RU2700254C1 - Test system for detecting dna of rhinotracheitis virus (bovine herpes virus 1, bohv-1) in cattle - Google Patents
Test system for detecting dna of rhinotracheitis virus (bovine herpes virus 1, bohv-1) in cattle Download PDFInfo
- Publication number
- RU2700254C1 RU2700254C1 RU2018134801A RU2018134801A RU2700254C1 RU 2700254 C1 RU2700254 C1 RU 2700254C1 RU 2018134801 A RU2018134801 A RU 2018134801A RU 2018134801 A RU2018134801 A RU 2018134801A RU 2700254 C1 RU2700254 C1 RU 2700254C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- virus
- dna
- bohv
- control sample
- rhinotracheitis virus
- Prior art date
Links
- 241000701083 Bovine alphaherpesvirus 1 Species 0.000 title claims abstract description 36
- 241000700605 Viruses Species 0.000 title claims abstract description 30
- 206010051497 Rhinotracheitis Diseases 0.000 title claims abstract description 28
- 238000012360 testing method Methods 0.000 title claims abstract description 24
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 title claims abstract description 15
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims abstract description 33
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims abstract description 30
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 18
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 16
- 239000013641 positive control Substances 0.000 claims abstract description 12
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims abstract description 10
- 239000013068 control sample Substances 0.000 claims abstract description 10
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims abstract description 9
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 claims abstract description 8
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims abstract description 8
- 101710136739 Teichoic acid poly(glycerol phosphate) polymerase Proteins 0.000 claims abstract description 4
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 4
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 claims abstract description 4
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 claims abstract description 4
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 claims abstract description 4
- 125000002264 triphosphate group Chemical class [H]OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])O* 0.000 claims abstract description 4
- 239000013615 primer Substances 0.000 claims description 14
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 7
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 claims description 5
- 238000003556 assay Methods 0.000 claims 1
- 241000701533 Escherichia virus T4 Species 0.000 abstract description 8
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 abstract description 6
- 239000000975 dye Substances 0.000 abstract description 4
- 231100000676 disease causative agent Toxicity 0.000 abstract description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 23
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 13
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 7
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 7
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 6
- 238000001917 fluorescence detection Methods 0.000 description 6
- 239000000463 material Substances 0.000 description 6
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 6
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 6
- 238000000034 method Methods 0.000 description 5
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 5
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 5
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 4
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 4
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 3
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 3
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 3
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 description 2
- 102000006601 Thymidine Kinase Human genes 0.000 description 2
- 108020004440 Thymidine kinase Proteins 0.000 description 2
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 2
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 2
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 2
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 2
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 210000002850 nasal mucosa Anatomy 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 2
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 210000001215 vagina Anatomy 0.000 description 2
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 1
- 101001017362 Enterobacteria phage T4 Holin Proteins 0.000 description 1
- 241001329308 Enterobacteria phage T4T Species 0.000 description 1
- 238000010222 PCR analysis Methods 0.000 description 1
- 108700005078 Synthetic Genes Proteins 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010835 comparative analysis Methods 0.000 description 1
- 230000001351 cycling effect Effects 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000003771 laboratory diagnosis Methods 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 1
- 239000004570 mortar (masonry) Substances 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 229910052573 porcelain Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000010791 quenching Methods 0.000 description 1
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000012932 thermodynamic analysis Methods 0.000 description 1
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 description 1
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к ветеринарной микробиологии, в частности к лабораторной диагностике возбудителей инфекционных заболеваний а именно к средствам диагностики инфекции у животных.The invention relates to veterinary microbiology, in particular for laboratory diagnosis of infectious pathogens, namely, means for diagnosing infection in animals.
