CN115106030A

CN115106030A - 具有水凝胶涂层的流动池

Info

Publication number: CN115106030A
Application number: CN202210303552.4A
Authority: CN
Inventors: 任洪吉; J·M·鲍特尔; J·A·穆恩; M·S·鲍恩; A·内米罗斯基; G·M·斯金纳; K·陈
Original assignee: Illumina Cambridge Ltd; Illumina Inc
Current assignee: Illumina Cambridge Ltd; Illumina Inc
Priority date: 2017-12-21
Filing date: 2018-12-17
Publication date: 2022-09-27
Anticipated expiration: 2038-12-17
Also published as: KR20210133298A; IL271026B1; AU2018392919B2; RU2751517C2; US11938475B2; EP3727674A4; BR112019026796A2; AU2021204165B2; CN115106030B; CN111093819B; JP7087010B2; SA519410903B1; SG11201911590VA; KR20200016859A; IL271026A; RU2019139643A; KR102313291B1; US20200129974A1; BR112019026796A8; US10919033B2

Abstract

在所述方法的实例中，在图案化流动池基底的凹陷中施加功能化涂层。所述凹陷由间隙区分隔开。引物接枝到功能化涂层上以在凹陷中形成接枝的功能化涂层。水凝胶施加在至少接枝的功能化涂层上。

Description

具有水凝胶涂层的流动池

本申请是申请日为2018年12月17日、申请号为 201880044290.6、发明名称为“具有水凝胶涂层的流动池”的中国发明专利的分案申请。

相关申请的交叉参考

本申请要求2017年12月21日提交的美国临时申请系列号 62/609,105的权益，将其内容全部按引用并入本文中。

背景技术

生物阵列是用于检测和分析分子的广泛工具之一，所述分子包括脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)。在这些应用中，将阵列工程化以包括针对人类和其他生物体的基因中存在的核苷酸序列的探针。在某些应用中，例如，单个DNA和RNA探针可以连接在阵列载体上几何网格中(或随机)的位置处。可以将例如来自人或生物体的测试样品暴露于网格，使得互补片段与在阵列中的单个位点处的探针杂交。然后可以通过在位点上扫描特定频率的光来检查阵列，以通过片段杂交的位点的荧光来鉴定样品中存在哪些片段。

生物阵列可用于基因测序。通常，基因测序包括确定一定长度的遗传物质(如DNA或RNA片段)中的核苷酸或核酸的顺序。正在分析越来越长的碱基对序列，并且可以将所得到的序列信息用于各种生物信息学方法中以将片段逻辑地装配在一起，从而可靠地确定片段从其产生的遗传物质的广泛长度的序列。已经开发了特征性片段的自动化的、基于计算机的检测方法，并将其用于基因组作图、基因及其功能的鉴定、某些病症和疾病状态的风险评估等。除了这些应用外，生物阵列还可用于检测和评估广泛的分子、分子家族、遗传表达水平、单核苷酸多态性和基因分型。

发明内容

在第一方面中，一种方法包括在图案化流动池基底的凹陷中施加功能化涂层，其中所述凹陷由间隙区分隔开；将引物接枝到功能化涂层上以在凹陷中形成接枝的功能化涂层；和在接枝的功能化涂层上施加水凝胶。

在所述方法的这个第一方面的实例中，水凝胶选自聚(N-(5-叠氮基乙酰胺基戊基)丙烯酰胺-共-丙烯酰胺)、交联聚丙烯酰胺、琼脂糖凝胶和交联聚乙二醇。

在所述方法的这个第一方面的实例中，将水凝胶布置在接枝的功能化涂层上。在一个实例中，将水凝胶施加于凹陷中的功能化涂层上和至少一些间隙区上。在另一个实例中，施加水凝胶包括选择性地将水凝胶布置在凹陷中接枝的功能化涂层上。

在所述方法的这个第一方面的实例中，在施加功能化涂层前，所述方法进一步包括处理图案化流动池基底的表面，以将官能团连接于表面，从而形成处理的凹陷和处理的间隙区。在这个实例中，在凹陷中施加功能化涂层包括：在处理的凹陷中和处理的间隙区上施加功能化涂层；并且从处理的间隙层抛光功能化涂层。

在所述方法的这个第一方面的实例中，施加水凝胶包括施加包含约0.001％至高达约0.1％(质量体积比)的水凝胶材料的水性混合物。在一个实例中，水凝胶材料选自聚(N-(5-叠氮基乙酰胺基戊基) 丙烯酰胺-共-丙烯酰胺)、交联聚丙烯酰胺、琼脂糖凝胶和交联聚乙二醇。

在所述方法的这个第一方面的实例中，图案化流动池基底的周边具有与其粘结的间隔层，并且在施加水凝胶后，所述方法进一步包括将盖子粘结(bonded)到间隔层上。

在所述方法的这个第一方面的实例中，在施加功能化涂层后并且在接枝引物前，所述方法包括将盖子粘结到至少一些间隙区上。

在所述方法的这个第一方面的实例中，施加水凝胶包括选择性地沉积水凝胶在接枝的功能化涂层上。应理解所述方法的这个第一方面的任何特征可以以任何所需的方式和/或配置结合在一起。

在第二方面中，一种方法包括将硅烷或硅烷衍生物连接于图案化基底的表面，所述基底包括具有在其中限定的凹陷的流通通道，其中所述凹陷由间隙区分隔开，由此形成硅烷化的凹陷和硅烷化的间隙区；在硅烷化的凹陷中和硅烷化的间隙区上施加功能化涂层；从硅烷化的间隙区抛光功能化涂层；将引物接枝到硅烷化凹陷中的功能化涂层上以在凹陷中形成接枝的功能化涂层；和将水凝胶施加到凹陷中的接枝的功能化涂层上。

在这个第二方面的实例中，施加水凝胶包括施加包含约0.001％至高达约0.1％(质量体积比)的水凝胶材料的水性混合物。在这个实例中，水凝胶材料选自聚(N-(5-叠氮基乙酰胺基戊基)丙烯酰胺-共- 丙烯酰胺)、交联聚丙烯酰胺、琼脂糖凝胶和交联聚乙二醇。

在这个第二方面的实例中，间隔层焐结于图案化基底并限定流通通道的周边；并且在施加水凝胶后，所述方法进一步包括将盖子粘结到间隔层上。

在这个第二方面的实例中，在将功能化涂层抛光后并且在接枝引物前，所述方法进一步包括将盖子粘结于至少一些间隙区。

在所述方法的这个第二方面的实例中，施加水凝胶包括将水凝胶施加于凹陷中的接枝的功能化涂层上。在一个实例中，将水凝胶施加于凹陷中的功能化涂层上和至少一些间隙区上。在另一个实例中，施加水凝胶包括选择性地沉积水凝胶在接枝的功能化涂层上。

应理解所述方法的这个第二方面的任何特征可以以任何所需的方式组合在一起。此外，应理解所述方法的这个方面和/或所述方法的第一方面的特征的任意组合可以一起使用，和/或来自这些方面中的任一个或两个的任何特征可以与本文公开的任一个实例结合。

在另一个方面中，流动池包括图案化基底，所述基底包括由间隙区分隔开的凹陷；附接于每个凹陷的测序表面化学物质(sequencing surface chemistry)，所述测序表面化学物质包括：功能化涂层，和接枝于功能化涂层的引物；和测序表面化学物质上和任选地一些间隙区上的水凝胶。

在流动池的实例中，所述水凝胶还在至少一些间隙区上。

在流动池的实例中，功能化涂层是聚(N-(5-叠氮基乙酰胺基戊基) 丙烯酰胺-共-丙烯酰胺)。

在流动池的实例中，所述水凝胶选自聚(N-(5-叠氮基乙酰胺基戊基)丙烯酰胺-共-丙烯酰胺)、交联聚丙烯酰胺、琼脂糖凝胶和交联聚乙二醇。

在流动池的实例中，水凝胶没有接枝于所述表面化学物质。

在流动池的实例中，图案化基底包括至少一个流动通道；凹陷在至少一个流动通道中限定；和流动池进一步包括附接于图案化基底的其他间隙区的间隔层，使得间隔层限定至少一个流动通道的周边。在这个实例中，所述流动池可以进一步包括附接于间隔层的盖子。

应理解流动池的这个方面的任何特征可以以任何所需的方式结合在一起。此外，应理解流动池的这个方面和/或所述方法的第一和/ 或第二方面的特征的任意组合可以一起使用，和/或来自任一个方面的任何特征可以与本文公开的任一个实例结合。

附图说明

通过参考以下的详述和附图，本公开的实例的特征将变得显而易见，在附图中，相似的附图标记对应于相似但可能不相同的组件。为了简洁起见，具有先前描述的功能的附图标记或特征可以结合或不结合它们在其中出现的其他附图来描述。

图1是说明了本文公开的方法的实例的流程图；

图2是说明了本文公开的方法的另一个实例的流程图；

图3A至3G和图3A至3D、3H和3I是描绘了本文公开的方法的相应实例的示意性剖视图；

图4是通过图3A至3G和图3A至3D、3H和3I中所示的方法形成的实例流动池的剖视图；

图5是说明对于没有水凝胶涂层的比较流动池的区块(tiles)(X 轴上的1-384)和包括水凝胶涂层的实例流动池的区块(X轴上的 385-768)，通过过滤器的簇的百分比(％PF)和DNA模板占据的凹陷/孔的百分比(％占据)的图；

图6是对于比较例流动池和包括水凝胶涂层的实例流动池，簇通过过滤器的百分比(％PF)相对于模板浓度(pM)的图；

图7是对于比较例流动池和包括水凝胶涂层的实例流动池，除去复制模板后簇通过过滤器的百分比(％PF)相对模板浓度(pM) 的图；和

图8A和8B是对于比较例流动池和包括水凝胶涂层的实例流动池，150个测序循环后阅读1(R1)(图8A)和阅读2(R2)(图 8B)错配率的图。

具体实施方式

流动池通常用于测序操作、分析和其他生物学应用。图案化流动池可以包括在其中或其上限定了凹陷的基底或载体；并且化学和/ 或生物活性表面化学物质可被限制在凹陷中。例如，表面化学物质包括功能化涂层和引物。在某些测序操作中，将引物固定在流动池基底的凹陷中后，可以将测序模板(包括与引物互补的部分)引入凹陷中，并随后可以扩增测序模板以产生测序模板的相同拷贝(在本文中称为簇生成的过程)。

