RU2449799C2 - Agent promoting therapeutic angiogenesis and method for implementation thereof - Google Patents
Agent promoting therapeutic angiogenesis and method for implementation thereof Download PDFInfo
- Publication number
- RU2449799C2 RU2449799C2 RU2009140171/15A RU2009140171A RU2449799C2 RU 2449799 C2 RU2449799 C2 RU 2449799C2 RU 2009140171/15 A RU2009140171/15 A RU 2009140171/15A RU 2009140171 A RU2009140171 A RU 2009140171A RU 2449799 C2 RU2449799 C2 RU 2449799C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- pc4w
- hvegfopt
- hhgfopt
- plasmid
- gene
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 17
- 230000033115 angiogenesis Effects 0.000 title claims abstract description 16
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 title claims description 11
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 title 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims abstract description 32
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 19
- 230000000302 ischemic effect Effects 0.000 claims abstract description 14
- 108010019530 Vascular Endothelial Growth Factors Proteins 0.000 claims abstract description 11
- 108010073929 Vascular Endothelial Growth Factor A Proteins 0.000 claims abstract description 10
- 102000005789 Vascular Endothelial Growth Factors Human genes 0.000 claims abstract description 10
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 10
- 108090000100 Hepatocyte Growth Factor Proteins 0.000 claims abstract description 7
- 102000003745 Hepatocyte Growth Factor Human genes 0.000 claims abstract description 6
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims abstract description 6
- 230000002491 angiogenic effect Effects 0.000 claims description 5
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 claims description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 7
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 4
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 abstract description 2
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 abstract description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 230000006444 vascular growth Effects 0.000 abstract 1
- 210000003141 lower extremity Anatomy 0.000 description 9
- 230000017531 blood circulation Effects 0.000 description 8
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 7
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 208000029078 coronary artery disease Diseases 0.000 description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 6
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 5
- 206010002091 Anaesthesia Diseases 0.000 description 4
- 101000808011 Homo sapiens Vascular endothelial growth factor A Proteins 0.000 description 4
- 230000037005 anaesthesia Effects 0.000 description 4
- 230000004087 circulation Effects 0.000 description 4
- 210000003414 extremity Anatomy 0.000 description 4
- 201000002818 limb ischemia Diseases 0.000 description 4
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 230000003511 endothelial effect Effects 0.000 description 3
- 208000028867 ischemia Diseases 0.000 description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 3
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 3
- 206010002383 Angina Pectoris Diseases 0.000 description 2
- 108010048154 Angiopoietin-1 Proteins 0.000 description 2
- 102000009088 Angiopoietin-1 Human genes 0.000 description 2
- 108010081589 Becaplermin Proteins 0.000 description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 2
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 2
- 206010029113 Neovascularisation Diseases 0.000 description 2
- 102000008299 Nitric Oxide Synthase Human genes 0.000 description 2
- 108010021487 Nitric Oxide Synthase Proteins 0.000 description 2
- 206010034576 Peripheral ischaemia Diseases 0.000 description 2
- 208000007718 Stable Angina Diseases 0.000 description 2
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 230000002526 effect on cardiovascular system Effects 0.000 description 2
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 2
- 102000058223 human VEGFA Human genes 0.000 description 2
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 230000010412 perfusion Effects 0.000 description 2
- 230000026341 positive regulation of angiogenesis Effects 0.000 description 2
- 210000002027 skeletal muscle Anatomy 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 2
- 241000320529 Allobates femoralis Species 0.000 description 1
- 208000024172 Cardiovascular disease Diseases 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 102000016503 Dimethylarginine dimethylaminohydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 108090000379 Fibroblast growth factor 2 Proteins 0.000 description 1
- 102000003974 Fibroblast growth factor 2 Human genes 0.000 description 1
- 101000898034 Homo sapiens Hepatocyte growth factor Proteins 0.000 description 1
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 1
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 1
- PIWKPBJCKXDKJR-UHFFFAOYSA-N Isoflurane Chemical compound FC(F)OC(Cl)C(F)(F)F PIWKPBJCKXDKJR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000428086 Mahanarva tibialis Species 0.000 description 1
- YDGMGEXADBMOMJ-LURJTMIESA-N N(g)-dimethylarginine Chemical compound CN(C)C(\N)=N\CCC[C@H](N)C(O)=O YDGMGEXADBMOMJ-LURJTMIESA-N 0.000 description 1
- 241000514832 Neomyzus circumflexus Species 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 208000031481 Pathologic Constriction Diseases 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000000692 Student's t-test Methods 0.000 description 1
- 230000003187 abdominal effect Effects 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 238000002266 amputation Methods 0.000 description 1
- 239000002870 angiogenesis inducing agent Substances 0.000 description 1
- 238000002399 angioplasty Methods 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 210000001367 artery Anatomy 0.000 description 1
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 description 1
