RU2700481C1 - Method for detecting rna of an arteritis virus agent in horses - Google Patents
Method for detecting rna of an arteritis virus agent in horses Download PDFInfo
- Publication number
- RU2700481C1 RU2700481C1 RU2018134641A RU2018134641A RU2700481C1 RU 2700481 C1 RU2700481 C1 RU 2700481C1 RU 2018134641 A RU2018134641 A RU 2018134641A RU 2018134641 A RU2018134641 A RU 2018134641A RU 2700481 C1 RU2700481 C1 RU 2700481C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- arteritis virus
- rna
- reaction
- genome
- signal
- Prior art date
Links
- 206010003230 arteritis Diseases 0.000 title claims abstract description 23
- 241000700605 Viruses Species 0.000 title claims abstract description 20
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 16
- 241000283086 Equidae Species 0.000 title claims abstract description 15
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims abstract description 24
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 20
- 241000710803 Equine arteritis virus Species 0.000 claims abstract description 19
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 18
- 241000709744 Enterobacterio phage MS2 Species 0.000 claims abstract description 13
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 claims abstract description 12
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 12
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims abstract description 12
- 239000013641 positive control Substances 0.000 claims abstract description 11
- 239000013615 primer Substances 0.000 claims abstract description 11
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims abstract description 10
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims abstract description 10
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims abstract description 10
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims abstract description 9
- 239000012620 biological material Substances 0.000 claims abstract description 8
- 239000013068 control sample Substances 0.000 claims abstract description 7
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 claims abstract description 7
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 claims abstract description 6
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 claims abstract description 6
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 claims abstract description 5
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 claims abstract description 5
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 claims abstract description 5
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims abstract description 5
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 claims abstract description 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims abstract 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 claims abstract 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims description 12
- 231100000676 disease causative agent Toxicity 0.000 claims description 9
- 244000052613 viral pathogen Species 0.000 claims description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 2
- 241000283073 Equus caballus Species 0.000 abstract description 7
- 210000003608 fece Anatomy 0.000 abstract description 7
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 abstract description 6
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 abstract description 6
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 abstract description 5
- 210000001508 eye Anatomy 0.000 abstract description 4
- 238000011897 real-time detection Methods 0.000 abstract description 4
- 210000001835 viscera Anatomy 0.000 abstract description 4
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 abstract description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 abstract description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 abstract description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 abstract description 3
- 210000001331 nose Anatomy 0.000 abstract description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 abstract 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 11
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 9
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 6
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 6
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 6
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 5
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 5
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 5
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 4
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 4
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 3
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 3
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 description 3
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 description 2
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 2
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 2
- 229940127219 anticoagulant drug Drugs 0.000 description 2
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 210000000795 conjunctiva Anatomy 0.000 description 2
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 2
- 238000001917 fluorescence detection Methods 0.000 description 2
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- 210000003300 oropharynx Anatomy 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 2
- 210000000582 semen Anatomy 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 101000621943 Acholeplasma phage L2 Probable integrase/recombinase Proteins 0.000 description 1
- 101000618348 Allochromatium vinosum (strain ATCC 17899 / DSM 180 / NBRC 103801 / NCIMB 10441 / D) Uncharacterized protein Alvin_0065 Proteins 0.000 description 1
- 241001292006 Arteriviridae Species 0.000 description 1
- 101000781117 Autographa californica nuclear polyhedrosis virus Uncharacterized 12.4 kDa protein in CTL-LEF2 intergenic region Proteins 0.000 description 1
- 101000708323 Azospirillum brasilense Uncharacterized 28.8 kDa protein in nifR3-like 5'region Proteins 0.000 description 1
- 101000770311 Azotobacter chroococcum mcd 1 Uncharacterized 19.8 kDa protein in nifW 5'region Proteins 0.000 description 1
- 101000748761 Bacillus subtilis (strain 168) Uncharacterized MFS-type transporter YcxA Proteins 0.000 description 1
- 101000765620 Bacillus subtilis (strain 168) Uncharacterized protein YlxP Proteins 0.000 description 1
- 101000916134 Bacillus subtilis (strain 168) Uncharacterized protein YqxJ Proteins 0.000 description 1
- 101000754349 Bordetella pertussis (strain Tohama I / ATCC BAA-589 / NCTC 13251) UPF0065 protein BP0148 Proteins 0.000 description 1
- 101000827633 Caldicellulosiruptor sp. (strain Rt8B.4) Uncharacterized 23.9 kDa protein in xynA 3'region Proteins 0.000 description 1
- 101000947628 Claviceps purpurea Uncharacterized 11.8 kDa protein Proteins 0.000 description 1
- 101000686796 Clostridium perfringens Replication protein Proteins 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 101000788129 Escherichia coli Uncharacterized protein in sul1 3'region Proteins 0.000 description 1
- 101000788370 Escherichia phage P2 Uncharacterized 12.9 kDa protein in GpA 3'region Proteins 0.000 description 1
- 241000047479 Escherichia virus MS2 Species 0.000 description 1
- 101100533229 Galleria mellonella SER1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101000787096 Geobacillus stearothermophilus Uncharacterized protein in gldA 3'region Proteins 0.000 description 1
