RU2762108C2 - Способ модификации поверхности стекла для введения функциональных аминогрупп - Google Patents
Способ модификации поверхности стекла для введения функциональных аминогрупп Download PDFInfo
- Publication number
- RU2762108C2 RU2762108C2 RU2020116181A RU2020116181A RU2762108C2 RU 2762108 C2 RU2762108 C2 RU 2762108C2 RU 2020116181 A RU2020116181 A RU 2020116181A RU 2020116181 A RU2020116181 A RU 2020116181A RU 2762108 C2 RU2762108 C2 RU 2762108C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- solution
- glass surface
- amino groups
- ethanol
- drying
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 53
- 239000011521 glass Substances 0.000 title claims abstract description 44
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 title claims abstract description 19
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 28
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims abstract description 27
- BOTDANWDWHJENH-UHFFFAOYSA-N Tetraethyl orthosilicate Chemical compound CCO[Si](OCC)(OCC)OCC BOTDANWDWHJENH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 14
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 11
- 238000001035 drying Methods 0.000 claims abstract description 11
- 239000003495 polar organic solvent Substances 0.000 claims abstract description 11
- WGYKZJWCGVVSQN-UHFFFAOYSA-N propylamine Chemical group CCCN WGYKZJWCGVVSQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 8
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims abstract description 8
- XDTMQSROBMDMFD-UHFFFAOYSA-N Cyclohexane Chemical compound C1CCCCC1 XDTMQSROBMDMFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 7
- FBWNMEQMRUMQSO-UHFFFAOYSA-N tergitol NP-9 Chemical compound CCCCCCCCCC1=CC=C(OCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCO)C=C1 FBWNMEQMRUMQSO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 6
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 claims abstract description 5
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims abstract description 5
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 claims abstract description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 4
- 230000004913 activation Effects 0.000 claims abstract description 3
- WYTZZXDRDKSJID-UHFFFAOYSA-N (3-aminopropyl)triethoxysilane Chemical compound CCO[Si](OCC)(OCC)CCCN WYTZZXDRDKSJID-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 11
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 claims description 5
- SJECZPVISLOESU-UHFFFAOYSA-N 3-trimethoxysilylpropan-1-amine Chemical compound CO[Si](OC)(OC)CCCN SJECZPVISLOESU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 abstract description 11
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 10
- 239000000463 material Substances 0.000 abstract description 6
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 abstract description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 5
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 4
- 238000009827 uniform distribution Methods 0.000 abstract description 4
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 3
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 3
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 abstract description 3
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 abstract description 3
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 abstract description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 2
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 abstract 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 abstract 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 9
- 238000004630 atomic force microscopy Methods 0.000 description 8
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 8
- 241000252506 Characiformes Species 0.000 description 7
- YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N Toluene Chemical compound CC1=CC=CC=C1 YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 6
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 6
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 5
- 229910004298 SiO 2 Inorganic materials 0.000 description 4
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 4
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 4
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 4
- 238000002444 silanisation Methods 0.000 description 4
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 3
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 239000007987 MES buffer Substances 0.000 description 2
- NJSVDVPGINTNGX-UHFFFAOYSA-N [dimethoxy(propyl)silyl]oxymethanamine Chemical compound CCC[Si](OC)(OC)OCN NJSVDVPGINTNGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 2
- 238000010835 comparative analysis Methods 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- FEKRFYZGYUTGRY-UHFFFAOYSA-N n'-ethylmethanediimine Chemical compound CCN=C=N FEKRFYZGYUTGRY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000004626 scanning electron microscopy Methods 0.000 description 2
