RU2737487C1 - Genetic engineering structure for angiogenesis stimulation - Google Patents
Genetic engineering structure for angiogenesis stimulation Download PDFInfo
- Publication number
- RU2737487C1 RU2737487C1 RU2019135603A RU2019135603A RU2737487C1 RU 2737487 C1 RU2737487 C1 RU 2737487C1 RU 2019135603 A RU2019135603 A RU 2019135603A RU 2019135603 A RU2019135603 A RU 2019135603A RU 2737487 C1 RU2737487 C1 RU 2737487C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- gene
- hhgfopt
- dna
- seq
- oligonucleotide
- Prior art date
Links
- 230000033115 angiogenesis Effects 0.000 title claims abstract description 25
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 title claims description 6
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 title abstract description 3
- 108010073929 Vascular Endothelial Growth Factor A Proteins 0.000 claims abstract description 71
- 108010019530 Vascular Endothelial Growth Factors Proteins 0.000 claims abstract description 71
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 68
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims abstract description 63
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 claims abstract description 23
- 230000000302 ischemic effect Effects 0.000 claims abstract description 17
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims abstract description 15
- 101000834253 Gallus gallus Actin, cytoplasmic 1 Proteins 0.000 claims abstract description 10
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 claims abstract description 9
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims abstract description 6
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims abstract description 5
- 108090000100 Hepatocyte Growth Factor Proteins 0.000 claims description 66
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 claims description 26
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 17
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 14
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims description 11
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 claims description 11
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 10
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 8
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 8
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 8
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 claims description 6
- 108010006025 bovine growth hormone Proteins 0.000 claims description 6
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 5
- 238000013461 design Methods 0.000 claims description 5
- 230000010076 replication Effects 0.000 claims description 5
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 claims description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 239000008354 sodium chloride injection Substances 0.000 claims description 3
- 239000013543 active substance Substances 0.000 claims description 2
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 claims description 2
- 239000008215 water for injection Substances 0.000 claims description 2
- 102000005789 Vascular Endothelial Growth Factors Human genes 0.000 abstract description 61
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 abstract description 11
- 101000898034 Homo sapiens Hepatocyte growth factor Proteins 0.000 abstract description 8
- 102000057308 human HGF Human genes 0.000 abstract description 8
- 101000808011 Homo sapiens Vascular endothelial growth factor A Proteins 0.000 abstract description 7
- 230000002491 angiogenic effect Effects 0.000 abstract description 7
- 101150022655 HGF gene Proteins 0.000 abstract description 5
- 230000012010 growth Effects 0.000 abstract description 5
- 230000036770 blood supply Effects 0.000 abstract description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 abstract description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 abstract description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 3
- 238000007634 remodeling Methods 0.000 abstract description 2
- 208000026062 Tissue disease Diseases 0.000 abstract 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 abstract 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 abstract 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 99
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 90
- 102000003745 Hepatocyte Growth Factor Human genes 0.000 description 58
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 30
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 26
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 20
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 15
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 13
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 13
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 13
- 108020004684 Internal Ribosome Entry Sites Proteins 0.000 description 12
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 12
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 12
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 12
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 11
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 11
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 11
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 10
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 10
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 10
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 10
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 10
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 9
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 9
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 9
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 9
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 9
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 8
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 8
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 7
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 7
- 108010082117 matrigel Proteins 0.000 description 7
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 7
- 210000002027 skeletal muscle Anatomy 0.000 description 7
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 7
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 6
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 6
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 6
- 102000058223 human VEGFA Human genes 0.000 description 5
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 5
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 5
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 5
- 241000620209 Escherichia coli DH5[alpha] Species 0.000 description 4
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 4
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 4
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 4
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 4
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 4
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 4
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 3
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 3
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 3
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 3
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 3
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 3
- 208000029078 coronary artery disease Diseases 0.000 description 3
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 3
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 3
- 210000003141 lower extremity Anatomy 0.000 description 3
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 3
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 3
- 208000032064 Chronic Limb-Threatening Ischemia Diseases 0.000 description 2
- 108020004638 Circular DNA Proteins 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108090000379 Fibroblast growth factor 2 Proteins 0.000 description 2
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 2
- 241000428086 Mahanarva tibialis Species 0.000 description 2
- 241000702623 Minute virus of mice Species 0.000 description 2
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 2
- 206010034576 Peripheral ischaemia Diseases 0.000 description 2
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 2
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 2
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 2
- 108020005091 Replication Origin Proteins 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 2
- 238000002659 cell therapy Methods 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 2
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 201000002818 limb ischemia Diseases 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 239000000902 placebo Substances 0.000 description 2
- 229940068196 placebo Drugs 0.000 description 2
- 230000026341 positive regulation of angiogenesis Effects 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- 239000008174 sterile solution Substances 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000001320 Atherosclerosis Diseases 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 241000710188 Encephalomyocarditis virus Species 0.000 description 1
- 102000003971 Fibroblast Growth Factor 1 Human genes 0.000 description 1
- 108090000386 Fibroblast Growth Factor 1 Proteins 0.000 description 1
- 102000003974 Fibroblast growth factor 2 Human genes 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- 101000739876 Homo sapiens Brain-derived neurotrophic factor Proteins 0.000 description 1
- 101000638886 Homo sapiens Urokinase-type plasminogen activator Proteins 0.000 description 1
- 108010003272 Hyaluronate lyase Proteins 0.000 description 1
- 102000001974 Hyaluronidases Human genes 0.000 description 1
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 1
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 1
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 1
- 239000012097 Lipofectamine 2000 Substances 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- 108091061960 Naked DNA Proteins 0.000 description 1
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 1
- 208000034038 Pathologic Neovascularization Diseases 0.000 description 1
- 241001483952 Peach chlorotic mottle virus Species 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 208000006011 Stroke Diseases 0.000 description 1
- 241000271705 Trigonopterus tibialis Species 0.000 description 1
- 208000025865 Ulcer Diseases 0.000 description 1
- 102100039037 Vascular endothelial growth factor A Human genes 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 239000002870 angiogenesis inducing agent Substances 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 229940121375 antifungal agent Drugs 0.000 description 1
- 239000003429 antifungal agent Substances 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 239000012062 aqueous buffer Substances 0.000 description 1
- 238000004500 asepsis Methods 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000721 bacterilogical effect Effects 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000031018 biological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- BPKIGYQJPYCAOW-FFJTTWKXSA-I calcium;potassium;disodium;(2s)-2-hydroxypropanoate;dichloride;dihydroxide;hydrate Chemical compound O.[OH-].[OH-].[Na+].[Na+].[Cl-].[Cl-].[K+].[Ca+2].C[C@H](O)C([O-])=O BPKIGYQJPYCAOW-FFJTTWKXSA-I 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 230000004186 co-expression Effects 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- -1 coatings Substances 0.000 description 1
- 238000010835 comparative analysis Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 1
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 239000002612 dispersion medium Substances 0.000 description 1
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 1
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 1
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 230000035876 healing Effects 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 description 1
- 102000051542 human BDNF Human genes 0.000 description 1
- 229940077456 human brain-derived neurotrophic factor Drugs 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 229960002773 hyaluronidase Drugs 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 238000010874 in vitro model Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000036512 infertility Effects 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 208000028867 ischemia Diseases 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 239000007951 isotonicity adjuster Substances 0.000 description 1
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 1
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 230000002107 myocardial effect Effects 0.000 description 1
- 208000031225 myocardial ischemia Diseases 0.000 description 1
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 230000009963 pathologic angiogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000010412 perfusion Effects 0.000 description 1
- 238000011170 pharmaceutical development Methods 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 1
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 1
- 238000011287 therapeutic dose Methods 0.000 description 1
- 230000000451 tissue damage Effects 0.000 description 1
- 231100000827 tissue damage Toxicity 0.000 description 1
- 210000005239 tubule Anatomy 0.000 description 1
- 230000006444 vascular growth Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
- C07K14/515—Angiogenesic factors; Angiogenin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
- A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
- C07K14/4753—Hepatocyte growth factor; Scatter factor; Tumor cytotoxic factor II
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Vascular Medicine (AREA)
- Toxicology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Heart & Thoracic Surgery (AREA)
- Cardiology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Description
Область техники, к которой относится изобретениеThe technical field to which the invention relates
Изобретение относится к области фармацевтики и биотехнологии, и может быть использовано для усиления роста новых сосудов в ишемизированных тканях. Изобретение представляет собой плазмидную бицистронную конструкцию, несущую ген hHGF фактора роста гепатоцитов человека и ген hVEGF165 фактора роста эндотелия сосудов. Заявляемая бицистронная конструкция может быть использована как лекарственное средство в медицинских целях для обеспечения стимуляции ангиогенеза, роста и ремоделирования сосудов, а также восстановления кровоснабжения в ишемизированных тканях, для лечения ряда заболеваний человека, обусловленных нарушением кровоснабжения тканей.The invention relates to the field of pharmaceuticals and biotechnology, and can be used to enhance the growth of new vessels in ischemic tissues. The invention is a plasmid bicistronic construct carrying the hHGF gene of human hepatocyte growth factor and the hVEGF165 gene of vascular endothelial growth factor. The claimed bicistronic construction can be used as a drug for medical purposes to stimulate angiogenesis, vascular growth and remodeling, as well as restore blood supply in ischemic tissues, for the treatment of a number of human diseases caused by impaired blood supply to tissues.
Уровень техникиState of the art
Ишемическая болезнь сердца (ИБС) и критическая ишемия нижних конечностей (КИНК), наряду с ишемическими нарушениями мозгового кровообращения, в настоящее время относят к основным причинам инвалидизации и смертности населения.Ischemic heart disease (CHD) and critical lower limb ischemia (CLI), along with ischemic cerebrovascular accidents, are currently considered the main causes of disability and mortality.
Одним из перспективных способов лечения КИНК является «терапевтический ангиогенез» - стимуляция роста новых кровеносных сосудов с помощью генной терапии. Для индукции ангиогенеза в ишемизированной скелетной мускулатуре было предложено использовать плазмидные конструкции, несущие кДНК генов b-FGF, VEGF165, HGF и других факторов роста. Безопасность таких конструкций была показана во многих исследованиях [Pavel Igorevich Makarevich and Yelena Viktorovna Parfyonova (April 5th 2017). Therapeutic Angiogenesis: Foundations and Practical Application, Physiologic and Pathologic Angiogenesis, Dan Simionescu and Agneta Simionescu, IntechOpen, DOI: 10.5772/66411].One of the promising methods of treating CLI is "therapeutic angiogenesis" - stimulation of the growth of new blood vessels using gene therapy. For the induction of angiogenesis in ischemic skeletal muscles, it was proposed to use plasmid constructs carrying cDNA of genes b-FGF, VEGF165, HGF and other growth factors. The safety of such structures has been shown in many studies [Pavel Igorevich Makarevich and Yelena Viktorovna Parfyonova (April 5 th 2017). Therapeutic Angiogenesis: Foundations and Practical Application, Physiologic and Pathologic Angiogenesis, Dan Simionescu and Agneta Simionescu, IntechOpen, DOI: 10.5772 / 66411].
В 2011 году на территории РФ был зарегистрирован препарат "Неоваскулген", представляющий собой плазмиду, кодирующую фактор роста эндотелия сосудов (pCMV-VEGF165), его эффективность и безопасность в комплексной терапии пациентов с хронической ишемией нижних конечностей была доказана в ходе клинических исследований. Результат клинического исследования 2б-3 фазы с участием 100 пациентов показал значительное улучшение их функционального состояния, что выражалось достоверным увеличением дистанции безболевой ходьбы на 110%. Отсроченное наблюдение не выявило каких-либо побочных эффектов, связанных с применением препарата и показало, что терапевтический эффект после стандартного курса терапии сохраняется на протяжении трех лет. Селективный анализ эффективности терапевтического ангиогенеза у пациентов с фоновым СД (n=15), которые участвовали в исследовании, показал достоверное увеличении дистанции безболевой ходьбы на 202% через 6 месяцев после стандартного курса терапии.In 2011, the drug "Neovasculgen" was registered on the territory of the Russian Federation, which is a plasmid encoding vascular endothelial growth factor (pCMV-VEGF165), its efficacy and safety in the complex therapy of patients with chronic lower limb ischemia has been proven in clinical trials. The result of a clinical study of phases 2b-3 with the participation of 100 patients showed a significant improvement in their functional state, which was expressed by a significant increase in the distance of painless walking by 110%. Delayed follow-up did not reveal any side effects associated with the use of the drug and showed that the therapeutic effect after a standard course of therapy persists for three years. A selective analysis of the effectiveness of therapeutic angiogenesis in patients with background diabetes (n = 15) who participated in the study showed a significant increase in painless walking distance by 202% 6 months after the standard course of therapy.
Весной 2019 года Министерство здравоохранения, труда и социального обеспечения Японии (MHLW) разрешило применение генотерапевтического препарата Collatagene компании AnGes, основываясь на результатах успешно завершившихся клинических исследований. Активным компонентом препарата является плазмида с геном фактора роста гепатоцитов - HGF, который обладает ангиогенными свойствами, препарат переназначен для лечения критической ишемии нижних конечностей (КИНК). В ходе предыдущего плацебо-контролируемого рандомизированного исследования 2 фазы было показано, что его применение обеспечивает достоверное улучшение функционального состояния пациентов с КИНК, что выражается в снижении выраженности болевого синдрома и увеличении частоты заживления язвенных дефектов (Shigematsu Н., Yasuda К., Iwai Т., Sasajima Т., Ishimaru S., Ohashi Y., Yamaguchi Т., Ogihara Т., Morishita R. Randomized, double-blind, placebo-controlled clinical trial of hepatocyte growth factor plasmid for critical limb ischemia // Gene Ther. 2010. T. 17. №9. - С. 1152-1161). Китайскими учеными в ходе 1 фазы открытого клинического исследования с участием 21 пациента с КИНК на фоне облитерирующего атеросклероза была доказана безопасность плазмиды с генами двух изоформ HGF. Также были получены предварительные данные об эффективности, которые выражались в увеличение показателей транскутанного напряжения кислорода и лодыжечно-плечевого индекса (A phase I clinical study of naked DNA expressing two isoforms of hepatocyte growth factor to treat patients with critical limb ischemia / Y. Gu, J. Zhang, L. Guo, S. Cui // J. Gene Medicine. - 2011. - Vol. 13. P. 602-610).In the spring of 2019, the Japanese Ministry of Health, Labor and Welfare (MHLW) approved AnGes' Collatagene gene therapy based on the results of successful clinical trials. The active component of the drug is a plasmid with the hepatocyte growth factor gene - HGF, which has angiogenic properties, the drug has been reassigned for the treatment of critical ischemia of the lower extremities (CLLI). In the course of a previous placebo-controlled, randomized
Стоит учитывать, что ангиогенез - это многоэтапный процесс, и каждый этап находится под контролем различных цитокинов и факторов роста, поэтому применение только одного ангиогенного фактора (как в виде рекомбинантного белка, так и виде генетической конструкции) не позволяет добиться значительных результатов.It should be borne in mind that angiogenesis is a multi-stage process, and each stage is under the control of various cytokines and growth factors; therefore, the use of only one angiogenic factor (both in the form of a recombinant protein and in the form of a genetic construct) does not allow achieving significant results.
Известно использование в терапевтическом ангиогенезе комплексного введения нескольких плазмид, кодирующих разные ангиогенные факторы роста (АФР), в комбинации друг с другом.It is known to use in therapeutic angiogenesis the complex introduction of several plasmids encoding different angiogenic growth factors (PRGs) in combination with each other.
Из уровня техники известно средство для стимуляции ангиогенеза в ишемизиро-ванной ткани, содержащее смесь в растворе 0,9%-ного NaCl плазмидных конструкций pC4W-hVEGFopt, несущую оптимизированный ген hVEGFopt фактора роста эндотелия сосудов, и pC4W-hHGFopt, несущую оптимизированный ген hHGFopt фактора роста гепатоцитов (патент РФ №2449799, 10.05.2012). Эффективный ангиогенез в ишемизированной ткани, достигается при использовании данного средства в массовом соотношении плазмидных конструкций pC4W-hVEGFopt и pC4W-hHGFopt от 1:3 до 3:1. Лучшие результаты достигались при их массовом соотношении 1:1.An agent for stimulating angiogenesis in ischemic tissue is known from the prior art, containing a mixture in a solution of 0.9% NaCl of plasmid constructs pC4W-hVEGFopt, carrying the optimized gene hVEGFopt of vascular endothelial growth factor, and pC4W-hHGFopt, carrying the optimized gene of the factor hHGFopt growth of hepatocytes (RF patent No. 2449799, 05/10/2012). Effective angiogenesis in ischemic tissue is achieved when using this agent in a mass ratio of the plasmid constructs pC4W-hVEGFopt and pC4W-hHGFopt from 1: 3 to 3: 1. The best results were achieved with a 1: 1 weight ratio.
Существенными недостатками введения смеси векторов является низкая вероятность котрансфекции клеток двумя плазмидами, различия экспрессии вводимых генов и снижение эффективности их совместного действия. Кроме того, при введении смеси плазмид не представляется возможным предсказать эффективность трансфекции клеток каждым из векторов, описать их фармакокинетику и конечную концентрацию кодируемых АФР, что значительно затрудняет фармацевтическую разработку лекарственных средств на основе комбинации двух и более генетических конструкций. Для ко-экспрессии двух и более генов разрабатываются мультицистронные конструкции, например, векторы, включающие внутренние сайты посадки рибосом (IRES). Плазмиды, несущие IRES, позволяют осуществлять одновременную экспрессию нескольких генов, однако, эффективность трансляции, обеспечиваемой IRES, обычно существенно уступает кэп-зависимой инициации, а конечное соотношение концентраций синтезируемых белков варьирует в зависимости от выбранного IRES. Группой польских ученых было проведено клиническое исследование плазмидной конструкции, несущей гены VEGFA и FGF2, разделенные последовательностью IRES вируса EMCV, для лечения ишемической болезни сердца [Kukula К, Chojnowska L, Dabrowski М, Witkowski A, Chmielak Z, Skwarek M, Kadziela J, Teresinska A, Malecki M, Janik P, et al. Intramyocardial plasmid-encoding human vascular endothelial growth factor A165/basic fibroblast growth factor therapy using percutaneous transcatheter approach in patients with refractory coronary artery disease (VIF-CAD) Am Heart J. 2011;161:581-589]. Введение плазмиды не привело к улучшению перфузии миокарда, однако, улучшились переносимость физической нагрузки и клинические проявления болезни.Significant disadvantages of introducing a mixture of vectors are the low probability of cotransfection of cells with two plasmids, differences in the expression of the introduced genes, and a decrease in the efficiency of their combined action. In addition, when a mixture of plasmids is introduced, it is not possible to predict the efficiency of cell transfection with each of the vectors, to describe their pharmacokinetics and the final concentration of encoded AFRs, which significantly complicates the pharmaceutical development of drugs based on a combination of two or more genetic constructs. For the co-expression of two or more genes, multicistronic constructs are being developed, for example, vectors that include internal ribosome entry sites (IRES). Plasmids carrying IRES allow simultaneous expression of several genes; however, the translation efficiency provided by IRES is usually significantly inferior to cap-dependent initiation, and the final ratio of the concentrations of synthesized proteins varies depending on the selected IRES. A group of Polish scientists conducted a clinical study of a plasmid construct carrying the VEGFA and FGF2 genes, separated by the IRES sequence of the EMCV virus, for the treatment of coronary artery disease [Kukula K, Chojnowska L, Dabrowski M, Witkowski A, Chmielak Z, Skwarek M, Kadzinskaa J, Te A, Malecki M, Janik P, et al. Intramyocardial plasmid-encoding human vascular endothelial growth factor A165 / basic fibroblast growth factor therapy using percutaneous transcatheter approach in patients with refractory coronary artery disease (VIF-CAD) Am Heart J. 2011; 161: 581-589]. Plasmid administration did not improve myocardial perfusion, however, exercise tolerance and clinical manifestations of the disease improved.
