RU2781833C1 - Method for producing double-stranded ribonucleic acid from saccharomyces cerevisiae yeast cells - Google Patents
Method for producing double-stranded ribonucleic acid from saccharomyces cerevisiae yeast cells Download PDFInfo
- Publication number
- RU2781833C1 RU2781833C1 RU2022122492A RU2022122492A RU2781833C1 RU 2781833 C1 RU2781833 C1 RU 2781833C1 RU 2022122492 A RU2022122492 A RU 2022122492A RU 2022122492 A RU2022122492 A RU 2022122492A RU 2781833 C1 RU2781833 C1 RU 2781833C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- solution
- dsrna
- concentration
- suspension
- precipitate
- Prior art date
Links
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 title claims abstract description 51
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 title claims abstract description 43
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 30
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 title claims abstract description 8
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims abstract description 165
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 147
- KWGKDLIKAYFUFQ-UHFFFAOYSA-M lithium chloride Chemical compound [Li+].[Cl-] KWGKDLIKAYFUFQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims abstract description 108
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims abstract description 96
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 76
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 76
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 claims abstract description 68
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims abstract description 40
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims abstract description 38
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 claims abstract description 27
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims abstract description 24
- 230000003544 deproteinization Effects 0.000 claims abstract description 23
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims abstract description 22
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 21
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims abstract description 19
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 24
- ZXEKIIBDNHEJCQ-UHFFFAOYSA-N isobutanol Chemical compound CC(C)CO ZXEKIIBDNHEJCQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N N-Butanol Chemical compound CCCCO LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 7
- BDERNNFJNOPAEC-UHFFFAOYSA-N propan-1-ol Chemical compound CCCO BDERNNFJNOPAEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims description 3
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M Chloride anion Chemical compound [Cl-] VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 2
- WHXSMMKQMYFTQS-UHFFFAOYSA-N Lithium Chemical compound [Li] WHXSMMKQMYFTQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 229910052744 lithium Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 abstract description 22
- 239000000047 product Substances 0.000 abstract description 19
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 abstract description 13
- 230000006378 damage Effects 0.000 abstract description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 4
- 238000000926 separation method Methods 0.000 abstract description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 4
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 description 83
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 36
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 19
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 18
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 11
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 10
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 9
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 7
- 230000008569 process Effects 0.000 description 7
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 6
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 6
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 6
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 6
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 6
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 6
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 6
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 6
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 5
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 5
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 5
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 5
- 239000008213 purified water Substances 0.000 description 5
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- -1 but not limited to Chemical compound 0.000 description 4
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 4
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 3
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 3
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 125000000484 butyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 3
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 description 3
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 3
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 3
- 125000001436 propyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 3
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 3
- BAVYZALUXZFZLV-UHFFFAOYSA-N Methylamine Chemical compound NC BAVYZALUXZFZLV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 239000000138 intercalating agent Substances 0.000 description 2
- 238000009830 intercalation Methods 0.000 description 2
- 230000002687 intercalation Effects 0.000 description 2
- PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N isoamylol Chemical compound CC(C)CCO PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000000959 isobutyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(C([H])([H])[H])C([H])([H])* 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 2
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 2
- OBETXYAYXDNJHR-SSDOTTSWSA-M (2r)-2-ethylhexanoate Chemical compound CCCC[C@@H](CC)C([O-])=O OBETXYAYXDNJHR-SSDOTTSWSA-M 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 239000008118 PEG 6000 Substances 0.000 description 1
- 229920002584 Polyethylene Glycol 6000 Polymers 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L Sodium Sulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=O PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000001476 alcoholic effect Effects 0.000 description 1
- OBETXYAYXDNJHR-UHFFFAOYSA-N alpha-ethylcaproic acid Natural products CCCCC(CC)C(O)=O OBETXYAYXDNJHR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000002924 anti-infective effect Effects 0.000 description 1
- 229940124599 anti-inflammatory drug Drugs 0.000 description 1
- 230000003110 anti-inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 1
- 229940124350 antibacterial drug Drugs 0.000 description 1
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 1
- 229940041181 antineoplastic drug Drugs 0.000 description 1
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000003086 colorant Substances 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 230000007123 defense Effects 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 229940124622 immune-modulator drug Drugs 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 229940035429 isobutyl alcohol Drugs 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 239000012266 salt solution Substances 0.000 description 1
- 238000005185 salting out Methods 0.000 description 1
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 1
- 238000003998 size exclusion chromatography high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 229910001415 sodium ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910052938 sodium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011152 sodium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 108010082737 zymolyase Proteins 0.000 description 1
Images
Abstract
Description
Изобретение относится к области биотехнологии и фармацевтической промышленности и представляет собой новый способ получения двуспиральной рибонуклеиновой кислоты (дсРНК) из биомассы дрожжей Saccharomyces cerevisiae и может быть использовано в фармацевтике и биотехнологии для производства противоинфекционных и иммуномодулирующих препаратов.The invention relates to the field of biotechnology and the pharmaceutical industry and is a new method for obtaining double-stranded ribonucleic acid (dsRNA) from the biomass of the yeast Saccharomyces cerevisiae and can be used in pharmaceuticals and biotechnology for the production of anti-infective and immunomodulatory drugs.
Природные двуспиральные РНК (дсРНК) являются одними из важнейших медиаторов, обеспечивающих индукцию интерферона (IFN) в ответ на вирусную инфекцию в организме [1], при этом дсРНК вызывают индукцию всех типов интерферона, включая интерферон-дельта, обладают противовирусным действием в отношении различных видов вирусов. Таким образом, с точки зрения терапевтического потенциала дсРНК являются перспективным объектом для создания на их основе противовирусных, антибактериальных, противовоспалительных и противоопухолевых препаратов, а также средств для повышения неспецифической защитной реакции и снижения восприимчивости организма к действию патогенных агентов различной природы [2]. Источниками дсРНК могут являться РНК-содержащие вирусы растений и животных, а также некоторые микромицеты и дрожжи, в частности, так называемые «киллерные» штаммы вида Saccharomyces cerevisiae [3]. Natural double-stranded RNA (dsRNA) are one of the most important mediators that provide the induction of interferon (IFN) in response to a viral infection in the body [1]. viruses. Thus, from the point of view of the therapeutic potential, dsRNAs are a promising object for the creation of antiviral, antibacterial, anti-inflammatory, and antitumor drugs on their basis, as well as agents for increasing the nonspecific defense reaction and reducing the body's susceptibility to the action of pathogenic agents of various nature [2]. Sources of dsRNA can be RNA-containing viruses of plants and animals, as well as some micromycetes and yeasts, in particular, the so-called "killer" strains of the species Saccharomyces cerevisiae [3].
Несмотря на большой интерес к природной дсРНК, описанные в уровне техники способы ее получения недостаточно эффективны и требуют совершенствования.Despite the great interest in natural dsRNA, the methods for its preparation described in the prior art are not effective enough and require improvement.
Из уровня техники известен способ выделения дсРНК из клеток дрожжей, который заключается в последовательном применении 2-этилгексановой кислоты и додецилсульфата натрия при оптимальном температурном режиме для разрушения клеток Saccharomyces cerevisiae с последующим дробным фракционированием экстрагированных нуклеиновых кислот хлористым литием и дополнительной депротеинизации конечного продукта [4]. From the prior art, a method for isolating dsRNA from yeast cells is known, which consists in the sequential use of 2-ethylhexanoic acid and sodium dodecyl sulfate at the optimum temperature for the destruction of Saccharomyces cerevisiae cells, followed by fractional fractionation of the extracted nucleic acids with lithium chloride and additional deproteinization of the final product [4].
Также известен способ получения дсРНК из клеток дрожжей, охарактеризованный следующими стадиями: суспендирование клеток в буфере при 25оС при перемешивании в течение 60 мин; добавление хлороформа до 25% и перемешивание в течение 30 мин; центрифугирование; сбор водной фазы. Для получения препарата суммарной РНК для осаждения была выбрана концентрация соли 3,5 М. Полученный высаливанием 3,5 М NaCl, осадок дважды промывали 3,5 М раствором соли и растворяли в воде. Раствор осветляли центрифугированием и фильтровали, проводили осаждение РНК этанолом до концентрации 60%. Сформировавшийся осадок отделяли центрифугированием и промывали 60%-ным этанолом и лиофильно высушивали [5]. Also known is a method for obtaining dsRNA from yeast cells, characterized by the following stages: suspension of cells in buffer at 25 about C with stirring for 60 min; adding chloroform to 25% and stirring for 30 min; centrifugation; collection of the aqueous phase. A salt concentration of 3.5 M was chosen to prepare the total RNA preparation for precipitation. Obtained by salting out with 3.5 M NaCl, the precipitate was washed twice with 3.5 M salt solution and dissolved in water. The solution was clarified by centrifugation and filtered, the RNA was precipitated with ethanol to a concentration of 60%. The formed precipitate was separated by centrifugation, washed with 60% ethanol, and freeze-dried [5].
Недостатками указанных способов является низкие выход и чистота целевого продукта (дсРНК) в следствии использования исключительно химических реагентов для выделения РНК из клеток дрожжей.The disadvantages of these methods are the low yield and purity of the target product (dsRNA) due to the use of exclusively chemical reagents for the isolation of RNA from yeast cells.
Известен способ получения дсРНК из киллерных штаммов дрожжей Saccharomyces cerevisiae ВКПМ Y-448, который включает выделение из экстракта клеток двуспиральной РНК двойным фракционированием нуклеиновых кислот хлористым литием (1 этап: добавляют литий хлористый до конечной концентрации 2 М в целевом растворе; 2 этап: добавляют литий хлористый до концентрации 4 М в целевом растворе), очистку двуспиральной РНК хлороформом или смесью хлороформа с изоамиловым спиртом, выделение целевого продукта этанолом [6].A known method for obtaining dsRNA from killer strains of the yeast Saccharomyces cerevisiae VKPM Y-448, which includes the isolation of double-stranded RNA cells from an extract of cells by double fractionation of nucleic acids with lithium chloride (stage 1: lithium chloride is added to a final concentration of 2 M in the target solution; stage 2: lithium is added chloride to a concentration of 4 M in the target solution), purification of double-stranded RNA with chloroform or a mixture of chloroform with isoamyl alcohol, isolation of the target product with ethanol [6].
Также известен способ получения двуспиральной РНК (дсРНК) из клеток дрожжей Saccharomyces cerevisiae штамма ВКПМ Y-448 [7], характеризующийся тем, что включает следующие стадии: клетки дрожжей разрушают в буфере. Далее проводят концентрирование дсРНК из надосадочной жидкости в 7-8%-ном растворе ПЭГ 6000 с последующим центрифугированием и растворением полученного осажденного концентрата в воде; отделение дсРНК осуществляют в 2 моль/л растворе хлорида лития с последующим центрифугированием смеси и сбором водной фазы; осаждение дсРНК из водной фазы проводят в 3,5 моль/л растворе хлорида лития с последующим центрифугированием с получением осадка и растворением его в воде, а окончательную очистку и осаждение дсРНК из раствора осуществляют 55% раствором этанола. Also known is a method for obtaining double-stranded RNA (dsRNA) from yeast cells Saccharomyces cerevisiae strain VKPM Y-448 [7], characterized in that it includes the following steps: yeast cells are destroyed in buffer. Next, dsRNA is concentrated from the supernatant in a 7-8% PEG 6000 solution, followed by centrifugation and dissolution of the resulting precipitated concentrate in water; separation of dsRNA is carried out in a 2 mol/l solution of lithium chloride, followed by centrifugation of the mixture and collection of the aqueous phase; precipitation of dsRNA from the aqueous phase is carried out in a 3.5 mol/l solution of lithium chloride, followed by centrifugation to obtain a precipitate and dissolve it in water, and the final purification and precipitation of dsRNA from the solution is carried out with a 55% ethanol solution.
