RU2709645C1 - METHOD FOR HUMAN GENOTYPE DETERMINATION BY MUTATION c.1236GA IN 11 EXON OF DPYD GENE - Google Patents
METHOD FOR HUMAN GENOTYPE DETERMINATION BY MUTATION c.1236GA IN 11 EXON OF DPYD GENE Download PDFInfo
- Publication number
- RU2709645C1 RU2709645C1 RU2019108708A RU2019108708A RU2709645C1 RU 2709645 C1 RU2709645 C1 RU 2709645C1 RU 2019108708 A RU2019108708 A RU 2019108708A RU 2019108708 A RU2019108708 A RU 2019108708A RU 2709645 C1 RU2709645 C1 RU 2709645C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- mutation
- exon
- dpyd
- dpyd gene
- gene
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 19
- 101150116866 Dpyd gene Proteins 0.000 title claims description 19
- 230000035772 mutation Effects 0.000 title claims description 15
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 claims abstract description 14
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 claims abstract description 6
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 3
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 claims description 2
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 claims description 2
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 claims description 2
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 claims description 2
- 238000011880 melting curve analysis Methods 0.000 claims 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 claims 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 abstract description 7
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 abstract description 5
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 abstract description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 3
- 238000002844 melting Methods 0.000 abstract description 3
- 230000008018 melting Effects 0.000 abstract description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 abstract description 3
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 8
- GAGWJHPBXLXJQN-UORFTKCHSA-N Capecitabine Chemical compound C1=C(F)C(NC(=O)OCCCCC)=NC(=O)N1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](C)O1 GAGWJHPBXLXJQN-UORFTKCHSA-N 0.000 description 6
- GHASVSINZRGABV-UHFFFAOYSA-N Fluorouracil Chemical compound FC1=CNC(=O)NC1=O GHASVSINZRGABV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 229960002949 fluorouracil Drugs 0.000 description 6
- 102100022334 Dihydropyrimidine dehydrogenase [NADP(+)] Human genes 0.000 description 5
- 238000011161 development Methods 0.000 description 5
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 5
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 5
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 5
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 5
- GAGWJHPBXLXJQN-UHFFFAOYSA-N Capecitabine Natural products C1=C(F)C(NC(=O)OCCCCC)=NC(=O)N1C1C(O)C(O)C(C)O1 GAGWJHPBXLXJQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108010066455 Dihydrouracil Dehydrogenase (NADP) Proteins 0.000 description 4
- 101000902632 Homo sapiens Dihydropyrimidine dehydrogenase [NADP(+)] Proteins 0.000 description 4
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 4
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 4
- 229960004117 capecitabine Drugs 0.000 description 4
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 4
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- 238000007894 restriction fragment length polymorphism technique Methods 0.000 description 3
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 3
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000001333 Colorectal Neoplasms Diseases 0.000 description 2
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 2
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 231100000171 higher toxicity Toxicity 0.000 description 2
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 210000005105 peripheral blood lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000002974 pharmacogenomic effect Effects 0.000 description 2
- 102000054765 polymorphisms of proteins Human genes 0.000 description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 2
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 2
- 208000034428 5-fluorouracil toxicity Diseases 0.000 description 1
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 230000001093 anti-cancer Effects 0.000 description 1
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 102000054766 genetic haplotypes Human genes 0.000 description 1
- 238000003205 genotyping method Methods 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 231100000518 lethal Toxicity 0.000 description 1
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 1
- 238000010197 meta-analysis Methods 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 230000008707 rearrangement Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 238000007480 sanger sequencing Methods 0.000 description 1
- 210000001599 sigmoid colon Anatomy 0.000 description 1
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 1
- 230000009897 systematic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011269 treatment regimen Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
Предложенный способ относится к области биотехнологии, молекулярной биологии и генетики, и может быть использован для определения генотипа человека по мутации c.1236G>A (p.E412E, rs556038477) в 11 экзоне гена DPYD (ENST00000370192.7, RefSeq NM_000110) с отнесением исследуемого образца к гомозиготе по «дикому типу» или гетерозиготе по диагностируемому аллельному варианту.The proposed method relates to the field of biotechnology, molecular biology and genetics, and can be used to determine the human genotype by mutation c.1236G> A (p.E412E, rs556038477) in exon 11 of the DPYD gene (ENST00000370192.7, RefSeq NM_000110) with reference to the studied sample to homozygous for the "wild type" or heterozygous for the diagnosed allelic variant.