在本文公开的实例中，水凝胶(在本文中也称为水凝胶涂层) 直接包括在表面化学物质上，即，在功能化涂层和引物上。已经发现，水凝胶涂层可以在簇生成时减慢测序模板接种速度。结果，在一个测序模板接种到凹陷中后，在任何后续的测序模板有机会通过水凝胶扩散并进入凹陷之前，有更多的时间(与不包括水凝胶时相比)将该模板扩增成较大的簇。这增加了接种单个测序模板的凹陷的数量。换句话说，这增加了特定凹陷内的单克隆成簇(即，形成一种类型的测序模板的多个拷贝)，并减少了特定凹陷内的多克隆簇(即，形成多种类型的测序模板的多个拷贝)。在去除重复后通过滤器的簇的数量可以指示增加的单克隆簇。在一个实例中，对于本文公开的包括水凝胶涂层的实例的净PF％范围比不包括水凝胶涂层的比较例的净PF％高约2％至约17％。

本文公开的方法可以完全在晶片水平、完全在模(die)水平、部分在晶片水平和/或部分在模水平进行。作为部分地在晶片和模水平进行所述方法的实例，可以使用晶片来启动该方法，然后将其切成小片以形成几个模，并且该方法可以使用每个模继续。至少在一些实例中，执行开放晶片处理的能力使得各种度量/分析技术能够用于质量控制和表征。在结合以形成流动池之前，可以将图案化的和表面改性的晶片/基底暴露于例如原子力显微镜(AFM)、扫描电子显微镜(SEM)、椭圆光度法、测角法、散射法和/或荧光技术中。或者，可以将结合的流动池暴露于这些技术。在模水平，所述方法可以在敞开的模上或在组装的流动池(带有封闭的流动通道)上进行。

应当理解，除非另外说明，否则本文中使用的术语具有相关领域中的普通含义。下面列出本文中使用的几个术语及其含义。

单数形式“一(a)”、“一个(an)”和“该(the)”包括复数指代物，除非文中清楚地另外指出。

术语包含、包括、含有以及这些术语的各种形式彼此是同义的并且意味着同等宽泛。

术语顶部、底部、较低、较高、上等在本文用于描述流动池和/ 或流动池的各个部件。应当理解，这些指向性术语并不意味着暗指特定的取向，而是用于指定部件之间的相对取向。指向性术语的使用不应解释为将本文公开的实例限于任何特定取向。

如本文使用的，“烷基”是指完全饱和的直链或支链烃链(即，不含双键或三键)。烷基基团可以具有1至20个碳原子。实例烷基基团包括甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、戊基、己基等。例如，命名“C1-4烷基”表示烷基链中存在一至四个碳原子，即，烷基链选自甲基、乙基、丙基、异丙基、n-丁基、异丁基、仲-丁基和叔-丁基。

如本文使用的，“烯基”是指含有一个或多个双键的直链或支链烃链。烯基基团可以具有2至20个碳原子。实例烯基基团包括乙烯基、丙烯基、丁烯基、戊烯基、己烯基等。

如本文使用的，“炔”或“炔基”是指含有一个或多个三键的直链或支链烃链。炔基基团可以具有2至20个碳原子。

如本文使用的，“芳基”是指在环骨架中只含碳的芳族环或环系统(即，共有两个邻接碳环的两个或更多个稠合的环)。当芳基是环系统时，系统中的每个环是芳族的。芳基基团可以具有6至18 个碳原子。芳基基团的实例包括苯基、萘基、薁基(azulenyl)和蒽基。

如本文使用的，术语“附接的”是指两个物体相互接合、固定、粘附、连接或结合的状态。附接可以是机械的，或可以是化学的。例如，核酸可以通过共价或非共价键化学地附接于功能化涂层。共价键的特征在于原子之间共享电子对。非共价键是不涉及电子对共享的物理键并且可以包括，例如，氢键、离子键、范德华力、亲水性相互作用和疏水性相互作用。

“叠氮化物”或“叠氮基”官能团是指-N₃。

如本文使用的，“粘结区”是指基底上与另一种材料粘结的区域，所述另一种材料可以是，例如，间隔层、盖子、另一基底等，或其组合(例如，间隔层和盖子)。在粘结区形成的粘结可以是化学粘结(如上所述)或机械粘结(例如，使用固定件等)。

如本文使用的，“碳环基(carbocyclyl)”表示在环系统骨架中只含有碳原子的非芳族环或环系统。当碳环基是环系统时，两个或多个环可以以稠合、桥接或螺接的方式接合在一起。碳环基可以具有任何饱和度，只要环系统中的至少一个环是非芳族的。因此，碳环基包括环烷基、环烯基和环炔基。碳环基基团可以具有3至20个碳原子。碳环基环的实例包括环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环己烯基、2,3-二氢-茚、双环[2.2.2]辛基、金刚烷基和螺[4.4]萘基。

如本文使用的，术语“羧酸”或如本文使用的“羧基”是指 -C(O)OH。

如本文使用的，术语“亚环烷基”表示通过两个连接点附接于分子其余部分的完全饱和的碳环基环或环系统。

如本文使用的，“环烯基”或“环烯烃”表示具有至少一个双键的碳环基或环系统，其中环系统中没有环是芳族的。实例包括环己烯基或环己烯和降冰片烯基或降冰片烯。还如本文使用的，“杂环烯基”或“杂环烯烃”表示具有至少一个双键的在环骨架中具有至少一个杂原子的碳环基环或环系统，其中环系统中没有环是芳族的。

如本文使用的，“环炔基”或“环炔烃”表示具有至少一个三键的碳环基环或环系统，其中环系统中没有环是芳族的。实例是环辛炔。另一个实例是双环辛炔。还如本文使用的，“杂环炔基”或 “杂环炔烃”表示具有至少一个三键的在环骨架中具有至少一个杂原子的碳环基环或环系统，其中环系统中没有环是芳族的。

如本文使用的，术语“沉积”是指任何合适的施用技术(其可以是人工的或自动的)，并且导致表面特性的改变。通常，可以使用气相沉积技术、涂层技术、接枝技术等进行沉积。一些特定的实例包括化学气相沉积(CVD)、喷雾涂层(例如，超声波喷雾涂层)、旋转涂层、浸泡(dunk)或浸渍涂层、刮刀涂层、搅拌分配(puddle dispensing)、流延涂层、气溶胶印刷、喷墨印刷等。

如本文使用的，术语“凹陷”是指图案化基底中的离散凹入特征，其具有完全被图案化基底表面的间隙区围绕的表面开口。凹陷在表面中的其开口处可以具有多种形状中的任何一种，包括例如圆形、椭圆形、方形、多边形、星形(具有任何数量的顶角)等。与表面正交截取的凹陷的横截面可以是弯曲的、方形、多边形、双曲线、圆锥形、角形等。例如，凹陷可以是孔。

术语“每个”在结合物品的集合使用时，旨在确定该集合中的单个物品，但不一定指代该集合中的每个物品。如果明确的公开或上下文另有明确规定，则可能会出现例外。

如本文使用的，术语“流动池”旨在表示具有其中可进行反应的腔室(即，流动通道)、用于将试剂递送至腔室的入口以及从腔室除去试剂的出口的容器。在一些实例中，所述腔室使得能够检测在腔室中发生的反应。例如，腔室可包括一个或多个透明表面，其允许对该腔室中的阵列、光学标记的分子等进行光学检测。

如本文使用的，“流动通道”可以是在两个粘结的部件之间限定的区域，其可以选择性地接收液体样品。在一些实例中，流动通道可以限定在图案化基底和盖子之间，并且因此可以与图案化基底中限定的一个或多个凹陷流体连通。

在本文中所指的“功能化涂层”旨在用于表示液体和气体可渗透的半刚性材料。功能化涂层可以是水凝胶，其在吸收液体时可以溶胀并且在通过干燥除去液体时可以收缩。在本文公开的实例中，功能化涂层包括可与炔烃官能团反应的叠氮化物/叠氮基官能团。在一个实例中，功能化涂层是聚(N-(5-叠氮基乙酰胺基戊基)丙烯酰胺- 共-丙烯酰胺)(PAZAM)。

如本文使用的，“杂芳基”是指在环骨架中含有一个或多个杂原子的芳族环或环系统(例如，共享两个邻接原子的两个或更多个环)，所述杂原子(即除了碳以外的元素)包括但不限于，氮、氧和硫。在杂芳基是环系统时，系统中的每个环是芳族的。杂芳基基团可以具有5-18个环成员。

如本文使用的，“杂环基”表示在环骨架中含有至少一个杂原子的非芳族环或环系统。杂环基可以以稠合、桥接或螺接的方式接合在一起。杂环基可以具有任何饱和度，只要环系统中的至少一个环是非芳族的。在环系统中，杂原子可以存在于非芳族或芳族环中。杂环基基团可以具有3至20个环成员(即，构成环骨架的原子数，包括碳原子和杂原子)。在一些实例中，杂原子是O、N或S。

如本文使用的术语“肼”或“肼基”是指-NHNH₂基团。

如本文使用的术语“腙”或“腙基”是指

基团，其中 R_a和R_b如本文限定。

如本文使用的，“水凝胶”是指由交联聚合物链组成的三维聚合物网络结构。水凝胶不是水溶性的或者在测序过程中其所暴露的液体中不是可去除的。

如本文使用的，“氢氧基(hydroxy)”或“羟基(hydroxyl)” 是指-OH基团。

如本文使用的，术语“间隙区”是指基底中或表面上分隔凹陷的区域。例如，间隙区可以将阵列的一个特征与阵列的另一特征分隔开。彼此分隔的两个特征可以是离散的，即，缺乏彼此的物理接触。在另一个实例中，间隙区可以将特征的第一部分与特征的第二部分分隔开。在许多实例中，间隙区是连续的，而特征是离散的，例如，如在另外连续的表面中限定的多个孔的情况一样。由间隙区提供的分隔可以是部分或完全的分隔。间隙区可以具有不同于表面中限定的特征的表面材料的表面材料。例如，阵列的特征具有的涂层和引物的量或浓度可以超过间隙区存在的量和浓度。在一些实例中，涂层和引物可以不存在于间隙区中。

如本文使用的，“氧化腈”表示“R_aC≡N⁺O^-”基团，其中R_a如本文中限定。制备氧化腈的实例包括通过用氯胺-T处理或通过碱对亚胺酰氯[RC(Cl)＝NOH]的作用从醛肟原位产生。