Недостатки указанного способа состоят в том, что при разрушении клеточных стенок используется исключительно химический способ без применения дополнительной стадии механической обработки клеток, при этом температура инкубирования на стадии разрушения клеток не меняется и всегда постоянна (что выражается в снижении выхода целевого продукта). Период концентрирования РНК из надосадочной жидкости непродолжительный (что также характерно и для стадии отделения высокополимерной РНК от дсРНК) и не предполагает использование этанола в качестве концентрирующего агента. Помимо этого, стадия фракционирования предполагает всего один этап (т.е. снижается качество очистки дсРНК от низкомолекулярных примесей), аналогично стадия итогового осаждения дсРНК из раствора включает этап осаждения этанолом только в конкретной концентрации – 55%, что также сказывается на выходе и чистоте целевого продукта. Таким образом, все вышеуказанные недостатки данного способа могут снижать выход и чистоту целевого продукта – дсРНК.The disadvantages of this method are that only a chemical method is used for the destruction of cell walls without the use of an additional stage of cell mechanical treatment, while the incubation temperature at the stage of cell destruction does not change and is always constant (which is expressed in a decrease in the yield of the target product). The period of RNA concentration from the supernatant is short (which is also characteristic of the stage of separation of high polymer RNA from dsRNA) and does not imply the use of ethanol as a concentrating agent. In addition, the fractionation stage involves only one stage (i.e., the quality of dsRNA purification from low molecular weight impurities decreases), similarly, the stage of final precipitation of dsRNA from solution includes the stage of precipitation with ethanol only at a specific concentration - 55%, which also affects the yield and purity of the target product. Thus, all the above disadvantages of this method can reduce the yield and purity of the target product, dsRNA.
Задачей настоящего изобретения является получение дсРНК из клеток киллерного штамма дрожжей Saccharomyces cerevisiae с увеличенными выходом и чистотой целевого продукта.The objective of the present invention is to obtain dsRNA from the cells of the killer yeast strain Saccharomyces cerevisiae with increased yield and purity of the target product.
Техническим результатом является создание комплексного способа получения дсРНК с увеличенными выходом и чистотой целевого продукта (дсРНК) в среднем примерно в 2 раза. The technical result is the creation of a complex method for obtaining dsRNA with increased yield and purity of the target product (dsRNA) by an average of about 2 times.
Ниже приведены термины, которые используются в описании настоящего изобретения. Если не указано иное, все технические и специальные термины, использованные в описании, имеют общепринятое в данной области техники значение.Below are the terms that are used in the description of the present invention. Unless otherwise indicated, all technical and technical terms used in the description have the meaning generally accepted in the art.
Термин «двуспиральная РНК (дсРНК)» в контексте настоящего изобретения характеризует молекулу РНК, состоящую из двух комплементарных цепей.The term "double-stranded RNA (dsRNA)" in the context of the present invention characterizes an RNA molecule consisting of two complementary strands.
Термин «высокополимерная РНК» (впРНК) в контексте настоящего изобретения характеризует все возможные отличные от дсРНК виды молекул РНК (например, мРНК, тРНК и др). The term "high polymer RNA" (vrRNA) in the context of the present invention characterizes all possible types of RNA molecules other than dsRNA (for example, mRNA, tRNA, etc.).
«Суммарная РНК» в контексте настоящего изобретения – это суммарное количество всей полученной РНК в процессе выделения дсРНК из клеток киллерных дрожжей Saccharomyces cerevisiae, которая может включать, как высокополимерную РНК и двуспиральную РНК."Total RNA" in the context of the present invention is the total amount of all RNA obtained during the isolation of dsRNA from cells of the killer yeast Saccharomyces cerevisiae , which may include both high polymer RNA and double stranded RNA.
Термин «биомасса» в контексте настоящего изобретения относится к совокупной массе клеток киллерного штамма дрожжей Saccharomyces cerevisiae, отделенных в процессе центрифугирования от супернатанта культуральной жидкости, полученной в результате культивирования, в том числе, в качалочных колбах или биореакторах. (например, при культивировании батарейным способом). The term "biomass" in the context of the present invention refers to the total mass of cells of the killer yeast strain Saccharomyces cerevisiae , separated by centrifugation from the supernatant of the culture liquid obtained as a result of cultivation, including in shake flasks or bioreactors. (for example, when cultivating in a battery way).
Термин «одноатомный спирт» в контексте настоящего изобретения относится к спиртам, в составе молекулы которых содержится одна гидроксильная группа (например, метанол, этанол, пропанол и т.п.).The term "monohydric alcohol" in the context of the present invention refers to alcohols, which contain one hydroxyl group in the molecule (for example, methanol, ethanol, propanol, etc.).
Термин «прецепитация» относится к процессу осаждения РНК одноатомным спиртом, в том числе, не ограничиваясь указанным, этанолом. Способ широко используется для очистки и концентрирования молекул нуклеиновых кислот. Эффект достигается за счет добавления соли и спирта в раствор, содержащий РНК. В присутствии соли (в частности, одновалентных катионов, таких как, например, ионы натрия (Na+)) спирты эффективно осаждает нуклеиновые кислоты. The term "precipitation" refers to the process of precipitation of RNA with a monohydric alcohol, including, but not limited to, ethanol. The method is widely used for the purification and concentration of nucleic acid molecules. The effect is achieved by adding salt and alcohol to a solution containing RNA. In the presence of a salt (in particular monovalent cations such as, for example, sodium ions (Na + )) alcohols effectively precipitate nucleic acids.
Термин «фракционирование» в рамках настоящего изобретения характеризует процесс очистки осадка дсРНК от примесей (в основном высокополимерных РНК и ДНК, белков).The term "fractionation" in the framework of the present invention characterizes the process of purification of the dsRNA precipitate from impurities (mainly high-polymer RNA and DNA, proteins).
Термин «ресуспендирование» относится к процессу растворения осадка, полученного в результате центрифугирования после отделения от супернатаната, в определенном объеме указанного раствора. The term "resuspension" refers to the process of dissolving the precipitate obtained as a result of centrifugation after separation from the supernatant, in a certain volume of the specified solution.
Термин «депротеинизация» относится к процессу удаления белковых примесей путем их осаждения, в рамках настоящего изобретения, например, не ограничиваясь указанным, хлороформом, этанолом, ацетоном, ацетонитрилом или метанолом. The term "deproteinization" refers to the process of removing protein impurities by precipitation, in the context of the present invention, for example, but not limited to chloroform, ethanol, acetone, acetonitrile or methanol.
В контексте настоящего изобретения «96 % раствор одноатомного спирта» означает водно-спиртовой раствор с относительным содержанием одноатомного спирта от 95,1 % до 96,9 % (или об., или об/об %) от общего объема водного-спиртового раствора.In the context of the present invention, "96% monohydric alcohol solution" means a water-alcohol solution with a relative content of monohydric alcohol from 95.1% to 96.9% (or v/v%) of the total volume of the aqueous-alcoholic solution.
Термин «об. %» в контексте настоящего изобретения означает объёмную концентрацию (долю) некоторого жидкого вещества в растворителе (т.е. соотношение объема растворенного вещества к объему раствора, выраженное в процентах - об. %).The term "about %" in the context of the present invention means the volume concentration (share) of some liquid substance in the solvent (i.e. the ratio of the volume of the solute to the volume of the solution, expressed as a percentage - vol.%).
В контексте настоящего изобретения термин «пн» означает количество комплементарных пар нуклеотидов.In the context of the present invention, the term "mon" means the number of complementary base pairs.
Поставленная задача решается, а заявленный технический результат достигается за счет нового способа получения двуспиральной РНК из клеток дрожжей киллерного штамма Saccharomyces cerevisiae, характеризующегося тем, что клетки дрожжей подвергают разрушению, центрифугируют, отделяют надосадочную жидкость и прецепитируют суммарную РНК, осадок отделяют и при перемешивании добавляют воду и хлорид натрия, отстаивают и центрифугируют, в полученный супернатант добавляют одноатомный спирт, чтобы его концентрация составила 40 об. % в целевом растворе, инкубируют и центрифугируют, к осадку при перемешивании добавляют буферный раствор и фракционируют раствором лития хлорида в две последовательные стадии: на первой стадии добавляют раствор хлорида лития до его концентрации в суспензии 2 М, на второй стадии до его концентрации в суспензии 4 М, полученную суспензию центрифугируют для отделения осадка и повторяют последовательное фракционирование раствором лития хлорида в две стадии, полученную суспензию центрифугируют и ресуспендируют в буферном растворе, далее дважды проводят депротеинизацию хлороформом и осаждают дсРНК из суспензии раствором одноатомного спирта до достижения его концентрации в целевом растворе 75 об. %, полученный осадок дважды промывают 96 об. % раствором одноатомного спирта.The problem is solved, and the claimed technical result is achieved by a new method for obtaining double-stranded RNA from yeast cells of the killer strain Saccharomyces cerevisiae , characterized in that the yeast cells are destroyed, centrifuged, the supernatant is separated and the total RNA is precipitated, the precipitate is separated and water is added with stirring and sodium chloride, defend and centrifuge, monohydric alcohol is added to the resulting supernatant so that its concentration is 40 vol. % in the target solution, incubated and centrifuged, a buffer solution is added to the precipitate with stirring and fractionated with a solution of lithium chloride in two successive stages: at the first stage, a solution of lithium chloride is added to its concentration in the suspension of 2 M, at the second stage, to its concentration in the suspension of 4 M, the resulting suspension is centrifuged to separate the precipitate and sequential fractionation is repeated with a solution of lithium chloride in two stages, the resulting suspension is centrifuged and resuspended in a buffer solution, then deproteinization is carried out twice with chloroform and dsRNA is precipitated from the suspension with a monohydric alcohol solution until its concentration in the target solution is 75 vol. . %, the resulting precipitate is washed twice with 96 vol. % solution of monohydric alcohol.
Одним из вариантов исполнения настоящего изобретения является способ получения дсРНК из клеток дрожжей киллерного штамма Saccharomyces cerevisiae, в котором используют дрожжи киллерного штамма Saccharomyces cerevisiae ВКПМ Y448.One of the embodiments of the present invention is a method for obtaining dsRNA from cells of the yeast killer strain Saccharomyces cerevisiae , which uses the yeast killer strain Saccharomyces cerevisiae VKPM Y448.
