JP7087010B2 - ヒドロゲルコーティングを有するフローセル - Google Patents

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１７年１２月２１日に出願された米国仮出願第６２／６０９，１０５号の利益を主張し、その内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

生物学的アレイは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）およびリボ核酸（ＲＮＡ）を含む、分子を検出および分析するために使用される広範囲のツールの中にある。これらの適用において、アレイは、ヒトおよび他の生物の遺伝子に存在するヌクレオチド配列のためのプローブを含むように操作される。特定の適用において、例えば、個々のＤＮＡプローブおよびＲＮＡプローブは、配列保持体上の幾何学的格子の位置に（またはランダムに）付着され得る。例えば、ヒトまたは生物由来の試験試料は、相補的フラグメントがアレイ中の個々の部位でプローブにハイブリダイズするように、グリッドに曝露され得る。次いで、この配列を、部位にわたる特異的な周波数の光をスキャンして、フラグメントがハイブリダイズした部位の蛍光によって、どのフラグメントが試料中に存在するかを同定することによって、試験し得る。

生物学的アレイは、遺伝子配列決定のために使用され得る。一般に、遺伝子配列決定は、ＤＮＡまたはＲＮＡの断片などの遺伝物質の長さにおけるヌクレオチドまたは核酸の順序を決定することを含む。塩基類対のより長い配列がますます分析されており、得られた配列情報は、フラグメントが由来する遺伝物質の広範な長さの配列を確実に決定するために、フラグメントを一緒に論理的に適合させるために、種々のバイオインフォマティクス方法において使用され得る。特性フラグメントの自動化されたコンピュータベースの検査が開発され、そしてゲノムマッピング、遺伝子およびそれらの機能の同定、特定の状態および疾患状態のリスクの評価などにおいて使用されてきた。これらの適用を超えて、生物学的アレイは、広範囲の分子、分子のファミリー、遺伝子発現量、一塩基多型、および遺伝子型の検出および評価のために使用され得る。

第１の態様において、本方法は、パターン化されたフローセル基材の凹部に官能化コーティング層を適用することを含み、該凹部は、間隙領域によって分離される；官能化コーティング層にプライマーをグラフトして、該凹部にグラフトされた官能化コーティング層を形成すること；および該グラフトされた官能化コーティング層上にヒドロゲルを適用すること；を含む。

本方法のこの第１の態様の例において、ヒドロゲルは、ポリ（Ｎ－（５－アジドアセトアミジルペンチル）アクリルアミド－ｃｏ－アクリルアミド）、架橋ポリアクリルアミド、アガロースゲル、および架橋ポリエチレングリコールからなる群より選択される。

本方法のこの第１の態様の例示では、ヒドロゲルは、グラフトされた官能化コーティング層上に配置される。１つの実施形態では、ヒドロゲルは、凹部内の官能化コーティング層上、および少なくともいくつかの間隙領域上に適用される。別の実施形態では、ヒドロゲルを適用することは、ヒドロゲルを凹部内のグラフトされた官能化コーティング層上に選択的に堆積させることを含む。

本方法のこの第１の態様の一例では、官能化コーティング層を適用する前に、本方法は、パターン化フローセル基材の表面を処理して、表面に官能基を付着させて、処理された凹部および処理された間隙領域を形成することをさらに含む。この実施形態では、官能化コーティング層を凹部内に適用することは、処理された凹部内および処理された間隙領域上に官能化コーティング層を適用することと、処理された間隙領域から官能化コーティング層を研磨することとを含む。

本方法のこの第１の態様の例では、ヒドロゲルを適用することは、約０．００１％から約０．１％（質量対体積）までのヒドロゲル材料を含む水性混合物を適用することを含む。例えば、ヒドロゲル材料は、ポリ（Ｎ－（５－アジドアセトアミジルペンチル）アクリルアミド－ｃｏ－アクリルアミド）、架橋ポリアクリルアミド、アガロースゲル、および架橋ポリエチレングリコールからなる群から選択される。

本方法のこの第１の態様の一例では、パターン化フローセル基材の周囲にスペーサー層が結合され、ヒドロゲルが適用された後、本方法は、蓋をスペーサー層に結合することをさらに含む。

本方法のこの第１の態様の一例では、官能化コーティング層が適用された後、プライマーがグラフトされる前に、本方法は、少なくともいくつかの間隙領域に蓋を結合することをさらに含む。

本方法のこの第１の態様の例示では、ヒドロゲルを適用することは、グラフトされた官能化コーティング層上にヒドロゲルを選択的に堆積させることを含む。本方法のこの第１の態様の任意の特徴は、任意の望ましい方法および／または構成で一緒に組み合わせることができることを理解されたい。

第２の態様では、本方法は、凹部が間隙領域によって分離され、それによってシラン化された凹部およびシラン化された間隙領域を形成する、内部に画定される凹部を有する流路を含むパターン化された基材の表面にシランまたはシラン誘導体を付着させるステップと、シラン化された凹部内およびシラン化された間隙領域上に官能化されたコーティングを適用するステップと、シラン化された間隙領域から官能化されたコーティングを研磨するステップと、シラン化された凹部内の官能化されたコーティングにプライマーをグラフトして、凹部内にグラフトされた官能化コーティングを形成するステップと、凹部内のグラフトされた官能化コーティング上にヒドロゲルを適用するステップとを含む。

この第２の態様の一例では、ヒドロゲルを適用することは、約０．００１％から約０．１％（質量対体積）までのヒドロゲル材料を含む水性混合物を適用することを含む。この実施形態では、ヒドロゲル材料は、ポリ（Ｎ－（５－アジドアセトアミジルペンチル）アクリルアミド－ｃｏ－アクリルアミド）、架橋ポリアクリルアミド、アガロースゲル、および架橋ポリエチレングリコールからなる群から選択される。

この第２の態様の一例では、スペーサー層がパターン形成された基材に結合され、流路の周囲を画定し、ヒドロゲルが適用された後、本方法は、蓋をスペーサー層に結合することをさらに含む。

この第２の態様の一例では、官能化コーティング層が研磨された後、プライマーがグラフトされる前に、本方法は、少なくともいくつかの間隙領域に蓋を結合することをさらに含む。

本方法のこの第２の態様の一例では、ヒドロゲルを適用することは、ヒドロゲルを凹部内のグラフトされた官能化コーティング層上に適用することを含む。１つの実施形態では、ヒドロゲルは、凹部内の官能化コーティング層上、および少なくともいくつかの間隙領域上に適用される。別の実施形態では、ヒドロゲルを適用することは、グラフトされた官能化コーティング層上にヒドロゲルを選択的に堆積させることを含む。

本方法のこの第２の態様の任意の特徴は、任意の望ましい方法で一緒に組み合わせることができることを理解されたい。さらに、方法のこの態様および／または方法の第１の態様の特徴の任意の組み合わせを一緒に使用することができ、かつ／またはこれらの態様のいずれかまたは両方からの任意の特徴を本明細書に開示された例のいずれかと組み合わせることができることを理解されたい。

別の態様では、フローセルは、間隙領域によって分離された凹部を含むパターン化された基材と、凹部の各々に付着された配列決定表面化学物質とを含み、配列決定表面化学物質は、官能化コーティング層と、機能性コーティング層にグラフトされたプライマーと、配列決定表面化学物質上の、および任意選択で間隙領域のいくつかの上のヒドロゲルとを含む。

フローセルの一例では、ヒドロゲルはまた、少なくともいくつかの間隙領域上にある。

フローセルの一例では、官能化コーティング層は、ポリ（Ｎ－（５－アジドアセトアミジルペンチル）アクリルアミド－ｃｏ－アクリルアミド）である。

フローセルの一例では、ヒドロゲルは、ポリ（Ｎ－（５－アジドアセトアミジルペンチル）アクリルアミド－ｃｏ－アクリルアミド）、架橋ポリアクリルアミド、アガロースゲル、および架橋ポリエチレングリコールからなる群から選択される。

フローセルの一例では、ヒドロゲルは表面化学物質にグラフトされない。

フローセルの一例では、パターン化された基材は、少なくとも１つのフローチャネルを含み、凹部は、少なくとも１つのフローチャネル内に画定され、フローセルは、スペーサー層が少なくとも１つのフローチャネルの周囲を画定するように、パターン化された基材の他の間隙領域に取り付けられたスペーサー層をさらに含む。この実施形態では、フローセルは、スペーサー層に取り付けられた蓋をさらに備えることができる。

フローセルのこの態様の任意の特徴は、任意の所望の様式で一緒に組み合わされ得ることが理解されるべきである。さらに、フローセルのこの態様および／または方法の第１および／または第２の態様の特徴の任意の組み合わせを一緒に使用してもよく、および／または任意の態様の任意の特徴を本明細書に開示される例の任意のものと組み合わせてもよいことを理解されたい。

本開示の例の特徴は、以下の詳細な説明および図面を参照することによって明らかになり、図面において、同様の参照番号は、おそらく同一ではないが、同様の構成要素に対応する。簡潔にするために、先に説明した機能を有する符号または特徴は、それらが現れる他の図面と接合構造して説明されてもよいし、説明されなくてもよい。

図１は、本明細書に開示される方法の一例を示すフロー図である。 図２は、本明細書で開示される方法の別の例を示す流れ図である。 図３Ａ～３Ｇ、および図３Ａ～３Ｄ、３Ｈ、および３Ｉは、本明細書で開示される方法のそれぞれの例を示す概略断面図である。 図４は、図３Ａ～３Ｇおよび図３Ａ～３Ｄ、３Ｈおよび３Ｉに示される方法によって形成される例示的なフローセルの断面図である。 図５は、ヒドロゲルコーティングを有さない比較例フローセルのタイル（Ｘ軸上の１～３８４）およびヒドロゲルコーティングを含む例示的フローセルのタイル（Ｘ軸上の３８５～７６８）について、フィルタを通過するクラスターの割合（％ＰＦ）およびＤＮＡテンプレートで占められた凹部／ウェルの割合（％占有率）を示すグラフである。 図６は、比較例フローセルおよびヒドロゲルコーティングを含む実施例フローセルについての、フィルタを通過するクラスターの割合（％ＰＦ）対テンプレート濃度（ｐＭ）のグラフである。 図７は、比較例フローセルおよびヒドロゲルコーティングを含む実施例フローセルについて、重複テンプレートを除去した後にフィルタを通過したクラスターの正味割合（％ＰＦ）対テンプレート濃度（ｐＭ）のプロットである。 図８Ａおよび８Ｂは、比較例フローセルおよびヒドロゲルコーティングを含む実施例フローセルについて、１５０の配列決定サイクル後のリード１（Ｒ１）（図８Ａ）およびリード２（Ｒ２）（図８Ｂ）不一致率のプロットである。

フローセルは、しばしば、配列決定操作、アッセイ、および他の生物学的適用において使用される。パターン化されたフローセルは、凹部が画定された、またはその上にある基材または保持体を含むことができ、化学的および／または生物学的に活性のある表面化学物質は、凹部に限定することができる。一例として、表面化学物質には機能化コーティング層とプライマーが含まれる。いくつかの配列決定操作において、プライマーがフローセル基材の凹部に固定化された後、配列決定テンプレート（プライマーに相補的な部分を含む）が凹部に導入され得、次いで、配列決定テンプレートが増幅されて、配列決定テンプレートの同一のコピーを作製し得る（その過程は、本明細書中でクラスター生成と呼ばれる）。

本明細書に開示される実施例では、ヒドロゲル（本明細書ではヒドロゲルコーティングとも呼ばれる）は、直接的に、表面化学物質、すなわち官能化コーティング層およびプライマー上に含まれる。ヒドロゲルコーティングは、クラスター生成時の配列決定テンプレート播種速度を遅くすることができることが見出された。結果として、１つの配列決定テンプレートが凹部に播種された後、任意の後続の配列決定テンプレートがヒドロゲルを通って凹部に拡散する機会を有する前に、テンプレートをより大きなクラスターに増幅するためのより多くの時間（ヒドロゲルが含まれない場合と比較して）が存在する。これは、単一の配列決定テンプレートに播種する凹部の集団を増加させる。換言すれば、これは、特定の凹部内のモノクローナルクラスター化（すなわち、１つの型の配列決定テンプレートの複数のコピーの生成）を増加させ、そして特定の凹部内のポリクローナルクラスター化（すなわち、複数種類の配列決定テンプレートの複数のコピーの生成）を減少させる。重複排除後にフィルタを通過するクラスターの数は、モノクローナルクラスター化の増加を示し得る。一実施例では、ヒドロゲルコーティングを含む本明細書に開示される実施例の正味ＰＦ％は、ヒドロゲルコーティングを含まない比較例の正味ＰＦ％よりも約２％～約１７％高い範囲である。

本明細書に開示される一方法は、完全にウェハレベルで、完全にダイス（die）レベルで、部分的にウェハレベルで、および／または部分的にダイスレベルで実行されてもよい。ウェハおよび金型レベルで部分的に方法を実行する例として、ウェハを使用して方法を開始し、次いで、ウェハをダイシングしていくつかの金型を形成し、方法は、各ダイスを使用して継続することができる。少なくともいくつかの例では、オープンウェーハ処理を実行する能力は、品質管理および特徴付けのために様々な計測／分析技術を使用することを可能にする。フローセルを形成するために結合される前に、パターン化され、表面改質されたウェハ／基材は、例えば、原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）、偏光解析、ゴニオメトリ、スキャトロメトリ、および／または蛍光技術に曝されてもよい。あるいは、結合されたフローセルは、これらの技術に曝露され得る。ダイスの段階では、本方法は、開放面ダイス上で、または組み立てられたフローセル（囲まれたフローチャンネルを有する）上で実施することができる。

