RU2713124C2 - Способ повышения продукции изолимонной кислоты у дрожжей Yarrowia lipolytica, дрожжи вида Yarrowia lipolytica, обладающие способностью к продукции изолимонной кислоты - Google Patents
Способ повышения продукции изолимонной кислоты у дрожжей Yarrowia lipolytica, дрожжи вида Yarrowia lipolytica, обладающие способностью к продукции изолимонной кислоты Download PDFInfo
- Publication number
- RU2713124C2 RU2713124C2 RU2018126504A RU2018126504A RU2713124C2 RU 2713124 C2 RU2713124 C2 RU 2713124C2 RU 2018126504 A RU2018126504 A RU 2018126504A RU 2018126504 A RU2018126504 A RU 2018126504A RU 2713124 C2 RU2713124 C2 RU 2713124C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- yeast
- lipolytica
- yarrowia lipolytica
- gene
- acid
- Prior art date
Links
- 241000235015 Yarrowia lipolytica Species 0.000 title claims abstract description 41
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 title claims abstract description 27
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims abstract description 22
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 9
- ODBLHEXUDAPZAU-UHFFFAOYSA-N threo-D-isocitric acid Natural products OC(=O)C(O)C(C(O)=O)CC(O)=O ODBLHEXUDAPZAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 title abstract description 13
- ODBLHEXUDAPZAU-ZAFYKAAXSA-N D-threo-isocitric acid Chemical compound OC(=O)[C@H](O)[C@@H](C(O)=O)CC(O)=O ODBLHEXUDAPZAU-ZAFYKAAXSA-N 0.000 title abstract description 6
- ODBLHEXUDAPZAU-FONMRSAGSA-N Isocitric acid Natural products OC(=O)[C@@H](O)[C@H](C(O)=O)CC(O)=O ODBLHEXUDAPZAU-FONMRSAGSA-N 0.000 title abstract description 6
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 27
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 18
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 14
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 claims abstract description 14
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 12
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 claims abstract description 9
- JSDNZHXBKWCZDG-RWQHKGFASA-N Isolimonic acid Chemical compound C=1([C@H](O)[C@@]2(CCC3[C@@]([C@@]22[C@H](O2)C(O)=O)(C)C(=O)CC2[C@@]3(C(O)CC(O)=O)COC2(C)C)C)C=COC=1 JSDNZHXBKWCZDG-RWQHKGFASA-N 0.000 claims description 41
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 claims description 2
- 230000002438 mitochondrial effect Effects 0.000 abstract description 6
- 210000003470 mitochondria Anatomy 0.000 abstract description 4
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 abstract description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 29
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 20
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 12
- 235000015165 citric acid Nutrition 0.000 description 12
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 12
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 12
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 10
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 9
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 8
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 6
- 239000000047 product Substances 0.000 description 6
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 6
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 5
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 5
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 5
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 5
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 5
- 235000008390 olive oil Nutrition 0.000 description 5
- 239000004006 olive oil Substances 0.000 description 5
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 4
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 4
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 4
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 4
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 4
- 238000009331 sowing Methods 0.000 description 4
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 4
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 3
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010002747 Pfu DNA polymerase Proteins 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 3
- 230000035508 accumulation Effects 0.000 description 3
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 3
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- -1 melibiosis Chemical compound 0.000 description 3
- 239000008057 potassium phosphate buffer Substances 0.000 description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 230000004102 tricarboxylic acid cycle Effects 0.000 description 3
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 2
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 2
- 241000192484 Diutina catenulata Species 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- JZRWCGZRTZMZEH-UHFFFAOYSA-N Thiamine Natural products CC1=C(CCO)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N JZRWCGZRTZMZEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 2
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 2
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 2
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 2
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 2
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 2
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 description 2
- 235000011837 pasties Nutrition 0.000 description 2
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- KYMBYSLLVAOCFI-UHFFFAOYSA-N thiamine Chemical compound CC1=C(CCO)SCN1CC1=CN=C(C)N=C1N KYMBYSLLVAOCFI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960003495 thiamine Drugs 0.000 description 2
- 235000019157 thiamine Nutrition 0.000 description 2
- 239000011721 thiamine Substances 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 2
- HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N α-D-glucopyranosyl-α-D-glucopyranoside Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(O)C(O)C(O)C(CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JAHNSTQSQJOJLO-UHFFFAOYSA-N 2-(3-fluorophenyl)-1h-imidazole Chemical compound FC1=CC=CC(C=2NC=CN=2)=C1 JAHNSTQSQJOJLO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108010009924 Aconitate hydratase Proteins 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- 102100039868 Cytoplasmic aconitate hydratase Human genes 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-CUHNMECISA-N D-Cellobiose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-CUHNMECISA-N 0.000 description 1
- RGHNJXZEOKUKBD-SQOUGZDYSA-N D-gluconic acid Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C(O)=O RGHNJXZEOKUKBD-SQOUGZDYSA-N 0.000 description 1
- SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N D-xylopyranose Chemical compound O[C@@H]1COC(O)[C@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 241000702191 Escherichia virus P1 Species 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- SQUHHTBVTRBESD-UHFFFAOYSA-N Hexa-Ac-myo-Inositol Natural products CC(=O)OC1C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C1OC(C)=O SQUHHTBVTRBESD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000218092 Hylotelephium spectabile Species 0.000 description 1
- 206010021143 Hypoxia Diseases 0.000 description 1
- 229920001202 Inulin Polymers 0.000 description 1
- 102000012011 Isocitrate Dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- 108010075869 Isocitrate Dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- SRBFZHDQGSBBOR-OWMBCFKOSA-N L-ribopyranose Chemical compound O[C@H]1COC(O)[C@@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-OWMBCFKOSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 1
- 108010055012 Orotidine-5'-phosphate decarboxylase Proteins 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 102000002508 Peptide Elongation Factors Human genes 0.000 description 1
- 108010068204 Peptide Elongation Factors Proteins 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical class [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MUPFEKGTMRGPLJ-RMMQSMQOSA-N Raffinose Natural products O(C[C@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O[C@@]2(CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O2)O1)[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 MUPFEKGTMRGPLJ-RMMQSMQOSA-N 0.000 description 1