Поставленная задача решается, а заявленный технический результат достигается за счет нового способа получения двуспиральной РНК из клеток дрожжей киллерного штамма Saccharomyces cerevisiae ВКПМ Y448, характеризующегося тем, что клетки дрожжей подвергают разрушению, центрифугируют, отделяют надосадочную жидкость и прецепитируют суммарную РНК, осадок отделяют и при перемешивании добавляют воду и хлорид натрия, отстаивают и центрифугируют, в полученный супернатант добавляют одноатомный спирт, чтобы его концентрация составила 40 об. % в целевом растворе, инкубируют и центрифугируют, к осадку при перемешивании добавляют буферный раствор и фракционируют раствором лития хлорида в две последовательные стадии: на первой стадии добавляют раствор хлорида лития до его концентрации в суспензии 2 М, на второй стадии до его концентрации в суспензии 4 М, полученную суспензию центрифугируют для отделения осадка и повторяют последовательное фракционирование раствором лития хлорида в две стадии, полученную суспензию центрифугируют и ресуспендируют в буферном растворе, далее дважды проводят депротеинизацию хлороформом и осаждают дсРНК из суспензии раствором одноатомного спирта до достижения его концентрации в целевом растворе 75 об. %, полученный осадок дважды промывают 96 об. % раствором одноатомного спирта.The problem is solved, and the claimed technical result is achieved through a new method for obtaining double-stranded RNA from yeast cells of the killer strain Saccharomyces cerevisiae VKPM Y448, characterized in that the yeast cells are destroyed, centrifuged, the supernatant is separated and the total RNA is precipitated, the precipitate is separated and with stirring water and sodium chloride are added, settled and centrifuged, monohydric alcohol is added to the resulting supernatant so that its concentration is 40 vol. % in the target solution, incubated and centrifuged, a buffer solution is added to the precipitate with stirring and fractionated with a solution of lithium chloride in two successive stages: at the first stage, a solution of lithium chloride is added to its concentration in the suspension of 2 M, at the second stage, to its concentration in the suspension of 4 M, the resulting suspension is centrifuged to separate the precipitate and sequential fractionation is repeated with a solution of lithium chloride in two stages, the resulting suspension is centrifuged and resuspended in a buffer solution, then deproteinization is carried out twice with chloroform and dsRNA is precipitated from the suspension with a monohydric alcohol solution until its concentration in the target solution is 75 vol. . %, the resulting precipitate is washed twice with 96 vol. % solution of monohydric alcohol.
Поставленная задача решается, а заявленный технический результат достигается за счет нового способа получения двуспиральной РНК из клеток дрожжей киллерного штамма Saccharomyces cerevisiae ВКПМ Y448, характеризующегося тем, что клетки дрожжей подвергают разрушению, центрифугируют, отделяют надосадочную жидкость и прецепитируют суммарную РНК, осадок отделяют и при перемешивании добавляют воду и хлорид натрия, отстаивают и центрифугируют, в полученный супернатант добавляют одноатомный спирт, чтобы его концентрация составила 40 об. % в целевом растворе, инкубируют и центрифугируют, к осадку при перемешивании добавляют буферный раствор и фракционируют раствором лития хлорида в две последовательные стадии: на первой стадии добавляют раствор хлорида лития до его концентрации в суспензии 2 М, на второй стадии до его концентрации в суспензии 4 М, полученную суспензию центрифугируют для отделения осадка и повторяют последовательное фракционирование раствором лития хлорида в две стадии, полученную суспензию центрифугируют и ресуспендируют в буферном растворе, далее дважды проводят депротеинизацию хлороформом и осаждают дсРНК из суспензии раствором одноатомного спирта до достижения его концентрации в целевом растворе 75 об. %, полученный осадок дважды промывают 96 % раствором одноатомного спирта.The problem is solved, and the claimed technical result is achieved through a new method for obtaining double-stranded RNA from yeast cells of the killer strain Saccharomyces cerevisiae VKPM Y448, characterized in that the yeast cells are destroyed, centrifuged, the supernatant is separated and the total RNA is precipitated, the precipitate is separated and with stirring water and sodium chloride are added, settled and centrifuged, monohydric alcohol is added to the resulting supernatant so that its concentration is 40 vol. % in the target solution, incubated and centrifuged, a buffer solution is added to the precipitate with stirring and fractionated with a solution of lithium chloride in two successive stages: at the first stage, a solution of lithium chloride is added to its concentration in the suspension of 2 M, at the second stage, to its concentration in the suspension of 4 M, the resulting suspension is centrifuged to separate the precipitate and sequential fractionation is repeated with a solution of lithium chloride in two stages, the resulting suspension is centrifuged and resuspended in a buffer solution, then deproteinization is carried out twice with chloroform and dsRNA is precipitated from the suspension with a monohydric alcohol solution until its concentration in the target solution is 75 vol. . %, the resulting precipitate is washed twice with a 96% solution of monohydric alcohol.
Поставленная задача решается, а заявленный технический результат достигается за счет нового способа получения двуспиральной рибонуклеиновой кислоты (дсРНК) из клеток дрожжей киллерного штамма Saccharomyces cerevisiae ВКПМ Y448, характеризующегося тем, что клетки дрожжей подвергают разрушению, центрифугируют, отделяют надосадочную жидкость и прецепитируют суммарную РНК, осадок отделяют и при перемешивании добавляют воду и хлорид натрия, отстаивают и центрифугируют, в полученный супернатант добавляют одноатомный спирт, чтобы его концентрация составила 40 об. % в целевом растворе, инкубируют и центрифугируют, к осадку при перемешивании добавляют буферный раствор и фракционируют раствором лития хлорида в две последовательные стадии: на первой стадии добавляют раствор хлорида лития до достижения его концентрации в суспензии 2 М, на второй стадии до достижения его концентрации в суспензии 4 М, полученную суспензию центрифугируют для отделения осадка и повторяют последовательное фракционирование растворами лития хлорида в две стадии, полученную суспензию центрифугируют и ресуспендируют в буферном растворе, далее дважды проводят депротеинизацию хлороформом в соотношении целевой раствор: хлороформ от 1:2 до 1:10 по объему и осаждают дсРНК из суспензии раствором одноатомного спирта до достижения его концентрации в целевом растворе 75 об. %, полученный осадок дважды промывают 96 об. % раствором одноатомного спирта.The problem is solved, and the claimed technical result is achieved due to a new method for obtaining double-stranded ribonucleic acid (dsRNA) from yeast cells of the killer strain Saccharomyces cerevisiae VKPM Y448, characterized in that the yeast cells are destroyed, centrifuged, the supernatant is separated and the total RNA precipitate is precipitated. separated and with stirring add water and sodium chloride, settle and centrifuge, add monohydric alcohol to the resulting supernatant so that its concentration is 40 vol. % in the target solution, incubated and centrifuged, a buffer solution is added to the precipitate with stirring and fractionated with a solution of lithium chloride in two successive stages: at the first stage, a solution of lithium chloride is added until its concentration in the suspension is 2 M, at the second stage, until its concentration is reached in 4 M suspension, the resulting suspension is centrifuged to separate the precipitate and successive fractionation with lithium chloride solutions is repeated in two stages, the resulting suspension is centrifuged and resuspended in a buffer solution, then deproteinization is carried out twice with chloroform in the ratio of target solution: chloroform from 1:2 to 1:10 volume and precipitated dsRNA from a suspension with a solution of monohydric alcohol until its concentration in the target solution is 75 vol. %, the resulting precipitate is washed twice with 96 vol. % solution of monohydric alcohol.
Поставленная задача решается, а заявленный технический результат достигается за счет нового способа получения двуспиральной рибонуклеиновой кислоты (дсРНК) из клеток дрожжей киллерного штамма Saccharomyces cerevisiae ВКПМ Y448, характеризующегося тем, что клетки дрожжей подвергают разрушению, центрифугируют, отделяют надосадочную жидкость и прецепитируют суммарную РНК, осадок отделяют и при перемешивании добавляют воду и хлорид натрия, отстаивают и центрифугируют, в полученный супернатант добавляют одноатомный спирт, чтобы его концентрация составила 40 об. % в целевом растворе, инкубируют и центрифугируют, к осадку при перемешивании добавляют буферный раствор и фракционируют раствором лития хлорида в две последовательные стадии: на первой стадии добавляют раствор хлорида лития до достижения его концентрации в суспензии 2 М, на второй стадии до достижения его концентрации в суспензии 4 М, полученную суспензию центрифугируют для отделения осадка и повторяют последовательное фракционирование растворами лития хлорида в две стадии, полученную суспензию центрифугируют и ресуспендируют в буферном растворе, далее дважды проводят депротеинизацию хлороформом в соотношении целевой раствор: хлороформ от 1:2 до 1:10 по объему и осаждают дсРНК из суспензии раствором одноатомного спирта до достижения его концентрации в целевом растворе 75 об. %, полученный осадок дважды промывают 96 % раствором одноатомного спирта.The problem is solved, and the claimed technical result is achieved due to a new method for obtaining double-stranded ribonucleic acid (dsRNA) from yeast cells of the killer strain Saccharomyces cerevisiae VKPM Y448, characterized in that the yeast cells are destroyed, centrifuged, the supernatant is separated and the total RNA precipitate is precipitated. separated and with stirring add water and sodium chloride, settle and centrifuge, add monohydric alcohol to the resulting supernatant so that its concentration is 40 vol. % in the target solution, incubated and centrifuged, a buffer solution is added to the precipitate with stirring and fractionated with a solution of lithium chloride in two successive stages: at the first stage, a solution of lithium chloride is added until its concentration in the suspension is 2 M, at the second stage, until its concentration is reached in 4 M suspension, the resulting suspension is centrifuged to separate the precipitate and successive fractionation with lithium chloride solutions is repeated in two stages, the resulting suspension is centrifuged and resuspended in a buffer solution, then deproteinization is carried out twice with chloroform in the ratio of target solution: chloroform from 1:2 to 1:10 volume and precipitated dsRNA from a suspension with a solution of monohydric alcohol until its concentration in the target solution is 75 vol. %, the resulting precipitate is washed twice with a 96% solution of monohydric alcohol.
Поставленная задача решается, а заявленный технический результат достигается за счет нового способа получения двуспиральной рибонуклеиновой кислоты (дсРНК) из клеток дрожжей киллерного штамма Saccharomyces cerevisiae ВКПМ Y448, характеризующегося тем, что клетки дрожжей подвергают разрушению, центрифугируют, отделяют надосадочную жидкость и прецепитируют суммарную РНК, осадок отделяют и при перемешивании добавляют воду и хлорид натрия, отстаивают и центрифугируют, в полученный супернатант добавляют одноатомный спирт, чтобы его концентрация составила 40 об. % в целевом растворе, инкубируют и центрифугируют, к осадку при перемешивании добавляют буферный раствор и фракционируют раствором лития хлорида в две последовательные стадии: на первой стадии добавляют раствор хлорида лития до достижения его концентрации в суспензии 2 М, на второй стадии до достижения его концентрации в суспензии 4 М, полученную суспензию центрифугируют для отделения осадка и повторяют последовательное фракционирование растворами лития хлорида в две стадии, полученную суспензию центрифугируют и ресуспендируют в буферном растворе, далее дважды проводят депротеинизацию хлороформом в соотношении целевой раствор: хлороформ от 1:2 до 1:10 по объему и осаждают дсРНК из суспензии раствором одноатомного спирта до достижения его концентрации в целевом растворе 75 об. %, полученный осадок дважды промывают 96 % раствором одноатомного спирта.The problem is solved, and the claimed technical result is achieved due to a new method for obtaining double-stranded ribonucleic acid (dsRNA) from yeast cells of the killer strain Saccharomyces cerevisiae VKPM Y448, characterized in that the yeast cells are destroyed, centrifuged, the supernatant is separated and the total RNA precipitate is precipitated. separated and with stirring add water and sodium chloride, settle and centrifuge, add monohydric alcohol to the resulting supernatant so that its concentration is 40 vol. % in the target solution, incubated and centrifuged, a buffer solution is added to the precipitate with stirring and fractionated with a solution of lithium chloride in two successive stages: at the first stage, a solution of lithium chloride is added until its concentration in the suspension is 2 M, at the second stage, until its concentration is reached in 4 M suspension, the resulting suspension is centrifuged to separate the precipitate and successive fractionation with lithium chloride solutions is repeated in two stages, the resulting suspension is centrifuged and resuspended in a buffer solution, then deproteinization is carried out twice with chloroform in the ratio of target solution: chloroform from 1:2 to 1:10 volume and precipitated dsRNA from a suspension with a solution of monohydric alcohol until its concentration in the target solution is 75 vol. %, the resulting precipitate is washed twice with a 96% solution of monohydric alcohol.