本明細書で使用される用語は、別段の指定がない限り、関連技術におけるそれらの通常の意味をとることを理解されたい。本明細書で使用されるいくつかの用語およびそれらの意味を以下に示す。

単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈が明らかにそうでないことを示さない限り、複数の指示対象を含む。

これらの用語を含む、備える、包含する、および様々な形状の用語は、互いに同義であり、等しく広いことを意味する。

用語「上」、「下」、「下側」、「上側」などは、本明細書では、フローセルおよび／またはフローセルの様々な構成要素を説明するために使用される。これらの方向を示す用語は、具体的な配向性を意味するものではなく、構成要素間の相対的な配向性を示すために使用されることを理解されたい。方向を示す用語の使用は、本明細書に開示される実施例を任意の具体的な配向性に限定すると解釈されるべきではない。

本明細書中で使用される場合、「アルキル」は、完全に飽和した（すなわち、二重結合または三重結合を含まない）直鎖または分岐鎖状炭化水素鎖を指し、アルキル基は、１～２０個の炭素原子を有し得る。例のアルキル基には、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、第三ブチル、ペンチル、ヘキシルなどが含まれる。例として、「Ｃ１～４アルキル」という名称は、アルキル鎖中に１～４個の炭素原子が存在すること、すなわち、アルキル鎖は、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ｎ－ブチル、イソブチル、ｓｅｃ－ブチル、およびｔ－ブチルからなる群より選択されることを示す。

本明細書中で使用される場合、「アルケニル」は、１つ以上の二重結合を含む直鎖または分岐鎖状炭化水素鎖をいう。アルケニル基は、２～２０個の炭素原子を有することができる。例示的なアルケニル基には、エテニル、プロペニル、ブテニル、ペンテニル、ヘキセニルなどが含まれる。

本明細書中で使用される場合、「アルキン」または「アルキニル」は、１つ以上の三重結合を含む直鎖または分枝鎖炭化水素鎖をいう。アルキニル基は、２～２０個の炭素原子を有していてもよい。

本明細書中で使用される場合、「アリール」は、環主鎖に炭素のみを含む芳香環または環系（すなわち、２つの隣り合う炭素原子を共有する２つ以上の縮合環）をいう。アリールが環系である場合、系中の全ての環は芳香族である。アリール基は、６～１８個の炭素原子を有することができる。アリール基の例には、フェニル、ナフチル、アズレニル、およびアントラセニルが含まれる。

本明細書中で使用される場合、用語「取り付けられた」は、互いに接合され、固定され、接着され、接続され、または結合される２つの物の状態をいう。アタッチメント（結合）は、機械的であってもよいし、化学的であってもよい。例えば、核酸は、共有結合または非共有結合によって、官能化コーティング層に化学的に結合され得る。共有結合は、原子間で電子の一対を共有することを特徴とする。非共有結合は、電子の一対の共有を伴わない物理的な結合であり、例えば、水素結合、イオン結合、ファンデルワールス力、親水性相互作用および疎水性相互作用を含むことができる。

「アジド（azide）」または「アジド（azido）」官能基は、－Ｎ_３を指す。

本明細書で使用されるように、「結合領域」は、別の物質に結合されるべき基材上の領域を指し、別の物質は、例として、スペーサー層、蓋、別の基材など、またはそれらの組み合わせ（例えば、スペーサー層および蓋）であってもよい。結合領域で形成される結合は、化学結合（上述のようである）または機械的結合（例えば、ファスナなどを使用する）であってもよい。

本明細書中で使用される場合、「カルボシクリル」は、環系背骨中に炭素原子のみを含む非芳香族環または環系を意味する。カルボシクリルが環系である場合、２つ以上の環が、縮合、架橋、またはスピロ連結様式で一緒に結合され得る。カルボシクリルは、環系中の少なくとも１つの環が芳香族でないという条件で、任意の飽和度を有し得る。したがって、カルボシクリルには、シクロアルキル、シクロアルケニル、およびシクロアルキニルが含まれる。カルボシクリル基は、３～２０個の炭素原子を有してもよい。カルボシクロ環の例には、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘキセニル、２，３－ジヒドロ－インデン、ビシクロ［２．２．２］オクタニル、アダマンチル、およびスピロ［４．４］ノナニルが含まれる。

本明細書で使用される「カルボン酸」または「カルボキシル」という語は、本明細書で使用される場合、－Ｃ（Ｏ）ＯＨを指す。

本明細書中で使用される場合、「シクロアルキレン」は、２つの結合点を介して分子の残りの部分に結合している完全に飽和したカルボシクリル環または環系を意味する。

本明細書中で使用される場合、「シクロアルケニル」または「シクロアルケン」は、少なくとも１つの二重結合を有するカルボシクリル環または環系を意味し、環系中の環は芳香族ではない。例としては、シクロヘキセニルまたはシクロヘキセンおよびノルボルネニルまたはノルボルネンが挙げられる。また、本明細書中で使用される場合、「ヘテロシクロアルケニル」または「ヘテロシクロアルケン」は、環主鎖中に少なくとも１つのヘテロ原子を有するカルボシクリル環または環系であって、少なくとも１つの二重結合を有し、環系中における環が芳香族ではないものを意味する。

本明細書で使用する「シクロアルキニル」または「シクロアルキン」とは、少なくとも１つの三重結合を有するカルボシクリル環または環系を意味し、環系中における環が芳香族ではない。例はシクロオクチンである。他の例はビシクロノインである。本明細書で使用する「ヘテロシクロアルキニル」または「ヘテロシクロアルキン」とは、少なくとも１つの三重結合を有し、環系中における環が芳香族ではない、環主鎖中に少なくとも１つのヘテロ原子を有するカルボシクリル環または環系を意味する。

本明細書で使用される用語「堆積」は、手動または自動であってもよく、表面性状の改変をもたらす任意の適切な適用技術を指す。一般に、蒸着は、蒸着技術、コーティング技術、グラフト技術などを使用して行うことができる。いくつかの具体例は、化学蒸着（ＣＶＤ）、スプレーコート（例えば、超音波スプレーコート）、スピンコート、ダンクまたはディップ法，ドクターブレードコーティング、パドルディスペンシング、フロースルーコーティング、エアロゾル印刷、インクジェット印刷などを含む。

本明細書で使用されるように、「凹部」という語は、パターン形成された基材表面の隙間領域によって完全に取り囲まれた表面開口を有するパターン形成された基材内の別個の凹状が特徴の部分を指す。凹部は、例えば、円形、楕円形、正方形、多角形、星形（任意の個数の頂点を有する）等を含む様々な形状のいずれかを面内の開口部に有することができる。表面と直交する凹部の断面は、湾曲、正方形、多角形、双曲線、円錐状、角度等であってもよい。一例として、凹部はウェルであってもよい。

用語「各々」は、アイテムのコレクションに関して使用される場合、コレクション内の個々のアイテムを識別することを意図するが、コレクション内のすべてのアイテムを必ずしも参照するわけではない。例外は、明示的な開示または文脈が明らかにそうでないことを指示する場合に発生する可能性がある。

本明細書で使用される「フローセル」という語は、反応を行うことができる室（すなわち、流路）と、室に試薬を送達するための入口と、室から試薬を除去するための出口とを有する容器を意味することを意図している。いくつかの例では、室は、室内で起こる反応の検出を可能にする。例えば、室は、室内のアレイ、光学的に標識された分子などの光学的検出を可能にする１つまたは複数の透明表面を含むことができる。

本明細書中で使用される場合、「流路」は、液状試料を選択的に受容し得る、２つの結合された構成要素の間に規定される領域であり得る。いくつかの例では、流路は、パターン形成された基材と蓋との間に画定されてもよく、したがって、パターン形成された基材に画定された１つまたは複数の凹部と流体により連通してもよい。

本明細書で言及される「官能化コーティング層」は、液体および気体に対して透過性である半剛性材料を意味することが意図される。官能化コーティング層は、液体が吸収されると膨潤し、乾燥によって液体が除去されると収縮するヒドロゲルであってもよい。本明細書に開示される実施例では、官能化コーティング層は、アルキン官能基と反応することができるアジド／アジド官能基を含む。例えば、官能化コーティング層は、ポリ（Ｎ－（５－アジドアセトアミジルペンチル）アクリルアミド－ｃｏ－アクリルアミド）（ＰＡＺＡＭ）である。

本明細書中で使用される場合、「ヘテロアリール」は、環主鎖中に１つ以上のヘテロ原子、すなわち、炭素以外の元素（窒素、酸素およびイオウを含むが、これらに限定されない）を含有する芳香族環または環系（例えば、２つ以上の隣り合う原子を共有する２つ以上の縮合環）をいう。ヘテロアリールが環系である場合、系中の全ての環は芳香族である。ヘテロアリール基は、５～１８環メンバーを有することができる。

本明細書中で使用される場合、「ヘテロシクリル」は、環主鎖中に少なくとも１つのヘテロ原子を含む非芳香族環または環系を意味する。複素環は、融合、架橋、またはスピロ連結様式で一緒に結合され得る。複素環は、環系中の少なくとも１つの環が芳香族でないことを条件として、任意の飽和度を有することができる。環系において、ヘテロ原子は、非芳香環または芳香環のいずれかで存在する。ヘテロシクリル基は、３～２０環メンバー（すなわち、炭素原子およびヘテロ原子を含む、環主鎖を構成する原子の数）を有し得る。いくつかの例では、ヘテロ原子は、Ｏ、Ｎ、またはＳである。

本明細書で使用される「ヒドラジン」または「ヒドラジニル」という語は、－ＮＨＮＨ_２基を指す。

本明細書中で使用される場合、用語「ヒドラゾン」または「ヒドラゾニル」は、本明細書中で使用される場合、Ｒ_ａおよびＲ_ｂが定義される

基をいう。

本明細書で使用される「ヒドロゲル」は、架橋重合体鎖から構成される三次元ポリマーネットワーク構造を指す。ヒドロゲルは、水溶性ではなく、または配列決定の間に曝露される液体中で取り外し可能ではない。

本明細書中で使用される「ヒドロキシ」または「ヒドロキシル」は－ＯＨ基を意味する。

本明細書で使用される「隙間領域」という語は、凹部を分離する基材または表面上の領域を指す。例えば、隙間領域は、アレイの１つの特徴をアレイの別の特徴から分離することができる。互いに分離された２つの特徴は、離散的であり得る、すなわち、互いに物理的接触を欠いている。別の例では、隙間領域は、特徴部分の第１の部分を特徴部分の第２の部分から分離することができる。多くの例では、間隙領域は連続的であるが、特徴は、例えば、他の点では連続的な表面に画定された複数のウェルの場合のように、不連続である。隙間領域によって提供される分離は、部分的または完全な分離であり得る。隙間領域は、表面に画定された特徴部分の表面材料とは異なる表面材料を有することができる。例えば、配列の特徴は、間隙領域に存在する量または濃度を超える量または濃度のコーティング層およびプライマーを有することができる。いくつかの例では、コーティング層およびプライマーは、間隙領域に存在しなくてもよい。

本明細書中で使用される「ニトリルオキシド」は、Ｒ_ａが本明細書中で定義される「Ｒ_ａＣ≡Ｎ^＋Ｏ^－」基を意味する。ニトリルオキシドを調製する例には、クロラミド－Ｔでの処理による、またはイミドイルクロリド［ＲＣ（Ｃｌ）＝ＮＯＨ］に対する塩基類の活動による、アルドキシムからのｉｎ ｓｉｔｕ生成が含まれる。

本明細書で使用される「ニトロン」は、Ｒ_１、Ｒ_２、およびＲ_３が、本明細書で定義されるＲ_ａおよびＲ_ｂのいずれかであり得る

基を意味する。

本明細書中で使用される場合、「ヌクレオチド」は、窒素を含む複素環塩基類、糖、および１つ以上のリン酸基を含む。ヌクレオチドは、核酸配列のモノマー単位である。ＲＮＡでは、糖はリボースであり、ＤＮＡでは、糖はデオキシリボース、すなわち、リボースの２’位に存在する水酸基を欠く糖である。窒素含有複素環塩基類（すなわち、核酸塩基）は、プリン塩基類またはピリミジン塩基類であり得る。プリン塩基類には、アデニン（Ａ）およびグアニン（Ｇ）、ならびにそれらの修飾誘導体またはアナログが含まれる。ピリミジン塩基類には、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）、およびウラシル（Ｕ）、ならびにそれらの修飾誘導体またはアナログが含まれる。デオキシリボースのＣ－１原子はピリミジンのＮ－１またはプリンのＮ－９に結合している。

