RU2840148C1 - Culture-based inactivated emulsion vaccine against foot-and-mouth disease a/africa/g-vii genotype - Google Patents
Culture-based inactivated emulsion vaccine against foot-and-mouth disease a/africa/g-vii genotype Download PDFInfo
- Publication number
- RU2840148C1 RU2840148C1 RU2024132991A RU2024132991A RU2840148C1 RU 2840148 C1 RU2840148 C1 RU 2840148C1 RU 2024132991 A RU2024132991 A RU 2024132991A RU 2024132991 A RU2024132991 A RU 2024132991A RU 2840148 C1 RU2840148 C1 RU 2840148C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- vii
- foot
- mouth disease
- africa
- genotype
- Prior art date
Links
- 241000710198 Foot-and-mouth disease virus Species 0.000 title claims abstract description 197
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 title claims abstract description 98
- 208000007212 Foot-and-Mouth Disease Diseases 0.000 title claims abstract description 75
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 title claims abstract description 32
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims abstract description 23
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 claims abstract description 22
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 claims abstract description 19
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims description 43
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 36
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 35
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 35
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 claims description 11
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 claims description 8
- 239000013543 active substance Substances 0.000 claims description 7
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 7
- 244000052769 pathogen Species 0.000 claims description 7
- 241000699673 Mesocricetus auratus Species 0.000 claims description 4
- 231100000676 disease causative agent Toxicity 0.000 claims description 4
- 244000037640 animal pathogen Species 0.000 claims description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 abstract description 34
- 241000282887 Suidae Species 0.000 abstract description 20
- 230000003053 immunization Effects 0.000 abstract description 7
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 abstract description 7
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 5
- 238000002649 immunization Methods 0.000 abstract description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 65
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 40
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 28
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 21
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 18
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 17
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 15
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 13
- 238000000034 method Methods 0.000 description 12
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 10
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 10
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 10
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 9
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 8
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 8
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 8
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 8
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 8
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 8
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 8
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 8
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 8
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 7
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 7
- 238000004264 monolayer culture Methods 0.000 description 7
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 6
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 6
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 6
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 6
- 210000003128 head Anatomy 0.000 description 6
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 6
- 239000000047 product Substances 0.000 description 6
- 238000011160 research Methods 0.000 description 6
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 6
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 5
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 description 5
- 238000011161 development Methods 0.000 description 5
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 5
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 5
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 5
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 5
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 5
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 5
- 241001250094 Capra sibirica Species 0.000 description 4
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 4
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 4
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 4
- 230000000120 cytopathologic effect Effects 0.000 description 4
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 4
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 4
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 4
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- 238000004114 suspension culture Methods 0.000 description 4
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 description 3
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 description 3
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 3
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 3
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 3
- 239000013553 cell monolayer Substances 0.000 description 3
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 3
- 238000010835 comparative analysis Methods 0.000 description 3
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 3
- 230000036541 health Effects 0.000 description 3
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 3
- -1 polyhexamethylene guanidine Polymers 0.000 description 3
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 3
- 239000003531 protein hydrolysate Substances 0.000 description 3
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 3
- 210000000605 viral structure Anatomy 0.000 description 3
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 2
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000010629 Molecular evolutionary genetics analysis Methods 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 2
- 208000002399 aphthous stomatitis Diseases 0.000 description 2
- 230000000680 avirulence Effects 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 2
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 2
- 230000004727 humoral immunity Effects 0.000 description 2
- 229940031551 inactivated vaccine Drugs 0.000 description 2
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 2
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 2
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 238000012552 review Methods 0.000 description 2
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 2
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- 241000710189 Aphthovirus Species 0.000 description 1
- 102100031974 CMP-N-acetylneuraminate-beta-galactosamide-alpha-2,3-sialyltransferase 4 Human genes 0.000 description 1
- 241000306001 Cetartiodactyla Species 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 239000012981 Hank's balanced salt solution Substances 0.000 description 1
- 101000703754 Homo sapiens CMP-N-acetylneuraminate-beta-galactosamide-alpha-2,3-sialyltransferase 4 Proteins 0.000 description 1
- 108090001030 Lipoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000004895 Lipoproteins Human genes 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 108010009736 Protein Hydrolysates Proteins 0.000 description 1
- 101710140501 Sulfate adenylyltransferase subunit 2 1 Proteins 0.000 description 1
- 101710173681 Sulfate adenylyltransferase subunit 2 2 Proteins 0.000 description 1
- 102100030100 Sulfate anion transporter 1 Human genes 0.000 description 1
- 101710144481 Sulfate anion transporter 1 Proteins 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- 239000000443 aerosol Substances 0.000 description 1
- 230000037429 base substitution Effects 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 230000036760 body temperature Effects 0.000 description 1
- 239000012888 bovine serum Substances 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 239000002131 composite material Substances 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 230000009351 contact transmission Effects 0.000 description 1
- 238000011217 control strategy Methods 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- BTWUORFYKAZQHW-UHFFFAOYSA-L disodium;2-hydroxy-3-[4-[4-[(2-hydroxy-3-sulfonatopropyl)amino]-3-methylphenyl]-2-methylanilino]propane-1-sulfonate Chemical compound [Na+].[Na+].C1=C(NCC(O)CS([O-])(=O)=O)C(C)=CC(C=2C=C(C)C(NCC(O)CS([O-])(=O)=O)=CC=2)=C1 BTWUORFYKAZQHW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 230000003067 hemagglutinative effect Effects 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000005304 joining Methods 0.000 description 1
- 238000012417 linear regression Methods 0.000 description 1
- WSFSSNUMVMOOMR-NJFSPNSNSA-N methanone Chemical compound O=[14CH2] WSFSSNUMVMOOMR-NJFSPNSNSA-N 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 210000004400 mucous membrane Anatomy 0.000 description 1
- 210000003928 nasal cavity Anatomy 0.000 description 1
- 230000017074 necrotic cell death Effects 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000007918 pathogenicity Effects 0.000 description 1
- 238000010827 pathological analysis Methods 0.000 description 1
- 208000008494 pericarditis Diseases 0.000 description 1
- 230000000737 periodic effect Effects 0.000 description 1
- 238000013081 phylogenetic analysis Methods 0.000 description 1
- 230000000704 physical effect Effects 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 description 1
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 description 1
- 239000012264 purified product Substances 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 230000000601 reactogenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 230000003319 supportive effect Effects 0.000 description 1
- 230000009897 systematic effect Effects 0.000 description 1
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 1
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
- 230000036642 wellbeing Effects 0.000 description 1
Abstract
Description
Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии, а именно к разработке вакцины против ящура генотипа A/AFRICA/G-VII культуральная инактивированная эмульсионная.The invention relates to the field of veterinary virology and biotechnology, namely to the development of a vaccine against foot-and-mouth disease of the genotype A/AFRICA/G-VII, a culture inactivated emulsion vaccine.
Ящур является очень опасным и сверх контагиозным вирусом, который вызывает везикулярные поражения слизистых оболочек ротовой и носовой полости, перикардитами [1].Foot-and-mouth disease is a very dangerous and highly contagious virus that causes vesicular lesions of the mucous membranes of the mouth and nasal cavity, pericarditis [1].
Существует семь следующих серотипов вируса ящура: O, A, C, SAT-1, SAT-2, SAT-3 и Азия-1, при этом представители серотипа А являются наиболее распространенными, в том числе и на территории Африканского континента.There are seven serotypes of foot-and-mouth disease virus: O, A, C, SAT-1, SAT-2, SAT-3 and Asia-1, with serotype A being the most common, including on the African continent.
Серологические типы вируса ящура разделены на более чем 60 генотипов, различия между которыми определяют при анализе нуклеотидной последовательности высоковариабельного 1D-гена, кодирующего аминокислотную последовательность поверхностного и наиболее вариабельного вирусного белка VP1 [2].Serological types of foot-and-mouth disease virus are divided into more than 60 genotypes, the differences between which are determined by analyzing the nucleotide sequence of the highly variable 1D gene, which encodes the amino acid sequence of the surface and most variable viral protein VP 1 [2].
Восстановление животных после переболевания ящуром, каким-либо одним генотипом, не обеспечивает иммунную защиту против другого генотипа [3-5].Recovery of animals after foot-and-mouth disease with one genotype does not provide immune protection against another genotype [3-5].
Поскольку вакцинация используется в качестве основного инструмента контроля в эндемичных районах, анализ каждого пула и генотипов в нем может подобрать наиболее специфичные вакцины, имеющие в своем составе соответствующие топотипы, присутствующие в этом пуле, вместо того, чтобы продолжать полагаться на более широко доступные в настоящее время генетические вакцины.Since vaccination is used as the primary control tool in endemic areas, analysis of each pool and the genotypes within it could select the most specific vaccines that contain the relevant topotypes present in that pool, rather than continuing to rely on the more widely available genetic vaccines.
Для изолятов вируса ящура серотипа А характерно широкое генетическое разнообразие. Серотип А включает в себя 3 охарактеризованных генотипа ASIA, AFRICA, EURO-SA и одну пока еще малоизученную группу изолятов [2, 5], что приводит к проблемам в специфической профилактики ящура при применении культуральных инактивированных противоящурных вакцин. В результате возникает необходимость создания новых средств специфической профилактики в отношении ящура серотипа А [1, 6, 7].Isolates of foot-and-mouth disease virus serotype A are characterized by a wide genetic diversity. Serotype A includes 3 characterized genotypes ASIA, AFRICA, EURO-SA and one still poorly studied group of isolates [2, 5], which leads to problems in the specific prevention of foot-and-mouth disease when using culture-based inactivated foot-and-mouth disease vaccines. As a result, there is a need to create new means of specific prevention against foot-and-mouth disease serotype A [1, 6, 7].
В целях обеспечения биологической безопасности на территории Российской Федерации, недопущения возникновения ящура в хозяйствах нашего государства применяется комплекс мероприятий по борьбе и профилактике ящура, который направлен на предупреждение заноса вируса в страну, систематическую вакцинацию животных в буферной зоне, проведение мониторинга иммунного статуса КРС и свиней, для которых применяют культуральные инактивированные вакцины против ящура.In order to ensure biological security in the territory of the Russian Federation, to prevent the occurrence of foot-and-mouth disease in the farms of our state, a set of measures is used to combat and prevent foot-and-mouth disease, which is aimed at preventing the introduction of the virus into the country, systematic vaccination of animals in the buffer zone, monitoring the immune status of cattle and pigs, for which cultural inactivated vaccines against foot-and-mouth disease are used.
Для иммунизации животных должна применяться вакцина, изготовленная из вируса, гомологичного полевым изолятам, что подтверждено исследованиями многих ученых [6, 7, 8, 9, 10, 11].To immunize animals, a vaccine made from a virus homologous to field isolates should be used, which has been confirmed by studies by many scientists [6, 7, 8, 9, 10, 11].
Вакцины инактивированные, изготовленные преимущественного из 146S компонента, на сегодняшний день в отношении ящура по-прежнему признаются наиболее эффективными [8, 9, 12, 13-16].Inactivated vaccines, made primarily from the 146S component, are still considered the most effective against foot-and-mouth disease [8, 9, 12, 13-16].
Генетическое и антигенное разнообразие вируса ящура серотипа А приводит к проблемам в специфической профилактике ящура при применении культуральных инактивированных противоящурных вакцин, а также затрудняет штаммоспецифическую диагностику выделенных изолятов вируса ящура. В результате возникает необходимость создания новых средств диагностики и специфической иммунопрофилактики в отношении вируса ящура серотипа А и, в частности, генотипа А/AFRICA/G-VII, представители которого распространялись на территории Африки [3].The genetic and antigenic diversity of the foot-and-mouth disease virus serotype A leads to problems in the specific prevention of foot-and-mouth disease when using culture-based inactivated foot-and-mouth disease vaccines, and also complicates the strain-specific diagnostics of the isolated foot-and-mouth disease virus isolates. As a result, there is a need to create new diagnostic tools and specific immunoprophylaxis against foot-and-mouth disease virus serotype A and, in particular, genotype A/AFRICA/G-VII, representatives of which have spread throughout Africa [3].
Учитывая процесс развития и активного налаживания торгово-экономических взаимоотношений Российской Федерацией со странами Африканского континента, высоки риски заноса изолятов вируса ящура серотипа А на территорию нашей страны, что может серьезно угрожать биологической безопасности России в отношении возникновения ящура серотипа А [6].Considering the process of development and active establishment of trade and economic relations between the Russian Federation and the countries of the African continent, there is a high risk of introducing isolates of foot-and-mouth disease virus serotype A into the territory of our country, which could seriously threaten the biological security of Russia with regard to the emergence of foot-and-mouth disease serotype A [6].
Анализируя вспышки, которые регистрировались на территории Западной Африки, обнаружено, что в Бурунди в 2022 г. обнаружены изоляты генотипа A/AFRICA/G-I, в Эритрее в 2008 и 2018 гг. была вспышка ящура генотипа A/AFRIVA/G-IV. Высокое количество вспышек отмечали в Эфиопии и Кения в период с 2003 по настоящее время, которые вызваны генотипами A/AFRICA-G-II, A/AFRICA/G-IV и A/AFRICA/G-VII. В Танзании и Уганде в 2013 и 2016 гг. были выделены изоляты вируса ящура генотипа A/AFRICA/G-I. При этом в Кении отмечают вспышки ящура экзотического генотипа A/AFRICA/G-VII, который является редким и имеет уникальный нуклеотидный и аминокислотный состав. Распространение ящура генотипа A/AFRICA/G-VII является опасным и требует исследования штаммов данного генотипа для создания средств диагностики и специфической профилактики ящура данного генотипа.Analyzing outbreaks registered in West Africa, it was found that isolates of the A/AFRICA/G-I genotype were detected in Burundi in 2022, while outbreaks of the A/AFRIVA/G-IV genotype foot-and-mouth disease were reported in Eritrea in 2008 and 2018. A high number of outbreaks were noted in Ethiopia and Kenya from 2003 to the present, caused by the A/AFRICA-G-II, A/AFRICA/G-IV and A/AFRICA/G-VII genotypes. Isolates of the A/AFRICA/G-I genotype foot-and-mouth disease virus were isolated in Tanzania and Uganda in 2013 and 2016. At the same time, outbreaks of the exotic A/AFRICA/G-VII genotype foot-and-mouth disease have been reported in Kenya, which is rare and has a unique nucleotide and amino acid composition. The spread of foot-and-mouth disease genotype A/AFRICA/G-VII is dangerous and requires research into strains of this genotype to create diagnostic tools and specific prevention of foot-and-mouth disease of this genotype.
