Gly Gly Ile Ala Asp Val Gln Ser Pro Asp Val Ser Ser Ser Thr Gly Gly Gly Ile Ala Asp Val
165 170 175 165 170 175
Met Ser Gly Asp Ala Glu Met Ala Ala Val Gly Gly Gly Ala Pro Gly Met Ser Gly Asp Ala Glu Met Ala Ala Val Gly Gly Gly Ala Pro Gly
180 185 190 180 185 190
Val Asp Gly Gln Gly Ala Glu Gly Val Gly Thr Ser Ser Gly Asn Trp Val Asp Gly Gln Gly Ala Glu Gly Val Gly Thr Ser Ser Gly Asn Trp
195 200 205 195 200 205
His Cys Asp Ser Gln Trp Ser Glu Gly His Val Arg Thr Thr Ser Thr His Cys Asp Ser Gln Trp Ser Glu Gly His Val Arg Thr Thr Ser Thr
210 215 220 210 215 220
Arg Thr Trp Val Leu Pro Ser Tyr Asn Asn His Leu Tyr Lys Arg Leu Arg Thr Trp Val Leu Pro Ser Tyr Asn Asn His Leu Tyr Lys Arg Leu
225 230 235 240 225 230 235 240
Gly Ser Ser Ala Gln Ser Asn Thr Tyr Asn Gly Phe Ser Thr Pro Trp Gly Ser Ser Ala Gln Ser Asn Thr Tyr Asn Gly Phe Ser Thr Pro Trp
245 250 255 245 250 255
Gly Tyr Leu Asp Phe Asn Arg Trp His Cys His Phe Ser Pro Arg Asn Gly Tyr Leu Asp Phe Asn Arg Trp His Cys His Phe Ser Pro Arg Asn
260 265 270 260 265 270
Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn Asn Trp Gly Ile Arg Pro Lys Arg Leu Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn Asn Trp Gly Ile Arg Pro Lys Arg Leu
275 280 285 275 280 285
Asn Val Lys Leu Phe Asn Ile Gln Val Lys Glu Val Thr Thr Glu Gly Asn Val Lys Leu Phe Asn Ile Gln Val Lys Glu Val Thr Thr Glu Gly
290 295 300 290 295 300
Gly Thr Thr Thr Val Ala Asn Asn Leu Thr Ser Thr Ile Gln Val Phe Gly Thr Thr Thr Val Ala Asn Asn Leu Thr Ser Thr Ile Gln Val Phe
305 310 315 320 305 310 315 320
Ala Asp Asn Ala Tyr Glu Leu Pro Tyr Val Val Asp Ala Gly His Glu Ala Asp Asn Ala Tyr Glu Leu Pro Tyr Val Val Asp Ala Gly His Glu
325 330 335 325 330 335
Gly Ala Leu Pro Pro Phe Pro Asn Asp Val Phe Met Ile Pro Gln Tyr Gly Ala Leu Pro Pro Phe Pro Asn Asp Val Phe Met Ile Pro Gln Tyr
340 345 350 340 345 350
Gly Tyr Cys Gly Leu Val Ser Gly Gln Ser Gln Ala Gln Ser Asp Leu Gly Tyr Cys Gly Leu Val Ser Gly Gln Ser Gln Ala Gln Ser Asp Leu
355 360 365 355 360 365
Cys Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe Pro Ser Gln Met Leu Arg Thr Cys Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe Pro Ser Gln Met Leu Arg Thr
370 375 380 370 375 380
Gly Asn Asn Phe Glu Met Asn Phe Arg Phe Glu Asp Val Pro Phe His Gly Asn Asn Phe Glu Met Asn Phe Arg Phe Glu Asp Val Pro Phe His
385 390 395 400 385 390 395 400
Ser Met Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu Asp Arg Leu Met Asn Pro Leu Ser Met Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu Asp Arg Leu Met Asn Pro Leu
405 410 415 405 410 415
Ile Asp Gln Tyr Leu Trp Ser Leu Lys Gln Thr Gly Asn Pro Thr Gly Ile Asp Gln Tyr Leu Trp Ser Leu Lys Gln Thr Gly Asn Pro Thr Gly
420 425 430 420 425 430
Ser Thr Thr Arg Asp Leu Lys Phe Ile Lys Asn Lys Val Pro Asn Phe Ser Thr Thr Arg Asp Leu Lys Phe Ile Lys Asn Lys Val Pro Asn Phe
435 440 445 435 440 445
Ala His Tyr Gly Lys Asn Trp Leu Pro Gly Pro Phe Ile Arg Gln Gln Ala His Tyr Gly Lys Asn Trp Leu Pro Gly Pro Phe Ile Arg Gln Gln
450 455 460 450 455 460
Gly Trp Thr Thr Gln Asn Ile Asn Asn Ser Val Val Asn Phe Asn Asp Gly Trp Thr Thr Gln Asn Ile Asn Asn Ser Val Val Asn Phe Asn Asp
465 470 475 480 465 470 475 480
Met Leu Gly Lys Asn Ser Thr Phe Thr Leu Asp Thr Arg Trp Ser Ser Met Leu Gly Lys Asn Ser Thr Phe Thr Leu Asp Thr Arg Trp Ser Ser
485 490 495 485 490 495
Leu Ala Pro Gly Pro Cys Met Gly Asp Asp Gly Arg Thr Pro Ser Thr Leu Ala Pro Gly Pro Cys Met Gly Asp Asp Gly Arg Thr Pro Ser Thr
500 505 510 500 505 510
Thr Lys Phe Ser Asn Ala Gln Leu Met Phe Gly Ser Gly Thr Gln Pro Thr Lys Phe Ser Asn Ala Gln Leu Met Phe Gly Ser Gly Thr Gln Pro
515 520 525 515 520 525
Thr Glu Gly Gly Glu Asp Ala Val His Ile Thr Ser Glu Ser Glu Val Thr Glu Gly Gly Glu Asp Ala Val His Ile Thr Ser Glu Ser Glu Val
530 535 540 530 535 540
Lys Ala Thr Asn Pro Thr Ala Ile Asp Glu Tyr Gly Arg Val Ala Asp Lys Ala Thr Asn Pro Thr Ala Ile Asp Glu Tyr Gly Arg Val Ala Asp
545 550 555 560 545 550 555 560
Asn Thr Gln Asn Ala Thr Thr Ala Pro Thr Thr Val Gly Asn Ala Ala Asn Thr Gln Asn Ala Thr Thr Ala Pro Thr Thr Val Gly Asn Ala Ala
565 570 575 565 570 575
Met Gly Ala Met Pro Gly Met Val Trp Gln Asp Arg Asp Ile Tyr Leu Met Gly Ala Met Pro Gly Met Val Trp Gln Asp Arg Asp Ile Tyr Leu
580 585 590 580 585 590
Gln Gly Pro Ile Trp Gly Lys Ile Pro His Thr Asp Gly His Phe His Gln Gly Pro Ile Trp Gly Lys Ile Pro His Thr Asp Gly His Phe His
595 600 605 595 600 605
Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe Gly Tyr Arg Lys Pro Pro Pro Gln Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe Gly Tyr Arg Lys Pro Pro Pro Gln
610 615 620 610 615 620
Ile Phe Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro Gly Asn Pro Ala Thr Thr Phe Ile Phe Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro Gly Asn Pro Ala Thr Thr Phe
625 630 635 640 625 630 635 640
Ser Pro Asn Arg Ile Asn Asn Phe Ile Thr Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Ser Pro Asn Arg Ile Asn Asn Phe Ile Thr Gln Tyr Ser Thr Gly Gln
645 650 655 645 650 655
Val Thr Val Thr Ile Asp Trp Glu Leu Gln Lys Glu Asn Ser Lys Arg Val Thr Val Thr Ile Asp Trp Glu Leu Gln Lys Glu Asn Ser Lys Arg
660 665 670 660 665 670
Trp Asn Pro Glu Val Gln Phe Thr Ser Asn Phe Gly Thr Val Asp Ser Trp Asn Pro Glu Val Gln Phe Thr Ser Asn Phe Gly Thr Val Asp Ser
675 680 685 675 680 685
Leu Asn Trp Ala Pro Asp Asn Ala Gly Asn Tyr Lys Glu Pro Arg Val Leu Asn Trp Ala Pro Asp Asn Ala Gly Asn Tyr Lys Glu Pro Arg Val
690 695 700 690 695 700
Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg Ile Leu Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg Ile Leu
705 710 705 710
<210> 58<210> 58
<211> 2145<211> 2145
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Cap VP1 AAV2 VP2 VP3 вируса морского льва v3<223> Cap VP1 AAV2 VP2 VP3 Sea Lion Virus v3
<400> 58<400> 58
atggctgccg atggttatct tccagattgg ctcgaggaca ctctctctga aggaataaga 60atggctgccg atggttatct tccagattgg ctcgaggaca ctctctctga aggaataaga 60
cagtggtgga agctcaaacc tggcccacca ccaccaaagc ccgcagagcg gcataaggac 120cagtggtgga agctcaaacc tggcccacca ccaccaaagc ccgcagagcg gcataaggac 120
gacagcaggg gtcttgtgct tcctgggtac aagtacctcg gacccttcaa cggactcgac 180gacagcaggg gtcttgtgct tcctgggtac aagtacctcg gacccttcaa cggactcgac 180
aagggagagc cggtcaacga ggcagacgcc gcggccctcg agcacgacaa agcctacgac 240aagggagagc cggtcaacga ggcagacgcc gcggccctcg agcacgacaa agcctacgac 240
cggcagctcg acagcggaga caacccgtac ctcaagtaca accacgccga cgcggagttt 300cggcagctcg acagcggaga caacccgtac ctcaagtaca accacgccga cgcggagttt 300
caggagcgcc ttaaagaaga tacgtctttt gggggcaacc tcggacgagc agtcttccag 360caggagcgcc ttaaagaaga tacgtctttt gggggcaacc tcggacgagc agtcttccag 360
gcgaaaaaga gggttcttga acctctgggc ctggttgagg aacctgttaa gacggctccg 420gcgaaaaaga gggttcttga acctctgggc ctggttgagg aacctgttaa gacggctccg 420
ggaaaaaaga ggccggtaga gcactctcct gtggagccag actcctcctc gggaaccgga 480ggaaaaaaga ggccggtaga gcactctcct gtggagccag actcctcctc gggaaccgga 480
aaggcgggcc agcagcctgc aagaaaaaga ttgaattttg gtcagactat gtctggagat 540aaggcgggcc agcagcctgc aagaaaaaga ttgaattttg gtcagactat gtctggagat 540
gctgaaatgg ctgcagtggg cgggggagca ccgggcgtcg acggccaggg tgccgaggga 600gctgaaatgg ctgcagtggg cgggggagca ccgggcgtcg acggccaggg tgccgaggga 600
gtgggtactt cctcgggtaa ttggcattgc gattcccagt ggtcagaagg acacgtcaga 660gtgggtactt cctcgggtaa ttggcattgc gattcccagt ggtcagaagg acacgtcaga 660
accaccagca ccagaacctg ggtgttgccc agctacaaca accacctgta taaacggctt 720accaccagca ccagaacctg ggtgttgccc agctacaaca accacctgta taaacggctt 720
ggaagtagcg cacaatccaa tacctacaac ggattctcca ccccctgggg atacctcgac 780ggaagtagcg cacaatccaa tacctacaac ggattctcca ccccctgggg atacctcgac 780
ttcaatagat ggcactgtca cttcagtcct cggaactggc aacgtctcat caacaacaac 840ttcaatagat ggcactgtca cttcagtcct cggaactggc aacgtctcat caacaacaac 840
tggggcatca gaccaaaaag acttaatgtt aaattgttca acatacaagt caaagaggtc 900tggggcatca gaccaaaaag acttaatgtt aaattgttca acatacaagt caaagaggtc 900
acgacggaag gggggacgac gaccgtcgcc aataacctta ccagcacgat tcaggtgttt 960acgacggaag gggggacgac gaccgtcgcc aataacctta ccagcacgat tcaggtgttt 960
gcggacaacg cgtacgaact cccgtatgtt gtcgacgcgg gtcacgaggg ggcattgccg 1020gcggacaacg cgtacgaact cccgtatgtt gtcgacgcgg gtcacgaggg ggcattgccg 1020
ccgttcccaa acgacgtgtt tatgattccc caatacggat actgcgggct ggtgtctggt 1080ccgttcccaa acgacgtgtt tatgattccc caatacggat actgcgggct ggtgtctggt 1080
caaagtcagg ctcagtcgga cttgtgttcg ttttattgcc tggagtattt tccatcccag 1140caaagtcagg ctcagtcgga cttgtgttcg ttttattgcc tggagtattt tccatcccag 1140
atgctgagaa caggaaacaa ttttgaaatg aatttcaggt ttgaagacgt tccatttcac 1200atgctgagaa caggaaacaa ttttgaaatg aatttcaggt ttgaagacgt tccatttcac 1200
tccatgtacg cccacagcca gtctctagac aggctcatga atcctttaat tgatcagtat 1260tccatgtacg cccacagcca gtctctagac aggctcatga atcctttaat tgatcagtat 1260
ctgtggagtc taaaacaaac aggaaacccg actggatcaa caacgagaga cttaaaattt 1320ctgtggagtc taaaacaaac aggaaacccg actggatcaa caacgagaga cttaaaattt 1320
atcaagaaca aagttcccaa ttttgcacat tatggaaaaa attggcttcc tggacctttt 1380atcaagaaca aagttcccaa ttttgcacat tatggaaaaa attggcttcc tggacctttt 1380
attagacaac aggggtggac aacacaaaat attaataata gtgttgttaa ttttaatgac 1440attagacaac aggggtggac aacacaaaat attaataata gtgttgttaa ttttaatgac 1440
atgctgggaa aaaattcgac atttactttg gacactagat ggagttcatt agcgcctggt 1500atgctgggaa aaaattcgac atttactttg gacactagat ggagttcatt agcgcctggt 1500
ccgtgtatgg gggatgacgg acgaactcca tccaccacca agttctcaaa tgctcagctc 1560ccgtgtatgg gggatgacgg acgaactcca tccaccacca agttctcaaa tgctcagctc 1560
atgtttggat ctggaacaca acccaccgaa ggcggtgaag atgctgtaca tattacatcc 1620atgtttggat ctggaacaca acccaccgaa ggcggtgaag atgctgtaca tattacatcc 1620
gagtcggagg tcaaggcaac caacccaact gcaatcgatg aatacggacg agtggccgat 1680gagtcggagg tcaaggcaac caacccaact gcaatcgatg aatacggacg agtggccgat 1680
aatacgcaaa atgcaacaac cgccccaacc acagtgggaa atgctgcaat gggggccatg 1740aatacgcaaa atgcaacaac cgccccaacc acagtgggaa atgctgcaat gggggccatg 1740
cctgggatgg tgtggcaaga tagggatatc tatcttcaag gacccatctg gggaaaaata 1800cctgggatgg tgtggcaaga tagggatatc tatcttcaag gacccatctg gggaaaaata 1800
ccccatacag acggacattt tcatccgtct cctctcatgg gggggtttgg atacagaaaa 1860ccccatacag acggacattt tcatccgtct cctctcatgg gggggtttgg atacagaaaa 1860
ccccctccgc aaatttttat taaaaacacc cccgttcctg gaaatccggc aactacattt 1920ccccctccgc aaatttttat taaaaacacc cccgttcctg gaaatccggc aactacattt 1920
tctccaaata gaataaacaa tttcattact caatactcaa cgggacaagt gaccgttact 1980tctccaaata gaataaacaa tttcattact caatactcaa cgggacaagt gaccgttact 1980
attgactggg agctgcaaaa ggaaaactca aagagatgga acccagaagt acaatttaca 2040attgactggg agctgcaaaa ggaaaactca aagagatgga acccagaagt acaatttaca 2040
tcaaattttg gcacggtcga ttcactaaac tgggcaccgg acaacgcggg aaactacaaa 2100tcaaattttg gcacggtcga ttcactaaac tgggcaccgg acaacgcggg aaactacaaa 2100
gaaccaaggg tgattggcac cagatacctg actcgtatac tataa 2145gaaccaaggg tgattggcac cagatacctg actcgtatac tataa 2145
<210> 59<210> 59
<211> 714<211> 714
<212> БЕЛОК<212> PROTEIN
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Cap VP1 AAV2 VP2 VP3 вируса морского льва v3<223> Cap VP1 AAV2 VP2 VP3 Sea Lion Virus v3
<400> 59<400> 59
Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Thr Leu Ser Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Thr Leu Ser
1 5 10 15 1 5 10 15
Glu Gly Ile Arg Gln Trp Trp Lys Leu Lys Pro Gly Pro Pro Pro Pro Glu Gly Ile Arg Gln Trp Trp Lys Leu Lys Pro Gly Pro Pro Pro Pro
20 25 30 20 25 30
Lys Pro Ala Glu Arg His Lys Asp Asp Ser Arg Gly Leu Val Leu Pro Lys Pro Ala Glu Arg His Lys Asp Asp Ser Arg Gly Leu Val Leu Pro
35 40 45 35 40 45
Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro
50 55 60 50 55 60
Val Asn Glu Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp Val Asn Glu Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp
65 70 75 80 65 70 75 80
Arg Gln Leu Asp Ser Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala Arg Gln Leu Asp Ser Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala
85 90 95 85 90 95
Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Lys Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Lys Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly
100 105 110 100 105 110
Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro
115 120 125 115 120 125
Leu Gly Leu Val Glu Glu Pro Val Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg Leu Gly Leu Val Glu Glu Pro Val Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg
