RU2738743C1 - Способ выделения вирулентных бактериофагов staphylococcus aureus - Google Patents
Способ выделения вирулентных бактериофагов staphylococcus aureus Download PDFInfo
- Publication number
- RU2738743C1 RU2738743C1 RU2020134298A RU2020134298A RU2738743C1 RU 2738743 C1 RU2738743 C1 RU 2738743C1 RU 2020134298 A RU2020134298 A RU 2020134298A RU 2020134298 A RU2020134298 A RU 2020134298A RU 2738743 C1 RU2738743 C1 RU 2738743C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- incubated
- suspension
- staphylococcus aureus
- hours
- taken
- Prior art date
Links
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 title claims abstract description 77
- 241000191967 Staphylococcus aureus Species 0.000 title claims abstract description 58
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 23
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims abstract description 52
- NWIBSHFKIJFRCO-WUDYKRTCSA-N Mytomycin Chemical compound C1N2C(C(C(C)=C(N)C3=O)=O)=C3[C@@H](COC(N)=O)[C@@]2(OC)[C@@H]2[C@H]1N2 NWIBSHFKIJFRCO-WUDYKRTCSA-N 0.000 claims abstract description 28
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 24
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims abstract description 17
- 229960004857 mitomycin Drugs 0.000 claims abstract description 14
- 210000002741 palatine tonsil Anatomy 0.000 claims abstract description 12
- 206010009152 Chronic tonsillitis Diseases 0.000 claims abstract description 9
- 206010044008 tonsillitis Diseases 0.000 claims abstract description 9
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 claims abstract description 8
- 206010051223 adenoiditis Diseases 0.000 claims abstract description 7
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 claims abstract description 6
- 239000006137 Luria-Bertani broth Substances 0.000 claims abstract description 6
- 239000012895 dilution Substances 0.000 claims abstract description 6
- 238000010790 dilution Methods 0.000 claims abstract description 6
- 230000000737 periodic effect Effects 0.000 claims abstract description 6
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims abstract description 5
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 6
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 5
- 241000191940 Staphylococcus Species 0.000 abstract description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 abstract description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 15
- 238000007622 bioinformatic analysis Methods 0.000 description 6
- 239000012568 clinical material Substances 0.000 description 6
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 4
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 4
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 3
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 3
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 3
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 3
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 3
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 230000032770 biofilm formation Effects 0.000 description 2
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 2
- 208000035143 Bacterial infection Diseases 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 241000701553 Myoviridae Species 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 230000000845 anti-microbial effect Effects 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000003190 augmentative effect Effects 0.000 description 1
- 208000022362 bacterial infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002101 lytic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 210000003800 pharynx Anatomy 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
- A61K35/76—Viruses; Subviral particles; Bacteriophages
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Virology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Mycology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Изобретение относится к медицине, биологии и биотехнологии. Способ выделения вирулентных бактериофагов включает следующие стадии: биопленкообразующий изолят Staphylococcus aureus, выделенный из удаленной миндалины больного хроническим аденоидитом или хроническим тонзиллитом засевают на поверхность стерильного LB-агара, инкубируют при 36-37°С в течение 20-24 часов, отбирают выросшие колонии, суспендируют их в стерильном LB-бульона, инкубируют суспензию при 36-37°С в течение 2-2,5 часов, затем добавляют к преинкубированной суспензии митомицин С в количестве 1-10 мкг, после чего дополнительно инкубируют при периодическом встряхивании, затем добавляют к суспензии хлороформ, взятый в объеме 0,5-0,6 мл, после чего последовательно инкубируют полученную суспензию при комнатной температуре в течение 20-30 минут, центрифугируют инкубированную суспензию при 4000-5000 об./мин в течение 20-30 минут, отбирают супернатант в стерильную пробирку, инкубируют его при комнатной температуре в течение 1-2 часов, затем сеют по Грациа в разведениях 10-2-10-8 на суточную культуру штамма Staphylococcus aureus, свободного от индуцируемых бактериофагов, последовательно инкубируют посев при 36-37°С в течение 18-24 часов, отбирают изолированные бляшки, суспендируют их в стерильном физиологическом растворе, затем добавляют к суспензии хлороформ, взятый в объеме 0,5-0,6 мл, снова инкубируют полученную суспензию, центрифугируют и отбирают супернатант. Способ позволяет увеличить эффективность выделения природных вирулентных бактериофагов Staphylococcus aureus, активных в отношении стафилококковых биопленок. 2 табл., 3 пр.