Наиболее близким к заявляемому решению является плазмидная конструкция, в которых гены факторов роста HGF и VEGF165 разделены сайтом внутренней посадки рибосом - IRES [Слободкина Е.А., Нимирицкий П.П., Долинкин А.О., Макаревич П.И., Парфенова Е.В. Разработка генотерапевтической плазмидной конструкции, кодирующей фактор роста гепатоцитов (HGF) и фактор роста эндотелия сосудов (VEGF165), Гены и Клетки - Материалы III Национального Конгресса по Регенеративной Медицине. Москва, 15-18 ноября 2017 года, серия 3, место издания Институт Стволовых Клеток Человека, Москва, Россия Москва, том 12, тезисы]. Общая схема данной плазмиды представлена на фиг. 1. Генно-инженерная конструкция, представляет собой экспрессионную векторную плазмиду, в которую клонированы вставки кДНК, кодирующие фактор роста эндотелия сосудов и фактор роста гепатоцитов, и содержит:The closest to the claimed solution is a plasmid construct, in which the genes of growth factors HGF and VEGF165 are separated by the site of internal ribosome entry - IRES [Slobodkina E.A., Nimiritsky P.P., Dolinkin A.O., Makarevich P.I., Parfenova E.V. Development of a gene therapy plasmid construct encoding hepatocyte growth factor (HGF) and vascular endothelial growth factor (VEGF165), Genes and Cells - Proceedings of the III National Congress on Regenerative Medicine. Moscow, November 15-18, 2017, series 3, place of publication Human Stem Cell Institute, Moscow, Russia Moscow,
Основные элементы конструкции:Main structural elements:
последовательность гена HGFHGF gene sequence
последовательность гена VEGF165VEGF165 gene sequence
последовательность IRES (различные варианты)IRES sequence (various options)
Регуляторные элементы экспрессии и трансляции конструкции:Regulatory elements of expression and translation of the construct:
Энхансер 1 - CMV enhancerEnhancer 1 - CMV enhancer
Промотор pCMV (промотор цитомегаловируса)PCMV promoter (cytomegalovirus promoter)
Терминатор - bGH poly А (участок полиаденилирования гена бычьего гормона роста)Terminator - bGH poly A (bovine growth hormone gene polyadenylation site)
Регуляторные элементы экспрессии и трансляции конструкции в бактерии Е. coli:Regulatory elements of the expression and translation of the construct in E. coli bacteria:
Точка начала репликации (ori)Replication origin (ori)
Селективный маркер для отбора трансформированных бактерий: - ген устойчивости к канамицину.Selective marker for the selection of transformed bacteria: - kanamycin resistance gene.
Однако данная плазмида не обеспечивает синтез достаточных количеств ангиогенных факторов роста ни in vitro, так, например, концентрации HGF и VEGF165 in vitro (в среде культивирования клеток линии НЕК293Т после их трансфекции) составляют не более 2,72 нМ и 1,6 нМ для HGF и VEGF165 соответственно. При этом соотношение концентраций HGF и VEGF165 непредсказуемо и в среднем составляет от 1:12 до 1:5 в зависимости от используемого IRES. Также данная плазмида не обеспечивает синтез достаточных количеств ангиогенных факторов роста ни in vitro ни при введении мышам – не более 0,72 нг/мл и вплоть до полного отсутствия. Следовательно, данный вектор не обладает параметрами, необходимыми для его использования в качестве экспрессионной конструкции для одновременной экспрессии генов фактора роста гепатоцитов и фактора роста эндотелия сосудов.However, this plasmid does not provide the synthesis of sufficient amounts of angiogenic growth factors either in vitro, for example, the concentrations of HGF and VEGF165 in vitro (in the culture medium of HEK293T cells after their transfection) are no more than 2.72 nM and 1.6 nM for HGF and VEGF165, respectively. At the same time, the concentration ratio of HGF and VEGF165 is unpredictable and on average ranges from 1:12 to 1: 5, depending on the IRES used. Also, this plasmid does not provide the synthesis of sufficient amounts of angiogenic growth factors either in vitro or when administered to mice - no more than 0.72 ng / ml and up to complete absence. Therefore, this vector does not have the parameters necessary for its use as an expression construct for the simultaneous expression of genes for hepatocyte growth factor and vascular endothelial growth factor.
Технической проблемой является синтез двух генов в заданном соотношении, обеспечивающем эффективную стимуляцию ангиогенеза.A technical problem is the synthesis of two genes in a predetermined ratio, which provides effective stimulation of angiogenesis.
Раскрытие изобретенияDisclosure of invention
Техническая проблема решается заявляемым плазмидным вектором, несущим гены ангиогенных факторов роста человека, и обеспечивающего синтез данных АФР in vivo в близком к эквимолярному соотношению.The technical problem is solved by the inventive plasmid vector carrying the genes of human angiogenic growth factors, and providing the synthesis of these AFR in vivo in a close to equimolar ratio.
Техническим результатом является создание плазмидной генетической конструкции, кодирующей кДНК фактора роста гепатоцитов (hHGF) и кДНК фактора роста эндотелия сосудов (hVEGF165) под независимыми промоторами, позволяющей осуществлять синтез данных АФР in vivo в соотношении молярных концентраций HGF/VEGF165 отThe technical result is the creation of a plasmid genetic construct encoding hepatocyte growth factor (hHGF) cDNA and vascular endothelial growth factor (hVEGF165) cDNA under independent promoters, which makes it possible to synthesize these AFR in vivo in the ratio of HGF / VEGF165 molar concentrations from
0,24:1 до 0,32:1 при обеспечении стабильного выхода белков. Полученный вектор оказался эффективен, и может быть использован для создания генотерапевтического препарата.0.24: 1 to 0.32: 1 while ensuring a stable protein yield. The resulting vector turned out to be effective and can be used to create a gene therapy drug.
Для заявляемой генетической конструкции характерны следующие преимущества:The claimed genetic construct has the following advantages:
обеспечивает продукцию значительных количеств АФР: от 50 до 53 нМ и от 14 до 17 нМ для VEGF165 и HGF соответственно;provides the production of significant amounts of PRA: from 50 to 53 nM and from 14 to 17 nM for VEGF165 and HGF, respectively;
поскольку оба гена (VEGF165 и HGF) имеют собственные промоторы, энхансеры и терминаторы транскрипции, то экспрессия каждого из них происходит независимо и не влияет друг на друга.since both genes (VEGF165 and HGF) have their own promoters, enhancers, and transcription terminators, the expression of each of them occurs independently and does not affect each other.
Технический результат достигается созданием вектора, схема которого представлена на фиг.2, а именно генно-инженерной конструкцией для стимуляции ангиогенеза в ишемизированных тканях, включающей:The technical result is achieved by creating a vector, the diagram of which is shown in figure 2, namely, a genetically engineered construct to stimulate angiogenesis in ischemic tissues, including:
последовательность, кодирующую ген фактора роста гепатоцитов, находящуюся под контролем промотора цитомегаловируса - pCMV-HGF;the sequence encoding the hepatocyte growth factor gene under the control of the cytomegalovirus promoter - pCMV-HGF;
последовательность, кодирующую ген фактора роста эндотелия сосудов, находящуюся под контролем промотора гена β-актина цыпленка - pCAG-VEGF165.the sequence encoding the vascular endothelial growth factor gene under the control of the chicken β-actin gene promoter - pCAG-VEGF165.
При этом, в качестве последовательности, кодирующей ген фактора роста гепатоцитов, используют последовательность SEQ ID N0:1, а в качестве последовательности, кодирующей ген фактора роста эндотелия сосудов используют последовательность SEQ ID NО:2.In this case, SEQ ID NO: 1 is used as the sequence encoding the hepatocyte growth factor gene, and SEQ ID NO: 2 is used as the sequence encoding the vascular endothelial growth factor gene.
Генно-инженерная конструкция включает следующие последовательно расположенные элементы:The genetic engineering design includes the following sequentially located elements:
Энхансер 1 - CMV enhancer - 36 - 415 п.о.Enhancer 1 - CMV enhancer - 36 - 415 bp
Промотор 1 - pCMV (промотор цитомегаловируса)-488-691 п.о.Promoter 1 - pCMV (cytomegalovirus promoter) -488-691 bp
Ген hHGF - 784-2970 п.о.HHGF gene - 784-2970 bp.
Терминатор 1 - bGH poly А (участок полиаденилирования гена бычьего гормона роста) - 3044-3268 п.о.Terminator 1 - bGH poly A (bovine growth hormone polyadenylation site) - 3044-3268 bp
Селективный маркер для отбора трансформированных бактерий - ген устойчивости к антибиотику - 3441-4253 п.о.Selective marker for the selection of transformed bacteria - antibiotic resistance gene - 3441-4253 bp.
Энхансер 2 - CMV enhancer - 4455-4740 п.о.Enhancer 2 - CMV enhancer - 4455-4740 bp
Промотор 2 - pCAG (промотор гена β-актина цыпленка) - 4742-5019 п.о.Promoter 2 - pCAG (chicken β-actin gene promoter) - 4742-5019 bp
Гибридный интрон - 5019-5248 п.о.Hybrid intron - 5019-5248 bp
Ген hVEGF165 - 5278-5853 п.о.HVEGF165 gene - 5278-5853 bp
Терминатор 2 - SV40 poly А (участок полиаденилирования вируса SV40) - 5908-6029 п.о.Terminator 2 - SV40 poly A (polyadenylation site of the SV40 virus) - 5908-6029 bp
Точка начала репликации (ori) - 6235-6823 п.о.The origin of replication (ori) is 6235-6823 bp.
Техническая проблема также решается применением заявляемой генно-инженерной конструкции в качестве действующего вещества генотерапевтического средства для стимуляции ангиогенеза в ишемизированных тканях.The technical problem is also solved by using the inventive genetically engineered construct as an active substance of a gene therapeutic agent to stimulate angiogenesis in ischemic tissues.
Также техническая проблема решается средством для стимуляции ангиогенеза в ишемизированных тканях, включающее заявляемую плазмидную конструкцию и вспомогательные вещества для внутримышечного введения. При этом в качестве вспомогательных веществ использованы натрия хлорид или вода для инъекций.Also, the technical problem is solved by a means for stimulating angiogenesis in ischemic tissues, including the claimed plasmid structure and auxiliary substances for intramuscular administration. In this case, sodium chloride or water for injection were used as auxiliary substances.
Техническая проблема также решается способом стимуляции ангиогенеза в ишемизированных тканях, включающим внутримышечное введение лекарственного средства для стимуляции ангиогенеза в ишемизированных тканях, включающего заявляемую плазмидную конструкцию, в терапевтически эффективном количестве.The technical problem is also solved by a method for stimulating angiogenesis in ischemic tissues, including intramuscular administration of a drug for stimulating angiogenesis in ischemic tissues, including the claimed plasmid construct, in a therapeutically effective amount.
Краткое описание чертежейBrief Description of Drawings
Изобретение поясняется следующими чертежами.The invention is illustrated by the following drawings.
На фиг. 1 представлена «карта» прототипа плазмидной генетической конструкции, кодирующей ген hHGF фактора роста гепатоцитов человека и ген hVEGF165 фактора роста эндотелия сосудов, разделенные последовательностью IRES.FIG. 1 shows a "map" of a prototype plasmid genetic construct encoding the hHGF gene of human hepatocyte growth factor and the hVEGF165 gene of vascular endothelial growth factor separated by the IRES sequence.
На фиг. 2 представлена «карта» плазмидной генетической конструкции, кодирующей ген hHGF фактора роста гепатоцитов человека и ген hVEGF165 фактора роста эндотелия сосудов под двумя независимыми промоторами.FIG. 2 shows a "map" of the plasmid genetic construct encoding the hHGF gene of the human hepatocyte growth factor and the hVEGF165 gene of the vascular endothelial growth factor under two independent promoters.
На фиг. 3. представлена диаграмма, демонстрирующая содержание HGF и VEGF165 в среде культивирования HEK293T после трансфекции кальций-фосфатным способом.FIG. 3. is a diagram showing the content of HGF and VEGF165 in the HEK293T culture medium after calcium phosphate transfection.
На фиг. 4. представлены фотографии, на которых показано формирование капилляроподобных структур клетками HUVEC на матригеле после их обработки экспериментальной и контрольными средами.FIG. 4. are photographs showing the formation of capillary-like structures by HUVEC cells on Matrigel after their treatment with experimental and control media.
На фиг. 5 представлены графики, демонстрирующие общую длину капилляроподобных структур, сформированных клетками HUVEC на матригеле через 15 ч после обработки экспериментальной и контрольными средами.FIG. 5 shows graphs showing the total length of capillary-like structures formed by HUVEC cells on Matrigel 15 h after treatment with experimental and control media.
На фиг. 6 представлены графики, демонстрирующие количество точек ветвления капилляроподобных структур, сформированных клетками HUVEC на матригеле через 15 ч после обработки экспериментальной и контрольными средами.FIG. 6 shows graphs showing the number of branch points of capillary-like structures formed by HUVEC cells on Matrigel 15 h after treatment with experimental and control media.
Осуществление изобретенияImplementation of the invention
Заявляемая генно-инженерная конструкция представляет собой экспрессионную векторную плазмиду, в которую клонированы вставки кДНК, кодирующие фактор роста эндотелия сосудов и фактор роста гепатоцитов человека, а именно кольцевую ДНК длиной 6888 нуклеотидных пар.The inventive genetically engineered construct is an expression vector plasmid into which cDNA inserts encoding vascular endothelial growth factor and human hepatocyte growth factor are cloned, namely, circular DNA with a length of 6888 nucleotide pairs.
Основные элементы конструкции:Main structural elements:
участок pCMV-HGFpCMV-HGF plot
участок pCAG-VEGF 165pCAG-
Расположение кДНК, кодирующих фактор роста эндотелия сосудов и фактор роста гепатоцитов человека, под независимыми промоторами, позволяет осуществлять синтез данных АФР in vivo в соотношении концентраций HGF/VEGF165 от 0,24:1 до 0,32:1 при обеспечении стабильного выхода белков.The location of cDNAs encoding vascular endothelial growth factor and human hepatocyte growth factor under independent promoters allows the synthesis of these AFRs in vivo in a concentration ratio of HGF / VEGF165 from 0.24: 1 to 0.32: 1 while ensuring a stable yield of proteins.
Плазмидная конструкция несет оптимизированные гены VEGF165 (фактора роста эндотелия сосудов) и HGF (фактора роста гепатоцитов) человека, которые могут быть заменены на другие (например, нативные) последовательности данных генов.The plasmid construct carries the optimized human VEGF165 (vascular endothelial growth factor) and HGF (hepatocyte growth factor) genes, which can be substituted for other (eg, native) sequences of these genes.
Регуляторные элементы экспрессии и трансляции конструкции:Regulatory elements of expression and translation of the construct:
Энхансер 1 - CMV enhancer - 380 п.о.Enhancer 1 - CMV enhancer - 380 bp
Промотор 1 - pCMV (промотор цитомегаловируса) - 204 п.о.Promoter 1 - pCMV (cytomegalovirus promoter) - 204 bp
Терминатор 1 - bGH poly А (участок полиаденилирования гена бычьего гормона роста) - 225 п.о.Terminator 1 - bGH poly А (bovine growth hormone gene polyadenylation site) - 225 bp
Энхансер 2 - CMV enhancer - 286 п.о.Enhancer 2 - CMV enhancer - 286 bp
Промотор 2 - pCAG (промотор гена (β-актина цыпленка) - 278 п.о.Promoter 2 - pCAG (gene promoter (chicken β-actin) - 278 bp
Г ибридный (химерный) интрон - 229 п.о.Hybrid (chimeric) intron - 229 bp
Терминатор 2 - SV40 poly А (участок полиаденилирования вируса SV40) - 122 п.о.Terminator 2 - SV40 poly A (polyadenylation site of the SV40 virus) - 122 bp
Регуляторные элементы экспрессии и трансляции конструкции в бактерии Е. coli:Regulatory elements of the expression and translation of the construct in E. coli bacteria:
Точка начала репликации (ori) - 589 п.о.The origin of replication (ori) is 589 bp.
Селективный маркер для отбора трансформированных бактерий: - ген устойчивости к канамицину - 813 п.о. (может быть заменен на другой ген устойчивости к антибиотикам или селективный маркер).Selective marker for the selection of transformed bacteria: - kanamycin resistance gene - 813 bp. (can be replaced with another antibiotic resistance gene or selectable marker).
Синтез плазмиды осуществляли с помощью стандартной технологии и оборудования, применяемых для решения подобных задач в генной инженерии (Watson J.D., Gilman М, Witkowski J., Zoller M. - Recombinant DNA, Scientific American Books, New York, 1992). В качестве вектора для синтеза заявляемой плазмиды могут быть использованы любые коммерческие векторы, для которых характерна высококопийная репликация в Е. coli (болееPlasmid synthesis was carried out using standard technology and equipment used to solve similar problems in genetic engineering (Watson J.D., Gilman M, Witkowski J., Zoller M. - Recombinant DNA, Scientific American Books, New York, 1992). As a vector for the synthesis of the claimed plasmid, any commercial vectors can be used, which are characterized by high-copy replication in E. coli (more
150 копий на клетку), относительно небольшой размер (3-6 тыс. п.о.) и высокий уровень экспрессии клонируемого гена в клетках млекопитающих. 150 copies per cell), relatively small size (3-6 thousand bp), and a high level of expression of the cloned gene in mammalian cells.
В качестве генов, кодирующих VEGF165 и HGF могут быть использованы как ко-дон-оптимизированные последовательности генов данных АФР с последовательностями SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 2, так и нативные гены.As genes encoding VEGF165 and HGF can be used as co-don-optimized gene sequences of these PRA with the sequences SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2, and native genes.
Для трансформации и наработки плазмидной ДНК могут быть использованы компетентные штаммы Escherichia coli, например, Е. coli DH-5α.For transformation and production of plasmid DNA can be used competent strains of Escherichia coli, for example, E. coli DH-5α.
Основные элементы конструкции:Main structural elements:
Регуляторные элементы экспрессии и трансляции конструкции и гены VEGF165 (фактора роста эндотелия сосудов) и HGF (фактора роста гепатоцитов) человека:Regulatory elements of expression and translation of the construct and genes VEGF165 (vascular endothelial growth factor) and HGF (hepatocyte growth factor) human:
Регуляторные элементы экспрессии и трансляции конструкции в бактерии Е. coli:Regulatory elements of the expression and translation of the construct in E. coli bacteria:
Ниже представлено более подробное описание заявляемого изобретения. Настоящее изобретение может подвергаться различным изменениям и модификациям, понятным специалисту на основе прочтения данного описания. Такие изменения не ограничивают объем притязаний. Например, могут изменяться стратегия сборки генетической конструкции (используемые праймеры, сайты клонирования и т.д.), методы наращивания, выделения и очистки плазмид, способ трансфекции, методы оценки концентраций АФР и др.Below is a more detailed description of the claimed invention. The present invention can be subject to various changes and modifications, which will be understood by a person skilled in the art based on reading this description. Such changes do not limit the scope of the claim. For example, the strategy for assembling the genetic construct (used primers, cloning sites, etc.), methods for growing, isolating and purifying plasmids, the method of transfection, methods for assessing the concentration of PRA, etc. can be changed.
Все используемые реагенты являются коммерчески доступными, все процедуры, если не оговорено особо, осуществляли при комнатной температуре или температуре окружающей среды, то есть в диапазоне от 18 до 25°С.All reagents used are commercially available, all procedures, unless otherwise stated, were carried out at room temperature or ambient temperature, that is, in the range from 18 to 25 ° C.
Фармацевтическая композиция на основе изобретения может вводиться парентерально, внутримышечно или любым другим способом, обеспечивающим возможность доставки соединения и/или композиции к клеткам/тканям. Например, фармацевтическую композицию можно вводить субъекту в виде внутримышечных инъекций. Для этих целей необходимо использовать стерильные растворы заявляемой композиции в фармацевтически приемлемом растворителе (см. ниже). Стерильность полученных композиций обеспечивается технологией и процессом их производства или получения в эксперименте.The pharmaceutical composition based on the invention can be administered parenterally, intramuscularly, or in any other way that allows the compound and / or composition to be delivered to cells / tissues. For example, the pharmaceutical composition can be administered to a subject by intramuscular injection. For these purposes, it is necessary to use sterile solutions of the claimed composition in a pharmaceutically acceptable solvent (see below). The sterility of the obtained compositions is ensured by the technology and process of their production or obtaining in experiment.