Поставленная задача решается, а заявленный технический результат достигается за счет нового способа получения двуспиральной рибонуклеиновой кислоты (дсРНК) из клеток дрожжей киллерного штамма Saccharomyces cerevisiae ВКПМ Y448, характеризующегося тем, что клетки дрожжей подвергают разрушению, центрифугируют, отделяют надосадочную жидкость и прецепитируют суммарную РНК, осадок отделяют и при перемешивании добавляют воду и хлорид натрия, отстаивают и центрифугируют, в полученный супернатант добавляют одноатомный спирт, чтобы его концентрация составила 40 % в целевом растворе, инкубируют и центрифугируют, к осадку при перемешивании добавляют буферный раствор и фракционируют раствором лития хлорида в две последовательные стадии: на первой стадии добавляют раствор хлорида лития до достижения его концентрации в суспензии 2 М, на второй стадии до достижения его концентрации в суспензии 4 М, полученную суспензию центрифугируют для отделения осадка и повторяют последовательное фракционирование растворами лития хлорида в две стадии, полученную суспензию центрифугируют и ресуспендируют в буферном растворе, далее дважды проводят депротеинизацию хлороформом в соотношении целевой раствор: хлороформ от 1:2 до 1:10 по объему и осаждают дсРНК из суспензии раствором одноатомного спирта до достижения его концентрации в целевом растворе 75 %, полученный осадок дважды промывают 96 % раствором одноатомного спирта.The problem is solved, and the claimed technical result is achieved due to a new method for obtaining double-stranded ribonucleic acid (dsRNA) from yeast cells of the killer strain Saccharomyces cerevisiae VKPM Y448, characterized in that the yeast cells are destroyed, centrifuged, the supernatant is separated and the total RNA precipitate is precipitated. water and sodium chloride are separated and added with stirring, settled and centrifuged, monohydric alcohol is added to the resulting supernatant so that its concentration is 40% in the target solution, incubated and centrifuged, a buffer solution is added to the precipitate with stirring and fractionated with a solution of lithium chloride in two successive stages: at the first stage, a solution of lithium chloride is added until its concentration in the suspension reaches 2 M, at the second stage, until its concentration in the suspension reaches 4 M, the resulting suspension is centrifuged to separate the precipitate and successive fractionation is repeated solutions of lithium chloride in two stages, the resulting suspension is centrifuged and resuspended in a buffer solution, then deproteinization is carried out twice with chloroform in the ratio of the target solution: chloroform from 1:2 to 1:10 by volume and dsRNA is precipitated from the suspension with a solution of monohydric alcohol until its concentration reaches target solution of 75%, the resulting precipitate is washed twice with a 96% solution of monohydric alcohol.
Одним из вариантов исполнения настоящего изобретения является способ получения дсРНК из клеток дрожжей киллерного штамма Saccharomyces cerevisiae, в котором одноатомный спирт представляет собой метанол, этанол, пропанол, изопропанол, бутанол или изобутанол.One embodiment of the present invention is a method for producing dsRNA from Saccharomyces cerevisiae killer yeast cells, wherein the monoalcohol is methanol, ethanol, propanol, isopropanol, butanol, or isobutanol.
Более предпочтительно в способе получения дсРНК по настоящему изобретению используют в качестве одноатомного спирта этанол.More preferably, ethanol is used as the monohydric alcohol in the dsRNA preparation method of the present invention.
Одним из вариантов исполнения настоящего изобретения является способ получения дсРНК из клеток дрожжей киллерного штамма Saccharomyces cerevisiae, в котором одноатомный спирт представляет собой этанол концентрацией 96 об. %.One of the embodiments of the present invention is a method for obtaining dsRNA from cells of the killer yeast strain Saccharomyces cerevisiae , in which the monohydric alcohol is ethanol with a concentration of 96 vol. %.
Одним из вариантов исполнения настоящего изобретения является способ получения дсРНК из клеток дрожжей киллерного штамма Saccharomyces cerevisiae, в котором одноатомный спирт представляет собой этанол концентрацией 96 %.One of the embodiments of the present invention is a method for obtaining dsRNA from cells of the killer yeast strain Saccharomyces cerevisiae , in which the monohydric alcohol is ethanol with a concentration of 96%.
Одним из вариантов исполнения настоящего изобретения является способ получения дсРНК из клеток дрожжей киллерного штамма Saccharomyces cerevisiae, в котором хлорид натрия добавляют до достижения его концентрации 2,0 М в целевом растворе. One of the embodiments of the present invention is a method for obtaining dsRNA from cells of the killer yeast strain Saccharomyces cerevisiae , in which sodium chloride is added to reach its concentration of 2.0 M in the target solution.
Более предпочтительно депротеинизацию проводят хлороформом в соотношении целевой раствор (раствор, содержащий дсРНК) : хлороформ 1:2 по объему.More preferably, deproteinization is carried out with chloroform in the ratio of target solution (solution containing dsRNA): chloroform 1:2 by volume.
Одним из вариантов исполнения настоящего изобретения является способ получения дсРНК из клеток дрожжей киллерного штамма Saccharomyces cerevisiae, в котором используют водный раствор хлорида лития с концентрацией 8-10 М. One of the embodiments of the present invention is a method for obtaining dsRNA from cells of the killer yeast strain Saccharomyces cerevisiae , in which an aqueous solution of lithium chloride with a concentration of 8-10 M is used.
Более предпочтительно в способе по настоящему изобретению используют раствор хлорида лития с концентрацией 8 М.More preferably, an 8 M lithium chloride solution is used in the process of the present invention.
Одним из вариантов исполнения настоящего изобретения является способ получения дсРНК из клеток дрожжей киллерного штамма Saccharomyces cerevisiae, в котором полученную дсРНК лиофильно высушивают.One of the embodiments of the present invention is a method for obtaining dsRNA from cells of the yeast killer strain Saccharomyces cerevisiae , in which the resulting dsRNA is freeze-dried.
Краткое описание чертежей.Brief description of the drawings.
Настоящее изобретение дополнительно проиллюстрировано посредством Фиг. 1 и Фиг. 2.The present invention is further illustrated by FIG. 1 and FIG. 2.
На Фиг.1 изображена электрофореграмма образцов дсРНК, полученных путем реализации способа 1, способа 2 и способа 5:Figure 1 shows the electropherogram of dsRNA samples obtained by implementing
М – маркер молекулярной массы (маркер молекулярного веса ДНК, содержащий 13 фрагментов от 250 до 10000 п.н. (фрагменты: 250, 500, 750, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 4000, 5000, 6000, 8000, 10000 п.н.);M - molecular weight marker (molecular weight marker of DNA containing 13 fragments from 250 to 10000 bp (fragments: 250, 500, 750, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 4000, 5000, 6000, 8000, 10000 b.s.);
1 – образец, полученный способом 1;1 – sample obtained by
2 – образец, полученный способом 2;2 – sample obtained by
3 – образец, полученный способом 5.3 – sample obtained by
На Фиг. 2 изображена электрофореграмма образцов дсРНК, полученных путем реализации способов 3 и 4:On FIG. 2 shows the electropherogram of dsRNA samples obtained by implementing
М – маркер молекулярной массы (маркер молекулярного веса ДНК, содержащий 13 фрагментов от 250 до 10000 п.н. (фрагменты: 250, 500, 750, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 4000, 5000, 6000, 8000, 10000 п.н.);М – маркер молекулярной массы (маркер молекулярного веса ДНК, содержащий 13 фрагментов от 250 до 10000 п.н. (фрагменты: 250, 500, 750, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 4000, 5000, 6000, 8000, 10000 п.н.);M - molecular weight marker (molecular weight marker of DNA containing 13 fragments from 250 to 10000 bp (fragments: 250, 500, 750, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 4000, 5000, 6000, 8000, 10000 bp); M – molecular weight marker (DNA molecular weight marker containing 13 fragments from 250 to 10000 bp (fragments: 250, 500, 750, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 4000, 5000 , 6000, 8000, 10000 bp);
4 – образец, полученный способом 4;4 – sample obtained by
5 – образец, полученный способом 3.5 - sample obtained by
Подробное описание изобретения. Раскрытие сущности изобретения.Detailed description of the invention. Disclosure of the essence of the invention.
Предложенный в рамках настоящего изобретения способ получения дсРНК из клеток дрожжей киллерного штамма Saccharomyces cerevisiae, например, из ВКПМ Y-448, по одному из вариантов исполнения настоящего изобретения предусматривает следующие этапы.Proposed in the framework of the present invention, a method for obtaining dsRNA from cells of a killer yeast strainSaccharomyces cerevisiae,for example, from VKPM Y-448, according to one of the embodiments of the present invention provides for the following steps.
Клетки дрожжей киллерного штамма Saccharomyces cerevisiae ВКПМ Y-448 подвергают разрушению (механическому и/или химическому и/или ферментативному), суспензию центрифугируют, отделяют надосадочную жидкость и прецепитируют суммарную РНК. После чего осадок отделяют и при перемешивании смешивают с водой очищенной до достижения значений оптической плотности при 260 нм до 180±20 о.е./мл. Суспензию перемешивают до получения однородности в течение 6-10 ч, затем добавляют хлорид натрия до достижения его концентрации в целевом растворе 2,0 М. Раствор перемешивают, охлаждают до 5-2оС и инкубируют при этой температуре не менее 12 ч. Далее суспензию центрифугируют и определяют наличие зоны дсРНК в супернатанте.Yeast cells of the killer strain Saccharomyces cerevisiae VKPM Y-448 are destroyed (mechanically and/or chemically and/or enzymatically), the suspension is centrifuged, the supernatant is separated, and total RNA is precipitated. After that, the precipitate is separated and mixed with purified water with stirring until the optical density at 260 nm reaches 180 ± 20 o.u./ml. The suspension is stirred until homogeneous for 6-10 hours, then sodium chloride is added until its concentration in the target solution is 2.0 M. The solution is stirred, cooled to 5-2 o C and incubated at this temperature for at least 12 hours. Next, the suspension centrifuge and determine the presence of a zone of dsRNA in the supernatant.
Полученный в результате супернатант, содержащий фракцию дсРНК, собирают и отбирают пробу для определения оптической плотности при 260 нм, которая должна соответствовать значению 55±5 е.о.п. После чего в супернатант, содержащий фракцию дсРНК, добавляют одноатомный спирт, в том числе, не ограничиваясь указанным, метиловый, этиловый, пропиловый, бутиловый, изобутиловый, с концентрацией 90-96 % до достижения его концентрации в целевом растворе 40-45 об. %. Полученную суспензию перемешивают, охлаждают до 5±2 °С и отстаивают в течение не менее 12 часов. The resulting supernatant containing the dsRNA fraction is collected and a sample is taken to determine the optical density at 260 nm, which should correspond to a value of 55±5 e.o.p. After that, monohydric alcohol is added to the supernatant containing the dsRNA fraction, including, but not limited to, methyl, ethyl, propyl, butyl, isobutyl, with a concentration of 90-96% until its concentration in the target solution reaches 40-45 vol. %. The resulting suspension is stirred, cooled to 5 ± 2 °C and settled for at least 12 hours.