Description
Область техники, к которой относится изобретение
Изобретение относится к медицине, биологии и биотехнологии, а именно к выделению вирулентных бактериофагов.
Применение вирулентных бактериофагов является альтернативой или дополнением использования антибиотиков и других антибактериальных средств. Однако в связи с возможностью развития фагоустойчивости бактерий необходим постоянный поиск новых природных, натуральных вирулентных бактериофагов.
В контексте настоящего описания природное происхождение вирулентных (или, иначе, литических бактериофагов) обозначается с учетом общепринятых синонимичных терминов: бактериофаг дикого типа, натуральный бактериофаг, природный бактериофаг, немодифицированный бактериофаг, немодифицированная форма бактериофага.
Природные вирулентные бактериофаги имеют более широкие возможности применения, чем генетически модифицированные (Моуе Z.D., Woolston J., Sulakvelidze A. Bacteriophage applications for food production and processing // Viruses. - 2018. - Vol. 10, №4. - Article 205. - DOI: 10.3390/v10040205; Verbeken G., Pirnay J.-P., Lavigne R., Jennes S., De Vos D., Casteels M., Huys I. Call for a dedicated European legal framework for bacteriophage therapy // Archivum immunologiae et therapiae experimentalis. -2014. - Vol. 62(2). - P. 117-129. - DOI: 10.1007/s00005-014-0269-y). Кроме того, природные, немодифицированные вирулентные фаги являются не только первоначальной основой для фагосодержащей продукции, но и носителями генетической информации, позволяющей разрабатывать генетически-модифицированные фаги.
Уровень техники
Важным направлением поиска природных вирулентных бактериофагов является выделение бактериофагов, эффективных в отношении бактерий, образующих биопленки, так как в биопленках проявляется феномен повышенной, не обусловленной генетически антибиотикотолерантности бактерий, а также может снижаться эффективность применения бактериофагов (Галимзянов Х.М., Башкина О.А., Досмуханова Э.Г., Абдрахманова P.O., Демина Ю.З., Даудова А.Д., Алешкин А.В., Несвижский Ю.В., Рыбкин B.C., Афанасьев С.С., Чикобава М.Г., Аршба И.М., Рубальский М.О., Рубальский Е.О. Клиническое значение биопленкообразования у бактерий // Астраханский медицинский журнал. - 2018. - Т. 13, №4. - С. 32-42; Abedon S.T. Bacteriophage exploitation of bacterial biofilms: phage preference for less mature targets? // FEMS microbiology letters. - 2016. - Vol. 363, N 3. - PII fnv246. - DOI: 10.1093/femsle/fnv246; Levin-Reisman I., Ronin I., Gefen O., Braniss I., Shoresh N., Balaban N.Q. Antibiotic tolerance facilitates the evolution of resistance // Science (New York, N.Y.). - 2017. - Vol. 355, №6327. - P. 826-830; Stewart P.S. Antimicrobial tolerance in biofilms // Microbiology spectrum. - 2015. - Vol. 3, №3. - URL: http://www.asmscience.org/content/journal/ microbiolspec/10.1128/microbiolspec.MB-0010-2014).
Одними из наиболее распространенных биопленкообразующих возбудителей бактериальных инфекций являются золотистые стафилококки - Staphylococcus aureus (Manandhar S., Singh A., Varma A., Pandey S., Shrivastava N. Biofilm producing clinical Staphylococcus aureus isolates augmented prevalence of antibiotic resistant cases in tertiary care hospitals of Nepal // Frontiers in microbiology. - 2018. - Vol. 27, №9. - Article 2749. - DOI: 10.3389/fmicb.2018.02749$ Kwiecinski J.M, Jacobsson G., Horswill A.R., Josefsson E., Jin T. Biofilm formation by Staphylococcus aureus clinical isolates correlates with the infection type // Infectious diseases (London, England). - 2019. - Vol. 51, №6. - P. 446-451. - DOI: 10.1080/23744235.2019.1593499).