- 101000976889 Haemophilus phage HP1 (strain HP1c1) Uncharacterized 19.2 kDa protein in cox-rep intergenic region Proteins 0.000 description 1
- 101000827627 Klebsiella pneumoniae Putative low molecular weight protein-tyrosine-phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 101710084021 Large envelope protein Proteins 0.000 description 1
- 101001130841 Middle East respiratory syndrome-related coronavirus (isolate United Kingdom/H123990006/2012) Non-structural protein ORF5 Proteins 0.000 description 1
- 101150062176 ORF5 gene Proteins 0.000 description 1
- 239000013614 RNA sample Substances 0.000 description 1
- 101000974028 Rhizobium leguminosarum bv. viciae (strain 3841) Putative cystathionine beta-lyase Proteins 0.000 description 1
- 101000756519 Rhodobacter capsulatus (strain ATCC BAA-309 / NBRC 16581 / SB1003) Uncharacterized protein RCAP_rcc00048 Proteins 0.000 description 1
- 101000948219 Rhodococcus erythropolis Uncharacterized 11.5 kDa protein in thcD 3'region Proteins 0.000 description 1
- 101000936711 Streptococcus gordonii Accessory secretory protein Asp4 Proteins 0.000 description 1
- 101000929863 Streptomyces cinnamonensis Monensin polyketide synthase putative ketoacyl reductase Proteins 0.000 description 1
- 101000788468 Streptomyces coelicolor Uncharacterized protein in mprR 3'region Proteins 0.000 description 1
- 101000845085 Streptomyces violaceoruber Granaticin polyketide synthase putative ketoacyl reductase 1 Proteins 0.000 description 1
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 1
- 101000711771 Thiocystis violacea Uncharacterized 76.5 kDa protein in phbC 3'region Proteins 0.000 description 1
- 101000711318 Vibrio alginolyticus Uncharacterized 11.6 kDa protein in scrR 3'region Proteins 0.000 description 1
- 108020000999 Viral RNA Proteins 0.000 description 1
- 206010000210 abortion Diseases 0.000 description 1
- 231100000176 abortion Toxicity 0.000 description 1
- 210000004712 air sac Anatomy 0.000 description 1
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 210000000234 capsid Anatomy 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001351 cycling effect Effects 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 241001493065 dsRNA viruses Species 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 1
- 238000007403 mPCR Methods 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 239000004570 mortar (masonry) Substances 0.000 description 1
- 210000004400 mucous membrane Anatomy 0.000 description 1
- 201000009240 nasopharyngitis Diseases 0.000 description 1
- 230000017074 necrotic cell death Effects 0.000 description 1
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 230000010494 opalescence Effects 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 210000004798 organs belonging to the digestive system Anatomy 0.000 description 1
- NOOLISFMXDJSKH-UHFFFAOYSA-N p-menthan-3-ol Chemical compound CC(C)C1CCC(C)CC1O NOOLISFMXDJSKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002205 phenol-chloroform extraction Methods 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 229910052573 porcelain Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 238000010791 quenching Methods 0.000 description 1
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 1
- 230000001850 reproductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 description 1
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 210000003437 trachea Anatomy 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 1
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к ветеринарной вирусологии, а именно к средствам диагностики вирусных и инфекционных заболеваний у животных, в частности к методам выявления ДНК возбудителя вируса артериита у лошадей.The invention relates to veterinary virology, and in particular to means for diagnosing viral and infectious diseases in animals, in particular to methods for detecting DNA of the causative agent of the arteritis virus in horses.
Вирусный артериит лошадей (Arteriitis viralis equorum, Equine viral arteritis) - контагиозное заболевание, характеризующееся некрозами стенки кровеносных сосудов, катаральным воспалением органов дыхания и пищеварения у жеребят, абортами у кобыл и нарушением воспроизводительной функции у жеребцов.Horse viral arteritis (Arteriitis viralis equorum, Equine viral arteritis) is a contagious disease characterized by necrosis of the blood vessel wall, catarrh of the respiratory and digestive organs in foals, abortions in mares and impaired reproductive function in stallions.
Известно, что диагноз на вирусный артериит устанавливают на основании эпизоотологических, клинических данных и, в случае гибели животных, патоморфологических исследований. Лабораторные методы диагностики включают выделение вируса в культуре клеток, ретроспективные серологические исследования. Для выделения вируса используют культуры клеток лошади, перевиваемых линии ВНК-21, Веро и др. Идентификацию вируса проводят в реакции нейтрализации со специфической сывороткой. Альтернативными (вспомогательными) методами лабораторных исследований являются РСК, ИФА. Полимеразная цепная реакция для диагностики вирусного артериита лошадей, находится на стадии изучения. http://www.liveanimal.ru/loshadi/veterinariya/zaraznye-zabolevaniya/infektsionnye-zabolevaniya/virusnyi-arteriit-loshadejIt is known that the diagnosis of viral arteritis is established on the basis of epizootological, clinical data and, in the case of death of animals, pathomorphological studies. Laboratory diagnostic methods include the isolation of the virus in cell culture, retrospective serological studies. To isolate the virus, horse cell cultures are used, transplanted lines of BHK-21, Vero and others. The virus is identified in the neutralization reaction with a specific serum. Alternative (auxiliary) methods of laboratory research are RSK, ELISA. A polymerase chain reaction for the diagnosis of viral arteritis in horses is under study. http://www.liveanimal.ru/loshadi/veterinariya/zaraznye-zabolevaniya/infektsionnye-zabolevaniya/virusnyi-arteriit-loshadej
Также известен способ выявления инфекций методом мультиплексной ПЦР с детекцией в режиме реального времени (патент РФ №2460803, C12Q 1/68, 2014 г. - прототип), включающий выделение РНК из биологического материала инфицированных особей сорбционным методом, синтез кДНК на матрице РНК путем постановки одноэтапной с добавлением внутреннего и положительного контролей образцов мультиплексной реакции обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции с проведением 45 циклов амплификации с детекцией в реальном времени с использованием специфичных для участка генома вирусного возбудителя олигонуклеотидных праймеров, флуоресцентно-меченного зонда и контрольных образцов, измерение накопления флуоресцентного сигнала по каналам соответствующих флуоресцентных красителей и интерпретацию результатов на основании наличия или отсутствия пересечения кривой флуоресценции с пороговой линией -Threshold.There is also a known method for detecting infections by multiplex PCR with real-time detection (RF patent No. 2460803,
Недостатком прототипа является отсутствие возможности получения достоверной диагностики вируса артериита у лошадей.The disadvantage of the prototype is the lack of the possibility of obtaining reliable diagnosis of the arteritis virus in horses.
