RU2639523C2

RU2639523C2 - Пептидомиметические макроциклы и их применение

Info

Publication number: RU2639523C2
Application number: RU2014119673A
Authority: RU
Inventors: Нориюки КАВАХАТА; Венсан ГЕРЛАВЭ; Манодж САМАНТ
Original assignee: Эйлерон Терапьютикс, Инк.
Priority date: 2011-10-18
Filing date: 2012-10-18
Publication date: 2017-12-21
Also published as: US20130123169A1; AU2012326026A1; BR112014009418A2; EP2768518A4; TW201806968A; US20160137710A1; US9096684B2; US9522947B2; JP2014530868A; JP6342808B2; WO2013059525A1; MX358886B; MX2014004644A; US20170226177A1; AU2017204332A1; CA2852468A1; TWI643868B; CN108929375A; AR088392A1; KR20140100937A

Abstract

Группа изобретений относится к биотехнологии и медицине. Предложены пептидомиметический макроцикл, который связывается с рецептором гормона, высвобождающего гормон роста (GHRH), и его применения. Предложенный пептидомиметический макроцикл имеет структуру, как представлено в формуле. Указанный пептидомиметический макроцикл обладает улучшенной биологической активностью, стимулирует получение и высвобождение гормона роста и может быть использован для увеличения сухой мышечной массы у пациента, для уменьшения жировой ткани у пациента, для лечения мышечной атрофии, липодистрофии, нарушения гормона роста, пареза желудка или синдрома короткой кишки у пациента. 9 н. и 22 з.п. ф-лы, 11 ил., 5 табл., 4 пр.

Description

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА

По настоящей заявке испрашивается приоритет временной заявки №61/548690, US, поданной 18 октября 2011, которая включена в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме.

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

Настоящая заявка включает Список последовательностей, представленный в формате ASCII посредством EFS-Web и таким образом полностью включенный в настоящее описание путем ссылки. Указанная копия ASCII, созданная 2 ноября 2012, имеет название 35769601.txt и размер 225304 байт.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Человеческий GHRH (гормон, высвобождающий гормон роста) представляет собой пептид, состоящий из 44 аминокислот, чья полная биологическая активность локализована в его первых 29 аминокислотах ("GHRH 1-29"). GHRH связывается с рецептором GHRH и стимулирует секрецию пульсативного GH [гормона роста], и с этим механизмом действия GHRH представляет собой альтернативу терапии с использованием GH в случае пациентов с интактным гипофизом, который может минимизировать побочные действия, сопутствующие длительному применению GH. Так как величина высвобождения GH, вызванного GHRH, ограничена уровнями IGF-1, который оказывает отрицательный эффект обратной связи, риск побочных действий, связанных с избыточной секрецией GH, также может быть меньше с терапией GHRH, чем с терапией GH. Кроме того, методика лечения с GHRH может приводить к секреции гипофизом более широкого набора протеинов GH, а не только формы 22 кДа, которую обеспечивает рекомбинантный человеческий GH, что может также иметь благоприятные эффекты. Было показано, что в клиническом аспекте, GHRH является безопасным и эффективным для увеличения уровней GH у взрослых и детей, а эффект стимулирования роста GHRH коррелируется с дозой и частотой введения. При этом период полувыведения GHRH после внутривенного введения составляет только 10-12 мин, что значительно ограничивает его применение в качестве терапевтического средства. Таким образом, существует клиническая необходимость в аналогах GHRH, которые обладают более длительным периодом полувыведения in vivo, что может обеспечивать больший терапевтический эффект с улучшенным (менее частым) режимом дозирования.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение обеспечивает пептидомиметические макроциклы - производные GHRH, которые могут обладать улучшенными по сравнению с GHRH фармацевтическими свойствами. Эти улучшенные свойства включают повышенную химическую стабильность, более длительный период полувыведения in vivo, увеличенную активность и сниженную иммуногенность. Эти пептидомиметические макроциклы пригодны для увеличения уровней циркулирующего GH в качестве методики лечения мышечных атрофий, липодистрофий, нарушений деятельности гормона роста, пареза желудка/синдрома короткой кишки, и других патологических состояний, при которых увеличение GH обеспечило бы терапевтический эффект.

Ниже описаны стабильные сшитые пептиды, полученные из пептида GHRH. Эти сшитые пептиды содержат по меньшей мере две модифицированные аминокислоты, которые вместе образуют внутримолекулярную сшивку, которая может помочь в стабилизации односпиральной вторичной структуры участка GHRH, что, как полагают, важно для активности агониста в рецепторе GHRH. По сравнению с аминокислотной последовательностью пептида дикого типа, любая аминокислота, которая не является необходимой для активности пептида в высвобождении гормона роста, может быть заменена любыми другими аминокислотами, тогда как аминокислоты, которые являются необходимыми для активности пептида в высвобождении гормона роста, могут быть заменены только на аминокислоту, аналоги которой существенно не уменьшают указанную активность.

Соответственно, сшитый полипептид, описанный в данном документе, может иметь улучшенную биологическую активность по сравнению с соответствующим полипептидом, который не является сшитым. Без привязки к теории, омиметические макроциклы GHRH, как полагают, существуют для того, чтобы активировать рецептор GHRH, тем самым стимулируя получение и высвобождение гормона роста, который может увеличивать сухую мышечную массу или уменьшать жировую ткань (такую как абдоминальная жировая ткань). Например, жировая ткань может быть снижена у субъектов, страдающих от ожирения, включая абдоминальное ожирение. Омиметические макроциклы GHRH, описанные в данном документе, могут быть использованы с терапевтической целью, например, для лечения мышечных атрофий, которые включают анорексии, кахексии (такие как раковая кахексия, кахексия при хронической сердечной недостаточности, кахексия при хроническом обструктивном заболевании легких, кахексия при ревматоидном артрите) и саркопении, для лечения липодистрофий, которые включают липодистрофию при HIV, для лечения нарушений деятельности гормона роста, которые включают недостатки гормона роста у взрослых и детей, или для лечения пареза желудка или синдрома короткой кишки. Недостаток гормона роста у детей может быть, например, связан с или сопутствующим идиопатической низкорослости, SGA (низкой массой для данного гестационного возраста у новорожденного), хронической почечной недостаточности, синдромом Прадера-Вилли, синдромом Тернера, дефектом гена SHOX (shortstaturehomeobox), или первичным недостатком IGF-1.

В одном аспекте, настоящее изобретение обеспечивает пептидомиметический макроцикл, содержащий аминокислотную последовательность, который на по меньшей мере приблизительно 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, или 99% идентична GHRH 1-44, GHRH 1-29 и/или аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей из Таблицы 1, 2 или 4. Альтернативно, аминокислотная последовательность указанного пептидомиметического макроцикла представляет собой выбранную из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей, представленных в Таблицах 1, 2 или 4. Пептидомиметический макроцикл может содержать один, два, три, четыре, пять или более макроцикл-образующих линкеров, где каждый макроцикл-образующий линкер соединяет одну аминокислоту к другой аминокислоте в структуру пептидомиметического макроцикла. Например, пептидомиметический макроцикл содержит по меньшей мере два макроцикл-образующих линкера, где первый из указанных по меньшей мере двух макроцикл-образующих линкеров соединяет первую аминокислоту со второй аминокислоте, а вторая из указанных по меньшей мере двух макроцикл-образующих линкеров соединяет третью аминокислоту с четвертой аминокислоте. В отдельных вариантах осуществления настоящего изобретения пептидомиметический макроцикл содержит ровно два макроцикл-образующих линкера. В других вариантах осуществления настоящего изобретения пептидомиметический макроцикл содержит ровно один макроцикл-образующий линкер.

Макроцикл-образующие линкеры соединяют любые две аминокислоты, которые могут быть сшиты без ослабления активности пептидомиметического макроцикла. В отдельных вариантах осуществления настоящего изобретения макроцикл-образующий линкер соединяет одну из следующих пар аминокислот (пронумерованные со ссылкой на любую последовательность в соответствии с GHRH 1-29): 4 и 8; 5 и 12; 8 и 12; 8 и 15; 9 и 16; 12 и 16; 12 и 19; 15 и 22; 18 и 25; 21 и 25; 21 и 28; 22 и 29; 25 и 29. Например, макроцикл-образующий линкеры соединяют следующие пары аминокислот: 4 и 8; 5 и 12; 12 и 19; 15 и 22; 18 и 25; 21 и 25; 21 и 28. В отдельных вариантах осуществления настоящего изобретения первый макроцикл-образующий линкер соединяет аминокислотные пары 4 и 8; 5 и 12; 8 и 12; 8 и 15; 9 и 16; 12 и 16; или 12 и 19; а второй макроцикл-образующий линкер соединяет аминокислотные пары 15 и 22; 18 и 25; 21 и 25; 21 и 28; 22 и 29; или 25 и 29. Например, первый макроцикл-образующий линкер соединяет аминокислотные пары 4 и 8; 5 и 12; или 12 и 19; а второй макроцикл-образующий линкер соединяет аминокислотные пары 15 и 22; 18 и 25; 21 и 25; или 21 и 28. В отдельных вариантах осуществления настоящего изобретения первый макроцикл-образующий линкер соединяет аминокислотные пары 4 и 8, а второй макроцикл-образующий линкер соединяет аминокислотные пары 21 и 25.

В отдельных вариантах осуществления настоящего изобретения пептидомиметический макроцикл содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на приблизительно 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, или 99% идентична GHRH 1-44, GHRH 1-29 и/или аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей из Таблицы 1, 2 или 4, и к тому же содержит макроцикл-образующий линкер, соединяющий первую аминокислоту со второй аминокислотой, где первая и вторая аминокислоты выбраны из следующих пар аминокислот: 4 и 8; 5 и 12; 8 и 12; 8 и 15; 9 и 16; 12 и 16; 12 и 19; 15 и 22; 18 и 25; 21 и 25; 21 и 28; 22 и 29. Например, макроцикл-образующий линкер соединяет аминокислоты 12 и 19.

В отдельных вариантах осуществления настоящего изобретения пептидомиметический макроцикл содержит последовательность, выбранную из группы, состоящей из аминокислотных последовательности в Таблицах 1, 2 или 4, или аминокислотную последовательность пептидомиметического макроцикла, выбранную из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей, представленных в Таблицах 1, 2 или 4.

В отдельных вариантах осуществления настоящего изобретения пептидомиметический макроцикл содержит спираль, такую как α-спираль или 3₁₀ спираль. В других вариантах осуществления настоящего изобретения пептидомиметический макроцикл содержит α,α-двузамещенную аминокислоту. Например, по меньшей мере одна аминокислота, или каждая аминокислота, соединенная с помощью макроцикл-образующего линкера, представляет собой α,α-двузамещенную аминокислоту.

В отдельных вариантах осуществления настоящего изобретения пептидомиметический макроцикл по настоящему изобретению содержит сшивающее средство, сшивающее α-положения по меньшей мере двух аминокислот.

В отдельных вариантах осуществления настоящего изобретения пептидомиметический макроцикл имеет Формулу:

где:

каждый A, C, D, и E независимо представляет собой аминокислоту;

B представляет собой аминокислоту,

, [-NH-L₃-CO-], [-NH-L₃-SO₂-], или [-NH-L₃-];

R₁ и R₂ независимо представляют собой –H, алкил, алкенил, алкинил, арилалкил, циклоалкил, циклоалкилалкил, гетероалкил, или гетероциклоалкил, незамещенный или замещенный галогеном;

R₃ представляет собой водород, алкил, алкенил, алкинил, арилалкил, гетероалкил, циклоалкил, гетероциклоалкил, циклоалкилалкил, циклоарил, или гетероциклоарил, который необязательно замещен на R₅;

L представляет собой макроцикл-образующий линкер Формулы –L₁–L₂–;

и где A, B, C, D, и E, взятые вместе со сшитыми аминокислотами, соединенные с помощью макроцикл-образующего линкера L, образуют аминокислотную последовательность пептидомиметического макроцикла, который на по меньшей мере приблизительно 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, или 99% идентичен GHRH 1-44, GHRH 1-29 и/или аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей в Таблице 1, 2 или 4;

L₁ и L₂ независимо представляют собой алкилен, алкенилен, алкинилен, гетероалкилен, циклоалкилен, гетероциклоалкилен, циклоарилен, гетероциклоарилен, или [-R₄-K-R₄-]_n, каждый из которых который необязательно замещен на R₅;

каждый R₄ представляет собой алкилен, алкенилен, алкинилен, гетероалкилен, циклоалкилен, гетероциклоалкилен, арилен, или гетероарилен;

каждый K представляет собой O, S, SO, SO₂, CO, CO₂, или CONR₃;

каждый R₅ независимо представляет собой галоген, алкил, -OR₆, -N(R₆)₂, -SR₆, -SOR₆, -SO₂R₆, -CO₂R₆, флуоресцентную функциональную группу, радиоизотоп или терапевтическое средство;

каждый R₆ независимо представляет собой –H, алкил, алкенил, алкинил, арилалкил, циклоалкилалкил, гетероциклоалкил, флуоресцентную функциональную группу, радиоизотоп или терапевтическое средство;

R₇ представляет собой –H, алкил, алкенил, алкинил, арилалкил, циклоалкил, гетероалкил, циклоалкилалкил, гетероциклоалкил, циклоарил, или гетероциклоарил, который необязательно замещен на R₅,иличасть циклической структуры с остатком D;

R₈ представляет собой –H, алкил, алкенил, алкинил, арилалкил, циклоалкил, гетероалкил, циклоалкилалкил, гетероциклоалкил, циклоарил, или гетероциклоарил, который необязательно замещен на R₅,иличасть циклической структуры с остатком E;

v и w независимо представляют собой целые числа от 1 до 1000, например от 1 до 500, от 1 до 200, от 1 до 100, от 1 до 50, от 1 до 40, от 1 до 25, от 1 до 20, от 1 до 15, или от 1 до 10;

u, x, y и z независимо представляют собой целые числа от 0 до 10, например u представляет собой 1, 2, или 3; и

n представляет собой целое число от 1 до 5. Например, u представляет собой 2. В отдельных вариантах осуществления настоящего изобретения сумма x+y+z представляет собой 2, 3 или 6, например 3 или 6.

В отдельных вариантах осуществления настоящего изобретения пептидомиметический макроцикл Формулы (I) имеет Формулу:

где каждый A, C, D, и E независимо представляет собой аминокислоту;

B представляет собой аминокислоту,

[-NH-L₃-CO-], [-NH-L₃-SO₂-], или [-NH-L₃-];

L’ представляет собой макроцикл-образующий линкер Формулы –L₁’–L₂’–;

и где A, B, C, D, и E, взятые вместе со сшитыми аминокислотами, соединенные с помощью макроцикл-образующих линкеров L и L’, образуют аминокислотную последовательность пептидомиметического макроцикла;

R₁’ и R₂’ независимо представляют собой –H, алкил, алкенил, алкинил, арилалкил, циклоалкил, циклоалкилалкил, гетероалкил, или гетероциклоалкил, незамещенный или замещенный на галоген;

L₁’ и L₂’ независимо представляют собой алкилен, алкенилен, алкинилен, гетероалкилен, циклоалкилен, гетероциклоалкилен, циклоарилен, гетероциклоарилен, или [-R₄-K-R₄-]_n, каждый из которых который необязательно замещен на R₅;

каждый K независимо представляет собой O, S, SO, SO₂, CO, CO₂, или CONR₃;

R₇’ представляет собой –H, алкил, алкенил, алкинил, арилалкил, циклоалкил, гетероалкил, циклоалкилалкил, гетероциклоалкил, циклоарил, или гетероциклоарил, который необязательно замещен на R₅,иличасть циклической структуры с остатком D;

R₈’ представляет собой –H, алкил, алкенил, алкинил, арилалкил, циклоалкил, гетероалкил, циклоалкилалкил, гетероциклоалкил, циклоарил, или гетероциклоарил, который необязательно замещен на R₅, или часть циклической структуры с остатком E;

v’ и w’ независимо представляют собой целые числа от 1 до 1000, например, от 1 до 500, от 1 до 200, от 1 до 100, от 1 до 50, от 1 до 40, от 1 до 25, от 1 до 20, от 1 до 15, или от 1 до 10;

x’, y’ и z’ независимо представляют собой целые числа от 0 до 10; и

n представляет собой целое число от 1 до 5. В отдельных вариантах осуществления настоящего изобретения сумма x’+y’+z’ представляет собой 2, 3 или 6, например 3 или 6.

В отдельных вариантах осуществления любого из пептидомиметических макроциклов, описанных в данном документе, каждый K представляет собой O, S, SO, SO₂, CO, или CO₂.

В других вариантах осуществления настоящего изобретения пептидомиметический макроцикл может содержать сшивающее средство, которое сшивает остов аминогруппы первой аминокислоты ко второй аминокислоте в структуру пептидомиметического макроцикла. Например, настоящее изобретение обеспечивает пептидомиметические макроциклы Формулы (II) или (IIa):

где:

B представляет собой аминокислота,

, [-NH-L₃-CO-], [-NH-L₃-SO₂-], или [-NH-L₃-];

R₁ и R₂ независимо представляют собой –H, алкил, алкенил, алкинил, арилалкил, циклоалкил, циклоалкилалкил, гетероалкил, или гетероциклоалкил, незамещенный или замещенный на галоген, или часть циклической структуры с остатком E;

L₁ и L₂ независимо представляют собой алкилен, алкенилен, алкинилен, гетероалкилен, циклоалкилен, гетероциклоалкилен, циклоарилен, гетероциклоарилен, или [-R₄-K-R₄-]_n, каждый из которых необязательно замещен на R₅;

и где A, B, C, D, и E, взятые вместе со сшитыми аминокислотами, соединенные с помощью макроцикл-образующего линкера -L₁-L₂-, образуют аминокислотную последовательность пептидомиметического макроцикла, который на по меньшей мере приблизительно 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, или 99% идентичен GHRH 1-44, GHRH 1-29 и/или аминокислотная последовательность, выбранная из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей в Таблице 1, 2 или 4;

R₇ представляет собой –H, алкил, алкенил, алкинил, арилалкил, циклоалкил, гетероалкил, циклоалкилалкил, гетероциклоалкил, циклоарил, или гетероциклоарил, который необязательно замещен на R₅;

v и w независимо представляют собой целые числа от 1 до 1000, например, от 1 до 500, от 1 до 200, от 1 до 100, от 1 до 50, от 1 до 40, от 1 до 25, от 1 до 20, от 1 до 15, или от 1 до 10;

u, x, y и z независимо представляют собой целые числа от 0 до 10, например, u представляет собой от 1 до 3; и

n представляет собой целое число от 1 до 5.

Кроме того, приведенное в данном документе представляет собой пептидомиметический макроцикл, который содержит аминокислотную последовательность Формулы:

Х1-Х2-Х3-Х4-Х5-Х6-Х7-Х8-Х9-Х10-Х11-Х12-Х13-Х14-Х15-Х16-Х17-Х18-Х19-Х20-Х21-Х22-Х23-Х24-Х25-Х26-Х27-Х28-Х29 (SEQ ID NO: 1)

где:

X1 представляет собой Tyr или His;

Х2 представляет собой Ala, D-Ala, или Val;

Х3 представляет собой Asp;

Х4 представляет собой Ala или сшитую аминокислоту;

Х5 представляет собой Ile;

Х6 представляет собой Phe;

Х7 представляет собой Thr;

Х8 представляет собой Gln, Asn, или сшитую аминокислоту;

Х9 представляет собой Ser или сшитую аминокислоту;

Х10 представляет собой Tyr;

X11 представляет собой Arg, Ala или Gln;

Х12 представляет собой Lys, Ala, Gln или сшитую аминокислоту;

Х13 представляет собой Val или Ile;

Х14 представляет собой Leu;

Х15 представляет собой Gly, Ala или сшитую аминокислоту;

Х16 представляет собой Gln, Glu или сшитую аминокислоту;

Х17 представляет собой Leu;

X18 представляет собой Ser, Tyr или сшитую аминокислоту;

X19 представляет собой Ala или сшитую аминокислоту;

X20 представляет собой Arg или Gln;

X21 представляет собой Lys, Gln или сшитую аминокислоту;

X22 представляет собой Leu, Ala, или сшитую аминокислоту;

X23 представляет собой Leu;

X24 представляет собой Gln, Glu или His;

X25 представляет собой Asp, Glu или сшитую аминокислоту;

X26 представляет собой Ile;

X27 представляет собой Met, Ile, Leu или Nle;

X28 представляет собой Ser или сшитую аминокислоту;

X29 представляет собой Arg, Ala, Gln или сшитую аминокислоту;

где пептидомиметический макроцикл содержит по меньшей мере один макроцикл-образующий линкер, соединяющий по меньшей мере одну пару аминокислот, выбранную из X1-X29;

каждый K представляет собой O, S, SO, SO₂, CO, или CO₂;

каждый R₅ независимо представляет собой галоген, алкил, -OR₆, -N(R₆)₂, -SR₆, -SOR₆, -SO₂R₆, -CO₂R₆, флуоресцентную функциональную группу, радиоизотоп или терапевтическое средство; и

каждый R₆ независимо представляет собой –H, алкил, алкенил, алкинил, арилалкил, циклоалкилалкил, гетероциклоалкил, флуоресцентную функциональную группу, радиоизотоп или терапевтическое средство.

Например, полипептид содержит по меньшей мере один, или по меньшей мере два макроцикл-образующий линкера, которые соединяют одну из следующих пар аминокислот: X4 и X8; X5 и X12; X8 и X12; X8 и X15; X9 и X16; X12 и X16; X12 и X19; X15 и X22; X18 и X25; X21 и X25; X21 и X28; X22 и X29; X25 и X29. Например, каждый макроцикл-образующий линкер соединяет одну из следующих пар аминокислот: X4 и X8; X5 и X12; X12 и X19; X15 и X22; X18 и X25; X21 и X25; X21 и X28.

В отдельных вариантах осуществления настоящего изобретения пептидомиметические макроциклы содержат макроцикл-образующий линкер Формулы –L₁-L₂-, где L₁ и L₂ независимо представляют собой алкилен, алкенилен или алкинилен. Например, L₁ и L₂ независимо представляют собой C₃-C₁₀ алкилен или алкенилен, или C₃-C₆ алкилен или алкенилен.

