RU2798124C9 - Method of obtaining brucellosis polystyrene latex diagnosticum - Google Patents
Method of obtaining brucellosis polystyrene latex diagnosticum Download PDFInfo
- Publication number
- RU2798124C9 RU2798124C9 RU2022129422A RU2022129422A RU2798124C9 RU 2798124 C9 RU2798124 C9 RU 2798124C9 RU 2022129422 A RU2022129422 A RU 2022129422A RU 2022129422 A RU2022129422 A RU 2022129422A RU 2798124 C9 RU2798124 C9 RU 2798124C9
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- brucellosis
- latex
- diagnosticum
- concentration
- antigen
- Prior art date
Links
- 239000004816 latex Substances 0.000 title claims abstract description 27
- 229920000126 latex Polymers 0.000 title claims abstract description 27
- 206010006500 Brucellosis Diseases 0.000 title claims abstract description 25
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 title claims abstract description 11
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 title claims abstract description 10
- 238000000034 method Methods 0.000 title abstract description 11
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims abstract description 17
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims abstract description 14
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims abstract description 14
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims abstract description 14
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims abstract description 14
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 10
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims abstract description 7
- 229960001506 brilliant green Drugs 0.000 claims abstract description 5
- HXCILVUBKWANLN-UHFFFAOYSA-N brilliant green cation Chemical compound C1=CC(N(CC)CC)=CC=C1C(C=1C=CC=CC=1)=C1C=CC(=[N+](CC)CC)C=C1 HXCILVUBKWANLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 5
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims abstract description 5
- ZXJXZNDDNMQXFV-UHFFFAOYSA-M crystal violet Chemical compound [Cl-].C1=CC(N(C)C)=CC=C1[C+](C=1C=CC(=CC=1)N(C)C)C1=CC=C(N(C)C)C=C1 ZXJXZNDDNMQXFV-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims abstract description 5
- 229960001235 gentian violet Drugs 0.000 claims abstract description 5
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 claims abstract description 4
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 claims abstract description 4
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 claims abstract description 4
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 claims abstract description 4
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 claims abstract description 4
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 claims abstract description 4
- 241000589562 Brucella Species 0.000 claims abstract description 3
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 claims abstract description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 8
- 239000013049 sediment Substances 0.000 claims description 3
- 230000004520 agglutination Effects 0.000 abstract description 11
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 abstract description 10
- 238000001514 detection method Methods 0.000 abstract description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 abstract 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 abstract 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 9
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 7
- 239000004005 microsphere Substances 0.000 description 6
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 6
- 241000589567 Brucella abortus Species 0.000 description 5
- 102000011632 Caseins Human genes 0.000 description 5
- 108010076119 Caseins Proteins 0.000 description 5
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 5
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 5
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 5
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 5
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 4
- 229920006008 lipopolysaccharide Polymers 0.000 description 4
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 4
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 4
- 235000021249 α-casein Nutrition 0.000 description 4
- 206010008631 Cholera Diseases 0.000 description 3
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 description 3
- 208000034784 Tularaemia Diseases 0.000 description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 3
- 230000037029 cross reaction Effects 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- PAYRUJLWNCNPSJ-UHFFFAOYSA-N Aniline Chemical compound NC1=CC=CC=C1 PAYRUJLWNCNPSJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010035148 Plague Diseases 0.000 description 2
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 101000588258 Taenia solium Paramyosin Proteins 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 238000003748 differential diagnosis Methods 0.000 description 2
- 230000035931 haemagglutination Effects 0.000 description 2
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 2
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 2
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 206010070834 Sensitisation Diseases 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000002421 anti-septic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 229940064004 antiseptic throat preparations Drugs 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 1
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 1
- 231100000676 disease causative agent Toxicity 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 239000000945 filler Substances 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 239000003547 immunosorbent Substances 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 230000036512 infertility Effects 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000002082 metal nanoparticle Substances 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 230000000704 physical effect Effects 0.000 description 1
- 229920003229 poly(methyl methacrylate) Polymers 0.000 description 1
- 239000004926 polymethyl methacrylate Substances 0.000 description 1
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 1
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 1
- 229920005553 polystyrene-acrylate Polymers 0.000 description 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 230000008313 sensitization Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 150000004961 triphenylmethanes Chemical class 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 1
Abstract
Description
Изобретение относится к биотехнологии, микробиологии и, в частности, к способу получения латексных диагностикумов для реакции агглютинации латекса.The invention relates to biotechnology, microbiology and, in particular, to a method for producing latex diagnostics for the latex agglutination reaction.