- 235000019484 Rapeseed oil Nutrition 0.000 description 1
- 102000018120 Recombinases Human genes 0.000 description 1
- 108010091086 Recombinases Proteins 0.000 description 1
- 241000220286 Sedum Species 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 101150078565 TEF gene Proteins 0.000 description 1
- 241001540751 Talaromyces ruber Species 0.000 description 1
- 241001197925 Theila Species 0.000 description 1
- HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N Trehalose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N 0.000 description 1
- MUPFEKGTMRGPLJ-UHFFFAOYSA-N UNPD196149 Natural products OC1C(O)C(CO)OC1(CO)OC1C(O)C(O)C(O)C(COC2C(C(O)C(O)C(CO)O2)O)O1 MUPFEKGTMRGPLJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N alpha,alpha-trehalose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000000141 anti-hypoxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002180 anti-stress Effects 0.000 description 1
- 239000002518 antifoaming agent Substances 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 230000003078 antioxidant effect Effects 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N arabinose Natural products OCC(O)C(O)C(O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MSWZFWKMSRAUBD-UHFFFAOYSA-N beta-D-galactosamine Natural products NC1C(O)OC(CO)C(O)C1O MSWZFWKMSRAUBD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MSWZFWKMSRAUBD-QZABAPFNSA-N beta-D-glucosamine Chemical compound N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O MSWZFWKMSRAUBD-QZABAPFNSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 description 1
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N beta-maltose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N 0.000 description 1
- 238000010352 biotechnological method Methods 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 230000034303 cell budding Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000005515 coenzyme Substances 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 230000037149 energy metabolism Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 235000013569 fruit product Nutrition 0.000 description 1
- 235000011389 fruit/vegetable juice Nutrition 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-GUCUJZIJSA-N galactitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-GUCUJZIJSA-N 0.000 description 1
- HHLFWLYXYJOTON-UHFFFAOYSA-N glyoxylic acid Chemical compound OC(=O)C=O HHLFWLYXYJOTON-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007954 hypoxia Effects 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 238000009655 industrial fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- CDAISMWEOUEBRE-GPIVLXJGSA-N inositol Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O CDAISMWEOUEBRE-GPIVLXJGSA-N 0.000 description 1
- 229960000367 inositol Drugs 0.000 description 1
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 1
- JYJIGFIDKWBXDU-MNNPPOADSA-N inulin Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)OC[C@]1(OC[C@]2(OC[C@]3(OC[C@]4(OC[C@]5(OC[C@]6(OC[C@]7(OC[C@]8(OC[C@]9(OC[C@]%10(OC[C@]%11(OC[C@]%12(OC[C@]%13(OC[C@]%14(OC[C@]%15(OC[C@]%16(OC[C@]%17(OC[C@]%18(OC[C@]%19(OC[C@]%20(OC[C@]%21(OC[C@]%22(OC[C@]%23(OC[C@]%24(OC[C@]%25(OC[C@]%26(OC[C@]%27(OC[C@]%28(OC[C@]%29(OC[C@]%30(OC[C@]%31(OC[C@]%32(OC[C@]%33(OC[C@]%34(OC[C@]%35(OC[C@]%36(O[C@@H]%37[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O%37)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%36)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%35)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%34)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%33)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%32)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%31)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%30)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%29)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%28)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%27)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%26)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%25)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%24)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%23)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%22)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%21)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%20)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%19)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%18)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%17)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%16)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%15)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%14)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%13)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%12)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%11)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%10)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O9)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O8)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O7)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O6)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O5)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O4)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O3)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 JYJIGFIDKWBXDU-MNNPPOADSA-N 0.000 description 1
- 229940029339 inulin Drugs 0.000 description 1
- 238000006317 isomerization reaction Methods 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 150000002605 large molecules Chemical class 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- LVHBHZANLOWSRM-UHFFFAOYSA-N methylenebutanedioic acid Natural products OC(=O)CC(=C)C(O)=O LVHBHZANLOWSRM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007003 mineral medium Substances 0.000 description 1
- 210000001700 mitochondrial membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 150000002823 nitrates Chemical class 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 238000005895 oxidative decarboxylation reaction Methods 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- MUPFEKGTMRGPLJ-ZQSKZDJDSA-N raffinose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O2)O)O1 MUPFEKGTMRGPLJ-ZQSKZDJDSA-N 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- CDAISMWEOUEBRE-UHFFFAOYSA-N scyllo-inosotol Natural products OC1C(O)C(O)C(O)C(O)C1O CDAISMWEOUEBRE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 235000013619 trace mineral Nutrition 0.000 description 1
- 239000011573 trace mineral Substances 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 235000015112 vegetable and seed oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000008158 vegetable oil Substances 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
- 239000007222 ypd medium Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
- C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
- C12P7/44—Polycarboxylic acids
- C12P7/48—Tricarboxylic acids, e.g. citric acid
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Mycology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Группа изобретений относится к микробиологической промышленности. Предложен способ повышения продукции изолимонной кислоты в условиях избытка источника углерода и лимита по азоту с использованием дрожжей Yarrowia lipolytica, в которых усилен уровень экспрессии гена Y. lipolytica YALI0E34672g, кодирующий митохондриальный транспортер YALI0E34672p, участвующий в экспорте изоцитрата из митохондрии. Предложены также дрожжи вида Yarrowia lipolytica, продуцирующие изолимонную кислоту в условиях избытка источника углерода и лимита по азоту, у которых увеличено число копий гена Y. lipolytica YALI0E34672g и/или усилена промоторная область указанного гена. Группа изобретений обеспечивает повышение продукции изолимонной кислоты у дрожжей Yarrowia lipolytica. 2 н.п. ф-лы, 5 ил., 1 табл., 3 пр.
