RU2754667C2 - Способ микроразбавления в жидкой среде для оценки и определения минимальной ингибирующей концентрации антибактериальных полипептидов - Google Patents
Способ микроразбавления в жидкой среде для оценки и определения минимальной ингибирующей концентрации антибактериальных полипептидов Download PDFInfo
- Publication number
- RU2754667C2 RU2754667C2 RU2018135238A RU2018135238A RU2754667C2 RU 2754667 C2 RU2754667 C2 RU 2754667C2 RU 2018135238 A RU2018135238 A RU 2018135238A RU 2018135238 A RU2018135238 A RU 2018135238A RU 2754667 C2 RU2754667 C2 RU 2754667C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- liquid medium
- serum
- lytic
- bacteria
- polypeptide
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 103
- 239000007788 liquid Substances 0.000 title claims abstract description 77
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 title claims abstract description 7
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims description 124
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title claims description 114
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 title claims description 107
- 238000010790 dilution Methods 0.000 title description 12
- 239000012895 dilution Substances 0.000 title description 12
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 title description 7
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims abstract description 128
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 claims abstract description 67
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 claims abstract description 50
- 241000192125 Firmicutes Species 0.000 claims abstract description 25
- 239000003910 polypeptide antibiotic agent Substances 0.000 claims abstract description 19
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims abstract description 18
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 claims abstract description 15
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 claims abstract description 7
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 69
- 241000283073 Equus caballus Species 0.000 claims description 60
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical group SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 claims description 51
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 21
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 claims description 17
- PBVAJRFEEOIAGW-UHFFFAOYSA-N 3-[bis(2-carboxyethyl)phosphanyl]propanoic acid;hydrochloride Chemical compound Cl.OC(=O)CCP(CCC(O)=O)CCC(O)=O PBVAJRFEEOIAGW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 13
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 claims description 12
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 claims description 9
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 claims description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 49
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 abstract description 22
- 238000012546 transfer Methods 0.000 abstract description 9
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 8
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 7
- 238000002815 broth microdilution Methods 0.000 abstract description 5
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 95
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 85
- 235000018977 lysine Nutrition 0.000 description 74
- 230000002101 lytic effect Effects 0.000 description 73
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 66
- 101000925662 Enterobacteria phage PRD1 Endolysin Proteins 0.000 description 49
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 49
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 49
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 49
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 34
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 30
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 27
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 27
- 239000005862 Whey Substances 0.000 description 26
- 102000007544 Whey Proteins Human genes 0.000 description 26
- 108010046377 Whey Proteins Proteins 0.000 description 26
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 26
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 26
- 241000191967 Staphylococcus aureus Species 0.000 description 24
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 24
- 241000191940 Staphylococcus Species 0.000 description 23
- 241000194017 Streptococcus Species 0.000 description 23
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 21
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 20
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 20
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 19
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 18
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 17
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 17
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 17
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 15
- -1 for example Substances 0.000 description 14
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 description 14
- 241000186781 Listeria Species 0.000 description 13
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 13
- 108010059993 Vancomycin Proteins 0.000 description 13
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 13
- 229960003165 vancomycin Drugs 0.000 description 13
- MYPYJXKWCTUITO-LYRMYLQWSA-N vancomycin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=C2C=C3C=C1OC1=CC=C(C=C1Cl)[C@@H](O)[C@H](C(N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@H]3C(=O)N[C@H]1C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](C3=CC(O)=CC(O)=C3C=3C(O)=CC=C1C=3)C(O)=O)=O)[C@H](O)C1=CC=C(C(=C1)Cl)O2)=O)NC(=O)[C@@H](CC(C)C)NC)[C@H]1C[C@](C)(N)[C@H](O)[C@H](C)O1 MYPYJXKWCTUITO-LYRMYLQWSA-N 0.000 description 13
- MYPYJXKWCTUITO-UHFFFAOYSA-N vancomycin Natural products O1C(C(=C2)Cl)=CC=C2C(O)C(C(NC(C2=CC(O)=CC(O)=C2C=2C(O)=CC=C3C=2)C(O)=O)=O)NC(=O)C3NC(=O)C2NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(CC(C)C)NC)C(O)C(C=C3Cl)=CC=C3OC3=CC2=CC1=C3OC1OC(CO)C(O)C(O)C1OC1CC(C)(N)C(O)C(C)O1 MYPYJXKWCTUITO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- 241000194033 Enterococcus Species 0.000 description 12
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 12
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 11
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 11
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 11
- 150000002669 lysines Chemical class 0.000 description 11
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 11
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 11
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 11
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 10
- 241000894007 species Species 0.000 description 10
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 10
- UNXHWFMMPAWVPI-UHFFFAOYSA-N Erythritol Natural products OCC(O)C(O)CO UNXHWFMMPAWVPI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 241000194021 Streptococcus suis Species 0.000 description 9
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 9
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 9
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 9
- MSFSPUZXLOGKHJ-UHFFFAOYSA-N Muraminsaeure Natural products OC(=O)C(C)OC1C(N)C(O)OC(CO)C1O MSFSPUZXLOGKHJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 108010013639 Peptidoglycan Proteins 0.000 description 7
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 7
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 7
- 229960005484 daptomycin Drugs 0.000 description 7
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 7
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 7
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 7
- 108010013198 Daptomycin Proteins 0.000 description 6
- 241000194032 Enterococcus faecalis Species 0.000 description 6
- 241000943303 Enterococcus faecalis ATCC 29212 Species 0.000 description 6
- DOAKLVKFURWEDJ-QCMAZARJSA-N daptomycin Chemical compound C([C@H]1C(=O)O[C@H](C)[C@@H](C(NCC(=O)N[C@@H](CCCN)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@H](CO)C(=O)N[C@H](C(=O)N1)[C@H](C)CC(O)=O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)CCCCCCCCC)C(=O)C1=CC=CC=C1N DOAKLVKFURWEDJ-QCMAZARJSA-N 0.000 description 6
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 6
- 238000011160 research Methods 0.000 description 6
- 238000010206 sensitivity analysis Methods 0.000 description 6
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 6
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 6
- RJQXTJLFIWVMTO-TYNCELHUSA-N Methicillin Chemical compound COC1=CC=CC(OC)=C1C(=O)N[C@@H]1C(=O)N2[C@@H](C(O)=O)C(C)(C)S[C@@H]21 RJQXTJLFIWVMTO-TYNCELHUSA-N 0.000 description 5
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 5
- 241000193998 Streptococcus pneumoniae Species 0.000 description 5
- 239000004599 antimicrobial Substances 0.000 description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 5
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 5
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 description 5
- 229960003085 meticillin Drugs 0.000 description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 5
- 230000008569 process Effects 0.000 description 5
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 5
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 4
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 4
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 4
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 4
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 4
- 241000193996 Streptococcus pyogenes Species 0.000 description 4
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 4
- 230000000845 anti-microbial effect Effects 0.000 description 4
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 4
- 238000011161 development Methods 0.000 description 4
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 4
- 229940032049 enterococcus faecalis Drugs 0.000 description 4
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 4
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 4
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 4
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 4
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 4
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 4
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 4
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 4
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 4
- 229940031000 streptococcus pneumoniae Drugs 0.000 description 4
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108700023418 Amidases Proteins 0.000 description 3
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 3
- 208000035143 Bacterial infection Diseases 0.000 description 3
- 241000193403 Clostridium Species 0.000 description 3
- 241000186216 Corynebacterium Species 0.000 description 3
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 3
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 3
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 3
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 3
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 3
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 3
- 240000005578 Rivina humilis Species 0.000 description 3
- 241000191963 Staphylococcus epidermidis Species 0.000 description 3
- 241000194048 Streptococcus equi Species 0.000 description 3
- 102000005922 amidase Human genes 0.000 description 3
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 3
- 208000022362 bacterial infectious disease Diseases 0.000 description 3
- 230000001420 bacteriolytic effect Effects 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 3
- 229960001231 choline Drugs 0.000 description 3
- OEYIOHPDSNJKLS-UHFFFAOYSA-N choline Chemical compound C[N+](C)(C)CCO OEYIOHPDSNJKLS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 3
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 3
- TYZROVQLWOKYKF-ZDUSSCGKSA-N linezolid Chemical compound O=C1O[C@@H](CNC(=O)C)CN1C(C=C1F)=CC=C1N1CCOCC1 TYZROVQLWOKYKF-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 3
- 229960003907 linezolid Drugs 0.000 description 3
- 244000005706 microflora Species 0.000 description 3
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 3
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 3
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 3
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 3
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 3
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 3
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 3
- 238000003239 susceptibility assay Methods 0.000 description 3
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 2
- 241000193738 Bacillus anthracis Species 0.000 description 2
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- QNAYBMKLOCPYGJ-UWTATZPHSA-N D-alanine Chemical compound C[C@@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-UWTATZPHSA-N 0.000 description 2
- QNAYBMKLOCPYGJ-UHFFFAOYSA-N D-alpha-Ala Natural products CC([NH3+])C([O-])=O QNAYBMKLOCPYGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010059378 Endopeptidases Proteins 0.000 description 2
- 102000005593 Endopeptidases Human genes 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- 108090000988 Lysostaphin Proteins 0.000 description 2
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 2
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 2
- 241000186359 Mycobacterium Species 0.000 description 2
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 2
- 206010034133 Pathogen resistance Diseases 0.000 description 2
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 description 2
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 2
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 2
- 241000201788 Staphylococcus aureus subsp. aureus Species 0.000 description 2
- 241000193985 Streptococcus agalactiae Species 0.000 description 2
- 241001505901 Streptococcus sp. 'group A' Species 0.000 description 2
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 2
- 239000012080 ambient air Substances 0.000 description 2
- 230000003385 bacteriostatic effect Effects 0.000 description 2
- 239000006161 blood agar Substances 0.000 description 2
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 2
- 239000002283 diesel fuel Substances 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 2
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 2
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 2
- 230000005714 functional activity Effects 0.000 description 2
- 244000000059 gram-positive pathogen Species 0.000 description 2
- 244000144980 herd Species 0.000 description 2
- 235000014304 histidine Nutrition 0.000 description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000000099 in vitro assay Methods 0.000 description 2
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 2
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 2
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 2
- 201000004792 malaria Diseases 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 2
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 2
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 2
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 2
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 2
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 2
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 2
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- 229940030998 streptococcus agalactiae Drugs 0.000 description 2
- 238000010189 synthetic method Methods 0.000 description 2
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N α-D-glucopyranosyl-α-D-glucopyranoside Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(O)C(O)C(O)C(CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WHTVZRBIWZFKQO-AWEZNQCLSA-N (S)-chloroquine Chemical compound ClC1=CC=C2C(N[C@@H](C)CCCN(CC)CC)=CC=NC2=C1 WHTVZRBIWZFKQO-AWEZNQCLSA-N 0.000 description 1
- OOSZCNKVJAVHJI-UHFFFAOYSA-N 1-[(4-fluorophenyl)methyl]piperazine Chemical group C1=CC(F)=CC=C1CN1CCNCC1 OOSZCNKVJAVHJI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GHCZTIFQWKKGSB-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxypropane-1,2,3-tricarboxylic acid;phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O.OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O GHCZTIFQWKKGSB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- 241000588626 Acinetobacter baumannii Species 0.000 description 1
- 241000186046 Actinomyces Species 0.000 description 1
- 206010067484 Adverse reaction Diseases 0.000 description 1
- 108090000531 Amidohydrolases Proteins 0.000 description 1
- 102000004092 Amidohydrolases Human genes 0.000 description 1
- 102000004400 Aminopeptidases Human genes 0.000 description 1
- 108090000915 Aminopeptidases Proteins 0.000 description 1
- 108700042778 Antimicrobial Peptides Proteins 0.000 description 1
- 102000044503 Antimicrobial Peptides Human genes 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- 208000031729 Bacteremia Diseases 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 208000003508 Botulism Diseases 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 206010009657 Clostridium difficile colitis Diseases 0.000 description 1
- 208000003322 Coinfection Diseases 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N D-mannopyranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N 0.000 description 1
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 239000004375 Dextrin Substances 0.000 description 1
- 229920001353 Dextrin Polymers 0.000 description 1
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZGTMUACCHSMWAC-UHFFFAOYSA-L EDTA disodium salt (anhydrous) Chemical compound [Na+].[Na+].OC(=O)CN(CC([O-])=O)CCN(CC(O)=O)CC([O-])=O ZGTMUACCHSMWAC-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 241000194031 Enterococcus faecium Species 0.000 description 1
- 201000000628 Gas Gangrene Diseases 0.000 description 1
- 208000005577 Gastroenteritis Diseases 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000003794 Gram staining Methods 0.000 description 1
- 108010000540 Hexosaminidases Proteins 0.000 description 1
- 102000002268 Hexosaminidases Human genes 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 108010044467 Isoenzymes Proteins 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- 241000194036 Lactococcus Species 0.000 description 1
- 229910010082 LiAlH Inorganic materials 0.000 description 1
- 241000186779 Listeria monocytogenes Species 0.000 description 1
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 201000009906 Meningitis Diseases 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 102100030397 N-acetylmuramoyl-L-alanine amidase Human genes 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 208000037273 Pathologic Processes Diseases 0.000 description 1
- 241000009328 Perro Species 0.000 description 1
- 208000003100 Pseudomembranous Enterocolitis Diseases 0.000 description 1
- 206010037128 Pseudomembranous colitis Diseases 0.000 description 1
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 1
- 241000702217 Pseudomonas virus phi6 Species 0.000 description 1
- 206010037660 Pyrexia Diseases 0.000 description 1
- 101800001554 RNA-directed RNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 102000000395 SH3 domains Human genes 0.000 description 1
- 108050008861 SH3 domains Proteins 0.000 description 1
- 101000775071 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) Peroxiredoxin AHP1 Proteins 0.000 description 1
- 206010040047 Sepsis Diseases 0.000 description 1
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 241000295644 Staphylococcaceae Species 0.000 description 1
- 206010051017 Staphylococcal bacteraemia Diseases 0.000 description 1
- 241000191978 Staphylococcus simulans Species 0.000 description 1
- 241000194042 Streptococcus dysgalactiae Species 0.000 description 1
- 241000194026 Streptococcus gordonii Species 0.000 description 1
- 201000005010 Streptococcus pneumonia Diseases 0.000 description 1
- 241000194023 Streptococcus sanguinis Species 0.000 description 1
- 241000193990 Streptococcus sp. 'group B' Species 0.000 description 1
- 241000194005 Streptococcus sp. 'group G' Species 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- 206010043376 Tetanus Diseases 0.000 description 1
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 description 1
- HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N Trehalose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 206010000059 abdominal discomfort Diseases 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000006838 adverse reaction Effects 0.000 description 1