Известен вирулентный бактериофаг Staphylococcus aureus SA18, относящийся к семейству Myoviridae, выделенный из клинического материала (RU 2503716 С1, 10.01.2014).
Основным недостатком известного аналога является отсутствие эффективного действия на бипленкообразующие изоляты Staphylococcus aureus.
Из уровня техники известен способ выделения штамма бактериофага Staphylococcus aureus SA20, способного разрушать биопленки, сформированные различными штаммами Staphylococcus aureus. Согласно описанию изобретения, данный способ заключается в выделении бактериофага из мазков зева и миндалин добровольцев (RU 2565824 С1, 20.10.2015).
Основным недостатком известного способа является единичное получение штамма бактериофага, эффективного против биопленкообразующих изолятов Staphylococcus aureus.
Наиболее близким аналогом заявляемого технического решения -прототипом - является известный способ получения бактериофага (RU 2613423 С1, 16.03.2017), при использовании которого на полученный газон культуры штамма-хозяина Staphylococcus aureus, свободного от индуцируемых бактериофагов, вместо маточного бактериофага засевали биопленкообразующий изолят Staphylococcus aureus, выделенный из удаленной миндалины больного хроническим аденоидитом или хроническим тонзиллитом.
Недостатком данного аналога является недостаточная эффективность выделения природных вирулентных бактериофагов Staphylococcus aureus, активных в отношении стафилококковых биопленок.
Решаемой технической проблемой в настоящем изобретении является разработка способа, направленного на повышение эффективности выделения природных вирулентных бактериофагов Staphylococcus aureus, активных в отношении стафилококковых биопленок.
Раскрытие сущности изобретения
Достигаемым техническим результатом является увеличение эффективности выделения природных вирулентных бактериофагов Staphylococcus aureus, активных в отношении стафилококковых биопленок, при использовании в качестве источника бактериофагов клинически значимых для хронического инфекционного процесса биопленкообразующих изолятов Staphylococcus aureus, высеянных из доступного, распространенного клинического материала.
Достижение указанного технического результата обусловлено следующей совокупностью существенных признаков:
биопленкообразующий изолят Staphylococcus aureus, выделенный из удаленной миндалины больного хроническим аденоидитом или хроническим тонзиллитом, засевают на поверхность стерильного LB-агара в чашке Петри, инкубируют посев при 36-37°С в течение 20-24 часов,
отбирают выросшие колонии Staphylococcus aureus, суспендируют их в стерильном LB-бульона, взятом в объеме 5 мл, инкубируют полученную суспензию при 36-37°С в течение 2-2,5 часов,
добавляют к преинкубированной суспензии митомицин С в количестве 1-10 мкг, после чего дополнительно инкубируют суспензию при 36-37°С в течение 2-2,5 часов при периодическом встряхивании,
добавляют к суспензии хлороформ, взятый в объеме 0,5-0,6 мл,
последовательно инкубируют полученную суспензию при комнатной температуре в течение 20-30 минут, центрифугируют инкубированную суспензию при 4000-5000 об./мин в течение 20-30 минут,
отбирают супернатант в стерильную пробирку, инкубируют его при комнатной температуре в течение 1-2 часов, затем сеют по Грациа инкубированный супернатант в разведениях 10-2-10-8 на суточную культуру штамма Staphylococcus aureus, свободного от индуцируемых бактериофагов, последовательно инкубируют посев при 36-37°С в течение 18-24 часов, отбирают изолированные бляшки, суспендируют их в стерильном физиологическом растворе, затем добавляют к суспензии хлороформ, взятый в объеме 0,5-0,6 мл,
инкубируют полученную суспензию при комнатной температуре в течение 20-30 минут, затем центрифугируют инкубированную суспензию при 4000-5000 об./мин в течение 20-30 минут и отбирают супернатант в стерильную пробирку.