Техническим результатом является получение достоверной диагностики заболевания и расширение функциональных возможностей.The technical result is to obtain reliable diagnosis of the disease and the expansion of functionality.
Технический результат достигается тем, что в способе выявления РНК возбудителя вируса артериита у лошадей, включающем выделение РНК из биологического материала инфицированных особей сорбционным методом, синтез кДНК на матрице РНК путем постановки одноэтапной с добавлением внутреннего и положительного контролей образцов мультиплексной реакции обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции с проведением 45 циклов амплификации с детекцией в реальном времени с использованием специфичных для участка генома вирусного возбудителя олигонуклеотидных праймеров, флуоресцентно-меченного зонда и контрольных образцов, измерение накопления флуоресцентного сигнала по каналам соответствующих флуоресцентных красителей и интерпретацию результатов на основании наличия или отсутствия пересечения кривой флуоресценции с пороговой линией - Threshold, согласно изобретению для выделения РНК используют биологический материал лошадей по выбору: в виде выделений из носа, глаз, фекалий, крови, спермы и фрагментов внутренних органов и тканей взятые от лошадей инфицированных возбудителем вируса артериита (Equine arteritis virus), при этом для внутреннего контрольного образца используют суспензию бактериофага MS2 с концентрацией 5×103 копий нуклеотидных последовательностей на 1 мкл, а для положительного контрольного образца используют смесь рекомбинантных плазмидных ДНК, содержащих фрагмент генома возбудителя вируса артериита лошадей (Equine arteritis virus) и фрагмент генома бактериофага MS2 взятых в соотношении 1:1, со следующими нуклеотидными последовательностями:The technical result is achieved by the fact that in the method for detecting RNA of the causative agent of the arteritis virus in horses, including the extraction of RNA from biological material of infected individuals by the sorption method, cDNA synthesis on the RNA matrix by staging one-step with the addition of internal and positive control samples of the multiplex reverse transcription reaction and polymerase chain reaction with 45 cycles of amplification with real-time detection using site-specific viral pathogen genome ligonucleotide primers, fluorescently-labeled probe and control samples, measuring the accumulation of the fluorescent signal through the channels of the corresponding fluorescent dyes and interpreting the results based on the presence or absence of the intersection of the fluorescence curve with the threshold line - Threshold, according to the invention, horses use the biological material of their choice: discharge from the nose, eyes, feces, blood, semen and fragments of internal organs and tissues taken from horses of infected pathogens m virus arteritis (Equine arteritis virus), wherein for the internal control sample is a suspension of bacteriophage MS2 at a concentration of 5 × 10 March copies of nucleotide sequences to 1 l, and for the positive control sample is a mixture of recombinant plasmid DNA containing a fragment of the genome of the pathogen viral arteritis horses (Equine arteritis virus) and a fragment of the genome of the bacteriophage MS2 taken in a 1: 1 ratio, with the following nucleotide sequences:
при этом накопление флуоресцентного сигнала измеряют по каналам: FAM/Green для специфического сигнала; Cy5/Red для сигнала внутреннего контроля, если кривые накопления флуоресцентного сигнала выходят до 35 цикла, то результат реакции считают положительным, а если кривые не пересекают пороговую линию или пересекают ее после 35 цикла, то результат реакции - отрицательный.wherein the accumulation of the fluorescent signal is measured by the channels: FAM / Green for a specific signal; Cy5 / Red for the internal control signal, if the fluorescence signal accumulation curves go out before the 35th cycle, then the reaction result is considered positive, and if the curves do not cross the threshold line or cross it after the 35th cycle, the reaction result is negative.
Новизна заявляемого технического решения заключается в том, что для получения достоверной диагностики вируса артериита лошадей используют две последовательные реакции: обратной транскрипции вирусной РНК для получения кДНК и полимеразной цепной реакции для амплификации фрагмента полученной кДНК матрицы. Обе реакции проводятся последовательно в одной ПЦР-пробирке (one-tube) с использованием специфичных для участка генома артериита олигонуклеотидных праймеров, флуоресцентно-меченного зонда и разных видов контроля для которых используют различные формы материала бактериофага MS2: суспензия и фрагмент генома со специфическими к нему праймерами и зондом. Такая постановка ОТ-ПЦР в реальном времени сокращает и упрощает процедуру анализа, снижает риск контаминации и возможность ошибки при переносе кДНК в другую пробирку для ПЦР. Кроме того, детекция продуктов амплификации осуществляется с использованием принципа выщепления флуоресцентной метки на 5' конце олигонуклеотидного зонда.The novelty of the claimed technical solution lies in the fact that to obtain a reliable diagnosis of equine arteritis virus, two sequential reactions are used: reverse transcription of viral RNA to obtain cDNA and polymerase chain reaction for amplification of a fragment of the obtained cDNA matrix. Both reactions are carried out sequentially in one PCR tube (one-tube) using oligonucleotide primers specific for the arteritis genome region, a fluorescently-labeled probe, and different types of control for which different forms of MS2 bacteriophage material are used: suspension and a fragment of the genome with primers specific to it and a probe. This real-time RT-PCR formulation shortens and simplifies the analysis procedure, reduces the risk of contamination and the possibility of errors when transferring cDNA to another PCR tube. In addition, the detection of amplification products is carried out using the principle of cleavage of the fluorescent label at the 5 'end of the oligonucleotide probe.
Признаки, отличающие заявляемое техническое решение от прототипа, направлены на достижение технического результата и не выявлены при изучении данной и смежной областей науки и техники и, следовательно, соответствуют критерию «изобретательский уровень».The features that distinguish the claimed technical solution from the prototype are aimed at achieving a technical result and have not been identified in the study of this and related fields of science and technology and, therefore, meet the criterion of "inventive step".