- 230000037006 agalactosis Effects 0.000 description 1
- 238000002814 agar dilution Methods 0.000 description 1
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 1
- 230000000172 allergic effect Effects 0.000 description 1
- HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N alpha,alpha-trehalose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N 0.000 description 1
- 230000009435 amidation Effects 0.000 description 1
- 238000007112 amidation reaction Methods 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 208000022338 anthrax infection Diseases 0.000 description 1
- 238000009635 antibiotic susceptibility testing Methods 0.000 description 1
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 1
- 229940127219 anticoagulant drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003430 antimalarial agent Substances 0.000 description 1
- 238000011203 antimicrobial therapy Methods 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 235000006708 antioxidants Nutrition 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 239000000010 aprotic solvent Substances 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000009697 arginine Nutrition 0.000 description 1
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 description 1
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- 208000010668 atopic eczema Diseases 0.000 description 1
- 229940065181 bacillus anthracis Drugs 0.000 description 1
- 239000003637 basic solution Substances 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000013060 biological fluid Substances 0.000 description 1
- SIPUZPBQZHNSDW-UHFFFAOYSA-N bis(2-methylpropyl)aluminum Chemical compound CC(C)C[Al]CC(C)C SIPUZPBQZHNSDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 208000037815 bloodstream infection Diseases 0.000 description 1
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 1
- 239000012888 bovine serum Substances 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 239000007975 buffered saline Substances 0.000 description 1
- 239000006172 buffering agent Substances 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 1
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 1
- 229960003677 chloroquine Drugs 0.000 description 1
- WHTVZRBIWZFKQO-UHFFFAOYSA-N chloroquine Natural products ClC1=CC=C2C(NC(C)CCCN(CC)CC)=CC=NC2=C1 WHTVZRBIWZFKQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 238000002648 combination therapy Methods 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 235000019425 dextrin Nutrition 0.000 description 1
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 1
- 206010013023 diphtheria Diseases 0.000 description 1
- 150000002016 disaccharides Chemical class 0.000 description 1
- KDQPSPMLNJTZAL-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogenphosphate dihydrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O KDQPSPMLNJTZAL-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 208000002173 dizziness Diseases 0.000 description 1
- 206010014665 endocarditis Diseases 0.000 description 1
- 229940066758 endopeptidases Drugs 0.000 description 1
- 230000007071 enzymatic hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006047 enzymatic hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000002813 epsilometer test Methods 0.000 description 1
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 1
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000013100 final test Methods 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 1
- 239000012520 frozen sample Substances 0.000 description 1
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 244000005709 gut microbiome Species 0.000 description 1
- 229940093915 gynecological organic acid Drugs 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 229920001477 hydrophilic polymer Polymers 0.000 description 1
- 210000001822 immobilized cell Anatomy 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 239000012678 infectious agent Substances 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 230000036512 infertility Effects 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000012280 lithium aluminium hydride Substances 0.000 description 1
- 244000144972 livestock Species 0.000 description 1
- 239000003055 low molecular weight heparin Substances 0.000 description 1
- 229940127215 low-molecular weight heparin Drugs 0.000 description 1
- 239000003580 lung surfactant Substances 0.000 description 1
- 239000008176 lyophilized powder Substances 0.000 description 1
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 1
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 1
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 230000000116 mitigating effect Effects 0.000 description 1
- NJTGANWAUPEOAX-UHFFFAOYSA-N molport-023-220-454 Chemical compound OCC(O)CO.OCC(O)CO NJTGANWAUPEOAX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000002772 monosaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 230000003232 mucoadhesive effect Effects 0.000 description 1
- 210000001989 nasopharynx Anatomy 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 239000002736 nonionic surfactant Substances 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000007899 nucleic acid hybridization Methods 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 238000002515 oligonucleotide synthesis Methods 0.000 description 1
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 description 1
- 229960001019 oxacillin Drugs 0.000 description 1
- UWYHMGVUTGAWSP-JKIFEVAISA-N oxacillin Chemical compound N([C@@H]1C(N2[C@H](C(C)(C)S[C@@H]21)C(O)=O)=O)C(=O)C1=C(C)ON=C1C1=CC=CC=C1 UWYHMGVUTGAWSP-JKIFEVAISA-N 0.000 description 1
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000009054 pathological process Effects 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- 238000001066 phage therapy Methods 0.000 description 1
- 239000008177 pharmaceutical agent Substances 0.000 description 1
- 238000009520 phase I clinical trial Methods 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 229920001983 poloxamer Polymers 0.000 description 1
- 229920000724 poly(L-arginine) polymer Polymers 0.000 description 1
- 108010011110 polyarginine Proteins 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 229940068965 polysorbates Drugs 0.000 description 1
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 1
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 1
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 description 1
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 1
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 description 1
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 1
- 238000001303 quality assessment method Methods 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 1
- 238000007423 screening assay Methods 0.000 description 1
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 1
- 238000004904 shortening Methods 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012279 sodium borohydride Substances 0.000 description 1
- 229910000033 sodium borohydride Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940074545 sodium dihydrogen phosphate dihydrate Drugs 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 229940037648 staphylococcus simulans Drugs 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 229940115920 streptococcus dysgalactiae Drugs 0.000 description 1
- KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-L succinate(2-) Chemical compound [O-]C(=O)CCC([O-])=O KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 150000005846 sugar alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 210000001179 synovial fluid Anatomy 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 1
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 239000006150 trypticase soy agar Substances 0.000 description 1
- 108010050327 trypticase-soy broth Proteins 0.000 description 1
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 1
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- A61K38/12—Cyclic peptides, e.g. bacitracins; Polymyxins; Gramicidins S, C; Tyrocidins A, B or C
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
- C12Q1/18—Testing for antimicrobial activity of a material
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
- C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
- C12Y302/01017—Lysozyme (3.2.1.17)
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
Настоящее изобретение относится к области медицины, а именно к способу анализа чувствительности грамположительных бактерий в отношении антибактериального пептида с микроразбавлением в жидкой среде (BMD), включающему оценку указанного антибактериального пептида в жидкой среде с добавлением сыворотки крови животного и восстановителя, причем указанный антибактериальный пептид представляет собой полипептид-лизин, и при этом оценка указанного антибактериального пептида включает определение минимальной ингибирующей концентрации (МИК) указанного антибактериального пептида. Настоящее изобретение обеспечивает улучшенный анализ методом микроразбавления в жидкой среде (BMD), в котором устранен эффект переноса. 13 з.п. ф-лы, 12 ил., 6 табл., 1 пр.
Description
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
[0001] Настоящее изобретение в целом относится к компонентам, способам анализа и способам оценки антибактериальной эффективности и определения минимальной ингибирующей концентрации (МИК) полипептидов, в том числе полипептидов-лизинов, уничтожающих бактерии.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
[0002] Развитие бактерий, устойчивых к лекарственным средствам, является одной из значительных проблемой в медицине ввиду возрастания количества антибиотиков, применяемых при широком спектре заболеваний и других состояний. Новые подходы к антимикробной терапии включают антибиотики на основе ферментов («энзибиотики»), например, лизины бактериофагов. Фаги используют эти лизины для гидролиза клеточной стенки бактерий-хозяев, приводящего к высвобождению потомства вируса за счет гипотонического лизиса. Высокая летальная активность лизинов против грамположительных патогенных организмов делает их привлекательными кандидатами для разработки терапевтических средств (Fischetti, V.A. (2008) Curr Opinion Microbiol 11:393-400; Nelson, D.L. et al. (2001) Proc Natl Acad Sci USA 98:4107-4112). Лизины бактериофагов исходно были предложены для устранения носительства патогенных стрептококков в носоглотке (Loeffler, J.М. et al. (2001) Science 294: 2170-2172; Nelson, D. et al (2001) Proc Natl Acad Sci USA 98:4107-4112).
[0003] Установлено, что литические ферменты бактериофагов можно применять в оценке и специфическом лечении различных видов инфекций у субъектов с использованием различных путей введения. Например, патент США 5604109 (Fischetti et al.) относится к быстрому обнаружению стрептококков группы А в клинических образцах посредством ферментативного гидролиза полуочищенным ферментом-лизином, ассоциированным с фагом стрептококков группы С. Действие этого фермента легло в основу дополнительных исследований, приведших к разработке способов лечения заболеваний. В патентах Fischetti и Loomis (патентах США 5985271, 6017528 и 6056955) описано применение фермента-лизина, продуцируемого бактериями-стрептококками группы С, инфицированными бактериофагом С1. В патенте США 6248324 (Fischetti and Loomis) описана композиция для лечения дерматологических инфекций за счет применения литического фермента в носителе, подходящем для наружного нанесения на кожные ткани. В патенте 6254866 (Fischetti, Loomis) описан способ лечения бактериальных инфекций пищеварительного тракта, включающий введение литического фермента, специфического по отношению к бактерии, вызвавшей инфекцию. В патенте США 6264945 (Fischetti, Loomis) описаны способ и композиция для лечения бактериальных инфекций путем парентерального введения (внутримышечно, подкожно или внутривенно) по меньшей мере одного литического фермента, продуцируемого бактерией, инфицированной бактериофагом, специфичным по отношению к указанной бактерии, и соответствующего носителя для доставки литического фермента в организм пациента.
[0004] В патенте США 7402309, 7638600 и опубликованной заявке РСТ WO 2008/018854 предложены отдельные фаг-ассоциированные литические ферменты, используемые в качестве антибактериальных агентов для лечения или ослабления инфекции Bacillus anthracis. В патенте США 7569223 описаны литические ферменты для Streptococcus pneumoniae. Лизин, подходящий для Enterococcus (Е. faecalis и Е. faecium, в том числе ванкомицин-резистентных штаммов), описан в патенте США 7582291. В US 2008/0221035 описаны мутантные лизины Ply GBS, характеризующиеся высокой эффективностью в уничтожении стрептококков группы В. Химерный лизин, обозначенный как ClyS, обладающий активностью против бактерий-стафилококков, в том числе Staphylococcus aureus, подробно описан в WO 2010/002959. Лизин PlySs2, выделенный из Streptococcus suis и эффективно уничтожающий штаммы Streptococcus, Staphylococcus, Enterococcus и Listeria, описан в WO 2012/145630 и патенте США 9034322.
[0005] Лизин PlySs2 (CF-301) представляет собой первый лизин, для которого были начаты и завершены клинические исследования I фазы, разрешенные FDA (Управлением по контролю за продуктами питания и лекарственными средствами США). Лизины можно комбинировать с антибиотиками (например, ванкомицином или даптомицином), стандартно применяемыми для лечения инфекций кровотока, в том числе эндокардита, вызываемых метициллин-чувствительным и резистентным Staphylococcus aureus. Для поддержки клинических исследований в целях оценки и стандартизации бактериальных агентов используют анализ чувствительности к антибиотикам (AST) in vitro.
[0006] Для анализа активности лизина, например, PlySs2/CF-301, против изолятов S. aureus можно применять микроразбавление в жидкой среде (бульоне) (BMD), хотя стандартный способ (методология CLSI) не является надежным анализом и демонстрирует различные проблемы при использовании для анализа такого литического полипептида, как PlySs2 (CF-301). Эти проблемы включают эффект переноса, несовпадение или отклонение от результатов анализа чувствительности в крови, сыворотке или плазме человека и потерю активности фермента в панелях разбавленных замороженных препаратов.
[0007] Ввиду недостатков и проблем, ассоциированных со стандартными способами микроразбавления в жидкой среде для оценки антибактериальных агентов, например, полипептидов-лизинов, в данной области техники существует потребность в достоверном, надежном и воспроизводимом способе оценки чувствительности бактерий в анализе in vitro, которые можно применять для клинического тестирования и оценки, надлежащим образом имитирующих активность и эффекты in vivo.
[0008] Источники, цитируемые в настоящем документе, не следует интерпретировать в качестве признания того, что они являются предшествующим уровнем техники по отношению к настоящему изобретению.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0009] Настоящая заявка относится к модифицированным способам и анализам (тест-системам), в которых применяются уникальные компоненты для определения минимальной ингибирующей концентрации и оценки эффективности пептидов в уничтожении бактерий, в частности, пептидов, эффективно действующих против бактерий, в частности, литических пептидов.
[00010] Настоящее изобретение относится к предложенным системе или анализу для определения МИК антибактериального пептида, в частности, литического пептида, причем указанный анализ выполняют с применением среды или жидкой среды с добавлением сыворотки млекопитающего и восстановителя. В одном аспекте настоящего изобретения предложен анализ для определения эффективности антибактериального пептида в уничтожении бактерий, точно отражающего эффективность антибактериального пептида, например, литического пептида или лизина, в уничтожении бактерий в организме млекопитающего или пациента, в частности, человека.
[00011] В соответствии с настоящим изобретением предложен способ определения активности антибактериального пептида, например, литического пептида или лизина, в уничтожении бактерий, причем активность, связанная с уничтожением, точно имитирует уничтожение бактерий указанным антибактериальным пептидом в организме человека, включающий оценку антибактериального пептида в жидкой среде с добавлением сыворотки животного и восстановителя. В одном аспекте настоящего изобретения антибактериальный пептид, такой как, литический полипептид или лизин, оценивают по отношению к чувствительной бактерии в жидкой среде с добавлением сыворотки крови лошади, сыворотки крови собаки, сыворотки крови кролика или сыворотки крови мыши и восстановителя. В одном аспекте настоящего изобретения антибактериальный пептид, такой как, литический полипептид или лизин, оценивают по отношению к чувствительной бактерии в жидкой среде с добавлением сыворотки крови лошади и восстановителя.
[00012] В соответствии с настоящим изобретением предложен модифицированный и улучшенный способ и анализ с микроразбавлением в жидкой среде (BMD) для тестирования пептидов, в частности, пептидов с антибактериальным действием, в частности, литических пептидов или пептидов-лизинов. В одном аспекте настоящего изобретения предложено модифицированное BMD с применением среды или жидкой среды для оценки, причем в среду или жидкую среду добавлены сыворотка крови млекопитающего и восстановители.
[00013] В одном аспекте предложено модифицированное BMD с применением среды или жидкой среды для оценки, причем в среду или жидкую среду добавлена сыворотка крови животного. В одном аспекте предложено модифицированное BMD с применением среды или жидкой среды для оценки, причем в среду или жидкую среду добавлена сыворотка крови позвоночного. В одном аспекте предложено модифицированное BMD с применением среды или жидкой среды для оценки, причем в среду или жидкую среду добавлена сыворотка крови млекопитающего. В одном аспекте предложено модифицированное BMD с применением среды или жидкой среды для оценки, причем в среду или жидкую среду добавлена сыворотка животного, выбранная из сыворотки крови лошади, сыворотки крови человека, сыворотки крови собаки, сыворотки крови кролика, сыворотки крови мыши, сыворотки крови крупного рогатого скота. В одном аспекте предложен способ микроразбавления в жидкой среде (BMD) с применением среды или жидкой среды, причем в среду или жидкую среду добавлена сыворотка крови животного, выбранная из сыворотки крови лошади, сыворотки крови собаки, сыворотки крови кролика, сыворотки мыши, сыворотки крупного рогатого скота. В одном аспекте предложен способ микроразбавления в жидкой среде (BMD) с применением в среды или жидкой среды для оценки, причем в среду или жидкую среду добавлена сыворотка крови лошади.
[00014] В одном аспекте способа BMD согласно настоящему изобретению в среду или жидкую среду добавлены сыворотка крови млекопитающего и восстановитель. В одном аспекте в среду или жидкую среду добавлены сыворотка крови лошади и восстановитель. В одном аспекте восстановитель представляет собой DL-дитиотрейтол (ДТТ). В одном аспекте восстановитель представляет собой гидрохлорид трис(2-карбоксиэтил)фосфина (ТСЕР).
[00015] В одном аспекте в среду или жидкую среду, подходящую для роста бактерий, добавлены сыворотка крови млекопитающего и восстановитель. В одном аспекте в среду или жидкую среду с откорректированным катионным составом добавлены крови млекопитающего и восстановитель. В одном аспекте в среду или жидкую среду с откорректированным катионным составом добавлены сыворотка крови лошади и восстановитель. В одном аспекте восстановитель представляет собой DL-дитиотрейтол (ДТТ). В одном аспекте восстановитель представляет собой гидрохлорид трис(2-карбоксиэтил)фосфина (ТСЕР).
[00016] Количество добавляемой сыворотки можно определить путем сравнения с сывороткой крови человека. Количество добавляемой сыворотки может составлять от 10% сыворотки до 80% сыворотки. В одном аспекте количество добавляемой сыворотки может составлять от 10% сыворотки до 60% сыворотки. В одном аспекте количество добавляемой сыворотки может составлять от 10% сыворотки до 50% сыворотки. В одном аспекте количество добавляемой сыворотки может составлять от 15% сыворотки до 40% сыворотки. В одном аспекте количество добавляемой сыворотки может составлять от 15% сыворотки до 30% сыворотки. В одном аспекте количество добавляемой сыворотки может составлять от 20% сыворотки до 30% сыворотки. В одном аспекте количество добавляемой сыворотки может составлять приблизительно 25% сыворотки. В одном аспекте количество добавляемой сыворотки составляет от 20% сыворотки до 30% сыворотки. В одном аспекте количество добавляемой сыворотки составляет приблизительно 25% сыворотки. В одном аспекте количество добавляемой сыворотки составляет 25% сыворотки животного. В одном аспекте количество добавляемой сыворотки составляет приблизительно 25% сыворотки крови лошади.