В отдельных вариантах осуществления настоящего изобретения R₁ и R₂ независимо представляют собой H или алкил, например, метил.

Кроме того, настоящее изобретение обеспечивает способ увеличения циркулирующего уровня гормона роста (GH) у субъекта, способ увеличения сухой мышечной массы у субъекта и способ уменьшения жировой ткани (такой как абдоминальная жировая ткань) у субъекта содержит введение субъекту пептидомиметического макроцикла по настоящему изобретению. Например, субъекты, страдающие от ожирения, включая абдоминальное ожирение, проходят лечение с использованием пептидомиметического макроцикла по настоящему изобретению. Настоящее изобретение также обеспечивает способ лечения мышечной атрофии, которая включает анорексии, кахексии (такие как раковая кахексия, кахексия при хронической сердечной недостаточности, кахексия при хроническом обструктивном заболевании легких, кахексия при ревматоидном артрите) и саркопении, способ лечения липодистрофий, которые включают липодистрофию при HIV, способ лечения нарушения деятельности гормона роста, который включает недостаток гормона роста у взрослых и детей, или способ лечения пареза желудка или синдрома короткой кишки. Недостаток гормона роста у детей может быть, например, связан с, или быть сопутствующим, идиопатической низкорослостью, SGA (низкой массой для данного гестационного возраста у новорожденного), хронической почечной недостаточностью, синдромом Прадера-Вилли, синдромом Тернера, дефектом гена SHOX (shortstaturehomeobox), или первичным недостатком IGF-1. Настоящее изобретение также обеспечивает способ лечения мышечных атрофий, липодистрофий, нарушений деятельности гормона роста или пареза желудка/синдрома короткой кишки у субъекта с помощью введения агониста рецептора GHRH, такого как аналог GHRH, где агонист вводят не чаще чем раз в день, не чаще чем раз в два дня, не чаще чем дважды в неделю, не чаще чем раз в неделю или не чаще чем раз в две недели. Настоящее изобретение также обеспечивает способ увеличения циркулирующего уровня гормона роста (GH) у субъекта с помощью введения агониста рецептора GHRH, такого как аналог GHRH, где агонист вводят не чаще чем раз в день, не чаще чем раз в два дня, не чаще чем дважды в неделю, не чаще чем раз в неделю или не чаще чем раз в две недели.

ВКЛЮЧЕНИЕ СВЕДЕНИЙ ПУТЕМ ССЫЛКИ

Все публикации, патенты и патентные заявки, упомянутые в этом описании, включены данный документ в виде ссылки так, как если бы каждая отдельная публикация, патент или патентная заявка были конкретно и отдельно указаны как включенные посредством ссылки.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

Новые отличительные признаки настоящего изобретения будут подробно изложены в прилагаемой формуле изобретения. Лучшее понимания особенностей и преимуществ настоящего изобретения будет получено при обращении к следующему подробному описанию, которое излагает иллюстративные варианты осуществления настоящего изобретения, в которых используются принципы изобретения, и прилагаемых графических материалах, на которых:

ФИГУРЫ 1A и 1B иллюстрируют повышенные устойчивости пептидомиметических макроциклов по настоящему изобретению к протеолизу трипсином.

ФИГУРА 2 иллюстрирует повышенные устойчивости пептидомиметических макроциклов по настоящему изобретению к сыворотке крови.

ФИГУРЫ 3 и 3a иллюстрируют активности агониста рецептора GHRH пептидомиметических макроциклов по настоящему изобретению, которые измеряли с помощью высвобождения cAMP и периодов полувыведения трипсина. В случае значений сАМР, "+" представляет собой значения больше 50 нмоль; "++" представляет собой значения между 10 и 50 нмоль; "+++" представляет собой значения между 1 и 10 нмоль; "++++" представляет собой значения менее 1 нмоль. В случае периодов полувыведения трипсина, "+" представляет собой значения меньше чем 50 мин.; "++" представляет собой значения между 50 и 100 мин.; "+++" представляет собой значения между 100 и 200 мин.; "++++" представляет собой значения более 200 мин.; и "NT" означает "не измерено". На Фигуре 3 раскрыты SEQ ID NOS 89-131, соответственно, в порядке появления. На Фигуре 3а раскрыты SEQ ID NOS 132-137, соответственно, в порядке появления.

ФИГУРА 4 иллюстрирует результат фармакокинетического анализа плазмы крови, выполненного с пептидомиметическим макроциклом SP-1.

ФИГУРА 5 иллюстрирует результат фармакокинетического анализа плазмы крови, выполненного с пептидомиметическим макроциклом SP-8.

ФИГУРА 6 иллюстрирует результат фармакокинетического анализа плазмы крови, выполненного с пептидомиметическим макроциклом SP-6.

ФИГУРА 7 иллюстрирует результат фармакокинетического анализа плазмы крови, выполненного с пептидомиметическим макроциклом SP-21.

ФИГУРА 8 иллюстрирует результат фармакокинетического анализа плазмы крови, выполненного с пептидомиметическим макроциклом SP-32.

ФИГУРА 9 иллюстрирует результат фармакокинетического анализа плазмы крови, выполненного с пептидомиметическими макроциклами SP-1, SP-6, SP-8, SP-21, и SP-32.

ФИГУРА 10 иллюстрирует стимулирование выделения гормона роста с помощью пептидомиметического макроцикла SP-8.

ФИГУРА 11 иллюстрирует высвобождение гормона роста (AUC), вызванного серморелином по сравнению с пептидомиметическими макроциклами SP-1, SP-6, SP-8, SP-21, и SP-32.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Используемый в данном документе термин “макроцикл” соответствует молекуле, которая имеет химическую структуру, включающую кольцо или цикл, образованный по меньшей мере 9 ковалентно связанными атомами.

Используемый в данном документе термин “пептидомиметический макроцикл” или “сшитый полипептид” соответствует соединению, которое содержит множество аминокислотных остатков, связанных множеством пептидных связей, и по меньшей мере один макроцикл-образующий линкер, который образует макроцикл между первым, встречающимся в природе или не встречающимся в природе, аминокислотным остатком (или его аналогом) и вторым, встречающимся в природе или не встречающимся в природе, аминокислотным остатком (или его аналогом) в структуру этой же молекулы. Пептидомиметический макроцикл включает варианты осуществления настоящего изобретения, в которых макроцикл-образующий линкер соединяет α-углеродный атом первого аминокислотный остаток (или его аналога) с α-углеродным атомом второго аминокислотного остатка (или его аналога). Пептидомиметические макроциклы необязательно включают одну или несколько непептидных связей между одним или несколькими аминокислотными остатками и/или остатками аналогов аминокислот, и необязательно включают один или несколько не встречающиеся в природе аминокислотных остатков или остатков аналогов аминокислот, в дополнение к любому, образующему макроцикл. “Соответствующий несшитый полипептид”, когда в контексте соответствует пептидомиметическому макроциклу, подразумевается как относящийся к полипептиду такой же длины, что и макроцикл, и содержит эквивалентные природные аминокислоты в последовательности дикого типа, соответствующей макроциклу.

Используемый в данном документе термин “стабильность” соответствует поддержанию определенной вторичной структуры в растворе с помощью пептидомиметического макроцикла по настоящему изобретению, которую измеряли с помощью кругового дихроизма, NMR или другого биофизического метода измерения, или устойчивость к протеолитическому распаду invitro или invivo. Неограничивающие примеры вторичных структур, предполагаемых по настоящему изобретению, представляют собой α-спирали, 3₁₀ спирали, β-петли, и β-складки.

Используемый в данном документе термин “спиральная стабильность” соответствует поддержание α-спиральной структуры с помощью пептидомиметического макроцикла по настоящему изобретению, которую измеряли с помощью кругового дихроизма или NMR. Например, в отдельных вариантах осуществления настоящего изобретения пептидомиметические макроциклы по настоящему изобретению демонстрируют по меньшей мере 1,25, 1,5, 1,75 или 2-кратное увеличение α-спиральности, что определяли с помощью кругового дихроизма по сравнению с соответствующим несшитым макроциклом.

Термин “аминокислота” соответствует молекуле, которая содержит и аминогруппу, и гидроксильную группу. Соответствующие аминокислоты включают, без ограничения, и D- и L-изомеры встречающихся в природе аминокислот, и не встречающихся в природе аминокислот, полученные с помощью органического синтеза или другими путями метаболизма. Термин аминокислота, используемый в данном документе, включает без ограничения α-аминокислоты, природные аминокислоты, искусственные аминокислоты и аналоги аминокислот.

Термин “α-аминокислота” соответствует молекуле, которая содержит и аминогруппу и гидроксильную группу, связанную с атомом углерода, который обозначен как α-углерод.

Термин “β-аминокислота” соответствует молекуле, которая содержит и аминогруппу и гидроксильную группа в β положении.

Термин “встречающаяся в природе аминокислота” соответствует любой из двадцати аминокислот, которые обычно встречаются в пептидах, синтезируемые в природе, и известные под одним из буквенных обозначений A, R, N, C, D, Q, E, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y и V.

Следующая Таблица иллюстрирует краткие сведения о свойствах природных аминокислот:

Аминокислота	3-бук-венное обозна-чение	1-бук-венное обозна-чение	Поляр-ность боковой цепи	Заряд боковой цепочки (pH 7,4)	Индекс гидро-фобности
Аланин	Ala	A	неполярная	нейтральный	1,8
Аргинин	Arg	R	полярная	положительный	−4,5
Аспарагин	Asn	N	полярная	нейтральный	−3,5
Аспарагиновая	Asp	D	полярная	отрицательный	−3,5

кислота
Цистеин	Cys	C	полярная	нейтральный	2,5
Глутаминовая кислота	Glu	E	полярная	отрицательный	−3,5
Глутамин	Gln	Q	полярная	нейтральный	−3,5
Глицин	Gly	G	неполярная	нейтральный	−0,4
Гостидин	His	H	полярная	Положительный (10%) Нейтральный (90%)	−3,2
Изолейцин	Ile	I	неполярная	нейтральный	4,5
Лейцин	Leu	L	неполярная	нейтральный	3,8
Лизин	Lys	K	полярная	положительный	−3,9
Метионин	Met	M	неполярная	нейтральный	1,9
Фенилаланин	Phe	F	неполярная	нейтральный	2,8
Пролин	Pro	P	неполярная	нейтральный	−1,6
Серин	Ser	S	полярная	нейтральный	−0,8
Треонин	Thr	T	полярная	нейтральный	−0,7
Триптофан	Trp	W	неполярная	нейтральный	−0,9
Тирозин	Tyr	Y	полярная	нейтральный	−1,3
Валин	Val	V	неполярная	нейтральный	4,2

“Гидрофобные аминокислоты” включают малые гидрофобные аминокислоты и большие гидрофобные аминокислоты. “Малыми гидрофобными аминокислотами” являются глицин, аланин, пролин, и их аналоги. “Большими гидрофобными аминокислотами” являются валин, лейцин, изолейцин, фенилаланин, метионин, триптофан, и их аналоги. “Полярными аминокислотами” являются серин, треонин, аспарагин, глутамин, цистеин, тирозин, и их аналоги. “Заряженными аминокислотами” являются лизин, аргинин, гостидин, аспартат, глутамат, и их аналоги.

Термин “аналог аминокислоты” соответствует молекуле, которая является структурно подобной аминокислоте и которая может быть замещена на аминокислоту в ходе образования пептидомиметического макроцикла. Аналоги аминокислот включают, без ограничения, β-аминокислоты и аминокислоты, где амино или карбоксильная группа является замещенной на подобную реакционную группу (например, замещение первичного амина на вторичный или третичный амин, или замещение карбоксильной группы на сложноэфирную).

Термин “не встречающаяся в природе аминокислота” соответствует аминокислоте, которая не является любой из двадцати аминокислот, которые обычно встречаются в пептидах, синтезируемых в природе, и известных под одним из буквенных обозначений A, R, N, C, D, Q, E, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y и V.Искусственные аминокислоты или аналоги аминокислот включают, без ограничения, структуры, соответствующие следующим:

Аналоги аминокислот включают аналоги β-аминокислот. Примеры аналогов β-аминокислот включают, но без ограничения ими, следующие: циклические аналоги β-аминокислот; β-аланин; (R)-β-фенилаланин; (R)-1,2,3,4-тетрагидро-изохинолин-3- уксусная кислота; (R)-3-амино-4-(1-нафтил)-масляная кислота; (R)-3-амино-4-(2,4-дихлорфенил)масляная кислота; (R)-3-амино-4-(2-хлорфенил)-масляная кислота; (R)-3-амино-4-(2-цианофенил)-масляная кислота; (R)-3-амино-4-(2-фторфенил)-масляная кислота; (R)-3-амино-4-(2-фурил)-масляная кислота; (R)-3-амино-4-(2-метилфенил)-масляная кислота; (R)-3-амино-4-(2-нафтил)-масляная кислота; (R)-3-амино-4-(2-тиенил)-масляная кислота; (R)-3-амино-4-(2-трифторметилфенил)-масляная кислота; (R)-3-амино-4-(3,4-дихлорфенил)масляная кислота; (R)-3-амино-4-(3,4-дифторфенил)масляная кислота; (R)-3-амино-4-(3-бензотиенил)-масляная кислота; (R)-3-амино-4-(3-хлорфенил)-масляная кислота; (R)-3-амино-4-(3-цианофенил)-масляная кислота; (R)-3-амино-4-(3-фторфенил)-масляная кислота; (R)-3-амино-4-(3-метилфенил)-масляная кислота; (R)-3-амино-4-(3-пиридил)-масляная кислота; (R)-3-амино-4-(3-тиенил)-масляная кислота; (R)-3-амино-4-(3-трифторметилфенил)-масляная кислота; (R)-3-амино-4-(4-бромфенил)-масляная кислота; (R)-3-амино-4-(4-хлорфенил)-масляная кислота; (R)-3-амино-4-(4-цианофенил)-масляная кислота; (R)-3-амино-4-(4-фторфенил)-масляная кислота; (R)-3-амино-4-(4-йодфенил)-масляная кислота; (R)-3-амино-4-(4-метилфенил)-масляная кислота; (R)-3-амино-4-(4-нитрофенил)-масляная кислота; (R)-3-амино-4-(4-пиридил)-масляная кислота; (R)-3-амино-4-(4-трифторметилфенил)-масляная кислота; (R)-3-амино-4-пентафторо-фенилмасляная кислота; (R)-3-амино-5-гексеновая кислота; (R)-3-амино-5-гексиновая кислота; (R)-3-амино-5-фенилпентановая кислота; (R)-3-амино-6-фенил-5-гексеновая кислота; (S)-1,2,3,4-тетрагидро-изохинолин-3-уксусная кислота; (S)-3-амино-4-(1-нафтил)-масляная кислота; (S)-3-амино-4-(2,4-дихлорфенил)масляная кислота; (S)-3-амино-4-(2-хлорфенил)-масляная кислота; (S)-3-амино-4-(2-цианофенил)-масляная кислота; (S)-3-амино-4-(2-фторфенил)-масляная кислота; (S)-3-амино-4-(2-фурил)-масляная кислота; (S)-3-амино-4-(2-метилфенил)-масляная кислота; (S)-3-амино-4-(2-нафтил)-масляная кислота; (S)-3-амино-4-(2-тиенил)-масляная кислота; (S)-3-амино-4-(2-трифторметилфенил)-масляная кислота; (S)-3-амино-4-(3,4-дихлорфенил)масляная кислота; (S)-3-амино-4-(3,4-дифторфенил)масляная кислота; (S)-3-амино-4-(3-бензотиенил)-масляная кислота; (S)-3-амино-4-(3-хлорфенил)-масляная кислота; (S)-3-амино-4-(3-цианофенил)-масляная кислота; (S)-3-амино-4-(3-фторфенил)-масляная кислота; (S)-3-амино-4-(3-метилфенил)-масляная кислота; (S)-3-амино-4-(3-пиридил)-масляная кислота; (S)-3-амино-4-(3-тиенил)-масляная кислота; (S)-3-амино-4-(3-трифторметилфенил)-масляная кислота; (S)-3-амино-4-(4-бромфенил)-масляная кислота; (S)-3-амино-4-(4-хлорфенил)-масляная кислота; (S)-3-амино-4-(4-цианофенил)-масляная кислота; (S)-3-амино-4-(4-фторфенил)-масляная кислота; (S)-3-амино-4-(4-йодфенил)-масляная кислота; (S)-3-амино-4-(4-метилфенил)-масляная кислота; (S)-3-амино-4-(4-нитрофенил)-масляная кислота; (S)-3-амино-4-(4-пиридил)-масляная кислота; (S)-3-амино-4-(4-трифторметилфенил)-масляная кислота; (S)-3-амино-4-пентафторо-фенилмасляная кислота; (S)-3-амино-5-гексеновая кислота; (S)-3-амино-5-гексиновая кислота; (S)-3-амино-5-фенилпентановая кислота; (S)-3-амино-6-фенил-5-гексеновая кислота; 1,2,5,6 - тетрагидропиридин-3-карбоновая кислота; 1,2,5,6-тетрагидропиридин-4-карбоновая кислота; 3-амино-3-(2-хлорфенил)-пропионовая кислота; 3-амино-3-(2-тиенил)-пропионовая кислота; 3-амино-3-(3-бромфенил)-пропионовая кислота; 3-амино-3-(4-хлорфенил)-пропионовая кислота; 3-амино-3-(4-метоксифенил)-пропионовая кислота; 3-амино-4,4,4-трифтор-масляная кислота; 3-аминоадипиновая кислота; D-β-фенилаланин; β-лейцин; L–β-гомоаланин; γ-бензиловый эфир L-β-гомоаспарагиновой кислоты; δ-бензиловый эфир L-β-гомоглутаминовой кислоты; L-β-изолейцин; L-β-гомолейцин; L-β-гомометионин; L-β-гомофенилаланин; L-β-гомопролин; L-β-гомотриптофан; L-β-гомовалин; L-Nω-бензилоксикарбонил-β-гомолизин; Nω-L-β-гомоаргинин; O-бензил-L-β-гомогидроксипролин; O-бензил-L-β-гомосерин; O-бензил-L-β-гомотреонин; O-бензил-L-β-гомотирозин; γ-тритил-L-β-гомоаспарагин; (R)-β- фенилаланин; L-β-гомоаспарагиновая кислота γ-трет-бутиловый эфир; L-β-гомоглутаминовая кислота δ-трет-бутиловый эфир; L-Nω-β-гомолизин; Nδ-тритил-L-β-гомоглутамин; Nω-2,2,4,6,7-пента-дигидробензофуран-5-сульфонил-L-β-гомоаргинин; O-трет-бутил-L-β-гомогидрокси-пролин; O-трет-бутил-L-β-гомосерин; O-трет-бутил-L-β-гомотреонин; O-трет-бутил-L-β-гомотирозин; 2-аминоциклопентан карбоновая кислота; и 2-аминоциклогексанкарбоновая кислота.

Аналоги аминокислот включают аналоги аланина, валина, глицина или лейцина. Примеры аналогов аминокислот аланина, валина, глицина, и лейцина включают, но без ограничения ими, следующие: α-метоксиглицин; α-аллил-L-аланин; α-аминоизомасляная кислота; α-метил-лейцин; β-(1-нафтил)-D-аланин; β-(1-нафтил)-L-аланин; β-(2-нафтил)-D-аланин; β-(2-нафтил)-L-аланин; β-(2-пиридил)-D-аланин; β-(2-пиридил)-L-аланин; β-(2-тиенил)-D-аланин; β-(2-тиенил)-L-аланин; β-(3-бензотиенил)-D-аланин; β-(3-бензотиенил)-L-аланин; β-(3-пиридил)-D-аланин; β-(3-пиридил)-L-аланин; β-(4-пиридил)-D-аланин; β-(4-пиридил)-L-аланин; β-хлор-L-аланин; β-циано-L-аланин; β-циклогексил-D-аланин; β-циклогексил-L-аланин; β-циклопентен-1-ил-аланин; β-циклопентил-аланин; дициклогексиламмонийная соль β-циклопропил-L-Ala-OH; β-трет-бутил-D-аланин; β-трет-бутил-L-аланин; γ-аминомасляная кислота; L-α,β-диаминопропионовая кислота; 2,4-динитро-фенилглицин; 2,5-дигидро-D-фенилглицин; 2-амино-4,4,4-трифтормасляная кислота; 2-фтор-фенилглицин; 3-амино-4,4,4-трифтор-масляная кислота; 3-фтор-валин; 4,4,4-трифтор-валин; дициклогексиламмонийная соль 4,5-дегидро-L-Leu-OH; 4-фтор-D-фенилглицин; 4-фтор-L-фенилглицин; 4-гидрокси-D-фенилглицин; 5,5,5-трифтор-лейцин; 6-аминогексановая кислота; дициклогексиламмонийная соль циклопентил-D-Gly-OH; дициклогексиламмонийная соль циклопентил-Gly-OH; D-α,β-диаминопропионовая кислота; D-α-аминомасляная кислота; D-α-трет-бутилглицин; D-(2-тиенил)глицин; D-(3-тиенил)глицин; D-2-аминокапроновая кислота; D-2-инданилглицин; дициклогексиламмонийная соль D-аллилглицина; D-циклогексилглицин; D-норвалин; D-фенилглицин; β-аминомасляная кислота; β-аминоизомасляная кислота; (2-бромфенил)глицин; (2-метоксифенил)глицин; (2-метилфенил)глицин; (2-тиазоил)глицин; (2-тиенил)глицин; 2-амино-3-(диметиламино)-пропионовая кислота; L-α,β-диаминопропионовая кислота; L-α-аминомасляная кислота; L-α-трет-бутилглицин; L-(3-тиенил)глицин; L-2-амино-3-(диметиламино)-пропионовая кислота; дициклогексил-аммонийная соль L-2-аминокапроновой кислоты; L-2-инданилглицин; дициклогексил-аммонийная соль L-аллилглицина; L-циклогексилглицин; L-фенилглицин; L-пропаргилглицин; L-норвалин; N-α-аминометил-L-аланин; D-α,γ-диаминомасляная кислота; L-α,γ-диаминомасляная кислота; β-циклопропил-L-аланин; (N-β-(2,4-динитрофенил))-L-α,β-диаминопропионовая кислота; (N-β-1-(4,4-диметил-2,6-диоксоциклогекс-1-илиден)этил)-D-α,β-диаминопропионовая кислота; (N-β-1-(4,4-диметил -2,6-диоксоциклогекс-1-илиден)этил)-L-α,β-диаминопропионовая кислота; (N-β-4-метилтритил)-L-α,β-диаминопропионовая кислота; (N-β-аллилоксикарбонил)-L-α,β-диаминопропионовая кислота; (N-γ-1-(4,4-диметил-2,6-диоксоциклогекс-1-илиден)этил)-D-α,γ-диаминомасляная кислота; (N-γ-1-(4,4-диметил-2,6-диоксоциклогекс-1-илиден)этил)-L-α,γ-диаминомасляная кислота; (N-γ-4-метилтритил)-D-α,γ-диаминомасляная кислота; (N-γ-4-метилтритил)-L-α,γ-диаминомасляная кислота; (N-γ-аллилоксикарбонил)-L-α,γ-диаминомасляная кислота; D-α,γ-диаминомасляная кислота; 4,5-дегидро-L-лейцин; циклопентил-D-Gly-OH; циклопентил-Gly-OH; D-аллилглицин; D-гомоциклогексилаланин; L-1-пиренилаланин; L-2-аминокапроновая кислота; L-аллилглицин; L-гомоциклогексилаланин; и N-(2-гидрокси-4-метокси-Bzl)-Gly-OH.

