RU2730614C1 - Антибактериальная композиция (варианты) и применение белка в качестве антимикробного средства, направленного против бактерий Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli, Salmonella typhi и Staphylococcus haemolyticus (варианты) - Google Patents
Антибактериальная композиция (варианты) и применение белка в качестве антимикробного средства, направленного против бактерий Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli, Salmonella typhi и Staphylococcus haemolyticus (варианты) Download PDFInfo
- Publication number
- RU2730614C1 RU2730614C1 RU2019114136A RU2019114136A RU2730614C1 RU 2730614 C1 RU2730614 C1 RU 2730614C1 RU 2019114136 A RU2019114136 A RU 2019114136A RU 2019114136 A RU2019114136 A RU 2019114136A RU 2730614 C1 RU2730614 C1 RU 2730614C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- bacteria
- protein
- pseudomonas aeruginosa
- endolysin
- klebsiella pneumoniae
- Prior art date
Links
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 title claims abstract description 41
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 33
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims abstract description 30
- 241000588747 Klebsiella pneumoniae Species 0.000 title claims abstract description 22
- 241000589517 Pseudomonas aeruginosa Species 0.000 title claims abstract description 22
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 title claims abstract description 15
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title claims abstract description 14
- 241000293871 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhi Species 0.000 title claims abstract description 9
- 239000004599 antimicrobial Substances 0.000 title claims abstract description 9
- 241000191984 Staphylococcus haemolyticus Species 0.000 title claims abstract description 8
- 229940037649 staphylococcus haemolyticus Drugs 0.000 title claims abstract description 8
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims abstract description 46
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims abstract description 17
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims abstract description 12
- 230000035699 permeability Effects 0.000 claims abstract description 9
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims abstract description 6
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 17
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 9
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 abstract description 39
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 39
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N lysine Chemical compound NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 37
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 abstract description 32
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 abstract description 13
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 13
- MSFSPUZXLOGKHJ-UHFFFAOYSA-N Muraminsaeure Natural products OC(=O)C(C)OC1C(N)C(O)OC(CO)C1O MSFSPUZXLOGKHJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 5
- 108010013639 Peptidoglycan Proteins 0.000 abstract description 5
- 230000034994 death Effects 0.000 abstract description 3
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 abstract description 3
- 230000000149 penetrating effect Effects 0.000 abstract description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 abstract description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 abstract description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 abstract 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 abstract 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 abstract 1
- 241000588626 Acinetobacter baumannii Species 0.000 description 36
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 23
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 22
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 22
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 22
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 20
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 19
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 17
- 230000009471 action Effects 0.000 description 17
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 17
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 15
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 14
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 101100454361 Arabidopsis thaliana LCB1 gene Proteins 0.000 description 11
- 101100171146 Oryza sativa subsp. japonica DREB2C gene Proteins 0.000 description 11
- 230000002101 lytic effect Effects 0.000 description 11
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 9
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 9
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 9
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 9
- 230000000845 anti-microbial effect Effects 0.000 description 8
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 8
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 8
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 7
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 7
- 241000191967 Staphylococcus aureus Species 0.000 description 6
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 6
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 6
- 241000192125 Firmicutes Species 0.000 description 5
- 206010036790 Productive cough Diseases 0.000 description 5
- 238000011161 development Methods 0.000 description 5
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 5
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- 210000003802 sputum Anatomy 0.000 description 5
- 208000024794 sputum Diseases 0.000 description 5
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 4
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 4
- 238000011010 flushing procedure Methods 0.000 description 4
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 4
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 4
- 239000008057 potassium phosphate buffer Substances 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 3
- 206010011409 Cross infection Diseases 0.000 description 3
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 3
- 241001198387 Escherichia coli BL21(DE3) Species 0.000 description 3
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 description 3
- 238000011203 antimicrobial therapy Methods 0.000 description 3
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 3
- -1 coatings Substances 0.000 description 3
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 3
- 244000000058 gram-negative pathogen Species 0.000 description 3
- 230000036541 health Effects 0.000 description 3
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 241000894007 species Species 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 3
- 108700042778 Antimicrobial Peptides Proteins 0.000 description 2
- 102000044503 Antimicrobial Peptides Human genes 0.000 description 2
- 108010004743 Art-175 Proteins 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 2
- 241001596967 Escherichia coli M15 Species 0.000 description 2
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 2
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 2
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 2
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 2
- 206010034133 Pathogen resistance Diseases 0.000 description 2
- 206010035664 Pneumonia Diseases 0.000 description 2
- 108010040201 Polymyxins Proteins 0.000 description 2
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 2
- 206010039438 Salmonella Infections Diseases 0.000 description 2
- 241000607762 Shigella flexneri Species 0.000 description 2
- 206010048038 Wound infection Diseases 0.000 description 2
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 2
- 229910052783 alkali metal Inorganic materials 0.000 description 2
- 229940126575 aminoglycoside Drugs 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 231100000676 disease causative agent Toxicity 0.000 description 2
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 2
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 2
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 2
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 2
- 238000000034 method Methods 0.000 description 2
- 244000005706 microflora Species 0.000 description 2
- 210000001989 nasopharynx Anatomy 0.000 description 2
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 2
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 2
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 2
- 230000008823 permeabilization Effects 0.000 description 2
- 229940041153 polymyxins Drugs 0.000 description 2
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 2
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 206010039447 salmonellosis Diseases 0.000 description 2
- WTJDAUWOECZENF-OZWITMHCSA-N smap-29 Chemical compound NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)CC)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)CC)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)CC)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)CNC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N)[C@@H](C)CC)C(C)C)CC1=CC=C(O)C=C1 WTJDAUWOECZENF-OZWITMHCSA-N 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K tripotassium phosphate Chemical compound [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 2
- 206010067484 Adverse reaction Diseases 0.000 description 1
- 241000193755 Bacillus cereus Species 0.000 description 1
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 1
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 1
- 208000031729 Bacteremia Diseases 0.000 description 1
- 231100000699 Bacterial toxin Toxicity 0.000 description 1
- 208000004020 Brain Abscess Diseases 0.000 description 1
- 208000014912 Central Nervous System Infections Diseases 0.000 description 1
- 201000003883 Cystic fibrosis Diseases 0.000 description 1
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 1
- 241000588921 Enterobacteriaceae Species 0.000 description 1
- 241000194031 Enterococcus faecium Species 0.000 description 1
- 208000001860 Eye Infections Diseases 0.000 description 1
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- 241000588915 Klebsiella aerogenes Species 0.000 description 1
- 201000008225 Klebsiella pneumonia Diseases 0.000 description 1
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 1
- 201000009906 Meningitis Diseases 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 241000701553 Myoviridae Species 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 208000005141 Otitis Diseases 0.000 description 1
- 206010033078 Otitis media Diseases 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 206010035717 Pneumonia klebsiella Diseases 0.000 description 1
- 206010037660 Pyrexia Diseases 0.000 description 1
- 206010057190 Respiratory tract infections Diseases 0.000 description 1
- 241000293869 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium Species 0.000 description 1
- 108010079723 Shiga Toxin Proteins 0.000 description 1
- 241000607760 Shigella sonnei Species 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 206010052428 Wound Diseases 0.000 description 1
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 1
- 241000589636 Xanthomonas campestris Species 0.000 description 1
- 239000002250 absorbent Substances 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 230000006838 adverse reaction Effects 0.000 description 1
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 1
- 239000000443 aerosol Substances 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 208000030961 allergic reaction Diseases 0.000 description 1
- 230000000244 anti-pseudomonal effect Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 239000000688 bacterial toxin Substances 0.000 description 1
- 230000000721 bacterilogical effect Effects 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 208000025222 central nervous system infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 239000012568 clinical material Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 239000000645 desinfectant Substances 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 239000002612 dispersion medium Substances 0.000 description 1
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 1
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 1
- 208000019258 ear infection Diseases 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 206010014665 endocarditis Diseases 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 208000011323 eye infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 230000005802 health problem Effects 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000035987 intoxication Effects 0.000 description 1
- 231100000566 intoxication Toxicity 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 230000007794 irritation Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 1
- 239000007951 isotonicity adjuster Substances 0.000 description 1
- 206010023332 keratitis Diseases 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 1
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 1
- 230000001806 lysozymelike Effects 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 239000004530 micro-emulsion Substances 0.000 description 1
- 244000000010 microbial pathogen Species 0.000 description 1
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 230000036457 multidrug resistance Effects 0.000 description 1
- 229940051921 muramidase Drugs 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000002674 ointment Substances 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 239000008191 permeabilizing agent Substances 0.000 description 1
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 239000003910 polypeptide antibiotic agent Substances 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 229910000160 potassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011009 potassium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 239000003380 propellant Substances 0.000 description 1
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 1
- 230000008707 rearrangement Effects 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 238000009877 rendering Methods 0.000 description 1
- 230000008261 resistance mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000007480 sanger sequencing Methods 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 229940115939 shigella sonnei Drugs 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 210000004872 soft tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- 239000002594 sorbent Substances 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000003708 urethra Anatomy 0.000 description 1
- 210000001635 urinary tract Anatomy 0.000 description 1
- 208000012313 wound discharge Diseases 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
- A61K35/76—Viruses; Subviral particles; Bacteriophages
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
- A61K38/46—Hydrolases (3)
- A61K38/47—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2), e.g. cellulases, lactases
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
- C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
- C12N9/2462—Lysozyme (3.2.1.17)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
- C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
- C12Y302/01017—Lysozyme (3.2.1.17)
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Virology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Oncology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Mycology (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к терапевтическим белкам и может быть использовано в медицине в качестве антибактериального средства. Предложено использование белка рекомбинантного эндолизина бактериофага, в том числе в комбинации с фармацевтически приемлемыми носителями и/или веществами, увеличивающими проницаемость мембран, в качестве антимикробного средства, направленного против бактерий Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli, Salmonella typhi и Staphylococcus haemolyticus. На основе указанного белка, в том числе слитого с 8-гистидиновой меткой, получены антибактериальные композиции. Изобретение обеспечивает эффективное проникновение эндолизина без добавления различных пермеабилизаторов или ковалентно связанных пенетрирующих пептидов через наружную мембрану указанных бактерий и расщепление пептидогликана, что в конечном итоге приводит к гибели бактерий. 4 н.п. ф-лы, 3 табл., 6 пр., 5 ил.
