RU2766781C1 - Method for detecting vascular endothelium involvement - Google Patents
Method for detecting vascular endothelium involvement Download PDFInfo
- Publication number
- RU2766781C1 RU2766781C1 RU2021105482A RU2021105482A RU2766781C1 RU 2766781 C1 RU2766781 C1 RU 2766781C1 RU 2021105482 A RU2021105482 A RU 2021105482A RU 2021105482 A RU2021105482 A RU 2021105482A RU 2766781 C1 RU2766781 C1 RU 2766781C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- cd42b
- endothelial cells
- vascular endothelium
- patients
- circulating endothelial
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 19
- 210000003989 endothelium vascular Anatomy 0.000 title claims abstract description 11
- 210000002358 circulating endothelial cell Anatomy 0.000 claims abstract description 21
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims abstract description 18
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims abstract description 17
- 101001070790 Homo sapiens Platelet glycoprotein Ib alpha chain Proteins 0.000 claims abstract description 11
- 102100034173 Platelet glycoprotein Ib alpha chain Human genes 0.000 claims abstract description 11
- 230000006378 damage Effects 0.000 claims abstract description 11
- 230000002792 vascular Effects 0.000 claims description 6
- 230000003511 endothelial effect Effects 0.000 claims description 5
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 abstract description 8
- 208000037273 Pathologic Processes Diseases 0.000 abstract description 5
- 230000009054 pathological process Effects 0.000 abstract description 5
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 3
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 abstract description 2
- 210000001772 blood platelet Anatomy 0.000 abstract 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 208000025721 COVID-19 Diseases 0.000 description 20
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 14
- 206010037660 Pyrexia Diseases 0.000 description 10
- DDRJAANPRJIHGJ-UHFFFAOYSA-N creatinine Chemical compound CN1CC(=O)NC1=N DDRJAANPRJIHGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 241001678559 COVID-19 virus Species 0.000 description 7
- 102100024616 Platelet endothelial cell adhesion molecule Human genes 0.000 description 7
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 7
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 6
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 6
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 5
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 5
- 208000001528 Coronaviridae Infections Diseases 0.000 description 5
- 239000003154 D dimer Substances 0.000 description 5
- 108010049003 Fibrinogen Proteins 0.000 description 5
- 102000008946 Fibrinogen Human genes 0.000 description 5
- 102000001554 Hemoglobins Human genes 0.000 description 5
- 108010054147 Hemoglobins Proteins 0.000 description 5
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 description 5
- 108010094028 Prothrombin Proteins 0.000 description 5
- 102100027378 Prothrombin Human genes 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 238000004820 blood count Methods 0.000 description 5
- 238000002591 computed tomography Methods 0.000 description 5
- 229940109239 creatinine Drugs 0.000 description 5
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 5
- 108010052295 fibrin fragment D Proteins 0.000 description 5
- 229940012952 fibrinogen Drugs 0.000 description 5
- 230000035987 intoxication Effects 0.000 description 5
- 231100000566 intoxication Toxicity 0.000 description 5
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 5
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 5
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 5
- 210000000440 neutrophil Anatomy 0.000 description 5
- 229940039716 prothrombin Drugs 0.000 description 5
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 5
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 5
- 108050000784 Ferritin Proteins 0.000 description 4
- 102000008857 Ferritin Human genes 0.000 description 4
- 238000008416 Ferritin Methods 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 4
- 230000036387 respiratory rate Effects 0.000 description 4
- 102100035765 Angiotensin-converting enzyme 2 Human genes 0.000 description 3
- 108090000975 Angiotensin-converting enzyme 2 Proteins 0.000 description 3
- 206010011224 Cough Diseases 0.000 description 3
- 206010048554 Endothelial dysfunction Diseases 0.000 description 3
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 3
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 3
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 3
- 208000017574 dry cough Diseases 0.000 description 3
- 230000008694 endothelial dysfunction Effects 0.000 description 3
- 210000003725 endotheliocyte Anatomy 0.000 description 3
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 3
- 241000711573 Coronaviridae Species 0.000 description 2
- 101000738771 Homo sapiens Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Proteins 0.000 description 2
- 108010004729 Phycoerythrin Proteins 0.000 description 2
- 102100037422 Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Human genes 0.000 description 2
- 108010004469 allophycocyanin Proteins 0.000 description 2
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 2
- 229940127219 anticoagulant drug Drugs 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 210000003855 cell nucleus Anatomy 0.000 description 2
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 210000003038 endothelium Anatomy 0.000 description 2
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 2
- 230000010118 platelet activation Effects 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 208000024172 Cardiovascular disease Diseases 0.000 description 1
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 1
- 206010053567 Coagulopathies Diseases 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 206010030113 Oedema Diseases 0.000 description 1
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 1
- 108010069381 Platelet Endothelial Cell Adhesion Molecule-1 Proteins 0.000 description 1
- 201000003176 Severe Acute Respiratory Syndrome Diseases 0.000 description 1
- 241000008910 Severe acute respiratory syndrome-related coronavirus Species 0.000 description 1
- 206010040844 Skin exfoliation Diseases 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 206010047115 Vasculitis Diseases 0.000 description 1
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 1
- 208000015294 blood coagulation disease Diseases 0.000 description 1
- 230000036770 blood supply Effects 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000000701 coagulant Substances 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 description 1
- 238000013480 data collection Methods 0.000 description 1
- 230000035618 desquamation Effects 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 230000004064 dysfunction Effects 0.000 description 1
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 1
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 208000027866 inflammatory disease Diseases 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001658 nucleotropic effect Effects 0.000 description 1
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000000770 proinflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000004064 recycling Methods 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 208000010110 spontaneous platelet aggregation Diseases 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002885 thrombogenetic effect Effects 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61B—DIAGNOSIS; SURGERY; IDENTIFICATION
- A61B5/00—Measuring for diagnostic purposes; Identification of persons
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Hematology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pathology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Heart & Thoracic Surgery (AREA)
- Medical Informatics (AREA)
- Surgery (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к медицине, а именно к терапии и инфекционным болезням, и может быть использовано для определения количества циркулирующих эндотелиальных клеток и активированных тромбоцитов при диагностике поражения сосудистого эндотелия, в том числе при SARS-CoV-2.The invention relates to medicine, namely to therapy and infectious diseases, and can be used to determine the number of circulating endothelial cells and activated platelets in the diagnosis of vascular endothelial damage, including SARS-CoV-2.