Полимерные микросферы (латексные частицы) с адсорбированными на них молекулами антител или антигенов вступают в реакцию и агглютинируют с соответствующими антигенами микроорганизмов или антителами. Полимерные микросферы являются удобной и гибкой системой для разработки диагностических препаратов, применяемых в реакции агглютинации латекса (РАЛ). При выборе полимерных микросфер обычно учитывают диаметр и распределение частиц по размерам, состав, химические свойства поверхности (реакционные группы, функциональность, заряд) и другие более специфические свойства, такие как наличие хромофорных наполнителей (красителей), наночастиц металлов и их оксидов. Для латексной агглютинации чаще применяются микросферы (окрашенные, неокрашенные) с размером 0,2-1,0 мкм, активированные (для ковалентной сшивки) и неактивированные (для физической сорбции). Важным параметром является и состав полимерных микросфер. Обычно полимерные микросферы состоят из полиакролеина, полистирола, полиметилметакрилата. Эти материалы обладают различными физическими и оптическими свойствами, которые могут показывать преимущества или же накладывать некоторые ограничения их использования [1].Polymer microspheres (latex particles) with molecules of antibodies or antigens adsorbed on them react and agglutinate with the corresponding antigens of microorganisms or antibodies. Polymer microspheres are a convenient and flexible system for the development of diagnostic drugs used in the latex agglutination reaction (LAR). When choosing polymer microspheres, the diameter and size distribution of particles, composition, chemical properties of the surface (reactive groups, functionality, charge) and other more specific properties, such as the presence of chromophoric fillers (dyes), metal nanoparticles and their oxides are usually taken into account. For latex agglutination, microspheres (colored, uncolored) with a size of 0.2-1.0 microns, activated (for covalent cross-linking) and non-activated (for physical sorption) are most often used. The composition of polymer microspheres is also an important parameter. Typically, polymer microspheres consist of polyacrolein, polystyrene, and polymethyl methacrylate. These materials have different physical and optical properties, which may show advantages or impose some limitations on their use [1].
Для выявления антител против возбудителя бруцеллеза применяются различные серологические методы (реакция непрямой гемагглютинации - РИГА; иммуноферментный анализ - ИФА; реакция агглютинации латекса - РАЛ и т.д.), обладающие своими достоинствами и недостатками.To detect antibodies against the causative agent of brucellosis, various serological methods are used (indirect hemagglutination reaction - RIHA; enzyme-linked immunosorbent assay - ELISA; latex agglutination reaction - RAL, etc.), which have their own advantages and disadvantages.
Известен способ получения R-бруцеллезного эритроцитарного диагностикума для РИГА [2], заключающийся в приготовлении формалинизированных эритроцитов барана, с последующей их сенсибилизацией сенситином, полученным выращиванием бактериальной массы В. abortus 16/4, ее смывом, инактивацией, экстрагированием, отделением сенситина центрифугированием, воздействием на бактериальные клетки додецилсульфатом натрия.There is a known method for obtaining R-brucellosis erythrocyte diagnosticum for RIGA [2], which consists in the preparation of formalinized sheep erythrocytes, followed by their sensitization with sensitin obtained by growing the bacterial mass B. abortus 16/4, its washing, inactivation, extraction, separation of sensitin by centrifugation, exposure on bacterial cells with sodium dodecyl sulfate.
Недостатком данного способа является использование биологического сырья - эритроцитов барана, сложно поддающихся стандартизации, чьи параметры зависят от таких факторов, как пол, возраст животного, время взятия крови. Кроме того, для получения качественных эритроцитарных диагностикумов формалинизированные эритроциты для стабилизации необходимо выдерживать в течение года.The disadvantage of this method is the use of biological raw materials - sheep erythrocytes, which are difficult to standardize, whose parameters depend on factors such as gender, age of the animal, and time of blood collection. In addition, to obtain high-quality erythrocyte diagnostics, formalinized erythrocytes must be kept for a year for stabilization.