Description
Область техники, к которой относится изобретение
Изобретение относится к биохимии, молекулярной биологии, микробиологии и биотехнологии и может быть использовано в создании биологических препаратов для профилактики и лечения инфекций, а также дезинфекции.
Уровень техники
Устойчивость бактерий к существующим антимикробным средствам является одной из основных проблем современности в области здравоохранения. Горизонтальный перенос генов позволяет бактериям очень быстро распространять новые механизмы резистентности, что наряду с неправильным использованием и злоупотреблением антибиотиками среди населения, а также в сельском хозяйстве и промышленности, приводит к появлению штаммов, которые невосприимчивы к антибиотикам вообще. Всемирная организация здравоохранения обращает особое внимание на патогенов группы ESKAPE, к которым относятся Enterococcus faecium, Staphylococcus aureus, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae и другие представители Enterobacteriaceae. Данные бактерии способны приобретать устойчивость сразу к нескольким антибактериальным средствам и чаще других вызывают опасные для жизни пациентов инфекции, в том числе и внутрибольничные.
Альтернативой антибиотикам и синтетическим антибактериальным средствам являются бактериофаги, использование которых началось еще до открытия пенициллина. Применение бактериофагов имеет множество преимуществ: автоматическое дозирование в зависимости от степени заражения, минимальное нарушение естественной микрофлоры, низкая вероятность развития устойчивости, совместимость с антибиотиками, быстрая скорость разработки препаратов на основе фагов и их низкая стоимость, уничтожение биопленок, возможность единоразового введения и применения низких доз, а также низкая степень нагрузки на окружающую среду.
Помимо зарегистрированных на территории РФ бактериофаговых препаратов компании «Микроген», существует множество изолированных бактериофагов, которые можно применять для лечения инфекций, вызванных грамотрицательными бактериями. Например, вирулентный фаг Фи 03 (RU 2112800, опубликован 29.03.1996) обладает способностью действовать на клетки синегнойной палочки, имеющие пили. Однако его спектр действия довольно узкий. Фаг Фи 02 (RU 2113476, опубликован 29.03.1996) обладает широким спектром действия. Бактериофаг ph57 (RU 2455355, опубликован 29.04.2011) также обладает широким спектром и может применяться для лечения гнойно-септических инфекций. Бактериофаг Esc-СОР-1 способен специфически уничтожать штаммы Шига-токсин продуцирующей E. соli типа F18 и может быть использован в медицинской промышленности (RU 2662985, опубликован 28.12.2015). Высоковирулентный штамм бактериофага Pseudomonas aeruginosa ph57 обладает широким спектром литической активности в отношении бактерий Pseudomonas aeruginosa и может быть использован в качестве основы для приготовления антисептического средства против синегнойной палочки (RU 2455355, опубликован 19.04.2011). Штамм бактериофага Salmonella typhimurium S-394 обладает поливалентной литической активностью по отношению к бактериям родов Escherichia coli, штаммам Salmonella ТА 1537 и Salmonella ТА 100 и штаммам Shigella sonnei 32 и Shigella flexneri Аd (RU 2412243, опубликован 16.06.2009). Также можно отметить антибактериальные композиции широкого спектра действия, содержащие несколько бактериофагов, например те, которые описаны в патентах RU 2518303 (опубликован 29.06.2012) и RU 2628312 (опубликован 16.03.2015).
Штамм бактериофага Acinetobacter baumannii AP22, из генома которого был выделен эндолизин, являющийся предметом данного патента, был запатентован для идентификации Acinetobacter baumannii при бактериологическом анализе клинического материала и для получения препарата против внутрибольничных A.baumannii-инфекций (RU 2439151, опубликован 10.01.2012). Он обладает узким спектром действия и способен лизировать только представителей вида Acinetobacter baumannii.
Однако есть и минусы применения лекарственных препаратов на основе бактериофагов. Бактериофаги сложно и долго выделять из бактериальных культур, они могут переносить гены бактериальных токсинов, к ним зачастую может возникать устойчивость бактерий, они обладают сильной иммуногенностью. Также их выделение может быть затруднительным, а нормировать их фармакокинетические характеристики сложно, а порой и невозможно. Для раневых инфекций было показано, что присутствие бактериофагов вызывало непродуктивный иммунный ответ, способствующий развитию хронической раневой инфекции и определяющий более тяжелое течение.
Считается, что более перспективным классом антибактериальных агентов могут стать эндолизины бактериофагов - литические ферменты, способные расщеплять пептидогликан клеточной стенки бактерий, что влечет за собой гибель бактерии вследствие гипотонического лизиса.
Эндолизины обладают рядом преимуществ по сравнению с бактериофагами и антибактериальными молекулами. Чаще всего они действуют специфично на определенный вид бактерий, при этом литический эффект достигается очень быстро за счет прямого действия на пептидогликан. Однако для многих эндолизинов, чье действие показано против грамотрицательных бактерий, обнаруживается довольно широкий спектр активности на различные роды представителей грамотрицательных патогенов. Среди других преимуществ эндолизинов можно отметить низкую вероятность развития резистентности, действие на антибиотикоустойчивые штаммы, а также на бактерии, находящиеся в любых метаболических стадиях, включая дормантные.
Эндолизины все чаще отмечают как потенциальные и эффективные препараты в борьбе с различными возбудителями. Независимыми группами ученых проводятся исследования по созданию и применению их для борьбы с грамотрицательными бактериями особо важной группы ESKAPE. При этом очень часто (но не всегда) использованию эндолизинов в чистом виде мешает наличие наружной мембраны, экранирующей пептидогликан от действия фермента. В качестве веществ, увеличивающих проницаемость наружной мембраны, могут использоваться полимиксины, полигуанидины и их производные, аминогликозиды, этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА) и ее соли, лимонная кислота и др.
Среди примеров эндолизинов, чье бактерицидное действие проявляется или значительно увеличивается в присутствии пермеабилизующих агентов, в частности ЭДТА, можно отметить антисинегнойные эндолизины EL188 (WO2015071437 A1, опубликован 21.05.2015) и OBPgpLYS (US 8846865 B2, опубликован 30.09.2014).
Другим подходом, позволяющим не задействовать дополнительные реагенты, увеличивающие проницаемость наружных мембран, является создание химерных молекул. Эти соединения представляют собой ковалентно сшитые эндолизин и пептид, который позволяет перенести молекулу через наружную мембрану грамотрицательных бактерий. В частности, антимикробный пептид SMAP-29 использовался для создания Art-175, представляющего собой модифицированную молекулу KZ144. В отличие от KZ144 Art-175 может проходить через наружную мембрану синегнойной палочки и уничтожать бактерии, в том числе и с множественной резистентностью (US 20160281074 A1, опубликован 29.09.2016).