На сегодняшний день ангиотензин-превращающий фермент 2 (АПФ2) однозначно определен как транспортер в клетку-мишень, в частности, для вируса SARS-CoV-2 (Severe acute respiratory syndrome-related coronavirus 2 - тяжелый острый респираторный синдром, связанный с коронавирусом 2) и играет решающую роль в патогенезе заболевания COVID-19 (coronavirus disease, кронавирусное заболевание - 2019). Так как АПФ2 в большом количестве представлен в эндотелиальных клетках, выстилающих стенку сосуда, вирус SARS-CoV-2 проникает в эндотелиоциты, реплицируется в них и выходит в кровоток, что в итоге приводит к гибели клеток. Клетки отделяются от стенки сосуда (десквамация эндотелиальных клеток), формируя циркулирующий эндотелий и оголяя тромбогенную и провоспалительную субэндотелиальную поверхность (денудация сосудов), что в свою очередь приводит, во-первых, к активации тромбоцитов, обусловливающей развитие выраженной коагулопатии, и, во-вторых, к периваскулярному воспалению и отеку тканей.To date, angiotensin-converting enzyme 2 (ACE2) has been unambiguously identified as a transporter into the target cell, in particular for the SARS-CoV-2 virus (Severe acute respiratory syndrome-related coronavirus 2 - severe acute respiratory syndrome associated with coronavirus 2) and plays a crucial role in the pathogenesis of COVID-19 disease (coronavirus disease, coronavirus disease - 2019). Since ACE2 is abundant in endothelial cells lining the vessel wall, the SARS-CoV-2 virus enters endotheliocytes, replicates in them and enters the bloodstream, which ultimately leads to cell death. Cells detach from the vessel wall (desquamation of endothelial cells), forming a circulating endothelium and exposing the thrombogenic and pro-inflammatory subendothelial surface (vascular denudation), which in turn leads, firstly, to platelet activation, which causes the development of severe coagulopathy, and, secondly , to perivascular inflammation and tissue edema.
Эндотелиоциты (эндотелиальные клетки, ЭК) сосудистой стенки характеризуются выраженной морфологической неоднородностью. Это плоские вытянутые клетка мезенхимного происхождения, толщиной около 0,1-2 мкм, диаметром 10-40 мкм. Ядро расположено центрально, более или менее крупное, круглой или овальной формы. Неприкрепленные к сосудистой стенке циркулирующие эндотелиальные клетки (ЦЭК) представляют собой зрелые и дифференцированные клетки полигональной или округлой формы. Точное происхождение ЦЭК в настоящее время до конца не определено. Считается, что ЦЭК могут появляться в крови в результате их нормального процесса рециркуляции в виде жизнеспособных клеток и у здоровых лиц представлены в незначительном количестве. А также вследствие воздействия патогенов, сердечно-сосудистых нарушений или воспалительных заболеваний (иммуноопосредованных васкулитах, злокачественных новообразованиях и др.), в результате чего число ЦЭК в кровотоке повышается. Поэтому уровень ЦЭК в периферической крови считается отражением системного повреждения эндотелия и квалифицируется как достоверный и воспроизводимый маркер для оценки его повреждения/дисфункции.Endotheliocytes (endothelial cells, EC) of the vascular wall are characterized by pronounced morphological heterogeneity. These are flat elongated cells of mesenchymal origin, about 0.1-2 microns thick, 10-40 microns in diameter. The nucleus is located centrally, more or less large, round or oval. Circulating endothelial cells (CECs) not attached to the vascular wall are mature and differentiated polygonal or rounded cells. The exact origin of the CEC is currently not fully defined. It is believed that CECs can appear in the blood as a result of their normal recycling process as viable cells and are present in insignificant amounts in healthy individuals. And also due to exposure to pathogens, cardiovascular disorders or inflammatory diseases (immune-mediated vasculitis, malignant neoplasms, etc.), as a result of which the number of CEC in the bloodstream increases. Therefore, the level of CEC in peripheral blood is considered a reflection of systemic damage to the endothelium and is qualified as a reliable and reproducible marker for assessing its damage/dysfunction.
Поскольку характерным и наиболее опасным следствием патологического процесса, характерного для поражения сосудистого эндотелия, особенно при SARS-CoV-2, является образование артериальных и венозных тромбов, препятствующих кровоснабжению органов и газообмену в легких, то естественно, что одним из важнейших факторов развития патологического процесса является активация тромбоцитов. Поэтому концентрация активированных тромбоцитов является важным показателем.Since the characteristic and most dangerous consequence of the pathological process characteristic of the lesion of the vascular endothelium, especially in SARS-CoV-2, is the formation of arterial and venous thrombi that prevent the blood supply to organs and gas exchange in the lungs, it is natural that one of the most important factors in the development of the pathological process is platelet activation. Therefore, the concentration of activated platelets is an important indicator.