Сформировавшийся осадок отделяют с помощью, например, центрифугирования, после чего к осадку добавляют буферный раствор ((рН = 7,20 ± 0,05) со следующим составом: натрия хлорид – 100-300 мМ; ЭДТА – 0,5-4,0 мМ; трис(оксиметил)аминометан – 30-150 мМ). Полученную суспензию перемешивают до полного растворения осадка в течение 6,0-9,0 ч. Оптическая плотность полученного раствора дсРНК должна составлять 120±30 е.о.п. при 260 нм. The formed precipitate is separated by, for example, centrifugation, after which a buffer solution ((pH = 7.20 ± 0.05) with the following composition is added to the precipitate: sodium chloride - 100-300 mM; EDTA - 0.5-4.0 mM; tris(oxymethyl)aminomethane - 30-150 mM). The resulting suspension is stirred until the precipitate is completely dissolved for 6.0-9.0 hours. The optical density of the resulting dsRNA solution should be 120 ± 30 e.o.p. at 260 nm.
Далее в приготовленный раствор дсРНК добавляют такой объем 8 М раствора хлорида лития, чтобы концентрация хлорида лития в полученной суспензии составила 2 М. Полученную суспензию перемешивают, охлаждают до 5±2 °С и отстаивают при установленной температуре не менее 12 часов. Полученную суспензию центрифугируют для отделения супернатанта.Next, such a volume of 8 M lithium chloride solution is added to the prepared dsRNA solution so that the concentration of lithium chloride in the resulting suspension is 2 M. The resulting suspension is stirred, cooled to 5 ± 2 °C and settled at the set temperature for at least 12 hours. The resulting suspension is centrifuged to separate the supernatant.
К супернатанту, полученному на предыдущей стадии, загружают такой объем 8 М раствор хлорида лития, чтобы концентрация хлорида лития в полученной суспензии составляла 4 М. Полученный раствор перемешивают до получения однородной суспензии, охлаждают до 5±2 °С и отстаивают при установленной температуре в течение не менее 12 часов. Далее суспензию центрифугируют для отделения осадка. Супернатант утилизируют.To the supernatant obtained in the previous stage, such a volume of 8 M lithium chloride solution is loaded so that the concentration of lithium chloride in the resulting suspension is 4 M. The resulting solution is stirred until a homogeneous suspension is obtained, cooled to 5 ± 2 ° C and settled at the set temperature for at least 12 hours. Next, the suspension is centrifuged to separate the precipitate. The supernatant is discarded.
Полученный осадок отправляют на повторные стадии фракционирования 2 М и 4 М хлоридом лития. В полученном супернатанте измеряют оптическую плотность при 260 нм, которая должна соответствовать значению 8,0±5 е.о.п. The resulting precipitate is sent to repeated stages of fractionation 2 M and 4 M lithium chloride. In the resulting supernatant, the optical density is measured at 260 nm, which should correspond to a value of 8.0±5 e.o.p.
Полученный по окончании центрифугирования осадок дсРНК растворяют в буфере ((рН = 7,20± 0,05) следующего состава: натрия хлорид – 70 мМ; ЭДТА – 1мМ). Далее перемешивают полученную суспензию до гомогенного состояния в течение 2,0-4,0 ч. К полученной суспензии дсРНК добавляют хлороформ в объемном соотношении целевой раствор дсРНК : хлороформ от 1:2 до 1:10 и перемешивают до получения суспензии белого цвета в течение 15-45 мин. Полученную суспензию отстаивают при 5±2 °С в течение 1 часа. The dsRNA precipitate obtained after centrifugation is dissolved in buffer (pH = 7.20 ± 0.05) of the following composition: sodium chloride, 70 mM; EDTA, 1 mM). Next, the resulting suspension is stirred until a homogeneous state for 2.0-4.0 hours. Chloroform is added to the resulting dsRNA suspension in a volume ratio of the target dsRNA solution: chloroform from 1:2 to 1:10 and stirred until a white suspension is obtained for 15 -45 min. The resulting suspension is allowed to stand at 5±2°C for 1 hour.
После отстаивания отбирают водную верхнюю фракцию. Затем проводят повторный процесс депротеинизации раствора дсРНК при аналогичных условиях. После отстаивания отбирают водную верхнюю фракцию и измеряют оптическую плотность полученной фракции при 260 нм, которая должна соответствовать значению 75±10 е.о.п. After settling, the water upper fraction is taken. Then, a repeated process of deproteinization of the dsRNA solution is carried out under similar conditions. After settling, the aqueous upper fraction is taken and the optical density of the obtained fraction is measured at 260 nm, which should correspond to a value of 75±10 e.o.p.
Далее к раствору дсРНК загружают одноатомный спирт, например, не ограничиваясь указанным, метиловый, этиловый, пропиловый, бутиловый, изобутиловый, концентрацией 96 % до концентрации его в целевом растворе 75 об. %, охлаждают до 5±2 °С и отстаивают при данной температуре в течение не менее 12 часов. Next, monohydric alcohol is loaded to the dsRNA solution, for example, but not limited to, methyl, ethyl, propyl, butyl, isobutyl, with a concentration of 96% to its concentration in the target solution of 75 vol. %, cooled to 5±2 °C and maintained at this temperature for at least 12 hours.
По окончании отстаивания суспензию центрифугируют. К полученному спиртовому осадку дсРНК добавляют одноатомный спирт, например, не ограничиваясь указанным, метиловый, этиловый, пропиловый, бутиловый или изобутиловый, в концентрации 96 % и перемешивают полученную суспензию. Затем суспензию центрифугируют. Данную процедуру промывки одноатомным спиртом проводят дважды. After settling, the suspension is centrifuged. Monohydric alcohol, for example, but not limited to methyl, ethyl, propyl, butyl or isobutyl alcohol, is added to the resulting dsRNA alcohol precipitate at a concentration of 96% and the resulting suspension is stirred. The suspension is then centrifuged. This washing procedure with monohydric alcohol is carried out twice.
Далее полученный спиртовой осадок растворяют в воде, например, не ограничиваясь указанным, очищенной, инъекционной, до полного растворения осадка. Измеряют рН и оптическую плотность раствора при 260 нм, значение которой должно соответствовать 90±10 е.о.п. В случае, если оптическая плотность раствора больше данного значения, то значение оптической плотности в растворе доводят до заданного диапазона с помощью воды, например, не ограничиваясь указанным, очищенной, инъекционной.Next, the resulting alcohol precipitate is dissolved in water, for example, not limited to the specified, purified, injectable, until the precipitate is completely dissolved. The pH and optical density of the solution are measured at 260 nm, the value of which should correspond to 90 ± 10 e.o.p. If the optical density of the solution is greater than this value, then the value of the optical density in the solution is adjusted to a predetermined range using water, for example, not limited to the specified, purified, injectable.
Полученный водный раствор дсРНК с предыдущей стадии подвергают фильтрации с целью удаления взвешенных частиц и мутности и лиофильно высушивают.The resulting aqueous dsRNA solution from the previous step is filtered to remove suspended particles and turbidity and freeze-dried.
Список литературы.Bibliography.
1. Isaque João da Silva de Faria, Roenick Proveti Olmo, Emanuele Guimarães Silva, and João Trindade Marques.Journal of Interferon & Cytokine Research.May 2013.239-253.http://doi.org/10.1089/jir.2013.0026.1. Isaque João da Silva de Faria, Roenick Proveti Olmo, Emanuele Guimarães Silva, and João Trindade Marques. Journal of Interferon & Cytokine Research. May 2013.239-253. http://doi.org/10.1089/jir.2013.0026.
2. Yoneyama, Mitsutoshi and Takashi Fujita. “Recognition of viral nucleic acids in innate immunity.” Reviews in Medical Virology 20 (2010): n. pag.2. Yoneyama, Mitsutoshi and Takashi Fujita. “Recognition of viral nucleic acids in innate immunity.” Reviews in Medical Virology 20 (2010): n. pag.
3. Даниленко, Е. Д., Белкина, А. О., Сысоева, Г. М. (2019). Создание лекарственных препаратов на основе высокополимерных двуспиральных РНК для противовирусной и противоопухолевой терапии. Биомедицинская химия, 65(4), 282.3. Danilenko, E. D., Belkina, A. O., Sysoeva, G. M. (2019). Creation of drugs based on high-polymer double-stranded RNA for antiviral and antitumor therapy. Biomedical Chemistry, 65(4), 282.
4. Краснопольский Ю. М.: Фармацевтическая биотехнология: Производство биологически активных веществ: учеб. пособие: в 2 ч. – Ч. 2 / Ю. М. Краснопольский, Н. Ф. Клещев. – Харьков: НТУ «ХПИ», 2013. – 47 с.4. Krasnopolsky Yu. M.: Pharmaceutical biotechnology: Production of biologically active substances: textbook. allowance: in 2 hours -
5. Шевченко З.А., Телегина Ю.В., Лебедев Л.Р. Способ получения препаратов на основе рнк // Актуальные проблемы гуманитарных и естественных наук. 2017. №8-2.5. Shevchenko Z.A., Telegina Yu.V., Lebedev L.R. A method for obtaining drugs based on RNA // Actual problems of the humanities and natural sciences. 2017. No. 8-2.
6. Патент РФ № 2302464.6. RF patent No. 2302464.
7. Патент РФ № 2558256.7. RF patent No. 2558256.
Далее приводятся примеры осуществления изобретения, которые иллюстрируют изобретение, но не охватывают все возможные варианты его осуществления и не ограничивают изобретение. The following are examples of the invention, which illustrate the invention, but do not cover all possible options for its implementation and do not limit the invention.
Специалисту в данной области очевидно, что возможны и другие частные варианты осуществления изобретения.It is obvious to the person skilled in the art that other particular embodiments of the invention are also possible.
Пример 1. Получение дсРНК из клеток дрожжей Saccharomyces cerevisiae.Example 1 Preparation of dsRNA from Saccharomyces cerevisiae yeast cells.
Клетки дрожжей киллерного штамма Saccharomyces cerevisiae ВКПМ Y-448 подвергали разрушению, суспензию центрифугировали, отделяли надосадочную жидкость и прецепитировали суммарную РНК. Yeast cells of the killer strain Saccharomyces cerevisiae VKPM Y-448 were destroyed, the suspension was centrifuged, the supernatant was separated, and total RNA was precipitated.
В частном случае исполнения настоящего изобретения биомассу дрожжей киллерного штамма Saccharomyces cerevisiae ВКПМ Y-448 суспендировали в буферном растворе (состав рН = 7,00±0,05, состав: натрий сернокислый – 100 мМ; ЭДТА – 5 мМ; калий фосфорнокислый однозамещенный – 40 мМ; калия хлорид – 350 мМ; SDS – 5 мМ) до гомогенного состояния. Далее при постоянном перемешивании полученную суспензию нагревали до 30±1оС и добавляли ферментный препарат, содержащий зимолиазу, и 1 % раствор SDS. Суспензию перемешивали и инкубировали при указанной температуре 2 часа при перемешивании. Далее суспензию охлаждали до 18±1 оС и гомогенизировали при высоком давлении (1400 бар). Полученную суспензию центрифугировали. Далее проводили этап осаждения одноатомным спиртом, например, 96 % этиловым спиртом. In a particular case of the implementation of the present invention, the biomass of the killer yeast strain Saccharomyces cerevisiae VKPM Y-448 was suspended in a buffer solution (composition pH = 7.00 ± 0.05, composition: sodium sulfate - 100 mM; EDTA - 5 mM; monosubstituted potassium phosphate - 40 mM; potassium chloride - 350 mM; SDS - 5 mM) until a homogeneous state. Then, with constant stirring, the resulting suspension was heated to 30 ± 1 o C and an enzyme preparation containing zymolyase and 1% SDS solution were added. The suspension was stirred and incubated at the same temperature for 2 hours with stirring. Next, the suspension was cooled to 18±1 about With and homogenized at high pressure (1400 bar). The resulting suspension was centrifuged. Next, the stage of precipitation with monohydric alcohol, for example, 96% ethyl alcohol, was carried out.