Аналоги аминокислот включают аналоги аргинина или лизина. Примеры аналогов аминокислот аргинина и лизина включают, но без ограничения ими, следующие: цитруллин; L-2-амино-3-гуанидинопропионовая кислота; L-2-амино-3-уреидопропионовая кислота; L-цитруллин; Lys(Me)₂-OH; Lys(N₃)-OH; Nδ-бензилоксикарбонил-L-орнитин; Nω-нитро-D-аргинин; Nω-нитро-L-аргинин; α-метил-орнитин; 2,6-диаминопимелиновая кислота; L-орнитин; (Nδ-1-(4,4-диметил-2,6-диоксо-циклогекс-1-илиден)этил)-D-орнитин; (Nδ-1-(4,4-диметил-2,6-диоксо-циклогекс-1-илиден)этил)-L-орнитин; (Nδ-4-метилтритил)-D-орнитин; (Nδ-4-метилтритил)-L-орнитин; D-орнитин; L-орнитин; Arg(Me)(Pbf)-OH; Arg(Me)₂-OH (асимметричный); Arg(Me)2-OH (симметричный); Lys(ivDde)-OH; гидрохлорид Lys(Me)2-OH; хлорид Lys(Me3)-OH; Nω-нитро-D-аргинин; и Nω-нитро-L-аргинин.

Аналоги аминокислот включают аналоги аспарагиновой или глутаминовой кислот. Примеры аналогов аминокислот аспарагиновой или глутаминовой кислот включают, но без ограничения ими, следующие: α-метил-D-аспарагиновая кислота; α-метил-глутаминовая кислота; α-метил-L-аспарагиновая кислота; γ-метилен-глутаминовая кислота; (N-γ-этил)-L-глутамин; [N-α-(4-аминобензоил)]-L-глутаминовая кислота; 2,6-диаминопимелиновая кислота; L-α-аминосубериновая кислота; D-2-аминоадипиновая кислота; D-α-аминосубериновая кислота; α-аминопимелиновая кислота; иминодиуксусная кислота; L-2-аминоадипиновая кислота; трео-β-метил-аспарагиновая кислота; γ-карбоксильная-D-глутаминовая кислота γ,γ-ди-трет-бутиловый эфир; γ,γ-ди-трет-бутиловый эфир γ-карбоксильной-L-глутаминовой кислоты; Glu(OAll)-OH; L-Asu(OtBu)-OH; и пироглутаминовая кислота.

Аналоги аминокислот включают аналоги цистеина и метионина. Примеры аналогов аминокислот цистеина и метионина включают, но без ограничения ими, Cys(фарнезил)-OH, Cys(фарнезил)-OMe, α-метил-метионин, Cys(2-гидроксиэтил)-OH, Cys(3-аминопропил)-OH, 2-амино-4-(этилтио)масляную кислоту, бутионин, бутионинсульфоксимин, этионин, метилсульфонил хлорид метионина, селенометионин, цистеиновую кислоту, [2-(4-пиридил)этил]-DL-пеницилламин, [2-(4-пиридил)этил]-L-цистеин, 4-метоксибензил-D-пеницилламин, 4-метоксибензил-L-пеницилламин, 4-метилбензил-D-пеницилламин, 4-метилбензил-L-пеницилламин, бензил-D-цистеин, бензил-L-цистеин, бензил-DL-гомоцистеин, карбамоил-L-цистеин, карбоксиэтил-L-цистеин, карбоксиметил-L-цистеин, дифенилметил-L-цистеин, этил-L-цистеин, метил-L-цистеин, трет-бутил-D-цистеин, тритил-L-гомоцистеин, тритил-D-пеницилламин, цистатионин, гомоцистин, L-гомоцистин, (2-аминоэтил)-L-цистеин, селено-L-цистин, цистатионин, Cys(StBu)-OH и ацетамидометил-D-пеницилламин.

Аналоги аминокислот включают аналоги фенилаланина и тирозина. Примеры аналогов аминокислот фенилаланина и тирозина включают β-метил-фенилаланин, β-гидроксифенилаланин, α-метил-3-метокси-DL-фенилаланин, α-метил-D-фенилаланин, α-метил-L-фенилаланин, 1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-3-карбоновая кислота, 2,4-дихлор-фенилаланин, 2-(трифторметил)-D-фенилаланин, 2-(трифторметил)-L-фенилаланин, 2-бром-D-фенилаланин, 2-бром-L-фенилаланин, 2-хлор-D-фенилаланин, 2-хлор-L-фенилаланин, 2-циано-D-фенилаланин, 2-циано-L-фенилаланин, 2-фтор-D-фенилаланин, 2-фтор-L-фенилаланин, 2-метил-D-фенилаланин, 2-метил-L-фенилаланин, 2-нитро-D-фенилаланин, 2-нитро-L-фенилаланин, 2;4;5-тригидрокси-фенилаланин, 3,4,5-трифтор-D-фенилаланин, 3,4,5-трифтор-L-фенилаланин, 3,4-дихлор-D-фенилаланин, 3,4-дихлор-L-фенилаланин, 3,4-дифтор-D-фенилаланин, 3,4-дифтор-L-фенилаланин, 3,4-дигидрокси-L-фенилаланин, 3,4-диметокси-L-фенилаланин, 3,5,3’-трийод-L-тиронин, 3,5-дийод-D-тирозин, 3,5-дийод-L-тирозин, 3,5-дийод-L-тиронин, 3-(трифторметил)-D-фенилаланин, 3-(трифторметил)-L-фенилаланин, 3-амино-L-тирозин, 3-бром-D-фенилаланин, 3-бром-L-фенилаланин, 3-хлор-D-фенилаланин, 3-хлор-L-фенилаланин, 3-хлор-L-тирозин, 3-циано-D-фенилаланин, 3-циано-L-фенилаланин, 3-фтор-D-фенилаланин, 3-фтор-L-фенилаланин, 3-фтор-тирозин, 3-йод-D-фенилаланин, 3-йод-L-фенилаланин, 3-йод-L-тирозин, 3-метокси-L-тирозин, 3-метил-D-фенилаланин, 3-метил-L-фенилаланин, 3-нитро-D-фенилаланин, 3-нитро-L-фенилаланин, 3-нитро-L-тирозин, 4-(трифторметил)-D-фенилаланин, 4-(трифторметил)-L-фенилаланин, 4-амино-D-фенилаланин, 4-амино-L-фенилаланин, 4-бензоил-D-фенилаланин, 4-бензоил-L-фенилаланин, 4-бис(2-хлорэтил)амино-L-фенилаланин, 4-бром-D-фенилаланин, 4-бром-L-фенилаланин, 4-хлор-D-фенилаланин, 4-хлор-L-фенилаланин, 4-циано-D-фенилаланин, 4-циано-L-фенилаланин, 4-фтор-D-фенилаланин, 4-фтор-L-фенилаланин, 4-йод-D-фенилаланин, 4-йод-L-фенилаланин, гомофенилаланин, тироксин, 3,3-дифенилаланин, тиронин, этил-тирозин и метил-тирозин.

Аналоги аминокислот включают аналоги пролина. Примеры аналогов аминокислоты пролина включают, но без ограничения ими, 3,4-дегидро-пролин, 4-фтор-пролин, цис-4-гидрокси-пролин, тиазолидин-2-карбоновая кислота и транс-4-фтор-пролин.

Аналоги аминокислот включают аналоги серина и треонина. Примеры аналогов аминокислот серина и треонина включают, но без ограничения ими, 3-амино-2-гидрокси-5-метилгексановая кислота, 2-амино-3-гидрокси-4-метилпентановая кислота, 2-амино-3-этоксибутановая кислота, 2-амино-3-метоксибутановая кислота, 4-амино-3-гидрокси-6-метилгептановая кислота, 2-амино-3-бензилоксипропионовая кислота, 2-амино-3-бензилоксипропионовая кислота, 2-амино-3-этоксипропионовая кислота, 4-амино-3-гидроксибутановая кислота и α-метилсерин.

Аналоги аминокислот включают аналоги триптофана. Примеры аналогов аминокислоты триптофан включают, но без ограничения ими, следующие: α-метил-триптофан; β-(3-бензотиенил)-D-аланин; β-(3-бензотиенил)-L-аланин; 1-метил-триптофан; 4-метилтриптофан; 5-бензилокси-триптофан; 5-бром-триптофан; 5-хлор-триптофан; 5-фтор-триптофан; 5-гидрокси-триптофан; 5-гидрокси-L-триптофан; 5-метокси-триптофан; 5-метокси-L-триптофан; 5-метил-триптофан; 6-бром-триптофан; 6-хлор-D-триптофан; 6-хлор-триптофан; 6-фтор-триптофан; 6-метил-триптофан; 7-бензилокси-триптофан; 7-бром-триптофан; 7-метил-триптофан; D-1,2,3,4-тетрагидро-норгарман-3-карбоновая кислота; 6-метокси-1,2,3,4-тетрагидроноргарман-1-карбоновая кислота; 7-азатриптофан; L-1,2,3,4-тетрагидро-норгарман-3-карбоновая кислота; 5-метокси-2-метил-триптофан; и 6-хлор-L-триптофан.

В отдельных вариантах осуществления настоящего изобретения аналоги аминокислот являются рацемическими. В отдельных вариантах осуществления настоящего изобретения используется D-изомер аналога аминокислоты. В отдельных вариантах осуществления настоящего изобретения используется L-изомер аналога аминокислоты. В других вариантах осуществления настоящего изобретения аналог аминокислоты содержит хиральные центры, которые имеют R- или S- конфигурацию. В дополнительных вариантах осуществления настоящего изобретения аминогруппа(ы) β-аналога аминокислоты замещена защитной группой, например, трет-бутилоксикарбонилом (BOC группа), 9-флуоренилметилоксикарбонилом (FMOC), тозильной группой, и подобной. В еще одних вариантах осуществления настоящего изобретения функциональная группа карбоновой кислоты β-аналога аминокислоты защищена, например, ее сложноэфирным производным. В отдельных вариантах осуществления настоящего изобретения используется соль аналога аминокислоты.

Остаток “заменимой” аминокислоты представляет собой остаток, который может быть изменен в последовательности полипептида дикого типа без исчезновения или значительного исчезновения его незаменимой биологической или биохимической активность (например, связывания с рецептором или активации). Остаток “незаменимой” аминокислоты представляет собой остаток, который при изменении последовательности полипептида дикого типа приводит к исчезновению или значительному исчезновению незаменимой биологической или биохимической активности полипептидов.

“Консервативная замена аминокислоты” представляет собой замену, при которой аминокислотный остаток заменяется на аминокислотный остаток, который имеет подобную боковую цепочка. В данной области техники определены семейства аминокислотных остатков, которые имеют подобные боковые цепи. Эти семейства включают аминокислоты с основными боковыми цепями (например, K, R, H), кислыми боковыми цепями (например, D, E), незаряженными полярными боковыми цепями (например, G, N, Q, S, T, Y, C), неполярными боковыми цепями (например, A, V, L, I, P, F, M, W), бета-разветвленными боковыми цепями (например, T, V, I) и ароматическими боковыми цепями (например, Y, F, W, H). Таким образом, предположительный не незаменимый аминокислотный остаток в полипептиде, например, заменяют на другой аминокислотный остаток из того же семейства боковых цепей. Другие примеры допустимых замещений представляют собой замещения, основанные на изостерических соображениях (например, норлейцин на метионин) или других свойствах (например, 2-тиенилаланин на фенилаланин).

Термин “блокирующая группа” соответствует химической функциональной группе, находящейся либо на C-конце, либо на N-конце полипептидной цепочки подлежащего пептидомиметического макроцикла. Блокирующая группа карбоксильного конца включает немодифицированную карбоновую кислоту (например, –COOH) или карбоновую кислоту с заместителем. Например, С-конец может быть замещен аминогруппой с получением карбоксамида на С-конце. Различные заместители включают, но без ограничения ими, первичные и вторичные амины, включая пегилированные вторичные амины. Репрезентативные блокирующие группы C-конца вторичного амина включают:

Блокирующая группа N-конца включает немодифицированный амин (например, –NH₂) или амин с заместителем. Например, N-конец может быть замещен ацильной группой с получением карбоксамида на N-конце. Различные заместители включают, но без ограничения ими, замещенные ацильные группы, включая карбонилы C₁-C₆, карбонилы C₇-C₃₀, и пегилированные карбаматы. Репрезентативные блокирующие группы N-конца включают:

Термин “член”, используемый в данном документе в отношении макроциклов или макроцикл-образующих линкеров соответствует атомам, которые образуют или могут образовывать макроцикл, и исключает атомы заместителя или боковой цепи. По аналогии, циклодекан, 1,2-дифтор-декан и 1,3-диметилциклодекан, с учетом всех обстоятельств, являются десятичленными макроциклами, в которых заместители водород, или фтор, или метильные боковые цепочки не принимают участие в образовании макроцикла.

Символ “

” при использовании в качестве части молекулярной структуры соответствует одинарной связи или транс- или цис- двойной связи.

Термин “аминокислота боковая цепочка” соответствует функциональной группе, присоединенной в аминокислоте к α-атому углерода (или другому атому остова). Например, боковая цепочка аминокислоты в случае аланина представляет собой метил, боковая цепочка аминокислоты в случае фенилаланина представляет собой фенилметил, боковая цепочка аминокислоты в случае цистеина представляет собой тиометил, боковая цепочка аминокислоты в случае аспартата представляет собой карбоксиметил, боковая цепочка аминокислоты в случае тирозина представляет собой 4-гидроксифенилметил, и т.д. Другие боковые цепочки не встречающихся в природе аминокислот также включают, например, те, которые встречаются в природе (например, метаболит аминокислоты) или те, которые получены синтетически (например, α,α-ди-замещенная аминокислота).

Термин “α,α-ди-замещенная аминокислота” соответствует молекуле или функциональной группа, которая содержит и аминогруппу, и гидроксильную группу, связанную с атомом углерода (α-углерод), который присоединен к двум природным или не встречающимся в природе боковым цепям аминокислоты.

Термин “полипептид” включает в себя две или более природные или не встречающиеся в природе аминокислоты, соединенные с помощью ковалентной связи (например, амидная связь). Полипептиды, как описано в данном документе, включают непроцессированный белок (например, полностью процессированные белки), также как более короткие аминокислотные последовательности (например, фрагменты встречающихся в природе белков или фрагменты синтетического полипептида).

Термин “реагент для макроциклизации” или “макроцикл-образующий реагент”, используемый в данном документе, соответствует любому реагенту, который может быть использован для получения пептидомиметического макроцикла по настоящему изобретению с помощью промежуточной реакции между двумя реакционными группами. Реакционные группы могут быть, например, азидами и алкинами, в случае которых реагенты для макроциклизации включают, без ограничения, реагенты на основе Cu, такие как реагенты, которые обеспечивают реакционные вещества на основе Cu(I), такие как CuBr, CuI или CuOTf, также как соли Cu(II), такие как Cu(CO₂CH₃)₂, CuSO₄, и CuCl₂, которые могут быть превращены insitu в активный реагент на основе Cu(I) с помощью добавления восстанавливающего средства, такого как аскорбиновая кислота или аскорбат натрия. Реагенты для макроциклизации могут, кроме того, включать, например, реагенты на основе Ru, известные в данной области техники, такие как Cp*RuCl(PPh3)2, [Cp*RuCl]4 или другие реагенты на основе Ru, которые могут обеспечивать реакционные вещества на основе Ru(II). В других случаях, реакционные группы представляют собой олефины с концевой двойной связью. В подобных вариантах осуществления настоящего изобретения реагенты для макроциклизации или макроцикл-образующий реагенты представляют собой катализаторы метатезиса, которые включают, но без ограничения ими, стабилизированные, металлкарбеновые комплексные катализаторы на основе позднего переходного металла, такие как карбеновые катализаторы на основе переходного металла группы VIII. Например, такими катализаторами являются центры с металлами Ru и Os, которые имеют степень окисления +2, количество электронов равно 16 и они являются пентакоординированными. В других примерах, катализаторы имеют центры с W или Mo. Различные катализаторы раскрыты в Grubbs исоавт., “Ring Closing Metathesis and Related Processes in Organic Synthesis” Acc. Chem. Res. 1995, 28, 446-452, ипатентСША № 5811515; патентСША № 7932397; заявка на патент США № 2011/0065915; заявка на патент США № 2011/0245477; Yu исоавт., "Synthesis of Macrocyclic Natural Products by Catalyst-Controlled Stereoselective Ring-Closing Metathesis," Nature 2011, 479, 88; и Peryshkov и соавт., "Z-Selective Olefin Metathesis Reactions Promoted by Tungsten Oxo Alkylidene Complexes," J. Am. Chem. Soc. 2011, 133, 20754. В других случаях, реакционные группы представляют собой тиоловые группы. В подобных вариантах осуществления настоящего изобретения реагент для макроциклизации представляет собой, например, линкер, замещенный двумя тиоловыми реакционными группами, такими как галогеновые группы.

Термин “галоген” или “галогеновый” соответствует фтору, хлору, брому или йоду или их радикалу.

Термин “алкил” соответствует углеводородной цепи, которая является неразветвленной цепочкой или разветвленной цепочкой, которая содержит указанное число атомов углерода. Например, C₁-C₁₀ указывает, что группа имеет в себе от 1 до 10 (включительно) углеродных атомов. В отсутствие любого цифрового обозначения, “алкил” представляет собой цепочку (неразветвленную или разветвленную), которая имеет в себе от 1 до 20 (включительно) углеродных атомов.

Термин “алкилен” соответствует двухвалентному алкилу (например, -R-).

Термин “алкенил” соответствует углеводородной цепочке, которая представляет собой неразветвленную цепочка или разветвленную цепочка, которая имеет одну или несколько углерод-углеродных двойных связей. Алкенильная функциональная группа содержит указанное число атомов углерода. Например, C₂-C₁₀ указывает, что группа имеет в себе от 2 до 10 (включительно) углеродных атомов. Термин “низший алкенил” соответствует C₂-C₆ алкенильной цепи. В отсутствие любого цифрового обозначения, “алкенил” представляет собой цепочку (неразветвленная или разветвленная), которая имеет в себе от 2 до 20 (включительно) углеродных атомов.

Термин “алкинил” соответствует углеводородной цепочке, которая представляет собой неразветвленную цепочку или разветвленную цепочку, которая имеет один или несколько углерод-углеродных тройных связей. Алкинильная функциональная группа содержит указанное число атомов углерода. Например, C₂-C₁₀ указывает, что группа имеет в себе от 2 до 10 (включительно) углеродных атомов. Термин “низший алкинил” соответствует C₂-C₆ алкинильной цепочке. В отсутствие любого цифрового обозначения, “алкинил” представляет собой цепочку (неразветвленная или разветвленная), которая имеет в себе от 2 до 20 (включительно) углеродных атомов.

Термин “арил” соответствует 6-атомной углеродной моноциклической или 10-атомной углеродной бициклической ароматической кольцевой системе, где 0, 1, 2, 3, или 4 атома каждого кольца замещены заместителем. Примеры арильных групп включают фенил, нафтил и подобные. Термин “арилалкокси” соответствует алкоксизамещенному арилу.

“Арилалкил” соответствует арильной группе, как определено выше, где один из водородных атомов арильных групп заменен на алкильную группу C₁-C₅, как определено выше. Репрезентативные примеры арилалкильной группы включают, но без ограничения ими, 2-метилфенил, 3-метилфенил, 4-метилфенил, 2-этилфенил, 3-этилфенил, 4-этилфенил, 2-пропилфенил, 3-пропилфенил, 4-пропилфенил, 2-бутилфенил, 3-бутилфенил, 4-бутилфенил, 2-пентилфенил, 3-пентилфенил, 4-пентилфенил, 2-изопропилфенил, 3-изопропилфенил, 4-изопропилфенил, 2-изобутилфенил, 3-изобутилфенил, 4-изобутилфенил, 2-втор-бутилфенил, 3-втор-бутилфенил, 4-втор-бутилфенил, 2-трет-бутилфенил, 3-трет-бутилфенил и 4-трет-бутилфенил.

“Ариламид” соответствует арильной группе, как определено выше, где один из водородных атомов арильных групп заменен на одну или несколько групп -C(O)NH₂. Репрезентативные примеры ариламидной группы включают 2-C(O)NH2-фенил, 3-C(O)NH₂-фенил, 4-C(O)NH₂-фенил, 2-C(O)NH₂-пиридил, 3-C(O)NH₂-пиридил, и 4-C(O)NH₂-пиридил.

“Алкилгетероцикл” соответствует алкильной группе C₁-C₅, как определено выше, где один из водородных атомов алкильных групп C₁-C₅ заменен на гетероцикл. Репрезентативные примеры алкилгетероциклических групп включают, но без ограничения ими, -CH₂CH₂-морфолин, -CH₂CH₂-пиперидин, -CH₂CH₂CH₂-морфолин, и -CH₂CH₂CH₂-имидазол.