130 135 140 130 135 140
Pro Val Glu His Ser Pro Val Glu Pro Asp Ser Ser Ser Gly Thr Gly Pro Val Glu His Ser Pro Val Glu Pro Asp Ser Ser Ser Gly Thr Gly
145 150 155 160 145 150 155 160
Lys Ala Gly Gln Gln Pro Ala Arg Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln Thr Lys Ala Gly Gln Gln Pro Ala Arg Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln Thr
165 170 175 165 170 175
Met Ser Gly Asp Ala Glu Met Ala Ala Val Gly Gly Gly Ala Pro Gly Met Ser Gly Asp Ala Glu Met Ala Ala Val Gly Gly Gly Ala Pro Gly
180 185 190 180 185 190
Val Asp Gly Gln Gly Ala Glu Gly Val Gly Thr Ser Ser Gly Asn Trp Val Asp Gly Gln Gly Ala Glu Gly Val Gly Thr Ser Ser Gly Asn Trp
195 200 205 195 200 205
His Cys Asp Ser Gln Trp Ser Glu Gly His Val Arg Thr Thr Ser Thr His Cys Asp Ser Gln Trp Ser Glu Gly His Val Arg Thr Thr Ser Thr
210 215 220 210 215 220
Arg Thr Trp Val Leu Pro Ser Tyr Asn Asn His Leu Tyr Lys Arg Leu Arg Thr Trp Val Leu Pro Ser Tyr Asn Asn His Leu Tyr Lys Arg Leu
225 230 235 240 225 230 235 240
Gly Ser Ser Ala Gln Ser Asn Thr Tyr Asn Gly Phe Ser Thr Pro Trp Gly Ser Ser Ala Gln Ser Asn Thr Tyr Asn Gly Phe Ser Thr Pro Trp
245 250 255 245 250 255
Gly Tyr Leu Asp Phe Asn Arg Trp His Cys His Phe Ser Pro Arg Asn Gly Tyr Leu Asp Phe Asn Arg Trp His Cys His Phe Ser Pro Arg Asn
260 265 270 260 265 270
Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn Asn Trp Gly Ile Arg Pro Lys Arg Leu Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn Asn Trp Gly Ile Arg Pro Lys Arg Leu
275 280 285 275 280 285
Asn Val Lys Leu Phe Asn Ile Gln Val Lys Glu Val Thr Thr Glu Gly Asn Val Lys Leu Phe Asn Ile Gln Val Lys Glu Val Thr Thr Glu Gly
290 295 300 290 295 300
Gly Thr Thr Thr Val Ala Asn Asn Leu Thr Ser Thr Ile Gln Val Phe Gly Thr Thr Thr Val Ala Asn Asn Leu Thr Ser Thr Ile Gln Val Phe
305 310 315 320 305 310 315 320
Ala Asp Asn Ala Tyr Glu Leu Pro Tyr Val Val Asp Ala Gly His Glu Ala Asp Asn Ala Tyr Glu Leu Pro Tyr Val Val Asp Ala Gly His Glu
325 330 335 325 330 335
Gly Ala Leu Pro Pro Phe Pro Asn Asp Val Phe Met Ile Pro Gln Tyr Gly Ala Leu Pro Pro Phe Pro Asn Asp Val Phe Met Ile Pro Gln Tyr
340 345 350 340 345 350
Gly Tyr Cys Gly Leu Val Ser Gly Gln Ser Gln Ala Gln Ser Asp Leu Gly Tyr Cys Gly Leu Val Ser Gly Gln Ser Gln Ala Gln Ser Asp Leu
355 360 365 355 360 365
Cys Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe Pro Ser Gln Met Leu Arg Thr Cys Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe Pro Ser Gln Met Leu Arg Thr
370 375 380 370 375 380
Gly Asn Asn Phe Glu Met Asn Phe Arg Phe Glu Asp Val Pro Phe His Gly Asn Asn Phe Glu Met Asn Phe Arg Phe Glu Asp Val Pro Phe His
385 390 395 400 385 390 395 400
Ser Met Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu Asp Arg Leu Met Asn Pro Leu Ser Met Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu Asp Arg Leu Met Asn Pro Leu
405 410 415 405 410 415
Ile Asp Gln Tyr Leu Trp Ser Leu Lys Gln Thr Gly Asn Pro Thr Gly Ile Asp Gln Tyr Leu Trp Ser Leu Lys Gln Thr Gly Asn Pro Thr Gly
420 425 430 420 425 430
Ser Thr Thr Arg Asp Leu Lys Phe Ile Lys Asn Lys Val Pro Asn Phe Ser Thr Thr Arg Asp Leu Lys Phe Ile Lys Asn Lys Val Pro Asn Phe
435 440 445 435 440 445
Ala His Tyr Gly Lys Asn Trp Leu Pro Gly Pro Phe Ile Arg Gln Gln Ala His Tyr Gly Lys Asn Trp Leu Pro Gly Pro Phe Ile Arg Gln Gln
450 455 460 450 455 460
Gly Trp Thr Thr Gln Asn Ile Asn Asn Ser Val Val Asn Phe Asn Asp Gly Trp Thr Thr Gln Asn Ile Asn Asn Ser Val Val Asn Phe Asn Asp
465 470 475 480 465 470 475 480
Met Leu Gly Lys Asn Ser Thr Phe Thr Leu Asp Thr Arg Trp Ser Ser Met Leu Gly Lys Asn Ser Thr Phe Thr Leu Asp Thr Arg Trp Ser Ser
485 490 495 485 490 495
Leu Ala Pro Gly Pro Cys Met Gly Asp Asp Gly Arg Thr Pro Ser Thr Leu Ala Pro Gly Pro Cys Met Gly Asp Asp Gly Arg Thr Pro Ser Thr
500 505 510 500 505 510
Thr Lys Phe Ser Asn Ala Gln Leu Met Phe Gly Ser Gly Thr Gln Pro Thr Lys Phe Ser Asn Ala Gln Leu Met Phe Gly Ser Gly Thr Gln Pro
515 520 525 515 520 525
Thr Glu Gly Gly Glu Asp Ala Val His Ile Thr Ser Glu Ser Glu Val Thr Glu Gly Gly Glu Asp Ala Val His Ile Thr Ser Glu Ser Glu Val
530 535 540 530 535 540
Lys Ala Thr Asn Pro Thr Ala Ile Asp Glu Tyr Gly Arg Val Ala Asp Lys Ala Thr Asn Pro Thr Ala Ile Asp Glu Tyr Gly Arg Val Ala Asp
545 550 555 560 545 550 555 560
Asn Thr Gln Asn Ala Thr Thr Ala Pro Thr Thr Val Gly Asn Ala Ala Asn Thr Gln Asn Ala Thr Thr Ala Pro Thr Thr Val Gly Asn Ala Ala
565 570 575 565 570 575
Met Gly Ala Met Pro Gly Met Val Trp Gln Asp Arg Asp Ile Tyr Leu Met Gly Ala Met Pro Gly Met Val Trp Gln Asp Arg Asp Ile Tyr Leu
580 585 590 580 585 590
Gln Gly Pro Ile Trp Gly Lys Ile Pro His Thr Asp Gly His Phe His Gln Gly Pro Ile Trp Gly Lys Ile Pro His Thr Asp Gly His Phe His
595 600 605 595 600 605
Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe Gly Tyr Arg Lys Pro Pro Pro Gln Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe Gly Tyr Arg Lys Pro Pro Pro Gln
610 615 620 610 615 620
Ile Phe Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro Gly Asn Pro Ala Thr Thr Phe Ile Phe Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro Gly Asn Pro Ala Thr Thr Phe
625 630 635 640 625 630 635 640
Ser Pro Asn Arg Ile Asn Asn Phe Ile Thr Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Ser Pro Asn Arg Ile Asn Asn Phe Ile Thr Gln Tyr Ser Thr Gly Gln
645 650 655 645 650 655
Val Thr Val Thr Ile Asp Trp Glu Leu Gln Lys Glu Asn Ser Lys Arg Val Thr Val Thr Ile Asp Trp Glu Leu Gln Lys Glu Asn Ser Lys Arg
660 665 670 660 665 670
Trp Asn Pro Glu Val Gln Phe Thr Ser Asn Phe Gly Thr Val Asp Ser Trp Asn Pro Glu Val Gln Phe Thr Ser Asn Phe Gly Thr Val Asp Ser
675 680 685 675 680 685
Leu Asn Trp Ala Pro Asp Asn Ala Gly Asn Tyr Lys Glu Pro Arg Val Leu Asn Trp Ala Pro Asp Asn Ala Gly Asn Tyr Lys Glu Pro Arg Val
690 695 700 690 695 700
Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg Ile Leu Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg Ile Leu
705 710 705 710
<210> 60<210> 60
<211> 2145<211> 2145
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Cap VP1 AAV2 VP2 VP3 вируса морского льва v4<223> Cap VP1 AAV2 VP2 VP3 Sea Lion Virus v4
<400> 60<400> 60
atggctgccg atggttatct tccagattgg ctcgaggaca ctctctctga aggaataaga 60atggctgccg atggttatct tccagattgg ctcgaggaca ctctctctga aggaataaga 60
cagtggtgga agctcaaacc tggcccacca ccaccaaagc ccgcagagcg gcataaggac 120cagtggtgga agctcaaacc tggcccacca ccaccaaagc ccgcagagcg gcataaggac 120
gacagcaggg gtcttgtgct tcctgggtac aagtacctcg gacccttcaa cggactcgac 180gacagcaggg gtcttgtgct tcctgggtac aagtacctcg gacccttcaa cggactcgac 180
aagggagagc cggtcaacga ggcagacgcc gcggccctcg agcacgacaa agcctacgac 240aagggagagc cggtcaacga ggcagacgcc gcggccctcg agcacgacaa agcctacgac 240
cggcagctcg acagcggaga caacccgtac ctcaagtaca accacgccga cgcggagttt 300cggcagctcg acagcggaga caacccgtac ctcaagtaca accacgccga cgcggagttt 300
caggagcgcc ttaaagaaga tacgtctttt gggggcaacc tcggacgagc agtcttccag 360caggagcgcc ttaaagaaga tacgtctttt gggggcaacc tcggacgagc agtcttccag 360
gcgaaaaaga gggttcttga acctctgggc ctggttgagg aacctgttaa gacggctccg 420gcgaaaaaga gggttcttga acctctgggc ctggttgagg aacctgttaa gacggctccg 420
ggaaaaaaga ggccggtaga gcactctcct gtggagccag actcctcctc gggaaccgga 480ggaaaaaaga ggccggtaga gcactctcct gtggagccag actcctcctc gggaaccgga 480
aaggcgggcc agcagcctgc aagaactggc ggaggaattg ccgacgtcat gtctggagat 540aaggcgggcc agcagcctgc aagaactggc ggaggaattg ccgacgtcat gtctggagat 540
gctgaaatgg ctgcagtggg cgggggagca ccgggcgtcg acggccaggg tgccgaggga 600gctgaaatgg ctgcagtggg cgggggagca ccgggcgtcg acggccaggg tgccgaggga 600
gtgggtactt cctcgggtaa ttggcattgc gattcccagt ggtcagaagg acacgtcaga 660gtgggtactt cctcgggtaa ttggcattgc gattcccagt ggtcagaagg acacgtcaga 660
accaccagca ccagaacctg ggtgttgccc agctacaaca accacctgta taaacggctt 720accaccagca ccagaacctg ggtgttgccc agctacaaca accacctgta taaacggctt 720
ggaagtagcg cacaatccaa tacctacaac ggattctcca ccccctgggg atacctcgac 780ggaagtagcg cacaatccaa tacctacaac ggattctcca ccccctgggg atacctcgac 780
ttcaatagat ggcactgtca cttcagtcct cggaactggc aacgtctcat caacaacaac 840ttcaatagat ggcactgtca cttcagtcct cggaactggc aacgtctcat caacaacaac 840
tggggcatca gaccaaaaag acttaatgtt aaattgttca acatacaagt caaagaggtc 900tggggcatca gaccaaaaag acttaatgtt aaattgttca acatacaagt caaagaggtc 900
acgacggaag gggggacgac gaccgtcgcc aataacctta ccagcacgat tcaggtgttt 960acgacggaag gggggacgac gaccgtcgcc aataacctta ccagcacgat tcaggtgttt 960
gcggacaacg cgtacgaact cccgtatgtt gtcgacgcgg gtcacgaggg ggcattgccg 1020gcggacaacg cgtacgaact cccgtatgtt gtcgacgcgg gtcacgaggg ggcattgccg 1020
ccgttcccaa acgacgtgtt tatgattccc caatacggat actgcgggct ggtgtctggt 1080ccgttcccaa acgacgtgtt tatgattccc caatacggat actgcgggct ggtgtctggt 1080
caaagtcagg ctcagtcgga cttgtgttcg ttttattgcc tggagtattt tccatcccag 1140caaagtcagg ctcagtcgga cttgtgttcg ttttattgcc tggagtattt tccatcccag 1140
atgctgagaa caggaaacaa ttttgaaatg aatttcaggt ttgaagacgt tccatttcac 1200atgctgagaa caggaaacaa ttttgaaatg aatttcaggt ttgaagacgt tccatttcac 1200
tccatgtacg cccacagcca gtctctagac aggctcatga atcctttaat tgatcagtat 1260tccatgtacg cccacagcca gtctctagac aggctcatga atcctttaat tgatcagtat 1260
ctgtggagtc taaaacaaac aggaaacccg actggatcaa caacgagaga cttaaaattt 1320ctgtggagtc taaaacaaac aggaaacccg actggatcaa caacgagaga cttaaaattt 1320
atcaagaaca aagttcccaa ttttgcacat tatggaaaaa attggcttcc tggacctttt 1380atcaagaaca aagttcccaa ttttgcacat tatggaaaaa attggcttcc tggacctttt 1380
attagacaac aggggtggac aacacaaaat attaataata gtgttgttaa ttttaatgac 1440attagacaac aggggtggac aacacaaaat attaataata gtgttgttaa ttttaatgac 1440
atgctgggaa aaaattcgac atttactttg gacactagat ggagttcatt agcgcctggt 1500atgctgggaa aaaattcgac atttactttg gacactagat ggagttcatt agcgcctggt 1500
ccgtgtatgg gggatgacgg acgaactcca tccaccacca agttctcaaa tgctcagctc 1560ccgtgtatgg gggatgacgg acgaactcca tccaccacca agttctcaaa tgctcagctc 1560
atgtttggat ctggaacaca acccaccgaa ggcggtgaag atgctgtaca tattacatcc 1620atgtttggat ctggaacaca acccaccgaa ggcggtgaag atgctgtaca tattacatcc 1620
gagtcggagg tcaaggcaac caacccaact gcaatcgatg aatacggacg agtggccgat 1680gagtcggagg tcaaggcaac caacccaact gcaatcgatg aatacggacg agtggccgat 1680
aatacgcaaa atgcaacaac cgccccaacc acagtgggaa atgctgcaat gggggccatg 1740aatacgcaaa atgcaacaac cgccccaacc acagtgggaa atgctgcaat gggggccatg 1740
cctgggatgg tgtggcaaga tagggatatc tatcttcaag gacccatctg gggaaaaata 1800cctgggatgg tgtggcaaga tagggatatc tatcttcaag gacccatctg gggaaaaata 1800
ccccatacag acggacattt tcatccgtct cctctcatgg gggggtttgg atacagaaaa 1860ccccatacag acggacattt tcatccgtct cctctcatgg gggggtttgg atacagaaaa 1860
ccccctccgc aaatttttat taaaaacacc cccgttcctg gaaatccggc aactacattt 1920ccccctccgc aaatttttat taaaaacacc cccgttcctg gaaatccggc aactacattt 1920
tctccaaata gaataaacaa tttcattact caatactcaa cgggacaagt gaccgttact 1980tctccaaata gaataaacaa tttcattact caatactcaa cgggacaagt gaccgttact 1980
attgactggg agctgcaaaa ggaaaactca aagagatgga acccagaagt acaatttaca 2040attgactggg agctgcaaaa ggaaaactca aagagatgga acccagaagt acaatttaca 2040
tcaaattttg gcacggtcga ttcactaaac tgggcaccgg acaacgcggg aaactacaaa 2100tcaaattttg gcacggtcga ttcactaaac tgggcaccgg acaacgcggg aaactacaaa 2100
gaaccaaggg tgattggcac cagatacctg actcgtatac tataa 2145gaaccaaggg tgattggcac cagatacctg actcgtatac tataa 2145
<210> 61<210> 61
<211> 714<211> 714
<212> БЕЛОК<212> PROTEIN
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Cap VP1 AAV2 VP2 VP3 вируса морского льва v4<223> Cap VP1 AAV2 VP2 VP3 Sea Lion Virus v4
<400> 61<400> 61
Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Thr Leu Ser Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Thr Leu Ser
1 5 10 15 1 5 10 15
Glu Gly Ile Arg Gln Trp Trp Lys Leu Lys Pro Gly Pro Pro Pro Pro Glu Gly Ile Arg Gln Trp Trp Lys Leu Lys Pro Gly Pro Pro Pro Pro
20 25 30 20 25 30
Lys Pro Ala Glu Arg His Lys Asp Asp Ser Arg Gly Leu Val Leu Pro Lys Pro Ala Glu Arg His Lys Asp Asp Ser Arg Gly Leu Val Leu Pro
35 40 45 35 40 45
Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro
50 55 60 50 55 60
Val Asn Glu Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp Val Asn Glu Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp
65 70 75 80 65 70 75 80
Arg Gln Leu Asp Ser Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala Arg Gln Leu Asp Ser Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala
85 90 95 85 90 95
Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Lys Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Lys Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly
100 105 110 100 105 110
Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro
115 120 125 115 120 125
Leu Gly Leu Val Glu Glu Pro Val Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg Leu Gly Leu Val Glu Glu Pro Val Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg
130 135 140 130 135 140
Pro Val Glu His Ser Pro Val Glu Pro Asp Ser Ser Ser Gly Thr Gly Pro Val Glu His Ser Pro Val Glu Pro Asp Ser Ser Ser Gly Thr Gly
145 150 155 160 145 150 155 160
Lys Ala Gly Gln Gln Pro Ala Arg Thr Gly Gly Gly Ile Ala Asp Val Lys Ala Gly Gln Gln Pro Ala Arg Thr Gly Gly Gly Ile Ala Asp Val
165 170 175 165 170 175
Met Ser Gly Asp Ala Glu Met Ala Ala Val Gly Gly Gly Ala Pro Gly Met Ser Gly Asp Ala Glu Met Ala Ala Val Gly Gly Gly Ala Pro Gly
180 185 190 180 185 190
Val Asp Gly Gln Gly Ala Glu Gly Val Gly Thr Ser Ser Gly Asn Trp Val Asp Gly Gln Gly Ala Glu Gly Val Gly Thr Ser Ser Gly Asn Trp
195 200 205 195 200 205
His Cys Asp Ser Gln Trp Ser Glu Gly His Val Arg Thr Thr Ser Thr His Cys Asp Ser Gln Trp Ser Glu Gly His Val Arg Thr Thr Ser Thr
210 215 220 210 215 220
Arg Thr Trp Val Leu Pro Ser Tyr Asn Asn His Leu Tyr Lys Arg Leu Arg Thr Trp Val Leu Pro Ser Tyr Asn Asn His Leu Tyr Lys Arg Leu
225 230 235 240 225 230 235 240
Gly Ser Ser Ala Gln Ser Asn Thr Tyr Asn Gly Phe Ser Thr Pro Trp Gly Ser Ser Ala Gln Ser Asn Thr Tyr Asn Gly Phe Ser Thr Pro Trp
245 250 255 245 250 255
Gly Tyr Leu Asp Phe Asn Arg Trp His Cys His Phe Ser Pro Arg Asn Gly Tyr Leu Asp Phe Asn Arg Trp His Cys His Phe Ser Pro Arg Asn
260 265 270 260 265 270
Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn Asn Trp Gly Ile Arg Pro Lys Arg Leu Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn Asn Trp Gly Ile Arg Pro Lys Arg Leu
275 280 285 275 280 285
Asn Val Lys Leu Phe Asn Ile Gln Val Lys Glu Val Thr Thr Glu Gly Asn Val Lys Leu Phe Asn Ile Gln Val Lys Glu Val Thr Thr Glu Gly
290 295 300 290 295 300
Gly Thr Thr Thr Val Ala Asn Asn Leu Thr Ser Thr Ile Gln Val Phe Gly Thr Thr Thr Val Ala Asn Asn Leu Thr Ser Thr Ile Gln Val Phe
305 310 315 320 305 310 315 320
Ala Asp Asn Ala Tyr Glu Leu Pro Tyr Val Val Asp Ala Gly His Glu Ala Asp Asn Ala Tyr Glu Leu Pro Tyr Val Val Asp Ala Gly His Glu
325 330 335 325 330 335
Gly Ala Leu Pro Pro Phe Pro Asn Asp Val Phe Met Ile Pro Gln Tyr Gly Ala Leu Pro Pro Phe Pro Asn Asp Val Phe Met Ile Pro Gln Tyr
340 345 350 340 345 350
Gly Tyr Cys Gly Leu Val Ser Gly Gln Ser Gln Ala Gln Ser Asp Leu Gly Tyr Cys Gly Leu Val Ser Gly Gln Ser Gln Ala Gln Ser Asp Leu
355 360 365 355 360 365
Cys Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe Pro Ser Gln Met Leu Arg Thr Cys Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe Pro Ser Gln Met Leu Arg Thr
370 375 380 370 375 380
Gly Asn Asn Phe Glu Met Asn Phe Arg Phe Glu Asp Val Pro Phe His Gly Asn Asn Phe Glu Met Asn Phe Arg Phe Glu Asp Val Pro Phe His
385 390 395 400 385 390 395 400
Ser Met Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu Asp Arg Leu Met Asn Pro Leu Ser Met Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu Asp Arg Leu Met Asn Pro Leu
405 410 415 405 410 415
Ile Asp Gln Tyr Leu Trp Ser Leu Lys Gln Thr Gly Asn Pro Thr Gly Ile Asp Gln Tyr Leu Trp Ser Leu Lys Gln Thr Gly Asn Pro Thr Gly
420 425 430 420 425 430
Ser Thr Thr Arg Asp Leu Lys Phe Ile Lys Asn Lys Val Pro Asn Phe Ser Thr Thr Arg Asp Leu Lys Phe Ile Lys Asn Lys Val Pro Asn Phe
435 440 445 435 440 445
Ala His Tyr Gly Lys Asn Trp Leu Pro Gly Pro Phe Ile Arg Gln Gln Ala His Tyr Gly Lys Asn Trp Leu Pro Gly Pro Phe Ile Arg Gln Gln
450 455 460 450 455 460
Gly Trp Thr Thr Gln Asn Ile Asn Asn Ser Val Val Asn Phe Asn Asp Gly Trp Thr Thr Gln Asn Ile Asn Asn Ser Val Val Asn Phe Asn Asp
465 470 475 480 465 470 475 480
Met Leu Gly Lys Asn Ser Thr Phe Thr Leu Asp Thr Arg Trp Ser Ser Met Leu Gly Lys Asn Ser Thr Phe Thr Leu Asp Thr Arg Trp Ser Ser
485 490 495 485 490 495
Leu Ala Pro Gly Pro Cys Met Gly Asp Asp Gly Arg Thr Pro Ser Thr Leu Ala Pro Gly Pro Cys Met Gly Asp Asp Gly Arg Thr Pro Ser Thr
500 505 510 500 505 510
Thr Lys Phe Ser Asn Ala Gln Leu Met Phe Gly Ser Gly Thr Gln Pro Thr Lys Phe Ser Asn Ala Gln Leu Met Phe Gly Ser Gly Thr Gln Pro
515 520 525 515 520 525
Thr Glu Gly Gly Glu Asp Ala Val His Ile Thr Ser Glu Ser Glu Val Thr Glu Gly Gly Glu Asp Ala Val His Ile Thr Ser Glu Ser Glu Val
530 535 540 530 535 540
Lys Ala Thr Asn Pro Thr Ala Ile Asp Glu Tyr Gly Arg Val Ala Asp Lys Ala Thr Asn Pro Thr Ala Ile Asp Glu Tyr Gly Arg Val Ala Asp
545 550 555 560 545 550 555 560
Asn Thr Gln Asn Ala Thr Thr Ala Pro Thr Thr Val Gly Asn Ala Ala Asn Thr Gln Asn Ala Thr Thr Ala Pro Thr Thr Val Gly Asn Ala Ala
565 570 575 565 570 575
Met Gly Ala Met Pro Gly Met Val Trp Gln Asp Arg Asp Ile Tyr Leu Met Gly Ala Met Pro Gly Met Val Trp Gln Asp Arg Asp Ile Tyr Leu
580 585 590 580 585 590
Gln Gly Pro Ile Trp Gly Lys Ile Pro His Thr Asp Gly His Phe His Gln Gly Pro Ile Trp Gly Lys Ile Pro His Thr Asp Gly His Phe His
595 600 605 595 600 605
Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe Gly Tyr Arg Lys Pro Pro Pro Gln Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe Gly Tyr Arg Lys Pro Pro Pro Gln
610 615 620 610 615 620
Ile Phe Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro Gly Asn Pro Ala Thr Thr Phe Ile Phe Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro Gly Asn Pro Ala Thr Thr Phe
625 630 635 640 625 630 635 640
Ser Pro Asn Arg Ile Asn Asn Phe Ile Thr Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Ser Pro Asn Arg Ile Asn Asn Phe Ile Thr Gln Tyr Ser Thr Gly Gln
645 650 655 645 650 655
Val Thr Val Thr Ile Asp Trp Glu Leu Gln Lys Glu Asn Ser Lys Arg Val Thr Val Thr Ile Asp Trp Glu Leu Gln Lys Glu Asn Ser Lys Arg
660 665 670 660 665 670
Trp Asn Pro Glu Val Gln Phe Thr Ser Asn Phe Gly Thr Val Asp Ser Trp Asn Pro Glu Val Gln Phe Thr Ser Asn Phe Gly Thr Val Asp Ser
675 680 685 675 680 685
Leu Asn Trp Ala Pro Asp Asn Ala Gly Asn Tyr Lys Glu Pro Arg Val Leu Asn Trp Ala Pro Asp Asn Ala Gly Asn Tyr Lys Glu Pro Arg Val
690 695 700 690 695 700
Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg Ile Leu Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg Ile Leu
705 710 705 710
<210> 62<210> 62
<211> 2157<211> 2157
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Cap VP1 AAV2 VP2 VP3 вируса морского льва v5<223> Cap VP1 AAV2 VP2 VP3 sea lion virus v5
<400> 62<400> 62
atgtcttctt tgtttaaaga gtacctgcag agtaccggac tggtgggtat ccagtcggga 60atgtcttctt tgtttaaaga gtacctgcag agtaccggac tggtgggtat ccagtcggga 60
gcgccgaagc caaaggccgg ccagcagaag caggatacag ggtcctttga gtggaaaaag 120gcgccgaagc caaaggccgg ccagcagaag caggatacag ggtcctttga gtggaaaaag 120
aaggaggaca cagccagagg gctggtcctt cccggttaca agtacctcgg gcccttcaac 180aaggaggaca cagccagagg gctggtcctt cccggttaca agtacctcgg gcccttcaac 180
ggtctagagc ggggcgagcc tgtgaatgcc gcggacgccg cggcccagcg acacgaccga 240ggtctagagc ggggcgagcc tgtgaatgcc gcggacgccg cggcccagcg acacgaccga 240
cagtacgatc gtattctaca acaagggggt aatccatacc tcacgtacaa ccacgccgac 300cagtacgatc gtattctaca acaagggggt aatccatacc tcacgtacaa ccacgccgac 300
cgagagttcc aggaggagct ccagtctgac gagtcttttg ggggaaatct tggcaaggct 360cgagagttcc aggaggagct ccagtctgac gagtcttttg ggggaaatct tggcaaggct 360
gtgtttcagg ccaagaagcg aatcctagag cccctcggtc tggttgaaga ggatccctct 420gtgtttcagg ccaagaagcg aatcctagag cccctcggtc tggttgaaga ggatccctct 420
cagccagatt cgtcctcgga caacacggcg ccacccgtga aaaagtcccg tctcgaagaa 480cagccagatt cgtcctcgga caacacggcg ccacccgtga aaaagtcccg tctcgaagaa 480
gcccagccca ttcaaagtcc agacgtttcc agcagcactg gcggaggaat tgccgacgtc 540gcccagccca ttcaaagtcc agacgtttcc agcagcactg gcggaggaat tgccgacgtc 540
atgtctggag atgctgaaat ggctgcagtg ggcgggggag caccgggcgt cgacggccag 600atgtctggag atgctgaaat ggctgcagtg ggcgggggag caccgggcgt cgacggccag 600
ggtgccgagg gagtgggtac ttcctcgggt aattggcatt gcgattccca gtggtcagaa 660ggtgccgagg gagtgggtac ttcctcgggt aattggcatt gcgattccca gtggtcagaa 660
ggacacgtca gaaccaccag caccagaacc tgggtgttgc ccagctacaa caaccacctg 720ggacacgtca gaaccaccag caccagaacc tgggtgttgc ccagctacaa caaccacctg 720
tataaacggc ttggaagtag cgcacaatcc aatacctaca acggattctc caccccctgg 780tataaacggc ttggaagtag cgcacaatcc aatacctaca acggattctc caccccctgg 780
ggatacctcg acttcaatag atggcactgt cacttcagtc ctcggaactg gcaacgtctc 840ggatacctcg acttcaatag atggcactgt cacttcagtc ctcggaactg gcaacgtctc 840
atcaacaaca actggggcat cagaccaaaa agacttaatg ttaaattgtt caacatacaa 900atcaacaaca actggggcat cagaccaaaa agacttaatg ttaaattgtt caacatacaa 900
gtcaaagagg tcacgacgga aggggggacg acgaccgtcg ccaataacct taccagcacg 960gtcaaagagg tcacgacgga aggggggacg acgaccgtcg ccaataacct taccagcacg 960
attcaggtgt ttgcggacaa cgcgtacgaa ctcccgtatg ttgtcgacgc gggtcacgag 1020attcaggtgt ttgcggacaa cgcgtacgaa ctcccgtatg ttgtcgacgc gggtcacgag 1020
ggggcattgc cgccgttccc aaacgacgtg tttatgattc cccaatacgg atactgcggg 1080ggggcattgc cgccgttccc aaacgacgtg tttatgattc cccaatacgg atactgcggg 1080
ctggtgtctg gtcaaagtca ggctcagtcg gacttgtgtt cgttttattg cctggagtat 1140ctggtgtctg gtcaaagtca ggctcagtcg gacttgtgtt cgttttattg cctggagtat 1140
tttccatccc agatgctgag aacaggaaac aattttgaaa tgaatttcag gtttgaagac 1200tttccatccc agatgctgag aacaggaaac aattttgaaa tgaatttcag gtttgaagac 1200
gttccatttc actccatgta cgcccacagc cagtctctag acaggctcat gaatccttta 1260gttccattc actccatgta cgcccacagc cagtctctag acaggctcat gaatccttta 1260
attgatcagt atctgtggag tctaaaacaa acaggaaacc cgactggatc aacaacgaga 1320attgatcagt atctgtggag tctaaaacaa acaggaaacc cgactggatc aacaacgaga 1320
gacttaaaat ttatcaagaa caaagttccc aattttgcac attatggaaa aaattggctt 1380gacttaaaat ttatcaagaa caaagttccc aattttgcac attatggaaa aaattggctt 1380
cctggacctt ttattagaca acaggggtgg acaacacaaa atattaataa tagtgttgtt 1440cctggacctt ttattagaca acaggggtgg acaacacaaa atattaataa tagtgttgtt 1440
aattttaatg acatgctggg aaaaaattcg acatttactt tggacactag atggagttca 1500aattttaatg acatgctggg aaaaaattcg acatttactt tggacactag atggagttca 1500
ttagcgcctg gtccgtgtat gggggatgac ggacgaactc catccaccac caagttctca 1560ttagcgcctg gtccgtgtat gggggatgac ggacgaactc catccaccac caagttctca 1560
aatgctcagc tcatgtttgg atctggaaca caacccaccg aaggcggtga agatgctgta 1620aatgctcagc tcatgtttgg atctggaaca caacccaccg aaggcggtga agatgctgta 1620
catattacat ccgagtcgga ggtcaaggca accaacccaa ctgcaatcga tgaatacgga 1680catattacat ccgagtcgga ggtcaaggca accaacccaa ctgcaatcga tgaatacgga 1680
cgagtggccg ataatacgca aaatgcaaca accgccccaa ccacagtggg aaatgctgca 1740cgagtggccg ataatacgca aaatgcaaca accgccccaa ccacagtggg aaatgctgca 1740
atgggggcca tgcctgggat ggtgtggcaa gatagggata tctatcttca aggacccatc 1800atggggggcca tgcctgggat ggtgtggcaa gatagggata tctatcttca aggacccatc 1800
tggggaaaaa taccccatac agacggacat tttcatccgt ctcctctcat gggggggttt 1860tggggaaaaa taccccatac agacggacat tttcatccgt ctcctctcat gggggggttt 1860
ggatacagaa aaccccctcc gcaaattttt attaaaaaca cccccgttcc tggaaatccg 1920ggatacagaa aaccccctcc gcaaattttt attaaaaaca cccccgttcc tggaaatccg 1920
gcaactacat tttctccaaa tagaataaac aatttcatta ctcaatactc aacgggacaa 1980gcaactacat tttctccaaa tagaataaac aatttcatta ctcaatactc aacgggacaa 1980
gtgaccgtta ctattgactg ggagctgcaa aaggaaaact caaagagatg gaacccagaa 2040gtgaccgtta ctattgactg ggagctgcaa aaggaaaact caaagagatg gaacccagaa 2040
gtacaattta catcaaattt tggcacggtc gattcactaa actgggcacc ggacaacgcg 2100gtacaattta catcaaattt tggcacggtc gattcactaa actgggcacc ggacaacgcg 2100
ggaaactaca aagaaccaag ggtgattggc accagatacc tgactcgtat actataa 2157ggaaactaca aagaaccaag ggtgattggc accagatacc tgactcgtat actataa 2157
<210> 63<210> 63
<211> 718<211> 718
<212> БЕЛОК<212> PROTEIN
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Cap VP1 AAV2 VP2 VP3 вируса морского льва v5<223> Cap VP1 AAV2 VP2 VP3 sea lion virus v5
<400> 63<400> 63
Met Ser Ser Leu Phe Lys Glu Tyr Leu Gln Ser Thr Gly Leu Val Gly Met Ser Ser Leu Phe Lys Glu Tyr Leu Gln Ser Thr Gly Leu Val Gly
1 5 10 15 1 5 10 15
Ile Gln Ser Gly Ala Pro Lys Pro Lys Ala Gly Gln Gln Lys Gln Asp Ile Gln Ser Gly Ala Pro Lys Pro Lys Ala Gly Gln Gln Lys Gln Asp
20 25 30 20 25 30
Thr Gly Ser Phe Glu Trp Lys Lys Lys Glu Asp Thr Ala Arg Gly Leu Thr Gly Ser Phe Glu Trp Lys Lys Lys Glu Asp Thr Ala Arg Gly Leu
35 40 45 35 40 45
Val Leu Pro Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Glu Arg Val Leu Pro Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Glu Arg