Известны производственные штаммы вируса ящура серотипа А, которые применяются для производства средств специфической профилактики ящура:There are known production strains of foot-and-mouth disease virus serotype A, which are used for the production of specific foot-and-mouth disease prophylaxis agents:
- штамм «А22/Ирак/64» (генотип A/ASIA/Iraq-64),- strain "A 22 /Iraq/64" (genotype A/ASIA/Iraq-64),
- штамм «А/Турция/06» (генотип A/ASIA/Iran-05),- strain "A/Türkiye/06" (genotype A/ASIA/Iran-05),
- штамм «А/Краснодарский/2013» (генотип A/ASIA/Iran-05SIS-10),- strain "A/Krasnodar/2013" (genotype A/ASIA/Iran-05 SIS-10 ),
- штамм «А/Забайкальский/2013» (генотип A/ASIA/Sea-97),- strain "A/Zabaikalsky/2013" (genotype A/ASIA/Sea-97),
- штамм «А/ВНИИЗЖ/2015» (генотип A/ASIA/G-VII),- strain "A/VNIIZZH/2015" (genotype A/ASIA/G-VII),
- штамм «А/Танзания/2013» (генотип A/AFRICA/G-I),- strain “A/Tanzania/2013” (genotype A/AFRICA/G-I),
- штамм «А 2205/G-IV» (генотип A/AFRICA/G-IV).- strain “A 2205/G-IV” (genotype A/AFRICA/G-IV).
Изолят вируса ящура был выделен от крупного рогатого скота на территории Кении в 2005 г. и поступил в ФГБУ «ВНИИЗЖ» для проведения научных исследований в 2018 г.The foot-and-mouth disease virus isolate was isolated from cattle in Kenya in 2005 and was delivered to the All-Russian Research Institute of Animal Health for scientific research in 2018.
Штамм «А / Кения / G-VII» был получен в результате научно-исследовательской работы путем адаптации изолята к репродукции в первично-трипсинизированной монослойной клеточной линии почки свиньи СП, в перевиваемых культурах клеток ВНК-21/SUSP/ARRIAH, IB-RS-2, ПСГК-30, в организме крупного рогатого скота и свиней в условиях ФГБУ «ВНИИЗЖ».Strain "A/Kenya/G-VII" was obtained as a result of research work by adapting the isolate to reproduction in the primary trypsinized monolayer cell line of pig kidney SP, in transplantable cell cultures BHK-21/SUSP/ARRIAH, IB-RS-2 , PSGK-30, in the body of cattle and pigs under the conditions of the Federal State Budgetary Institution "All-Russian Research Institute of Animal Health".
По результатам сравнительного анализа нуклеотидных последовательностей выделенный штамм вируса ящура принадлежит к генотипу A/AFRICA/G-VII, который значительно отличается от производственных штаммов вируса ящура серотипа A, в том числе, от штамма «А 2205/G-IV» [9].According to the results of a comparative analysis of nucleotide sequences, the isolated strain of foot-and-mouth disease virus belongs to the genotype A/AFRICA/G-VII, which differs significantly from production strains of foot-and-mouth disease virus serotype A, including the strain “A 2205/G-IV” [9].
В ФГБУ «ВНИИЗЖ» данный изолят был адаптирован к различным чувствительным клеточным линиям, в том числе, к монослойной и суспензионной перевиваемой клеточной линии почки новорожденного сирийского хомячка ВНК-21/SUSP/ARRIAH и получен штамм «А / Кения / G-VII» (генотип A/AFRICA/G-VII). Филогенетическая принадлежность штамма «А / Кения / G-VII» вируса ящура представлена на фиг. 1.At the FGBU "ARRIAH" this isolate was adapted to various sensitive cell lines, including the monolayer and suspension transplantable cell line of newborn Syrian hamster kidney BHK-21/SUSP/ARRIAH, and the strain "A / Kenya / G-VII" (genotype A / AFRICA / G-VII) was obtained. The phylogenetic affiliation of the strain "A / Kenya / G-VII" of foot-and-mouth disease virus is shown in Fig. 1.
По причине значительного увеличения торгово-экономических взаимоотношений между Россией и странами Африки, в которых периодически регистрируют вспышки ящура генотипа A/AFRICA/G-VII, возникает опасность случаев возникновения ящура данного генотипа в Российской Федерации и особое значение приобретает проблема возможной экстренной профилактики данного заболевания для формирования иммунитета у восприимчивых животных. Таким образом, возникла необходимость разработать вакцину против ящура генотипа A/AFRICA/G-VII культуральную инактивированную эмульсионную для обеспечения биологической безопасности и ветеринарного благополучия территории Российской Федерации, сопредельных государств и стран, эндемичных по ящуру, которые будут использовать данный препарат для профилактики заболевания.Due to a significant increase in trade and economic relations between Russia and African countries, where outbreaks of foot-and-mouth disease of the A/AFRICA/G-VII genotype are periodically registered, there is a risk of cases of foot-and-mouth disease of this genotype in the Russian Federation, and the problem of possible emergency prevention of this disease to form immunity in susceptible animals is of particular importance. Thus, it became necessary to develop a vaccine against foot-and-mouth disease of the A/AFRICA/G-VII genotype, a culture-based inactivated emulsion vaccine, to ensure biological safety and veterinary well-being of the territory of the Russian Federation, neighboring states and countries endemic for foot-and-mouth disease, which will use this drug to prevent the disease.
Наиболее близкой предлагаемому изобретению по совокупности существенных признаков является вакцина для ранней защиты против ящура из штамма А 2205/G-IV культуральная инактивированная эмульсионная [17], содержащая активное вещество в виде авирулентного и очищенного культурального антигенного материала из гомологичного возбудителю ящура штамма А 2205/G-IV (генотип A/AFRICA/G-IV), полученного в чувствительной биологической системе, и целевые добавки в виде масляного адъюванта Montanide ISA-206 VG («Seppic», Р. Франция): концентрация антигена - не менее 6,0 мкг в 1,0 см3 готового препарата, содержание масляного адъюванта Montanide ISA-206 VG - 500000,0-575000,0 мкг в 1,0 см3 готового препарата (прототип).The closest to the proposed invention in terms of the set of essential features is a vaccine for early protection against foot-and-mouth disease from the A 2205/G-IV strain, a culture-based inactivated emulsion vaccine [17], containing an active substance in the form of avirulent and purified culture antigen material from the A 2205/G-IV strain homologous to the causative agent of foot-and-mouth disease (genotype A/AFRICA/G-IV), obtained in a sensitive biological system, and target additives in the form of the oil adjuvant Montanide ISA-206 VG (“Seppic”, R. France): antigen concentration is at least 6.0 μg in 1.0 cm 3 of the finished product, the content of the oil adjuvant Montanide ISA-206 VG is 500,000.0-575,000.0 μg in 1.0 cm 3 of the finished product (prototype).
Существенный недостаток вакцины-прототипа состоит в его низкой иммуногенной активности относительно штаммов/изолятов вируса ящура генотипа A/AFRICA/G-VII.A significant drawback of the prototype vaccine is its low immunogenic activity against strains/isolates of the foot-and-mouth disease virus of genotype A/AFRICA/G-VII.
Для решения указанной проблемы было создано настоящее изобретение, в которое входила разработка вакцины против ящура генотипа A/AFRICA/G-VII культуральной инактивированной эмульсионной. Данная вакцина предполагает высокое содержание 146S иммуногенного компонента и масляный адъювант Montanide ISA-61 VG в составе препарата.To solve the above problem, the present invention was created, which included the development of a vaccine against foot-and-mouth disease of the genotype A/AFRICA/G-VII, a culture inactivated emulsion vaccine. This vaccine assumes a high content of the 146S immunogenic component and the oil adjuvant Montanide ISA-61 VG in the composition of the preparation.
Технический результат от использования предлагаемого изобретения заключается в расширении арсенала противоящурных инактивированных культуральных эмульсионных вакцин для защиты животных против изолятов и штаммов вируса ящура генотипа A/AFRICA/G-VII.The technical result of using the proposed invention consists in expanding the arsenal of anti-foot-and-mouth disease inactivated culture emulsion vaccines for protecting animals against isolates and strains of the foot-and-mouth disease virus of genotype A/AFRICA/G-VII.
Указанный технический результат достигнут созданием вакцины против ящура генотипа A/AFRICA/G-VII культуральной инактивированной эмульсионной, охарактеризованной следующей совокупностью признаков, отраженных ниже.The specified technical result was achieved by creating a vaccine against foot-and-mouth disease of the A/AFRICA/G-VII genotype, a culture-based inactivated emulsion vaccine, characterized by the following set of features, reflected below.
Разработанная вакцина в дозе препарата 2,0 см3 содержит следующие основные компоненты: 1) активное вещество в виде авирулентного и очищенного антигенного материала из гомологичного возбудителю инфекции штамма «А/Кения/G-VII» (генотип A/AFRICA/G-VII) вируса ящура, репродуцированного в перевиваемой суспензионной клеточной линии ВНК-21/SUSP/ARRIAH, в количестве не менее 15,0 мкг; 2) масляный адъювант Montanide ISA-61 VG, обеспечивающий усиление иммунного ответа у животных с содержанием 60% по массе, 3) поддерживающая среда - до 2,0 см3.The developed vaccine in a dose of 2.0 cm3 contains the following main components: 1) the active substance in the form of avirulent and purified antigen material from the homologous to the causative agent of the infection strain "A/Kenya/G-VII" (genotype A/AFRICA/G-VII) of the foot-and-mouth disease virus, reproduced in the transplantable suspension cell line BHK-21/SUSP/ARRIAH, in an amount of at least 15.0 μg; 2) oil adjuvant Montanide ISA-61 VG, providing an increase in the immune response in animals with a content of 60% by weight, 3) maintenance medium - up to 2.0 cm3 .
Штамм «А/Кения/G-VII» вируса ящура депонирован во Всероссийской государственной коллекции экзотических типов вирусов ящура и других патогенов животных (ГКШМ) ФГБУ «ВНИИЗЖ», под регистрационным номером: №492 - деп / 23-42 - ГКШМ ФГБУ «ВНИИЗЖ».The strain "A/Kenya/G-VII" of the foot-and-mouth disease virus is deposited in the All-Russian State Collection of Exotic Types of Foot-and-Mouth Disease Viruses and Other Animal Pathogens (GKShM) of the FGBU "ARRIAH", under the registration number: No. 492 - dep / 23-42 - GKShM of the FGBU "ARRIAH".
Штамм адаптирован к первично-трипсинизированным монослойным клеткам линии свиной почки (СП) и перевиваемым клеточным линиям из почки новорожденного сирийского хомячка (ВНК-21/SUSP/ARRIAH), почки свиньи (IB-RS-2) и почки сибирского горного козерога (ПСГК-30).The strain is adapted to primary trypsinized monolayer cells of the porcine kidney (SP) line and continuous cell lines from the kidney of a newborn Syrian hamster (BHK-21/SUSP/ARRIAH), pig kidney (IB-RS-2) and the kidney of the Siberian ibex (PSGK-30).
Для изготовления вакцины в качестве чувствительной биологической системы предпочтительно используют перевиваемую суспензионную культуру клеток ВНК-21/SUSP/ARRIAH, а в качестве поддерживающей среды применяют среду Хэнкса без внесения сыворотки, но с добавлением гидролизата белков крови в количестве 5,0% от общего объема при рН среды 7,50-7,70. Инактивацию вируса проводят с использованием аминоэтилэтиленимина (АЭЭИ) с концентрацией 0,03% от объема вируссодержащей суспензии. Инактивированный вирус очищают от балластных примесей с помощью полигексаметиленгуанидина (ПГМГ), который вносят в суспензию до концентрации 0,04% от общего объема.For the production of the vaccine, the transplantable suspension culture of BHK-21/SUSP/ARRIAH cells is preferably used as a sensitive biological system, and Hanks' medium without the addition of serum, but with the addition of blood protein hydrolysate in an amount of 5.0% of the total volume at a pH of the medium of 7.50-7.70, is used as a supporting medium. The virus is inactivated using aminoethylethyleneimine (AEEI) with a concentration of 0.03% of the volume of the virus-containing suspension. The inactivated virus is purified from ballast impurities using polyhexamethylene guanidine (PHMG), which is added to the suspension to a concentration of 0.04% of the total volume.
Авирулентный и очищенный антиген штамма «А/Кения/G-VII» (генотип А/AFRICA/G-VII) вируса ящура представляет собой суспензию, содержащую инактивированный 146S иммуногенный компонент вируса ящура. Концентрацию компонента в продукте определяют с помощью количественного варианта реакции связывания комплемента (РСК) [18-20].The avirulent and purified antigen of the A/Kenya/G-VII strain (genotype A/AFRICA/G-VII) of foot-and-mouth disease virus is a suspension containing the inactivated 146S immunogenic component of the foot-and-mouth disease virus. The concentration of the component in the product is determined using a quantitative complement fixation reaction (CFR) [18-20].
Для создания вакцины используют вирусный материал, содержащий в 2,0 см3 не менее 15,0 мкг инактивированных иммуногенных 146S частиц вируса ящура. Заявленную концентрацию иммуногенного компонента в вакцинном препарате обеспечивают благодаря концентрированию антигена с помощью установки тангенциальной фильтрации.To create the vaccine, a viral material is used that contains at least 15.0 μg of inactivated immunogenic 146S particles of the foot-and-mouth disease virus per 2.0 cm 3. The stated concentration of the immunogenic component in the vaccine preparation is ensured by concentrating the antigen using a tangential filtration unit.
Вакцину против ящура генотипа A/AFRICA/G-VII культуральную инактивированную эмульсионную получают путем смешивания очищенного антигена и масляного адъюванта Montanide ISA-61 VG в соотношении 40% и 60% по массе, соответственно.The vaccine against foot-and-mouth disease genotype A/AFRICA/G-VII, culture-based inactivated emulsion vaccine, is obtained by mixing purified antigen and oil adjuvant Montanide ISA-61 VG in a ratio of 40% and 60% by weight, respectively.
Полученная вакцина представляет собой стабильную обратную эмульсию белого или бледно-розового цвета типа «вода в масле», содержащую инактивированный 146S компонент вируса ящура штамма «А/Кения/G-VII».The resulting vaccine is a stable, white or pale pink water-in-oil reverse emulsion containing the inactivated 146S component of the foot-and-mouth disease virus strain A/Kenya/G-VII.
Предлагаемое изобретение включает следующую совокупность существенных признаков, обеспечивающих получение технического результата во всех случаях, на которые спрашивается правовая охрана:The proposed invention includes the following set of essential features that ensure the achievement of a technical result in all cases for which legal protection is requested:
1. Вакцина против ящура генотипа A/AFRICA/G-VII культуральная инактивированная эмульсионная.1. Vaccine against foot-and-mouth disease genotype A/AFRICA/G-VII, culture-based inactivated emulsion.
2. Активное вещество в виде авирулентного и очищенного антигенного материала из гомологичного возбудителю заболевания штамма «А/Кения/G-VII» генотипа А/AFRICA/G-VII вируса ящура в эффективном количестве.2. An active substance in the form of avirulent and purified antigen material from the homologous to the pathogen strain "A/Kenya/G-VII" genotype A/AFRICA/G-VII foot-and-mouth disease virus in an effective amount.