如本文使用的，“硝酮”表示

基团，其中R₁、R₂和R₃可以是本文限定的R_a和R_b中的任一个。

如本文使用的，“核苷酸”包括含氮杂环碱基、糖和一个或多个磷酸基团。核苷酸是核酸序列的单体单元。在RNA中，糖是核糖，而在DNA中，糖是脱氧核糖，即缺乏在核糖的2'位置处存在的羟基的糖。含氮杂环碱基(即核碱基)可以是嘌呤碱基或嘧啶碱基。嘌呤碱基包括腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G)及其修饰的衍生物或类似物。嘧啶碱基包括胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)及其修饰的衍生物或类似物。脱氧核糖的C-1原子与嘧啶的N-1或嘌呤的 N-9键合。

术语“流动池基底”或“基底”是指可以在其上添加表面化学物质的载体。术语“图案化基底”是指在其中或在其上限定凹陷的载体。基底可以是晶片、面板、矩形片、模或任何其他合适的构造。基底通常是刚性的，并且不溶于水性液体。基底可以对用于修饰凹陷的化学物质为惰性的。例如，基底可以对用于施加功能化涂层、将引物连接至功能化涂层、施加水凝胶等的化学作用是惰性的。合适基底的实例包括环氧硅氧烷、多面体低聚倍半硅氧烷(POSS)或其衍生物、玻璃和改性或功能化的玻璃、塑料(包括丙烯酸树脂、聚苯乙烯和苯乙烯与其他材料的共聚物、聚丙烯、聚乙烯、聚丁烯、聚氨酯、聚四氟乙烯(如来自Chemours的

)、环烯烃/环氧 -烯烃聚合物(COP)(如来自Zeon的

)、聚酰亚胺等)、尼龙、陶瓷/陶瓷氧化物、二氧化硅、熔融二氧化硅或基于二氧化硅的材料(例如，包括至少10％二氧化硅)、铝硅酸盐、硅和改性硅 (例如掺硼的p+硅)、氮化硅(Si₃N₄)、氧化硅(SiO₂)、五氧化钽(TaO₅)或其他钽氧化物(TaO_x)、氧化铪(HaO₂)、碳、金属、无机玻璃等。基底也可以是玻璃或硅或POSS或其衍生物，在其表面上具有钽氧化物或另一陶瓷氧化物的涂层。

如本文使用的，“等离子体灰化”是指通过氧等离子体从基底去除有机物质的过程。等离子体灰化产生的产物可以用真空泵/系统除去。等离子体灰化可以通过引入反应性羟基或羧基基团来激活基底。

如本文使用的，“引物”定义为用作DNA或RNA合成的起始点的单链核酸序列(例如，单链DNA或单链RNA)。引物的5’末端可以进行修饰以允许与功能化涂层的偶联反应。引物长度可以是任何数量的碱基长度并且可以包括各种非天然的核苷酸。在一个实例中，测序引物是20至40个碱基的短链。

如本文使用的，术语“硅烷”和“硅烷衍生物”是指含有一个或多个硅原子的有机或无机化合物。无机硅烷化合物的实例是SiH₄或其中氢被一个或多个卤素原子代替的卤代SiH₄。有机硅烷化合物的实例是X-R^B-Si(OR^C)₃，其中X是有机基团，如氨基、乙烯基、甲基丙烯酸酯、环氧基

硫、烷基、烯基或炔基； R^B是间隔物，例如，-(CH₂)_n-，其中n为0至1000；R^C选自氢、任选取代的烷基、任选取代的烯基、任选取代的炔基、任选取代的碳环基、任选取代的芳基、任选取代的5-10元杂芳基和任选取代的5-10 元杂环基，如本文限定的。如本文使用的术语“硅烷”和“硅烷衍生物” 可以包括不同硅烷和/或硅烷衍生物化合物的混合物。

在一些实例中，硅烷或硅烷衍生物包括能够与功能化聚合物层的官能团反应的不饱和部分。如本文使用的，术语“不饱和部分” 是指包括烯烃、炔烃、环烯烃、环炔烃、杂环烯烃、杂环炔烃或其任选取代的变体(包括至少一个双键或一个三键)的化学基团。不饱和部分可以是单价或二价的。当不饱和部分为单价时，环烯烃、环炔烃、杂环烯烃和杂环炔烃分别与环烯基、环炔基、杂环烯基和杂环炔基互换使用。当不饱和部分为二价时，环烯烃、环炔烃、杂环烯烃和杂环炔烃分别与亚环烯基、亚环炔基、亚杂环烯基和亚杂环炔基互换使用。

不饱和部分可以是与硅烷或硅烷衍生物的硅原子直接共价连接，或通过接头间接连接。合适的接头的实例包括任选取代的亚烷基(例如，被认为是通过打开双键从烯烃衍生的或通过从不同碳原子上去除两个氢原子从烷烃衍生的二价饱和脂族基团(如亚乙基))、取代的聚亚乙基二醇等。

如本文使用的，“间隔层”是指将两个组件粘结在一起的材料。在一些实例中，间隔层可以是有助于粘结的辐射吸收材料，或者可以与有助于粘结的辐射吸收材料接触。

如本文使用的，术语“表面化学物质”是指并入图案化基底的凹陷中的化学和/或生物活性组分。本文公开的表面化学物质的实例包括附接于至少一部分基底表面的功能化聚合物层和/或连接至少一部分功能化聚合物层的引物。

“硫醇”官能团是指-SH。

如本文使用的，术语“四嗪”和“四嗪基”是指含有四个氮原子的六元杂芳基基团。四嗪可以是任选取代的。

如本文使用的，“四唑”是指包括四个氮原子的五元杂环基团。四唑可以是任选取代的。

图1中描绘了方法100的实例。方法100包括在图案化流动池基底的凹陷中施加功能化涂层，其中所述凹陷通过间隙区分隔开(如附图标记102所示的)，将引物接枝到功能化涂层上以在凹陷中形成接枝的功能化涂层(如附图标记104所示的)，和将水凝胶施加于至少接枝的功能化涂层上(如附图标记106所示的)。

图案化流动池基底可以是图案化晶片或图案化模或本文公开的其他图案化基底中的任何一种。可以使用本文所述的基底的任何实例。图案化基底(图3A和4中显示为附图标记12)包括在暴露层或基底表面之上或之中限定的凹陷，和分隔相邻的凹陷的间隙区。可以使用各种技术在基底中或基底上制造凹陷，包括，例如，光刻、纳米压印、冲压技术、压花技术、模塑技术、微蚀刻技术、印刷技术等。如本领域技术人员理解的，所用的技术将取决于基底的组成和形状。可以设想许多不同的凹陷布局，如下面参考图4所讨论的。

尽管在图1中未示出，在施加功能化涂层和接枝引物之前(即，在添加表面化学物质之前)，所述方法可以包括通过将图案化基底暴露于清洁处理和/或为了随后的表面化学物质沉积而制备图案化基底表面(例如，凹陷，以及在一些情况中，邻近的间隙区)的另一过程来处理表面。例如，所述方法可以包括处理流动池基底的表面以将官能团连接于表面而形成处理的凹陷，以及在一些情况中，形成处理的间隙区。处理过程(例如，清洁过程和表面制备过程)的更详细实例在以下参考图3A至3I进行讨论。

在图1中所示的实例中，添加表面化学物质包括在凹陷中施加功能化涂层(附图标记102)以及将引物接枝到功能化涂层上(附图标记104)。

功能化涂层的实例包括丙烯酰胺共聚物，如聚(N-(5-叠氮基乙酰胺基戊基)丙烯酰胺-共-丙烯酰胺)，PAZAM。PAZAM和一些其他形式的丙烯酰胺共聚物由式(I)表示：

其中：

R^A选自叠氮基、任选取代的氨基、任选取代的烯基、任选取代的腙、任选取代的肼、羧基、羟基、任选取代的四唑、任选取代的四嗪、氧化腈、硝酮和硫醇；

R^B是氢或任选取代的烷基；

R^C、R^D和R^E独立地选自H和任选取代的烷基；

-(CH₂)_p-的每一个可以是任选取代的；

p是1至50范围的整数；

n是1至50,000范围的整数；和

m是1至100,000范围的整数。

本领域普通技术人员将认识到式(I)中重复出现的“n”和“m”特征的排列是代表性的，并且单体亚单元可以以任何顺序存在于聚合物结构中(例如，无规、嵌段、模式化(patterned)或其组合)。

PAZAM的一个具体实例由下式来表示：

其中n是1-20,000范围的整数，并且m是1-100,000范围的整数。

PAZAM的分子量范围可以为约10kDa至约1500kDa，或在特定的实例中，可以为约312kDa。

在一些实例中，PAZAM是线性聚合物。在一些其他实例中， PAZAM是轻度交联的聚合物。

在其他实例中，功能化涂层可以是式(I)的变型。在一个实例中，丙烯酰胺单元可以被N,N-二甲基丙烯酰胺

替代。在这个实例中，式(I)中的丙烯酰胺单元可以被

替代，R^D、R^E和R^F各自是H，并且R^G和R^H各自是甲基基团(与丙烯酰胺的情况的H不同)。在这个实例中，q可以是1至10,000范围的整数。在另一个实例中，除丙烯酰胺单元外，还可以使用N,N-二甲基丙烯酰胺。在这个实例中，式(I)还可以包括

(除重复出现的“n”和“m”特征外)，其中R^D、 R^E和R^F各自是H，并且R^G和R^H各自是甲基基团。在这个实例中， q可以是1至100,000范围的整数。

应当理解，其他功能化的分子可以用于形成功能化涂层，只要它们被功能化以与图案化基底和随后施加的引物相互作用即可。用于形成功能化涂层的合适分子的其他实例包括具有胶体结构的那些，如琼脂糖；或聚合物网状结构，如明胶；或交联的聚合物结构，如聚丙烯酰胺聚合物和共聚物、无硅烷丙烯酰胺(SFA)或SFA的叠氮化形式。合适的聚丙烯酰胺聚合物的实例可以由丙烯酰胺和丙烯酸或含有乙烯基的丙烯酸合成，或由形成[2+2]光环加成反应的单体合成。

可以使用旋转涂层，或者浸渍或浸渍涂层，或者功能化的分子在正或负压力下流动，或者另一种合适的技术将功能化分子(例如， PAZAM)沉积在图案化基底的表面上。功能化分子可以以混合物存在。在一个实例中，混合物包括在水中或在乙醇和水的混合物中的PAZAM。