50 55 60 50 55 60
Gly Glu Pro Val Asn Ala Ala Asp Ala Ala Ala Gln Arg His Asp Arg Gly Glu Pro Val Asn Ala Ala Asp Ala Ala Ala Gln Arg His Asp Arg
65 70 75 80 65 70 75 80
Gln Tyr Asp Arg Ile Leu Gln Gln Gly Gly Asn Pro Tyr Leu Thr Tyr Gln Tyr Asp Arg Ile Leu Gln Gln Gly Gly Asn Pro Tyr Leu Thr Tyr
85 90 95 85 90 95
Asn His Ala Asp Arg Glu Phe Gln Glu Glu Leu Gln Ser Asp Glu Ser Asn His Ala Asp Arg Glu Phe Gln Glu Glu Leu Gln Ser Asp Glu Ser
100 105 110 100 105 110
Phe Gly Gly Asn Leu Gly Lys Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Ile Phe Gly Gly Asn Leu Gly Lys Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Ile
115 120 125 115 120 125
Leu Glu Pro Leu Gly Leu Val Glu Glu Asp Pro Ser Gln Pro Asp Ser Leu Glu Pro Leu Gly Leu Val Glu Glu Asp Pro Ser Gln Pro Asp Ser
130 135 140 130 135 140
Ser Ser Asp Asn Thr Ala Pro Pro Val Lys Lys Ser Arg Leu Glu Glu Ser Ser Asp Asn Thr Ala Pro Pro Val Lys Lys Ser Arg Leu Glu Glu
145 150 155 160 145 150 155 160
Ala Gln Pro Ile Gln Ser Pro Asp Val Ser Ser Ser Thr Gly Gly Gly Ala Gln Pro Ile Gln Ser Pro Asp Val Ser Ser Ser Thr Gly Gly Gly
165 170 175 165 170 175
Ile Ala Asp Val Met Ser Gly Asp Ala Glu Met Ala Ala Val Gly Gly Ile Ala Asp Val Met Ser Gly Asp Ala Glu Met Ala Ala Val Gly Gly
180 185 190 180 185 190
Gly Ala Pro Gly Val Asp Gly Gln Gly Ala Glu Gly Val Gly Thr Ser Gly Ala Pro Gly Val Asp Gly Gln Gly Ala Glu Gly Val Gly Thr Ser
195 200 205 195 200 205
Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Gln Trp Ser Glu Gly His Val Arg Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Gln Trp Ser Glu Gly His Val Arg
210 215 220 210 215 220
Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Val Leu Pro Ser Tyr Asn Asn His Leu Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Val Leu Pro Ser Tyr Asn Asn His Leu
225 230 235 240 225 230 235 240
Tyr Lys Arg Leu Gly Ser Ser Ala Gln Ser Asn Thr Tyr Asn Gly Phe Tyr Lys Arg Leu Gly Ser Ser Ala Gln Ser Asn Thr Tyr Asn Gly Phe
245 250 255 245 250 255
Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Leu Asp Phe Asn Arg Trp His Cys His Phe Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Leu Asp Phe Asn Arg Trp His Cys His Phe
260 265 270 260 265 270
Ser Pro Arg Asn Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn Asn Trp Gly Ile Arg Ser Pro Arg Asn Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn Asn Trp Gly Ile Arg
275 280 285 275 280 285
Pro Lys Arg Leu Asn Val Lys Leu Phe Asn Ile Gln Val Lys Glu Val Pro Lys Arg Leu Asn Val Lys Leu Phe Asn Ile Gln Val Lys Glu Val
290 295 300 290 295 300
Thr Thr Glu Gly Gly Thr Thr Thr Val Ala Asn Asn Leu Thr Ser Thr Thr Thr Glu Gly Gly Thr Thr Thr Val Ala Asn Asn Leu Thr Ser Thr
305 310 315 320 305 310 315 320
Ile Gln Val Phe Ala Asp Asn Ala Tyr Glu Leu Pro Tyr Val Val Asp Ile Gln Val Phe Ala Asp Asn Ala Tyr Glu Leu Pro Tyr Val Val Asp
325 330 335 325 330 335
Ala Gly His Glu Gly Ala Leu Pro Pro Phe Pro Asn Asp Val Phe Met Ala Gly His Glu Gly Ala Leu Pro Pro Phe Pro Asn Asp Val Phe Met
340 345 350 340 345 350
Ile Pro Gln Tyr Gly Tyr Cys Gly Leu Val Ser Gly Gln Ser Gln Ala Ile Pro Gln Tyr Gly Tyr Cys Gly Leu Val Ser Gly Gln Ser Gln Ala
355 360 365 355 360 365
Gln Ser Asp Leu Cys Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe Pro Ser Gln Gln Ser Asp Leu Cys Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe Pro Ser Gln
370 375 380 370 375 380
Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Glu Met Asn Phe Arg Phe Glu Asp Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Glu Met Asn Phe Arg Phe Glu Asp
385 390 395 400 385 390 395 400
Val Pro Phe His Ser Met Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu Asp Arg Leu Val Pro Phe His Ser Met Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu Asp Arg Leu
405 410 415 405 410 415
Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Trp Ser Leu Lys Gln Thr Gly Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Trp Ser Leu Lys Gln Thr Gly
420 425 430 420 425 430
Asn Pro Thr Gly Ser Thr Thr Arg Asp Leu Lys Phe Ile Lys Asn Lys Asn Pro Thr Gly Ser Thr Thr Arg Asp Leu Lys Phe Ile Lys Asn Lys
435 440 445 435 440 445
Val Pro Asn Phe Ala His Tyr Gly Lys Asn Trp Leu Pro Gly Pro Phe Val Pro Asn Phe Ala His Tyr Gly Lys Asn Trp Leu Pro Gly Pro Phe
450 455 460 450 455 460
Ile Arg Gln Gln Gly Trp Thr Thr Gln Asn Ile Asn Asn Ser Val Val Ile Arg Gln Gln Gly Trp Thr Thr Gln Asn Ile Asn Asn Ser Val Val
465 470 475 480 465 470 475 480
Asn Phe Asn Asp Met Leu Gly Lys Asn Ser Thr Phe Thr Leu Asp Thr Asn Phe Asn Asp Met Leu Gly Lys Asn Ser Thr Phe Thr Leu Asp Thr
485 490 495 485 490 495
Arg Trp Ser Ser Leu Ala Pro Gly Pro Cys Met Gly Asp Asp Gly Arg Arg Trp Ser Ser Leu Ala Pro Gly Pro Cys Met Gly Asp Asp Gly Arg
500 505 510 500 505 510
Thr Pro Ser Thr Thr Lys Phe Ser Asn Ala Gln Leu Met Phe Gly Ser Thr Pro Ser Thr Thr Lys Phe Ser Asn Ala Gln Leu Met Phe Gly Ser
515 520 525 515 520 525
Gly Thr Gln Pro Thr Glu Gly Gly Glu Asp Ala Val His Ile Thr Ser Gly Thr Gln Pro Thr Glu Gly Gly Glu Asp Ala Val His Ile Thr Ser
530 535 540 530 535 540
Glu Ser Glu Val Lys Ala Thr Asn Pro Thr Ala Ile Asp Glu Tyr Gly Glu Ser Glu Val Lys Ala Thr Asn Pro Thr Ala Ile Asp Glu Tyr Gly
545 550 555 560 545 550 555 560
Arg Val Ala Asp Asn Thr Gln Asn Ala Thr Thr Ala Pro Thr Thr Val Arg Val Ala Asp Asn Thr Gln Asn Ala Thr Thr Ala Pro Thr Thr Val
565 570 575 565 570 575
Gly Asn Ala Ala Met Gly Ala Met Pro Gly Met Val Trp Gln Asp Arg Gly Asn Ala Ala Met Gly Ala Met Pro Gly Met Val Trp Gln Asp Arg
580 585 590 580 585 590
Asp Ile Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Gly Lys Ile Pro His Thr Asp Asp Ile Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Gly Lys Ile Pro His Thr Asp
595 600 605 595 600 605
Gly His Phe His Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe Gly Tyr Arg Lys Gly His Phe His Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe Gly Tyr Arg Lys
610 615 620 610 615 620
Pro Pro Pro Gln Ile Phe Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro Gly Asn Pro Pro Pro Pro Gln Ile Phe Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro Gly Asn Pro
625 630 635 640 625 630 635 640
Ala Thr Thr Phe Ser Pro Asn Arg Ile Asn Asn Phe Ile Thr Gln Tyr Ala Thr Thr Phe Ser Pro Asn Arg Ile Asn Asn Phe Ile Thr Gln Tyr
645 650 655 645 650 655
Ser Thr Gly Gln Val Thr Val Thr Ile Asp Trp Glu Leu Gln Lys Glu Ser Thr Gly Gln Val Thr Val Thr Ile Asp Trp Glu Leu Gln Lys Glu
660 665 670 660 665 670
Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Val Gln Phe Thr Ser Asn Phe Gly Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Val Gln Phe Thr Ser Asn Phe Gly
675 680 685 675 680 685
Thr Val Asp Ser Leu Asn Trp Ala Pro Asp Asn Ala Gly Asn Tyr Lys Thr Val Asp Ser Leu Asn Trp Ala Pro Asp Asn Ala Gly Asn Tyr Lys
690 695 700 690 695 700
Glu Pro Arg Val Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg Ile Leu Glu Pro Arg Val Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg Ile Leu
705 710 715 705 710 715
<210> 64<210> 64
<211> 2145<211> 2145
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Cap VP1 AAV2 VP2 VP3 вируса морского льва v2 B1 заменен<223> Cap VP1 AAV2 VP2 VP3 Sea Lion Virus v2 B1 Replaced
<400> 64<400> 64
atggctgccg atggttatct tccagattgg ctcgaggaca ctctctctga aggaataaga 60atggctgccg atggttatct tccagattgg ctcgaggaca ctctctctga aggaataaga 60
cagtggtgga agctcaaacc tggcccacca ccaccaaagc ccgcagagcg gcataaggac 120cagtggtgga agctcaaacc tggcccacca ccaccaaagc ccgcagagcg gcataaggac 120
gacagcaggg gtcttgtgct tcctgggtac aagtacctcg gacccttcaa cggactcgac 180gacagcaggg gtcttgtgct tcctgggtac aagtacctcg gacccttcaa cggactcgac 180
aagggagagc cggtcaacga ggcagacgcc gcggccctcg agcacgacaa agcctacgac 240aagggagagc cggtcaacga ggcagacgcc gcggccctcg agcacgacaa agcctacgac 240
cggcagctcg acagcggaga caacccgtac ctcaagtaca accacgccga cgcggagttt 300cggcagctcg acagcggaga caacccgtac ctcaagtaca accacgccga cgcggagttt 300
caggagcgcc ttaaagaaga tacgtctttt gggggcaacc tcggacgagc agtcttccag 360caggagcgcc ttaaagaaga tacgtctttt gggggcaacc tcggacgagc agtcttccag 360
gcgaaaaaga gggttcttga acctctgggc ctggttgagg aacctgttaa gacggctccg 420gcgaaaaaga gggttcttga acctctgggc ctggttgagg aacctgttaa gacggctccg 420
ggaaaaaaga ggacggcgcc acccgtgaaa aagtcccgtc tcgaagaagc ccagcccatt 480ggaaaaaaga ggacggcgcc acccgtgaaa aagtcccgtc tcgaagaagc ccagcccatt 480
caaagtccag acgtttccag cagcactggc ggaggaattg ccgacgtcat gtctggagat 540caaagtccag acgtttccag cagcactggc ggaggaattg ccgacgtcat gtctggagat 540
gctgaaatgg ctgcagtggg cgggggagca ccgggcgtcg acggccaggg tgccgaggga 600gctgaaatgg ctgcagtggg cgggggagca ccgggcgtcg acggccaggg tgccgaggga 600
gtgggtactt cctcgggtaa ttggcattgc gattcccagt ggtcagaagg acacgtcaga 660gtgggtactt cctcgggtaa ttggcattgc gattcccagt ggtcagaagg acacgtcaga 660
accaccagca ccagaacctg ggtgttgccc agctacaaca accacctgta taaacggctt 720accaccagca ccagaacctg ggtgttgccc agctacaaca accacctgta taaacggctt 720
ggaagtagcg cacaatccaa tacctacaac ggattctcca ccccctgggg atacctcgac 780ggaagtagcg cacaatccaa tacctacaac ggattctcca ccccctgggg atacctcgac 780
ttcaatagat ggcactgtca cttcagtcct cggaactggc aacgtctcat caacaacaac 840ttcaatagat ggcactgtca cttcagtcct cggaactggc aacgtctcat caacaacaac 840
tggggcatca gaccaaaaag acttaatgtt aaattgttca acatacaagt caaagaggtc 900tggggcatca gaccaaaaag acttaatgtt aaattgttca acatacaagt caaagaggtc 900
acgacggaag gggggacgac gaccgtcgcc aataacctta ccagcacgat tcaggtgttt 960acgacggaag gggggacgac gaccgtcgcc aataacctta ccagcacgat tcaggtgttt 960
gcggacaacg cgtacgaact cccgtatgtt gtcgacgcgg gtcacgaggg ggcattgccg 1020gcggacaacg cgtacgaact cccgtatgtt gtcgacgcgg gtcacgaggg ggcattgccg 1020
ccgttcccaa acgacgtgtt tatgattccc caatacggat actgcgggct ggtgtctggt 1080ccgttcccaa acgacgtgtt tatgattccc caatacggat actgcgggct ggtgtctggt 1080
caaagtcagg ctcagtcgga cttgtgttcg ttttattgcc tggagtattt tccatcccag 1140caaagtcagg ctcagtcgga cttgtgttcg ttttattgcc tggagtattt tccatcccag 1140
atgctgagaa caggaaacaa ttttgaaatg aatttcaggt ttgaagacgt tccatttcac 1200atgctgagaa caggaaacaa ttttgaaatg aatttcaggt ttgaagacgt tccatttcac 1200
tccatgtacg cccacagcca gtctctagac aggctcatga atcctttaat tgatcagtat 1260tccatgtacg cccacagcca gtctctagac aggctcatga atcctttaat tgatcagtat 1260
ctgtggagtc taaaacaaac aggaaacccg actggatcaa caacgagaga cttaaaattt 1320ctgtggagtc taaaacaaac aggaaacccg actggatcaa caacgagaga cttaaaattt 1320
atcaagaaca aagttcccaa ttttgcacat tatggaaaaa attggcttcc tggacctttt 1380atcaagaaca aagttcccaa ttttgcacat tatggaaaaa attggcttcc tggacctttt 1380
attagacaac aggggtggac aacacaaaat attaataata gtgttgttaa ttttaatgac 1440attagacaac aggggtggac aacacaaaat attaataata gtgttgttaa ttttaatgac 1440
atgctgggaa aaaattcgac atttactttg gacactagat ggagttcatt agcgcctggt 1500atgctgggaa aaaattcgac atttactttg gacactagat ggagttcatt agcgcctggt 1500
ccgtgtatgg gggatgacgg acgaactcca tccaccacca agttctcaaa tgctcagctc 1560ccgtgtatgg gggatgacgg acgaactcca tccaccacca agttctcaaa tgctcagctc 1560
atgtttggat ctggaacaca acccaccgaa ggcggtgaag atgctgtaca tattacatcc 1620atgtttggat ctggaacaca acccaccgaa ggcggtgaag atgctgtaca tattacatcc 1620
gagtcggagg tcaaggcaac caacccaact gcaatcgatg aatacggacg agtggccgat 1680gagtcggagg tcaaggcaac caacccaact gcaatcgatg aatacggacg agtggccgat 1680
aatacgcaaa atgcaacaac cgccccaacc acagtgggaa atgctgcaat gggggccatg 1740aatacgcaaa atgcaacaac cgccccaacc acagtgggaa atgctgcaat gggggccatg 1740
cctgggatgg tgtggcaaga tagggatatc tatcttcaag gacccatctg gggaaaaata 1800cctgggatgg tgtggcaaga tagggatatc tatcttcaag gacccatctg gggaaaaata 1800
ccccatacag acggacattt tcatccgtct cctctcatgg gggggtttgg atacagaaaa 1860ccccatacag acggacattt tcatccgtct cctctcatgg gggggtttgg atacagaaaa 1860
ccccctccgc aaatttttat taaaaacacc cccgttcctg gaaatccggc aactacattt 1920ccccctccgc aaatttttat taaaaacacc cccgttcctg gaaatccggc aactacattt 1920
tctccaaata gaataaacaa tttcattact caatactcaa cgggacaagt gaccgttact 1980tctccaaata gaataaacaa tttcattact caatactcaa cgggacaagt gaccgttact 1980
attgactggg agctgcaaaa ggaaaactca aagagatgga acccagaagt acaatttaca 2040attgactggg agctgcaaaa ggaaaactca aagagatgga acccagaagt acaatttaca 2040
tcaaattttg gcacggtcga ttcactaaac tgggcaccgg acaacgcggg aaactacaaa 2100tcaaattttg gcacggtcga ttcactaaac tgggcaccgg acaacgcggg aaactacaaa 2100
gaaccaaggg tggtggggtc tcgattcctt acgcatatac tataa 2145gaaccaaggg tggtggggtc tcgattcctt acgcatatac tataa 2145
<210> 65<210> 65
<211> 714<211> 714