[00017] В одном аспекте в среду или жидкую среду добавляют сыворотку лошади и восстановитель. В одном аспекте в среду или жидкую среду добавляют приблизительно от 20% до 30% сыворотки крови лошади и восстановитель. В одном аспекте в среду или жидкую среду добавляют приблизительно 25% сыворотки крови лошади и восстановитель. В одном аспекте в среду или жидкую среду добавляют 25% сыворотку лошади и восстановитель. В одном аспекте в жидкую среду с откорректированным катионным составом добавляют сыворотку лошади и восстановитель. В одном аспекте в жидкую среду с откорректированным катионным составом добавляют приблизительно от 20% до 30% сыворотки крови лошади и восстановитель. В одном аспекте в жидкую среду с откорректированным катионным составом добавляют 25% сыворотку лошади и восстановитель.
[00018] В одном аспекте в среду или жидкую среду, подходящую для роста (выращивания) бактерий, добавляют 25% сыворотку млекопитающего и дитиотрейтол (ДТТ). В одном аспекте в жидкую среду Мюллера-Хинтона с откорректированным катионным составом (СА-МНВ) добавляют 25% сыворотку лошади и дитиотрейтол (ДТТ). В одном аспекте в жидкую среду Мюллера-Хинтона с откорректированным катионным составом (СА-МНВ) добавляют 25% сыворотку лошади и гидрохлорид трис(2-карбоксиэтил)фосфина (ТСЕР). В одном аспекте в жидкую среду Мюллера-Хинтона с откорректированным катионным составом (СА-МНВ) добавляют 25% сыворотку лошади и 0,5 мМ DL-дитиотрейтола (ДТТ).
[00019] В одном аспекте количество восстановителя составляет от 0,1 мМ до 10 мМ. В одном аспекте количество восстановителя составляет от 0,1 мМ до 5 мМ. В одном аспекте количество восстановителя составляет от 0,1 мМ до 2 мМ. В одном аспекте количество восстановителя составляет от 0,1 мМ до 1 мМ. В одном аспекте количество восстановителя составляет от 0,1 мМ до 0,9 мМ. В одном аспекте количество восстановителя составляет от 0,1 мМ до 0,6 мМ. В одном аспекте количество восстановителя составляет от 0,2 мМ до 0,6 мМ. В одном аспекте количество восстановителя составляет от 0,3 мМ до 0,6 мМ. В одном аспекте количество восстановителя составляет от 0,4 мМ до 0,6 мМ. В одном аспекте количество восстановителя составляет приблизительно 0,5 мМ. В одном аспекте количество восстановителя составляет от 0,25 мМ до 1 мМ. В одном аспекте количество восстановителя составляет менее 1 мМ.
[00020] В одном варианте реализации анализ и способ согласно настоящему изобретению применяют при оценке и анализе литического полипептида. В одном аспекте настоящего изобретения способ BMD с добавкой (добавками) применяют для определения эффективности уничтожения бактерий литическим полипептидом, активным против бактерий Streptococcus. В одном аспекте настоящего изобретения способ BMD с добавкой (добавками) применяют для определения эффективности уничтожения бактерий литическим полипептидом, активным против бактерий Streptococcus и Staphylococcus. В одном аспекте настоящего изобретения способ BMD с добавкой (добавками) применяют для анализа МИК литического полипептида, активного против бактерий Streptococcus. В одном аспекте настоящего изобретения способ BMD с добавкой (добавками) применяют для анализа МИК литического полипептида, активного против бактерий Staphylococcus. В одном аспекте настоящего изобретения способ BMD с добавкой (добавками) применяют для анализа МИК литического полипептида, активного против бактерий Streptococcus и Staphylococcus. В одном аспекте настоящего изобретения способ BMD с добавкой (добавками) применяют для анализа МИК литического полипептида против грамположительных бактерий. В одном аспекте настоящего изобретения способ BMD с добавкой (добавками) применяют для анализа МИК литического полипептида против более чем одного вида грамположительных бактерий. Грамположительные бактерии можно выбирать из бактерий Streptococcus, Staphylococcus, Enterococcus и Listeria.
[00021] В одном аспекте компоненты, способ или анализ согласно настоящему изобретению используют для оценки литического полипептида, например, в том числе, полипептида PlySs2 (CF-301) или его варианта или производного, против грамположительных бактерий. В одном аспекте компоненты, способ или анализ согласно настоящему изобретению используют для оценки литического полипептида, в том числе полипептида PlySs2 (CF-301) или его варианта или производного, против бактерий, устойчивых к антибиотикам. В одном аспекте компоненты, способ или анализ согласно настоящему изобретению используют для оценки литического полипептида, в том числе полипептида PlySs2 (CF-301) или его варианта или производного, против бактерий Streptococcus и Staphylococcus. В одном аспекте компоненты, способ или анализ согласно настоящему изобретению используют для оценки литического полипептида, в том числе полипептида PlySs2 (CF-301) или его варианта или производного, против бактерий Streptococcus и/или Staphylococcus, устойчивых к антибиотикам. В одном аспекте литический полипептид представляет собой PlySs2 или его производное или вариант. В одном аспекте полипептид содержит последовательность, представленную на фигуре 1 (SEQ ID NO: 1).
[00022] Добавление сыворотки млекопитающего, например, сыворотки крови лошади, соответствует результатам, описанным в настоящем документе и указывающим, что пептид, в частности, литический полипептид, в частности, типичный литический полипептид PlySs2, более активен в сыворотке/крови человека (а также некоторых других видов млекопитающих, в том числе лошади), чем просто в среде или жидкой среде, применяемой в анализе. Обнаружено, что полипептид, в частности, литический полипептид, в частности, типичный литический полипептид PlySs2, значительно более активен в сыворотке/крови человека (а также некоторых других видов млекопитающих, в том числе лошади), чем в жидкой среде с откорректированным катионным составом без добавления сыворотки. Антибактериальный полипептид, в частности, типичный литический полипептид PlySs2, более активен (в частности, в 32-64 раза более активен) в сыворотке/крови человека (а также некоторых других видов млекопитающих в том числе, лошади), чем в жидкой среде, например, жидкой среде с откорректированным катионным составом без добавления сыворотки. При добавлении в СА-МНВ в 25% концентрации сыворотка лошади предотвращает эффект переноса и позволяет получить значения МИК, практически идентичные значениям, полученным в 100% сыворотке человека. Добавление ДТТ применяется для стабилизации полипептида-лизина и позволяет использовать замороженные панели для микроразбавления в жидкой среде для определения МИК. ДТТ представляет собой распространенный восстановитель, используемый для предотвращения окисления и инактивации ферментов при хранении или в условиях анализов in vitro.
[00023] В одном аспекте настоящего изобретения лизин бактериофага, полученный из бактерий Streptococcus или Staphylococcus, применяют в способах и композициях согласно настоящему изобретению. Типичный(е) полипептид(ы)-лизин(ы) для применения в настоящем изобретении, в частности, лизин PlySs2, предложенный в настоящем документе и на фигуре 1 (SEQ ID NO: 1), демонстрируют уникальную широкую активность, позволяющую уничтожать различные бактерии, в частности, грамположительные бактерии, в том числе штаммы бактерий Staphylococcus, Streptococcus, Enterococcus и Listeria. В одном из аспектов лизин PlySs2 может уничтожать штаммы Staphylococcus aureus и бактерий, как показано в настоящем документе. В одном из аспектов лизин PlySs2 может уничтожать штаммы бактерий Staphylococcus и Streptococcus. PlySs2 эффективен против устойчивого к антибиотикам Staphylococcus aureus, например, устойчивого к метициллину Staphylococcus aureus (MRSA), устойчивого к ванкомицину Staphylococcus aureus (VRSA), устойчивого к даптомицину Staphylococcus aureus (DRSA) и устойчивого к линезолиду Staphylococcus aureus (LRSA). PlySs2 эффективен против умеренно чувствительного к ванкомицину Staphylococcus aureus (VISA).
[00024] Выделенный полипептид-лизин PlySs2 может содержать аминокислотную последовательность, представленную на фигуре 1, или ее варианты, обладающие по меньшей мере 80% идентичностью, 85% идентичностью, 90% идентичностью, 95% идентичностью или 99% идентичностью по отношению к полипептиду, изображенному на фигуре 1, и эффективно уничтожает грамположительные бактерии. Выделенный полипептид-лизин PlySs2 может содержать аминокислотную последовательность, представленную на фигуре 1, или ее варианты, обладающие по меньшей мере 80% идентичностью, 85% идентичностью, 90% идентичностью, 95% идентичностью или 99% идентичностью по отношению к полипептиду, изображенному на фигуре 1, и эффективно уничтожает бактерии Staphylococcus и Streptococcus.
[00025] В любом из таких способов или в любых способах бактерии можно выбирать из Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes, Staphylococcus simulans, Streptococcus suis, Staphylococcus epidermidis, Streptococcus equi, Streptococcus equi zoo, Streptococcus agalactiae (GBS), Streptococcus pyogenes (GAS), Streptococcus sanguinis, Streptococcus gordonii, Streptococcus dysgalactiae, Streptococcus группы G, Streptococcus группы E, Enterococcus faecalis и Streptococcus pneumonia.
[00026] В соответствии с любым из способов согласно настоящему изобретению бактерии могут являться бактериями, устойчивыми к антибиотикам. Бактерия может представлять собой устойчивый к метициллину Staphylococcus aureus (MRSA), умеренно чувствительный к ванкомицину Staphylococcus aureus (VISA), устойчивый к ванкомицину Staphylococcus aureus (VRSA), устойчивый к даптомицину Staphylococcus aureus (DRSA) или устойчивый к линезолиду Staphylococcus aureus (LRSA). Чувствительные бактерии могут представлять собой клинически значимые или патогенные, в частности, для людей, бактерии. В одном аспекте способа(ов) полипептид(ы)-лизин(ы) эффективно уничтожает(ют) штаммы бактерий Staphylococcus, Streptococcus, Enterococcus и Listeria.
[00027] В дополнительном аспекте или варианте реализации способов и композиций, предложенных в настоящем документе, применяют другой отличающийся лизин, специфичный по отношению к стафилококкам, отдельно или в комбинации с лизином PlySs2, предложенным и описанным в настоящем документе. В одном из таких аспектов или вариантов реализации способов и композиций, предложенных в настоящем документе, применяют лизин ClyS, специфичный по отношению к стафилококкам, отдельно или в комбинации с лизином PlySs2, предложенным и описанным в настоящем документе.
[00028] Для специалистов в данной области техники после ознакомления со следующим описанием, снабженным ссылками на следующие иллюстративные изображения, станут очевидны другие объекты и преимущества.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
[00029] На фигуре 1 показаны (А) аминокислотная последовательность полипептида-лизина PlySs2 (CF-301) с обозначенными остатками активного центра и структурой доменов, включая каталитический домен семейства CHAP и домен семейства SH3, связывающийся с клеточной стенкой; и (В) предсказанная 3-мерная структура (представление по I-TASSER).
[00030] На фигуре 2 показаны (А) мишень в клеточной стенке S. aureus; (В) расщепление связи D-Ala-L-Gly в пептидогликановой сетчатой структуре клеточной стенки стафилококков, необходимой для стабильности структуры (по материалам Capot-Chartier, Front Microbiol 22:2104); и (С) гидролиз клеточной стенки и осмотический лизис. На фигуре (С) показано, что гидролиз пептидогликана приводит к осмотическому лизису бактерий. На фигуре (С) приведены необработанная бактерия, бактерия через 15 секунд (15 с) после добавления CF-301 и через 15 минут обработки CF-301.
[00031] На фигуре 3 представлены примеры влияния переноса и крови при анализе BMD. (А) эффект переноса, или эффект Игла снижает точность определения МИК у MHBII. (В) Изображено влияние крови на штамм S. aureus. Сыворотку (HuS) и плазму крови (HuP) применяют следующим образом: HuS1 = объединенная сыворотка мужчин с АВ, Innovative Research, Inc; HuS2 = объединенная сыворотка здоровых людей, Innovative Research, Inc; HuS3 = сыворотка отдельного здорового человека, BioreclamationIVT; HuS4 = объединенная сыворотка мужчин с АВ, Sigma-Aldrich.
[00032] На фигуре 4 представлены результаты анализа чувствительности набора 30 штаммов S. aureus. Описаны проблемы, связанные с некоторыми способами анализа.
[00033] На фигуре 5 представлена таблица с результатами BMD-анализа PlySs2/CF301 с применением нового способа и 25% сыворотки крови лошади из 14 различных источников для оценки S. aureus АТСС 29213 и Е. faecalis АТСС 29212.
[00034] На фигуре 6 представлена динамика определения МИК в замороженных образцах CF-301 с применением новой BMD-методологии.
[00035] На фигуре 7 представлен анализ МИК для штамма MRSA АТСС 29213 в различных условиях. (А) только MHBII (МИК=16 мкг/мл с легким эффектом переноса); (В) 100% сыворотка человека (МИК=1 мг/мл); и (С) MHBII, 25% сыворотка лошади, 0,5 мм ДТТ (МИК=0,5 мкг/мл).
[00036] На фигуре 8 представлен анализ МИК шиамма S. aureus АТСС 700699 в СА-МНВ с 25% сывороткой лошади и 0,5 мМ ДТТ (МИК=1 мкг/мл).
[00037] На фигуре 9 представлена оценка активности МИК CF-301 с применением BMD-методологии с добавлением сыворотки крови лошади и ДТТ по отношению к различным чувствительным грамположительным бактериям, в том числе MRSA, MSSA, Staphylococcus epidermidis, Streptococcus pyogenes, Streptococcus agalactiae, Streptococcus pneumoniae и Enterococcus faecalis.
[00038] На фигуре 10 представлена активность ванкомицина согласно оценке с применением модифицированного способа BMD по сравнению со стандартной жидкой средой САМНВ без добавок. Выполнена оценка различных штаммов Staphylococcus aureus, в том числ штаммов MSSA и MRSA.
[00039] На фигуре 11 представлен анализ контроля качества определения МИК на основе анализа BMD с использованием МНВ II с 25% сывороткой лошади и 0,5 мМ ДТТ в течение 5 дней по отношению к (A) S. aureus АТСС 29213 и (В) Е. faecalis АТСС 29212. За несколько дней подряд проанализировали пять повторностей на штамм. Показано сравнение оценки в двух различных лабораториях - лаборатории 1 и лаборатории 2. Ванкомицин и оксациллин использовали в качестве контрольных агентов в СА-МНВ и СА-МНВ=2% физиологическом растворе, соответственно.
[00040] На фигуре 12 представлены исследования по поиску диапазона, в которых оценивали (А) различное количества добавляемой сыворотки крови лошади (от 12,5% до 30%) и (В) различные количества добавляемого восстановителя ДТТ (0-1 мМ). Количество обозначено либо более темным, либо светлым оттенком. Темный оттенок означает, что способ забракован из-за эффекта переноса, высоких значений МИК (в сравнении с сывороткой (HuS) или невозможности замораживания. Более светлый оттенок означает, что способ обеспечивает уровень активности, аналогичный активности в HuS.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ
[00041] В соответствии с настоящим изобретением можно применять стандартные методики молекулярной биологии, микробиологии и технологии рекомбинантных ДНК в пределах данной области техники. Такие методики описаны в литературе в полном объеме. См., например, Sambrook et al, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (1989); "Current Protocols in Molecular Biology" Volumes I-III [Ausubel, R.M., ed. (1994)]; "Cell Biology: A Laboratory Handbook" Volumes I-III [J.E. Celis, ed. (1994))]; "Current Protocols in Immunology" Volumes I-III [Coligan, J.E., ed. (1994)]; "Oligonucleotide Synthesis" (M.J. Gait ed. 1984); "Nucleic Acid Hybridization" [B.D. Hames & S.J. Higgins eds. (1985)]; "Transcription And Translation" [B.D. Hames & S.J. Higgins, eds. (1984)]; "Animal Cell Culture" [R.I. Freshney, ed. (1986)]; "Immobilized Cells And Enzymes" [IRL Press, (1986)]; B. Perbal, "A Practical Guide To Molecular Cloning" (1984).
[00042] Соответственно, в настоящем документе следующие термины должны соответствовать определениям, приведенным ниже.