涂覆后，还可以将功能化分子暴露于固化过程以在整个图案化基底上(即，在凹陷和空隙区域上)形成功能化涂层。在一个实例中，功能化分子固化可以在室温(例如约25℃)至约60℃的温度范围的温度下进行约5分钟至约2小时的时间。

为了在图案化基底的凹陷中且不在间隙区上形成功能化涂层，可以使用i)pH范围为约7.5至约11的并且包括磨料颗粒的碱性含水浆液；或ii)抛光垫和不含磨料颗粒的溶液将功能化涂层从间隙区抛光掉。

在方法100的这个实例中，随后将引物接枝到保留在凹陷中的功能化涂层上，如附图标记104所示的，以形成接枝的功能化涂层。合适的引物的实例包括正向扩增引物或反向扩增引物。合适的引物的具体实例包括P5或P7引物，其在Illumina Inc.出售的商业流动池的表面上用于在

MISEQ^TM、MISEQX^TM、 NEXTSEQ^TM、NOVASEQ^TM、GENOME ANALYZER^TM以及其他仪器平台上测序。

可以通过浸泡涂层、喷雾涂层、搅拌分配或通过将引物连接到至少一些凹陷中的功能化涂层上的另一种合适的方法来完成接枝。这些示例技术中的每一种可以利用引物溶液或混合物，其可以包括引物、水、缓冲剂和催化剂。

浸泡涂层可包括将图案化基底(在其凹陷中具有功能化涂层) 浸入一系列温度控制的浴中。浴也可以是流量控制的和/或被氮气层覆盖的。浴可包括引物溶液或混合物。在各种浴中，引物连接于至少一些凹陷中的功能化涂层上。在一个实例中，将涂覆和抛光的图案化基底引入包括引物溶液或混合物的第一浴中，在其中发生反应以连接引物，然后将图案化基底移至另外的浴中进行洗涤。可以使用机械臂或手动地将图案化基底在浴之间移动。干燥系统也可用于浸泡涂层中。

喷雾涂层可通过将引物溶液或混合物直接喷射到涂覆和抛光的图案化基底上来完成。可以将喷涂的晶片在约0℃至约70℃的温度范围的温度下孵育约4分钟至约60分钟的时间。孵育后，可以使用例如旋涂机稀释并除去引物溶液或混合物。

可以根据合并和拆分(pool and spin off)法进行搅拌分配，并且因此可以用旋涂机完成。引物溶液或混合物可以(手动或通过自动化过程)施加到涂覆和抛光的图案化基底上。可以将施加的引物溶液或混合物施加至或扩散在经涂覆和抛光的图案化基底的整个表面上。引物涂覆的图案化基底可以在约0℃至约80℃范围的温度下孵育约2分钟至约60分钟的时间。孵育后，可以使用例如旋涂机稀释并除去引物溶液或混合物。

在一个实例中，在引物接枝至凹陷中的功能化涂层以形成接枝的功能化涂层后，方法100的这个实例进一步包括将水凝胶施加至接枝的功能化涂层上(如附图标记106所示的)。

水凝胶可以是暴露于流动池的用作测序模板过滤器的任何亲水性聚合物。水凝胶的沉积部分地受沉积在流动池上的溶液中的聚合物浓度的控制。水凝胶减慢了测序模板至凹陷中的扩散，因此在另一个测序模板能够通过水凝胶扩散之前，具有允许单个测序模板在凹陷中接种并成簇时间。在测序模板接种期间和在其他测序步骤期间，水凝胶也保留在流动池上，且因此不是水溶性的或在测序过程中在其暴露的液体中不是可去除的。水凝胶的一些实例包括PAZAM (或其如本文中所述的变体)、交联聚丙烯酰胺、琼脂糖凝胶、交联聚乙二醇(PEG)等。水凝胶可以是其他基于丙烯酰胺的共聚物、基于琼脂糖的共聚物或基于PEG的共聚物。应当理解，基于X的共聚物(例如，基于丙烯酰胺、基于琼脂糖、基于PEG等)包括分子量组成的约10％或更多的量的X组分。在一些实例中，基于X的共聚物包括分子量组成的约10％，或分子量组成的约11％，或分子量组成的约12％，或分子量组成的约15％，或分子量组成的约20％，或分子量组成的约39％，或更高百分比的X组分。此外，只要共聚物起到水凝胶的作用，X组分可以高于或低于给定的百分比。交联的PEG水凝胶可通过具有反应性链末端的PEG大分子单体的共价交联来合成，如丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、烯丙基醚、马来酰亚胺、乙烯基砜、NHS酯和乙烯基醚基团。任何一种示例水凝胶可包括疏水性或亲水性侧链。

水凝胶未用引物接枝，而是涂覆引物。

在一些实例中，水凝胶可以选择性地沉积或图案化，使得覆盖表面化学物质(在这个实例中，功能化涂层和其上的引物)，并且使得图案化流动池基底的粘结区保持暴露。图案化流动池基底的粘结区通常位于图案化流动池基底的一些间隙区上，盖子在其中与图案化基底粘结。当图案化基底是晶片时，粘结区可以限定由晶片形成的几个流动池的边界(例如，周边)。当图案化基底是模时，粘结区可以限定形成的一个流动池的外边界(例如，周边)。应当理解图案化流动池基底的其他部分(其不是粘结区的部分)可以被水凝胶覆盖。

在方法100的这个实例中，可以通过溶液孵育、浸渍涂层、旋转涂层、喷雾涂层、超声喷雾涂层、刮刀涂层、气溶胶印刷或喷墨印刷来完成选择性地沉积或图案化水凝胶。可以使用掩膜来覆盖图案化基底的粘结区，使得水凝胶不被施加在粘结区上。水凝胶的选择性沉积可用于将水凝胶沉积在凹陷中的接枝的功能化涂层上，而不沉积在间隙区域上。

在其他实例中，可以在形成功能化涂层后，将盖子粘结于图案化流动池基底的粘结区，并且可以使用流经方法(flow through process) 来施加引物和水凝胶。

用于施加水凝胶的各每种示例技术可利用水性混合物，其可以包括水和多达约0.1％(质量体积比)的水凝胶材料。在一些实例中，水凝胶材料构成水性混合物的0.1％或更少。在其他实例中，水性混合物包含约0.001％至约0.1％的水凝胶材料，或约0.025％至约0.005％的水凝胶材料。应当理解水性混合物的浓度可以根据流动池结构(例如，流动通道、入口和出口的尺寸等)而改变。例如，当利用流经沉积(flow through deposition)时，浓度可以选择为使得水性混合物可以流过流动池而不堵塞接口、流动通道等。因此，浓度也可以高于约0.1％。水凝胶材料(和所得到的水凝胶涂层)可以是本文公开的实例中的任何一种(即，PAZAM或其变型、交联聚丙烯酰胺、琼脂糖凝胶等)。

在一些实例中，水性混合物还可以包括添加剂，如共溶剂、抗氧化剂、染料、紫外光稳定剂、加工助剂等。这些添加剂可以以不会不利地影响混合物的流动性或水凝胶的成膜能力的量包括在水性混合物中。

施加水性混合物后，允许孵育来形成水凝胶。用于溶液孵育的时间和温度可以是足以使水凝胶形成的任何时间和温度。例如，温度范围可以从室温至约65℃，并且时间范围可以从约5分钟至约1 小时，或更长。在一个实例中，溶液孵育在约50℃的温度下进行约10分钟。

在一些情况中，水性混合物可以在水凝胶形成过程中部分地干燥。可以通过空气暴露、氮气暴露、真空、加热(例如，在烤箱中) 或旋转涂层(即，旋转直至干燥)来完成部分干燥。在其中使用加热的实例中，温度可以为约50℃，并且可以将水凝胶在这个温度下维持约10分钟。还可以使用稀缓冲液洗涤水凝胶。

方法200的另一个实例描绘于图2中。该方法200包括将硅烷或硅烷衍生物连接到图案化基底的表面上，所述图案化基底包括在其中具有限定的凹陷的流动通道，其中所述凹陷通过间隙区分隔开，由此形成硅烷化的凹陷和硅烷化的间隙区(附图标记202)，将功能化涂层施加于硅烷化凹陷中和硅烷化间隙区上(附图标记204)；从硅烷化间隙区抛光功能化涂层(附图标记206)；将引物接枝到硅烷化凹陷中的功能化涂层上以形成凹陷中的接枝的功能化涂层(附图标记208)；和在凹陷中的接枝的功能化涂层上施加水凝胶(附图标记210)。将参考图3A至3E，并结合图3H和3I在图3A至3D中进一步描述该方法200的实例。

图3A是图案化基底12的实例的剖视图。图案化基底12可以是图案化晶片或图案化模或任何其他图案化基底(例如，面板、矩形片等)。可以使用本文所述的基底12的任何实例。图案化晶片可以用于形成数个流动池，并且图案化模可以用于形成单个流动池。在一个实例中，基底可以具有约2mm至约300mm范围的直径，或具有高达10英尺(～3米)的最大尺寸的矩形片或面板。在一个实例中，基底晶片具有约200mm至约300mm范围的直径。在另一个实例中，基底模具有约0.1mm至约10mm范围的宽度。尽管已经提供了示例尺寸，应当理解可以使用具有任何合适尺寸的基底。

图案化基底12包括在基底12的暴露层或表面上或其中限定的凹陷14及分隔相邻凹陷14的间隙区16。在本文公开的实例中，凹陷14用表面化学物质(例如，20、22)变成功能化的，而间隙区16 可以用于粘合但不具有在其上存在的引物(图3E-3G和3I中所示的 22)。

可以使用各种技术在基底中或其上制造凹陷14，包括，例如，光刻、纳米压印、冲压技术、压花技术、模塑技术、微蚀刻技术、印刷技术等。如本领域技术人员将理解的，所用的技术将取决于基底12的组成和形状。

可以设想许多不同的凹陷14的布局，包括规则的、重复的和不规则的图案。在一个实例中，凹陷14布置在六边形网格中以紧密堆积并提高密度。其他布局可以包括例如直线(即，矩形)布局、三角形布局等。在一些实例中，布局或图案可以是成行和列的凹陷14的x-y格式。在一些其他实例中，布局或图案可以是凹陷14和/或间隙区16的重复排列。在再其他的实例中，布局或图案可以是凹陷14 和/或间隙区16的随机排列。图案可以包括斑点、垫、孔、柱、条带、漩涡、线条、三角形、矩形、圆形、弧形、棋盘(check)、格子、对角线、箭头、正方形和/或网纹。