Из литературы и практики использования реакций амплификации нуклеиновых кислот неизвестно о способе выделения вирулентных бактериофагов Staphylococcus aureus, который был бы идентичен разработанному нами.
Разработанный способ выделения вирулентных бактериофагов Staphylococcus aureus апробирован в федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего образования «Астраханский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБОУ ВО Астраханский ГМУ Минздрава России).
Было проведено сравнительное исследование характеристик, полученных при использовании разработанного нами способа выделения вирулентного бактериофага Staphylococcus aureus и способа, согласно ближайшему аналогу. Результаты представлены в таблице 1.
Как следует из приведенной таблицы 1, эффективность выделения природных вирулентных бактериофагов Staphylococcus aureus согласно разработанному способу выше, чем у способа-прототипа.
Кроме того, были проведены исследования в сравнении с выделением природных вирулентных бактериофагов без применения митомицина С из одинаковых биопленкообразующих изолятов Staphylococcus aureus, выделенных из удаленных миндалин больных хроническим аденоидитом или хроническим тонзиллитом. Результаты данной апробации приведены в таблице 2.
Как следует из приведенной таблицы 2, при использовании разработанного способа были выделены немодифицированные, природные вирулентные бактериофаги Staphylococcus aureus из 5 биопленкообразующих изолятов Staphylococcus aureus, из которых при предварительных попытках выделения бактериофагов без митомицина С бактериофаги выделены не были.
Таким образом, указанная выше совокупность существенных признаков необходима и достаточна для получения технического результата - увеличения эффективности выделения природных вирулентных бактериофагов Staphylococcus aureus, активных в отношении стафилококковых биопленок, при использовании в качестве источника бактериофагов клинически значимых для хронического инфекционного процесса биопленкообразующих изолятов Staphylococcus aureus, высеянных из доступного, распространенного клинического материала.
Осуществление изобретения
Сущность изобретения поясняется на ряде примеров, наглядно демонстрирующих увеличение эффективности выделения природных вирулентных бактериофагов Staphylococcus aureus, активных в отношении стафилококковых биопленок, при использовании в качестве источника бактериофагов клинически значимых для хронического инфекционного процесса биопленкообразующих изолятов Staphylococcus aureus, высеянных из доступного, распространенного клинического материала. При этом приведенные примеры способа выделения вирулентных бактериофагов Staphylococcus aureus показывают конкретную реализацию заявляемого изобретения, но не ограничивают объем притязаний формулы заявляемого изобретения.
Пример 1. Для выделения природного вирулентного бактериофага Staphylococcus aureus, активного в отношении стафилококковых биопленок, использован биопленкообразующий изолят Staphylococcus aureus 7зев14, выделенный из удаленной миндалины больного хроническим тонзиллитом, являющихся доступным, распространенным клиническим материалом. Предварительная попытка выделения бактериофагов из используемого биопленкообразующего изолята Staphylococcus aureus без применения митомицина С не была эффективной, то есть бактериофаги выделены не были.
Для повышения эффективности выделения вирулентных бактериофагов Staphylococcus aureus используемый биопленкообразующий изолят Staphylococcus aureus, выделенный из удаленной миндалины больного хроническим тонзиллитом, засевали на поверхность стерильного LB-агара в чашке Петри, инкубировали посев при 36°С в течение 24 часов, отбирали выросшие колонии Staphylococcus aureus, суспендировали их в стерильном LB-бульона, взятом в объеме 5 мл, инкубировали полученную суспензию при 36°С в течение 2,5 часов, затем добавляли к преинкубированной суспензии митомицин С в количестве 10 мкг, после чего дополнительно инкубировали суспензию при 36°С в течение 2,5 часов при периодическом встряхивании, затем добавляли к суспензии хлороформ, взятый в объеме 0,6 мл, после чего последовательно инкубировали полученную суспензию при комнатной температуре в течение 20 минут, центрифугировали инкубированную суспензию при 4000 об./мин в течение 30 минут, отбирали супернатант в стерильную пробирку, инкубировали его при комнатной температуре в течение 2 часов, затем сеяли по Грациа инкубированный супернатант в разведениях 10-2-10-8 на суточную культуру штамма Staphylococcus aureus АТСС 19685, свободного от индуцируемых бактериофагов, после этого последовательно инкубировали посев при 36°С в течение 24 часов, отбирали изолированные бляшки, суспендировали их в стерильном физиологическом растворе, затем добавляли к суспензии хлороформ, взятый в объеме 0,6 мл, после этого инкубировали полученную суспензию при комнатной температуре в течение 20 минут, затем центрифугировали инкубированную суспензию при 4000 об./мин в течение 30 минут и отбирают супернатант в стерильную пробирку.