Фармакогенетическое тестирование с целью прогноза развития токсических и побочных эффектов при проведении лекарственного лечения является одним из активно развивающихся направлений в ДНК-тестировании и постепенно занимает свое место во многих клинических рекомендациях по лечению злокачественных новообразований. Разработка и внедрение способа тестирования полиморфных вариантов в гене DPYD, одобренного FDA (Food and Drug Administration) и включенного в рекомендации ESMO (European Society of Clinical Oncology) для прогнозирования токсичности химиотерапии при лечении ряда злокачественных новообразований, является одним из приоритетных направлений в фармакогенетическом тестировании. Pharmacogenetic testing to predict the development of toxic and side effects during drug treatment is one of the rapidly developing areas in DNA testing and is gradually taking its place in many clinical guidelines for the treatment of malignant neoplasms. The development and implementation of a method for testing polymorphic variants in the DPYD gene, approved by the FDA (Food and Drug Administration) and included in the ESMO (European Society of Clinical Oncology) recommendations for predicting the toxicity of chemotherapy in the treatment of a number of malignant neoplasms, is one of the priorities in pharmacogenetic testing.
Ген DPYD кодирует фермент дигидропиримидиндегидрогеназу, функциональная недостаточность которой, приводит к развитию 5-фторурацил-ассоциированной токсичности (OMIM 274270) при назначении 5-фторурацила и капецитабина («Кселода»). ДНК-диагностика, основанная на определении генотипа человека по мутациям и полиморфизмам в гене DPYD, необходима для прогнозирования развития осложнений, ассоциированных с приемом данных лекарственных препаратов, коррекции дозы и схемы проводимого лечения.The DPYD gene encodes a dihydropyrimidine dehydrogenase enzyme whose functional deficiency leads to the development of 5-fluorouracil-associated toxicity (OMIM 274270) when 5-fluorouracil and capecitabine (Xeloda) are given. DNA diagnostics based on the determination of the human genotype by mutations and polymorphisms in the DPYD gene is necessary to predict the development of complications associated with taking these drugs, dose adjustment and treatment regimens.
Широко распространен способ определения полиморфных вариантов и мутаций в гене DPYD с помощью секвенирования по Сэнгеру всей кодирующей последовательности гена DPYD (Kuilenburg, A. Analysis of severely affected patients with dihydropyrimidine dehydrogenase defeciency reveals large intragenic rearrangements of DPYD and a de novo interstitial deletion del(1)(p13.3p21.3) / Kuilenburg A., Meijer J., Mul A. et al. // Hum.Genet. - 2009. - V.125. - P.589-590).A widely used method for determining polymorphic variants and mutations in the DPYD gene is through Sanger sequencing of the entire coding sequence of the DPYD gene (Kuilenburg, A. Analysis of severely affected patients with dihydropyrimidine dehydrogenase defeciency reveals large intragenic rearrangements of DPYD and a de novo interstitial deletion del (1 ) (p13.3p21.3) / Kuilenburg A., Meijer J., Mul A. et al. // Hum. Genet. - 2009. - V.125. - P.589-590).
Недостатки: трудоемкость, высокая стоимость проведения исследования.Disadvantages: the complexity, the high cost of the study.
Известен способ генотипирования полиморфных вариантов в гене DPYD, основанный на применении метода ПЦР с детекцией результатов в режиме реального времени (Real-time PCR) (Deenen, M. Relationship between Single Nucleotide Polymorphisms and Haplotypes in DPYD and Toxicity and Efficacy of Capecitabine in Advanced Colorectal Cancer / Deenen, M., Tol J., Burylo A. et al. // Clin. Cancer Res. - V. 17. - P. 3455-3468).A known method of genotyping polymorphic variants in the DPYD gene , based on the use of PCR method with the detection of results in real time (Real-time PCR) (Deenen, M. Relationship between Single Nucleotide Polymorphisms and Haplotypes in DPYD and Toxicity and Efficacy of Capecitabine in Advanced Colorectal Cancer / Deenen, M., Tol J., Burylo A. et al. // Clin. Cancer Res. - V. 17. - P. 3455-3468).
Недостатки: высокая стоимость проведения исследования.Disadvantages: high cost of the study.