布局或图案可以关于限定区域中的凹陷14的密度(即，凹陷14 的数量)来表征。例如，凹陷14可以以大约2百万/mm²的密度存在。可以将该密度调整为不同的密度，包括例如至少约100/mm²，约 1,000/mm²，约10万/mm²，约100万/mm²，约200万/mm²，约500 万/mm²，约1000万/mm²，约5000万/mm²或更大的密度。替代地或附加地，可以将该密度调整为不超过约5000万/mm²，约1000万/mm²，约500万/mm²，约200万/mm²，约100万/mm²，约10万/mm²，约 1,000/mm²，约100/mm²或更小。还应当进一步理解，基底12上凹陷14的密度可以在选自上述范围的下限值之一和上限值之一之间。例如，高密度阵列可以表征为具有通过小于约100nm分隔的凹陷 14，中密度阵列可以表征为具有通过约400nm至约1μm分隔的凹陷14，而低密度阵列可以表征为具有通过大于约1μm分隔的凹陷 14。尽管提供了示例密度，但是应当理解，可以使用具有任何合适密度的基底。

所述布局或图案还可以或者可选地根据平均间距来表征，即从凹陷14的中心到相邻的间隙区16的中心的间距(中心到中心间距)。图案可以是规则的，使得平均间距的变异系数较小，或者图案可以是不规则的，在这种情况下，变异系数可以相对较大。在任一种情况下，平均间距可以为例如至少约10nm，约0.1μm，约0.5μm，约 1μm，约5μm，约10μm，约100μm或更大。替代地或附加地，平均间距可以例如是至多约100μm，约10μm，约5μm，约1μm，约 0.5μm，约0.1μm或更小。部位16的特定图案的平均间距可以在选自上述范围的下限值之一和上限值之一之间。在一个实例中，凹陷 14具有约1.5μm的间距(中心到中心间距)。尽管已经提供了示例平均间距值，但是应当理解，可以使用其他平均间距值。

在图3A至3I所示的实例中，凹陷14是孔14’，并且因此图案化基底12在其表面上包括孔14’的阵列。孔14’可以是微孔或纳米孔。每个孔14’的尺寸可以通过其体积、孔开口面积、深度和/或直径来表征。

每个孔14’可以具有能够限制液体的任何体积。例如，可以选择最小或最大体积以适应流动池下游用途所预期的通量(例如，多重性)、分辨率、分析物组成或分析物反应性。例如，体积可以是至少约1×10^-3μm³，约1×10^-2μm³，约0.1μm³，约1μm³，约10μm³，约100μm³或更大。替代地或另外地，体积可以为至多约1×10⁴μm³，约1×10³μm³，约100μm³，约10μm³，约1μm³，约0.1μm³或更小。应当理解，功能化涂层可以填充孔14’的全部或部分体积。单个孔14’ 中的涂层的体积可以大于、小于上述指定的值或在上述指定值之间。

可以基于与以上针对孔体积所提出的那些相似的标准来选择表面上每个孔开口所占据的面积。例如，表面上每个孔开口的面积可以为至少约1×10^-3μm²，约1×10^-2μm²，约0.1μm²，约1μm²，约10 μm²，约100μm²或更大。替代地或另外地，该面积可以为最大约1×10³μm²，约100μm²，约10μm²，约1μm²，约0.1μm²，约1×10^-2μm²或更小。每个孔开口占据的面积可以大于、小于上述指定的值或在上述指定值之间。

每个孔14’的深度可以是至少约0.1μm，约1μm，约10μm，约 100μm或更大。替代地或附加地，深度可以是至多约1×10³μm，约 100μm，约10μm，约1μm，约0.1μm或更小。每个孔14’的深度可以大于、小于上述指定的值或在上述指定值之间。

在一些情况下，每个孔14’的直径可以是至少约50nm，约0.1 μm，约0.5μm，约1μm，约10μm，约100μm或更大。替代地或另外地，直径可以为至多约1×10³μm，约100μm，约10μm，约1μm，约0.5μm，约0.1μm或更小(例如，约50nm)。每个孔14’的直径可以大于、小于上述指定的值或在上述指定值之间。

可以将图案化基底12暴露于一系列处理，以便在凹陷14中添加表面化学物质20、22。

尽管没有显示，应当理解图案化基底12可以暴露于等离子体灰化，以清洁和激活表面。例如，等离子体灰化过程可以去除有机物质并引入表面羟基基团。可以使用其他合适的清洁工艺来清洁基底 12，这部分地取决于基底12的类型。例如，可以使用氧化剂或苛性碱溶液来进行化学清洁。

随后可以将图案化基底(图3A中所示)暴露于制备基底12而用于沉积功能化聚合物以形成功能化聚合物层20的处理(图3C)。在一个实例中，图案化基底12可以暴露于硅烷化，其将硅烷或硅烷衍生物18(图3B)连接到图案化晶片表面上。硅烷化在整个表面上引入硅烷或硅烷衍生物18，包括在凹陷14、14’中(例如，在底表面上和沿侧壁)以及在间隙区16上。在一些方面中，硅烷或硅烷衍生物仅选择性地引入到图案化基底的凹陷或引入非图案化基底的微位置(micro-location)(其彼此分离)。

可以使用任何硅烷或硅烷衍生物18来完成硅烷化。硅烷或硅烷衍生物18的选择可以部分地取决于待用于形成功能化聚合物层20 的功能化分子(图3C中所示)，因为可能期望在硅烷或硅烷衍生物 18和功能化聚合物层20之间形成共价键。用于将硅烷或硅烷衍生物 18连接于基底12的方法可以根据待使用的硅烷或硅烷衍生物18而改变。在本文中列出了几个实例。

在一个实例中，硅烷或硅烷衍生物18是(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷(APTES)或(3-氨基丙基)三甲氧基硅烷(APTMS)(即， X-R^B-Si(OR^C)₃)，其中X是氨基，R^B-是-(CH₂)₃-，和R^C是乙基或甲基。在这个实例中，基底12表面可以用(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷 (APTES)或(3-氨基丙基)三甲氧基硅烷(APTMS)预处理以将硅共价连接于表面上的一个或多个氧原子(没有打算受限于机理，每个硅可以键合一个、两个或三个氧原子)。将这种化学处理的表面烘烤以形成胺基单层。随后将胺基团与sulfo-HSAB反应以形成叠氮衍生物。在21℃下使用1J/cm²至30J/cm²能量的UV激活产生活性氮烯物质，其可以容易地使用PAZAM(例如，功能化分子)发生各种插入反应。在一些方面中，硅烷或硅烷衍生物选择性地施加于图案化基底的凹陷或非图案化基底上的微位置。

也可以使用其他硅烷化方法。合适的硅烷化方法的实例包括气相沉积、YES方法、旋转涂层或其他沉积方法。本文描述了可以用于将基底12硅烷化的方法和材料的一些实例，尽管将理解可以使用其他方法和材料。

在利用YES CVD炉的实例中，将图案化基底12置于CVD炉中。可以将腔室通气，并随后开始硅烷化循环。在循环过程中，可以将硅烷或硅烷衍生物容器维持在合适的温度下(例如，对于降冰片烯硅烷，约120℃)，可以将硅烷或硅烷衍生物蒸汽管线维持在合适的温度下(例如，对于降冰片烯硅烷，约125℃)，和将真空管线维持在合适的温度下(例如，约145℃)。

在另一个实例中，可以将硅烷或硅烷衍生物18(例如，液体降冰片烯硅烷)沉积在玻璃小瓶内部并与图案化基底12一起放置在玻璃真空干燥器内。随后可以将干燥器排空至约15mTorr至约30 mTorr范围的压力，并放置在温度范围为约60℃至约125℃的炉内部。允许硅烷化进行，并随后从炉中取出干燥器，冷却并在空气中通气。

气相沉积、YES方法和/或真空干燥器可以与各种硅烷或硅烷衍生物18一起使用，如包括本文公开的不饱和部分的实例的那些硅烷或硅烷衍生物18。例如，当硅烷或硅烷衍生物18包括烯烃或环烯烃不饱和部分(如降冰片烯、降冰片烯衍生物(例如，(杂)降冰片烯，包括氧或氮替代碳原子中的一个)、反式环辛烯、反式环辛烯衍生物、反式环戊烯，反式环庚烯、反式环壬烯、双环[3.3.1]壬-1-烯、双环[4.3.1]癸-1(9)-烯、双环[4.2.1]壬-1(8)-烯和双环[4.2.1]壬-1-烯) 时，可以使用这些方法。这些环烯烃中的任何一个可以用例如R基团取代，所述R基团如氢、烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、环炔基、芳基、杂芳基、杂脂环基、芳烷基或(杂脂环基)烷基。降冰片烯衍生物的实例包括[(5-双环[2.2.1]庚-2-烯基)乙基]三甲氧基硅烷。作为其他实例，当硅烷或硅烷衍生物18包括炔烃或环炔烃不饱和部分时，可以使用这些方法，所述炔烃或环炔烃不饱和部分如环辛炔、环辛炔衍生物或双环壬炔(例如，双环[6.1.0]壬-4-炔或其衍生物、双环[6.1.0]壬-2-炔或双环[6.1.0]壬-3-炔)。这些环炔烃可以用本文所述的任一个R基团取代。

如图3B中所示，硅烷或硅烷衍生物18的连接形成硅烷化的图案化基底，包括硅烷化的凹陷和硅烷化的间隙区(其是处理的凹陷和处理的间隙区的一个实例)。

随后可以将硅烷化的图案化晶片暴露于在硅烷化凹陷和硅烷化间隙区上形成功能化聚合物层20的处理。

如本文所述的，功能化聚合物层20的实例包括PAZAM，或任何经功能化以与图案化基底12和随后施加的引物22相互作用的其他分子。功能化分子可以存在于混合物中。在一个实例中，混合物包括在水中或乙醇和水混合物中的PAZAM。可以使用任何合适的技术，在硅烷化的图案化晶片的表面上形成功能化聚合物层20(例如，在硅烷化凹陷和硅烷化间隙区上)。可以使用旋转涂层，或者浸渍或浸渍涂层，或者功能化分子在正压或负压下的流动，或者其他合适的技术，在图案化基底12的表面上沉积功能化分子。所得到的层 20显示于图3C中。

可以通过共价键合将功能化聚合物层20连接于硅烷化凹陷和硅烷化间隙区(即，18)。功能化聚合物层20与硅烷化凹陷的共价连接对于在最终形成的流动池在各种使用过程中的整个寿命期间维持凹陷14、14’中的功能化聚合物层20是有帮助的。以下是在硅烷或硅烷衍生物18与功能化聚合物层20之间可以发生的反应的一些实例。