3. Целевые добавки.3. Targeted supplements.
Существенные отличительные признаки предлагаемой вакцины заключаются в том, что в качестве активного вещества она содержит авирулентный очищенный антиген штамма «А/Кения/G-VII» генотипа А/AFRICA/G-VII вируса ящура в эффективном количестве.The essential distinguishing features of the proposed vaccine are that it contains, as an active substance, an avirulent purified antigen of the A/Kenya/G-VII strain of the A/AFRICA/G-VII genotype of the foot-and-mouth disease virus in an effective amount.
Предлагаемое изобретение характеризуется также другими отличительными признаками, выражающими конкретные формы выполнения или особые условия его использования:The proposed invention is also characterized by other distinctive features expressing specific forms of implementation or special conditions of its use:
1. Авирулентный и очищенный антиген штамма «А/Кения/G-VII» генотипа А/AFRICA/G-VII вируса ящура, полученный предпочтительно в суспензионной перевиваемой клеточной линии BHK-21/SUSP/ARRIAH и представляющий собой суспензию, содержащую преимущественно 146S иммуногенный компонент вируса ящура в эффективном количестве.1. An avirulent and purified antigen of the A/Kenya/G-VII strain of the A/AFRICA/G-VII genotype of foot-and-mouth disease virus, obtained preferably in the suspension transplantable cell line BHK-21/SUSP/ARRIAH and representing a suspension containing predominantly the 146S immunogenic component of the foot-and-mouth disease virus in an effective amount.
2. Авирулентный и очищенный антиген штамма «А/Кения/G-VII» генотипа А/AFRICA/G-VII вируса ящура, полученный предпочтительно в суспензионной перевиваемой культуре клеток BHK-21/SUSP/ARRIAH и представляющий собой суспензию, содержащую преимущественно 146S иммуногенный компонент вируса ящура в количестве не менее 15,0 мкг в 2,0 см3 готового вакцинного препарата.2. An avirulent and purified antigen of the A/Kenya/G-VII strain of the A/AFRICA/G-VII genotype of the foot-and-mouth disease virus, obtained preferably in a suspension transplantable cell culture of BHK-21/SUSP/ARRIAH and representing a suspension containing predominantly the 146S immunogenic component of the foot-and-mouth disease virus in an amount of at least 15.0 μg in 2.0 cm3 of the finished vaccine preparation.
3. Из целевых добавок вакцина содержит масляный адъювант Montanide ISA-61 VG.3. Among the target additives, the vaccine contains the oil adjuvant Montanide ISA-61 VG.
4. Вакцина содержит масляный адъювант Montanide ISA-61 VG в количестве 60% (по массе) в 2,0 см3 готового препарата.4. The vaccine contains the oil adjuvant Montanide ISA-61 VG in an amount of 60% (by weight) in 2.0 cm3 of the finished product.
5. Авирулентный и очищенный антиген штамма «А/Кения/G-VII» генотипа А/AFRICA/G-VII вируса ящура, полученного предпочтительно в перевиваемой суспензионной клеточной линии BHK-21/SUSP/ARRIAH, масляный адъювант Montanide ISA-61 VG, добавка в дозе готового препарата 2,0 см3 в виде поддерживающей среды в следующих количествах:5. Avirulent and purified antigen of the strain "A/Kenya/G-VII" of the genotype A/AFRICA/G-VII foot-and-mouth disease virus, obtained preferably in the continuous suspension cell line BHK-21/SUSP/ARRIAH, oil adjuvant Montanide ISA-61 VG, additive in a dose of the finished product of 2.0 cm3 in the form of a maintenance medium in the following quantities:
Предлагаемая вакцина против ящура генотипа A/AFRICA/G-VII культуральная инактивированная эмульсионная обладает высокой иммуногенной активностью и обеспечивает надежную защиту против изолятов вируса ящура генотипа А/AFRICA/G-VII.The proposed vaccine against foot-and-mouth disease genotype A/AFRICA/G-VII, culture-based inactivated emulsion vaccine, has high immunogenic activity and provides reliable protection against isolates of foot-and-mouth disease virus genotype A/AFRICA/G-VII.
Достижение технического результата от использования изобретения обеспечивается тем, что в состав предлагаемой противоящурной культуральной инактивированной эмульсионной вакцины в качестве активного вещества введен антиген штамма «А/Кения/G-VII» генотипа А/AFRICA/G-VII вируса ящура, обладающий высокой иммуногенной активностью, создающий эффективную защиту восприимчивых животных против изолятов вируса ящура представленного генотипа, которые в последние годы вызывают вспышки в мире.The achievement of the technical result from the use of the invention is ensured by the fact that the proposed anti-foot-and-mouth disease culture inactivated emulsion vaccine contains, as an active substance, an antigen of the strain "A/Kenya/G-VII" of the genotype A/AFRICA/G-VII of the foot-and-mouth disease virus, which has high immunogenic activity, creating effective protection of susceptible animals against isolates of the foot-and-mouth disease virus of the presented genotype, which in recent years have caused outbreaks around the world.
Сущность изобретения отражена на графическом изображении:The essence of the invention is reflected in the graphic image:
Фиг. 1 - Дендрограмма, отражающая филогенетическое взаимоотношение штамма «А/Кения/G-VII» вируса ящура с эпизоотическими штаммами серологического типа А. Дендрограмма основана на сравнении полных нуклеотидных последовательностей гена VP1.Fig. 1 - Dendrogram reflecting the phylogenetic relationship of the strain "A/Kenya/G-VII" of foot-and-mouth disease virus with epizootic strains of serological type A. The dendrogram is based on a comparison of the complete nucleotide sequences of the VP gene1.
Сущность изобретения пояснена следующими перечнями последовательностей:The essence of the invention is explained by the following lists of sequences:
SEQ ID NO:1 представляет последовательность нуклеотидов 1D-гена белка VP1 штамма «А/Кения/G-VII» вируса ящура генотипа А/AFRICA/G-VII;SEQ ID NO:1 represents the nucleotide sequence of the 1D gene of the VP 1 protein of the A/Kenya/G-VII strain of foot-and-mouth disease virus genotype A/AFRICA/G-VII;
SEQ ID NO:2 представляет последовательность аминокислот 1D-гена белка VP1 штамма «А/Кения/G-VII» вируса ящура генотипа А/AFRICA/G-VII.SEQ ID NO:2 represents the amino acid sequence of the 1D gene of the VP 1 protein of the A/Kenya/G-VII strain of foot-and-mouth disease virus genotype A/AFRICA/G-VII.
Штамм «А/Кения/G-VII» вируса ящура характеризуется следующими признаками и свойствами.The A/Kenya/G-VII strain of foot-and-mouth disease virus is characterized by the following features and properties.
Морфологические признакиMorphological features
Штамм «А / Кения / G-VII» вируса ящура имеет следующую таксономию: сфера Riboviria, царство Orthornavirae, тип Pisuviricota, класс Pisoniviricetes, отряд Picornavirales, семейство Picornaviridae, род Aphthovirus, вид Foot-and-mouth disease virus, серотип А, генотип A/AFRICA/G-VII. Штамм возбудителя обладает следующими морфологическими признаками, характерными для возбудителя ящура: форма вириона иксаэдрическая, размер 20 нм. Вирион состоит из молекулы одноцепочечной положительно заряженной молекулы РНК и 60 копий полипептида, каждый из которых представлен белками VP4, VP2, VP3, VP1.The strain "A/Kenya/G-VII" of foot and mouth disease virus has the following taxonomy: sphereRiboviria, kingdomOrthornavirae, type Pisuviricota, Class Pisoniviricetes, squadPicornavirals, familyPicornaviridae, genus Aphthovirus, view Foot and mouth disease virus, serotype A, genotype A/AFRICA/G-VII. The strain of the pathogen has the following morphological features characteristic of the pathogen of foot-and-mouth disease: the shape of the virion is ixahedral, the size is 20 nm. The virion consists of a molecule of a single-stranded positively charged RNA molecule and 60 copies of a polypeptide, each of which is represented by VP proteins4, VP2, VP3, VP1.
Антигенные свойстваAntigenic properties
По антигенным свойствам штамм «А / Кения / G-VII» вируса ящура относится к серотипу А. Вирус стабильно нейтрализуется гомологичной антисывороткой, не проявляет гемагглютинирующей активности. У переболевших животных в сыворотке крови образуются специфические антитела, выявляемые в реакции микронейтрализации, иммуноферментном анализе и реакции связывания комплемента.According to its antigenic properties, the A/Kenya/G-VII strain of the foot-and-mouth disease virus belongs to serotype A. The virus is stably neutralized by homologous antiserum and does not exhibit hemagglutinating activity. In animals that have recovered from the disease, specific antibodies are formed in the blood serum, which are detected in the microneutralization reaction, enzyme immunoassay, and complement fixation reaction.
Методом нуклеотидного секвенирования была определена первичная структура 1D-гена белка VP1 штамма «А / Кения / G-VII» вируса ящура. Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей показал, что штамм «А / Кения / G-VII» вируса ящура принадлежит к генотипу A/AFRICA/G-VII (Фиг. 1).The primary structure of the 1D gene of the VP protein was determined using nucleotide sequencing1strain "A / Kenya / G-VII" of foot and mouth disease virus. Comparative analysis of nucleotide sequences showed that the strain "A / Kenya / G-VII" of foot and mouth disease virus belongs to the genotype A/AFRICA/G-VII (Fig. 1).
Антигенное родство (r1) штамма «А / Кения / G-VII» вируса ящура изучено в реакции микронейтрализации вируса в высокочувствительной перевиваемой клеточной линии почки свиньи IB-RS-2 с помощью перекрестного исследования данного штамма возбудителя ящура со специфическими сыворотками, полученными на следующие производственные штаммы вируса ящура:The antigenic relatedness (r 1 ) of the strain "A / Kenya / G-VII" of foot-and-mouth disease virus was studied in the microneutralization reaction of the virus in the highly sensitive continuous cell line of porcine kidney IB-RS-2 using a cross-study of this strain of the causative agent of foot-and-mouth disease with specific sera obtained for the following production strains of foot-and-mouth disease virus:
- штамм «А22/Ирак/64» (генотип A/ASIA/Iraq-64),- strain "A 22 /Iraq/64" (genotype A/ASIA/Iraq-64),
- штамм «А/Турция/06» (генотип A/ASIA/Iran-05),- strain "A/Türkiye/06" (genotype A/ASIA/Iran-05),
- штамм «А/Краснодарский/2013» (генотип A/ASIA/Iran-05SIS-10),- strain "A/Krasnodar/2013" (genotype A/ASIA/Iran-05 SIS-10 ),
- штамм «А/Забайкальский/2013» (генотип A/ASIA/Sea-97),- strain "A/Zabaikalsky/2013" (genotype A/ASIA/Sea-97),
- штамм «А/ВНИИЗЖ/2015» (генотип A/ASIA/G-VII),- strain "A/VNIIZZH/2015" (genotype A/ASIA/G-VII),
- штамм «А/Танзания/2013» (генотип A/AFRICA/G-I),- strain “A/Tanzania/2013” (genotype A/AFRICA/G-I),
- штамм «А 2205/G-IV» (генотип A/AFRICA/G-IV).- strain “A 2205/G-IV” (genotype A/AFRICA/G-IV).
Титр референтных сывороток крови КРС, полученных путем иммунизации животных моновалентными вакцинами из производственных штаммов вируса ящура серотипа А, против 2,0 lg ТЦД50 гомологичного и гетерологичного вируса определяли в реакции микронейтрализации (РМН) при перекрестном титровании, рассчитывая значения с использованием уравнения линейной регрессии, и выражали в log2 SN50. Значение r1 определяли, как антилогарифм разности log2 SN50 титров сыворотки против гетерологичного и гомологичного вируса [7-10].The titer of reference cattle blood sera obtained by immunizing animals with monovalent vaccines from industrial strains of foot-and-mouth disease virus serotype A against 2.0 lg TCID 50 of homologous and heterologous virus was determined in the microneutralization reaction (MNR) during cross titration, calculating the values using the linear regression equation, and expressed in log 2 SN 50 . The r 1 value was determined as the antilogarithm of the difference in log 2 SN 50 serum titers against heterologous and homologous virus [7-10].
Значение r1 в РМН интерпретировали следующим образом:The r 1 value in the RMN was interpreted as follows:
при ≥ 0,3 - исследуемый и производственный штаммы вируса ящура являются родственными;at ≥ 0.3 - the studied and production strains of foot-and-mouth disease virus are related;
при < 0,3 - исследуемый образец штамма вируса ящура значительно отличается от производственного штамма.at < 0.3 - the studied sample of the foot-and-mouth disease virus strain differs significantly from the production strain.
Максимальное родство отмечается при значении r1 в РМН, стремящимся к 1,0.The maximum relationship is observed when the value of r 1 in the RMN tends to 1.0.
Показатели антигенного родства при изучении штамма «А / Кения / G-VII» составили r1 от 0,01 до 0,09, что свидетельствует об отсутствии явного антигенного родства с производственными штаммами вируса ящура серотипа А.The antigenic relationship indices for the A/Kenya/G-VII strain were r 1 from 0.01 to 0.09, indicating the absence of obvious antigenic relationship with production strains of foot-and-mouth disease virus serotype A.
Гено- и хемотаксономические характеристикиGeno- and chemotaxonomic characteristics
Штамм «А / Кения / G-VII» вируса ящура является РНК(+) - содержащим вирусом с молекулярной массой 8,096×106 Д. Нуклеиновая кислота представлена одноцепочной линейной молекулой молекулярной массой 2,862×106 Д. Вирион имеет белковую оболочку, состоящую из четырех структурных белков VP1, VP2, VP3 и VP4. Липопротеидная оболочка отсутствует.The strain "A/Kenya/G-VII" of foot-and-mouth disease virus is an RNA(+)-containing virus with a molecular weight of 8.096×10 6 D. The nucleic acid is a single-stranded linear molecule with a molecular weight of 2.862×10 6 D. The virion has a protein membrane consisting of four structural proteins VP 1 , VP 2 , VP 3 and VP 4 . The lipoprotein membrane is absent.
Основным антигенным белком является VP1. В вирионе содержится приблизительно 32,2% РНК и 67,8% белка. РНК возбудителя ящура является инфекционной и участвует в образовании белков-предшественников в инфицированных клетках. Данные полипептидные молекулы, в свою очередь, расщепляются с образованием более стабильных структурных и неструктурных белков вируса ящура.The main antigenic protein is VP 1 . The virion contains approximately 32.2% RNA and 67.8% protein. The RNA of the foot-and-mouth disease pathogen is infectious and participates in the formation of precursor proteins in infected cells. These polypeptide molecules, in turn, are cleaved to form more stable structural and non-structural proteins of the foot-and-mouth disease virus.