<212> БЕЛОК<212> PROTEIN
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Cap VP1 AAV2 VP2 VP3 вируса морского льва v2 B1 заменен<223> Cap VP1 AAV2 VP2 VP3 Sea Lion Virus v2 B1 Replaced
<400> 65<400> 65
Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Thr Leu Ser Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Thr Leu Ser
1 5 10 15 1 5 10 15
Glu Gly Ile Arg Gln Trp Trp Lys Leu Lys Pro Gly Pro Pro Pro Pro Glu Gly Ile Arg Gln Trp Trp Lys Leu Lys Pro Gly Pro Pro Pro Pro
20 25 30 20 25 30
Lys Pro Ala Glu Arg His Lys Asp Asp Ser Arg Gly Leu Val Leu Pro Lys Pro Ala Glu Arg His Lys Asp Asp Ser Arg Gly Leu Val Leu Pro
35 40 45 35 40 45
Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro
50 55 60 50 55 60
Val Asn Glu Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp Val Asn Glu Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp
65 70 75 80 65 70 75 80
Arg Gln Leu Asp Ser Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala Arg Gln Leu Asp Ser Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala
85 90 95 85 90 95
Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Lys Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Lys Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly
100 105 110 100 105 110
Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro
115 120 125 115 120 125
Leu Gly Leu Val Glu Glu Pro Val Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg Leu Gly Leu Val Glu Glu Pro Val Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg
130 135 140 130 135 140
Thr Ala Pro Pro Val Lys Lys Ser Arg Leu Glu Glu Ala Gln Pro Ile Thr Ala Pro Pro Val Lys Lys Ser Arg Leu Glu Glu Ala Gln Pro Ile
145 150 155 160 145 150 155 160
Gln Ser Pro Asp Val Ser Ser Ser Thr Gly Gly Gly Ile Ala Asp Val Gln Ser Pro Asp Val Ser Ser Ser Thr Gly Gly Gly Ile Ala Asp Val
165 170 175 165 170 175
Met Ser Gly Asp Ala Glu Met Ala Ala Val Gly Gly Gly Ala Pro Gly Met Ser Gly Asp Ala Glu Met Ala Ala Val Gly Gly Gly Ala Pro Gly
180 185 190 180 185 190
Val Asp Gly Gln Gly Ala Glu Gly Val Gly Thr Ser Ser Gly Asn Trp Val Asp Gly Gln Gly Ala Glu Gly Val Gly Thr Ser Ser Gly Asn Trp
195 200 205 195 200 205
His Cys Asp Ser Gln Trp Ser Glu Gly His Val Arg Thr Thr Ser Thr His Cys Asp Ser Gln Trp Ser Glu Gly His Val Arg Thr Thr Ser Thr
210 215 220 210 215 220
Arg Thr Trp Val Leu Pro Ser Tyr Asn Asn His Leu Tyr Lys Arg Leu Arg Thr Trp Val Leu Pro Ser Tyr Asn Asn His Leu Tyr Lys Arg Leu
225 230 235 240 225 230 235 240
Gly Ser Ser Ala Gln Ser Asn Thr Tyr Asn Gly Phe Ser Thr Pro Trp Gly Ser Ser Ala Gln Ser Asn Thr Tyr Asn Gly Phe Ser Thr Pro Trp
245 250 255 245 250 255
Gly Tyr Leu Asp Phe Asn Arg Trp His Cys His Phe Ser Pro Arg Asn Gly Tyr Leu Asp Phe Asn Arg Trp His Cys His Phe Ser Pro Arg Asn
260 265 270 260 265 270
Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn Asn Trp Gly Ile Arg Pro Lys Arg Leu Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn Asn Trp Gly Ile Arg Pro Lys Arg Leu
275 280 285 275 280 285
Asn Val Lys Leu Phe Asn Ile Gln Val Lys Glu Val Thr Thr Glu Gly Asn Val Lys Leu Phe Asn Ile Gln Val Lys Glu Val Thr Thr Glu Gly
290 295 300 290 295 300
Gly Thr Thr Thr Val Ala Asn Asn Leu Thr Ser Thr Ile Gln Val Phe Gly Thr Thr Thr Val Ala Asn Asn Leu Thr Ser Thr Ile Gln Val Phe
305 310 315 320 305 310 315 320
Ala Asp Asn Ala Tyr Glu Leu Pro Tyr Val Val Asp Ala Gly His Glu Ala Asp Asn Ala Tyr Glu Leu Pro Tyr Val Val Asp Ala Gly His Glu
325 330 335 325 330 335
Gly Ala Leu Pro Pro Phe Pro Asn Asp Val Phe Met Ile Pro Gln Tyr Gly Ala Leu Pro Pro Phe Pro Asn Asp Val Phe Met Ile Pro Gln Tyr
340 345 350 340 345 350
Gly Tyr Cys Gly Leu Val Ser Gly Gln Ser Gln Ala Gln Ser Asp Leu Gly Tyr Cys Gly Leu Val Ser Gly Gln Ser Gln Ala Gln Ser Asp Leu
355 360 365 355 360 365
Cys Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe Pro Ser Gln Met Leu Arg Thr Cys Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe Pro Ser Gln Met Leu Arg Thr
370 375 380 370 375 380
Gly Asn Asn Phe Glu Met Asn Phe Arg Phe Glu Asp Val Pro Phe His Gly Asn Asn Phe Glu Met Asn Phe Arg Phe Glu Asp Val Pro Phe His
385 390 395 400 385 390 395 400
Ser Met Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu Asp Arg Leu Met Asn Pro Leu Ser Met Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu Asp Arg Leu Met Asn Pro Leu
405 410 415 405 410 415
Ile Asp Gln Tyr Leu Trp Ser Leu Lys Gln Thr Gly Asn Pro Thr Gly Ile Asp Gln Tyr Leu Trp Ser Leu Lys Gln Thr Gly Asn Pro Thr Gly
420 425 430 420 425 430
Ser Thr Thr Arg Asp Leu Lys Phe Ile Lys Asn Lys Val Pro Asn Phe Ser Thr Thr Arg Asp Leu Lys Phe Ile Lys Asn Lys Val Pro Asn Phe
435 440 445 435 440 445
Ala His Tyr Gly Lys Asn Trp Leu Pro Gly Pro Phe Ile Arg Gln Gln Ala His Tyr Gly Lys Asn Trp Leu Pro Gly Pro Phe Ile Arg Gln Gln
450 455 460 450 455 460
Gly Trp Thr Thr Gln Asn Ile Asn Asn Ser Val Val Asn Phe Asn Asp Gly Trp Thr Thr Gln Asn Ile Asn Asn Ser Val Val Asn Phe Asn Asp
465 470 475 480 465 470 475 480
Met Leu Gly Lys Asn Ser Thr Phe Thr Leu Asp Thr Arg Trp Ser Ser Met Leu Gly Lys Asn Ser Thr Phe Thr Leu Asp Thr Arg Trp Ser Ser
485 490 495 485 490 495
Leu Ala Pro Gly Pro Cys Met Gly Asp Asp Gly Arg Thr Pro Ser Thr Leu Ala Pro Gly Pro Cys Met Gly Asp Asp Gly Arg Thr Pro Ser Thr
500 505 510 500 505 510
Thr Lys Phe Ser Asn Ala Gln Leu Met Phe Gly Ser Gly Thr Gln Pro Thr Lys Phe Ser Asn Ala Gln Leu Met Phe Gly Ser Gly Thr Gln Pro
515 520 525 515 520 525
Thr Glu Gly Gly Glu Asp Ala Val His Ile Thr Ser Glu Ser Glu Val Thr Glu Gly Gly Glu Asp Ala Val His Ile Thr Ser Glu Ser Glu Val
530 535 540 530 535 540
Lys Ala Thr Asn Pro Thr Ala Ile Asp Glu Tyr Gly Arg Val Ala Asp Lys Ala Thr Asn Pro Thr Ala Ile Asp Glu Tyr Gly Arg Val Ala Asp
545 550 555 560 545 550 555 560
Asn Thr Gln Asn Ala Thr Thr Ala Pro Thr Thr Val Gly Asn Ala Ala Asn Thr Gln Asn Ala Thr Thr Ala Pro Thr Thr Val Gly Asn Ala Ala
565 570 575 565 570 575
Met Gly Ala Met Pro Gly Met Val Trp Gln Asp Arg Asp Ile Tyr Leu Met Gly Ala Met Pro Gly Met Val Trp Gln Asp Arg Asp Ile Tyr Leu
580 585 590 580 585 590
Gln Gly Pro Ile Trp Gly Lys Ile Pro His Thr Asp Gly His Phe His Gln Gly Pro Ile Trp Gly Lys Ile Pro His Thr Asp Gly His Phe His
595 600 605 595 600 605
Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe Gly Tyr Arg Lys Pro Pro Pro Gln Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe Gly Tyr Arg Lys Pro Pro Pro Gln
610 615 620 610 615 620
Ile Phe Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro Gly Asn Pro Ala Thr Thr Phe Ile Phe Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro Gly Asn Pro Ala Thr Thr Phe
625 630 635 640 625 630 635 640
Ser Pro Asn Arg Ile Asn Asn Phe Ile Thr Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Ser Pro Asn Arg Ile Asn Asn Phe Ile Thr Gln Tyr Ser Thr Gly Gln
645 650 655 645 650 655
Val Thr Val Thr Ile Asp Trp Glu Leu Gln Lys Glu Asn Ser Lys Arg Val Thr Val Thr Ile Asp Trp Glu Leu Gln Lys Glu Asn Ser Lys Arg
660 665 670 660 665 670
Trp Asn Pro Glu Val Gln Phe Thr Ser Asn Phe Gly Thr Val Asp Ser Trp Asn Pro Glu Val Gln Phe Thr Ser Asn Phe Gly Thr Val Asp Ser
675 680 685 675 680 685
Leu Asn Trp Ala Pro Asp Asn Ala Gly Asn Tyr Lys Glu Pro Arg Val Leu Asn Trp Ala Pro Asp Asn Ala Gly Asn Tyr Lys Glu Pro Arg Val
690 695 700 690 695 700
Val Gly Ser Arg Phe Leu Thr His Ile Leu Val Gly Ser Arg Phe Leu Thr His Ile Leu
705 710 705 710
<210> 66<210> 66
<211> 2145<211> 2145
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Cap VP1 AAV2 VP2 VP3 вируса морского льва v3 B1 заменен<223> Cap VP1 AAV2 VP2 VP3 sea lion virus v3 B1 replaced
<400> 66<400> 66
atggctgccg atggttatct tccagattgg ctcgaggaca ctctctctga aggaataaga 60atggctgccg atggttatct tccagattgg ctcgaggaca ctctctctga aggaataaga 60
cagtggtgga agctcaaacc tggcccacca ccaccaaagc ccgcagagcg gcataaggac 120cagtggtgga agctcaaacc tggcccacca ccaccaaagc ccgcagagcg gcataaggac 120
gacagcaggg gtcttgtgct tcctgggtac aagtacctcg gacccttcaa cggactcgac 180gacagcaggg gtcttgtgct tcctgggtac aagtacctcg gacccttcaa cggactcgac 180
aagggagagc cggtcaacga ggcagacgcc gcggccctcg agcacgacaa agcctacgac 240aagggagagc cggtcaacga ggcagacgcc gcggccctcg agcacgacaa agcctacgac 240
cggcagctcg acagcggaga caacccgtac ctcaagtaca accacgccga cgcggagttt 300cggcagctcg acagcggaga caacccgtac ctcaagtaca accacgccga cgcggagttt 300
caggagcgcc ttaaagaaga tacgtctttt gggggcaacc tcggacgagc agtcttccag 360caggagcgcc ttaaagaaga tacgtctttt gggggcaacc tcggacgagc agtcttccag 360
gcgaaaaaga gggttcttga acctctgggc ctggttgagg aacctgttaa gacggctccg 420gcgaaaaaga gggttcttga acctctgggc ctggttgagg aacctgttaa gacggctccg 420
ggaaaaaaga ggccggtaga gcactctcct gtggagccag actcctcctc gggaaccgga 480ggaaaaaaga ggccggtaga gcactctcct gtggagccag actcctcctc gggaaccgga 480
aaggcgggcc agcagcctgc aagaaaaaga ttgaattttg gtcagactat gtctggagat 540aaggcgggcc agcagcctgc aagaaaaaga ttgaattttg gtcagactat gtctggagat 540
gctgaaatgg ctgcagtggg cgggggagca ccgggcgtcg acggccaggg tgccgaggga 600gctgaaatgg ctgcagtggg cgggggagca ccgggcgtcg acggccaggg tgccgaggga 600
gtgggtactt cctcgggtaa ttggcattgc gattcccagt ggtcagaagg acacgtcaga 660gtgggtactt cctcgggtaa ttggcattgc gattcccagt ggtcagaagg acacgtcaga 660
accaccagca ccagaacctg ggtgttgccc agctacaaca accacctgta taaacggctt 720accaccagca ccagaacctg ggtgttgccc agctacaaca accacctgta taaacggctt 720
ggaagtagcg cacaatccaa tacctacaac ggattctcca ccccctgggg atacctcgac 780ggaagtagcg cacaatccaa tacctacaac ggattctcca ccccctgggg atacctcgac 780
ttcaatagat ggcactgtca cttcagtcct cggaactggc aacgtctcat caacaacaac 840ttcaatagat ggcactgtca cttcagtcct cggaactggc aacgtctcat caacaacaac 840
tggggcatca gaccaaaaag acttaatgtt aaattgttca acatacaagt caaagaggtc 900tggggcatca gaccaaaaag acttaatgtt aaattgttca acatacaagt caaagaggtc 900
acgacggaag gggggacgac gaccgtcgcc aataacctta ccagcacgat tcaggtgttt 960acgacggaag gggggacgac gaccgtcgcc aataacctta ccagcacgat tcaggtgttt 960
gcggacaacg cgtacgaact cccgtatgtt gtcgacgcgg gtcacgaggg ggcattgccg 1020gcggacaacg cgtacgaact cccgtatgtt gtcgacgcgg gtcacgaggg ggcattgccg 1020
ccgttcccaa acgacgtgtt tatgattccc caatacggat actgcgggct ggtgtctggt 1080ccgttcccaa acgacgtgtt tatgattccc caatacggat actgcgggct ggtgtctggt 1080
caaagtcagg ctcagtcgga cttgtgttcg ttttattgcc tggagtattt tccatcccag 1140caaagtcagg ctcagtcgga cttgtgttcg ttttattgcc tggagtattt tccatcccag 1140
atgctgagaa caggaaacaa ttttgaaatg aatttcaggt ttgaagacgt tccatttcac 1200atgctgagaa caggaaacaa ttttgaaatg aatttcaggt ttgaagacgt tccatttcac 1200
tccatgtacg cccacagcca gtctctagac aggctcatga atcctttaat tgatcagtat 1260tccatgtacg cccacagcca gtctctagac aggctcatga atcctttaat tgatcagtat 1260
ctgtggagtc taaaacaaac aggaaacccg actggatcaa caacgagaga cttaaaattt 1320ctgtggagtc taaaacaaac aggaaacccg actggatcaa caacgagaga cttaaaattt 1320
atcaagaaca aagttcccaa ttttgcacat tatggaaaaa attggcttcc tggacctttt 1380atcaagaaca aagttcccaa ttttgcacat tatggaaaaa attggcttcc tggacctttt 1380
attagacaac aggggtggac aacacaaaat attaataata gtgttgttaa ttttaatgac 1440attagacaac aggggtggac aacacaaaat attaataata gtgttgttaa ttttaatgac 1440
atgctgggaa aaaattcgac atttactttg gacactagat ggagttcatt agcgcctggt 1500atgctgggaa aaaattcgac atttactttg gacactagat ggagttcatt agcgcctggt 1500
ccgtgtatgg gggatgacgg acgaactcca tccaccacca agttctcaaa tgctcagctc 1560ccgtgtatgg gggatgacgg acgaactcca tccaccacca agttctcaaa tgctcagctc 1560
atgtttggat ctggaacaca acccaccgaa ggcggtgaag atgctgtaca tattacatcc 1620atgtttggat ctggaacaca acccaccgaa ggcggtgaag atgctgtaca tattacatcc 1620
gagtcggagg tcaaggcaac caacccaact gcaatcgatg aatacggacg agtggccgat 1680gagtcggagg tcaaggcaac caacccaact gcaatcgatg aatacggacg agtggccgat 1680
aatacgcaaa atgcaacaac cgccccaacc acagtgggaa atgctgcaat gggggccatg 1740aatacgcaaa atgcaacaac cgccccaacc acagtgggaa atgctgcaat gggggccatg 1740
cctgggatgg tgtggcaaga tagggatatc tatcttcaag gacccatctg gggaaaaata 1800cctgggatgg tgtggcaaga tagggatatc tatcttcaag gacccatctg gggaaaaata 1800
ccccatacag acggacattt tcatccgtct cctctcatgg gggggtttgg atacagaaaa 1860ccccatacag acggacattt tcatccgtct cctctcatgg gggggtttgg atacagaaaa 1860
ccccctccgc aaatttttat taaaaacacc cccgttcctg gaaatccggc aactacattt 1920ccccctccgc aaatttttat taaaaacacc cccgttcctg gaaatccggc aactacattt 1920
tctccaaata gaataaacaa tttcattact caatactcaa cgggacaagt gaccgttact 1980tctccaaata gaataaacaa tttcattact caatactcaa cgggacaagt gaccgttact 1980
attgactggg agctgcaaaa ggaaaactca aagagatgga acccagaagt acaatttaca 2040attgactggg agctgcaaaa ggaaaactca aagagatgga acccagaagt acaatttaca 2040