当硅烷或硅烷衍生物18包括降冰片烯或降冰片烯衍生物作为不饱和部分时，降冰片烯或降冰片烯衍生物可以：i)与PAZAM的叠氮化物/叠氮基团发生1,3-偶极环加成反应；ii)与连接于PAZAM的四嗪基团发生偶联反应；iii)与连接于PAZAM的腙基团发生环加成反应；iv)与连接PAZAM的四唑基团发生光点击反应(photo-click reaction)；或v)与连接于PAZAM的氧化腈基团发生环加成。

当硅烷或硅烷衍生物18包括环辛炔或环辛炔衍生物作为不饱和部分时，环辛炔或环辛炔衍生物可以：i)与PAZAM的叠氮化物/ 叠氮基发生应变促进的叠氮化物-炔1,3-环加成(SPAAC)反应；或 ii)与连接于PAZAM的氧化腈基团发生应变促进的炔-氧化腈环加成反应。

当硅烷或硅烷衍生物18包括双环壬炔作为不饱和部分时，由于双环环系统中的应变，双环壬炔可以与连接于PAZAM的叠氮化物或氧化腈发生相似的SPAAC炔环加成。

尽管没有显示，应当理解在所述方法的一些实例中，图案化基底12可以不暴露于硅烷化。相反，可以将图案化基底12暴露于等离子体灰化，并且随后可以将功能化聚合物层20直接旋转涂覆(或另外地沉积)在等离子体灰化的图案化基底12上。在这个实例中，等离子体灰化可以产生表面活化剂(例如，-OH基团)，其可以将功能化涂层20粘附至图案化基底12上。在这些实例中，选择功能化聚合物层20使是其与通过等离子体灰化产生的表面基团反应。

涂覆后，还可以将功能化分子暴露于固化处理以在整个图案化基底上(即，在凹陷14和间隙区16上)形成功能化聚合物层20。在一个实例中，功能化分子固化可以在室温(例如，约25℃)至约 95℃范围的温度下进行约1毫秒至约几天的时间。在另一个实例中，时间范围可以为10秒至至少24小时。在再另一个实例中，时间范围可以为约5分钟至约2小时。

可以将硅烷化和涂覆的图案化基底(显示于图3C中)暴露于清洁处理。该处理可以利用水浴和超声。水浴可以维持在约22℃至约 45℃范围的相对低温下。在另一个实例中，水浴温度范围为约25℃ 至约30℃。

如果需要，随后将硅烷化和涂覆的图案化基底暴露于抛光以从硅烷化的间隙区除去部分功能化聚合物层20。硅烷化的、涂覆的和抛光的基底显示于图3D中。与间隙区16邻接的硅烷或硅烷衍生物部分可以作为抛光的结果去除或不去除。因此，在图3D至3I中，以虚影示出了与间隙区16邻接的硅烷或硅烷衍生物18的部分，因为它们可以在抛光后至少部分地保留或者可以在抛光后被去除。当这些硅烷化部分被完全去除时，应当理解下面的基底12被暴露。

抛光过程可以用温和化学浆料(包括例如磨料、缓冲剂、螯合剂、表面活性剂和/或分散剂)进行，其可以人间隙区16去除薄的功能化聚合物层20，并且在一些情况中，至少部分的硅烷或硅烷衍生物18，而不会对那些区域的下层基底12产生有害影响。或者，抛光可以用不包括磨料颗粒的溶液进行。

化学浆料可以用于化学机械抛光系统中以抛光图3C中所示的硅烷化和涂覆的图案化基底的表面。抛光头/抛光垫或其他抛光工具能够从间隙区16抛光功能化聚合物层20，同时保留凹陷14、14’中的功能化聚合物层20和保持下层基底12至少基本上完整。作为实例，抛光头可以是Strasbaugh ViPRR II抛光头。

如上所述，可以用抛光垫和没有任何磨料的溶液进行抛光。例如，抛光垫可以与不含磨料颗粒的溶液(即，不包括磨料颗粒的溶液)一起使用。

抛光从间隙区16去除部分的功能化聚合物层20(以及在某些情况下，至少部分的硅烷或硅烷衍生物18)，并且保留硅烷化的凹陷中的部分的功能化聚合物层20，如图3D所示。同样如上所述，间隙区16可在抛光完成后保持硅烷化。换句话说，硅烷化的间隙区可以在抛光后保持完整。或者(如18的虚影部分所示)，作为抛光的结果，硅烷或硅烷衍生物18可以从间隙区16去除。

尽管未示出，但是应当理解，硅烷化的、涂覆的和抛光的图案化基底(如图3D中所示)可以暴露于清洁处理。该处理可以利用水浴和超声。可以将水浴保持在约22℃至约30℃范围的相对低的温度下。还可以将硅烷化的、涂覆的和抛光的图案化基底旋转干燥，或通过其他合适的技术干燥。

然后，可以将图3D中所示的硅烷化的、涂覆的和抛光的图案化基底暴露于图3E至图3G中所示的处理，其产生流动池10，或暴露于图3H至图3I所示的处理，其产生流动池10’。在图3E至3G中，在将盖子26粘结到图案化的流动池基底12之前，将引物22接枝并施加水凝胶24。如图3H和3I中所示，在接枝底物22和施加水凝胶 24之前，将盖子26粘结到图案化的流动池基底12上。

在图3E中，进行接枝处理以将引物22接枝到凹陷14，14’中的功能化聚合物层20上。在这个实例中，可以通过浸泡涂层、喷雾涂层、搅拌分配或通过另一种将引物22连接到至少一些凹陷14，14’ 中的功能化聚合物层20上的合适方法来完成接枝。这些示例技术中的每一种可以利用本文公开的引物溶液或混合物(其可以包括引物、水、缓冲液和催化剂)，并且如本文所述的进行。

如图3F中所示，在将引物22接枝到凹陷14、14’中的功能化涂层20上后，在接枝的功能化涂层20、22以及在至少一部分图案化流动池基底12上形成水凝胶24。在这个实例中，水凝胶24可以形成在图案化基底12的不是粘结区25的部分的暴露表面上。在该实例中，水凝胶24在相邻凹陷14，14’之间的间隙区16上选择性地沉积或图案化，但不在粘结区25所在的图案化基底12的边缘/外周处。如本文中所述的，可使用水性混合物来完成水凝胶24的选择性沉积 /图案化。在水性混合物沉积后，可以将其部分干燥以形成水凝胶24。

如图3G中所示的，盖子26然后可以与粘结区25粘结。当图案化的流动池基底12是晶片时，盖子26的不同区域可以至少部分地限定使用晶片形成的相应流动通道30。当图案化的流动池基底12 是模时，盖子26可以限定所形成的一个或多个流动通道30。

盖子26可以是对激发光透明的任何材料，该激发光指向凹陷14 中的表面化学物质20、22。作为实例，盖子26可以是玻璃(例如，硼硅酸盐、熔融石英等)、塑料等。合适的硼硅酸盐玻璃的可商购实例是可从Schott North America，Inc.获得的D

合适的塑料材料(即环烯烃聚合物)的可商购实例是可从Zeon Chemicals L.P. 获得的

产品。

在一些实例中，盖子26可以与对应于粘结区25的形状，并且与粘结区25粘结的侧壁29一体形成。例如，凹部可以在透明块中蚀刻以形成基本平坦的(例如，顶部)部分27和从基本上平坦的部分27延伸的侧壁29。在将蚀刻的块安装到图案化基底12的粘结区时，凹部可以变成流动通道30。

在其他实例中，侧壁29和盖子26可以是彼此耦合的单独的部件。例如，盖子26可以是基本矩形的块，其具有至少基本平坦的外表面和至少基本平坦的内表面，该内表面限定流动通道30的一部分 (例如，顶部部分)(一旦与图案化基底12粘结)。块可以安装到侧壁29上(例如，与其粘结)，其与图案化流动池基底12的粘结区25粘结并且形成流动通道30的侧壁。在这一实例中，侧壁29可以包括本文所示的用于间隔层(在下面描述)的任何材料。

盖子26可以使用任何合适的技术与图案化流动池基底12的粘结区25粘结，如激光接合、扩散粘结、阳极接合、共晶接合、等离子体活化接合、玻璃熔块接合或本领域已知的其他方法。在一个实例中，间隔层28可以用于将盖子26与粘结区25粘结。间隔层28 可以是将图案化基底12的至少一部分间隙区16(例如，粘结区25) 和盖子26密封在一起的任何材料。

在一个实例中，间隔层28可以是吸收由盖子26和/或图案化基底12透射的波长的辐射的辐射吸收材料。吸收的能量转而在间隔层 28和盖子26之间以及在间隔层28和图案化基底12之间形成粘结。这种辐射吸收材料的实例是来自DuPont(USA)的黑色

(含炭黑的聚酰亚胺)，其在约1064nm处吸收。应当理解，可以使用聚酰亚胺而不添加炭黑，除了必须将波长改变为被天然聚酰亚胺材料显著吸收的波长(例如480nm)外。作为另一个实例，聚酰亚胺CEN JP可以在用532nm的光照射时粘结。当间隔层28是辐射吸收材料时，间隔层28可以位于盖子26和图案化基底12之间的界面处，使得间隔层28接触期望的粘结区25。可以施加压缩(例如，大约100PSI的压力)，而同时将适当波长的激光能量施加到界面上 (即，照射辐射吸收材料)。激光能量可以从顶部和从底部施加到界面上以实现合适的粘结。

在另一个实例中，间隔层28可以包括与其接触的辐射吸收材料。可以在间隔层28和盖子26之间的界面处以及间隔层28和图案化流动池基底12之间的界面处施加辐射吸收材料。作为实例，间隔层28 可以是聚酰亚胺，并且单独的辐射吸收材料可以是炭黑。在该实例中，单独的辐射吸收材料吸收在间隔层28和盖子26之间以及在间隔层28和图案化基底12之间形成粘结的激光能量。在这个实例中，可以在相应的界面处施加压迫，同时将适当波长的激光能量施加到界面上(即，照射辐射吸收材料)。