Известен способ определения полиморфных вариантов в гене DPYD, основанный на гибридизации на чипах с применением аллель-специфичных зондов (т.н. SNP-array) (Rosmarin, D. Genetic Markers of Toxicity From Capecitabine and Other Fluorouracil-Based Regimens: Investigation in the QUASAR2 Study, Systematic Review and Meta-Analysis / Dan R., Palles C., Church D. et al. // Journal of clinical oncology. - 2014. - V. 32).A known method for determining polymorphic variants in the DPYD gene is based on hybridization on chips using allele-specific probes (the so-called SNP array) (Rosmarin, D. Genetic Markers of Toxicity From Capecitabine and Other Fluorouracil-Based Regimens: Investigation in the QUASAR2 Study, Systematic Review and Meta-Analysis / Dan R., Palles C., Church D. et al. // Journal of clinical oncology. - 2014 .-- V. 32).
Недостатки: трудоемкость, высокая стоимость проведения исследования, потребность совместимого оборудования.Disadvantages: the complexity, the high cost of the study, the need for compatible equipment.
Известен способ ДНК-тестирования мутаций в гене DPYD с помощью ПЦР с последующим анализом длины рестрикционных фрагментов, т.н. ПДРФ-анализ (Restriction Fragment Length Polymorphism - RFLP analysis) (Uzunkoy, A. Investigation of IVS14+1G>A polymorphism of DPYD gene in a group of Turkish patients with colorectal cancer / Uzunkoy A., Dilmec F., Ozgonul A. et al. // Anticancer Res. - 2007. - V. 27. - P. 3899-3902).A known method of DNA testing of mutations in the DPYD gene using PCR followed by analysis of the length of restriction fragments, the so-called RFLP analysis (Restriction Fragment Length Polymorphism - RFLP analysis) (Uzunkoy, A. Investigation of IVS14 + 1G> A polymorphism of DPYD gene in a group of Turkish patients with colorectal cancer / Uzunkoy A., Dilmec F., Ozgonul A. et al. // Anticancer Res. - 2007. - V. 27. - P. 3899-3902).
Недостатки: трудоемкость, времязатратность. Disadvantages: labor input, time consuming.
Одним из способов диагностики мутаций в гене DPYD является высокоэффективная жидкостная хроматография (Ezzeldin, H. Denaturing high performance liquid chromatography analysis of the DPYD gene in patients with lethal 5-fluorouracil toxicity / Ezzeldin, H.,Johnson MR, Okamoto, Y. et al. // Clin. Cancer Res. - 2003. - V. 1. - P. 3021-3028).One way to diagnose mutations in the DPYD gene is through high performance liquid chromatography (Ezzeldin, H. Denaturing high performance liquid chromatography analysis of the DPYD gene in patients with lethal 5-fluorouracil toxicity / Ezzeldin, H., Johnson MR, Okamoto, Y. et al . // Clin. Cancer Res. - 2003. - V. 1. - P. 3021-3028).
Недостатки: трудоемкость, высокая стоимость проведения исследования, потребность совместимого оборудования.Disadvantages: the complexity, the high cost of the study, the need for compatible equipment.
Задачей заявляемого изобретения является разработка оптимального способа определения генотипа человека по мутации c.1236G/A в 11 экзоне гена DPYD, ответственного за развитие токсических побочных эффектов при назначении 5-фторурацила и его аналогов. The task of the invention is to develop an optimal method for determining the human genotype by mutation c.1236G / A in exon 11 of the DPYD gene, responsible for the development of toxic side effects when prescribing 5-fluorouracil and its analogues.
Задача решается путем подбора специфичных оригинальных олигонуклеотидyных последовательностей, образующих короткий фрагмент ДНК, который включает фрагмент гена DPYD с искомым вариантом, и оптимизации ПЦР с помощью адаптированного оригинального буфера для Taq-полимеразы. Высокая специфичность заявляемого способа диагностики мутации c.1236G/A достигается за счет оригинального дизайна олигонуклеотидов, позволяющих получить короткий целевой фрагмент гена. The problem is solved by selecting specific original oligonucleotide sequences that form a short DNA fragment that includes the DPYD gene fragment with the desired variant, and optimizing PCR using an adapted original Taq polymerase buffer. High specificity of the proposed method for the diagnosis of c.1236G / A mutation is achieved due to the original design of oligonucleotides, allowing to obtain a short target gene fragment.
Техническим результатом заявляемого изобретения является широкая доступность, высокая чувствительность и специфичность при низкой стоимости исследования. Реакционные смеси включают специфичные оригинальные последовательности олигонуклеотидов, а также адаптированный буфер для Taq-полимеразы, позволяющий повысить чувствительность метода. Изобретение позволяет снизить затраты на молекулярно-генетическое исследование, повысить его доступность и точность тестирования за счет применения оригинальных олигонуклеотидных последовательностей и оптимизированных реакционных смесей.The technical result of the claimed invention is wide availability, high sensitivity and specificity at a low research cost. The reaction mixtures include specific original sequences of oligonucleotides, as well as an adapted buffer for Taq polymerase, which allows to increase the sensitivity of the method. The invention allows to reduce the cost of molecular genetic research, to increase its availability and testing accuracy through the use of original oligonucleotide sequences and optimized reaction mixtures.