Выделенный штамм стафилококкового бактериофага был активен в отношении стафилококковых биопленок. Проведенный биоинформатический анализ полногеномной нуклеотидной последовательности выделенного штамма бактериофага доказал его вирулентность. В результате сравнительного биоинформатического анализа, показавшего идентичность генома вирулентного бактериофага, находящегося в культуре использованного биопленкообразующего изолята Staphylococcus aureus, не подвергавшегося воздействию митомицина С, и генома выделенного вирулентного стафилококкового бактериофага, установлено отсутствие мутаций в геноме выделенного вирулентного бактериофага в результате воздействия митомицина С, что подтверждает выделение немодифицированной формы вирулентного стафилококкового бактериофага согласно предлагаемому способу.
Пример 2. Для выделения природного вирулентного бактериофага Staphylococcus aureus, активного в отношении стафилококковых биопленок, использован биопленкообразующий изолят Staphylococcus aureus 9зев14, выделенный из удаленной миндалины больного хроническим тонзиллитом, являющихся доступным, распространенным клиническим материалом. Предварительная попытка выделения бактериофагов из используемого биопленкообразующего изолята Staphylococcus aureus без применения митомицина С не была эффективной, то есть бактериофаги выделены не были.
Для повышения эффективности выделения вирулентных бактериофагов Staphylococcus aureus используемый биопленкообразующий изолят Staphylococcus aureus, выделенный из удаленной миндалины больного хроническим тонзиллитом, засевали на поверхность стерильного LB-агара в чашке Петри, инкубировали посев при 36,5°С в течение 22 часов, отбирали выросшие колонии Staphylococcus aureus, суспендировали их в стерильном LB-бульона, взятом в объеме 5 мл, инкубировали полученную суспензию при 36,5°С в течение 2,3 часов, затем добавляли к преинкубированной суспензии митомицин С в количестве 5 мкг, после чего дополнительно инкубировали суспензию при 36,5°С в течение 2,3 часов при периодическом встряхивании, затем добавляли к суспензии хлороформ, взятый в объеме 0,55 мл, после чего последовательно инкубировали полученную суспензию при комнатной температуре в течение 25 минут, центрифугировали инкубированную суспензию при 4500 об./мин в течение 25 минут, отбирали супернатант в стерильную пробирку, инкубировали его при комнатной температуре в течение 1,5 часов, затем сеяли по Грациа инкубированный супернатант в разведениях 10-2-10-8 на суточную культуру штамма Staphylococcus aureus 2072, свободного от индуцируемых бактериофагов, после этого последовательно инкубировали посев при 36,5°С в течение 22 часов, отбирали изолированные бляшки, суспендировали их в стерильном физиологическом растворе, затем добавляли к суспензии хлороформ, взятый в объеме 0,55 мл, после этого инкубировали полученную суспензию при комнатной температуре в течение 25 минут, затем центрифугировали инкубированную суспензию при 4500 об./мин в течение 25 минут и отбирают супернатант в стерильную пробирку.