当图案化流动基底12是晶片时，间隔层28和(盖子26的或与盖子26连接的)侧壁29可以将一个流动通道30与相邻的流动通道 30物理地分隔开，并且可以位于晶片的外周处。当图案化基底12 是模并且形成的流动池10包括单个流动通道30或泳道时，间隔层 28和(盖子26的或与盖子26连接的)侧壁29可以位于模的外周处以限定流动通道30并密封流动池10。当图案化基底12是模且形成的流动池10包括多个分离的流动通道30(例如，八个或四个流动通道/泳道)时，间隔层28和(盖子26的或连接盖子26的)侧壁29 可以将一个流动通道/泳道30与相邻的流动通道/泳道30物理地分隔开，并且可以位于模的外周处。然而，应当理解，根据实施方式，间隔层28和侧壁29可以位于任何期望的区域中。

当图案化基底12是模时，组装流动池10可以包括盖子26的粘结。当图案化基底是晶片时，组装流动池10可以包括盖子26粘结后的其他处理，如切割。在一个实例中，盖子26可以粘结于图案化晶片12，并且切割形成单个流动池10。如本文中所提及的，在晶片上，侧壁29可以将一个流动通道30与相邻的流动通道30物理地分隔开，并且因此切割可通过至少一些侧壁29进行，使得各单个流动池10包括期望数量的流动通道30，每个流动通道具有围绕其周边的原始侧壁29的一部分。在另一个实例中，可以将图案化晶片切割以形成未加盖的模，其可以具有与其粘结的相应的盖子26以形成单个流动池10。

在图3G中所示的实例中，盖子26包括与侧壁29一体形成的顶部部分27。侧壁29通过间隔层28与图案化基底12的粘结区25粘结。

总之，盖子26和图案化流动池基底12限定流动通道30，其与凹陷14、14’选择性地流体连通。流动通道30可用于例如选择性地将反应组分或反应物引入到水凝胶24和下面的表面化学物质20、 22，以便在凹陷14、14'中/处引发指定的反应。

流动池10的实例显示于图3G中。

现在参考图3H和3I，方法200的另一个实例包括在接枝引物 22和施加水凝胶24之前，将盖子26粘结于图案化流动池基底12。

如图3H中所示的，已经如图3D中并且参考图1所述的施加功能化涂层(例如，沉积和抛光的)。至少一些抛光的间隙区16可以限定粘结区25，并且盖子26可以粘结于粘结区25。盖子26可以是任一材料，并且可以具有本文所述的任一构造。盖子26可以通过本文所述的任一技术粘结于粘结区25。

在图3H中所示的实例中，盖子26包括与侧壁29一体形成的顶部部分27。侧壁29通过间隔层28粘结于图案化基底12的粘结区 25。在盖子26粘结后，在盖子26和图案化基底12之间形成流动通道30。流动通道30可以用于选择性地将各种流体引入到流动池10’ (图3I)。

在方法200的这个实例中，随后将引物22接枝到凹陷14中的功能化涂层20上，如图3I中所示。可以使用本文所述的任一引物。在这个实例中，可以通过流经方法来完成接枝。在所述流经方法中，可以将本文所述的引物溶液或混合物通过相应的入口(未显示)引入流动通道30中，可以在流动通道30中维持足够的时间(即，孵育时间)用于引物22连接于一个或多个凹陷14中的功能化涂层20，并且随后可以从相应的出口(未显示)移除。引物22连接后，可以将其他的流体指引通过流动通道30以洗涤现功能化的凹陷和流动通道30。

在引物22接枝到凹陷14中的功能化涂层20上后，方法200的这个实例进一步包括在接枝的功能化涂层20、22上以及在至少一些间隙区16(例如，凹陷14之间的那些区域16)上形成水凝胶。

在这个实例中，可以通过流经过程来沉积水凝胶涂层14。在流经过程中，可以将水性混合物(包括水和水凝胶材料)通过相应的入口引入流动池的流动通道30中，并且可以维持在流动通道30中。可以引入足够的水性混合物以覆盖接枝的功能化涂层20、22和流动通道30内图案化流动池基底12的任何暴露表面。这种溶液孵育形成水凝胶涂层24。在一些实例中，尽管混合物在流动通道30中，可以将流动通道30暴露于干燥过程，其中空气、氮气或真空通过入口冲洗设定的时间量以部分表面化学物质20、22和干燥基底12的任何暴露部分(例如，一些间隙区16)上的水凝胶涂层24。在这个实例中，水凝胶涂层24可以是本文公开的任何实例。

通过本文公开的方法100、200形成的流动池10”的实例显示于图4中。流动池10”包括图案化基底12，其可以是已经暴露于方法 100、200的处理的模，或已经暴露于方法100、200的处理并且切割的晶片。

通常，图案化基底12包括被间隙区16分隔开的凹陷14和位于凹陷14中的表面化学物质20，22。表面化学物质包括功能化涂层 20和引物22。尽管未显示，应当理解凹陷14还可以具有位于基底 12和功能化涂层20之间的表面制备或处理化学物质(例如，硅烷或硅烷衍生物)。这种相同的表面制备或处理化学物质也可以位于间隙区16上。

流动池10”还包括粘结于图案化基底12的粘结区25的盖子26，其中盖子26至少部分地限定与凹陷14选择性连通的流动通道30A、 30B等。在图4中所示的实例中，盖子26包括连接至多个侧壁29 的顶部部分27，并且这些部件27、29限定了六个流动通道30A、30B、30C、30D、30E、30F中每一个的一部分。相应侧壁29将一个流动通道30A、30B、30C、30D、30E、30F与各个相邻的流动通道30A、 30B、30C、30D、30E、30F分离，每个流动通道30A、30B、30C、30D、30E、30F与相应的凹陷14组选择性地流体连通。

尽管未示出，但盖子26或图案化基底12可包括入口和出口，其与用于将流体引导到相应的流动通道30A、30B、30C、30D、30E、 30F中(例如，从试剂料盒或其他流体存储系统)和引出流动通道(例如，至废料骈除系统)的其他端口(未示出)流体接合。

水凝胶/水凝胶涂层24覆盖凹陷14中的表面化学物质20、22，以及图案化基底12的至少一部分(例如，也不是粘结区25的那些间隙区16)。在示例流动池10”中，水凝胶/水凝胶涂层24如本文所述形成。因此，水凝胶/水凝胶涂层24可以是本文公开的任何实例(即，PAZAM、交联聚丙烯酰胺、琼脂糖凝胶等)。

尽管未示出，但应当理解，流动池10、10'、10”的一些实例可以通过一个或多个固定机制(例如，粘合、键合、固定件等)直接固定于检测装置(未示出)，并因此与之物理接触。检测装置可以包括CMOS装置(其包括多个堆叠的层，包括例如硅层、电介质层、金属-电介质层、金属层等)和光学部件。光学部件可以被布置以使得检测装置的光学传感器至少基本上与检测装置的单个光波导及单个凹陷14、14'内或流动池的流动通道30内的表面化学物质20、22 对准，并因此操作关联。

同样尽管未示出，但是应当理解，与粘结于盖子26相反，可以将功能化基底(其上具有表面化学物质20、22和水凝胶/水凝胶涂层 24)粘结至其上具有表面化学物质20、22和水凝胶/水凝胶涂层24 的另一功能化基底。两个功能化表面可以彼此面对，并且可以具有在它们之间限定的流动通道。间隔层和合适的粘结方法可以用于将两个功能化基底粘结在一起。

本文公开的流动池10、10'、10”可以用于多种测序方法或技术中，包括通常被称为合成测序(SBS)、循环阵列测序、连接测序、焦磷酸测序等的技术。利用这些技术的任一种和在使用图案化基底的实例中，由于功能化聚合物层20和连接的测序引物22存在于功能化凹陷(即，其上具有表面化学物质20、22的凹陷14、14')中而没有在间隙区16上，扩增将局限于功能化凹陷。此外，由于水凝胶24 的存在，有更多的时间(与不包括水凝胶时相比)将一个测序模板扩增成较大的簇，这增加了整个图案化流动池基底12上接种单个测序模板的凹陷14的群体。

作为一个实例，可以在诸如来自Illumina，Inc.(San Diego，CA) 的HISEQTM、HISEQXTM、MISEQTM、NOVASEQTM或NEXTSEQTM 测序仪系统等的系统上进行合成测序(SBS)反应。在SBS中，监测核酸引物(例如引物22)沿核酸模板(即，测序模板)的延伸以确定模板中的核苷酸序列。基础的化学过程可以是聚合(例如，通过聚合酶催化的)或连接(例如，通过连接酶催化的)。在特定的基于聚合酶的SBS方法中，荧光标记的核苷酸以模板依赖的方式添加到引物22(从而延伸引物22)，使得可以将添加到引物22的核苷酸的顺序和类型的检测用于确定模板的序列。例如，为了启动第一SBS循环，可以将一个或多个标记的核苷酸、DNA聚合酶等递送到容纳涂覆有水凝胶24的引物22阵列的流动通道30中或通过流动通道30等。可以通过成像事件来检测其中引物延伸导致标记的核苷酸掺入的功能化凹陷(即，其上具有表面化学物质20、22的凹陷14、 14')。在成像事件期间，照明系统(未示出)可以将激发光提供给功能化凹陷(即，其上具有化学表面物质20、22的凹陷14、14′)。

在一些实例中，核苷酸可进一步包括可逆终止性质，一旦核苷酸添加到引物22上，该可逆终止性质终止进一步的引物延伸。例如，可将具有可逆终止子部分的核苷酸类似物添加至引物22，使得随后的延伸不可发生，直至递送解封闭剂以除去该部分。因此，对于使用可逆终止的实例，可以将解封闭剂递送至流动通道30等(在进行检测之前或之后)。

洗涤可以在各个流体输送步骤之间进行。然后可以重复SBS循环n次以将引物22延伸n个核苷酸，从而检测长度n的序列。

尽管已经详细描述了SBS，应当理解本文所述的流动池10、10’、 10”可以与其他测序实验方案一起使用，用于分型或用于其他化学和 /或生物学应用中。

为了进一步说明本发明，本文给出了实施例。应当理解提供这些实施例为了说明性目的并且不应解释为限制本公开的范围。

非限制性工作实施例

实施例1

使用包括在图案化熔融石英基底上限定的8个流动通道/泳道的流动池，其中每个泳道包括96个区块(其对应于成像区域)，并且其中每个区块与多个孔流体连通。PAZAM层在每个孔中形成，并且在PAZAM层上接枝1μm引物。

泳道1-4，并且因此区块1至384，是比较例泳道和区块。因此，在这些泳道和区块中，水凝胶层不施加在PAZAM层或引物上。

泳道5-8，并且因此区块385-768，是示例泳道和区块。因此，在这些泳道和区块中的PAZAM层和引物上施加水凝胶层。水凝胶涂层是通过流经方法施加的另一个PAZAM层。将水中0.025％ PAZAM溶液引入泳道5-8中，并加热至60℃，并且在该温度下维持约10分钟。