Description
Область техники
Настоящее изобретение относится к микробиологической промышленности, а именно к способу получения изолимонной кислоты с использованием в качестве продуцента дрожжей вида Yarrowia lipolytica, модифицированных методами генной инженерии.
Предшествующий уровень техники
Возрастающий интерес к продукции природного изомера изолимонной кислоты (трео-Ds(+)-изолимонная кислота) связан с использованием данной органической кислоты в фармацевтической и пищевой промышленностях [1]. Было показано, что изолимонная кислота является регулятором энергетического обмена, благодаря чему проявляет антигипоксические, антиоксидантные и антистрессовые свойства, и может быть использована для профилактики и лечения гипоксии [2]. Изолимонная кислота является одним из маркеров, используемых для определения подлинности и качества фруктовых продуктов [3].
В результате химического синтеза получается смесь из четырех стереоизомеров изолимонной кислоты, включая природный изомер трео-Ds(+)-изолимонная кислота, при этом, стереоизомеры представляют собой ингибиторы клеточных ферментов. На настоящий момент развития технологии разделить синтезированную смесь стереоизомеров нельзя, поэтому химический синтез не может быть использован для фармацевтических и пищевых целей.
Существуют способы получения исключительно природного изомера изолимонной кислоты из растительного сырья. Однако данный подход имеет следующие ограничения: зависимость от урожайности сырья, необходимость в обширных территориях для посева, зависимость от климатических факторов. С 1980 года фирма «Sigma-Aldrich» производит изолимонную кислоту, выделяя ее из сока специально культивируемого растения Sedum spectabile (Очиток удивительный). Однако, цена на полученный таким образом продукт слишком высока (704 доллара за 1 г монокалиевой соли изолимонной кислоты), что делает биосинтез на базе растений не доступным для широкого применения [4].
В настоящее время перспективной является разработка технологии получения изолимонной кислоты с использованием микроорганизмов. Микробиологический синтез также позволяет получить исключительно природный изомер, является сравнительно быстрым и простым способом, что снижает себестоимость изолимонной кислоты и делает продукт доступным и рентабельным для дальнейшего использования.
Способность продуцировать изолимонную кислоту была продемонстрирована у мицелиального гриба вида Penicillium purpurogenum, представителей дрожжей Candida ravautii, Candida catenulate, а также Yarrowia lipolytica [4]. Среди указанных микроорганизмов дрожжи Y. lipolytica являются наиболее физиологически и генетически изученными, для них разработаны технологии промышленной ферментации, системы генетической трансформации, подходы для экспрессии и инактивации генов, секвенирован геном [5].
В условиях избытка источника углерода и лимита по азоту дрожжи Y. lipolytica секретируют в среду культивирования смесь лимонной (ЛК) и изолимонной кислот (ИЛК). Следует отметить, что источник углерода определяет соотношение концентраций изолимонной и лимонной кислоты (ИЛК/ЛК) в их смеси. Так, при культивировании на глюкозе Y. lipolytica продуцируют преимущественно лимонную кислоту с концентрацией до 62 г/л, при этом концентрация изолимонной кислоты не превышает 7 г/л [6]. При культивировании на растительных маслах разные природные изоляты дрожжей Y. lipolytica продуцируют органические кислоты с соотношением ИЛК/ЛК в диапазоне от 0.43:1 до 1.59:1 [4]. Оптимизируя параметры культивирования в ферментере, удалось подобрать условия, позволяющие повысить данное соотношение до 2.1:1 [4]. Добавление итаконовой кислоты в качестве ингибитора глиоксилатного цикла при культивировании в ферментере с рапсовым маслом позволило повысить продукцию изолимонной кислоты до 82.7 г/л при культивировании, а соотношение ИЛК/ЛК до 4.9:1 [7].
В настоящее время актуальной задачей является расширение арсенала биотехнологических способов повышения продукции изолимонной кислоты методами генной инженерии в дрожжах Y. lipolytica.
Краткое описание изобретения
Предложен способ повышения продукции изолимонной кислоты у дрожжей вида Y. lipolytica путем увеличения пула митохондриального транспортера изоцитрата за счет усиления уровня экспрессии гена Y. lipolytica YALI0E34672g, кодирующего митохондриальный транспортер YALI0E34672p, участвующий в экспорте изоцитрата из митохондрии.
Суть данного изобретения заключается в следующем.