Известно, что OBPgpLYS также модифицировали с помощью SMAP-29. При этом он начинает проявлять значительно больший антимикробный эффект как на штаммы синегнойной палочки, так и на другие грамотрицательные бактерии (US 8846865 B2, опубликован 30.09.2014). Модифицированный и немодифицированный OBPgpLYS также способны элиминировать бактерии внутри биопленок (WO 2011134998 A1, опубликован 03.11.2011).
Однако встречается множество примеров рекомбинантных эндолизинов, которые способны действовать на представителей грамотрицательных бактерий и без пермеабилизаторов или видоизменения структуры.
Известно, что эндолизин PlyE146 за счет положительно заряженной области на С-конце белка также обладает способностью проникать через наружную мембрану грамотрицательных бактерий и лизировать клетки E. coli, P. aeruginosa и A. baumannii в концентрации 400 мкг/мл (Larpin et al., 2018). Эндолизин бактериофага Acinetobacter baumannii LysAB2 за счет амфифильных структур в молекуле обладает бактерицидным действием как против грамотрицательных, так и против грамположительных бактерий, эффект достигается при концентрации 500 мкг/мл. В его спектр входят штаммы A. baumannii, E. coli и S. aureus (Lai et al., 2011). Также без добавления пермеабилизаторов проявляет свой антимикробный эффект эндолизин Р28 в концентрации 500 мкг/мл, его спектр действия охватывает Bacillus subtilis, Bacillus cereus, Klebsiella mobilis, Shigella flexneri, Xanthomonas campestris и Staphylococcus aureus (Dong et al., 2015). Другие примеры включают в себя LysPA26, способный уничтожать клетки Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumonia, Acinetobacter baumannii и Escherichia coli в концентрации 500 мкг/мл (Guo et al., 2017), PlyAB1 с узким спектром действия против A. baumannii (Huang et al., 2014) и другие.
Таким образом, в настоящее время проводится множество исследований эндолизинов, чей эффект направлен против широких панелей штаммов грамотрицательных бактерий с лекарственной устойчивостью, в том числе и множественной. Это подтверждает актуальность данного направления исследований.
Техническая проблема
Техническая проблема состоит в необходимости расширения арсенала антибактериальных средств в отношении грамотрицательных бактерий, в том числе с множественной лекарственной устойчивостью.
Сущность изобретения
Данное изобретение представляет собой рекомбинантный белок LysAp22 (аминокислотная последовательность SEQ ID NO: 3 а также последовательности, которые по меньшей мере на 90% ей идентичны, и последовательность нуклеотидов SEQ ID NO: 4, а также последовательности, которые по меньшей мере на 80% ей идентичны), представляющий собой модифицированный 8-гистидиновой меткой рекомбинантный эндолизин бактериофага AP22 (аминокислотная последовательность SEQ ID NO: 1 и последовательность нуклеотидов SEQ ID NO: 2, а также последовательности, которые по меньшей мере на 90% им идентичны). Он обладает широким спектром действия, проявляя антибактериальную активность в отношении Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumannii, Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli, Salmonella typhi и других видов бактерий.
Рекомбинантный эндолизин LysAp22 способен без добавления дополнительных увеличивающих проницаемость мембран компонентов проникать через наружную мембрану и эффективно и быстро уничтожать клетки грамотрицательных бактерий различных штаммов, видов и родов. Он позволит проводить антимикробную терапию различных видов инфекций, вызванных штаммами бактерий с множественной лекарственной устойчивостью, а также избавляться от бактерий, образовавших биопленки, внутрь которых доступ существующих антибактериальных средств затруднен.
Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumannii и Klebsiella pneumoniae являются одними из самых опасных возбудителей внутрибольничных инфекций, терапия которых зачастую затруднена в связи с высокой устойчивостью данных видов бактерий к существующим лекарственным средствам, а также их способностью образовывать биопленки. Инфекции, вызываемые этими патогенами, клинически очень разнообразны, а их течение очень тяжелое, особенно в случае нозокомиального происхождения, когда иммунитет пациента сильно снижен. По различным оценкам, внутрибольничные инфекции поражают 5-10% пациентов, находящихся в стационаре. Ежегодно в России число зафиксированных случаев внутрибольничных инфекций составляет порядка 2,5 млн.
Escherichia coli является представителем нормальной микрофлоры организма, но среди них есть и патогенные разновидности, которые морфологически не отличаются от непатогенных и вызывают эшерихиозы, чаще всего сопровождающиеся интоксикацией, лихорадкой и поражением желудочно-кишечного тракта. Заражение чаще всего происходит через загрязненную воду или пищу. E. coli также зачастую может развивать множественную устойчивость.
Различные представители рода Salmonella патогенны для человека и вызывают сальмонеллез, причем в последние годы заболеваемость сальмонеллезом сильно возросла, даже в развитых странах, так как данные бактерии активно развивают устойчивость к используемым антибиотикам. Также они могут вызывать внутрибольничные заболевания с тяжелым течением.
Сложность терапии и высокая летальность говорят о высокой актуальности внедрения в практику новых эффективных методов лечения инфекций, вызванных грамотрицательными патогенами.
Эндолизин LysAp22 в чистом виде, а также в комбинациях с различными средствами, увеличивающими проницаемость мембран, антимикробными пептидами и антимикробными средствами (в том числе антибиотиками) можно использовать в различных областях медицины, ветеринарии, сельском хозяйстве и пищевой промышленности.
Данные изобретения могут использоваться в виде подходящих лекарственных форм (раствор, аэрозоль, мазь и др.) для лечения и профилактики различных видов инфекций, вызванных чувствительными к действию эндолизина грамотрицательными бактериями. К таким инфекциям относятся эндокардит, респираторные инфекции (пневмонии), инфекции центральной нервной системы (менингит и абсцессы головного мозга), ушные и глазные инфекции (например, отит и кератит), бактериемия, инфекции кожных структур и мягких тканей (в том числе раневые и ожоговые), инфекции костей и суставов, инфекции мочевыводящих путей, инфекции желудочно-кишечного тракта и другие. Также возможно использование препаратов на основе LysAp22 для лечения пневмоний, сопутствующих муковисцидозу. При введении препарата, содержащего эффективную дозу активного вещества, местно, ингаляционно, внутримышечно, подкожно или внутривенно можно ожидать благоприятный исход течения инфекционного заболевания и быструю элиминацию патогенов.
Также LysAp22 можно использовать для быстрой и точной диагностики с целью определения возбудителя инфекции и своевременного начала терапии, а также для определения чувствительности различных штаммов бактерии к данным ферментам. Возможно создание различных систем детекции и биосенсоров на их основе.
Одной из наиболее важных проблем в медицине является образование грамотрицательными патогенами биопленок на различных поверхностях (в том числе медицинских инструментов). Бактерии внутри биопленок значительно меньше подвержены воздействию антимикробных средств и дезинфектантов. LysAp22 в виде раствора или любых других подходящих форм можно использовать для устранения биопленок, а также для дезинфекции инструментов (особенно используемых при различных хирургических манипуляциях), материалов, аппаратуры (в том числе аппаратов для искусственной вентиляции легких) и поверхностей.
В ветеринарии и сельском хозяйстве LysAp22 также можно использовать для лечения и профилактики инфекций животных, вызываемых чувствительными грамотрицательными бактериями.
В пищевой промышленности LysAp22 можно использовать для предотвращения контаминации воды и пищевых продуктов чувствительными грамотрицательными бактериями, а также для удаления биопленок и дезинфекции различных поверхностей.
В этом случае технический результат достигается использованием антибактериальной композиции, которая содержит эффективное количество (дозу) рекомбинантного белка LysAp22 и фармацевтически приемлемый носитель.
Технический результат достигается также использованием антибактериальной композиции, содержащей эффективное количество эндолизина LysAp22, пермеабилизатор и фармацевтически приемлемый носитель. В качестве пермеабилизаторов могут использоваться полимиксины и их производные, аминогликозиды, этилендиаминтетрауксусная кислота и ее соли (ЭДТА), лимонная кислота и др.