Выделенный штамм стафилококкового бактериофага был активен в отношении стафилококковых биопленок. Проведенный биоинформатический анализ полногеномной нуклеотидной последовательности выделенного штамма бактериофага доказал его вирулентность. В результате сравнительного биоинформатического анализа, показавшего идентичность генома вирулентного бактериофага, находящегося в культуре использованного биопленкообразующего изолята Staphylococcus aureus, не подвергавшегося воздействию митомицина С, и генома выделенного вирулентного стафилококкового бактериофага, установлено отсутствие мутаций в геноме выделенного вирулентного бактериофага в результате воздействия митомицина С, что подтверждает выделение немодифицированной формы вирулентного стафилококкового бактериофага согласно разработанному способу.
Пример 3. Для выделения природного вирулентного бактериофага Staphylococcus aureus, активного в отношении стафилококковых биопленок, использован биопленкообразующий изолят Staphylococcus aureus 2аден, выделенный из удаленной миндалины больного хроническим аденоидитом, являющихся доступным, распространенным клиническим материалом. Предварительная попытка выделения бактериофагов из используемого биопленкообразующего изолята Staphylococcus aureus без применения митомицина С не была эффективной, то есть бактериофаги выделены не были.
Для повышения эффективности выделения вирулентных бактериофагов Staphylococcus aureus используемый биопленкообразующий изолят Staphylococcus aureus, выделенный из удаленной миндалины больного хроническим аденоидитом, засевали на поверхность стерильного LB-агара в чашке Петри, инкубировали посев при 37°С в течение 20 часов, отбирали выросшие колонии Staphylococcus aureus, суспендировали их в стерильном LB-бульона, взятом в объеме 5 мл, инкубировали полученную суспензию при 37°С в течение 2 часов, затем добавляли к преинкубированной суспензии митомицин С в количестве 1 мкг, после чего дополнительно инкубировали суспензию при 37°С в течение 2 часов при периодическом встряхивании, затем добавляли к суспензии хлороформ, взятый в объеме 0,5 мл, после чего последовательно инкубировали полученную суспензию при комнатной температуре в течение 30 минут, центрифугировали инкубированную суспензию при 5000 об./мин в течение 20 минут, отбирали супернатант в стерильную пробирку, инкубировали его при комнатной температуре в течение 1 часа, затем сеяли по Грациа инкубированный супернатант в разведениях 10-2-10-8 на суточную культуру штамма Staphylococcus aureus АТСС 12600, свободного от индуцируемых бактериофагов, после этого последовательно инкубировали посев при 37°С в течение 20 часов, отбирали изолированные бляшки, суспендировали их в стерильном физиологическом растворе, затем добавляли к суспензии хлороформ, взятый в объеме 0,5 мл, после этого инкубировали полученную суспензию при комнатной температуре в течение 30 минут, затем центрифугировали инкубированную суспензию при 5000 об./мин в течение 20 минут и отбирают супернатант в стерильную пробирку.
Выделенный штамм стафилококкового бактериофага был активен в отношении стафилококковых биопленок. Проведенный биоинформатический анализ полногеномной нуклеотидной последовательности выделенного штамма бактериофага доказал его вирулентность. В результате сравнительного биоинформатического анализа, показавшего идентичность генома вирулентного бактериофага, находящегося в культуре использованного биопленкообразующего изолята Staphylococcus aureus, не подвергавшегося воздействию митомицина С, и генома выделенного вирулентного стафилококкового бактериофага, установлено отсутствие мутаций в геноме выделенного вирулентного бактериофага в результате воздействия митомицина С, что подтверждает выделение немодифицированной формы вирулентного стафилококкового бактериофага согласно разработанному способу.
