RU2734520C1 - Method for detecting the antibiotic resistance gene blavim-2 (metal-beta-lactamase class b vim-2) pseudomonas aeruginosa in ultralow concentrations and specific oligonucleotides for use in the method - Google Patents
Method for detecting the antibiotic resistance gene blavim-2 (metal-beta-lactamase class b vim-2) pseudomonas aeruginosa in ultralow concentrations and specific oligonucleotides for use in the method Download PDFInfo
- Publication number
- RU2734520C1 RU2734520C1 RU2020114569A RU2020114569A RU2734520C1 RU 2734520 C1 RU2734520 C1 RU 2734520C1 RU 2020114569 A RU2020114569 A RU 2020114569A RU 2020114569 A RU2020114569 A RU 2020114569A RU 2734520 C1 RU2734520 C1 RU 2734520C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- blavim
- pseudomonas aeruginosa
- antibiotic resistance
- resistance gene
- crispr
- Prior art date
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 118
- 241000589517 Pseudomonas aeruginosa Species 0.000 title claims abstract description 106
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 title claims abstract description 103
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 title claims abstract description 21
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 19
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 27
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims abstract description 47
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims abstract description 45
- 108091033409 CRISPR Proteins 0.000 claims abstract description 43
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 41
- 238000010354 CRISPR gene editing Methods 0.000 claims abstract description 38
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 38
- 102000004389 Ribonucleoproteins Human genes 0.000 claims abstract description 32
- 108010081734 Ribonucleoproteins Proteins 0.000 claims abstract description 32
- 108020005004 Guide RNA Proteins 0.000 claims description 67
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 23
- 241001112693 Lachnospiraceae Species 0.000 claims description 19
- 108010008532 Deoxyribonuclease I Proteins 0.000 claims description 9
- 102000007260 Deoxyribonuclease I Human genes 0.000 claims description 9
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 claims description 8
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 claims description 5
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 3
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 abstract description 8
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 abstract description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 3
- 238000009007 Diagnostic Kit Methods 0.000 abstract description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 108091027544 Subgenomic mRNA Proteins 0.000 description 57
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 33
- 239000000047 product Substances 0.000 description 27
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 21
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 15
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 14
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 13
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 10
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 9
- 238000011160 research Methods 0.000 description 7
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 6
- 239000000463 material Substances 0.000 description 6
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 6
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 description 6
- 238000011161 development Methods 0.000 description 5
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 5
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 5
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 5
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 4
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- 108700003860 Bacterial Genes Proteins 0.000 description 3
- 241000701806 Human papillomavirus Species 0.000 description 3
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 238000003205 genotyping method Methods 0.000 description 3
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 3
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 3
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 2
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 239000013068 control sample Substances 0.000 description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 2
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 108700004991 Cas12a Proteins 0.000 description 1
- 238000000018 DNA microarray Methods 0.000 description 1
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 241000588747 Klebsiella pneumoniae Species 0.000 description 1
- 108060004795 Methyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 206010036790 Productive cough Diseases 0.000 description 1
- 230000006819 RNA synthesis Effects 0.000 description 1
- 102000018120 Recombinases Human genes 0.000 description 1
- 108010091086 Recombinases Proteins 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 230000000845 anti-microbial effect Effects 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 231100000676 disease causative agent Toxicity 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 230000003394 haemopoietic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 238000012405 in silico analysis Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 239000012678 infectious agent Substances 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 238000011901 isothermal amplification Methods 0.000 description 1
- 210000003563 lymphoid tissue Anatomy 0.000 description 1
- 108060004734 metallo-beta-lactamase Proteins 0.000 description 1
- 102000020235 metallo-beta-lactamase Human genes 0.000 description 1
- 238000013048 microbiological method Methods 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 238000007481 next generation sequencing Methods 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 1
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000011896 sensitive detection Methods 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 210000003802 sputum Anatomy 0.000 description 1
- 208000024794 sputum Diseases 0.000 description 1
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
Область техникиTechnology area
Изобретение относится к области генной инженерии и биотехнологии, а именно к числу средств - направляющих РНК, которые могут быть использованы в системах CRISPR-Cas12 в составе рибонуклеопротеиновых комплексов для выявления (обнаружения, детекции) гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 (металло-бета-лактамаза класс В VIM-2) Pseudomonas aeruginosa, а также к диагностическим способам и наборам.The invention relates to the field of genetic engineering and biotechnology, namely to the number of means - guide RNAs that can be used in CRISPR-Cas12 systems as part of ribonucleoprotein complexes for the detection (detection, detection) of the antibiotic resistance gene blaVIM-2 (metal-beta-lactamase class VIM-2) Pseudomonas aeruginosa, as well as diagnostic methods and kits.
Изобретение позволяет in vitro выявлять единичные копии гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa.The invention allows in vitro detection of single copies of the antibiotic resistance gene blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa.
Направляющие РНК, описанные в настоящей заявке, могут быть использованы для детекции гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa после проведения специфической амплификации фрагментов ДНК гена blaVIM-2. Амплификация при этом может быть проведена различными способами, среди которых полимеразная цепная реакция (PCR); петлевая изотермическая амплификация (LAMP); геликаза-зависимая амплификация (HDA); рекомбиназа-опосредованная амплификация (RPA); амплификация со смещением цепи (SDA); амплификация, основанная на последовательности нуклеиновых кислот (NASBA); опосредованная транскрипцией амплификация (ТМА); амплификация, опосредованная никирующим ферментом (NEAR); круговая амплификация (RCA) и многие другие виды амплификации.The guide RNAs described in this application can be used to detect the antibiotic resistance gene blaVIM-2 of Pseudomonas aeruginosa after specific amplification of DNA fragments of the blaVIM-2 gene. Amplification can be carried out in various ways, including polymerase chain reaction (PCR); loop isothermal amplification (LAMP); helicase-dependent amplification (HDA); recombinase-mediated amplification (RPA); strand displacement amplification (SDA); nucleic acid sequence based amplification (NASBA); transcription-mediated amplification (TMA); dick enzyme-mediated amplification (NEAR); circular amplification (RCA) and many other types of amplification.
Направляющие РНК, описанные в настоящей заявке, могут быть использованы для разработки высокочувствительных и высокотехнологичных диагностических систем нового поколения на основе CRISPR технологий для борьбы с распространением антибиотикоустойчивых бактериальных патогенов.The guide RNAs described in this application can be used to develop highly sensitive and high-tech new generation diagnostic systems based on CRISPR technologies to combat the spread of antibiotic-resistant bacterial pathogens.
Уровень техники.State of the art.
Для решения эпидемиологических задач по расшифровке вспышек инфекционных болезней, выявления и идентификации возбудителя, а также детекции специфических бактериальных генов необходимы разработка и внедрение в практику работы надзорных и мониторинговых служб современных технологий молекулярной эпидемиологии. Одной из таких технологий является использование элементов генетического редактирования системы CRISPR/CAS. Данная технология развивается достаточно эффективно в отношении создания средств лечения некоторых болезней, несмотря на ряд трудностей, связанных с возникновением непредвиденных мутаций. При углубленных исследованиях в области применения CRISPR/CAS системы, было выяснено, что она может быть использована для тонких диагностических процедур при выявлении возбудителя/ей инфекции у человека, а также их генотипирования.To solve epidemiological problems of decoding outbreaks of infectious diseases, detecting and identifying the pathogen, as well as detecting specific bacterial genes, it is necessary to develop and introduce modern technologies of molecular epidemiology into the practice of supervisory and monitoring services. One of these technologies is the use of CRISPR / CAS genetic editing elements. This technology is developing quite effectively in relation to the creation of drugs for the treatment of certain diseases, despite a number of difficulties associated with the occurrence of unexpected mutations. With in-depth studies in the field of application of the CRISPR / CAS system, it was found that it can be used for delicate diagnostic procedures in identifying the causative agent / her infection in humans, as well as their genotyping.
В 2018 году было показано, что один из ферментов CRISPR системы - Cas12 после распознавания своей целевой ДНК-мишени начинает неспецифически гидролизовать одноцепочечную, а также двухцепочечную ДНК. Такое свойство Cas12 можно использовать в качестве индикатора присутствия определенной мишени, например, генома вируса или бактерии. Исследователи использовали это открытие для создания технологической платформы обнаружения нуклеиновых кислот, известной как DETECTR (DNA Endonuclease Targeted CRISPR Trans Reporter - ДНК-нацеленная эндонуклеаза CRISPR транс репортер). Впервые DETECTR была использована для выявления и генотипирования вируса папилломы человека (HPV). Предложенная платформа объединяет нуклеазу Cas12a, ее направляющую РНК, специфичную к нуклеиновой кислоте HPV, флуоресцентную репортерную молекулу. Технология DETECTR используется для обнаружения целевой ДНК-мишени после предварительной амплификации (Chen JS, Ma Е, Harrington LB, Da Costa M, Tian X, Palefsky JM, Doudna JA. CRISPR-Casl2a target binding unleashes indiscriminate single-stranded DNase activity. Science. 2018 Apr 27; 360(6387):436-439).In 2018, it was shown that one of the enzymes of the CRISPR system, Cas12, after recognition of its target DNA target, begins to hydrolyze nonspecifically single-stranded as well as double-stranded DNA. This property of Cas12 can be used as an indicator of the presence of a specific target, for example, the genome of a virus or bacteria. The researchers used this discovery to create a technological platform for the detection of nucleic acids known as DETECTR (DNA Endonuclease Targeted CRISPR Trans Reporter). For the first time, DETECTR was used for the detection and genotyping of the human papillomavirus (HPV). The proposed platform combines Cas12a nuclease, its guide RNA, specific to HPV nucleic acid, and a fluorescent reporter molecule. DETECTR technology is used to detect a target DNA target after preliminary amplification (Chen JS, Ma E, Harrington LB, Da Costa M, Tian X, Palefsky JM, Doudna JA. CRISPR-Casl2a target binding unleashes indiscriminate single-stranded DNase activity. Science. 2018 Apr 27; 360 (6387): 436-439).