Термин «фармацевтически приемлемый» относится к нетоксическому материалу, который не взаимодействует с действием активного компонента фармацевтической композиции. "Фармацевтически приемлемый носитель" относится к биосовместимому раствору, который в достаточной степени имеет такие характеристики, как стерильность, рН, изотоничность, стабильность и подобные, и может включать любые растворители, разбавители, включая стерильный физиологический раствор, раствор хлорида натрия для инъекций, раствор Рингера для инъекций, раствор декстрозы для инъекций, раствор декстрозы и хлорида натрия для инъекций, содержащий лактат раствор Рингера для инъекций и другие водные буферные растворы, дисперсионные среды, покрытия, антибактериальные и противогрибковые средства, изотонические вещества и подобные. Фармацевтически приемлемый носитель также может содержать стабилизаторы, консерванты, антиоксиданты или другие добавки, которые хорошо известны специалистам в данной области, или другой наполнитель, известный из уровня техники.The term "pharmaceutically acceptable" refers to a non-toxic material that does not interact with the active ingredient of the pharmaceutical composition. "Pharmaceutically acceptable carrier" refers to a biocompatible solution that is sufficiently sterile, pH, isotonic, stability, and the like, and may include any solvents, diluents, including sterile saline, sodium chloride injection, Ringer's solution for injection, dextrose solution for injection, dextrose and sodium chloride solution for injection, lactated Ringer's solution for injection and other aqueous buffers, dispersion media, coatings, antibacterial and antifungal agents, isotonic agents and the like. The pharmaceutically acceptable carrier may also contain stabilizers, preservatives, antioxidants, or other additives that are well known to those skilled in the art, or other excipient known in the art.
Концентрация плазмидного вектора для высокоэффективной экспрессии генов VEGF165 и HGF человека в носителе должна быть достаточной для обеспечения терапевтического ангиогенеза. Например, при применении раствора на основе 0,9% хлорида натрия терапевтическая доза может составлять приблизительно от 25 до 1000 мкг на кг веса пациента.The concentration of the plasmid vector for highly efficient expression of the human VEGF165 and HGF genes in the carrier should be sufficient to provide therapeutic angiogenesis. For example, when using a solution based on 0.9% sodium chloride, the therapeutic dose may be from about 25 to 1000 μg per kg of patient weight.
Введение рекомендуется осуществлять путем внутримышечной инъекции в место, максимально близкое к ишемизированному участку. Введение производится после стандартной обработки кожи, с соблюдением правил асептики, дробно через несколько вколов так, чтобы весь массив мышц пораженного сегмента был инфильтрирован раствором. Введение может осуществляться как однократно (разово), так и несколько раз в зависимости от показаний, который оценивает лечащий врач на основании специфических параметров пациента, таких как возраст, масса тела, пол, степень повреждения ткани и т.п.The introduction is recommended by intramuscular injection in a place as close as possible to the ischemic area. The introduction is performed after standard skin treatment, in compliance with the rules of asepsis, fractionally after several injections so that the entire muscle mass of the affected segment is infiltrated with a solution. The introduction can be carried out both once (once) or several times, depending on the indications, which is assessed by the attending physician based on the specific parameters of the patient, such as age, body weight, gender, degree of tissue damage, etc.
1. Создание плазмидного вектора для высокоэффективной экспрессии генов VEGF165 и HGF человека.1. Creation of a plasmid vector for highly efficient expression of the human VEGF165 and HGF genes.
Синтез генов и плазмид осуществляли с помощью стандартной технологии и оборудования, применяемых для решения подобных задач в генной инженерии [Sambrook J et al., Molecular Cloning - A laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, (1989)], [Watson, J.D., Oilman, M., Witkowski, J., Zoller, M. Recombinant DNA, Scientific American Books, New York, 1992].The synthesis of genes and plasmids was carried out using standard technology and equipment used to solve similar problems in genetic engineering [Sambrook J et al., Molecular Cloning - A laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, (1989)], [Watson , JD, Oilman, M., Witkowski, J., Zoller, M. Recombinant DNA, Scientific American Books, New York, 1992].
Синтез плазмиды осуществляли на основе видоизмененной системы pVAX, преимуществом которой является факт разрешения ее к использованию FDA США, т.е. данные о безопасности входящих в ее состав компонентов. В качестве генов, кодирующих VEGF165 и HGF использовали последовательности SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 2. Для повышения уровня продукции HGF и VEGF165 в трансфицированных клетках была оптимизирована природная последовательность кДНК этих генов. Среди триплетов нуклеотидов, кодирующих аминокислоты белковых последовательностей природных генов HGF и VEGF165, были выявлены наиболее редко встречаемые последовательности в генах человека. Выявленные редкие триплеты, а также соседние с ними триплеты были заменены на триплеты, кодирующие ту же аминокислоту, но при этом наиболее часто встречающиеся в генах человека. После модификации все аминокислоты природных генов HGF и VEGF165 остались неизмененными.The synthesis of the plasmid was carried out on the basis of the modified pVAX system, the advantage of which is the fact that it was approved for use by the US FDA, i.e. data on the safety of its constituent components. The sequences of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 were used as genes encoding VEGF165 and HGF. To increase the level of production of HGF and VEGF165 in transfected cells, the natural cDNA sequence of these genes was optimized. Among the triplets of nucleotides encoding amino acids of the protein sequences of the natural genes HGF and VEGF165, the most rare sequences in human genes were identified. The revealed rare triplets, as well as their neighboring triplets, were replaced by triplets encoding the same amino acid, but most often found in human genes. After modification, all amino acids of the natural genes HGF and VEGF165 remained unchanged.
Использованный дизайн плазмидного вектора, с одной стороны, позволил без существенного увеличения размера плазмиды вместить в нее кДНК двух факторов роста, а с другой, позволил обеспечить близкое к оптимальному соотношение продуцируемых белков, т.е. высокую продукцию рекомбинантного human-BDNF и умеренную продукцию human-uPA, различающуюся в среднем на порядок.The design of the plasmid vector used, on the one hand, made it possible to accommodate cDNA of two growth factors in it without a significant increase in the size of the plasmid, and, on the other hand, made it possible to provide a close to optimal ratio of produced proteins, i.e. high production of recombinant human-BDNF and moderate production of human-uPA, differing on average by an order of magnitude.
Ниже представлен пример реализации изобретения, который не ограничивает настоящее изобретение, а лишь демонстрирует возможность его осуществления с достижением технического результата.Below is an example of implementation of the invention, which does not limit the present invention, but only demonstrates the possibility of its implementation with the achievement of a technical result.
ПримерExample
Используемый экспрессионный вектор pVax2 был создан из коммерческого вектора pVax1 (ThermoFisher) и был взят как основной каркасный вектор для конструирования заявляемого изобретения. Модификация заключалась во вставке SV40 энхансера между CMV промотором и CMV энхансером pVax1 и замене гена устойчивости к канамицину KanR.The expression vector pVax2 used was generated from the commercial vector pVax1 (ThermoFisher) and was taken as the main framework vector for the construction of the claimed invention. The modification consisted of inserting an SV40 enhancer between the CMV promoter and the CMV enhancer pVax1 and replacing the kanamycin resistance gene KanR.
1. На первом этапе была проведена рестирикция pVax2 CeiI (в буфере W+BSA) и вставка фосфорилированного дуплекса с получением конструкции pVax2-VEGFIns.1. At the first stage, pVax2 CeiI (in buffer W + BSA) was restrained and the phosphorylated duplex was inserted to obtain the pVax2-VEGFIns construct.
2. На втором этапе конструкция pVax2-VEGFIns подвергалась рестрикция AsuNHI+Pmel (CutSmart) с последующей вставкой оптимизированного hHGF, собранного из синтетических олигонуклеотидов и рестрицированного AsuNHI (CutSmart), с получением конструкции pVax2-CMV_hHGF-VEGFIns. Олигонуклеотиды для сборки hHGFopt приведены в таблице 2 и 3.2. In the second step, the pVax2-VEGFIns construct was subjected to restriction with AsuNHI + Pmel (CutSmart) followed by the insertion of optimized hHGF assembled from synthetic oligonucleotides and AsuNHI-restricted (CutSmart) to obtain the pVax2-CMV_hHGF-VEGFIns construct. Oligonucleotides for assembly of hHGFopt are shown in Tables 2 and 3.
3. На третьем этапе была осуществлена последовательная рестрикция конструкции pVax2-hHGF-VEGFIns рестриктазами XbaI (CutSmart) и Bsp13I (2K), а затем вставка CAG-промотора, амплифицированного из вектора рХ458 с помощью праймеров, приведенных в таблице 4, и последовательно рестрицированного Xba1 (CutSmart) и Bsp13I (2K). В итоге была получена конструкция pVax2-CMV_hHGF-CAG_VEGFIns.3. At the third stage, sequential restriction of the pVax2-hHGF-VEGFIns construct with restriction enzymes XbaI (CutSmart) and Bsp13I (2K) was carried out, followed by insertion of the CAG promoter amplified from the pX458 vector using the primers shown in Table 4 and sequentially restricting Xba1 (CutSmart) and Bsp13I (2K). As a result, the pVax2-CMV_hHGF-CAG_VEGFIns construct was obtained.
Затем, на четвертом этапе, была проведена рестрикция вектора pVax2-CMV_hHGF-CAG VEGFIns PciSI (В), и осуществлена вставка hVEGF165, собранного из синтетических олигонуклеотидов и рестрицированного PciSI (В) с получением заявляемой плазмиды pVax2-CMV_hHGF-CAG_hVEGF165. Олигонуклеотиды для сборки hVEGF165 приведены в таблицах 5 и 6.Then, in the fourth step, the vector pVax2-CMV_hHGF-CAG VEGFIns PciSI (B) was restricted, and the hVEGF165 assembled from synthetic oligonucleotides and PciSI-restricted (B) was inserted to obtain the claimed plasmid pVax2-CMV_hhHGF-CAG165. Oligonucleotides for assembly of hVEGF165 are shown in Tables 5 and 6.
Затем полученный продукт трансформировали в Е. coli DH5a и трансформанты отбирали на основании устойчивости к канамицину. Плазмидную ДНК, выделенную приблизительно из 10 таких колоний, анализировали на наличие кДНК HGF и VEGF165 ре-стрикционным расщеплением, используя различные ферменты рестрикции. Одну такую плазмиду секвенировали, используя автоматический ДНК секвенатор (ABI), и она была определена, как имеющая правильную интеграцию и последовательность кДНК HGF и VEGF165 в векторе pVax2.The resulting product was then transformed into E. coli DH5a and transformants were selected based on kanamycin resistance. Plasmid DNA isolated from about 10 of these colonies was analyzed for the presence of HGF and VEGF165 cDNA by restriction digestion using various restriction enzymes. One such plasmid was sequenced using an automated DNA sequencer (ABI) and was determined to have the correct integration and sequence of the HGF and VEGF165 cDNA in the pVax2 vector.
Схема полученной плазмиды представлена на фиг. 2.The resulting plasmid is schematically shown in FIG. 2.
Таким образом, генно-инженерная конструкция, представляющая собой экспрессионную векторную плазмиду (кольцевую ДНК длиной 6888 нуклеотидных пар), в которую клонированы вставки кДНК, кодирующие фактор роста эндотелия сосудов и фактор роста гепатоцитов человека (несет оптимизированные гены VEGF165 (фактора роста эндотелия сосудов) и HGF (фактора роста гепатоцитов) человека), содержит основные элементы конструкции:Thus, a genetically engineered construct, which is an expression vector plasmid (circular DNA with a length of 6888 nucleotide pairs), into which cDNA inserts encoding vascular endothelial growth factor and human hepatocyte growth factor are cloned (carries optimized genes VEGF165 (vascular endothelial growth factor) and HGF (human hepatocyte growth factor)), contains the main structural elements:
Регуляторные элементы экспрессии и трансляции конструкции:Regulatory elements of expression and translation of the construct:
Регуляторные элементы экспрессии и трансляции конструкции в бактерии Е. coli:Regulatory elements of the expression and translation of the construct in E. coli bacteria:
Точка начала репликации (ori) - 6235-6823 п.о.The origin of replication (ori) is 6235-6823 bp.
Селективный маркер для отбора трансформированных бактерий: - ген устойчивости к канамицину - 3441-4253 п.о. (может быть заменен на другой ген устойчивости к антибиотикам или селективный маркер).Selective marker for the selection of transformed bacteria: - kanamycin resistance gene - 3441-4253 bp. (can be replaced with another antibiotic resistance gene or selectable marker).
Для амплификации всех полученных плазмидных ДНК использовались бактерии Е. coli штамма DH-5α. После трансформации бактерии культивировались в течение ночи в селективной среде LB с канамицином в концентрации 100 мкг/мл. После окончания инкубации бактерии осаждали центрифугированием и использовали для выделения плазмидной ДНК на колонке (Qiagen, США).For amplification of all obtained plasmid DNAs, E. coli bacteria strain DH-5α was used. After transformation, bacteria were cultured overnight in LB selective medium with kanamycin at a concentration of 100 μg / ml. After the end of incubation, bacteria were precipitated by centrifugation and used to isolate plasmid DNA on a column (Qiagen, USA).
1. Приготовление заявляемой генетической конструкции1. Preparation of the claimed genetic construct
Для трансформации и наработки плазмидной ДНК (пДНК) использовали штамм Е. coli DH-5α. Исходный штамм Е. coli DH-5α является музейным и хранится во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов. Трансформированный штамм Е. coli DH-5α-CMV-HGF_CAG-VEGF165 отличается от исходного штамма Е. coli DH-5α устойчивостью к антибиотику канамицину, обеспечиваемой введенной в состав штамма плазмиды «CMV-HGF_CAG-VEGF165». Штамм-продуцент DH-5α-CMV-HGF_CAG-VEGF165 для наработки плазмидной ДНК получали трансформацией исходного компетентного штамма Е. coli DH-5α соответствующей плазмидой, с последующим отбором рекомбинантных клонов на среде LB с канамицином при 37°С. Трансформацию компетентных клеток Е. coli штамма DH5α проводили следующим образом. В эппендорф, содержащий 1 нг пДНК добавляли суспензию размороженных на льду бактерий (объем культуры 30 мкл), после чего проводили трансформацию методом «теплового шока». Для этого пробирку помещали в термостат, нагретый до 42°С на 45 сек, после чего на 5 мин переносили в лед. После этого к полученной культуре добавляли стерильную среду LB (500 мкл) и инкубировали на термошейкере в течение 60 мин (500 об/мин, 37°С). После этого 150 мкл полученной суспензии переносили в ламинарном бактериологическом боксе на заранее подготовленные чашки Петри диаметром 100 мм залитые LB-агаром, содержащим селектирующий агент - канамицин (100 мкг/мл). Контролем трансформации служила проба без внесения пДНК, в которой адекватным считалось отсутствие бактериального роста в LB-агаре с канамицином. После этого суспензию распределяли по поверхности LB-arapa с помощью прожженной проволочной петли и полученную культуру переносили в инкубатор на 15-17 ч при температуре 37°С. По окончании инкубации одну колонию бактерий с помощью стерильного шпателя переносили в жидкую культуру малого объема (15-20 мл, соотношение объема жидкости и воздуха не менее 1:4-1:5) на среде LB, содержащей 100 мкг/мл канамицина. После этого колбу с инокулированной средой помещали в термошейкер на 18 часов (250 об/мин, 37°С). Далее полученную культуру переносили в жидкую среду LB со 100 мкг/мл канамицина объемом 500 мл в соотношении 1:500, после чего ее инкубировали в аналогичных условиях в течение 15-18 ч для получения большого объема бактериальных клеток, содержащих пДНК. Полученную культуру бактерий в среде LB (объемом от 500 мл до 3 л в зависимости от количества пДНК) осаждали центрифугированием (12000 g, 15 мин), после чего жидкую фазу удаляли, а осадок использовали для выделения пДНК. Лизис, очистку от эндотоксинов и выделение плазмиды проводили с использованием наборов компании Qiagen (Midi или Maxi EndoFree kit) согласно протоколу производителяFor transformation and production of plasmid DNA (pDNA) used strain E. coli DH-5α. The original E. coli DH-5α strain is a museum and is kept in the All-Russian Collection of Industrial Microorganisms. The transformed strain of E. coli DH-5α-CMV-HGF_CAG-VEGF165 differs from the original strain of E. coli DH-5α in resistance to the antibiotic kanamycin, provided by the plasmid "CMV-HGF_CAG-VEGF165" introduced into the strain. Producer strain DH-5α-CMV-HGF_CAG-VEGF165 for the production of plasmid DNA was obtained by transformation of the original competent E. coli strain DH-5α with the corresponding plasmid, followed by selection of recombinant clones on LB medium with kanamycin at 37 ° C. The transformation of competent cells of E. coli strain DH5α was carried out as follows. A suspension of bacteria thawed on ice (culture volume 30 μL) was added to an Eppendorf containing 1 ng of pDNA, after which the transformation was carried out by the "heat shock" method. For this, the test tube was placed in a thermostat heated to 42 ° C for 45 sec, after which it was transferred to ice for 5 min. After that, sterile LB medium (500 μl) was added to the resulting culture and incubated on a thermal shaker for 60 min (500 rpm, 37 ° C). Thereafter, 150 μL of the resulting suspension was transferred in a laminar bacteriological box onto
2. Трансфекция клеток линии HEK293T2. Transfection of HEK293T cells
Трансфекция клеток линии HEK293T проводилась кальций-фосфатным методом, однако, возможно использование и другого метода (например, протокол трансфекции с помощью Lipofectamine 2000). Трансфекция проводилась в 6-луночном планшете по достижении клетками 80-90% конфлюэнтного монослоя. Для этого 2 мкг пДНК смешивали с раствором 0,3 М CaCl2 и по каплям добавляли к 2xHBS (рН=7,10), состоящему из 280 мМ NaCl; 50 мМ HEPES; 1,5 мМ Na2HPO4. После этого полученную смесь инкубировали 1 мин и по каплям добавляли к среде культивирования HEK293T (DMEM/10% ФБС, объем 2 мл/лунке). Через 15-16 часов клетки отмывали и к ним добавляли бессывороточную DMEM, которую через 48 ч собирали, откручивали от клеточного дебриса и использовали для оценки продукции VEGF165 и HGF. Концентрации VEGF165 и HGF в среде культивирования клеток HEK293T через 48 ч после трансфекции составили 51,50 и 15,48 нМ соответственно.The HEK293T cells were transfected using the calcium phosphate method; however, another method is also possible (for example, the transfection protocol with Lipofectamine 2000). Transfection was performed in a 6-well plate when the cells reached 80-90% of the confluent monolayer. For this, 2 μg of pDNA was mixed with a solution of 0.3 M CaCl 2 and added dropwise to 2xHBS (pH = 7.10), consisting of 280 mM NaCl; 50 mM HEPES; 1.5 mM Na 2 HPO 4 . After that, the resulting mixture was incubated for 1 min and added dropwise to the HEK293T culture medium (DMEM / 10% PBS,
Соотношение молярных концентраций HGF7VEGF165 равнялось 0,3. Полученные данные представлены на фиг. 3The molar concentration ratio of HGF7VEGF165 was 0.3. The data obtained are shown in FIG. 3
3. Тестирование биологической активности плазмид путем оценки формирования капилляроподобных структур клетками HUVEC на матригеле (tube assay) - модель ангиогенеза in vitro3. Testing the biological activity of plasmids by evaluating the formation of capillary-like structures by HUVEC cells on Matrigel (tube assay) - in vitro model of angiogenesis
Клетки HUVEC 3-4 пассажа высаживали на 48-луночный планшет, покрытый слоем Матригеля (BD Biosciences). Перед началом эксперимента клетки депривировали в бессывороточной среде для культивирования клеток эндотелия (М200) в течение 4 ч. Затем на клетки наносили среду, собранную с трансфицированных клеток HEK293T (общий объем среды 2000 мкл). В качестве положительного контроля использовали клетки, к которым добавлялась полная среда культивирования (M200+supl). Планшет с клетками помещали в систему прижизненного анализа клеток - IncuCyte®, клетки фотографировали, в режиме фазового контраста со 100х увеличением каждые 2 часа. Длину трубочек и число точек ветвления оценивали с использованием программного пакета ImageJ. Результат представлен на фиг. 4-6.Passage 3-4 HUVEC cells were seeded onto a 48-well Matrigel-coated plate (BD Biosciences). Before the start of the experiment, the cells were deprived in serum-free endothelial cell culture medium (M200) for 4 h. Then, the medium collected from the transfected HEK293T cells (total medium volume 2000 μl) was applied to the cells. Cells to which complete culture medium (M200 + supl) was added were used as a positive control. The plate with the cells was placed in the system of in vivo analysis of cells - IncuCyte®, the cells were photographed in phase contrast mode with 100x magnification every 2 hours. The length of the tubules and the number of branch points were estimated using the ImageJ software package. The result is shown in FIG. 4-6.