Известен способ получения иммуноферментных тест-систем на основе моноклональных антител против S-ЛПС (S-липополисахарид) и R-ЛПС (R-липополисахарид), меченных пероксидазой хрена, для дифференциальной диагностики бруцеллеза [3].There is a known method for producing enzyme-linked immunosorbent test systems based on monoclonal antibodies against S-LPS (S-lipopolysaccharide) and R-LPS (R-lipopolysaccharide), labeled with horseradish peroxidase, for the differential diagnosis of brucellosis [3].
Недостатком данного способа является сравнительная сложность получения тест-системы и постановки анализа, возможность ложноположительных результатов, необходимость использования химически чистой посуды. Помимо этого, обязательным условием является наличие в лаборатории фотометра для учета результатов.The disadvantage of this method is the relative complexity of obtaining a test system and performing an analysis, the possibility of false positive results, and the need to use chemically clean glassware. In addition, a prerequisite is the presence of a photometer in the laboratory to record the results.
Наиболее близким к заявляемому способу является способ получения иммунодиагностикума на основе полистирольного латекса [4]. Для получения иммунодиагностикума в соответствии с предлагаемым изобретением к 2% суспензии сферических частиц полистирольного карбоксилированного латекса с иммобилизованным на их поверхности специфическим к данному заболеванию белком в 0,1 М глициновом буфере рН 8,2 (буфер) прибавляют равный объем раствора α-казеина (10 мг/мл) в буфере, приготовленного следующим образом: α-казеин растворяют в рассчитанном количестве буфера, прогревают 30 мин при 37°С, раствор осветляют центрифугированием в течение 15 мин при 5000 об/мин. Оптимальная концентрация раствора α-казеина для насыщения свободных центров связывания - 0,4 мг/мл. Смесь латексной суспензии с раствором α-казеина тщательно встряхивают и оставляют при комнатной температуре на 30 мин, после чего помещают в холодильник (4°С) на 24 ч. Описанный общий подход позволяет получать широкий спектр диагностикумов, отличающихся только специфическим белком, иммобилизованным на поверхности полимера, однако наличие казеина в составе препарата значительно сокращает срок его годности из-за возможности бактериального пророста. Недостатком данного способа является и то, что диагностикумы, полученные описанным методом, не являются достаточно чувствительными: максимальное разведение сыворотки, которое позволяет обнаружить данный препарат, составляет 1:320.The closest to the claimed method is a method for producing an immunodiagnosticum based on polystyrene latex [4]. To obtain an immunodiagnosticum in accordance with the present invention, an equal volume of α-casein solution (10 mg/ml) in a buffer prepared as follows: α-casein is dissolved in the calculated amount of buffer, heated for 30 minutes at 37°C, the solution is clarified by centrifugation for 15 minutes at 5000 rpm. The optimal concentration of α-casein solution to saturate free binding sites is 0.4 mg/ml. The mixture of the latex suspension with the α-casein solution is thoroughly shaken and left at room temperature for 30 minutes, after which it is placed in the refrigerator (4°C) for 24 hours. The described general approach makes it possible to obtain a wide range of diagnostics, differing only in the specific protein immobilized on the surface polymer, however, the presence of casein in the composition of the drug significantly reduces its shelf life due to the possibility of bacterial growth. The disadvantage of this method is that the diagnostics obtained by the described method are not sensitive enough: the maximum dilution of serum that allows the detection of this drug is 1:320.
Цель изобретения - разработка способа получения активного и специфичного бруцеллезного полистирольного латексного диагностикума для выявления антител в реакции агглютинации латекса.The purpose of the invention is to develop a method for producing an active and specific brucellosis polystyrene latex diagnosticum for detecting antibodies in the latex agglutination reaction.