После чего осадок отделяли и при перемешивании смешивали с водой очищенной в количестве 3,33 л воды очищенной на 1,0 кг осадка до достижения значений оптической плотности при 260 нм до 180±20 о.е./мл. Далее суспензию перемешивали при температуре 18,0±1 оС до получения однородности в течение 6-10 ч, затем доводили объем суспензии водой очищенной до объема, равному двукратному количеству очищенной воды, используемой ранее, перемешивали в течение 15 мин.After that, the precipitate was separated and, with stirring, mixed with purified water in the amount of 3.33 l of purified water per 1.0 kg of sediment until the optical density at 260 nm reached 180 ± 20 o.u./ml. Next, the suspension was stirred at a temperature of 18.0 ± 1 ° C until homogeneity was obtained for 6-10 hours, then the volume of the suspension was adjusted with purified water to a volume equal to twice the amount of purified water used earlier, stirred for 15 minutes.
К полученной суспензии добавляли взвешенный на весах хлорид натрия до достижения его концентрации в целевом растворе 2,0 М. Суспензию перемешивали до полного растворения в течение 20-30 мин и охлаждали до 4оС. Охлажденную суспензию инкубировали при этой температуре 12 ч. Далее суспензию центрифугировали при 15000 об/мин и определяют наличие зоны дсРНК в супернатанте. Полученный осадок сливали.Sodium chloride weighed on a balance was added to the resulting suspension until its concentration in the target solution was 2.0 M. The suspension was stirred until complete dissolution for 20–30 min and cooled to 4°C. The cooled suspension was incubated at this temperature for 12 h. Next, the suspension centrifuged at 15,000 rpm and determine the presence of a zone of dsRNA in the supernatant. The resulting precipitate was discarded.
Полученный в результате супернатант, содержащий фракцию дсРНК, собирали и отбирали пробу для определения оптической плотности при 260 нм. Оптическая плотность соответствовала значению 55,0 е.о.п. Далее к супернатанту добавляли 96 % этиловый спирт (или другой одноатомный спирт, например, не ограничиваясь указанным, метанол, пропанол, изопропанол, бутанол или изобутанол) до достижения его концентрации в целевом растворе 40 об. %. Полученную суспензию перемешивали в течение 15 мин, охлаждали до 4±1 °С и отстаивали в течение 12 часов. The resulting supernatant containing the dsRNA fraction was collected and sampled to determine the optical density at 260 nm. The optical density corresponded to a value of 55.0 e.o.p. Next, 96% ethyl alcohol (or another monohydric alcohol, for example, but not limited to methanol, propanol, isopropanol, butanol or isobutanol) was added to the supernatant until its concentration in the target solution reached 40 vol. %. The resulting suspension was stirred for 15 min, cooled to 4±1°C, and settled for 12 hours.
Сформировавшийся осадок отделяли с помощью центрифугирования, после чего к осадку добавляли буферный раствор ((рН = 7,20 ± 0,05) состав: натрия хлорид – 150 мМ; ЭДТА – 1,0 мМ; трис(оксиметил)аминометан – 50 мМ). Полученную суспензию перемешивали до полного растворения осадка в течение 6,0 ч. Оптическая плотность полученного раствора дсРНК составляла примерно 120 е.о.п. при 260 нм. The formed precipitate was separated by centrifugation, after which a buffer solution was added to the precipitate ((pH = 7.20 ± 0.05) composition: sodium chloride - 150 mM; EDTA - 1.0 mM; tris(hydroxymethyl)aminomethane - 50 mM) . The resulting suspension was stirred until complete dissolution of the precipitate within 6.0 hours. The optical density of the resulting dsRNA solution was approximately 120 e.o.p. at 260 nm.
Далее в приготовленный раствор дсРНК приливали 8 М раствор хлорида лития до достижения его концентрации в полученной суспензии 2 М, то есть в объемном соотношении раствор дсРНК (целевой раствор) : 8 М раствор хлорида лития = 1,000 : 3,333. Полученную суспензию перемешивали в течение 15 мин, охлаждали до 4±1 °С и отстаивали при установленной температуре 12 часов. Полученную суспензию центрифугировали при 8000 об/мин для отделения супернатанта. Next, an 8 M lithium chloride solution was added to the prepared dsRNA solution until its concentration in the resulting suspension reached 2 M, i.e., in a volume ratio of dsRNA solution (target solution) : 8 M lithium chloride solution = 1.000 : 3.333. The resulting suspension was stirred for 15 min, cooled to 4±1°C, and allowed to stand at the set temperature for 12 hours. The resulting suspension was centrifuged at 8000 rpm to separate the supernatant.
К супернатанту, полученному на предыдущей стадии, загружали 8 М раствор хлорида лития до достижения его концентрации в полученной суспензии 4 М, то есть в объемном соотношении раствор дсРНК : 8 М раствор хлорида лития = 1 : 0,5. Полученный раствор перемешивали до получения однородной суспензии в течение 15 минут, охлаждали до 4±1 °С и отстаивали при установленной температуре в течение 12 часов. Далее суспензию центрифугировали при 8000 об/мин для отделения осадка. Супернатант утилизировали.An 8 M lithium chloride solution was added to the supernatant obtained at the previous stage until its concentration in the resulting suspension reached 4 M, i.e., in a volume ratio of dsRNA solution : 8 M lithium chloride solution = 1 : 0.5. The resulting solution was stirred until a homogeneous suspension was obtained for 15 minutes, cooled to 4 ± 1 °C and settled at the set temperature for 12 hours. Next, the suspension was centrifuged at 8000 rpm to separate the precipitate. The supernatant was discarded.
Полученный осадок отправляли на повторные стадии фракционирования 2 М и 4 М хлоридом лития. Для этого к осадку добавляли буферный раствор ((рН = 7,20 ± 0,05) состав: натрия хлорид – 150 мМ; ЭДТА – 1,0 мМ; трис(оксиметил)аминометан – 50 мМ). Полученную суспензию перемешивали до полного растворения осадка в течение 4,0 ч. Оптическая плотность полученного раствора дсРНК составляла примерно 80 е.о.п. при 260 нм. The precipitate obtained was sent to repeated fractionation steps with 2 M and 4 M lithium chloride. To do this, a buffer solution ((pH = 7.20 ± 0.05) composition: sodium chloride - 150 mM; EDTA - 1.0 mM; tris(oxymethyl)aminomethane - 50 mM) was added to the precipitate. The resulting suspension was stirred until complete dissolution of the precipitate within 4.0 hours. The optical density of the resulting dsRNA solution was approximately 80 e.o.p. at 260 nm.
Далее в приготовленный раствор дсРНК приливали 8 М раствор хлорида лития до достижения его концентрации в полученной суспензии 2 М, то есть в объемном соотношении раствор дсРНК : 8 М раствор хлорида лития = 1,000 : 3,333. Полученную суспензию перемешивали в течение 15 мин, охлаждали до 4±1 °С и отстаивали при установленной температуре 12 часов. Полученную суспензию центрифугировали при 10000 об/мин для отделения супернатанта. Оптическая плотность полученного раствора дсРНК составляла примерно 40 е.о.п. при 260 нм.Next, an 8 M lithium chloride solution was added to the prepared dsRNA solution until its concentration in the resulting suspension reached 2 M, i.e., in a volume ratio of dsRNA solution : 8 M lithium chloride solution = 1.000 : 3.333. The resulting suspension was stirred for 15 min, cooled to 4±1°C, and allowed to stand at the set temperature for 12 hours. The resulting suspension was centrifuged at 10,000 rpm to separate the supernatant. The optical density of the resulting dsRNA solution was approximately 40 fu. at 260 nm.
К супернатанту, полученному на предыдущей стадии, загружали 8 М раствор хлорида лития до достижения его концентрации в полученной суспензии 4 М, то есть в объемном соотношении раствор дсРНК (целевой раствор) : 8 М раствор хлорида лития = 1 : 0,5. Полученный раствор перемешивали до получения однородной суспензии в течение 15 минут, охлаждали до 4±1 °С и отстаивали при установленной температуре в течение 12 часов. Далее суспензию центрифугировали при 10000 об/мин для отделения осадка. Оптическая плотность полученного супернатанта составляла примерно 8,0 е.о.п. при 260 нм.An 8 M lithium chloride solution was added to the supernatant obtained at the previous stage until its concentration in the resulting suspension reached 4 M, i.e., in a volume ratio of dsRNA solution (target solution) : 8 M lithium chloride solution = 1 : 0.5. The resulting solution was stirred until a homogeneous suspension was obtained for 15 minutes, cooled to 4 ± 1 °C and settled at the set temperature for 12 hours. Next, the suspension was centrifuged at 10,000 rpm to separate the precipitate. The optical density of the resulting supernatant was about 8.0 u.o.p. at 260 nm.
Полученный по окончании центрифугирования осадок дсРНК растворяли в буфере ((рН = 7,20± 0,05) состав: натрия хлорид – 70 мМ; ЭДТА – 1мМ) и перемешивали полученную суспензию до гомогенного состояния в течение 2,0 ч. К полученной суспензии дсРНК добавляли хлороформ в соотношении раствор дсРНК (целевой раствор) : хлороформ от 1:2 до 1:10 по объему (в частном случае, в соотношении раствор дсРНК (целевой раствор) : хлороформ 1:2 по объему) и перемешивали до получения суспензии белого цвета в течение 15 мин. Полученную суспензию отстаивали при 4±1 °С в течение 1 часа. The dsRNA precipitate obtained after centrifugation was dissolved in buffer ((pH = 7.20 ± 0.05) composition: sodium chloride - 70 mM; EDTA - 1 mM) and the resulting suspension was stirred until a homogeneous state for 2.0 h. dsRNA was added with chloroform in the ratio of dsRNA solution (target solution) : chloroform from 1:2 to 1:10 by volume (in a particular case, in the ratio of dsRNA solution (target solution) : chloroform 1:2 by volume) and stirred until a white suspension was obtained. colors within 15 min. The resulting suspension was defended at 4±1°C for 1 hour.
После отстаивания отбирали водную верхнюю фракцию и проводили повторный процесс депротеинизации раствора дсРНК при аналогичных условиях. После отстаивания отбирали водную верхнюю фракцию и измеряли оптическую плотность полученной фракции при 260 нм. Оптическая плотность соответствовала значению 75±10 е.о.п. Нижнюю фазу (отработанный хлороформ) отправляли на утилизацию.After settling, the aqueous upper fraction was taken and a repeated process of deproteinization of the dsRNA solution was carried out under similar conditions. After settling, the aqueous upper fraction was taken and the optical density of the obtained fraction was measured at 260 nm. The optical density corresponded to the value of 75±10 e.d.p. The lower phase (used chloroform) was sent for disposal.