4. Инъекция плазмид в скелетные мышцы мышей с последующей низковольтовой электропорацией4. Injection of plasmids into skeletal muscle of mice followed by low-voltage electroporation
Для внутримышечного введения плазмид использовался стерильный раствор пДНК в 0,9% NaCl, который вводился в m. tibialis anterior однократно. Животным вводилось по 100 мкг пДНК, растворенной в 30-50 мкл физиологического раствора (2-3 мг/мл). Чрескожно игла инсулинового шприца вводилась параллельно продольной оси мышцы, после чего раствор медленно вводился в толщу мышцы во избежание разрыва перимизия. Для повышения эффективности трансфекции был использован метод низковольтовой электропорации, описанный Schertzer и Lynch, с минимальной модификацией: было опущено введение гиалуронидазы, описанное в оригинальном методе. Непосредственно после инъекции плазмид на кожу, прилегающую к m. tibialis anterior, накладывались пластинчатые электроды, смазанные проводящим гелем. Затем с использованием генератора импульсных токов постоянной фор мы марки BTX-Harvard apparatus ЕСМ 830 (Harvard apparatus, США) проводилась электропорация тремя импульсами с напряжением 80 В/см расстояния между электродами, частотой 1 Гц и продолжительностью 20 мсек. Затем полярность электродов менялась и подавалось еще 3 импульса с аналогичными приведенным характеристиками. Поле проведения электропорации поверхность кожи очищалась 70% этиловым спиртом.For intramuscular injection of plasmids, a sterile solution of pDNA in 0.9% NaCl was used, which was injected into m. tibialis anterior once. The animals were injected with 100 μg of pDNA dissolved in 30-50 μl of saline (2-3 mg / ml). Percutaneously, the needle of the insulin syringe was inserted parallel to the longitudinal axis of the muscle, after which the solution was slowly injected into the thickness of the muscle to avoid rupture of perimisia. To increase the efficiency of transfection, the low-voltage electroporation method described by Schertzer and Lynch was used, with minimal modification: the introduction of hyaluronidase described in the original method was omitted. Immediately after the injection of plasmids into the skin adjacent to m. tibialis anterior, plate electrodes were applied, smeared with a conductive gel. Then, using a constant shape pulse current generator of the BTX Harvard apparatus ECM 830 (Harvard apparatus, United States), electroporation was performed with three pulses with a voltage of 80 V / cm distance between electrodes, a frequency of 1 Hz and a duration of 20 ms. Then the polarity of the electrodes was changed, and 3 more pulses were supplied with similar characteristics. After electroporation, the skin surface was cleaned with 70% ethyl alcohol.
5. Опыты ex vivo на модели эксплантной культуры скелетной мышцы5. Experiments ex vivo on a skeletal muscle explant culture model
Образцы т. tibialis anterior мыши были выделены на 2 день после введения пДНК. Подготовку эксплантной культуры на матригеле выполняли по методу Jang et al. (Jang HS, Kim HJ, Kim JM, Lee YS, Kim KL, et al. (2004) A novel ex vivo angiogenesis assay based on electroporation-mediated delivery of naked plasmid DNA to skeletal muscle. Mol Ther 9: 464-474.). Образцы скелетной мышцы высаживали на матригель и затем культивировали в полной среде DMEM с 4,5 г/л D-глюкозы (Life Technologies, США) и 2% ФБС (Gibco, США) при стандартных условиях. На 3 и 7 сутки культивирования эксплантов отбирали образцы культуральной среды для оценки содержания VEGF165 и HGF человека методом ИФА. Концентрации VEGF165 и HGF, продуцированных мышиными мышечными эксплантами после инъекции, составили 0,81 и 0,35 нг/мл соответственно на 3 день и 0,82 и 0,49 нг/мл на 7 день. Соотношение молярных концентраций HGF/VEGF165 равнялось 0,24 на 3 день и 0,32 на 7 день.Samples of t. Tibialis anterior mice were isolated 2 days after pDNA injection. The preparation of the explant culture on Matrigel was performed according to the method of Jang et al. (Jang HS, Kim HJ, Kim JM, Lee YS, Kim KL, et al. (2004) A novel ex vivo angiogenesis assay based on electroporation-mediated delivery of naked plasmid DNA to skeletal muscle. Mol Ther 9: 464-474. ). Skeletal muscle samples were planted on Matrigel and then cultured in complete DMEM medium with 4.5 g / L D-glucose (Life Technologies, USA) and 2% PBS (Gibco, USA) under standard conditions. On the 3rd and 7th days of culturing the explants, samples of the culture medium were taken to assess the content of human VEGF165 and HGF by ELISA. The concentrations of VEGF165 and HGF produced by murine muscle explants after injection were 0.81 and 0.35 ng / ml, respectively, on day 3 and 0.82 and 0.49 ng / ml on day 7. The HGF / VEGF165 molar concentration ratio was 0.24 on day 3 and 0.32 on day 7.
6. Сравнительная оценка продукции VEGF165 и HGF клетки НЕК29 разными плазмидами6. Comparative evaluation of VEGF165 and HGF production in HEK29 cells by different plasmids
На первом этапе на основе вектора pVAX нами были созданы прототипы заявляемой генетической конструкции, а именно плазмиды, несущие различные варианты IRES для осуществления одновременной экспрессии генов факторов роста HGF и VEGF165, характеризующиеся общей схемой строения: HGF-IRES -VEGF165. Для оценки продукции VEGF165 и HGF клетки НЕК293Т трансфицировали кальций фосфатным способом, концентрации VEGF165 и HGF в клеточной среде оценивались методом ИФА (результаты представлены в таблице 7).At the first stage, based on the pVAX vector, we created prototypes of the claimed genetic construct, namely plasmids carrying various IRES variants for simultaneous expression of the genes of the growth factors HGF and VEGF165, characterized by the general structure scheme: HGF-IRES-VEGF165. To assess the production of VEGF165 and HGF, HEK293T cells were transfected with calcium phosphate, the concentrations of VEGF165 and HGF in the cell medium were evaluated by ELISA (the results are shown in Table 7).
Плазмида №3 - конструкция HGF-IRES_FGF1-VEGF165 отличается от конструкции №1 тем, что включает последовательность IRES эукариотического белка FGF1. Молярные концентрации HGF и VEGF165 составили 0,08 и 1,59 нМ соответственно. Соотношение HGF/VEGF165 равнялось 11,38.Plasmid # 3 - construct HGF-IRES_FGF1-VEGF165 differs from
In vivo продукция белков VEGF165 и HGF оценивалась на модели эксплантной культуры скелетных мышц, выделенных после инъекции с электропорации векторов по пункту 1 (100 нг/мл) мышам. Образцы культуральной среды для оценки содержания VEGF165 и HGF методом ИФА отбирались на 3 и 7 сутки культивирования эксплантов.In vivo production of VEGF165 and HGF proteins was assessed in a skeletal muscle explant culture model isolated after electroporation injection of vectors according to step 1 (100 ng / ml) in mice. Samples of the culture medium for assessing the content of VEGF165 and HGF by ELISA were taken on the 3rd and 7th days of cultivation of the explants.
Для плазмиды №1 концентрации HGF и VEGF165, продуцированных мышиными мышечными эксплантами, не детектировались методом ИФА.For
Для плазмиды №2 концентрации HGF в среде культивирования мышечных эксплантов составили 0,72 нг/мл и 0,48 нг/мл на 3 и 7 дни соответственно. Концентрация белка VEGF165 была ниже порога чувствительности используемого метода детекции.For plasmid No. 2, the concentration of HGF in the culture medium of muscle explants was 0.72 ng / ml and 0.48 ng / ml on days 3 and 7, respectively. The VEGF165 protein concentration was below the sensitivity threshold of the used detection method.
Для плазмиды №3 концентрации HGF и VEGF165 также не детектировались методом ИФА.For plasmid No. 3, the concentrations of HGF and VEGF165 were also not detected by ELISA.
Таким образом, векторы №№1, 2, 3 не дали достаточной для оценки методом ИФА продукции АФР. Из полученных данных можно сделать вывод о том, что синтезируемые количества белков VEGF165 и HGF ниже констант диссоциации данных АФР с их рецепторами и недостаточны для проявления их биологического действия.Thus, vectors Nos. 1, 2, 3 did not give sufficient AFR production for the ELISA method. From the data obtained, it can be concluded that the synthesized amounts of VEGF165 and HGF proteins are lower than the dissociation constants of these AFRs with their receptors and are insufficient for the manifestation of their biological action.
В качестве альтернативного варианта мультицистронного вектора была создана и протестирована следующая генетическая конструкция:As an alternative variant of the multicistronic vector, the following genetic construct was created and tested:
№4 - вектор, в котором гены белков VEGF165 и HGF имеют собственные независимые промоторы: цитомегаловируса (CMV) и куриного бета-актина (CAG) для генов HGF и VEGF165 соответственно - «CMV_CAG». Молярные концентрации HGF и VEGF165 составили 6,05 и 5,92 нМ соответственно. Соотношение HGF/VEGF165 равнялось 1,38.No. 4 - a vector in which the genes of the VEGF165 and HGF proteins have their own independent promoters: cytomegalovirus (CMV) and chicken beta-actin (CAG) for the HGF and VEGF165 genes, respectively - "CMV_CAG". The molar concentrations of HGF and VEGF165 were 6.05 and 5.92 nM, respectively. The HGF / VEGF165 ratio was 1.38.
Конструкция №4 была протестирована in vivo на модели эксплантной культуры скелетных мышц мышей, описанной в пункте 2. Продукция белков VEGF165 и HGF оценивалась методом ИФА.Construct # 4 was tested in vivo on the mouse skeletal muscle explant culture model described in
После инъекции и электропорации мышам вектора №4 концентрации HGF в среде культивирования мышечных эксплантов составили 1,14 нг/мл и 1,3 нг/мл на 3 и 7 дни соответственно. Концентрации VEGF165 составили 0,5 нг/мл и 0,2 нг/мл на 3 и 7 дни соответственно. Соотношение HGF/VEGF165 равнялось 2,28 на 3 день и 6,67 на 7 день культивирования эксплантов.After injection and electroporation of vector No. 4 to mice, the concentration of HGF in the culture medium for muscle explants was 1.14 ng / ml and 1.3 ng / ml on days 3 and 7, respectively. VEGF165 concentrations were 0.5 ng / ml and 0.2 ng / ml on days 3 and 7, respectively. The HGF / VEGF165 ratio was 2.28 on day 3 and 6.67 on day 7 of explant culture.
Таким образом, только вектор, включающий два отдельных промотора для независимой экспрессии обоих АФР дает продукцию белков HGF и VEGF165 in vitro и in vivo.Thus, only a vector containing two separate promoters for independent expression of both PRA produces the HGF and VEGF165 proteins in vitro and in vivo.
На основе вектора №4, сконструирована заявляемая генетическая конструкция. Вектор представляет собой аналогичную плазмиде №4 конструкцию, отличающуюся тем, что в ней последовательностью гена HGF заменена на оптимизированную. Концентрации белков HGF и VEGF165 в среде культивирования трансфицированных плазмидой клеток HEK293T составили 15,48 и 51,5 нМ соответственно. Соотношение HGF/VEGF165 равнялось 0,3.On the basis of vector No. 4, the claimed genetic construct is constructed. The vector is a construct similar to plasmid No. 4, characterized in that the HGF gene sequence is replaced with an optimized one. The concentrations of HGF and VEGF165 proteins in the culture medium transfected with the plasmid HEK293T cells were 15.48 and 51.5 nM, respectively. The HGF / VEGF165 ratio was 0.3.
Как следует из описанного выше, единственным вектором, позволяющим достигать оптимальных концентраций и соотношения АФР является заявляемая конструкция с двумя отдельными промоторами для каждого из генов: CMV для гена HGF и CAG для гена VEGF165. Использование двух отдельных кассет с собственными энхансерами, промоторами и терминаторами транскрипции для каждого из генов обеспечивает независимую экспрессию каждого из них. Результаты экспериментов с вектором, выбранном в качестве прототипа - плазмидой №4, а также с заявляемой конструкцией показали активность обоих промоторов как in vitro в клетках человека, так и in vivo в эксплантной культуре мышц, полученной после инъекции плазмиды мышам. Однако только использование заявляемого вектора обеспечивает продукцию белков HGF и VEGF165 в близком к эквимолярному соотношению с небольшим преобладанием «активатора ангиогенеза» - фактора роста эндотелия сосудов. Все варианты векторов, основанные на отличных способах реализации, не позволяют достичь технического результата и не могут быть использованы для одновременной экспрессии in vivo двух ангиогенных факторов роста (АФР) с одной генетической конструкции в достаточных количествах и в оптимальном соотношении.As follows from the above, the only vector that allows you to achieve optimal concentrations and ratios of PRA is the claimed construct with two separate promoters for each of the genes: CMV for the HGF gene and CAG for the VEGF165 gene. The use of two separate cassettes with their own enhancers, promoters, and transcription terminators for each of the genes allows for independent expression of each of them. The results of experiments with the vector selected as a prototype - plasmid No. 4, as well as with the claimed design, showed the activity of both promoters both in vitro in human cells and in vivo in explant muscle culture obtained after plasmid injection into mice. However, only the use of the inventive vector ensures the production of HGF and VEGF165 proteins in a close to equimolar ratio with a slight predominance of the "angiogenesis activator" - vascular endothelial growth factor. All variants of vectors based on excellent implementation methods do not allow achieving a technical result and cannot be used for the simultaneous in vivo expression of two angiogenic growth factors (AFRs) from one genetic construct in sufficient quantities and in an optimal ratio.
--->--->