He менее важным приложением системы CRISPR/CAS является идентификация бактериальных патогенов и детекция специфических бактериальных генов. Так, например, с помощью платформы SHERLOCK (Specific High Sensitivity Enzymatic Reporter UnLOCKing - Специфичное Высокочувствительное Ферментативное Репортерное Разблокирование) удалось корректно генотипировать ряд штаммов Escherichia coli и Pseudomonas aeruginosa при низкой перекрестной реактивности. Кроме того, платформа SHERLOCK использована для дифференциации клинических изолятов Klebsiella pneumoniae с двумя различными генами антибиотикоустойчивости, что открывает значительные перспективы к созданию мультиплексных систем для одновременной идентификации бактериальных патогенов и выявления у них генов антибиотикоустойчивости.An equally important application of the CRISPR / CAS system is the identification of bacterial pathogens and the detection of specific bacterial genes. For example, using the SHERLOCK platform (Specific High Sensitivity Enzymatic Reporter UnLOCKing), a number of Escherichia coli and Pseudomonas aeruginosa strains were correctly genotyped with low cross-reactivity. In addition, the SHERLOCK platform has been used to differentiate clinical isolates of Klebsiella pneumoniae with two different antibiotic resistance genes, which opens up significant prospects for the creation of multiplex systems for the simultaneous identification of bacterial pathogens and the detection of antibiotic resistance genes in them.
В связи с этим крайне актуальной является задача разработки новых эффективных методик выявления генов антибиотикоустойчивости у бактериальных патогенов, основанных на генетических технологиях, таких как CRISPR/CAS.In this regard, it is extremely urgent to develop new effective methods for detecting antibiotic resistance genes in bacterial pathogens based on genetic technologies such as CRISPR / CAS.
В ходе изучения уровня техники найдены научные статьи, описывающие разработку и получение направляющих РНК для выявления генов антибиотикоустойчивости у бактериальных патогенов с помощью технологии CRISPR/CAS (
Ближайшим аналогом изобретения является статья https://doi.org/10.1038/srep37938 (
Недостатками описанного анализа является необходимость использования дорогостоящего высокотехнологичного оборудования (специализированные нанофлюидные биочипы, инвертированный флуоресцентный микроскоп с увеличением не менее 100×), а также необходимость проведения сложного анализа полученных данных с применением специализированного программного обеспечения. Кроме того, только в перспективе предложенный анализ сможет быть применен к образцам с низкой концентрацией ДНК - предложенный способ, описывает проведение анализа с образцами, содержащими около 108 копий плазмидных ДНК, несущих гены антибиотикоустойчивости (60 нг ДНК, плазмидной ДНК размером 67 т.п.н. - 220 т.п.н.).The disadvantages of the described analysis are the need to use expensive high-tech equipment (specialized nanofluid biochips, an inverted fluorescence microscope with a magnification of at least 100 ×), as well as the need for a complex analysis of the data obtained using specialized software. In addition, only in the future, the proposed analysis can be applied to samples with a low concentration of DNA - the proposed method describes the analysis with samples containing about 10 8 copies of plasmid DNA carrying antibiotic resistance genes (60 ng DNA, plasmid DNA size 67 kb) .n. - 220 kb).
Исходя из этого, возникает техническая проблема, заключающаяся в необходимости получения направляющих РНК для выявления единичных копий гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 (металло-бета-лактамаза класс В VIM-2) Pseudomonas aeruginosa in vitro и разработке соответствующих способов обнаружения гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa.Based on this, a technical problem arises, consisting in the need to obtain guide RNAs for the detection of single copies of the antibiotic resistance gene blaVIM-2 (metallo-beta-lactamase class B VIM-2) Pseudomonas aeruginosa in vitro and the development of appropriate methods for detecting the antibiotic resistance gene blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa.
Раскрытие сущностиDisclosure of essence
Предложенная технология перспективна для разнообразных применений, включая количественное определение ДНК/РНК, быструю мультиплексную детекцию экспрессии, другие виды чувствительной детекции, например, выявление загрязнения образцов нуклеиновыми кислотами. Технология основанная на CRISPR/CAS является многофункциональной, устойчивой к ошибкам технологией детекции ДНК, пригодной для быстрой постановки диагнозов, включая инфекционные заболевания, и генотипирования инфекционных агентов и выявление генов антибиотикоустойчивости бактериальных патогенов.The proposed technology is promising for a variety of applications, including quantitative determination of DNA / RNA, rapid multiplex expression detection, and other types of sensitive detection, for example, detecting contamination of samples with nucleic acids. The CRISPR / CAS-based technology is a multifunctional, error-resistant DNA detection technology, suitable for rapid diagnosis, including infectious diseases, and genotyping of infectious agents and identification of antibiotic resistance genes of bacterial pathogens.
Применение предложенной технологии делает возможным создание диагностических систем нового поколения, которые будут обладать следующими свойствами:The use of the proposed technology makes it possible to create a new generation of diagnostic systems that will have the following properties:
- высокая чувствительность;- high sensitivity;
- возможность проведения диагностики у постели больного;- possibility of diagnostics at the patient's bedside;
- возможность проведения диагностики в полевых условиях без применения специализированного высокотехнологичного оборудования;- the ability to conduct diagnostics in the field without the use of specialized high-tech equipment;
- скорость и простота анализа;- speed and ease of analysis;
- сниженная стоимость анализа;- reduced cost of analysis;
- отсутствие необходимости оснащения диагностической лаборатории дорогостоящим оборудованием;- no need to equip the diagnostic laboratory with expensive equipment;
- отсутствие необходимости проведения выделения нуклеиновых кислот возбудителя.- no need for isolation of nucleic acids of the pathogen.
Изобретение относится к новым средствам - направляющим РНК, которые могут быть использованы в системах CRISPR-Cas12 для ультрачувствительного выявления, идентификации, обнаружения или детекции гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa в биологических образцах.The invention relates to new means - guide RNAs, which can be used in CRISPR-Cas12 systems for ultrasensitive detection, identification, detection or detection of the antibiotic resistance gene blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa in biological samples.
Технической задачей предложенного изобретения является разработка новых средств - направляющих РНК, которые могут быть использованы в системах CRISPR-Cas12 с белками Cas12, такими как белок LbCpf1 из Lachnospiraceae, для ультрачувствительного выявления гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa.The technical objective of the proposed invention is the development of new means - guide RNAs that can be used in CRISPR-Cas12 systems with Cas12 proteins, such as the LbCpf1 protein from Lachnospiraceae, for ultrasensitive detection of the antibiotic resistance gene blaVIM-2 of Pseudomonas aeruginosa.
При осуществлении настоящего изобретения, согласно приведенной в формуле изобретения совокупности существенных признаков, достигается неожиданный технический результат - возможность ультрачувствительного выявления гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa до единичных копий гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa в одной реакции. Изобретение обеспечивает повышение эффективности выявления гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa с 1-5×105 до 2-3×102 копий/мл.When implementing the present invention, according to the set of essential features given in the claims, an unexpected technical result is achieved - the possibility of ultrasensitive detection of the antibiotic resistance gene blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa to single copies of the antibiotic resistance gene blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa in one reaction. The invention improves the efficiency of detecting the antibiotic resistance gene blaVIM-2 of Pseudomonas aeruginosa from 1-5 × 10 5 to 2-3 × 10 2 copies / ml.
Технический результат достигается за счет:The technical result is achieved due to:
- разработки молекул направляющих РНК, которые могут быть использованы в системах CRISPR-Cas12 для ультрачувствительного выявления гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa, где указанные направляющие РНК выбраны из последовательностей SEQ ID NO: 1-5, способны связываться с целевыми высоко консервативными участками гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa, содержат РНК-шпильку, которая распознается РНК-направляемой ДНК-эндонуклеазой LbCpf1 из Lachnospiraceae, с обеспечением выявления единичных копий гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa;- development of guide RNA molecules that can be used in CRISPR-Cas12 systems for ultrasensitive detection of the antibiotic resistance gene blaVIM-2 of Pseudomonas aeruginosa, where these guide RNAs are selected from the sequences SEQ ID NO: 1-5, are able to bind to the target highly conserved regions of the antibiotic resistance gene blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa, contain an RNA hairpin, which is recognized by the RNA-directed DNA endonuclease LbCpf1 from Lachnospiraceae, ensuring the detection of single copies of the antibiotic resistance gene blaVIM-2 of Pseudomonas aeruginosa;
- применения РНК-направляемой ДНК-эндонуклеазы LbCpf1 из Lachnospiraceae, полученных согласно способу, разработанному авторами ранее (Изобретение по патенту РФ №2707542, дата приоритета 28.03.2019, опубликовано 27.11.2019), для создания рибонуклеопротеиновых комплексов (РПК) системы CRISPR/CAS, пригодных для детекции гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa в ультранизких концентрациях (единичные копии);- the use of RNA-directed DNA endonuclease LbCpf1 from Lachnospiraceae, obtained according to the method developed by the authors earlier (Invention according to RF patent No. 2707542, priority date 03/28/2019, published 11/27/2019), to create ribonucleoprotein complexes (RPK) of the CRISPR / CAS system suitable for the detection of the antibiotic resistance gene blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa in ultra-low concentrations (single copies);
- разработки набора специфических олигонуклеотидов, выбранных из SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 7, для предварительной амплификации фрагмента гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa;- development of a set of specific oligonucleotides selected from SEQ ID NO: 6 and SEQ ID NO: 7, for preliminary amplification of a fragment of the antibiotic resistance gene blaVIM-2 of Pseudomonas aeruginosa;
- оптимизации условий проведения предварительной амплификации фрагмента гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa;- optimization of conditions for preliminary amplification of a fragment of the antibiotic resistance gene blaVIM-2 of Pseudomonas aeruginosa;
- определения условий проведения ультрачувствительной детекции гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa и установления последовательности стадий метода.- determining the conditions for ultrasensitive detection of the antibiotic resistance gene blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa and establishing the sequence of the method steps.
Направляющие РНК согласно настоящему изобретению соответствуют высоко консервативным фрагментам гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa. Наиболее предпочтительны направляющие РНК, распознающиеся РНК-направляемой ДНК-эндонуклеазой LbCpf1 из Lachnospiraceae, характеризующиеся, имеющие или содержащие нуклеотидную последовательность, выбранную из:The guide RNAs of the present invention correspond to highly conserved fragments of the Pseudomonas aeruginosa blaVIM-2 antibiotic resistance gene. Most preferred are guide RNAs recognized by the RNA-directed DNA endonuclease LbCpf1 from Lachnospiraceae, characterized by having or containing a nucleotide sequence selected from:
- SEQ ID NO: 1;- SEQ ID NO: 1;
- SEQ ID NO: 2;- SEQ ID NO: 2;
- SEQ ID NO: 3;- SEQ ID NO: 3;
- SEQ ID NO: 4;- SEQ ID NO: 4;
-SEQ ID NO: 5;-SEQ ID NO: 5;
- или идентичной любой из них по меньшей мере на 80% - 99,99%,- or identical to any of them by at least 80% - 99.99%,
- или комплементарной любой из них,- or complementary to any of them,
- или гибридизующейся с любой из них в строгих условиях.- or hybridizing with any of them under stringent conditions.