tcaaattttg gcacggtcga ttcactaaac tgggcaccgg acaacgcggg aaactacaaa 2100tcaaattttg gcacggtcga ttcactaaac tgggcaccgg acaacgcggg aaactacaaa 2100
gaaccaaggg tggtggggtc tcgattcctt acgcatatac tataa 2145gaaccaaggg tggtggggtc tcgattcctt acgcatatac tataa 2145
<210> 67<210> 67
<211> 714<211> 714
<212> БЕЛОК<212> PROTEIN
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Cap VP1 AAV2 VP2 VP3 вируса морского льва v3 B1 заменен<223> Cap VP1 AAV2 VP2 VP3 sea lion virus v3 B1 replaced
<400> 67<400> 67
Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Thr Leu Ser Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Thr Leu Ser
1 5 10 15 1 5 10 15
Glu Gly Ile Arg Gln Trp Trp Lys Leu Lys Pro Gly Pro Pro Pro Pro Glu Gly Ile Arg Gln Trp Trp Lys Leu Lys Pro Gly Pro Pro Pro Pro
20 25 30 20 25 30
Lys Pro Ala Glu Arg His Lys Asp Asp Ser Arg Gly Leu Val Leu Pro Lys Pro Ala Glu Arg His Lys Asp Asp Ser Arg Gly Leu Val Leu Pro
35 40 45 35 40 45
Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro
50 55 60 50 55 60
Val Asn Glu Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp Val Asn Glu Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp
65 70 75 80 65 70 75 80
Arg Gln Leu Asp Ser Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala Arg Gln Leu Asp Ser Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala
85 90 95 85 90 95
Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Lys Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Lys Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly
100 105 110 100 105 110
Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro
115 120 125 115 120 125
Leu Gly Leu Val Glu Glu Pro Val Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg Leu Gly Leu Val Glu Glu Pro Val Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg
130 135 140 130 135 140
Pro Val Glu His Ser Pro Val Glu Pro Asp Ser Ser Ser Gly Thr Gly Pro Val Glu His Ser Pro Val Glu Pro Asp Ser Ser Ser Gly Thr Gly
145 150 155 160 145 150 155 160
Lys Ala Gly Gln Gln Pro Ala Arg Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln Thr Lys Ala Gly Gln Gln Pro Ala Arg Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln Thr
165 170 175 165 170 175
Met Ser Gly Asp Ala Glu Met Ala Ala Val Gly Gly Gly Ala Pro Gly Met Ser Gly Asp Ala Glu Met Ala Ala Val Gly Gly Gly Ala Pro Gly
180 185 190 180 185 190
Val Asp Gly Gln Gly Ala Glu Gly Val Gly Thr Ser Ser Gly Asn Trp Val Asp Gly Gln Gly Ala Glu Gly Val Gly Thr Ser Ser Gly Asn Trp
195 200 205 195 200 205
His Cys Asp Ser Gln Trp Ser Glu Gly His Val Arg Thr Thr Ser Thr His Cys Asp Ser Gln Trp Ser Glu Gly His Val Arg Thr Thr Ser Thr
210 215 220 210 215 220
Arg Thr Trp Val Leu Pro Ser Tyr Asn Asn His Leu Tyr Lys Arg Leu Arg Thr Trp Val Leu Pro Ser Tyr Asn Asn His Leu Tyr Lys Arg Leu
225 230 235 240 225 230 235 240
Gly Ser Ser Ala Gln Ser Asn Thr Tyr Asn Gly Phe Ser Thr Pro Trp Gly Ser Ser Ala Gln Ser Asn Thr Tyr Asn Gly Phe Ser Thr Pro Trp
245 250 255 245 250 255
Gly Tyr Leu Asp Phe Asn Arg Trp His Cys His Phe Ser Pro Arg Asn Gly Tyr Leu Asp Phe Asn Arg Trp His Cys His Phe Ser Pro Arg Asn
260 265 270 260 265 270
Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn Asn Trp Gly Ile Arg Pro Lys Arg Leu Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn Asn Trp Gly Ile Arg Pro Lys Arg Leu
275 280 285 275 280 285
Asn Val Lys Leu Phe Asn Ile Gln Val Lys Glu Val Thr Thr Glu Gly Asn Val Lys Leu Phe Asn Ile Gln Val Lys Glu Val Thr Thr Glu Gly
290 295 300 290 295 300
Gly Thr Thr Thr Val Ala Asn Asn Leu Thr Ser Thr Ile Gln Val Phe Gly Thr Thr Thr Val Ala Asn Asn Leu Thr Ser Thr Ile Gln Val Phe
305 310 315 320 305 310 315 320
Ala Asp Asn Ala Tyr Glu Leu Pro Tyr Val Val Asp Ala Gly His Glu Ala Asp Asn Ala Tyr Glu Leu Pro Tyr Val Val Asp Ala Gly His Glu
325 330 335 325 330 335
Gly Ala Leu Pro Pro Phe Pro Asn Asp Val Phe Met Ile Pro Gln Tyr Gly Ala Leu Pro Pro Phe Pro Asn Asp Val Phe Met Ile Pro Gln Tyr
340 345 350 340 345 350
Gly Tyr Cys Gly Leu Val Ser Gly Gln Ser Gln Ala Gln Ser Asp Leu Gly Tyr Cys Gly Leu Val Ser Gly Gln Ser Gln Ala Gln Ser Asp Leu
355 360 365 355 360 365
Cys Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe Pro Ser Gln Met Leu Arg Thr Cys Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe Pro Ser Gln Met Leu Arg Thr
370 375 380 370 375 380
Gly Asn Asn Phe Glu Met Asn Phe Arg Phe Glu Asp Val Pro Phe His Gly Asn Asn Phe Glu Met Asn Phe Arg Phe Glu Asp Val Pro Phe His
385 390 395 400 385 390 395 400
Ser Met Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu Asp Arg Leu Met Asn Pro Leu Ser Met Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu Asp Arg Leu Met Asn Pro Leu
405 410 415 405 410 415
Ile Asp Gln Tyr Leu Trp Ser Leu Lys Gln Thr Gly Asn Pro Thr Gly Ile Asp Gln Tyr Leu Trp Ser Leu Lys Gln Thr Gly Asn Pro Thr Gly
420 425 430 420 425 430
Ser Thr Thr Arg Asp Leu Lys Phe Ile Lys Asn Lys Val Pro Asn Phe Ser Thr Thr Arg Asp Leu Lys Phe Ile Lys Asn Lys Val Pro Asn Phe
435 440 445 435 440 445
Ala His Tyr Gly Lys Asn Trp Leu Pro Gly Pro Phe Ile Arg Gln Gln Ala His Tyr Gly Lys Asn Trp Leu Pro Gly Pro Phe Ile Arg Gln Gln
450 455 460 450 455 460
Gly Trp Thr Thr Gln Asn Ile Asn Asn Ser Val Val Asn Phe Asn Asp Gly Trp Thr Thr Gln Asn Ile Asn Asn Ser Val Val Asn Phe Asn Asp
465 470 475 480 465 470 475 480
Met Leu Gly Lys Asn Ser Thr Phe Thr Leu Asp Thr Arg Trp Ser Ser Met Leu Gly Lys Asn Ser Thr Phe Thr Leu Asp Thr Arg Trp Ser Ser
485 490 495 485 490 495
Leu Ala Pro Gly Pro Cys Met Gly Asp Asp Gly Arg Thr Pro Ser Thr Leu Ala Pro Gly Pro Cys Met Gly Asp Asp Gly Arg Thr Pro Ser Thr
500 505 510 500 505 510
Thr Lys Phe Ser Asn Ala Gln Leu Met Phe Gly Ser Gly Thr Gln Pro Thr Lys Phe Ser Asn Ala Gln Leu Met Phe Gly Ser Gly Thr Gln Pro
515 520 525 515 520 525
Thr Glu Gly Gly Glu Asp Ala Val His Ile Thr Ser Glu Ser Glu Val Thr Glu Gly Gly Glu Asp Ala Val His Ile Thr Ser Glu Ser Glu Val
530 535 540 530 535 540
Lys Ala Thr Asn Pro Thr Ala Ile Asp Glu Tyr Gly Arg Val Ala Asp Lys Ala Thr Asn Pro Thr Ala Ile Asp Glu Tyr Gly Arg Val Ala Asp
545 550 555 560 545 550 555 560
Asn Thr Gln Asn Ala Thr Thr Ala Pro Thr Thr Val Gly Asn Ala Ala Asn Thr Gln Asn Ala Thr Thr Ala Pro Thr Thr Val Gly Asn Ala Ala
565 570 575 565 570 575
Met Gly Ala Met Pro Gly Met Val Trp Gln Asp Arg Asp Ile Tyr Leu Met Gly Ala Met Pro Gly Met Val Trp Gln Asp Arg Asp Ile Tyr Leu
580 585 590 580 585 590
Gln Gly Pro Ile Trp Gly Lys Ile Pro His Thr Asp Gly His Phe His Gln Gly Pro Ile Trp Gly Lys Ile Pro His Thr Asp Gly His Phe His
595 600 605 595 600 605
Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe Gly Tyr Arg Lys Pro Pro Pro Gln Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe Gly Tyr Arg Lys Pro Pro Pro Gln
610 615 620 610 615 620
Ile Phe Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro Gly Asn Pro Ala Thr Thr Phe Ile Phe Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro Gly Asn Pro Ala Thr Thr Phe
625 630 635 640 625 630 635 640
Ser Pro Asn Arg Ile Asn Asn Phe Ile Thr Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Ser Pro Asn Arg Ile Asn Asn Phe Ile Thr Gln Tyr Ser Thr Gly Gln
645 650 655 645 650 655
Val Thr Val Thr Ile Asp Trp Glu Leu Gln Lys Glu Asn Ser Lys Arg Val Thr Val Thr Ile Asp Trp Glu Leu Gln Lys Glu Asn Ser Lys Arg
660 665 670 660 665 670
Trp Asn Pro Glu Val Gln Phe Thr Ser Asn Phe Gly Thr Val Asp Ser Trp Asn Pro Glu Val Gln Phe Thr Ser Asn Phe Gly Thr Val Asp Ser
675 680 685 675 680 685
Leu Asn Trp Ala Pro Asp Asn Ala Gly Asn Tyr Lys Glu Pro Arg Val Leu Asn Trp Ala Pro Asp Asn Ala Gly Asn Tyr Lys Glu Pro Arg Val
690 695 700 690 695 700
Val Gly Ser Arg Phe Leu Thr His Ile Leu Val Gly Ser Arg Phe Leu Thr His Ile Leu
705 710 705 710
<210> 68<210> 68
<211> 2145<211> 2145
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Cap VP1 AAV2 VP2 VP3 вируса морского льва v4 B1 заменен<223> Cap VP1 AAV2 VP2 VP3 sea lion virus v4 B1 replaced
<400> 68<400> 68
atggctgccg atggttatct tccagattgg ctcgaggaca ctctctctga aggaataaga 60atggctgccg atggttatct tccagattgg ctcgaggaca ctctctctga aggaataaga 60
cagtggtgga agctcaaacc tggcccacca ccaccaaagc ccgcagagcg gcataaggac 120cagtggtgga agctcaaacc tggcccacca ccaccaaagc ccgcagagcg gcataaggac 120
gacagcaggg gtcttgtgct tcctgggtac aagtacctcg gacccttcaa cggactcgac 180gacagcaggg gtcttgtgct tcctgggtac aagtacctcg gacccttcaa cggactcgac 180
aagggagagc cggtcaacga ggcagacgcc gcggccctcg agcacgacaa agcctacgac 240aagggagagc cggtcaacga ggcagacgcc gcggccctcg agcacgacaa agcctacgac 240
cggcagctcg acagcggaga caacccgtac ctcaagtaca accacgccga cgcggagttt 300cggcagctcg acagcggaga caacccgtac ctcaagtaca accacgccga cgcggagttt 300
caggagcgcc ttaaagaaga tacgtctttt gggggcaacc tcggacgagc agtcttccag 360caggagcgcc ttaaagaaga tacgtctttt gggggcaacc tcggacgagc agtcttccag 360
gcgaaaaaga gggttcttga acctctgggc ctggttgagg aacctgttaa gacggctccg 420gcgaaaaaga gggttcttga acctctgggc ctggttgagg aacctgttaa gacggctccg 420
ggaaaaaaga ggccggtaga gcactctcct gtggagccag actcctcctc gggaaccgga 480ggaaaaaaga ggccggtaga gcactctcct gtggagccag actcctcctc gggaaccgga 480
aaggcgggcc agcagcctgc aagaactggc ggaggaattg ccgacgtcat gtctggagat 540aaggcgggcc agcagcctgc aagaactggc ggaggaattg ccgacgtcat gtctggagat 540
gctgaaatgg ctgcagtggg cgggggagca ccgggcgtcg acggccaggg tgccgaggga 600gctgaaatgg ctgcagtggg cgggggagca ccgggcgtcg acggccaggg tgccgaggga 600
gtgggtactt cctcgggtaa ttggcattgc gattcccagt ggtcagaagg acacgtcaga 660gtgggtactt cctcgggtaa ttggcattgc gattcccagt ggtcagaagg acacgtcaga 660
accaccagca ccagaacctg ggtgttgccc agctacaaca accacctgta taaacggctt 720accaccagca ccagaacctg ggtgttgccc agctacaaca accacctgta taaacggctt 720
ggaagtagcg cacaatccaa tacctacaac ggattctcca ccccctgggg atacctcgac 780ggaagtagcg cacaatccaa tacctacaac ggattctcca ccccctgggg atacctcgac 780
ttcaatagat ggcactgtca cttcagtcct cggaactggc aacgtctcat caacaacaac 840ttcaatagat ggcactgtca cttcagtcct cggaactggc aacgtctcat caacaacaac 840
tggggcatca gaccaaaaag acttaatgtt aaattgttca acatacaagt caaagaggtc 900tggggcatca gaccaaaaag acttaatgtt aaattgttca acatacaagt caaagaggtc 900
acgacggaag gggggacgac gaccgtcgcc aataacctta ccagcacgat tcaggtgttt 960acgacggaag gggggacgac gaccgtcgcc aataacctta ccagcacgat tcaggtgttt 960
gcggacaacg cgtacgaact cccgtatgtt gtcgacgcgg gtcacgaggg ggcattgccg 1020gcggacaacg cgtacgaact cccgtatgtt gtcgacgcgg gtcacgaggg ggcattgccg 1020
ccgttcccaa acgacgtgtt tatgattccc caatacggat actgcgggct ggtgtctggt 1080ccgttcccaa acgacgtgtt tatgattccc caatacggat actgcgggct ggtgtctggt 1080
caaagtcagg ctcagtcgga cttgtgttcg ttttattgcc tggagtattt tccatcccag 1140caaagtcagg ctcagtcgga cttgtgttcg ttttattgcc tggagtattt tccatcccag 1140
atgctgagaa caggaaacaa ttttgaaatg aatttcaggt ttgaagacgt tccatttcac 1200atgctgagaa caggaaacaa ttttgaaatg aatttcaggt ttgaagacgt tccatttcac 1200
tccatgtacg cccacagcca gtctctagac aggctcatga atcctttaat tgatcagtat 1260tccatgtacg cccacagcca gtctctagac aggctcatga atcctttaat tgatcagtat 1260
ctgtggagtc taaaacaaac aggaaacccg actggatcaa caacgagaga cttaaaattt 1320ctgtggagtc taaaacaaac aggaaacccg actggatcaa caacgagaga cttaaaattt 1320
atcaagaaca aagttcccaa ttttgcacat tatggaaaaa attggcttcc tggacctttt 1380atcaagaaca aagttcccaa ttttgcacat tatggaaaaa attggcttcc tggacctttt 1380
attagacaac aggggtggac aacacaaaat attaataata gtgttgttaa ttttaatgac 1440attagacaac aggggtggac aacacaaaat attaataata gtgttgttaa ttttaatgac 1440
atgctgggaa aaaattcgac atttactttg gacactagat ggagttcatt agcgcctggt 1500atgctgggaa aaaattcgac atttactttg gacactagat ggagttcatt agcgcctggt 1500
ccgtgtatgg gggatgacgg acgaactcca tccaccacca agttctcaaa tgctcagctc 1560ccgtgtatgg gggatgacgg acgaactcca tccaccacca agttctcaaa tgctcagctc 1560
atgtttggat ctggaacaca acccaccgaa ggcggtgaag atgctgtaca tattacatcc 1620atgtttggat ctggaacaca acccaccgaa ggcggtgaag atgctgtaca tattacatcc 1620
gagtcggagg tcaaggcaac caacccaact gcaatcgatg aatacggacg agtggccgat 1680gagtcggagg tcaaggcaac caacccaact gcaatcgatg aatacggacg agtggccgat 1680
aatacgcaaa atgcaacaac cgccccaacc acagtgggaa atgctgcaat gggggccatg 1740aatacgcaaa atgcaacaac cgccccaacc acagtgggaa atgctgcaat gggggccatg 1740
cctgggatgg tgtggcaaga tagggatatc tatcttcaag gacccatctg gggaaaaata 1800cctgggatgg tgtggcaaga tagggatatc tatcttcaag gacccatctg gggaaaaata 1800
ccccatacag acggacattt tcatccgtct cctctcatgg gggggtttgg atacagaaaa 1860ccccatacag acggacattt tcatccgtct cctctcatgg gggggtttgg atacagaaaa 1860