Физические свойстваPhysical properties
Масса вириона составляет 8,452×10-18 г. Плавучая плотность 1,43 г/см3.The mass of the virion is 8.452×10 -18 g. The buoyant density is 1.43 g/cm 3 .
Устойчивость к внешним факторамResistance to external factors
Штамм «А / Кения / G-VII» вируса ящура устойчив к эфиру, хлороформу, и ацетону. Наиболее стабилен при pH 7,40-7,75. Сдвиги pH в кислую и сильно щелочную сторону ведут к инактивации вируса. Чувствителен к формальдегиду, УФ-облучению, γ-облучению, высоким температурам (выше 38,4°С).The strain "A / Kenya / G-VII" of the foot-and-mouth disease virus is resistant to ether, chloroform, and acetone. It is most stable at pH 7.40-7.75. Shifts in pH to the acidic and strongly alkaline side lead to inactivation of the virus. It is sensitive to formaldehyde, UV radiation, γ-irradiation, high temperatures (above 38.4°C).
Дополнительные признаки и свойстваAdditional features and properties
Реактогенность - реактогенными свойствами не обладает.Reactogenicity - does not have reactogenic properties.
Патогенность - антиген для вакцины не патогенен для мозоленогих и парнокопытных животных.Pathogenicity - the antigen for the vaccine is not pathogenic for callused and even-toed ungulates.
Вирулентность - антиген для вакцины не вирулентен для естественно-восприимчивых животных при контактном, аэрозольном и парентеральном заражении.Virulence - the vaccine antigen is not virulent for naturally susceptible animals upon contact, aerosol and parenteral infection.
Стабильность - не инактивированный вирус данного штамма сохраняет исходные биологические свойства при пассировании в чувствительных биологических системах в течение 5 пассажей (срок наблюдения) на перевиваемых культурах.Stability - the non-inactivated virus of this strain retains its original biological properties when passaged in sensitive biological systems for 5 passages (observation period) on transplantable cultures.
Биотехнологические характеристикиBiotechnological characteristics
Штамм «А / Кения / G-VII» вируса ящура репродуцируется в перевиваемых культурах клеток: почки сибирского горного козерога (ПСГК-30), почки свиньи (IB-RS-2), почки новорожденного сирийского хомячка (ВНК-21).The strain "A/Kenya/G-VII" of the foot-and-mouth disease virus is reproduced in continuous cell cultures: Siberian ibex kidneys (PSGK-30), pig kidneys (IB-RS-2), and newborn Syrian hamster kidneys (BHK-21).
При испытании было проведено 5 последовательных пассажей штамма «А / Кения / G-VII» вируса ящура в перевиваемых культурах клеток ПСГК-30, ВНК-21, IB-RS-2. Биологические свойства характеризовали путем определения инфекционной активности вируса каждого пассажа в перевиваемой клеточной линии IB-RS-2 и на естественно восприимчивых животных - крупном рогатом скоте (КРС) и свиньях.During the test, 5 consecutive passages of the strain "A / Kenya / G-VII" of the foot-and-mouth disease virus were carried out in continuous cell cultures PSGK-30, BHK-21, IB-RS-2. Biological properties were characterized by determining the infectious activity of the virus of each passage in the continuous cell line IB-RS-2 and in naturally susceptible animals - cattle and pigs.
Для снижения эпизоотической опасности возникновения ящура, вызванного генотипом А/AFRICA/G-VII, и предотвращения возникновения новых очагов болезни важна своевременная вакцинопрофилактика, что требует разработки безопасной и эффективной вакцины.To reduce the epizootic risk of foot-and-mouth disease caused by genotype A/AFRICA/G-VII and to prevent the emergence of new outbreaks of the disease, timely vaccination is important, which requires the development of a safe and effective vaccine.
Получена безопасная и эффективная вакцина против ящура генотипа A/AFRICA/G-VII культуральная инактивированная эмульсионная.A safe and effective vaccine against foot-and-mouth disease genotype A/AFRICA/G-VII, a culture-based inactivated emulsion vaccine, has been obtained.
Сущность предлагаемого изобретения пояснена примерами его использования, которые не ограничивают объем изобретения.The essence of the proposed invention is explained by examples of its use, which do not limit the scope of the invention.
Пример 1. Генетическая характеристика штамма «А/Кения/G-VII» вируса ящура по данным ПЦР и нуклеотидного секвенирования. Example 1. Genetic characteristics of the A/Kenya/G-VII strain of foot-and-mouth disease virus based on PCR and nucleotide sequencing data.
Проводили анализ первичной структуры гена 1D (белок VP1) штамма «А/Кения/G-VII» вируса ящура методом нуклеотидного секвенирования методом Сенгера и определении положения данного штамма на филогенетическом древе вируса ящура серотипа А. Метод основан на определении первичной структуры гена 1D (белок VP1) испытуемого изолята/штамма с последующим анализом филогенетического родства с другими изолятами/штаммами вируса ящура серотипа А.The primary structure of the 1D gene (VP 1 protein) of the A/Kenya/G-VII foot-and-mouth disease virus strain was analyzed using Sanger nucleotide sequencing and the position of this strain on the phylogenetic tree of foot-and-mouth disease virus serotype A was determined. The method is based on determining the primary structure of the 1D gene (VP 1 protein) of the test isolate/strain, followed by an analysis of the phylogenetic relationship with other isolates/strains of foot-and-mouth disease virus serotype A.
Было необходимо провести сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей гена 1D, кодирующего белок VP1 вируса ящура вакцинного штамма «А/Кения/G-VII» с другими штаммами. Последовательность нуклеотидов гена белка VP1 штамма «А/Кения/G-VII» генотипа А/AFRICA/G-VII вируса ящура представлена SEQ ID NO:1. Последовательность аминокислот 1D-гена, кодирующего белок VP1 штамма «А/Кения/G-VII» генотипа А/AFRICA/G-VII вируса ящура отражена на SEQ ID NO:2.It was necessary to conduct a comparative analysis of the nucleotide sequences of the 1D gene encoding the VP 1 protein of the foot-and-mouth disease virus vaccine strain "A/Kenya/G-VII" with other strains. The nucleotide sequence of the VP 1 protein gene of the strain "A/Kenya/G-VII" genotype A/AFRICA/G-VII of the foot-and-mouth disease virus is presented in SEQ ID NO: 1. The amino acid sequence of the 1D gene encoding the VP 1 protein of the strain "A/Kenya/G-VII" genotype A/AFRICA/G-VII of the foot-and-mouth disease virus is reflected in SEQ ID NO: 2.
Осуществлен филогенетический анализ для штамма «А/Кения/G-VII». Филогенетическое дерево выведено с использованием программы MEGA и алгоритма Neighbor-Joining [21]. Процент повторяющихся ветвей, в которых связанные таксоны сгруппированы вместе в тесте начальной загрузки (увеличили со стандартных 100 до 1000 повторов для высокой степени достоверности), показан рядом с ветвями [22, 23]. Эволюционные расстояния были рассчитаны с использованием метода Maximum Composite Likelihood [24] и выражены в единицах количества замен оснований на сайт. Эволюционный анализ проводился в MEGA 6 [25].A phylogenetic analysis was performed for the A/Kenya/G-VII strain. The phylogenetic tree was inferred using MEGA and the Neighbor-Joining algorithm [21]. The percentage of repeat branches in which related taxa are grouped together in the bootstrap test (increased from the standard 100 to 1000 repeats for high confidence) is shown next to the branches [22, 23]. Evolutionary distances were calculated using the Maximum Composite Likelihood method [24] and are expressed as units of base substitutions per site. Evolutionary analysis was performed in MEGA 6 [25].
В результате проведенной работы по сравнению полных нуклеотидных последовательностей гена 1D (белок VP1) штамма «А/Кения/G-VII» и других изолятов/штаммов вируса ящура серотипа А определено положение исследуемого штамма на филогенетическом древе (фиг. 1). Таким образом, исследуемый штамм «А/Кения/G-VII» относится к генотипу А/AFRICA/G-VII, что подтверждают данные нуклеотидного и аминокислотного анализа.As a result of the work carried out on comparison of complete nucleotide sequences of gene 1D (VP 1 protein) of strain "A/Kenya/G-VII" and other isolates/strains of foot-and-mouth disease virus serotype A, the position of the studied strain on the phylogenetic tree was determined (Fig. 1). Thus, the studied strain "A/Kenya/G-VII" belongs to the genotype A/AFRICA/G-VII, which is confirmed by the data of nucleotide and amino acid analysis.
Пример 2. Адаптация штамма «А/Кения/G-VII» генотипа А/AFRICA/G-VII к перевиваемой монослойной культуре клеток почки сибирского горного козерога ПСГК-30. Example 2. Adaptation of the strain “A/Kenya/G-VII” of the genotype A/AFRICA/G-VII to the transplantable monolayer culture of Siberian ibex kidney cells PSGK-30.
Для заражения перевиваемой монослойной культуры клеток почки сибирского горного козерога ПСГК-30 использовали 40%-ную афтозную суспензию вируса ящура, полученную из афт свиньи (2 пассаж). Посевная концентрация клеток составляла 0,20-0,25 млн кл./см3, доза заражения вирусом - 0,001 ТЦД50/кл. По результатам исследования репродукция вируса ящура штамма «А/Кения/G-VII» проходила при специфическом разрушении монослоя на 90-100% за 18 ч. В течение 6 последовательных пассажей отмечали рост значений титра инфекционной активности вируса от 5,30±0,10 до 7,20±0,10 lg ТЦД50/см3.To infect the continuous monolayer culture of Siberian ibex kidney cells PSGK-30, a 40% aphthous suspension of foot-and-mouth disease virus obtained from pig aphthae (passage 2) was used. The inoculation concentration of cells was 0.20-0.25 million cells/cm 3 , the dose of virus infection was 0.001 TCID 50 /cell. According to the results of the study, reproduction of foot-and-mouth disease virus strain "A/Kenya/G-VII" occurred with specific destruction of the monolayer by 90-100% in 18 hours. Over 6 consecutive passages, an increase in the values of the titer of infectious activity of the virus was noted from 5.30 ± 0.10 to 7.20 ± 0.10 lg TCID 50 /cm 3 .
Максимальное значение титра инфекционной активности вируса было достигнуто на этапе 6 пассажа (7,20±0,10 lg ТЦД50/см3). Концентрация 146S частиц с 1 по 6 пассажи изменялась с 0,21±0,02 до 0,87±0,02 мкг/см3. При этом наибольшее количество 146S компонента отмечали на этапе 6 пассажа (0,87±0,02 мкг/см3). Степень достоверности (R2) результатов исследования в количественном варианте ОТ-ПЦР-РВ колебалась от 98,66 до 100,00%. Таким образом, на протяжении 6-ти последовательных пассажей была успешно проведена адаптация штамма «А/Кения/G-VII» вируса ящура к перевиваемой монослойной клеточной линии ПСГК-30.The maximum value of the virus infectious activity titer was achieved at the stage of the 6th passage (7.20±0.10 lg TCID50 / cm3 ). The concentration of 146S particles from the 1st to the 6th passage changed from 0.21±0.02 to 0.87±0.02 μg/ cm3 . Moreover, the highest amount of the 146S component was noted at the stage of the 6th passage (0.87±0.02 μg/ cm3 ). The reliability degree ( R2 ) of the study results in the quantitative version of RT-PCR-RV ranged from 98.66 to 100.00%. Thus, over the course of 6 consecutive passages, the adaptation of the foot-and-mouth disease virus strain "A/Kenya/G-VII" to the transplantable monolayer cell line PSGK-30 was successfully carried out.
Пример 3. Изучение условий монослойного культивирования вируса ящура штамма «А/Кения/G-VII» генотипа А/AFRICA/G-VII в промышленных масштабах. Example 3. Study of conditions for monolayer cultivation of foot-and-mouth disease virus strain “A/Kenya/G-VII” genotype A/AFRICA/G-VII on an industrial scale.
В процессе промышленного культивирования штамма «А/Кения/G-VII» генотипа А/AFRICA/G-VII вируса ящура в перевиваемой монослойной культуре клеток ПСГК-30 осуществляли подбор оптимальных условий культивирования вируса по поддерживающей среде, температурному фактору и дозе заражения исследуемым вирусом клеток.In the process of industrial cultivation of the strain "A/Kenya/G-VII" of the genotype A/AFRICA/G-VII of the foot-and-mouth disease virus in a continuous monolayer culture of PSGK-30 cells, the optimal conditions for culturing the virus were selected based on the supporting medium, temperature factor and dose of infection of the cells with the studied virus.
На первом этапе исследования оценивали влияние состава поддерживающей среды на репродукцию штамма «А/Кения/G-VII» вируса ящура в монослойной культуре клеток ПСГК-30 в масштабах производства (на этапе с 5-го на 6-й пассажи). Для сравнения применяли три среды с добавлением 2,0% фетальной сыворотки крови телят: 1) среда Игла DMEM; 2) среда RPMI-1640; 3) раствор Хэнкса с 5% гидролизата белков крови. Посевная концентрация клеток составляла 0,1 млн кл./см3, доза заражения вирусом - 0,1000-0,0001 ТЦД50/кл. Культивирование вируса осуществляли при температурах 35±0,2 - 38±0,2°С до разрушения клеточного монослоя не менее 90%. Результаты репродукции штамма «А/Кения/G-VII» вируса ящура с поддерживающими средами разного состава отражены в таблице 1.At the first stage of the study, the effect of the composition of the supporting medium on the reproduction of the A/Kenya/G-VII foot-and-mouth disease virus strain in a monolayer culture of PSGK-30 cells on a production scale (at the stage from the 5th to the 6th passage) was assessed. For comparison, three media with the addition of 2.0% fetal calf blood serum were used: 1) Eagle's medium DMEM; 2) RPMI-1640 medium; 3) Hanks' solution with 5% blood protein hydrolysate. The inoculation concentration of cells was 0.1 million cells/ cm3 , the dose of virus infection was 0.1000-0.0001 TCID50 /cell. The virus was cultivated at temperatures of 35±0.2 - 38±0.2°C until the cell monolayer was destroyed by at least 90%. The results of reproduction of the A/Kenya/G-VII strain of foot-and-mouth disease virus with support media of different compositions are shown in Table 1.
Из данных таблицы видно, что при репродукции штамма «А/Кения/G-VII» вируса ящура в монослойной культуре клеток ПСГК-30 с применением поддерживающих сред разного состава, оптимальной является среда Хэнкса, позволяющая за 18 ч достичь специфического разрушения клеточного монослоя на 95-100% с накоплением в полученной суспензии 146S компонента в количестве 0,87±0,02 мкг/см3 и титром инфекционной активности 7,20±0,10 lg ТЦД50/см3. При использовании среды RPMI-1640 и Игла DMEM показатели репродукции вируса были ниже.The data in the table show that when reproducing the A/Kenya/G-VII foot-and-mouth disease virus strain in a monolayer culture of PSGK-30 cells using support media of different compositions, the optimal medium is Hanks' medium, which allows achieving specific destruction of the cell monolayer by 95-100% in 18 hours with accumulation of the 146S component in the resulting suspension in an amount of 0.87±0.02 μg/ cm3 and an infectious activity titer of 7.20±0.10 lg TCID50 / cm3 . When using RPMI-1640 and Eagle DMEM medium, the virus reproduction rates were lower.