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 1
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000036770 blood supply Effects 0.000 description 1
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 1
- 230000002490 cerebral effect Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 108010048054 dimethylargininase Proteins 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 1
- 239000003651 drinking water Substances 0.000 description 1
- 235000020188 drinking water Nutrition 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 210000003038 endothelium Anatomy 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- KAQKFAOMNZTLHT-VVUHWYTRSA-N epoprostenol Chemical compound O1C(=CCCCC(O)=O)C[C@@H]2[C@@H](/C=C/[C@@H](O)CCCCC)[C@H](O)C[C@@H]21 KAQKFAOMNZTLHT-VVUHWYTRSA-N 0.000 description 1
- 229960001123 epoprostenol Drugs 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 210000001105 femoral artery Anatomy 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000023597 hemostasis Effects 0.000 description 1
- 102000057308 human HGF Human genes 0.000 description 1
- 230000000260 hypercholesteremic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 1
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 1
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 1
- 208000023589 ischemic disease Diseases 0.000 description 1
- 229960002725 isoflurane Drugs 0.000 description 1
- 210000003127 knee Anatomy 0.000 description 1
- 210000002414 leg Anatomy 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 210000003041 ligament Anatomy 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000004088 microvessel Anatomy 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 208000031225 myocardial ischemia Diseases 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 108010064377 prostacyclin synthetase Proteins 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 238000011555 rabbit model Methods 0.000 description 1
- 238000011552 rat model Methods 0.000 description 1
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 208000037804 stenosis Diseases 0.000 description 1
- 230000036262 stenosis Effects 0.000 description 1
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
- YFDSDPIBEUFTMI-UHFFFAOYSA-N tribromoethanol Chemical compound OCC(Br)(Br)Br YFDSDPIBEUFTMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229950004616 tribromoethanol Drugs 0.000 description 1
- 210000000689 upper leg Anatomy 0.000 description 1
- 210000005166 vasculature Anatomy 0.000 description 1
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к области медицины и биотехнологии, а именно к способам терапевтического ангиогенеза, направленным на усиление роста новых сосудов в ишемизированных тканях с целью лечения таких заболеваний, как критическая ишемия нижних конечностей (КИНК) и ишемическая болезнь сердца (ИБС), а также препаратам для его осуществления.The invention relates to the field of medicine and biotechnology, and in particular to methods of therapeutic angiogenesis aimed at enhancing the growth of new vessels in ischemic tissues in order to treat diseases such as critical lower limb ischemia (CINC) and coronary heart disease (CHD), as well as drugs for its implementation.
ИБС и КИНК, наряду с ишемическими нарушениями мозгового кровообращения, в настоящее время относят к основным причинам инвалидизации населения. В России ИБС страдает около 10 миллионов человек трудоспособного возраста, и более чем у трети из них имеется стабильная стенокардия. В 2000 г. заболеваемость ИБС в России составила 425,5 случая на 100 тыс. населения (В.И.Маколкин, Ф.Н.Зябрев. Почему надо снижать частоту сердечных сокращений при лечении стабильной стенокардии. Кардиология 2006. Т.46. С.88-91); при этом на долю ИБС в РФ приходится 48% всех сердечно-сосудистых заболеваний. По данным иностранных авторов на долю больных с рефракторной стенокардией приходится около 15% от всех больных ИБС.IHD and CINC, along with ischemic disorders of cerebral circulation, are currently considered to be the main causes of disability in the population. In Russia, coronary heart disease affects about 10 million people of working age, and more than a third of them have stable angina pectoris. In 2000, the incidence of coronary heart disease in Russia amounted to 425.5 cases per 100 thousand people (V.I. Makolkin, F.N. Zyabrev. Why it is necessary to reduce the heart rate in the treatment of stable angina. Cardiology 2006. V. 46. C .88-91); at the same time, coronary heart disease in the Russian Federation accounts for 48% of all cardiovascular diseases. According to foreign authors, the proportion of patients with refractory angina pectoris accounts for about 15% of all patients with coronary artery disease.
Согласно материалам Европейской согласительной комиссии (European working group on chronic critical leg ischemia "Second European Consensus Document on chronic critical leg ischemia." Eur. J. Vasc. Surg. 1992. V.6 (Suppl. A). P.1-32) из миллиона больных сахарным диабетом КИНК ежегодно диагностируется у 500-1000 пациентов. По статистическим данным окклюзионно-стенотические поражения артерий нижних конечностей возникают у 18-22,5% пациентов с сахарным диабетом, причем данное заболевание характеризуется быстрым прогрессированием и ранним развитием ишемических и гнойно-некротических осложнений. В целом же около 90% ампутаций проводится именно по поводу ишемии нижних конечностей.According to the European Working Group on chronic critical leg ischemia, "Second European Consensus Document on chronic critical leg ischemia." Eur. J. Vasc. Surg. 1992. V.6 (Suppl. A). P.1-32 ) out of a million patients with diabetes, CINC is diagnosed annually in 500-1000 patients. According to statistics, occlusal-stenotic lesions of the arteries of the lower extremities occur in 18-22.5% of patients with diabetes mellitus, and this disease is characterized by rapid progression and early development of ischemic and purulent-necrotic complications. In general, about 90% of amputations are performed specifically for lower limb ischemia.