- FZHAPNGMFPVSLP-UHFFFAOYSA-N silanamine Chemical class [SiH3]N FZHAPNGMFPVSLP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 2
- SXGZJKUKBWWHRA-UHFFFAOYSA-N 2-(N-morpholiniumyl)ethanesulfonate Chemical compound [O-]S(=O)(=O)CC[NH+]1CCOCC1 SXGZJKUKBWWHRA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- -1 3-dimethylaminopropyl Chemical group 0.000 description 1
- XUZVALKTSQQLCH-UHFFFAOYSA-N 3-tripropoxysilylpropan-1-amine Chemical compound CCCO[Si](CCCN)(OCCC)OCCC XUZVALKTSQQLCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonium chloride Substances [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N Silicon Chemical compound [Si] XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- 235000011114 ammonium hydroxide Nutrition 0.000 description 1
- 239000005388 borosilicate glass Substances 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 230000005757 colony formation Effects 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 238000000151 deposition Methods 0.000 description 1
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010438 granite Substances 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 125000005375 organosiloxane group Chemical group 0.000 description 1
- 239000007800 oxidant agent Substances 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 239000012429 reaction media Substances 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 229910052710 silicon Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010703 silicon Substances 0.000 description 1
- 235000012239 silicon dioxide Nutrition 0.000 description 1
- 239000005361 soda-lime glass Substances 0.000 description 1
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C03—GLASS; MINERAL OR SLAG WOOL
- C03C—CHEMICAL COMPOSITION OF GLASSES, GLAZES OR VITREOUS ENAMELS; SURFACE TREATMENT OF GLASS; SURFACE TREATMENT OF FIBRES OR FILAMENTS MADE FROM GLASS, MINERALS OR SLAGS; JOINING GLASS TO GLASS OR OTHER MATERIALS
- C03C17/00—Surface treatment of glass, not in the form of fibres or filaments, by coating
- C03C17/28—Surface treatment of glass, not in the form of fibres or filaments, by coating with organic material
- C03C17/30—Surface treatment of glass, not in the form of fibres or filaments, by coating with organic material with silicon-containing compounds
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C03—GLASS; MINERAL OR SLAG WOOL
- C03C—CHEMICAL COMPOSITION OF GLASSES, GLAZES OR VITREOUS ENAMELS; SURFACE TREATMENT OF GLASS; SURFACE TREATMENT OF FIBRES OR FILAMENTS MADE FROM GLASS, MINERALS OR SLAGS; JOINING GLASS TO GLASS OR OTHER MATERIALS
- C03C17/00—Surface treatment of glass, not in the form of fibres or filaments, by coating
- C03C17/34—Surface treatment of glass, not in the form of fibres or filaments, by coating with at least two coatings having different compositions
- C03C17/3405—Surface treatment of glass, not in the form of fibres or filaments, by coating with at least two coatings having different compositions with at least two coatings of organic materials
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
- C09D—COATING COMPOSITIONS, e.g. PAINTS, VARNISHES OR LACQUERS; FILLING PASTES; CHEMICAL PAINT OR INK REMOVERS; INKS; CORRECTING FLUIDS; WOODSTAINS; PASTES OR SOLIDS FOR COLOURING OR PRINTING; USE OF MATERIALS THEREFOR
- C09D183/00—Coating compositions based on macromolecular compounds obtained by reactions forming in the main chain of the macromolecule a linkage containing silicon, with or without sulfur, nitrogen, oxygen, or carbon only; Coating compositions based on derivatives of such polymers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Materials Engineering (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Geochemistry & Mineralogy (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Surface Treatment Of Glass (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Изобретение может быть использовано при получении материалов для конструирования био- и химических сенсоров в области генной диагностики для получения генных библиотек и проведения полимеразной цепной реакции на нуклеиновых кислотах, иммобилизованных на поверхности стекла. Способ модификации поверхности стекла для введения функциональных аминогрупп включает активацию раствором концентрированной H2SO4 и 30% H2O2, промывку дистиллированной водой, сушку, обработку раствором тетраэтоксисилана (TEOS) в неполярном органическом растворителе в присутствии водного раствора аммиака и нонилфеноксиполиэтоксиэтанола, промывку неполярным органическим растворителем и этанолом, сушку. Затем проводят обработку раствором (3-аминопропил)триалкоксисилана в этаноле, промывку этанолом, сушку. В качестве неполярного органического растворителя используют циклогексан. Изобретение позволяет получать поверхность стекла с контролируемой плотностью и равномерным распределением функциональных аминогрупп для последующей иммобилизации олигонуклеотидов посредством амидной связи. 5 з.п. ф-лы, 5 ил., 5 пр.