Известен набор для выявления ДНК вируса ринотрахеита у крупного рогатого скота при помощи одноступенчатой ПЦР с использованием пары праймеров 5'-AGA ССС С AG TTG TGA TGA ATG С-3' и 5'-АС А CGT CCA GCA CGA АСА СС-3', комплиментарных высоко консервативной области генома вируса ринотрахеита у крупного рогатого скота гена тимидинкиназы (tk) (Kibenge F.S. et al, "Amplification of strains of bovine herpesvirus 1 by use polymerase chain reaction with primers in the thymidine kinase region", American Journal of Veterinary Research, 1994, Sep; 55(9):1206-1212).A known kit for detecting rhinotracheitis virus DNA in cattle using single-stage PCR using a pair of primers 5'-AGA CCC C AG TTG TGA TGA ATG C-3 'and 5'-AC A CGT CCA GCA CGA ACA CC-3', complementary to the highly conserved region of the rhinotracheitis virus genome in cattle, the thymidine kinase (tk) gene (Kibenge FS et al, "Amplification of strains of
Также известен способ выявления ДНК вируса ринотрахеита крупного рогатого скота с помощью специфических олигонуклеотидных праймеров в полимеразной цепной реакции (ПЦР) включающий пластиковые флаконы и пробирки, термостабильный фермент Tag-полимеразу, буфер для постановки реакции, смесь четырех дезоксинуклеотидтрифосфатов, внутренний контрольный образец, положительный контроль - рекомбинантную плазмиду, содержащую фрагмент гена вируса ринотрахеита, синтетические олигонуклеотидные праймеры и зонды меченные красителями (патент RU №2259398, кл. C12N 15/38, C12Q 1/68, 2005 г., - прототип).Also known is a method for detecting rhinotracheitis virus of cattle using specific oligonucleotide primers in the polymerase chain reaction (PCR) including plastic bottles and tubes, thermostable Tag polymerase enzyme, a reaction buffer, a mixture of four deoxynucleotide triphosphates, an internal control sample, a positive control a recombinant plasmid containing a fragment of the rhinotracheitis virus gene, synthetic oligonucleotide primers and probes labeled with dyes (patent RU No. 222593 98, CL C12N 15/38,
Однако в известном тест-системе последовательность, непосредственно читается по электрофореграмме. Длина фрагмента, который может быть расшифрован этим методом, ограничивается разрешающей способностью метода гель-электрофореза, кроме того - ограниченные функциональные возможности.However, in the well-known test system, the sequence is directly read by electrophoregram. The length of the fragment that can be decoded by this method is limited by the resolution of the gel electrophoresis method, in addition - limited functionality.
Общим недостатком известных технических решений является отсутствие возможности получения достоверной диагностики выявления генома вируса ринотрахеита крупного рогатого скота.A common disadvantage of the known technical solutions is the lack of the possibility of obtaining reliable diagnostics for identifying the genome of the rhinotracheitis virus in cattle.
Техническим результатом является получение достоверной диагностики возбудителя ДНК вируса ринотрахеита крупного рогатого скота. Технический результат достигается тем, что в тест-системе для выявления ДНК вируса ринотрахеита (bovine herpes virus 1, BoHV-1) у крупного рогатого скота, включающем пластиковые флаконы и пробирки, термостабильный фермент Tag-полимеразу, буфер для постановки реакции, смесь четырех дезоксинуклеотидтрифосфатов, внутренний контрольный образец, положительный контрольный образец, рекомбинантную плазмиду, содержащую фрагмент гена вируса ринотрахеита, синтетические олигонуклеотидные праймеры и зонды меченные красителями, согласно изобретению для внутреннего контрольного образца используют суспензию бактериофага Т4 с концентрацией 5×103 копий нуклеотидных последовательностей на 1 мкл, а для положительного контрольного образца используют смесь рекомбинантных плазмидных ДНК, содержащих фрагмент генома ДНК вируса ринотрахеита (bovine herpes virus 1, BoHV-1) и фрагмент генома бактериофага Т4 взятых в соотношении 1:1, со следующими нуклеотидными последовательностями:The technical result is to obtain a reliable diagnosis of the pathogen DNA virus of rhinotracheitis in cattle. The technical result is achieved in that in a test system for the detection of rhinotracheitis virus DNA (
Новизна заявляемого технического решения заключается в том, что для получения достоверной диагностики возбудителя ДНК вируса ринотрахеита (bovine herpes virus 1, BoHV-1) проводят реакцию в одной ПЦР-пробирке (one-tube) с использованием специфичных для участка генома вируса ринотрахеита (bovine herpes virus 1, BoHV-1) олигонуклеотидных праймеров флуоресцентно-меченного зонда и разных видов контроля для которых используют различные формы материала бактериофага Т4: суспензия и фрагмент генома со специфическими к нему праймерами и зондом. Такая постановка ПЦР в реальном времени сокращает и упрощает процедуру анализа, снижает риск контаминации. Кроме того, флуоресцентная детекция продуктов амплификации осуществляется с использованием принципа выщепления флуоресцентной метки на 5' конце олигонуклеотидного зонда.The novelty of the claimed technical solution lies in the fact that to obtain a reliable diagnosis of the causative agent of the DNA pathogen of rhinotracheitis virus (
Признаки, отличающие заявляемое техническое решение от прототипа, направлены на достижение технического результата и не выявлены при изучении данной и смежной областей науки и техники и, следовательно, соответствуют критерию «изобретательский уровень».The features that distinguish the claimed technical solution from the prototype are aimed at achieving a technical result and have not been identified in the study of this and related fields of science and technology and, therefore, meet the criterion of "inventive step".