Лечение КИНК включает целый ряд мер медикаментозного характера, изменение образа жизни, коррекцию сопутствующей патологии, однако наиболее выраженный эффект часто дают хирургические методы восстановления нарушенного кровотока - шунтирование, ангиопластика, атерэктомия и т.д. При этом всегда существует определенная когорта больных с множественными критическими стенозами сосудов нижних конечностей, для которых описанные выше лечебные мероприятия являются неэффективными. То же относится и к лицам, которым уже было выполнено хирургическое вмешательство, в результате чего все последующие операции по восстановлению перфузии становятся крайне затруднительными или невозможными. В связи со сказанным возникает необходимость разработки альтернативных методов лечения КИНК, одним из которых является терапевтический ангиогенез - направление регенеративной медицины, активно развивающееся в последнее время.CINC treatment includes a number of medical measures, lifestyle changes, correction of concomitant pathology, however, the most pronounced effect is often given by surgical methods to restore impaired blood flow - bypass surgery, angioplasty, atherectomy, etc. At the same time, there always exists a certain cohort of patients with multiple critical stenosis of the vessels of the lower extremities, for which the therapeutic measures described above are ineffective. The same applies to persons who have already undergone surgery, as a result of which all subsequent perfusion restoration operations become extremely difficult or impossible. In connection with the foregoing, there is a need to develop alternative treatment methods for CINC, one of which is therapeutic angiogenesis - a direction of regenerative medicine that has been actively developing recently.
Ангиогенез является естественной реакцией организма на ишемию, призванной восстановить кровоснабжение ткани за счет образования новых сосудов. При этом в очаге ишемии активируется синтез ангиогенных факторов роста (АФР), а эндотелиальные клетки-предшественники мобилизуются из костного мозга и мигрируют в очаги неоваскуляризации. Стимуляция ангиогенеза с помощью генной терапии получает все большее распространение как потенциальный метод лечения КИНК и других ишемических заболеваний. Для индукции ангиогенеза в ишемизированной скелетной мускулатуре было предложено использовать плазмидные конструкции, несущие кДНК генов b-FGF, VEGF165, HGF и других факторов роста. Безопасность таких конструкций была показана во многих исследованиях. Однако эффективность известных методов терапевтического ангиогенеза оказалась не слишком высокой (Yla-Herttuala S., Rissanen T.T., Vajanto I. Vascular endothelial growth factors: biology and current status of clinical application in cardiovascular medicine. JMCC 2007. V.49. P.1015-26; Rissanen T.T., Yla-Herttuala S. Current status of cardiovascular gene therapy. Mol. Ther. 2007. V.15. P.1233-47).Angiogenesis is a natural reaction of the body to ischemia, designed to restore blood supply to the tissue due to the formation of new vessels. At the same time, synthesis of angiogenic growth factors (AFR) is activated in the ischemic focus, and endothelial progenitor cells mobilize from the bone marrow and migrate to the foci of neovascularization. Stimulation of angiogenesis using gene therapy is becoming increasingly common as a potential treatment for CINC and other ischemic diseases. To induce angiogenesis in ischemic skeletal muscle, it was proposed to use plasmid constructs carrying cDNA of the b-FGF, VEGF165, HGF, and other growth factors. The safety of such structures has been shown in many studies. However, the effectiveness of known methods of therapeutic angiogenesis was not too high (Yla-Herttuala S., Rissanen TT, Vajanto I. Vascular endothelial growth factors: biology and current status of clinical application in cardiovascular medicine. JMCC 2007. V.49. P.1015- 26; Rissanen TT, Yla-Herttuala S. Current status of cardiovascular gene therapy. Mol. Ther. 2007. V.15. P.1233-47).
Это во многом обусловлено тем, что ангиогенез - это многоэтапный процесс, и каждый этап находится под контролем различных цитокинов и факторов роста, поэтому применение только одного ангиогенного фактора (как в виде рекомбинантого белка, так и виде генетической конструкции) не позволяет добиться значительных результатов.This is largely due to the fact that angiogenesis is a multi-stage process, and each stage is controlled by various cytokines and growth factors, so the use of only one angiogenic factor (both in the form of a recombinant protein and in the form of a genetic construct) does not allow achieving significant results.
Известно использование в терапевтическом ангиогенезе комплексного введения нескольких плазмид, кодирующих разные АФР, в комбинации друг с другом.It is known to use in therapeutic angiogenesis the complex administration of several plasmids encoding different AFRs in combination with each other.