ccccctccgc aaatttttat taaaaacacc cccgttcctg gaaatccggc aactacattt 1920ccccctccgc aaatttttat taaaaacacc cccgttcctg gaaatccggc aactacattt 1920
tctccaaata gaataaacaa tttcattact caatactcaa cgggacaagt gaccgttact 1980tctccaaata gaataaacaa tttcattact caatactcaa cgggacaagt gaccgttact 1980
attgactggg agctgcaaaa ggaaaactca aagagatgga acccagaagt acaatttaca 2040attgactggg agctgcaaaa ggaaaactca aagagatgga acccagaagt acaatttaca 2040
tcaaattttg gcacggtcga ttcactaaac tgggcaccgg acaacgcggg aaactacaaa 2100tcaaattttg gcacggtcga ttcactaaac tgggcaccgg acaacgcggg aaactacaaa 2100
gaaccaaggg tggtggggtc tcgattcctt acgcatatac tataa 2145gaaccaaggg tggtggggtc tcgattcctt acgcatatac tataa 2145
<210> 69<210> 69
<211> 714<211> 714
<212> БЕЛОК<212> PROTEIN
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Cap VP1 AAV2 VP2 VP3 вируса морского льва v4 B1 заменен<223> Cap VP1 AAV2 VP2 VP3 sea lion virus v4 B1 replaced
<400> 69<400> 69
Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Thr Leu Ser Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Thr Leu Ser
1 5 10 15 1 5 10 15
Glu Gly Ile Arg Gln Trp Trp Lys Leu Lys Pro Gly Pro Pro Pro Pro Glu Gly Ile Arg Gln Trp Trp Lys Leu Lys Pro Gly Pro Pro Pro Pro
20 25 30 20 25 30
Lys Pro Ala Glu Arg His Lys Asp Asp Ser Arg Gly Leu Val Leu Pro Lys Pro Ala Glu Arg His Lys Asp Asp Ser Arg Gly Leu Val Leu Pro
35 40 45 35 40 45
Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro
50 55 60 50 55 60
Val Asn Glu Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp Val Asn Glu Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp
65 70 75 80 65 70 75 80
Arg Gln Leu Asp Ser Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala Arg Gln Leu Asp Ser Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala
85 90 95 85 90 95
Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Lys Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Lys Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly
100 105 110 100 105 110
Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro
115 120 125 115 120 125
Leu Gly Leu Val Glu Glu Pro Val Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg Leu Gly Leu Val Glu Glu Pro Val Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg
130 135 140 130 135 140
Pro Val Glu His Ser Pro Val Glu Pro Asp Ser Ser Ser Gly Thr Gly Pro Val Glu His Ser Pro Val Glu Pro Asp Ser Ser Ser Gly Thr Gly
145 150 155 160 145 150 155 160
Lys Ala Gly Gln Gln Pro Ala Arg Thr Gly Gly Gly Ile Ala Asp Val Lys Ala Gly Gln Gln Pro Ala Arg Thr Gly Gly Gly Ile Ala Asp Val
165 170 175 165 170 175
Met Ser Gly Asp Ala Glu Met Ala Ala Val Gly Gly Gly Ala Pro Gly Met Ser Gly Asp Ala Glu Met Ala Ala Val Gly Gly Gly Ala Pro Gly
180 185 190 180 185 190
Val Asp Gly Gln Gly Ala Glu Gly Val Gly Thr Ser Ser Gly Asn Trp Val Asp Gly Gln Gly Ala Glu Gly Val Gly Thr Ser Ser Gly Asn Trp
195 200 205 195 200 205
His Cys Asp Ser Gln Trp Ser Glu Gly His Val Arg Thr Thr Ser Thr His Cys Asp Ser Gln Trp Ser Glu Gly His Val Arg Thr Thr Ser Thr
210 215 220 210 215 220
Arg Thr Trp Val Leu Pro Ser Tyr Asn Asn His Leu Tyr Lys Arg Leu Arg Thr Trp Val Leu Pro Ser Tyr Asn Asn His Leu Tyr Lys Arg Leu
225 230 235 240 225 230 235 240
Gly Ser Ser Ala Gln Ser Asn Thr Tyr Asn Gly Phe Ser Thr Pro Trp Gly Ser Ser Ala Gln Ser Asn Thr Tyr Asn Gly Phe Ser Thr Pro Trp
245 250 255 245 250 255
Gly Tyr Leu Asp Phe Asn Arg Trp His Cys His Phe Ser Pro Arg Asn Gly Tyr Leu Asp Phe Asn Arg Trp His Cys His Phe Ser Pro Arg Asn
260 265 270 260 265 270
Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn Asn Trp Gly Ile Arg Pro Lys Arg Leu Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn Asn Trp Gly Ile Arg Pro Lys Arg Leu
275 280 285 275 280 285
Asn Val Lys Leu Phe Asn Ile Gln Val Lys Glu Val Thr Thr Glu Gly Asn Val Lys Leu Phe Asn Ile Gln Val Lys Glu Val Thr Thr Glu Gly
290 295 300 290 295 300
Gly Thr Thr Thr Val Ala Asn Asn Leu Thr Ser Thr Ile Gln Val Phe Gly Thr Thr Thr Val Ala Asn Asn Leu Thr Ser Thr Ile Gln Val Phe
305 310 315 320 305 310 315 320
Ala Asp Asn Ala Tyr Glu Leu Pro Tyr Val Val Asp Ala Gly His Glu Ala Asp Asn Ala Tyr Glu Leu Pro Tyr Val Val Asp Ala Gly His Glu
325 330 335 325 330 335
Gly Ala Leu Pro Pro Phe Pro Asn Asp Val Phe Met Ile Pro Gln Tyr Gly Ala Leu Pro Pro Phe Pro Asn Asp Val Phe Met Ile Pro Gln Tyr
340 345 350 340 345 350
Gly Tyr Cys Gly Leu Val Ser Gly Gln Ser Gln Ala Gln Ser Asp Leu Gly Tyr Cys Gly Leu Val Ser Gly Gln Ser Gln Ala Gln Ser Asp Leu
355 360 365 355 360 365
Cys Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe Pro Ser Gln Met Leu Arg Thr Cys Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe Pro Ser Gln Met Leu Arg Thr
370 375 380 370 375 380
Gly Asn Asn Phe Glu Met Asn Phe Arg Phe Glu Asp Val Pro Phe His Gly Asn Asn Phe Glu Met Asn Phe Arg Phe Glu Asp Val Pro Phe His
385 390 395 400 385 390 395 400
Ser Met Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu Asp Arg Leu Met Asn Pro Leu Ser Met Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu Asp Arg Leu Met Asn Pro Leu
405 410 415 405 410 415
Ile Asp Gln Tyr Leu Trp Ser Leu Lys Gln Thr Gly Asn Pro Thr Gly Ile Asp Gln Tyr Leu Trp Ser Leu Lys Gln Thr Gly Asn Pro Thr Gly
420 425 430 420 425 430
Ser Thr Thr Arg Asp Leu Lys Phe Ile Lys Asn Lys Val Pro Asn Phe Ser Thr Thr Arg Asp Leu Lys Phe Ile Lys Asn Lys Val Pro Asn Phe
435 440 445 435 440 445
Ala His Tyr Gly Lys Asn Trp Leu Pro Gly Pro Phe Ile Arg Gln Gln Ala His Tyr Gly Lys Asn Trp Leu Pro Gly Pro Phe Ile Arg Gln Gln
450 455 460 450 455 460
Gly Trp Thr Thr Gln Asn Ile Asn Asn Ser Val Val Asn Phe Asn Asp Gly Trp Thr Thr Gln Asn Ile Asn Asn Ser Val Val Asn Phe Asn Asp
465 470 475 480 465 470 475 480
Met Leu Gly Lys Asn Ser Thr Phe Thr Leu Asp Thr Arg Trp Ser Ser Met Leu Gly Lys Asn Ser Thr Phe Thr Leu Asp Thr Arg Trp Ser Ser
485 490 495 485 490 495
Leu Ala Pro Gly Pro Cys Met Gly Asp Asp Gly Arg Thr Pro Ser Thr Leu Ala Pro Gly Pro Cys Met Gly Asp Asp Gly Arg Thr Pro Ser Thr
500 505 510 500 505 510
Thr Lys Phe Ser Asn Ala Gln Leu Met Phe Gly Ser Gly Thr Gln Pro Thr Lys Phe Ser Asn Ala Gln Leu Met Phe Gly Ser Gly Thr Gln Pro
515 520 525 515 520 525
Thr Glu Gly Gly Glu Asp Ala Val His Ile Thr Ser Glu Ser Glu Val Thr Glu Gly Gly Glu Asp Ala Val His Ile Thr Ser Glu Ser Glu Val
530 535 540 530 535 540
Lys Ala Thr Asn Pro Thr Ala Ile Asp Glu Tyr Gly Arg Val Ala Asp Lys Ala Thr Asn Pro Thr Ala Ile Asp Glu Tyr Gly Arg Val Ala Asp
545 550 555 560 545 550 555 560
Asn Thr Gln Asn Ala Thr Thr Ala Pro Thr Thr Val Gly Asn Ala Ala Asn Thr Gln Asn Ala Thr Thr Ala Pro Thr Thr Val Gly Asn Ala Ala
565 570 575 565 570 575
Met Gly Ala Met Pro Gly Met Val Trp Gln Asp Arg Asp Ile Tyr Leu Met Gly Ala Met Pro Gly Met Val Trp Gln Asp Arg Asp Ile Tyr Leu
580 585 590 580 585 590
Gln Gly Pro Ile Trp Gly Lys Ile Pro His Thr Asp Gly His Phe His Gln Gly Pro Ile Trp Gly Lys Ile Pro His Thr Asp Gly His Phe His
595 600 605 595 600 605
Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe Gly Tyr Arg Lys Pro Pro Pro Gln Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe Gly Tyr Arg Lys Pro Pro Pro Gln
610 615 620 610 615 620
Ile Phe Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro Gly Asn Pro Ala Thr Thr Phe Ile Phe Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro Gly Asn Pro Ala Thr Thr Phe
625 630 635 640 625 630 635 640
Ser Pro Asn Arg Ile Asn Asn Phe Ile Thr Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Ser Pro Asn Arg Ile Asn Asn Phe Ile Thr Gln Tyr Ser Thr Gly Gln
645 650 655 645 650 655
Val Thr Val Thr Ile Asp Trp Glu Leu Gln Lys Glu Asn Ser Lys Arg Val Thr Val Thr Ile Asp Trp Glu Leu Gln Lys Glu Asn Ser Lys Arg
660 665 670 660 665 670
Trp Asn Pro Glu Val Gln Phe Thr Ser Asn Phe Gly Thr Val Asp Ser Trp Asn Pro Glu Val Gln Phe Thr Ser Asn Phe Gly Thr Val Asp Ser
675 680 685 675 680 685
Leu Asn Trp Ala Pro Asp Asn Ala Gly Asn Tyr Lys Glu Pro Arg Val Leu Asn Trp Ala Pro Asp Asn Ala Gly Asn Tyr Lys Glu Pro Arg Val
690 695 700 690 695 700
Val Gly Ser Arg Phe Leu Thr His Ile Leu Val Gly Ser Arg Phe Leu Thr His Ile Leu
705 710 705 710
<210> 70<210> 70
<211> 2157<211> 2157
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Cap VP1 AAV2 VP2 VP3 вируса морского льва v5 B1 заменен<223> Cap VP1 AAV2 VP2 VP3 sea lion virus v5 B1 replaced
<400> 70<400> 70
atgtcttctt tgtttaaaga gtacctgcag agtaccggac tggtgggtat ccagtcggga 60atgtcttctt tgtttaaaga gtacctgcag agtaccggac tggtgggtat ccagtcggga 60
gcgccgaagc caaaggccgg ccagcagaag caggatacag ggtcctttga gtggaaaaag 120gcgccgaagc caaaggccgg ccagcagaag caggatacag ggtcctttga gtggaaaaag 120
aaggaggaca cagccagagg gctggtcctt cccggttaca agtacctcgg gcccttcaac 180aaggaggaca cagccagagg gctggtcctt cccggttaca agtacctcgg gcccttcaac 180
ggtctagagc ggggcgagcc tgtgaatgcc gcggacgccg cggcccagcg acacgaccga 240ggtctagagc ggggcgagcc tgtgaatgcc gcggacgccg cggcccagcg acacgaccga 240
cagtacgatc gtattctaca acaagggggt aatccatacc tcacgtacaa ccacgccgac 300cagtacgatc gtattctaca acaagggggt aatccatacc tcacgtacaa ccacgccgac 300
cgagagttcc aggaggagct ccagtctgac gagtcttttg ggggaaatct tggcaaggct 360cgagagttcc aggaggagct ccagtctgac gagtcttttg ggggaaatct tggcaaggct 360
gtgtttcagg ccaagaagcg aatcctagag cccctcggtc tggttgaaga ggatccctct 420gtgtttcagg ccaagaagcg aatcctagag cccctcggtc tggttgaaga ggatccctct 420
cagccagatt cgtcctcgga caacacggcg ccacccgtga aaaagtcccg tctcgaagaa 480cagccagatt cgtcctcgga caacacggcg ccacccgtga aaaagtcccg tctcgaagaa 480
gcccagccca ttcaaagtcc agacgtttcc agcagcactg gcggaggaat tgccgacgtc 540gcccagccca ttcaaagtcc agacgtttcc agcagcactg gcggaggaat tgccgacgtc 540
atgtctggag atgctgaaat ggctgcagtg ggcgggggag caccgggcgt cgacggccag 600atgtctggag atgctgaaat ggctgcagtg ggcgggggag caccgggcgt cgacggccag 600
ggtgccgagg gagtgggtac ttcctcgggt aattggcatt gcgattccca gtggtcagaa 660ggtgccgagg gagtgggtac ttcctcgggt aattggcatt gcgattccca gtggtcagaa 660
ggacacgtca gaaccaccag caccagaacc tgggtgttgc ccagctacaa caaccacctg 720ggacacgtca gaaccaccag caccagaacc tgggtgttgc ccagctacaa caaccacctg 720
tataaacggc ttggaagtag cgcacaatcc aatacctaca acggattctc caccccctgg 780tataaacggc ttggaagtag cgcacaatcc aatacctaca acggattctc caccccctgg 780
ggatacctcg acttcaatag atggcactgt cacttcagtc ctcggaactg gcaacgtctc 840ggatacctcg acttcaatag atggcactgt cacttcagtc ctcggaactg gcaacgtctc 840
atcaacaaca actggggcat cagaccaaaa agacttaatg ttaaattgtt caacatacaa 900atcaacaaca actggggcat cagaccaaaa agacttaatg ttaaattgtt caacatacaa 900
gtcaaagagg tcacgacgga aggggggacg acgaccgtcg ccaataacct taccagcacg 960gtcaaagagg tcacgacgga aggggggacg acgaccgtcg ccaataacct taccagcacg 960
attcaggtgt ttgcggacaa cgcgtacgaa ctcccgtatg ttgtcgacgc gggtcacgag 1020attcaggtgt ttgcggacaa cgcgtacgaa ctcccgtatg ttgtcgacgc gggtcacgag 1020
ggggcattgc cgccgttccc aaacgacgtg tttatgattc cccaatacgg atactgcggg 1080ggggcattgc cgccgttccc aaacgacgtg tttatgattc cccaatacgg atactgcggg 1080
ctggtgtctg gtcaaagtca ggctcagtcg gacttgtgtt cgttttattg cctggagtat 1140ctggtgtctg gtcaaagtca ggctcagtcg gacttgtgtt cgttttattg cctggagtat 1140
tttccatccc agatgctgag aacaggaaac aattttgaaa tgaatttcag gtttgaagac 1200tttccatccc agatgctgag aacaggaaac aattttgaaa tgaatttcag gtttgaagac 1200
gttccatttc actccatgta cgcccacagc cagtctctag acaggctcat gaatccttta 1260gttccattc actccatgta cgcccacagc cagtctctag acaggctcat gaatccttta 1260
attgatcagt atctgtggag tctaaaacaa acaggaaacc cgactggatc aacaacgaga 1320attgatcagt atctgtggag tctaaaacaa acaggaaacc cgactggatc aacaacgaga 1320
gacttaaaat ttatcaagaa caaagttccc aattttgcac attatggaaa aaattggctt 1380gacttaaaat ttatcaagaa caaagttccc aattttgcac attatggaaa aaattggctt 1380
cctggacctt ttattagaca acaggggtgg acaacacaaa atattaataa tagtgttgtt 1440cctggacctt ttattagaca acaggggtgg acaacacaaa atattaataa tagtgttgtt 1440
aattttaatg acatgctggg aaaaaattcg acatttactt tggacactag atggagttca 1500aattttaatg acatgctggg aaaaaattcg acatttactt tggacactag atggagttca 1500
ttagcgcctg gtccgtgtat gggggatgac ggacgaactc catccaccac caagttctca 1560ttagcgcctg gtccgtgtat gggggatgac ggacgaactc catccaccac caagttctca 1560
aatgctcagc tcatgtttgg atctggaaca caacccaccg aaggcggtga agatgctgta 1620aatgctcagc tcatgtttgg atctggaaca caacccaccg aaggcggtga agatgctgta 1620
catattacat ccgagtcgga ggtcaaggca accaacccaa ctgcaatcga tgaatacgga 1680catattacat ccgagtcgga ggtcaaggca accaacccaa ctgcaatcga tgaatacgga 1680
cgagtggccg ataatacgca aaatgcaaca accgccccaa ccacagtggg aaatgctgca 1740cgagtggccg ataatacgca aaatgcaaca accgccccaa ccacagtggg aaatgctgca 1740