Заявляемый тетс-систему рекомендовано использовать в ветеринарной вирусологии, так как относится к средствам диагностики вируса ринотрахеита (bovine herpes virus 1, BoHV-1), что соответствует критерию «промышленная применимость».The inventive Tets system is recommended for use in veterinary virology, as it relates to diagnostic tools for the rhinotracheitis virus (
Сущность изобретения поясняется чертежами, где представлены скриншоты графиков, на фиг. 1 - представлен канал FAM/Green сигнал внутреннего контроля, на фиг. 2 - канал JOE(HEX)/Yellow накопление флуоресцентного сигнала для специфического сигнала ДНК вируса ринотрахеита (bovine herpes virus 1, BoHV-1), фиг. 3 - количественные данные таблица количественных данных для Cycling A.Yellow (bovine herpes virus 1, BoHV-1) и A. Green (BKO).The invention is illustrated by drawings, which show screenshots of graphs, in FIG. 1 shows the FAM / Green channel of the internal control signal, FIG. 2 - channel JOE (HEX) / Yellow accumulation of a fluorescent signal for a specific DNA signal of rhinotracheitis virus (
Тест-система для выявления ДНК вируса ринотрахеита (bovine herpes virus 1, BoHV-1) у крупного рогатого скота используется следующим образом Для постановки одноэтапной полимеразной цепной реакции используют тест-систему, в котором в качестве внутреннего положительного контроля, используют суспензию бактериофага Т4 с концентрацией 5×103 копий нуклеотидных последовательностей на 1 мкл и в качестве положительного контрольного образца используют смесь рекомбинантных плазмидных ДНК, содержащих фрагмент генома ДНК вируса ринотрахеита (bovine herpes virus 1, BoHV-1) и фрагмент генома бактериофага Т4 взятых в соотношении 1:1, со следующими нуклеотидными последовательностями:The test system for the detection of rhinotracheitis virus DNA (
Использование для разных видов контроля различные формы материала бактериофага Т4: суспензии и фрагмента генома со специфическими к нему праймерами и зондом обусловлено тем, что это позволяет контролировать корректное прохождение реакции в каждой пробирки, а также контролируется этап выделения ДНК из образцов.The use of different forms of T4 bacteriophage material for different types of control: a suspension and a fragment of the genome with specific primers and a probe, is due to the fact that this allows you to control the correct course of the reaction in each tube, and also controls the stage of DNA extraction from samples.
Выбор последовательности и расчет первичной структуры олигонуклеотидных праймеров и зондов.Sequence selection and calculation of the primary structure of oligonucleotide primers and probes.
Праймеры, специфичные для ДНК Infectious bovine rhinotracheites virus были отобраны на основе консервативного участка гена " glycoprotein " (Herpesvirus type 1 glycoprotein gene, complete cds. M23257) и спроектированы с использованием Primer Express Software v3.0 (Applied Biosystems). С помощью BLAST праймеры были проверены на отсутствие гомологии с последовательностями других вирусов и генома человека. Термодинамический анализ выбранных праймеров был выполнен с помощью Vector NTI. Расчетная длина специфического фрагмента составила 120 пар нуклеотидов.DNA-specific primers of Infectious bovine rhinotracheites virus were selected based on the conserved region of the glycoprotein gene (
Для детекции продуктов амплификации был подобран олигонуклеотидный флуоресцентно-меченный зонд IRT-P (комплементарный участку нуклеотидной последовательности, ограниченной позициями отжига праймеров IRT-F и IRT-R). Зонд был помечен красителем R6G. Для гашения самопроизвольной флуоресценции на 3'-конце олигонуклеотидного зонда прикреплен гаситель BHQ-1. Основные свойства рассчитанных олигонуклеотидов, определившие возможность их использования в ПЦР были описаны с помощью программы "Oligo 6.0".To detect amplification products, an IRT-P oligonucleotide fluorescently-labeled probe (complementary to the nucleotide sequence region limited by the annealing positions of the IRT-F and IRT-R primers) was selected. The probe was labeled with dye R6G. To quench spontaneous fluorescence, a BHQ-1 quencher is attached at the 3'-end of the oligonucleotide probe. The main properties of the calculated oligonucleotides, which determined the possibility of their use in PCR, were described using the Oligo 6.0 program.