Заявляемый способ рекомендовано использовать в ветеринарной вирусологии, а именно к средствам диагностики возбудителя вируса артериита лошадей, что соответствует критерию «промышленная применимость».The inventive method is recommended for use in veterinary virology, and in particular to diagnostic tools for the causative agent of the horse arteritis virus, which meets the criterion of "industrial applicability".
Сущность изобретения поясняется чертежом, где представлены скриншоты графиков и таблицы, на фиг. 1 - представлен канал FAM /Green - для тестирования наличия ДНК возбудителя вируса артериита у лошадей; на фиг. 2 представлен канал Cy5/Red - для тестирования сигнала внутреннего контрольного образца (ВКО), на рис. 3 - таблица количественных данных для Cycling A.Green (Equine arteritis virus) и A.Red (ВКО).The invention is illustrated by the drawing, which shows screenshots of graphs and tables, in FIG. 1 - the FAM / Green channel is presented - for testing the presence of DNA of the causative agent of the arteritis virus virus in horses; in FIG. Figure 2 shows the channel Cy5 / Red - for testing the signal of the internal control sample (CTP), in Fig. 3 is a table of quantitative data for Cycling A.Green (Equine arteritis virus) and A.Red (EKO).
Способ выявления РНК возбудителя вируса артериита у лошадей осуществляется следующим образомA method for detecting RNA of the causative agent of the arteritis virus in horses is as follows
Для исследования с целью выделения РНК используют биологический материал животных по выбору: в виде выделений из носа, глаз, фекалий, крови, спермы и фрагментов внутренних органов и тканей взятые от лошадей инфицированных возбудителем вируса артериита (Equine arteritis virus). Для внутреннего контрольного образца используют суспензию бактериофага MS2 с концентрацией 5×10 копий нуклеотидных последовательностей на 1 мкл, а для положительного контрольного образца используют смесь рекомбинантных плазмидных ДНК, содержащих фрагмент генома возбудителя вируса артериита лошадей (Equine arteritis virus) и фрагмент генома бактериофага MS2 взятых в соотношении 1:1, со следующими нуклеотидными последовательностями:For research, RNA is isolated using the biological material of animals of their choice: in the form of secretions from the nose, eyes, feces, blood, semen and fragments of internal organs and tissues taken from horses infected with the causative agent of the arteritis virus (Equine arteritis virus). For the internal control sample, a suspension of bacteriophage MS2 with a concentration of 5 × 10 copies of nucleotide sequences per 1 μl is used, and for a positive control sample, a mixture of recombinant plasmid DNA containing a fragment of the equine arteritis virus pathogen genome and a bacteriophage MS2 genome fragment taken in 1: 1 ratio, with the following nucleotide sequences:
Затем измеряют накопление флуоресцентного сигнала по каналам: FAM/Green для специфического сигнала; Cy5/Red для сигнала внутреннего контроля и интерпретируют результаты на основании наличия/отсутствия пересечения кривой флуоресценции с пороговой линией (Threshold). Если кривые накопления флуоресцентного сигнала выходят до 35 цикла, то результат реакции считается положительным, а если кривые не пересекают пороговую линию или пересекают ее после 35 цикла, то результат реакции - отрицательный.Then measure the accumulation of the fluorescent signal in the channels: FAM / Green for a specific signal; Cy5 / Red for the internal control signal and interpret the results based on the presence / absence of the intersection of the fluorescence curve with the threshold line (Threshold). If the fluorescence signal accumulation curves go out before the 35th cycle, then the reaction result is considered positive, and if the curves do not cross the threshold line or cross it after the 35th cycle, the reaction result is negative.
Использование для разных видов контроля различные формы материала бактериофага MS2: суспензии и фрагмента генома со специфическими к нему праймерами и зондом обусловлено тем, что это позволяет контролировать корректное прохождение реакции в каждой пробирки, а также контролируется этап выделения РНК из образцов.The use of different forms of the material of the bacteriophage MS2 for different types of control: suspension and a fragment of the genome with specific primers and a probe is due to the fact that this allows you to control the correct course of the reaction in each tube, and also controls the stage of RNA extraction from samples.
Выбор последовательности и расчет первичной структуры олигонуклеотидных праймеров и зондов.Sequence selection and calculation of the primary structure of oligonucleotide primers and probes.
Вирус артериита входит в семейство Arteriviridae, род Arierivirus. Вирионы размером около 60 нм, сферической формы. Тип симметрии кубический, некоторые из них имеют хвостоподобные выступы. Состоят из нуклеокапсида и липидсодержащей суперкапсидной оболочки клеточного происхождения, на поверхности которой имеются выступы длиной 12-15 нм. Геном представлен 10 фрагментами 2-нитевой РНК, Белковый капсид его состоит из 7 структурных белков (36-120 кД).Arteritis virus is a member of the family Arteriviridae, genus Arierivirus. Virions about 60 nm in size, spherical in shape. The type of symmetry is cubic; some of them have tail-like protrusions. They consist of a nucleocapsid and a lipid-containing supercapsid membrane of cell origin, on the surface of which there are protrusions 12-15 nm long. The genome is represented by 10 fragments of a 2-strand RNA. Its protein capsid consists of 7 structural proteins (36-120 kD).