Набор специфических олигонуклеотидов для проведения предварительной амплификации фрагмента гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa согласно настоящему изобретению соответствует высоко консервативному участку гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa. Наиболее предпочтительны олигонуклеотиды, характеризующиеся, имеющие или содержащие нуклеотидную последовательность, выбранную из:A set of specific oligonucleotides for carrying out preliminary amplification of a fragment of the antibiotic resistance gene blaVIM-2 of Pseudomonas aeruginosa according to the present invention corresponds to a highly conserved region of the gene of antibiotic resistance blaVIM-2 of Pseudomonas aeruginosa. Most preferred are oligonucleotides characterized by having or containing a nucleotide sequence selected from:
- SEQ ID NO: 6;- SEQ ID NO: 6;
- SEQ ID NO: 7;- SEQ ID NO: 7;
- или идентичной любой из них по меньшей мере на 80% - 99,99%,- or identical to any of them by at least 80% - 99.99%,
- или комплементарной любой из них,- or complementary to any of them,
- или гибридизующейся с любой из них в строгих условиях.- or hybridizing with any of them under stringent conditions.
Согласно предложенному изобретению получают рибонуклеопротеиновые комплексы (РПК), состоящие из по меньшей мере одной направляющей РНК и РНК-направляемой ДНК-нуклеазы системы CRISPR/CAS LbCpf1 из Lachnospiraceae, пригодные для использования для выявления гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa в ультранизких концентрациях (единичные копии).According to the proposed invention, ribonucleoprotein complexes (RPKs) are obtained, consisting of at least one guide RNA and RNA-guided DNA nuclease of the CRISPR / CAS LbCpf1 system from Lachnospiraceae, suitable for use for detecting the antibiotic resistance gene blaVIM-2 of Pseudomonas aeruginosa in ultra-low concentrations copies).
Препараты РПК представляют собой растворы, содержащие направляющую РНК, выбранную из SEQ ID NO: 1-5, объединенную с белком системы CRISPR/CAS (LbCpf1 из Lachnospiraceae) или лиофильно высушенные РПК.PKK preparations are solutions containing a guide RNA selected from SEQ ID NO: 1-5, combined with a CRISPR / CAS protein (LbCpf1 from Lachnospiraceae) or freeze-dried PKK.
Полученные направляющие РНК могут быть использованы в составе набора для обнаружения гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa с инструкцией по применению.The resulting guide RNAs can be used as part of a kit for detecting the antibiotic resistance gene blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa with instructions for use.
Способ обнаружения гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa предусматривает:The method for detecting the antibiotic resistance gene blaVIM-2 of Pseudomonas aeruginosa includes:
i) проведение предварительной амплификации материала образца от пациента, предположительно содержащего Pseudomonas aeruginosa с использованием одного или нескольких специфических олигонуклеотидов, выбранных из SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 7, с целью получения мишени - предварительно амплифицированного фрагмента гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa,i) carrying out preliminary amplification of sample material from a patient suspected of containing Pseudomonas aeruginosa using one or more specific oligonucleotides selected from SEQ ID NO: 6 and SEQ ID NO: 7 in order to obtain a target - a preliminary amplified fragment of the antibiotic resistance gene blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa,
ii) приготовление реакционной смеси для детекции, содержащей мишень, полученную на стадии (i); рибонуклеопротеиновый комплекс системы CRISPR/CAS, сформированный из РНК-направляемой ДНК-эндонуклеазы LbCpf1 из Lachnospiraceae, и по меньшей мере одной направляющей РНК с SEQ ID NO: 1-5; флюоресцентный зонд и буфер для детекции,ii) preparing a reaction mixture for detection containing the target obtained in step (i); ribonucleoprotein complex of the CRISPR / CAS system, formed from RNA-directed DNA endonuclease LbCpf1 from Lachnospiraceae, and at least one guide RNA with SEQ ID NO: 1-5; fluorescent probe and detection buffer,
iii) проведение 30-60 циклов детекции в реакционной смеси, полученной на стадии (ii), в амплификаторе,iii) carrying out 30-60 cycles of detection in the reaction mixture obtained in step (ii) in an amplifier,
с обнаружением таким образом гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa.thus detecting the antibiotic resistance gene blaVIM-2 of Pseudomonas aeruginosa.
Предварительно амплифицированный фрагмент гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa согласно предложенному способу может быть представлен фрагментом с 37 по 447 п.о. (размером 411 п.о.) гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa.The pre-amplified fragment of the blaVIM-2 antibiotic resistance gene of Pseudomonas aeruginosa according to the proposed method can be represented by a fragment from 37 to 447 bp. (411 bp in size) of the blaVIM-2 antibiotic resistance gene of Pseudomonas aeruginosa.
Предложенный способ обеспечивает выявление гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa в ультранизких концентрациях, вплоть до единичных копий.The proposed method provides for the detection of the antibiotic resistance gene blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa in ultra-low concentrations, up to single copies.
Специфический олигонуклеотид для использования в способе выбирается из группы SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 7 и используется для предварительной амплификации высоко консервативного фрагмента гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa, который распознается рибонуклеопротеиновым комплексом.A specific oligonucleotide for use in the method is selected from the group SEQ ID NO: 6 and SEQ ID NO: 7 and is used to pre-amplify a highly conserved fragment of the Pseudomonas aeruginosa blaVIM-2 antibiotic resistance gene, which is recognized by the ribonucleoprotein complex.
Набор для использования в способе обнаружения гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa содержит рибонуклеопротеиновый комплекс системы CRISPR/CAS, сформированный из РНК-направляемой ДНК-эндонуклеазы LbCpfl из Lachnospiraceae, и по меньшей мере одной направляющей РНК с SEQ ID NO: 1-5; флюоресцентный зонд, буфер для детекции и инструкцию по применению.The kit for use in the method of detecting the antibiotic resistance gene blaVIM-2 of Pseudomonas aeruginosa contains a ribonucleoprotein complex of the CRISPR / CAS system, formed from RNA-directed DNA endonuclease LbCpfl from Lachnospiraceae, and at least one guide RNA with SEQ ID NO: 1-5; fluorescent probe, detection buffer and instructions for use.
Набор может дополнительно включать компоненты для проведения предварительной амплификации высоко консервативного фрагмента гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa, в том числе один или несколько специфических олигонуклеотидов, выбранных из SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 7.The kit may additionally include components for pre-amplifying a highly conserved fragment of the Pseudomonas aeruginosa blaVIM-2 antibiotic resistance gene, including one or more specific oligonucleotides selected from SEQ ID NO: 6 and SEQ ID NO: 7.
При этом по меньшей мере одна направляющая РНК в составе набора может находиться в комплексе с белком системы CRISPR/CAS (LbCpf1 из Lachnospiraceae) в одном контейнере или отдельно в разных контейнерах.In this case, at least one guide RNA in the kit can be complexed with a CRISPR / CAS protein (LbCpf1 from Lachnospiraceae) in one container or separately in different containers.
Предложенная технология позволяет определить единичные копии гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa в биологических образцах пациента, выбранных из жидкости и/или ткани, предположительно содержащих Pseudomonas aeruginosa. Биологическим образцом может быть образец крови, сыворотки или плазмы крови, клеток крови, слюны, мокроты, лимфоидных тканей, тканей кроветворных органов и других биологических материалов от пациента, которые могут быть использованы для анализа на наличие гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa.The proposed technology makes it possible to determine single copies of the antibiotic resistance gene blaVIM-2 of Pseudomonas aeruginosa in biological samples of a patient selected from fluid and / or tissue, presumably containing Pseudomonas aeruginosa. A biological sample can be a sample of blood, serum or blood plasma, blood cells, saliva, sputum, lymphoid tissues, tissues of hematopoietic organs and other biological materials from a patient, which can be used to analyze for the presence of the antibiotic resistance gene blaVIM-2 of Pseudomonas aeruginosa.
Краткое описание чертежейBrief Description of Drawings
Фиг. 1. Визуализация фрагмента гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa с 37 по 447 п.о. (размером 411 п.о.) после предварительной амплификации при помощи электрофореза в агарозном геле, где цифрами 1-8 обозначены:FIG. 1. Visualization of a fragment of the antibiotic resistance gene blaVIM-2 of Pseudomonas aeruginosa from 37 to 447 bp. (411 bp in size) after preliminary amplification by electrophoresis in agarose gel, where numbers 1-8 indicate:
1 - ПЦР-продукт blaVIM-2, полученный в ходе амплификации 1 нг модельной матрицы pGEM-T-blaVIM-2;1 - PCR product blaVIM-2, obtained during the amplification of 1 ng of the pGEM-T-blaVIM-2 model template;
2 - ПЦР-продукт blaVIM-2, полученный в ходе амплификации 0,1 нг модельной матрицы pGEM-T-blaVIM-2;2 - PCR product blaVIM-2, obtained during the amplification of 0.1 ng of the pGEM-T-blaVIM-2 model template;
3 - ПЦР-продукт blaVIM-2, полученный в ходе амплификации 0,01 нг модельной матрицы pGEM-T-blaVIM-2;3 - PCR product blaVIM-2, obtained during amplification of 0.01 ng of the model pGEM-T-blaVIM-2 template;
4 - ПЦР-продукт blaVIM-2, полученный в ходе амплификации 0,001 нг модельной матрицы pGEM-T-blaVIM-2;4 - PCR product blaVIM-2, obtained during the amplification of 0.001 ng of the pGEM-T-blaVIM-2 model template;
5 - ПЦР-продукт blaVIM-2, полученный в ходе амплификации 0,0001 нг модельной матрицы pGEM-T-blaVIM-2;5 - PCR product blaVIM-2 obtained during the amplification of 0.0001 ng of the model pGEM-T-blaVIM-2 template;
6 - ПЦР-продукт blaVIM-2, полученный в ходе амплификации 0,00001 нг модельной матрицы pGEM-T-blaVIM-2;6 - PCR product blaVIM-2, obtained during the amplification of 0.00001 ng of the pGEM-T-blaVIM-2 model template;
7 - отрицательный контроль, не содержащий модельной матрицы pGEM-T-blaVIM-2;7 - negative control, not containing the model matrix pGEM-T-blaVIM-2;
М - стандарты молекулярных масс: снизу вверх 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1200, 1500, 2000, 3000 пар нуклеотидов (GeneRuler 100 bp Plus, Thermo Fisher Scientific, США).M - molecular weight standards: from bottom to top 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1200, 1500, 2000, 3000 base pairs (GeneRuler 100 bp Plus, Thermo Fisher Scientific, USA).