В качестве внутреннего контроля использовался бактериофаг Т4, имеющий геномную ДНК порядка 169-170 тысяч пар нуклеотидов (Enterobacteria phage Т4Т, complete genome GenBank: HM137666.1). В результате анализа был выбран участок между 400 и 500 нуклеотидами, содержащий уникальные нуклеотидные последовательности, рассчитаны первичные структуры олигонуклеотидных праймеров, фланкирующих выбранный участок генома. Праймеры были спроектированы с использованием Primer Express Software v3.0 (Applied Biosystems) и исследованы с использованием BLAST, чтобы подтвердить их специфичность.Bacteriophage T4 having genomic DNA of the order of 169-170 thousand nucleotide pairs (Enterobacteria phage T4T, complete genome GenBank: HM137666.1) was used as an internal control. As a result of the analysis, a region between 400 and 500 nucleotides containing unique nucleotide sequences was selected; primary structures of oligonucleotide primers flanking the selected genome region were calculated. Primers were designed using Primer Express Software v3.0 (Applied Biosystems) and tested using BLAST to confirm their specificity.
Для детекции продуктов амплификации подобран олигонуклеотидный флуоресцентно-меченный зонд Т4Р, комплементарный участку нуклеотидной последовательности, ограниченной позициями отжига праймеров T4F и T4R. Зонд был помечен красителем Fam. Используя программу "Oligo 6.0" описаны основные свойства рассчитанных олигонуклеотидов, определившие возможность их использования в ПЦР.To detect amplification products, an oligonucleotide fluorescently labeled T4P probe was selected that is complementary to the portion of the nucleotide sequence limited to the annealing positions of the T4F and T4R primers. The probe was labeled with Fam. Using the program "Oligo 6.0" describes the basic properties of the calculated oligonucleotides, which determined the possibility of their use in PCR.
Пример конкретного применения тест-системы для выявления ДНК вируса ринотрахеита (bovine herpes virus 1, BoHV-1) у крупного рогатого скотаAn example of a specific application of a test system for the detection of rhinotracheitis virus DNA (
Для исследования используют следующий биологический материал по выбору:For research using the following biological material of choice:
- Сперму отбирают в объеме не менее 2 мл в стерильные пробирки.- Sperm is taken in a volume of at least 2 ml in sterile tubes.
- Мазки из влагалища берут стерильным зондом с использованием стерильных гинекологических инструментов. Собранный материал помещают в пробирку, содержащую 500 мкл стерильного физиологического раствора.- Smears from the vagina are taken with a sterile probe using sterile gynecological instruments. The collected material is placed in a test tube containing 500 μl of sterile saline.
- Мазки со слизистой носовой полости берут стерильным зондом, помещая собранный материал в пробирку, содержащую 500 мкл стерильного физиологического раствора.- Smears from the nasal mucosa are taken with a sterile probe, placing the collected material in a test tube containing 500 μl of sterile saline.
- Из тканей и органов (селезенка, легкие) вырезают кусочки размером 1×1×1 см и помещают в стерильный контейнер. Лимфоузлы берут целиком Подготовку исследуемого материала осуществляют следующим образом:- From tissues and organs (spleen, lungs), 1 × 1 × 1 cm pieces are cut out and placed in a sterile container. The lymph nodes are taken as a whole. The preparation of the test material is carried out as follows:
Мазки из влагалища и со слизистой носовой полости используют без предварительной подготовки.Smears from the vagina and from the nasal mucosa are used without prior preparation.
Образцы спермы смешивают в соотношении 1:4 с физиологическим раствором. Для экстракции ДНК используют 100 мкл полученной смеси.Sperm samples are mixed in a ratio of 1: 4 with saline. For the extraction of DNA using 100 μl of the resulting mixture.
Пробы тканей и органов гомогенизируют с использованием стерильных фарфоровых ступок и пестиков, затем готовят 10% суспензию на стерильном физиологическом растворе или фосфатном буфере. Суспензию переносят в пробирку объемом 1,5 мл и центрифугируют при 12 тыс об/мин в течение 2 минут. Надосадочную жидкость используют для экстракции ДНК.Samples of tissues and organs are homogenized using sterile porcelain mortars and pestles, then a 10% suspension is prepared in sterile saline or phosphate buffer. The suspension is transferred into a 1.5 ml tube and centrifuged at 12 thousand rpm for 2 minutes. The supernatant is used for DNA extraction.