Description
Область техники
Настоящее изобретение относится к области химии, биотехнологии, медицины и химико-фармацевтической промышленности. Более конкретно, настоящее изобретение относится к способу получения покрытий, обладающих повышенной поверхностной плотностью и равномерностью распределения функциональных групп, в частности к способу модификации поверхности стекла для введения функциональных аминогрупп. Данные материалы могут быть использованы для конструирования био- и химических сенсоров, прежде всего в области генной диагностики для получения генных библиотек и проведения полимеразной цепной реакции на нуклеиновых кислотах, иммобилизованных на поверхности стекла.
Уровень техники
Наиболее простым и широко распространенным способом получения функционализированных поверхностей является обработка стекла органосилоксанами или другими реагентами, содержащими соответствующие функциональные группы (см., например, патенты США №№ 5077210, 6689473, 6916541, 7049064, 9982250; заявка РСТ, опубликованная как WO2005003391; А.Х. Туктамышева и др., "Сравнительный анализ различных вариантов химической модификации поверхности кремнезема", Вестник Башкирского университета, 2012, т.17, №3, 1247-1252). Покрытия, получаемые описанными способами, имеют низкую плотность целевых групп, причем их расположение на ровной поверхности зачастую создает стерические препятствия для реакции гибридизации.
Среди разработанных на сегодняшний день методик силанизации поверхности стекла наиболее широко распространен газофазный метод обработки 1% раствором (3-аминопропил)триэтоксисилана (APTES) в абсолютном толуоле, благодаря таким преимуществам как простота исполнения, а также возможность крупномасштабного производства (Wei Wang, Mark W. Vaughn, Morphology and amine accessibility of APTES films on glass surface // Scanning, 30, 65-77, 2008).
Однако за счет того, что реакция протекает в газовой фазе, трудно контролировать распределение и плотность аминогрупп на поверхности стекла. Кроме того, силанизация напрямую APTES приводит к довольно низкой поверхностной плотности функциональных аминогрупп.
Указанная цель была достигнута путем разработки нового способа модификации поверхности стекла с получением поверхности с функционально активными аминогруппами и необходимой плотностью и равномерным распределением аминогрупп на поверхности стекла для последующей иммобилизации олигонуклеотидов посредством амидной связи.
Так, настоящее изобретение представляет собой способ модификации поверхности стекла для введения функциональных аминогрупп, включающий следующие последовательные стадии:
а) активация раствором "пираньи" (конц. H2SO4: 30% H2O2);
б) промывка дистиллированной водой и сушка;
в) обработка раствором тетраэтоксисилана (TEOS) в неполярном органическом растворителе в присутствии водного раствора аммиака и нонилфеноксиполиэтоксиэтанола;
г) промывка указанным неполярным органическим растворителем и этанолом, и сушка;
д) обработка(3-аминопропил)триалкоксисиланом в этаноле;
е) промывка этанолом и сушка.
Также настоящее изобретение представляет собой описанный выше способ, в котором используют раствор "пираньи" с соотношением конц. H2SO4 и 30% H2O2 в диапазоне 2-3:1, соответственно.
Также настоящее изобретение представляет собой описанный выше способ, в котором используют раствор 0,2-0,4% тетраэтоксисилана (TEOS) в неполярном органическом растворителе в присутствии водного раствора 25-30% аммиака и 0,5-1% нонилфеноксиполиэтоксиэтанола.
Также настоящее изобретение представляет собой описанный выше способ, в котором в качестве неполярного органического растворителя используют циклогексан.
Также настоящее изобретение представляет собой описанный выше способ, в котором указанный (3-аминопропил)триалкоксисилан выбран из группы, включающей (3-аминопропил)триметоксисилан (APTMS) и (3-аминопропил)триэтоксисилан (APTES).
Также настоящее изобретение представляет собой описанный выше способ, в котором указанный (3-аминопропил)триалкоксисилан используют в виде 10-20% раствора в этаноле.
Также настоящее изобретение представляет собой описанный выше способ, в котором сушку проводят в течение 1-2 часов при температуре 81-110°C.
Также настоящее изобретение представляет собой описанный выше способ, в котором стадии в) - е) повторяют два или три раза.
Краткое описание рисунков
На Фиг. 1 приведены изображение стекла, модифицированногоспособом, указанным в Примере 1, по данным атомно-силовой микроскопии и гистограмма распределения высот.