Праймеры высокоспецифичны к коротким консервативным участкам гена ORF5 (Equine arteritis virus strain SER-1 large envelope protein (ORF5) gene, partial cds, код доступа KX645659.1, участок между 70 и 390) и не комплементарны каким-либо участкам геномов других вирусов. Праймеры были спроектированы с использованием Primer Express Software v3.0 (Applied Biosystems) и исследованы с использованием BLAST, чтобы подтвердить их специфичность. Для детекции продуктов амплификации был подобран олигонуклеотидный флуоресцентно-меченный зонд EAVP (комплементарный участку нуклеотидной последовательности, ограниченной позициями отжига праймеров EAVF и EAVR). Зонд был помечен красителем FAM. Для гашения самопроизвольной флуоресценции на 3'-конце олигонуклеотидного зонда прикреплен гаситель BHQ-1.Primers are highly specific for short conserved regions of the ORF5 gene (Equine arteritis virus strain SER-1 large envelope protein (ORF5) gene, partial cds, access code KX645659.1, region 70 and 390) and are not complementary to any regions of the genomes of other viruses. Primers were designed using Primer Express Software v3.0 (Applied Biosystems) and tested using BLAST to confirm their specificity. To detect amplification products, an EAVP oligonucleotide fluorescently-labeled probe (complementary to the nucleotide sequence region limited by the annealing positions of the EAVF and EAVR primers) was selected. The probe was labeled with a FAM dye. To quench spontaneous fluorescence, a BHQ-1 quencher is attached at the 3'-end of the oligonucleotide probe.
Используя программу "Oligo 6.0" описаны основные свойства рассчитанных олигонуклеотидов, определившие возможность их использования в ПЦР.Using the program "Oligo 6.0" describes the basic properties of the calculated oligonucleotides, which determined the possibility of their use in PCR.
С помощью программы «Oligo 6.0» проанализирована нуклеотидная последовательность бактериофага MS2 (Enterobacteria phage MS2 isolate ST4, complete genome. ACCESSION EF204940). Бактериофаг MS2 содержит однонитевую позитивно ориентрованную РНК размером 3569 оснований. В результате анализа внутри гена белка `созревания` (maturation protein) выбран участок между 200 и 350 нуклеотидами, содержащий уникальные нуклеотиные последовательности, рассчитаны первичные структуры олигонуклеотидных праймеров, фланкирующих выбранный участок генома. Для детекции продуктов амплификации подобран олигонуклеотидный флуоресцентно-меченный зонд MS2P, комплементарный участку нуклеотидной последовательности, ограниченной позициями отжига праймеров MS2F и MS2R. Используя программу «Oligo 6.0» описаны основные свойства рассчитанных олигонуклеотидов, определившие возможность их использования в ПЦР.Using the Oligo 6.0 program, the nucleotide sequence of the bacteriophage MS2 (Enterobacteria phage MS2 isolate ST4, complete genome. ACCESSION EF204940) was analyzed. The bacteriophage MS2 contains single-stranded positively oriented RNA of 3569 bases. As a result of the analysis within the maturation protein gene, a region between 200 and 350 nucleotides containing unique nucleotide sequences was selected, the primary structures of oligonucleotide primers flanking the selected genome region were calculated. An MS2P oligonucleotide fluorescently labeled probe complementary to the nucleotide sequence region bounded by the annealing positions of the MS2F and MS2R primers was selected to detect amplification products. Using the program "Oligo 6.0" describes the basic properties of the calculated oligonucleotides, which determined the possibility of their use in PCR.
Пример конкретного осуществления способа выявления РНК возбудителя вируса артериита у лошадей.An example of a specific implementation of the method for detecting RNA of an arteritis virus pathogen in horses.
Для исследования используют следующий материал:For research using the following material:
- Соскобы со слизистых конъюнктивы глаз и ротоглотки берут сухими ватными зондами;- Scrapes from the mucous conjunctiva of the eyes and oropharynx are taken with dry cotton probes;
- Фекалии весом 5 г отбирают в стерильный пластиковый контейнер;- Feces weighing 5 g are collected in a sterile plastic container;
- Сперму, отбирают в пластиковую микропробирку объемом 1,5 мл- Sperm, taken into a 1.5 ml plastic microtube
- Для получения сыворотки забирают кровь в пробирку без антикоагулянта;- To obtain serum, blood is taken into a test tube without an anticoagulant;
- Фрагменты внутренних органов и ткани (трахея, легкие, селезенка, мозг, воздухоносные мешки, кишечник, лимфоузлы) помещают в стерильный контейнер.- Fragments of internal organs and tissue (trachea, lungs, spleen, brain, air sacs, intestines, lymph nodes) are placed in a sterile container.
Соскобы со слизистых конъюнктивы и ротоглотки в физиологическом растворе исследуют без предварительной подготовки.Scrapes from the mucous membranes of the conjunctiva and oropharynx in physiological saline are examined without prior preparation.
Сперму разводят физиологическим раствором 1:3, тщательно перемешивают на вортексе. Для экстракции используют аликвоту 0,1 мл суспензии.Sperm is diluted with saline 1: 3, thoroughly mixed on a vortex. An aliquot of 0.1 ml of suspension is used for extraction.
Для получения сыворотки пробирки с кровью (без антикоагулянта) отстаивают при комнатной температуре в течение 30 минут до полного образования сгустка. Затем центрифугируют при 600-1600 g (3000 об./мин на центрифуге «MiniSpin», Eppendorf, Германия) в течение 10 минут при комнатной температуре. Сыворотку переносят отдельными наконечниками с фильтром в стерильные пробирки объемом 1,5 мл.To obtain serum, blood tubes (without anticoagulant) are allowed to stand at room temperature for 30 minutes until a clot forms completely. It is then centrifuged at 600-1600 g (3000 rpm on a MiniSpin centrifuge, Eppendorf, Germany) for 10 minutes at room temperature. The serum is transferred by separate filter tips to sterile 1.5 ml tubes.
Из тканей и органов вырезают небольшие кусочки до 1 г весом. Растирают пробы в отдельных фарфоровых ступках или гомогенизируют на автоматических гомогенизаторах. Затем готовят 10% суспензию на стерильном физиологическом растворе или фосфатном буфере. Суспензию переносят в пробирку объемом 1,5 мл и центрифугируют при 9000 об./мин на центрифуге «MiniSpin», Eppendorf, в течение 1 мин. Аликвоту надосадочной жидкости (0,1 мл) используют для экстракции РНК.Small pieces of up to 1 g in weight are cut from tissues and organs. The samples are ground in separate porcelain mortars or homogenized on automatic homogenizers. Then prepare a 10% suspension in sterile saline or phosphate buffer. The suspension was transferred to a 1.5 ml tube and centrifuged at 9000 rpm on a MiniSpin centrifuge, Eppendorf, for 1 min. An aliquot of the supernatant (0.1 ml) is used for RNA extraction.