Технический результат достигается путем подбора специфичных оригинальных последовательностей олигонуклеотидов, оптимизации условий проведения ПЦР с использованием оригинального состава буфера для Taq-полимеразы, отработки технических условий для проведения HRM-анализа.The technical result is achieved by selecting specific original sequences of oligonucleotides, optimizing the conditions for PCR using the original composition of the Taq polymerase buffer, and working out the technical conditions for HRM analysis.
Последовательность специфичных оригинальных олигонуклеотидов приведена в Перечне последовательности олигонуклеотидовThe sequence of specific original oligonucleotides is given in the List of Oligonucleotide Sequences
Копия перечня последовательностей, представленная на машиночитаемом носителе, идентична перечню последовательностей в печатной форме. A copy of the list of sequences presented on a computer-readable medium is identical to the list of sequences in printed form.
Используются последовательности олигонуклеотидов: The sequences of oligonucleotides are used:
SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 2.SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 2.
Подбор последовательностей олигонуклеотидов включает: дизайн олинуклеотидов, строго комплементарных целевой последовательности ДНК. Длина образуемого фрагмента ДНК составляет 91 пара нуклеотидов. Selection of oligonucleotide sequences includes: design of olinucleotides that are strictly complementary to the target DNA sequence. The length of the formed DNA fragment is 91 pairs of nucleotides.
Состав буфера для Taq-полимеразы: Трис-HCl 67 mM, (NH4)2SO4 166 mM, tween-20 0,1%, глицерин 1%, рН 8,7; The composition of the Taq polymerase buffer: Tris-HCl 67 mM, (NH 4 ) 2 SO 4 166 mM, tween-20 0.1%,
- Режим проведения ПЦР:- PCR mode:
1 этап: денатурация при t=95° С в течение 5 минStage 1: denaturation at t = 95 ° C for 5 min
2 этап: 50 циклов ПЦРStage 2: 50 cycles of PCR
- денатурация при t=95° С в течение 15 сек - denaturation at t = 95 ° C for 15 sec
- отжиг олигонуклеотидов при t=58° С в течение 15 сек - annealing of oligonucleotides at t = 58 ° C for 15 sec
- элонгация при t=72° С в течение 40 сек - elongation at t = 72 ° C for 40 sec
3 этап: элонгация при t=72° в течение 2 мин.Stage 3: elongation at t = 72 ° for 2 min.
4 этап: плавление продуктов ПЦР при t=72° - 95° CStage 4: melting of PCR products at t = 72 ° - 95 ° C
5 этап: охлаждение и хранение при t=95° - 12° C.Stage 5: cooling and storage at t = 95 ° - 12 ° C.
Детекция флуоресцентного сигнала осуществляется как во время отжига олигонуклеотидов на каждом цикле ПЦР, так и при плавлении продуктов ПЦР с частотой 45 на 1 0C.Detection of a fluorescent signal is carried out both during annealing of oligonucleotides on each PCR cycle, and during melting of PCR products with a frequency of 45 to 10 ° C.
Изобретение иллюстрируется чертежом, на котором представлено графическое изображение образцов ДНК с различными генотипами по мутации c.1236G>A.The invention is illustrated in the drawing, which shows a graphical image of DNA samples with different genotypes for mutations c.1236G> A.
Изобретение иллюстрируется примерами 1 и 2. The invention is illustrated by examples 1 and 2.
Пример 1. Example 1
Ф.И.О.: Пациент М.Name, Patient M.
Возраст: 1964 г.р. Age: 1964
Диагноз: Cr. сигмовидной кишки.Diagnosis: Cr. sigmoid colon.
Выполнено молекулярно-генетическое исследование по заявляемому способу - анализ последовательности кодирующей части гена дигидропиримидиндегидрогеназы (DPYD) на предмет наличия герминальной мутации c.1236G>A (p.Е412Е, rs556038477), ассоциированной с повышенной токсичностью при назначении 5-фторурацила и капецитабина («Кселода») в процессе ПХТ.A molecular genetic study according to the claimed method was performed — sequence analysis of the coding part of the dihydropyrimidine dehydrogenase gene ( DPYD ) for the presence of the germline mutation c.1236G> A (p.E412E, rs556038477) associated with increased toxicity with 5-fluorouracil and capecitabine (K) ») In the process of PCT.