Так, известно использование в экспериментальных исследованиях на животных сочетания гена фактора роста эндотелия сосудов человека (VEGF) с генами эндотелиальной NO-синтазы или простациклин-синтазы либо в комбинации с геном фермента, подавляющим активность эндогенного ингибитора эндотелиальной NO-синтазы (Hiraoka K., Koike H., Yamamoto S. et al. Enhanced therapeutic angiogenesis by cotransfection of prostacyclin syntase gene or optimization of intramuscular injection of naked plasmid DNA. Circulation 2003. V.108. P.2689-96; Jacobi J., Sydow K., von Degenfeld G. et al. Overex-pression of dimethylarginine dimethylaminohydrolase reduces tissue asymmetric dimethylarginine levels and enhances angiogenesis. Circulation 2005. V.111. P.1431-8).Thus, it is known to use in experimental animal studies a combination of the human vascular endothelial growth factor gene (VEGF) gene with endothelial NO synthase or prostacyclin synthase genes or in combination with an enzyme gene that suppresses the activity of an endogenous endothelial NO synthase inhibitor (Hiraoka K., Koike H., Yamamoto S. et al. Enhanced therapeutic angiogenesis by cotransfection of prostacyclin syntase gene or optimization of intramuscular injection of naked plasmid DNA. Circulation 2003. V.108. P.2689-96; Jacobi J., Sydow K., von Degenfeld G. et al. Overex-pression of dimethylarginine dimethylaminohydrolase reduces tissue asymmetric dimethylarginine levels and enhances angiogenesis. Circulation 2005. V.111. P.1431-8) .
Наиболее близким по технической сущности к заявляемому способу является применение в терапевтическом ангиогенезе гена VEGF в комбинации с геном фактора стабилизации сосудов ангиопоэтина-1 (Shyu K.-G., Chang H., Isner J.M. Synergistic effect of angiopoietin-1 and vascular endothelial growth factor on neoangiogenesis in hypercholesterolemic rabbit model with acute hind limb ischemia. Life Sciences 2003. V.73. P.563-79). При этом образовывалась сосудистая сеть, остававшаяся стабильной даже через год после отмены этих факторов.The closest in technical essence to the claimed method is the use of VEGF gene in therapeutic angiogenesis in combination with the gene for vascular stabilization factor angiopoietin-1 (Shyu K.-G., Chang H., Isner JM Synergistic effect of angiopoietin-1 and vascular endothelial growth factor on neoangiogenesis in hypercholesterolemic rabbit model with acute hind limb ischemia. Life Sciences 2003. V.73. P.563-79). At the same time, a vasculature formed, which remained stable even a year after the abolition of these factors.
Вместе с тем сочетание VEGF с другими АФР, такими как FGF-2 или PDGF-BB, оказалось неэффективным, что свидетельствовало о том, что простое механическое смешение генов различных АФР не позволяет добиться надежных результатов (Cao R., Brakenhielm Е., Pawliuk R. et al. Angiogenic synergism, vascular stability and improvement of hind-limb ischemia by a combination of PDGF-BB and FGF. Nat. Med. 2003. V.9. P.604-13).However, the combination of VEGF with other PRA, such as FGF-2 or PDGF-BB, proved to be ineffective, which indicated that simple mechanical mixing of the genes of various PRA does not allow reliable results (Cao R., Brakenhielm E., Pawliuk R . et al. Angiogenic synergism, vascular stability and improvement of hind-limb ischemia by a combination of PDGF-BB and FGF. Nat. Med. 2003. V.9. P.604-13).
Задачей, решаемой авторами настоящего изобретения, являлась разработка более эффективного средства за счет создания комбинации плазмидных конструкций, несущих гены АФР, и способа лечения, которые обеспечивали бы наиболее эффективный ангиогенез в ишемизированной ткани.The problem solved by the authors of the present invention was the development of a more effective means by creating a combination of plasmid constructs carrying AFR genes and a treatment method that would provide the most effective angiogenesis in ischemic tissue.
Технический результат был достигнут при использовании средства, содержащего смесь плазмидных конструкций pC4W-hVEGFopt с оптимизированным геном hVEGFopt фактора роста эндотелия сосудов человека (VEGF) и pC4W-hHGFopt с оптимизированным геном hHGFopt фактора роста гепатоцитов человека (HGF) в массовом соотношении от 1:3 до 3:1. Лучшие результаты достигались при их массовом соотношении 1:1.The technical result was achieved using an agent containing a mixture of plasmid constructs pC4W-hVEGFopt with the optimized hVEGFopt gene for human vascular endothelial growth factor (VEGF) and pC4W-hHGFopt with the optimized hHGFopt gene for human hepatocyte growth factor (HGF) in a weight ratio of 1: 3 to 3: 3: 1. The best results were achieved with their mass ratio of 1: 1.
Способ терапевтического ангиогенеза заключался во введении внутримышечно физиологического раствора, содержащего смесь плазмидных конструкций pC4W-hVEGFopt и pC4W-hHGFopt в концентрации суммарно 2 мг/мл.The method of therapeutic angiogenesis consisted in the introduction of intramuscularly physiological solution containing a mixture of plasmid constructs pC4W-hVEGFopt and pC4W-hHGFopt in a concentration of 2 mg / ml.