Исходя из анализа литературных источников, наиболее часто используемым методом оценки количества ЦЭК является поточная флуориметрия, с помощью которой выявляют пул ЦЭК как события CD45- (дифференцировка гемопоэтических клеток), сочетание нуклеотропного (ядерного) красителя Syto16+ и маркера CD31+ для исключения тромбоцитов, а остальные события анализируются по экспрессии эндотелиального антигена CD146 (в этом случае контаминация Т-лимфоцитами исключается негативностью окрашивания по CD45) [Mancuso Р, 2009; Gian PF, 2010; Kraan J, 2012].Based on the analysis of literature sources, the most commonly used method for assessing the amount of CEC is flow fluorimetry, which identifies the CEC pool as CD45- events (differentiation of hematopoietic cells), the combination of the nucleotropic (nuclear) dye Syto16+ and the CD31+ marker to exclude platelets, and the remaining events analyzed by the expression of the endothelial antigen CD146 (in this case, contamination with T-lymphocytes is excluded by negative staining for CD45) [Mancuso R, 2009; Gian PF, 2010; Kraan J, 2012].
Однако при поражении эндотелиоцитов, например, вирусом SARS-CoV-2 данный способ не эффективен, так как он учитывает только зрелые здоровые полноценные и целостные ядерные клетки с экспрессией эндотелиального антигена. Однако еще в 70-е годы прошлого века ЦЭК были определены не только как интактные, содержащие ядра клетки, но и как уже поврежденные и погибшие клетки, безъядерные клеточные «каркасы».However, when endotheliocytes are damaged, for example, by the SARS-CoV-2 virus, this method is not effective, since it takes into account only mature healthy, full-fledged and intact nuclear cells with endothelial antigen expression. However, back in the 70s of the last century, CECs were defined not only as intact, containing cell nuclei, but also as already damaged and dead cells, non-nuclear cell "scaffolds".
Задачей изобретения является создание эффективного способа определения количества циркулирующих эндотелиальных клеток и активированных тромбоцитов, позволяющего выявлять поражение сосудистого эндотелия и, следовательно, своевременно начать терапию, направленную на коррекцию патологического процесса, а также оценить эффективность применяемой терапии.The objective of the invention is to create an effective method for determining the number of circulating endothelial cells and activated platelets, which makes it possible to detect damage to the vascular endothelium and, therefore, timely start therapy aimed at correcting the pathological process, as well as evaluate the effectiveness of the therapy used.
Технический результат заключается в повышении эффективности способа.The technical result is to increase the efficiency of the method.
Это достигается тем, что в заявляемом способе выявления поражения сосудистого эндотелия, включающем определение количества циркулирующих эндотелиальных клеток и активированных тромбоцитов в крови пациентов методом последовательного гейтирования, где подсчет циркулирующих эндотелиальных клеток ведут по фракциям CD45-CD31+CD42b-, а подсчет активированных тромбоцитов CD45-CD31+CD42b+, и по количеству циркулирующих эндотелиальных клеток и активированных тромбоцитов выявляют поражение сосудистого эндотелия.This is achieved by the fact that in the claimed method for detecting damage to the vascular endothelium, including determining the number of circulating endothelial cells and activated platelets in the blood of patients by the method of sequential gating, where the counting of circulating endothelial cells is carried out according to the fractions CD45-CD31+CD42b-, and the counting of activated platelets CD45- CD31+CD42b+, and by the number of circulating endothelial cells and activated platelets, damage to the vascular endothelium is detected.
Поскольку заболевания, связанные с поражением сосудистого эндотелия, особенно при SARS-CoV-2, проявляются выраженной эндотелиальной дисфункцией, данный подход подсчета ЦЭК по фракции CD45-CD31+CD42b- дает возможность учитывать не только зрелые здоровые и целостные, интактные, содержащие ядра, клетки, а все ЦЭК в кровотоке, в том числе погибшие десквамированные ЭК, представленные в виде безъядерных клеточных «каркасов». А поскольку характерным и наиболее опасным следствием эндотелиальной дисфункции является образование артериальных и венозных тромбов, последовательное гейтирование CD45-CD31+CD42b+ дает хорошую возможность оценить количество активированных тромбоцитов, адгезированных на клетках мононуклеарной фракции, а также их агрегатов.Since diseases associated with damage to the vascular endothelium, especially in SARS-CoV-2, are manifested by severe endothelial dysfunction, this approach to calculating the CEC by the CD45-CD31+CD42b- fraction makes it possible to take into account not only mature healthy and intact, intact, containing nuclei, cells , and all CECs in the bloodstream, including dead desquamated ECs, presented in the form of nuclear-free cell "frameworks". And since the characteristic and most dangerous consequence of endothelial dysfunction is the formation of arterial and venous thrombi, sequential CD45-CD31+CD42b+ gating provides a good opportunity to assess the number of activated platelets adhered to cells of the mononuclear fraction, as well as their aggregates.
Осуществление способа.The implementation of the method.