Claims (1)
- Способ выделения вирулентных бактериофагов Staphylococcus aureus, отличающийся тем, что биопленкообразующий изолят Staphylococcus aureus, выделенный из удаленной миндалины больного хроническим аденоидитом или хроническим тонзиллитом, засевают на поверхность стерильного LB-агара в чашке Петри, инкубируют посев при 36-37°С в течение 20-24 часов, отбирают выросшие колонии Staphylococcus aureus, суспендируют их в стерильном LB-бульона, взятом в объеме 5 мл, инкубируют полученную суспензию при 36-37°С в течение 2-2,5 часов, затем добавляют к преинкубированной суспензии митомицин С в количестве 1-10 мкг, после чего дополнительно инкубируют суспензию при 36-37°С в течение 2-2,5 часов при периодическом встряхивании, затем добавляют к суспензии хлороформ, взятый в объеме 0,5-0,6 мл, после чего последовательно инкубируют полученную суспензию при комнатной температуре в течение 20-30 минут, центрифугируют инкубированную суспензию при 4000-5000 об./мин в течение 20-30 минут, отбирают супернатант в стерильную пробирку, инкубируют его при комнатной температуре в течение 1-2 часов, затем сеют по Грациа инкубированный супернатант в разведениях 10-2-10-8 на суточную культуру штамма Staphylococcus aureus, свободного от индуцируемых бактериофагов, после этого последовательно инкубируют посев при 36-37°С в течение 18-24 часов, отбирают изолированные бляшки, суспендируют их в стерильном физиологическом растворе, затем добавляют к суспензии хлороформ, взятый в объеме 0,5-0,6 мл, после этого инкубируют полученную суспензию при комнатной температуре в течение 20-30 минут, затем центрифугируют инкубированную суспензию при 4000-5000 об./мин в течение 20-30 минут и отбирают супернатант в стерильную пробирку.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2020134298A RU2738743C1 (ru) | 2020-10-20 | 2020-10-20 | Способ выделения вирулентных бактериофагов staphylococcus aureus |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2020134298A RU2738743C1 (ru) | 2020-10-20 | 2020-10-20 | Способ выделения вирулентных бактериофагов staphylococcus aureus |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2738743C1 true RU2738743C1 (ru) | 2020-12-16 |
Family
ID=73835119
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2020134298A RU2738743C1 (ru) | 2020-10-20 | 2020-10-20 | Способ выделения вирулентных бактериофагов staphylococcus aureus |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2738743C1 (ru) |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2366437C2 (ru) * | 2007-10-29 | 2009-09-10 | Общество с ограниченной ответственностью "Амфита" (ООО "Амфита") | Композиция на основе бактериофага (варианты) |
| RU2366708C2 (ru) * | 2007-10-29 | 2009-09-10 | Общество с ограниченной ответственностью "Амфита" (ООО "Амфита") | Иммунобиологический бактерицидный препарат (варианты) |
| RU2565824C1 (ru) * | 2014-11-19 | 2015-10-20 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт химической биологии и фундаментальной медицины Сибирского отделения Российской академии наук (ИХБФМ СО РАН) | ШТАММ БАКТЕРИОФАГА Staphylococcus aureus SA20, ОБЕСПЕЧИВАЮЩИЙ РАЗРУШЕНИЕ БИОПЛЕНОК, ОБРАЗУЕМЫХ БАКТЕРИЯМИ РОДА Staphylococcus |
-
2020
- 2020-10-20 RU RU2020134298A patent/RU2738743C1/ru active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2366437C2 (ru) * | 2007-10-29 | 2009-09-10 | Общество с ограниченной ответственностью "Амфита" (ООО "Амфита") | Композиция на основе бактериофага (варианты) |
| RU2366708C2 (ru) * | 2007-10-29 | 2009-09-10 | Общество с ограниченной ответственностью "Амфита" (ООО "Амфита") | Иммунобиологический бактерицидный препарат (варианты) |