Фиг. 2. Визуализация ПЦР-продуктов, кодирующих направляющие РНК, специфичные к гену антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa, при помощи электрофореза в агарозном геле, где цифрами 1-5 обозначены:FIG. 2. Visualization of PCR products encoding guide RNAs specific to the antibiotic resistance gene blaVIM-2 of Pseudomonas aeruginosa using agarose gel electrophoresis, where numbers 1-5 indicate:
1 - ПЦР-продукт, кодирующий sgRNA blaVIM-2 №93;1 - PCR product encoding sgRNA blaVIM-2 # 93;
2 - ПЦР-продукт, кодирующий sgRNA blaVIM-2 №95;2 - PCR product encoding sgRNA blaVIM-2 No. 95;
3 - ПЦР-продукт, кодирующий sgRNA blaVIM-2 №207;3 - PCR product encoding sgRNA blaVIM-2 # 207;
4 - ПЦР-продукт, кодирующий sgRNA blaVIM-2 №285;4 - PCR product encoding sgRNA blaVIM-2 # 285;
5 - ПЦР-продукт, кодирующий sgRNA blaVIM-2 №366;5 - PCR product encoding sgRNA blaVIM-2 # 366;
М - стандарты молекулярных масс: снизу вверх 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1200, 1500, 2000, 3000 пар нуклеотидов (GeneRuler 100 bp Plus, Thermo Fisher Scientific, США).M - molecular weight standards: from bottom to top 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1200, 1500, 2000, 3000 base pairs (GeneRuler 100 bp Plus, Thermo Fisher Scientific, USA).
Фиг. 3. Профиль флуоресценции в реальном времени для предварительно амплифицированной мишени blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa, обработанной рибонуклеопортеиновым комплексом, содержащим направляющую РНК sgRNA blaVIM-2 №93 и белок LbCpf1.FIG. 3. Real-time fluorescence profile for a pre-amplified Pseudomonas aeruginosa blaVIM-2 target treated with a ribonucleoportein complex containing sgRNA blaVIM-2 guide RNA # 93 and LbCpf1 protein.
Фиг. 4. Профиль флуоресценции в реальном времени для предварительно амплифицированной мишени blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa, обработанной рибонуклеопортеиновым комплексом, содержащим направляющую РНК sgRNA blaVIM-2 №95 и белок LbCpf1.FIG. 4. Real-time fluorescence profile for a pre-amplified Pseudomonas aeruginosa blaVIM-2 target treated with a ribonucleoportein complex containing sgRNA blaVIM-2 guide RNA No. 95 and LbCpf1 protein.
Фиг. 5. Профиль флуоресценции в реальном времени для предварительно амплифицированной мишени blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa, обработанной рибонуклеопортеиновым комплексом, содержащим направляющую РНК sgRNA blaVIM-2 №207 и белок LbCpf1.FIG. 5. Real-time fluorescence profile for a pre-amplified Pseudomonas aeruginosa blaVIM-2 target treated with a ribonucleoportein complex containing sgRNA blaVIM-2 guide RNA # 207 and LbCpf1 protein.
Фиг. 6. Профиль флуоресценции в реальном времени для предварительно амплифицированной мишени blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa, обработанной рибонуклеопортеиновым комплексом, содержащим направляющую РНК sgRNA blaVIM-2 №285 и белок LbCpf1.FIG. 6. Real-time fluorescence profile for a pre-amplified Pseudomonas aeruginosa blaVIM-2 target treated with a ribonucleoportein complex containing sgRNA blaVIM-2 guide RNA # 285 and LbCpf1 protein.
Фиг. 7. Профиль флуоресценции в реальном времени для предварительно амплифицированной мишени blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa, обработанной рибонуклеопортеиновым комплексом, содержащим направляющую РНК sgRNA blaVIM-2 №366 и белок LbCpf1.FIG. 7. Real-time fluorescence profile for a pre-amplified Pseudomonas aeruginosa blaVIM-2 target treated with a ribonucleoportein complex containing sgRNA blaVIM-2 guide RNA # 366 and LbCpf1 protein.
Фиг. 8. Значения флуоресценции в конечной точке (30 цикл анализа, 30 минут) для предварительно амплифицированной мишени blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa, обработанной рибонуклеопортеиновым комплексом, содержащим направляющие РНК sgRNA blaVIM-2 №93, sgRNA blaVIM-2 №95, sgRNA blaVIM-2 №207, sgRNA blaVIM-2 №285 и sgRNA blaVIM-2 №366.FIG. 8. Endpoint fluorescence values (30 analysis cycle, 30 minutes) for pre-amplified Pseudomonas aeruginosa blaVIM-2 target treated with ribonucleoportein complex containing guide RNA sgRNA blaVIM-2 No. 93, sgRNA blaVIM-2 No. 95, sgRNA blaVIM # 207, sgRNA blaVIM-2 # 285 and sgRNA blaVIM-2 # 366.
Фиг. 9. Значения флуоресценции в конечной точке (30 цикл анализа, 30 минут) для предварительно амплифицированных с клинических образцов мишеней blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa, обработанных рибонуклеопортеиновым комплексом, содержащим направляющую РНК sgRNA blaVIM-2 №93.FIG. 9. Endpoint fluorescence values (30 analysis cycle, 30 minutes) for Pseudomonas aeruginosa blaVIM-2 targets pre-amplified from clinical samples, treated with ribonucleoportein complex containing sgRNA blaVIM-2 guide RNA No. 93.
Фиг. 10. Значения флуоресценции в конечной точке (30 цикл анализа, 30 минут) для предварительно амплифицированных с клинических образцов мишеней blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa, обработанных рибонуклеопортеиновым комплексом, содержащим направляющую РНК sgRNA blaVIM-2 №95.FIG. 10. Endpoint fluorescence values (30 analysis cycle, 30 minutes) for Pseudomonas aeruginosa blaVIM-2 targets pre-amplified from clinical samples and treated with ribonucleoportein complex containing sgRNA blaVIM-2 guide RNA No. 95.
Фиг. 11. Значения флуоресценции в конечной точке (30 цикл анализа, 30 минут) для предварительно амплифицированных с клинических образцов мишеней blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa, обработанных рибонуклеопортеиновым комплексом, содержащим направляющую РНК sgRNA blaVIM-2 №207.FIG. 11. Endpoint fluorescence values (30 analysis cycle, 30 minutes) for Pseudomonas aeruginosa blaVIM-2 targets pre-amplified from clinical samples, treated with ribonucleoportein complex containing sgRNA blaVIM-2 guide RNA No. 207.
Фиг. 12. Значения флуоресценции в конечной точке (30 цикл анализа, 30 минут) для предварительно амплифицированных с клинических образцов мишеней blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa, обработанных рибонуклеопортеиновым комплексом, содержащим направляющую РНК sgRNA blaVIM-2 №285.FIG. 12. Endpoint fluorescence values (30 analysis cycle, 30 minutes) for Pseudomonas aeruginosa blaVIM-2 targets pre-amplified from clinical samples, treated with ribonucleoportein complex containing sgRNA blaVIM-2 guide RNA No. 285.
Фиг. 13. Значения флуоресценции в конечной точке (30 цикл анализа, 30 минут) для предварительно амплифицированных с клинических образцов мишеней blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa, обработанных рибонуклеопортеиновым комплексом, содержащим направляющую РНК sgRNA blaVIM-2 №366.FIG. 13. Endpoint fluorescence values (30 analysis cycle, 30 minutes) for Pseudomonas aeruginosa blaVIM-2 targets pre-amplified from clinical samples, treated with ribonucleoportein complex containing sgRNA blaVIM-2 guide RNA No. 366.
Примеры осуществления изобретенияExamples of implementation of the invention
ПРИМЕР 1: ПОДБОР ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ-МИШЕНЕЙ В ГЕНЕ АНТИБИОТИКОУСТОЙЧИВОСТИ BLAVIM-2 PSEUDOMONAS AERUGINOSA ДЛЯ СОЗДАНИЯ НАПРАВЛЯЮЩИХ РНКEXAMPLE 1: SELECTION OF TARGET SEQUENCES IN THE BLAVIM-2 PSEUDOMONAS AERUGINOSA ANTIBIOTIC RESISTANCE GENE FOR GUIDING RNA CREATION
Для подбора последовательностей-мишеней в гене антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa для создания направляющих РНК были использованы современные алгоритмы in silico анализа нуклеотидных последовательностей и программы, находящиеся в открытом доступе, включая Benchling (https://www.benchling.com/molecular-biology/). Был составлен перечень участков в гене антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa с теоретически рассчитанной вероятностью их расщепления в высоко консервативных участках (Таблица 1).To select target sequences in the blaVIM-2 antibiotic resistance gene of Pseudomonas aeruginosa to create guide RNAs, modern algorithms for in silico analysis of nucleotide sequences and publicly available programs were used, including Benchling (https://www.benchling.com/molecular-biology /). A list of regions in the antibiotic resistance gene blaVIM-2 of Pseudomonas aeruginosa with a theoretically calculated probability of their cleavage in highly conserved regions was compiled (Table 1).
Направляющие РНК, специфически узнающие высоко консервативный участок антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa, представлены уникальными последовательностями SEQ ID NO: 1-5.The guide RNAs that specifically recognize the highly conserved antibiotic resistance site of blaVIM-2 of Pseudomonas aeruginosa are represented by the unique sequences SEQ ID NO: 1-5.