На Фиг. 2 приведены изображение стекла, модифицированногоспособом, указанным в Примере 2, по данным атомно-силовой микроскопии и гистограмма распределения высот.
На Фиг. 3 приведены изображение стекла, модифицированногоспособом, указанным в Примере 3, по данным атомно-силовой микроскопии и гистограмма распределения высот.
На Фиг. 4 приведеныфотографии каналов проточных ячеек, полученных согласно Примерам 1, 2 и 3, соответственно, модифицированных олигонуклеотидами А1 и В1, до (слева) и после (справа) гибридизации с комплементарными им олигонуклеотидами, меченными флуоресцентным красителем Cy5.
На Фиг. 5 приведены фотографии колоний после изотермической полимеразной цепной реакции на 4-х спектрально отличных каналах детекции сигнала флуоресценции.
Подробное описание настоящего изобретения
Способ, согласно настоящему изобретению, позволяет осуществлять модификацию поверхности стекла для введения функциональных аминогрупп. Данные материалы могут быть использованы для конструирования био- и химических сенсоров, прежде всего в области генной диагностики для получения генных библиотек и проведения полимеразной цепной реакции на нуклеиновых кислотах, иммобилизованных на поверхности стекла.
Используемая стеклянная подложка может быть предоставлена в любой подходящей форме, такой как предметные стекла, пластины, сферы, листы, трубки, капилляры, прокладки, пластины, предметные стекла и т.д. Подложка может иметь любую удобную форму, такую как форма диска, квадрата, сферы, круга и т.д. В частности, указанная стеклянная подложка может внутренней поверхностью канала проточной ячейки секвенатора ДНК.
В предпочтительном варианте осуществления подложка представляет собой низкофлуоресцентное стекло или стекло из чистого SiO2, наиболее предпочтительно низкофлуоресцентное боросиликатное, боросиликатное стекло, приваренное к кремниевому, или натриево-известковое стекло.
Первой стадией способа согласно настоящему изобретению является стадия очистки и активации поверхности стеклянной подложки. Указанную стадию осуществляют посредством обработки поверхности стекла раствором "пираньи".
Раствор "пираньи" представляет собой смесь концентрированной серной кислоты (H2SO4) и перекиси водорода (H2O2). Поскольку указанная смесь является сильным окислителем, ее применение позволяет удалять с поверхности органические вещества, а также позволяет гидроксилировать поверхность стекла, повышая его гидрофильность.
Используют различные соотношения компонентов указанной смеси. Предпочтительно использовать раствор пираньи с соотношением концентрированной H2SO4 и 30%-50%H2O2 в диапазоне 2-3:1, соответственно. Типичный раствор "пираньи" - это 2-3 части концентрированной серной кислоты и 1 часть 30% раствора перекиси водорода.
После стадии очистки подложки осуществляют стадию нанесения покрытия поверхности стекла диоксидом кремния SiO2. Предпочтительное покрытие SiO2 представляет собой золь-гель покрытие, полученное изтетраэтоксисилана (TEOS). Наиболее предпочтительно использование тетраэтоксисилана в виде раствора в неполярном органическом растворителе в присутствии водного раствора аммиака и поверхностно-активного вещества.
Такой модифицирующий слой обычно имеют толщину от мономолекулярной толщины до нескольких сотен микрон. Предпочтительная толщина покрытия из TEOS составляет 0,1-1 микрон.
В качестве неполярного органического растворителя возможно использование различных неполярных органических растворителей, известных специалисту данной области техники. Предпочтительным является использование циклогексана.
В качестве поверхностно-активного вещества предпочтительно использовать неионогенное неденатурирующее средство, предпочтительно нонилфеноксиполиэтоксиэтанол. Указанное вещество также известно под коммерческим наименованием IGEPAL®CO-520 (Sigma-Aldrich, кат. № 238643).
Наиболее предпочтительно использование тетраэтоксисилана в виде раствора в циклогексане в присутствии в присутствии водного раствора 25-30% аммиака и 0,5-1% нонилфеноксиполиэтоксиэтанола.