Технический результат изобретения заключается в том, что полимерную суспензию центрифугируют, доводят 0,9% раствором натрия хлорида до концентрации 2% по сухому остатку полимера и смешивают в равных объемах с разрушенным на ультразвуковом дезинтеграторе антигеном бруцеллезного микроба из штамма Brucella (В.) abortus 19 ВА в концентрации 2×109 м.к./мл на 12% растворе натрия хлорида, окрашенным бриллиантовым зеленым (0,004%) и генцианвиолетом (0,002%); инкубируют при температуре 37°С в течение 2 ч и 12-16 ч в холодильнике при температуре 4°С; дважды отмывают от несвязавшегося антигена 0,1 М фосфатно-солевым буфером, рН 7,2-7,4 путем центрифугирования при 5000 об/мин, в течение 10 мин; осадок ресуспендируют в 0,1% растворе желатина до 0,2% концентрации и стабилизируют формалином до 0,1%.The technical result of the invention is that the polymer suspension is centrifuged, adjusted with a 0.9% sodium chloride solution to a concentration of 2% based on the dry residue of the polymer and mixed in equal volumes with the brucellosis microbe antigen from the Brucella (B.) abortus 19 strain destroyed on an ultrasonic disintegrator VA at a concentration of 2×10 9 mc/ml in a 12% sodium chloride solution, colored with brilliant green (0.004%) and gentian violet (0.002%); incubate at a temperature of 37°C for 2 hours and 12-16 hours in a refrigerator at a temperature of 4°C; washed twice from unbound antigen with 0.1 M phosphate-buffered saline, pH 7.2-7.4 by centrifugation at 5000 rpm for 10 minutes; the sediment is resuspended in a 0.1% gelatin solution to 0.2% concentration and stabilized with formaldehyde to 0.1%.
Для получения бруцеллезного латексного диагностикума для выявления антител в РАЛ использовали латекс для агглютинации (ООО «Диаэм», Москва) с размером частиц 0,8 мкм, содержанием полистирола по сухому остатку - 10% и додецилсульфата натрия - 0,01%. В качестве лиганда применяли взвесь бруцеллезного микроба В. abortus 19 ВА, выращенного на агаре Альбими при температуре (37±1)°С в течение (48±1) ч. Смыв бакмассы проводили 12% раствором натрия хлорида. Далее бакмассу прогревали при 100°С в течение 60 мин. После контроля общей и специфической стерильности бакмассы, разводили взвесь до концентрации 2×109 м.к./мл 12% раствором натрия хлорида с 0,5% фенола. Добавляли анилиновые красители трифенилметанового ряда: бриллиантовый зеленый до 0,004% концентрации и генцианвиолет до 0,002% концентрации. Антиген разрушали на гомогенизаторе ультразвуковом (Sonicator Q125, Qsonica LLC) в течение 2 мин (частота 20 Гц).To obtain a brucellosis latex diagnosticum for detecting antibodies in RAL, we used latex for agglutination (Diaem LLC, Moscow) with a particle size of 0.8 microns, a polystyrene content of dry residue - 10% and sodium dodecyl sulfate - 0.01%. A suspension of the brucellosis microbe B. abortus 19 BA, grown on Albimi agar at a temperature of (37±1)°C for (48±1) hours, was used as a ligand. The bacterium was washed off with a 12% sodium chloride solution. Next, the bakmass was heated at 100°C for 60 minutes. After monitoring the general and specific sterility of the bacmass, the suspension was diluted to a concentration of 2×10 9 mc/ml with a 12% sodium chloride solution with 0.5% phenol. Aniline dyes of the triphenylmethane series were added: brilliant green to 0.004% concentration and gentian violet to 0.002% concentration. The antigen was destroyed using an ultrasonic homogenizer (Sonicator Q125, Qsonica LLC) for 2 min (frequency 20 Hz).
Контроль чувствительности и специфичности разработанных экспериментальных серий препарата проводили с гомологичными и гетерологичными сыворотками. РАЛ ставили в U-образных (круглодонных) микропланшетах.The sensitivity and specificity of the developed experimental series of the drug were monitored with homologous and heterologous sera. RAL was placed in U-shaped (round-bottomed) microplates.
Для контроля чувствительности РАЛ использованы бруцеллезные сыворотки: иммунная кроличья сыворотка, полученная в ФКУЗ Ставропольский противочумный институт Роспотребнадзора (экспериментальная серия) и сыворотка диагностическая поливалентная бруцеллезная сухая для реакции агглютинации (ФКУЗ Иркутский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора).To control the sensitivity of RAL, brucellosis sera were used: immune rabbit serum obtained at the Stavropol Anti-Plague Institute of Rospotrebnadzor (experimental series) and diagnostic polyvalent brucellosis dry serum for the agglutination reaction (FKUI Irkutsk Research Anti-Plague Institute of Rospotrebnadzor).