ПРИМЕР 2: ПОДГОТОВКА МАТЕРИАЛА ДЛЯ ОБНАРУЖЕНИЯ ГЕНА АНТИБИОТИКОУСТОЙЧИВОСТИ BLAVIM-2 PSEUDOMONAS AERUGINOSA МЕТОДОМ ПРЕДВАРИТЕЛЬНОЙ АМПЛИФИКАЦИИEXAMPLE 2: PREPARATION OF MATERIAL FOR DETECTION OF ANTIBIOTIC RESISTANCE GENE BLAVIM-2 PSEUDOMONAS AERUGINOSA BY PRE-AMPLIFICATION METHOD
Подготовку материала для обнаружения гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa проводят методом предварительной амплификации. В качестве модельной матрицы гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa биологического образца используют плазмидную ДНК pGEM-T-blaVIM-2, содержащую в своем составе фрагмент гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa с 37 по 447 п. о. (размером 411 п.о.).Preparation of material for the detection of the antibiotic resistance gene blaVIM-2 of Pseudomonas aeruginosa is carried out by the method of preliminary amplification. Plasmid DNA pGEM-T-blaVIM-2, which contains a fragment of the antibiotic resistance gene blaVIM-2 of Pseudomonas aeruginosa from 37 to 447 bp, is used as a model matrix of the blaVIM-2 antibiotic resistance gene of Pseudomonas aeruginosa of a biological sample. (411 bp size).
Предварительную амплификацию участка, соответствующего фрагменту гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa с 37 по 447 п.о., проводят с использованием специфических олигонуклеотидов с SEQ ID NO: 6-7, приведенных в Таблице 2.Pre-amplification of the region corresponding to the fragment of the antibiotic resistance gene blaVIM-2 of Pseudomonas aeruginosa from 37 to 447 bp is carried out using specific oligonucleotides with SEQ ID NO: 6-7 shown in Table 2.
ПЦР-продукт, кодирующий фрагмент антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa, получают в реакции амплификации с использованием ПЦР-смеси-2 blue (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия) и специфических олигонуклеотидов For blaVIM-2 и Rev blaVIM-2 (ГенТерра, Россия). Размер амплифицированного фрагмента blaVIM-2 составляет 411 пар нуклеотидов.The PCR product encoding the antibiotic resistance fragment blaVIM-2 of Pseudomonas aeruginosa is obtained in an amplification reaction using PCR mixture-2 blue (FBSI Central Research Institute of Epidemiology of Rospotrebnadzor, Russia) and specific oligonucleotides For blaVIM-2 and Rev blaVIM-2 (Genterra, Russia) ... The size of the amplified blaVIM-2 fragment is 411 base pairs.
Температурный профиль амплификации для получения ПЦР-продукта, фрагмент гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa с 37 по 447 п.о.:Temperature profile of amplification for obtaining a PCR product, a fragment of the antibiotic resistance gene blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa from 37 to 447 bp:
1. денатурация: 95°С в течение 3 минут;1.denaturation: 95 ° C for 3 minutes;
2. 40 циклов амплификации:2.40 amplification cycles:
95°С - 15 сек,95 ° С - 15 sec,
55°С - 45 сек,55 ° С - 45 sec,
72°С - 30 сек;72 ° С - 30 sec;
3. финальная элонгация: 72°С в течение 5 минут.3. final elongation: 72 ° C for 5 minutes.
В ходе подготовки материала для обнаружения гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa методом предварительной амплификации проводят титрование модельной матрицы pGEM-T-blaVIM-2 путем приготовления серийных разведений (Таблица 3).During the preparation of material for the detection of the antibiotic resistance gene blaVIM-2 of Pseudomonas aeruginosa by the method of preliminary amplification, titration of the model matrix pGEM-T-blaVIM-2 is carried out by preparing serial dilutions (Table 3).
Для оценки эффективности предварительной амплификации полученные фрагменты гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa визуализируют при помощи электрофореза в агарозном геле (Фиг. 1).To assess the efficiency of preliminary amplification, the obtained fragments of the antibiotic resistance gene blaVIM-2 of Pseudomonas aeruginosa are visualized using agarose gel electrophoresis (Fig. 1).
Подготовленный описанным способом материал используют для экспериментов по выявлению гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa с помощью рибонуклеопротеиновых комплексов LbCpf1 из Lachnospiraceae, содержащих направляющие РНК sgRNA blaVIM-2 №93, sgRNA blaVIM-2 №95, sgRNA blaVIM-2 №207, sgRNA blaVIM-2 №285 и sgRNA blaVIM-2 №366, без предварительной очистки.The material prepared by the described method is used for experiments to identify the antibiotic resistance gene blaVIM-2 of Pseudomonas aeruginosa using ribonucleoprotein complexes LbCpf1 from Lachnospiraceae containing guide RNA sgRNA blaVIM-2 No. 93, sgRNA blaVIM-2 No. blaVIM-2 No. blaVIM-2 -2 # 285 and sgRNA blaVIM-2 # 366, without preliminary purification.
ПРИМЕР 3: ПОЛУЧЕНИЕ НАПРАВЛЯЮЩИХ РНК И СОЗДАНИЕ РИБОНУКЛЕОПРОТЕИНОВЫХ КОМПЛЕКСОВ ДЛЯ ОБНАРУЖЕНИЯ ГЕНА АНТИБИОТИКОУСТОЙЧИВОСТИ BLAVIM-2 PSEUDOMONAS AERUGINOSAEXAMPLE 3: OBTAINING GUIDING RNA AND ESTABLISHING RIBONUCLEOPROTEIN COMPLEXES FOR DETECTING ANTIBIOTIC RESISTANCE GENE BLAVIM-2 PSEUDOMONAS AERUGINOSA
Для получения направляющих РНК для обнаружения гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa разработан набор специфических олигонуклеотидов, приведенных в Таблице 4.To obtain guide RNAs for detecting the antibiotic resistance gene blaVIM-2 of Pseudomonas aeruginosa, a set of specific oligonucleotides has been developed, shown in Table 4.
Получение направляющих РНК проводят в несколько этапов;Receiving guide RNAs is carried out in several stages;
1. получение ПЦР-продукта с использованием набора специфических олигонуклеотидов (Таблица 4), кодирующего направляющую РНК, способную связываться с целевым высоко консервативным участком гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa, содержащую РНК-шпильку, которая распознается РНК-направляемой ДНК-эндонуклеазой LbCpf1 из Lachnospiraceae;1.Production of a PCR product using a set of specific oligonucleotides (Table 4) encoding a guide RNA capable of binding to the target highly conserved region of the blaVIM-2 antibiotic resistance gene of Pseudomonas aeruginosa, containing an RNA hairpin that is recognized by RNA-directed DNA endonuclease LbCpf1 Lachnospiraceae;
2. очистка ПЦР-продукта, кодирующего направляющую РНК, специфичную к фрагменту гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa;2. purification of the PCR product encoding a guide RNA specific to a fragment of the antibiotic resistance gene blaVIM-2 of Pseudomonas aeruginosa;
3. синтез направляющей РНК, специфичной к фрагменту гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa;3. synthesis of a guide RNA specific to a fragment of the antibiotic resistance gene blaVIM-2 of Pseudomonas aeruginosa;
4. очистка направляющей РНК, специфичной к фрагменту гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa.4. Purification of guide RNA specific to a fragment of the antibiotic resistance gene blaVIM-2 of Pseudomonas aeruginosa.
ПЦР-продукт, кодирующий направляющую РНК sgRNA blaVIM-2 №93, получают в реакции амплификации с использованием ПЦР-смеси-2 blue (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия) и специфических олигонуклеотидов T7pr и sgRNA-93-Rev (ГенТерра, Россия). Размер амплифицированного фрагмента, кодирующего sgRNA blaVIM-2 №93, составляет 62 пары нуклеотидов.The PCR product encoding the guide RNA sgRNA blaVIM-2 No. 93 is obtained in an amplification reaction using PCR-mixture-2 blue (FBSI Central Research Institute of Epidemiology of Rospotrebnadzor, Russia) and specific oligonucleotides T7pr and sgRNA-93-Rev (GenTerra, Russia). The size of the amplified fragment encoding sgRNA blaVIM-2 No. 93 is 62 base pairs.
ПЦР-продукт, кодирующий направляющую РНК sgRNA blaVIM-2 №95, получают в реакции амплификации с использованием ПЦР-смеси-2 blue (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия) и специфических олигонуклеотидов T7pr и sgRNA-95-Rev (ГенТерра, Россия). Размер амплифицированного фрагмента, кодирующего sgRNA blaVIM-2 №95, составляет 62 пары нуклеотидов.The PCR product encoding the guide RNA sgRNA blaVIM-2 No. 95 is obtained in an amplification reaction using PCR mixture-2 blue (FBSI Central Research Institute of Epidemiology of Rospotrebnadzor, Russia) and specific oligonucleotides T7pr and sgRNA-95-Rev (GenTerra, Russia). The size of the amplified fragment encoding sgRNA blaVIM-2 No. 95 is 62 base pairs.
ПЦР-продукт, кодирующий направляющую РНК sgRNA blaVIM-2 №207, получают в реакции амплификации с использованием ПЦР-смеси-2 blue (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия) и специфических олигонуклеотидов T7pr и sgRNA-207-Rev (ГенТерра, Россия). Размер амплифицированного фрагмента, кодирующего sgRNA blaVIM-2 №207, составляет 62 пары нуклеотидов.The PCR product encoding the guide RNA sgRNA blaVIM-2 No. 207 is obtained in an amplification reaction using PCR mixture-2 blue (FBSI Central Research Institute of Epidemiology of Rospotrebnadzor, Russia) and specific oligonucleotides T7pr and sgRNA-207-Rev (GenTerra, Russia). The size of the amplified fragment encoding sgRNA blaVIM-2 # 207 is 62 base pairs.
ПЦР-продукт, кодирующий направляющую РНК sgRNA blaVIM-2 №285, получают в реакции амплификации с использованием ПЦР-смеси-2 blue (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия) и специфических олигонуклеотидов T7pr и sgRNA-285-Rev (ГенТерра, Россия). Размер амплифицированного фрагмента, кодирующего sgRNA blaVIM-2 №285, составляет 62 пары нуклеотидов.The PCR product encoding the guide RNA sgRNA blaVIM-2 No. 285 is obtained in an amplification reaction using PCR mixture-2 blue (FBSI Central Research Institute of Epidemiology of Rospotrebnadzor, Russia) and specific oligonucleotides T7pr and sgRNA-285-Rev (GenTerra, Russia). The size of the amplified fragment encoding sgRNA blaVIM-2 # 285 is 62 base pairs.