Определение количества ЦЭК в периферической крови осуществляют на проточном цитометре FACS Canto II ("Becton Dickinson", США) с использованием флуорисцентных моноклональных антител против следующих антигенов: CD45, конъюгированный с FITC (fluorescein isothiocyanate, флуоресцеин изотиоцианат, Becton Dickinson, BD Biosciences, США), как панлейкоцитарный маркер, CD42b (ГП Ib), конъюгированный с АРС (allophycocyanin, аллофикоцианин, Becton Dickinson, BD Biosciences, США), для идентификации тромбоцитов и CD31, конъюгированный с РЕ (phycoerythrin, фикоэритрин, Becton Dickinson, BD Biosciences, США), как маркер эндотелиальных клеток.Determination of the amount of CEC in peripheral blood is carried out on a FACS Canto II flow cytometer (Becton Dickinson, USA) using fluorescent monoclonal antibodies against the following antigens: CD45 conjugated with FITC (fluorescein isothiocyanate, fluorescein isothiocyanate, Becton Dickinson, BD Biosciences, USA) as a panleukocyte marker, CD42b (GP Ib) conjugated with APC (allophycocyanin, allophycocyanin, Becton Dickinson, BD Biosciences, USA), for the identification of platelets and CD31, conjugated with PE (phycoerythrin, phycoerythrin, Becton Dickinson, BD Biosciences, USA) as a marker for endothelial cells.
Для исследования используют цельную венозную кровь, в качестве антикоагулянта - 3,8% цитрат натрия в соотношении кровь/антикоагулянт - 9/1. В 50 мкл образца вносят антитела с флуорисцентной меткой в концентрации, предложенной производителем. Инкубируют 30 мин при комнатной температуре в темноте. Для лизиса эритроцитов в пробу вносят 900 мкл холодной (4°С) бидистеллированной воды, пипетировали 20-30 сек, изотоничность клеточной суспензии восстанавливают внесением 300 мкл 0.6 М раствора NaCl. Объем доводят до 2 мл раствором 2% BSA/PBS (150 mM NaCl, 10 mM sodium phosphate, рН 7.4), после чего клетки осаждают центрифугированием в условиях 300 g 5 мин при комнатной температуре и ресуспендируют для анализа в конечном объеме 300 мкл 1% раствора параформальдегида в 2% BSA/PBS.For the study, whole venous blood is used, as an anticoagulant - 3.8% sodium citrate in the ratio of blood / anticoagulant - 9/1. Antibodies with a fluorescent label are added to 50 µl of the sample at the concentration suggested by the manufacturer. Incubate for 30 min at room temperature in the dark. For the lysis of erythrocytes, 900 µl of cold (4°C) bidistalled water is added to the sample, pipetted for 20–30 sec, the isotonicity of the cell suspension is restored by adding 300 µl of 0.6 M NaCl solution. The volume is adjusted to 2 ml with a solution of 2% BSA/PBS (150 mM NaCl, 10 mM sodium phosphate, pH 7.4), after which the cells are pelleted by centrifugation under conditions of 300 g for 5 min at room temperature and resuspended for analysis in a final volume of 300
Непосредственно перед анализом в пробу вносят 50 мкл частиц для счета размером 10 мкм с известной концентрацией (Flow-Count Fluorospheres, Becton Coulter, США). Сбор и анализ данных проводят с использованием программного обеспечения
На Фиг. 1 показан анализ ЦЭК методом проточной цитометрии. (а) - цельная кровь, (b) - проба после лизиса эритроцитов, Р1 - тромбоцитарная фракция, Р2 - мононуклеары, Р3 - частицы для счета.On FIG. 1 shows CEC analysis by flow cytometry. (a) - whole blood, (b) - sample after erythrocyte lysis, P1 - platelet fraction, P2 - mononuclear cells, P3 - counting particles.
Из гейта Р2 на дот-плоте CD45-FITC/CD31-PE выделяют CD45-негативную фракцию Q4. В связи с наличием небольшого количества антигена CD31 на поверхности тромбоцитов, ЦЭК принято определять, как негативную фракцию по отношению к тромбоцитарному маркеру (дот-плот CD42b-APC/CD31-PE, гейт Q4-1). Однако, поскольку COVID-19 связан с выраженной эндотелиальной дисфункцией и индукцией агрегации тромбоцитов, данное последовательное гейтирование дает хорошую возможность оценить количество активных тромбоцитов и их агрегатов, как фракцию CD31+CD42b+ в гейте мононуклеаров, по сравнению с образцами здоровых доноров. Также способ позволяет в гейте Р2 определить область, содержащую события, превосходящие по размеру частицы для счета, т.е. заведомо больше 10 мкм, тем самым отделив предположительно целые клетки от их осколков, а также от крупных тромбоцитов и их агрегатов. И в данной области также производят оценку событий по фракциям: CD45-CD31+/CD45-CD31+CD42b-/CD45-CD31+CD42b+.The CD45-negative Q4 fraction was isolated from gate P2 on a CD45-FITC/CD31-PE dot-plot. Due to the presence of a small amount of CD31 antigen on the surface of platelets, CEC is usually defined as a negative fraction in relation to the platelet marker (CD42b-APC/CD31-PE dot-plot, gate Q4-1). However, since COVID-19 is associated with severe endothelial dysfunction and induction of platelet aggregation, this sequential gating provides a good opportunity to assess the number of active platelets and their aggregates, as a CD31+CD42b+ fraction in the mononuclear cell gate, compared with healthy donor samples. Also, the method allows in the gate P2 to determine the area containing events that exceed the size of the particles for counting, i.e. obviously more than 10 microns, thereby separating the presumably whole cells from their fragments, as well as from large platelets and their aggregates. And in this area, events are also evaluated by fractions: CD45-CD31+/CD45-CD31+CD42b-/CD45-CD31+CD42b+.