Термин «фармацевтически приемлемый носитель» включает любые и все растворители, добавки, эксципиенты вспомогательные вещества, дисперсионные среды, солюбилизирующие агенты, покрытия, консерванты, изотонические и абсорбционные агенты, поверхностно-активные вещества, пропелленты и тому подобное, которые являются фармацевтически совместимыми. Носитель (и) должен быть «приемлемым» в плане безвредности для субъекта, которому вводят препарат на основе объектов формулы изобретения в количествах, обычно используемых в лекарственных препаратах. Фармацевтически приемлемые носители совместимы с другими ингредиентами композиции без превращения композиции в непригодную для применения по назначению. Кроме того, фармацевтически приемлемые носители пригодны для использования без проявления серьезных нежелательных реакций (таких как токсичность, раздражение и аллергическая реакция). Побочные эффекты «неоправданы», когда их риск их появления превышает преимущество от применения композиции. Неограничивающие примеры фармацевтически приемлемых носителей или эксципиентов вспомогательных веществ включают в себя любой из стандартных фармацевтических носителей, таких как солевые растворы, вода и эмульсии, такие как эмульсии масло / вода и микроэмульсии.
Термин «эффективное количество» относится к количеству, которое при применении или назначении с соответствующей частотой приема или в определенном режиме дозирования является достаточным для предотвращения или ингибирования роста бактерий или предотвращения развития, улучшения течения, уменьшения тяжести, продолжительности или прогрессирования инфекционного заболевания, вызывает регрессию заболевания или усиливает или улучшает профилактический или терапевтический эффект другого метода лечения, такого как антимикробная терапия.
Термин «биопленка» относится к бактериям, которые прикрепляются к поверхностям и погружены в выделяемый ими внеклеточный матрикс. Биопленка представляет собой совокупность микроорганизмов, где клетки прилипают друг к другу на какой-либо поверхности. Эти адгезивные клетки часто погружены во внеклеточный матрикс из полимерного вещества. Биопленка представляет собой полимерную конгломерацию, обычно состоящую из внеклеточной ДНК, белков и полисахаридов.
Иллюстрации, поясняющие сущность изобретения
На иллюстрациях приведены поясняющие графические материалы, раскрывающие сущность изобретения. Указанные материалы не ограничивают объем притязаний заявителя и должны использоваться для пояснения существа заявленного технического решения.
На фиг. 1 приведен график, отображающий бактерицидную активность различных концентраций LysAp22 против штамма A. baumannii Ts 50-16. В качестве контроля использовали клетки бактерий, инкубированные с буфером вместо белка. Число выживших колоний после 18 часов инкубации чашек Петри выражено в виде снижения log10 КОЕ/мл по сравнению с контролем. Для всех экспериментов показаны средние значения по стандартным отклонением после трех независимых экспериментов. Звездочка (*) обозначает значимый бактерицидный эффект.
На фиг. 2 приведен график сравнения активности эндолизина LysAp22 в концентрациях 10 и 100 мкг/мл против штамма A. baumannii Ts 50-16 в экспоненциальной (Эксп) и стационарной (Ст) фазах роста без добавления и с добавлением 0,5 мМ ЭДТА. Приведена остаточная активность фермента (%) по сравнению с контролем. NS - нет статистически достоверного отличия от контрольной культуры без добавления эндолизина (p > 0,05, критерий Манна-Уитни). Для всех экспериментов показаны средние значения по стандартным отклонением после трех независимых экспериментов. Звездочка (*) обозначает значимый бактерицидный эффект.
На фиг. 3 приведен график, отображающий влияние pH и 0,5 мМ ЭДТА на антимикробную активность LysAp22 в концентрации 1 мкг/мл против A. baumannii Ts 50-16. Приведена остаточная активность фермента (%) по сравнению с контролем. NS - нет статистически достоверного отличия от контрольной культуры без добавления эндолизина (p > 0,05, критерий Манна-Уитни). Для всех экспериментов показаны средние значения по стандартным отклонением после трех независимых экспериментов.
На фиг. 4 приведен график влияния солей на литическую активность LysAp22 в концентрации 10 мкг/мл против A. baumannii Ts 50-16. Приведена остаточная активность фермента (%) по сравнению с контролем. NS - нет статистически достоверного отличия от контрольной культуры без добавления эндолизина (p > 0,05, критерий Манна-Уитни). Все остальные значения статистически достоверно отличаются от контроля. Для всех экспериментов показаны средние значения по стандартным отклонением после трех независимых экспериментов.
На фиг. 5 приведен график, отображающий бактерицидную активность LysAp22 в концентрации 50 мкг/мл против различных штаммов грамотрицательных и грамположительных бактерий. Приведена остаточная активность фермента (%) по сравнению с контролем. НА - не было отмечено бактерицидной активности. Все значения статистически достоверно отличаются от контрольной культуры без добавления эндолизина (p < 0,05, критерий Манна-Уитни). Для всех экспериментов показаны средние значения по стандартным отклонением после трех независимых экспериментов.
Далее приведены аминокислотные и нуклеотидные последовательности: первая из которых аминокислотная последовательность эндолизина бактериофага AP22 (SEQ ID NO: 1); вторая - нуклеотидная последовательность эндолизина бактериофага AP22 (SEQ ID NO: 2); третья - аминокислотная последовательность эндолизина LysAp22, модифицированного 8-гистидиновой меткой (SEQ ID NO: 3); четвертая - нуклеотидная последовательность эндолизина LysAp22, модифицированного 8-гистидиновой меткой (SEQ ID NO: 4).
Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения
Белок LysAp22 (аминокислотная последовательность SEQ ID NO: 3 и последовательность нуклеотидов SEQ ID NO: 4) был получен рекомбинантным путем и содержит в одной рамке трансляции гистидиновую метку (8 His). Данный фермент представляет собой модифицированный 8-гистидиновой меткой рекомбинантный эндолизин бактериофага AP22 (аминокислотная последовательность SEQ ID NO: 1 и последовательность нуклеотидов SEQ ID NO: 2) семейства Myoviridae, поражающего клетки Acinetobacter baumannii. Предсказано, что LysAp22 (белок размером 21,4 кДа) в своей структуре содержит лизоцим-подобный каталитический (мурамидазный), что и обеспечивает бактерицидную активность по отношению к клеточным стенкам бактерий.
Что касается антимикробных свойств, было показано, что LysAp22 оказывает бактерицидное действие на экспоненциально растущие клетки клинического штамма A. baumannii Ts 50-16 в концентрации от 0,5 мкг/мл в 20 мM Tрис HCl буфере (pH 7.5). График дозозависимого эффекта приведен на фиг. 1.
При действии LysAp22 на бактерии в стационарной фазе роста бактерицидный эффект в концентрации белка 10 мкг/мл и 100 мкг/мл сильно снижается, предположительно, из-за перестройки бактериальной клеточной стенки и отсутствия эффективной пермеабилизации мембраны. При этом добавление веществ, увеличивающих проницаемость мембран (0,5 мМ ЭДТА), способствует проявлению литического эффекта, однако, он восстанавливается лишь при высоких концентрациях фермента (100 мкг/мл) (фиг. 2).
Анализ in vitro антибактериальной активности при различных значениях рН (от 5,0 до 9,0) показал, что в буфере Tрис HCl наиболее оптимальными значениями являются слабокислые (5,0-6,0), а также нейтральные и слабощелочные (7,5-8,0). Однако, при рН 6,5-7,0 наблюдается некоторое снижение активности (примерно на 10%), что, предположительно, связано с изменением заряда С-конца белка, отвечающего за эффективную пермеабилизацию. Добавление 0,5 мМ ЭДТА устраняет различия в эффективности и элиминирует эффект рН, что подтверждает предположение о влиянии заряда белка на способность проникать через наружную мембрану (фиг. 3).
5 мМ калий фосфатный буфер (pH 7.5) является отличной заменой буферу, содержащему Трис, т.к. он более физиологичен по своему составу. Добавляя к LysAp22 в этом буфере различные концентрации солей щелочных металлов (NaCl и KCl), мы оценивали их влияние на бактерицидную активность. Было показано, что, начиная с концентрации 25 мМ для NaCl и 50 мМ для KCl, наблюдается ингибирование действия фермента. Хотя в концентрации 250-500 мМ для обеих солей литический эффект частично восстанавливается (фиг. 4).
Широта спектра действия оценивалась на 16 штаммах грамотрицательных бактерий различных родов и видов и 2 штаммах грамположительных бактерий различного происхождения: клинические изоляты и лабораторные штаммы (Таблица 1). Было показано, что LysAp22 оказывает различный по силе бактерицидный эффект по отношению ко всем изученным штаммам, кроме грамположительного Staphylococcus aureus Z 73-14 (фиг. 5).