На следующем этапе изучения условий монослойного культивирования штамма «А/Кения/G-VII» вируса ящура в культуре клеток ПСГК-30 в условиях производства оценивали влияние на процесс репродукции вируса температурного фактора. Для этого культивирование вируса проводили в среде Хэнкса при следующих температурах: 35,0±0,2; 36,0±0,2; 37,0±0,2; 38,0±0,2°С. Доза заражения культуры клеток вирусом ящура составляла 0,010-0,001 ТЦД50/кл. Культивирование вируса осуществляли до разрушения клеточного монослоя на 90-100% в течение 18-26 ч (табл. 1). По итогам исследования выявили, что для полной репродукции штамма «А/Кения/G-VII» вируса ящура в монослойной культуре клеток ПСГК-30 оптимальной является температура среды 37,0±0,2°С, при которой за 18 ч развитие ЦПД достигало 95-100% с накоплением 146S частиц, равным 0,87±0,02 мкг/см3 и титром инфекционной активности вируса 7,20±0,10 lg ТЦД50/см3.At the next stage of studying the conditions of monolayer cultivation of the A/Kenya/G-VII foot-and-mouth disease virus strain in the PSGK-30 cell culture under production conditions, the effect of the temperature factor on the virus reproduction process was assessed. For this purpose, the virus was cultivated in Hanks' medium at the following temperatures: 35.0±0.2; 36.0±0.2; 37.0±0.2; 38.0±0.2°C. The dose of infection of the cell culture with the foot-and-mouth disease virus was 0.010-0.001 TCID50 /cell. The virus was cultivated until the cell monolayer was destroyed by 90-100% for 18-26 hours (Table 1). The results of the study revealed that for the complete reproduction of the A/Kenya/G-VII strain of foot-and-mouth disease virus in a monolayer culture of PSGK-30 cells, the optimal temperature of the medium is 37.0±0.2°C, at which the development of CPE reached 95-100% in 18 hours with the accumulation of 146S particles equal to 0.87±0.02 μg/ cm3 and the titer of infectious activity of the virus of 7.20±0.10 lg TCID50 / cm3 .
Оценивали влияние дозы заражения монослоя клеток линии ПСГК-30 штаммом «А/Кения/G-VII» при культивировании в масштабах производства. Для этого использовали разные дозы вируса: 0,10-0,01; 0,010-0,001; 0,0010-0,0001 ТЦД50/кл. В качестве поддерживающей среды применяли среду Хэнкса. Репродукцию вируса проводили при температуре 37,0±0,2°С в течение 18-26 ч до специфического разрушения клеток на 90-100%. По итогам культивирования определяли концентрацию 146S компонента и титр инфекционной активности вируса ящура. Как следует из данных таблицы 1, наибольшее накопление 146S компонента вируса достигалось при дозе заражения 0,01-0,001 ТЦД50/кл. и составило 0,87±0,02 мкг/см3 с титром инфекционной активности вируса 7,20±0,10 lg ТЦД50/см3.The effect of the infection dose of the PSGK-30 cell line monolayer with the A/Kenya/G-VII strain was assessed during cultivation on a production scale. Different doses of the virus were used for this purpose: 0.10-0.01; 0.010-0.001; 0.0010-0.0001 TCID 50 /cell. Hanks' medium was used as a maintenance medium. Virus reproduction was carried out at a temperature of 37.0±0.2°C for 18-26 hours until specific cell destruction by 90-100%. Based on the results of cultivation, the concentration of the 146S component and the titer of infectious activity of the foot-and-mouth disease virus were determined. As follows from the data in Table 1, the highest accumulation of the 146S virus component was achieved at an infection dose of 0.01-0.001 TCID 50 /cell. and amounted to 0.87±0.02 μg/ cm3 with a titer of infectious activity of the virus of 7.20±0.10 lg TCID 50 / cm3 .
Таким образом, проведено изучение условий монослойного культивирования штамма «А/Кения/G-VII» вируса ящура в культуре клеток ПСГК-30 в промышленных масштабах. В результате исследования определены следующие оптимальные параметры репродукции штамма «А/Кения/G-VII» вируса ящура в монослойной клеточной линии ПСГК-30: 1) поддерживающая среда - среда Хэнкса; 2) температурный режим культивирования - 37,0±0,2°С; 3) доза заражения вирусом - 0,01-0,001 ТЦД50/кл.Thus, the conditions of monolayer cultivation of the foot-and-mouth disease virus strain "A/Kenya/G-VII" in the PSGK-30 cell culture were studied on an industrial scale. As a result of the study, the following optimal parameters for the reproduction of the foot-and-mouth disease virus strain "A/Kenya/G-VII" in the PSGK-30 monolayer cell line were determined: 1) maintenance medium - Hanks'medium; 2) cultivation temperature - 37.0±0.2°C; 3) virus infection dose - 0.01-0.001 TCID50 /cell.
Пример 4. Изучение условий суспензионного культивирования штамма «А/Кения/G-VII» генотипа А/AFRICA/G-VII вируса ящура в промышленных масштабах. Example 4. Study of conditions for suspension cultivation of the strain “A/Kenya/G-VII” of the genotype A/AFRICA/G-VII foot-and-mouth disease virus on an industrial scale.
При промышленном культивирования штамма «А/Кения/G-VII» генотипа А/AFRICA/G-VII вируса ящура в перевиваемой суспензионной культуре клеток ВНК-21/SUSP/ARRIAH проводили поиск оптимальных параметров для успешной репродукции возбудителя ящура, используя разные концентрации клеток, температурные условия и дозу заражения вирусом.During industrial cultivation of the strain “A/Kenya/G-VII” genotype A/AFRICA/G-VII of the foot-and-mouth disease virus in a continuous suspension culture of BHK-21/SUSP/ARRIAH cells, a search was conducted for optimal parameters for successful reproduction of the foot-and-mouth disease pathogen using different cell concentrations, temperature conditions, and the dose of virus infection.
На первом этапе работы определяли влияние посевной концентрации клеток линии ВНК-21/SUSP/ARRIAH в суспензии на репродукцию штамма «А/Кения/G-VII» вируса ящура в промышленных масштабах. Для анализа подготовили суспензии со следующими концентрации клеток: 3,0; 3,5; 4,0; 4,5 млн кл./см3. Температура культивирования вируса составляла 37,0±0,2°С, доза заражения вирусом - 0,010-0,001 ТЦД50/кл. Репродукцию вируса проводили до специфической гибели клеток на 95-100%. Результаты суспензионного культивирования штамма «А/Кения/G-VII» вируса ящура в суспензии с разными концентрациями клеток представлены в таблице 2.At the first stage of the work, the influence of the seeding concentration of BHK-21/SUSP/ARRIAH cell line in suspension on the reproduction of the strain “A/Kenya/G-VII” was determined. foot-and-mouth disease virus on an industrial scale. For analysis, suspensions with the following cell concentrations were prepared: 3.0; 3.5; 4.0; 4.5 million cells/cm3The virus cultivation temperature was 37.0±0.2°C, the virus infection dose was 0.010-0.001 TCD50/cl. Virus reproduction was carried out until specific cell death by 95-100%. Results of suspension cultivation of strain "A/Kenya/G-VII" The results of the analysis of the results of the cell suspensions of the foot-and-mouth disease virus are presented in Table 2.
При культивировании вируса ящура штамма «А/Кения/G-VII» в суспензионной клеточной линии ВНК-21/SUSP/ARRIAH с разными концентрациями клеток, определили, что накопление 146S компонента в суспензии с концентрацией клеток 3,0 млн кл./см3 составило 1,23±0,02 мкг/см3, с концентрацией 3,5 млн кл./см3 - 1,60±0,02 мкг/см3, с концентрацией 4,0 млн кл./см3 - 2,21±0,02 мкг/см3, и с концентрацией 4,5 млн кл./см3 - 2,30±0,02 мкг/см3. Как следует из полученных данных для репродукции штамма «А/Кения/G-VII» вируса ящура достаточной является концентрация клеток ВНК-21/SUSP/ARRIAH в суспензии, равная 4,0 млн кл./см3 (при концентрации 4,5 млн кл./см3 концентрация незначительно выше, но затраты на производство по количеству клеток выше, исходя из этого, экономически целесообразно использовать концентрацию клеток, равную 4,0 млн кл./см3). Значение титра инфекционной активности вируса при этом составило 8,75±0,10 lg ТЦД50/см3.When cultivating foot-and-mouth disease virus strain "A/Kenya/G-VII" in the suspension cell line BHK-21/SUSP/ARRIAH with different cell concentrations, it was determined that the accumulation of the 146S component in a suspension with a cell concentration of 3.0 million cells/cm3amounted to 1.23±0.02 μg/cm3, with a concentration of 3.5 million cells/cm3- 1.60±0.02 μg/cm3, with a concentration of 4.0 million cells/cm3- 2.21±0.02 μg/cm3, and with a concentration of 4.5 million cells/cm3- 2.30±0.02 μg/cm3. As follows from the data obtained for the reproduction of the strain "A/Kenya/G-VII" For the foot-and-mouth disease virus, a concentration of BHK-21/SUSP/ARRIAH cells in suspension equal to 4.0 million cells/cm is sufficient.3(at a concentration of 4.5 million cells/cm3the concentration is slightly higher, but the production costs per cell number are higher, based on this, it is economically feasible to use a cell concentration equal to 4.0 million cells/cm3). The titer of infectious activity of the virus was 8.75±0.10 lg TCD50/cm3.
На следующем этапе работы исследовали влияние температурного фактора на репродукцию штамма «А/Кения/G-VII» вируса ящура в суспензионной культуре клеток линии ВНК-21/SUSP/ARRIAH в промышленных масштабах. Для этого репродукцию вируса проводили при следующих температурных условиях: 35,0±0,2; 36,0±0,2; 37,0±0,2; 38,0±0,2°С. Доза заражения культуры клеток вирусом составляла 0,010-0,001 ТЦД50/кл. Культивирование вируса проводили до ЦПД, равного не менее 85% (приоритет отдавали полной специфической деструкции клеток). По результатам анализа определили, что для полной репродукции штамма «А/Кения/G-VII» вируса ящура в суспензионной культуре клеток ВНК-21/SUSP/ARRIAH оптимальной является температура среды 37,0±0,2°С, при которой в течение 12 ч наблюдается специфическая гибель клеток на 95-100% с высоким накоплением 146S компонента (2,21±0,02 мкг/см3) и титром инфекционной активности вируса 8,75±0,10 lg ТЦД50/см3.At the next stage of the work, the influence of the temperature factor on the reproduction of the strain "A/Kenya/G-VII" was investigated. foot-and-mouth disease virus in suspension culture of BHK-21/SUSP/ARRIAH cells on an industrial scale. For this purpose, virus reproduction was carried out under the following temperature conditions: 35.0±0.2; 36.0±0.2; 37.0±0.2; 38.0±0.2°C. The dose of infection of cell culture with the virus was 0.010-0.001 TCD50/cell. The virus was cultured to a CPE of at least 85% (priority was given to complete specific destruction of cells). Based on the analysis results, it was determined that for complete reproduction of the strain "A/Kenya/G-VII" foot-and-mouth disease virus in a suspension culture of BHK-21/SUSP/ARRIAH cells, the optimal temperature of the medium is 37.0±0.2°C, at which specific cell death of 95-100% with a high accumulation of the 146S component (2.21±0.02 μg/cm) is observed within 12 hours.3) and a titer of infectious activity of the virus of 8.75±0.10 lg TCD50/cm3.
В ходе работы по изучению условий суспензионного культивирования штамма «А/Кения/G-VII» вируса ящура в промышленных масштабах с применением культуры клеток ВНК-21/SUSP/ARRIAH оценивали влияние дозы заражения клеток. Для этого клеточные суспензии заражали вирусом в разных дозах: 0,10-0,01; 0,01-0,001; 0,001-0,0001 ТЦД50/кл. Репродукцию вируса осуществляли при температуре 37,0±0,2°С до цитопатического действия, равного не менее 90%. По итогам культивирования определяли концентрацию 146S частиц и титр инфекционной активности вируса ящура. Как видно из данных таблицы 2, наибольшее накопление 146S компонента отмечали при дозе заражения 0,010-0,001 ТЦД50/кл. (2,21±0,02 мкг/см3) с титром инфекционной активности вируса, равным 8,75±0,10 lg ТЦД50/см3.In the course of work on studying the conditions of suspension cultivation of the strain "A/Kenya/G-VII" of the foot-and-mouth disease virus on an industrial scale using the BHK-21/SUSP/ARRIAH cell culture, the effect of the cell infection dose was assessed. For this purpose, cell suspensions were infected with the virus at different doses: 0.10-0.01; 0.01-0.001; 0.001-0.0001 TCD50/cell. Virus reproduction was carried out at a temperature of 37.0±0.2°C until the cytopathic effect was at least 90%. Based on the results of cultivation, the concentration of 146S particles and the titer of infectious activity of the foot-and-mouth disease virus were determined. As can be seen from the data in Table 2, the highest accumulation of the 146S component was noted at an infection dose of 0.010-0.001 TCD50/cl. (2.21±0.02 µg/cm3) with a titer of infectious activity of the virus equal to 8.75±0.10 lg TCD50/cm3.
Таким образом, проведено изучение трех параметров суспензионного культивирования штамма «А/Кения/G-VII» генотипа А/AFRICA/G-VII вируса ящура в суспензионной клеточной линии ВНК-21/SUSP/ARRIAH в промышленных масштабах. Выявлены оптимальные условия репродукции штамма «А/Кения/G-VII» в суспензионной культуре клеток ВНК-21/SUSP/ARRIAH: 1) концентрация клеток перед заражением - 4,0 млн кл./см3; 2) температурный режим культивирования - 37,0±0,2°С; 3) доза заражения вирусом - 0,010-0,001 ТЦД50/кл.Thus, a study of three parameters of suspension cultivation of the strain "A/Kenya/G-VII" was carried out. genotype A/AFRICA/G-VII of the foot-and-mouth disease virus in the suspension cell line BHK-21/SUSP/ARRIAH on an industrial scale. Optimal conditions for the reproduction of the strain "A/Kenya/G-VII" in the suspension cell culture BHK-21/SUSP/ARRIAH were identified: 1) the concentration of cells before infection is 4.0 million cells/cm3; 2) cultivation temperature regime - 37.0±0.2°C; 3) virus infection dose - 0.010-0.001 TCD50/cl.