Далее проводят анализ, состоящий из трех этапов:Next, an analysis consisting of three stages is carried out:
- экстракция НК (на этом этапе дополнительно используют реактивы для экстракции, например набор «ДНК/РНК-С-ФАКТОР»);- NK extraction (at this stage, reagents for extraction are additionally used, for example, the DNA / RNA-C-FACTOR kit);
- проведение ПЦР с флуоресцентной детекцией в режиме реального времени;- real-time PCR with fluorescence detection;
- учет результатов анализа.- accounting for the results of the analysis.
Для проведения анализа используют тест-систему, представляющий собой набор в соответствии с инструкцией по применению набора реагентов «ПЦР-РИНОТРАХЕИТ-КРС-ФАКТОР» для выявления ДНК вируса ринотрахеита (bovine herpes virus 1, BoHV-1) в биологическом материале методом полимеразной цепной реакции с флуоресцентной детекцией в режиме реального времени (ПЦР РВ), ТУ 21.10.60-125-51062356-2016, для диагностики in vitro, (http://www.vetfaktor.ru/.).For analysis, a test system is used, which is a kit in accordance with the instructions for use of the PCR-RINOTRAKHEIT-KRS-FACTOR reagent kit for the detection of rhinotracheitis virus DNA (
Набор состоит из комплекта реагентов для проведения мультиплексной ПЦР РВ (комплект №1) и комплекта контрольных образцов (комплект №2).The kit consists of a kit of reagents for conducting multiplex RT-PCR (kit No. 1) and a set of control samples (kit No. 2).
Набор выпускается в двух вариантах:The kit is available in two versions:
1) Для анализа 55 образцов (включая контрольные образцы)1) For analysis of 55 samples (including control samples)
2) Для анализа 110 образцов (включая контрольные образцы).2) For analysis of 110 samples (including control samples).
Состав набора приведен в таблицах 1 и 2.The composition of the kit is shown in tables 1 and 2.
1-й этап анализа - экстракция (выделение) нуклеиновых кислот (НК) из исследуемых проб.The 1st stage of the analysis is the extraction (isolation) of nucleic acids (NK) from the studied samples.
Отбирают необходимое количество одноразовых пробирок объемом 1,5 мл, включая отрицательный контроль выделения. Вносят во все пробирки с исследуемыми образцами, включая пробирку для отрицательного контрольного образца (ОКО), по 10 мкл внутреннего контрольного образец (ВКО) BoHV-1. В качестве внутреннего контрольного образец (ВКО) BoHV-1 используют суспензию бактериофага Т4 с концентрацией 5×103 копий нуклеотидных последовательностей на 1 мкл, если концентрация копий нуклеотидных последовательностей отклоняется в большую или меньшую сторону, то наблюдаются повторности сомнительных образцов.The required number of 1.5 ml disposable tubes was selected, including a negative selection control. Pipette 10 μl of the BoHV-1 internal control sample (EQA) into all tubes with test samples, including a test tube for negative control (OKO). As an internal control sample (CTP) of BoHV-1, a suspension of bacteriophage T4 with a concentration of 5 × 10 3 copies of nucleotide sequences per 1 μl is used, if the concentration of copies of nucleotide sequences deviates up or down, then duplicate samples are observed.
Вносят исследуемые пробы в объеме согласно инструкции, к набору для выделения НК, в пробирку отрицательного контроля выделения вместо исследуемой пробы внести ОКО (пробирку обозначить как ВК-).Enter the test samples in volume according to the instructions, to the kit for the selection of NK, in the test tube of the negative control of isolation, instead of the test sample, add the OKO (designate the tube as VK-).
Выделяют ДНК из анализируемых и контрольных образцов согласно протоколу инструкции производителя набора для выделения НК.DNA is isolated from the analyzed and control samples according to the protocol of the manufacturer's instructions for the kit for the selection of NK.
Выделенную ДНК можно хранить в течение одной недели при температуре от 2°C до 8°C или в течение года при температуре не выше минус 16°C.Isolated DNA can be stored for one week at a temperature of 2 ° C to 8 ° C or for a year at a temperature not exceeding minus 16 ° C.
Далее подготавливают образцы к проведению ПЦР.Next, prepare samples for PCR.
Общий объем реакционной смеси - 25 мкл, объем ДНК-пробы - 10 мкл.The total volume of the reaction mixture is 25 μl, the volume of the DNA sample is 10 μl.