[00043] Термины "лизин(ы) PlySs", "лизин PlySs2", "PlySs2", "CF-301", "CF301" и любые варианты, не перечисленные явным образом, могут использоваться в настоящем документе на равных основаниях, и на протяжении настоящей заявки и формулы изобретения относятся к белковому материалу, включая одиночные и множественные белки, и распространяется на белки с аминокислотной последовательностью, описанной в настоящем документе и представленной на фигуре 1 и в SEQ ID NO: 1, и профилями активности, представленными в настоящем документе и формуле изобретения. Соответственно, аналогичным образом рассматриваются белки с практически эквивалентной или модифицированной активностью. Эти модификации могут быть преднамеренными, например, модификации, внесенные за счет сайт-специфического мутагенеза, или случайными, например, модификации, полученные за счет мутаций у организмов-хозяев, являющихся продуцентами комплекса или его указанных субъединиц. Кроме того, предполагается, что термины "лизин(ы) PlySs", "лизин PlySs2", "PlySs2", "CF-301", "CF301" охватывают белки, явным образом указанные в настоящем документе, а также их практически гомологичные аналоги, фрагменты и укороченные и аллельные модификации. Лизин PlySs2 описан в патенте США 9034322 и заявке РСТ PCT/US2012/34456. Gilmer et al также описали лизин PlySs2 (Gilmer DB et al (2013) Antimicrob Agents Chemother Epub 2013 April 9 [PMID 23571534]).
[00044] Термин "ClyS", "лизин ClyS" относится к химерному лизину ClyS, обладающему активностью против бактерий-стафилококков, в том числе Staphylococcus aureus, подробно описанному в WO 2010/002959, а также в статье Daniel et al (Daniel, A et al (2010) Antimicrobial Agents and Chemother 54(4):1603-1612). Типичная аминокислотная последовательность ClyS представлена в SEQ ID NO: 2.
[00045] Термин "литический фермент" или "литический полипептид» включает фермент, обладающий литической активностью по отношению к клеточной стенке бактерий, уничтожающий одну или более из бактерий в подходящих условиях и за соответствующее время. Примеры литических ферментов включают, без ограничения, различные амидазные ферменты, вызывающие лизис клеточной стенки. В частном аспекте литический фермент относится к литическому ферменту бактериофага. Термин "литический фермент бактериофага" относится к литическому ферменту, выделенному из бактериофага, или синтезированному литическому ферменту с аналогичной структурой, поддерживающему функционал литического фермента.
[00046] Литический фермент или литический полипептид могут специфическим образом расщеплять связи, присутствующие в пептидогликане или бактериальных клетках, разрушая клеточную стенку бактерий. Кроме того, в настоящее время принято считать, что пептидогликан клеточной стенки бактерий является высококонсервативным у большинства бактерий, и расщепление лишь нескольких связей может разрушить клеточную стенку бактерии. Примерами литических ферментов, расщепляющих эти связи, являются мурамидазы, глюкозаминидазы, эндопептидазы или N-ацетилмурамоил-L-аланинамидазы. Fischetti и др. (1974) сообщили, что фермент-лизин фага С1 стрептококков представлял собой амидазу. Garcia и др. (1987, 1990) сообщили, что лизин Cpl S. pneumoniae из фага Ср-l представлял собой лизоцим. Caldentey, Bamford (1992) сообщили, что литический фермент фага phi 6 Pseudomonas представлял собой эндопептидазу, расщепляющую пептидный мостик, образованный мелодиаминопимилиновой кислотой и D-аланином. Литические ферменты фага Т1 и Т6 Е. Coli представляют собой амидазы, как и литический фермент фага Listeria (ply) (Loessner et al, 1996). Кроме того, в данной области техники известны и другие литические ферменты, способные расщеплять клеточную стенку бактерий.
[00047] Термин "литический фермент, генетически кодируемый бактериофагом" включает полипептид, способный уничтожать бактерию-хозяина, например, обладающий по меньшей мере некоторой активностью, вызывающей лизис клеточной стенки, по отношению к бактерии-хозяину. Полипептид может содержать последовательность, охватывающую нативную последовательность литического фермента и ее варианты. Этот полипептид можно выделить из различных источников, например, бактериофага («фага»), или изготовить с помощью рекомбинантных способов или способов синтеза. Этот полипептид может, например, содержать холин-связывающий фрагмент со стороны С-конца, и может характеризоваться ферментативной активностью, способной расщеплять пептидогликан клеточной стенки (например, амидазной активностью, действующей на амидные связи пептидогликана), со стороны N-конца. Описаны литические ферменты, обладающие несколькими видами ферментативной активности, например, содержащими два ферментативных домена, например, лизин PlyGBS. Кроме того, описаны другие литические ферменты, содержащие только каталитический домен, и не содержащие домена, связывающего клеточную стенку.
[00048] Термин "литический фаг-ассоциированный фермент с нативной последовательностью" включает полипептид с такой же аминокислотной последовательностью, что и у фермента, происходящего из бактериального генома (т.е. профага). Такой фермент с нативной последовательностью можно выделить или получить рекомбинантным или синтетическим путем.
[00049] Термин «фермент с нативной последовательностью» охватывает природные формы (например, альтернативные сплайс-варианты или модифицированные формы) и природные варианты фермента. В одном варианте реализации настоящего изобретения фермент с нативной последовательностью представляет собой зрелый или полноразмерный полипептид, генетически кодируемый геном бактериофага, специфичного по отношению к Streptococcus suis. Разумеется, возможен и известен ряд вариантов, что подтверждается в публикациях, например, Lopez et al., Microbial Drug Resistance 3: 199-211 (1997); Garcia et al., Gene 86: 81-88 (1990); Garcia et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 914-918 (1988); Garcia et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 914-918 (1988); Garcia et al., Streptococcal Genetics (J.J. Ferretti and Curtis eds., 1987); Lopez et al., FEMS Microbiol. Lett. 100: 439-448 (1992); Romero et al., J. Bacteriol. 172: 5064-5070 (1990); Ronda et al., Eur. J. Biochem. 164: 621-624 (1987) и Sanchez et al., Gene 61: 13-19 (1987). Содержание каждого из указанных источников, особенно списков последовательностей и связанного с ними текста, содержащего сравнение последовательностей, в том числе утверждения о гомологии последовательностей, специально включено в настоящий документ посредством ссылки в полном объеме.
[00050] Термин "литический фермент с вариантной последовательностью" включает литический фермент, характеризующийся полипептидной последовательностью, отличающейся от последовательности литического фермента, но сохраняющий функциональную активность. В некоторых вариантах реализации литический фермент может генетически кодировать бактериофаг, специфичный по отношению к бактерии, например, в случае PlySs2, - Streptococcus suis, обладающий определенной аминокислотной последовательностью с последовательностью(ями) литического фермента, как типичный лизин PlySs2, предложенный в настоящем документе на фигуре 1. Например, в некоторых вариантах реализации функционально активный литический фермент может уничтожать бактерии Streptococcus suis и другие чувствительные бактерии, представленные в настоящем документе, в том числе путем разрушения клеточной стенки бактерий, как показано в настоящем документе. Активный литический фермент может характеризоваться 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 97, 98, 99 или 99,5% идентичностью аминокислотной последовательности по отношению к последовательности(ям) литического фермента, приведенным в настоящем документе на фигуре 1. Такие варианты фаг-ассоциированного литического фермента включают, например, полипептиды литических ферментов, в которых добавлены или удалены один или более аминокислотных остатков с N- или С-конца последовательности(ей) литического фермента, представленного на фигуре 1.
[00051] В частном аспекте фаг-ассоциированный литический фермент характеризуется по меньшей мере приблизительно 80% или 85% идентичностью аминокислотной последовательности по отношению к нативным последовательностям фаг-ассоциированных литических ферментов, в частности, по меньшей мере приблизительно 90% (например, 90%) идентичностью аминокислотной последовательности. Конкретнее, вариант фаг-ассоциированного литического фермента должен обладать по меньшей мере 95% (например, 95%) идентичностью аминокислотной последовательности по отношению к нативной(ым)последовательности(ям) фаг-ассоциированного литического фермента. Типичная нативная фаговая последовательность лизина PlySs2 предложена на фигуре 1.
[00052] "Процент идентичности аминокислотной последовательности" по отношению к последовательностям фаг-ассоциированных литических ферментов в настоящем документе определяют как процентное содержание аминокислотных остатков в последовательности-кандидате, идентичных аминокислотным остаткам в последовательности фаг-ассоциированного литического фермента после выравнивания последовательностей в одной той же рамке считывания и, при необходимости, внедрения разрывов для достижения максимальной процентной идентичности последовательности, без учета консервативных замен как части идентичности последовательностей.
[00053] Термин «полипептид» включает молекулу полимера, содержащую множество аминокислот, соединенных линейно. В некоторых вариантах реализации полипептид может соответствовать молекулам, кодируемым природной полинуклеотидной последовательностью. Полипептид может содержать консервативные замены, при которых природную аминокислоту замещают аминокислотой с аналогичными свойствами, причем такие консервативные замены не влияют на функцию полипептида.
[00054] Термин «модифицированные литические ферменты» включает перекомбинированные (shuffled) и/или химерные литические ферменты.
[00055] Обнаружено, что фаговые литические ферменты, специфичные по отношению к бактериям, инфицированным конкретным фагом, эффективно и успешно разрушают клеточную стенку рассматриваемой бактерии. Считается, что литический фермент не обладает протеолитической ферментативной активностью и поэтому не разрушает белки и ткани млекопитающих, присутствующие при гидролизе клеточной стенки бактерий. Кроме того, поскольку обнаружено, что действие литических ферментов, в отличие от антибиотиков, является специфичным по отношению к патогенному(ым) организму(ам)-мишени(ям), вероятно сохранение нормальной микрофлоры в практически интактном состоянии (М.J. Loessner, G. Wendlinger, S. Scherer, Mol Microbiol 16, 1231-41. (1995), полностью включенный в настоящий документ посредством ссылки). Фактически, хотя лизин PlySs2 демонстрирует уникально широкий диапазон уничтожаемых видов и штаммов бактерий, он сравнительно неактивен, в особенности против бактерий, составляющих нормальную микрофлору, в том числе Е. coli, как описано в настоящем документе.
[00056] Литический фермент или полипептид для применения согласно настоящему изобретению может продуцироваться в организме бактерии после инфекции определенным бактериофагом, либо его можно продуцировать или получить рекомбинантным или синтетическим путем в качестве профилактического средства для защиты от заболевания лиц, подвергающихся воздействию других лиц с симптомами инфекции, или терапевтического средства для лиц, уже заболевших в результате данной инфекции. Поскольку в настоящем документе содержатся описание и ссылки на последовательности полипептидов-лизинов и нуклеиновые кислоты, кодирующие полипептиды-лизины, литический(е) фермент(ы)/полипептид(ы) предпочтительно можно продуцировать с использованием выделенного гена литического фермента из фагового генома, помещая указанный ген в вектор переноса и клонируя указанный вектор переноса в системе экспрессии с применением стандартных способов, известных в данной области техники, в том числе способов, описанных в настоящем документе в качестве примеров. Литический(е) фермент(ы) или полипептид(ы) могут быть укороченными, химерными, перекомбинированными или «природными», и могут присутствовать в комбинации. Соответствующий патент США №5604109 полностью включен в настоящий документ посредством ссылки. «Модифицированный» литический фермент можно получить различными способами. В предпочтительном варианте реализации ген модифицированного литического фермента из фагового генома помещают в вектор переноса или перемещаемый вектор, предпочтительно плазмиду, и указанную плазмиду клонируют в экспрессирующем векторе или системе экспрессии. Экспрессирующий вектор для продукции полипептида-лизина или фермента в соответствии с настоящим изобретением может подходить для Е. coli, Bacillus или ряда других подходящих бактерий. Система вектора также может представлять собой бесклеточную систему экспрессии. Все указанные способы экспрессии гена или набора генов известны в данной области техники. Литический фермент также можно получить, инфицировав Streptococcus suis бактериофагом, специфичным по отношению к Streptococcus suis, причем указанный по меньшей мере один литический фермент лизирует исключительно клеточную стенку указанного Streptococcus suis, оказывая минимально возможное действие на другую, например, природную или комменсальную присутствующую бактериальную микрофлору.
[00057] Биологически активные фрагменты белка или фрагмент пептида согласно вариантам реализации, описанные в настоящем документе, включают полипептиды, содержащие аминокислотные последовательности, в значительной мере идентичные аминокислотной последовательности белка-лизина согласно настоящему описанию или происходящие от нее, которые содержат меньшее количество аминокислот, чем полноразмерный белок-лизин, и демонстрируют по меньшей мере одну активность соответствующего полноразмерного белка. Обычно биологически активные фрагменты содержат домен или мотив, обладающий по меньшей мере одной активностью соответствующего белка. Например, как описано на фигуре 1, лизин PlySs2 содержит N-концевой домен CHAP и С-концевой домен SH3. Биологически активный фрагмент белка может представлять собой полипептид длиной, например, 10, 25, 50, 100 либо меньше или больше аминокислот. Кроме того, с помощью рекомбинантных технологий можно получить другие биологически активные фрагменты с удаленными или добавленными другими областями белка и оценить их на предмет одной или более функциональных активностей нативной формы полипептида согласно вариантам реализации настоящего изобретения.
[00058] В аминокислотные последовательности или нуклеотидные последовательности, кодирующие полипептиды и лизины для применения в способах, описанных в настоящем документе, в том числе в последовательности лизина, приведенные на фигуре 1, или в активные фрагменты или их укороченные варианты можно внести мутации, например, заменить конкретный кодон на кодон, кодирующий другую аминокислоту, заменить аминокислоту на другую аминокислоту или удалить одну или более аминокислоту. Такую мутацию обычно вносят путем изменения минимально возможного количества аминокислот или нуклеотидов. Мутацию-замену этого типа можно внести, заменив аминокислоту в полученном белке неконсервативным образом (например, путем замены кодона аминокислоты, принадлежащей к группе аминокислот определенного размера или обладающей определенными характеристиками, аминокислотой, принадлежащей к другой группе) или консервативным образом (например, путем замены кодона аминокислоты, принадлежащей к группе аминокислот определенного размера или обладающей определенными характеристиками, аминокислотой, принадлежащей к той же группе). Такая консервативная замена обычно ведет к меньшим изменениям структуры и функции полученного белка. Неконсервативная замена с большей вероятностью влияет на структуру, активность или функцию полученного белка. Подразумевается, что настоящее изобретение включает последовательности, содержащие консервативные замены, не оказывающие существенного влияния на активность или характеристики связывания полученного белка.
[00059] У таких мутантов или их вариантов можно прогнозировать наличие функции, или тестировать их на предмет наличия функции или способности уничтожать бактерии, в том числе бактерий Staphylococcus, Streptococcus, Listeria или Enterococcus, и/или наличия активности, сопоставимой с активностью лизина(ов), описанных и явным образом предложенных в настоящем документе. Таким образом, можно внести изменения в последовательность лизина и протестировать мутанты или варианты с изменениями в последовательности с использованием анализов и способов, описанных и приведенных в качестве примера в настоящем документе, в том числе в разделе «Примеры». Специалист в данной области техники на основании доменной структуры лизина(ов), описанного в настоящем документе, может указать одну или более, одну или несколько аминокислот, подходящих для замены, и/или одну или более аминокислот, не подходящих для замены, в том числе обоснованной консервативной или неконсервативной замены.
[00060] Лизин PlySs2 демонстрирует активность и способность уничтожать различные отдельные штаммы и виды грамположительнызх бактерий, в том числе бактерий Staphylococcus, Streptococcus, Listeria или Enterococcus. Особенно важно, что PlySs2 активно уничтожает штаммы Staphylococcus, в том числе Staphylococcus aureus, в частности, как чувствительные, так и устойчивые к антибиотикам штаммы. PlySs2 также активно уничтожает штаммы Streptococcus и демонстрирует особенно эффективное уничтожение штаммов Streptococcus группы А и группы В. Антибактериальная активность лизина PlySs2 отображена ниже в таблице 1 на основании логарифмических оценок способности к уничтожению выделенных штаммов in vitro. Чувствительные бактерии, представленные в настоящем документе, можно использовать в модифицированных способах BMD согласно настоящему изобретению для определения и сравнения значений МИК.
[00061] Термин «содержать» в общем случае используется в смысле «включать», другими словами, допускает наличие одного или более признаков или компонентов.