「フローセル基材」または「基材」という用語は、その上に表面化学物質を添加することができる保持体を指す。「パターン化基材」という用語は、その中またはその上に凹部が画定される保持体を指す。基材は、ウェハ、パネル、矩形シート、ダイス、または好適な形態であってもよい。基材は、一般に剛性であり、水溶液に不溶である。基材は、凹部を改質するために使用される薬品に対して不活性であってもよい。例えば、基材は、官能化コーティング層を適用するため、官能化コーティング層にプライマーを付着させるため、ヒドロゲルを適用するためなどに使用される化学物質に対して不活性であり得る。好適な基材の例としては、エポキシシロキサン、ポリヘドラルオリゴマーシルセキオキサン（ＰＯＳＳ）またはその誘導体、ガラスおよび修飾または官能化ガラス、プラスチック（アクリル、スチレンおよび他の材料のポリスチレンおよびコポリマー、ポリプロピレン，ポリエチレン、ポリブチレン、ポリウレタン、ポリテトラフルオロエチレン（ＣｈｅｍｏｕｒｓからのＴＥＦＬＯＮ（登録商標）など）、環状オレフィン／シクロオレフィンポリマー（ＣＯＰ）（ＺＥＯＮＯＲ（登録商標）など）、ポリイミドなど）、ナイロン、セラミック／セラミック酸化物、シリカ、溶融シリカ、またはシリカベースの材料（例えば、少なくとも１０％シリカを含む）、ケイ酸アルミニウム、ケイ素および修飾シリコン（例えば、ホウ素ドープｐ＋シリコン）、シリコン窒化物（Ｓｉ_３Ｎ_４）、酸化ケイ素（ＳｉＯ_２）、五酸化タンタル（ＴａＯ_５）または他のタンタル酸化物（ＴａＯ_ｘ）、酸化ハフニウム（ＨａＯ_２）、カーボン、金属、無機ガラスなどが挙げられる。基材はまた、ガラス、ケイ素、ＰＯＳＳ、またはそれらの誘導体であってもよく、その表面に酸化タンタルまたは他のセラミックス酸化物のコーティング層を有していてもよい。

本明細書で使用される「プラズマアッシング」は、酸素プラズマによって基材から有機物を除去する工程を指す。プラズマアッシングから生じる生成物は、減圧ポンプ／システムを用いて除去することができる。プラズマアッシングは、反応性水酸基またはカルボキシル基を導入することによって基材を活性化することができる。

本明細書中で使用される場合、「プライマー」は、ＤＮＡまたはＲＮＡ合成の開始点として役立つ一本鎖核酸配列（例えば、一本鎖ＤＮＡまたは一本鎖ＲＮＡ）として定義される。プライマーの５’末端は、官能化コーティング層とのカップリング反応を可能にするように修飾されてもよい。プライマー長は、任意の数の塩基類長であってよく、様々な非天然ヌクレオチドを含むことができる。例えば、配列決定プライマーは、２０～４０塩基類の範囲の短い鎖である。

本明細書で使用される場合、用語「シラン」および「シラン誘導体」は、１つ以上のケイ素原子を含有する有機または無機化合物を指す。無機シラン化合物としては、例えば、ＳｉＨ_４、ハロゲン化ＳｉＨ_４（水素を１種以上のハロゲン原子で置換したもの）が挙げられる。有機シラン化合物の例は、Ｘ－Ｒ^Ｂ－Ｓｉ（ＯＲ^Ｃ）_３であり、ここで、Ｘは、アミノ、ビニル、メタクリレート、エポキシ、

イオウ、アルキル、アルケニル、またはアルキニルなどの有機基であり；Ｒ^Ｂは、スペーサー、例えば、－（ＣＨ_２）_ｎ－であり、ここで、ｎは、０～１０００であり；Ｒ^Ｃは、水素、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルケニル、任意に置換されたアルキニル、任意に置換されたカルボシクリル、任意に置換されたアリール、任意に置換された５～１０員ヘテロアリール、および任意に置換された５～１０員ヘテロシクリルから選択される。本明細書中で使用される場合、用語「シラン」および「シラン誘導体」は、異なるシランおよび／またはシラン誘導体化合物の混合物を含み得る。

いくつかの例では、シランまたはシラン誘導体は、官能化重合体層の官能基と反応することができる不飽和部分を含む。本明細書中で使用される場合、「不飽和部分」という語は、アルケン、アルキン、シクロアルケン、シクロアルキン、ヘテロシクロアルケン、ヘテロシクロアルキン、または少なくとも１つの二重結合もしくは１つの三重結合を含むその任意に置換された変形例を含む化学基を指す。不飽和部分は、１価または２価であり得る。不飽和部分が一価である場合、シクロアルケン、シクロアルキン、ヘテロシクロアルケン、およびヘテロシクロアルキンは、それぞれ、シクロアルケニル、シクロアルキニル、ヘテロシクロアルケニル、およびヘテロシクロアルキニルと交換可能に使用される。不飽和部分が二価である場合、シクロアルケン、シクロアルキン、ヘテロシクロアルケン、およびヘテロシクロアルキンは、それぞれシクロアルケニレン、シクロアルキニレン、ヘテロシクロアルケニレン、およびヘテロシクロアルキニレンと交換可能に使用される。

不飽和部分は、シランまたはシラン誘導体のケイ素原子に直接的に、またはリンカーを介して間接的に、共有結合することができる。好適なリンカーの例としては、任意に置換されたアルキレン（例えば、二重結合を開くことによりアルケンから、または異なった炭素原子から２つの水素原子を取り除くことによりアルカンから誘導されるとみなされる二価飽和脂肪族基（例えば、エチレン））、置換ポリエチレングリコールなどが挙げられる。

本明細書で使用される「スペーサー層」は、２つの成分を互いに結合する材料を指す。いくつかの例では、スペーサー層は、結合を助ける放射線吸収材料であってもよく、または結合を助ける放射線吸収材料と接してもよい。

本明細書で使用される「表面化学物質」という語は、パターン形成された基材の凹部に組み込まれる化学的および／または生物学的に活性のある成分を指す。本明細書に開示される表面化学物質の例には、基材の表面の少なくとも一部に付着した官能化高分子層、および／または官能化高分子層の少なくとも一部に付着したプライマーが含まれる。

「チオール」官能基は、－ＳＨを指す。

本明細書で使用されるように、「テトラジン」および「テトラジン」という用語は、四つの窒素原子から成る６員ヘテロアリール基を指す。テトラジンは、任意に置換されていてもよい。

本明細書で使用される「テトラゾール」は、４個の窒素原子を含む５員複素環基を指す。テトラゾールは、任意に置換されていてもよい。

方法１００の一例を図１に示す。本方法１００は、（符号１０２で示されるように）間隙領域によって分離される、パターン化されたフローセル基材の凹部内に官能化コーティング層を適用すること、（符号１０４で示されるように）凹部内にグラフトされた官能化コーティング層を形成するために官能化コーティング層にプライマーをグラフトすること、および（符号１０６で示されるように）少なくともグラフトされた官能化コーティング層上にヒドロゲルを適用することを含む。

パターニングされたフローセル基材は、パターニングされたウェハ、パターニングされたダイス、または本明細書に開示される他のパターニングされた基材のいずれかであってもよい。本明細書に記載される基材の任意の実例が使用されてもよい。パターン化された基材（図３Ａおよび図４に符号１２で示す）は、基材の露出した層または表面上またはその中に画定された凹部と、隣り合う凹部を分離する間隙領域とを含む。凹部は、例えば、フォトリソグラフィー、ナノインプリントリソグラフィ、スタンピング技術、エンボス技術、モールディング技術、マイクロエッチング技術、プリント技術などを含む様々な技術を使用して、基材内または上に作製されてもよい。当業者によって理解されるように、使用される技術は、基材の組成物および形状に依存する。図４Ａを参照して以下に説明するように、凹部の多くの異なるレイアウトを想定することができる。

図１には示されていないが、官能化コーティング層を適用し、プライマーをグラフト化する前に（すなわち、表面化学物質を添加する前に）、この方法は、パターン化基材を洗浄工程および／または表面化学物質の後続の析出のためにパターン化基材の表面（例えば、凹部、およびいくつかの例では隣り合う間隙領域）を準備する別のプロセスに曝すことによって表面を処理することを含むことができる。一例として、本方法は、パターン化されたフローセル基材の表面を処理して、表面に官能基を付着させて、処理された凹部、およびいくつかの例では、処理された間隙領域を形成することを含み得る。処理工程（例えば、洗浄工程および表面調製プロセス）のより詳細な例は、図３Ａ～３Ｉを参照して以下でさらに論じられる。

図１に示す実施例では、表面化学物質を添加することは、官能化コーティング層を凹部（符号１０２）に適用すること、およびプライマーを官能化コーティング層（符号１０４）にグラフトすることを含む。

官能化コーティング層の例としては、ポリ（Ｎ－（５－アジドアセトアミジルペンチル）アクリルアミド－ｃｏ－アクリルアミド、ＰＡＺＡＭなどのアクリルアミドコポリマーが挙げられる。ＰＡＺＡＭおよびアクリルアミドコポリマーのいくつかの他の形態は、式（Ｉ）：

によって表され、
ここで、
Ｒ^Ａは、アジド、置換されていてもよいアミノ、置換されていてもよいアルケニル、置換されていてもよいヒドラゾン、置換されていてもよいヒドラジン、カルボキシル、ヒドロキシ、置換されていてもよいテトラゾール、置換されていてもよいテトラジン、ニトリルオキシド、ニトロン、およびチオールからなる群より選択され；
Ｒ^ＢはＨまたは任意に置換されたアルキルであり；
Ｒ^Ｃ、Ｒ^ＤおよびＲ^Ｅは、独立して、Ｈおよび置換されていてもよいアルキルからなる群から選択され；
－（ＣＨ_２）_ｐ－の各々は、任意に置換されていてもよく；
ｐは、１～５０の範囲の整数であり；
ｎは１～５０，０００の範囲の整数であり；
ｍは１～１００，０００の範囲の整数である。

当業者は、式（Ｉ）中の繰り返し「ｎ」および「ｍ」特徴の配置が代表的であり、モノマーサブユニットが、ポリマー構造中に任意の順序（例えば、ランダム、ブロック、パターン化、またはそれらの組み合わせ）で存在し得ることを認識する。

ＰＡＺＡＭの１つの具体例は、

によって表され、
ここで、ｎは１～２０，０００の範囲の整数であり、ｍは１～１００，０００の範囲の整数である。

ＰＡＺＡＭの分子量は、約１０ｋＤａ～約１５００ｋＤａの範囲であってもよく、または具体例では、約３１２ｋＤａであってもよい。

いくつかの例では、ＰＡＺＡＭは直鎖状重合体である。いくつかの他の例では、ＰＡＺＡＭは、軽度に架橋高分子である。

他の例では、官能化コーティング層は、式（Ｉ）の変形であってもよい。一例では、アクリルアミド単位は、Ｎ，Ｎ－ジメチルアクリルアミド

で置き換えることができる。
本実施例において、式（Ｉ）中のアクリルアミド単位は、

で置換されてもよく、Ｒ^Ｄ、Ｒ^Ｅ、Ｒ^Ｆは、それぞれＨであり、Ｒ^ＧおよびＲ^Ｈは、それぞれメチル基である（アクリルアミドと同様に、Ｈの代わりに）。この例では、ｑは、１～１００，０００の範囲の整数であってもよい。別の例では、アクリルアミド単位に加えて、Ｎ，Ｎ－ジメチルアクリルアミドを使用することができる。この実施形態では、式（Ｉ）は、繰り返しの「ｎ」および「ｍ」の特徴に加えて、

を含むこととしてもよく、
ここで、
Ｒ^Ｄ、Ｒ^ＥおよびＲ^ＦがそれぞれＨであり、Ｒ^ＧおよびＲ^Ｈがそれぞれメチル基である特徴を含むことができる。この例では、ｑは、１～１００，０００の範囲の整数であってもよい。

他の官能化された分子は、それらがパターニングされた基材およびその後に適用されるプライマーと相互作用するように官能化される限り、官能化コーティング層を形成するために使用されてもよいことが理解されるべきである。官能化コーティング層を形成するのに適した分子の他の例には、アガロースなどのコロイド構造；またはゼラチンなどのポリマーメッシュ構造；またはポリアクリルアミドポリマーおよび共重合体などの架橋高分子構造、シランフリーアクリルアミド（ＳＦＡ）、またはＳＦＡのアジドール化版が含まれる。好適なポリアクリルアミドポリマーの例は、アクリルアミドおよびビニル基を含むアクリル酸またはアクリル酸から、または［２＋２］光環状付加反応を形成するモノマーから合成することができる。

官能化分子（例えば、ＰＡＺＡＭ）は、スピンコート、ディッピング若しくはディップ法、又は正圧若しくは負圧下での官能化分子の流れ、又は別の好適な技術を使用して、パターン化基材の表面上に堆積されてもよい。官能化分子は、混合物中に存在してもよい。例えば、混合物は、水中またはエチルアルコールと水の混合物中のＰＡＺＡＭを含む。

コーティングされた後、官能化された分子はまた、硬化工程にさらされて、パターン化された基材全体にわたって（すなわち、凹部および間隙領域上に）官能化コーティング層を形成し得る。一例では、官能化分子の硬化は、室温（例えば、約２５℃）～約６０℃の範囲の温度で、約５分～約２時間の範囲の時間にわたって行うことができる。

パターン化された基材の間隙領域上ではなく凹部内に官能化コーティング層を形成するために、官能化コーティング層は、ｉ）約７．５～約１１の範囲のｐＨを有し、研磨粒子を含む塩基性水溶液スラリー液、またはｉｉ）研磨パッドおよび研磨粒子を含まない溶液を使用して、間隙領域から研磨されてもよい。