Пример 5. Инактивация суспензии вируса ящура штамма «А/Кения/G-VII» генотипа А/AFRICA/G-VII. Example 5. Inactivation of a suspension of foot-and-mouth disease virus strain “A/Kenya/G-VII” genotype A/AFRICA/G-VII.
По окончании цикла репродукции вируса ящура, не прекращая процесс термостатирования (37,0±0,2°С), в вируссодержащую суспензию добавляли подкисленный раствор аминоэтилэтиленимина (АЭЭИ) с рН, равным 8,2-8,5. Конечная концентрация АЭЭИ в вируссодержащей суспензии должна быть равной 0,03%. Инактивацию инфекционной активности вируса ящура штамма «А/Кения/G-VII» генотипа А/AFRICA/G-VII проводили в течение 12 часов при температуре 37,0±0,1°С с периодическим перемешиванием.At the end of the reproduction cycle of the foot-and-mouth disease virus, without stopping the thermostatting process (37.0±0.2°C), an acidified solution of aminoethylethyleneimine (AEEI) with a pH of 8.2-8.5 was added to the virus-containing suspension. The final concentration of AEEI in the virus-containing suspension should be 0.03%. Inactivation of the infectious activity of the foot-and-mouth disease virus strain "A/Kenya/G-VII" genotype A/AFRICA/G-VII was carried out for 12 hours at a temperature of 37.0±0.1°C with periodic stirring.
Для определения времени полной инактивации после добавления 1,2-АЭЭИ каждый час производили отбор проб. Полученные образцы проверяли на наличие инфекционной активности вируса ящура в первичной культуре клеток почки свиньи СП. Результаты представлены в таблице 3, из данных которой видно, что инактивация вируса ящура штамма «А/Кения/G-VII», репродуцированного в культиваторах, до 0,0 lg ТЦД50/мл произошла через 5 часов после внесения 1,2-АЭЭИ, а до титра -11,0 lg ТЦД50/мл - спустя 12 ч инкубации (табл. 3).To determine the time of complete inactivation after the addition of 1,2-AEEI, samples were taken every hour. The obtained samples were tested for the presence of infectious activity of the foot-and-mouth disease virus in the primary culture of SP pig kidney cells. The results are presented in Table 3, from which it is evident that the inactivation of the foot-and-mouth disease virus strain "A/Kenya/G-VII", reproduced in cultivators, to 0.0 lg TCD50/ml occurred 5 hours after the introduction of 1,2-AEEI, and to a titer of -11.0 lg TCD50/ml – after 12 hours of incubation (Table 3).
Готовые вирусные инактивированные суспензии исследовали в РСК для оценки содержания в них компонентов вируса. Концентрация 146S компонента составила 2,14±0,02 мкг/см3.The prepared viral inactivated suspensions were studied in the RSC to assess the content of viral components in them. The concentration of the 146S component was 2.14±0.02 μg/cm 3 .
Пример 6. Подбор условий очистки суспензии вируса ящура штамма «А/Кения/G-VII» генотипа А/AFRICA/G-VII. Example 6. Selection of conditions for purification of a suspension of foot-and-mouth disease virus strain “A/Kenya/G-VII” genotype A/AFRICA/G-VII.
Суспензию вируса ящура штамма «А/Кения/G-VII» генотипа А/AFRICA/G-VII, полученную при репродукции в суспензионной клеточной линии ВНК-21/SUSP/ARRIAH, подвергали очистке. Для получения очищенного антигена вируса ящура использовали полигексаметиленгуанидин (ПГМГ) с концентрациями 0,03, 0,04 и 0,05%. До и после процесса очистки антигена вируса ящура штамма «А/Кения/G-VII» в количественном варианте РСК определяли концентрацию общего вирусного белка и иммуногенных компонентов. Результаты анализа отражены в таблице 4, из которой следует, что в результате очистки антигена вируса ящура штамма «А/Кения/G-VII» с помощью ПГМГ в концентрации 0,03% отмечали снижение концентрации балластного белка и 146S компонента на 2%. При использовании ПГМГ в концентрации 0,04% наблюдали снижение количества балластного белка и 146S компонента на 4%. Применяя ПГМГ в концентрации 0,05% содержание балластного белка и иммуногенных компонентов - на 27%.The suspension of the foot-and-mouth disease virus strain "A/Kenya/G-VII" genotype A/AFRICA/G-VII, obtained by reproduction in the suspension cell line BHK-21/SUSP/ARRIAH, was purified. Polyhexamethylene guanidine (PHMG) with concentrations of 0.03, 0.04 and 0.05% was used to obtain purified foot-and-mouth disease virus antigen. Before and after the process of purification of the foot-and-mouth disease virus antigen strain "A/Kenya/G-VII" In the quantitative version of the RSC, the concentration of total viral protein and immunogenic components was determined. The results of the analysis are reflected in Table 4, from which it follows that as a result of purification of the antigen of the foot-and-mouth disease virus strain "A/Kenya/G-VII" using PHMG at a concentration of 0.03%, a decrease in the concentration of ballast protein and the 146S component by 2% was noted. When using PHMG at a concentration of 0.04%, a decrease in the amount of ballast protein and the 146S component by 4% was observed. Using PHMG at a concentration of 0.05%, the content of ballast protein and immunogenic components decreased by 27%.
Таким образом, исследуя условия очистки антигена штамма «А/Кения/G-VII», пришли к выводу о том, что для получения очищенного продукта оптимально использовать ПГМГ с концентрацией 0,04%.Thus, having studied the conditions for purifying the antigen of the strain “A/Kenya/G-VII”, we came to the conclusion that for obtaining a purified product it is optimal to use PHMG with a concentration of 0.04%.
Пример 7. Подбор условий концентрирования суспензии антигена штамма «А/Кения/G-VII» вируса ящура генотипа А/AFRICA/G-VII. Example 7. Selection of conditions for concentrating the suspension of the antigen of the strain “A/Kenya/G-VII” of the foot-and-mouth disease virus genotype A/AFRICA/G-VII.
Культуральную инактивированною суспензию штамма «А/Кения/G-VII», полученную с применением суспензионной клеточной линии ВНК-21/SUSP/ARRIAH, подвергали концентрированию в 10 раз по объему. Для увеличения концентрации иммуногенных компонентов антигена вируса ящура использовали следующие приемы: 1) добавление полиэтиленгликоля (ПЭГ-6000) с концентрацией 50% к антигену в соотношении 1:4, с экспозицией 4 ч; 2) добавление полиэтиленгликоля (ПЭГ-6000) с концентрацией 50% к антигену в соотношении 1:4, с экспозицией 12 ч; 3) концентрирование с помощью установки тангенциальной фильтрации в течение 4 ч при рабочем давлении на фильтр 2,2-2,3 атм.The culture inactivated suspension of the strain "A/Kenya/G-VII" obtained using the suspension cell line BHK-21/SUSP/ARRIAH was concentrated 10 times by volume. The following techniques were used to increase the concentration of immunogenic components of the foot-and-mouth disease virus antigen: 1) adding polyethylene glycol (PEG-6000) at a concentration of 50% to the antigen in a ratio of 1:4, with an exposure of 4 hours; 2) adding polyethylene glycol (PEG-6000) at a concentration of 50% to the antigen in a ratio of 1:4, with an exposure of 12 hours; 3) concentrating using a tangential filtration unit for 4 hours at an operating pressure on the filter of 2.2-2.3 atm.
До и после процесса концентрирования суспензии антигена вируса ящура штамма «А/Кения/G-VII» определяли концентрацию общего вирусного белка и иммуногенных компонентов в количественном варианте РСК. Результаты исследований представлены в таблице 5, из которой видно, что при концентрировании антигена штамма «А/Кения/G-VII» вируса ящура с помощью ПЭГ-6000 в течение 4 ч отмечали увеличение содержания компонентов по сравнению с исходными значениями (до концентрирования) в 8,3 раз. Используя тот же полимер, но повышая время воздействия до 12 ч, увеличили концентрацию компонентов вируса в 9,26 раз. Применяя метод концентрирования с помощью тангенциальной фильтрации, удалось увеличить количество иммуногенных компонентов антигена штамма «А/Кения/G-VII» вируса ящура в суспензии в 10 раз. Таким образом, технология тангенциальной фильтрации позволила получить антиген штамма «А/Кения/G-VII» с высокой концентрацией структурных вирусных белков.Before and after the process of concentrating the antigen suspension of foot and mouth disease virus strain "A/Kenya/G-VII" The concentration of total viral protein and immunogenic components in the quantitative variant of the RSC was determined. The results of the studies are presented in Table 5, which shows that when concentrating the antigen of the strain "A/Kenya/G-VII" of foot-and-mouth disease virus using PEG-6000 for 4 hours, an increase in the content of components compared to the initial values (before concentration) was noted by 8.3 times. Using the same polymer, but increasing the exposure time to 12 hours, the concentration of virus components was increased by 9.26 times. Using the concentration method using tangential filtration, it was possible to increase the amount of immunogenic components of the antigen of the strain "A / Kenya / G-VII" foot-and-mouth disease virus in suspension by 10 times. Thus, the tangential filtration technology made it possible to obtain the antigen of the strain "A/Kenya/G-VII" with a high concentration of structural viral proteins.
Пример 8. Подбор адъюванта и соотношения антиген-адъювант. Example 8. Selection of adjuvant and antigen-adjuvant ratio.
Для изготовления противоящурной моновалентной эмульсионной вакцины из антигена штамма «А/Кения/G-VII» в качестве адъюванта был выбран масляный адъювант Montanide ISA-61 VG в количестве 60% по массе.For the production of a monovalent emulsion vaccine against foot-and-mouth disease from the antigen of the strain "A/Kenya/G-VII" The oil adjuvant Montanide ISA-61 VG was selected as an adjuvant in an amount of 60% by weight.
Пример 9. Компоновка вакцины против ящура из штамма «А/Кения/G-VII» генотипа А/AFRICA/G-VII культуральной инактивированной эмульсионной. Example 9. Composition of a vaccine against foot-and-mouth disease from the strain "A/Kenya/G-VII" genotype A/AFRICA/G-VII, culture inactivated emulsion.
Из полученного концентрата антигена вируса ящура штамма «А/Кения/G-VII» изготовили вакцину против ящура генотипа А/AFRICA/G-VII культуральную инактивированную эмульсионную с применением масляного адъюванта Montanide ISA-61 VG. Количество 146S иммуногенного компонента в 1,0 см3 антигена составило 20,05±0,02 мкг/см3, а в дозе - 16,04 мкг.From the obtained concentrate of the foot-and-mouth disease virus antigen of the strain "A/Kenya/G-VII", a vaccine against foot-and-mouth disease of the genotype A/AFRICA/G-VII was produced, a culture inactivated emulsion vaccine using the oil adjuvant Montanide ISA-61 VG. The amount of 146S immunogenic component in 1.0 cm3antigen amounted to 20.05±0.02 μg/cm3, and in a dose of 16.04 mcg.
Пример 10. Иммунизация животных вакциной против ящура генотипа А/AFRICA/G-VII культуральной инактивированной эмульсионной.Example 10. Immunization of animals with a vaccine against foot-and-mouth disease genotype A/AFRICA/G-VII, culture inactivated emulsion .
Из полученной вакцины против ящура из штамма «А/Кения/G-VII» генотипа А/AFRICA/G-VII культуральной инактивированной эмульсионной (предлагаемое изобретение) был приготовлен ряд разведений для свиней с 5-ти кратным шагом. 15 голов свиней разделили на 3 группы по 5 голов в каждой. Иммунизирующая доза составляла 2,0 см3. Первую группу животных (№№ 1-5) иммунизировали вакциной без разведения, вторую группу свиней (№№ 6-10) привили вакциной, разведенной 1/5, третья группа животных (№№ 11-15) - вакциной, разведенной 1/25. Препарат вводили внутримышечно в среднюю треть шеи. В качестве контроля вируса оставили 2 головы без вакцинации.A series of dilutions for pigs with a 5-fold step were prepared from the obtained vaccine against foot-and-mouth disease from the strain "A/Kenya/G-VII" of the genotype A/AFRICA/G-VII cultural inactivated emulsion (the proposed invention) . 15 pigs were divided into 3 groups of 5 pigs each. The immunizing dose was 2.0 cm 3 . The first group of animals (Nos. 1-5) were immunized with the vaccine without dilution, the second group of pigs (Nos. 6-10) were vaccinated with the vaccine diluted 1/5, the third group of animals (Nos. 11-15) - with the vaccine diluted 1/25. The preparation was administered intramuscularly into the middle third of the neck. As a virus control, 2 heads were left without vaccination.
Пример 11. Исследование сывороток крови вакцинированных животных на наличие антител к неструктурным белкам вируса ящура. Example 11. Study of blood serum of vaccinated animals for the presence of antibodies to non-structural proteins of foot-and-mouth disease virus.
Сыворотки крови от свиней, полученные до иммунизации и через 14 суток после иммунизации, исследовали на наличие антител к неструктурным белкам вируса ящура с помощью блокирующего варианта иммуноферментного анализа (ИФА) в соответствии с рекомендациями OIE (МЭБ) [3]. Тестирование полученных сывороток проводили с использованием тест-системы для ИФА «Prio CHECK®FMDV NSP ELISA for in vitro detection of antibodies against Foot and Mouth Disease Virus in serum of cattle, sheep and pigs» (Prionics Lelystad B.V., Нидерланды). Полученные результаты исследований отражены в таблице 6, из которой видно, что сыворотки крови животных не содержали антител к неструктурным белкам вируса ящура (значения PI для сывороток крови свиней < 50%).Blood sera from pigs obtained before immunization and 14 days after immunization were tested for the presence of antibodies to non-structural proteins of the foot-and-mouth disease virus using a blocking version of the enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) in accordance with OIE recommendations [3]. Testing of the obtained sera was carried out using the ELISA test system "Prio CHECK ® FMDV NSP ELISA for in vitro detection of antibodies against Foot and Mouth Disease Virus in serum of cattle, sheep and pigs" (Prionics Lelystad BV, the Netherlands). The obtained research results are reflected in Table 6, which shows that the blood sera of the animals did not contain antibodies to non-structural proteins of the foot-and-mouth disease virus (PI values for pig blood sera < 50%).
Пример 12. Оценка авирулентности и безвредности вакцины против ящура генотипа А/AFRICA/G-VII культуральной инактивированной эмульсионной (предлагаемое изобретение).Example 12. Evaluation of the avirulence and harmlessness of the vaccine against foot-and-mouth disease genotype A/AFRICA/G-VII, culture inactivated emulsion (proposed invention) .