Все плазмидные конструкции получали на основе экспрессионного плазмидного вектора pC4W для синтеза белков в клетках млекопитающих, являющегося предметом ранее выданного патента РФ 2364627. В качестве генов, кодирующих VEGF и HGF, использовали оптимизированные нуклеотидные последовательности, являющиеся предметом ранее поданных заявок RU 2008125416 и RU 2008125409 на патенты РФ «Ген HGFopt фактора роста гепатоцитов» и «Ген VEGFopt фактора роста эндотелия сосудов человека», по которым приняты решения о выдаче патентов.All plasmid constructs were obtained on the basis of the expression plasmid vector pC4W for the synthesis of proteins in mammalian cells, which is the subject of the previously issued patent of the Russian Federation 2364627. As genes encoding VEGF and HGF, optimized nucleotide sequences were used, which are the subject of previously filed applications RU 2008125416 and RU 2008125409 for RF patents “HGFopt hepatocyte growth factor gene” and “VEGFopt gene of human vascular endothelial growth factor” gene according to which decisions were made on granting patents.
Комплексное средство получали смешением концентратов ингредиентов в заданных соотношениях и разведением в растворе стерильного 0,9%-ного NaCl до нужной концентрации.A complex product was obtained by mixing the concentrates of ingredients in predetermined proportions and diluting in a solution of sterile 0.9% NaCl to the desired concentration.
На фиг.1 показаны кривые зависимости относительной перфузии ишемизированной конечности мыши от времени, прошедшего после операции, в случае введения: 1) контрольной плазмидной конструкции pC4W-β-GAL, кодирующей β-галактозидазу; 2) контрольного раствора 0,9% NaCl; 3) отдельной плазмидной конструкции pC4W-hHGFopt, кодирующей HGF; 4) отдельной плазмидной конструкции pC4W-hVEGFopt, кодирующей VEGF; и 5) смеси плазмидных конструкций pC4W-hVEGFopt и pC4W-hHGFopt в соотношении 1:1.Figure 1 shows the curves of the relative perfusion of the ischemic limb of the mouse from the time elapsed after the operation in the case of the introduction of: 1) a control plasmid construct pC4W-β-GAL encoding β-galactosidase; 2) a control solution of 0.9% NaCl; 3) a separate plasmid construct pC4W-hHGFopt encoding HGF; 4) a separate plasmid construct pC4W-hVEGFopt encoding VEGF; and 5) mixtures of plasmid constructs pC4W-hVEGFopt and pC4W-hHGFopt in a 1: 1 ratio.
Методология проведения экспериментов и полученные результаты иллюстрируются следующими примерами.The methodology of the experiments and the results are illustrated by the following examples.
Пример 1. Испытания заявляемого препарата проводили в ходе исследований на мышах с ишемизированной задней конечностью. Ишемизацию тканей нижней конечности мыши проводили по модифицированной методике Takeshita с соавторами (Takeshita S. Isshiki Т., Ochiai M., Eto K., Mori H., Tanaka E., Umetani K., Sato Т. Endothelium-dependent relaxation of collateral microvessels after intramuscular gene transfer of vascular endothelial growth factor in a rat model of hindlimb ischemia. Circulation 1998. V.98. P.1261-3). В исследованиях использовали самцов мышей линии С57Вl весом 30 граммов. Операцию проводили в асептических условиях под анестезией (2,5%-ный авертин, интраперитонеально). Производили продольный разрез кожи левого бедра мыши от области паховой связки до коленной области. Бедренную артерию выделяли целиком от начала бифуркации брюшной аорты до разделения на a. poplitae и a. saphenous и ее ветви, включая a. epigastrica inferior, a. femoralis profunda, a. circumflexus lateralis, перевязывали и отсекали. После контроля гемостаза разрез зашивали шелковой нитью с атравматической иглой.Example 1. Tests of the claimed drug was carried out in the course of studies in mice with ischemic hind limb. Ischemia of the tissues of the lower limb of the mouse was carried out according to a modified method of Takeshita et al. (Takeshita S. Isshiki T., Ochiai M., Eto K., Mori H., Tanaka E., Umetani K., Sato T. Endothelium-dependent relaxation of collateral microvessels after intramuscular gene transfer of vascular endothelial growth factor in a rat model of hindlimb ischemia. Circulation 1998. V.98. P.1261-3). The studies used male C57Bl mice weighing 30 grams. The operation was performed under aseptic conditions under anesthesia (2.5% avertin, intraperitoneally). A longitudinal incision was made in the skin of the left thigh of the mouse from the inguinal ligament to the knee region. The femoral artery was isolated entirely from the onset of abdominal aortic bifurcation to division into a. poplitae and a. saphenous and its branches, including a. epigastrica inferior, a. femoralis profunda, a. circumflexus lateralis, bandaged and cut off. After controlling hemostasis, the incision was sutured with silk thread with an atraumatic needle.