方法１００のこの実施例では、次に、プライマーは、符号１０４で示されるように、凹部に残っている官能化コーティング層にグラフトされ、グラフトされた官能化コーティング層を形成する。適切なプライマーの例には、順方向増幅プライマーまたは逆方向増幅プライマーが含まれる。好適なプライマーの具体例としては、Ｐ５またはＰ７プライマーが挙げられ、これらは、ＨＩＳＥＱ（登録商標）、ＨＩＳＥＱＸ（登録商標）、ＭＩＳＥＱ（商標）、ＭＩＳＥＱＸ（商標）、ＮＥＸＴＳＥＱ（商標）、ＮＯＶＡＳＥＱ（商標）、ＧＥＮＯＭＥ ＡＮＡＬＹＺＥＲ（商標）、および他の機器プラットフォーム上での配列決定のために、Illumina Inc.によって販売される市販のフローセルの表面上で使用される。

グラフティングは、ダンクコーティング，スプレーコート、パドル払い出し、または少なくともいくつかの凹部において、プライマーを機能化コーティング層に取り付ける別の適切な方法で行うことができる。これらの例示的な技術のそれぞれは、プライマー溶液または混合物を利用してもよく、プライマー、水、緩衝液、および触媒を含んでもよい。

ダンクコーティングは、パターン化された基材（その凹部内に官能化コーティング層を有する）を一連の温度制御めっき浴に浸漬することを含むことができる。めっき浴はまた、流量制御されてもよく、および／または窒素ブランケットで覆われてもよい。めっき浴は、プライマー溶液または混合物を含んでもよい。様々な浴を通して、プライマーは、少なくともいくつかの凹部において官能化コーティング層に付着する。例えば、コーティングされ、研磨されたパターン化基材は、プライマーを付着させるために反応が起こるプライマー溶液または混合物を含む第１のめっき浴に導入され、次いで、パターン化された基材は、洗浄のために追加のめっき浴に移動される。パターン化された基材は、ロボットアームを用いてめっき浴からめっき浴へ、または手動で移動されてもよい。また、乾式系をダンクコーティングに使用することもできる。

スプレーコートは、被覆され研磨されたパターン化基材上にプライマー液または混合物を直接的に噴霧することによって達成することができる。スプレーコーティングされたウェハは、約０℃～約７０℃の範囲の温度で、約４分～約６０分の範囲の時間インキュベートされ得る。インキュベーション後、プライマー溶液または混合物を希釈し、例えばスピンコーターを用いて除去することができる。

パドルディスペンシングは、プール及びスピンオフ法に従って行うことができ、従って、スピンコーターを用いて達成することができる。プライマー液または混合物は、コーティングされ研磨されたパターン化基材に（手動でまたは自動化された工程を介して）塗布（適用）されてもよい。塗布されたプライマー液または混合物は、コーティングされ研磨されたパターン化基材の全面に塗布されてもよいし、全面に広げられてもよい。プライマーコーティングされたパターン化基材は、約０℃～約８０℃の範囲で約２分～約６０分間インキュベートすることができる。インキュベーション後、プライマー溶液または混合物を希釈し、例えばスピンコーターを用いて除去することができる。

一例では、プライマーが、グラフトされた官能化コーティング層を形成するために、凹部内の官能化コーティング層にグラフトされた後、本方法１００のこの例は、（符号１０６で示されるように）グラフトされた官能化コーティング層上にヒドロゲルを適用することをさらに含む。

ヒドロゲルは、フローセルに曝露される配列決定テンプレートのフィルタとして働く任意の親水性重合体であり得る。ヒドロゲルの堆積は、フローセル上に堆積される溶液中のポリマー濃度によって部分的に制御される。ヒドロゲルは、凹部への配列決定テンプレートの拡散を遅くし、したがって、別の配列決定テンプレートがヒドロゲルを通って拡散することができる前に、単一の配列決定テンプレートが凹部内でシード（seed）およびクラスター化する時間を可能にする。ヒドロゲルはまた、配列決定テンプレート播種の間および他の配列決定工程の間、フローセル上に残存し、したがって、水溶性ではなく、または配列決定の間に曝露される液体中で取り外し可能なではない。ヒドロゲルのいくつかの例には、ＰＡＺＡＭ（または本明細書に記載のその変形）、架橋ポリアクリルアミド、アガロースゲル、架橋ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などが含まれる。ヒドロゲルは、他のアクリルアミドベースのコポリマー、アガロースベースのコポリマー、またはＰＥＧベースのコポリマーであってもよい。Ｘベースのコポリマー（例えば、アクリルアミドベース、アガロースベース、ＰＥＧベースなど）は、分子量組成物の約１０％以上の量でＸ成分を含むことを理解されたい。いくつかの例では、Ｘベースのコポリマーは、分子量組成物の約１０％、または分子量組成物の約１１％、または分子量組成物の約１２％、または分子量組成物の約１５％、または分子量組成物の約２０％、または分子量組成物の約３９％、またはＸ成分のより高いパーセンテージを含む。さらに、Ｘ成分は、コポリマーがヒドロゲルとして機能する限り、所与のパーセンテージより高くても低くてもよい。断面ＰＥＧヒドロゲルは、ＰＥＧマクロマーと、アクリル酸塩、メタクリレート、アリルエーテル、マレイミド、ビニルスルホン、ＮＨＳエステルおよびビニルエーテル類基などの反応性連鎖末端との共有結合断面を介して合成することができる。例示的なヒドロゲルのいずれかは、疎水性または親水性側鎖を含み得る。

ヒドロゲルはプライマーでグラフトされず、むしろプライマーを被覆する。

いくつかの例では、ヒドロゲルは、表面化学物質（この例では、官能化コーティング層およびその上のプライマー）が覆われ、パターン化されたフローセル基材の結合区域が露出したままであるように、選択的に堆積またはパターン化されてもよい。パターン化されたフローセル基材の結合領域は、一般に、パターン化されたフローセル基材の間隙領域（単数または複数）のうちのいくつかの上に位置し、そこで、蓋がパターン化された基材に結合される。パターニングされた基材がウェハである場合、接合区域は、ウェハから形成されているいくつかのフローセルの境界（例えば、周囲）を画定することができる。パターン化された基材がダイスである場合、接合部は、形成されている１つのフローセルの外側境界（例えば、周囲）を画定することができる。結合領域の一部ではないパターン化フローセル基板の他の部分は、ヒドロゲルでコーティングされてもよいことを理解されたい。

方法１００のこの実施形態では、ヒドロゲルの選択的な堆積又はパターン化は、溶液インキュベーション、ディップ法，スピンコート，スプレーコート、超音波スプレーコート，ドクターブレードコーティング、エアロゾル印刷、又はインクジェット印刷を介して達成することができる。ヒドロゲルが結合領域上に適用されないように、マスクを使用して、パターン形成された基材の結合領域を覆うことができる。ヒドロゲルの選択的析出を用いて、間隙領域ではなく、凹部内のグラフトされた官能化コーティング層上にヒドロゲルを析出させることができる。

他の例では、官能化コーティング層が形成された後に、パターン化されたフローセル基材の結合部位に蓋を結合することができ、プライマーおよびヒドロゲルの両方を、フロースルー処理を使用して適用することができる。

ヒドロゲルを適用するための例示的な技法のそれぞれは、水と、約０．１％（質量対体積）までのヒドロゲル材料とを含むことができる水性混合物を利用することができる。いくつかの例では、ヒドロゲル材料は、水性混合物の０．１％以下を構成する。他の例では、水性混合物は、約０．００１％～約０．１％のヒドロゲル材料、または約０．０２５％～約０．００５％のヒドロゲル材料を含む。水性混合物の濃度は、フローセルアーキテクチャ（例えば、フローチャネル、入力ポートおよび出力ポートの寸法など）に依存して変化し得ることが理解されるべきである。例えば、フロースルー析出が利用される場合、濃度は、水性混合物が、ポート、フローチャネルなどを詰まらせることなくフローセルを通って流れることができるように選択され得る。このように、濃度はまた、約０．１％より大きくてもよい。ヒドロゲル材料（および得られるヒドロゲルコーティング）は、本明細書中に開示される例のいずれかであり得る（すなわち、ＰＡＺＡＭまたはその変形、架橋ポリアクリルアミド、アガロースゲルなど）。

いくつかの例では、水性混合物は、共溶媒、酸化防止剤、色素、紫外線安定剤，加工助剤などの添加剤も含むことができる。これらの添加剤は、混合物の流動性またはヒドロゲルの皮膜形成能に有害な影響を及ぼさない量で水性混合物中に含まれてもよい。

水性混合物を適用した後、それをインキュベートしてヒドロゲルを形成させることができる。溶液インキュベーションのための時間および温度は、ヒドロゲル形成に十分である任意の時間および温度であり得る。例として、温度は室温～約６５℃の範囲であってもよく、時間は約５分～約１時間、またはそれ以上の範囲であってもよい。一例では、溶液インキュベーションは、約５０℃の温度で約１０分間行われる。

場合によっては、水性混合物は、ヒドロゲル形成中に部分的に乾燥されてもよい。部分乾燥は、大気曝露、窒素曝露、減圧、加熱（例えば、炉内で）、またはスピンコート（すなわち、乾燥するまで回転）によって達成され得る。加熱が使用される例では、温度は約５０℃であってもよく、ヒドロゲルはこの温度で約１０分間維持されてもよい。ヒドロゲルはまた、希釈緩衝液で洗浄され得る。

方法２００の別の例を図２に示す。本方法２００は、シランまたはシラン誘導体を、そこに画定された凹部を有するフローチャネルを含むパターン化された基板の表面に付着させ、凹部が間隙領域によって分離され、それによってシラン化凹部およびシラン化間隙領域を形成し（符号２０２）、シラン化凹部およびシラン化間隙領域に官能化コーティング層を適用し（符号２０４）、シラン化間隙領域から官能化コーティング層を研磨し（符号２０６）、シラン化凹部内の官能化コーティング層にプライマーをグラフトして、凹部内にグラフトされた官能化コーティング層を形成し（符号２０８）、凹部内のグラフトされた官能化コーティング層上にヒドロゲルを適用する（符号２１０）ことを含む。方法２００の例は、図３Ａ～３Ｅ、図３Ｈおよび３Ｉと組み合わせた図３Ａ～３Ｄを参照してさらに説明される。

図３Ａは、パターニングされた基材１２の例示的な断面図である。パターニングされた基材１２は、パターニングされたウェハ、パターニングされたダイス、または任意の他のパターニングされた基材（例えば、パネル、矩形板など）であってもよい。本明細書に記載される基材１２の任意の実施形態が使用されてもよい。パターン化されたウェハは、いくつかのフローセルを形成するために使用されてもよく、パターン化されたダイスは、単一のフローセルを形成するために使用されてもよい。一実施形態では、基材は、約２ｍｍ～約３００ｍｍの範囲の径、または最大１０フィート（～３メートル）までの最大寸法を有する長方形の板またはパネルを有することができる。一実施形態では、基材ウェハは、約２００ｍｍ～約３００ｍｍの範囲の径を有する。別の実施形態では、基材ダイスは、約０．１ｍｍ～約１０ｍｍの範囲の幅を有する。例示的な寸法が提供されたが、適切な寸法を有する基材が使用されてもよいことを理解されたい。

パターニングされた基材１２は、基材１２の露出した層または面の上または中に画定された凹部１４と、隣り合う凹部１４を分離する間隙領域１６とを含む。本明細書に開示される例では、凹部１４は、表面化学物質（例えば、２０、２２）で官能化されるようになり、間隙領域１６は、結合のために使用されてもよいが、その上に存在するプライマー（図３Ｅ～３Ｇおよび３Ｉに示される２２）を有さない。

凹部１４は、例えば、フォトリソグラフィー、ナノインプリントリソグラフィ、スタンピング技術、エンボス加工技術、モールディング技術、マイクロエッチング技術、プリント技術などを含む様々な技術を使用して、基材１２内または上に製作することができる。当業者によって理解されるように、使用される技術は、基材１２の組成物および形状に依存する。

規則的パターン、繰り返しのパターン、および非規則的パターンを含む、凹部１４の多くの異なるレイアウトを想定することができる。例えば、凹部１４は、密接にパッキンし、かつ、高密度化するために、六角形の格子状に配置されている。他のレイアウトは、例えば、直線（すなわち、長方形）レイアウト、三角形レイアウトなどを含むことができる。いくつかの例では、レイアウトまたはパターンは、行および列にある凹部１４のｘ－ｙフォーマットとすることができる。いくつかの他の例では、レイアウトまたはパターンは、凹部１４および／または隙間領域１６の繰り返し配列であってもよい。さらに他の例では、レイアウトまたはパターンは、凹部１４および／または隙間領域１６のランダムな配列であってもよい。パターンは、スポット、パッド、ウェル、ポスト、ストライプ、スワール、ライン、三角形、長方形、円、円弧、チェック、プライド、対角線、矢印、正方形、および／またはクロスハッチを含むことができる。

レイアウトまたはパターンは、定義された領域における凹部１４の密度（すなわち、凹部１４の数）に関して特徴付けられてもよい。例えば、凹部１４は、約２００万／ｍｍ^２の濃度で存在してもよい。密度は、例えば、少なくとも約１００／ｍｍ^２、約１，０００／ｍｍ^２、約１０万／ｍｍ^２、約１００万／ｍｍ^２、約２００万／ｍｍ^２、約５００万／ｍｍ^２、約１０００万／ｍｍ^２、約５０００万／ｍｍ^２、またはそれ以上の密度を含む様々な密度に調整することができる。代替的に又は追加的に、濃度は、約５０００万／ｍｍ^２、約１０００万／ｍｍ^２、約５００万／ｍｍ^２、約２００万／ｍｍ^２、約１００万／ｍｍ^２、約１０万／ｍｍ^２、約１，０００／ｍｍ^２、約１００／ｍｍ^２、又はそれ以下に調整することができる。基材１２上の凹部１４の密度は、より低い値の１つと、上記の範囲から選択されるより高い値の１つとの間であり得ることがさらに理解されるべきである。例として、高密度アレイは、約１００ｎｍ未満だけ分離された凹部１４を有することを特徴とすることができ、中密度アレイは、約４００ｎｍ～約１μｍだけ分離された凹部１４を有することを特徴とすることができ、低密度アレイは、約１μｍを超えて分離された凹部１４を有することを特徴とすることができる。例示的な密度が提供されたが、任意の好適な密度を有する基材が使用されてもよいことを理解されたい。