Изоцитрат синтезируется в митохондрии в цикле Кребса посредством реакции изомеризации цитрата в изоцитрат, катализируемой ферментом аконитазой. В условиях избытка источника углерода и лимита по азоту происходит частичное торможение следующего этапа цикла Кребса - окислительного декарбоксилирования изоцитрата, катализируемого ферментом изоцитратдегидрогеназой (Idh), что приводит к накоплению интермедиантов цикла Кребса изоцитрата и цитрата в митохондрии (фиг. 1) [8]. Внутренняя мембрана митохондрии непроницаема для крупных молекул, таких как органические кислоты, аминокислоты, нуклеотиды, коферменты и кофакторы. Транспортную функцию данных молекул через мембрану осуществляет особая группа белков - митохондриальные транспортеры [9]. Нами установлено, что митохондриальным транспортером, обладающим сродством к изоцитрату, является белок YALI0E34672p.Так как данный белок имеет 65% гомологии к митохондриальному транспортеру S. cerevisiae Sfc1p [9, 10], то в соответствие с принятой международной номенклатурой он назван YlSfc1p, а кодирующий его ген YALI0E34672g назван YISFC1.
Показано, что, повышая уровень экспрессии данного гена, можно добиться повышения продукции изолимонной кислоты и соотношения ИЛК/ЛК дрожжами вида Y. lipolytica.
Из литературных данных известно, что повысить уровень экспрессии гена можно как посредством увеличения числа копий гена [11], так и посредством замены нативного промотора гена на более сильный промотор [11, 12]. Однако лучшего результата можно добиться путем совместного использования обоих подходов [11].
Таким образом, технической задачей, на решение которой направлено представленное изобретение является расширение арсенала способов повышения продукции изолимонной кислоты у дрожжей вида Yarrowia lipolytica, а также расширение арсенала дрожжей вида Yarrowia lipolytica, обладающих способностью к продукции изолимонной кислоты в условиях избытка источника углерода и лимита по азоту.
Поставленная задача решена тем, что предложен способ повышения продукции изолимонной кислоты у дрожжей вида Y. lipolytica в условиях избытка источника углерода и лимита по азоту путем повышения уровня экспрессии гена Y. lipolytica YALI0E34672g за счет увеличения числа копий гена и/или замены нативного промотора указанного гена на более сильный промотор.Поставленная задача решена также тем, что получены дрожжи вида Y. lipolytica, продуцирующие изолимонную кислоту в условиях избытка источника углерода и лимита по азоту, модифицированные таким образом, что в них увеличено число копий гена Y. lipolytica YALI0E34672g и/или усилена промоторная область указанного гена.
Показано, что дрожжи, полученные заявленным способом, обладают повышенной продукцией изолимонной кислоты и более высоким уровнем соотношения концентраций изолимонной кислоты к лимонной кислоте по сравнению с исходной культурой.
Краткое описание рисунков
Изобретение проиллюстрировано следующими фигурами графического изображения:
Фиг. 1 Схема синтеза изолимонной и лимонной кислот в дрожжах Yarrowia lipolytica
Фиг. 2 Схема экспрессионного вектора pTEFin-uno
Фиг. 3 Схема генетической конструкции pTEFin-uno-YlSFC1
Фиг. 4 Утилизация глюкозы, накопление биомассы и продукция изолимонной и лимонной кислот при культивировании в 1-л ферментере штамма ВКПМ Y-4395.
Фиг. 5 Утилизация глюкозы, накопление биомассы и продукция изолимонной и лимонной кислот при культивировании в 1-л ферментере дикого штамма ВКПМ Y-3178.
Примеры.
Пример 1. Получение дрожжей Y. lipolytica с усиленной экспрессией гена 
Для проведения экспериментов использовали дикий штамм Yarrowia lipolytica W29, депонированный в БРЦ ВКПМ НИЦ «Курчатовский институт» - ГосНИИ Генетика под регистрационным номером ВКПМ Y-3178.
1.1 Конструирование экспрессионного вектора pTEF-uno
Промотор гена TEF, кодирующего фактор элонгации трансляции Y. lipolytica, содержащий интрон (TEFin), амплифицируют с геномной ДНК природного изолята Y. lipolytica БРЦ ВКПМ Y-3178 с помощью метода ПЦР с использованием Pfu-полимеразы (#ЕР0502, Thermo Scientific) и праймеров:
ПЦР-продукт TEFin размером 560 п. н. очищают после электрофореза в 1% агарозном геле методом экстракции ДНК (Kit #K0513, Thermo Scientific) и лигируют на вектор pUC19, обработанный эндонуклеазой рестрикции 
Лигазную смесь трансформируют в штамм Е. coli XL1 (Blue). Белые клоны, содержащие необходимую вставку амплифицированной ДНК, отбирают на чашках с добавлением Xgal и IPTG по стандартному тесту на отсутствие активности β-галактозидазы и по устойчивости к ампициллину. Плазмидную ДНК, выделенную из полученных клонов, проверяют рестрикционным анализом и секвенируют (стандартные праймеры M13F, M13R). Полученная плазмида размером 3238 п. н. названа pUC-TEFin.
Терминатор Txpr получают путем обработки вектора pUC-Txpr (RU 2355754) эндонуклеазами рестрикции XbaI и XmaJI, очищают после электрофореза в 1% агарозном геле и лигируют на вектор pUC-TEFin, обработанный эндонуклеазой рестрикции XmaJI и щелочной фосфатазой (#EF0651, Thermo Scientific). Лигазную смесь трансформируют в Е. coli XL1 (Blue). Клоны, содержащие необходимую вставку, отбирают на чашках по устойчивости к ампициллину. Плазмидную ДНК, выделенную из полученных клонов, проверяют рестрикционным анализом. Полученная плазмида размером 3378 п. н. названа pUC-TEFin-Txpr.