[00062] Термин "состоящий главным образом из" относится к продукту, в частности, пептидной последовательности с заданным количеством остатков, не являющейся ковалентно присоединенной к более крупному продукту. В случае пептида согласно настоящему изобретению специалисты в данной области техники поймут, что можно учитывать незначительные модификации на N- или С-конце пептида, например, химические модификации концевой области с целью добавления защитной группы и т.п., например, амидирование С-конца.
[00063] Термин "выделенный" («изолированный») относится к состоянию, в котором находятся полипептид(ы)-лизин(ы) согласно настоящему изобретению или нуклеиновая кислота, кодирующая такие полипептиды, в соответствии с настоящим изобретением. Полипептиды и нуклеиновая кислота не буду содержать или практически не будут содержать материал, с которым они ассоциированы в естественном окружении или окружении, в котором происходит их получение (например, культуре клеток), если такое получение осуществляют с помощью технологии рекомбинантных ДНК in vitro или in vivo. Полипептиды и нуклеиновая кислота могут быть включены в состав с разбавителями или адьювантами, и для практических целей могут быть выделенными, например, полипептиды обычно смешивают с полимерами или мукоадгезивными агентами или другими носителями либо, при применении в диагностических и терапевтических целях, с фармацевтически приемлемыми носителями или разбавителями.
[00064] Терапевтические или фармацевтические композиции, содержащие литический(е) фермент(ы)/полипептид(ы) для применения в способах и вариантах применения согласно настоящему изобретению, можно применять в способах или включать в способы, описанные в настоящем документе. Терапевтические или фармацевтические композиции могут содержать один или более литических полипептидов и необязательно содержат природные, укороченные, химерные или перекомпонованные литические ферменты в комбинации с одним или более антибиотиками и, необязательно, в комбинации с подходящими вспомогательными веществами, носителями или основами. Настоящее изобретение включает оценку терапевтических композиций или фармацевтических композиций лизинов, в том числе PlySs2, в комбинации с антибиотиком для применения в уничтожении, смягчении, деколонизации, профилактике или лечении заболеваний, вызванных грамположительными бактериями, в том числе бактериальных инфекций или состояний, имеющих к ним отношение. Настоящее изобретение включает оценку терапевтических композиций или фармацевтических композиций лизинов, в том числе PlySs2, в комбинации с ванкомицином, линезолидом или даптомицином.
[00065] Фермент(ы) или полипептид(ы), включенные в терапевтические композиции, могут представлять собой одну или более или любую комбинацию немодифицированных фаг-ассоциированных литических ферментов, укороченных литических полипептидов, вариантных литических полипептидов и химерных и/или перекомбинированных литических ферментов. Кроме того, для лечения заболевания, вызванного одной и той же бактерией, можно применять различные литические полипептиды, генетически кодируемые различными фагами. Эти литические ферменты также могут представлять собой любую комбинацию «немодифицированных» литических ферментов или полипептидов, укороченных литических полипептидов, вариантных литических полипептидов и химерных и/или перекомбинированных литических ферментов. Литический(е) фермент(ы)/полипептид(ы) в терапевтической или фармацевтической композиции для грамположительных бактерий, в том числе Streptococcus, Staphylococcus, Enterococcus и Listeria, можно применять по отдельности или в комбинации с антибиотиками или, в случае обработки других инвазивных организмов-бактерий, в комбинации с другими фаг-ассоциированными литическими ферментами, специфичными по отношению к другим бактериям-мишеням. Литический фермент, укороченный фермент, вариантный фермент, химерный фермент и/или перекомбинированный литический фермент можно применять в сочетании с холиновым белком. Количество холинового белка также может меняться. В терапевтическую композицию с ферментом(ами) или полипептидом(ами) в присутствии лизостафина или без него можно необязательно включать различные антибиотики. В терапевтическую композицию можно включать более одного литического фермента или полипептида.
[00066] Фармацевтическая композиция также может содержать один или более из модифицированных литических ферментов, в том числе их изозимов, аналогов или вариантов, полученных путем химического синтеза или технологии рекомбинантных ДНК. В частности, модифицированный литический белок можно продуцировать посредством аминокислотной замены, делеции, укорачивания, химеризации, перекомбинирования или их комбинаций. Фармацевтическая композиция может содержать комбинацию одного или более природных литических белков и один или более из укороченных, вариантных, химерных или перекомбинированных литических белков. Фармацевтическая композиция также может содержать пептид или пептидный фрагмент по меньшей мере одного литического белка, происходящего от того же или другого вида бактерий, с необязательным добавлением одного или более из дополняющих агентов, и фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель.
[00067] Терапевтические или фармацевтические композиции могут содержать литический(е) полипептид(ы) в комбинации с различными носителями для лечения заболеваний, вызванных чувствительными грамположительными бактериями. Носитель в соответствующих случаях содержит небольшие количества добавок, например, веществ, повышающих изотоничность и химическую стабильность. Такие материалы нетоксичны для реципиента в применяемых дозировках и концентрациях и включают буферные вещества, например, фосфат, цитрат, сукцинат, уксусную кислоту и другие органические кислоты и их соли; антиоксиданты, например, аскорбиновую кислоту; низкомолекулярные (содержащие менее десяти остатков) полипептиды, например, полиаргинин, или трипептиды; белки, например, сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины; гидрофильные полимеры, например, поливинилпирролидон; глицин; аминокислоты, например, глутаминовую кислоту, аспарагиновую кислоту, гистидин или аргинин; моносахариды, дисахариды и другие углеводы, включая целлюлозу или ее производные, глюкозу, маннозу, трегалозу или декстрины; хелатирующие агенты, например, ЭДТА; сахароспирты, например, маннит или сорбит; противоионы, например, натрия; неионогенные ПАВ, например, полисорбаты, полоксамеры или полиэтиленгликоль (ПЭГ); и/или нейтральные соли. Глицерин (1,2,3-пропантриол) доступен для приобретения в целях фармацевтического применения. ДМСО представляет собой апротонный растворитель с выраженной способностью усиливать проникновение многих местно наносимых лекарственных средств. Носитель-основа также может включать раствор Рингера, буферный раствор и раствор декстрозы, в частности, когда готовят раствор для внутривенного введения.
[00068] Литический фермент/полипептид должен находиться в среде с рН, обеспечивающим активность литического фермента/полипептида. Оптимальную активность литического фермента/полипептида может обеспечивать стабилизирующий буфер. Стабилизирующий буфер также может представлять собой или содержать хелатирующий реагент, например, динатриевую соль этилендиаминтетрауксусной кислоты, а также может содержать фосфатный или цитрат-фосфатный буфер или другой подходящий буфер.
[00069] Термин «агент» означает любую молекулу, включая полипептиды, антитела, полинуклеотиды, химические соединения и низкомолекулярные соединения. В частности, термин «агент» включает такие соединения, как исследуемые соединения, дополнительные соединения или соединения ферментов-лизинов.
[00070] Термин «агонист» относится к лиганду, стимулирующему рецептор, с которым связывается лиганд, в самом широком смысле.
[00071] Термин «анализ» означает любой процесс, используемый для измерения специфического свойства соединения. «Скрининговый анализ» означает процесс, используемый для изучения или выбора соединений из набора соединений на основании их активности.
[00072] Термин «предотвращение» относится к снижению риска возникновения или развития заболевания или нарушения (т.е. подавлению развития по меньшей мере одного из клинических симптомов заболевания) у субъекта, который может подвергаться воздействию болезнетворного агента или быть предрасположен к заболеванию, до начала заболевания.
[00073] Термин «профилактика» связан с термином «предотвращение» и включен в него, и относится к мере или процедуре, целью которой является предотвратить, а не лечить или излечивать заболевание. Неограничивающие примеры профилактических мер могут включать введение вакцин, введение низкомолекулярного гепарина пациентам в стационаре, подвергающимся риску тромбоза вследствие, например, иммобилизации; и введение средства против малярии, например, хлорохина, заранее до посещения географической области, где малярия является эндемичным заболеванием или где высок риск контакта с малярией.
[00074] «Терапевтически эффективное количество» означает количество лекарственного средства, соединения, антимикробного агента, антитела, полипептида или фармацевтического агента, которое должно вызвать биологическую или медицинскую реакцию у субъекта, ожидаемую врачом или другим практикующим медицинским работником. В частности, считается, что термин «эффективное количество» по отношению к инфекциям, вызванным грамположительными бактериями, и росту грамположительных бактерий включает эффективное количество соединения или агента, которое должно вызвать приблизительно биологически значимое количественное или качественное ослабление инфекции, вызванной грамположительными бактериями, в том числе за счет бактерицидного и/или бактериостатического действия. Фраза «терапевтически эффективное количество» используется в настоящем документе для обозначения количества, достаточного для профилактики, и, предпочтительно, снижения по меньшей мере на приблизительно 30 процентов, более предпочтительно - по меньшей мере на 50 процентов, наиболее предпочтительно - по меньшей мере на 90 процентов, клинически значимого изменения роста или количества инфекционных бактерий, или другой особенности патологического процесса, например, лихорадки или повышенного количества лейкоцитов, которая может реагировать на его присутствие и активность.
[00075] Термин «лечение» любого заболевания или инфекции в одном варианте реализации относится к облегчению заболевания или инфекции (т.е. блокировке заболевания или роста инфекционного агента или бактерии или снижению проявления, степени или тяжести по меньшей мере одного из его клинических симптомов). В еще одном варианте реализации термин «лечение» относится к облегчению по меньшей мере одного физического параметра, которое может быть незаметно для субъекта. В еще одном варианте реализации термин «лечение» относится к модификации заболевания или инфекции на физическом (например, путем стабилизации заметного симптома), физиологическом (например, путем стабилизации физического параметра) или обоих уровнях. В дополнительном варианте реализации термин «лечение» имеет отношение к замедлению прогрессирования заболевания или ослаблению инфекции.
[00076] Термины «грамположительные бактерии», «грамположительный» и любые их варианты, не указанные конкретно, могут использоваться в настоящем документе на равных основаниях, и на протяжении всей заявки и формулы изобретения относятся к грамположительным бактериям, которые известны или могут быть выявлены по присутствию определенных характеристик клеточной стенки и/или клеточной мембраны и/или посредством окрашивания по Граму. Грамположительные бактерии известны и легко определяются; их можно выбрать, в числе прочего, из родов Listeria, Staphylococcus, Streptococcus, Enterococcus, Mycobacterium, Corynebacterium и Clostridium, включая их всевозможные известные или неизвестные виды или штаммы. В одном аспекте настоящего изобретения грамположительные бактерии, чувствительные к лизину PlyS, включают бактерии, выбранные из одного или более представителей Listeria, Staphylococcus, Streptococcus и Enterococcus.
[00077] Грамположительные бактерии окружены клеточной стенкой, содержащей полипептиды и полисахарид. Грамположительные бактерии включают роды Actinomyces, Bacillus, Listeria, Lactococcus, Staphylococcus, Streptococcus, Enterococcus, Mycobacterium, Corynebacterium и Clostridium, но не ограничиваются ими. Обладающие медицинским значением виды включают Streptococcus pyogenes, Streptococcus pneumoniae, Staphylococcus aureus и Enterococcus faecalis. Виды Bacillus, являющиеся спорообразующими бактериями, вызывают сибирскую язву и гастроэнтерит. Спорообразующие виды Clostridium вызывают за ботулизм, столбняк, газовую гангрену и псевдомембранозный колит. Виды Corynebacterium вызывают дифтерию, а виды Listeria - менингит.
[00078] Термин «бактерицидный» относится к способности уничтожать клетки бактерий.
[00079] Термин «бактериостатический» относится к способности ингибировать рост бактерий, в том числе ингибировать растущие клетки бактерий.
[00080] Фраза «фармацевтически приемлемый» относится к молекулярным структурам и композициям, которые физиологически переносятся и при введении человеку обычно не вызывают аллергических или аналогичных нежелательных реакций, например, расстройства желудка, головокружения и т.п.
[00081] Термин "восстановитель" относится к и включает вещество, вызывающее восстановление другого вещества и окисляющееся в ходе этого процесса. Восстановитель можно использовать для поддержания ферментов или белков в восстановленном состоянии и предотвращения их окисления. В одном аспекте восстановитель поддерживает стабильность полипептида или фермента, в том числе при хранении в течение определенного времени или в различных условиях.
[00082] Специалисту в данной области техники должны быть известны общепризнанные восстановители, в частности, применяемые и общепринятые для применения при анализах, в том числе клинических анализах. Примеры восстановителей включают дитиотрейтол (ДТТ), гидрохлорид трис(2-карбоксиэтил)фосфина (ТСЕР), Алюмогидрид лития (LiAlH4), Боргидрид натрия (NaBH4), диборан, бета-меркаптоэтанол (БМЭ) и Гидрид диизобутилалюминия (DIBAL-H).
[00083] Жидкая среда или среда, подходящая для использования и применения в способах и анализах согласно настоящему изобретению, включает жидкую среду или среду для роста и поддержания бактерий, общепринятую и известную специалисту в данной области техники, или любую среду общего назначения, которую можно применять при культивировании широкого спектра микроорганизмов и включает жидкую среду или среду, используемую и/или описанную в настоящем документе, но не ограничивается ими Типичная жидкая среда или среда включает жидкую среду с откорректированным катионным составом, подходящую для количественных процедур анализа чувствительности к антимикробным средствам.
[00084] Настоящее изобретение можно лучше понять, обратившись к следующим неограничивающим примерам, приведенным в качестве примеров реализации изобретения. Следующие примеры приведены с целью более полной иллюстрации предпочтительных вариантов реализации изобретения, их никоим образом не следует интерпретировать как ограничивающие сущность настоящего изобретения.
ПРИМЕР 1
[00085] Лизины представляют собой антимикробные ферменты, предлагаемые в качестве новой альтернативы общепринятым антибиотикам. Лизины представляют собой белки, кодируемые бактериофагами и используемые для уничтожения бактерий в естественных условиях. В биосфере существует приблизительно 1031 фагов, и фаги ежедневно уничтожают приблизительно одну треть всех бактерий с использованием семейства белков-лизинов - основного средства уничтожения бактерий-хозяев (Hatful GF (2015) J Virol 89(16):8107-8110). Очищенные лизины демонстрируют явление, называемое "лизис извне" (Fischetti VA et al (20016) Nature Biotechnology 24:1508-1511) и могут быть получены с помощью рекомбинантных способов синтеза. Очищенные лизины демонстрируют мощное бактериолитическое действие при контакте за счет гидролиза клеточной стенки. Полипептиды-лизины обычно представляют собой белки с молекулярной массой 20-30 кДа.
[00086] Лизин PlySs2 (также обозначаемый как CF-301) представляет собой первый и единственный лизин, допущенный к клиническим исследованиям на людях в США. FDA присвоило CF-301 статус ускоренного рассмотрения при бактериемии Staphylococcus aureus, исследования I фазы были завершены в 2015 г. PlySs2 изначально происходит из профага, содержавшегося в Streptococcus suis у свиней. Продемонстрировано, что лизин уничтожает различные штаммы клинически значимых грамположительных бактерий, в том числе штаммы, устойчивые к антибиотикам, например, штаммы Staphylococcus aureus, устойчивые и чувствительные к метициллину и ванкомицину (MRSA, MSSA, VRSA, VISA), устойчивый к даптомицину Staphylococcus aureus (DRSA) и устойчивый к линезолиду Staphylococcus aureus (LRSA). PlySs2 представляет собой уникальный лизин в том отношении, что он обладает способностью уничтожать сравнительно широкий, но определенный спектр видов бактерий, а также может уничтожать многие виды бактерий, в частности, грамположительные бактерии, в том числе штаммы бактерий Staphylococcus, Streptococcus, Enterococcus и Listeria, в то же время являясь неактивным против естественной микрофлоры кишечника.
[00087] PlySs2/CF-301 для клинического применения рекомбинантно продуцировали в Е. coli; он был активен в широком диапазоне рН (рН 6-9,7) и температур (16-55°С) (Gilmer et al (2013) Antimicrob Agents Chemother 57:2743-2750; Scuch et al (2014) J Infect Dis 209:1469-78). Он был активен в различных биологических жидкостях человека, в том числе крови, сыворотке, плазме, слюне, синовиальной жидкости, легочном сурфактанте и бронхиальном лаваже. Аминокислотная последовательность и структура PlySs2 (CF-301) приведена на фигуре 1.