Для определения авирулентности вакцины для свиней отобранную пробу вакцинного препарата вводили внутрикожно по 0,1 см3. В исследовании использовали свиней массой 30-40 кг. В течение 10 суток наблюдения животные остались клинически здоровыми, и при патологоанатомическом исследовании не было обнаружено изменений, характерных для ящура. Это свидетельствовало об отсутствии вирулентных свойств разработанной вакцины.To determine the avirulence of the vaccine for pigs, a selected sample of the vaccine preparation was administered intradermally at 0.1 cm 3 . Pigs weighing 30-40 kg were used in the study. During 10 days of observation, the animals remained clinically healthy, and pathological examination did not reveal any changes characteristic of foot-and-mouth disease. This indicated the absence of virulent properties of the developed vaccine.
Контроль безвредности продукта на животных проводили путём внутримышечного введения вакцины в дозе 6,0 см3 (тройная доза по 2,0 см3). Срок наблюдения также составлял 10 суток. Следует отметить, что после иммунизации температура тела животного может повышаться до 40,6°С и удерживаться на этом уровне в течение 1-2 суток, что не выходит за рамки нормы после введения вакцинного препарата.The safety of the product was monitored on animals by intramuscular administration of the vaccine at a dose of 6.0 cm 3 (a triple dose of 2.0 cm 3 ). The observation period was also 10 days. It should be noted that after immunization, the animal's body temperature can rise to 40.6°C and remain at this level for 1-2 days, which does not go beyond the norm after the administration of the vaccine.
По результатам исследований вакцина против ящура генотипа А/AFRICA/G-VII культуральная инактивированная эмульсионная (предлагаемое изобретение) была признана безвредной, все животные в период наблюдения оставались клинически здоровыми, при патологоанатомическом анализе некроза тканей на месте введения вакцины не обнаружено.According to the results of the studies, the vaccine against foot-and-mouth disease genotype A/AFRICA/G-VII, culture inactivated emulsion (the proposed invention) , was recognized as harmless, all animals remained clinically healthy during the observation period, and pathological analysis did not reveal tissue necrosis at the site of vaccine administration.
Пример 13. Изучение иммуногенных свойств вакцины против ящура генотипа А/AFRICA/G-VII культуральной инактивированной эмульсионной (предлагаемое изобретение) по способности индуцирования вируснейтрализующих антител у естественно восприимчивых животных. Example 13. Study of the immunogenic properties of the vaccine against foot-and-mouth disease genotype A/AFRICA/G-VII, culture inactivated emulsion (proposed invention), based on the ability to induce virus-neutralizing antibodies in naturally susceptible animals.
На 21 сутки после введения вакцины против ящура из штамма «А/Кения/G-VII» генотипа А/AFRICA/G-VII культуральной инактивированной эмульсионной (предлагаемое изобретение) у свиней отбирали кровь и проводили исследование полученных сывороток крови в реакции микронейтрализации [3]. Выявлено, что у свиней, иммунизированных вакциной в цельной дозе (5 голов), средние значения титра антител составили 9,30±0,27 log2 SN50, с разведением 1/5 (5 голов) - 5,30±0,27 log2 SN50, с разведением 1/25 (5 голов) - 3,70±0,27 log2 SN50 (табл. 7). Полученные данные реакции микронейтрализации свидетельствуют о том, что после введения вакцины в цельном виде обеспечивается формирование гуморального иммунитета с защитными титрами штаммоспецифических антител (5,5 и более log2 SN50), что соответствует требованиям международных стандартов [3].On the 21st day after the introduction of the vaccine against foot-and-mouth disease from the strain "A/Kenya/G-VII" genotype A/AFRICA/G-VII culture inactivated emulsion (the proposed invention), blood was collected from the pigs and the obtained blood sera were tested in the microneutralization reaction [3]. It was revealed that in pigs immunized with the vaccine in a whole dose (5 heads), the average values of the antibody titer were 9.30±0.27 log 2 SN 50 , with a dilution of 1/5 (5 heads) - 5.30±0.27 log 2 SN 50 , with a dilution of 1/25 (5 heads) - 3.70±0.27 log 2 SN 50 (Table 7). The obtained data from the microneutralization reaction indicate that after the administration of the vaccine in its entirety, the formation of humoral immunity with protective titers of strain-specific antibodies (5.5 or more log 2 SN 50 ) is ensured, which meets the requirements of international standards [3].
Пример 14. Контрольное заражение естественно восприимчивых животных. Изучение защитной способности вакцины против ящура генотипа А/AFRICA/G-VII культуральной инактивированной эмульсионной (предлагаемое изобретение) на естественно восприимчивых видах животных. Example 14. Control infection of naturally susceptible animals. Study of the protective capacity of the vaccine against foot-and-mouth disease of genotype A/AFRICA/G-VII, culture inactivated emulsion (proposed invention) on naturally susceptible animal species.
Свиньи, иммунизированные в количестве 15 голов, вакциной в цельном виде и в разведениях, заражали контрольным штаммом «А/Кения/G-VII» генотипа А/AFRICA/G-VII вируса ящура, адаптированного к этим животным в дозе 104,0 ИД50/0,20 см3 (в две точки по 0,10±0,05 см3). Спустя 7 суток после заражения всех животных подвергли эвтаназии и провели патологоанатомический осмотр. Защищенными от ящура считали животных, у которых на конечностях отсутствовали поражения. Первичные афты не учитывали.Pigs immunized in the amount of 15 heads with the vaccine in whole form and in dilutions were infected with the control strain "A/Kenya/G-VII" of the genotype A/AFRICA/G-VII foot-and-mouth disease virus adapted to these animals at a dose of 10 4.0 ID 50 /0.20 cm 3 (in two points of 0.10 ± 0.05 cm 3 ). Seven days after infection, all animals were euthanized and a pathological examination was performed. Animals with no lesions on the extremities were considered protected from foot-and-mouth disease. Primary aphthae were not taken into account.
Результаты контрольного заражения представлены в таблице 7, из которой следует, что вакцина против ящура из штамма «А/Кения/G-VII» генотипа А/AFRICA/G-VII культуральная инактивированная эмульсионная (предлагаемое изобретение) в цельном виде, а также в разведениях 1/5 и 1/25, введенная в однократной дозе (2,0 см3) защищает свиней от заражения гомологичным штаммом всех животных (5 из 5 голов).The results of the control infection are presented in Table 7, from which it follows that the vaccine against foot-and-mouth disease from the strain "A/Kenya/G-VII" of the genotype A/AFRICA/G-VII, culture inactivated emulsion (the proposed invention) in whole form, as well as in dilutions of 1/5 and 1/25, administered in a single dose (2.0 cm3 ) protects pigs from infection with a homologous strain of all animals (5 out of 5 heads).
По результатам контрольного заражения было установлено, что в прививном объеме данной вакцины содержится 55,90 ПД50 и 0,04 ИмД50 для свиней.Based on the results of the control infection, it was established that the inoculation volume of this vaccine contains 55.90 PD 50 and 0.04 IMD 50 for pigs.
Таким образом, приведенная выше информация свидетельствует о том, что вакцина против ящура генотипа A/AFRICA/G-VII культуральная инактивированная эмульсионная, воплощающая предлагаемое изобретение, предназначена как резервная для использования в сельском хозяйстве, а именно в ветеринарной вирусологии и биотехнологии; подтверждена возможность осуществления представленного; вакцина, изготовленная из штамма «А/Кения/G-VII» генотипа А/AFRICA/G-VII в соответствии с предлагаемым изобретением, обладает высокой иммуногенной активностью и способна обеспечить эффективную защиту восприимчивых животных против эпизоотического штамма вируса ящура генотипа А/AFRICA/G-VII. Вакцина против ящура генотипа A/AFRICA/G-VII культуральная инактивированная эмульсионная изготовлена с применением масляного адъюванта Montanide ISA-61 VG. По результатам контрольного заражения было установлено, что в прививном объеме данной вакцины содержится 55,90 ПД50 и 0,04 ИмД50 для свиней.Thus, the above information indicates that the vaccine against foot-and-mouth disease of the genotype A/AFRICA/G-VII, a culture inactivated emulsion vaccine, embodying the proposed invention, is intended as a reserve vaccine for use in agriculture, namely in veterinary virology and biotechnology; the possibility of implementing the presented vaccine, made from the strain "A/Kenya/G-VII" is confirmed. genotype A/AFRICA/G-VII in accordance with the proposed invention, has high immunogenic activity and is capable of providing effective protection of susceptible animals against the epizootic strain of the foot-and-mouth disease virus of genotype A/AFRICA/G-VII. The vaccine against foot-and-mouth disease of genotype A/AFRICA/G-VII, a culture inactivated emulsion vaccine, is manufactured using the oil adjuvant Montanide ISA-61 VG. Based on the results of the control infection, it was established that the inoculation volume of this vaccine contains 55.90 PD50and 0.04 ImD50for pigs.
Источники информации, принятые во внимание при составлении описания изобретения к заявке на выдачу патента РФ на изобретение «Вакцина против ящура генотипа A/AFRICA/G-VII культуральная инактивированная эмульсионная»:Sources of information taken into account when drafting the description of the invention for the application for the issuance of a Russian patent for the invention “Vaccine against foot-and-mouth disease genotype A/AFRICA/G-VII, culture-based inactivated emulsion vaccine”:
1. Ящур. Меры профилактики. URL: http://89.rospotrebnadzor.ru/directions/epid_nadzor/146902 (Дата обращения: 11.08.2024).1. Foot-and-mouth disease. Preventive measures. URL: http://89.rospotrebnadzor.ru/directions/epid_nadzor/146902 (Accessed: 11.08.2024).
2. Опасность болезни ящура. URL: https://vet.astrobl.ru/press-release/opasnost-bolezni-yashchura (Дата обращения: 14.06.2024).2. The danger of foot-and-mouth disease. URL: https://vet.astrobl.ru/press-release/opasnost-bolezni-yashchura (Accessed: 14.06.2024).
3. OIE. Manual of diagnostic tests and vaccines for terrestrial animals - 24th Ed. - Paris, 2022 - Vol. 1, Chapter 2.1.5. - P. 166-169.3. OIE. Manual of diagnostic tests and vaccines for terrestrial animals - 24th Ed. - Paris, 2022 - Vol. 1, Chapter 2.1.5. - P. 166-169.
4. Бурдов А. Н., Дудников А. И., Малярец П. В. и др. Ящур. - М.: Агропромиздат, 1990. - 320 с.4. Burdov A. N., Dudnikov A. I., Malyarets P. V., et al. Foot-and-mouth disease. - M.: Agropromizdat, 1990. - 320 p.
5. Пономарев А. П., Узюмов В. Л., Груздев К. Н. Вирус ящура: структура, биологические и физико-химические свойства. - Владимир: Фолиант, 2006. - 250 с.5. Ponomarev A. P., Uzyumov V. L., Gruzdev K. N. Foot-and-mouth disease virus: structure, biological and physicochemical properties. - Vladimir: Foliant, 2006. - 250 p.
6. Aspects of emergency vaccination against foot-and-mouth disease / P. Barnett, J.M/ Garland, R.P. Kitching [et.al.] // Comparative Immunology, Microbiology and Infectious Diseases. - October 2002. - V. 25. - P. 345-364.6. Aspects of emergency vaccination against foot-and-mouth disease / P. Barnett, J.M./ Garland, R.P. Kitching [et.al.] // Comparative Immunology, Microbiology and Infectious Diseases. - October 2002. - V. 25. - P. 345-364.
7. Brown F. A brief history of FMD and its casual agent. FMD: Control Strateies: Proc. Jnt. Symp. 2-5. June 2002, Lyons, France. - Paris, 2003. - p. 13-21.7. Brown F. A brief history of FMD and its casual agent. FMD: Control Strategies: Proc. Jnt. Symp. 2-5. June 2002, Lyons, France. - Paris, 2003. - p. 13-21.
8. Cao Y, Lu Z, Liu Z. Foot-and-mouth disease vaccines: progress and problems. Expert Rev Vaccines. 2016 Jun;15(6):783-9. doi: 10.1586/14760584.2016.1140042. Epub 2016 Jan 22. PMID: 26760264.8. Cao Y, Lu Z, Liu Z. Foot-and-mouth disease vaccines: progress and problems. Expert Rev Vaccines. 2016 Jun;15(6):783-9. doi: 10.1586/14760584.2016.1140042. Epub 2016 Jan 22. PMID: 26760264.
9. Muleme M, Barigye R, Khaitsa ML, Berry E, Wamono AW, Ayebazibwe C. Effectiveness of vaccines and vaccination programs for the control of foot-and-mouth disease in Uganda, 2001-2010. Trop Anim Health Prod. 2013 Jan;45(1):35-43. doi: 10.1007/s11250-012-0254-6. Epub 2012 Sep 7. PMID: 22956440.9. Muleme M, Barigye R, Khaitsa ML, Berry E, Wamono AW, Ayebazibwe C. Effectiveness of vaccines and vaccination programs for the control of foot-and-mouth disease in Uganda, 2001-2010. Trop Anim Health Prod. 2013 Jan;45(1):35-43. doi:10.1007/s11250-012-0254-6. Epub 2012 Sep 7. PMID: 22956440.
10. Barnett P.V. A review of emergency foot-and-mouth disease (FMD) vaccines / Vaccine. - February 2002. - V. 20. - P. 1505-1514.10. Barnett P.V. A review of emergency foot-and-mouth disease (FMD) vaccines / Vaccine. - February 2002. - V. 20. - P. 1505-1514.
11. Официальный сайт The FAO World Reference Laboratory for Foot-and-Mouth Disease - URL: http://www.wrlfmd.org/ref_labs/fmd_ref_lab_reports.htm (Дата обращения 11.08.2024).11. Official website of the FAO World Reference Laboratory for Foot-and-Mouth Disease - URL: http://www.wrlfmd.org/ref_labs/fmd_ref_lab_reports.htm (Accessed 11.08.2024).
12. Salt I.S. Emergency vaccination of pigs against foot-and-mouth disease: protection against disease and reduction in contact transmission / Vaccine. - April 1998. - V. 16. - Р. 746-754.12. Salt I.S. Emergency vaccination of pigs against foot-and-mouth disease: protection against disease and reduction in contact transmission / Vaccine. - April 1998. - V. 16. - R. 746-754.
13. Рахманов А.М. Современная эпизоотическая ситуация в мире по ящуру и меры ее контроля //Ветеринарная медицина, 2013. - С. 37-38.13. Rakhmanov A.M. Current epizootic situation in the world on foot-and-mouth disease and measures for its control // Veterinary medicine, 2013. - P. 37-38.
14. Longjam N., Tayo T. Antigenic variation of Foot and Mouth Disease Virus // Vet. World. - 2011. - Vol. 4(10). - P. 475-479.14. Longjam N., Tayo T. Antigenic variation of Foot and Mouth Disease Virus // Vet. World. - 2011. - Vol. 4(10). - P. 475-479.