Успешное прохождение реакции контролируют использованием положительного контрольного образца (ПКО) BOHV-1, ВКО BOHV-1 и ДНК буфера. В качестве положительного контрольного образца (ПКО) используют смесь рекомбинантных плазмидных ДНК, содержащих фрагмент генома ДНК вируса ринотрахеита (bovine herpes virus 1, BoHV-1) и фрагмент генома бактериофага Т4 взятых в соотношении 1:1, при не соблюдении этого соотношения наблюдаются повторности сомнительных образцов.Successful completion of the reaction is monitored using a positive control sample (PKO) BOHV-1, VKO BOHV-1 and DNA buffer. As a positive control sample (FFP), a mixture of recombinant plasmid DNAs containing a fragment of the rhinotracheitis virus DNA genome (
В отдельной пробирке смешивают компоненты набора из расчета на каждую реакцию ПЦР:The components of the kit are mixed in a separate tube based on each PCR reaction:
5 мкл ПЦР СМЕСЬ BOHV-15 μl PCR MIXTURE BOHV-1
10 мкл смеси ПЦР БУФЕР BOHV-110 μl PCR buffer BUFER BOHV-1
0,5 мкл TAQ POLYMERASE0.5 μl TAQ POLYMERASE
Перемешивают смесь на вортексе и сбрасывают капли кратковременным центрифугированием. Отбирают необходимое количество пробирок для амплификации ДНК исследуемых и контрольных проб. Вносят по 15 мкл приготовленной реакционной смеси.Vortex the mixture and mix the drops by short centrifugation. Select the required number of tubes for amplification of the DNA of the investigated and control samples. Add 15 μl of the prepared reaction mixture.
Используя наконечники с фильтром в подготовленные пробирки вносят:Using tips with a filter in prepared tubes make:
а) в пробирку отрицательного контроля ПЦР (К-) 10 мкл ДНК буфера;a) in a test tube negative control PCR (K-) 10 μl of DNA buffer;
б) в ряд пробирок для исследуемых проб - в каждую внести по 10 мкл ДНК соответствующей пробы, (включая пробу ВК-);b) in a series of test tubes for the studied samples - add 10 μl of the DNA of the corresponding sample to each one (including the VK- sample);
в) в пробирку положительный контроль ПЦР (К+) 10 мкл ПКО BOHV-1c) in vitro positive PCR control (K +) 10 μl PKO BOHV-1
2-й этап анализа - проведение реакции ПЦР РВ с флуоресцентной детекцией с помощью прибора «Rotor-Gene Q».The 2nd stage of the analysis is the PCR reaction of RS with fluorescence detection using the Rotor-Gene Q device.
Параметры температурно-временного режима амплификации на приборе «Rotor-Gene Q» представлены в таблице 3.The parameters of the temperature-time mode of amplification on the device "Rotor-Gene Q" are presented in table 3.
Поместить подготовленные для проведения ПЦР пробирки в ячейки амплификатора. Запрограммировать прибор согласно инструкции производителя.Place prepared tubes for PCR in amplifier cells. Program the device according to the manufacturer's instructions.
После завершения программы амплификации отработанные пробирки утилизируют в соответствии с МУ 1.3. 2569 -09.After completion of the amplification program, the waste tubes are disposed of in accordance with MU 1.3. 2569 -09.
3-й этап - учет результатов анализа, интерпретация результатов анализа.3rd stage - accounting for analysis results, interpretation of analysis results.
Полученные данные - кривые накопления флуоресцентного сигнала анализируются с помощью программного обеспечения используемого прибора для проведения ПЦР в режиме «реального времени» в соответствии с инструкцией производителя к прибору.The data obtained - the fluorescence signal accumulation curves are analyzed using the software of the device used for real-time PCR in accordance with the manufacturer's instructions for the device.
Учет результатов ПЦР-анализа проводится по наличию или отсутствию пересечения кривой флуоресценции с установленной на соответствующем уровне пороговой линией (что соответствует наличию или отсутствию значения порогового цикла «Ct» для исследуемого образца).The results of PCR analysis are taken into account by the presence or absence of the intersection of the fluorescence curve with the threshold line set at the appropriate level (which corresponds to the presence or absence of the threshold cycle value “Ct” for the test sample).