Растворы плазмид в стерильном 0,9%-ном NaCl вводили в объеме 100 мкл в переднюю большеберцовую мышцу (m. tibialis anterior) с помощью инсулинового шприца однократной многоточечной (4 точки на мышь) болюсной инъекцией. Суммарная концентрация вводимой плазмидной ДНК составляла 1 мг/мл, если вводили только одну плазмиду, и 2 мг/мл при введении смеси двух плазмид. Для предотвращения вытекания раствора введение проводили медленно в течение 3 секунд под наблюдением.Plasmid solutions in sterile 0.9% NaCl were injected in a volume of 100 μl into the anterior tibial muscle (m. Tibialis anterior) using a single-point multipoint insulin syringe (4 points per mouse) by bolus injection. The total concentration of the introduced plasmid DNA was 1 mg / ml if only one plasmid was introduced, and 2 mg / ml when a mixture of two plasmids was introduced. To prevent leakage of the solution, administration was carried out slowly for 3 seconds under observation.
Для повышения эффективности трансфекции проводили чрескожную низковольтовую электропорацию с пластинчатыми электродами, для чего использовали генератор импульсов "Harvard apparatus BCM830" и прилагаемые к нему электроды. На кожу заранее обработанной и выбритой области голени мыши накладывались электроды, смазанные электропроводящим гелем «Униагель» таким образом, чтобы мышца с введенной плазмидой оказалась зажатой пластинками электродов. Затем подавали 3 импульса длительностью 20 мс, с частотой 1 Гц и напряжением 32-35 В (80 В на 1 см расстояния между пластинками электрода). Затем полярность электродов меняли и подавали еще 3 импульса с такими же характеристиками.To increase the efficiency of transfection, percutaneous low-voltage electroporation with plate electrodes was carried out, for which a Harvard apparatus BCM830 pulse generator and the electrodes attached to it were used. Electrodes were applied to the skin of the previously treated and shaved region of the leg of the mouse, smeared with the Uniagel electroconductive gel so that the muscle with the introduced plasmid would be clamped by the plates of the electrodes. Then 3 pulses were supplied with a duration of 20 ms, with a frequency of 1 Hz and a voltage of 32-35 V (80 V per 1 cm of the distance between the plates of the electrode). Then the polarity of the electrodes was changed and 3 more pulses with the same characteristics were applied.
Пример 2. Анализ восстановления кровотока в ишемизированной конечности мыши.Example 2. Analysis of the restoration of blood flow in the ischemic limb of the mouse.
Эффекты плазмид, несущих гены разных АФР, на стимуляцию ангиогенеза по примеру 1 оценивали по восстановлению кровотока в подошвенной области лапы мышей. Для оценки кровотока по методике Т. Couffinhal использовали лазерный доплеровский флоуметр (Laser Doppler Imaging System, Moor, Великобритания). В данном приборе используется инфракрасный лазер 2,5 мВт, генерирующий луч света, способный проникать на глубину до 1 мм. Метод измерения кровотока основан на том, что клетки крови, проходящие по сосуду, вызывают сдвиг частоты испускаемого света, который и фиксируется прибором.The effects of plasmids carrying genes of different AFR on the stimulation of angiogenesis in Example 1 were evaluated by restoring blood flow in the plantar region of the mouse paw. To evaluate blood flow by the method of T. Couffinhal used a laser Doppler flowmeter (Laser Doppler Imaging System, Moor, UK). This device uses a 2.5 mW infrared laser that generates a beam of light that can penetrate to a depth of 1 mm. The method of measuring blood flow is based on the fact that blood cells passing through the vessel cause a shift in the frequency of the emitted light, which is recorded by the device.
Кровоток измеряли непосредственно до и после операции, а также на 7-й, 14-й и 21-й дни. Анестезию проводили газовой смесью 1,5%-ного изофлюрана/O2 и поддерживали на этой анестезии в течение всего процесса измерения. Во избежание влияния перепадов температуры животных помещали на матрас с поверхностной температурой 37°С и до начала сканирования выдерживали минимум 10 мин при этих условиях. Обрабатывали только данные, отвечающие следующему критерию: «разница в результатах трех последовательных измерений, проведенных с интервалом в 2 мин, не превышает 5%». Для снижения возможного разброса результатов измерений при переходе от одного животного к другому, а также для исключения влияния внешних факторов (свет, глубина наркоза и т.д.) кровоток в ишемизированной конечности выражали в процентном отношении к кровотоку в интактной конечности. В течение периода наблюдения животные получали стандартные лабораторные корма с достаточным количеством питьевой воды.Blood flow was measured immediately before and after surgery, as well as on the 7th, 14th and 21st days. Anesthesia was performed with a gas mixture of 1.5% isoflurane / O 2 and maintained on this anesthesia throughout the measurement process. In order to avoid the influence of temperature differences, the animals were placed on a mattress with a surface temperature of 37 ° C and were kept for at least 10 minutes under these conditions before scanning. Only data meeting the following criterion was processed: “the difference in the results of three consecutive measurements carried out with an interval of 2 minutes does not exceed 5%”. To reduce the possible dispersion of the measurement results during the transition from one animal to another, as well as to exclude the influence of external factors (light, depth of anesthesia, etc.), blood flow in the ischemic limb was expressed as a percentage of blood flow in the intact limb. During the observation period, the animals received standard laboratory feed with enough drinking water.