15. Мельник Р.Н., Хаустова Н.В., Мельник Н.В., Самуйленко А.Я., Гринь С.А., Святенко М.С., Литенкова И.Ю. Антигенная вариабельность вируса ящура серотипа А и обоснование необходимости получения новых актуальных производственных штаммов/ Ветеринария и кормление. - 2019. - №3. - С.29-31.15. Melnik R.N., Khaustova N.V., Melnik N.V., Samoylenko A.Ya., Grin' S.A., Svyatenko M.S., Litenkova I.Yu. Antigenic variability of foot-and-mouth disease virus serotype A and rationale for the need to obtain new relevant production strains / Veterinary science and feeding. - 2019. - No. 3. - P.29-31.
16. Paton D.J., Sumption K.J., Charleston B. Options for control of foot-and-mouth disease: knowledge, capability and policy/ Phil. Trans. R. Soc. B (2009) 364. - P. 2657-2667.16. Paton D.J., Sumption K.J., Charleston B. Options for control of foot-and-mouth disease: knowledge, capability and policy/ Phil. Trans. R. Soc. B (2009) 364. - pp. 2657-2667.
17. Патент РФ № 2772713, 24.05.2022 Вакцина для ранней защиты против ящура из штамма А 2205 / G IV культуральная инактивированная эмульсионная // Заявка № 2021113565 / Михалишин Д.В., Доронин М.И., Елькина Ю.С., Борисов А.В., Фомина С.Н.17. Russian Federation Patent No. 2772713, 05.24.2022 Vaccine for early protection against foot-and-mouth disease from strain A 2205 / G IV, culture-inactivated emulsion // Application No. 2021113565 / Mikhalishin D.V., Doronin M.I., Elkina Yu.S., Borisov A.V., Fomina S.N.
18. Barnett P.V. A review of emergency foot-and-mouth disease (FMD) vaccines / Vaccine. - February 2002. - V. 20. - P. 1505-1514.18. Barnett P.V. A review of emergency foot-and-mouth disease (FMD) vaccines / Vaccine. - February 2002. - V. 20. - P. 1505-1514.
19. Методические рекомендации по определению концентрации 146S, 75S, 12S компонентов вакцинных штаммов культурального вируса ящура в реакции связывания комплемента (РСК) / ФГБУ «ВНИИЗЖ». - Утв. 21.09.17.19. Methodological recommendations for determining the concentration of 146S, 75S, 12S components of vaccine strains of culture foot-and-mouth disease virus in the complement fixation reaction (CFR) / FGBU "ARRIAH". - Approved 21.09.17.
20. Методические указания по определению антигенного соответствия между эпизоотическими изолятами и производственными штаммами вируса ящура в перекрестной реакции микронейтрализации: утв. Россельхознадзором 13.09.2017 / ФГБУ «ВНИИЗЖ». - Владимир: 2017. - 24 с.20. Guidelines for determining the antigen match between epizootic isolates and production strains of foot-and-mouth disease virus in a cross-microneutralization reaction: approved by Rosselkhoznadzor on September 13, 2017 / FGBU "ARRIAH". - Vladimir: 2017. - 24 p.
21. Saitou N. and Nei M. (1987). The neighbor-joining method: A new method for reconstructing phylogenetic trees. Molecular Biology and Evolution 4:406-42.21. Saitou N. and Nei M. (1987). The neighbor-joining method: A new method for reconstructing phylogenetic trees. Molecular Biology and Evolution 4:406–42.
22. Felsenstein J. (1985). Confidence limits on phylogenies: An approach using the bootstrap. Evolution 39:783-791.22. Felsenstein J. (1985). Confidence limits on phylogenies: An approach using the bootstrap. Evolution 39:783–791.
23. Tamura K., Nei M., and Kumar S. (2004). Prospects for inferring very large phylogenies by using the neighbor-joining method. Proceedings of the National Academy of Sciences (USA) 101:11030-11035.23. Tamura K., Nei M., and Kumar S. (2004). Prospects for inferring very large phylogenies by using the neighbor-joining method. Proceedings of the National Academy of Sciences (USA) 101:11030–11035.
24. Kumar S., Stecher G., Li M., Knyaz C., and Tamura K. (2018). MEGA 6: Molecular Evolutionary Genetics Analysis across computing platforms. Molecular Biology and Evolution 35:1547-1549.24. Kumar S., Stecher G., Li M., Knyaz C., and Tamura K. (2018). MEGA 6: Molecular Evolutionary Genetics Analysis across computing platforms. Molecular Biology and Evolution 35:1547–1549.
25. Barnett P. Aspects of emergency vaccination against foot-and-mouth disease / P. Barnett, J.M/ Garland, R.P. Kitching [et.al.] // Comparative Immunology, Microbiology and Infectious Diseases. - 2002. - V. 25. - P. 345-364.25. Barnett P. Aspects of emergency vaccination against foot-and-mouth disease / P. Barnett, J.M./ Garland, R.P. Kitching [et.al.] // Comparative Immunology, Microbiology and Infectious Diseases. - 2002. - V. 25. - P. 345-364.
Таблица 1Table 1
Результаты адаптации штамма «А/Кения/G-VII» вируса ящура при культивировании в перевиваемой монослойной культуре клеток ПСГК-30 в разных условияхResults of adaptation of the strain "A/Kenya/G-VII" of foot-and-mouth disease virus during cultivation in a continuous monolayer culture of PSGK-30 cells under different conditions
(n=3, M±m, p<0,01) (n=3, M ± m, p<0.01)
Примечание: SКРС - сыворотка крови крупного рогатого скота,Note: S KRS - bovine serum,
ГБК - гидролизат белков крови,GBP - blood protein hydrolysate,
DMEM - название среды Игла,DMEM is the name of the Eagle's medium,
RPMI-1640 - название культуральной среды,RPMI-1640 is the name of the culture medium,
ЦПД - цитопатическое действие.CPE - cytopathic effect.
Таблица 2Table 2
Результаты репродукции штамма «А/Кения/G-VII» вируса ящура в перевиваемой суспензионной клеточной линии ВНК-21/SUSP/ARRIAH с разной концентрацией клетокResults of reproduction of the strain "A/Kenya/G-VII" of foot-and-mouth disease virus in the continuous suspension cell line BHK-21/SUSP/ARRIAH with different cell concentrations
(n=3, M±m, p<0,01) (n=3, M ± m, p<0.01)
Примечание: ОТ-ПЦР-РВ - обратная транскрипция и полимеразная цепная реакция, Note: RT-PCR-RV - reverse transcription and polymerase chain reaction,
ТЦД - тканевая цитопатическая доза,TCD - tissue cytopathic dose,
ЦПД - цитопатическое действие.CPE - cytopathic effect.
Таблица 3Table 3
Исследование кинетики инактивации суспензии вируса ящура штамма «А/Кения/G-VII» генотипа А/AFRICA/G-VIIStudy of the kinetics of inactivation of the suspension of foot-and-mouth disease virus strain "A/Kenya/G-VII" genotype A/AFRICA/G-VII
(n=3, M±m, p<0,05) (n=3, M ± m, p<0.05)
Таблица 4Table 4
Содержание компонентов штамма «А/Кения/G-VII» генотипа А/AFRICA/G-VII вируса ящура в суспензиях до и после очисткиContent of components of the strain "A/Kenya/G-VII" of the genotype A/AFRICA/G-VII foot-and-mouth disease virus in suspensions before and after purification
(n=3, M±m, p<0,005) (n=3, M ± m, p<0.005)
0,05%PGMG,
0.05%
Примечание: концентрацию балластного белка определяли по формуле Калькара: Note: the concentration of ballast protein was determined using the Kalkar formula:
С=1,45 × А280-0,74 × А260,C=1.45 × A 280 -0.74 × A 260 ,
где А280 - значение оптической плотности при длине волны 280 нм, where A 280 is the optical density value at a wavelength of 280 nm,
А260 - значение оптической плотности при длине волны 260 нм, A 260 is the optical density value at a wavelength of 260 nm,
ПГМГ - полигексаметиленгуанидин (флокулянт).PHMG - polyhexamethylene guanidine (flocculant).
Таблица 5Table 5
Содержание компонентов антигена штамма «А/Кения/G-VII» генотипа А/AFRICA/G-VII вируса ящура в суспензиях до и после концентрирования Content of antigen components of strain "A/Kenya/G-VII" genotype A/AFRICA/G-VII of foot-and-mouth disease virus in suspensions before and after concentration
(n=3, M±m, p<0,01) (n=3, M ± m, p<0.01)
(в 10 раз)Concentration methods
(10 times)
Примечание: ПЭГ - полиэтиленгликоль,Note: PEG - polyethylene glycol,
ОВБ - общий вирусный белок.OVB - total viral protein.
Таблица 6Table 6
Результаты исследования сывороток крови свиней на антитела к неструктурным белкам вируса ящура до и после вакцинации препаратом (предлагаемое изобретение), изготовленным с применением антигена вируса ящура штамма «А/Кения/G-VII» генотипа А/AFRICA/G-VIIResults of a study of pig blood serum for antibodies to non-structural proteins of the foot-and-mouth disease virus before and after vaccination with a preparation (proposed invention) manufactured using the antigen of the foot-and-mouth disease virus strain "A/Kenya/G-VII" genotype A/AFRICA/G-VII
Примечание: СПК - слабоположительный контроль,Note: SPC - weak positive control,
ПК - положительный контроль,PC - positive control,
ОК - отрицательный контроль, сыворотка отрицательная при PI, меньшим 50%.OK - negative control, serum is negative at PI less than 50%.
Таблица 7Table 7
Исследование гуморального иммунитета и иммуногенной активности вакцины против ящура генотипа А/AFRICA/G-VII культуральной инактивированной эмульсионной на свиньяхStudy of humoral immunity and immunogenic activity of the vaccine against foot and mouth disease genotype A/AFRICA/G-VII culture inactivated emulsion on pigs
(n=5, p<0,01, M±m) (n=5, p<0.01, M ± m)
G-VIIA/Kenya/
G-VII
55,900.04/
55.90
Примечание: «-» отсутствие генерализации процесса ящура,Note: "-" absence of generalization of the foot-and-mouth disease process,
РМН - реакция микронейтрализации,RMN - microneutralization reaction,
ИмД50 - иммуногенная доза,ImD 50 - immunogenic dose,
ПД50 - протективная доза.PD 50 is a protective dose.
Claims (3)
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2840148C1 true RU2840148C1 (en) | 2025-05-19 |
Family
ID=
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2772713C1 (en) * | 2021-05-12 | 2022-05-24 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Федеральный центр охраны здоровья животных" (ФГБУ "ВНИИЗЖ") | Vaccine for early protection against foot-and-mouth disease from strain a 2205/g iv cultural inactivated emulsion |
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2772713C1 (en) * | 2021-05-12 | 2022-05-24 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Федеральный центр охраны здоровья животных" (ФГБУ "ВНИИЗЖ") | Vaccine for early protection against foot-and-mouth disease from strain a 2205/g iv cultural inactivated emulsion |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| МЕЛЬНИК Р.Н., и др. Антигенная вариабельность вируса ящура серотипа А и обоснование необходимости получения новых актуальных производственных штаммов, Ветеринария и кормление, 2019., N 3., c.29-31. BARNETT P.V., A review of emergency foot-and-mouth disease (FMD) vaccines, Vaccine., February, 2002., V. 20., p. 1505-1514. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| DK2331682T3 (en) | INFECTIOUS BRONKITIS VACCINES DERIVED FROM IB-QX SIMILAR TREASURES | |
| RU2603003C1 (en) | Inactivated sorptive vaccine to fmd types a, o, asia-1 | |
| RU2840148C1 (en) | Culture-based inactivated emulsion vaccine against foot-and-mouth disease a/africa/g-vii genotype | |
| RU2847812C1 (en) | Vaccine against foot-and-mouth disease genotype a/asia/iran-05/her-10, culture-inactivated emulsion | |
| RU2699671C1 (en) | Vaccine for early protection against foot-and-mouth disease of type o inactivated emulsion | |
| RU2839344C1 (en) | Cultural inactivated emulsion vaccine for early protection against foot-and-mouth disease of genotypes sat-2/vii/lib-12 and sat-2/xiv | |
| RU2824660C1 (en) | Culture inactivated emulsion vaccine against foot-and-mouth disease of sat-2/xiv genotype from sat-2/xiv/2023 strain | |
| RU2849065C1 (en) | Vaccine against foot-and-mouth disease genotype o/ea-4 culture inactivated emulsion | |
| RU2839345C1 (en) | Cultural inactivated emulsion vaccine against foot-and-mouth disease of sat-3/v genotype from "sat-3/uganda/v" strain | |
| RU2847820C1 (en) | Vaccine against foot-and-mouth disease serotype o, cultural monovalent inactivated emulsion | |
| RU2849063C1 (en) | Vaccine against foot-and-mouth disease genotype sat-2/xiii culture inactivated emulsion | |
| RU2847814C1 (en) | Vaccine against foot-and-mouth disease genotype a/africa/g-i, cultured monovalent inactivated emulsion | |
| RU2837673C1 (en) | Vaccine against foot-and-mouth disease of genotype sat-2/vii/ghb-12 from strain "sat-2/north america/2012" cultural inactivated emulsion | |
| RU2850550C1 (en) | Vaccine against sat-2/iv genotype culture inactivated emulsion | |
| RU2850549C1 (en) | Vaccine against sat-1/ix genotype culture inactivated emulsion | |
| RU2849071C1 (en) | Vaccine against sat-2/iii genotype foot-and-mouth disease culture-inactivated emulsion | |
| RU2824662C1 (en) | Culture inactivated emulsion vaccine against foot-and-mouth disease of asia-1/g-v genotype from asia-1/g-v/2006 strain | |
| RU2835906C1 (en) | Inactivated cultural sorbed vaccine against foot-and-mouth disease of genotype sat-2/xiv from strain "sat-2/xiv/2023" | |
| RU2848211C1 (en) | Culture-inactivated emulsion vaccine for early protection against sat-3/v foot-and-mouth disease | |
| RU2839456C1 (en) | Whole-virion culture inactivated emulsion vaccine against foot-and-mouth disease genotype sat-1/x | |
| RU2847822C1 (en) | Vaccine against foot-and-mouth disease genotype o/ea-2, monovalent, inactivated, emulsion | |
| RU2848762C1 (en) | Vaccine against sat-2/iv genotype foot-and-mouth disease culture-inactivated emulsion | |
| RU2848204C1 (en) | Cultural inactivated emulsion vaccine for early protection against sat-1/i genotype foot-and-mouth disease | |
| RU2847817C1 (en) | Cultural inactivated emulsion vaccine for early protection against foot-and-mouth disease genotype sat-1/x | |
| RU2810131C1 (en) | CULTURE INACTIVATED SORBED VACCINE AGAINST FOOT AND MOUTH DISEASE OF O/ME-SA/PanAsia2ANT-10 GENOTYPE FROM O N2356/PAKISTAN/2018 STRAIN |