На Фиг. 2 показано последовательное гейтирование и анализ фракций клеток, (а) и (d) - отрицательные контроли, (b) и (е) - здоровые доноры, (с) и (f) - пациент с covid-19. Подсчет ЦЭК вели по фракции CD45-CD31+ (Q4), количество истинных ЭК можно оценить по фракции CD31+CD42b- (кадры на Фиг. 2 - Е, F - Q4-1, кадры на Фиг. 2 - Eb, Fb), количество истинных тромбоцитов, детектируемых в гейте Р2 (Фиг. 1), можно оценить по фракции CD31+CD42b+ (кадры на Фиг. 2 - Е, F - Q2-1, кадры на Фиг. 2 - Еа, Fa) - у всех пациентов на дот-плоте (F, Fa) отчетливо детектируется тромбоцитарная фракция, а количество событий в гейте Q4-1 (кадры на Фиг. 2 - F, Fb) - эндотелиальные клетки.On FIG. 2 shows sequential gating and analysis of cell fractions, (a) and (d) - negative controls, (b) and (e) - healthy donors, (c) and (f) - patient with covid-19. CECs were counted according to the CD45-CD31+ (Q4) fraction, the number of true ECs can be estimated from the CD31+CD42b- fraction (frames in Fig. 2 - E, F - Q4-1, frames in Fig. 2 - Eb, Fb), the number true platelets detected in the P2 gate (Fig. 1) can be assessed by the CD31+CD42b+ fraction (frames in Fig. 2 - E, F - Q2-1, frames in Fig. 2 - Ea, Fa) - in all patients on Dot-plot (F, Fa) clearly detects the platelet fraction, and the number of events in the gate Q4-1 (frames in Fig. 2 - F, Fb) - endothelial cells.
Все события регистрируют до достижения 1000 событий в гейте частиц для счета (Р3). Концентрацию клеток в мкл в пробе считают по формуле, предложенной производителем. В качестве отрицательного контроля анализируют пробы без добавления конъюгированных антител. Из всех результатов вычитают фоновые значения отрицательного контроля.All events are recorded up to 1000 events in the particle count gate (P3). The concentration of cells in µl in the sample is calculated according to the formula proposed by the manufacturer. As a negative control, analyze samples without the addition of conjugated antibodies. Negative control background values are subtracted from all results.
Примеры осуществления способа.Examples of the implementation of the method.
Пример 1. Больной Н., мужчина, 53 года, карта 21080-20, ПЦР на COVID-19 - положительный, поступил на 8-й день начала симптомов с диагнозом: подозрение на новую коронавирусную инфекцию (COVID-19). При поступлении в стационар состояние средней степени тяжести, выраженный интоксикационный синдром, лихорадка. Жалобы при поступлении: сухой кашель, слабость, повышение температуры до 38.5, плохо сбивается. В отделении мазок на COVID-19 - отрицательный, результат компьютерной томографии легких - КТ1. ЧСС 85 уд/мин, ЧДД 20 в мин, SpO2 99%, t=36,2°С, сознание ясное. Общий анализ крови: гемоглобин 155 г/л, эритроциты 5,3×10^12/л, лейкоциты 5,8×10^9/л, нейтрофилы 58%, лимфоциты 33%, тромбоциты 182,0×10^3/л, СОЭ 10 мм/ч, CRB 25 мг/л. Коагулограмма: D-димер 87 нг/мл, протромбиновое время 18,8 сек, фибриноген 4,95 г/л, АЧТВ 50,8 сек, Биохимия: ИЛ-6 6,2 пг/мл, ферритин 214,2 нг/мл, альбумин 45,7 г/л, креатинин 93,7 мкмоль/л, рН крови 7,42. Уровень ЦЭК в крови в день госпитализации - 1035,15/мкл, уровень активированных тромбоцитов 1829,78/мкл.Example 1. Patient N., male, 53 years old, card 21080-20, PCR for COVID-19 - positive, was admitted on the 8th day of onset of symptoms with a diagnosis of suspected new coronavirus infection (COVID-19). Upon admission to the hospital, the state of moderate severity, pronounced intoxication syndrome, fever. Complaints at admission: dry cough, weakness, fever up to 38.5, badly confused. In the department, a smear for COVID-19 is negative, the result of computed tomography of the lungs is CT1. HR 85 beats/min, RR 20/min, SpO2 99%, t=36.2°C, clear consciousness. Complete blood count: hemoglobin 155 g/l, erythrocytes 5.3×10^12/l, leukocytes 5.8×10^9/l, neutrophils 58%, lymphocytes 33%, platelets 182.0×10^3/l ,
Пример 2. Больной С., мужчина, 43 года, карта 20953-20, ПЦР на COVID-19 - положительный, поступил на 4-й день начала симптомов с диагнозом: подозрение на новую коронавирусную инфекцию (COVID-19). При поступлении в стационар состояние средней степени тяжести, выраженный интоксикационный синдром, лихорадка. Жалобы при поступлении: сухой кашель, слабость, повышение температуры до 38.5, плохо сбивается. В отделении мазок на COVID-19 - отрицательный, результат компьютерной томографии легких - КТ1. ЧСС 80 уд/мин, ЧДД 18 в мин, SpO2 99%, t=39°С, сознание ясное. Общий анализ крови: гемоглобин 146 г/л, эритроциты 5,0×10^12/л, лейкоциты 4,2×10^9/л, нейтрофилы 65%, лимфоциты 22%, тромбоциты 151,0×10^3/л, СОЭ 6 мм/ч, CRB 9,83 мг/л. Коагулограмма: D-димер 299 нг/мл, протромбиновое время 13,9 сек, фибриноген 4,4 г/л, АЧТВ 39,1 сек, Биохимия: ИЛ-6 10,5 пг/мл, ферритин 598,7 нг/мл, альбумин 42,7 г/л, креатинин 90,8 мкмоль/л, рН крови 7,40. Уровень ЦЭК в крови в день госпитализации - 410,02/мкл, уровень активированных тромбоцитов 807,20/мкл.Example 2. Patient S., male, 43 years old, card 20953-20, PCR for COVID-19 - positive, was admitted on the 4th day of onset of symptoms with a diagnosis of suspected new coronavirus infection (COVID-19). Upon admission to the hospital, the state of moderate severity, pronounced intoxication syndrome, fever. Complaints at admission: dry cough, weakness, fever up to 38.5, badly confused. In the department, a smear for COVID-19 is negative, the result of computed tomography of the lungs is CT1. HR 80 beats/min, respiratory rate 18/min, SpO2 99%, t=39°C, clear consciousness. Complete blood count: hemoglobin 146 g/l, erythrocytes 5.0×10^12/l, leukocytes 4.2×10^9/l, neutrophils 65%,
Пример 3. Больной С., мужчина, 56 лет, карта 20958-20, ПЦР на COVID-19 - отрицательный, поступил на 2-й день начала симптомов с диагнозом: подозрение на новую коронавирусную инфекцию (COVID-19). При поступлении в стационар состояние средней степени тяжести, выраженный интоксикационный синдром, лихорадка. Жалобы при поступлении: слабость, повышение температуры до 38.5. В отделении мазок на COVID-19 - отрицательный, результат компьютерной томографии легких - КТ0. ЧСС 80 уд/мин, ЧДД 18 в мин, SpO2 99%, t=36,6°С, сознание ясное. Общий анализ крови: гемоглобин 146 г/л, эритроциты 4,7×10^12/л, лейкоциты 6,4×10^9/л, нейтрофилы 67%, лимфоциты 17%, тромбоциты 148,0×10^3/л, СОЭ 6 мм/ч, CRB 19,5 мг/л. Коагулограмма: D-димер 134 нг/мл, протромбиновое время 13,9 сек, фибриноген 4,1 г/л, АЧТВ 26 сек, Биохимия: ИЛ-6 1,81 пг/мл, ферритин 516,5 нг/мл, альбумин 40,4 г/л, креатинин 86,8 мкмоль/л, рН крови 7,41. Уровень ЦЭК в крови в день госпитализации - 383,34/мкл, уровень активированных тромбоцитов 946,50/мкл.Example 3. Patient S., male, 56 years old, card 20958-20, PCR for COVID-19 - negative, was admitted on the 2nd day of onset of symptoms with a diagnosis of suspected new coronavirus infection (COVID-19). Upon admission to the hospital, the state of moderate severity, pronounced intoxication syndrome, fever. Complaints at admission: weakness, fever up to 38.5. In the department, the smear for COVID-19 is negative, the result of computed tomography of the lungs is CT0. HR 80 beats/min, respiratory rate 18/min, SpO2 99%, t=36.6°C, clear consciousness. Complete blood count: hemoglobin 146 g/l, erythrocytes 4.7×10^12/l, leukocytes 6.4×10^9/l, neutrophils 67%, lymphocytes 17%, platelets 148.0×10^3/l , ESR 6 mm/h, CRB 19.5 mg/l. Coagulogram: D-dimer 134 ng/ml, prothrombin time 13.9 sec, fibrinogen 4.1 g/l, APTT 26 sec, Biochemistry: IL-6 1.81 pg/ml, ferritin 516.5 ng/ml, albumin 40.4 g/l, creatinine 86.8 µmol/l, blood pH 7.41. The level of CEC in the blood on the day of hospitalization was 383.34/µl, the level of activated platelets was 946.50/µl.
Пример 4. Больная Л., женщина, 86 лет, карта 21250-20, ПЦР на COVID-19 - положительный, поступил на 6-й день начала симптомов с диагнозом: подозрение на новую коронавирусную инфекцию (Covid-19). При поступлении в стационар состояние средней степени тяжести, выраженный интоксикационный синдром, лихорадка. Жалобы при поступлении: слабость, повышение температуры до 38.5. В отделении мазок на COVID-19 - положительный, результат компьютерной томографии легких - КТ0. ЧСС 80 уд/мин, ЧДД 16 в мин, SpO2 96%, t=36,5°С, сознание ясное. Общий анализ крови: гемоглобин 102 г/л, эритроциты 3,1×10^12/л, лейкоциты 3,6×10^9/л, нейтрофилы 74%, лимфоциты 17%, тромбоциты 163,0×10^3/л, СОЭ 90 мм/ч, CRB 41,9 мг/л. Коагулограмма: D-димер 245 нг/мл, протромбиновое время 27,2 сек, фибриноген 5,12 г/л, АЧТВ 46,8 сек, Биохимия: ИЛ-6 - 10,28 пг/мл, альбумин 32,2 г/л, креатинин 106,3 мкмоль/л, рН крови 7,29. Уровень ЦЭК в крови в день госпитализации 351,73/мкл, уровень активированных тромбоцитов 939,59/мкл.Example 4. Patient L., woman, 86 years old, card 21250-20, PCR for COVID-19 - positive, was admitted on the 6th day of onset of symptoms with a diagnosis of suspected new coronavirus infection (Covid-19). Upon admission to the hospital, the state of moderate severity, pronounced intoxication syndrome, fever. Complaints at admission: weakness, fever up to 38.5. In the department, a smear for COVID-19 is positive, the result of computed tomography of the lungs is CT0. HR 80 bpm, respiratory rate 16 per min, SpO2 96%, t=36.5°C, clear consciousness. Complete blood count: hemoglobin 102 g/l, erythrocytes 3.1×10^12/l, leukocytes 3.6×10^9/l, neutrophils 74%, lymphocytes 17%, platelets 163.0×10^3/l , ESR 90 mm/h, CRB 41.9 mg/l. Coagulogram: D-dimer 245 ng/ml, prothrombin time 27.2 sec, fibrinogen 5.12 g/l, APTT 46.8 sec, Biochemistry: IL-6 - 10.28 pg/ml, albumin 32.2 g/ml l, creatinine 106.3 µmol/l, blood pH 7.29. The level of CEC in the blood on the day of hospitalization was 351.73/µl, the level of activated platelets was 939.59/µl.