ПЦР-продукт, кодирующий направляющую РНК sgRNA blaVIM-2 №366, получают в реакции амплификации с использованием ПЦР-смеси-2 blue (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия) и специфических олигонуклеотидов T7pr и sgRNA-366-Rev (ГенТерра, Россия). Размер амплифицированного фрагмента, кодирующего sgRNA blaVIM-2 №366, составляет 62 пары нуклеотидов.The PCR product encoding the guide RNA sgRNA blaVIM-2 No. 366 is obtained in an amplification reaction using PCR-mixture-2 blue (FBSI Central Research Institute of Epidemiology of Rospotrebnadzor, Russia) and specific oligonucleotides T7pr and sgRNA-366-Rev (GenTerra, Russia). The size of the amplified fragment encoding sgRNA blaVIM-2 # 366 is 62 base pairs.
Температурный профиль амплификации для получения ПЦР-продуктов, кодирующих направляющие РНК:Amplification temperature profile for obtaining PCR products encoding guide RNAs:
1. денатурация: 95°С в течение 3 минут;1.denaturation: 95 ° C for 3 minutes;
2. 35 циклов амплификации:2.35 amplification cycles:
95°С - 15 сек,95 ° С - 15 sec,
55°С - 45 сек,55 ° С - 45 sec,
72°С - 30 сек;72 ° С - 30 sec;
3. финальная элонгация: 72°С в течение 5 минут.3. final elongation: 72 ° C for 5 minutes.
ПЦР-продукты, кодирующие направляющие РНК, специфичные к фрагменту гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa, визуализируют при помощи электрофореза в агарозном геле (Фиг. 2).PCR products encoding guide RNAs specific to a fragment of the antibiotic resistance gene blaVIM-2 of Pseudomonas aeruginosa were visualized by agarose gel electrophoresis (Fig. 2).
Очистку ПЦР-продуктов, кодирующих направляющие РНК, специфичные к фрагменту гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa, проводят с использованием коммерчески доступного набора ISOLATE II PGR and Gel Kit (BioLine, США) согласно инструкции производителя. Очищенные ПЦР-продукты, кодирующие направляющие РНК, специфичные к фрагменту гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa, используют в качестве матрицы для синтеза направляющих РНК.Purification of PCR products encoding guide RNAs specific to a fragment of the antibiotic resistance gene blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa is carried out using a commercially available ISOLATE II PGR and Gel Kit (BioLine, USA) according to the manufacturer's instructions. Purified PCR products encoding guide RNAs specific to a fragment of the Pseudomonas aeruginosa blaVIM-2 antibiotic resistance gene are used as a template for the synthesis of guide RNAs.
Синтез направляющих РНК, специфичных к фрагменту гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa, осуществляется методом in vitro транскрипции с использованием коммерчески доступных наборов реагентов (HiScribe™ Т7 High Yield RNA Synthesis Kit, NEB, США) согласно инструкции производителя. Продукты реакции in vitro транскрипции переосаждают из реакционной смеси добавлением хлорида натрия до конечной концентрации 400 mM и равного объема изопропилового спирта. Такие модификации протокола производителя, внесенные авторами, позволяют увеличить выход продукта реакции и получить желаемую концентрацию финального препарата направляющей РНК.The synthesis of guide RNAs specific to a fragment of the Pseudomonas aeruginosa blaVIM-2 antibiotic resistance gene is performed by in vitro transcription using commercially available reagent kits (HiScribe ™ T7 High Yield RNA Synthesis Kit, NEB, USA) according to the manufacturer's instructions. The products of the in vitro transcription reaction are reprecipitated from the reaction mixture by adding sodium chloride to a final concentration of 400 mM and an equal volume of isopropyl alcohol. Such modifications of the manufacturer's protocol, introduced by the authors, increase the yield of the reaction product and obtain the desired concentration of the final guide RNA preparation.
Создание готового рибонуклеопротеинового комплекса, содержащего белок семейства CRISPR/CAS LbCpf1 из Lachnospiraceae, и направляющую РНК авторы проводят по стандартному протоколу с некоторыми модификациями (In vitro enzymology of Cas9 // Anders C, Jinek M. Methods Enzymol. 2014; 546:1-20. doi: 10.1016/B978-0-12-801185-0.00001-5).The creation of a ready-made ribonucleoprotein complex containing a protein of the CRISPR / CAS LbCpf1 family from Lachnospiraceae and a guide RNA was carried out by the authors according to the standard protocol with some modifications (In vitro enzymology of Cas9 // Anders C, Jinek M. Methods Enzymol. 2014; 546: 1-20 . doi: 10.1016 / B978-0-12-801185-0.00001-5).
Непосредственно перед объединением с CAS-белком препарат направляющей РНК (в количестве 250 нг) прогревают при 90°С в течение 5 минут и позволяют медленно остыть до комнатной температуры (инкубация при комнатной температуре не менее 10 минут). Такое прогревание необходимо для формирования корректной конформации шпильки, содержащейся в направляющей РНК. Многие производители коммерческих препаратов CAS-белков пропускают данный этап при подготовке рибонуклеопротеинового комплекса.Immediately before combining with the CAS protein, the guide RNA preparation (in the amount of 250 ng) is heated at 90 ° C for 5 minutes and allowed to cool slowly to room temperature (incubation at room temperature for at least 10 minutes). Such heating is necessary for the formation of the correct conformation of the hairpin contained in the guide RNA. Many manufacturers of commercial CAS protein preparations skip this step when preparing the ribonucleoprotein complex.
Для формирования готового рибонуклеопротеинового комплекса 250 нг CAS-белка LbCpf1 из Lachnospiraceae и подготовленную направляющую РНК смешивают и инкубируют 15 минут при комнатной температуре. Полученный таким способом рибонуклеопротеиновый комплекс готов для выявления гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa.To form the finished ribonucleoprotein complex, 250 ng of the LbCpf1 CAS protein from Lachnospiraceae and the prepared guide RNA are mixed and incubated for 15 minutes at room temperature. The ribonucleoprotein complex obtained in this way is ready to detect the antibiotic resistance gene blaVIM-2 of Pseudomonas aeruginosa.
ПРИМЕР 4: ОБНАРУЖЕНИЕ ЕДИНИЧНЫХ КОПИЙ ГЕНА АНТИБИОТИКОУСТОЙЧИВОСТИ BLAVIM-2 PSEUDOMONAS AERUGINOSA С ПОМОЩЬЮ РИБОНУКЛЕОПРОТЕИНОВЫХ КОМПЛЕКСОВ CRISPR/CAS НА ПРИМЕРЕ МОДЕЛЬНОЙ МАТРИЦЫEXAMPLE 4: DETECTION OF SINGLE COPIES OF ANTIBIOTIC RESISTANCE GENE BLAVIM-2 PSEUDOMONAS AERUGINOSA USING RIBONUCLEOPROTEIN COMPLEXES CRISPR / CAS ON THE EXAMPLE OF A MODEL MATRIX
Предварительно амплифицированный материал, полученный способом, описанным в Примере 2, используют в качестве матрицы для обнаружения гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa с помощью рибонуклеопротеиновых комплексов CRISPR/CAS, полученных способом, описанным в 1 Примере 3.The pre-amplified material obtained by the method described in Example 2 is used as a template for detecting the antibiotic resistance gene blaVIM-2 of Pseudomonas aeruginosa using ribonucleoprotein complexes CRISPR / CAS obtained by the method described in 1 of Example 3.
Для обнаружения гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa с помощью рибонуклеопротеиновых комплексов CRISPR/CAS готовят реакционную смесь, содержащую следующие компоненты:To detect the Pseudomonas aeruginosa blaVIM-2 antibiotic resistance gene using CRISPR / CAS ribonucleoprotein complexes, a reaction mixture is prepared containing the following components:
- 10× буфер (100 mM TrisHCl рН 8,0, 1 М NaCl);- 10 × buffer (100 mM TrisHCl pH 8.0, 1 M NaCl);
- 50 mM MgCl3 (конечная концентрация в реакционной смеси 10 mM);- 50 mM MgCl 3 (final concentration in the reaction mixture 10 mM);
- 250 нг рибонуклеопротеинового комплекса (LbCpf1 из Lachnospiraceae и направляющие РНК sgRNA blaVIM-2 №93, sgRNA blaVIM-2 №95, sgRNA blaVIM-2 №207, sgRNA blaVIM-2 №285 и sgRNA blaVIM-2 №366);- 250 ng of ribonucleoprotein complex (LbCpf1 from Lachnospiraceae and guide RNAs sgRNA blaVIM-2 No. 93, sgRNA blaVIM-2 No. 95, sgRNA blaVIM-2 No. 207, sgRNA blaVIM-2 No. 285 and sgRNA No. blaVIM-2);
- 20 pmol флуоресцентный зонд (6FAM-TTATT-BHQ1);- 20 pmol fluorescent probe (6FAM-TTATT-BHQ1);
- мишень (предварительно амплифицированный фрагмента гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa);- target (pre-amplified fragment of the antibiotic resistance gene blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa);
- вода mQ.- water mQ.
Реакционные смеси, содержащие все необходимые компоненты, помещают в амплификатор ДТПрайм 5 (ДНК-Технология, Россия) и задают следующие параметры реакции:Reaction mixtures containing all the necessary components are placed in a
30-60 циклов:30-60 cycles:
37°С - 35 сек,37 ° С - 35 sec,
37°С - 25 сек, съемка флуоресценции.37 ° С - 25 sec, fluorescence shooting.