Таблица 1. Спектр антимикробной активности LysAp22 против грамотрицательных бактерий. + наличие эффекта, - отсутствие эффекта.
| Бактериальный штамм | Антимикробная активность |
| Pseudomonas aeruginosa Ts 38-16 | + |
| Pseudomonas aeruginosa Ts 43-16 | + |
| Pseudomonas aeruginosa Ts 44-16 | + |
| Acinetobacter baumannii Ts 50-16 | + |
| Acinetobacter baumannii Ts 53-16 | + |
| Acinetobacter baumannii Ts 58-16 | + |
| Acinetobacter baumannii Ts 54-16 | + |
| Klebsiella pneumoniae Ts 141-14 | + |
| Klebsiella pneumoniae Ts 08-15 | + |
| Klebsiella pneumoniae F 104-14 | + |
| Klebsiella pneumoniae B3060 | + |
| Klebsiella pneumoniae Osh-2k | + |
| Klebsiella pneumoniae I6208 | + |
| Escherichia coli M15 | + |
| Salmonella typhi MVP 728 | + |
| Staphylococcus aureus Z 73-14 | - |
| Staphylococcus haemolyticus G 58-0916 | + |
| Escherichia coli BL21(DE3) pLysS | + |
Таким образом, эндолизин LysAp22 без добавления различных пермеабилизаторов или ковалентно связанных пенетрирующих пептидов способен проникать через наружную мембрану грамотрицательных бактерий и расщеплять пептидогликан, что в конечном итоге приводит к гибели бактерий. Значительное снижение количества колоний, выросших на чашках Петри, после инкубации бактерий и белка в течение небольшого количества времени, говорит о высокой активности LysAp22. Таким образом, данный эндолизин является перспективной молекулой для борьбы с патогенами группы ESKAPE.
Пример 1. Получение штамма бактериофага Acinetobacter baumannii АP22 и его лизата.
Для получения штамма бактериофага Acinetobacter baumannii АP22, активного в отношении Acinetobacter baumannii, бактериальную культуру штамма-хозяина в титре 108 КОЕ/мл засевали в сосуд для культивирования на скошенную плотную питательную среду с толщиной слоя от 10 мм до 25 мм.
Штамм-хозяин культивировали в течение 3 часов при оптимальной температуре для его роста (37 C), затем на полученный газон культуры Acinetobacter baumannii засевали маточный бактериофаг в титре 106 БОЕ/мл, герметично закрывали сосуд для культивирования (стеклянный микробиологический матрац) и культивировали бактериофаг в течение 13 часов при оптимальной температуре 37°C и толщине слоя воздуха над поверхностью плотной питательной среды от 25 мм до 40 мм.
Для получения фаголизата бактериофаг суспендировали с поверхности плотной питательной среды физиологическим раствором в количестве 0,04 мл на 1 см2 поверхности плотной питательной среды. Полученную жидкость отсасывали в стерильную емкость, добавляли хлороформ и выдерживали в течение 30 мин при непрерывной аэрации. Далее центрифугировали раствор в течение 30 мин при 6000 об/мин, стерилизовали надосадочную жидкость фильтрацией через фильтр с диаметром пор 0,2 мкм и пропускали полученный фильтрат через колонку, содержащую агент, аффинный к эндотоксину.
Полученный элюат представлял собой очищенный фаголизат и содержал бактериофаги в титре 1011 БОЕ/мл при отсутствии бактерий, ингредиентов использованной питательной среды и при концентрации эндотоксина менее 50 единиц эндотоксина на 1 мл очищенного фаголизата (ЕЭ/мл).
Пример 2. Получение экспрессионного вектора, несущего кодирующую последовательность LysAp22.
Кодирующую последовательность эндолизина LysAp22 получали методом ПЦР-амплификации с помощью ген-специфичных праймеров (Таблица 2) из лизата бактериофагов. Полученную нуклеотидную последовательность поместили в экспрессионную кассету pET42b (+). Корректность сборки векторной конструкций проверяли методом секвенирования по Сэнгеру. Для очистки рекомбинантного продукта с помощью аффинной хроматографии, кодирующая последовательность LysAp22 была слита с последовательностью, кодирующей 8-гистидиновую метку на С-конце.
Таблица 2. Последовательности праймеров, используемых для получения кодирующей последовательности LysAp22.
| 5'-AAGAAGGAGATATACATATGAGTATTAAGAATTTCTTTGATG-3' | |
| 5'-TGGTGGTGGTGGTGCTCGAGCTTCTTTAGAAATAAACTTCTTTCA-3' |
Таким образом, была получена генно-инженерная конструкция на основе вектора pET42b (+), кодирующая последовательность LysAp22, для дальнейшей экспрессии рекомбинантного фермента.
Пример 3. Получение рекомбинантного белка LysAp22 и его очистка.
Экспрессионный вектор помещали в компетентные клетки E. coli штамма BL21(DE3) pLysS с помощью протокола трансформации по методу «heat shock».
Клетки E. coli подращивали в среде LB (37°C, 240 rpm) до OD600 = 0,55-0,65 и проводили индукцию с помощью 1 мM ИПТГ при 37°C в течение 3 часов. Полученные клетки осаждали центрифугированием (6000 g, 10 мин, при 4°C), ресуспендировали в буфере, содержащем 20 мM Трис HCl pH 8,0, 250 мM NaCl, 0,1 мM ЭДТА), инкубировали с 100 мкл/мл лизоцима при комнатной температуре в течение 30 мин, а затем разрушали с помощью обработки ультразвуком. Полученный лизат центрифугировали при 10000 g в течение 30 мин при 4°C, а затем супернатант фильтровали через фильтр с размером пор 0.2 мкм. Очитка проводилась на хроматографе NGC Discovery™ 10 (Bio-Rad, США) с использованием колонки HisTrap FF на 5 мл (GE Healthcare, Германия), заряженной Ni2+ ионами. Лизат смешивали с 30 мM имидазола и 1 мM MgCl2 и наносили на колонку, предварительно уравновешенную с помощью буфера, содержащего 20 мM Трис HCl pH 8,0, 250 мM NaCl, 30 мM имидазола. Фракции белка элюировали с сорбента с помощью линейного градиента до 100% буфера, содержащего 20 мM Tрис HCl pH 8,0, 250 мM NaCl, 500 мM имидазола. Собранные фракции диализовали против буфера 20 мM Tрис HCl pH 7,5. Чистоту белка определяли с помощью электрофореза 16% SDS-PAGE.
Концентрацию белка определяли спектрофотометрически при длине волны 280 нм (Implen NanoPhotometer, IMPLEN, Германия). Концентрация рассчитывалась с учетом коэффициента поглощения E0,1% 280нм.
Таким образом, рекомбинантный эндолизин LysAp22 был получен биотехнологическим путем и подготовлен для дальнейших экспериментов по оценке бактерицидной активности.
Пример 4. Изучение антибактериальных свойств LysAp22.
Ночную культуру бактериальных клеток (OD600 = 1,2-1,4) использовали в качестве культуры бактерий в стационарной фазе роста или разбавляли в 30 раз средой LB и подращивали до экспоненциальной фазы роста (OD600 = 0,6). Клетки осаждали центрифугированием (3000 g, 10 мин) и ресуспендировали в таком же объеме 20 мM Tрис HCl pH 7,5. Суспензию разводили в 100 раз в том же буфере до конечной плотности около 106 клеток/мл. После 100 мкл бактериальной суспензии смешивали со 100 мкл белка в требуемой концентрации в 96-луночном планшете. В качестве отрицательного контроля использовали буфер без добавления белка. Смесь инкубировали при 37°C в течение 30 мин (на качалке 200 rpm) и затем разбавляли в 10 раз фосфатно-солевым буфером (pH 7,4). 100 мкл каждого разведения наносили на чашки Петри с агаризованной средой LB. Колонии на чашках подсчитывали после ночной инкубации (18 часов) при 37°С. Все эксперименты проводились в трех независимых повторностях.
Антибактериальную активность выражали в виде log10 от числа колоний, либо в виде остаточной активности LysAp22 (%) по сравнению с контролем без добавления фермента.