Пример 5. Больной Л., мужчина, 85 лет, карта 21243-20, ПЦР на Covid-19 - положительный, поступил на 7-й день начала симптомов с диагнозом: подозрение на новую коронавирусную инфекцию (COVID-19). При поступлении в стационар состояние средней степени тяжести, выраженный интоксикационный синдром, лихорадка. Жалобы при поступлении: слабость, повышение температуры до 38.5, сухой кашель. В отделении мазок на COVID-19 - отрицательный, результат компьютерной томографии легких - КТ1. ЧСС 88 уд/мин, ЧДД 22 в мин, SpO2 95%, t=38°С, сознание ясное. Общий анализ крови: гемоглобин 119 г/л, эритроциты 4,2×10^12/л, лейкоциты 2,9×10^9/л, нейтрофилы 56%, лимфоциты 33%, тромбоциты 147,0×10^3/л, СОЭ 42 мм/ч, CRB 35,6 мг/л. Коагулограмма: D-димер 363 нг/мл, протромбиновое время 11,8 сек, фибриноген 4,78 г/л, АЧТВ 29 сек, Биохимия: ИЛ-6 - 11,56 пг/мл, ферритин 138,3 нг/мл, альбумин 38,4 г/л, креатинин 118,3 мкмоль/л, рН крови 7,32. Уровень ЦЭК в крови в день госпитализации - 360,62/мкл, уровень активированных тромбоцитов 1173,74/мкл.Example 5. Patient L., male, 85 years old, card 21243-20, PCR for Covid-19 - positive, was admitted on the 7th day of the onset of symptoms with a diagnosis of suspected new coronavirus infection (COVID-19). Upon admission to the hospital, the state of moderate severity, pronounced intoxication syndrome, fever. Complaints at admission: weakness, fever up to 38.5, dry cough. In the department, a smear for COVID-19 is negative, the result of computed tomography of the lungs is CT1. HR 88 bpm,
Заявляемым способом было проанализировано 10 образцов условно здоровых доноров и 10 пациентов с подтвержденным заболеванием COVID-19 в первый день госпитализации: 6 мужчин, 4 женщины в возрасте от 43 до 86 лет. Так количество событий CD45-CD31+CD42b-, определенных как ЦЭК, у больных составило 562,17±415,95 в мкл против 4,69±1,48 в мкл у здоровых (р=0,007), а событий CD45-CD31+CD42b+, определенных, как активные адгезированные тромбоциты, у больных составило 1139,20±152,15 мкл против 7,65±2,47 мкл у здоровых (р=0,003).The claimed method was used to analyze 10 samples of apparently healthy donors and 10 patients with confirmed COVID-19 disease on the first day of hospitalization: 6 men, 4 women aged 43 to 86 years. Thus, the number of CD45-CD31+CD42b- events, defined as CEC, in patients was 562.17±415.95 per µl versus 4.69±1.48 per µl in healthy people (p=0.007), and CD45-CD31+ events CD42b+, defined as active adherent platelets, in patients was 1139.20±152.15 µl versus 7.65±2.47 µl in healthy people (p=0.003).
Таким образом, заявляемый способ позволяет эффективно определить количество циркулирующих эндотелиальных клеток и активированных тромбоцитов в крови пациентов, для диагностики поражения сосудистого эндотелия, в том числе при SARS-CoV-2, что дает возможность своевременно начать терапию, направленную на коррекцию патологического процесса, а также впоследствии оценить эффективность применяемой терапии.Thus, the claimed method allows to effectively determine the number of circulating endothelial cells and activated platelets in the blood of patients, to diagnose vascular endothelial damage, including SARS-CoV-2, which makes it possible to start therapy aimed at correcting the pathological process in a timely manner, as well as subsequently evaluate the effectiveness of the therapy used.