В первую очередь были проведены эксперименты по обнаружению единичных копий гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa с помощью рибонуклеопротеиновых комплексов CRISPR/CAS, сформированных на основе LbCpf1 из Lachnospiraceae, с использованием в качестве мишени модельной матрицы - плазмидной ДНК pGEM-T-blaVIM-2, содержащей в своем составе фрагмент гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa с 37 по 447 п.о. размером 411 п.о. Было показано, что рибонуклеопротеиновые комплексы CRISPR/CAS обладают способностью выявлять единичные копий гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa. Типичные результаты анализа приведены на примерах профилей флуоресценции в реальном времени для предварительно амплифицированной мишени blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa, обработанной рибонуклеопортеиновыми комплексами, содержащими направляющие РНК sgRNA blaVIM-2 №93, sgRNA blaVIM-2 №95, sgRNA blaVIM-2 №207, sgRNA blaVIM-2 №285 и sgRNA blaVIM-2 №366 и белок LbCpf1, на Фиг. 3, Фиг. 4, Фиг. 5, Фиг. 6 и Фиг. 7 соответственно. Отметим, что уже на 30-ом цикле анализа (30 минут) значение сигнала, полученного в ходе детекции единичных копий (1,5 копий/реакция) гена blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa, превышало значение «шума» (неспецифической флуоресценции контрольного образца, не содержащего мишени) минимум втрое.First of all, experiments were carried out to detect single copies of the antibiotic resistance gene blaVIM-2 of Pseudomonas aeruginosa using ribonucleoprotein complexes CRISPR / CAS, formed on the basis of LbCpf1 from Lachnospiraceae, using as a target a model matrix - plasmid DNA blaVIM-T-2, containing a fragment of the antibiotic resistance gene blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa from 37 to 447 bp. size 411 p.o. It has been shown that CRISPR / CAS ribonucleoprotein complexes are capable of detecting single copies of the blaVIM-2 antibiotic resistance gene from Pseudomonas aeruginosa. Typical analysis results are shown by examples of real-time fluorescence profiles for a pre-amplified Pseudomonas aeruginosa blaVIM-2 target treated with ribonucleoportein complexes containing guide RNAs sgRNA blaVIM-2 No. 93, sgRNA blaVIM-2 No. 95, sgRNA No. blaVIM-2 blaVIM-2 # 285 and sgRNA blaVIM-2 # 366 and LbCpf1 protein in FIG. 3, FIG. 4, FIG. 5, Fig. 6 and FIG. 7 respectively. Note that already at the 30th cycle of analysis (30 minutes), the value of the signal obtained during the detection of single copies (1.5 copies / reaction) of the blaVIM-2 gene of Pseudomonas aeruginosa exceeded the “noise” value (non-specific fluorescence of the control sample, not containing targets) at least three times.
В ходе работ была оценена эффективность выявления единичных копий гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa, содержащегося в составе модельной матрицы, с использованием различных направляющих РНК. Было показано, что рибонуклеопротеиновые комплексы CRISPR/CAS, сформированные на основе LbCpf1 из Lachnospiraceae и направляющих РНК, выявляют единичные копии гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa с различной эффективностью, и их можно расположить в следующем порядке по уменьшению активности: sgRNA blaVIM-2 №207 > sgRNA blaVIM-2 №93 > sgRNA blaVIM-2 №366 > sgRNA blaVIM-2 №285 > sgRNA blaVIM-2 №95 (Фиг. 8).In the course of the work, the efficiency of detecting single copies of the antibiotic resistance gene blaVIM-2 of Pseudomonas aeruginosa, contained in the model matrix, was assessed using various guide RNAs. It was shown that ribonucleoprotein complexes CRISPR / CAS, formed on the basis of LbCpf1 from Lachnospiraceae and guide RNAs, reveal single copies of the antibiotic resistance gene blaVIM-2 of Pseudomonas aeruginosa with different efficiencies, and they can be arranged in the following order according to the decrease in activity: sgRNA blaVIM-2 207> sgRNA blaVIM-2 # 93> sgRNA blaVIM-2 # 366> sgRNA blaVIM-2 # 285> sgRNA blaVIM-2 # 95 (Fig. 8).
ПРИМЕР 5: ОБНАРУЖЕНИЕ ЕДИНИЧНЫХ КОПИЙ ГЕНА АНТИБИОТИКОУСТОЙЧИВОСТИ BLAVIM-2 PSEUDOMONAS AERUGINOSA С ПОМОЩЬЮ РИБОНУКЛЕОПРОТЕИНОВЫХ КОМПЛЕКСОВ CRISPR/CAS НА ОГРАНИЧЕННОЙ ПАНЕЛИ КЛИНИЧЕСКИХ ОБРАЗЦОВEXAMPLE 5: DETECTION OF SINGLE COPIES OF ANTIBIOTIC RESISTANCE GENE BLAVIM-2 PSEUDOMONAS AERUGINOSA USING RIBONUCLEOPROTEIN COMPLEXES CRISPR / CAS ON A LIMITED PANEL
Разработанные направляющие РНК были апробированы на ограниченной панели клинических образцов (10 шт.), содержащих Pseudomonas aeruginosa, несущую ген антибиотикоустойчивости blaVIM-2 (ранее подтверждено микробиологическими методами и методом секвенирования следующего поколения).The developed guide RNAs were tested on a limited panel of clinical samples (10 pcs.) Containing Pseudomonas aeruginosa carrying the blaVIM-2 antibiotic resistance gene (previously confirmed by microbiological methods and next generation sequencing).
Для обнаружения единичных копий гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 с помощью рибонуклеопротеиновых комплексов CRISPR/CAS была проведена предварительная амплификация фрагментов этого гена. Для проведения предварительной амплификации были подготовлены серийные (согласно Таблице 3) разведения препаратов ДНК, выделенных из клинических образцов 10 пациентов с помощью коммерчески доступного набора DNeasy Blood & Tissue Kit (QIAGEN, США) согласно инструкции производителя.In order to detect single copies of the blaVIM-2 antibiotic resistance gene using ribonucleoprotein complexes CRISPR / CAS, preliminary amplification of fragments of this gene was carried out. To carry out preliminary amplification, serial (according to Table 3) dilutions of DNA preparations isolated from clinical samples of 10 patients using a commercially available DNeasy Blood & Tissue Kit (QIAGEN, USA) were prepared according to the manufacturer's instructions.
ПЦР-продукты, кодирующие фрагмент гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa, получают в реакции амплификации с использованием ПЦР-смеси-2 blue (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия) как описано в Примере 2, применяя описанный температурный профиль и продолжительность реакции амплификации.PCR products encoding a fragment of the antibiotic resistance gene blaVIM-2 of Pseudomonas aeruginosa are obtained in an amplification reaction using PCR mixture-2 blue (FBSI Central Research Institute of Epidemiology of Rospotrebnadzor, Russia) as described in Example 2, using the described temperature profile and duration of the amplification reaction.
Полученный таким способом материал используют в качестве матрицы для обнаружения единичных копий гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa с помощью рибонуклеопротеиновых комплексов CRISPR/CAS, полученных способом, описанным в Примере 3.The material obtained in this way is used as a template for detecting single copies of the antibiotic resistance gene blaVIM-2 of Pseudomonas aeruginosa using ribonucleoprotein complexes CRISPR / CAS obtained by the method described in Example 3.
Обнаружение единичных копий гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa с помощью рибонуклеопротеиновых комплексов CRISPR/CAS проводят способом, описанным в Примере 4.The detection of single copies of the antibiotic resistance gene blaVIM-2 of Pseudomonas aeruginosa using ribonucleoprotein complexes CRISPR / CAS is carried out by the method described in Example 4.
В ходе проведенного анализа было показано, что рибонуклеопротеиновые комплексы CRISPR/CAS обладают способностью выявлять единичные копии (1,5 копий/реакция) гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa в препаратах ДНК, выделенных из клинических образцов. При этом уже на 2-15 цикле (2-15 минут) анализа значение сигнала превышало значение «шума» (неспецифической флуоресценции контрольного образца, не содержащего мишени) втрое, а к 5-26 циклу (5-26 минут) анализа - более чем в 5 раз (широкий диапазон и разница в циклах обусловлены различиями использованных в анализе направляющих РНК, Таблица 5).The analysis showed that CRISPR / CAS ribonucleoprotein complexes are capable of detecting single copies (1.5 copies / reaction) of the blaVIM-2 antibiotic resistance gene of Pseudomonas aeruginosa in DNA preparations isolated from clinical samples. At the same time, already at 2-15 cycles (2-15 minutes) of the analysis, the signal value exceeded the value of "noise" (nonspecific fluorescence of the control sample containing no target) three times, and by the 5-26 cycle (5-26 minutes) of the analysis - more than 5 times (wide range and difference in cycles are due to differences in guide RNAs used in the analysis, Table 5).
Типичные результаты анализа приведены на примерах значений флуоресценции в конечной точке (30 цикл анализа, 30 минут) для предварительно амплифицированных мишеней blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa (10 независимых клинических образцов), обработанных рибонуклеопортеиновыми комплексами, содержащими направляющие РНК sgRNA blaVIM-2 №93, sgRNA blaVIM-2 №95, sgRNA blaVIM-2 №207, sgRNA blaVIM-2 №285 и sgRNA blaVIM-2 №366 и белок LbCpfl, на Фиг. 9, Фиг. 10, Фиг. 11, Фиг. 12 и Фиг. 13 соответственно.Typical assay results are shown using examples of fluorescence endpoint values (30 assay cycle, 30 minutes) for pre-amplified blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa targets (10 independent clinical samples) treated with ribonucleoportein complexes containing sgRNA blaVIM-2 guide RNAs # 93, sgRNA blaVIM-2 # 95, sgRNA blaVIM-2 # 207, sgRNA blaVIM-2 # 285 and sgRNA blaVIM-2 # 366 and LbCpfl protein, in FIG. 9, Fig. 10, Fig. 11, Fig. 12 and FIG. 13 respectively.
Эффективность выявления единичных копий гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa, содержащегося в составе препаратов ДНК, выделенных из клинических образцов, с использованием различных направляющих РНК в составе рибонуклеопротеиновых комплексов CRISPR/CAS, сформированных на основе LbCpf1 из Lachnospiraceae, можно представить в следующем порядке по убыванию: sgRNA blaVIM-2 №207 > sgRNA blaVIM-2 №93 > sgRNA blaVIM-2 №285 > sgRNA blaVIM-2 №366 > sgRNA blaVIM-2 №95 (Таблица 5).The efficiency of detecting single copies of the Pseudomonas aeruginosa blaVIM-2 antibiotic resistance gene contained in DNA preparations isolated from clinical samples using various guide RNAs in the CRISPR / CAS ribonucleoprotein complexes formed on the basis of LbCpf1 from Lachnospiraceae can be presented in descending order as follows : sgRNA blaVIM-2 # 207> sgRNA blaVIM-2 # 93> sgRNA blaVIM-2 # 285> sgRNA blaVIM-2 # 366> sgRNA blaVIM-2 # 95 (Table 5).