Результат считается достоверным в случае корректного прохождения положительных и отрицательных контролей амплификации и экстракции ДНК в соответствии с таблицей 4, фиг. 1, 2, 3The result is considered reliable if the positive and negative DNA amplification and extraction controls are correctly passed in accordance with Table 4, FIG. 1, 2, 3
Появление любого значения Ct в таблице результатов для отрицательного контроля этапа экстракции ВК- на канале JOE (HEX)/Yellow и для отрицательного контроля этапа ПЦР К- на любом из каналов свидетельствует о наличии контаминации реактивов или образцов. В этом случае результаты анализа по всем пробам считаются недействительными. Требуется повторить анализ всех проб, а также предпринять меры по выявлению и ликвидации источника контаминации.The appearance of any Ct value in the results table for negative control of the VK- extraction stage on the JOE (HEX) / Yellow channel and for negative control of the K- PCR stage on any of the channels indicates the presence of reagent or sample contamination. In this case, the results of the analysis for all samples are considered invalid. It is required to repeat the analysis of all samples, as well as take measures to identify and eliminate the source of contamination.
Образцы, для которых по каналу FAM/Green значение Ct отсутствует или превышает 35 цикл (и при этом по каналу JOE(HEX)/Yellow отсутствует значение Ct) требуют повторного проведения исследования. Задержка в значениях пороговых циклов для исследуемых образцов на канале FAM/Green (фиг 1, 3) указывает на присутствие ингибиторов в пробе(ах) или на ошибки при экстракции ДНК или при постановке реакции. Требуется провести исследование, начиная с этапа экстракции ДНК.Samples for which the FAM / Green channel has no Ct value or exceeds the 35th cycle (and the Ct value is absent for the JOE (HEX) / Yellow channel) require repeated testing. The delay in the threshold cycle values for the studied samples on the FAM / Green channel (Figs. 1, 3) indicates the presence of inhibitors in the sample (s) or errors in DNA extraction or in the formulation of the reaction. Research is required starting from the DNA extraction step.
Образец считается положительным (ДНК вируса ринотрахеита КРС присутствует) если наблюдается экспоненциальный рост сигнала на канале JOE (HEX)/Yellow, при этом значения Ct контрольных образцов находятся в пределах нормы (табл. 4, фиг. 2, 3). Если для исследуемого образца по каналу JOE (HEX)/Yellow значение Ct определяется позднее 37 цикла при корректном прохождении положительных и отрицательных контролей - он считается спорным и исследуется повторно с этапа выделения НК. Если при повторной постановке наблюдается схожий результат (Ct на канале JOE (HEX)/Yellow более 37), требуется повторное взятие материала от того же животного для проведения ПЦР-исследования и (или) использование альтернативных методов диагностики.The sample is considered positive (cattle rhinotracheitis virus DNA is present) if an exponential signal growth is observed on the JOE (HEX) / Yellow channel, while the Ct values are within normal limits (Table 4, Figs. 2, 3). If the Ct value for the test sample through the JOE (HEX) / Yellow channel is determined after the 37th cycle with the correct passage of the positive and negative controls, it is considered controversial and re-examined from the stage of NC extraction. If during re-staging a similar result is observed (Ct on the JOE (HEX) / Yellow channel more than 37), re-sampling of the material from the same animal is required for PCR studies and / or the use of alternative diagnostic methods.
Для доказательства эффективности использования тест-системы для проведения ПЦР с флуоресцентной детекцией в режиме реального времени проводился сравнительный анализ чувствительности заявляемого технического решения с прототипом, в котором использовался метод ПЦР с электрофоретической детекцией. Оказалось, чувствительность ПЦР с флуоресцентной детекцией при выявлении генома ДНК вируса ринотрахеита КРС на 3,0-3,3% выше, чем ПЦР с электрофоретической детекцией.To prove the effectiveness of using the test system for real-time PCR with fluorescence detection, a comparative analysis of the sensitivity of the claimed technical solution with the prototype was carried out, in which the PCR method with electrophoretic detection was used. It turned out that the sensitivity of PCR with fluorescence detection when detecting the genome of the Rhinotracheitis virus DNA of cattle is 3.0-3.3% higher than PCR with electrophoretic detection.