Для контроля специфичности использованы следующие сыворотки: диагностическую холерную O1 адсорбированную сухую для РА (ФКУН «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб»); диагностическую сальмонеллезную адсорбированную О-поливалентную для РА (ЗАО «Эколаб»); диагностическую туляремийную сухую для РА (ФКУЗ Иркутский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора).To control specificity, the following sera were used: diagnostic cholera O1 adsorbed dry sera for RA (FKUN “Russian Research Antiplague Institute “Microbe”); diagnostic salmonella adsorbed O-polyvalent for RA (JSC "Ekolab"); diagnostic dry tularemia for RA (FKUZ Irkutsk Research Antiplague Institute of Rospotrebnadzor).
Постановку РАЛ (микрометод) осуществляли следующим образом: во все лунки (8 рядов) планшета вносили по 25 мкл разводящей жидкости твин-80 в разведении 1:25 тыс. Далее, в первые лунки рядов по 25 мкл гомологичных и гетерологичных сывороток в разведении 1:100, титровали с шагом 2, получая разведения в лунках от 1:200 до 1:12800, восьмые ряды - отрицательные контроли (в них сыворотки не вносили). Затем во все лунки капали по 25 мкл разработанного диагностикума бруцеллезного латексного. Чувствительность РАЛ составила 1:800-1:1600, что соответствует чувствительности бруцеллезного эритроцитарного диагностикума. При контроле специфичности установлено, что с сальмонеллезной, холерной сыворотками отсутствовала перекрестная реакция, а с туляремийной - наблюдалась перекрестная реакция до ¼ титра диагностикума, что соответствует требованиям нормативных документов, предъявляемых к данным видам диагностикумов. Возможность практического применения изобретения иллюстрируется примерами его конкретного выполнения с использованием совокупности заявляемых признаков.The RAL setup (micromethod) was carried out as follows: 25 μl of Tween-80 dilution liquid at a dilution of 1:25 thousand was added to all wells (8 rows) of the plate. Next, 25 μl of homologous and heterologous sera at a dilution of 1 were added to the first wells of the rows: 100, titrated in steps of 2, obtaining dilutions in wells from 1:200 to 1:12800, the eighth rows are negative controls (no serum was added to them). Then 25 μl of the developed brucellosis latex diagnosticum was dropped into all wells. The sensitivity of RAL was 1:800-1:1600, which corresponds to the sensitivity of the brucellosis erythrocyte diagnosticum. When monitoring specificity, it was found that there was no cross-reaction with salmonella and cholera sera, and with tularemia, a cross-reaction of up to ¼ titer of the diagnosticum was observed, which meets the requirements of regulatory documents for these types of diagnosticums. The possibility of practical application of the invention is illustrated by examples of its specific implementation using the set of claimed features.
Пример 1. Разработка способа получения бруцеллезного латексного диагностикума для реакции агглютинации с бруцеллезным антигеном В. abortus 19 ВА в соотношении 1:2.Example 1. Development of a method for producing brucellosis latex diagnosticum for an agglutination reaction with the brucellosis antigen B. abortus 19 BA in a ratio of 1:2.