“Алкиламид” соответствует алкильной группе C₁-C₅, как определено выше, где один из водородных атомов алкильных групп C₁-C₅ заменен на группу -C(O)NH₂. Репрезентативные примеры алкиламидной группы включают, но без ограничения ими, -CH₂-C(O)NH₂, -CH₂CH₂-C(O)NH₂, -CH₂CH₂CH₂C(O)NH₂, -CH₂CH₂CH₂CH₂C(O)NH₂, -CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂C(O)NH₂, -CH₂CH(C(O)NH₂)CH₃, -CH₂CH(C(O)NH₂)CH₂CH₃, -CH(C(O)NH₂)CH₂CH₃, -C(CH₃)₂CH₂C(O)NH₂, –CH₂-CH₂–NH-C(O)-CH₃, –CH₂-CH₂–NH-C(O)-CH₃-CH3, и –CH₂-CH₂–NH-C(O)-CH=CH₂.

“Алканол” соответствует алкильной группе C₁-C₅, как определено выше, где один из водородных атомов алкильных групп C₁-C₅ заменен на гидроксильную группу. Репрезентативные примеры алканольных групп включают, но без ограничения ими, -CH₂OH, -CH₂CH₂OH, -CH₂CH₂CH₂OH, -CH₂CH₂CH₂CH₂OH, -CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂OH, -CH₂CH(OH)CH₃, -CH₂CH(OH)CH₂CH₃, -CH(OH)CH₃ и -C(CH₃)₂CH₂OH.

“Алкилкарбокси” соответствует алкильной группе C₁-C₅, как определено выше, где один из водородных атомов алкильных групп C₁-C₅ заменен на группу --COOH. Репрезентативные примеры алкилкарбоксильной группы включают, но без ограничения ими, -CH₂COOH, -CH₂CH₂COOH, -CH₂CH₂CH₂COOH, -CH₂CH₂CH₂CH₂COOH, -CH₂CH(COOH)CH₃, -CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂COOH, -CH₂CH(COOH)CH₂CH₃, -CH(COOH)CH₂CH₃ и -C(CH₃)₂CH₂COOH.

Термин “циклоалкил”, как используется в данном документе, включает насыщенные и частично ненасыщенные циклические углеводородные группы, которые имеют от 3 до 12 атомов углерода, предпочтительно от 3 до 8 атомов углерода, и более предпочтительно от 3 до 6 атомов углерода, где циклоалкильная группа, кроме того, необязательно замещена. Некоторые циклоалкильные группы включают, без ограничения, циклопропил, циклобутил, циклопентил, циклопентенил, циклогексил, циклогексeнил, циклогептил, и циклооктил.

Термин “гетероарил” соответствует ароматической 5-8-членной моноциклической, 8-12-членной бициклической, или 11-14-членной трициклической кольцевой системе, которая имеет от 1 до 3 гетероатомов, если является моноциклической, 1-6 гетероатомов, если является бициклической, или 1-9 гетероатомов, если является трициклической, указанные гетероатомы выбраны из O, N, или S (например, углеродные атомы и от 1 до 3, 1-6, или 1-9 гетероатомов O, N, или S, если моноциклическая, бициклическая, или трициклическая, соответственно), где 0, 1, 2, 3, или 4 атомов каждого кольца замещены заместителем. Примеры гетероарильных групп включают пиридил, фурил или фуранил, имидазолил, бензимидазолил, пиримидинил, тиофенил или тиенил, хинолинил, индолил, тиазолил, и подобные.

Термин “гетероарилалкил” или термин “гетероаралкил” соответствует алкилу, замещенному гетероарилом. Термин “гетероарилалкокси” соответствует алкокси группе, замещенной гетероарилом.

Термин “гетероциклил” соответствует неароматической 5-8-членной моноциклической, 8-12-членной бициклической, или 11-14-членной трициклической кольцевой системе, которая имеет от 1 до 3 гетероатомов, если является моноциклической, 1-6 гетероатомов, если является бициклической, или 1-9 гетероатомов, если является трициклической, указанные гетероатомы выбраны из O, N, или S (например, углеродные атомы и от 1 до 3, от 1 до 6, или от 1 до 9 гетероатомов O, N, или S, если является моноциклической, бициклической, или трициклической, соответственно), где 0, 1, 2 или 3 атома каждого кольца замещены заместителем. Примеры гетероциклильных групп включают пиперазинил, пирролидинил, диоксанил, морфолинил, тетрагидрофуранил, и подобные.

Термин “заместитель” соответствует группе, которая заменяет другой атом или группу, такую как атом водорода, в любой молекуле, соединении или функциональной группе. Соответствующие заместители включают, без ограничения, галоген, гидрокси, меркапто, оксо, нитро, галогеналкил, алкил, алкарил, арил, аралкил, алкокси, тиоалкокси, арилокси, амино, алкоксикарбонил, амидо, карбокси, алкансульфонил, алкилкарбонил, и циано группы.

В отдельных вариантах осуществления настоящего изобретения соединения по настоящему изобретению содержат один или несколько асимметрических центров и таким образом, встречается в виде рацематов и рацемических смесей, отдельных энантиомеров, отдельных диастереомеров и диастереомерных смесей. Все подобные изомерные формы этих соединений включены в объем настоящего изобретения, если специально не предусмотрено другое. В отдельных вариантах осуществления настоящего изобретения соединения по настоящему изобретению также представлены в различных таутомерных формах, в таких случаях, настоящее изобретение включает все таутомерные формы соединения, описанного в данном документе (например, если алкилирование кольцевой системы приводит к алкилированию нескольких положений, настоящее изобретение включает все подобные продукты реакции). Все подобные изомерные формы подобных соединений включены в настоящее изобретение, если специально не предусмотрено другое. Все кристаллические формы соединений, описанных в данном документе, включены в настоящее изобретение, если специально не предусмотрено другое.

Используемый в данном документе, термины “увеличение” и “уменьшение” используют, соответственно, для обозначения статистически значительного (например, p<0,1) увеличения или уменьшения на по меньшей мере 5%.

Как используется в данном документе, приведение числового диапазона для переменной предназначено для обозначения того, что переменная равна любому из значений в пределах этого диапазона. Таким образом, для переменной, которая является по своей сути дискретной, переменная равна любому целому числу в пределах числового диапазона, включая крайние точки диапазона. Аналогично этому, для переменной, которая является по своей сути неразрывной, переменная равна любому реальному значению в пределах числового диапазона, включая крайние точки диапазона. В качестве примера, и без ограничения, переменная, которая описывается как имеющая значения между 0 и 2, принимает значения 0, 1 или 2, если переменная является по своей сути дискретной, и принимает значения 0,0, 0,1, 0,01, 0,001, или любые другие реальные значения ≥0 и ≤2, если переменная является по своей сути неразрывной.

Как используется в данном документе, если специально не указано другое, слово “или” используется в смысле исключительно “и/или”, а не исключительно в смысле “или/или.”

Термин “в среднем” представляет собой среднее значение, полученное от выполнения не менее трех независимых повторов для каждой точки измерения.

Термин “биологическая активность” включает в себя структурные и функциональные свойства макроцикла по настоящему изобретению. Биологическая активность представляет собой, например, структурную стабильность, альфа-спиральность, сродство к мишени, устойчивость к протеолитическому распаду, клеточную проницаемость, внутриклеточную стабильность, стабильность invivo, или любую их комбинацию.

Детали одного или нескольких отдельных вариантов осуществления настоящего изобретения приведены в прилагаемых графических материалах и описании ниже. Другие признаки, цели и преимущества настоящего изобретения будут очевидны из описания и чертежей и из формулы изобретения.

В отдельных вариантах осуществления настоящего изобретения пептидные последовательности получены из пептида GHRH. Например, пептидные последовательности получены из GHRH человека (1-29) или GHRH человека (1-44).

Неограничивающий перечень примеров пептидов GHRH, подходящих для применения по настоящему изобретению, приведены ниже в Таблице 1 и Таблица 2. В Таблицах 1 и 2, все пептиды имеют свободный N-конец (показано как H-) и все пептиды имеют на конце карбоксамидную группу (показано как –NH2). Остатки X образуют сшивки с другим остатком X, остатки Z образуют сшивки с другим остатком Z, аХ остатки образуют сшивки с двумя другими остатками X. В Таблицах 1 и 2, аминокислота А2 представляет собой либо L-Ala, либо D-Ala, А8 представляет собой либо L-Asn, либо L-Gln, А15 представляет собой либо L-Ala, либо Gly, и А27 представляет собой либо L-Nle, либо L-Leu.

H-Y-A2-DAIFT-A8-SYRKVL-A15-X-LSARKL-X-QDI-A27-SR-NH2

H-Y-A2-DAIFT-A8-SYRKVL-A15-Q-X-SARKLL-X-ди-A27-SR-NH2

H-Y-A2-DAIFT-A8-SYRKVL-A15-QL-X-ARKLLQ-X-I-A27-SR-NH2

H-Y-A2-DAIFT-A8-SYRKVL-A15-QLS-X-RKLLQD-X-A27-SR-NH2

H-Y-A2-DAIFT-A8-SYRKVL-A15-QLSA-X-KLLQDI-X-SR-NH2

H-Y-A2-DAIFT-A8-SYRKVL-A15-QLSAR-X-LLQDI-A27-X-R-NH2

H-Y-A2-DAIFT-A8-SYRKVL-A15-QLSARK-X-LQDI-A27-S-X-NH2

H-Y-A2-D-X-IFT-A8-SY-X-KVL-A15-QLSAR-Z-LLQ-Z-I-A27-SR-NH2

H-Y-A2-D-X-IFT-A8-SY-X-KVL-A15-QLSARKLLQ-Z-I-A27-S-Z-NH2

H-Y-A2-DA-X-FT-A8-SYR-X-VL-A15-QLSAR-Z-LLQ-Z-I-A27-SR-NH2

H-Y-A2-DA-X-FT-A8-SYR-X-VL-A15-QLSARKLLQ-Z-I-A27-S-Z-NH2

H-Y-A2-DAI-X-T-A8-SYRK-X-L-A15-QLSAR-Z-LLQ-Z-I-A27-SR-NH2

H-Y-A2-DAI-X-T-A8-SYRK-X-L-A15-QLSARKLLQ-Z-I-A27-S-Z-NH2

H-Y-A2-DAIF-X-A8-SYRKV-X-A15-QLSAR-Z-LLQ-Z-I-A27-SR-NH2

H-Y-A2-DAIF-X-A8-SYRKV-X-A15-QLSARKLLQ-Z-I-A27-S-Z-NH2

H-Y-A2-DAIFT-X-SYRKVL-X-QLSAR-Z-LLQ-Z-I-A27-SR-NH2

H-Y-A2-DAIFT-X-SYRKVL-X-QLSARKLLQ-Z-I-A27-S-Z-NH2

H-Y-A2-DAIFT-A8-X-YRKVL-A15-X-LSARKLLQ-Z-I-A27-S-Z-NH2

H-Y-A2-DAIFT-A8-X-YRKVL-A15-X-LSAR-Z-LLQ-Z-I-A27-SR-NH2

H-Y-A2-DAIFT-A8-SYR-X-VL-A15-QLS-X-RKLLQ-Z-I-A27-S-Z-NH2

H-Y-A2-D-X-IFT-X-SYRKVL-Z-QLSARK-Z-LQDI-A27-SR-NH2

H-Y-A2-D-X-IFT-X-SYRKVL-A15-QL-Z-ARKLLQ-Z-I-A27-SR-NH2

H-Y-A2-D-X-IFT-X-SYRKVL-A15-QLSAR-Z-LLQDI-A27-Z-R-NH2

H-Y-A2-D-X-IFT-X-SYRKVL-A15-QLSARK-Z-LQDI-A27-S-Z-NH2

H-Y-A2-DAIFT-X-SYR-X-VL-Z-QLSARK-Z-LQDI-A27-SR-NH2

H-Y-A2-DAIFT-X-SYR-X-VL-A15-QL-Z-ARKLLQ-Z-I-A27-SR-NH2

H-Y-A2-DAIFT-X-SYR-X-VL-A15-QLSAR-Z-LLQDI-A27-Z-R-NH2

H-Y-A2-DAIFT-X-SYR-X-VL-A15-QLSARK-Z-LQDI-A27-S-Z-NH2

H-Y-A2-DAIFT-A8-SYR-X-VL-A15-X-LSAR-Z-LLQDI-A27-Z-R-NH2

H-Y-A2-DAIFT-A8-SYR-X-VL-A15-X-LSARK-Z-LQDI-A27-S-Z-NH2

H-Y-A2-DAIFT-A8-SY-X-KVL-X-QLSAR-Z-LLQDI-A27-Z-R-NH2

H-Y-A2-DAIFT-A8-SY-X-KVL-X-QLSARK-Z-LQDI-A27-S-Z-NH2

H-Y-A2-D-X-IFT-XX-SYR-X-VL-A15-QLSARKLLQDI-A27-SR-NH2

H-Y-A2-DAIFT-X-SYR-XX-VL-A15-X-LSARKLLQDI-A27-SR-NH2

H-Y-A2-DAIFT-A8-SYR-X-VL-A15-XX-LSA-X-KLLQDI-A27-SR-NH2

H-Y-A2-DAIFT-A8-SYRKVL-A15-QLSAR-X-LLQ-XX-I-A27-S-X-NH2

H-Y-A2-D-X-IFT-XX-SYRKVL-X-QLSARKLLQDI-A27-SR-NH2

H-Y-A2-D-X-IFT-A8-SY-XX-KVL-X-QLSARKLLQDI-A27-SR-NH2

H-Y-A2-DAIFT-X-SYR-XX-VL-A15-QLS-X-RKLLQDI-A27-SR-NH2

H-Y-A2-DAIFT-X-SYRKVL-XX-QLS-X-RKLLQDI-A27-SR-NH2

H-Y-A2-DAIFT-A8-X-YRKVL-A15-XX-LSA-X-KLLQDI-A27-SR-NH2

H-Y-A2-DAIFT-A8-X-YRK-XX-L-A15-QLSA-X-KLLQDI-A27-SR-NH2

H-Y-A2-DAIFT-A8-SYR-X-VL-A15-QLS-XX-RKL-X-QDI-A27-SR-NH2

H-Y-A2-DAIFT-A8-SYR-X-VL-A15-XX-LSARKL-X-QDI-A27-SR-NH2

H-Y-A2-DAIFT-A8-SYRKVL-A15-X-LSARKL-XX-QDI-X-SR-NH2

H-Y-A2-DAIFT-A8-SYRKVL-A15-X-LSA-XX-KLLQDI-X-SR-NH2

H-Y-A2-DAIFT-A8-SYRKVL-A15-QL-X-ARK-XX-LQDI-A27-S-X-NH2

H-Y-A2-DAIFT-A8-SYRKVL-A15-QL-X-ARKLLQ-XX-I-A27-S-X-NH2

H-Y-A2-D-X-IFT-A8-SY-XX-KVL-A15-QL-X-ARKLLQDI-A27-SR-NH2

H-Y-A2-DAIFT-X-SYRKVL-XX-QLSARK-X-LQDI-A27-SR-NH2

H-Y-A2-DAIFT-A8-X-YRKVL-A15-XX-LSARKL-X-QDI-A27-SR-NH2

H-Y-A2-DAIFT-A8-SYR-X-VL-A15-QLS-XX-RKLLQD-X-A27-SR-NH2

QQGESNQERGARARL-NH2
H-Y-A2-DAIFT-X-SYRKVL-X-QLSAR-Z-LLQ-Z-I-A27-SRQQGESNQERGARARL-NH2

H-Y-A2-DAIFT-X-SYRKVL-X-QLSARKLLQ-Z-I-A27-S-Z-QQGESNQERGARARL-NH2

Пептидомиметические макроциклы по настоящему изобретению

В отдельных вариантах осуществления настоящего изобретения пептидомиметический макроцикл по настоящему изобретению имеет

где:

каждый A, C, D, и E независимо представляет собой аминокислоту (включая природные или искусственные аминокислоты и аналоги аминокислот) и концевые D и E независимо необязательно включают блокирующую группу;

B представляет собой аминокислоту (включая природные или искусственные аминокислоты и аналоги аминокислот),

[-NH-L₃-CO-], [-NH-L₃-SO₂-], или [-NH-L₃-];

R₁ и R₂ независимо представляют собой –H, алкил, алкенил, алкинил, арилалкил, циклоалкил, циклоалкилалкил, гетероалкил, или гетероциклоалкил, незамещенные или замещенные на галоген;

и где A, B, C, D, и E, взятые вместе со сшитыми аминокислотами, соединенные с помощью макроцикл-образующего линкера L, образуют аминокислотную последовательность пептидомиметического макроцикла, которая на по меньшей мере приблизительно 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, или 99% идентична GHRH 1-44, GHRH 1-29 и/или аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей из Таблицы 1, 2 или 4;

R₇ представляет собой –H, алкил, алкенил, алкинил, арилалкил, циклоалкил, гетероалкил, циклоалкилалкил, гетероциклоалкил, циклоарил, или гетероциклоарил, который необязательно замещен на R₅, или часть циклической структуры с остатком D;

R₈ представляет собой –H, алкил, алкенил, алкинил, арилалкил, циклоалкил, гетероалкил, циклоалкилалкил, гетероциклоалкил, циклоарил, или гетероциклоарил, который необязательно замещен на R₅, или часть циклической структуры с остатком E;

n представляет собой целое число от 1 до 5, например, 1. Например, u представляет собой 2. В отдельных вариантах осуществления настоящего изобретения сумма x+y+z представляет собой 2, 3 или 6, например 3 или 6.

B представляет собой аминокислоту,

[-NH-L₃-CO-], [-NH-L₃-SO₂-], или [-NH-L₃-];

L₁’ и L₂’ независимо представляют собой алкилен, алкенилен, алкинилен, гетероалкилен, циклоалкилен, гетероциклоалкилен, циклоарилен, гетероциклоарилен, или [-R₄-K-R₄-]_n, каждый из которых необязательно замещен на R₅;

R₇’ представляет собой –H, алкил, алкенил, алкинил, арилалкил, циклоалкил, гетероалкил, циклоалкилалкил, гетероциклоалкил, циклоарил, или гетероциклоарил, который необязательно замещен на R₅, или часть циклической структуры с остатком D;

R₈’ представляет собой –H, алкил, алкенил, алкинил, арилалкил, циклоалкил, гетероалкил, циклоалкилалкил, гетероциклоалкил, циклоарил, или гетероциклоарил, который необязательно замещен на R₅,иличасть циклической структуры с остатком E;

v’ и w’ независимо представляют собой целые числа от 1 до 1000, например от 1 до 500, от 1 до 200, от 1 до 100, от 1 до 50, от 1 до 40, от 1 до 25, от 1 до 20, от 1 до 15, или от 1 до 10;

n представляет собой целое число от 1 до 5. В отдельных вариантах осуществления настоящего изобретения сумма x’+y’+z’ представляет собой 2, 3 или 6, например, 3 или 6.

В отдельных вариантах осуществления настоящего изобретения в любом их пептидомиметических макроциклов, описанных в данном документе, каждый K представляет собой O, S, SO, SO₂, CO, или CO₂.

В одном примере, по меньшей мере один из R₁ и R₂ представляет собой алкил, незамещенный или замещенный на галоген. В другом примере, и R₁, и R₂ независимо представляют собой алкил, незамещенный или замещенный на галоген. В отдельных вариантах осуществления настоящего изобретения по меньшей мере один из R₁ и R₂ представляет собой метил. В других вариантах осуществления настоящего изобретения R₁ и R₂ представляют собой метил.

В отдельных вариантах осуществления настоящего изобретения сумма x+y+z представляет собой по меньшей мере 3, и/или сумма x’+y’+z’ представляет собой по меньшей мере 3. В других вариантах осуществления настоящего изобретения по настоящему изобретению, сумма x+y+z представляет собой 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 (например, 2, 3 или 6) и/или сумма x’+y’+z’ представляет собой 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 (например, 2, 3 или 6).

Каждое появление A, B, C, D или E в макроцикле или предшественнике макроцикла по настоящему изобретению выбирается независимо. Например, последовательность представлена Формулой [A]_x, где x представляет собой 3, включает в себя варианты осуществления настоящего изобретения, где аминокислоты являются неидентичными, например Gln–Asp–Ala, также как варианты осуществления настоящего изобретения, где аминокислоты являются идентичными, например Gln–Gln–Gln. Это относится к любой величине x, y, или z в указанных диапазонах. Аналогично этому, когда u больше 1, каждое соединение по настоящему изобретению может охватывать пептидомиметические макроциклы, которые являются одинаковыми или различными. Например, соединение по настоящему изобретению может содержать пептидомиметические макроциклы, которые содержат линкеры с различными длинами или химическими составами.

В отдельных вариантах осуществления настоящего изобретения пептидомиметический макроцикл по настоящему изобретению содержит вторичную структуру, которая представляет собой α-спираль и R₈ представляет собой –H, делая возможным образование водородных связей внутри спирали. В отдельных вариантах осуществления настоящего изобретения по меньшей мере один из A, B, C, D или E представляет собой α,α-двузамещенную аминокислоту. В одном примере B представляет собой α,α-двузамещенную аминокислоту. Например, по меньшей мере один из A, B, C, D или E представляет собой 2-аминоизомасляную кислоту. В других вариантах осуществления настоящего изобретения по меньшей мере один из A, B, C, D или E представляет собой

.

В других вариантах осуществления настоящего изобретения длина макроцикл-образующий линкера L, измеренный от первого Cα до второго Cα, выбирают для того, чтобы стабилизировать требуемую вторичную структуру пептида, такую как α-спираль, образованную остатками пептидомиметического макроцикла, включая, но не обязательно ограничиваясь ими, те, которые находятся между первым Cα и вторым Cα.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения пептидомиметический макроцикл Формулы (I) представляет собой:

где каждый R₁ и R₂ независимо представляет собой –H, алкил, алкенил, алкинил, арилалкил, циклоалкил, циклоалкилалкил, гетероалкил, или гетероциклоалкил, незамещенный или замещенный на галоген.