Ген, кодирующий оротидин-5-фосфат-декарбоксилазу URA3, экранированный сайтами узнавания рекомбиназы Cre фага Р1 (lox66, lox71) амплифицируют методом ПЦР с использованием праймеров
ПЦР-продукт очищают после электрофореза в 1% агарозном геле и лигируют на вектор pUC19, обработанный эндонуклеазой рестрикции 
Лигазную смесь трансформируют в Е. coli XL1 (Blue). Белые клоны, содержащие необходимую вставку амплифицированной ДНК, отбирают на чашках с добавлением Xgal и IPTG. Плазмидную ДНК, выделенную из полученных клонов, проверяют рестрикционным анализом и секвенируют (стандартные праймеры M13F, M13R). Полученную плазмиду pUC-URAlox, размером 4162 п. н. обрабатывают эндонуклеазами рестрикции XbaI и EcoO109I. Полученный в результате ДНК-фрагмент lox66-URA3-lox71 выделяют после электрофореза в 1% агарозном геле, обрабатывают Pfu-полимеразой для получения тупых концов и лигируют на вектор pUC-TEFin-Txpr, обработанный эндонуклеазой рестрикции EcoO109I, Pfu-полимеразой и щелочной фосфатазой. Лигазную смесь трансформируют в Е. coli XL1(Blue). Плазмидную ДНК, выделенную из полученных клонов, проверяют рестрикционным анализом. Полученная плазмида, размером 5291 п. н. названа pTEFin-uno (фиг. 2).
1.2 Получение генетической конструкции pTEF-uno-YlSFC1
Ген 
амплифицируют методом ПЦР с геномной ДНК штамма БРЦ ВКПМ Y-3178 по праймерам:
ПЦР-продукт размером 977 п. н. обрабатывают эндонуклеазами рестрикции Esp3I и XmaJI, очищают после электрофореза в 1% агарозном геле методом экстракции ДНК и лигируют на вектор pTEFin-uno, обработанный эндонуклеазами рестрикции BpiI и XmaJI. Лигазную смесь трансформируют в Е. coli XL1(Blue). Плазмидную ДНК, выделенную из полученных клонов, проверяют рестрикционным анализом и секвенируют. Полученная плазмида размером 6239 п. н. названа pTEFin-uno-YlSFC1 (фиг. 3).
1.3 Получение дрожжей Y. lipolytica с усиленным уровнем экспрессии гомологичного гена
Методом, описанным в [11] на базе штамма ВКПМ Y-3178 получают ауксотрофный по урацилу штамм ВКПМ Y-3178 URA3-, депонированный в БРЦ ВКПМ под регистрационным номером ВКПМ Y-3372.
Генетическую конструкцию pTEFin-uno-YlSFC1 обрабатывают эндонуклеазами рестрикции SapI и EheI и 2 мкг полученной экспрессионной кассеты TEFin-uno-YlSFC1 используют для трансформации штамма Y. lipolytica БРЦ ВКПМ Y-3372 метод электропорации [12]. Трансформанты отбирают на минимальной среде YNBD (Himedia G091 с добавлением глюкозы 20 г/л) по прототрофности к урацилу. Полученные дрожжи обладают усиленным уровнем экспрессии гена Y. lipolytica .
Культивирование отобранных трансформантов проводят в трех независимых повторностях в пробирках (50 мл) с рабочим объемом 10 мл при 30°С и постоянном перемешивании (250 об/мин) в течение 5 суток в среде YNBD9N0.2 (Himedia M151 с добавлением глюкозы 90 г/л, (NH4)2SO4 2 г/л, 100мМ калий фосфатного буфера рН=6.8). В качестве контроля используют исходный родительский дикий штамм ВКПМ Y-3178. На 2 сутки культивирования для поддержания рН добавляют мел 200 мг. Пробы отбирают на 5 сутки культивирования. К культуральной жидкости добавляют равный объем 1М HCl, центрифугируют 1 мин 14500 об/мин, супернатант переносят в новый эппендорф и делают необходимые разведения. Количество продуцируемых изолимонной и лимонной кислот в супернатанте определяют с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии. В результате культивирования выявлено, что полученные дрожжи, обладающие усиленным уровнем экспрессии гена Y. lipolytica , способны к продукции изолимонной кислоты.
Исходя из уровня продукции изолимонной кислоты, отбирают лучший трансформант W29 
№19, который продуцирует 33.9 г/л изолимонной кислоты, что в 4 раза выше уровня продукции изолимонной кислоты диким штаммом ВКПМ Y-3178 (табл. 1).
Соотношение ИЛК/ЛК, продуцируемых штаммом W29 при культивировании на глюкозе в качестве единственного источника углерода, составляет 2.2:1, тогда как данный параметр для дикого штамма равен 0.3:1 (табл. 1). Следует отметить, что данные результаты впервые демонстрируют продукцию изолимонной кислоты как основную органическую кислоту при культивировании на глюкозе дрожжами Y. lipolytica.
Сконструированный штамм W29 
№19 депонирован в БРЦ ВКПМ НИЦ «Курчатовский институт» - ГосНИИ Генетика (117545 Москва, 1-ый Дорожный пр-д, д.1) и имеет регистрационный номер ВКПМ Y-4395.
Сконструированный штамм Y. lipolytica ВКПМ Y- характеризуется следующими признаками:
1. Культурально-морфологические признаки
Суточная культура в жидкой среде YPD (мас. %: дрожжевой экстракт 1, пептон 2, глюкоза 2) представлена овальными, удлиненно-овальными, округлыми клетками размером 4.6-6.0×4.5-12.5 мкм. Почкование полярное или латеральное, на узком основании. К третьим суткам большинство клеток почкуются и образуют псевдомицелий. Колонии на агаризованной среде YPD кремового цвета, пастообразные, слегка приподнятые в центре, морщинистые, с фестончатым краем. Штрих на агаризованной среде YPD непрерывный, плоский, блестящий, кремово-белого цвета, пастообразный, края ровные, со временем становится складчатым. Спор не образует.