レイアウトまたはパターンは、平均ピッチ、すなわち、凹部１４の中心から隣接する隙間領域１６の中心までの間隔（中心間間隔）によって特徴付けられてもよいし、代替的に特徴付けられてもよい。パターンは、平均ピッチの周りの変動係数が小さくなるように規則的であってもよく、またはパターンは、変動係数が比較的大きくなり得る非規則的であってもよい。いずれの場合も、平均ピッチは、例えば、少なくとも約１０ｎｍ、約０．１μｍ、約０．５μｍ、約１μｍ、約５μｍ、約１０μｍ、約１００μｍ、またはそれ以上であり得る。あるいは、またはさらに、平均ピッチは、例えば、多くとも約１００μｍ、約１０μｍ、約５μｍ、約１μｍ、約０．５μｍ、約０．１μｍ、またはそれ以下であり得る。サイト１６の特定のパターンの平均ピッチは、より低い値のうちの１つと、上記の範囲から選択されたより高い値のうちの１つとの間とすることができる。一例では、凹部１４は、約１．５μｍのピッチ（中心間間隔）を有する。例示的な平均ピッチ値が提供されたが、他の平均ピッチ値が使用されてもよいことが理解されるべきである。

図３Ａから３Ｉに示す実施例において、凹部１４はウェル１４’であり、したがって、パターン形成された基材１２は、その表面にウェル１４’の配列を含む。ウェル１４’は、マイクロウェルまたはナノウェルであってもよい。各ウェル１４’のサイズは、ウェル１４’の体積、ウェル開口面積、深さ、および／または直径によって特徴付けることができる。

各ウェル１４’は、液体を閉じ込めることができる任意の体積を有することができる。最小限または最大限の体積は、例えば、処理量（例えば、多重性）、分解能、分析物組成物、またはフローセルの下流での使用に予想される分析物反応性に適応するように選択することができる。例えば、体積は、少なくとも約１×１０^－３μｍ^３、約１×１０^－２μｍ^３、約０．１μｍ^３、約１μｍ^３、約１０μｍ^３、約１００μｍ^３、またはそれ以上であり得る。あるいは、またはさらに、体積は、最大で約１×１０^４μｍ^３、約１×１０^３μｍ^３、約１００μｍ^３、約１０μｍ^３、約１μｍ^３、約０．１μｍ^３、またはそれ以下であり得る。官能化コーティング層は、ウェル１４’の体積の全部または一部を満たすことができることを理解されたい。個々のウェル１４’内のコーティング層の体積は、上記の値より大きくても、小さくても、またはその間であってもよい。

表面上の各ウェル開口部によって占められる面積は、ウェル体積について上述したものと同様の基準に基づいて選択することができる。例えば、表面上の各ウェル開口部の表面積は、少なくとも約１×１０^－３μｍ^２、約１×１０^－２μｍ^２、約０．１μｍ^２、約１μｍ^２、約１０μｍ^２、約１００μｍ^２、またはそれ以上とすることができる。あるいは、またはさらに、面積は、最大で約１×１０^３μｍ^２、約１００μｍ^２、約１０μｍ^２、約１μｍ^２、約０．１μｍ^２、約１×１０^－２μｍ^２、またはそれ以下であり得る。各ウェル開口部によって占められる面積は、上記で特定された値より大きくても、小さくても、またはその間であってもよい。

各ウェル１４’の深さは、少なくとも約０．１μｍ、約１μｍ、約１０μｍ、約１００μｍ、またはそれ以上とすることができる。あるいは、またはさらに、深さは、多くとも約１×１０^２μｍ、約１００μｍ、約１０μｍ、約１μｍ、約０．１μｍ、またはそれ以下であり得る。各ウェル１４’の深さは、上記で特定した値より大きくても、小さくても、またはその間であってもよい。

場合によっては、各ウェル１４’の直径は、少なくとも約５０ｎｍ、約０．１μｍ、約０．５μｍ、約１μｍ、約１０μｍ、約１００μｍ、またはそれ以上とすることができる。あるいは、またはさらに、直径は、多くとも約１×１０ＯＢμｍ、約１００μｍ、約１０μｍ、約１μｍ、約０．５μｍ、約０．１μｍ、またはそれ以下（例えば、約５０ｎｍ）であり得る。各ウェル１４’の直径は、上記の値より大きくても、小さくても、またはその間であってもよい。

パターン形成された基材１２は、凹部１４内にサーフェスケミストリ２０、２２を追加するために、一連の処理にさらされてもよい。

図示されていないが、パターン化された基材１２は、表面を清浄化し活性化するためにプラズマアッシングにさらされてもよいことが理解されるべきである。例えば、プラズマアッシング処理は、有機質材を除去し、表面水酸基を導入することができる。基材１２の種類に部分的に依存して、他の適当な洗浄工程を用いて基材１２を洗浄することができる。例えば、化学洗浄は、酸化剤または苛性溶液を用いて行うことができる。

パターニングされた基材１２（図３Ａに示す）は、官能化高分子層２０（図３Ｃ）を形成するために官能化ポリマーの析出のために面１２を準備する工程にさらされてもよい。例えば、パターニングされた基材１２は、シランまたはシラン誘導体１８（図３Ｂ）をパターニングされたウェハ表面に付着させるシラン化にさらされてもよい。シラン化は、凹部１４、１４’（例えば、底面および側壁に沿って）および間隙領域１６を含む表面を横切ってシランまたはシラン誘導体１８を導入する。いくつかの態様では、シランまたはシラン誘導体は、パターン形成された基材の凹部にのみ、またはパターン形成されていない基材の微小位置（互いに分離されている）にのみ選択的に導入される。

シラン化は、任意のシランまたはシラン誘導体１８を用いて達成することができる。シランまたはシラン誘導体１８の選択は、シランまたはシラン誘導体１８と官能化高分子層２０との間に共有結合を形成することが望ましい場合があるので、官能化高分子層２０（図３Ｃに示される）を形成するために使用される官能化分子に部分的に依存し得る。シランまたはシラン誘導体１８を基材１２に付着させるために使用される方法は、使用されるシランまたはシラン誘導体１８に応じて変えることができる。いくつかの例を本明細書に記載する。

例えば、シランまたはシラン誘導体１８は、（３－アミノプロピル）トリエトキシシラン（ＡＰＴＥＳ）または（３－アミノプロピル）トリメトキシシラン（ＡＰＴＭＳ）（すなわち、Ｘがアミノ、Ｒ^Ｂが－（ＣＨ_２）_３－、およびＲ^ＣがエチルまたはメチルであるＸ－Ｒ^Ｂ－Ｓｉ（ＯＲ^Ｃ）_３である。この実施形態では、基材１２の表面を（３－アミノプロピル）トリエトキシシラン（ＡＰＴＥＳ）または（３－アミノプロピル）トリメトキシシラン（ＡＰＴＭＳ）で前処理して、表面上の１つ以上の酸素原子にシリコンを共有結合させることができる（メカニズムによって保持されることを意図することなく、それぞれのシリコンは、１つ、２つ、または３つの酸素原子に結合することができる）。この化学的に処理された表面を焼成してアミン基単分子層を形成する。次いで、アミン基をＳｕｌｆｏ－ＨＳＡＢと反応させてアジド誘導体を形成する。２１℃、１Ｊ／ｃｍ^２～３０Ｊ／ｃｍ^２エネルギーでのＵＶ活性化は、ＰＡＺＡＭ（例えば、官能化分子）との様々な挿入反応を容易に受けることができる活性ニトレン種を生成する。いくつかの態様では、シランまたはシラン誘導体は、パターン形成された基材の凹部に、またはパターン形成されていない基材上の微小位置に選択的に適用される。

他のシラン化方法も使用することができる。好適なシラン化法の例には、気相成長法、イエス法、スピンコート、または他の堆積法が含まれる。基材１２をシラン化するために使用され得る方法および材料のいくつかの例が、本明細書に記載されるが、他の方法および材料が使用され得ることが理解されるべきである。

イエスＣＶＤオーブンを利用する実施形態では、パターン化された基材１２はＣＶＤオーブン内に配置される。チャンバーを排気し、次いでシラン化サイクルを開始することができる。サイクルの間、シランまたはシラン誘導体容器は、適切な温度（例えば、ノルボルネンシランについて約１２０℃）に維持されてもよく、シランまたはシラン誘導体蒸気ラインは、適切な温度（例えば、ノルボルネンシランについて約１２５℃）に維持されてもよく、真空ラインは、適切な温度（例えば、約１４５℃）に維持されてもよい。

別の例では、シランまたはシラン誘導体１８（例えば、液状ノルボルネンシラン）は、ガラス瓶の内部に堆積され、パターン化された基材１２を有するガラスバキュームデシケータの内部に配置されてもよい。次いで、デシケータを約１５ｍＴｏｒｒ～約３０ｍＴｏｒｒの範囲の圧力まで排気し、約６０℃～約１２５℃の範囲の温度でオーブン内に配置することができる。シラン化を進行させ、次いで乾燥器を炉から取り出し、冷却し、大気中で排気する。

気相成長法、ＹＥＳ法および／または真空デシケータは、本明細書に開示される不飽和部分の例を含むシランまたはシラン誘導体１８など、様々なシランまたはシラン誘導体１８と共に使用することができる。例として、シランまたはシラン誘導体１８が、ノルボルネン、ノルボルネン誘導体（例えば、炭素原子の１つの代わりに酸素または窒素を含む（ヘテロ）ノルボルネン）、トランスシクロオクタン、トランスシクロオクタン誘導体、トランスシクロペンテン、トランスシクロヘプテン、トランスシクロヘプテン、トランス－シクロノネン、ビシクロ［３．３．１］ノン－１－エン、ビシクロ［４．３．１］ｄｅｃ－１（９）－エン、ビシクロ［４．２．１］ノン－１（８）－エン、およびビシクロ［４．２．１］ノン－１－エンなどのアルケンまたはシクロアルケン不飽和部分を含む場合、これらの方法を使用することができる。これらのシクロアルケンのいずれも、例えば、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロアリシクリル、アラルキル、または（ヘテロアリシクリル）アルキルなどのＲ基で置換することができる。例えば、ノルボルネン誘導体としては、［（５－ビシクロ［２．２．１］ヘプト－２－エニル）エチル］トリメトキシシランが挙げられる。他の例として、シランまたはシラン誘導体１８が、シクロオクチン、シクロオクチン誘導体、またはビシクロノニン（例えば、ビシクロ［６．１．０］ノン４－インまたはその誘導体、ビシクロ［６．１．０］ノン２－イン、またはビシクロ［６．１．０］ノン３－イン）などのアルキンまたはシクロアルキン不飽和部分を含む場合、これらの方法を使用することができる。これらのシクロアルキンは、本明細書中に記載されるＲ基のいずれかで置換され得る。

図３Ｂに示されるように、シランまたはシラン誘導体１８の取付け部材は、シラン化された凹部およびシラン化された間隙領域（処理された凹部および処理された間隙領域の一例である）を含む、シラン化されたパターン化された基材を形成する。

次いで、シラン化されたパターン化されたウェハは、シラン化された凹部およびシラン化された間隙領域上に官能化ポリマー層２０を形成するプロセスにさらされてもよい。

本明細書に記載されるように、官能化ポリマー層２０の例は、ＰＡＺＡＭ、またはパターン化されたウェハ１２およびその後に適用されるプライマー２２と相互作用するように官能化される任意の他の分子を含む。官能化分子は、混合物中に存在してもよい。例えば、混合物は、水中の、またはエチルアルコールと水の混合物中のＰＡＺＡＭを含む。官能化ポリマー層２０は、任意の適切な技術を使用して、シラン化パターン化ウェハの表面上に（すなわち、シラン化凹部およびシラン化間隙領域上に）形成されてもよい。官能化分子は、スピンコート、ディッピング若しくはディップ法、又は正圧若しくは負圧下での官能化分子のフロー、又は他の好適な技法を使用して、パターン化基材１２の表面上に堆積させることができる。得られた層２０を図３Ｃに示す。

シラン化凹部およびシラン化間隙領域（すなわち、１８）への官能化ポリマー層２０の付着は、共有結合を介してもよい。官能化高分子層２０のシラン化凹部への共有結合は、種々の使用中に最終的に形成されるフローセルの寿命を通して、官能化高分子層２０を凹部１４、１４’内に維持するのに役立つ。以下は、シランまたはシラン誘導体１８と官能化ポリマー層２０との間で起こり得る反応のいくつかの例である。