Из фекалий (1-5 г) готовят 10% суспензию на стерильном физиологическом растворе. Взвесь фекалий декантируют в течении 5-10 минут. Отбирают 1 мл надосадочной жидкости и переносят в чистую пробирку 1,5 мл, центрифугируют при 5000 об./мин на центрифуге «MiniSpin», Eppendorf, в течение 5 мин. Экстракцию РНК из осветленного экстракта фекалий проводят по возможности, сразу. При необходимости хранения замораживают.From feces (1-5 g) prepare a 10% suspension in sterile saline. A feces suspension is decanted for 5-10 minutes. 1 ml of supernatant was collected and transferred to a clean 1.5 ml tube, centrifuged at 5000 rpm on a MiniSpin centrifuge, Eppendorf, for 5 minutes. RNA extraction from clarified feces extract is carried out immediately, if possible. If necessary, the storage is frozen.
Анализ проводят с помощью набора реагентов «ПЦР-АРТЕРИИТ-ФАКТОР» методом ОТ-ПЦР РВ:The analysis is carried out using a set of reagents "PCR-ARTERIIT-FACTOR" by RT-PCR RV:
Набор состоит из комплекта реагентов для проведения мультиплексной ОТ-ПЦР РВ (Комплект №1) и контрольных образцов (Комплект №2).The kit consists of a kit of reagents for conducting multiplex RT-PCR RV (Kit No. 1) and control samples (Kit No. 2).
Набор выпускается в двух вариантах:The kit is available in two versions:
1) Для анализа 55 образцов (включая контрольные образцы)1) For analysis of 55 samples (including control samples)
2) Для анализа 110 образцов (включая контрольные образцы).2) For analysis of 110 samples (including control samples).
Состав набора приведен в Таблицах 1 и 2.The composition of the kit is shown in Tables 1 and 2.
*Возможна легкая опалесценция* Light opalescence possible
Наборы используют в соответствии с инструкцией по применению набора реагентов «ПЦР-АРТЕРИИТ-ФАКТОР» для выявления РНК вируса артериита лошадей (Equine arteritis virus) в биологическом материале от животных методом совмещенной реакции обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции с флуоресцентной детекцией в режиме реального времени (ОТ ПЦР РВ), ТУ 21.10.60-126-51062356-2017 (для диагностики in vitro) http://www. vetfaktor.ru/.The kits are used in accordance with the instructions for the use of the PCR-ARTERIIT-FACTOR reagent kit to detect equine arteritis virus RNA in biological material from animals by the combined reverse transcription reaction and polymerase chain reaction with real-time fluorescence detection ( FROM RT PCR), TU 21.10.60-126-51062356-2017 (for in vitro diagnostics) http: // www. vetfaktor.ru/.
В набор не входят реактивы для экстракции НК. Выделение РНК может проводиться, например, с помощью наборов на основе сорбционного метода, в состав которых входит силика или микроцентрифужные колонки, наборов на основе фенол-хлороформной экстракции и т.п. Рекомендуется использовать набор «ДНК/РНК-С-ФАКТОР» либо аналогичный.The kit does not include reagents for the extraction of NK. RNA isolation can be carried out, for example, using sets based on the sorption method, which include silica or microcentrifuge columns, sets based on phenol-chloroform extraction, etc. It is recommended to use the DNA / RNA-S-FACTOR kit or similar.
Анализ состоит из трех этапов:The analysis consists of three stages:
- экстракция НК (на этом этапе дополнительно используют реактивы для экстракции, например набор «ДНК/РНК-С-ФАКТОР»);- NK extraction (at this stage, reagents for extraction are additionally used, for example, the DNA / RNA-C-FACTOR kit);
- проведение реакции ОТ-ПЦР РВ;- carrying out the RT-PCR reaction;
- учет результатов анализа.- accounting for the results of the analysis.
Экстракцию (выделение) нуклеиновых кислот (НК) из исследуемых проб проводят следующим образом.The extraction (isolation) of nucleic acids (NK) from the studied samples is carried out as follows.
Отбирают необходимое количество одноразовых пробирок объемом 1,5 мл, включая отрицательный контроль выделения. Вносят во все пробирки, включая пробирку для отрицательного контрольного образца (ОКО), по 10 мкл внутреннего контрольного образца (ВКО EAV) в качестве которого используют суспензию бактериофага MS2 с концентрацией 5×103 копий нуклеотидных последовательностей на 1 мкл, а для положительного контрольного образца (ПКО EAV) используют смесь рекомбинантных плазмидных ДНК, содержащих фрагмент генома возбудителя вируса артериита лошадей (Equine arteritis virus) и фрагмент генома бактериофага MS2 взятых в соотношении 1:1, со следующими нуклеотидными последовательностями:The required number of 1.5 ml disposable tubes was selected, including a negative selection control. Pipette into all tubes, including a tube for a negative control sample (OKO), 10 μl of an internal control sample (EQA EQ), which is used as a suspension of bacteriophage MS2 with a concentration of 5 × 10 3 copies of nucleotide sequences per 1 μl, and for a positive control sample (PAV EAV) use a mixture of recombinant plasmid DNA containing a fragment of the genome of the causative agent of the horse arteritis virus (Equine arteritis virus) and a fragment of the genome of the bacteriophage MS2 taken in a 1: 1 ratio, with the following nucleotide sequence awns:
Выделяют НК из анализируемых и контрольных образцов согласно инструкции производителя набора для выделения НК.NK is isolated from the analyzed and control samples according to the manufacturer’s instructions for the NK extraction kit.