Для внесения на поверхность стекла функциональных аминогрупп, необходимых для ковалентного присоединения олигонуклеотидов, используют различные аминосиланы, связывающиеся с гидроксильными группами протравленных и покрытых SiO2 субстратов, упомянутых выше. В качестве аминосиланов предпочтительно использование (3-аминопропил)триалкоксисиланов, включая(3-аминопропил)триметоксисилан (APTMS), (3-аминопропил)триэтоксисилан (APTES), (3-аминопропил)трипропоксисилан(APTPS) и т.п.
Предпочтительно использовать указанные (3-аминопропил)триалкоксисиланы в виде 10-20% раствора в этаноле.
Особенностью способа согласно настоящему изобретению является то, что каждую из стадий проводят раздельно, с использованием отдельных реакционных сред, при этом после каждой из стадий осуществляют промывку и сушку обработанной поверхности.
Осуществление способа согласно настоящему изобретению позволяет получить поверхность стекла с высокой степенью равномерности распределения функциональных аминогрупп.
Повторение стадий в) - е) способа согласно настоящему изобретению последовательно несколько раз, предпочтительно два или три, с одним и тем же стеклом позволяет контролировать плотность функциональных аминогрупп на поверхности материала.
В настоящем описании в качестве примера осуществления настоящего изобретения, не ограничивающего рамки настоящего изобретения, приведен вариант осуществления, в котором стеклянная подложка выполнена в виде проточной ячейки секвенатора, в которой модификации подвергают канал указанной проточной ячейки. Типичные ячейки имеют толщину стекла около 1 мм и размеры 14 мм × 28 мм.
Сопоставительный анализ способа согласно настоящему изобретению с известными и широко используемыми способами силанизации и внесения функциональных аминогрупп, таким, например, как силанизация 1% раствором APTES в абсолютном толуоле, показал, что способ согласно настоящему изобретению обладает следующими преимуществами:
1) увеличение плотности аминогрупп на поверхности канала проточной ячейки,
2) возможность контроля за равномерным распределением аминогрупп на поверхности канала проточной ячейки.
Далее приведены примеры вариантов осуществления способа согласно настоящему изобретению. Указанные примеры приведены для целей разъяснения сути настоящего изобретения и не ограничивают каким-либо образом рамки настоящего изобретения, определяемые формулой настоящего изобретения.
Примеры
Пример 1. Способ модификации поверхности канала проточной ячейки.
Поверхность канала проточной ячейки активировали раствором "пираньи" (H2SO4:H2O2=2:1), который вводили в канал и оставляли реагировать при 100°C в течение 24 ч. Затем ячейку промывали 20×20 мкл дистиллированной воды и высушивали при 100°C в течение 2 ч. Далее готовили раствор циклогексан:IGEPALC-520:NH4OH:TEOS = 150:7,5:1:4, который вводили в канал, помещали ячейку в этот же раствор и оставляли реагировать при постоянном перемешивании при комнатной температуре в течение 24 ч. После чего ячейку промывали 20х20 мкл циклогексана и 20х20 мкл этанола и сушили при 100°C в течение 2 ч. На последнем этапе в канал проточной ячейки вводили 10% раствор APTES в этаноле и оставляли реагировать при постоянном перемешивании при комнатной температуре в течение 24 ч. Затем ячейку промывали 20х20 мкл этанола и сушили при 100°C в течение 2 ч.