シランまたはシラン誘導体１８が不飽和部分としてノルボルネンまたはノルボルネン誘導体を含む場合、ノルボルネンまたはノルボルネン誘導体は、ｉ）ＰＡＺＡＭのアジド／アジド基との１，３－双極性環化付加反応を受けることができ、ｉｉ）ＰＡＺＡＭに結合したテトラジン基とのカップリング反応を受けることができ、ｉｉｉ）ＰＡＺＡＭに結合したヒドラゾン基との環化付加反応を受けることができ、ｉｖ）ＰＡＺＡＭに結合したテトラゾール基とのフォトクリック反応を受けることができ、またはｖ）ＰＡＺＡＭに結合したニトリルオキシド基との環化付加を受けることができる。

シランまたはシラン誘導体１８が不飽和部分としてシクロオクチンまたはシクロオクチン誘導体を含む場合、シクロオクチンまたはシクロオクチン誘導体は、ｉ）ＰＡＺＡＭのアジド／アジドとの歪み促進アジド－アルキン１，３－環化付加（ＳＰＡＡＣ）反応を受けることができ、またはｉｉ）ＰＡＺＡＭに結合したニトリルオキシド基との歪み促進アルキン－ニトリルオキシド環化付加反応を受けることができる。

シランまたはシラン誘導体１８が不飽和部分としてビシクロノニンを含む場合、ビシクロノニンは、二環式環系における歪みのために、ＰＡＺＡＭに結合したアジドまたはニトリルオキシドとの同様のＳＰＡＡＣアルキン環化付加を受けることができる。

図示されていないが、本方法のいくつかの例では、パターン化された基材１２はシラン化にさらされなくてもよいことを理解されたい。むしろ、パターニングされた基材１２は、プラズマアッシングにさらされてもよく、次いで、官能化ポリマーレイヤ２０は、プラズマアッシングされたパターニングされた基材１２上に直接的にスピンコーティング（または他の方法で堆積）されてもよい。この例では、プラズマアッシングは、官能化コーティング層２０をパターン化基材１２に付着させることができる表面活性化剤（例えば、－ＯＨ基）を生成することができる。これらの実施例では、官能化ポリマー層２０は、プラズマアッシングによって生成された表面基と反応するように選択される。

被覆された後、官能化された分子はまた、硬化工程にさらされて、パターン化された基材全体にわたって（すなわち、凹部１４および間隙１６上に）官能化された高分子層２０を形成する。一例では、官能化分子の硬化は、室温（例えば、約２５℃）～約９５℃の範囲の温度で、約１ミリ秒～約数日の範囲の時間にわたって行うことができる。別の例では、時間は、１０秒～少なくとも２４時間の範囲であってもよい。さらに別の例では、時間は、約５分～約２時間の範囲であってもよい。

シラン化され、コーティングされたパターン化基材（図３Ｃに示される）は、洗浄工程にさらされてもよい。このプロセスは、水浴および音波処理を利用してもよい。恒温水槽は、約２２℃～約４５℃の範囲の比較的低い温度に維持することができる。別の実施形態では、水分浴温は、約２５℃～約３０℃の範囲である。

次いで、シラン化され、コーティングされたパターン化基材は、必要に応じて研磨にさらされ、シラン化された間隙領域から官能化高分子層２０の一部が除去される。シラン化され、コーティングされ、研磨されたパターン化基材が図３Ｄに示されている。間隙領域１６に隣接するシランまたはシラン誘導体１８の部分は、研磨の結果として除去されてもされなくてもよい。そのようなものとして、図３Ｄ～３Ｉでは、間隙領域１６に隣接するシランまたはシラン誘導体１８の部分は、研磨後に少なくとも部分的に残ることができるか、または研磨後に除去することができるので、仮想線で示されている。これらのシラン化された部分が完全に除去されると、下にある基材１２が露出されることが理解されるべきである。

研磨工程は、薄い官能化重合体層２０、および場合によってはシランまたはシラン誘導体１８の少なくとも一部を、それらの領域で下にある基材１２に有害な影響を及ぼすことなく、間隙領域１６から除去することができる穏やかな化学スラリー液（例えば、研磨剤、緩衝剤、キレート剤、界面活性剤、および／または分散剤を含む）を用いて行うことができる。あるいは、研磨粒子を含まない溶液で研磨を行ってもよい。

化学スラリー液は、図３Ｃに示されるシラン化され、コーティングされたパターン化基材の表面を研磨するために、化学機械研磨系において使用され得る。研磨ヘッド／パッドまたは他の研磨工具は、凹部１４、１４’内に官能化高分子層２０を残し、下にある基材１２を少なくとも実質的に無傷のままにしながら、間隙領域１６から官能化高分子層２０を研磨することができる。一例として、研磨ヘッドは、Strasbaugh ViPRR II研磨ヘッドであってもよい。

上述のように、研磨は、研磨パッドおよび研磨剤を含まない溶液を用いて行うことができる。例えば、研磨パッドは、研磨粒子を含まない溶液（すなわち、研磨粒子を含まない溶液）と共に利用されてもよい。

研磨は、図３Ｄに示されるように、間隙領域１６から官能化高分子層２０の一部（およびいくつかの例では、シランまたはシラン誘導体１８の少なくとも一部）を除去し、シラン化凹部内に官能化高分子層２０の一部（複数可）を残す。また、上述のように、間隙領域１６は、研磨が完了した後にシラン化されたままであってもよい。換言すれば、シラン化された間隙領域は、研磨後もそのまま残ることができる。あるいは（１８の仮想部分によって示されるように）、シランまたはシラン誘導体１８は、研磨の結果として間隙領域１６から除去されてもよい。

図示されていないが、シラン化され、コーティングされ、研磨されたパターン化基材（図３Ｄに示されている）は、洗浄工程にさらされてもよいことを理解されたい。このプロセスは、水浴および音波処理を利用してもよい。恒温水槽は、約２２℃～約３０℃の範囲の比較的低い温度に維持することができる。シラン化され、コーティングされ、研磨されたパターン化基材はまた、回転乾燥されてもよく、または別の好適な技術によって乾燥されてもよい。

次に、図３Ｄに示されるシラン化され、コーティングされ、研磨されたパターン化基材を、図３Ｅ～３Ｇに示されるプロセスに曝露することができ、フローセル１０を生成するか、または図３Ｈ～３Ｉに示されるプロセスに曝露することができ、フローセル１０’を生成する。図３Ｅ～３Ｇでは、プライマー２２はグラフトされ、蓋２６がパターン化フローセル基材１２に結合される前にヒドロゲル２４が適用される。図３Ｈおよび３Ｉにおいて、蓋２６は、プライマー２２がグラフトされ、そしてヒドロゲル２４が適用される前に、パターン化されたフローセル基材１２に結合される。

図３Ｅでは、プライマー２２を凹部１４、１４’内の官能化ポリマー層２０にグラフトするために、グラフト化処理が実施される。この実施例では、移植は、浸漬コーティング，スプレーコート、パドルディスペンシング、または少なくともいくつかの凹部１４、１４’内の官能化重合体層２０にプライマー２２を付着させる別の好適な方法によって達成することができる。これらの例示的な技術のそれぞれは、本明細書に開示されるプライマー溶液または混合物を利用してもよく、プライマー、水、緩衝液、および触媒を含んでもよく、本明細書に記載されるように実施されてもよい。

図３Ｆに示されるように、プライマー２２が凹部１４、１４’内の官能化コーティング層２０にグラフトされた後、ヒドロゲル２４がグラフトされた官能化コーティング層２０、２２上およびパターン化フローセル基材１２の少なくとも一部上に形成される。この実施形態では、ヒドロゲル２４は、接合領域２５の一部ではないパターン化基材１２の露出表面上に形成されてもよい。この実施形態では、ヒドロゲル２４は、隣り合う凹部１４、１４’の間の間隙領域１６上に選択的に堆積またはパターン形成されるが、接合領域２５が位置するパターン形成された基材１２の縁部／周囲には堆積またはパターン形成されない。ヒドロゲル２４の選択的堆積／パターニングは、本明細書に記載されるように、水性混合物を使用して達成されてもよい。水性混合物を堆積させた後、それを部分的に乾燥させてヒドロゲル２４を形成することができる。

次に、図３Ｇに示すように、蓋２６を接合領域２５に接合することができる。パターン化されたフローセル基材１２がウェハである場合、蓋２６の異なる領域は、ウェハを使用して形成されているそれぞれのフローチャネル３０を少なくとも部分的に画定することができる。パターン化されたフローセル基材１２がダイスである場合、蓋２６は、形成されている１つ以上のフローチャネル３０を画定してもよい。

蓋２６は、凹部１４内の表面化学物質２０、２２に向けられる励起光に対して透明である任意の材料とすることができる。例として、蓋２６は、グラス（例えば、ホウケイ酸塩、溶融シリカなど）、プラスチックなどであってもよい。好適な瑚珪酸ガラスの商業的に入手可能な例は、Schott North America社から入手可能なＤ２６３（登録商標）である。好適なプラスチック材料、すなわちシクロオレフィンポリマーの市販の例は、ゼオンケミカルズ（Zeon Chemicals）Ｌ．Ｐ．から入手可能なゼオノア（登録商標）製品である。

いくつかの例では、蓋２６は、接合領域２５の形に対応し、接合領域２５に接合されるサイドウォール２９と一体的に形成されてもよい。例えば、凹部は、実質的に平坦な（例えば、頂部）部分２７と、実質的に平坦な部分２７から延びる側壁２９とを形成するために、透明な塊にエッチングされてもよい。エッチングされたブロックがパターン化された基材１２の接合部に取り付けられると、凹部は流路３０となる。

他の例では、サイドウォール２９および蓋２６は、互いに結合される別個の構成要素であってもよい。例えば、蓋２６は、少なくとも実質的に平坦な外装と、流路３０の一部（例えば、天板部）を画定する少なくとも実質的に平坦な内面とを有する実質的に長方形の塊であってもよい（一旦、パターン化された基材１２に接合されると）。この塊は、パターン化されたフローセル基材１２の接合部２５に接合され、流路３０のサイドウォールを形成するサイドウォール２９上に取り付ける（例えば、接合する）ことができる。この実施形態では、サイドウォール２９は、スペーサー層（以下に説明する）について本明細書で説明する材料のいずれかを含むことができる。

蓋２６は、レーザー接合、拡散接合、陽極接合、共晶接合、プラズマ活性化接合、ガラスフリット接合、または当技術分野で知られている他の方法などの任意の好適な技法を使用して、パターン化フローセル基材１２の接合領域２５に接合することができる。例えば、スペーサー２８を用いて蓋２６を接合領域２５に接合してもよい。スペーサー層２８は、パターン形成された基材１２の間隙領域１６（例えば、接合領域２５）の少なくとも一部と蓋２６とを一緒に封止する任意の物質であってもよい。

一実施形態では、スペーサー層２８は、蓋２６および／またはパターン化基材１２によって透過される波長の放射を吸収する放射吸収材であってもよい。次に、吸収エネルギーは、スペーサー層２８と蓋２６との間、およびスペーサー層２８とパターン形成された基材１２との間の結合を形成する。この放射線吸収物質の例は、ＤｕＰｏｎｔ（米国）からの黒色ＫＡＰＴＯＮ（登録商標）（カーボンブラックを含むポリイミド）であり、これは約１０６４ｎｍで吸収する。ポリイミドは、天然のポリイミド物質によって著しく吸収されるもの（例えば、４８０ｎｍ）に波長を変えなければならないことを除いて、カーボンブラックを加えることなく使用することができることを理解されたい。別の例として、ポリイミドＣＥＮ ＪＰは、５３２ｎｍの光で照射された場合に結合され得る。スペーサー層２８が放射線吸収材である場合、スペーサー層２８は、スペーサー層２８が所望の接合領域２５に接触するように、蓋２６とパターニングされた基材１２との間のインタフェースに配置されてもよい。適当な波長のレーザーエネルギーがインタフェースに印加される（すなわち、放射線吸収物質が照射される）間に、圧力が適用されてもよい（例えば、約１００ｐｓｉの圧）。レーザーエネルギーは、好適な結合を達成するために、上から及び下からの両方からインタフェースに印加されてもよい。

別の実施形態では、スペーサー層２８は、それと接する放射線吸収材を含むことができる。放射線吸収材は、スペーサー層２８と蓋２６との間のインタフェース、並びにスペーサー層２８とパターン化フローセル基材１２との間のインタフェースに適用することができる。例えば、スペーサー膜２８はポリイミドであってもよく、別個の放射線吸収物質はカーボンブラックであってもよい。この実施形態では、別個の放射線吸収材は、スペーサー層２８と蓋２６との間、およびスペーサー層２８とパターン化基材１２との間に結合を形成するレーザーエネルギーを吸収する。この実施形態では、適当な波長のレーザーエネルギーがインタフェースに印加されている間（すなわち、放射線吸収物質が照射されている間）、それぞれのインタフェースで圧迫を加えることができる。

パターン化されたフロー基材１２がウェハである場合、スペーサー層２８及び（蓋２６の、あるいは蓋２６に接続されているサイドウォール２９）は、隣接するフローチャネル３０から１つのフローチャネル３０を物理的に分離してもよいし、ウェハの周囲に位置してもよい。パターン化された基材１２がダイスであり、形成されようとしているフローセル１０が単一のフローチャネル３０又はレーンを含むようになっている場合、スペーサー層２８と、（蓋２６の、あるいは蓋２６に接続されている）サイドウォール２９とによって、フローチャネル３０を定義し、フローセル１０を封止することができるように、ダイスのペリフェリに位置することとしてもよい。パターン化された基材１２がダイスであり、形成されつつあるフローセル１０が、複数の孤立したフローチャネル３０（例えば、８つのまたは４つのフローチャネル／レーン）を含むようになっている場合、スペーサー層２８と、（蓋２６の、あるいは蓋２６に接続されている）そのサイドウォール２９が、隣接するフローチャネル／レーン３０から１つのフローチャネル／レーン３０を物理的に分離し、ダイスの周囲に位置することができる。しかし、スペーサー層２８およびサイドウォール２９は、実施形態に応じて任意の所望領域に配置することができることを理解されたい。