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙLIST OF SEQUENCES
<110> Открытое общество с ограниченной ответственностью «Генная и клеточная терапия» (ООО «Генная и клеточная терапия»)<110> Open Limited Liability Company "Gene and Cell Therapy" (LLC "Gene and Cell Therapy")
<120> ГЕННО-ИНЖЕНЕРНАЯ КОНСТРУКЦИЯ ДЛЯ СТИМУЛЯЦИИ АНГИОГЕНЕЗА<120> GENETIC ENGINEERING STRUCTURE FOR STIMULATION OF ANGIOGENESIS
<160> SEQ ID NО:1<160> SEQ ID NO: 1
<210> 1<210> 1
<211> 2187<211> 2187
<212> ДНК <212> DNA
<213> Кодон-оптимизированная последовательность Homo sapiens (human) <213> Codon-optimized sequence Homo sapiens (human)
<223> Нуклеотидная последовательность гена фактор роста гепатоцитов (hHGF) <223> Nucleotide sequence of the hepatocyte growth factor (hHGF) gene
<400> 1<400> 1
1 ATGTGGGTGA CCAAGCTGCT GCCAGCCCTG CTGCTGCAGC ATGTCCTCCT1 ATGTGGGTGA CCAAGCTGCT GCCAGCCCTG CTGCTGCAGC ATGTCCTCCT
51 GCATCTCCTC CTGCTCCCCA TCGCCATCCC CTATGCAGAG GGACAAAGGA51 GCATCTCCTC CTGCTCCCCA TCGCCATCCC CTATGCAGAG GGACAAAGGA
101 AAAGAAGAAA TACAATTCAT GAATTCAAAA AATCAGCAAA GACCACCCTG101 AAAGAAGAAA TACAATTCAT GAATTCAAAA AATCAGCAAA GACCACCCTG
151 ATCAAGATCG ACCCCGCCCT GAAGATCAAG ACCAAAAAAG TGAATACTGC151 ATCAAGATCG ACCCCGCCCT GAAGATCAAG ACCAAAAAAG TGAATACTGC
201 AGACCAGTGT GCCAATAGAT GTACCAGGAA CAAGGGCCTG CCATTCACTT201 AGACCAGTGT GCCAATAGAT GTACCAGGAA CAAGGGCCTG CCATTCACTT
251 GCAAGGCTTT TGTTTTTGAT AAAGCAAGAA AACAATGCCT CTGGTTCCCC251 GCAAGGCTTT TGTTTTTGAT AAAGCAAGAA AACAATGCCT CTGGTTCCCC
301 TTCAATAGCA TGTCAAGTGG AGTGAAAAAA GAATTTGGCC ATGAATTTGA301 TTCAATAGCA TGTCAAGTGG AGTGAAAAAA GAATTTGGCC ATGAATTTGA
351 CCTCTATGAA AACAAAGACT ACATTAGAAA CTGCATCATT GGTAAAGGAC351 CCTCTATGAA AACAAAGACT ACATTAGAAA CTGCATCATT GGTAAAGGAC
401 GCAGCTACAA GGGAACAGTA TCTATCACTA AGAGTGGCAT CAAATGTCAG401 GCAGCTACAA GGGAACAGTA TCTATCACTA AGAGTGGCAT CAAATGTCAG
451 CCCTGGAGTT CCATGATACC ACACGAACAC AGCTTTCTGC CTTCCAGCTA451 CCCTGGAGTT CCATGATACC ACACGAACAC AGCTTTCTGC CTTCCAGCTA
501 CCGGGGCAAG GACCTGCAGG AGAACTACTG CCGGAACCCT CGAGGGGAAG501 CCGGGGCAAG GACCTGCAGG AGAACTACTG CCGGAACCCT CGAGGGGAAG
551 AAGGGGGACC CTGGTGTTTC ACAAGCAATC CAGAGGTACG CTACGAAGTC551 AAGGGGGACC CTGGTGTTTC ACAAGCAATC CAGAGGTACG CTACGAAGTC
601 TGTGACATTC CTCAGTGTTC AGAAGTTGAA TGCATGACCT GCAATGGGGA601 TGTGACATTC CTCAGTGTTC AGAAGTTGAA TGCATGACCT GCAATGGGGA
651 GAGTTATCGA GGTCTCATGG ATCATACAGA ATCAGGCAAG ATTTGTCAGC651 GAGTTATCGA GGTCTCATGG ATCATACAGA ATCAGGCAAG ATTTGTCAGC
701 GCTGGGATCA TCAGACACCA CACCGGCACA AATTCTTGCC TGAAAGATAT701 GCTGGGATCA TCAGACACCA CACCGGCACA AATTCTTGCC TGAAAGATAT
751 CCCGACAAGG GCTTTGATGA TAATTATTGC CGCAATCCCG ATGGCCAGCC751 CCCGACAAGG GCTTTGATGA TAATTATTGC CGCAATCCCG ATGGCCAGCC
801 GAGGCCATGG TGCTATACTC TTGACCCTCA CACCCGCTGG GAGTACTGTG801 GAGGCCATGG TGCTATACTC TTGACCCTCA CACCCGCTGG GAGTACTGTG
851 CAATTAAAAC ATGCGCTGAC AATACTATGA ATGACACTGA TGTTCCTTTG851 CAATTAAAAC ATGCGCTGAC AATACTATGA ATGACACTGA TGTTCCTTTG
901 GAAACAACTG AATGCATCCA AGGTCAAGGA GAAGGCTACA GGGGCACTGT901 GAAACAACTG AATGCATCCA AGGTCAAGGA GAAGGCTACA GGGGCACTGT
951 CAATACCATT TGGAATGGAA TTCCATGTCA GCGTTGGGAT TCTCAGTATC951 CAATACCATT TGGAATGGAA TTCCATGTCA GCGTTGGGAT TCTCAGTATC
1001 CTCACGAGCA TGACATGACT CCTGAAAATT TCAAGTGCAA GGACCTACGA1001 CTCACGAGCA TGACATGACT CCTGAAAATT TCAAGTGCAA GGACCTACGA
1051 GAAAATTACT GCCGAAATCC AGATGGGTCT GAATCACCCT GGTGTTTTAC1051 GAAAATTACT GCCGAAATCC AGATGGGTCT GAATCACCCT GGTGTTTTAC
1101 CACTGATCCA AACATCCGAG TTGGCTACTG CTCCCAAATT CCAAACTGTG1101 CACTGATCCA AACATCCGAG TTGGCTACTG CTCCCAAATT CCAAACTGTG
1151 ATATGTCACA TGGACAAGAT TGTTATCGTG GGAATGGCAA AAATTATATG1151 ATATGTCACA TGGACAAGAT TGTTATCGTG GGAATGGCAA AAATTATATG
1201 GGCAACTTAT CCCAAACAAG ATCTGGACTA ACATGTTCAA TGTGGGACAA1201 GGCAACTTAT CCCAAACAAG ATCTGGACTA ACATGTTCAA TGTGGGACAA
1251 GAACATGGAA GACTTACATC GTCATATCTT CTGGGAACCA GATGCAAGTA1251 GAACATGGAA GACTTACATC GTCATATCTT CTGGGAACCA GATGCAAGTA
1301 AGCTGAATGA GAATTACTGC CGAAATCCAG ATGATGATGC TCATGGACCC1301 AGCTGAATGA GAATTACTGC CGAAATCCAG ATGATGATGC TCATGGACCC
1351 TGGTGCTACA CGGGAAATCC ACTCATTCCT TGGGATTATT GCCCTATTTC1351 TGGTGCTACA CGGGAAATCC ACTCATTCCT TGGGATTATT GCCCTATTTC
1401 TCGTTGTGAA GGTGATACCA CACCTACAAT AGTCAATTTA GACCATCCCG1401 TCGTTGTGAA GGTGATACCA CACCTACAAT AGTCAATTTA GACCATCCCG
1451 TAATATCTTG TGCCAAAACG AAACAATTGC GAGTTGTAAA TGGGATTCCA1451 TAATATCTTG TGCCAAAACG AAACAATTGC GAGTTGTAAA TGGGATTCCA
1501 ACACGAACAA ACATAGGATG GATGGTTAGT TTGAGATACA GAAATAAACA1501 ACACGAACAA ACATAGGATG GATGGTTAGT TTGAGATACA GAAATAAACA
1551 TATCTGCGGA GGATCATTGA TAAAGGAGAG TTGGGTTCTT ACTGCACGAC1551 TATCTGCGGA GGATCATTGA TAAAGGAGAG TTGGGTTCTT ACTGCACGAC
1601 AGTGTTTCCC TTCTCGAGAC TTGAAAGATT ATGAAGCTTG GCTTGGAATT1601 AGTGTTTCCC TTCTCGAGAC TTGAAAGATT ATGAAGCTTG GCTTGGAATT
1651 CATGATGTCC ACGGAAGAGG AGATGAGAAA TGCAAACAGG TTCTCAATGT1651 CATGATGTCC ACGGAAGAGG AGATGAGAAA TGCAAACAGG TTCTCAATGT
1701 TTCCCAGCTG GTATATGGCC CTGAAGGATC AGATCTGGTT TTAATGAAGC1701 TTCCCAGCTG GTATATGGCC CTGAAGGATC AGATCTGGTT TTAATGAAGC
1751 TTGCCAGGCC TGCTGTCCTG GATGATTTTG TTAGTACGAT TGATTTACCT1751 TTGCCAGGCC TGCTGTCCTG GATGATTTTG TTAGTACGAT TGATTTACCT
1801 AATTATGGAT GCACAATTCC TGAAAAGACC AGTTGCAGTG TTTATGGCTG1801 AATTATGGAT GCACAATTCC TGAAAAGACC AGTTGCAGTG TTTATGGCTG
1851 GGGCTACACT GGACTGATCA ACTACGACGG CCTGCTGCGG GTGGCCCACC1851 GGGCTACACT GGACTGATCA ACTACGACGG CCTGCTGCGG GTGGCCCACC
1901 TGTACATCAT GGGAAATGAG AAATGCAGCC AGCATCATCG AGGGAAGGTG1901 TGTACATCAT GGGAAATGAG AAATGCAGCC AGCATCATCG AGGGAAGGTG
1951 ACTCTGAATG AGTCTGAAAT ATGTGCTGGG GCTGAAAAGA TTGGATCAGG1951 ACTCTGAATG AGTCTGAAAT ATGTGCTGGG GCTGAAAAGA TTGGATCAGG
2001 ACCATGTGAG GGGGATTATG GTGGCCCACT TGTTTGTGAG CAACATAAAA2001 ACCATGTGAG GGGGATTATG GTGGCCCACT TGTTTGTGAG CAACATAAAA
2051 TGAGAATGGT TCTTGGTGTC ATTGTTCCTG GTCGTGGATG TGCCATTCCA2051 TGAGAATGGT TCTTGGTGTC ATTGTTCCTG GTCGTGGATG TGCCATTCCA
2101 AATCGTCCTG GTATTTTTGT CCGAGTAGCA TATTATGCAA AATGGATCCA2101 AATCGTCCTG GTATTTTTGT CCGAGTAGCA TATTATGCAA AATGGATCCA
2151 CAAGATCATC CTGACCTACA AGGTGCCACA GTCCTGA2151 CAAGATCATC CTGACCTACA AGGTGCCACA GTCCTGA
<160> SEQ ID NО:2<160> SEQ ID NO: 2
<210> 2<210> 2
<211> 576<211> 576
<212> ДНК <212> DNA
<213> Кодон-оптимизированная последовательность Homo sapiens (human) <213> Codon-optimized sequence Homo sapiens (human)
<223> Нуклеотидная последовательность гена фактора роста эндотелия сосудов (hVEGF165)<223> Nucleotide Sequence of Vascular Endothelial Growth Factor Gene (hVEGF165)
<400> 2<400> 2
1 ATGAACTTTC TGCTGAGCTG GGTCCACTGG TCACTGGCAC TGCTGCTGTA1 ATGAACTTTC TGCTGAGCTG GGTCCACTGG TCACTGGCAC TGCTGCTGTA
51 TCTGCATCAC GCAAAATGGT CACAGGCCGC ACCTATGGCC GAGGGCGGAG51 TCTGCATCAC GCAAAATGGT CACAGGCCGC ACCTATGGCC GAGGGCGGAG
101 GGCAGAACCA CCATGAAGTG GTCAAGTTCA TGGACGTGTA CCAGAGATCA101 GGCAGAACCA CCATGAAGTG GTCAAGTTCA TGGACGTGTA CCAGAGATCA
151 TATTGTCACC CTATCGAGAC ACTGGTCGAC ATTTTCCAGG AATACCCAGA151 TATTGTCACC CTATCGAGAC ACTGGTCGAC ATTTTCCAGG AATACCCAGA
201 TGAGATCGAA TATATCTTCA AGCCAAGCTG CGTGCCACTG ATGCGGTGCG201 TGAGATCGAA TATATCTTCA AGCCAAGCTG CGTGCCACTG ATGCGGTGCG
251 GCGGATGCTG TAACGATGAG GGACTGGAAT GCGTCCCCAC CGAGGAATCT251 GCGGATGCTG TAACGATGAG GGACTGGAAT GCGTCCCCAC CGAGGAATCT
301 AATATCACAA TGCAGATCAT GCGAATTAAG CCTCACCAGG GGCAGCATAT301 AATATCACAA TGCAGATCAT GCGAATTAAG CCTCACCAGG GGCAGCATAT
351 TGGCGAGATG AGTTTCCTGC AGCACAACAA ATGCGAGTGT AGGCCAAAGA351 TGGCGAGATG AGTTTCCTGC AGCACAACAA ATGCGAGTGT AGGCCAAAGA
401 AAGACCGAGC TCGACAGGAG AATCCATGTG GACCTTGCTC TGAAAGGAGA401 AAGACCGAGC TCGACAGGAG AATCCATGTG GACCTTGCTC TGAAAGGAGA
451 AAGCATCTGT TTGTGCAGGA CCCCCAGACT TGCAAGTGTA GCTGCAAAAA451 AAGCATCTGT TTGTGCAGGA CCCCCAGACT TGCAAGTGTA GCTGCAAAAA
501 TACCGATTCC AGGTGTAAGG CACGGCAGCT GGAACTGAAT GAGCGGACCT501 TACCGATTCC AGGTGTAAGG CACGGCAGCT GGAACTGAAT GAGCGGACCT
551 GTCGGTGTGA TAAGCCAAGA AGATAA551 GTCGGTGTGA TAAGCCAAGA AGATAA
<160> SEQ ID NО:3<160> SEQ ID NO: 3
<210> 3<210> 3
<211> 229<211> 229
<212> ДНК <212> DNA
<213> искусственная последовательность: hybrid between chicken β-actin (CBA) and minute virus of mice (MMV) introns <213> artificial sequence: hybrid between chicken β-actin (CBA) and minute virus of mice (MMV) introns
<223> Нуклеотидная последовательность гибридного (химерного) интрона<223> Nucleotide sequence of hybrid (chimeric) intron
<400> 3<400> 3
1 ggagtcgctg cgacgctgcc ttcgccccgt gccccgctcc gccgccgcct1 ggagtcgctg cgacgctgcc ttcgccccgt gccccgctcc gccgccgcct
51 cgcgccgccc gccccggctc tgactgaccg cgttactccc acaggtgagc51 cgcgccgccc gccccggctc tgactgaccg cgttactccc acaggtgagc
101 gggcgggacg gcccttctcc tccgggctgt aattagctga gcaagaggta101 gggcgggacg gcccttctcc tccgggctgt aattagctga gcaagaggta
151 agggtttaag ggatggttgg ttggtggggt attaatgttt aattacctgg151 agggtttaag ggatggttgg ttggtggggt attaatgttt aattacctgg
201 agcacctgcc tgaaatcact ttttttcag201 agcacctgcc tgaaatcact ttttttcag
<160> SEQ ID NО:4<160> SEQ ID NO: 4
<210> 4<210> 4
<211> 82<211> 82
<212> ДНК <212> DNA
<213> искусственная последовательность insVEGF-f<213> artificial sequence insVEGF-f
<223> Олигонуклеотид для вставки фосфорилированного дуплекса<223> Oligonucleotide for insertion of phosphorylated duplex
<400> 4<400> 4
1 CATGAGACAA TAACCCTGAT AAATGCTTCA ATaatcTCTA GAcacacaTC1 CATGAGACAA TAACCCTGAT AAATGCTTCA ATaatcTCTA GAcacacaTC
51 CGGAGAAGAG CacacacacG CTCTTCAAAT CT51 CGGAGAAGAG CacacacacG CTCTTCAAAT CT
<160> SEQ ID NО:5<160> SEQ ID NO: 5
<210> 5<210> 5
<211> 82<211> 82
<212> ДНК <212> DNA
<213> искусственная последовательность insVEGF-r<213> artificial sequence insVEGF-r
<223> Олигонуклеотид для вставки фосфорилированного дуплекса<223> Oligonucleotide for insertion of phosphorylated duplex
<400> 5<400> 5
1 CATGAGATTT GAAGAGCgtg tgtgtGCTCT TCTCCGGAtg tgtgTCTAGA1 CATGAGATTT GAAGAGCgtg tgtgtGCTCT TCTCCGGAtg tgtgTCTAGA
51 gattATTGAA GCATTTATCA GGGTTATTGT CT51 gattATTGAA GCATTTATCA GGGTTATTGT CT
<160> SEQ ID NО:6<160> SEQ ID NO: 6
<210> 6<210> 6
<211> 79<211> 79
<212> ДНК <212> DNA
<213> искусственная последовательность hHGFopt-f1<213> artificial sequence hHGFopt-f1
<223> Олигонуклеотид для сборки hHGFopt<223> Oligonucleotide for assembly of hHGFopt
<400> 6<400> 6
1 CCCAAGCTGG CTAGCGGCAT TCCGGTACTG TTGGTAAAGC CACCATGTGG1 CCCAAGCTGG CTAGCGGCAT TCCGGTACTG TTGGTAAAGC CACCATGTGG
51 GTGACCAAGC TGCTGCCAGC CCTGCTGCT51 GTGACCAAGC TGCTGCCAGC CCTGCTGCT
<160> SEQ ID NО:7<160> SEQ ID NO: 7
<210> 7<210> 7
<211> 79<211> 79
<212> ДНК <212> DNA
<213> искусственная последовательность hHGFopt-f2<213> artificial sequence hHGFopt-f2
<223> Олигонуклеотид для сборки hHGFopt<223> Oligonucleotide for assembly of hHGFopt
<400> 7<400> 7
1 GCAGCATGTC CTCCTGCATC TCCTCCTGCT CCCCATCGCC ATCCCCTATG1 GCAGCATGTC CTCCTGCATC TCCTCCTGCT CCCCATCGCC ATCCCCTATG
51 CAGAGGGACA AAGGAAAAGA AGAAATACA51 CAGAGGGACA AAGGAAAAGA AGAAATACA
<160> SEQ ID NО:8<160> SEQ ID NO: 8
<210> 8<210> 8
<211> 79<211> 79
<212> ДНК <212> DNA
<213> искусственная последовательность hHGFopt-f3<213> artificial sequence hHGFopt-f3
<223> Олигонуклеотид для сборки hHGFopt<223> Oligonucleotide for assembly of hHGFopt
<400> 8<400> 8
1 ATTCATGAAT TCAAAAAATC AGCAAAGACC ACCCTGATCA AGATCGACCC1 ATTCATGAAT TCAAAAAATC AGCAAAGACC ACCCTGATCA AGATCGACCC
51 CGCCCTGAAG ATCAAGACCA AAAAAGTGA51 CGCCCTGAAG ATCAAGACCA AAAAAGTGA
<160> SEQ ID NО:9<160> SEQ ID NO: 9
<210> 9<210> 9
<211> 79<211> 79
<212> ДНК <212> DNA
<213> искусственная последовательность hHGFopt-f4<213> artificial sequence hHGFopt-f4
<223> Олигонуклеотид для сборки hHGFopt<223> Oligonucleotide for assembly of hHGFopt
<400> 9<400> 9
1 ATACTGCAGA CCAGTGTGCC AATAGATGTA CCAGGAACAA GGGCCTGCCA1 ATACTGCAGA CCAGTGTGCC AATAGATGTA CCAGGAACAA GGGCCTGCCA
51 TTCACTTGCA AGGCTTTTGT TTTTGATAA51 TTCACTTGCA AGGCTTTTGT TTTTGATAA
<160> SEQ ID NО:10<160> SEQ ID NO: 10
<210> 10<210> 10
<211> 79<211> 79
<212> ДНК <212> DNA
<213> искусственная последовательность hHGFopt-f5<213> artificial sequence hHGFopt-f5
<223> Олигонуклеотид для сборки hHGFopt<223> Oligonucleotide for assembly of hHGFopt
<400> 10<400> 10
1 AGCAAGAAAA CAATGCCTCT GGTTCCCCTT CAATAGCATG TCAAGTGGAG1 AGCAAGAAAA CAATGCCTCT GGTTCCCCTT CAATAGCATG TCAAGTGGAG
51 TGAAAAAAGA ATTTGGCCAT GAATTTGAC51 TGAAAAAAGA ATTTGGCCAT GAATTTGAC
<160> SEQ ID NО:11<160> SEQ ID NO: 11
<210> 11<210> 11
<211> 79<211> 79
<212> ДНК <212> DNA
<213> искусственная последовательность hHGFopt-f6<213> artificial sequence hHGFopt-f6
<223> Олигонуклеотид для сборки hHGFopt<223> Oligonucleotide for assembly of hHGFopt
<400> 11<400> 11
1 CTCTATGAAA ACAAAGACTA CATTAGAAAC TGCATCATTG GTAAAGGACG1 CTCTATGAAA ACAAAGACTA CATTAGAAAC TGCATCATTG GTAAAGGACG
51 CAGCTACAAG GGAACAGTAT CTATCACTA51 CAGCTACAAG GGAACAGTAT CTATCACTA
<160> SEQ ID NО:12<160> SEQ ID NO: 12
<210> 12<210> 12
<211> 79<211> 79
<212> ДНК <212> DNA
<213> искусственная последовательность hHGFopt-f7<213> artificial sequence hHGFopt-f7
<223> Олигонуклеотид для сборки hHGFopt<223> Oligonucleotide for assembly of hHGFopt
<400> 12<400> 12
1 AGAGTGGCAT CAAATGTCAG CCCTGGAGTT CCATGATACC ACACGAACAC1 AGAGTGGCAT CAAATGTCAG CCCTGGAGTT CCATGATACC ACACGAACAC
51 AGCTTTCTGC CTTCCAGCTA CCGGGGCAA51 AGCTTTCTGC CTTCCAGCTA CCGGGGCAA
<160> SEQ ID NО:13<160> SEQ ID NO: 13
<210> 13<210> 13
<211> 79<211> 79
<212> ДНК <212> DNA
<213> искусственная последовательность hHGFopt-f8<213> artificial sequence hHGFopt-f8
<223> Олигонуклеотид для сборки hHGFopt<223> Oligonucleotide for assembly of hHGFopt
<400> 13<400> 13
1 GGACCTGCAG GAGAACTACT GCCGGAACCC TCGAGGGGAA GAAGGGGGAC1 GGACCTGCAG GAGAACTACT GCCGGAACCC TCGAGGGGAA GAAGGGGGAC
51 CCTGGTGTTT CACAAGCAAT CCAGAGGTA51 CCTGGTGTTT CACAAGCAAT CCAGAGGTA
<160> SEQ ID NО:14<160> SEQ ID NO: 14
<210> 14<210> 14
<211> 79<211> 79
<212> ДНК <212> DNA
<213> искусственная последовательность hHGFopt-f9<213> artificial sequence hHGFopt-f9
<223> Олигонуклеотид для сборки hHGFopt<223> Oligonucleotide for assembly of hHGFopt
<400> 14<400> 14
1 CGCTACGAAG TCTGTGACAT TCCTCAGTGT TCAGAAGTTG AATGCATGAC1 CGCTACGAAG TCTGTGACAT TCCTCAGTGT TCAGAAGTTG AATGCATGAC