Claims (1)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2021105482A RU2766781C1 (en) | 2021-03-03 | 2021-03-03 | Method for detecting vascular endothelium involvement |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2021105482A RU2766781C1 (en) | 2021-03-03 | 2021-03-03 | Method for detecting vascular endothelium involvement |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2766781C1 true RU2766781C1 (en) | 2022-03-15 |
Family
ID=80736677
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2021105482A RU2766781C1 (en) | 2021-03-03 | 2021-03-03 | Method for detecting vascular endothelium involvement |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2766781C1 (en) |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2566287C1 (en) * | 2014-03-20 | 2015-10-20 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Российский кардиологический научно-производственный комплекс" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ "РКНПК" Минздрава России) | Method of diagnosing in-stent restenosis |
| RU2671707C2 (en) * | 2012-06-27 | 2018-11-06 | Рутгерс, Дзе Стейт Юниверсити Оф Нью-Джерси | Rapid assays for t-cell activation by rna measurements using flow cytometry |
-
2021
- 2021-03-03 RU RU2021105482A patent/RU2766781C1/en active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2671707C2 (en) * | 2012-06-27 | 2018-11-06 | Рутгерс, Дзе Стейт Юниверсити Оф Нью-Джерси | Rapid assays for t-cell activation by rna measurements using flow cytometry |
| RU2566287C1 (en) * | 2014-03-20 | 2015-10-20 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Российский кардиологический научно-производственный комплекс" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ "РКНПК" Минздрава России) | Method of diagnosing in-stent restenosis |
Non-Patent Citations (5)
| Title |
|---|
| CKE Wong et al. Levels of a subpopulation of platelets, but not circulating endothelial cells, predict early treatment failure in prostate cancer patients after prostatectomy. British Journal of Cancer (2012) 107, 1564-1573. * |
| E. SHANTSILA et al. Circulating microparticles in cardiovascular disease: implications for atherogenesis and atherothrombosis. Journal of Thrombosis and Haemostasis, Volume8, November 2010: 2358-2368. * |
| Patrick Starlinger et al. Discrimination between Circulating Endothelial Cells and Blood Cell Populations with Overlapping Phenotype Reveals Distinct Regulation and Predictive Potential in Cancer Therapy. Neoplasia. 2011 Oct; 13(10): 980-990. PMID: 22028623. * |
| Васильева В А. Циркулирующие эндотелиальные клетки и популяция Т-хелперов 17-го типа на ранних сроках после трансплантации аллогенных гемопоэтических стволовых клеток. Диссер. к.м.н. Москва, 2018, 118с.. * |
| Васильева В А. Циркулирующие эндотелиальные клетки и популяция Т-хелперов 17-го типа на ранних сроках после трансплантации аллогенных гемопоэтических стволовых клеток. Диссер. к.м.н. Москва, 2018, 118с.. CKE Wong et al. Levels of a subpopulation of platelets, but not circulating endothelial cells, predict early treatment failure in prostate cancer patients after prostatectomy. British Journal of Cancer (2012) 107, 1564-1573. Patrick Starlinger et al. Discrimination between Circulating Endothelial Cells and Blood Cell Populations with Overlapping Phenotype Reveals Distinct Regulation and Predictive Potential in Cancer Therapy. Neoplasia. 2011 Oct; 13(10): 980-990. PMID: 22028623. E. SHANTSILA et al. Circulating microparticles in cardiovascular disease: implications for atherogenesis and atherothrombosis. Journal of Thrombosis and Haemostasis, Volume8, November 2010: 2358-2368. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Dragovic et al. | Isolation of syncytiotrophoblast microvesicles and exosomes and their characterisation by multicolour flow cytometry and fluorescence Nanoparticle Tracking Analysis | |
| Takahashi et al. | Measurement of human endothelial cells in whole blood | |
| US4654312A (en) | Lysing agent for analysis of peripheral blood cells | |
| Sahu et al. | Association of TNF level with production of circulating cellular microparticles during clinical manifestation of human cerebral malaria | |
| JP4435948B2 (en) | Leukocyte classification and counting method | |
| US4902613A (en) | Lysing agent for analysis of peripheral blood cells | |
| US5514557A (en) | Method and kit for detecting antibodies specific for HLA and/or platelet glycoproteins | |
| Diaz-Ricart et al. | Preanalytical treatment of EDTA-anticoagulated blood to ensure stabilization of the mean platelet volume and component measured with the ADVIA counters | |
| CN104977284A (en) | Capture and identification method for fetal nucleated red blood cells | |
| Iversen et al. | A heparin-based method for flow cytometric analysis of microparticles directly from platelet-poor plasma in calcium containing buffer | |
| Sköld et al. | Autofluorescence in human alveolar macrophages from smokers: relation to cell surface markers and phagocytosis | |
| Finnegan et al. | Adherent leukocytes capture sickle erythrocytes in an in vitro flow model of vaso‐occlusion | |
| WO2003069341A2 (en) | Method of diagnosis of inflammatory diseases using calgranulin c | |
| JP2012168012A (en) | Novel examination method and examination kit for examining vascular endothelial disorder | |
| Khandelwal et al. | Age-dependent increase in green autofluorescence of blood erythrocytes | |
| RU2766781C1 (en) | Method for detecting vascular endothelium involvement | |
| Kasuya et al. | P-selectin expression, but not GPIIb/IIIa activation, is enhanced in the inflammatory stage of Takayasu's arteritis | |
| RU2531947C1 (en) | Method for prediction of risk of cardiovascular mortality in patients suffering from chronic ischemic heart failure combined with type 2 diabetes mellitus | |
| CN1116654A (en) | Preserved non-infectious control cells for use in blood tests to identify disease | |
| Li et al. | A whole‐blood flow cytometric assay for leukocyte CD11b expression using fluorescence signal triggering | |
| US20210325405A1 (en) | Identification of platelet activating antibodies | |
| Stiegler et al. | Direct evidence for an increase in thrombopoiesis after liver transplantation | |
| Piagnerelli et al. | Modifications of red blood cell shape and glycoproteins membrane content in septic patients | |
| CN108728400A (en) | A kind of Chronic glomerular disease glomerulosclerosis marker and its detection kit | |
| US20050244897A1 (en) | Endothelial cells as diagnostic instrument in cardiovascular diseases |