Для получения бруцеллезного антигенного латексного диагностикума использован полистирольный латекс для агглютинации с размером частиц 0,8 мкм. В качестве лиганда для иммобилизации применяли взвесь В. abortus 19 ВА в концентрации 2×109 м.к./мл на 12% растворе натрия хлорида, инактивированную прогреванием при 100°С в течение 60 мин с добавлением 0,5% фенола и разрушенную на гомогенизаторе ультразвуковом в течение 2 мин. В качестве антисептиков и красителей использованы бриллиантовый зеленый - до 0,004%, генцианвиолет - до 0,002% концентрации. Латекс (2%) и антиген смешивали в объемном соотношении 1:2. Смесь инкубировали при перемешивании и температуре 37°С в течение 2 час и 12-16 час в холодильнике, при температуре 4°С. Далее центрифугировали при 5000 об/мин в течение 10 мин, дважды отмывали от несвязавшегося антигена 0,1 М ФСБ, рН 7,2-7,4 и последний осадок ресуспендировали в 0,1% растворе желатина до 0,2% концентрации. Для стабилизации и возможности хранения длительное время вносили формалин до 0,1% концентрации. При постановке РАЛ в микропланшете чувствительность составила 1:1600, при отсутствии перекрестных реакций с холерной и сальмонеллезной сыворотками и до ¼ титра диагностикума с туляремийной, что соответствует нормативной документации на данные препараты и может быть использовано в работе.To obtain a brucellosis antigenic latex diagnosticum, polystyrene latex was used for agglutination with a particle size of 0.8 microns. A suspension of B. abortus 19 BA was used as a ligand for immobilization at a concentration of 2 × 10 9 m.c./ml in a 12% sodium chloride solution, inactivated by heating at 100°C for 60 min with the addition of 0.5% phenol and destroyed on an ultrasonic homogenizer for 2 minutes. Brilliant green - up to 0.004%, gentian violet - up to 0.002% concentration were used as antiseptics and dyes. Latex (2%) and antigen were mixed in a volume ratio of 1:2. The mixture was incubated with stirring and a temperature of 37°C for 2 hours and 12-16 hours in a refrigerator at a temperature of 4°C. Next, it was centrifuged at 5000 rpm for 10 minutes, washed twice from unbound antigen with 0.1 M PBS, pH 7.2-7.4, and the last sediment was resuspended in a 0.1% gelatin solution to a 0.2% concentration. For stabilization and storage for a long time, formaldehyde was added to a concentration of 0.1%. When performing RAL in a microplate, the sensitivity was 1:1600, in the absence of cross-reactions with cholera and salmonella sera and up to ¼ titer of the diagnosticum with tularemia, which corresponds to the regulatory documentation for these drugs and can be used in work.
Пример 2. Разработка способа получения бруцеллезного латексного диагностикума для реакции агглютинации с бруцеллезным антигеном В. abortus 19 ВА в соотношении 1:1.Example 2. Development of a method for producing brucellosis latex diagnosticum for an agglutination reaction with the brucellosis antigen B. abortus 19 BA in a 1:1 ratio.
Получали диагностикум аналогично примеру 1, только с одним отличием -латекс иммобилизовали с бруцеллезным антигеном в соотношении 1:1. При этом чувствительность составила 1:1600.The diagnosticum was prepared similarly to example 1, with only one difference - the latex was immobilized with brucellosis antigen in a 1:1 ratio. In this case, the sensitivity was 1:1600.
Таким образом, целесообразней использовать приготовление диагностикума по примеру 2, исключая излишний перерасход антигена.Thus, it is more expedient to use the preparation of diagnosticum according to example 2, excluding unnecessary waste of antigen.
Используемая литератураUsed Books
1. G&T Polymer Technologies [Электронный ресурс]: URL http://gtpt.ru (дата обращения: 24.05.2021).1. G&T Polymer Technologies [Electronic resource]: URL http://gtpt.ru (access date: 05/24/2021).
2. Способ изготовления R-бруцеллезного эритроцитарного антигена для реакции непрямой гемагглютинации (РИГА): пат. 2491553 Рос. Федерация. №2011140108/15 / Карлова М.Ю., Дегтяренко Л.В.; заявл. 03.10.2011; опубл. 27.08.2013, Бюл. №24. 7 с.2. Method of manufacturing R-brucellosis erythrocyte antigen for the indirect hemagglutination reaction (RIHA): Pat. 2491553 Ross. Federation. No. 2011140108/15 / Karlova M.Yu., Degtyarenko L.V.; application 03.10.2011; publ. 08/27/2013, Bulletin. No. 24. 7 p.
3. Способ дифференциальной диагностики бруцеллеза: пат. 2490647 Рос. Федерация. №2009144376/10 / Юдин В.И., Козлов В.Е., Безгин В.М., Скляров О.Д.; заявл. 30.11.2009; опубл. 20.08.2013, Бюл. №23. 9 с.3. Method for differential diagnosis of brucellosis: Pat. 2490647 Ross. Federation. No. 2009144376/10 / Yudin V.I., Kozlov V.E., Bezgin V.M., Sklyarov O.D.; application November 30, 2009; publ. 08/20/2013, Bulletin. No. 23. 9 p.
4. Иммунодиагностикум на основе полистирольного латекса: пат. 2231366 Рос. Федерация. №2002113997/14 / Леонова В.Б., Розенфельд М.А.; заявл. 29.05.2002; опубл. 27.06.2004, Бюл. №18. 8 с.4. Immunodiagnosticum based on polystyrene latex: patent. 2231366 Ross. Federation. No. 2002113997/14 / Leonova V.B., Rosenfeld M.A.; application 05/29/2002; publ. 06/27/2004, Bulletin. No. 18. 8 p.