atgggggcca tgcctgggat ggtgtggcaa gatagggata tctatcttca aggacccatc 1800atggggggcca tgcctgggat ggtgtggcaa gatagggata tctatcttca aggacccatc 1800
tggggaaaaa taccccatac agacggacat tttcatccgt ctcctctcat gggggggttt 1860tggggaaaaa taccccatac agacggacat tttcatccgt ctcctctcat gggggggttt 1860
ggatacagaa aaccccctcc gcaaattttt attaaaaaca cccccgttcc tggaaatccg 1920ggatacagaa aaccccctcc gcaaattttt attaaaaaca cccccgttcc tggaaatccg 1920
gcaactacat tttctccaaa tagaataaac aatttcatta ctcaatactc aacgggacaa 1980gcaactacat tttctccaaa tagaataaac aatttcatta ctcaatactc aacgggacaa 1980
gtgaccgtta ctattgactg ggagctgcaa aaggaaaact caaagagatg gaacccagaa 2040gtgaccgtta ctattgactg ggagctgcaa aaggaaaact caaagagatg gaacccagaa 2040
gtacaattta catcaaattt tggcacggtc gattcactaa actgggcacc ggacaacgcg 2100gtacaattta catcaaattt tggcacggtc gattcactaa actgggcacc ggacaacgcg 2100
ggaaactaca aagaaccaag ggtggtgggg tctcgattcc ttacgcatat actataa 2157ggaaactaca aagaaccaag ggtggtgggg tctcgattcc ttacgcatat actataa 2157
<210> 71<210> 71
<211> 718<211> 718
<212> БЕЛОК<212> PROTEIN
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Cap VP1 AAV2 VP2 VP3 вируса морского льва v5 B1 заменен<223> Cap VP1 AAV2 VP2 VP3 sea lion virus v5 B1 replaced
<400> 71<400> 71
Met Ser Ser Leu Phe Lys Glu Tyr Leu Gln Ser Thr Gly Leu Val Gly Met Ser Ser Leu Phe Lys Glu Tyr Leu Gln Ser Thr Gly Leu Val Gly
1 5 10 15 1 5 10 15
Ile Gln Ser Gly Ala Pro Lys Pro Lys Ala Gly Gln Gln Lys Gln Asp Ile Gln Ser Gly Ala Pro Lys Pro Lys Ala Gly Gln Gln Lys Gln Asp
20 25 30 20 25 30
Thr Gly Ser Phe Glu Trp Lys Lys Lys Glu Asp Thr Ala Arg Gly Leu Thr Gly Ser Phe Glu Trp Lys Lys Lys Glu Asp Thr Ala Arg Gly Leu
35 40 45 35 40 45
Val Leu Pro Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Glu Arg Val Leu Pro Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Glu Arg
50 55 60 50 55 60
Gly Glu Pro Val Asn Ala Ala Asp Ala Ala Ala Gln Arg His Asp Arg Gly Glu Pro Val Asn Ala Ala Asp Ala Ala Ala Gln Arg His Asp Arg
65 70 75 80 65 70 75 80
Gln Tyr Asp Arg Ile Leu Gln Gln Gly Gly Asn Pro Tyr Leu Thr Tyr Gln Tyr Asp Arg Ile Leu Gln Gln Gly Gly Asn Pro Tyr Leu Thr Tyr
85 90 95 85 90 95
Asn His Ala Asp Arg Glu Phe Gln Glu Glu Leu Gln Ser Asp Glu Ser Asn His Ala Asp Arg Glu Phe Gln Glu Glu Leu Gln Ser Asp Glu Ser
100 105 110 100 105 110
Phe Gly Gly Asn Leu Gly Lys Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Ile Phe Gly Gly Asn Leu Gly Lys Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Ile
115 120 125 115 120 125
Leu Glu Pro Leu Gly Leu Val Glu Glu Asp Pro Ser Gln Pro Asp Ser Leu Glu Pro Leu Gly Leu Val Glu Glu Asp Pro Ser Gln Pro Asp Ser
130 135 140 130 135 140
Ser Ser Asp Asn Thr Ala Pro Pro Val Lys Lys Ser Arg Leu Glu Glu Ser Ser Asp Asn Thr Ala Pro Pro Val Lys Lys Ser Arg Leu Glu Glu
145 150 155 160 145 150 155 160
Ala Gln Pro Ile Gln Ser Pro Asp Val Ser Ser Ser Thr Gly Gly Gly Ala Gln Pro Ile Gln Ser Pro Asp Val Ser Ser Ser Thr Gly Gly Gly
165 170 175 165 170 175
Ile Ala Asp Val Met Ser Gly Asp Ala Glu Met Ala Ala Val Gly Gly Ile Ala Asp Val Met Ser Gly Asp Ala Glu Met Ala Ala Val Gly Gly
180 185 190 180 185 190
Gly Ala Pro Gly Val Asp Gly Gln Gly Ala Glu Gly Val Gly Thr Ser Gly Ala Pro Gly Val Asp Gly Gln Gly Ala Glu Gly Val Gly Thr Ser
195 200 205 195 200 205
Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Gln Trp Ser Glu Gly His Val Arg Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Gln Trp Ser Glu Gly His Val Arg
210 215 220 210 215 220
Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Val Leu Pro Ser Tyr Asn Asn His Leu Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Val Leu Pro Ser Tyr Asn Asn His Leu
225 230 235 240 225 230 235 240
Tyr Lys Arg Leu Gly Ser Ser Ala Gln Ser Asn Thr Tyr Asn Gly Phe Tyr Lys Arg Leu Gly Ser Ser Ala Gln Ser Asn Thr Tyr Asn Gly Phe
245 250 255 245 250 255
Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Leu Asp Phe Asn Arg Trp His Cys His Phe Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Leu Asp Phe Asn Arg Trp His Cys His Phe
260 265 270 260 265 270
Ser Pro Arg Asn Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn Asn Trp Gly Ile Arg Ser Pro Arg Asn Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn Asn Trp Gly Ile Arg
275 280 285 275 280 285
Pro Lys Arg Leu Asn Val Lys Leu Phe Asn Ile Gln Val Lys Glu Val Pro Lys Arg Leu Asn Val Lys Leu Phe Asn Ile Gln Val Lys Glu Val
290 295 300 290 295 300
Thr Thr Glu Gly Gly Thr Thr Thr Val Ala Asn Asn Leu Thr Ser Thr Thr Thr Glu Gly Gly Thr Thr Thr Val Ala Asn Asn Leu Thr Ser Thr
305 310 315 320 305 310 315 320
Ile Gln Val Phe Ala Asp Asn Ala Tyr Glu Leu Pro Tyr Val Val Asp Ile Gln Val Phe Ala Asp Asn Ala Tyr Glu Leu Pro Tyr Val Val Asp
325 330 335 325 330 335
Ala Gly His Glu Gly Ala Leu Pro Pro Phe Pro Asn Asp Val Phe Met Ala Gly His Glu Gly Ala Leu Pro Pro Phe Pro Asn Asp Val Phe Met
340 345 350 340 345 350
Ile Pro Gln Tyr Gly Tyr Cys Gly Leu Val Ser Gly Gln Ser Gln Ala Ile Pro Gln Tyr Gly Tyr Cys Gly Leu Val Ser Gly Gln Ser Gln Ala
355 360 365 355 360 365
Gln Ser Asp Leu Cys Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe Pro Ser Gln Gln Ser Asp Leu Cys Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe Pro Ser Gln
370 375 380 370 375 380
Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Glu Met Asn Phe Arg Phe Glu Asp Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Glu Met Asn Phe Arg Phe Glu Asp
385 390 395 400 385 390 395 400
Val Pro Phe His Ser Met Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu Asp Arg Leu Val Pro Phe His Ser Met Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu Asp Arg Leu
405 410 415 405 410 415
Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Trp Ser Leu Lys Gln Thr Gly Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Trp Ser Leu Lys Gln Thr Gly
420 425 430 420 425 430
Asn Pro Thr Gly Ser Thr Thr Arg Asp Leu Lys Phe Ile Lys Asn Lys Asn Pro Thr Gly Ser Thr Thr Arg Asp Leu Lys Phe Ile Lys Asn Lys
435 440 445 435 440 445
Val Pro Asn Phe Ala His Tyr Gly Lys Asn Trp Leu Pro Gly Pro Phe Val Pro Asn Phe Ala His Tyr Gly Lys Asn Trp Leu Pro Gly Pro Phe
450 455 460 450 455 460
Ile Arg Gln Gln Gly Trp Thr Thr Gln Asn Ile Asn Asn Ser Val Val Ile Arg Gln Gln Gly Trp Thr Thr Gln Asn Ile Asn Asn Ser Val Val
465 470 475 480 465 470 475 480
Asn Phe Asn Asp Met Leu Gly Lys Asn Ser Thr Phe Thr Leu Asp Thr Asn Phe Asn Asp Met Leu Gly Lys Asn Ser Thr Phe Thr Leu Asp Thr
485 490 495 485 490 495
Arg Trp Ser Ser Leu Ala Pro Gly Pro Cys Met Gly Asp Asp Gly Arg Arg Trp Ser Ser Leu Ala Pro Gly Pro Cys Met Gly Asp Asp Gly Arg
500 505 510 500 505 510
Thr Pro Ser Thr Thr Lys Phe Ser Asn Ala Gln Leu Met Phe Gly Ser Thr Pro Ser Thr Thr Lys Phe Ser Asn Ala Gln Leu Met Phe Gly Ser
515 520 525 515 520 525
Gly Thr Gln Pro Thr Glu Gly Gly Glu Asp Ala Val His Ile Thr Ser Gly Thr Gln Pro Thr Glu Gly Gly Glu Asp Ala Val His Ile Thr Ser
530 535 540 530 535 540
Glu Ser Glu Val Lys Ala Thr Asn Pro Thr Ala Ile Asp Glu Tyr Gly Glu Ser Glu Val Lys Ala Thr Asn Pro Thr Ala Ile Asp Glu Tyr Gly
545 550 555 560 545 550 555 560
Arg Val Ala Asp Asn Thr Gln Asn Ala Thr Thr Ala Pro Thr Thr Val Arg Val Ala Asp Asn Thr Gln Asn Ala Thr Thr Ala Pro Thr Thr Val
565 570 575 565 570 575
Gly Asn Ala Ala Met Gly Ala Met Pro Gly Met Val Trp Gln Asp Arg Gly Asn Ala Ala Met Gly Ala Met Pro Gly Met Val Trp Gln Asp Arg
580 585 590 580 585 590
Asp Ile Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Gly Lys Ile Pro His Thr Asp Asp Ile Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Gly Lys Ile Pro His Thr Asp
595 600 605 595 600 605
Gly His Phe His Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe Gly Tyr Arg Lys Gly His Phe His Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe Gly Tyr Arg Lys
610 615 620 610 615 620
Pro Pro Pro Gln Ile Phe Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro Gly Asn Pro Pro Pro Pro Gln Ile Phe Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro Gly Asn Pro
625 630 635 640 625 630 635 640
Ala Thr Thr Phe Ser Pro Asn Arg Ile Asn Asn Phe Ile Thr Gln Tyr Ala Thr Thr Phe Ser Pro Asn Arg Ile Asn Asn Phe Ile Thr Gln Tyr
645 650 655 645 650 655
Ser Thr Gly Gln Val Thr Val Thr Ile Asp Trp Glu Leu Gln Lys Glu Ser Thr Gly Gln Val Thr Val Thr Ile Asp Trp Glu Leu Gln Lys Glu
660 665 670 660 665 670
Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Val Gln Phe Thr Ser Asn Phe Gly Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Val Gln Phe Thr Ser Asn Phe Gly
675 680 685 675 680 685
Thr Val Asp Ser Leu Asn Trp Ala Pro Asp Asn Ala Gly Asn Tyr Lys Thr Val Asp Ser Leu Asn Trp Ala Pro Asp Asn Ala Gly Asn Tyr Lys
690 695 700 690 695 700
Glu Pro Arg Val Val Gly Ser Arg Phe Leu Thr His Ile Leu Glu Pro Arg Val Val Gly Ser Arg Phe Leu Thr His Ile Leu
705 710 715 705 710 715
<210> 72<210> 72
<211> 10<211> 10
<212> БЕЛОК<212> PROTEIN
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> KTag<223> KTag
<400> 72<400> 72
Ala Thr His Ile Lys Phe Ser Lys Arg Asp Ala Thr His Ile Lys Phe Ser Lys Arg Asp
1 5 10 1 5 10
<210> 73<210> 73
<211> 14<211> 14
<212> БЕЛОК<212> PROTEIN
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> SpyTag002<223> SpyTag002
<400> 73<400> 73
Val Pro Thr Ile Val Met Val Asp Ala Tyr Lys Arg Tyr Lys Val Pro Thr Ile Val Met Val Asp Ala Tyr Lys Arg Tyr Lys
1 5 10 1 5 10
<---<---
Claims (100)
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US62/852,791 | 2019-05-24 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2021133286A RU2021133286A (en) | 2023-06-26 |
| RU2842439C2 true RU2842439C2 (en) | 2025-06-26 |
Family
ID=
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2015191508A1 (en) * | 2014-06-09 | 2015-12-17 | Voyager Therapeutics, Inc. | Chimeric capsids |
| WO2019006046A2 (en) * | 2017-06-27 | 2019-01-03 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Tropism-modified recombinant viral particles and uses thereof for the targeted introduction of genetic material into human cells |
| RU2683497C2 (en) * | 2012-04-18 | 2019-03-28 | Дзе Чилдрен'З Хоспитал Оф Филадельфия | Composition and methods for highly efficient gene transfer using aav capsid variants |
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2683497C2 (en) * | 2012-04-18 | 2019-03-28 | Дзе Чилдрен'З Хоспитал Оф Филадельфия | Composition and methods for highly efficient gene transfer using aav capsid variants |
| WO2015191508A1 (en) * | 2014-06-09 | 2015-12-17 | Voyager Therapeutics, Inc. | Chimeric capsids |
| WO2019006046A2 (en) * | 2017-06-27 | 2019-01-03 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Tropism-modified recombinant viral particles and uses thereof for the targeted introduction of genetic material into human cells |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR20220011664A (en) | Modified viral particles and uses thereof | |
| AU2018290885B2 (en) | Tropism-modified recombinant viral particles and uses thereof for the targeted introduction of genetic material into human cells | |
| JP7372154B2 (en) | Directed modified recombinant viral vectors and their use for targeted introduction of genetic material into human cells | |
| KR20220012231A (en) | Fully-Human Post-Translational Modified Antibody Therapeutics | |
| US20250304918A1 (en) | Viral particles retargeted to skeletal muscle | |
| KR20230154074A (en) | Antibody delivery using a dual viral vector system | |
| KR20230093437A (en) | Vectorized anti-TNF-α antibodies for ocular indications | |
| RU2842439C2 (en) | Modified viral particles and ways of use thereof | |
| WO2024173248A1 (en) | Treatment of muscle related disorders with anti-human cacng1 antibodies | |
| CN115772544B (en) | AAV vectors against VEGF-A and ANG-2 | |
| JP2025525792A (en) | Viral particles retargeted to transferrin receptor 1 | |
| RU2811426C2 (en) | Recombinant viral particles with modified tropism and ways of their use for targeted introduction of genetic material into human cells | |
| WO2024229105A1 (en) | Anti-human m-cadherin (cdh15) antibodies, conjugates, and uses thereof for delivery of genetic payloads to muscle cells | |
| HK40018460A (en) | Tropism-modified recombinant viral vectors and uses thereof for the targeted introduction of genetic material into human cells | |
| HK40018460B (en) | Tropism-modified recombinant viral vectors and uses thereof for the targeted introduction of genetic material into human cells |