В связанных вариантах осуществления настоящего изобретения пептидомиметический макроцикл содержит структуру Формулы (I), которая представляет собой:

или

В других вариантах осуществления настоящего изобретения пептидомиметический макроцикл Формулы (I) представляет собой соединение любой из Формул, приведенных ниже:

где “AA” представляет собой любой природную или не

встречающуюся в природе боковую цепочку аминокислоты и “

“ представляет собой [D]_v, [E]_w, как определено выше, и n представляет собой целое число между 0 и 20, 50, 100, 200, 300, 400 или 500. В отдельных вариантах осуществления настоящего изобретения заместитель “n”, приведенный в предыдущем параграфе, представляет собой 0. В других вариантах осуществления настоящего изобретения заместитель “n”, приведенный в предыдущем параграфе, менее 50, 40, 30, 20, 10, или 5.

Иллюстративные варианты осуществления макроцикл-образующего линкера L показаны ниже.

В других вариантах осуществления настоящего изобретения D и/или E в соединении Формулы I так же модифицированы для того, чтобы облегчить клеточное поглощение. В отдельных вариантах осуществления настоящего изобретения образование соединения с липидами или пегилирование пептидомиметического макроцикла облегчает клеточное поглощение, увеличивает биодоступность, увеличивает кровообращение, изменяет фармакокинетику, уменьшает иммуногенность и/или уменьшает необходимую частоту введения.

В других вариантах осуществления настоящего изобретения по меньшей мере один из [D] и [E] в соединении Формулы I представляет собой функциональную группу, которая содержит дополнительный макроцикл-образующий линкер таким образом, что пептидомиметический макроцикл содержит по меньшей мере два макроцикл-образующих линкера. В отдельных вариантах осуществления настоящего изобретения пептидомиметический макроцикл содержит два макроцикл-образующих линкера.

В пептидомиметических макроциклах по настоящему изобретению любой из макроцикл-образующих линкеров, описанных в данном документе, может быть использован в любой комбинация с любой из последовательностей, приведенных в Таблицах от 1 до 3 и также с любым из R– заместителей, указанных в данном документе.

В отдельных вариантах осуществления настоящего изобретения пептидомиметический макроцикл содержит по меньшей мере один мотив α-спирали. Например, A, B и/или C в соединении Формулы I включают одну или несколько α-спиралей. В общем, α-спирали включают от 3 до 4 аминокислотных остатков на петлю. В отдельных вариантах осуществления настоящего изобретения α-спираль пептидомиметического макроцикла включает от 1 до 5 петель и, поэтому, от 3 до 20 аминокислотных остатков. В отдельных вариантах осуществления настоящего изобретения α-спираль включает 1 петлю, 2 петли, 3 петли, 4 петли, или 5 петель. В отдельных вариантах осуществления настоящего изобретения макроцикл-образующий линкер стабилизирует мотив α-спирали, который включен в структуру пептидомиметического макроцикла. Таким образом, в отдельных вариантах осуществления настоящего изобретения для увеличения стабильности α-спирали выбирают длину макроцикл-образующего линкера L от первого Cα до второго Cα. В отдельных вариантах осуществления настоящего изобретения макроцикл-образующий линкер охватывает от 1 петли до 5 петель α-спирали. В отдельных вариантах осуществления настоящего изобретения макроцикл-образующий линкер охватывает приблизительно 1 петлю, 2 петли, 3 петли, 4 петли, или 5 петель α-спирали. В отдельных вариантах осуществления настоящего изобретения длина макроцикл-образующего линкера составляет приблизительно от 5 Å до 9 Å на петлю α-спирали, или приблизительно от 6 Å до 8 Å на петлю α-спирали. Если макроцикл-образующий линкер охватывает приблизительно 1 петлю α-спирали, длина составляет от приблизительно 5 углерод-углеродных связей до 13 углерод-углеродных связей, приблизительно от 7 углерод-углеродных связей до 11 углерод-углеродных связей, или приблизительно 9 углерод-углеродных связей. Если макроцикл-образующий линкер охватывает приблизительно 2 петли α-спирали, длина составляет приблизительно от 8 углерод-углеродных связей до 16 углерод-углеродных связей, приблизительно от 10 углерод-углеродных связей до 14 углерод-углеродных связей, или приблизительно 12 углерод-углеродных связей. Если макроцикл-образующий линкер охватывает приблизительно 3 петли α-спирали, длина составляет приблизительно от 14 углерод-углеродных связей до 22 углерод-углеродных связей, приблизительно от 16 углерод-углеродных связей до 20 углерод-углеродных связей, или приблизительно 18 углерод-углеродных связей. Если макроцикл-образующий линкер охватывает приблизительно 4 петли α-спирали, длина составляет приблизительно от 20 углерод-углеродных связей до 28 углерод-углеродных связей, приблизительно от 22 углерод-углеродных связей до 26 углерод-углеродных связей, или приблизительно 24 углерод-углеродные связи. Если макроцикл-образующий линкер охватывает приблизительно 5 петель α-спирали, длина составляет приблизительно от 26 углерод-углеродных связей до 34 углерод-углеродных связей, приблизительно от 28 углерод-углеродных связей до 32 углерод-углеродных связей, или приблизительно 30 углерод-углеродных связей. Если макроцикл-образующий линкер охватывает приблизительно 1 петля α-спирали, связь содержит приблизительно от 4 атомов до 12 атомов, приблизительно от 6 атомов до 10 атомов, или приблизительно 8 атомов. Если макроцикл-образующий линкер охватывает приблизительно 2 петли α-спирали, связь содержит приблизительно от 7 атомов до 15 атомов, приблизительно от 9 атомов до 13 атомов, или приблизительно 11 атомов. Если макроцикл-образующий линкер охватывает приблизительно 3 петли α-спирали, связь содержит приблизительно от 13 атомов до 21 атомов, приблизительно от 15 атомов до 19 атомов, или приблизительно 17 атомов. Если макроцикл-образующий линкер охватывает приблизительно 4 петли α-спирали, связь содержит приблизительно от 19 атомов до 27 атомов, приблизительно от 21 атомов до 25 атомов, или приблизительно 23 атома. Если макроцикл-образующий линкер охватывает приблизительно 5 петель α-спирали, связь содержит приблизительно от 25 атомов до 33 атомов, приблизительно от 27 атомов до 31 атомов, или приблизительно 29 атомов. Если макроцикл-образующий линкер охватывает приблизительно 1 петлю α-спирали, полученный в результате макроцикл образует кольцо, которое содержит приблизительно от17 членов до 25 членов, приблизительно 19 членов до 23 членов, или приблизительно 21 член. Если макроцикл-образующий линкер охватывает приблизительно 2 петли α-спирали, полученный в результате макроцикл образует кольцо, которое содержит приблизительно от 29 членов до 37 членов, приблизительно от 31 членов до 35 членов, или приблизительно 33 члена. Если макроцикл-образующий линкер охватывает приблизительно 3 петли α-спирали, полученный в результате макроцикл образует кольцо, которое содержит приблизительно от 44 членов до 52 членов, приблизительно от 46 членов до 50 членов, или приблизительно 48 членов. Если макроцикл-образующий линкер охватывает приблизительно 4 петли α-спирали, полученный в результате макроцикл образует кольцо, которое содержит приблизительно от 59 членов до 67 членов, приблизительно от 61 членов до 65 членов, или приблизительно 63 члена. Если макроцикл-образующий линкер охватывает приблизительно 5 петель α-спирали, полученный в результате макроцикл образует кольцо, которое содержит приблизительно от 74 членов до 82 членов, приблизительно от 76 членов до 80 членов, или приблизительно 78 членов.

В отдельных вариантах осуществления настоящего изобретения L представляет собой макроцикл-образующий линкер Формулы

Иллюстративные варианты осуществления подобных макроцикл-образующий линкеров по настоящему изобретению L показаны ниже.

В других вариантах осуществления настоящее изобретение обеспечивает пептидомиметические макроциклы Формулы (II) или (IIa):

где:

B представляет собой аминокислоту,

[-NH-L₃-CO-], [-NH-L₃-SO₂-], или [-NH-L₃-];

и где A, B, C, D, и E, взятые вместе со сшитыми аминокислотами, соединенные с помощью макроцикл-образующего линкера -L₁-L₂-, образуют аминокислотную последовательность пептидомиметического макроцикла, которая на по меньшей мере приблизительно 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, или 99% идентична GHRH 1-44, GHRH 1-29 и/или аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей из Таблицы 1, 2 или 4;

v и w независимо представляют собой целые числа от 1 до 1000, например от 1 до 100;

u, x, y и z независимо представляют собой целые числа от 0 до 10, например u представляет собой от 1 до 3; и

n представляет собой целое число от 1 до 5.

В одном примере по меньшей мере один из R₁ и R₂ представляет собой алкил, незамещенный или замещенный на галоген. В другом примере, и R₁, и R₂ независимо представляют собой алкил, незамещенный или замещенный на галоген. В отдельных вариантах осуществления настоящего изобретения по меньшей мере один из R₁ и R₂ представляет собой метил. В других вариантах осуществления настоящего изобретения R₁ и R₂ представляют собой метил.

В отдельных вариантах осуществления настоящего изобретения сумма x+y+z составляет по меньшей мере 1. В других вариантах осуществления настоящего изобретения по настоящему изобретению, сумма x+y+z составляет по меньшей мере 2. В других вариантах осуществления настоящего изобретения по настоящему изобретению, сумма x+y+z составляет 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10. Каждое появление A, B, C, D или E в макроцикле или предшественнике макроцикла по настоящему изобретению выбирается независимо. Например, последовательность представлена Формулой [A]_x, где x составляет 3, включает в себя варианты осуществления настоящего изобретения.где аминокислоты являются неидентичными, например Gln–Asp–Ala, а также варианты осуществления настоящего изобретения, где аминокислоты являются идентичными, например Gln–Gln–Gln. Это относится к любой величине x, y, или z в указанных диапазонах.

В отдельных вариантах осуществления настоящего изобретения пептидомиметический макроцикл по настоящему изобретению содержит вторичную структуру, которая представляет собой α-спираль и R₈ представляет собой –H, делая возможным образование водородных связей внутри спирали. В отдельных вариантах осуществления настоящего изобретения по меньшей мере один из A, B, C, D или E представляет собой α,α-двузамещенную аминокислоту. В одном примере, B представляет собой α,α-двузамещенную аминокислоту. Например, по меньшей мере один из A, B, C, D или E представляет собой 2-аминоизомасляную кислоту. В других вариантах осуществления настоящего изобретения по меньшей мере один из A, B, C, D или E представляет собой

В других вариантах осуществления настоящего изобретения длину макроцикл-образующего линкера -L₁-L₂-, измеренную от первого Cα до второго Cα, выбирают для того, чтобы стабилизировать требуемую вторичную структуру пептида, такую как α-спираль, образованную остатками пептидомиметического макроцикла, включая, но не обязательно ограничиваясь ими, те, которые находятся между первым Cα и вторым Cα.

Иллюстративные варианты осуществления макроцикл-образующего линкера по настоящему изобретению -L₁-L₂- показаны ниже.

Примеры пептидомиметических макроциклов Формулы (II) показаны в Таблице 4 и включают SP-85, SP-86, SP-87, SP-88, SP-91, и SP-92.

Получение пептидомиметических макроциклов

Пептидомиметические макроциклы по настоящему изобретению могут быть получены с помощью любого из множества способов, известных в данной области техники. Например, любой из остатков, указанных как “X”, “Z” или “XX” в Таблицах 1, 2 или 4, может быть замещен остатком, способным к образованию сшивающего средства со вторым остатком в той же молекуле или предшественнике подобных остатков.

В данной области техники известны различные эффективные способы образования пептидомиметических макроциклов. Например, получение пептидомиметических макроциклов Формулы I описанное в Schafmeister и соавт., J. Am. Chem. Soc. 122:5891-5892 (2000); Schafmeister&Verdine, J. Am. Chem. Soc. 122:5891 (2005); Walensky и соавт., Science 305:1466-1470 (2004); патент США № 7192713 и PCT заявка WO 2008/121767. α,α-двузамещенные аминокислоты и предшественники аминокислот, раскрытые в цитированных ссылках, могут быть использованы в синтезе пептидомиметического макроцикла предшественника полипептидов. Например, “S5-олефиновая аминокислота” представляет собой (S)-α-(2’-пентенил)аланин и “R8 олефиновая аминокислота” представляет собой (R)-α-(2’-октенил)аланин. После включение подобных аминокислот в предшественники полипептидов, олефины с концевой двойной связью вступают во взаимодействие с катализатором метатезиса, что приводит к образованию пептидомиметического макроцикла. В различных вариантах осуществления настоящего изобретения следующие аминокислоты могут быть использованы в синтезе пептидомиметического макроцикла:

В отдельных вариантах осуществления настоящего изобретения x+y+z составляет 3, и A, B и C независимо представляют собой природные или искусственные аминокислоты. В других вариантах осуществления настоящего изобретения x+y+z составляет 6, и A, B и C независимо представляют собой природные или искусственные аминокислоты.

В отдельных вариантах осуществления настоящего изобретения этап взаимодействия выполняется в растворителе, выбранном из группы, состоящей из протонного растворителя, водного растворителя, органического растворителя, и их смесей. Например, растворитель может быть выбран из группы, состоящей из H₂O, THF, THF/H₂O, tBuOH/H₂O, DMF, DIPEA, CH₃CN или CH₂Cl₂, ClCH₂CH₂Cl или их смеси. Растворитель может быть растворителем, который содействует спирализации.

Альтернативные, но эквивалентные защитные группы, замещающие группы или реагенты замещены, и некоторые из этапов синтеза выполняются в альтернативной последовательности или для получения требуемых соединений. Превращения синтетической химии и методологии защитных групп (защита и снятие защитных групп), пригодные для синтезирования соединений, описанные в данном документе, включают, например, те, которые описаны в Larock, Comprehensive OrganicTransformations, VCHPublishers (1989); Greene и Wuts, ProtectiveGroupsin Organic Synthesis, 2d. Ed., John Wiley и Sons (1991); Fieser и Fieser, Fieser and Fieser's Reagents for Organic Synthesis, John Wiley и Sons (1994); и Paquette, ed., Encyclopedia of Reagents for Organic Synthesis, John Wiley и Sons (1995), иихпоследующихизданиях.

Пептидомиметические макроциклы, раскрытые в данном документе, сделаны, например, с помощью способов химического синтеза, таких как описаны в Fields и соавт., Часть 3 в SyntheticPeptides: AUser'sGuide, ed. Grant, W. H. Freeman & Co., New York, N. Y., 1992, p. 77. Хотя, например, в пептидах, синтезированных с использованием твердофазного автоматизированного синтеза полипептидов по Меррифилду с аминогруппой, защищенной с помощью либо tBoc, либо Fmoc, используется химия защищенных аминокислот боковой цепочки, например, автоматический синтезатор пептидов (например, AppliedBiosystems (Фостер Сити, Калифорния), модель 430A, 431, или 433).

Один из способов получения пептидомиметических предшественников и пептидомиметических макроциклов, описанных в данном документе, использует твердофазный пептидный синтез (SPPS). C-концевая аминокислота присоединена к сетчатой полистирольной смоле посредством кислотолабильной связи с молекулой-линкером. Эта смола нерастворима в растворителях, использумых для синтеза, что делает смывание избытка реагентов и побочных продуктов относительно простым и быстрым.N-конец защищен группой Fmoc, которая является устойчивой к кислоте, но удаляется с помощью основания. Функциональные группы боковой цепочки защищены при необходимости щелочелабильными, кислотолабильными группами.

Более длинные пептидомиметические предшественники получают, например, с помощью сочетания отдельных синтетических пептидов с использованием нативного химического сшивания. Альтернативно, более длинные синтетические пептиды биосинтезируют с помощью хорошо известного рекомбинантного ДНК и техник экспрессии белка. Подобные техники представлены в хорошо известных типовых инструкциях с детализированными протоколами. Для построения гена, кодирующего пептидомиметического предшественника по настоящему изобретению, аминокислотная последовательность подвергается процессу обратной трансляции для того, чтобы получить нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность, предпочтительно с кодонами, которые являются оптимальными для организма, в котором ген должен быть экспрессирован. Далее, синтетический ген получают, как правило, с помощью синтезирования олигонуклеотидов, которые при необходимости кодируют пептид и любые регуляторные элементы. Синтетический ген включается в соответствующий клонирующий вектор и трансфицируется в клетку-хозяина. Пептид в дальнейшем экспрессируется при соответствующих патологических состояниях, подходящих для выбранной экспрессирующей системы и хозяина. Пептид очищали и определяли с помощью стандартных методов.

Пептидомиметические предшественники получают, например, с высокой пропускной способностью, комбинаторным образом, с использованием, например, высокой пропускной способности поликанального комбинаторного синтезатора (например, мультиканальный синтезатор пептидов ThuramedTETRAS от CreoSalus, Луисвилль, Кентикку или мультиканальный синтезатор пептидов ModelApex 396 от AAPPTEC, Inc., Луисвилль, Кентукки).

В отдельных вариантах осуществления настоящего изобретения пептидомиметические макроциклы по настоящему изобретению содержат триазольные макроцикл-образующие линкеры. Например, синтез подобных пептидомиметических макроциклов включает в себя многоступенчатый процесс, который описывает синтез пептидомиметического предшественника, которая содержит азидную функциональную группу и алкинную функциональную группу; за которым следует контактирование пептидомиметического предшественника с реагентом для макроциклизации, для того, чтобы создать триазол-связанный пептидомиметический макроцикл. Подобный способ описан, например, в заявке на патент США 12/037,041, поданной 25 февраля 2008. Макроциклы или предшественники макроцикла синтезируют, например, с помощью жидкофазных или твердофазных способов, и может содержать и встречающиеся в природе, и не встречающиеся в природе аминокислоты. Смотри, например, Hunt, "The Non-Protein Amino Acids" в Chemistry and Biochemistry of the Amino Acids, под редакцией G.C. Barrett, Chapman and Hall, 1985.

В отдельных вариантах осуществления настоящего изобретения азид соединен с α-атомом углерода остатка и алкин присоединен к α-атому углерода другого остатка. В отдельных вариантах осуществления настоящего изобретения азидные функциональные группы представляют собой азиды-аналоги аминокислот L-лизин, D-лизин, альфа-метил-L-лизин, альфа-метил-D-лизин, L-орнитин, D-орнитин, альфа-метил-L-орнитин или альфа-метил-D-орнитин. В другом варианте осуществления настоящего изобретения алкинная функциональная группа представляет собой L-пропаргилглицин. В еще одних вариантах осуществления настоящего изобретения алкинная функциональная группа представляет собой аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из L-пропаргилглицина, D-пропаргилглицина, (S)-2-амино-2-метил-4-пентиноевой кислоты, (R)-2-амино-2-метил-4-пентиноевой кислоты, (S)-2-амино-2-метил-5-гексиновой кислоты, (R)-2-амино-2-метил-5-гексиновой кислоты, (S)-2-амино-2-метил-6-гептиновой кислоты, (R)-2-амино-2-метил-6-гептиновой кислоты, (S)-2-амино-2-метил-7-октиновой кислоты, (R)-2-амино-2-метил-7-октиновой кислоты, (S)-2-амино-2-метил-8-нониновой кислоты и (R)-2-амино-2-метил-8- нониновой кислоты.

Следующие синтетические схемы представлены исключительно для иллюстрации настоящего изобретения и не предназначены для ограничения объема изобретения, описанного в данном документе. Для упрощения графических материалов иллюстративные схемы изображают азидные аналоги аминокислот ε-азидо-α-метил-L-лизина и ε-азидо-α-метил-D-лизина, алкинные аналоги аминокислот L-пропаргилглицина, (S)-2-амино-2-метил-4-пентиноевой кислоты и (S)-2-амино-2-метил-6-гептиновой кислоты. Таким образом, в следующих синтетических схемах, каждый R₁, R₂, R₇ и R₈ представляет собой -H; каждый L₁ представляет собой -(CH₂)₄-; и каждый L₂ представляет собой -(CH₂)-. При этом, как отмечалось во всем подробном описании выше, могут быть использованы многие другие аналоги аминокислот, в которых R₁, R₂, R₇, R₈, L₁ и L₂ могут быть независимо выбраны из различных структур, раскрытых в данном документе.

Синтетическая схема 1:

Синтетическая схема 1 описывает получение некоторых соединений по настоящему изобретению. Комплексы Ni(II) оснований Шиффа, полученные из хирального вспомогательного элемента (S)-2-[N-(N’-бензилпролил)амино]бензофенона (BPB) и аминокислоты, такой как глицин или аланин, получают так,как описано в Belokon и соавт. (1998), TetrahedronAsymm. 9:4249-4252. Полученные в результате комплексы в дальнейшем вступают в реакцию с алкилирующими реагентами, содержащими азидную или алкинильную функциональную группу с получением энантиомерно обогащенных соединений по настоящему изобретению. При необходимости, полученные в результате соединения могут быть защищены для применения в пептидном синтезе.

Синтетическая схема 2:

Способ синтеза пептидомиметических макроциклов в целом проиллюстрирован на Синтетической схеме 2, пептидомиметический предшественник содержит азидную функциональную группу и алкинную функциональную группу, и синтезируются с помощью жидкофазного или твердофазного пептидного синтеза (SPPS) с использованием коммерчески доступной аминокислоты N-α-Fmoc-L-пропаргилглицин и N-α-Fmoc-защищенных форм аминокислот, (S)-2-амино-2-метил-4-пентиноевой кислоты, (S)-2-амино-6-гептиновой кислоты, (S)-2-амино-2-метил-6-гептиновой кислоты, N-метил-ε-азидо-L-лизина, и N-метил-ε-азидо-D-лизина. Пептидомиметический предшественник затем подвергается снятию защиты и отщепляется от твердофазной смолы при стандартных условиях (например, концентрированная кислота, такая как 95% TFA). Пептидомиметический предшественник вступает в реакцию в качестве сырой смеси или очищается перед вступлением в реакцию с реагентом для макроциклизации, таким как Cu(I) в органических или водных растворах (Rostovtsev и соавт.(2002), Angew. Chem. Int. Ed. 41:2596-2599; Tornoe и соавт. (2002), J. Org. Chem. 67:3057-3064; Deiters и соавт.(2003), J. Am. Chem. Soc. 125:11782-11783; Punna и соавт.(2005), Angew.Chem. Int. Ed. 44:2215-2220).В одном варианте осуществления настоящего изобретения реакция образования триазола выполняется при условиях, которые содействуют α-спирализации. В одном варианте осуществления настоящего изобретения этап макроциклизации выполняется в растворителе, выбранном из группы, состоящей из H₂O, THF, CH₃CN, DMF, DIPEA, tBuOH или их смеси. В другом варианте осуществления настоящего изобретения этап макроциклизации выполняется в DMF. В отдельных вариантах осуществления настоящего изобретения этап макроциклизации выполняется в буфферизированном водном или частично водном растворителе.