Заселенность поверхности стекла и рельеф поверхности стекла определяли с помощью атомно-силовой микроскопии (АСМ) с использованием сканирующего электронного микроскопа Inspect (FEI, США), напылительной установки SPIModuleSputter/CarbonCoater (StructureProbeInc., США), сканирующего зондового микроскопа NtegraAura (NT-MDT, Россия). Исследовали морфологию и механические свойства поверхности стекол с помощью полуконтактного и контактного режимов сканирования методом АСМ. Использовали зонды серии HA_NC, NSG01, NSG10 (NT-MDT, Россия). Коэффициент жесткости зондов измеряли с помощью метода Садера (Sader, J.E., Larson, I., Mulvaney, P., White, L.R. Method for calibration of atomic force microscope cantilevers. // Rev. Sci. Instrum. 66, - 1995. - P. 3789-3498), механические свойства изучались по кривым подвода/отвода. Изучение образцов проводили на воздухе при средней температуре 23°С и относительной влажности в пределах 30-40%. При измерениях использовали пассивную (гранитная плита) и активную (антивибрационный стол) виброзащиты. Для юстировки зонда и выбора области для АСМ измерений использовали оптическую систему регистрации Optem (Excelitas Technologies Corp., Уолтем, Массачусетс, США) с камерой и зумом в пределах 85х - 1050х кратного увеличения. Для изучения морфологии образцов стекол методом сканирующей электронной микроскопии (СЭМ) предварительно напыляли магнетронным методом золотую токопроводящую пленку толщиной около 30 нм для снятия заряда во время сканирования образца пучком сфокусированных электронов. Измерения методом СЭМ проводили в вакууме при давлении около 10-3 Па и ускоряющем напряжении 20 кВ в режиме вторичных электронов (детектор Эверхарта-Торнли).
На Фиг. 1 представлена фотография, демонстрирующая заселенность поверхности стекла, и гистограмма распределения высот.
Пример 2. Способ модификации поверхности канала проточной ячейки, в котором стадии в) - е) способа согласно настоящему изобретению повторяли два раза.
Для увеличения плотности аминогрупп на поверхности канала проточной ячейки по сравнению с Примером 1 стадии в) - е) способа согласно настоящему изобретению повторяли два раза на одной и той же проточной ячейке.
На Фиг. 2 представлена фотография, демонстрирующая заселенность поверхности стекла, и гистограмма распределения высот. Данные получены методом, описанным в Примере 1.
Пример 3. Способ модификации поверхности канала проточной ячейки, в котором стадии в) - е) способа согласно настоящему изобретению повторяли три раза.
Для увеличения плотности аминогрупп на поверхности канала проточной ячейки по сравнению с Примером 1 стадии в) - е) способа согласно настоящему изобретению повторяли три раза на одной и той же проточной ячейке.
На Фиг. 3 представлена фотография, демонстрирующая заселенность поверхности стекла, и гистограмма распределения высот. Данные получены методом, описанным в Примере 1.
Пример 4. Подтверждение наличия функциональных аминогрупп на поверхности стекла, модифицированного способом согласно настоящему изобретению.
Данные в Примерах 1-3, полученные с помощью атомно-силовой микроскопии, показывают заселенность поверхности стекла, модифицированного способом согласно настоящему изобретению, но не доказывают, что на поверхность канала проточной ячейки внесены функциональные аминогруппы.
Для доказательства наличия функциональных аминогрупп на поверхности канала ячеек, полученных согласно Примерам 1, 2 и 3, посредством амидной связи иммобилизовали олигонуклеотиды А1, Б1:
5'-(Carboxy-dT)tt-ttt-ttt-ttt-act-atg-ccg-ctg-gtg-gct-cta-gat-gtg-3'
5'-(Carboxy-dT)tt-ttt-ttt-ttg-ttc-gtc-ttc-tgc-cgt-atg-ctc-ta-3'
Для этого в канал проточной ячейки вводили раствор, содержащий 27 мкл 100 мМ буферного раствора 2-(N-морфолино)этансульфоновой кислоты(MES), рН 4,8, 1 мкл 1,25М раствора N-(3-диметиламинопропил)-N'-этилкарбодиимида (EDC) и по 4 мкл 25 мкМ раствора каждого олигонуклеотида. Ячейку оставляли реагировать при комнатной температуре в течение 24 ч. Затем ячейку промывали 20х20 мкл буферного раствора MES, рН4,8.
Далее осуществляли гибридизацию иммобилизованных олигонуклеотидов с комплементарными им олигонуклеотидами, меченными флуоресцентным красителем Cy5:
5'-(Cy5)cac-atc-tag-agc-cac-cag-cgg-cat-agt-aa-3'
5'-(Cy5)tag-agc-ata-cgg-cag-aag-acg-aac-a-3'
После гибридизации сигнал флуоресценции красителя снимали на приборе Typhoon 9200.
На Фиг. 4 представлены фотографии каналов проточных ячеек, полученных согласно Примерам 1,2 и 3, соответственно, модифицированных олигонуклеотидами А1 и Б1, до и после гибридизации с комплементарными им олигонуклеотидами, меченными флуоресцентным красителем Cy5.