2. Физиолого-биохимические признаки
Облигатный аэроб. Сахара не сбраживает. Ассимилирует глюкозу, глицерин, этанол, ацетат, гидрофобные субстраты. Не ассимилирует: мальтозу, лактозу, целлобиозу, трегалозу, мелибиозу, раффинозу, мелицитозу, инулин, крахмал, D-ксилозу, L- и D-арабинозу, раммозу, дульцит, инозит, D-глюкозамин и глюкуроновую, 2-кетоглюконовую, 5-кетоглюконовую кислоты. Не ассимилирует нитраты. Не растет в безвитаминной среде, требует тиамин, не требует биотин. Оптимальное значение рН для роста 5,5-7,0. Не растет при 37°С. Максимальная температура роста 35°С.
Пример 2. Культивирование штамма Y. lipolytica ВКПМ Y-4395 в малом объеме с разными источниками углерода
Штамм ВКПМ Y-4395 культивируют в пробирках (50 мл) как описано в примере 1.3 в средах следующего состава:
YNBOo9N0.2 - Himedia M151, с добавлением эмульсии оливкового масла до конечной концентрации 9% (v/v), (NH4)2SO4 0.2%, 100 мМ калий фосфатного буфера рН=6.8. Оливковое масло эмульгируют с водой с помощью твина 40 (50% v/v оливкового масла, 1% v/v твина 40);
YNBG9N0.2 - Himedia M151 с добавлением глицерина 9%, (NH4)2SO4 0.2%, 100 мМ калий фосфатного буфера рН=6.8.
Подготовка проб и анализ ведут как описано в примере 1.3.
Результаты представлены в табл. 1. Как видно из табл. 1 при культивировании с оливковым маслом в качестве источника углерода штамм ВКПМ Y-4395 продуцирует 32.0 г/л изолимонной кислоты, что превосходит продукцию изолимонной кислоты контрольным диким штаммом ВКПМ Y-3178 в 1.7. Соотношение ИЛК/ЛК при культивировании на оливковом масле составляет 2.3:1. Данный параметр для контрольного штамма ВКПМ Y-3178 равен 1:1.
При культивировании с глицерином в качестве источника углерода штамм ВКПМ Y-4395 продуцирует 43.3 изолимонной кислоты, соответственно, что превосходит продукцию изолимонной кислоты диким штаммом ВКПМ Y-3178 в 6.3 раза, соответственно (табл. 1). Соотношение ИЛК/ЛК при культивировании на глицерине составляет 3.7:1 для штамма ВКПМ Y-4395, тогда как данный параметр для дикого штамма равен 0.2:1 (Табл. 1).
Пример 3. Культивирование штамма Y. lipolytica ВКПМ Y-4395 в ферментере
Культивирование штамма ВКПМ Y-4395 проводят в 1-л ферментере Applikon BioBundle 1L с рабочим объемом 500 мл при температуре 29°С в минеральной среде следующего состава (мас. %): глюкоза 4, (NH4)2SO4 0.3, MgSO4⋅7H2O 0.14, NaCl 0.05, Ca(NO3)2 0.08, KH2PO4 0.2, K2HPO4 0.02, биотин 0.00005, тиамин 0.001. Концентрированный раствор микроэлементов следующего состава (мас. %): CuSO4⋅5H2O 0.6, KI 0.0088, MnSO4⋅5H2O 0.3, Н3ВО3 0.02, CoCl2⋅6H2O 0.0955, ZnSO4⋅7H2O 4.2, FeSO4⋅7H2O 6.5, H2SO4 0.5, готовится отдельно и вносится в количестве 4.6 мл на 1 л рабочего объема. В качестве пеногасителя используют адеканоль (0.1% v/v). Каждые 24 ч в ферментер вносится подпитка глюкозы (30 г/л). Раствор 5М NaOH используют для поддержания значения рН среды равного 5 на протяжении первых суток культивирования, затем значение рН=6 до конца культивирования. Уровень растворенного в среде кислорода составляет не менее 50%.
Подготовку посевной культуры проводят в два этапа:
- пересев штамма на агаризованную среду YPD;
- посев в жидкую среду YNBDbuf (YNBD с добавлением 100 мМ К-фостатного буфера) в колбы с общим объемом 750 мл и рабочим объемом 70 мл и инкубация в течение 24 ч при 30°С и постоянном перемешивании (250 об/мин).
Посевная культура вносится в ферментер в количестве 10% от рабочего объема. Отбор проб осуществляется каждые 24 ч.
В качестве контроля в аналогичных условиях проводят культивирование дикого штамма ВКПМ Y-3178.
Сконструированный штамм ВКПМ Y-4395 накапливает 69.4 г/л изолимонной кислоты за 144 ч культивирования, при этом соотношение концентраций изолимонной кислоты к лимонной кислоте составляет 2.3:1 (фиг. 4).
Контрольный дикий штамм БРЦ ВКПМ Y-3178 накапливает всего 7.5 г/л изолимонной кислоты на 144 ч культивирования, тогда как основным продуктом ферментации является лимонная кислота, концентрация которой составляет 63.8 г/л (фиг. 5). Соотношение концентраций изолимонной кислоты к лимонной кислоте составляет 0.1:1.
Представленное изобретение позволяет повысить продукцию изолимонной кислоты дрожжами Y. lipolytica на средах, содержащих широкий спектр субстратов, включая глюкозу, а также повысить соотношение концентраций изолимонной кислоты к лимонной кислоте, секретируемых в среду культивирования.