パターン化された基材１２がダイスである場合、フローセル１０を組み立てることは、蓋２６の接合を含み得る。パターニングされた基材がウェハである場合、フローセル１０を組み立てることは、蓋２６が接合された後に、ダイシングなどの追加処理を含むことができる。一例では、蓋２６は、パターン化されたウェハ１２に接合されてもよく、ダイシングは、個々のフローセル１０を形成する。ここで述べるように、ウェハ上で、サイドウォール２９は、隣接するフローチャネル３０から１つのフローチャネル３０を物理的に分離することができ、したがって、ダイシングは、各々のセル１０が、その周囲を取り巻く元のサイドウォール２９の一部を有する望ましい数のフローチャネル３０を含むように、サイドウォール２９の少なくとも一部を通して行われることができる。別の例では、パターン化されたウェハは、個々のフローセル１０を形成するためにそれぞれの蓋２６を接合することができる蓋のないダイズスを形成するためにダイシングされてもよい。

図３Ｇに示す実施形態では、蓋２６は、サイドウォール２９と一体に形成された天板部２７を含む。サイドウォール２９は、スペーサー膜２８を介して、パターニングされた基材１２の接合領域２５に接合されている。

蓋２６およびパターン化フローセル基材１２は、一緒になって、凹部１４、１４’と選択的に流通する流路３０を画定する。流路３０は、例えば、指定された反応を凹部１４、１４’内／で開始するために、ヒドロゲル２４および下にある表面化学物質２０、２２に反応成分または反応物を選択的に導入する役割を果たすことができる。

フローセル１０の一例を図３Ｇに示す。

ここで図３Ｈおよび３Ｉを参照すると、方法２００の別の例は、プライマー２２がグラフトされ、ヒドロゲル２４が適用される前に、蓋２６をパターン化フローセル基材１２に結合することを含む。

図３Ｈに示されるように、官能化コーティング層２０は、図３Ｄおよび図１に関連して記載されるように、適用されている（例えば、堆積および研磨されている）。研磨された隙間領域１６の少なくともいくつかは、接合領域２５を画定することができ、蓋２６は、接合領域２５に結合することができる。蓋２６は、任意の材料とすることができ、本明細書で説明する任意の構成を有することができる。蓋２６は、本明細書に記載される技術のいずれかを介して接合領域２５に接合されてもよい。

図３Ｈに示す実施形態では、蓋２６は、サイドウォール２９と一体に形成された天板部２７を含む。サイドウォール２９は、スペーサー膜２８を介して、パターニングされた基材１２の接合領域２５に接合されている。蓋２６が接合された後、流路３０が蓋２６とパターン化基材１２との間に形成される。流路３０は、様々な流体をフローセル１０’（図３Ｉ）に選択的に導入する役割を果たすことができる。

本方法２００のこの実施例では、プライマー２２は、図３Ｉに示されるように、凹部１４内の官能化コーティング層２０にグラフトされる。本明細書中に記載されるプライマーのいずれかが使用され得る。この例では、グラフト化は、フロースルー処理によって達成され得る。フロースルー処理において、本明細書に記載されるプライマー溶液または混合物は、それぞれのインプットポート（図示せず）を通ってフローチャネル３０に導入され得、プライマー２２が１つ以上の凹部１４において官能化コーティング層２０に付着するのに充分な期間（すなわち、インキュベーション時間）、フローチャネル３０に維持され得、次いで、それぞれのアウトプットポート（図示せず）から除去され得る。プライマー２２を取り付けた後、追加の流体を流路３０に通して、機能化された凹部および流路３０を洗浄することができる。

プライマー２２が、凹部１４内の官能化コーティング層２０にグラフトされた後、本方法２００のこの例は、グラフトされた官能化コーティング層２０、２２上、および少なくともいくつかの間隙領域１６（例えば、凹部１４間の領域１６）上にヒドロゲルを形成することをさらに含む。

この実施形態では、ヒドロゲルコーティング１４は、フロースルー処理によって堆積されてもよい。フロースループロセスにおいて、水性混合物（水およびヒドロゲル材料を含む）は、それぞれの入力ポートを通ってフローセルのフローチャネル３０に導入され得、そしてフローチャネル３０に維持され得る。グラフトされた官能化コーティング層２０、２２および流路３０内のパターン化フローセル基材１２の任意の露出表面を覆うのに十分な量の水溶液を導入することができる。この溶液インキュベーションは、ヒドロゲルコーティング２４を形成する。いくつかの例では、混合物が流路３０内にある間、流路３０は、大気、窒素、または減圧が設定された期間インプットポートを通ってフラッシュされて、表面化学物質２０、２２上のヒドロゲルコーティング２４および基材１２の任意の露出部分（例えば、いくつかの間隙領域１６）を部分的に乾燥させるドライダウンプロセスに曝されてもよい。この実施例では、ヒドロゲルコーティング２４は、本明細書に開示される実施例のいずれであってもよい。

本明細書に開示される方法１００、２００によって形成されるフローセル１０’’の一例は、図４に示されており、フローセル１０’’は、方法１００、２００のプロセスにさらされたダイス、または方法１００、２００のプロセスにさらされ、ダイシングされたウェハであってもよい、パターン化された基材１２を含む。

一般に、パターン形成された基材１２は、間隙領域１６によって分離された凹部１４と、凹部１４内に配置された表面化学物質２０、２２とを含む。該表面化学物質は、官能化コーティング層２０およびプライマー２２を含む。図示されていないが、凹部１４は、基材１２と官能化コーティング層２０との間に配置された表面処理又は表面処理剤（例えば、シラン又はシラン誘導体）を有することもできることを理解されたい。この同じ表面調製または処理化学物質を間隙領域１６上に配置することもできる。

フローセル１０’’はまた、パターン化された基材１２の接合領域２５に接合された蓋２６を含み、蓋２６は、凹部１４と選択的に連通する流路３０Ａ、３０Ｂ等を少なくとも部分的に画定する。図４に示す実施形態では、蓋２６は、いくつかのサイドウォール２９に接続された天板部２７を含み、これらの成分２７、２９は、６つの流路３０Ａ、３０Ｂ、３０Ｃ、３０Ｄ、３０Ｅ、３０Ｆのそれぞれの一部を画定する。それぞれのサイドウォール２９は、１つの流路３０Ａ、３０Ｂ、３０Ｃ、３０Ｄ、３０Ｅ、３０Ｆをそれぞれの隣り合う流路３０Ａ、３０Ｂ、３０Ｃ、３０Ｄ、３０Ｅ、３０Ｆから隔離し、それぞれの流路３０Ａ、３０Ｂ、３０Ｃ、３０Ｄ、３０Ｅ、３０Ｆは、それぞれの組の凹部１４と選択的に連通している。

図示されていないが、蓋２６またはパターン化された基材１２は、流体をそれぞれの流路３０Ａ、３０Ｂ、３０Ｃ、３０Ｄ、３０Ｅ、３０Ｆ（例えば、試薬カートリッジまたは他の流体貯蔵システムから）に、および流路から（例えば、廃棄物除去システムに）導くために、他のポート（図示せず）と流体的に係合する入口ポートおよび出口ポートを含み得る。

ヒドロゲル／ヒドロゲルコーティング２４は、凹部１４内の表面化学物質２０、２２、およびパターン形成された基材１２の少なくとも一部（例えば、接合領域２５でもない間隙領域１６）を覆う。例示的なフローセル１０’’において、ヒドロゲル／ヒドロゲルコーティング２４は、本明細書に記載されるように形成されている。したがって、ヒドロゲル／ヒドロゲルコーティング２４は、本明細書に開示される例のいずれかであってもよい（すなわち、ＰＡＺＡＭ、架橋ポリアクリルアミド、アガロースゲルなど）。

図示されていないが、フローセル１０、１０’、１０’’のいくつかの例は、１つ以上の固定機構（例えば、接着剤、接着、締結具など）を介して検知装置（図示せず）に直接的に固定され、したがって、検知装置と物理的に接してもよいことを理解されたい。検出装置は、ＣＭＯＳデバイス（例えば、ケイ素層、誘電体層、金属－誘電体層、金属層などを含む複数の積層を含む）および光学部品を含むことができる。光学部品は、検出装置の光学センサ部が、単一の凹部１４、１４’内またはフローセルの流路３０内で、検出装置の単一の光導波路および表面化学物質２０、２２と少なくとも実質的に位置合わせされ、したがって、それと動作可能に関連付けられるように配置することができる。

また、示されていないが、蓋２６に結合される代わりに、官能化基材（表面化学物質２０、２２およびヒドロゲル／ヒドロゲルコーティング２４をその上に有する）が、表面化学物質２０、２２およびヒドロゲル／ヒドロゲルコーティング２４をその上に有する別の官能化基材に結合され得ることが理解されるべきである。２つの官能化表面は、互いに向き合うことができ、それらの間に画定された流路を有することができる。２つの官能化基材を一緒に結合するために、スペーサー層および好適な結合法を使用することができる。

本明細書中に開示されるフローセル１０、１０’、１０’’は、しばしば合成による配列決定（ＳＢＳ）、環状アレイ配列決定、連結による配列決定、パイロシークエンシングなどと呼ばれる技術を含む、種々の配列決定アプローチまたは技術において使用され得る。これらの技術のいずれかを用いて、そしてパターン化された基材を用いる実施例において、機能性高分子層２０および付着した配列決定プライマー２２は、官能化された凹部（すなわち、その上に表面化学物質２０、２２を有する１４、１４’）中に存在し、そして間隙領域１６上には存在しないので、増幅は、官能化された凹部に限定される。さらに、ヒドロゲル２４の存在のために、１つの配列決定テンプレートをより大きなクラスターに増幅するためのより多くの時間（ヒドロゲルが含まれない場合と比較して）があり、これは、単一の配列決定テンプレートに播種するパターン化フローセル基材１２を横切る凹部１４の集団を増加させる。

一例として、合成によるシーケンシング（ＳＢＳ）反応は、Illumina、Inc.（San Diego、CA）からのＨｉＳｅｑ（商標）、ＨｉＳｅｑＸ（商標）、ＭｉＳｅｑ（商標）、ＮｏｖａＳｅｑ（商標）、またはＮｅｘｔＳｅｑ（商標）シーケンサーシステムなどのシステム上で実行することができる。ＳＢＳにおいて、核酸テンプレート（すなわち、配列決定テンプレート）に沿った核酸プライマー（例えば、プライマー２２）の伸長は、テンプレート中のヌクレオチドの配列を決定するためにモニターされる。基礎となる化学的処理は、重合（例えば、ポリメラーゼ酵素によって触媒される）またはライゲーション（例えば、リガーゼ酵素によって触媒される）であり得る。特定のポリメラーゼベースのＳＢＳ処理において、蛍光標識されたヌクレオチドは、プライマー２２に付加されたヌクレオチドの順序および型の検出がテンプレートの配列を決定するために使用され得るように、テンプレート依存的な様式でプライマー２２に付加される（それによってプライマー２２を伸長する）。例えば、第１のＳＢＳサイクルを開始するために、１つ以上の標識ヌクレオチド、ＤＮＡポリメラーゼなどが、ヒドロゲル２４でコーティングされたプライマー２２のアレイを収容するフローチャネル３０などに／を通って送達され得る。プライマー伸長により標識ヌクレオチドが取り込まれる官能化された凹部（すなわち、表面化学物質２０、２２がその上にある１４、１４’）は、画像化事象によって検出することができる。イメージング事象の間、照明システム（図示せず）は、機能化された凹部（すなわち、表面化学物質２０、２２がその上にある１４、１４’）に励起光を提供することができる。

いくつかの例では、ヌクレオチドは、ヌクレオチドがプライマー２２に付加されると、さらなるプライマー伸長を終結する可逆的終結特性をさらに含むことができる。例えば、可逆的停止部分を有するヌクレオチドアナログは、部分を除去するために脱ブロッキング剤が送達されるまで、その後の伸長が起こり得ないように、プライマー２２に付加され得る。したがって、可逆的終結を使用する例では、脱ブロッキング剤を流路３０などに送達することができる（検知が行われる前後）。

洗浄は、様々な流体送達工程の間に行うことができる。次いで、ＳＢＳサイクルをｎ時間繰り返して、プライマー２２をｎヌクレオチド伸長させ、それによって長さｎの配列を検出することができる。

ＳＢＳを詳細に記載したが、本明細書中に記載されるフローセル１０、１０’、１０’’は、遺伝子型決定のために、または他の化学的および／または生物学的適用において、他の配列決定プロトコルとともに利用され得ることが理解されるべきである。

本開示をさらに説明するために、本明細書に実施例を示す。これらの実施例は、例示の目的で提供され、本開示の範囲を限定するものとして解釈されるべきではないことが理解されるべきである。
非限定的な実施例
実施例１

パターン化された融合シリカ基材上に画定された８つの流路／レーンを含み、各レーンが９６個のタイル（画像化領域に対応する）を含み、各タイルが複数のウェルと流動的に連通しているフローセルを使用した。各ウェルにＰＡＺＡＭ層を形成し、ＰＡＺＡＭ層上に１μｍのプライマーをグラフトした。