51 CTGCAATGGG GAGAGTTATC GAGGTCTCA51 CTGCAATGGG GAGAGTTATC GAGGTCTCA
<160> SEQ ID NО:15<160> SEQ ID NO: 15
<210> 15<210> 15
<211> 79<211> 79
<212> ДНК <212> DNA
<213> искусственная последовательность hHGFopt-f10<213> artificial sequence hHGFopt-f10
<223> Олигонуклеотид для сборки hHGFopt<223> Oligonucleotide for assembly of hHGFopt
<400> 15<400> 15
1 TGGATCATAC AGAATCAGGC AAGATTTGTC AGCGCTGGGA TCATCAGACA1 TGGATCATAC AGAATCAGGC AAGATTTGTC AGCGCTGGGA TCATCAGACA
51 CCACACCGGC ACAAATTCTT GCCTGAAAG51 CCACACCGGC ACAAATTCTT GCCTGAAAG
<160> SEQ ID NО:16<160> SEQ ID NO: 16
<210> 16<210> 16
<211> 79<211> 79
<212> ДНК <212> DNA
<213> искусственная последовательность hHGFopt-f11<213> artificial sequence hHGFopt-f11
<223> Олигонуклеотид для сборки hHGFopt<223> Oligonucleotide for assembly of hHGFopt
<400> 16<400> 16
1 ATATCCCGAC AAGGGCTTTG ATGATAATTA TTGCCGCAAT CCCGATGGCC1 ATATCCCGAC AAGGGCTTTG ATGATAATTA TTGCCGCAAT CCCGATGGCC
51 AGCCGAGGCC ATGGTGCTAT ACTCTTGAC51 AGCCGAGGCC ATGGTGCTAT ACTCTTGAC
<160> SEQ ID NО:17<160> SEQ ID NO: 17
<210> 17<210> 17
<211> 79<211> 79
<212> ДНК <212> DNA
<213> искусственная последовательность hHGFopt-f12<213> artificial sequence hHGFopt-f12
<223> Олигонуклеотид для сборки hHGFopt<223> Oligonucleotide for assembly of hHGFopt
<400> 17<400> 17
1 CCTCACACCC GCTGGGAGTA CTGTGCAATT AAAACATGCG CTGACAATAC1 CCTCACACCC GCTGGGAGTA CTGTGCAATT AAAACATGCG CTGACAATAC
51 TATGAATGAC ACTGATGTTC CTTTGGAAA51 TATGAATGAC ACTGATGTTC CTTTGGAAA
<160> SEQ ID NО:18<160> SEQ ID NO: 18
<210> 18<210> 18
<211> 79<211> 79
<212> ДНК <212> DNA
<213> искусственная последовательность hHGFopt-f13<213> artificial sequence hHGFopt-f13
<223> Олигонуклеотид для сборки hHGFopt<223> Oligonucleotide for assembly of hHGFopt
<400> 18<400> 18
1 CAACTGAATG CATCCAAGGT CAAGGAGAAG GCTACAGGGG CACTGTCAAT1 CAACTGAATG CATCCAAGGT CAAGGAGAAG GCTACAGGGG CACTGTCAAT
51 ACCATTTGGA ATGGAATTCC ATGTCAGCG51 ACCATTTGGA ATGGAATTCC ATGTCAGCG
<160> SEQ ID NО:19<160> SEQ ID NO: 19
<210> 19<210> 19
<211> 79<211> 79
<212> ДНК <212> DNA
<213> искусственная последовательность hHGFopt-f14<213> artificial sequence hHGFopt-f14
<223> Олигонуклеотид для сборки hHGFopt<223> Oligonucleotide for assembly of hHGFopt
<400> 19<400> 19
1 TTGGGATTCT CAGTATCCTC ACGAGCATGA CATGACTCCT GAAAATTTCA1 TTGGGATTCT CAGTATCCTC ACGAGCATGA CATGACTCCT GAAAATTTCA
51 AGTGCAAGGA CCTACGAGAA AATTACTGC51 AGTGCAAGGA CCTACGAGAA AATTACTGC
<160> SEQ ID NО:20<160> SEQ ID NO: 20
<210> 20<210> 20
<211> 79<211> 79
<212> ДНК <212> DNA
<213> искусственная последовательность hHGFopt-f15<213> artificial sequence hHGFopt-f15
<223> Олигонуклеотид для сборки hHGFopt<223> Oligonucleotide for assembly of hHGFopt
<400> 20<400> 20
1 CGAAATCCAG ATGGGTCTGA ATCACCCTGG TGTTTTACCA CTGATCCAAA1 CGAAATCCAG ATGGGTCTGA ATCACCCTGG TGTTTTACCA CTGATCCAAA
51 CATCCGAGTT GGCTACTGCT CCCAAATTC51 CATCCGAGTT GGCTACTGCT CCCAAATTC
<160> SEQ ID NО:21<160> SEQ ID NO: 21
<210> 21<210> 21
<211> 79<211> 79
<212> ДНК <212> DNA
<213> искусственная последовательность hHGFopt-f16<213> artificial sequence hHGFopt-f16
<223> Олигонуклеотид для сборки hHGFopt<223> Oligonucleotide for assembly of hHGFopt
<400> 21<400> 21
1 CAAACTGTGA TATGTCACAT GGACAAGATT GTTATCGTGG GAATGGCAAA1 CAAACTGTGA TATGTCACAT GGACAAGATT GTTATCGTGG GAATGGCAAA
51 AATTATATGG GCAACTTATC CCAAACAAG51 AATTATATGG GCAACTTATC CCAAACAAG
<160> SEQ ID NО:22<160> SEQ ID NO: 22
<210> 22<210> 22
<211> 79<211> 79
<212> ДНК <212> DNA
<213> искусственная последовательность hHGFopt-f17<213> artificial sequence hHGFopt-f17
<223> Олигонуклеотид для сборки hHGFopt<223> Oligonucleotide for assembly of hHGFopt
<400> 22<400> 22
1 ATCTGGACTA ACATGTTCAA TGTGGGACAA GAACATGGAA GACTTACATC1 ATCTGGACTA ACATGTTCAA TGTGGGACAA GAACATGGAA GACTTACATC
51 GTCATATCTT CTGGGAACCA GATGCAAGT51 GTCATATCTT CTGGGAACCA GATGCAAGT
<160> SEQ ID NО:23<160> SEQ ID NO: 23
<210> 23<210> 23
<211> 79<211> 79
<212> ДНК <212> DNA
<213> искусственная последовательность hHGFopt-f18<213> artificial sequence hHGFopt-f18
<223> Олигонуклеотид для сборки hHGFopt<223> Oligonucleotide for assembly of hHGFopt
<400> 23<400> 23
1 AAGCTGAATG AGAATTACTG CCGAAATCCA GATGATGATG CTCATGGACC1 AAGCTGAATG AGAATTACTG CCGAAATCCA GATGATGATG CTCATGGACC
51 CTGGTGCTAC ACGGGAAATC CACTCATTC51 CTGGTGCTAC ACGGGAAATC CACTCATTC
<160> SEQ ID NО:24<160> SEQ ID NO: 24
<210> 24<210> 24
<211> 79<211> 79
<212> ДНК <212> DNA
<213> искусственная последовательность hHGFopt-f19<213> artificial sequence hHGFopt-f19
<223> Олигонуклеотид для сборки hHGFopt<223> Oligonucleotide for assembly of hHGFopt
<400> 24<400> 24
1 CTTGGGATTA TTGCCCTATT TCTCGTTGTG AAGGTGATAC CACACCTACA1 CTTGGGATTA TTGCCCTATT TCTCGTTGTG AAGGTGATAC CACACCTACA
51 ATAGTCAATT TAGACCATCC CGTAATATC51 ATAGTCAATT TAGACCATCC CGTAATATC
<160> SEQ ID NО:25<160> SEQ ID NO: 25
<210> 25<210> 25
<211> 79<211> 79
<212> ДНК <212> DNA
<213> искусственная последовательность hHGFopt-f20<213> artificial sequence hHGFopt-f20
<223> Олигонуклеотид для сборки hHGFopt<223> Oligonucleotide for assembly of hHGFopt
<400> 25<400> 25
1 TTGTGCCAAA ACGAAACAAT TGCGAGTTGT AAATGGGATT CCAACACGAA1 TTGTGCCAAA ACGAAACAAT TGCGAGTTGT AAATGGGATT CCAACACGAA
51 CAAACATAGG ATGGATGGTT AGTTTGAGA51 CAAACATAGG ATGGATGGTT AGTTTGAGA
<160> SEQ ID NО:26<160> SEQ ID NO: 26
<210> 26<210> 26
<211> 79<211> 79
<212> ДНК <212> DNA
<213> искусственная последовательность hHGFopt-f21<213> artificial sequence hHGFopt-f21
<223> Олигонуклеотид для сборки hHGFopt<223> Oligonucleotide for assembly of hHGFopt
<400> 26<400> 26
1 TACAGAAATA AACATATCTG CGGAGGATCA TTGATAAAGG AGAGTTGGGT1 TACAGAAATA AACATATCTG CGGAGGATCA TTGATAAAGG AGAGTTGGGT
51 TCTTACTGCA CGACAGTGTT TCCCTTCTC51 TCTTACTGCA CGACAGTGTT TCCCTTCTC
<160> SEQ ID NО:27<160> SEQ ID NO: 27
<210> 27<210> 27
<211> 78<211> 78
<212> ДНК <212> DNA
<213> искусственная последовательность hHGFopt-f22<213> artificial sequence hHGFopt-f22
<223> Олигонуклеотид для сборки hHGFopt<223> Oligonucleotide for assembly of hHGFopt
<400> 27<400> 27
1 GAGACTTGAA AGATTATGAA GCTTGGCTTG GAATTCATGA TGTCCACGGA1 GAGACTTGAA AGATTATGAA GCTTGGCTTG GAATTCATGA TGTCCACGGA
51 AGAGGAGATG AGAAATGCAA ACAGGTTC51 AGAGGAGATG AGAAATGCAA ACAGGTTC
<160> SEQ ID NО:28<160> SEQ ID NO: 28
<210> 28<210> 28
<211> 78<211> 78
<212> ДНК <212> DNA
<213> искусственная последовательность hHGFopt-f23<213> artificial sequence hHGFopt-f23
<223> Олигонуклеотид для сборки hHGFopt<223> Oligonucleotide for assembly of hHGFopt
<400> 28<400> 28
1 TCAATGTTTC CCAGCTGGTA TATGGCCCTG AAGGATCAGA TCTGGTTTTA1 TCAATGTTTC CCAGCTGGTA TATGGCCCTG AAGGATCAGA TCTGGTTTTA
51 ATGAAGCTTG CCAGGCCTGC TGTCCTGG51 ATGAAGCTTG CCAGGCCTGC TGTCCTGG
<160> SEQ ID NО:29<160> SEQ ID NO: 29
<210> 29<210> 29
<211> 78<211> 78
<212> ДНК <212> DNA
<213> искусственная последовательность hHGFopt-f24<213> artificial sequence hHGFopt-f24
<223> Олигонуклеотид для сборки hHGFopt<223> Oligonucleotide for assembly of hHGFopt
<400> 29<400> 29
1 ATGATTTTGT TAGTACGATT GATTTACCTA ATTATGGATG CACAATTCCT1 ATGATTTTGT TAGTACGATT GATTTACCTA ATTATGGATG CACAATTCCT
51 GAAAAGACCA GTTGCAGTGT TTATGGCT51 GAAAAGACCA GTTGCAGTGT TTATGGCT
<160> SEQ ID NО:30<160> SEQ ID NO: 30
<210> 30<210> 30
<211> 78<211> 78
<212> ДНК <212> DNA
<213> искусственная последовательность hHGFopt-f25<213> artificial sequence hHGFopt-f25
<223> Олигонуклеотид для сборки hHGFopt<223> Oligonucleotide for assembly of hHGFopt
<400> 30<400> 30
1 GGGGCTACAC TGGACTGATC AACTACGACG GCCTGCTGCG GGTGGCCCAC1 GGGGCTACAC TGGACTGATC AACTACGACG GCCTGCTGCG GGTGGCCCAC
51 CTGTACATCA TGGGAAATGA GAAATGCA51 CTGTACATCA TGGGAAATGA GAAATGCA
<160> SEQ ID NО:31<160> SEQ ID NO: 31
<210> 31<210> 31
<211> 78<211> 78
<212> ДНК <212> DNA
<213> искусственная последовательность hHGFopt-f26<213> artificial sequence hHGFopt-f26
<223> Олигонуклеотид для сборки hHGFopt<223> Oligonucleotide for assembly of hHGFopt
<400> 31<400> 31
1 GCCAGCATCA TCGAGGGAAG GTGACTCTGA ATGAGTCTGA AATATGTGCT1 GCCAGCATCA TCGAGGGAAG GTGACTCTGA ATGAGTCTGA AATATGTGCT
51 GGGGCTGAAA AGATTGGATC AGGACCAT51 GGGGCTGAAA AGATTGGATC AGGACCAT
<160> SEQ ID NО:32<160> SEQ ID NO: 32
<210> 32<210> 32
<211> 78<211> 78
<212> ДНК <212> DNA
<213> искусственная последовательность hHGFopt-f27<213> artificial sequence hHGFopt-f27
<223> Олигонуклеотид для сборки hHGFopt<223> Oligonucleotide for assembly of hHGFopt
<400> 32<400> 32
1 GTGAGGGGGA TTATGGTGGC CCACTTGTTT GTGAGCAACA TAAAATGAGA1 GTGAGGGGGA TTATGGTGGC CCACTTGTTT GTGAGCAACA TAAAATGAGA
51 ATGGTTCTTG GTGTCATTGT TCCTGGTC51 ATGGTTCTTG GTGTCATTGT TCCTGGTC
<160> SEQ ID NО:33<160> SEQ ID NO: 33
<210> 33<210> 33
<211> 80<211> 80
<212> ДНК <212> DNA
<213> искусственная последовательность hHGFopt-f28<213> artificial sequence hHGFopt-f28
<223> Олигонуклеотид для сборки hHGFopt<223> Oligonucleotide for assembly of hHGFopt
<400> 33<400> 33
1 GTGGATGTGC CATTCCAAAT CGTCCTGG TATTTTTGTC CGAGTAGCAT1 GTGGATGTGC CATTCCAAAT CGTCCTGG TATTTTTGTC CGAGTAGCAT
51 ATTATGCAAA ATGGATCCAC AAGATCATCC51 ATTATGCAAA ATGGATCCAC AAGATCATCC
<160> SEQ ID NО:34<160> SEQ ID NO: 34
<210> 34<210> 34
<211> 77<211> 77
<212> ДНК <212> DNA
<213> искусственная последовательность hHGFopt-f29<213> artificial sequence hHGFopt-f29
<223> Олигонуклеотид для сборки hHGFopt<223> Oligonucleotide for assembly of hHGFopt
<400> 34<400> 34
1 TGACCTACAA GGTGCCACAG TCCTGACTTA AGCTTGGTAC CGAGCTCGGA1 TGACCTACAA GGTGCCACAG TCCTGACTTA AGCTTGGTAC CGAGCTCGGA
51 TCCGCCCCTC TCCCTCCCCC CCCCTAA51 TCCGCCCCTC TCCCTCCCCC CCCCTAA
<160> SEQ ID NО:35<160> SEQ ID NO: 35
<210> 35<210> 35
<211> 39<211> 39
<212> ДНК <212> DNA
<213> искусственная последовательность hHGFopt-r1<213> artificial sequence hHGFopt-r1
<223> Олигонуклеотид для сборки hHGFopt<223> Oligonucleotide for assembly of hHGFopt
<400> 35<400> 35
1 TTAGGGGGGG GGGAGGGAGA GGGGCGGATC CGAGCTCGG1 TTAGGGGGGG GGGAGGGAGA GGGGCGGATC CGAGCTCGG
<160> SEQ ID NО:36<160> SEQ ID NO: 36
<210> 36<210> 36
<211> 79<211> 79
<212> ДНК <212> DNA
<213> искусственная последовательность hHGFopt-r2<213> artificial sequence hHGFopt-r2
<223> Олигонуклеотид для сборки hHGFopt<223> Oligonucleotide for assembly of hHGFopt
<400> 36<400> 36
1 TACCAAGCTT AAGTCAGGAC TGTGGCACCT TGTAGGTCAG GATGATCTTG1 TACCAAGCTT AAGTCAGGAC TGTGGCACCT TGTAGGTCAG GATGATCTTG
51 TGGATCCATT TTGCATAATA TGCTACTCG51 TGGATCCATT TTGCATAATA TGCTACTCG
<160> SEQ ID NО:37<160> SEQ ID NO: 37
<210> 37<210> 37
<211> 79<211> 79
<212> ДНК <212> DNA
<213> искусственная последовательность hHGFopt-r3<213> artificial sequence hHGFopt-r3
<223> Олигонуклеотид для сборки hHGFopt<223> Oligonucleotide for assembly of hHGFopt
<400> 37<400> 37
1 GACAAAAATA CCAGGACGAT TTGGAATGGC ACATCCACGA CCAGGAACAA1 GACAAAAATA CCAGGACGAT TTGGAATGGC ACATCCACGA CCAGGAACAA
51 TGACACCAAG AACCATTCTC ATTTTATGT51 TGACACCAAG AACCATTCTC ATTTTATGT
<160> SEQ ID NО:38<160> SEQ ID NO: 38
<210> 38<210> 38
<211> 79<211> 79
<212> ДНК <212> DNA
<213> искусственная последовательность hHGFopt-r4<213> artificial sequence hHGFopt-r4
<223> Олигонуклеотид для сборки hHGFopt<223> Oligonucleotide for assembly of hHGFopt
<400> 38<400> 38
1 TGCTCACAAA CAAGTGGGCC ACCATAATCC CCCTCACATG GTCCTGATCC1 TGCTCACAAA CAAGTGGGCC ACCATAATCC CCCTCACATG GTCCTGATCC
51 AATCTTTTCA GCCCCAGCAC ATATTTCAG51 AATCTTTTCA GCCCCAGCAC ATATTTCAG
<160> SEQ ID NО:39<160> SEQ ID NO: 39
<210> 39<210> 39
<211> 79<211> 79
<212> ДНК <212> DNA
<213> искусственная последовательность hHGFopt-r5<213> artificial sequence hHGFopt-r5
<223> Олигонуклеотид для сборки hHGFopt<223> Oligonucleotide for assembly of hHGFopt
<400> 39<400> 39
1 ACTCATTCAG AGTCACCTTC CCTCGATGAT GCTGGCTGCA TTTCTCATTT1 ACTCATTCAG AGTCACCTTC CCTCGATGAT GCTGGCTGCA TTTCTCATTT
51 CCCATGATGT ACAGGTGGGC CACCCGCAG51 CCCATGATGT ACAGGTGGGC CACCCGCAG
<160> SEQ ID NО:40<160> SEQ ID NO: 40
<210> 40<210> 40
<211> 79<211> 79
<212> ДНК <212> DNA
<213> искусственная последовательность hHGFopt-r6<213> artificial sequence hHGFopt-r6
<223> Олигонуклеотид для сборки hHGFopt<223> Oligonucleotide for assembly of hHGFopt
<400> 40<400> 40
1 CAGGCCGTCG TAGTTGATCA GTCCAGTGTA GCCCCAGCCA TAAACACTGC1 CAGGCCGTCG TAGTTGATCA GTCCAGTGTA GCCCCAGCCA TAAACACTGC
51 AACTGGTCTT TTCAGGAATT GTGCATCCA51 AACTGGTCTT TTCAGGAATT GTGCATCCA
<160> SEQ ID NО:41<160> SEQ ID NO: 41
<210> 41<210> 41
<211> 79<211> 79
<212> ДНК <212> DNA
<213> искусственная последовательность hHGFopt-r7<213> artificial sequence hHGFopt-r7
<223> Олигонуклеотид для сборки hHGFopt<223> Oligonucleotide for assembly of hHGFopt
<400> 41<400> 41
1 TAATTAGGTA AATCAATCGT ACTAACAAAA TCATCCAGGA CAGCAGGCCT1 TAATTAGGTA AATCAATCGT ACTAACAAAA TCATCCAGGA CAGCAGGCCT
51 GGCAAGCTTC ATTAAAACCA GATCTGATC51 GGCAAGCTTC ATTAAAACCA GATCTGATC
<160> SEQ ID NО:42<160> SEQ ID NO: 42
<210> 42<210> 42
<211> 79<211> 79
<212> ДНК <212> DNA
<213> искусственная последовательность hHGFopt-r8<213> artificial sequence hHGFopt-r8
<223> Олигонуклеотид для сборки hHGFopt<223> Oligonucleotide for assembly of hHGFopt
<400> 42<400> 42
1 CTTCAGGGCC ATATACCAGC TGGGAAACAT TGAGAACCTG TTTGCATTTC1 CTTCAGGGCC ATATACCAGC TGGGAAACAT TGAGAACCTG TTTGCATTTC
51 TCATCTCCTC TTCCGTGGAC ATCATGAAT51 TCATCTCCTC TTCCGTGGAC ATCATGAAT
<160> SEQ ID NО:43<160> SEQ ID NO: 43
<210> 43<210> 43
<211> 79<211> 79
<212> ДНК <212> DNA
<213> искусственная последовательность hHGFopt-r9<213> artificial sequence hHGFopt-r9
<223> Олигонуклеотид для сборки hHGFopt<223> Oligonucleotide for assembly of hHGFopt
<400> 43<400> 43
1 TCCAAGCCAA GCTTCATAAT CTTTCAAGTC TCGAGAAGGG AAACACTGTC1 TCCAAGCCAA GCTTCATAAT CTTTCAAGTC TCGAGAAGGG AAACACTGTC
51 GTGCAGTAAG AACCCAACTC TCCTTTATC51 GTGCAGTAAG AACCCAACTC TCCTTTATC
<160> SEQ ID NО:44<160> SEQ ID NO: 44
<210> 44<210> 44
<211> 79<211> 79
<212> ДНК <212> DNA
<213> искусственная последовательность hHGFopt-r10<213> artificial sequence hHGFopt-r10
<223> Олигонуклеотид для сборки hHGFopt<223> Oligonucleotide for assembly of hHGFopt
<400> 44<400> 44