| RU2565824C1 (ru) * | 2014-11-19 | 2015-10-20 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт химической биологии и фундаментальной медицины Сибирского отделения Российской академии наук (ИХБФМ СО РАН) | ШТАММ БАКТЕРИОФАГА Staphylococcus aureus SA20, ОБЕСПЕЧИВАЮЩИЙ РАЗРУШЕНИЕ БИОПЛЕНОК, ОБРАЗУЕМЫХ БАКТЕРИЯМИ РОДА Staphylococcus |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| SIDDIQUI A. et al. Rapid Plate Method for the Isolation of Lysogenic Bacteriophages, Applied Microbiology, Vol.27, No.1, pp.278-280. * |
| КРЕНДЕЛЕВ М.С. Проблема биопленкообразования при хроническом тонзиллите, Современные проблемы науки и образования, 2016, N 5, С.50. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Whiteway et al. | Acinetobacter baumannii | |
| Nouraldin et al. | Bacteriophage-antibiotic synergism to control planktonic and biofilm producing clinical isolates of Pseudomonas aeruginosa | |
| US11457635B2 (en) | Pseudomonas aeruginosa bacteriophage Pse-AEP-3 and use thereof for inhibiting proliferation of Pseudomonas aeruginosa | |
| US11497216B2 (en) | Pseudomonas aeruginosa bacteriophage pse-AEP-4 and use thereof for inhibiting proliferation of Pseudomonas aeruginosa | |
| RU2738743C1 (ru) | Способ выделения вирулентных бактериофагов staphylococcus aureus | |
| JP2023540973A (ja) | 新規プロバイオティックストレプトコッカス・サリバリウス株とその用途 | |
| RU2366437C2 (ru) | Композиция на основе бактериофага (варианты) | |
| RU2628312C2 (ru) | Композиция антибактериальная для профилактики или лечения госпитальных инфекций (варианты), штаммы бактериофагов, используемые для получения такой композиции | |
| WO2019211635A1 (en) | Antimicrobial composition and the use of thereof | |
| JPH0820510A (ja) | 抗菌活性のある香辛料、およびこれを原料とする抗菌剤 | |
| RU2503716C1 (ru) | ВИДОСПЕЦИФИЧЕСКИЙ ВИРУЛЕНТНЫЙ ШТАММ БАКТЕРИОФАГА, ОБЛАДАЮЩИЙ ЛИТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТЬЮ В ОТНОШЕНИИ Staphylococcus aureus, ВКЛЮЧАЯ МУЛЬТИРЕЗИСТЕНТНЫЕ ШТАММЫ | |
| CN114703152B (zh) | 类鼻疽伯克霍尔德菌噬菌体vB_BpP_HN01及应用 | |
| JP2023134853A5 (ru) | ||
| RU2717451C1 (ru) | Штамм бактериофага Pseudomonas aeruginosa N 323 (500317), предназначенный для приготовления моно- и поливалентных лечебно-профилактических препаратов бактериофагов | |
| Zadeh et al. | Bacteriophage and probiotic therapy in the treatment of Pseudomonas aeruginosa burn infection and their synergistic effect | |
| Ghayyib et al. | Isolation and characterization of Staphylococcus Phage Rih21 and evaluation of its antibacterial activity against methicillin-resistant Staphylococcus aureus clinical isolates | |
| Else et al. | Development of Bacteriophage Therapy for Novel Treatment of Bacterial Infections | |
| Skurnik | Can Bacteriophages Replace Antibiotics? Antibiotics 2022, 11, 575 | |
| Govindan et al. | Necrotizing fasciitis caused by a variant of epidemic methicillin resistant Staphylococcus aureus-15 | |
| RU2717972C1 (ru) | Штамм бактериофага Pseudomonas aeruginosa N 324 (500318), предназначенный для приготовления моно- и поливалентных лечебно-профилактических препаратов бактериофагов | |
| RU2730614C1 (ru) | Антибактериальная композиция (варианты) и применение белка в качестве антимикробного средства, направленного против бактерий Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli, Salmonella typhi и Staphylococcus haemolyticus (варианты) | |
| Plaskett | Acinetobacter Bacteriophage Discovery in Soil | |
| Axel et al. | Novel approach for isolation of lytic bacteriophages against Staphylococcus aureus | |
| RU2717435C1 (ru) | Штамм бактериофага Pseudomonas aeruginosa N 326 (500320), предназначенный для приготовления моно- и поливалентных лечебно-профилактических препаратов бактериофагов | |
| RU2717420C1 (ru) | Штамм бактериофага Pseudomonas aeruginosa N 327 (500321), предназначенный для приготовления моно- и поливалентных лечебно-профилактических препаратов бактериофагов |