Как видно на Фиг. 4, использование способа согласно настоящему изобретению позволяет модифицировать поверхность канала проточной ячейки с достижением высокой плотности и равномерным распределением функциональных аминогрупп на поверхности материала.
Пример 5. Изучение образования колоний на стекле, модифицированном способом согласно настоящему изобретению, после поведения изотермической полимеразной цепной реакции
Изотермическую ПЦР проводили, как описано в WO 98/44151. На поверхности стекла иммобилизовали олинонуклеотиды А1 и Б1. Фотографии, приведенные на Фиг. 5, получали на приборе Нанофор-СПС (время экспозиции 3 сек, размер кадра 2448х2048 пикселей, площадь зрения 0,393 кв.мм). В результате обработки данных изображений в поле зрения было обнаружено 527324 колонии (плотность колоний составила 1343311 колоний/кв.мм). Полученный результат свидетельствуют о достижении уровня загрузки иммобилизованными на поверхности стекла ДНК колониями, достаточного для реализации различных методов исследования, в частности, метода массового параллельного секвенирования ДНК.
Хотя настоящее изобретение было подробно описано со ссылкой на предпочтительные варианты его осуществления, специалисту в данной области техники понятно, что могут быть сделаны различные замены и использованы различные эквиваленты, которые не выходят за рамки настоящего изобретения. Все документы, процитированные в настоящем описании, являются частью настоящей заявки, и целиком включены в настоящее описание посредством ссылки.
Claims (12)
1. Способ модификации поверхности стекла для введения функциональных аминогрупп, включающий следующие последовательные стадии:
а) активация раствором конц. H2SO4 : 30% H2O2 с соотношением конц. H2SO4 и 30% H2O2 в диапазоне 2-3:1 соответственно;
б) промывка дистиллированной водой, сушка;
в) обработка раствором 0,2-0,4% тетраэтоксисилана (TEOS) в неполярном органическом растворителе в присутствии водного раствора 25-30% аммиака и 0,5-1% нонилфеноксиполиэтоксиэтанола;
г) промывка неполярным органическим растворителем и этанолом, сушка;
д) обработка раствором 10-20% (3-аминопропил)триалкоксисилана в этаноле;
е) промывка этанолом, сушка.
2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве неполярного органического растворителя используют циклогексан.
3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанный (3-аминопропил)триалкоксисилан выбран из группы, включающей (3-аминопропил)триметоксисилан и (3-аминопропил)триэтоксисилан.
4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что сушку проводят в течение 1-2 часов при температуре 81-110°C.
5. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанные стадии в) - е) повторяют два раза.
6. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанные стадии в) - е) повторяют три раза.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2020116181A RU2762108C2 (ru) | 2020-05-18 | 2020-05-18 | Способ модификации поверхности стекла для введения функциональных аминогрупп |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2020116181A RU2762108C2 (ru) | 2020-05-18 | 2020-05-18 | Способ модификации поверхности стекла для введения функциональных аминогрупп |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2020116181A3 RU2020116181A3 (ru) | 2021-11-18 |
| RU2020116181A RU2020116181A (ru) | 2021-11-18 |
| RU2762108C2 true RU2762108C2 (ru) | 2021-12-15 |
Family
ID=78595633
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2020116181A RU2762108C2 (ru) | 2020-05-18 | 2020-05-18 | Способ модификации поверхности стекла для введения функциональных аминогрупп |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2762108C2 (ru) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2826178C1 (ru) * | 2023-11-01 | 2024-09-05 | Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Томский государственный университет систем управления и радиоэлектроники" | Способ получения подложки для массового параллельного синтеза олигонуклеотидов |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2000033078A1 (en) * | 1998-12-01 | 2000-06-08 | Syntrix Biochip, Inc. | Porous coatings bearing ligand arrays |