用稀释缓冲液洗涤所有泳道。

在泳道1-8每一个中进行测序循环。使用了具有150pM浓度的 Phi X测序模板溶液。

图5显示了通过过滤器的簇的百分比(％通过过滤器(％PF)) 和被DNA测序模板占据的孔的百分比(％占据)。％通过过滤器 (％PF)是用于描述通过纯洁(chastity)阈值的簇的度量标准，并用于测序数据的进一步处理和分析。较高的％通过过滤器导致用于测序数据的独特簇的提高的产量。

图5中的数据表明使用水凝胶时，％通过过滤器提高(提高约 5％至约10％)(将区块1至384的数据(无水凝胶)与区块385至 768(具有水凝胶)的数据进行比较)。

％占据和％通过过滤器之间的差异是多克隆簇的粗略估计。示例区块385至768的％占据和％PF区块之间的差异远小于比较区块1 到384的％占据和％PF区块之间的差异，这表明PAZAM水凝胶涂覆的区块/泳道与比较的未涂覆的区块/泳道相比，具有少得多的多克隆簇。

总的来说，图5中的数据表明水凝胶涂层的存在有助于改善单克隆簇和多克隆簇的孔中主要成分/簇的纯度，这也将提高测序产率和数据质量。

实施例2

使用两个流动池，其各自包括在图案化熔融石英基底上限定的8 个流动通道/泳道，其中每条泳道包括96个区块(和成像区域)，并且其中每个区块与多个孔流体连通。在每个孔中形成PAZAM层，并且在PAZAM层上接枝1μm引物。

在比较流动池中，没有在任何泳道和区块中的PAZAM层或引物上施加水凝胶涂层。

在实例流动池中，在每个泳道和区块中的PAZAM层上和引物上施加水凝胶涂层。水凝胶涂层是通过流经方法施加的另一个 PAZAM层。将水中PAZAM的混合物/溶液引入到实例流动池的泳道1-8，加热至60℃，并在该温度下维持约10分钟。

用稀缓冲液洗涤比较流动池和实例流动池中的所有泳道。

在每个比较流动池和实例流动池的泳道1-8的每个中进行测序循环。在阅读1中测序151个循环，而在阅读2中测序另151个循环。测序度量从区块中心得出以消除边缘效应。在每个泳道中使用具有从100pM到800pM范围的不同浓度的不同测序模板溶液。更具体地说，每个比较和实例流动池的泳道1暴露于100pM测序模板溶液；每个比较和实例流动池的泳道2暴露于200pM测序模板溶液；每个比较和实例流动池的泳道3暴露于300pM测序模板溶液；每个比较和实例流动池的泳道4暴露于400pM测序模板溶液；每个比较和实例流动池的泳道5暴露于500pM测序模板溶液；每个比较和实例流动池的泳道6暴露于600pM测序模板溶液；每个比较和实例流动池的泳道7暴露于700pM测序模板溶液；且每个比较和实例流动池的泳道8暴露于800pM测序模板溶液。

图6显示了比较例和实例流动池的不同泳道的通过过滤器的簇的百分比(％通过过滤器(％PF))。如显示的，与具有水凝胶的比较流动池泳道相比，％PF在较宽浓度范围上对于包括水凝胶的实例流动池泳道更一致。

根据阅读是否与精确的相同基因组位置对齐，从实例流动池泳道和比较流流动池泳道中以生物信息学方式去除重复模板。重复去除后的净％PF如图7中所示。总的来说，使用浓度范围为300pM至800pM的测序模板，与比较流动池相比时，使用水凝胶涂覆的流动池可以获得更高的产量(从约2％到约17％的产率增加)。

对于比较流动池，重复去除后的最大％PF在暴露于300pM测序模板溶液的泳道中为76.13％。对于实例流动池，重复去除后的最大％PF在暴露于600pM测序模板溶液的泳道中为83.42％。这说明单克隆簇9.6％的增加。

图8A和8B说明了在150个测序循环后，比较例流动池和实例流动池的阅读1和阅读2错配率(MMR)。在比较和实例流动池上相似的错配率表明水凝胶涂层没有不利地影响测序操作。

其他说明

应当理解，前述概念和以下更详细讨论的其他概念的所有组合 (假设这样的概念不相互矛盾)被认为是本文公开的发明主题的部分。特别地，出现在本公开结尾处的要求保护的主题的所有组合被认为是本文公开的发明主题的部分。还应理解，本文明确采用的、也可能出现在通过引用并入的任何公开中的术语应被赋予与本文公开的特定概念最一致的含义。

在整个说明书中对“一个实例”、“另一个实例”、“实例” 等的引用表示结合该实例描述的特定元件(例如，特征、结构和/或特性)包括在本文所述的至少一个实例中，并且可以存在或不存在于其他实例中。另外，应该理解的是，除非上下文另外明确指出，否则在任何实例中，可以以任何合适的方式将用于任何实例的所述元件组合在一起。

应当理解，本文提供的范围包括所述范围以及在所述范围内的任何值或子范围。例如，从1到50,000的范围应解释为不仅包括从 1到50,000的明确列举的限值，还应包括单个值，如约708、约945、约3500等，以及子范围，例如，从约825至约29,000、从约95到约40,000等。此外，当使用“约”和/或“基本上”来描述一个值时，它们旨在包含从所述值的较小的变化(最高+/-10％)。

尽管已经详细描述了几个实例，但是应当理解，可以修改所公开的实例。因此，前述描述应被认为是非限制性的。

Claims

1.一种流动池，其包括

包括由间隙区分隔开的凹陷的图案化基底；

附接于每个所述凹陷的测序表面化学物质，所述测序表面化学物质包括：

功能化涂层；和

接枝到功能化涂层的引物；和

至少所述测序表面化学物质上的水凝胶。

2.权利要求1中限定的流动池，其中所述水凝胶还在至少一些所述间隙区上。

3.权利要求1或2中限定的流动池，其中所述功能化涂层是聚(N-5-叠氮基乙酰胺基戊基)丙烯酰胺-共-丙烯酰胺)。

4.权利要求1至3任一项中限定的流动池，其中所述水凝胶选自聚(N-5-叠氮基乙酰胺基戊基)丙烯酰胺-共-丙烯酰胺)、交联聚丙烯酰胺、琼脂糖凝胶和交联聚乙二醇。

5.权利要求1至4任一项中限定的流动池，其中所述水凝胶是非接枝的。

6.权利要求1至5任一项中限定的流动池，其中：

所述图案化基底包括至少一个流动通道；

所述凹陷在所述至少一个流动通道中形成；和

所述流动池进一步包括附接于所述图案化基底的其他间隙区的间隔层，使得所述间隔层限定所述至少一个流动通道的外周。

7.权利要求6中限定的流动池，进一步包括附接于所述间隔层的盖子。

8.一种方法，其包括：

在图案化流动池基底的凹陷中施加功能化涂层，其中所述凹陷由间隙区分隔开；

将引物接枝于所述功能化涂层以在所述凹陷中形成接枝的功能化涂层；和

在至少所述接枝的功能化涂层上施加水凝胶。

9.权利要求8中限定的方法，其中所述水凝胶选自聚(N-5-叠氮基乙酰胺基戊基)丙烯酰胺-共-丙烯酰胺)、交联聚丙烯酰胺、琼脂糖凝胶和交联聚乙二醇。

10.权利要求8或9中限定的方法，其中所述水凝胶布置在所述接枝的功能化涂层上和一些所述间隙区上。

11.权利要求8至10任一项中限定的方法，其中在施加所述功能化涂层之前，所述方法还包括处理所述图案化流动池基底的表面以将官能团连接于所述表面，从而形成处理的凹陷和处理的间隙区。

12.权利要求11中限定的方法，其中在所述凹陷中施加所述功能化涂层包括：

在所述处理的凹陷中和所述处理的间隙区上施加所述功能化涂层；和

从所述处理的间隙区抛光所述功能化涂层。

13.权利要求8至12任一项中限定的方法，其中施加所述水凝胶包括施加包含约0.001％至高达约0.1％(质量体积比)的水凝胶材料的水性混合物。

14.权利要求8至13任一项中限定的方法，其中所述图案化流动池基底的外周具有与其粘结的间隔层，和其中在所述水凝胶施加后，所述方法进一步包括将盖子粘结到所述间隔层上。

15.权利要求8至14任一项中限定的方法，其中在施加所述功能化涂层后且在接枝所述引物前，所述方法进一步包括将盖子粘结于至少一些所述间隙区。

16.权利要求8、9和11-15任一项中限定的方法，其中施加所述水凝胶包括选择性地将所述水凝胶沉积在所述接枝的功能化涂层上。

17.一种方法，包括：

将硅烷或硅烷衍生物连接到所述图案化基底的表面上，所述图案化基底包括在其中具有限定的凹陷的流动通道，其中所述凹陷由间隙区分隔开，由此形成硅烷化的凹陷和硅烷化的间隙区；

在所述硅烷化的凹陷中和所述硅烷化的间隙区上施加功能化涂层；

从所述硅烷化的间隙区抛光所述功能化涂层；

将引物接枝到所述硅烷化凹陷中的所述功能化涂层上以在所述凹陷中形成接枝的功能化涂层；和

施加水凝胶在所述凹陷中的所述接枝的功能化涂层上。

18.权利要求17中限定的方法，其中施加所述水凝胶包括施加包含约0.001％至高达约0.1％(质量体积比)的水凝胶材料的水性混合物。

19.权利要求17或18中限定的方法，其中所述水凝胶材料选自聚(N-5-叠氮基乙酰胺基戊基)丙烯酰胺-共-丙烯酰胺)、交联聚丙烯酰胺、琼脂糖凝胶和交联聚乙二醇。

20.权利要求17至19任一项中限定的方法，其中：

间隔层粘结于所述图案化基底并限定所述流动通道的周边；和

在施加所述水凝胶后，所述方法进一步包括将盖子粘结于到所述间隔层。

21.权利要求17至20任一项中限定的方法，其中在抛光所述功能化涂层后且在接枝所述引物前，所述方法进一步包括将盖子粘结到至少一些所述间隙区上。

22.权利要求17至21任一项中限定的方法，其中施加所述水凝胶包括选择性地沉积所述水凝胶在所述凹陷中的所述接枝的功能化涂层上。