Claims (7)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2018134801A RU2700254C1 (en) | 2018-10-01 | 2018-10-01 | Test system for detecting dna of rhinotracheitis virus (bovine herpes virus 1, bohv-1) in cattle |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2018134801A RU2700254C1 (en) | 2018-10-01 | 2018-10-01 | Test system for detecting dna of rhinotracheitis virus (bovine herpes virus 1, bohv-1) in cattle |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2700254C1 true RU2700254C1 (en) | 2019-09-13 |
Family
ID=67989530
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2018134801A RU2700254C1 (en) | 2018-10-01 | 2018-10-01 | Test system for detecting dna of rhinotracheitis virus (bovine herpes virus 1, bohv-1) in cattle |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2700254C1 (en) |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2241751C2 (en) * | 2002-08-26 | 2004-12-10 | Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" | Synthetic oligonucleotide-primers used for detection of dna of cattle infectious rhinotracheitis and pustular vulvovaginitis herpes virus type 1 |
| RU2259398C1 (en) * | 2003-12-18 | 2005-08-27 | Государственное Научное Учреждение Институт экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока СО РАСХН (ГНУ ИЭВСиДВ СО РАСХН) | Synthetic oligonucleotide primers and method for detecting cattle infectious rhinotracheitis virus dna using specific oligonucleotide primers in polymerase chain reaction (pcr) |
-
2018
- 2018-10-01 RU RU2018134801A patent/RU2700254C1/en not_active IP Right Cessation
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2241751C2 (en) * | 2002-08-26 | 2004-12-10 | Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" | Synthetic oligonucleotide-primers used for detection of dna of cattle infectious rhinotracheitis and pustular vulvovaginitis herpes virus type 1 |
| RU2259398C1 (en) * | 2003-12-18 | 2005-08-27 | Государственное Научное Учреждение Институт экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока СО РАСХН (ГНУ ИЭВСиДВ СО РАСХН) | Synthetic oligonucleotide primers and method for detecting cattle infectious rhinotracheitis virus dna using specific oligonucleotide primers in polymerase chain reaction (pcr) |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RU2680094C1 (en) | Test system for detection of dna of leptospirosis causative agent (leptospira speciales) in agricultural animals | |
| RU2700480C1 (en) | Test system for determining species affiliation of tissues of chickens and pigs in food raw materials, fodder and food products | |
| RU2681473C1 (en) | Test system for detection of the virus genome of parainfluenza 3 types at cattle with a multiplex polymerase chain reaction with fluorescent detection in real time mode | |
| RU2703394C1 (en) | Method for detecting and genotyping rna of porcine reproductive-respiratory syndrome virus | |
| RU2694558C1 (en) | Method for genome detection of coronavirus infection causative agent in cattle | |
| RU2703401C1 (en) | Test system for detecting and genotyping rna of swine reproductive-respiratory syndrome virus | |
| RU2700254C1 (en) | Test system for detecting dna of rhinotracheitis virus (bovine herpes virus 1, bohv-1) in cattle | |
| RU2726242C1 (en) | Test system for detecting dna of lumpy skin disease virus (lsdv) in biological material of animals using a polymerase chain reaction in real time | |
| RU2703400C1 (en) | Method for detecting a genome of a brucella infection agent (brucella speciales) in farm animals | |
| RU2700449C1 (en) | Method for detecting dna of rhinotracheitis virus (bovine herpes virus 1, bohv-1) in cattle | |
| CN116814857A (en) | Cat parvovirus and kit thereof and fluorescent recombinase polymerase amplification method | |
| RU2689718C1 (en) | Method for detecting genome of rotavirus infection agent in farm animals | |
| RU2698662C1 (en) | Test system for detecting rna of agent of arteritis virus in horses | |
| RU2700450C1 (en) | Test system for detecting provirus dna of bovine leukosis virus (blv) | |
| RU2700481C1 (en) | Method for detecting rna of an arteritis virus agent in horses | |
| RU2700448C1 (en) | Test system for detecting dna of bird flu ornithosis (chlamydophila psittaci) in birds | |
| RU2694499C1 (en) | Test system for detecting coronavirus infection pathogen genome in cattle by means of multiplex polymerase chain reaction with fluorescent detection in real time | |
| RU2700479C1 (en) | Method for determining species identity of tissues of chickens and pigs in food raw materials, fodder and food products | |
| RU2794654C1 (en) | Method for detection of bovine leukosis virus (blv) provirus dna in food by real-time polymerase chain reaction | |
| RU2700247C1 (en) | Test system for detecting salmonella (salmonella spp.) dna in animal biological material, food products and animal and vegetable fodders | |
| RU2814556C1 (en) | Test system for detecting dna of causative agent of moraxellosis kpc (moraxella bovis) in biological material of animals and feed using polymerase chain reaction in real time | |
| RU2700255C1 (en) | Test system for detecting the brucella infection agent (brucella spp) genome in farm animals | |
| RU2694719C1 (en) | Test system for detecting rna of schmallenberg disease virus in farm animals | |
| RU2700477C1 (en) | Test system for detecting the genome of the causative agent of bordetella bronchiseptica dna in farm livestock | |
| RU2814548C1 (en) | Test system for detecting dna of causative agent of mannheimiosis (mannheimia haemolytica) in biological material of animals and fodders using real-time polymerase chain reaction |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20201002 |