Синтетическая схема 3:

В целом, способ синтеза пептидомиметических макроциклов проиллюстрирован на Синтетической схеме 3, пептидомиметический предшественник содержит азидную функциональную группу и алкинную функциональную группу, и синтезируются с помощью твердофазного пептидного синтеза (SPPS) с использованием коммерчески доступной аминокислоты N-α-Fmoc-L-пропаргилглицина и N-α-Fmoc-защищенных форм аминокислот (S)-2-амино-2-метил-4-пентиноевой кислоты, (S)-2-амино-6-гептиновой кислоты, (S)-2-амино-2-метил-6-гептиновой кислоты, N-метил-ε-азидо-L-лизина, и N-метил-ε-азидо-D-лизина. Пептидомиметический предшественник вступает в реакцию с реагентом для макроциклизации, таким как реагент Cu(I) в смоле как сырой смеси (Rostovtsev и соавт.(2002), Angew. Chem. Int. Ed. 41:2596-2599; Tornoe и соавт. (2002), J. Org. Chem. 67:3057-3064; Deiters и соавт.(2003), J. Am. Chem. Soc. 125:11782-11783; Punna и соавт.(2005), Angew.Chem. Int. Ed. 44:2215-2220).Получающийся в итоге триазол-содержащий пептидомиметический макроцикл затем подвергается снятию защиты и отщепляется с твердофазной смолы при стандартных условиях (например, концентрированная кислота, такая как 95% TFA). В отдельных вариантах осуществления настоящего изобретения этап макроциклизации выполняется в растворителе, выбранном из группы, состоящей из CH₂Cl₂, ClCH₂CH₂Cl, DMF, THF, NMP, DIPEA, 2,6-лутидин, пиридин, DMSO, H₂O или их смеси. В отдельных вариантах осуществления настоящего изобретения этап макроциклизации выполняется в буфферизированном водном или частично водном растворителе.

Синтетическая схема 4:

В целом, способ синтеза пептидомиметических макроциклов проиллюстрирован на Синтетической схеме 4, пептидомиметический предшественник содержит азидную функциональную группу и алкинную функциональную группу и синтезируются с помощью жидкофазного или твердофазного пептидного синтеза (SPPS) с использованием коммерчески доступной аминокислоты N-α-Fmoc-L-пропаргилглицина и N-α-Fmoc-защищенных форм аминокислот (S)-2-амино-2-метил-4-пентиноевой кислоты, (S)-2-амино-6-гептиновой кислоты, (S)-2-амино-2-метил-6-гептиновой кислоты, N-метил-ε-азидо-L-лизина, и N-метил-ε-азидо-D-лизина. Пептидомиметический предшественник затем подвергается снятию защиты и отщепляется с твердофазной смолы при стандартных условиях (например, концентрированная кислота, такая как 95% TFA). Пептидомиметический предшественник вступает в реакцию в качестве сырой смеси или очищается перед вступлением в реакцию реагентом для макроциклизации, таким как реагенты Ru(II), например Cp*RuCl(PPh₃)₂ или [Cp*RuCl]₄ (Rasmussen и соавт. (2007), Org. Lett. 9:5337-5339; Zhang и соавт. (2005), J. Am. Chem. Soc. 127:15998-15999). В отдельных вариантах осуществления настоящего изобретения этап макроциклизации выполняется в растворителе, выбранном из группы, состоящей из DMF, CH₃CN и THF.

Синтетическая схема 5:

В целом, способ синтеза пептидомиметических макроциклов проиллюстрирован на Синтетической схеме 5, пептидомиметический предшественник содержит азидную функциональную группу и алкинную функциональную группу и синтезируются с помощью твердофазного пептидного синтеза (SPPS) с использованием коммерчески доступной аминокислоты N-α-Fmoc-L-пропаргилглицина и N-α-Fmoc-защищенных форм аминокислот (S)-2-амино-2-метил-4-пентиноевой кислоты, (S)-2-амино-6-гептиновой кислоты, (S)-2-амино-2-метил-6-гептиновой кислоты, N-метил-ε-азидо-L-лизина, и N-метил-ε-азидо-D-лизина. Пептидомиметический предшественник вступает в реакцию с реагентом для макроциклизации, таким как реагент Ru(II) насмола в качестве сырой смеси. Например, реагент может быть Cp*RuCl(PPh₃)₂ или [Cp*RuCl]₄ (Rasmussen и соавт. (2007), Org. Lett. 9:5337-5339; Zhang и соавт. (2005), J. Am. Chem. Soc. 127:15998-15999). В отдельных вариантах осуществления настоящего изобретения этап макроциклизации выполняется в растворителе, выбранном из группы, состоящей из CH₂Cl₂, ClCH₂CH₂Cl, CH₃CN, DMF, и THF.

Настоящее изобретение рассматривает применение не встречающихся в природе аминокислот и аналогов аминокислот в синтезе пептидомиметических макроциклов, описанном в данном документе. Любая аминокислота или аналог аминокислоты поддаются синтетическим способам, используемым для синтеза стабильного триазола, который содержит пептидомиметические макроциклы, которые могут быть использованы в настоящем изобретении. Например, L-пропаргилглицин предполагается в настоящем изобретении в качестве пригодной аминокислоты. При этом, другие алкин-содержащие аминокислоты, которые содержат различные аминокислотные боковые цепочки, также пригодные для использования в настоящем изобретении. Например, L-пропаргилглицин содержит одно метиленовое звено между α-атомом углерода аминокислоты и алкином аминокислотной боковой цепочки. Настоящее изобретение также рассматривает применение аминокислот с множеством метиленовых звеньев между α-атомом углерода и алкином. Так, в настоящем изобретении азидо-аналоги аминокислот L-лизина, D-лизина, альфа-метил-L-лизина, и альфа-метил-D-лизина предлагаются в качестве пригодных аминокислот. При этом, другие концевые азидные аминокислоты, которые содержат различные аминокислотные боковые цепочки, также пригодны для использования в настоящем изобретении. Например, азидо-аналог L-лизина содержит четыре метиленовых звена между α-атомом углерода аминокислоты и концевым азидом аминокислотной боковой цепочки. Настоящее изобретение также рассматривает применение аминокислот с менее чем или более чем четырьмя метиленовыми звеньями между α-атомом углерода и концевым азидом. Таблица 3 иллюстрирует некоторые аминокислоты, пригодные для получения пептидомиметических макроциклов, раскрытых в данном документе.

Таблица 3 иллюстрирует иллюстративные аминокислоты пригодные для получения пептидомиметических макроциклов, раскрытых в данном документе.

В отдельных вариантах осуществления настоящего изобретения аминокислоты и аналоги аминокислот имеют D-конфигурацию. В других вариантах осуществления настоящего изобретения они имеют L-конфигурацию. В отдельных вариантах осуществления настоящего изобретения некоторые аминокислоты и аналоги аминокислот, содержащиеся в пептидомиметике, имеют D-конфигурацию, тогда как некоторые аминокислоты и аналоги аминокислот имеют L-конфигурацию. В отдельных вариантах осуществления настоящего изобретения аналоги аминокислот являются α,α-двузамещенными, такими как α-метил-L-пропаргилглицин, α-метил-D-пропаргилглицин, ε-азидо-альфа-метил-L-лизин и ε-азидо-альфа-метил-D-лизин. В отдельных вариантах осуществления настоящего изобретения аналоги аминокислот являются N-алкилированными, например, N-метил-L-пропаргилглицин, N-метил-D-пропаргилглицин, N-метил-ε-азидо-L-лизин и N-метил-ε-азидо-D-лизин.

В отдельных вариантах осуществления настоящего изобретения функциональная группа аминокислоты –NH защищена с использованием защитной группы, включающая, без ограничения ими, -Fmoc и -Boc. В других вариантах осуществления настоящего изобретения аминокислота не защищена перед синтезом пептидомиметического макроцикла.

Дополнительные способы образования пептидомиметических макроциклов, которые предусмотрены в качестве пригодных для выполнения настоящего изобретения, включают те, которые описаны в Mustapa, M. FirouzMohd и соавт., J. Org. Chem (2003), 68, pp. 8193-8198; Yang, Bin и соавт. Bioorg Med. Chem. Lett. (2004), 14, pp. 1403-1406; патент США № 5364851; патент США № 5446128; патент США № 5824483; патент США № 6713280; и патент США № 7202332. В подобных вариантах осуществления настоящего изобретения используются предшественники аминокислот, которые содержат дополнительный заместитель R- в альфа-положении. Такие аминокислоты включаются в требуемые положения предшественника макроцикла, которые могут быть в положениях, в которых сшивающее средство замещено или, альтернативно, где-либо еще в последовательности предшественника макроцикла. Затем выполняется циклизация предшественника в соответствии с указанным способом.

Например, пептидомиметический макроцикл Формулы (II) получают, как указано:

где каждый AA₁, AA₂, AA₃ независимо представляет собой аминокислотную боковую цепочку.

В других вариантах осуществления настоящего изобретения пептидомиметический макроцикл Формулы (II) получают, как указано:

В отдельных вариантах осуществления настоящего изобретения пептидомиметический макроцикл делали в виде более чем одного изомера, например, в соответствии с конфигурацией двойной связи в структуре сшивающего средства (E по сравнению с Z). Такие изомеры могут или не могут быть разделимы стандартными хроматографическими способами. В отдельных вариантах осуществления настоящего изобретения один изомер имеет улучшенные биологические свойства по сравнению с другим изомером. В одном варианте осуществления настоящего изобретения олефиновый изомер сшивающего средства E пептидомиметического макроцикла имеет более лучшую растворимость, более лучшее сродство к мишени, более лучшую эффективность in vivo или in vitro, более высокую спиральность, или более лучшую клеточную проницаемость по сравнению сего аналогом Z. В другом варианте осуществления настоящего изобретения олефиновый изомер сшивающего средства Z пептидомиметического макроцикла имеет более лучшую растворимость, более лучшее сродство к мишени, более лучшую in vivo или in vitro эффективность, более высокую спиральность, или улучшенную клеточная проницаемость по сравнению сего аналогом E.

Способы исследования

Свойства пептидомиметических макроциклов по настоящему изобретению исследуются, например, с помощью способов, описанных ниже. В отдельных вариантах осуществления настоящего изобретения пептидомиметический макроцикл по настоящему изобретению по сравнению с соответствующим полипептидом, лишенным заместителей, имеет улучшенные биологические свойства, описанным в данном документе.

Способ исследования для определения α-спиральности.

В растворе вторичная структура полипептидов с α-спиральными доменами достигнет динамического равновесия между структурами случайной спирали и α-спиральными структурами, часто выражаемого в виде “процента спиральности”. Таким образом, например, односпиральные домены в растворе преимущественно представляют собой случайные спирали, обычно с содержанием α-спирали менее 25%. Пептидомиметические макроциклы с оптимизированными линкерами, с другой стороны, обладают, например, альфа-спиральностью, которая по меньшей мере в два раза больше, чем в соответствующем несшитом полипептиде. В отдельных вариантах осуществления настоящего изобретения макроциклы по настоящему изобретению будут обладать альфа-спиральностью более чем на 50%. Для способа исследования спиральности пептидомиметических макроциклов по настоящему изобретению, соединения растворяют в водном растворе (например, 50 ммоль раствора фосфата калия при pH 7, или дистиллированной H₂O, до концентраций 25-50 мкмоль). Спектр кругового дихроизма (CD) получали на спектрополяриметре (например, JascoJ-710) с использованием стандартных параметров измерения (например, температура, 20°C; длина волны, 190-260 нмоль; шаг разрешения, 0,5 нмоль; скорость, 20 нмоль/сек; повторения измерений, 10; ответ, 1 сек; рабочий диапазон, 1 нмоль; длина пробега, 0,1 см). Содержание α-спиралей каждого пептида рассчитывают с помощью деления средней остаточной эллиптичности (например, [Φ]222obs) на указанное для модельного спирального декапептида значение (Yang и соавт.(1986), Methods Enzymol. 130:208)).

Способ исследования для определения температуры плавления (Tm).

Пептидомиметический макроцикл по настоящему изобретению, который содержит вторичную структуру, такую как α-спираль, демонстрирует, например, более высокую температуру плавления, чем соответствующий несшитый полипептид. Как правило, пептидомиметические макроциклы по настоящему изобретению демонстрируют Tm>60ºC, что представляет высокостабильную структуру в водных растворах. Для анализа влияния образования макроцикла на температуру плавления, пептидомиметические макроциклы или немодифицированный пептиды растворяют в дистиллированной H₂O (например, при конечной концентрации 50 мкмоль) и Tm определяют с помощью измерения изменения эллиптичности в диапазоне температур (например, от 4 до 95°C) на спектрополяриметре (например, JascoJ-710) с использованием стандартных параметров (например, длина волны 222 нмоль; шаг разрешения, 0,5 нмоль; скорость, 20 нмоль/сек; повторения измерений, 10; ответ, 1 сек; рабочий диапазон, 1 нмоль; скорость роста температуры: 1°C/мин; длина пробега, 0,1 см).

Способ исследования устойчивости протеазы.

Амидная связь пептидного остова является чувствительной к гидролизу с помощью протеаз, тем самым делая пептидные соединения уязвимыми к быстрой деградации in vivo. Спирализация пептида, при этом, как правило, скрывает амидный остов и поэтому может защитить его от протеолитического расщепления. Пептидомиметические макроциклы по настоящему изобретению могут быть подвергнуты протеолизу трипсином in vitro для того, чтобы определить любые изменения скорости деградации по сравнению с соответствующим несшитым полипептидом. Например, пептидомиметический макроцикл и соответствующий несшитый полипептид инкубируют в трипсин-агарозе и реакции останавливают в различные моменты времени с помощью центрифугирования и с последующим введением HPLC для количественного определения остаточного субстрата с помощью ультрафиолетового поглощения при 280 нмоль. Вкратце, пептидомиметический макроцикл и пептидомиметический предшественник (5 мкг) инкубируют с трипсин-агарозой (Pierce) (S/E ~125) через 0, 10, 20, 90, и 180 минуты. Реакции останавливают с помощью настольного центрифугирования на высокой скорости; оставшийся субстрат в изолированном супернатанте определяют количественно с помощью детектирования пика HPLC на 280 нмоль. Протеолитическая реакция демонстрирует кинетику первого порядка и константу скорости реакции, k, определяют из графика ln[S] в зависимости от времени (k=-1Xslope).

Способ исследования стабильность Ex Vivo.

Пептидомиметические макроциклы с оптимизированными линкерами обладают, например, периодом полувыведения ex vivo, который по меньшей мере в два раза больше, чем соответствующий период для несшитого полипептида, и обладают периодом полувыведения ex vivo 12 часов или больше. В случае исследований стабильностисыворотки крови ex vivo может быть использовано множество способов исследований. Например, пептидомиметический макроцикл и соответствующий несшитый полипептид (2 мкг) инкубируют со свежей сывороткой крови мыши, крысы и/или человека (2 мл) при 37°C в течение 0, 1, 2, 4, 8, и 24 часов. Для определения уровня интактного соединения, далее может быть использована последовательность операций: пробы экстрагируют с помощью перенесения 100 мкл сыворотки в 2 мл центрифужные пробирки, за чем следует добавление 10 мкл 50 % муравьиной кислоты и 500 мкл ацетонитрил и центрифугирования при 14000 об/мин в течение 10 мин при 4±2°C. Супернатанты затем переносят в новые 2 мл пробирки и выпаривают в Turbovap под N₂<10 фунт/кв. дюйм, 37°C. Пробы восстанавливают в 100 мкл 50:50 ацетонитрил:вода и представляются на LC-MS/MS анализ.

Способы исследования связывания In vitro.

Для того, чтобы определить связывание и сродство пептидомиметических макроциклов и пептидомиметических предшественников к акцепторам протеинов, используется, например, способ флуоресцентной поляризации (FPA). Техника метода FPA измеряет молекулярную ориентацию и мобильность с использованием поляризованного света и флуоресцентной метки. При возбуждении поляризованным светом, флуоресцентная метки (например, FITC), присоединенная к молекулам с высокими средними молекулярными массами (например, FITC-меченые пептиды, связанные с большими белками), излучают более высокие уровни поляризованной флуоресценции в соответствии с их меньшими скоростями ротация, по сравнению с флуоресцентными метками, присоединенными к меньшим молекулам (например, FITC-меченые пептиды, которые свободны в растворе).

Например, меченные флуоресцирующие пептидомиметические макроциклы (25 нмоль) инкубируют с акцептором белка (25-1000 нмоль) в связывающем буфер (140 ммоль NaCl, 50 ммоль Tris-HCL, pH 7,4) в течение 30 минут при комнатной температуре. Активность связывания измеряют, например, с помощью флуоресцентной поляризации на люминесцентном спектрофотометре (например, Perkin-ElmerLS50B). Значения Kd могут быть определены с помощью нелинейного регрессионного анализа с использованием, например, программного обеспечения GraphpadPrism (GraphPadSoftware, Inc., Сан Диего, Калифорния). Пептидомиметический макроцикл по настоящему изобретению демонстрирует, в некоторых случаях, подобные или меньшие Kd, чем для соответствующего несшитого полипептида.

Способы исследования замещения invitro для описания антагонистов взаимодействий пептид-белок.

Для того, чтобы определить связывание и сродство соединений, которые оказывают антагонистическое воздействие на взаимодействие между пептидом и акцептором белка, используется, например, способ флуоресцентной поляризации (FPA), использующий меченные флуоресцирующие пептидомиметические макроциклы, полученные из последовательности пептидомиметического предшественника. Техника FPA измеряет молекулярную ориентацию и мобильность с использованием поляризованного света и флуоресцентной метки. При возбуждении поляризованным светом, флуоресцентные метки (например, FITC), присоединенные к молекулам с высокими средними молекулярными массами (например, FITC-меченые пептиды, связанные с большим белком), излучают более высокие уровни поляризованной флуоресценции в соответствии с их меньшими скоростями ротация, по сравнению с флуоресцентными метками, присоединенными к меньшим молекулам (например, FITC-меченые пептиды, который свободны в растворе). Соединение, которое оказывает антагонистические воздействия на взаимодействие между меченным флуоресцирующим пептидомиметическим макроциклом и акцептором белка, будут детектировать в эксперименте конкурентного связывания FPA.

Например, предполагаемый антигонист соединения (от 1 нмоль до 1 ммоль) и меченный флуоресцирующий пептидомиметический макроцикл (25 нмоль) инкубируют с акцептором белка (50 нмоль) в связывающем буфере (140 ммоль NaCl, 50 ммоль Tris-HCL, pH 7,4) в течение 30 минут при комнатной температуре. Активность антигониста связывания измеряют, например, с помощью флуоресцентной поляризации на люминесцентном спектрофотометре (например, Perkin-ElmerLS50B). Значения Kd могут быть определены с помощью нелинейного регрессионного анализа с использованием, например, программного обеспечения GraphpadPrism (GraphPadSoftware, Inc., Сан Диего, Калифорния).

Любой класс молекул, таких как малые органические молекулы, пептиды, олигонуклеотиды или белки, могут рассматриваться в качестве предполагаемых антагонистов в данном способе исследования.

Способ исследования связывания белок-лиганд с помощью хромато-масс-спектрометрии.

Для того, чтобы определить связывание и сродство тестовых соединений к протеинам, используется, например способ хромато-масс-спектрометрии. Эксперименты по связыванию белок-лиганд проводили в соответствии со следующей процедурой, описанной для общесистемного контрольного эксперимента, с использованием 1 мкмоль пептидомиметического макроцикла плюс 5 мкмоль целевого белка. 1 мкл аликвоты DMSO 40 мкмоль базового раствора пептидомиметического макроцикла растворяют в 19 мкл PBS (фосфатно-солевой буферный раствор: 50 ммоль, фосфатный буфер с pH 7,5, который содержит 150 ммоль NaCl). Полученный в результате раствор перемешивают с помощью многократного пипетирования и очищают от примесей с помощью центрифугирования при 10000 g в течение 10 мин. К 4 мкл аликвоты полученного в результате супернатанта добавляют 4 мкл 10 мкмоль целевого белка в PBS. Таким образом, каждые 8,0 мкл экспериментальной пробы содержат 40 пкмоль (1,5 мкг) белок в концентрации 5,0 мкмоль в PBS плюс 1 мкмоль пептидомиметический макроцикла и 2,5% DMSO. Параллельные пробы, полученные таким образом для каждой концентрации, инкубируют в течение 60 мин при комнатной температуре, и затем охлаждают до 4°C перед гель-проникающая хроматографией, LC-MS анализом 5,0 мкл вводимого объема. Пробы, которые содержат целевой белок, комплексы белок–лиганд и несвязанные соединения вводят в SEC колонку, где комплексы отделяются от несвязанного компонента с помощью быстрого этапа SEC. Элюат колонки SEC контролируется с использованием UV детекторов, чтобы подтвердить, что ранее элюированная фракция белка, которая элюируется в свободном объеме колонка SEC, хорошо очищена от несвязанных компонентов, которые удерживаются в колонке. После того, как пик, который содержит белок и комплексы белок–лиганд, элюируется из основного UV детектора, он входит в пробоотборную петлю, где исключается из потока этапа SEC и переносится непосредственно на LC-MS с помощью механизма клапанной системы. Ион (M+3H)³⁺ пептидомиметического макроцикла наблюдают с помощью ESI-MS при ожидаемом соотношении масса/заряд, что подтверждает обнаружение комплекса белок-лиганд.

Способ экспериментального определения Kd титрования белок-лиганд.