Список литературы
1. Aurich, A., et al., Microbiologically produced carboxylic acids used as building blocks in organic synthesis. Subcell Biochem, 2012. 64: p. 391-423.
2. Kamzolova, S.V., et al., The effect of oxalic and itaconic acids on threo-Ds-isocitric acid production from rapeseed oil by Yarrowia lipolytica. Bioresour Technol, 2016. 206: p. 128-133.
3. Karovicova, J., et al., Using capillary isotachophoresis for the determination of biogenic amines and D-isocitric acid in food products. Nahrung, 2003. 47(3): p. 188-90.
4. Kamzolova, S.V., et al., Isocitric acid production from rapeseed oil by Yarrowia lipolytica yeast. Appl Microbiol Biotechnol, 2013. 97(20): p. 9133-44.
5. Nicaud, J.M., Yarrowia lipolytica. Yeast, 2012. 29(10): p. 409-18.
6. Cavallo, E., et al., Yarrowia lipolytica: a model yeast for citric acid production. FEMS Yeast Res, 2017.17(8).
7. Kamzolova, S.V., et al., Fermentation Conditions and Media Optimization for Isocitric Acid Production from Ethanol by Yarrowia lipolytica. Biomed Res Int, 2018. 2018: p. 2543210.
8. Beopoulos, A., J.M. Nicaud, and C. Gaillardin, An overview of lipid metabolism in yeasts and its impact on biotechnological processes. Appl Microbiol Biotechnol, 2011. 90(4): p. 1193-206.
9. Palmieri, F., et al., Identification of mitochondrial carriers in Saccharomyces cerevisiae by transport assay of reconstituted recombinant proteins. Biochim Biophys Acta, 2006. 1757(9-10): p. 1249-62.
10. Bojunga, N., P. Kotter, and K.D. Entian, The succinate/fumarate transporter Acrlp of Saccharomyces cerevisiae is part of the gluconeogenic pathway and its expression is regulated by Cat8p. Mol Gen Genet, 1998. 260(5): p. 453-61.
11. Yuzbasheva, E.Y., et al., Co-expression of glucose-6-phosphate dehydrogenase and acyl-CoA binding protein enhances lipid accumulation in the yeast Yarrowia lipolytica. N Biotechnol, 2017.
12. Wang, J.-H., W. Hung, and S.-H. Tsai, High efficiency transformation by electroporation of Yarrowia lipolytica. The Journal of Microbiology, 2011. 49(3): p. 469-472.
Claims (2)
1. Способ повышения продукции изолимонной кислоты у дрожжей Yarrowia lipolytica в условиях избытка источника углерода и лимита по азоту путем повышения уровня экспрессии гена Y. lipolytica YALI0E34672g за счет увеличения числа копий гена и/или замены нативного промотора указанного гена на более сильный промотор.
2. Дрожжи вида Yarrowia lipolytica, продуцирующие изолимонную кислоту в условиях избытка источника углерода и лимита по азоту, отличающиеся тем, что в них увеличено число копий гена Y. lipolytica YALI0E34672g и/или усилена промоторная область указанного гена.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2018126504A RU2713124C2 (ru) | 2018-07-18 | 2018-07-18 | Способ повышения продукции изолимонной кислоты у дрожжей Yarrowia lipolytica, дрожжи вида Yarrowia lipolytica, обладающие способностью к продукции изолимонной кислоты |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2018126504A RU2713124C2 (ru) | 2018-07-18 | 2018-07-18 | Способ повышения продукции изолимонной кислоты у дрожжей Yarrowia lipolytica, дрожжи вида Yarrowia lipolytica, обладающие способностью к продукции изолимонной кислоты |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2018126504A RU2018126504A (ru) | 2020-01-20 |
| RU2018126504A3 RU2018126504A3 (ru) | 2020-01-20 |
| RU2713124C2 true RU2713124C2 (ru) | 2020-02-03 |
Family
ID=69171082
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2018126504A RU2713124C2 (ru) | 2018-07-18 | 2018-07-18 | Способ повышения продукции изолимонной кислоты у дрожжей Yarrowia lipolytica, дрожжи вида Yarrowia lipolytica, обладающие способностью к продукции изолимонной кислоты |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2713124C2 (ru) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2747583C1 (ru) * | 2020-05-26 | 2021-05-11 | Федеральный исследовательский центр "Пущинский научный центр биологических исследований Российской академии наук" (ФИЦ ПНЦБИ РАН) | Способ получения (2r, 3s)-изолимонной кислоты из подсолнечного масла с помощью дрожжей yarrowia lipolytica |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2757603C1 (ru) * | 2021-02-26 | 2021-10-19 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов Национального исследовательского центра "Курчатовский институт" (НИЦ "Курчатовский институт" - ГосНИИгенетика) | Штамм дрожжей Yarrowia lipolytica, продуцирующий изолимонную кислоту |
| CN113755536A (zh) * | 2021-03-15 | 2021-12-07 | 微恒科技(天津)有限公司 | 一种发酵生产异柠檬酸的方法 |
-
2018
- 2018-07-18 RU RU2018126504A patent/RU2713124C2/ru active
Non-Patent Citations (5)
| Title |
|---|
| PALMIERI L. ET AL. Identification of the Yeast Mitochondrial Transporter for Oxaloacetate and Sulfate. THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, 1999, Vol. 274, No. 32, Issue of August 6, pp. 22184-22190. * |