Таким образом, разработанные направляющие РНК позволяют ультрачувствительно выявлять единичные копии гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa в клинических образцах после предварительной амплификации в составе рибонуклеопротеиновых комплексов CRISPR/CAS.Thus, the developed guide RNAs allow ultrasensitive detection of single copies of the antibiotic resistance gene blaVIM-2 of Pseudomonas aeruginosa in clinical samples after preliminary amplification in the CRISPR / CAS ribonucleoprotein complexes.
Claims (9)
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2020114569A RU2734520C1 (en) | 2020-04-15 | 2020-04-15 | Method for detecting the antibiotic resistance gene blavim-2 (metal-beta-lactamase class b vim-2) pseudomonas aeruginosa in ultralow concentrations and specific oligonucleotides for use in the method |
| PCT/RU2020/050304 WO2021211011A1 (en) | 2020-04-15 | 2020-10-28 | Method for detecting the pseudomonas aeruginosa antibiotic resistance gene bla vim-2 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2020114569A RU2734520C1 (en) | 2020-04-15 | 2020-04-15 | Method for detecting the antibiotic resistance gene blavim-2 (metal-beta-lactamase class b vim-2) pseudomonas aeruginosa in ultralow concentrations and specific oligonucleotides for use in the method |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2734520C1 true RU2734520C1 (en) | 2020-10-19 |
Family
ID=72940398
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2020114569A RU2734520C1 (en) | 2020-04-15 | 2020-04-15 | Method for detecting the antibiotic resistance gene blavim-2 (metal-beta-lactamase class b vim-2) pseudomonas aeruginosa in ultralow concentrations and specific oligonucleotides for use in the method |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2734520C1 (en) |
| WO (1) | WO2021211011A1 (en) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2820306C1 (en) * | 2023-12-05 | 2024-06-03 | Федеральное бюджетное учреждение науки "Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора) | METHOD FOR DETECTING ANTIBIOTIC RESISTANCE GENE bla-TEM-1B IN ULTRA-LOW CONCENTRATIONS AND SPECIFIC OLIGONUCLEOTIDES FOR USE IN METHOD |
-
2020
- 2020-04-15 RU RU2020114569A patent/RU2734520C1/en active
- 2020-10-28 WO PCT/RU2020/050304 patent/WO2021211011A1/en not_active Ceased
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| CHEN J. S, et al, CRISPR-Casl2a target binding unleashes indiscriminate single-stranded DNase activity. Science. 2018 Apr 27; 360(6387):436-439. * |
| Muller V., et al Direct identification of antibiotic resistance genes on single plasmid molecules using CRISPR/Cas9 in combination with optical DNA mapping. Sci. Rep. 6., 2016., p. 1-11, https://doi.org/10.1038/srep37938 * |
| Muller V., et al Direct identification of antibiotic resistance genes on single plasmid molecules using CRISPR/Cas9 in combination with optical DNA mapping. Sci. Rep. 6., 2016., p. 1-11, https://doi.org/10.1038/srep37938. CHEN J. S, et al, CRISPR-Casl2a target binding unleashes indiscriminate single-stranded DNase activity. Science. 2018 Apr 27; 360(6387):436-439. КУЗНЕЦОВА М.В., и др., Поиск и изучение генов, кодирующих метало-бета-лактамазы, у госпитальных штаммов Pseudomonas aeruginosa, Вестник Пермского университета, Вып. 3-4, Биология, 2011, с. 39-44. * |
| КУЗНЕЦОВА М.В., и др., Поиск и изучение генов, кодирующих метало-бета-лактамазы, у госпитальных штаммов Pseudomonas aeruginosa, Вестник Пермского университета, Вып. 3-4, Биология, 2011, с. 39-44. * |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2820306C1 (en) * | 2023-12-05 | 2024-06-03 | Федеральное бюджетное учреждение науки "Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора) | METHOD FOR DETECTING ANTIBIOTIC RESISTANCE GENE bla-TEM-1B IN ULTRA-LOW CONCENTRATIONS AND SPECIFIC OLIGONUCLEOTIDES FOR USE IN METHOD |
| RU2829103C1 (en) * | 2023-12-05 | 2024-10-24 | Федеральное бюджетное учреждение науки "Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора) | CRISPR-Cas12 SYSTEM FOR DETECTING ANTIBIOTIC RESISTANCE GENE bla-TEM-1B IN ULTRA-LOW CONCENTRATIONS |
| RU2841369C1 (en) * | 2024-09-30 | 2025-06-06 | Федеральное бюджетное учреждение науки "Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора) | Method of detecting the antibiotic resistance gene bla-ndm-1 in ultra-low concentrations and specific oligonucleotides for use in the method |
| RU2841370C1 (en) * | 2024-09-30 | 2025-06-06 | Федеральное бюджетное учреждение науки "Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора) | Method of detecting the antibiotic resistance gene bla-oxa-1 in ultra-low concentrations and specific oligonucleotides for use in the method |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2021211011A1 (en) | 2021-10-21 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RU2745637C1 (en) | Method for obtaining the crispr/cas ribonucleoprotein complex preparation and preparation for detection of the blavim-2 (metal-beta-lactamase class b vim-2) pseudomonas aeruginosa antibiotic resistance gene in ultra-low concentrations | |
| CN112813200B (en) | Method for extremely short PCR amplification of nucleic acid, detection method and application | |
| RU2734520C1 (en) | Method for detecting the antibiotic resistance gene blavim-2 (metal-beta-lactamase class b vim-2) pseudomonas aeruginosa in ultralow concentrations and specific oligonucleotides for use in the method | |
| RU2743861C1 (en) | Crispr-cas system for detecting the antibiotic resistance gene blavim-2 (metallo-beta-lactamase class b vim-2) pseudomonas aeruginosa at ultra-low concentrations | |
| RU2839761C1 (en) | CRISPR-Cas12 SYSTEM FOR DETECTION OF ANTIBIOTIC RESISTANCE GENE bla-NDM-1 IN ULTRA-LOW CONCENTRATIONS | |
| RU2841369C1 (en) | Method of detecting the antibiotic resistance gene bla-ndm-1 in ultra-low concentrations and specific oligonucleotides for use in the method | |
| RU2791879C1 (en) | Crispr-cas12 system for detecting the exou gene encoding the type 3 secretion system exotoxin, pseudomonas aeruginosa, at ultra-low concentrations | |
| RU2839482C1 (en) | CRISPR-Cas12 KIT FOR DETECTING ANTIBIOTIC RESISTANCE GENE bla-NDM-1 IN ULTRA-LOW CONCENTRATIONS (VERSIONS) | |
| RU2839484C1 (en) | METHOD FOR PRODUCING PREPARATION OF RIBONUCLEOPROTEIN CRISPR-Cas COMPLEX AND PREPARATION FOR DETECTING ANTIBIOTIC RESISTANCE GENE bla-NDM-1 IN ULTRA-LOW CONCENTRATIONS | |
| RU2820307C1 (en) | METHOD FOR PREPARING PREPARATION OF RIBONUCLEOPROTEIN COMPLEX CRISPR-Cas AND PREPARATION FOR DETECTING ANTIBIOTIC RESISTANCE GENE bla-TEM-1B IN ULTRA-LOW CONCENTRATIONS | |
| RU2829103C1 (en) | CRISPR-Cas12 SYSTEM FOR DETECTING ANTIBIOTIC RESISTANCE GENE bla-TEM-1B IN ULTRA-LOW CONCENTRATIONS | |
| RU2791880C1 (en) | Method for detecting the exou gene encoding the type 3 secretion system exotoxin, pseudomonas aeruginosa at ultralow concentrations and specific oligonucleotides for use in the method | |
| RU2820306C1 (en) | METHOD FOR DETECTING ANTIBIOTIC RESISTANCE GENE bla-TEM-1B IN ULTRA-LOW CONCENTRATIONS AND SPECIFIC OLIGONUCLEOTIDES FOR USE IN METHOD | |
| RU2839762C1 (en) | CRISPR-Cas12 SYSTEM FOR DETECTION OF ANTIBIOTIC RESISTANCE GENE bla-OXA-1 IN ULTRA-LOW CONCENTRATIONS | |
| RU2782588C1 (en) | Method for detecting the meca antibiotic resistance gene of staphylococcus aureus in ultra-low concentrations and specific oligonucleotides for use in the method | |
| RU2782739C1 (en) | METHOD FOR PRODUCING A PREPARATION OF A RIBONUCLEOPROTEIN COMPLEX CRISPR-Cas AND A PREPARATION FOR DETECTING THE exoU GENE ENCODING AN EXOTOXIN OF THE THIRD TYPE SECRETION SYSTEM, PSEUDOMONAS AERUGINOSA | |
| RU2839486C1 (en) | CRISPR-Cas12 KIT FOR DETECTING ANTIBIOTIC RESISTANCE GENE bla-OXA-1 IN ULTRA-LOW CONCENTRATIONS (VERSIONS) | |
| RU2782315C1 (en) | METHOD FOR OBTAINING A PREPARATION OF THE RIBONUCLEOPROTEIN COMPLEX CRISPR-Cas AND A PREPARATION FOR DETECTING THE mecA ANTIBIOTIC RESISTANCE GENE OF STAPHYLOCOCCUS AUREUS IN ULTRA-LOW CONCENTRATIONS | |
| RU2782314C1 (en) | Crispr-cas12 system for detecting the meca antibiotic resistance gene of staphylococcus aureus at ultra-low concentrations | |
| RU2841370C1 (en) | Method of detecting the antibiotic resistance gene bla-oxa-1 in ultra-low concentrations and specific oligonucleotides for use in the method | |
| RU2747819C1 (en) | Method for obtaining preparation of ribonucleoprotein complex crispr / cas and preparation for detecting dna of john cunningham virus (jcpyv) in ultra-low concentrations | |
| RU2747820C1 (en) | Crispr-cas system for detection of john cunningham virus (jcpyv) dna at ultra-low concentrations | |
| RU2747880C1 (en) | Method for detecting dna of john cunningham virus (jcpyv) at ultra-low concentrations and specific oligonucleotides for use in method | |
| RU2839763C1 (en) | METHOD FOR PRODUCING PREPARATION OF RIBONUCLEOPROTEIN CRISPR-Cas COMPLEX AND PREPARATION FOR DETECTING ANTIBIOTIC RESISTANCE GENE bla-OXA-1 IN ULTRA-LOW CONCENTRATIONS | |
| RU2720768C1 (en) | Crispr-cas system for detecting proviral dna of human immunodeficiency virus integrated into a human genome in ultra-low concentrations |