Далее к раствору дсРНК загружали 96 % этиловый спирт (или другой одноатомный спирт, например, не ограничиваясь указанным, метанол, пропанол, изопропанол, бутанол или изобутанол) до достижения его концентрации в целевом растворе 75 об. %, охлаждали до 4±1 °С и отстаивали при данной температуре в течение 12 часов. Next, 96% ethyl alcohol (or another monohydric alcohol, for example, but not limited to methanol, propanol, isopropanol, butanol, or isobutanol) was added to the dsRNA solution until its concentration in the target solution reached 75 vol. %, cooled to 4±1°C and kept at this temperature for 12 hours.
По окончании отстаивания суспензию центрифугировали при 10000 об/мин. К полученному спиртовому осадку дсРНК добавляли 96 % этиловый спирт (или другой одноатомный спирт, например, не ограничиваясь указанным, метанол, пропанол, изопропанол, бутанол или изобутанол) в соотношении осадок : 96 % этиловый спирт = 1 г : 10 мл и перемешивали полученную суспензию в течение 10 мин. Затем суспензию центрифугировали при 10000 об/мин. After settling, the suspension was centrifuged at 10,000 rpm. 96% ethyl alcohol (or another monohydric alcohol, for example, but not limited to methanol, propanol, isopropanol, butanol or isobutanol) was added to the resulting alcoholic precipitate of dsRNA in the ratio of precipitate : 96% ethyl alcohol = 1 g : 10 ml and the resulting suspension was stirred within 10 min. The suspension was then centrifuged at 10,000 rpm.
К полученному спиртовому осадку повторно добавляли 96 об. % этиловый спирт (или другой одноатомный спирт, например, не ограничиваясь указанным, метанол, пропанол, изопропанол, бутанол или изобутанол) в соотношении осадок : 96 об. % этиловый спирт = 1 г : 10 мл и подвергали промывке при аналогичных условиях.To the resulting alcohol precipitate was re-added 96 vol. % ethyl alcohol (or other monohydric alcohol, for example, but not limited to methanol, propanol, isopropanol, butanol or isobutanol) in the ratio of sediment: 96 vol. % ethyl alcohol = 1 g: 10 ml and washed under similar conditions.
Далее полученный спиртовой осадок растворяли в воде инъекционной до полного растворения осадка. РН полученного раствора составлял примерно 7,0, оптическую плотность доводили до примерно 90±10 е.о.п. при длине волны 260 нм.Next, the resulting alcohol precipitate was dissolved in injection water until the precipitate was completely dissolved. The pH of the resulting solution was about 7.0, the optical density was adjusted to about 90±10 fu. at a wavelength of 260 nm.
Полученный водный раствор дсРНК с предыдущей стадии подвергали фильтрации с целью удаления взвешенных частиц и мутности, и лиофильно высушивали.The resulting dsRNA aqueous solution from the previous step was filtered to remove suspended particles and turbidity, and freeze-dried.
Идентификацию дсРНК проводили методами электрофореза в агарозном геле и высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). На электрофореграммах фиксировались полосы с четко очерченными границами. Высокая контрастность полос была обусловлена высокой степенью взаимодействия дсРНК с интеркалирующим агентом – бромистым этидием. Высокая степень интеркалирования прямо свидетельствует о двуспиральной структуре молекулы.dsRNA was identified by agarose gel electrophoresis and high performance liquid chromatography (HPLC). On the electropherograms, bands with clearly defined boundaries were recorded. The high contrast of the bands was due to the high degree of dsRNA interaction with the intercalating agent, ethidium bromide. A high degree of intercalation directly indicates the double helix structure of the molecule.
Пример 2. Изучение влияния различных условий в способах получения дсРНК из клеток киллерных дрожжей Saccharomyces cerevisiae на выход дсРНК.Example 2. Study of the influence of various conditions in the methods for obtaining dsRNA from cells of the killer yeast Saccharomyces cerevisiae on the yield of dsRNA.
Для изучения влияния различных условий в способах получения дсРНК из клеток киллерных дрожжей Saccharomyces cerevisiae на выход дсРНК авторы изобретения проделали ряд экспериментов по получению и выделению дсРНК различными способами. Результаты исследований представлены в таблице 1. In order to study the effect of different conditions in the methods for producing dsRNA from killer yeast Saccharomyces cerevisiae cells on the yield of dsRNA, the inventors performed a series of experiments on the production and isolation of dsRNA by various methods. The research results are presented in table 1.
В способах получения дсРНК из киллерных дрожжей Saccharomyces cerevisiae согласно таблице 1 анализировали влияние различных условий фракционирования, депротеинизации и осаждения дсРНК на выход и чистоту целевого продукта, при этом разрушение клеток дрожжей в способах 1-5 осуществляли одним и тем же методом (механическим и/или химическим, и/или ферментативным). In the methods for obtaining dsRNA from the killer yeast Saccharomyces cerevisiae according to Table 1, we analyzed the effect of various conditions of fractionation, deproteinization and sedimentation of dsRNA on the yield and purity of the target product, while the destruction of yeast cells in methods 1-5 was carried out by the same method (mechanical and/or chemical and/or enzymatic).
Для проведения каждого из экспериментов, описанных в таблице 1, использовали по 6 кг биомассы киллерных дрожжей Saccharomyces cerevisiae ВКПМ Y-448, полученных с одного процесса ферментации. Для оценки сходимости результатов эксперименты проводили по 3 раза. Все целевые продукты, полученные по завершении экспериментов, лиофилизировали при одинаковых условиях. Количественное содержание и чистоту дсРНК в лиофилизатах оценивали методом эксклюзионной ВЭЖХ в пересчете на безводный и свободный от остаточных органических растворителей лиофилизат. Для определения количественного содержания примесного белка в лиофилизате (в пересчете на безводный и свободный от остаточных органических растворителей лиофилизат) использовали метод Лоури.For each of the experiments described in Table 1, 6 kg of killer yeast biomass Saccharomyces cerevisiae VKPM Y-448 obtained from one fermentation process was used. To assess the convergence of the results, the experiments were carried out 3 times. All target products obtained at the end of the experiments were lyophilized under the same conditions. Quantitative content and purity of dsRNA in lyophilisates were evaluated by size exclusion HPLC in terms of anhydrous lyophilisate free from residual organic solvents. To determine the quantitative content of impurity protein in the lyophilisate (in terms of anhydrous and free from residual organic solvents lyophilisate), the Lowry method was used.
Таблица 1. Сравнение выхода и чистоты дсРНК, полученной различными способами.Table 1. Comparison of the yield and purity of dsRNA obtained by various methods.
Депротеинизация: хлороформом в соотношении целевой раствор дсРНК : хлороформ 1:1 по объему;
Осаждение дсРНК: из водной фазы двумя объемами этанола (или др одноатомного спирта) Fractionation: double fractionation with a LiCl solution until its concentration reaches 2 M in the target solution and then until its concentration reaches 4 M in the target solution;
Deproteinization: chloroform in the ratio of the target solution dsRNA : chloroform 1:1 by volume;
Precipitation of dsRNA: from the aqueous phase with two volumes of ethanol (or other monohydric alcohol)
Фракционирование: двойное фракционирование раствором LiCl до достижения его концентрации 2 М в целевом растворе и затем до достижения его концентрации 3,5 М в целевом растворе;
Осаждение дсРНК: в 55 об. % растворе этанола (или др одноатомного спирта)Precipitation of dsRNA 8% PEG solution;
Fractionation: double fractionation with a LiCl solution until its concentration reaches 2 M in the target solution and then until its concentration reaches 3.5 M in the target solution;
Precipitation of dsRNA: in 55 vol. % ethanol solution (or other monohydric alcohol)
(способ по настоящему изобретению) 3.
(method of the present invention)
Фракционирование: двойное фракционирование раствором LiCl до достижения его концентрации 2 М в целевом растворе и затем до достижения его концентрации 4 М в целевом растворе (двукратный повтор каждой стадии);
Депротеинизация: хлороформом в соотношении целевой раствор дсРНК : хлороформ от 1:2 до 1:10 по объему (2 раза);
Осаждение дсРНК: этанол (или др одноатомный спирт) до достижения его концентрации в целевом растворе 75 об. % Precipitation of dsRNA: ethanol (or other monohydric alcohol) until its concentration reaches 40 vol. % in target solution;
Fractionation: double fractionation with LiCl solution until its concentration reaches 2 M in the target solution and then until its concentration reaches 4 M in the target solution (double repetition of each stage);
Deproteinization: with chloroform in the ratio of the target solution of dsRNA : chloroform from 1:2 to 1:10 by volume (2 times);
Precipitation of dsRNA: ethanol (or other monohydric alcohol) until its concentration in the target solution reaches 75 vol. %
Фракционирование: двойное фракционирование раствором LiCl до достижения его концентрации 2М в целевом растворе и затем до достижения его концентрации 4М в целевом растворе (двукратный повтор каждой стадии);
Депротеинизация хлороформом в соотношении целевой раствор дсРНК : хлороформ от 1:2 до 1:10 по объему (2 раза);
Осаждение дсРНК: этанол (или др одноатомный спирт) до его концентрации в целевом растворе 75 об. % Precipitation of dsRNA: ethanol (or other monohydric alcohol) up to 30 vol. %;
Fractionation: double fractionation with LiCl solution until its concentration reaches 2M in the target solution and then until its concentration reaches 4M in the target solution (double repetition of each stage);
Deproteinization with chloroform in the ratio of the target solution of dsRNA : chloroform from 1:2 to 1:10 by volume (2 times);
Precipitation of dsRNA: ethanol (or other monohydric alcohol) to its concentration in the target solution of 75 vol. %
Фракционирование: двойное фракционирование раствором LiCl до достижения его концентрации 2 М в целевом растворе и затем до достижения его концентрации 4 М в целевом растворе (двукратный повтор каждой стадии);
Депротеинизация: хлороформом в соотношении целевой раствор дсРНК : хлороформ от 1:2 до 1:10 по объему (2 раза);
Осаждение дсРНК: этанол (или др одноатомный спирт) до достижения его концентрации в целевом растворе 35 об. % Precipitation of dsRNA: ethanol (or other monohydric alcohol) until its concentration reaches 40 vol. % in target solution;
Fractionation: double fractionation with LiCl solution until its concentration reaches 2 M in the target solution and then until its concentration reaches 4 M in the target solution (double repetition of each stage);
Deproteinization: with chloroform in the ratio of the target solution of dsRNA : chloroform from 1:2 to 1:10 by volume (2 times);
Precipitation of dsRNA: ethanol (or other monohydric alcohol) until its concentration in the target solution reaches 35 vol. %
Дополнительно проводили идентификацию дсРНК, полученной способами 1-5, методами высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) и электрофореза в агарозном геле. Additionally, dsRNA obtained by methods 1-5 was identified by high performance liquid chromatography (HPLC) and agarose gel electrophoresis.
Результаты электрофоретических методов исследования представлены на Фиг. 1 и Фиг. 2.The results of electrophoretic research methods are presented in Fig. 1 and FIG. 2.