1 AATGATCCTC CGCAGATATG TTTATTTCTG TATCTCAAAC TAACCATCCA1 AATGATCCTC CGCAGATATG TTTATTTCTG TATCTCAAAC TAACCATCCA
51 TCCTATGTTT GTTCGTGTTG GAATCCCAT51 TCCTATGTTT GTTCGTGTTG GAATCCCAT
<160> SEQ ID NО:45<160> SEQ ID NO: 45
<210> 45<210> 45
<211> 79<211> 79
<212> ДНК <212> DNA
<213> искусственная последовательность hHGFopt-r11<213> artificial sequence hHGFopt-r11
<223> Олигонуклеотид для сборки hHGFopt<223> Oligonucleotide for assembly of hHGFopt
<400> 45<400> 45
1 TTACAACTCG CAATTGTTTC GTTTTGGCAC AAGATATTAC GGGATGGTCT1 TTACAACTCG CAATTGTTTC GTTTTGGCAC AAGATATTAC GGGATGGTCT
51 AAATTGACTA TTGTAGGTGT GGTATCACC51 AAATTGACTA TTGTAGGTGT GGTATCACC
<160> SEQ ID NО:46<160> SEQ ID NO: 46
<210> 46<210> 46
<211> 79<211> 79
<212> ДНК <212> DNA
<213> искусственная последовательность hHGFopt-r12<213> artificial sequence hHGFopt-r12
<223> Олигонуклеотид для сборки hHGFopt<223> Oligonucleotide for assembly of hHGFopt
<400> 46<400> 46
1 TTCACAACGA GAAATAGGGC AATAATCCCA AGGAATGAGT GGATTTCCCG1 TTCACAACGA GAAATAGGGC AATAATCCCA AGGAATGAGT GGATTTCCCG
51 TGTAGCACCA GGGTCCATGA GCATCATCA51 TGTAGCACCA GGGTCCATGA GCATCATCA
<160> SEQ ID NО:47<160> SEQ ID NO: 47
<210> 47<210> 47
<211> 79<211> 79
<212> ДНК <212> DNA
<213> искусственная последовательность hHGFopt-r13<213> artificial sequence hHGFopt-r13
<223> Олигонуклеотид для сборки hHGFopt<223> Oligonucleotide for assembly of hHGFopt
<400> 47<400> 47
1 TCTGGATTTC GGCAGTAATT CTCATTCAGC TTACTTGCAT CTGGTTCCCA1 TCTGGATTTC GGCAGTAATT CTCATTCAGC TTACTTGCAT CTGGTTCCCA
51 GAAGATATGA CGATGTAAGT CTTCCATGT51 GAAGATATGA CGATGTAAGT CTTCCATGT
<160> SEQ ID NО:48<160> SEQ ID NO: 48
<210> 48<210> 48
<211> 79<211> 79
<212> ДНК <212> DNA
<213> искусственная последовательность hHGFopt-r14<213> artificial sequence hHGFopt-r14
<223> Олигонуклеотид для сборки hHGFopt<223> Oligonucleotide for assembly of hHGFopt
<400> 48<400> 48
1 TCTTGTCCCA CATTGAACAT GTTAGTCCAG ATCTTGTTTG GGATAAGTTG1 TCTTGTCCCA CATTGAACAT GTTAGTCCAG ATCTTGTTTG GGATAAGTTG
51 CCCATATAAT TTTTGCCATT CCCACGATA51 CCCATATAAT TTTTGCCATT CCCACGATA
<160> SEQ ID NО:49<160> SEQ ID NO: 49
<210> 49<210> 49
<211> 79<211> 79
<212> ДНК <212> DNA
<213> искусственная последовательность hHGFopt-r15<213> artificial sequence hHGFopt-r15
<223> Олигонуклеотид для сборки hHGFopt<223> Oligonucleotide for assembly of hHGFopt
<400> 49<400> 49
1 ACAATCTTGT CCATGTGACA TATCACAGTT TGGAATTTGG GAGCAGTAGC1 ACAATCTTGT CCATGTGACA TATCACAGTT TGGAATTTGG GAGCAGTAGC
51 CAACTCGGAT GTTTGGATCA GTGGTAAAA51 CAACTCGGAT GTTTGGATCA GTGGTAAAA
<160> SEQ ID NО:50<160> SEQ ID NO: 50
<210> 50<210> 50
<211> 79<211> 79
<212> ДНК <212> DNA
<213> искусственная последовательность hHGFopt-r16<213> artificial sequence hHGFopt-r16
<223> Олигонуклеотид для сборки hHGFopt<223> Oligonucleotide for assembly of hHGFopt
<400> 50<400> 50
1 CACCAGGGTG ATTCAGACCC ATCTGGATTT CGGCAGTAAT TTTCTCGTAG1 CACCAGGGTG ATTCAGACCC ATCTGGATTT CGGCAGTAAT TTTCTCGTAG
51 GTCCTTGCAC TTGAAATTTT CAGGAGTCA51 GTCCTTGCAC TTGAAATTTT CAGGAGTCA
<160> SEQ ID NО:51<160> SEQ ID NO: 51
<210> 51<210> 51
<211> 79<211> 79
<212> ДНК <212> DNA
<213> искусственная последовательность hHGFopt-r17<213> artificial sequence hHGFopt-r17
<223> Олигонуклеотид для сборки hHGFopt<223> Oligonucleotide for assembly of hHGFopt
<400> 51<400> 51
1 TGTCATGCTC GTGAGGATAC TGAGAATCCC AACGCTGACA TGGAATTCCA1 TGTCATGCTC GTGAGGATAC TGAGAATCCC AACGCTGACA TGGAATTCCA
51 TTCCAAATGG TATTGACAGT GCCCCTGTA51 TTCCAAATGG TATTGACAGT GCCCCTGTA
<160> SEQ ID NО:52<160> SEQ ID NO: 52
<210> 52<210> 52
<211> 79<211> 79
<212> ДНК <212> DNA
<213> искусственная последовательность hHGFopt-r18<213> artificial sequence hHGFopt-r18
<223> Олигонуклеотид для сборки hHGFopt<223> Oligonucleotide for assembly of hHGFopt
<400> 52<400> 52
1 GCCTTCTCCT TGACCTTGGA TGCATTCAGT TGTTTCCAAA GGAACATCAG1 GCCTTCTCCT TGACCTTGGA TGCATTCAGT TGTTTCCAAA GGAACATCAG
51 TGTCATTCAT AGTATTGTCA GCGCATGTT51 TGTCATTCAT AGTATTGTCA GCGCATGTT
<160> SEQ ID NО:53<160> SEQ ID NO: 53
<210> 53<210> 53
<211> 79<211> 79
<212> ДНК <212> DNA
<213> искусственная последовательность hHGFopt-r19<213> artificial sequence hHGFopt-r19
<223> Олигонуклеотид для сборки hHGFopt<223> Oligonucleotide for assembly of hHGFopt
<400> 53<400> 53
1 TTAATTGCAC AGTACTCCCA GCGGGTGTGA GGGTCAAGAG TATAGCACCA1 TTAATTGCAC AGTACTCCCA GCGGGTGTGA GGGTCAAGAG TATAGCACCA
51 TGGCCTCGGC TGGCCATCGG GATTGCGGC51 TGGCCTCGGC TGGCCATCGG GATTGCGGC
<160> SEQ ID NО:54<160> SEQ ID NO: 54
<210> 54<210> 54
<211> 79<211> 79
<212> ДНК <212> DNA
<213> искусственная последовательность hHGFopt-r20<213> artificial sequence hHGFopt-r20
<223> Олигонуклеотид для сборки hHGFopt<223> Oligonucleotide for assembly of hHGFopt
<400> 54<400> 54
1 AATAATTATC ATCAAAGCCC TTGTCGGGAT ATCTTTCAGG CAAGAATTTG1 AATAATTATC ATCAAAGCCC TTGTCGGGAT ATCTTTCAGG CAAGAATTTG
51 TGCCGGTGTG GTGTCTGATG ATCCCAGCG51 TGCCGGTGTG GTGTCTGATG ATCCCAGCG
<160> SEQ ID NО:55<160> SEQ ID NO: 55
<210> 55<210> 55
<211> 79<211> 79
<212> ДНК <212> DNA
<213> искусственная последовательность hHGFopt-r21<213> artificial sequence hHGFopt-r21
<223> Олигонуклеотид для сборки hHGFopt<223> Oligonucleotide for assembly of hHGFopt
<400> 55<400> 55
1 CTGACAAATC TTGCCTGATT CTGTATGATC CATGAGACCT CGATAACTCT1 CTGACAAATC TTGCCTGATT CTGTATGATC CATGAGACCT CGATAACTCT
51 CCCCATTGCA GGTCATGCAT TCAACTTCT51 CCCCATTGCA GGTCATGCAT TCAACTTCT
<160> SEQ ID NО:56<160> SEQ ID NO: 56
<210> 56<210> 56
<211> 79<211> 79
<212> ДНК <212> DNA
<213> искусственная последовательность hHGFopt-r22<213> artificial sequence hHGFopt-r22
<223> Олигонуклеотид для сборки hHGFopt<223> Oligonucleotide for assembly of hHGFopt
<400> 56<400> 56
1 GAACACTGAG GAATGTCACA GACTTCGTAG CGTACCTCTG GATTGCTTGT1 GAACACTGAG GAATGTCACA GACTTCGTAG CGTACCTCTG GATTGCTTGT
51 GAAACACCAG GGTCCCCCTT CTTCCCCTC51 GAAACACCAG GGTCCCCCTT CTTCCCCTC
<160> SEQ ID NО:57<160> SEQ ID NO: 57
<210> 57<210> 57
<211> 79<211> 79
<212> ДНК <212> DNA
<213> искусственная последовательность hHGFopt-r23<213> artificial sequence hHGFopt-r23
<223> Олигонуклеотид для сборки hHGFopt<223> Oligonucleotide for assembly of hHGFopt
<400> 57<400> 57
1 GAGGGTTCCG GCAGTAGTTC TCCTGCAGGT CCTTGCCCCG GTAGCTGGAA1 GAGGGTTCCG GCAGTAGTTC TCCTGCAGGT CCTTGCCCCG GTAGCTGGAA
51 GGCAGAAAGC TGTGTTCGTG TGGTATCAT51 GGCAGAAAGC TGTGTTCGTG TGGTATCAT
<160> SEQ ID NО:58<160> SEQ ID NO: 58
<210> 58<210> 58
<211> 78<211> 78
<212> ДНК <212> DNA
<213> искусственная последовательность hHGFopt-r24<213> artificial sequence hHGFopt-r24
<223> Олигонуклеотид для сборки hHGFopt<223> Oligonucleotide for assembly of hHGFopt
<400> 58<400> 58
1 GGAACTCCAG GGCTGACATT TGATGCCACT CTTAGTGATA GATACTGTTC1 GGAACTCCAG GGCTGACATT TGATGCCACT CTTAGTGATA GATACTGTTC
51 CCTTGTAGCT GCGTCCTTTA CCAATGAT51 CCTTGTAGCT GCGTCCTTTA CCAATGAT
<160> SEQ ID NО:59<160> SEQ ID NO: 59
<210> 59<210> 59
<211> 78<211> 78
<212> ДНК <212> DNA
<213> искусственная последовательность hHGFopt-r25<213> artificial sequence hHGFopt-r25
<223> Олигонуклеотид для сборки hHGFopt<223> Oligonucleotide for assembly of hHGFopt
<400> 59<400> 59
1 GCAGTTTCTA ATGTAGTCTT TGTTTTCATA GAGGTCAAAT TCATGGCCAA1 GCAGTTTCTA ATGTAGTCTT TGTTTTCATA GAGGTCAAAT TCATGGCCAA
51 ATTCTTTTTT CACTCCACTT GACATGCT51 ATTCTTTTTT CACTCCACTT GACATGCT
<160> SEQ ID NО:60<160> SEQ ID NO: 60
<210> 60<210> 60
<211> 78<211> 78
<212> ДНК <212> DNA
<213> искусственная последовательность hHGFopt-r26<213> artificial sequence hHGFopt-r26
<223> Олигонуклеотид для сборки hHGFopt<223> Oligonucleotide for assembly of hHGFopt
<400> 60<400> 60
1 ATTGAAGGGG AACCAGAGGC ATTGTTTTCT TGCTTTATCA AAAACAAAAG1 ATTGAAGGGG AACCAGAGGC ATTGTTTTCT TGCTTTATCA AAAACAAAAG
51 CCTTGCAAGT GAATGGCAGG CCCTTGTT51 CCTTGCAAGT GAATGGCAGG CCCTTGTT
<160> SEQ ID NО:61<160> SEQ ID NO: 61
<210> 61<210> 61
<211> 78<211> 78
<212> ДНК <212> DNA
<213> искусственная последовательность hHGFopt-r27<213> artificial sequence hHGFopt-r27
<223> Олигонуклеотид для сборки hHGFopt<223> Oligonucleotide for assembly of hHGFopt
<400> 61<400> 61
1 CCTGGTACAT CTATTGGCAC ACTGGTCTGC AGTATTCACT TTTTTGGTCT1 CCTGGTACAT CTATTGGCAC ACTGGTCTGC AGTATTCACT TTTTTGGTCT
51 TGATCTTCAG GGCGGGGTCG ATCTTGAT51 TGATCTTCAG GGCGGGGTCG ATCTTGAT
<160> SEQ ID NО:62<160> SEQ ID NO: 62
<210> 62<210> 62
<211> 78<211> 78
<212> ДНК <212> DNA
<213> искусственная последовательность hHGFopt-r28<213> artificial sequence hHGFopt-r28
<223> Олигонуклеотид для сборки hHGFopt<223> Oligonucleotide for assembly of hHGFopt
<400> 62<400> 62
1 CAGGGTGGTC TTTGCTGATT TTTTGAATTC ATGAATTGTA TTTCTTCTTT1 CAGGGTGGTC TTTGCTGATT TTTTGAATTC ATGAATTGTA TTTCTTCTTT
51 TCCTTTGTCC CTCTGCATAG GGGATGGC51 TCCTTTGTCC CTCTGCATAG GGGATGGC
<160> SEQ ID NО:63<160> SEQ ID NO: 63
<210> 63<210> 63
<211> 77<211> 77
<212> ДНК <212> DNA
<213> искусственная последовательность hHGFopt-r29<213> artificial sequence hHGFopt-r29
<223> Олигонуклеотид для сборки hHGFopt<223> Oligonucleotide for assembly of hHGFopt
<400> 63<400> 63
1 GATGGGGAGC AGGAGGAGAT GCAGGAGGAC ATGCTGCAGC AGCAGGGCTG1 GATGGGGAGC AGGAGGAGAT GCAGGAGGAC ATGCTGCAGC AGCAGGGCTG
51 GCAGCAGCTT GGTCACCCAC ATGGTGG51 GCAGCAGCTT GGTCACCCAC ATGGTGG
<160> SEQ ID NО:64<160> SEQ ID NO: 64
<210> 64<210> 64
<211> 39<211> 39
<212> ДНК <212> DNA
<213> искусственная последовательность hHGFopt-r30<213> artificial sequence hHGFopt-r30
<223> Олигонуклеотид для сборки hHGFopt<223> Oligonucleotide for assembly of hHGFopt
<400> 64<400> 64
1 CTTTACCAAC AGTACCGGAA TGCCGCTAGC CAGCTTGGG1 CTTTACCAAC AGTACCGGAA TGCCGCTAGC CAGCTTGGG
<160> SEQ ID NО:65<160> SEQ ID NO: 65
<210> 65<210> 65
<211> 55<211> 55
<212> ДНК <212> DNA
<213> искусственная последовательность <213> artificial sequence
<223> Праймер для амплификации CAG-промотора<223> Primer for amplification of the CAG promoter
<400> 65<400> 65
1 CCACCGtcta gaggtacccg ttacataact tacggtaaat ggcccgcctg1 CCACCGtcta gaggtacccg ttacataact tacggtaaat ggcccgcctg
51 gctga51 gctga
<160> SEQ ID NО:66<160> SEQ ID NO: 66
<210> 66<210> 66
<211> 74<211> 74
<212> ДНК <212> DNA
<213> искусственная последовательность <213> artificial sequence
<223> Праймер для амплификации CAG-промотора<223> Primer for amplification of the CAG promoter
<400> 66<400> 66
1 CCACCGTCCG GAATGCCctg aaaaaaagtg atttcaggca ggtgctccag1 CCACCGTCCG GAATGCCctg aaaaaaagtg atttcaggca ggtgctccag
51 gtaattaaac attaataccc cacc51 gtaattaaac attaataccc cacc
<160> SEQ ID NО:67<160> SEQ ID NO: 67
<210> 67<210> 67
<211> 78<211> 78
<212> ДНК <212> DNA
<213> искусственная последовательность hVEGF165-f1<213> hVEGF165-f1 artificial sequence
<223> Олигонуклеотид для сборки hVEGF165<223> Oligonucleotide for assembly of hVEGF165
<400> 67<400> 67
1 CCACCAGCTC TTCCCGGTAC TGTTGGTAAA GCCACCATGA ACTTTCTGCT1 CCACCAGCTC TTCCCGGTAC TGTTGGTAAA GCCACCATGA ACTTTCTGCT
51 GAGCTGGGTC CACTGGTCAC TGGCACTG51 GAGCTGGGTC CACTGGTCAC TGGCACTG
<160> SEQ ID NО:68<160> SEQ ID NO: 68
<210> 68<210> 68
<211> 78<211> 78
<212> ДНК <212> DNA
<213> искусственная последовательность hVEGF165-f2<213> artificial sequence hVEGF165-f2
<223> Олигонуклеотид для сборки hVEGF165<223> Oligonucleotide for assembly of hVEGF165
<400> 68<400> 68
1 CTGCTGTATC TGCATCACGC AAAATGGTCA CAGGCCGCAC CTATGGCCGA1 CTGCTGTATC TGCATCACGC AAAATGGTCA CAGGCCGCAC CTATGGCCGA
51 GGGCGGAGGG CAGAACCACC ATGAAGTG51 GGGCGGAGGG CAGAACCACC ATGAAGTG
<160> SEQ ID NО:69<160> SEQ ID NO: 69
<210> 69<210> 69
<211> 78<211> 78
<212> ДНК <212> DNA
<213> искусственная последовательность hVEGF165-f3<213> artificial sequence hVEGF165-f3
<223> Олигонуклеотид для сборки hVEGF165<223> Oligonucleotide for assembly of hVEGF165
<400> 69<400> 69
1 GTCAAGTTCA TGGACGTGTA CCAGAGATCA TATTGTCACC CTATCGAGAC1 GTCAAGTTCA TGGACGTGTA CCAGAGATCA TATTGTCACC CTATCGAGAC
51 ACTGGTCGAC ATTTTCCAGG AATACCCA51 ACTGGTCGAC ATTTTCCAGG AATACCCA
<160> SEQ ID NО:70<160> SEQ ID NO: 70
<210> 70<210> 70
<211> 78<211> 78
<212> ДНК <212> DNA
<213> искусственная последовательность hVEGF165-f4<213> artificial sequence hVEGF165-f4
<223> Олигонуклеотид для сборки hVEGF165<223> Oligonucleotide for assembly of hVEGF165
<400> 70<400> 70
1 GATGAGATCG AATATATCTT CAAGCCAAGC TGCGTGCCAC TGATGCGGTG1 GATGAGATCG AATATATCTT CAAGCCAAGC TGCGTGCCAC TGATGCGGTG
51 CGGCGGATGC TGTAACGATG AGGGACTG51 CGGCGGATGC TGTAACGATG AGGGACTG
<160> SEQ ID NО:71<160> SEQ ID NO: 71
<210> 71<210> 71
<211> 78<211> 78
<212> ДНК <212> DNA
<213> искусственная последовательность hVEGF165-f5<213> artificial sequence hVEGF165-f5
<223> Олигонуклеотид для сборки hVEGF165<223> Oligonucleotide for assembly of hVEGF165
<400> 71<400> 71
1 GAATGCGTCC CCACCGAGGA ATCTAATATC ACAATGCAGA TCATGCGAAT1 GAATGCGTCC CCACCGAGGA ATCTAATATC ACAATGCAGA TCATGCGAAT
51 TAAGCCTCAC CAGGGGCAGC ATATTGGC51 TAAGCCTCAC CAGGGGCAGC ATATTGGC
<160> SEQ ID NО:72<160> SEQ ID NO: 72
<210> 72<210> 72
<211> 78<211> 78
<212> ДНК <212> DNA
<213> искусственная последовательность hVEGF165-f6<213> artificial sequence hVEGF165-f6
<223> Олигонуклеотид для сборки hVEGF165<223> Oligonucleotide for assembly of hVEGF165
<400> 72<400> 72
1 GAGATGAGTT TCCTGCAGCA CAACAAATGC GAGTGTAGGC CAAAGAAAGA1 GAGATGAGTT TCCTGCAGCA CAACAAATGC GAGTGTAGGC CAAAGAAAGA
51 CCGAGCTCGA CAGGAGAATC CATGTGGA51 CCGAGCTCGA CAGGAGAATC CATGTGGA
<160> SEQ ID NО:73<160> SEQ ID NO: 73
<210> 73<210> 73
<211> 78<211> 78
<212> ДНК <212> DNA
<213> искусственная последовательность hVEGF165-f7<213> artificial sequence hVEGF165-f7
<223> Олигонуклеотид для сборки hVEGF165<223> Oligonucleotide for assembly of hVEGF165
<400> 73<400> 73
1 CCTTGCTCTG AAAGGAGAAA GCATCTGTTT GTGCAGGACC CCCAGACTTG1 CCTTGCTCTG AAAGGAGAAA GCATCTGTTT GTGCAGGACC CCCAGACTTG
51 CAAGTGTAGC TGCAAAAATA CCGATTCC51 CAAGTGTAGC TGCAAAAATA CCGATTCC
<160> SEQ ID NО:74<160> SEQ ID NO: 74
<210> 74<210> 74
<211> 77<211> 77
<212> ДНК <212> DNA
<213> искусственная последовательность hVEGF165-f8<213> artificial sequence hVEGF165-f8
<223> Олигонуклеотид для сборки hVEGF165<223> Oligonucleotide for assembly of hVEGF165
<400> 74<400> 74