Для подготовка образцов к проведению ПНР Общий объем реакционной смеси - 25 мкл, объем РНК-пробы - 10 мкл.To prepare samples for the NDP, the total volume of the reaction mixture is 25 μl, the volume of the RNA sample is 10 μl.
Успешное прохождение реакции контролируют использованием компонентов из комплектов 1 и 2 набора ПКО EAV, ВКО EAV и РНК Буфер.Successful completion of the reaction is monitored using components from
В отдельной пробирке смешать компоненты набора из расчета на каждую реакцию: 10 мкл ПЦР БУФЕР EAV 5 мкл ПЦР СМЕСЬ EAV 0,75 мкл RT PCR ENZIn a separate tube, mix the kit components for each reaction: 10 μl PCR
Перемешивают смесь на вортексе и сбрасывают капли кратковременным центрифугированием. Отбирают необходимое количество пробирок для амплификации НК исследуемых и контрольных проб и вносят в них по 15 мкл приготовленной реакционной смеси.Vortex the mixture and mix the drops by short centrifugation. Select the required number of tubes for amplification of the NK of the studied and control samples and add 15 μl of the prepared reaction mixture to them.
Используя наконечники с фильтром в подготовленные пробирки вносят:Using tips with a filter in prepared tubes make:
а) в пробирку отрицательного контроля ПЦР (К-) 10 мкл РНК буфера;a) in a test tube negative control PCR (K-) 10 μl of RNA buffer;
б) в ряд пробирок для исследуемых проб - в каждую вносят по 10 мкл НК соответствующей пробы;b) in a row of test tubes for the test samples - 10 μl of the corresponding sample of NK are introduced into each;
в) в пробирку с положительным контролем ПЦР (К+) вносят 10 мкл ПКO ЕАV.C) in a test tube with a positive PCR control (K +) contribute 10 μl of PCO EAV.
Далее проводят ПЦР РВ с флуоресцентной детекцией с помощью прибора - амплификатора типа «Rotor-Gene Q» при следующих режимах представленных в таблице 3.Next, carry out PCR RT with fluorescence detection using a device - amplifier type "Rotor-Gene Q" in the following modes shown in table 3.
Помещают подготовленные для проведения ПЦР пробирки в ячейки амплификатора, программируют прибор согласно инструкции производителя и осуществляют интерпретацию результатов анализаPrepare the tubes prepared for PCR in the amplifier cells, program the device according to the manufacturer's instructions and interpret the analysis results
Полученные данные - кривые накопления флуоресцентного сигнала анализируются с помощью программного обеспечения используемого прибора для проведения ПЦР в соответствии с инструкцией производителя к прибору. Учет результатов ОТ-ПЦР РВ проводится по наличию или отсутствию пересечения кривой флуоресценции с установленной на соответствующем уровне пороговой линией (что соответствует наличию или отсутствию значения порогового цикла «Ct» для исследуемого образца).The data obtained - the fluorescence signal accumulation curves are analyzed using the software of the device used for PCR in accordance with the manufacturer's instructions for the device. Analysis of the results of RT-PCR of the RT is carried out by the presence or absence of the intersection of the fluorescence curve with the threshold line set at the appropriate level (which corresponds to the presence or absence of the threshold cycle value “Ct” for the test sample).
Результат считается достоверным в случае корректного прохождения положительных и отрицательных контролей амплификации и экстракции НК в соответствии с таблицей 4.The result is considered reliable if the positive and negative controls for amplification and extraction of NK are correctly passed in accordance with table 4.
Появление любого значения Ct в таблице результатов для отрицательного контроля этапа экстракции ВК- на канале Fam/Green и для отрицательного контроля этапа ПЦР К- на любом из каналов свидетельствует о наличии контаминации реактивов или образцов. В этом случае результаты анализа по всем пробам считаются недействительными. Требуется повторить анализ всех проб, а также предпринять меры по выявлению и ликвидации источника контаминации.The appearance of any Ct value in the results table for the negative control of the VK- extraction stage on the Fam / Green channel and for the negative control of the K- PCR stage on any of the channels indicates the presence of reagent or sample contamination. In this case, the results of the analysis for all samples are considered invalid. It is required to repeat the analysis of all samples, as well as take measures to identify and eliminate the source of contamination.
Образцы, для которых по каналу Cy5/Red значение Ct отсутствует или превышает 35 цикл (при этом по каналу Fam/Green отсутствует значение Ct) требуют повторного проведения исследования (рис. 2, 3). Задержка в значениях пороговых циклов для исследуемых образцов на канале Cy5/Red указывает на присутствие ингибиторов в пробе(ах) или на ошибки при постановке реакции ОТ-ПЦР РВ. Требуется провести исследование, начиная с этапа экстракции НК.Samples for which the Ct value is absent or exceeds the 35th cycle on the Cy5 / Red channel (while the Ct value is absent on the Fam / Green channel), a repeated study is required (Fig. 2, 3). A delay in the threshold cycle values for the studied samples on the Cy5 / Red channel indicates the presence of inhibitors in the sample (s) or errors in the formulation of the RT-PCR reaction. A study is required starting from the stage of NK extraction.
Образец считается положительным, РНК вируса артериита лошадей присутствует, если наблюдается экспоненциальный рост сигнала на канале Fam/Green, при этом значения Ct контрольных образцов находятся в пределах нормы (см. Табл. 3, рис. 1,3). Если для исследуемого образца по каналу Fam/Green значение Ct определяется позднее 37 цикла при корректном прохождении положительных и отрицательных контролей - он считается спорным и исследуется повторно с этапа выделения НК. Если при повторной постановке наблюдается схожий результат (Ct на канале Fam/Green более 37), требуется повторное взятие материала от того же животного для проведения ПЦР-исследования и (или) использование альтернативных методов диагностики.The sample is considered positive, the horse RNA virus RNA is present if an exponential signal growth is observed on the Fam / Green channel, while the Ct values of the control samples are within normal limits (see Table 3, Fig. 1.3). If the Ct value for the test sample through the Fam / Green channel is determined after the 37th cycle with the correct passage of the positive and negative controls, it is considered controversial and re-examined from the stage of NC extraction. If during re-staging a similar result is observed (Ct on the Fam / Green channel is more than 37), re-sampling of the material from the same animal is required for PCR studies and / or the use of alternative diagnostic methods.