В ходе экспериментов по изучению антимикробных свойств LysAp22 было выявлено, что фермент оказывает бактерицидное действие на экспоненциально растущие клетки клинического штамма A. baumannii Ts 50-16 в концентрации от 0,5 мкг/мл (фиг.1). Однако при действии на бактерии в стационарной фазе роста бактерицидный эффект значительно снижается, предположительно, из-за снижения способности белка проникать сквозь наружную мембрану. При этом при добавлении веществ, увеличивающих проницаемость мембран, (0,5 мМ ЭДТА) литический эффект частично восстанавливается (фиг.2).
Пример 5. Изучения влияния рН, солей и буферов на активность LysAp22.
Влияние рН, солей и буферов (Трис HCl pH 7,5 и натрий или калий фосфатный буфер pH 7,5) на специфическую активность эндолизина оценивали на экспоненциально растущем штамме A. baumannii Ts 50-16. Для изучения влияния рН бактерии инкубировали с белком по вышеуказанному протоколу (Пример 3) в 20 мM Tрис HCl буфере с различными значениями рН (от 5.0 до 9.0). Эффект ЭДТА на бактерицидную активность при различных значениях pH оценивали с добавлением 0,5 мM пермеабилизатора во время инкубации бактериальной суспензии с эндолизином. При подборе оптимального для действия физиологичного буфера изучали 5, 10, 50 мM натрий или калий фосфатный буферы (pH 7,5). А для оценки влияния солей щелочных металлов к белку в 5 мM калий фосфатном буфере (pH 7,5) добавляли различные концентрации солей NaCl или KCl (0, 10, 25, 50, 100, 150, 250 и 500 мM).
Антибактериальную активность выражали в виде остаточной активности LysAp22 (%) по сравнению с контролем без добавления фермента.
Было показано, что при различных значениях рН оптимальными для действия фермента являются слабокислые, а также нейтральные и слабощелочные условия. При рН 6,5-7,0 наблюдается некоторое снижение активности, однако добавление 0,5 мМ ЭДТА элиминирует эффект рН (фиг.3).
Более физиологичным является 5 мМ калий фосфатный буфер (pH 7.5). При добавлении к LysAp22 в этом буфере различных концентраций NaCl и KCl начиная с 25 мМ для NaCl и 50 мМ для KCl, наблюдалось ингибирование действия фермента. Хотя в концентрации 250-500 мМ для обеих солей литический эффект частично восстанавливается (фиг.4).
Пример 6. Изучения спектра активности LysAp22.
Спектр активности фермента изучали по вышеуказанному протоколу в буфере 20 мM Tрис HCl (Пример 3) с использованием 16 штаммов грамотрицательных бактерий различных родов и видов и 2 штаммов грамположительных бактерий. Все использованные штаммы депонированы в коллекциях ФГБУ «Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н. Ф. Гамалеи» и Государственной коллекции патогенных микроорганизмов и клеточных культур (ГКПМ-Оболенск).
Таблица 3. Использованные в исследовании бактериальные штаммы и клинические изоляты и их источник получения.
| Бактериальный штамм | Источник |
| Pseudomonas aeruginosa Ts 38-16 | Мокрота пациента, госпитальный штамм |
| Pseudomonas aeruginosa Ts 43-16 | Раневое отделяемое, госпитальный штамм |
| Pseudomonas aeruginosa Ts 44-16 | Моча пациента, госпитальный штамм |
| Acinetobacter baumannii Ts 50-16 | Мокрота пациента, госпитальный штамм |
| Acinetobacter baumannii Ts 53-16 | Мокрота пациента, госпитальный штамм |
| Acinetobacter baumannii Ts 58-16 | Смыв с инфузомата, госпитальный штамм |
| Acinetobacter baumannii Ts 54-16 | Смыв с инфузомата, госпитальный штамм |
| Klebsiella pneumoniae Ts 141-14 | Моча пациента, госпитальный штамм |
| Klebsiella pneumoniae Ts 08-15 | Мокрота пациента, госпитальный штамм |
| Klebsiella pneumoniae F 104-14 | Мокрота пациента, госпитальный штамм |
| Klebsiella pneumoniae B3060 | Ликвор пациента, госпитальный штамм |
| Klebsiella pneumoniae Osh-2k | Кровь пациента, госпитальный штамм |
| Klebsiella pneumoniae I6208 | Смыв с носоглотки пациента, госпитальный штамм |
| Escherichia coli M15 | Лабораторный штамм |
| Salmonella typhi MVP 728 | Лабораторный штамм |
| Staphylococcus aureus Z 73-14 | Смыв с носоглотки пациента, госпитальный штамм |
| Staphylococcus haemolyticus G 58-0916 | Уретра пациента, госпитальный штамм |
| Escherichia coli BL21(DE3) pLysS | Лабораторный экспрессионный штамм |
Антибактериальную активность выражали в виде остаточной активности LysAp22 (%) по сравнению с контролем без добавления фермента.
Было показано, что LysAp22 оказывает бактерицидный эффект по отношению ко всем изученным штаммам, кроме грамположительного Staphylococcus aureus Z 73-14 (фиг.5).
На фигуре 1 показана бактерицидная активность различных концентраций LysAp22 против штамма A. baumannii Ts 50-16. В качестве контроля использовали клетки бактерий, инкубированные с буфером вместо белка. Число выживших колоний после 18 часов инкубации чашек Петри выражено в виде снижения log10 КОЕ/мл по сравнению с контролем. Для всех экспериментов показаны средние значения по стандартным отклонениям после трех независимых экспериментов. Звездочка (*) обозначает значимый бактерицидный эффект.
На фигуре 2 показана бактерицидная активность эндолизина LysAp22 в концентрациях 10 и 100 мкг/мл против штамма A. baumannii Ts 50-16 в экспоненциальной (Эксп) и стационарной (Ст) фазах роста без добавления и с добавлением 0,5 мМ ЭДТА. Приведена остаточная активность фермента (%) по сравнению с контролем. NS - нет статистически достоверного отличия от контрольной культуры без добавления эндолизина (p > 0,05, критерий Манна-Уитни). Для всех экспериментов показаны средние значения по стандартным отклонениям после трех независимых экспериментов. Звездочка (*) обозначает значимый бактерицидный эффект.
На фигуре 3 показано влияние pH и 0,5 мМ ЭДТА на антимикробную активность LysAp22 в концентрации 1 мкг/мл против A. baumannii Ts 50-16. Приведена остаточная активность фермента (%) по сравнению с контролем. NS - нет статистически достоверного отличия от контрольной культуры без добавления эндолизина (p > 0,05, критерий Манна-Уитни). Для всех экспериментов показаны средние значения по стандартным отклонениям после трех независимых экспериментов.
На фигуре 4 показано влияние солей на литическую активность LysAp22 в концентрации 10 мкг/мл против A. baumannii Ts 50-16. Приведена остаточная активность фермента (%) по сравнению с контролем. NS - нет статистически достоверного отличия от контрольной культуры без добавления эндолизина (p > 0,05, критерий Манна-Уитни). Все остальные значения статистически достоверно отличаются от контроля. Для всех экспериментов показаны средние значения по стандартным отклонениям после трех независимых экспериментов.
На фигуре 2 показана бактерицидная активность LysAp22 в концентрации 50 мкг/мл против различных штаммов грамотрицательных и грамположительных бактерий. Приведена остаточная активность фермента (%) по сравнению с контролем. НА - не было отмечено бактерицидной активности. Все значения статистически достоверно отличаются от контрольной культуры без добавления эндолизина (p < 0,05, критерий Манна-Уитни). Для всех экспериментов показаны средние значения по стандартным отклонениям после трех независимых экспериментов.
Список литературы
Abdelkader K. et al. The Preclinical and Clinical Progress of Bacteriophages and Their Lytic Enzymes: The Parts are Easier than the Whole // Viruses. - 2019. - Vol.11. - P.96.
Briers Y, Walmagh M, Lavigne R. Use of bacteriophage endolysin EL188 and outer membrane permeabilizers against Pseudomonas aeruginosa // J. Appl. Microbiol. - 2011. - Vol.110, №3. - P.778-785.
Briers Y. et al. Art-175 is a highly efficient antibacterial against multidrug-resistant strains and persisters of Pseudomonas aeruginosa // Antimicrob. Agents Chemother. - 2014. - Vol.58, №7. - P.3774-3784.
Briers Y. et al. Engineered endolysin-based “Artilysins” to combat multidrug-resistant gram-negative pathogens // mBio. - 2014. - Vol.5, №4. - e01379-14.
Dong H. et al. Activity of Stenotrophomonas maltophilia Endolysin P28 against both Gram-Positive and Gram-Negative Bacteria // Front Microbiol. - 2015. - Vol.6. - P.1299.