| US6916541B2 (en) * | 2001-09-07 | 2005-07-12 | Penn State Research Foundation | Modified substrates for the attachment of biomolecules |
| RU2318852C2 (ru) * | 2005-12-23 | 2008-03-10 | Самсунг Электроникс Ко., Лтд | Способ получения покрытий и пленок с применением органо-неорганических нанокомпозитных материалов на основе пленкообразующих органических полимеров, привитых олигосилоксановыми цепями |
| WO2011156434A2 (en) * | 2010-06-07 | 2011-12-15 | Firefly Bioworks, Inc. | Nucleic acid detection and quantification by post-hybridization labeling and universal encoding |
-
2020
- 2020-05-18 RU RU2020116181A patent/RU2762108C2/ru active
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2000033078A1 (en) * | 1998-12-01 | 2000-06-08 | Syntrix Biochip, Inc. | Porous coatings bearing ligand arrays |
| US6916541B2 (en) * | 2001-09-07 | 2005-07-12 | Penn State Research Foundation | Modified substrates for the attachment of biomolecules |
| RU2318852C2 (ru) * | 2005-12-23 | 2008-03-10 | Самсунг Электроникс Ко., Лтд | Способ получения покрытий и пленок с применением органо-неорганических нанокомпозитных материалов на основе пленкообразующих органических полимеров, привитых олигосилоксановыми цепями |
| WO2011156434A2 (en) * | 2010-06-07 | 2011-12-15 | Firefly Bioworks, Inc. | Nucleic acid detection and quantification by post-hybridization labeling and universal encoding |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| WEI WANG et al., Morphology and Amine Accessibility of (3-Aminopropyl) Triethoxysilane Films on Glass Surface, Scanning, 2008, vol. 30, pp. 65-77. * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2826178C1 (ru) * | 2023-11-01 | 2024-09-05 | Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Томский государственный университет систем управления и радиоэлектроники" | Способ получения подложки для массового параллельного синтеза олигонуклеотидов |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2020116181A3 (ru) | 2021-11-18 |
| RU2020116181A (ru) | 2021-11-18 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP7562822B2 (ja) | ゲルパターン化した表面 | |
| JP7574265B2 (ja) | フローセルパッケージおよびその製造方法 | |
| JP7087010B2 (ja) | ヒドロゲルコーティングを有するフローセル | |
| US7579077B2 (en) | Nanofiber surfaces for use in enhanced surface area applications | |
| AU2004236260B2 (en) | Nanofiber surfaces for use in enhanced surface area applications | |
| CN1125342C (zh) | 用于生物反应的高度特异性的表面,制备它们的方法及其使用方法 | |
| EP2564191B1 (en) | Nanoscale apertures having islands of functionality | |
| JP3670019B2 (ja) | 巨大分子を平行に整列させる装置およびその使用 | |
| KR20200016160A (ko) | 플로우 셀용 표면 보호 코팅 | |
| EP1643249A1 (en) | Bio-chip | |
| RU2762108C2 (ru) | Способ модификации поверхности стекла для введения функциональных аминогрупп | |
| TW202342727A (zh) | 核酸固定物件及其方法 | |
| CN116446055A (zh) | 一种具有高密度反应位点的基底的制备方法及应用 | |
| Vlachopoulou et al. | Protein arrays on high-surface-area plasma-nanotextured poly (dimethylsiloxane)-coated glass slides | |
| Honda et al. | Development of enzymatic reactions in miniaturized reactors | |
| CN114561455B (zh) | 一种芯片表面化学修饰方法 | |
| Shishkin et al. | Development of biological microchips on an aluminum support with cells made of brush polymers | |
| EP3284581B1 (en) | Method to fabricate chemically-stable plasma-etched substrates for direct covalent biomolecule immobilization | |
| WO2025207535A1 (en) | Photo-switchable surfaces | |
| Akkamsetty et al. | Application of nanostructured biochips for efficient cell transfection microarrays | |
| TWI245771B (en) | Micro-region selectively activating hydrophobic chip and its preparing method | |
| WO2005014852A1 (de) | Mikroarrays immobilisierter biomoleküle, deren herstellung und deren verwendung | |
| JP2005058892A (ja) | 多孔質体およびその製造方法 | |
| WO2018092908A1 (ja) | 生体関連分子固定化用担体 | |
| Tsougeni et al. | Plasma-Induced Nanotexturing of Polymers for the Fabrication of Protein and DNA Arrays |