Claims (8)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2018134641A RU2700481C1 (en) | 2018-10-01 | 2018-10-01 | Method for detecting rna of an arteritis virus agent in horses |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2018134641A RU2700481C1 (en) | 2018-10-01 | 2018-10-01 | Method for detecting rna of an arteritis virus agent in horses |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2700481C1 true RU2700481C1 (en) | 2019-09-17 |
Family
ID=67990006
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2018134641A RU2700481C1 (en) | 2018-10-01 | 2018-10-01 | Method for detecting rna of an arteritis virus agent in horses |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2700481C1 (en) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114369684A (en) * | 2021-11-05 | 2022-04-19 | 广州海关技术中心 | Primer, probe, kit and method for real-time fluorescent RT-PCR detection of equine viral arterivirus and application thereof |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2460803C2 (en) * | 2010-10-27 | 2012-09-10 | Российская Федерация, от имени которой выступает Министерство промышленности и торговли Российской Федерации (Минпромторг России) | Differential diagnostic technique for respiratory viral infections by real-time multiplex pcr and sequence list for implementation thereof |
-
2018
- 2018-10-01 RU RU2018134641A patent/RU2700481C1/en not_active IP Right Cessation
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2460803C2 (en) * | 2010-10-27 | 2012-09-10 | Российская Федерация, от имени которой выступает Министерство промышленности и торговли Российской Федерации (Минпромторг России) | Differential diagnostic technique for respiratory viral infections by real-time multiplex pcr and sequence list for implementation thereof |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| АЛЕКСЕЕНКОВА С.В. и др. Диагностика вирусных болезней лошадей методом ПЦР, Российский ветеринарный журнал, N3, 2011, c. 37-39, найдено в Интернет 13.05.2019, адрес сайта: logospress.ru. * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114369684A (en) * | 2021-11-05 | 2022-04-19 | 广州海关技术中心 | Primer, probe, kit and method for real-time fluorescent RT-PCR detection of equine viral arterivirus and application thereof |
| CN114369684B (en) * | 2021-11-05 | 2024-04-02 | 广州海关技术中心 | Primer, probe, kit and method for real-time fluorescence RT-PCR detection of equine viral arteritis virus and application of primer, probe, kit and method |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RU2680094C1 (en) | Test system for detection of dna of leptospirosis causative agent (leptospira speciales) in agricultural animals | |
| RU2703394C1 (en) | Method for detecting and genotyping rna of porcine reproductive-respiratory syndrome virus | |
| CN110607398B (en) | RT-LAMP kit for fluorescent visual rapid detection of porcine epidemic diarrhea virus | |
| RU2694558C1 (en) | Method for genome detection of coronavirus infection causative agent in cattle | |
| RU2703401C1 (en) | Test system for detecting and genotyping rna of swine reproductive-respiratory syndrome virus | |
| RU2700481C1 (en) | Method for detecting rna of an arteritis virus agent in horses | |
| RU2681473C1 (en) | Test system for detection of the virus genome of parainfluenza 3 types at cattle with a multiplex polymerase chain reaction with fluorescent detection in real time mode | |
| RU2698662C1 (en) | Test system for detecting rna of agent of arteritis virus in horses | |
| RU2726242C1 (en) | Test system for detecting dna of lumpy skin disease virus (lsdv) in biological material of animals using a polymerase chain reaction in real time | |
| RU2689718C1 (en) | Method for detecting genome of rotavirus infection agent in farm animals | |
| Tran et al. | Evaluation of an automated insulated isothermal polymerase chain reaction system for rapid and reliable, on-site detection of African swine fever virus | |
| RU2607025C1 (en) | Synthetic oligonucleotide primers and method for detecting rna atypical pestivirus of cattle | |
| RU2719719C1 (en) | Method for detection of dna of nodular dermatitis virus (lsdv) in animal biological material by means of polymerase chain reaction in real time | |
| RU2586527C1 (en) | Oligonucleotide primers and fluorescent probe and method for detection of epidemic diarrhea virus genome by reverse transcription - polymerase chain reaction | |
| CN108866241A (en) | It is a kind of for detecting the kit of border disease | |
| CN109355436A (en) | A kind of RT-LAMP primer composition for detecting PRRSV and its application | |
| RU2694501C1 (en) | Test system for genome detection of rotavirus agent of type a in agricultural animals by means of multiplex polymerase chain reaction with fluorescent detection in real time | |
| RU2481403C1 (en) | Synthetic oligonucleotide primers and method to detect dna of virus of infectious anaemia of chickens with synthetic oligonucleotide primers in polymerase chain reaction in real-time mode | |
| RU2696306C1 (en) | Method for detecting rna of schmallenberg disease virus in farm animals | |
| RU2782427C1 (en) | Method for detecting the dna of the causative agent of cryptosporidiosis in animal biological material and feed using a polymerase chain reaction in real time | |
| RU2819044C1 (en) | Test system for detecting dna of causative agent of moraxellosis kpc (moraxella bovis) in biological material of animals and feed using polymerase chain reaction in real time | |
| CN106521029A (en) | Multiple RT-PCR detection kit for identifying PRRSV (Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome) | |
| RU2694719C1 (en) | Test system for detecting rna of schmallenberg disease virus in farm animals | |
| RU2740097C1 (en) | Method for detecting a new type coronavirus infection agent genome (ncov19) in primates | |
| RU2785381C1 (en) | Test system for identifying the dna of a cryptosporidiosis pathogen in biological material of animals and in feeds using real-time polymerase chain reaction |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20201002 |