Полученные результаты приведены на фиг.1. Все результаты представлены в виде числа наблюдений или выборочного среднего ±СОС (стандартная ошибка среднего). Статистическую значимость различий оценивали с помощью критерия χ2 для частотных показателей или Т-критерия Стьюдента после соответствующей проверки на нормальность распределения. Статистически значимыми считались различия, значение р для которых было <0,05.The results are shown in figure 1. All results are presented as the number of observations or sample mean ± SEM (standard error of the mean). The statistical significance of the differences was evaluated using the χ 2 criterion for frequency indicators or Student's T-test after an appropriate check for the normality of the distribution. Differences were considered statistically significant, the p-value for which was <0.05.
Из приведенных экспериментальных данных следует, что ангиогенная активность смеси плазмидных конструкций pC4W-hVEGFopt и pC4W-hHGFopt статистически значимо превосходит ангиогенную активность как отдельной плазмидной конструкции pC4W-hHGFopt (на 7-й, 14-й и 21-й дни, р<0,05), так и отдельной плазмидной конструкции pC4W-hVEGFopt (на 14-й и 21-й дни, р<0,05).It follows from the experimental data that the angiogenic activity of the mixture of plasmid constructs pC4W-hVEGFopt and pC4W-hHGFopt is statistically significantly higher than the angiogenic activity as a separate plasmid construct pC4W-hHGFopt (on the 7th, 14th and 21st days, p <0, 05), as well as a separate plasmid construct pC4W-hVEGFopt (on the 14th and 21st days, p <0.05).
Статистически значимое превосходство смеси pC4W-hVEGFopt и pC4W-hHGFopt по сравнению с контрольным раствором 0,9%-ного NaCl показано на 7-й, 14-й и 21-й дни (р<0,001), а по сравнению с контрольной плазмидной конструкцией pC4W-β-GAL - на 14-й и 21-й дни (р<0,01).The statistically significant superiority of the mixture pC4W-hVEGFopt and pC4W-hHGFopt compared with the control solution of 0.9% NaCl is shown on the 7th, 14th and 21st days (p <0.001), and compared with the control plasmid construct pC4W-β-GAL - on the 14th and 21st days (p <0.01).
Claims (5)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2009140171/15A RU2449799C2 (en) | 2009-10-30 | 2009-10-30 | Agent promoting therapeutic angiogenesis and method for implementation thereof |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2009140171/15A RU2449799C2 (en) | 2009-10-30 | 2009-10-30 | Agent promoting therapeutic angiogenesis and method for implementation thereof |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2009140171A RU2009140171A (en) | 2011-05-10 |
| RU2449799C2 true RU2449799C2 (en) | 2012-05-10 |
Family
ID=44732217
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2009140171/15A RU2449799C2 (en) | 2009-10-30 | 2009-10-30 | Agent promoting therapeutic angiogenesis and method for implementation thereof |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2449799C2 (en) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2628706C2 (en) * | 2015-10-05 | 2017-08-21 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова" (МГУ) | Method of angiogenesis augmentation in ischemic tissues and combination drug for method implementation |
| WO2020139151A1 (en) * | 2018-12-27 | 2020-07-02 | Cell End Gene Therapy Ltd | Gene therapy dna vector based on gene therapy dna vector vtvaf17 |
| RU2737487C1 (en) * | 2019-11-06 | 2020-12-01 | Общество С Ограниченной Ответственностью "Генная И Клеточная Терапия" (Ооо "Генная И Клеточная Терапия") | Genetic engineering structure for angiogenesis stimulation |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2201765C2 (en) * | 1995-10-25 | 2003-04-10 | Транскариотик Терапиз, Инк. | Hybrid matrix implants and explants |
| RU2297848C2 (en) * | 2005-05-11 | 2007-04-27 | Александр Веньяминович Иткес | Gene engineered vegf-ibmed construct |
-
2009
- 2009-10-30 RU RU2009140171/15A patent/RU2449799C2/en active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2201765C2 (en) * | 1995-10-25 | 2003-04-10 | Транскариотик Терапиз, Инк. | Hybrid matrix implants and explants |
| RU2297848C2 (en) * | 2005-05-11 | 2007-04-27 | Александр Веньяминович Иткес | Gene engineered vegf-ibmed construct |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| DIAO Y et al. Construction and activity of recombinant adeno-associated virus expressing vasostatin // Sheng Wu Gong Cheng Xue Bao. 2008 Nov; 24(11): 1949-54 реферат, он-лайн [Найдено в Интернет на www.pubmed.com 15.02.2011], PMID: 19256344 [PubMed - indexed for MEDLINE]. * |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2628706C2 (en) * | 2015-10-05 | 2017-08-21 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова" (МГУ) | Method of angiogenesis augmentation in ischemic tissues and combination drug for method implementation |