Fischetti V.A. Bacteriophage endolysins: A novel anti-infective to control Gram-positive pathogens // Int. J. Med. Microbiol. - 2010. - Vol.300, №6. - P.357-362.
Guo M. et al. A Novel Antimicrobial Endolysin, LysPA26, against Pseudomonas aeruginosa // Front Microbiol. - 2017. - Vol.8. - P.293.
Huang G. et al. Antibacterial properties of Acinetobacter baumannii phage Abp1 endolysin (PlyAB1) // BMC Infectious Diseases. - 2014. - Vol.14. - P.681.
Lai M.-J. et al. Antibacterial activity of Acinetobacter baumannii phage 6AB2 endolysin (LysAB2) against both Gram-positive and Gram-negative bacteria // Appl Microbiol Biotechnol. - 2011. - Vol.90. - P.529-539.
Larpin Y. et al. In vitro characterization of PlyE146, a novel phage lysin that targets Gram-negative bacteria // PLoS ONE. - 2018. - Vol.13, №2. - e0192507.
Matsuzaki S. et al. Bacteriophage therapy: a revitalized therapy against bacterial infectious diseases // J Infect Chemother. - 2005. - Vol.11. - P.211-219.
Oliveira H. et al. Phage-Derived Peptidoglycan Degrading Enzymes: Challenges and Future Prospects for In Vivo Therapy // Viruses. - 2018. - Vol.10. - P.292.
Prestinaci F., Pezzotti P., Pantosti A. Antimicrobial resistance: a global multifaceted phenomenon // Pathog. Glob. Health. - 2015. - Vol.109, №7. - P.309-318.
World Health Organization. Global priority list of antibiotic-resistant bacteria to guide research, discovery, and development of new antibiotics. - Geneva: WHO, 2017. - 7p.
Международный патент № 2011134998 A1, 03.11.2011.
Международный патент № 2015071437 A1, 21.05.2015.
Патент РФ № 2112800, 29.03.1996.
Патент РФ № 2113476, 29.03.1996.
Патент РФ № 2412243, 16.06.2009.
Патент РФ № 2439151, 24.06.2010.
Патент РФ № 2455355, 19.04.2011.
Патент РФ № 2455355, 29.04.2011.
Патент РФ № 2518303, 29.06.2012.
Патент РФ № 2628312, 16.03.2015.
Патент РФ № 2662985, 28.12.2015.
Патент США № 20160281074 A1, 29.09.2016.
Патент США № 8846865 B2, 30.09.2014.
Патент США № 8846865 B2, 30.09.2014.
--->
Перечень последовательностей
| <110> | Антонова Наталия Петровна, RU, Васина Дарья Владимировна, RU, Гинцбург Александр Леонидович, RU, Ткачук Артем Петрович, RU, Гущин Владимир Алексеевич,RU.(Antonova N.P., Vasina D.V., Gintsburg A.L., Tkachuk A.P., Guschin V.A.) |
| <120> | РЕКОМБИНАНТНЫЙ БЕЛОК LYSAР22, ЕГО ПРОИЗВОДНЫЕ, ОБЛАДАЮЩИЕ АНТИБАКТЕРИАЛЬНЫМ ДЕЙСТВИЕМ, НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ, В ТОМ ЧИСЛЕ ВЕКТОРА, КОДИРУЮЩИЕ БЕЛОК И ЕГО ПРОИЗВОДНЫЕ, ЭКСПРЕССИОННЫЕ ШТАММЫ ПРОДУЦЕНТЫ БЕЛКА И ЕГО ПРОИЗВОДНЫХ, АНТИБАКТЕРИАЛЬНЫЕ КОМПОЗИЦИИ, СОДЕРЖАЩИЕ ОЧИЩЕННЫЕ РЕКОМБИНАНТНЫЕ МОЛЕКУЛЫ ИЛИ ИХ ПРОИЗВОДНЫЕ В ЧИСТОМ ВИДЕ, А ТАКЖЕ В РАЗЛИЧНЫХ КОМБИНАЦИЯХ СМЕСЕЙ, ВКЛЮЧАЮЩИХ ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИ ПРИЕМЛЕМЫЕ НОСИТЕЛИ И \ ИЛИ ПЕРМЕАБИЛИЗАТОРЫ, А ТАКЖЕ ИХ ПРИМЕНЕНИЕ ДЛЯ АНТИМИКРОБНОЙ ТЕРАПИИ |
| <160> | 4 |
| <210> | 1 |
| <211> | 184 |
| <212> | PRT |
| <213> | Бактериофаг AP22 |
| <223> | Аминокислотная последовательность эндолизина бактериофага AP22 |
| <400> | MSIKNFFDAA RQIAGGKLTQ AQVDDLNKVI DRLSPSGMTT SDTGINLIST FEGTRLTAYD 60 DGVGVWTIGI GTTIYPNGTK VKKGDTCTSE QAKTYFKHDL VKFENVVNES VKVPLSQNQF 120 DALVSLTYNI GSGAFKNSTL LKLLNNGDYQ GAADQFPAWK KAGGRVLEGL VKRRAAERSL 180 FLKK 184 |
| <210> | 2 |
| <211> | 555 |
| <212> | DNA |
| <213> | Бактериофаг AP22 |
| <223> | Нуклеотидная последовательность, кодирующая эндолизин бактериофага AP22 |
| <400> | ATGAGTATTA AGAATTTCTT TGATGCTGCG CGCCAAATTG CTGGTGGCAA ACTTACACAA 60 GCACAAGTTG ACGATCTAAA CAAAGTGATT GATCGACTTT CACCTTCTGG AATGACCACA 120 AGTGATACTG GCATCAATCT AATTTCTACT TTTGAAGGAA CTAGATTAAC TGCATATGAT 180 GATGGTGTTG GCGTGTGGAC TATCGGCATA GGTACAACCA TCTACCCAAA TGGTACAAAA 240 GTTAAGAAAG GCGATACATG TACATCTGAA CAAGCAAAAA CCTACTTCAA ACATGATTTA 300 GTTAAGTTTG AAAATGTTGT AAATGAATCC GTTAAAGTTC CACTTAGTCA GAATCAATTT 360 GATGCTCTAG TGTCACTGAC CTACAACATC GGCTCAGGTG CTTTTAAAAA TTCAACTTTA 420 CTCAAGCTTC TTAACAATGG CGATTATCAA GGTGCTGCCG ATCAATTCCC AGCATGGAAA 480 AAAGCTGGTG GTCGAGTTCT TGAAGGTTTA GTTAAGCGCC GTGCTGCTGA AAGAAGTTTA 540 TTTCTAAAGA AGTAA 555 |
| <210> | 3 |
| <211> | 194 |
| <212> | PRT |
| <213> | pET42b (+) LysAp22 |
| <223> | Аминокислотная последовательность рекомбинантного эндолизина LysAp22, содержащего 8-гистидиновую метку |
| <400> | MSIKNFFDAA RQIAGGKLTQ AQVDDLNKVI DRLSPSGMTT SDTGINLIST FEGTRLTAYD 60 DGVGVWTIGI GTTIYPNGTK VKKGDTCTSE QAKTYFKHDL VKFENVVNES VKVPLSQNQF 120 DALVSLTYNI GSGAFKNSTL LKLLNNGDYQ GAADQFPAWK KAGGRVLEGL VKRRAAERSL 180 FLKKLEHHHH HHHH 194 |
| <210> | 4 |
| <211> | 585 |
| <212> | DNA |
| <213> | pET42b (+) LysAp22 |
| <223> | Нуклеотидная последовательность, кодирующая рекомбинантный эндолизин LysAp22, содержащий 8-гистидиновую метку |
| <400> | ATGAGTATTA AGAATTTCTT TGATGCTGCG CGCCAAATTG CTGGTGGCAA ACTTACACAA 60 GCACAAGTTG ACGATCTAAA CAAAGTGATT GATCGACTTT CACCTTCTGG AATGACCACA 120 AGTGATACTG GCATCAATCT AATTTCTACT TTTGAAGGAA CTAGATTAAC TGCATATGAT 180 GATGGTGTTG GCGTGTGGAC TATCGGCATA GGTACAACCA TCTACCCAAA TGGTACAAAA 240 GTTAAGAAAG GCGATACATG TACATCTGAA CAAGCAAAAA CCTACTTCAA ACATGATTTA 300 GTTAAGTTTG AAAATGTTGT AAATGAATCC GTTAAAGTTC CACTTAGTCA GAATCAATTT 360 GATGCTCTAG TGTCACTGAC CTACAACATC GGCTCAGGTG CTTTTAAAAA TTCAACTTTA 420 CTCAAGCTTC TTAACAATGG CGATTATCAA GGTGCTGCCG ATCAATTCCC AGCATGGAAA 480 AAAGCTGGTG GTCGAGTTCT TGAAGGTTTA GTTAAGCGCC GTGCTGCTGA AAGAAGTTTA 540 TTTCTAAAGA AGCTCGAGCA CCACCACCAC CACCACCACC ACTAA 585 |
<---
Claims (4)
1. Антибактериальная композиция, обладающая антибактериальным эффектом в отношении бактерий: Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli, Salmonella typhi и Staphylococcus haemolyticus, включающая эффективное количество белка SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 3 и фармацевтически приемлемый носитель.