Результат: При исследовании ДНК, выделенной из лимфоцитов периферической крови, герминальных мутаций в 11 экзоне гена DPYD не выявлено. Result: In the study of DNA isolated from peripheral blood lymphocytes, germline mutations in exon 11 of the DPYD gene were not detected.
Пример 2. Example 2
Ф.И.О.: Пациент К.Name, Patient K.
Возраст: 1957 г.р. Age: b. 1957
Диагноз: Cr. желудка. Diagnosis: Cr. the stomach.
Выполнено молекулярно-генетическое исследование по заявляемому способу - анализ последовательности кодирующей части гена дигидропиримидиндегидрогеназы (DPYD) на предмет наличия герминальной мутации c.1236G>A (p.Е412Е, rs556038477), ассоциированной с повышенной токсичностью при назначении 5-фторурацила и капецитабина («Кселода») в процессе ПХТ.A molecular genetic study according to the claimed method was performed — sequence analysis of the coding part of the dihydropyrimidine dehydrogenase gene ( DPYD ) for the presence of the germline mutation c.1236G> A (p.E412E, rs556038477) associated with increased toxicity with 5-fluorouracil and capecitabine (K) ») In the process of PCT.
Результат: При исследовании ДНК, выделенной из лимфоцитов периферической крови, в 11 экзоне гена DPYD выявлена герминальная мутация c.1236G>A (p.Е412Е, rs556038477) в гетерозиготном состоянии. Result: In the study of DNA isolated from peripheral blood lymphocytes, in the exon 11 of the DPYD gene, a germline mutation c.1236G> A (p.E412E, rs556038477) in a heterozygous state was detected.
Выявленная герминальная мутация c.1236G>A в гене DPYD зарегистрирована в международных базах данных dbSNP и Ensembl.genome как высоко-патогенный клинически значимый вариант, ассоциированный с высоким риском развития токсичности при использовании 5-фторурацила и капецитабина («Кселода»). The identified germline mutation c.1236G> A in the DPYD gene is registered in the international dbSNP and Ensembl.genome databases as a highly pathogenic clinically significant variant associated with a high risk of toxicity when using 5-fluorouracil and capecitabine (Xeloda).
Claims (1)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2019108708A RU2709645C1 (en) | 2019-03-26 | 2019-03-26 | METHOD FOR HUMAN GENOTYPE DETERMINATION BY MUTATION c.1236GA IN 11 EXON OF DPYD GENE |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2019108708A RU2709645C1 (en) | 2019-03-26 | 2019-03-26 | METHOD FOR HUMAN GENOTYPE DETERMINATION BY MUTATION c.1236GA IN 11 EXON OF DPYD GENE |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2709645C1 true RU2709645C1 (en) | 2019-12-19 |
Family
ID=69007081
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2019108708A RU2709645C1 (en) | 2019-03-26 | 2019-03-26 | METHOD FOR HUMAN GENOTYPE DETERMINATION BY MUTATION c.1236GA IN 11 EXON OF DPYD GENE |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2709645C1 (en) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2807808C1 (en) * | 2023-03-31 | 2023-11-21 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Курский государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Set of primers and probes for genotyping of rs12566098 (cg) polymorphic locus of serbp1 gene in human using real-time pcr |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2552483C1 (en) * | 2014-08-11 | 2015-06-10 | Федеральное Государственное Бюджетное Учреждение Науки Институт Молекулярной Биологии Им. В.А. Энгельгардта Российской Академии Наук (Имб Ран) | Method of analysis of somatic mutations in genes egfr, kras and braf using lna-blocking multiplex pcr and subsequent hybridisation with oligonucleotide biological microchip (biochip) |
-
2019
- 2019-03-26 RU RU2019108708A patent/RU2709645C1/en active
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2552483C1 (en) * | 2014-08-11 | 2015-06-10 | Федеральное Государственное Бюджетное Учреждение Науки Институт Молекулярной Биологии Им. В.А. Энгельгардта Российской Академии Наук (Имб Ран) | Method of analysis of somatic mutations in genes egfr, kras and braf using lna-blocking multiplex pcr and subsequent hybridisation with oligonucleotide biological microchip (biochip) |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| KUILENBURG, A. et al., Analysis of severely affected patients with dihydropyrimidine dehydrogenase defeciency reveals large intragenic rearrangements of DPYD and a de novo interstitial deletion del(1)(p13.3p21.3) / Kuilenburg A., Meijer J., Mul A. et al. // Hum.Genet. - 2009. - V. 125. - P. 589-590 * |