[00088] Мишенью PlySs2 (CF-301) является клеточная стенка чувствительных бактерий, в том числе Staphylococcus aureus. Он представляет собой цистеин-гистидиновую аминопептидазу, мишенью которой является связь D-Ala-L-Gly пептидогликана клеточной стенки и которая расщепляет связь между остатками D-аланина (основной пептид) и L-глицина (поперечный мостик) клеточной стенки (фигура 2). Лизис бактерии происходит быстро (фигура 2С). CF-301 обладает определенной видоспецифичностью и уничтожает устойчивые к антибиотикам бактерии, в том числе MSSA, MRSA, VRSA, DRSA и LRSA - бактерии, устойчивые к антибиотикам метициллину, ванкомицину, даптомицину, линезолиду (Schich R et al (2014) J Infect Dis 209:1469-1478). Уничтожение является быстрым и активным, наблюдается профиль низкой устойчивости по отношению к литическому пептиду. CF-301 разрушает биопленки и уничтожает стойких бактерий. Наблюдается синергия с антибиотиками.
[00089] Для получения воспроизводимой и согласованной оценки действия литического полипептида на бактерии, в том числе в условиях клинического исследования, авторы изобретения выполнили оценку различных способов и разработали способ микроразбавления в жидкой среде (BMD), являющийся модификацией способа BMD в соответствии со стандартами, описанными в документе института клинических и лабораторных стандартов (CLSI) М07-А9 (Methods for dilutional antimicrobial sensitivity tests for bacteria that grow aerobically. Volume 32 (Wayne [PA]: Clinical and Laboratory Standards Institute [US], 2012).
[00090] Обнаружено, что стандартную методологию CLSI необходимо модифицировать для решения проблем с определением МИК литических полипептидов (в частности, PlySs2 (CF-301)), в том числе следующих трех основных проблем: 1) эффекта переноса, 2) явного отклонения от результатов анализа чувствительности в крови, сыворотке или плазме человека и 3) потерю активности фермента в панелях для разбавления замороженных препаратов. После интенсивной разработки анализа был разработан модифицированный способ BMD, позволявший выполнять точный, воспроизводимый и надежный анализ чувствительности. Новый способ в максимально возможной степени соответствует стандартам CLSI и оптимизирован для применения в обычной клинической лаборатории.
[00091] Анализ чувствительности к литическому полипептиду, например, PlySs2 (CF-301), представляет собой сложную задачу. PlySs2/CF-301 представляет собой крупный бактериолитический фермент, отличающийся от антибиотиков по физическим характеристикам, механизму действия и метаболизму. Точный анализ чувствительности могут затруднять несколько факторов: Размер (26 кДа) и заряд соединения (pI=9,2) ограничивают диффузию через твердые поверхности; тиоловая группа (остаток цистеина в активном центре) может окисляться и инактивироваться (период полужизни в МНВ составляет ~5 ч); суммарный положительный заряд опосредует "прилипание" к полистироловым поверхностям (в меньшей степени, чем к полипропилену); эффект переноса (или Игла) для ~70% штаммов S. aureus при использовании микроразбавления в жидкой среде (BMD); МИК в СА-МНВ (МИК90=64 мкг/мл) и крови/плазме человека (МИК90=1 мкг/мл) не совпадают. Таким образом, ожидается, что альтернативный способ BMD позволит выполнять точный анализ чувствительности к литическим полипептидам, например, PlySs2/CF-301.
[00092] Примеры проблем, связанных с эффектом переноса и влиянием крови в стандартных анализах BMD согласно CLSI показаны на фигуре 3. Стандартный анализ BMD S. aureus АТСС 700699 выполнили в СА-МНВ (фигура 3А) и крови человека (фигура 3В). Наблюдали эффект переноса, или Игла, который искажает точность определения МИК в стандартной жидкой среде Мюллера-Хинтона II (MHBII) (фигура 3А). Хотя значение МИК в этих стандартных условиях составляло 64 мкг/мл, наблюдались эффекты переноса и Игла до 512 мкг/мл. Обнаружено, что CF-301 значительно более активен в крови, плазме и сыворотке человека, чем в MHBII (фигура 3В). Значение МИК в крови человека составляет 1 мкг/мл. Таким образом, продемонстрировано, что MHBII недостаточно эффективна для анализа чувствительности и что внесение добавок или модификация стандартного анализа микроразбавления в жидкой среде может помочь достичь значений МИК, аналогичных значениям в биологических жидкостях человека.
[00093] Вначале разработали два модифицированных способа BMD для анализа PlySs2/CF-301. При первом способе основные модификации состояли в использовании полипропиленовых планшетов и добавлении 1 мМ ДТТ в MHBII. ДТТ (DL-дитиотрейтол) представляет собой реагент, широко используемый в молекулярной биологии для поддержания ферментов в восстановленном состоянии. С использованием этого временного способа исследовали 223 современных клинических штаммов MSSA и MRSA и определили, что МИК90=8 мкг/мл (диапазон = 1-16 мкг/мл). Эта процедура представляла собой временное решение из-за использования полипропилена, по-прежнему наблюдалось расхождение со значениями МИК в крови человека и проблемы с замороженными панелями.
[00094] Для определения следующего, лучшего способа использовали полистироловые планшеты и СА-МНВ. Выполнили скрининг панели из 30 штаммов S. aureus с использованием различных изменений процедуры и добавок (заведомо влияющих на характеристики AST) с целью поддержания активности, аналогичной активности в крови человека, и возможности использования замороженных панелей. Выполнили следующие оценки:
Сыворотка крови различных животных (5-50%) - собаки, кролика, лошади, мыши
Гемолизированная кровь лошади (1-5%)
ДТТ (0,05-5 мМ)
Сыворотка животных (5-50%) + ДТТ (0,5 мМ)
Твин-80 (0,002%)
БСА (0,05-0,5%)
NaCl (1-5%)
БСА 0,1%, NaCl 2%, перемешивание при 200 об/мин2
БСА 0,1%, NaCl 2%
CaCl2 (до 50 мкг/мл)
MgCl2 (до 50 мкг/мл)
CaCl2 (до 50 мкг/мл) + MgCl2 (до 50 мкг/мл)
ТСЕР (0,01-5 мМ)
различные жидкие среды и среды - LB, TSB, BHI, 
МНВ, 
МНВ
изменения рН, инокулята и состава атмосферы
[00095] Результаты изменений процедуры представлены ниже в таблице 2.
*Различается при использовании свежеразбавленных панелей CF-301 и панелей CF-301 для разбавления после замораживания-размораживания
[00096] На основании вышеописанных оценок определили добавки для нового способа BMD. Использовали сыворотку крови лошади и восстановитель (ДТТ), позволявшие добиться уровня активности, близкого к активности в сыворотке крови человека, и допускавшие использование замороженнных панелей полипептида-лизина (CF-301) для разбавления. В частности, добавление 25% сыворотки крови лошади и 0,5 мМ ДТТ позволили получить удовлетворительные результаты МИК. Значимые результаты анализа чувствительности набора из 30 штаммов S. aureus приведены в табличном виде на фигуре 4. При замораживании-размораживании использовали стандартную схему 2-кратного разбавления CF-301 в указанной среде с замораживанием при -70°С на 24 ч перед размораживанием, добавлением бактерий и определением МИК. Использованная методология BMD подробно описана в процедуре, приведенной ниже.
[00097] Для проверки способа с сывороткой крови лошади/ДТТ выполнили оценку свежих и размороженных панелей CF-301 для разбавления с использованием различных условий BMD и источников материалов по отношению к 25 штаммам S. aureus. Использовали следующие модификации условий и источников:
Анализ в течение 5 дней подряд, выполненный 2 различными лицами
Различные источники сыворотки крови лошади (Sigma, Corning, Gibco, BioreclamationIVT, Mediatech, RAMBIO, ATCC, Central Biomedia, Lampire)
Различные источники порошкообразной CA-MHB/MHB II (BD и Sigma) и готовой жидкой МНВ II (BD и Teknova)
Различные источники ДТТ (Sigma (жидкость, порошок), G-Biosciences)
Температуры роста 30-37°С в воздухе окружающей среды, 37°С в 5% CO2, встряхивание планшета с частотой до 200 об/мин
Определили конечный/оптимальный диапазон рН среды 7,4±0,6
Конечный/оптимальный диапазон количества инокулята (КОЕ/мл) 5×105±1-log10
[00098] Некоторые типичные результаты оценки в зависимости от источника и условий представлены ниже в таблицах 3, 4 и 5. Исследование по сравнению анализа BMD S. aureus АТСС 29213 и Е. faecalis АТСС 29212 в течение пяти дней подряд с использованием сыворотки крови лошади из 14 различных источников представлено на фигуре 5.
[00099] Все протестированные модификации позволили получить ≤2-кратную изменчивость значений МИК50/90, равных 0,5/1 мкг/мл (диапазон = 0,25-2). Кроме того, более продолжительную инкубацию панелей CF-301 при -80°С не оказывало значимого эффекта (при анализе вплоть до 365 дней на данный момент) (таблица 6). Динамика активности замороженных образцов представлена на фигуре 6.
[000100] Анализ МИК при использовании только MHBII, только 100% сыворотки крови лошади и в BHBII с добавлением сыворотки крови лошади и ДТТ выполнили на штамме MRSA АТСС 29213 при различных условиях (фигура 7). Только MHBII позволила получить МИК, равную 16 мкг/мл, с легким эффектом переноса. Анализ BMD в 100% сыворотке крови человека позволил получить МИК=1 мкг/мл; в MHBII с добавлением 25% сыворотки крови лошади, 0,5 мМ ДТТ МИК была близка к значению в сыворотке человека и составляла 0,5 мкг/мл.
[000101] Аналогичный анализ МИК для S. aureus АТСС 70069 с использованием нового способа в СА-МНВ с добавлением 0,25% сыворотки крови лошади и 0,5 мМ ДТТ не демонстрировал эффекта переноса или эффекта Игла и позволил получить значение МИК, равное 1 мкг/мл, как в сыворотке крови человека (фигура 8).
[000102] Для дальнейшей оценки способа BMD с использованием MHBII с добавлением 25% сыворотки крови лошади, 0,5 мМ ДТТ выполнили оценку широкого набора клинических изолятов MSSA и MRSA и сравнение определения МИК со 100% сывороткой крови человека. Данный анализ распространили на различные грамположительные патогенные организмы, ранее демонстрировавшие чувствительность к лизину PlySs2 (CF-301) (Schich et al (2014) J Infect Dis 209:1469-1478), в том числе Staphylococcus epidermidis, Streptococcus pyogenes, Streptococcus agalactiae, Streptococcus pneumoniae и Enterococcus faecalis. Результаты показаны на Фигуре 9. CF-301 поддерживал свой спектр активности при использовании новой методологии.
[000103] При модифицированном способе BMD выполнили оценку стандартного антибиотика - ванкомицина. Значения МИК50, МИК90 и диапазона были эквивалентны при использовании стандартной СА-МНВ и СА-МНВ с добавлением сыворотки крови лошади и ДТТ (фигура 10).
[000104] В рамках попыток дальнейшей оценки нового способа BMD выполнили анализ с изменением места проведения анализа, включая лабораторию автора изобретения и дополнительный адрес в институте клинической микробиологии (CMI; Уилсонвилл, штат Орегон, США), для подтверждения воспроизводимости результатов у других исследователей. Штаммы, используемые для оценки КК, включали S. aureus АТСС 29213 и Е. faecalis АТСС 29212. Анализ BMD с использованием МНВ II с 25% сывороткой крови лошади и 0,5 мМ ДТТ выполняли в течение 5 дней по отношению к S. aureus АТСС 29213 и Е. faecalis АТСС 29212 (фигура 11). За пять дней подряд проанализировали пять повторностей на штамм. Анализ повторяли в течение 5 дней подряд в различных лабораториях.
[000105] Эксперименты по поиску диапазона выполнили с оценкой различного добавляемого количества сыворотки и восстановителя. Результаты оценки добавления сыворотки крови лошади в диапазоне от 12,5% до 30% и оценки ДТТ в диапазоне от 0 до 1 мМ изображены на фигуре 12. Условия были основаны на способности воспроизводить активность, подобную активности в сыворотке человека. При анализе с сывороткой для всех условий использовали один и тот же набор из 30 штаммов S. aureus. При анализе с ДТТ для указанного диапазона условий использовали единственный штамм S. aureus. Указаны результаты оценки качества. Концентрации добавляемой сыворотки крови лошади от 20% до 30% подходили для целей исследования. 12,5% сыворотка крови лошади давала неудовлетворительные результаты. Подходящие концентрации ДТТ составляли от 0,25 до 1 мМ, причем наиболее идеальными были концентрации 0,5 мМ и 1 мМ из-за эффекта переноса или высоких значений МИК или невозможности замораживания при концентрации 0,25 мМ и менее. В исследованиях также использовали альтернативный восстановитель ТСЕР, который позволил получить результаты, аналогичные ДТТ.
[000106] В целом для точного анализа литических полипептидов, например, в частности, PlySs2 (CF-301) с применением BMD in vitro требуется применение двух добавок: сыворотки и восстановителя. В данном случае оценка BMD с добавлением сыворотки крови лошади и ДТТ из различных источников позволила получить точные результаты для различных штаммов бактерий, в том числе различных штаммов S. aureus и Е. faecalis. Добавление сыворотки крови млекопитающих, в частности, сыворотки крови лошади, устраняло эффект переноса и позволяло получить количественную оценку активности, сопоставимую с активностью, наблюдаемой в крови, сыворотке или плазме крови человека. Добавление восстановителя, например, в частности, ДТТ, стабилизировало лизин, предотвращало его окисление и позволяло использовать панели замороженного литического полипептида для разбавления. Этот модифицированный способ BMD является точным, воспроизводимым и надежным.
[000107] Более подробное описание типичного способа и процедуры модифицированного анализа BMD приведено ниже.
[000108] Процедура микроразбавления в жидкой среде:
[000109] Общая процедура выполнения анализа чувствительности с микроразбавлением в жидкой среде приведена в данном разделе. Данная процедура является модификацией технологии CLSI (документ М07-А9, 2015) и основана на способе, описанном Wiegand et al., 2008 (см. приложение D, раздел D1) для оценки МИК антимикробных пептидов с большим зарядом.
[000110] Подготовка разбавленного литического полипептида к анализу: Литический полипептид (PlySs2) предоставлен в виде замороженного исходного раствора, суспендированного в буфере Демо (Demo) в концентрации 10,74 мг/мл. Буфер Демо представляет собой дигидрат дигидрофосфата натрия (7,67 мМ), дигидрат гидрофосфата натрия (7,33 мМ) и хлорид натрия (150 мМ) при рН 7,22. Для получения разведений PlySS2 в качестве разбавителя использовали МНВ II с добавлением 25% сыворотки крови лошади и 0,5 мМ ДТТ. Каждый штамм или изолят исследовали в трех повторах, по два штамма или изолята на планшет.
1. Разморозьте замороженный исходный раствор полипептида лизина (например, CF-301) путем суспендирования в течение 5 минут на водяной бане с температурой 24°С. Размороженный образец храните на льду до использования в течение не более 30 минут. Неиспользованный полипептид (CF-301) выбросьте.
2. Выберите желательный диапазон двукратных разведений полипептида-лизина (например, CF-301), необходимом для анализа. Для большинства штаммов Staphylococcus aureus этот диапазон будет начинаться с конечной желательной концентрации 8 или 16 мкг/мл. Для некоторых штаммов Staphylococcus aureus с промежуточной устойчивостью к ванкомицину этот диапазон будет начинаться с конечной желательной концентрации 512 мкг/мл.
3. Приготовьте основные растворы разведений лизинового полипептида (например, CF-301) вдвое больше желательной конечной концентрации каждого разведения и залейте в соответствующие лунки в столбцах 1-10 по 0,05 мл. Пипеткой внесите по 0,1 мл жидкой среды в лунки столбца 12 для использования в качестве контроля стерильности и по 0,05 мл в лунки столбца 11 для использования в качестве контроля роста.