2. Антибактериальная композиция, обладающая антибактериальным эффектом в отношении бактерий: Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli, Salmonella typhi и Staphylococcus haemolyticus, включающая эффективное количество белка SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 3, фармацевтически приемлемые носители и пермеабилизаторы, выбранные из этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) и/или ее солей.
3. Применение белка SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 3 в качестве антимикробного средства, направленного против бактерий Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli, Salmonella typhi и Staphylococcus haemolyticus в чистом виде.
4. Применение белка SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 3 в комбинации с фармацевтически приемлемыми носителями и/или веществами, увеличивающими проницаемость мембран, в качестве антимикробного средства, направленного против бактерий: Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli, Salmonella typhi и Staphylococcus haemolyticus.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2019114136A RU2730614C1 (ru) | 2019-05-08 | 2019-05-08 | Антибактериальная композиция (варианты) и применение белка в качестве антимикробного средства, направленного против бактерий Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli, Salmonella typhi и Staphylococcus haemolyticus (варианты) |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2019114136A RU2730614C1 (ru) | 2019-05-08 | 2019-05-08 | Антибактериальная композиция (варианты) и применение белка в качестве антимикробного средства, направленного против бактерий Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli, Salmonella typhi и Staphylococcus haemolyticus (варианты) |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2730614C1 true RU2730614C1 (ru) | 2020-08-24 |
Family
ID=72238023
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2019114136A RU2730614C1 (ru) | 2019-05-08 | 2019-05-08 | Антибактериальная композиция (варианты) и применение белка в качестве антимикробного средства, направленного против бактерий Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli, Salmonella typhi и Staphylococcus haemolyticus (варианты) |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2730614C1 (ru) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2790481C1 (ru) * | 2021-09-28 | 2023-02-21 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Центр стратегического планирования и управления медико-биологическими рисками здоровью" Федерального медико-биологического агентства | Антибактериальная композиция на основе эндолизинов и лекарственные средства в форме геля или спрея с ее использованием |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2439151C1 (ru) * | 2010-06-24 | 2012-01-10 | Федеральное государственное учреждение науки Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии (ФГУН ГНЦ ПМБ) | ШТАММ БАКТЕРИОФАГА Acinetobacter baumannii АР22 ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ БАКТЕРИЙ Acinetobacter baumannii ПРИ БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКОМ АНАЛИЗЕ КЛИНИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА И ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕПАРАТА ПРОТИВ ВНУТРИБОЛЬНИЧНЫХ A.baumannii-ИНФЕКЦИЙ |
| US8846865B2 (en) * | 2009-08-24 | 2014-09-30 | Lysando Ag | Endolysin OBPgpLYS |
| RU2628312C2 (ru) * | 2015-03-16 | 2017-08-15 | Общество с ограниченной ответственностью "БиФаг" | Композиция антибактериальная для профилактики или лечения госпитальных инфекций (варианты), штаммы бактериофагов, используемые для получения такой композиции |
-
2019
- 2019-05-08 RU RU2019114136A patent/RU2730614C1/ru active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US8846865B2 (en) * | 2009-08-24 | 2014-09-30 | Lysando Ag | Endolysin OBPgpLYS |
| RU2439151C1 (ru) * | 2010-06-24 | 2012-01-10 | Федеральное государственное учреждение науки Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии (ФГУН ГНЦ ПМБ) | ШТАММ БАКТЕРИОФАГА Acinetobacter baumannii АР22 ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ БАКТЕРИЙ Acinetobacter baumannii ПРИ БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКОМ АНАЛИЗЕ КЛИНИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА И ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕПАРАТА ПРОТИВ ВНУТРИБОЛЬНИЧНЫХ A.baumannii-ИНФЕКЦИЙ |
| RU2628312C2 (ru) * | 2015-03-16 | 2017-08-15 | Общество с ограниченной ответственностью "БиФаг" | Композиция антибактериальная для профилактики или лечения госпитальных инфекций (варианты), штаммы бактериофагов, используемые для получения такой композиции |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| БД "GenBank" последовательность под номером CCH57765.1, размещена 14.05.2012. БД "GenBank" последовательность под номером NC_017984, размещена 04.05.2012. * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2790481C1 (ru) * | 2021-09-28 | 2023-02-21 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Центр стратегического планирования и управления медико-биологическими рисками здоровью" Федерального медико-биологического агентства | Антибактериальная композиция на основе эндолизинов и лекарственные средства в форме геля или спрея с ее использованием |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Düzgüneş et al. | Bacteriophage therapy of bacterial infections: the rediscovered frontier | |
| Gupta et al. | Efficacy of polyvalent bacteriophage P-27/HP to control multidrug resistant Staphylococcus aureus associated with human infections | |
| CN102575240B (zh) | 新的细胞内溶素OBPgpLYS | |
| JP6034187B2 (ja) | 抗微生物剤 | |
| RU2580248C2 (ru) | Бактериофаг, обладающий активностью против pseudomonas aeruginosa, белки бактериофага и способы их применения | |
| JP6769871B2 (ja) | Ｅ．ｃｏｌｉ感染のファージを用いての治療 | |
| CN108697744B (zh) | 假单胞菌感染的噬菌体疗法 | |
| JP6495821B2 (ja) | ペプチドおよびそれらの使用 | |
| JP2016208985A (ja) | バイオフィルムの低減方法 | |
| CN101977616B (zh) | 制备噬菌体混合物的方法以及该噬菌体混合物在抗生素抗性葡萄球菌治疗中的用途 | |
| JP2023182703A (ja) | Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ感染症を処置するための治療的バクテリオファージ組成物 | |
| US11690885B2 (en) | Anti-bacterial compositions and uses thereof | |
| Lim et al. | Eradication of drug-resistant Acinetobacter baumannii by cell-penetrating peptide fused endolysin | |
| US20220073567A1 (en) | Acinetobacter baumannii bacteriophage mikab48 or lytic protein derived from the bacteriophage | |
| RU2730615C1 (ru) | Антибактериальная композиция (варианты) и применение белка в качестве антимикробного средства, направленного против грамотрицательных бактерий: Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumannii, Klebsiella pneumoniae и Salmonella typhi (варианты) | |
| CN105963680B (zh) | 用于抑制/瓦解生物被膜的抑制剂及其应用 | |
| US10435671B2 (en) | Bacteriophage strains against proteus mirabilis and use thereof | |
| CN114401735A (zh) | 抗微生物的、细菌噬菌体来源的多肽及其针对革兰氏阴性和抗酸细菌的用途 | |
| RU2730614C1 (ru) | Антибактериальная композиция (варианты) и применение белка в качестве антимикробного средства, направленного против бактерий Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli, Salmonella typhi и Staphylococcus haemolyticus (варианты) | |
| RU2730613C1 (ru) | Антибактериальная композиция (варианты) и применение белка в качестве антимикробного средства, направленного против бактерий Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli, Salmonella typhi и Staphylococcus haemolyticus (варианты) | |
| RU2730616C1 (ru) | Антибактериальная композиция (варианты) и применение белка в качестве антимикробного средства, направленного против бактерий Acinetobacter baumannii, (варианты) | |
| US20220024992A1 (en) | Compositions and methods comprising lysocins as bioengineered antimicrobials for use in targeting gram-negative bacteria | |
| Homem et al. | Potential biomolecules of microbial origin against infectious diseases | |
| RU2703043C1 (ru) | Литический фермент бактериофага и антибактериальная композиция на его основе | |
| WO2016146037A1 (zh) | 用于抑制/瓦解生物被膜的抑制剂及其应用 |