| PALMIERI L. ET AL. Yeast Mitochondrial Carriers: Bacterial Expression, Biochemical Identification and Metabolic Significance. Journal of Bioenergetics and Biomembranes, 2000, Vol. 32, No. 1, pp.67-77. * |
| база данных UniProtKB - Q6C3I0 (Q6C3I0_YARLI), 16.08.2004. HOLZ M. ET AL. Aconitase overexpression changes the product ratio of citric acid production by Yarrowia lipolytica. Appl Microbiol Biotechnol. 2009 Jan;81(6):1087-96. doi: 10.1007/s00253-008-1725-6. * |
| база данных UniProtKB - Q6C3I0 (Q6C3I0_YARLI), 16.08.2004. HOLZ M. ET AL. Aconitase overexpression changes the product ratio of citric acid production by Yarrowia lipolytica. Appl Microbiol Biotechnol. 2009 Jan;81(6):1087-96. doi: 10.1007/s00253-008-1725-6. Epub 2008 Oct 11. PALMIERI L. ET AL. Identification of the Yeast Mitochondrial Transporter for Oxaloacetate and Sulfate. THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, 1999, Vol. 274, No. 32, Issue of August 6, pp. 22184-22190. PALMIERI L. ET AL. Yeast Mitochondrial Carriers: Bacterial Expression, Biochemical Identification and Metabolic Significance. Journal of Bioenergetics and Biomembranes, 2000, Vol. 32, No. 1, pp.67-77. КАМЗОЛОВА С.В. И ДР. Биосинтез изолимонной кислоты дрожжами Yarrowia lipolytica и его регуляция. Прикладная биохимия и микробиология, 2015, Т. 51, No. 2, c. 251. * |
| КАМЗОЛОВА С.В. И ДР. Биосинтез изолимонной кислоты дрожжами Yarrowia lipolytica и его регуляция. Прикладная биохимия и микробиология, 2015, Т. 51, No. 2, c. 251. * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2747583C1 (ru) * | 2020-05-26 | 2021-05-11 | Федеральный исследовательский центр "Пущинский научный центр биологических исследований Российской академии наук" (ФИЦ ПНЦБИ РАН) | Способ получения (2r, 3s)-изолимонной кислоты из подсолнечного масла с помощью дрожжей yarrowia lipolytica |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2018126504A (ru) | 2020-01-20 |
| RU2018126504A3 (ru) | 2020-01-20 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Cavallo et al. | Yarrowia lipolytica: a model yeast for citric acid production | |
| Timoumi et al. | Impacts of environmental conditions on product formation and morphology of Yarrowia lipolytica | |
| Lazar et al. | Simultaneous production of citric acid and invertase by Yarrowia lipolytica SUC+ transformants | |
| Dobrowolski et al. | Production of tailor-made fatty acids from crude glycerol at low pH by Yarrowia lipolytica | |
| US9725745B2 (en) | Process for biodiesel production from a yeast strain | |
| RU2713124C2 (ru) | Способ повышения продукции изолимонной кислоты у дрожжей Yarrowia lipolytica, дрожжи вида Yarrowia lipolytica, обладающие способностью к продукции изолимонной кислоты | |
| EP2283110A1 (en) | Improved yeast strains for organic acid production | |
| Cybulski et al. | Production of pyruvic acid from glycerol by Yarrowia lipolytica | |
| Amza et al. | High cell density cultivation of Lipomyces starkeyi for achieving highly efficient lipid production from sugar under low C/N ratio | |
| Morgunov et al. | Physiologo-biochemical characteristics of citrate-producing yeast Yarrowia lipolytica grown on glycerol-containing waste of biodiesel industry | |
| US20090269832A1 (en) | Growth of Microorganisms in Media Containing Crude Glycerol | |
| US20250305021A1 (en) | Enzymatic lysis for extraction of bioproducts from yeast | |
| Kamzolova et al. | Characteristics of the growth on rapeseed oil and synthesis of citric and isocitric acids by Yarrowia lipolytica yeasts | |
| US20220186237A1 (en) | Construction of high lipid accumulating mucor circinelloides strain by non-de novo synthesis method and industrial application of constructed strain | |
| Ardestani et al. | Optimization of single cell protein production by Aspergillus niger using Taguchi approach | |
| RU2539092C1 (ru) | РЕКОМБИНАНТНЫЙ ШТАММ ДРОЖЖЕЙ Schizosaccharomyces pombe - ПРОДУЦЕНТ МОЛОЧНОЙ КИСЛОТЫ | |
| Kamzolova et al. | Biotechnological potential of Yarrowia lipolytica grown under thiamine limitation | |
| Nietz et al. | A new lipase (Alip2) with high potential for enzymatic hydrolysis of the diester diethyladipate to the monoester monoethyladipate | |
| RU2355754C1 (ru) | ШТАММ ДРОЖЖЕЙ Yarrowia lipolytica - ПРОДУЦЕНТ ЛИПАЗЫ | |
| Wojtanowicz et al. | Effect of inoculum onkinetics and yield of citric acid production on glucose by Yarrowia lipolytica A-101 | |
| JPH0449396B2 (ru) | ||
| RU2504579C2 (ru) | РЕКОМБИНАНТНЫЙ ШТАММ ДРОЖЖЕЙ Yarrowia lipolytica - ПРОДУЦЕНТ ФИТАЗЫ | |
| RU2757603C1 (ru) | Штамм дрожжей Yarrowia lipolytica, продуцирующий изолимонную кислоту | |
| Nojima et al. | Isolation and characterization of triacylglycerol-secreting mutant strain from yeast, Saccharomyces cerevisiae | |
| Szczodrak et al. | Selection of yeast strain and fermentation conditions for high‐yield ethanol production from lactose and concentrated whey |