Для того, чтобы определить связывание и сродство тестовых соединений к протеинам, осуществляют, например, экспериментальное определение Kd титрования белок-лиганд. Экспериментальные определения K_d титрирований белок-лиганд проводили следующим образом: получают 2 мкл аликвот DMSO серийно разбавленного базового раствора титранта пептидомиметического макроцикла (5, 2,5,…, 0,098 ммоль), затем растворяют в 38 мкл PBS. Полученные в результате растворы перемешивают с помощью многократного пипетирования и очищают от примесей с помощью центрифугирования при 10000g в течение 10 мин. К 4,0 мкл аликвот полученных в результате супернатантов добавляют 4,0 мкл 10 мкмоль целевого белка в PBS. Каждые 8,0 мкл экспериментальной пробы содержит, таким образом, 40 пкмоль (1,5 мкг) белка в концентрации 5,0 мкмоль в PBS, различные концентрации (125, 62,5,…, 0,24 мкмоль) титранта пептида, и 2,5% DMSO. Параллельные пробы полученные, таким образом, для каждой концентрации инкубируют при комнатной температуре в течение 30 мин, затем охлаждают до 4 °C перед SEC-LC-MS анализом 2,0 мкл вводимого объема. Ион (M+H)¹⁺, (M+2H)²⁺, (M+3H)³⁺, и/или (M+Na)¹⁺ наблюдают с помощью ESI-MS; извлеченные ионные хроматограммы определяют количественно, затем приводят к уравнениям для получения K_d аффинности связывания, как описано в “AGeneralTechniquetoRankProtein-LigandBindingAffinitiesandDetermineAllostericvs. DirectBindingSiteCompetitioninCompoundMixtures.” Annis, D. A.; Nazef, N.; Chuang, C. C.; Scott, M. P.; Nash, H. M. J. Am. Chem. Soc. 2004, 126, 15495-15503; такжев “ALIS: An Affinity Selection-Mass Spectrometry System for the Discovery and Characterization of Protein-Ligand Interactions” D. A. Annis, C.-C. Chuang, и N. Nazef.In Mass Spectrometry in Medicinal Chemistry.Под редакцией Wanner K, Höfner G: Wiley-VCH; 2007:121-184. Mannhold R, Kubinyi H, Folkers G (Series Editors): Methods and Principles in Medicinal Chemistry.

Способ экспериментального определения конкурентного связывания с помощью хромато-масс-спектрометрии

Для определения способности тестовых соединений связывать конкурентно с протеинами, осуществляют, например, хромато-масс-спектрометрический способ исследования. Смесь лигандов по 40 мкмоль каждого компонент получают с помощью смешивания 2 мкл аликвоты 400 мкмоль реакционных масс каждого из трех соединений с 14 мкл DMSO. Затем, 1 мкл аликвоты этой смеси по 40 мкмоль каждого компонент смешивают с 1 мкл аликвоты DMSO серийно разбавленного базового раствора титранта пептидомиметического макроцикла (10, 5, 2,5,…, 0,078 ммоль). Эти 2 мкл пробы растворяют в 38 мкл PBS. Полученные в результате растворы перемешивают с помощью многократного пипетирования и очищают от примесей с помощью центрифугирования при 10000g в течение 10 мин. К 4,0 мкл аликвот полученных в результате супернатантов добавляют 4,0 мкл 10 мкмоль целевого белка в PBS. Каждые 8,0 мкл экспериментальной пробы содержит, таким образом, 40 пкмоль (1,5 мкг) белка в PBS в концентрации 5,0 мкмоль плюс 0,5 мкмоль лиганда, 2,5% DMSO, и различные концентрации (125, 62,5,…, 0,98 мкмоль) титранта пептидомиметического макроцикла. Параллельные пробы полученные, таким образом, для каждой концентрации, инкубируют при комнатной температуре в течение 60 мин, затем охлаждают до 4°C перед SEC-LC-MS анализом 2,0 мкл вводимого объема. Дополнительные детали этих и других способов описаны в “A General Technique to Rank Protein-Ligand Binding Affinities and Determine Allosteric vs. Direct Binding Site Competition in Compound Mixtures.” Annis, D. A.; Nazef, N.; Chuang, C. C.; Scott, M. P.; Nash, H. M. J. Am. Chem. Soc. 2004, 126, 15495-15503; такжев “ALIS: An Affinity Selection-Mass Spectrometry System for the Discovery and Characterization of Protein-Ligand Interactions” D. A. Annis, C.-C. Chuang, и N. Nazef.In Mass Spectrometry in Medicinal Chemistry.Под редакцией Wanner K, Höfner G: Wiley-VCH; 2007:121-184. Mannhold R, Kubinyi H, Folkers G (Series Editors): Methods and Principles in Medicinal Chemistry.

Способы исследования связывания в интактных клетках

В интактных клетках связывание пептидов или пептидомиметических макроциклов с их природными акцепторами возможно измерить с помощью экспериментального определения иммунопреципитации. Например, интактные клетки инкубируют с меченными флуоресцирующими (FITC-меченые) соединениями в течение 4 часов в отсутствие сыворотки крови, за чем следует замена сыворотки крови и дальнейшая инкубация в диапазоне от 4 до 18 часов. Клетки затем осаждают и инкубируют в лизирующем буфере (50 ммоль Tris [pH 7,6], 150 ммоль NaCl, 1% CHAPS и смесь ингибиторов протеаз) в течение 10 минут при 4°C. Экстракты центрифугируют при 14000 об/мин в течение 15 минут, собирают супернатанты и инкубируют с 10 мкл козьего анти-FITC антитела в течение 2 часов, вращая при 4°C, за чем следует к тому же 2 часа инкубации при 4°C с протеин-A/G-сефарозой (50 мкл 50% гранулированного мелкозернистого сорбента). После быстрого центрифугирования, гранулы промывают лизирующим буфером, который содержит увеличенную концентрацию соли (например, 150, 300, 500 ммоль). Гранулы затем повторно уравновешивают в 150 ммоль NaCl перед добавлением SDS-содержащего буфера пробы и кипячением. После центрифугирования супернатанты необязательно подвергают электрофорезу с использованием 4-12% бис-трис градиентных гелей, за чем следует перенос на мембраны иммобилон-P. После блокирования пятна необязательно инкубируют с антителом, которое детектирует FITC, а также с одним или несколькими антителами, детектирующими протеины, которые связываются с пептидомиметический макроцикл.

Способы исследования клеточнойпроницаемости

Для измерения клеточной проницаемости пептидомиметических макроциклов и соответствующих несшитых макроциклов интактные клетки инкубируют с меченными флуоресцирующими пептидомиметическими макроциклами или соответствующим несшитым макроциклом (10 мкмоль) в течение 4 часов в бессывороточной среде при 37°C, дважды промывают и инкубируют в среде с трипсином (0,25%) в течение 10 мин при 37°C. Клетки промывают еще раз и ресуспендируют в PBS. Анализируют клеточную флуоресценциюс использованием, например, либо проточного цитометра FACSCalibur, либо Cellomics’ KineticScan ® HCSReader.

Способ исследования стабильности In Vivo

Для того, чтобы исследовать стабильность пептидомиметических макроциклов invivo, соединения, например, вводят мышам и/или крысам с помощью IV, IP, PO или ингаляционных путей в концентрации, лежащей в диапазоне от 0,1 до 50 мг/кг и забора проб крови через 0 мин, 5 мин, 15 мин, 30 мин, 1 час, 4 часов, 8 часов и 24 часов после инъекции. Уровни интактного соединения в 25 мкл свежей сыворотке крови затем измеряли с помощью LC-MS/MS как указано выше.

Клинические испытания

Для определения пригодности пептидомиметических макроциклов по настоящему изобретению для методики лечения людей были выполнены клинические испытания. Например, пациенты с диагнозом мышечная атрофия или липодистрофия и при необходимости лечения были выбраны и разделены на экспериментальную группу, которой вводят пептидомиметический макроцикл по настоящему изобретению и одну или несколько контрольных групп, которые получают плацебо или известное лекарственное средство GHRH или GH. Лечения безопасно, а эффективность пептидомиметических макроциклов по настоящему изобретению может быть оценена, таким образом, с помощью осуществления сравнений групп пациентов по таким факторам, как выживание и уровень жизни. В этом примере, группа пациентов, которую обрабатывали пептидомиметическим макроциклом, демонстрирует улучшенное долгосрочное выживание по сравнению с контрольной группой пациентов, которую обрабатывают плацебо.

Фармацевтические составы и способы введения

Пептидомиметические макроциклы по настоящему изобретению также включают фармацевтически допустимые производные или их пролекарства. “Фармацевтически допустимое производное” обозначает любую фармацевтически допустимую соль, эфир, соль эфира, пролекарство или другое производное соединения по настоящему изобретению, которое, с момента введения реципиенту, способно обеспечивать (прямо или косвенно) соединение по настоящему изобретению. Особенно предпочтительными фармацевтически допустимыми производными являются те, которые увеличивают биодоступность соединения по настоящему изобретению, когда вводят млекопитающему (например, с помощью увеличения абсорбции в кровь перорально ввидимого соединения), или таких, которые увеличивают поступление активного соединения к биологическому компартменту (например, мозг или лимфатическая система) по сравнению с первоначальными веществами. Некоторые фармацевтически допустимые производные включают химическую группа, которая увеличивает растворимость в воде или активный транспорт через гастроинтестинальную слизистую оболочку.

В отдельных вариантах осуществления настоящего изобретения пептидомиметические макроциклы по настоящему изобретению модифицированы с помощью присоединения ковалентных или нековалентных соответствующих функциональных групп для повышения отдельных биологических свойств. Такие модификации включают и те, которые увеличивают биологическое проникновение в данный биологический компартмент (например, кровь, лимфатическая система, центральная нервная система), увеличивают пероральной доступности, увеличивают растворимости для того, чтобы позволить осуществить введение с помощью инъекции, изменяют метаболизм и изменяют скорость экскреции.

Фармацевтически допустимые соли соединений по настоящему изобретению включают те, которые получены из фармацевтически допустимых неорганических и органических солей и оснований. Примеры солей пригодных кислот включают ацетат, адипат, бензоат, бензинсульфонат, бутират, цитрат, диглюконат, додецилсульфат, формат, фумарат, гликолят, гемисульфат, гептаноат, гексаноат, гилрохлорид, гидробромид, гидройодид, лактат, малеат, малонат, метансульфонат, 2-нафталенсульфонат, никотинат, нитрат, пальмоат, фосфат, пикрат, пивалат, пропионат, салицилат, сукцинат, сульфат, тартрат, тозилати ундеканоат. Соли, полученные из соответствующих оснований, включают щелочной металл (например, натрий), щелочно-земельный металл (например, магний), аммоний и соли N-(алкил)₄ ⁺.

Для получения фармацевтических составов из соединений по настоящему изобретению, фармацевтически допустимые носители включает либо твердые, либо жидкие носители. Препараты в твердой форме включает порошки, таблетки, пилюли, капсулы, облатки, суппозитории и растворимые гранулы. Твердый носитель может быть одним или несколькими веществами, которые также действуют как разбавители, корригенты, связующие вещества, консерванты, разрыхлители таблеток или инкапсулирующий материал. Детали техник изготовления лекарственных средств и введения хорошо описаны в научной и патентной литературе, смотри, например, последнее издание Remington'sPharmaceuticalSciences, MaackPublishingCo, Истон, Пенсильвания.

В порошках носитель представляет собой тонко измельченное твердое вещество, которое находится в смеси с тонкоизмельченным активным компонентом. В таблетках активный компонент в соответствующих пропорциях смешан с носителем, обладающим необходимыми связывающими свойствами, и спрессован в желаемую форму и размер.

Соответствующие твердые вспомогающие вещества являются углеводами или белковыми наполнителями, включающими, но без ограничения ими, сахара, включая лактозу, сахарозу, маннит или сорбит; крахмал из кукурузы, пшеницы, риса, картофеля или других растений; целлюлозы, такие как метилцеллюлоза, гидроксипропилметилцеллюлоза или натриевая соль карбоксиметилцеллюлозы; и смолы, в том числе арабская и камедь; а также белки, такие как желатин и коллаген. При необходимости, добавляют вещество для улучшения распадаемости таблеток или солюбилизирующий компонент, такой как сшитый поливинилпирролидон, агар, альгиновая кислота, или их соль, такой как альгинат натрия.

Препараты в жидкой форме включают растворы, суспензии и эмульсии, например, воду или водно-пропиленгликолевые растворы. Для парентерального введения жидкие препараты могут быть приготовлены в виде раствора в водном растворе полиэтиленгликоля.

Фармацевтический препарат предпочтительно представляет собой единичную дозированную форму. В такой форме препарат разделен на стандартные дозы, содержащие соответствующие количества активного компонента. Стандартная лекарственная форма может представлять собой упакованный препарат, причем упаковка содержит дискретные количества препарата, такие как упакованные таблетки, капсулы и порошки во флаконах или ампулах. Кроме того, стандартная лекарственная форма может представлять собой капсулу, таблетку, облатку или таблетку для рассасывания, или она может представлять собой соответствующее количество любой из них в упакованной форме.

Если составы по настоящему изобретению содержат комбинацию пептидомиметического макроцикла и одно или нескольких дополнительных терапевтических или профилактических средств, и соединение, и дополнительное средство могут быть в уровне дозировки приблизительно от 1 до 100%, и более предпочтительно приблизительно от 5 до 95% дозировки, обычно вводимой в режиме монотерапии. В отдельных вариантах осуществления настоящего изобретения дополнительные средства вводят раздельно, как часть режима многократной дозировки соединений по настоящему изобретению. Альтернативно, эти средства являются частями отдельной лекарственной формы, смешанной вместе с соединениями по настоящему изобретению в отдельные композиции.

В отдельных вариантах осуществления настоящего изобретения составы представлены в виде стандартных лекарственных форм, который могут доставлять, например, от приблизительно 0,0001 мг до приблизительно 1000 мг пептидомиметических макроциклов, их солей, их пролекарств, их производных, или любая их комбинация. Таким образом, стандартная лекарственная форма может доставлять, например, в отдельных вариантах осуществления настоящего изобретения от приблизительно 1 мг до приблизительно 900 мг, от приблизительно 1 мг до приблизительно 800 мг, от приблизительно 1 мг до приблизительно 700 мг, от приблизительно 1 мг до приблизительно 600 мг, от приблизительно 1 мг до приблизительно 500 мг, от приблизительно 1 мг до приблизительно 400 мг, от приблизительно 1 мг до приблизительно 300 мг, от приблизительно 1 мг до приблизительно 200 мг, от приблизительно 1 мг до приблизительно 100 мг, от приблизительно 1 мг до приблизительно 10 мг, от приблизительно 1 мг до приблизительно 5 мг, от приблизительно 0,1 мг до приблизительно 10 мг, от приблизительно 0,1 мг до приблизительно 5 мг, от приблизительно10 мг до приблизительно 1000 мг, от приблизительно 50 мг до приблизительно 1000 мг, от приблизительно 100 мг до приблизительно 1000 мг, от приблизительно 200 мг до приблизительно 1000 мг, от приблизительно 300 мг до приблизительно 1000 мг, от приблизительно 400 мг до приблизительно 1000 мг, от приблизительно 500 мг до приблизительно 1000 мг, от приблизительно 600 мг до приблизительно1000 мг, от приблизительно 700 мг до приблизительно 1000 мг, от приблизительно 800 мг до приблизительно 1000 мг, от приблизительно 900 мг до приблизительно 1000 мг, от приблизительно 10 мг до приблизительно 900 мг, от приблизительно 100 мг до приблизительно 800 мг, от приблизительно 200 мг до приблизительно 700 мг, или от приблизительно 300 мг до приблизительно 600 мг пептидомиметических макроциклов, их солей, их пролекарств, их производных или любой их комбинации.

В отдельных вариантах осуществления настоящего изобретения составы присутствуют в виде стандартных лекарственных форм, которые могут доставлять, например, приблизительно 1 мг, приблизительно 2 мг, приблизительно 3 мг, приблизительно 4 мг, приблизительно 5 мг, приблизительно 6 мг, приблизительно 7 мг, приблизительно 8 мг, приблизительно 9 мг, приблизительно 10 мг, приблизительно 20 мг, приблизительно 30 мг, приблизительно 40 мг, приблизительно 50 мг, приблизительно60 мг, приблизительно 70 мг, приблизительно 80 мг, приблизительно 90 мг, приблизительно 100 мг, приблизительно 150 мг, приблизительно 200 мг, приблизительно 250 мг, приблизительно 300 мг, приблизительно 350 мг, приблизительно 400 мг, приблизительно 500 мг, приблизительно 600 мг, приблизительно 700 мг, приблизительно 800 мг, или приблизительно 800 мг пептидомиметических макроциклов, их солей, их пролекарств, их производных или любой их комбинации.

Соответствующие способы введения включают, но без ограничения ими, пероральное, внутривенное, ректальное, аэрозольное, парентеральное, офтальмологическое, легочное, трансмукозальное, трансдермальное, вагинальное, ушное, носовое и местное введение. Кроме того, только в качестве примера, парентеральное поступление включает внутримышечное, подкожное, внутривенное, интрамедуллярное введения, также как интратекальное, прямые интравентрикулярное, внутрибрюшинное, внутрилимфатическое и интраназальное введения.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения композицию, как она описана в данном документе, вводят скорее местным, чем системным способом, например, посредством введения соединения прямо в орган. В отдельных вариантах осуществления настоящего изобретения составы длительного действия вводят с помощью вживления (например, подкожно или внутримышечно) или с помощью внутримышечной инъекции. Кроме того, в других вариантах осуществления настоящего изобретения лекарственное средство доставляют в целевую систему поступления лекарственного средства, например, в липосому, покрытую орган-специфическим антителом. В подобных вариантах осуществления настоящего изобретения липосомы являются направленными и селективно абсорбируются органом. В еще одних вариантах осуществления настоящего изобретения соединение, как описано в данном документе, обеспечивается в виде состава быстрого действия, в виде состава с пролонгированным действием или в виде состава с действием среднего уровня. В еще одних вариантах осуществления настоящего изобретения соединение, описанное в данном документе, вводят местно.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения составы, описанные в данном документе, разработаны для перорального введения. Составы, описанные в данном документе, разработаны с помощью смешивания пептидомиметического макроцикла с, например, фармацевтически допустимыми носителями или вспомогательными веществами. В различных вариантах осуществления настоящего изобретения соединения, описанные в данном документе, разработаны в виде лекарственных форм для перорального применения, которые включают, только в качестве примера, таблетки, порошки, пилюли, драже, капсулы, жидкости, гели, сиропы, эликсиры, взвеси, суспензии и подобные.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения фармацевтические препараты для перорального применения получали с помощью смешивания одного или нескольких твердых вспомогательных веществ с одним или несколькими пептидомиметическими макроциклами, описанными в данном документе, необязательного измельчения полученной в результате смеси и, при необходимости, обработки смеси гранул после добавления соответствующих вспомогательных веществ для получения таблеток или драже. Подходящими вспомогающими веществами являются, в частности, наполнители такие сахара, включая лактозу, сахарозу, маннит или сорбит; целлюлозные препараты, такие как, например, кукурузный крахмал, пшеничный крахмал, рисовый крахмал, картофельный крахмал, желатин, трагакант, метилцеллюлоза, микрокристаллическая целлюлоза, гидроксипропилметилцеллюлоза, натриевая соль карбоксиметилцеллюлозы; или другие, такие как: поливинилпирролидон (PVP или повидон) или фосфат кальция. В конкретных вариантах осуществления необязательно добавляют вещества для улучшения распадаемости таблеток. Вещества для улучшения распадаемости таблеток включают, в качестве примера, сшитую кроскармеллозу натрия, поливинилпирролидон, агар или альгиновую кислоту или ее соль, такую как альгинат натрия.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения лекарственные формы, такие как драже и таблетки, обеспечивают с одним или несколькими соответствующими покрытиями. В отдельных вариантах осуществления настоящего изобретения для покрытия лекарственной формы используются концентрированные растворы сахара. Растворы сахара, необязательно содержащие дополнительные компоненты, такие как, только в качестве примера, аравийская камедь, тальк, поливинилпирролидон, гель карбопол, полиэтиленгликоль, и/или диоксид титана, растворы лака, и соответствующие органические растворители или смеси растворителей. Красители и/или пигменты также необязательно добавляют к покрытиям с целью идентификации. Кроме того, красители и/или пигменты необязательно используют для того, чтобы служить отличительным признаком различных комбинаций доз активного соединения.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения терапевтически эффективные количества по меньшей мере одного пептидомиметического макроцикла, описанного в данном документе, сформулированы в других пероральнх лекарственных формах. Лекарственная форма для перорального применения включает твердые капсулы, сделанные из желатина, также как мягкие запечатанные капсулы, изготовленные из желатина и пластификатора, такого как глицерин или сорбитол. В отдельных вариантах осуществления настоящего изобретения твердые капсулы содержат активные ингредиенты в примеси с одним или несколькими наполнителями. Наполнителями включают, только в качестве примера, лактозу, связывающие вещества, такие как крахмалы, и/или смазывающие вещества, такие как тальк или стеарат магния и, необязательно, стабилизаторы. В других вариантах осуществления настоящего изобретения мягкие капсулы содержат одно или несколько активных соединений, которые представляют собой растворенные или суспендированные в соответствующей жидкости. Соответствующие жидкости включают, только в качестве примера, одно или несколько жидкое масло, жидкий парафин, или жидкий полиэтиленгликоль. Кроме того, необязательно добавляют стабилизаторы.

В других вариантах осуществления настоящего изобретения терапевтически эффективные количества по меньшей мере одного из пептидомиметических макроциклов, описанных в данном документе, разработаны для буккального или сублингвального введения. Составы, пригодные для буккального или сублингвального введения включают, только в качестве примера, таблетки, таблетки для рассасывания, или гели. В дополнительных вариантах осуществления настоящего изобретения пептидомиметические макроциклы, описанные в данном документе, разработаны для парентеральной инъекции, включая составы, пригодные для введения в виде комка вещества или неразрывной инфузии. В отдельных вариантах осуществления настоящего изобретения составы для введения представлены в виде стандартной лекарственной формы (например, в ампулах) или в многодозных контейнерах. Консерванты необязательно добавляют к составам для введения. В дополнительных вариантах осуществления настоящего изобретения фармацевтические составы разработаны в форме, пригодной для парентерального введения в качестве стерильных суспензий, растворов или эмульсий на жировой или водной основах. Парентеральные составы для введения необязательно содержат вспомогательные вещества, такие как суспендирующее, стабилизирующее и/или диспергирующее средства. В отдельных вариантах осуществления настоящего изобретения фармацевтические составы для парентерального введения включает водный растворы активных соединений водорастворимой форме. В дополнительных вариантах осуществления настоящего изобретения суспензии активных соединений получают в виде соответствующих жировых суспензий для введения. Соответствующие липофильные растворители или основы для применения в фармацевтических составах, описанных в данном документе, включают, только в качестве примера, жидкие масла, такие как кунжутное масло, или синтетические эфиры жирных кислот, таких как этилолеат или триглицериды, или липосомы. В некоторых отдельных вариантах осуществления настоящего изобретения водные суспензии для введения содержат вещества, которые увеличивают вязкость суспензии, такие как натриевая карбоксиметилцеллюлоза, сорбитол, или декстран. Необязательно, суспензия содержит соответствующие стабилизаторы или средства, которые увеличивают растворимость соединений для того, чтобы позволить получение высококонцентрированных растворов. Альтернативно, в других вариантах осуществления настоящего изобретения активный ингредиент существует в форме порошка для разведения перед применением с подходящей основой, например, стерильной апирогенной водой.