[000111] Подготовка и внесение инокулята: Для стандартизации плотности инокулята для анализа чувствительности использовали стандарт эквивалентной мутности по Мак-Фарланду (Remel, номер в каталоге R20421). В день каждого анализа используют штаммы для контроля качества, например, следующие штаммы для контроля качества: S. aureus АТСС 29213 (CFS-581), S. aureus АТСС 43300 (CFS-553), и Е. faecalis АТСС 29212 (CFS-806).
1. Подготовьте инокулят, путем непосредственного приготовления суспензии отдельных колоний, отобранных с чашек с 18-24-ч кровяным агаром, в жидкой среде. Суспензию в жидкой среде можно получить в жидкой среде Мюллера-Хинтона BBL™, в 2-мл пробирках (BD Diagnostic Systems, номер в каталоге 296164).
2. Откорректируйте суспензию для получения эквивалента мутности, соответствующего стандарту 0,5 по Мак-Фарланду, с использованием денситометра DEN-1 производства Grant Instruments.
3. В течение 15 минут после получения разбавьте жидкую среду скорректированным инокулятом таким образом, чтобы после внесения инокулята каждая лунка содержала конечную концентрацию приблизительно 5×105 КОЕ/мл. Поскольку объем инокулята в каждой лунке 1-11 столбцов составлял 0,05 мл, суспензия 0,5 по Мак-Фарланду следует разбавить в соотношении 1:100 с получением концентрации 1×106 КОЕ/мл. При внесении 0,05 мл этой суспензии в лунки титрационного микропланшета (уже содержащие 0,05 мл) конечная анализируемая концентрация бактерий составляет приблизительно 5×105 КОЕ/мл
4. В течение 15 минут после стандартизации инокулята, как описано выше, в каждую лунку 1-11 столбцов внесите 0,05 мл инокулята. После этого конечный объем в каждой лунке составит 0,1 мл.
5. Выполните проверку чистоты суспензии инокулята посредством субкультивирования аликвоты на чашке с кровяным агаром при одновременной инкубации.
[000112] Инкубация: В течение 15 минут после внесения инокулята инокулированные лотки инкубируют при 37°С в течение 16-18 часов в инкубаторе с обычным воздухом окружающей среды. Рекомендуется не ставить планшеты в штабеля высотой более чем четыре планшета.
[000113] Определение конечных точек МИК:
1. Сравните значение роста в лунках, содержащих CF-301 со значением в лунках для контроля роста. Чтобы анализ можно было считать действительным, в лунках для контроля роста должен наблюдаться приемлемый рост. Значение МИК определяют визуально.
2. В качестве независимой регистрации считывают и сохраняют значения OD600 (оптической плотности на 600 нм) для лунок в каждом лотке, определяя его на планшетном ридере Molecular Devices SpectraMax М3.
[000114] Среда и добавки
[000115] Добавки
Основной раствор (1 М) DL-дитиотрейтола (ДТТ) из порошка
1. 1,5 г ДТТ растворяют в 1 мл H20 (сверхчистая дистиллированная вода без содержания ДНКазы/РНКазы)
2. Доводят объем до 10 мл дистиллированной водой и стерилизуют, пропуская через 0,22-мкм фильтр
3. Раствор готовят в день использования (не хранят и не используют повторно)
Раствор DL-дитиотрейтола (ДТТ) (1 M в Н20)
1. Асептически откывают стеклянный флакон и отбирают соответствующее количество
2. Раствор готовят в день использования (не хранят и не используют повторно)
Сыворотка крови лошади (100%)
1. Замороженную сыворотку крови лошади размораживают в течение ночи при 4°С или путем инкубации в течение 1 ч при 24°С
2. Асептически добавляют соответствующее количество сыворотки в автоклавированную и охлажденную среду МНВ II
3. Хранят в замороженном виде при -20°С в виде аликвот по 50 мл
[000116] Среда с агаром
Трипсиновый соевый агар с 5% крови овцы
Готовые чашки с трипсиновым соевым агаром (с добавлением 5% крови овцы) получают из коммерческого источника
[000117] Жидкая среда
Жидкая среда Мюллера-Хинтона с откорректированным катионным составом
Обезвоженную среду Мюллера-Хинтона II (с откорректированным катионным составом) получают из коммерческого источника.
Эта форма должна содержать 20-25 мг Са2+/л и 10-12,5 мг Mg2+/л.
1. МНВ II готовят в точном соответствии с рекомендациями производителя, автоклавируют, охлаждают до 55°С в течение 1 часа, стерилизуют фильтрацией, пропуская через мембрану с размером пор 0,22 мкм и охлаждают в течение ночи при 2-8°С.
2. Проверьте рН. Конечный рН должен был составлять 7,2-7,4.
3. Хранить при 2-8°С в темном месте в течение не более 1 недели.
Жидкая среда Мюллера-Хинтона с откорректированным катионным составом (СА-МНВ) с 25% сыворотки крови лошади и 0,5 мМ ДТТ
1. Жидкую среду Мюллера-Хинтона с откорректированным катионным составом готовят в соответствии с описанием в разделе В3.1.
2. После охлаждения среды в течение ночи при 2-8°С на каждые необходимые 100 мл к 75 мл среды добавляют 25 мл крови лошади. Получение крови лошади описано в разделе В1.2.
3. Аккуратно перемешивают, вращая сосуд.
4. После перемешивания добавляют 0,05 мл основного 1 М раствора ДТТ на каждые необходимые 100 мл жидкой среды с 25% сыворотки крови лошади. Приготовление ДТТ см. в разделах В1.1 или В1.2 в зависимости от источника ДТТ.
5. Конечный рН должен составлять 7,4.
6. Свежую среду готовят только в день использования. Среду не не хранят и не используют повторно.
[000118] Реагенты и оборудование
[000119] Среда для роста бактерий
Жидкая среда Мюллера-Хинтона II BBL™ с откорректированным катионным составом, стерилизованная автоклавированием (BD Diagnostics, номер в каталоге 212322, номер партии 5257869, срок годности 31.05.2019)
Жидкая среда Мюллера-Хинтона 2 с откорректированным катионным составом, стерилизованная автоклавированием (Sigma-Aldrich, номер в каталоге 90922, номер партии BCBR3303V, срок годности 11.2020)
Жидкая среда Мюллера-Хинтона II BBL™ с откорректированным катионным составом, 400 мл, стерильная (BD Diagnostics, номер в каталоге 297963, номер партии 6014547, срок годности 12.01.2017)
Жидкая среда Мюллера-Хинтона II с откорректированным катионным составом, 1000 мл, стерильная (Teknova, номер в каталоге М5860, номер партии М586012В1601, срок годности 09.12.2016)
Чашки с соевым агаром Trypticase™ с 5% кровью овцы (TSA II) (BD Diagnostics, номер в каталоге 221239, номер партии 6049996, срок годности 10.06.2016)
[000120] Препараты крови животных и человека
Сыворотка крови лошади, донорский табун, стерилизованная фильтрацией (Sigma-Aldrich, номер в каталоге Н1270, номер партии 15G382, срок годности 6.2016, хранить в замороженном виде при -20°С)
Сыворотка крови лошади, стерилизованная фильтрацией (BioreclamationIVT, номер в каталоге HSESRM, номер партии HSE1225, срок годности 10.2016, хранить в замороженном виде при -20°С)
Сыворотка крови лошади новозеландского происхождения, донорский табун, стерилизованная фильтрацией (Gibco, номер в каталоге 16050-122, номер партии 1671315, срок годности 2.2019, хранить в замороженном виде при -20°С)
Сыворотка крови лошади-донора из США, стерилизованная фильтрацией (Corning, номер в каталоге 35-030-CV, номер партии 35030105, срок годности 7.2018, хранить в замороженном виде при -20°С)
Сыворотка крови лошади-донора из США, стерилизованная фильтрацией (Sigma-Aldrich, номер в каталоге 12449С, номер партии 14А277, срок годности 28.02.2018, хранить в замороженном виде при -20°С)
Сыворотка крови человека (мужчины) АВ-плазма, из США, стерилизованная фильтрацией (Sigma-Aldrich, номер в каталоге SLBN4664V, срок годности 4.2018, хранить в замороженном виде при -20°С)
Объединенная сыворотка крови человека (здоровых мужчин) АВ-сыворотка, стерилизованная фильтрацией (Innovative Research Inc., номер в каталоге IPLA-SERAB, номер партии 19799, хранить в замороженном виде при -20°С)
Объединенная сыворотка крови человека (здоровых мужчин) с цитратом Na в качестве антикоагулянта, стерилизованная фильтрацией (Innovative Research Inc., номер в каталоге IPLA-N, номер партии 18944, хранить в замороженном виде при -20°С)
Сыворотка крови кролика из США, стерилизованная фильтрацией (Sigma-Aldrich, номер в каталоге R7136, номер партии 13Е108, срок годности 5.2017, хранить в замороженном виде при -20°С
Сыворотка крови собаки бигль категории Innovative из США (Innovative Research Inc., номер в каталоге IBG-SER, номер партии 17654, срок годности 6.2018, хранить при -20°С)
Гемолизированная кровь лошади Remel™ (Thermo Scientific, № в каталоге R54072, хранить в замороженном виде при -20°С)
[000121] Химические реагенты
Раствор DL-дитиотрейтола, 1 M в H2O (Sigma-Aldrich, номер в каталоге 646563-10X.5ML, номер партии MKBW5575V, хранить в невскрытом виде при 24°С)
DL-дитиотрейтол BioUltra для молекулярно-биологических исследований, ≥99,5% (RT) (Sigma-Aldrich, номер в каталоге 43815-25G, номер партии BCBBD7009V, хранить при 2-8°С)
DL-дитиотрейтол (G-Biosciences, номер в каталоге RC-046, номер партии 151106, хранить при 2-8°С)
Раствор гидрохлорида трис(2-карбоксиэтил)фосфина, 0,5 М, рН 7,0 (Sigma-Aldrich, номер в каталоге 646547-10X1ML, номер партии MKBW8503V, хранить в невскрытом виде при 24°С)
TWEEN® 80 (Sigma-Aldrich, номер в каталоге P4780-100ML, номер партии MKBW2896V, хранить при 24°С)
Хлорид натрия (NaCl) (Fisher BioReagents, номер в каталоге ВР358-10, номер партии 150661, хранить при 24°С)
Хлорид кальция (Fisher Bioreagents, номер в каталоге С77-212, номер партии 110651, хранить при 24°С)
Хлорид магния, безводный, ≥98% (Sigma-Aldrich, номер в каталоге M8266-100G, номер партии 120M0094V, хранить при 24°С)
Бычий сывороточный альбумин, лиофилизированный порошок, ≥96% (Sigma-Aldrich, номер в каталоге А2153, номер партии SLBL5462V, хранить при 2-8°С)
[000122] Материалы и оборудование
96-луночные планшеты для культивирования клеток Falcon®, полистироловые, стерильные, с u-образным дном, с крышкой для снижения испарения (Corning, номер в каталоге 351177, номер партии 6026023)
Жидкая среда Мюллера-Хинтона BBL™, 2-мл пробирки (BD Diagnostic Systems, номер в каталоге 296164, номер партии 6054984)
Настольный денситометр DEN-1 (Grant Biosciences, номер в каталоге DEN-1, номер партии 050102-1111-0426)
Многорежимный микропланшетный ридер SpectraMax М3 (Molecular Devices Inc.)
[000123] ЛИТЕРАТУРА
1. Wiegand et al. 2008. Agar and broth dilution methods to determine the minimal inhibitory concentration (MIC) of antimicrobial substances. Nature Protocols. 3:163-175.
2. Gilmer et al. 2013. Novel Bacteriophage Lysin with Broad Lytic Activity Protects against Mixed Infection by Streptococcus pyogenes and Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 57:2743-2750.
3. Schuch et al. 2014. Combination Therapy With Lysin CF-301 and Antibiotic Is Superior to Antibiotic Alone for Treating Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus-Induced Murine Bacteremia. The Journal of Infectious Diseases. 209:1469-78.
4. Hatful G. 2015. Dark Matter of the Biosphere: the Amazing World of Bacteriophage Diversity. Journal of Virology. 89:8107-10.
5. Fischetti, V.A., Nelson, D. & Schuch, R. 2006. Reinventing phage therapy: are the parts greater than the sum? Nature Biotechnology. 24:1508-11.
6. Kusuma & Kokai-Kun. 2005. Comparison of Four Methods for Determining Lysostaphin Susceptibility of Various Strains of Staphylococcus aureus. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 49:3256-63.
7. Methods for dilution antimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically. Vol. 32 (Clinical and Laboratory Standards Institute (US), Wayne (PA), 2012). Clinical Microbiology Procedures Handbook 3rd Ed. Washington DC, (ASM Press, 2010).
8. Fischetti, V.A. Bacteriophage lysins as effective antibacterials. Current opinion in microbiology 11, 393-400 (2008).
9. Fenton, M., Ross, P., McAuliffe, O., O'Mahony, J. & Coffey, A. Recombinant bacteriophage lysins as antibacterials. Bioengineered Bugs 1, 9-16 (2010).
10. Nelson, D., Loomis, L. & Fischetti, V.A. Prevention and elimination of upper respiratory colonization of mice by group A streptococci by using a bacteriophage lytic enzyme. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 98, 4107-4112 (2001).
11. Witzenrath, M., et al. Systemic use of the endolysin Cpl-1 rescues mice with fatal pneumococcal pneumonia. Critical care medicine 37, 642-649 (2009).
12. Pastagia, M., et al. A novel chimeric lysin shows superiority to mupirocin for skin decolonization of methicillin-resistant and -sensitive Staphylococcus aureus strains. Antimicrobial agents and chemotherapy 55, 738-744 (2011).
13. Loeffler, J.M., Djurkovic, S. & Fischetti, V.A. Phage Lytic Enzyme Cpl-1 as a Novel Antimicrobial for Pneumococcal Bacteremia. Infection and Immunity 71, 6199-6204 (2003).
14. Entenza, J.M., Loeffler, J.M., Grandgirard, D., Fischetti, V.A. & Moreillon, P. Therapeutic effects of bacteriophage Cpl-1 lysin against Streptococcus pneumoniae endocarditis in rats. Antimicrobial agents and chemotherapy 49, 4789-4792 (2005).
15. Grandgirard, D., Loeffler, J.M., Fischetti, V.A. & Leib, S.L. Phage lytic enzyme Cpl-1 for antibacterial therapy in experimental pneumococcal meningitis. The Journal of infectious diseases 197, 1519-1522 (2008).
16. Schuch, R., Fischetti, V.A. & Nelson, D.C. A Genetic Screen to Identify Bacteriophage Lysins. in Bacteriophages: Methods and Protocols, Volume 2: Molecular and Applied Aspects, Vol. 502 307-319 (2009).
17. Bateman, A. & Rawlings, N.D. The CHAP domain: a large family of amidases including GSP amidase and peptidoglycan hydrolases. Trends Biochem Sci 28, 234-237 (2003).
18. Whisstock, J.C. & Lesk, A.M. SH3 domains in prokaryotes. Trends in Biochemical Sciences 24, 132-133 (1999).
19. Rossi, P., et al. Structural elucidation of the Cys-His-Glu-Asn proteolytic relay in the secreted CHAP domain enzyme from the human pathogen Staphylococcus saprophyticus. Proteins 74, 515-519 (2009).
20. Mueller, M., de la Pena, A. & Derendorf, H. Issues in Pharmacokinetics and Pharmacodynamics of Anti-Infective Agents: Kill Curves versus MIC. Antimicrobial agents and chemotherapy 48, 369-377 (2004).
21. Cottarel, G. & Wierzbowski, J. Combination drugs, an emerging option for antibacterial therapy. Trends in biotechnology 25, 547-555 (2007).
22. Tallarida, R.J. Revisiting the isobole and related quantitative methods for assessing drug synergism. The Journal of pharmacology and experimental therapeutics 342, 2-8 (2012).
23. LaPlante, K.L., Leonard, S.N., Andes, D.R., Craig, W.A. & Rybak, M.J. Activities of clindamycin, daptomycin, doxycycline, linezolid, trimethoprim-sulfamethoxazole, and vancomycin against community-associated methicillin-resistant Staphylococcus aureus with inducible clindamycin resistance in murine thigh infection and in vitro pharmacodynamic models. Antimicrobial agents and chemotherapy 52, 2156-2162 (2008).