| UZUNKOY A., tt al., Investigation of IVS14+1G>A Polymorphism of DPYD Gene in a;Group of Turkish patients with colorectal cancer, Anticancer Res., v.27, p.3899-3902. * |
| UZUNKOY A., tt al., Investigation of IVS14+1G>A Polymorphism of DPYD Gene in a;Group of Turkish patients with colorectal cancer, Anticancer Res., v.27, p.3899-3902. KUILENBURG, A. et al., Analysis of severely affected patients with dihydropyrimidine dehydrogenase defeciency reveals large intragenic rearrangements of DPYD and a de novo interstitial deletion del(1)(p13.3p21.3) / Kuilenburg A., Meijer J., Mul A. et al. // Hum.Genet. - 2009. - V. 125. - P. 589-590. * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2807808C1 (en) * | 2023-03-31 | 2023-11-21 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Курский государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Set of primers and probes for genotyping of rs12566098 (cg) polymorphic locus of serbp1 gene in human using real-time pcr |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Gajecka et al. | Localization of a gene for keratoconus to a 5.6-Mb interval on 13q32 | |
| CN102203296B (en) | Genetic polymorphisms in age-related macular degeneration | |
| US20230074781A1 (en) | Methods and composition for the prediction of the activity of enzastaurin | |
| RS53383B (en) | METHOD FOR IDENTIFICATION OF ALCHAIMER DISEASE RISK FACTORS | |
| Saarela et al. | PRKCA and multiple sclerosis: association in two independent populations | |
| RU2709645C1 (en) | METHOD FOR HUMAN GENOTYPE DETERMINATION BY MUTATION c.1236GA IN 11 EXON OF DPYD GENE | |
| RU2701375C1 (en) | METHOD FOR HUMAN GENOTYPE DETERMINATION BY MUTATION c.496A>G IN 6 EXON OF DPYD GENE | |
| RU2709710C1 (en) | Method for human genotype determination by mutation ivs14+1ga b 14 intron of dpyd gene | |
| RU2730880C1 (en) | Method for determining human genotype by mutation c_2194g>a in 18 exon of dpyd gene | |
| Lee et al. | Interaction of polymorphisms in the interleukin 1B-31 and general transcription factor 2A1 genes on the susceptibility to gastric cancer | |
| RU2729360C9 (en) | Method of analyzing herminal mutations in brca1, brca2, atm and palb2 genes using multiplex pcr and subsequent hybridisation with an oligonucleotide biological microchip (biochip) | |
| Isman et al. | PAX9 polymorphisms and susceptibility with sporadic tooth agenesis in Turkish populations: a case-control study | |
| JPWO2013008709A1 (en) | Method and kit for diagnosing glaucoma in dogs | |
| US20060166219A1 (en) | NTRK1 genetic markers associated with progression of Alzheimer's disease | |
| RU2703805C1 (en) | Method for human genotype determination by polymorphism ugt1a1*6/*28 in promoter region of ugt1a1 gene | |
| WO2005072152A2 (en) | Apoc1 genetic markers associated with age of onset of alzheimer's disease | |
| CA2542629A1 (en) | Ntrk1 genetic markers associated with age of onset of alzheimer's disease | |
| US10550432B2 (en) | Method for predicting risk of ankylosing spondylitis using DNA copy number variants | |
| WO2003057920A1 (en) | Drug response marker in beta-1 adrenergic receptor gene | |
| KR101141546B1 (en) | Polynucleotides derived from ANKRD15, HPD, PSMD9, WDR66, GPC6, PAX9, LRRC28, TNS4, AXL, and HNRPUL1 genes comprising single nucleotide polymorphisms, microarrays and diagnostic kits comprising the same, and analytic methods using the same | |
| US20050250122A1 (en) | APOA4 genetic markers associated with progression of Alzheimer's disease | |
| KR20100136724A (en) | Survival-associated JRCA1 Gene Haplotype Markers and Their Uses in Non-Small Cell Lung Cancer Patients | |
| US7405043B2 (en) | Responsiveness to therapy for liver disorders | |
| Allikmets et al. | From gene chips to | |
| KR20100107866A (en) | Polymorphic markers of vcan for predicting susceptibility to gastric cancer and the prediction method using the same |