На электрофореграмме дсРНК, полученной способом по настоящему изобретению (3 способ), были различимы две яркие контрастные полосы, соответствующие дсРНК (интервал значений от 4700 до 5300 пн, от 1400 до 1800 пн). Высокая контрастность полос обусловлена высокой степенью взаимодействия указанных соединений с интеркалирующим агентом – бромистым этидием. Высокая степень интеркалирования прямо свидетельствует о двуспиральной структуре молекулы. Яркость полос, соответствующих дсРНК, на электрофореграммах дсРНК, полученных способами 1-2, 4-5, была существеннее ниже, что свидетельствует о низком содержании дсРНК, при этом фиксировалось наличие впРНК (диапазон молекулярно- массового распределения впРНК начинался от десятков пн до примерно 1000 пн).On the electropherogram of dsRNA obtained by the method of the present invention (method 3), two bright contrasting bands corresponding to dsRNA were distinguishable (range of values from 4700 to 5300 bp, from 1400 to 1800 bp). The high contrast of the bands is due to the high degree of interaction of these compounds with the intercalating agent, ethidium bromide. A high degree of intercalation directly indicates the double helix structure of the molecule. The brightness of the bands corresponding to dsRNA on dsRNA electrophoregrams obtained by methods 1-2, 4-5 was significantly lower, which indicates a low content of dsRNA, while the presence of vpRNA was recorded (the range of molecular weight distribution of vpRNA began from tens of bp to about 1000 bp). mon).
Целевой продукт, содержащий дсРНК, полученный способом 1, имел в своем составе значительное количество примесей и других нуклеиновых кислот, в т.ч. впРНК (примерно 50 %). Стадия депротеинизации не привела к значительному увеличению выхода продукта, который составил 135-177 мг на 1 кг биомассы клеток дрожжей.The target product containing dsRNA obtained by
Целевой продукт, содержащий дсРНК, полученный способом 2, содержал самое высокое содержание примесных белков (примерно 30 %), по сравнению со всеми остальными целевыми продуктами, полученными способами 1, 3-5, вследствие отсутствия отдельной стадии депротеинизации состава, а также примесей впРНК (примерно 30%), которые оставались в составе после осаждения раствором полиэтиленгликоля. The target product containing dsRNA obtained by
Целевой продукт, содержащий дсРНК, полученный способом 3, содержал следовые количества примесных белков и иных нуклеиновых кислот (в том числе высокополимерных РНК), при этом выход препарата дсРНК составил от 324 до 376 мг на 1 кг биомассы дрожжей.The target product containing dsRNA obtained by
В способах 4-5 варьировали концентрациями одноатомного спирта (в частности, этанола) при осаждении дсРНК. Выход и чистота целевых продуктов, полученных способами 4-5, были выше, чем в способах 1, 2. Количество примесных белков фиксировалось в районе 3-5 %, впРНК примерно 20 %, что существенно больше, чем в целевом продукте дсРНК, полученном способом по настоящему изобретению (3 способ). Methods 4-5 varied the concentrations of monohydric alcohol (particularly ethanol) during precipitation of dsRNA. The yield and purity of the target products obtained by
Следовательно, предложенный способ получения дсРНК по настоящему изобретению за счет проведения нескольких этапов осаждения дсРНК одноатомным спиртом определенной концентрации, последовательных этапов очистки (две серии дробного фракционирования LiCl) и депротеинизации определенным объемом хлороформа позволяет значительно увеличить чистоту и выход целевого продукта в среднем примерно в 2 раза. Therefore, the proposed method for obtaining dsRNA according to the present invention by carrying out several stages of precipitation of dsRNA with monohydric alcohol of a certain concentration, successive stages of purification (two series of fractional fractionation of LiCl) and deproteinization with a certain volume of chloroform can significantly increase the purity and yield of the target product by an average of about 2 times .
Таким образом, предложенный по настоящему изобретению способ получения дсРНК из клеток киллерного штамма дрожжей Saccharomyces cerevisiae позволяет получить целевой продукт с увеличенным выходом и чистотой.Thus, the proposed method according to the present invention for obtaining dsRNA from cells of the killer yeast strain Saccharomyces cerevisiae makes it possible to obtain the target product with increased yield and purity.
Claims (8)
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2781833C1 true RU2781833C1 (en) | 2022-10-18 |
Family
ID=
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2836349C1 (en) * | 2023-12-04 | 2025-03-13 | Федеральное бюджетное учреждение науки "Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН ГНЦ ВБ "Вектор" Роспотребнадзора) | Method of producing preparations having adjuvant properties in complex processing of saccharomyces cerevisiae killer yeast |
Citations (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SU936701A1 (en) * | 1979-08-23 | 1985-04-23 | Специальное Конструкторско-Технологическое Бюро Биологически Активных Веществ Главного Управления Микробиологической Промышленности При Совете Министров Ссср | Method of obtaining high-polymer ribonucleic acid from yeast |
| RU2103365C1 (en) * | 1996-06-14 | 1998-01-27 | Научно-производственное предприятие "Гель" | Method for producing ribonucleic acid |
| RU2302464C2 (en) * | 2003-11-12 | 2007-07-10 | Николай Борисович Бажутин | Method for production of double-helical ribonucleic acid |
| RU2403288C1 (en) * | 2009-07-27 | 2010-11-10 | Общество с ограниченной ответственностью "ВИТАЛАНГ" | Method of producing high-polymeric rna from dry baker's yeast |
| RU2435862C1 (en) * | 2010-06-15 | 2011-12-10 | Общество с ограниченной ответственностью "ВИТАЛАНГ" | Method for producing high-polymer rna from used beer yeast |
| RU2558256C1 (en) * | 2014-05-13 | 2015-07-27 | Федеральное бюджетное учреждение науки "Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" (ФБУН ГНЦ ВБ "Вектор") | METHOD OF PRODUCTION OF DOUBLE-STRANDED RIBONUCLEIC ACID (dsRNA) FROM CELLS OF YEAST Saccharomyces cerevisiae |
| RU2584346C2 (en) * | 2014-06-17 | 2016-05-20 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования Новосибирский государственный аграрный университет | Method for recovery of nucleic acids |
| RU2722731C2 (en) * | 2018-07-18 | 2020-06-03 | Федеральное бюджетное учреждение науки "Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН ГНЦ ВБ "Вектор" Роспотребнадзора) | Method for producing biologically active components from yeast cells saccharomyces cerevisiae and a therapeutic agent based thereon |
Patent Citations (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SU936701A1 (en) * | 1979-08-23 | 1985-04-23 | Специальное Конструкторско-Технологическое Бюро Биологически Активных Веществ Главного Управления Микробиологической Промышленности При Совете Министров Ссср | Method of obtaining high-polymer ribonucleic acid from yeast |
| RU2103365C1 (en) * | 1996-06-14 | 1998-01-27 | Научно-производственное предприятие "Гель" | Method for producing ribonucleic acid |
| RU2302464C2 (en) * | 2003-11-12 | 2007-07-10 | Николай Борисович Бажутин | Method for production of double-helical ribonucleic acid |
| RU2403288C1 (en) * | 2009-07-27 | 2010-11-10 | Общество с ограниченной ответственностью "ВИТАЛАНГ" | Method of producing high-polymeric rna from dry baker's yeast |
| RU2435862C1 (en) * | 2010-06-15 | 2011-12-10 | Общество с ограниченной ответственностью "ВИТАЛАНГ" | Method for producing high-polymer rna from used beer yeast |
| RU2558256C1 (en) * | 2014-05-13 | 2015-07-27 | Федеральное бюджетное учреждение науки "Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" (ФБУН ГНЦ ВБ "Вектор") | METHOD OF PRODUCTION OF DOUBLE-STRANDED RIBONUCLEIC ACID (dsRNA) FROM CELLS OF YEAST Saccharomyces cerevisiae |
| RU2584346C2 (en) * | 2014-06-17 | 2016-05-20 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования Новосибирский государственный аграрный университет | Method for recovery of nucleic acids |
| RU2722731C2 (en) * | 2018-07-18 | 2020-06-03 | Федеральное бюджетное учреждение науки "Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН ГНЦ ВБ "Вектор" Роспотребнадзора) | Method for producing biologically active components from yeast cells saccharomyces cerevisiae and a therapeutic agent based thereon |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Петров Д.Г. и др. Методы выделения и очистки ДНК из лизатов клеток (обзор). Научное приборостроение, 2019, том 29, N. 4, C. 28-50. Найдено онлайн: https://cyberleninka.ru/article/n/metody-vydeleniya-i-ochistki-dnk-iz-lizatov-kletok-obzor/viewer Дата обращения 28.09.2022. * |
| Шевченко З.А. и др. Способ получения препаратов на основе РНК. Актуальные проблемы гуманитарных и естественных наук, 2017, 8-2, С.9-13. * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2836349C1 (en) * | 2023-12-04 | 2025-03-13 | Федеральное бюджетное учреждение науки "Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН ГНЦ ВБ "Вектор" Роспотребнадзора) | Method of producing preparations having adjuvant properties in complex processing of saccharomyces cerevisiae killer yeast |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN107058295B (en) | Whole blood DNA rapid extraction method | |
| US3389133A (en) | Process for isolating and purifying soluble ribonucleic acid | |
| KR102402360B1 (en) | Method for extracting polydeoxyribonucleotides and polynucleotides derived from flatfish. | |
| RU2781833C1 (en) | Method for producing double-stranded ribonucleic acid from saccharomyces cerevisiae yeast cells | |
| SU1423002A3 (en) | Method of producing protein reducing content of cholesterol in blood of mammals | |
| RU2750928C1 (en) | Method for isolating exosomes from conditioned cell culture medium | |
| CN113493776A (en) | Method for continuously preparing enzyme-digested ultralow-molecular-weight hyaluronic acid or salt thereof | |
| EP1240306B1 (en) | Process for stabilizing wine | |
| RU2781832C1 (en) | Method for obtaining total rna from biomass of saccharomyces cerevisiae yeast cells | |
| US20030003534A1 (en) | Methods and compositions for extracting proteins from cells | |
| Lambertsson et al. | The ribosomal proteins of Drosophila melanogaster: I. Characterization in polyacrylamide gel of proteins from larval, adult, and ammonium chloride-treated ribosomes | |
| CN118755622A (en) | A method for extracting biologically active components of filamentous cyanobacteria and its application | |
| RU2558256C1 (en) | METHOD OF PRODUCTION OF DOUBLE-STRANDED RIBONUCLEIC ACID (dsRNA) FROM CELLS OF YEAST Saccharomyces cerevisiae | |
| CN111718428A (en) | A kind of method that utilizes Dendrobium officinale fermentation broth to prepare water-soluble polysaccharide | |
| US7935505B2 (en) | Plasmid DNA preparations and methods for producing same | |
| RU2790685C1 (en) | A new killer yeast strain saccharomyces cerevisiae | |
| RU2722731C2 (en) | Method for producing biologically active components from yeast cells saccharomyces cerevisiae and a therapeutic agent based thereon | |
| RU2237719C2 (en) | Method for preparing lipopolysaccharides | |
| CN118599960B (en) | Marine organism difficult and complicated sample DNA extraction and library construction method suitable for three-generation sequencing | |
| RU2422532C2 (en) | Method of recovery low-molecular nuclear ribonucleoproteids (rnp) from tissues and organs of mammals | |
| RU2302464C2 (en) | Method for production of double-helical ribonucleic acid | |
| Haylock et al. | The isolation of mRNA from the basidiomycete fungi Phanerochaete chrysosporium and Coprinus cinereus and its in vitro translation | |
| CN112336732B (en) | A kind of composition and its antibacterial application | |
| CN1101472C (en) | Process for preparing recombination colibacillus periplasm protein liquid | |
| RU2430969C2 (en) | High-polymer rna from baker's yeast, free from impurity associations of rna with proteins and polysaccharides |