| WO2020139151A1 (en) * | 2018-12-27 | 2020-07-02 | Cell End Gene Therapy Ltd | Gene therapy dna vector based on gene therapy dna vector vtvaf17 |
| RU2730664C2 (en) * | 2018-12-27 | 2020-08-24 | Селл энд Джин Терапи Лтд | Gene-therapeutic dna-vector based on gene-therapeutic dna-vector vtvaf17, carrying target gene selected from group of genes ang, angpt1, vegfa, fgf1, hif1α, hgf, sdf1, klk4, pdgfc, prok1, prok2 to increase expression level of said target genes, method for production and use thereof, strain escherichia coli scs110-af/vtvaf17-ang, or escherichia coli scs110-af/vtvaf17-angpt1, or escherichia coli scs110-af/vtvaf17-vegfa, or escherichia coli scs110-af/vtvaf17-fgf1, or escherichia coli scs110-af/vtvaf17-hif1α, or escherichia coli scs110-af/vtvaf17-hgf, or escherichia coli scs110-af/vtvaf17-sdf1, or escherichia coli scs110-af/vtvaf17-klk4, or escherichia coli scs110-af/vtvaf17-pdgfc, or escherichia coli scs110-af/vtvaf17-prok1, or escherichia coli scs110-af/vtvaf17-prok2, carrying gene-therapeutic dna vector, method for production thereof, method for industrial production of gene-therapeutic dna vector |
| RU2737487C1 (en) * | 2019-11-06 | 2020-12-01 | Общество С Ограниченной Ответственностью "Генная И Клеточная Терапия" (Ооо "Генная И Клеточная Терапия") | Genetic engineering structure for angiogenesis stimulation |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2009140171A (en) | 2011-05-10 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Yamaya et al. | Low-energy extracorporeal shock wave therapy promotes vascular endothelial growth factor expression and improves locomotor recovery after spinal cord injury | |
| US10307609B2 (en) | Compositions and methods for controlling pain | |
| JP2021181456A (en) | Spinal subpial gene delivery systems | |
| Makarevich et al. | Combined transfer of human VEGF165 and HGF genes renders potent angiogenic effect in ischemic skeletal muscle | |
| JP2018506530A5 (en) | ||
| Karagyaur et al. | Non-viral transfer of BDNF and uPA stimulates peripheral nerve regeneration | |
| Yu et al. | An engineered VEGF‐activating zinc finger protein transcription factor improves blood flow and limb salvage in advanced‐age mice | |
| Bobek et al. | Gene therapy of the ischemic lower limb—Therapeutic angiogenesis | |
| RU2449799C2 (en) | Agent promoting therapeutic angiogenesis and method for implementation thereof | |
| US10434145B2 (en) | Codon-optimized recombinant plasmid, method of stimulating peripheral nerve regeneration, and method of treating nerve damage in humans | |
| RU2486918C1 (en) | Method for stimulating recovered peripheral tissue innervation | |
| US20110022131A1 (en) | Method for Restoring an Ejaculatory Failure | |
| JP7450244B2 (en) | Methods for treating ischemic tissue | |
| JP5623740B2 (en) | Long-term antegrade epicardial coronary infusion of adeno-associated virus vector for gene therapy | |
| US20120232437A1 (en) | Device for modulating pgc-1 expression, and treating device and treating method for ischemic disease | |
| KR20150130313A (en) | Compositions comprising hypoxia inducible factor-1 alpha and methods of using the same | |
| Yang et al. | Neuropathic pain attenuation by adipose-derived stem cells engineered with RNA-guided gene activation | |
| JP2004518693A (en) | Gene delivery formulations and methods for treating ischemic conditions | |
| RU2522778C2 (en) | Agent for treatment of ischemic lesions of tissues and method of its use | |
| JP4464098B2 (en) | Method for electroporation | |
| RU2628706C2 (en) | Method of angiogenesis augmentation in ischemic tissues and combination drug for method implementation | |
| JP4775663B2 (en) | Angiogenesis control method | |
| US20220409698A1 (en) | Composition for preventing or treating bone diseases comprising ccr2 | |
| Merentie | Cardiological studies in mice: special emphasis on gene therapy, imaging and ECG findings | |
| Rendell | SB-509 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| TC4A | Altering the group of invention authors |
Effective date: 20150413 |
|
| PD4A | Correction of name of patent owner |