1 AGGTGTAAGG CACGGCAGCT GGAACTGAAT GAGCGGACCT GTCGGTGTGA1 AGGTGTAAGG CACGGCAGCT GGAACTGAAT GAGCGGACCT GTCGGTGTGA
51 TAAGCCAAGA AGATAAGTTT AAACCCG51 TAAGCCAAGA AGATAAGTTT AAACCCG
<160> SEQ ID NО:75<160> SEQ ID NO: 75
<210> 75<210> 75
<211> 77<211> 77
<212> ДНК <212> DNA
<213> искусственная последовательность hVEGF165-f9<213> artificial sequence hVEGF165-f9
<223> Олигонуклеотид для сборки hVEGF165<223> Oligonucleotide for assembly of hVEGF165
<400> 75<400> 75
1 CTGATCAGCC TCGACTTCGA GCAGACGCTT CGAGCAGACA TGATAAGATA1 CTGATCAGCC TCGACTTCGA GCAGACGCTT CGAGCAGACA TGATAAGATA
51 CATTGATGAG TTTGGACAAA CCACAAC51 CATTGATGAG TTTGGACAAA CCACAAC
<160> SEQ ID NО:76<160> SEQ ID NO: 76
<210> 76<210> 76
<211> 77<211> 77
<212> ДНК <212> DNA
<213> искусственная последовательность hVEGF165-f10<213> artificial sequence hVEGF165-f10
<223> Олигонуклеотид для сборки hVEGF165<223> Oligonucleotide for assembly of hVEGF165
<400> 76<400> 76
1 TAGAATGCAG TGAAAAAAAT GCTTTATTTG TGAAATTTGT GATGCTATTG1 TAGAATGCAG TGAAAAAAAT GCTTTATTTG TGAAATTTGT GATGCTATTG
51 CTTTATTTGT AACCATTATA AGCTGCA51 CTTTATTTGT AACCATTATA AGCTGCA
<160> SEQ ID NО:77<160> SEQ ID NO: 77
<210> 77<210> 77
<211> 77<211> 77
<212> ДНК <212> DNA
<213> искусственная последовательность hVEGF165-f11<213> artificial sequence hVEGF165-f11
<223> Олигонуклеотид для сборки hVEGF165<223> Oligonucleotide for assembly of hVEGF165
<400> 77<400> 77
1 ATAAACAAGT TAACAACAAC AATTGCATTC ATTTTATGTT TCAGGTTCAG1 ATAAACAAGT TAACAACAAC AATTGCATTC ATTTTATGTT TCAGGTTCAG
51 GGGGAGATGT GGGAGGTTTT TTAAAGC51 GGGGAGATGT GGGAGGTTTT TTAAAGC
<160> SEQ ID NО:78<160> SEQ ID NO: 78
<210> 78<210> 78
<211> 76<211> 76
<212> ДНК <212> DNA
<213> искусственная последовательность hVEGF165-f12<213> artificial sequence hVEGF165-f12
<223> Олигонуклеотид для сборки hVEGF165<223> Oligonucleotide for assembly of hVEGF165
<400> 78<400> 78
1 AACACGTGCT AAAACTTCAT TTTTAATTTA AAAGGATCTA GGTGAAGATC1 AACACGTGCT AAAACTTCAT TTTTAATTTA AAAGGATCTA GGTGAAGATC
51 CTTTTTGATA ATAGAAGAGC TGGTGG51 CTTTTTGATA ATAGAAGAGC TGGTGG
<160> SEQ ID NО:79<160> SEQ ID NO: 79
<210> 79<210> 79
<211> 39<211> 39
<212> ДНК <212> DNA
<213> искусственная последовательность hVEGF165-r1<213> artificial sequence hVEGF165-r1
<223> Олигонуклеотид для сборки hVEGF165<223> Oligonucleotide for assembly of hVEGF165
<400> 79<400> 79
1 CCACCAGCTC TTCTATTATC AAAAAGGATC TTCACCTAG1 CCACCAGCTC TTCTATTATC AAAAAGGATC TTCACCTAG
<160> SEQ ID NО:80<160> SEQ ID NO: 80
<210> 80<210> 80
<211> 78<211> 78
<212> ДНК <212> DNA
<213> искусственная последовательность hVEGF165-r2<213> artificial sequence hVEGF165-r2
<223> Олигонуклеотид для сборки hVEGF165<223> Oligonucleotide for assembly of hVEGF165
<400> 80<400> 80
1 ATCCTTTTAA ATTAAAAATG AAGTTTTAGC ACGTGTTGCT TTAAAAAACC1 ATCCTTTTAA ATTAAAAATG AAGTTTTAGC ACGTGTTGCT TTAAAAAACC
51 TCCCACATCT CCCCCTGAAC CTGAAACA51 TCCCACATCT CCCCCTGAAC CTGAAACA
<160> SEQ ID NО:81<160> SEQ ID NO: 81
<210> 81<210> 81
<211> 78<211> 78
<212> ДНК <212> DNA
<213> искусственная последовательность hVEGF165-r3<213> artificial sequence hVEGF165-r3
<223> Олигонуклеотид для сборки hVEGF165<223> Oligonucleotide for assembly of hVEGF165
<400> 81<400> 81
1 TAAAATGAAT GCAATTGTTG TTGTTAACTT GTTTATTGCA GCTTATAATG1 TAAAATGAAT GCAATTGTTG TTGTTAACTT GTTTATTGCA GCTTATAATG
51 GTTACAAATA AAGCAATAGC ATCACAAA51 GTTACAAATA AAGCAATAGC ATCACAAA
<160> SEQ ID NО:82<160> SEQ ID NO: 82
<210> 82<210> 82
<211> 78<211> 78
<212> ДНК <212> DNA
<213> искусственная последовательность hVEGF165-r4<213> hVEGF165-r4 artificial sequence
<223> Олигонуклеотид для сборки hVEGF165<223> Oligonucleotide for assembly of hVEGF165
<400> 82<400> 82
1 TTTCACAAAT AAAGCATTTT TTTCACTGCA TTCTAGTTGT GGTTTGTCCA1 TTTCACAAAT AAAGCATTTT TTTCACTGCA TTCTAGTTGT GGTTTGTCCA
51 AACTCATCAA TGTATCTTAT CATGTCTG51 AACTCATCAA TGTATCTTAT CATGTCTG
<160> SEQ ID NО:830<160> SEQ ID NO: 830
<210> 83<210> 83
<211> 78<211> 78
<212> ДНК <212> DNA
<213> искусственная последовательность hVEGF165-r5<213> hVEGF165-r5 artificial sequence
<223> Олигонуклеотид для сборки hVEGF165<223> Oligonucleotide for assembly of hVEGF165
<400> 83<400> 83
1 CTCGAAGCGT CTGCTCGAAG TCGAGGCTGA TCAGCGGGTT TAAACTTATC1 CTCGAAGCGT CTGCTCGAAG TCGAGGCTGA TCAGCGGGTT TAAACTTATC
51 TTCTTGGCTT ATCACACCGA CAGGTCCG51 TTCTTGGCTT ATCACACCGA CAGGTCCG
<160> SEQ ID NО:84<160> SEQ ID NO: 84
<210> 84<210> 84
<211> 76<211> 76
<212> ДНК <212> DNA
<213> искусственная последовательность hVEGF165-r6<213> hVEGF165-r6 artificial sequence
<223> Олигонуклеотид для сборки hVEGF165<223> Oligonucleotide for assembly of hVEGF165
<400> 84<400> 84
1 CTCATTCAGTTC CAGCTGCCGT GCCTTACACC TGGAATCGGT ATTTTTGCAG1 CTCATTCAGTTC CAGCTGCCGT GCCTTACACC TGGAATCGGT ATTTTTGCAG
51 CTACACTTGC AAGTCTGGGG GTCCTG51 CTACACTTGC AAGTCTGGGG GTCCTG
<160> SEQ ID NО:85<160> SEQ ID NO: 85
<210> 85<210> 85
<211> 77<211> 77
<212> ДНК <212> DNA
<213> искусственная последовательность hVEGF165-r7<213> hVEGF165-r7 artificial sequence
<223> Олигонуклеотид для сборки hVEGF165<223> Oligonucleotide for assembly of hVEGF165
<400> 85<400> 85
1 CACAAACAGA TGCTTTCTCC TTTCAGAGCA AGGTCCACAT GGATTCTCCT1 CACAAACAGA TGCTTTCTCC TTTCAGAGCA AGGTCCACAT GGATTCTCCT
51 GTCGAGCTCG GTCTTTCTTT GGCCTAC51 GTCGAGCTCG GTCTTTCTTT GGCCTAC
<160> SEQ ID NО:86<160> SEQ ID NO: 86
<210> 86<210> 86
<211> 77<211> 77
<212> ДНК <212> DNA
<213> искусственная последовательность hVEGF165-r8<213> hVEGF165-r8 artificial sequence
<223> Олигонуклеотид для сборки hVEGF165<223> Oligonucleotide for assembly of hVEGF165
<400> 86<400> 86
1 ACTCGCATTT GTTGTGCTGC AGGAAACTCA TCTCGCCAAT ATGCTGCCCC1 ACTCGCATTT GTTGTGCTGC AGGAAACTCA TCTCGCCAAT ATGCTGCCCC
51 TGGTGAGGCT TAATTCGCAT GATCTGC51 TGGTGAGGCT TAATTCGCAT GATCTGC
<160> SEQ ID NО:87<160> SEQ ID NO: 87
<210> 87<210> 87
<211> 77<211> 77
<212> ДНК <212> DNA
<213> искусственная последовательность hVEGF165-r9<213> artificial sequence hVEGF165-r9
<223> Олигонуклеотид для сборки hVEGF165<223> Oligonucleotide for assembly of hVEGF165
<400> 87<400> 87
1 ATTGTGATAT TAGATTCCTC GGTGGGGACG CATTCCAGTC CCTCATCGTT1 ATTGTGATAT TAGATTCCTC GGTGGGGACG CATTCCAGTC CCTCATCGTT
51 ACAGCATCCG CCGCACCGCA TCAGTGG51 ACAGCATCCG CCGCACCGCA TCAGTGG
<160> SEQ ID NО:88<160> SEQ ID NO: 88
<210> 88<210> 88
<211> 77<211> 77
<212> ДНК <212> DNA
<213> искусственная последовательность hVEGF165-r10<213> artificial sequence hVEGF165-r10
<223> Олигонуклеотид для сборки hVEGF165<223> Oligonucleotide for assembly of hVEGF165
<400> 88<400> 88
1 CACGCAGCTT GGCTTGAAGA TATATTCGAT CTCATCTGGG TATTCCTGGA1 CACGCAGCTT GGCTTGAAGA TATATTCGAT CTCATCTGGG TATTCCTGGA
51 AAATGTCGAC CAGTGTCTCG ATAGGGT51 AAATGTCGAC CAGTGTCTCG ATAGGGT
<160> SEQ ID NО:89<160> SEQ ID NO: 89
<210> 89<210> 89
<211> 77<211> 77
<212> ДНК <212> DNA
<213> искусственная последовательность hVEGF165-r11<213> hVEGF165-r11 artificial sequence
<223> Олигонуклеотид для сборки hVEGF165<223> Oligonucleotide for assembly of hVEGF165
<400> 89<400> 89
1 GACAATATGA TCTCTGGTAC ACGTCCATGA ACTTGACCAC TTCATGGTGG1 GACAATATGA TCTCTGGTAC ACGTCCATGA ACTTGACCAC TTCATGGTGG
51 TTCTGCCCTC CGCCCTCGGC CATAGGT51 TTCTGCCCTC CGCCCTCGGC CATAGGT
<160> SEQ ID NО:90<160> SEQ ID NO: 90
<210> 90<210> 90
<211> 77<211> 77
<212> ДНК <212> DNA
<213> искусственная последовательность hVEGF165-r12<213> artificial sequence hVEGF165-r12
<223> Олигонуклеотид для сборки hVEGF165<223> Oligonucleotide for assembly of hVEGF165
<400> 90<400> 90
1 GCGGCCTGTG ACCATTTTGC GTGATGCAGA TACAGCAGCA GTGCCAGTGA1 GCGGCCTGTG ACCATTTTGC GTGATGCAGA TACAGCAGCA GTGCCAGTGA
51 CCAGTGGACC CAGCTCAGCA GAAAGTT51 CCAGTGGACC CAGCTCAGCA GAAAGTT
<160> SEQ ID NО:91<160> SEQ ID NO: 91
<210> 91<210> 91
<211> 39<211> 39
<212> ДНК <212> DNA
<213> искусственная последовательность hVEGF165-r13<213> hVEGF165-r13 artificial sequence
<223> Олигонуклеотид для сборки hVEGF165<223> Oligonucleotide for assembly of hVEGF165
<400> 91<400> 91
1 CATGGTGGCT TTACCAACAG TACCGGGAAG AGCTGGTGG1 CATGGTGGCT TTACCAACAG TACCGGGAAG AGCTGGTGG
<---<---
Claims (19)
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2019135603A RU2737487C1 (en) | 2019-11-06 | 2019-11-06 | Genetic engineering structure for angiogenesis stimulation |
| PCT/RU2021/050002 WO2021091434A2 (en) | 2019-11-06 | 2021-01-05 | Genetic engineering construct for stimulating angiogenesis |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2019135603A RU2737487C1 (en) | 2019-11-06 | 2019-11-06 | Genetic engineering structure for angiogenesis stimulation |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2737487C1 true RU2737487C1 (en) | 2020-12-01 |
Family
ID=73792491
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2019135603A RU2737487C1 (en) | 2019-11-06 | 2019-11-06 | Genetic engineering structure for angiogenesis stimulation |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2737487C1 (en) |
| WO (1) | WO2021091434A2 (en) |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1204247C (en) * | 2001-06-15 | 2005-06-01 | 中国人民解放军军事医学科学院百环生物医学研究中心 | Recombined adenovirus and its use in curing myocardial ischemia |
| RU2449799C2 (en) * | 2009-10-30 | 2012-05-10 | Федеральное Государственное Учреждение "Российский кардиологический научно-производственный комплекс Федерального агентства по высокотехнологичной медицинской помощи" | Agent promoting therapeutic angiogenesis and method for implementation thereof |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6753321B2 (en) * | 2000-09-15 | 2004-06-22 | Genvec, Inc. | Method of modulating neovascularization |
| CN102242148A (en) * | 2010-10-09 | 2011-11-16 | 苏州大学 | Recombinant vector, fibroin film modified by transgenic marrow stromal cells and application thereof |
-
2019
- 2019-11-06 RU RU2019135603A patent/RU2737487C1/en active
-
2021
- 2021-01-05 WO PCT/RU2021/050002 patent/WO2021091434A2/en not_active Ceased
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1204247C (en) * | 2001-06-15 | 2005-06-01 | 中国人民解放军军事医学科学院百环生物医学研究中心 | Recombined adenovirus and its use in curing myocardial ischemia |
| RU2449799C2 (en) * | 2009-10-30 | 2012-05-10 | Федеральное Государственное Учреждение "Российский кардиологический научно-производственный комплекс Федерального агентства по высокотехнологичной медицинской помощи" | Agent promoting therapeutic angiogenesis and method for implementation thereof |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| MAKAREVICH P.I. et al., Angiogenic and pleiotropic effects of VEGF165 and HGF combined gene therapy in a rat model of myocardial infarction, 2018, PLoS ONE, v.13, n.5, e0197566. * |
| СЛОБОДКИНА Е.А. и др., Разработка генотерапевтической плазмидной конструкции, кодирующей фактор роста гепатоцитов (HGF) и фактор роста эндотелия сосудов (VEGF165), Материалы III Национального конгресса по регенеративной медицине, Москва, 15-18 ноября 2017 г., Гены и Клетки, 2017, т.XII, н.3, с.227. MASAKII.et al., Angiogenic gene therapy for experimental critical limb ischemia: acceleration of limb loss by overexpression of vascular endothelial growth factor 165 but not of fibroblast growth factor-2,Circ. Res., 2002,v.90, n.9, p.966-973. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2021091434A3 (en) | 2021-09-23 |
| WO2021091434A8 (en) | 2021-06-10 |
| WO2021091434A2 (en) | 2021-05-14 |
| WO2021091434A9 (en) | 2021-07-08 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP2023089132A (en) | Non-Integrating DNA Vectors for Genetic Modification of Cells | |
| EA027315B1 (en) | Nucleic acid molecule and protein for inducing immune response against prostate cancer antigen, plasmid, expression vector, method of treatment and pharmaceutical composition | |
| KR102248420B1 (en) | Recombinant vector containing target sequence for miR-142-3p | |
| CN113613668A (en) | Miniaturized dystrophin protein and uses thereof | |
| KR20210025122A (en) | Neuropathy treatment with IGF-1-encoding DNA constructs and HGF-encoding DNA constructs | |
| KR20160005333A (en) | The use of sdf-1 to mitigate scar formation | |
| CN113302202B (en) | Treatment of neuropathy with DNA constructs expressing insulin-like growth factor 1 isoforms | |
| WO2008039909A1 (en) | Genetic modification of targeted regions of the cardiac conduction system | |
| RU2737487C1 (en) | Genetic engineering structure for angiogenesis stimulation | |
| HUE032520T2 (en) | A pharmaceutical composition comprising pcmv-vegf165 for stimulation of angiogenesis | |
| AU2007212260A1 (en) | Method for treating peripheral arterial disease with zinc finger proteins | |
| JP2019031511A (en) | Composition having hypoxia-inducible factor-1 alpha and method of using the composition | |
| EP3889263A1 (en) | Mutated human 2ig-b7-h3 protein coding gene, recombinant vector, host cell containing same, pharmaceutical composition and application thereof | |
| US8734780B2 (en) | Methods for treating cardiac pacing conditions | |
| CN115335525B (en) | Modified channel rhodopsin | |
| F. Rossiter et al. | Report of the MDA gene therapy conference, Tucson, Arizona, September 27–28, 1991 | |
| RU2781980C2 (en) | Treatment of neuropathy with dna structures encoding igf-1 and dna structures encoding hgf | |
| AU783059C (en) | Recombinant sequence, its preparation and use | |
| CN100372572C (en) | Recombinant plasmid carrying human thymosin β4 gene | |
| KR20210070221A (en) | Pharmaceutical Composition for Treating Macular Degeneration Containing AAV Including cDNA of Soluble VEGFR-1 Variant | |
| EP1556494A2 (en) | Bicistronic vector encoding a vegf and an fgf, use thereof | |
| US20050186632A1 (en) | Transcription activator | |
| TR201613791A2 (en) | Combination of inducible promoters and therapeutic genes for the prevention and treatment of inflammatory, autoimmune and allergic diseases and prevention of organ rejection in organ transplants | |
| KR20030068337A (en) | Eukaryotic expression vector for human gene therapy |