Claims (1)
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2798124C1 RU2798124C1 (en) | 2023-06-15 |
| RU2798124C9 true RU2798124C9 (en) | 2023-09-08 |
Family
ID=
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2231366C2 (en) * | 2002-05-29 | 2004-06-27 | Институт биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН | Polystyrene latex-base immunodiagnosticum |
| RU2270449C1 (en) * | 2004-07-15 | 2006-02-20 | Татьяна Петровна Лобова | Method for production of latex diagnosticum for latex-agglutination reaction |
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2231366C2 (en) * | 2002-05-29 | 2004-06-27 | Институт биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН | Polystyrene latex-base immunodiagnosticum |
| RU2270449C1 (en) * | 2004-07-15 | 2006-02-20 | Татьяна Петровна Лобова | Method for production of latex diagnosticum for latex-agglutination reaction |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| ROUSHDY C.M. et al. "Latex agglutination: A rapid, specific immunoassay for diagnosis of ruminant Brucellosis"; Advances in animal and veterinary sciences, 2021, v. 9 (9), p. 1292-1301. MINGSONG ZHU et al. "A highly sensitive dual-color lateral flow immunoassay for brucellosis using one-step synthesized microspheres"; Analytical methods, 2019, N 11, p.2937-2942. ЖАРИКОВА И.В. "Методологические подходы и разработка биотехнологии иммунологических препаратов для диагностики инфекции особо опасных заболеваний и детекции их возбудителей"; Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук, 2004, Ставрополь с.1-40. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US3915805A (en) | Quantitative detection of endotoxin in biological fluids | |
| CN108593641B (en) | Kit and method for quantitatively detecting substance to be detected in whole blood sample | |
| CN105717033B (en) | A kind of method of flow cytometer quantitative detection of protein concentration | |
| US4711841A (en) | Method for determining one or more antigens in a sample | |
| RU2012888C1 (en) | Method of producing latex diagnosticum | |
| Ellis et al. | Diagnostic particle agglutination using ultrasound: a new technology to rejuvenate old microbiological methods | |
| RU2798124C9 (en) | Method of obtaining brucellosis polystyrene latex diagnosticum | |
| JPH0795065B2 (en) | Water-insoluble reagent, element containing the same and method of using the same | |
| CN106198962B (en) | Method for blocking biomagnetic beads | |
| EP2126576B1 (en) | Reagent for detection of analyte and processes thereof | |
| AU2017321642B2 (en) | Antibody measurement method using antigen-carrying insoluble carrier particles on which antigen is immobilized by different methods, and reagent for antibody measurement | |
| RU2798124C1 (en) | Method of obtaining brucellosis polystyrene latex diagnosticum | |
| Prathapan et al. | Surface engineering of transparent cellulose nanocrystal coatings for biomedical applications | |
| US5093235A (en) | Immuno-dye reagent and assay for detection of endotoxin | |
| RU2200327C2 (en) | Method for diagnostics of syphilis (variants) | |
| JP2000088854A (en) | High sensitive immunological detection measuring method for microorganism (bacteria, fungus, virus, producing substance) and quantitative method | |
| EP0134868A1 (en) | Unicellular organisms activated by glutaraldehyde as solid carriers for sensitizing agents and uses of sensitized unicellular organisms | |
| RU2777803C1 (en) | Method for obtaining latex diagnostic antigens for the detection of antibodies against pathogens of brucellosis, tularemia | |
| Nielsen et al. | Haemolysis in gel test for detecting bovine antibodies to Brucella abortus lipopolysaccharide | |
| RU2113172C1 (en) | Method to conduct immunological express diagnostics of toxic types of diphtheritic infections | |
| RU2815784C1 (en) | Method of producing polycaprolactone-based immunosorbent for isolating chlamydial immunoglobulins | |
| Sobanski et al. | Detection of meningococcal antigen by latex agglutination | |
| JP3618797B2 (en) | Immunoassay | |
| JPH07270423A (en) | Production of immunologically diagnosing medicine | |
| RU2282192C1 (en) | Method of preparing diagnosticum to reveal diphtheria toxin |