レーン１～４、したがってタイル１～３８４は、比較例のレーンおよびタイルであった。このように、ヒドロゲルコーティングは、ＰＡＺＡＭ層またはこれらのレーンおよびタイルのプライマー上に適用されなかった。

レーン５～８、したがってタイル３８５～７６８は、例示的なレーンおよびタイルであった。このようにして、ヒドロゲルコーティングをＰＡＺＡＭ層上、およびこれらのレーンおよびタイルのプライマー上に適用した。ヒドロゲルコーティングは、フロースループロセスを介して適用された別のＰＡＺＡＭであった。水中０．０２５％ＰＡＺＡＭ溶液をレーン５～８に導入し、６０℃に加熱し、その温度で約１０分間維持した。

全てのレーンを希釈緩衝液で洗浄した。

配列決定サイクルを、レーン１～８の各々において行った。１５０ｐＭの濃度を有するＰｈｉＸ配列決定テンプレート溶液を使用した。

図５は、フィルタを通過するクラスターの割合（％通過フィルタ（％ＰＦ））およびＤＮＡ配列決定テンプレートで占められたウェルの割合（％占有率）を示す。％通過フィルタ（％ＰＦ）は、シャスティティ閾値（chastity threshold）を通過し、配列決定データのさらなるプロセシングおよび分析のために使用されるクラスターを記述するために使用される測定基準である。より高い％通過フィルタは、配列決定データのために使用される独特のクラスターの増加した収率を生じる。

図５のデータは、ヒドロゲルを使用した場合（タイル１～３８４（ヒドロゲルなし）のデータを、タイル３８５～７６８（ヒドロゲルあり）のデータと比較して）、％通過フィルタが改善された（約５％～約１０％）ことを示す。

％占有率と％ＰＦとの間の差は、ポリクローナルクラスターの概算である％占有率タイルと％ＰＦタイル、例えばタイル３８５～７６８との間の差は、比較タイル１～３８４についての％占有率タイルと％ＰＦタイルとの間の差よりもはるかに小さく、これは、ＰＡＺＡＭヒドロゲル被覆タイル／レーンが、比較非被覆タイル／レーンよりもはるかに少ないポリクローナルクラスター化を有したことを示す。

概して、図５のデータは、ヒドロゲルコーティングの存在が、ポリクローンクラスターウェルにおけるモノクローナルクラスター化および主要成分／クラスターの純度を改善するのに役立ち、これはまた、配列決定の収率およびデータの質を改善することを示す。
実施例２

２つのフローセルを使用し、その各々は、パターン化された融合シリカ基材上に規定された８つのフローチャネル／レーンを含み、ここで、各レーンは、９６個のタイル（および画像化領域）を含み、そしてここで、各タイルは、複数のウェルと流動的に連絡していた。各ウェルにＰＡＺＡＭ層を形成し、ＰＡＺＡＭ層上に１μｍのプライマーをグラフトした。

比較例フローセルでは、レーンおよびタイルのいずれにおいても、ＰＡＺＡＭ層またはプライマー上にヒドロゲルコーティングを適用しなかった。

例示的なフローセルでは、ヒドロゲルコーティングを、レーンおよびタイルのそれぞれにおいて、ＰＡＺＡＭ層上およびプライマー上に適用した。ヒドロゲルコーティングは、フロースループロセスを介して適用された別のＰＡＺＡＭであった。水中のＰＡＺＡＭの混合物／溶液を、実施例フローセルのレーン１～８に導入し、６０℃に加熱し、その温度で約１０分間維持した。

比較例フローセルおよび実施例フローセルの全てのレーンを希釈緩衝液で洗浄した。

比較例フローセルおよび実施例フローセルのそれぞれのレーン１～８のそれぞれにおいて、配列決定サイクルを行った。１５１サイクルをリード１で配列決定し、別の１５１サイクルをリード２で配列決定した。配列決定メトリックをタイルの中心から引いて、エッジ効果を除去した。１００ｐＭ～８００ｐＭの範囲の異なる濃度を有する異なる配列決定テンプレート溶液を、各レーンにおいて使用した。より具体的には、比較例フローセルおよび実施例フローセルのそれぞれのレーン１を１００ｐＭ配列決定テンプレート溶液に暴露した；比較例フローセルおよび実施例フローセルのそれぞれのレーン２を２００ｐＭ配列決定テンプレート溶液に暴露した；比較例フローセルおよび実施例フローセルのそれぞれのレーン３を３００ｐＭ配列決定テンプレート溶液に暴露した；比較例フローセルおよび実施例フローセルのそれぞれのレーン４を４００ｐＭ配列決定テンプレート溶液に暴露した；比較例フローセルおよび実施例フローセルのそれぞれのレーン５を５００ｐＭ配列決定テンプレート溶液に暴露した；比較例フローセルおよび実施例フローセルのそれぞれのレーン６を６００ｐＭ配列決定テンプレート溶液に暴露した；比較例フローセルおよび実施例フローセルのそれぞれのレーン７を７００ｐＭ配列決定テンプレート溶液に暴露した；ならびに比較例フローセルおよび実施例フローセルのそれぞれのレーン８を８００ｐＭ配列決定テンプレート溶液に暴露した。

図６は、比較例および実施例フローセルの様々なレーンについて、フィルタを通過するクラスターの割合（％通過フィルタ（％ＰＦ））を示す。例示されるように、％ＰＦは、ヒドロゲルを有する比較例フローセルレーンよりも広い濃度範囲にわたって、ヒドロゲルを含む例示的フローセルレーンについてより一貫していた。

リード（読み取り）が正確に同じゲノム位置に整列するかどうかに従って、実施例フローセルレーンおよび比較例フローセルレーンから、二重のテンプレートをバイオインフォマティックに除去した。重複除去後の正味％ＰＦを図７に示す。全体として、比較例フローセルと比較した場合、３００ｐＭ～８００ｐＭの範囲の濃度を有する配列決定テンプレートを使用して、ヒドロゲルコーティングフローセルを用いて、より高い収率（約２％～約１７％の収率増加）を得ることができる。

比較例フローセルについての二重除去後の最大％ＰＦは、３００ｐＭ配列決定テンプレート溶液に曝露されたレーンにおいて７６．１３％であった。実施例フローセルについての二重除去後の最大％ＰＦは、６００ｐＭ配列決定テンプレート溶液に曝露されたレーンにおいて８３．４２％であった。これは、モノクローナルクラスターにおける９．６％の増加を示す。

図８Ａおよび８Ｂは、１５０の配列決定サイクル後の比較例フローセルおよび実施例フローセルについてのリード１およびリード２不整合率（ＭＭＲ）を示す。比較例フローセルおよび例示フローセルにわたる同様の不一致率は、ヒドロゲルコーティングが配列決定動作に有害な影響を及ぼさないことを示す。
注記事項

前述の概念と、以下でより詳細に論じられる追加の概念とのすべての組み合わせ（そのような概念が相互に矛盾しないという条件で）が、本明細書で開示される本発明の主題の一部であると考えられることを理解されたい。特に、本発明の最後に現れる特許請求の範囲に記載された主題の全ての組み合わせは、本明細書に開示された本発明の主題の一部であると考えられる。本明細書に明示的に用いられ、参照として組み込まれている任意の開示にも現れるであろう専門用語は、本明細書に開示された特定の概念と最も整合する意味を有することが理解されるべきである。

本明細書全体を通して、「一例」、「別の例」、「一例」などへの言及は、実施例に関連して説明される特定の要素（例えば、特性、構成、および／または特性）が、本明細書で説明される少なくとも１つの例に含まれ、他の例に存在しても存在しなくてもよいことを意味する。さらに、任意の例のための記載された要素は、文脈が明確にそうでないことを指示しない限り、様々な例において任意の適切な方法で組み合わされてもよいことが理解されるべきである。

本明細書で提供される範囲は、記載された範囲、および記載された範囲内の任意の数値またはサブ範囲を含むことを理解されたい。例えば、１～５０，０００の範囲は、１～５０，０００の明示的に列挙された限界を含むだけでなく、約７０８、約９４５、約３，５００などのような個々の値、および約８２５～約２９，０００、約９５～約４０，０００などのようなサブ範囲を含むと解釈されるべきである。さらに、「約」および／または「実質的に」が値を記述するために利用される場合、それらは、記載された値からのわずかな変動（＋／－１０％まで）を包含することを意味する。

いくつかの実施例を詳細に説明したが、開示された実施例は変更されてもよいことを理解されたい。したがって、前述の説明は、非限定的であると考えられるべきである。

Claims (14)

1. 間隙領域によって分離された凹部を含むパターン化された基材であって、
   結合領域を含む、基材と、
   前記凹部の各々に付着したシークエンシング表面化学物質であって、
   官能化コーティング層と、
   該官能化コーティング層にグラフトされたプライマーと、
   を含む、シークエンシング表面化学物質と、
   架橋ポリアクリルアミド、アガロースゲル、および架橋ポリエチレングリコールからなる群より選択される非グラフト化ヒドロゲルと、
   前記結合領域で、前記パターン化された基材に取り付けられた蓋と、
   該蓋と前記パターン化された基材との間に画定される流路と、
   を含む、フローセル。
2. 前記非グラフト化ヒドロゲルが、前記間隙領域の少なくともいくつかの上にもある、請求項１に記載のフローセル。
3. 前記官能化コーティング層が、ポリ（Ｎ－（５－アジドアセトアミジルペンチル）アクリルアミド－ｃｏ－アクリルアミド）である、請求項１または２に記載のフローセル。
4. フローセルを製造する方法であって、
   パターン化されたフローセル基材の凹部に官能化コーティング層を適用する工程であって、凹部が間隙領域によって分離されている工程であって、前記パターン化されたフローセル基材が結合領域を含む、工程と、
   プライマーを前記官能化コーティング層にグラフトして、前記凹部にグラフトされた官能化コーティング層を形成する工程と、
   少なくとも前記グラフトされた官能化コーティング層上に非グラフト化ヒドロゲルを適用する工程であって、該非グラフト化ヒドロゲルが、架橋ポリアクリルアミド、アガロースゲル、および架橋ポリエチレングリコールからなる群より選択される、工程と、
   前記結合領域で、前記パターン化されたフローセル基材に蓋を結合し、これにより、該蓋と前記パターン化されたフローセル基材との間に流路を画定する、工程と、
   を含む、方法。
5. 前記非グラフト化ヒドロゲルが、前記グラフトされた官能化コーティング層上および前記間隙領域のいくつかの上に配置される、請求項４に記載の方法。
6. 請求項４または５に記載の方法であって、前記官能化コーティング層を適用する前に、前記パターン化されたフローセル基材の表面を処理して、前記表面に官能基を付着させて、処理された凹部および処理された間隙領域を形成することをさらに含む、方法。
7. 前記凹部に前記官能化コーティング層を適用する工程は、
   前記処理された凹部および処理された間隙領域上に官能化コーティング層を適用する工程と、
   前記処理された間隙領域から官能化コーティング層を研磨する工程と、
   を含む、請求項６に記載の方法。
8. 前記非グラフト化ヒドロゲルを適用することが、約０．００１％～約０．１％（質量対体積）のヒドロゲル材料を含む水性混合物を適用することを含む、請求項４～７のいずれか１項に記載の方法。
9. 前記パターン化されたフローセル基材の結合領域が、それに結合されたスペーサー層を有し、前記非グラフト化ヒドロゲルが適用された後、前記パターン化されたフローセル基材への前記蓋の結合が、前記スペーサー層に前記蓋を結合することを含む、請求項４から８のいずれか１項に記載の方法。
10. 前記ヒドロゲルを適用することが、前記グラフトされた官能化コーティング層上にヒドロゲルを選択的に堆積させることを含む、請求項４および６～９のいずれか１項に記載の方法。
11. フローセルを製造する方法であって、
    凹部が画定された流路を含むパターン化された基材の表面にシランまたはシラン誘導体を付着させ、凹部が間隙領域によって分離され、それによってシラン化凹部およびシラン化間隙領域が形成される工程であって、前記パターン化された基材が結合領域を含む、工程と、
    前記シラン化凹部およびシラン化間隙領域に、官能化コーティング層を適用する工程と、
    前記シラン化間隙領域からの官能化コーティング層を研磨する工程と、
    前記シラン化凹部内の官能化コーティング層にプライマーをグラフトして凹部にグラフトされた官能化コーティング層を形成し、凹部のグラフトされた官能化コーティング層上に非グラフト化ヒドロゲルを適用する工程であって、該非グラフト化ヒドロゲルが、架橋ポリアクリルアミド、アガロースゲル、および架橋ポリエチレングリコールからなる群より選択される、工程と、
    前記結合領域で、前記パターン化された基材に蓋を結合し、これにより、該蓋と前記パターン化された基材との間に流路を画定する、工程と、
    を含む、方法。
12. 前記非グラフト化ヒドロゲルを適用する工程が、約０．００１％から約０．１％（質量対体積）までのヒドロゲル材料を含む水性混合物を適用することを含む、請求項１１に記載の方法。
13. 前記官能化コーティング層が研磨された後、前記プライマーがグラフトされる前に、前記間隙領域の少なくともいくつかに蓋を接合することをさらに含む、請求項１１または１２に記載の方法。
14. 前記非グラフト化ヒドロゲルを適用する工程は、該非グラフト化ヒドロゲルを前記凹部のグラフトされた官能化コーティング層上に選択的に堆積させることを含む、請求項１１～１３のいずれか１項に記載の方法。
    

Images