24. Crandon, J.L., Kuti, J.L. & Nicolau, D.P. Comparative efficacies of human simulated exposures of telavancin and vancomycin against methicillin-resistant Staphylococcus aureus with a range of vancomycin MICs in a murine pneumonia model. Antimicrobial agents and chemotherapy 54, 5115-5119 (2010).
25. Loeffler, J.M., Nelson, D. & Fischetti, V.A. Rapid killing of Streptococcus pneumoniae with a bacteriophage cell wall hydrolase. Science 294, 2170-2172 (2001).
26. Schuch, R., Nelson, D. & Fischetti, V. A bacteriolytic agent that detects and kills Bacillus anthracis. Nature 418, 884-889 (2002).
27. Manoharadas, S., Witte, A. & Blasi, U. Antimicrobial activity of a chimeric enzybiotic towards Staphylococcus aureus. Journal of biotechnology 139, 118-123 (2009).
28. Rashel, M., et al. Efficient elimination of multidrag-resistant Staphylococcus aureus by cloned lysin derived from bacteriophage phi MR11. The Journal of infectious diseases 196, 1237-1247 (2007).
29. Daniel, A., et al. Synergism between a novel chimeric lysin and oxacillin protects against infection by methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Antimicrobial agents and chemotherapy 54, 1603-1612 (2010).
30. Kokai-Kun, J.F., Chanturiya, T. & Mond, J.J. Lysostaphin as a treatment for systemic Staphylococcus aureus infection in a mouse model. The Journal of antimicrobial chemotherapy 60, 1051-1059 (2007).
31. Sopirala, M.M., et al. Synergy testing by Etest, microdilution checkerboard, and time-kill methods for pan-drug-resistant Acinetobacter baumannii. Antimicrobial agents and chemotherapy 54, 4678-4683 (2010).
32. Zhang, Y. I-TASSER server for protein 3D structure prediction. BMC bioinformatics 9, 40 (2008).
[000124] Настоящее изобретение можно реализовать в других формах или осуществить иными способами, не отклоняясь от его сущности или существенных характеристик. Поэтому следует считать, что настоящее описание во всех его аспектах является иллюстративным и неограничивающим, а сущность изобретения указана в прилагаемой формуле изобретения, и подразумевается, что она охватывает все изменения, не выходящие за пределы значений и диапазонов эквивалентности.
[000125] Настоящее описание изобретения включает ссылки на различные источники, каждый из которых полностью включен в настоящий документ посредством ссылки.
Claims (14)
1. Способ анализа чувствительности грамположительных бактерий в отношении антибактериального пептида с микроразбавлением в жидкой среде (BMD), включающий оценку указанного антибактериального пептида в жидкой среде с добавлением сыворотки крови животного и восстановителя, причем указанный антибактериальный пептид представляет собой полипептид-лизин, и при этом оценка указанного антибактериального пептида включает определение минимальной ингибирующей концентрации (МИК) указанного антибактериального пептида.
2. Способ по п. 1, характеризующийся тем, что в среду добавляют сыворотку крови животного в концентрации от 10% до 50% сыворотки крови животного.
3. Способ по п. 1, характеризующийся тем, что в среду добавляют сыворотку крови животного в концентрации от 10% до 30% сыворотки крови животного.
4. Способ по п. 1, характеризующийся тем, что в среду добавляют сыворотку крови животного в концентрации от 15% до 30% сыворотки крови животного.
5. Способ по п. 1, характеризующийся тем, что в среду добавляют сыворотку крови животного в концентрации от 20% до 30% сыворотки крови животного.
6. Способ по п. 1, характеризующийся тем, что в среду добавляют сыворотку крови лошади в концентрации от 20% до 30% сыворотки крови лошади.
7. Способ по п. 1, характеризующийся тем, что жидкая среда является жидкой средой с откорректированным катионным составом.
8. Способ по п. 1, характеризующийся тем, что жидкая среда представляет собой жидкую среду Мюллера-Хинтона (MHB).
9. Способ по п. 1, характеризующийся тем, что восстановитель выбирают из дитиотрейтола (ДТТ) и гидрохлорида трис(2-карбоксиэтил)фосфина (TCEP).
10. Способ по п. 1, характеризующийся тем, что количество восстановителя составляет от 0,1 до 1 мМ.
11. Способ по п. 1, характеризующийся тем, что количество восстановителя составляет от 0,25 до 1 мМ.
12. Способ по п. 1, характеризующийся тем, что полипептид-лизин представляет собой PlySs2 (CF-301) или его вариант или производное, эффективно уничтожающее грамположительные бактерии.
13. Способ по п. 1 для оценки композиции, содержащей антибактериальный пептид, представляющий собой полипептид-лизин, и дополнительно содержащей один или более антибактериальных агентов.
14. Способ по п. 13, характеризующийся тем, что указанный один или более антибактериальных агентов представляет собой антибиотик.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US201662335129P | 2016-05-12 | 2016-05-12 | |
| US62/335,129 | 2016-05-12 | ||
| PCT/US2017/032344 WO2017197227A1 (en) | 2016-05-12 | 2017-05-12 | Broth microdilution method for evaluating and determining minimal inhibitory concentration of antibacterial polypeptides |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2018135238A RU2018135238A (ru) | 2020-06-15 |
| RU2018135238A3 RU2018135238A3 (ru) | 2020-09-11 |
| RU2754667C2 true RU2754667C2 (ru) | 2021-09-06 |
Family
ID=60266856
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2018135238A RU2754667C2 (ru) | 2016-05-12 | 2017-05-12 | Способ микроразбавления в жидкой среде для оценки и определения минимальной ингибирующей концентрации антибактериальных полипептидов |
Country Status (14)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US10851401B2 (ru) |
| EP (1) | EP3454888B1 (ru) |
| JP (1) | JP6875756B2 (ru) |
| KR (1) | KR20190004799A (ru) |
| CN (1) | CN109152822B (ru) |
| AU (1) | AU2017263563A1 (ru) |
| BR (1) | BR112018073205A2 (ru) |
| CA (1) | CA3023730A1 (ru) |
| DK (1) | DK3454888T3 (ru) |
| IL (1) | IL262844B2 (ru) |
| MX (1) | MX388569B (ru) |
| RU (1) | RU2754667C2 (ru) |
| WO (1) | WO2017197227A1 (ru) |
| ZA (1) | ZA201806685B (ru) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP3164146B1 (en) * | 2014-06-26 | 2019-12-25 | The Rockefeller University | Acinetobacter lysins |
| MX2020008860A (es) * | 2018-02-26 | 2020-12-10 | Contrafect Corp | Lisinas plyss2 modificadas y sus usos. |
| CN113164909A (zh) * | 2018-07-11 | 2021-07-23 | 赛录科试诊断公司 | 用于抗微生物剂敏感性测试的测定和试剂 |
| CA3134154A1 (en) * | 2019-03-22 | 2020-10-01 | Contrafect Corporation | Method of treating infective endocarditis |
| JP2022526624A (ja) * | 2019-04-11 | 2022-05-25 | コントラフェクト コーポレイション | 骨及び関節の感染を治療及び予防する方法 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20150290299A1 (en) * | 2012-05-09 | 2015-10-15 | Contrafect Corporation | Bacteriophage lysin and antibiotic combinations against gram positive bacteria |
Family Cites Families (18)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU8108587A (en) | 1986-10-08 | 1988-05-06 | David Bernstein | Method for exposing group a streptococcal antigens and an improved diagnostic test for the identification of group a streptococci |
| US6248324B1 (en) | 1997-10-31 | 2001-06-19 | Vincent Fischetti | Bacterial phage associated lysing enzymes for treating dermatological infections |
| US6254866B1 (en) | 1997-10-31 | 2001-07-03 | New Horizons Diagnostics Corporation | Use of phage associated lytic enzymes for treating bacterial infections of the digestive tract |
| US5997862A (en) | 1997-10-31 | 1999-12-07 | New Horizons Diagnostics Corporation | Therapeutic treatment of group A streptococcal infections |
| US6264945B1 (en) | 1997-10-31 | 2001-07-24 | Vincent A Fischetti | Parenteral use of bacterial phage associated lysing enzymes for the therapeutic treatment of bacterial infections |
| HK1047243A1 (zh) | 1999-02-25 | 2003-02-14 | 新眼界诊断公司 | 預防性和治療性治療鏈球菌感染的方法 |
| US6056955A (en) | 1999-09-14 | 2000-05-02 | Fischetti; Vincent | Topical treatment of streptococcal infections |
| JP4381531B2 (ja) * | 1999-12-08 | 2009-12-09 | 塩野義製薬株式会社 | グリコペプチド誘導体 |
| AU2003291614A1 (en) | 2002-05-17 | 2004-04-08 | New Horizons Diagnostics Corporation | Identification of a phage associated lytic enzyme to rapidly and specifically detect and kill bacillus anthracis |
| US7569223B2 (en) | 2004-03-22 | 2009-08-04 | The Rockefeller University | Phage-associated lytic enzymes for treatment of Streptococcus pneumoniae and related conditions |
| EP1744779A2 (en) | 2004-03-24 | 2007-01-24 | The Rockfeller University | Lytic enzymes and spore surface antigen for detection and treatment of "bacillus anthracis" bacteria and spores |
| US8389469B2 (en) | 2005-06-06 | 2013-03-05 | The Rockefeller University | Bacteriophage lysins for Bacillus anthracis |
| US7582291B2 (en) | 2005-06-30 | 2009-09-01 | The Rockefeller University | Bacteriophage lysins for Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium and other bacteria |
| EP2360248A1 (en) | 2005-08-24 | 2011-08-24 | The Rockefeller University | Ply-GBS mutant lysins |
| CA2729160C (en) | 2008-07-03 | 2017-11-14 | The Rockefeller University | A chimeric bacteriophage lysin with activity against staphylococci bacteria |
| JP5823733B2 (ja) * | 2010-05-25 | 2015-11-25 | 株式会社ゲノム創薬研究所 | 抗生物質産生微生物及びそれが産生した抗生物質 |
| JP5863648B2 (ja) * | 2010-05-25 | 2016-02-16 | 株式会社ゲノム創薬研究所 | 新規環状ペプチド化合物とその製造方法及び感染症治療薬、抗生物質含有画分、その抗生物質及びその抗生物質の製造方法並びに抗生物質産生微生物及びそれが産生した抗生物質 |
| CA2833409A1 (en) | 2011-04-21 | 2012-10-26 | The Rockefeller University | Streptococcus bacteriophage lysins for detection and treatment of gram positive bacteria |
-
2017
- 2017-05-12 DK DK17796910.2T patent/DK3454888T3/da active
- 2017-05-12 CA CA3023730A patent/CA3023730A1/en active Pending
- 2017-05-12 EP EP17796910.2A patent/EP3454888B1/en active Active
- 2017-05-12 WO PCT/US2017/032344 patent/WO2017197227A1/en not_active Ceased
- 2017-05-12 JP JP2019511834A patent/JP6875756B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2017-05-12 RU RU2018135238A patent/RU2754667C2/ru active
- 2017-05-12 KR KR1020187035806A patent/KR20190004799A/ko not_active Abandoned
- 2017-05-12 MX MX2018013372A patent/MX388569B/es unknown
- 2017-05-12 US US16/096,746 patent/US10851401B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2017-05-12 AU AU2017263563A patent/AU2017263563A1/en not_active Abandoned
- 2017-05-12 BR BR112018073205-2A patent/BR112018073205A2/pt not_active Application Discontinuation
- 2017-05-12 CN CN201780029049.1A patent/CN109152822B/zh not_active Expired - Fee Related
-
2018
- 2018-10-08 ZA ZA2018/06685A patent/ZA201806685B/en unknown
- 2018-11-07 IL IL262844A patent/IL262844B2/en unknown
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20150290299A1 (en) * | 2012-05-09 | 2015-10-15 | Contrafect Corporation | Bacteriophage lysin and antibiotic combinations against gram positive bacteria |
Non-Patent Citations (5)
| Title |
|---|
| Kimberly D Leuthner et al., Comparative activity of the new lipoglycopeptide telavancin in the presence and absence of serum against 50 glycopeptide non-susceptible staphylococci and three vancomycin-resistant Staphylococcus aureus / J Antimicrob Chemother, 2006, Vol.58, N.2, pp.338-43. * |
| M49-P-Methods for Broth Dilution Susceptibility Testing of Bacteria Isolated From Aquatic Animals; Proposed Guideline / Clinical and Laboratory Standards Institute, 2005, Vol. 25 No. 22, pp.1-43. * |
| Maria Egervаrn et al., Effects of Inoculum Size and Incubation Time on Broth Microdilution Susceptibility Testing of Lactic Acid Bacteria / Antimicrobial agents and Chemotherapy, 2007, Vol. 51, No. 1, pp. 394-396. * |
| Raymond Schuch et al., Сombination Therapy With Lysin CF-301 and Antibiotic Is Superior to Antibiotic Alone for Treating Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus-Induced Murine Bacteremia /The Journal of Infectious Diseases, 2014, Vol.209, N.9, pp.1469-1478. * |
| Raymond Schuch et al., Сombination Therapy With Lysin CF-301 and Antibiotic Is Superior to Antibiotic Alone for Treating Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus-Induced Murine Bacteremia /The Journal of Infectious Diseases, 2014, Vol.209, N.9, pp.1469-1478. Kimberly D Leuthner et al., Comparative activity of the new lipoglycopeptide telavancin in the presence and absence of serum against 50 glycopeptide non-susceptible staphylococci and three vancomycin-resistant Staphylococcus aureus / J Antimicrob Chemother, 2006, Vol.58, N.2, pp.338-43. M49-P-Methods for Broth Dilution Susceptibility Testing of Bacteria Isolated From Aquatic Animals; Proposed Guideline / Clinical and Laboratory Standards Institute, 2005, Vol. 25 No. 22, pp.1-43. Maria Egervаrn et al., Effects of Inoculum Size and Incubation Time on Broth Microdilution Susceptibility Testing of Lactic Acid Bacteria / Antimicrobial agents and Chemotherapy, 2007, Vol. 51, No. 1, pp. 394-396. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP6875756B2 (ja) | 2021-05-26 |
| EP3454888A1 (en) | 2019-03-20 |
| CA3023730A1 (en) | 2017-11-16 |
| RU2018135238A3 (ru) | 2020-09-11 |
| RU2018135238A (ru) | 2020-06-15 |
| US10851401B2 (en) | 2020-12-01 |
| AU2017263563A1 (en) | 2018-10-18 |
| WO2017197227A1 (en) | 2017-11-16 |
| CN109152822B (zh) | 2023-12-05 |
| CN109152822A (zh) | 2019-01-04 |
| IL262844B1 (en) | 2023-03-01 |
| EP3454888B1 (en) | 2021-02-24 |
| JP2019514439A (ja) | 2019-06-06 |
| DK3454888T3 (da) | 2021-04-26 |
| IL262844A (en) | 2018-12-31 |
| US20190106724A1 (en) | 2019-04-11 |
| ZA201806685B (en) | 2021-02-24 |
| EP3454888A4 (en) | 2019-12-11 |
| BR112018073205A2 (pt) | 2019-02-19 |
| KR20190004799A (ko) | 2019-01-14 |
| MX388569B (es) | 2025-03-20 |
| IL262844B2 (en) | 2023-07-01 |
| MX2018013372A (es) | 2019-05-09 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP6873939B2 (ja) | バクテリオファージ溶解素によるバイオフィルムの防止、破壊および処置 | |
| JP6608697B2 (ja) | グラム陽性菌に対するバクテリオファージ溶解素と抗生物質との組み合わせ | |
| RU2754667C2 (ru) | Способ микроразбавления в жидкой среде для оценки и определения минимальной ингибирующей концентрации антибактериальных полипептидов | |
| JP2022532130A (ja) | 新規ガードネレラエンドリシンとその使用 | |
| HK40004457B (en) | Broth microdilution method for evaluating and determining minimal inhibitory concentration of antibacterial polypeptides | |
| Oliveira et al. | Bacteriophage proteins as antimicrobials to combat antibiotic resistance | |
| Shang | Structure-Guided Engineering of a Multimeric Bacteriophage-Encoded Endolysin PlyC |