Фармацевтические составы, описанные в данном документе, могут быть введены, например, один или два раза, или три, или четыре, или пять, или шесть раз в день, или один, или два раза, или три, или четыре, или пять или шесть раз в неделю, и можно вводить, в качестве примера, в течение дня, недели, месяца, 3 месяцев, полгода, года, пяти лет или, например десяти лет.

Способы применения

В одном аспекте настоящее изобретение обеспечивает новые пептидомиметические макроциклы, которые полезны для способов исследования конкурентного связывания с целью идентификации средств, которые связываются с природным лигандом(ами) белков или пептидов, на которых моделировали пептидомиметические макроциклы. Например, в системе GHRH меченые пептидомиметические макроциклы, основанные на GHRH, могут быть использованы в способе исследования связывания вместе с малыми молекулами, которые конкурентно связываются с рецептором GHRH. Исследования конкурентного связывания позволяют быстрое оценивание invitro и определение потенциальных лекарств, специфических к системе GHRH. Исследования подобного связывания могут быть выполнены с любыми пептидомиметическими макроциклами, раскрытыми в данном документе, и их партнерами для связывания.

Настоящее изобретение к тому же обеспечивает генерацию антител пептидомиметических макроциклов. В отдельных вариантах осуществления настоящего изобретения эти антитела специфически связывают и пептидомиметический макроцикл, и пептиды-предшественники, такие как GHRH, к которым относятся пептидомиметические макроциклы. Такие антитела, например, разрушают нативные взаимодействия белок-белок, например, между GHRH и рецептором GHRH.

В другом аспекте, настоящее изобретение обеспечивает способы активации рецептора GHRH, что тем самым стимулирует получение и высвобождение гормона роста, который, в свою очередь, может увеличивать сухую мышечную массу или снижать жировую ткань, например висцеральную и/или абдоминальную жировую ткань. В отдельных вариантах осуществления настоящего изобретения субъект, страдающий от ожирения, например, от абдоминального ожирения, проходит лечение с использованием фармацевтических составов по настоящему изобретению. Смотри, например, Makimura и соавт., J. Clin. Endocrinol. Metab. 2009, 94(12): 5131-5138, которая включена сюда посредством ссылки.

В еще одном аспекте, настоящее изобретение обеспечивает способы лечения мышечной атрофии, которая включает анорексии, кахексии (такие как раковая кахексия, кахексия при хронической сердечной недостаточности, кахексия при хроническом обструктивном заболевании легких, кахексия при ревматоидном артрите) и саркопении, способы лечения липодистрофий, которые включают липодистрофию при HIV, способы лечения нарушений деятельности гормона роста, которые включают недостаток гормона роста у взрослых и детей, или способы лечения пареза желудка или синдрома короткой кишки. Эти способы включают введение эффективного количества соединения по настоящему изобретению теплокровному животному, включая человека. В отдельных вариантах осуществления настоящего изобретения фармацевтические композиции, обеспечиваемые в данном документе, используемые в методике лечения мышечной атрофии, вводят не чаще чем раз в день, не чаще чем раз в два дня, не чаще чем дважды в неделю, не чаще чем раз в неделю или не чаще чем раз в две недели.

В отдельных вариантах осуществления настоящего изобретения обеспечиваемое в данном документе представляет собой способы лечения недостатка гормона роста у взрослых. Такие недостатки могут быть причиной, например, повреждения или травмы гипофиза или гипоталамуса. Часто во взрослом возрасте дефицит гормона роста вызван опухолью гипофиза или лечением таких опухолей, например, путем облучения головы. Недостаток гормона роста у взрослых также может быть вызван пониженным кровоснабжением гипофиза. В отдельных вариантах осуществления настоящего изобретения фармацевтическую композицию по настоящему изобретению, используемую в методике лечения недостатка гормона роста у взрослых, вводят не чаще чем раз в день, не чаще чем раз в два дня, не чаще чем дважды в неделю, не чаще чем раз в неделю или не чаще чем раз в две недели.

В отдельных вариантах осуществления настоящего изобретения обеспечиваемое в данном документе представляет собой способы лечения недостатка гормона роста у детей. Дефицит гормона роста у детей часто имеет идиопатическую природу. Тем не менее, возможные причины включают мутации в генах, включая GHRHR или GH1, врожденные пороки развития, связанные с гипофизом (например, септо-оптические дисплазии или эктопии задней доли гипофиза), хронические заболевания почек, внутричерепные опухоли (например, в пределах или вблизи турецкого седла, например краниофарингиому), повреждение гипофиза от лучевой терапии на черепе (в случае таких раковых заболеваний, как лейкемии или рак головного мозга), хирургического вмешательства, травму или внутричерепное заболевание (например, гидроцефалию), аутоиммунное воспаление (гипофизит), ишемический или геморрагический инфаркт от низкого кровяного давления (синдром Шихана) или гипофизарную апоплексию кровоизлияния в гипофиз. Дефицит гормона роста наблюдается при врожденных заболеваниях, таких как синдром Прадера-Вилли, синдром Тернера, или дефекте гена SHOX (shortstaturehomeobox), идиопатически низком росте или у младенцев, которые малы для своего гестационного возраста. В некоторых вариантах осуществления композиции по настоящему изобретению, используемые в лечении дефицита педиатрических гормона роста, вводят не чаще, чем один раз в день, не чаще, чем через день, не чаще, чем дважды в неделю, не чаще, чем раз в неделю, или не чаще, чем раз в две недели.

Используемый в данном документе термин “методика лечения” определен как применение или введение терапевтическое средства пациенту, или применение или введение терапевтического средства к изолированной ткани или клеточной линии пациента, который имеет заболевание, симптом заболевания или предрасположенность к заболеванию, с целью вылечить, способствовать заживлению, смягчить, ослабить, изменить, сгладить, улучшить, нормализовать или влиять на заболевание, симптомы заболевания или предрасположенность к заболеванию.

В отдельных вариантах осуществления настоящего изобретения настоящее изобретение обеспечивает пептидомиметические макроциклы и способы применения, как описано в признаках ниже.

Признак подлинности 1. Пептидомиметический макроцикл содержит аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере приблизительно 60% идентична аминокислотная последовательности, выбранной из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей, представленных в Таблицах 1, 2 или 4.

Признак подлинности 2. Пептидомиметический макроцикл с признаком подлинности по п. 1, где аминокислотная последовательность указанного пептидомиметического макроцикла на по меньшей мере приблизительно 80% идентична аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей, представленных в Таблицах 1, 2 или 4.

Признак подлинности 3. Пептидомиметический макроцикл с признаком подлинности по п. 1, где аминокислотная последовательность указанного пептидомиметического макроцикла на по меньшей мере приблизительно 90% идентична аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей, представленных в Таблицах 1, 2 или 4.

Признак подлинности 4. Пептидомиметический макроцикл с признаком подлинности по п. 1, где аминокислотная последовательность указанного пептидомиметического макроцикла выбрана из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей, представленных в Таблицах 1, 2 или 4.

Признак подлинности 5. Пептидомиметический макроцикл с признаком подлинности по п. 1, где пептидомиметический макроцикл содержит спираль.

Признак подлинности 6. Пептидомиметический макроцикл с признаком подлинности по п. 1, где пептидомиметический макроцикл содержит α-спираль.

Признак подлинности 7. Пептидомиметический макроцикл с признаком подлинности по п. 1, где пептидомиметический макроцикл содержит α,α-двузамещенную аминокислоту.

Признак подлинности 8. Пептидомиметический макроцикл с признаком подлинности по п. 1, где пептидомиметический макроцикл содержит сшивающее средство, сшивающее α-положения по меньшей мере двух аминокислот.

Признак подлинности 9. Пептидомиметический макроцикл с признаком подлинности по п. 8, где по меньшей мере один из указанных двух аминокислот представляет собой α,α-двузамещенную аминокислоту.

Признак подлинности 10. Пептидомиметический макроцикл с признаком подлинности по п. 8, где пептидомиметический макроцикл имеет Формулу:

Формула (I)

B представляет собой природную или не встречающуюся в природе аминокислоту, аналог аминокислоты,

[-NH-L₃-CO-], [-NH-L₃-SO₂-], или [-NH-L₃-];

R₁ и R₂ независимо представляют собой –H, алкил, алкенил, алкинил, арилалкил, циклоалкил, циклоалкилалкил, гетероалкил, или гетероциклоалкил, незамещенный или замещенный на галоген;

v и w независимо представляют собой целые числа от 1 до 1000;

u, x, y и z независимо представляют собой целые числа от 0 до 10; и

n представляет собой целое число от 1 до 5.

Признак подлинности 11. Пептидомиметический макроцикл с признаком подлинности по п. 1, где пептидомиметический макроцикл содержит сшивающее средство, сшивающее остов аминогруппы одной аминокислоты с другой аминокислотой в структуре пептидомиметического макроцикла.

Признак подлинности 12. Пептидомиметический макроцикл с признаком подлинности по п. 11, где пептидомиметический макроцикл имеет Формулу (II) или (IIa):

где:

каждый A, C, D, и E независимо представляет собой природную или не встречающуюся в природе аминокислоту;

[-NH-L₃-CO-], [-NH-L₃-SO₂-], или [-NH-L₃-];

n представляет собой целое число от 1 до 5.

Признак подлинности 13. Способ увеличения циркулирующего уровня гормона роста (GH) у субъекта содержит введение субъекту пептидомиметического макроцикла с признаком подлинности по п. 1.

Признак подлинности 14. Способ увеличения сухой мышечной массы у субъекта содержит введение субъекту пептидомиметического макроцикла с признаком подлинности по п. 1.

Признак подлинности 15. Способ уменьшения жировой ткани у субъекта содержит введение субъекту пептидомиметического макроцикла с признаком подлинности по п. 1.

Признак подлинности 16. Способ лечения мышечных атрофий, включая анорексии, кахексии (такие как раковая кахексия, кахексия при хронической сердечной недостаточности, кахексия при хроническом обструктивном заболевании легких, кахексия при ревматоидном артрите) или саркопений у субъекта содержит введение субъекту пептидомиметического макроцикла с признаком подлинности по п. 1.

Признак подлинности 17. Способ лечения липодистрофий, включая липодистрофию при HIV, у субъекта содержит введение субъекту пептидомиметического макроцикла с признаком подлинности по п. 1.

Признак подлинности 18. Способ лечения нарушений деятельности гормона роста, включая недостаток гормона роста у взрослых и недостаток гормона роста у детей, у субъекта содержит введение субъекту пептидомиметического макроцикла с признаком подлинности по п. 1.

Признак подлинности 19. Способ лечения пареза желудка или синдрома короткой кишки у субъекта содержит введение субъекту пептидомиметического макроцикла с признаком подлинности по п. 1.

Признак подлинности 20. Способ лечения мышечных атрофий, липодистрофий, нарушений деятельности гормона роста или пареза желудка/синдрома короткой кишки у субъекта с помощью введения агониста рецептора GHRH, где агонист вводят не чаще чем раз в день, не чаще чем раз в два дня, не чаще чем дважды в неделю, не чаще чем раз в неделю или не чаще чем раз в две недели.

Признак подлинности 21. Способ лечения мышечных атрофий, липодистрофий, нарушений деятельности гормона роста или пареза желудка/синдрома короткой кишки у субъекта с помощью введения аналога GHRH, где аналог GHRH вводят не чаще чем раз в день, не чаще чем раз в два дня, не чаще чем дважды в неделю, не чаще чем раз в неделю или не чаще чем раз в две недели.

Признак подлинности 22. Способ увеличения циркулирующего уровня гормона роста (GH) у субъекта с помощью введения агониста рецептора GHRH, где агонист вводят не чаще чем раз в день, не чаще чем раз в два дня, не чаще чем дважды в неделю, не чаще чем раз в неделю или не чаще чем раз в две недели.

Признак подлинности 23. Способ увеличения циркулирующего уровня гормона роста (GH) у субъекта с помощью введения аналога GHRH, где аналог GHRH вводят не чаще чем раз в день, не чаще чем раз в два дня, не чаще чем дважды в неделю, не чаще чем раз в неделю или не чаще чем раз в две недели.

Признак подлинности 24. Пептидомиметический макроцикл с признаком подлинности по п. 10, где L₁ и L₂ независимо представляют собой алкилен, алкенилен или алкинилен.

Признак подлинности 25. Пептидомиметический макроцикл с признаком подлинности по п. 24, где L₁ и L₂ независимо представляют собой C₃-C₁₀ алкилен или алкенилен.

Признак подлинности 26. Пептидомиметический макроцикл с признаком подлинности по п. 24, где L₁ и L₂ независимо представляют собой C₃-C₆ алкилен или алкенилен.

Признак подлинности 27. Пептидомиметический макроцикл с признаком подлинности по п. 10, где R₁ и R₂ представляют собой H.

Признак подлинности 28. Пептидомиметический макроцикл с признаком подлинности по п. 10, где R₁ и R₂ независимо представляют собой алкил.

Признак подлинности 29. Пептидомиметический макроцикл с признаком подлинности по п. 10, где R₁ и R₂ представляют собой метил.

В то время как предпочтительные варианты осуществления настоящего изобретения были показаны и описаны здесь, специалистам в данной области техники будет очевидно, что такие варианты осуществления обеспечиваются только в качестве примера. Многочисленные вариации, изменения и замены теперь будут очевидны специалистам в данной области без отступления от изобретения. Следует понимать, что различные альтернативы вариантам осуществления настоящего изобретения, описанные в данном документе, могут быть использованы в практической реализации изобретения. Предполагается, что следующая формула изобретения определяет объем настоящего изобретения, и что способы и структуры в пределах объема этих изобретения и ее эквивалентов будут покрыты таким образом.

ПРИМЕРЫ

Пример 1: Пептидомиметические макроциклы по настоящему изобретению

Пептидомиметические макроциклы синтезируют, очищают и анализируют как описано выше и как описано ниже (Schafmeister и соавт., J. Am. Chem. Soc. 122:5891-5892 (2000); Schafmeister & Verdine, J. Am. Chem. Soc. 122:5891 (2005); Walensky исоавт., Science 305:1466-1470 (2004); и патент США № 7192713). Пептидомиметические макроциклы разработали с помощью замена двух или более природных аминокислот на соответствующие синтетические аминокислоты. Замещения были сделаны в i и i+4, и i и i+7 положениях. Пептидный синтез проводят вручную или на автоматическом пептидном синтезаторе (AppliedBiosystems, модель 433A), в условиях твердой фазы, АМ-смола Ринка (Novabiochem), и защищающая основную цепочку защитная группа Fmoc. Для соединения природных Fmoc-защищенных аминокислот (Novabiochem) используют 10 эквивалентов аминокислот и связующие реагенты HBTU/HOBt (Novabiochem)/DIEA в молярном соотношении 1:1:2. Искусственные аминокислоты (4 экв.) соединяют с HATU (AppliedBiosystems)/HOBt/DIEA в молярном соотношении 1:1:2. N-конец синтетических пептидов ацелируют, тогда как С-конец амидируют.

Очистку сшитых соединений осуществляют с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (HPLC) (VarianProStar) на колонке с обращенной фазой С18 (Varian) с получением очищенных соединений. Химическую композиция очищенных соединений подтверждают с помощью LC/MS масс-спектрометрии (MicroraassLCT в соединении с системой Agilent 1100 HPLC) и аминокислотного анализа (AppliedBiosystems, модель 420А).

Таблица 4 иллюстрирует список пептидомиметических макроциклов полученных по настоящему изобретению.

Таблица 4 (SEQ ID NOS 89-180, соответственно, в порядке появления)

В последовательностях, приведенных выше, и в других местах используются следующие сокращения: аминокислоты, обозначенные как “$”, представляют собой альфа-MeS5-пентенил-аланин олефиновые аминокислоты, в случае которых i и i+4 соединены с помощью углеродного сшивающего средства, которое содержит одну двойную связь. “%” представляют собой альфа-MeS5-пентенил-аланин олефиновые аминокислоты, в случае которых i и i+4 соединены с помощью углеродного сшивающего средства, которое не содержит двойных связей (полностью насыщенное алкиленовое сшивающее средство). Аминокислоты, обозначенные как “%r8”, представляют собой альфа-MeR8-октенил-аланин олефиновые аминокислоты, в случае которых i и i+7 соединены с помощью углеродного сшивающего средства, которое содержит одну двойную связь. Аминокислоты, обозначенные как “%r8”, представляют собой альфа-MeR8-октенил-аланин олефиновые аминокислоты в случае которых i и i+7 соединены с помощью углеродного сшивающего средства, которое не содержит двойных связей (полностью насыщенное алкиленовое сшивающее средство). Обозначение “iso1” или “iso2” указывает, что пептидомиметический макроцикл представляет собой отдельный изомер. Аминокислоты, обозначенные как строчное “a” представляет собой D-аланин.

Аминокислоты, которые используются в ходе образования триазольных сшивающих средств, представлены в соответствии с пояснением, указанным ниже. Стереохимия в альфа-положении каждой аминокислоты представляет собой S-ориентацию, если не указано иное. В случае азидированных аминокислот, указанное число атомов углерода соответствует числу метиленовых звеньев между альфа атомом углерода и концевым азидом. В случае алкинированных аминокислот, указанное число атомов углерода соответствует числу метиленовых звеньев между альфа атомом углерода и триазольной функциональной группой плюс два углеродных атома в структуре триазольной группы, полученные из алкина.

$5a5 Альфа-Me-алкин-1,5-триазол(5 атомов углерода)

$5n3 Альфа-Me-азид-1,5-триазол (3 атомов углерода)

$4rn6 Альфа-Me R-азид-1,4триазол (6 атомов углерода)

$4a5 Альфа-Me алкин-1,4-триазол (5 атомов углерода)

Иллюстративные структуры некоторых пептидомиметических макроциклов представлены в Таблице 5.

Пример 2: Метаболизм с помощью очищенной протеазы

Линейные пептиды и сшитые пептидомиметические макроциклы проверяют на устойчивость к протеолизу с помощью трипсина (MPBiomedicals, SolonOH) путем солюбилизации каждого пептида в концентрации 10 мкмоль в 200 мкл 100 ммоль NH4OAc (pH 7,5). Вступление в реакцию инициируют с помощью добавления 3,5 мкл трипсина (12,5 мкг протеаза на 500 мкл реакционной смеси) и непрерывно встряхивают в герметичных флаконах во время инкубирования при комнатной температуре (22±2°C). Соотношение энзим/субстрат ratiowas составляло 1:102 (вес./вес.). После 0, 5, 30, 60 и 135 мин инкубации реакцию гасят с помощью добавления эквивалентного объема 0,2% трифторуксусной кислоты. Затем, раствор безотлагательно анализируют с помощью LC-MS в положительном режиме детектирования. Время полуреакции для каждого пептида рассчитывают в GraphPadPrism с помощью нелинейной аппроксимации некалиброваных сигналов MS по сравнению со временем инкубации энзима. Результаты приведены на ФИГУРАХ 1A и 1B.

Пример 3: Агонизм GHRHR, измеренный с помощью cAMP

GHRH (1-29) и сшитые пептидомиметические макроциклы проверяют на агонизм в рецепторе GHRH человека (hGHRHR) при различных концентрациях. 293 человеческие клетки, которые временно или стабильно экспрессируют hGHRHR, были отделены в колбах с клеточной культурой с версеном (Lifetechnologies), суспендировали в бессывороточной среде (50 тыс. клеток/точку измерения), и стимулируют в течение 30 мин при комнатной температуре с GHRH (1-29) (Bachem) или сшитыми пептидомиметическими макроциклами. cAMP определяют количественно с помощью способа исследования на основе HTRF® (CisBio) и используют в соответствии с инструкциями производителя. EC50% для каждого агониста рассчитывали по нелинейной аппроксимации ответа относительно дозы (GraphPadPrism). Максимальный ответ определяют путем стимулирования 10 мкмоль GHRH (1-29). Результаты проиллюстрированы на фигуре 3.

Пример 4: Изучение плазмической PK/PDу крыс

Пять пептидомиметических макроциклов по настоящему изобретению (SP-1, SP-6, SP-8, SP-21, SP-32), также как серморелин, изучают для определения фармакокинетических и фармакодинамических параметров у крыс. Использовали самцов крыс Sprague-Dawley (300 г, не голодавшие, канюлированные). В исследовании принимали участие три группы: IV введения, SC введения, и SC введения (контроль растворителем). В случае экспериментов с использованием серморелина, уровень дозы 3 мг/кг IV/SC использовали в виде шарика (объем дозы 3 мл/кг дозы и концентрация дозы 1 мг/мл). В качестве основы использовали: 10 вес.% N, N-диметилацетамида, 10 вес.% DMSO, 2 вес.% SolutolHS 15 в воде для инъекций, которая содержит 45 мг/мл (4,5 вес.%) маннита и 25 ммоль (0,38 вес.%) гистидина (pH 7,5; 320 мосмоль/кг). Пептид сначала растворяют в высокой концентрации в DMA и DMSO перед вторым разбавлением в основе солютол.

Для экспериментов с использованием пептидомиметических макроциклов используют 0,1 мл DMA и 0,1 мл DMSO для комбинирования с каждым мг макроцикла (в каждом эксперименте используют ~4,3-4,5 мг макроцикла). Чтобы обеспечить полное растворение использовали обработку ультразвуком. На каждый мг макроцикла в DMA/DMSO используют 0,8 мл основы солютол. Растворы аккуратно перемешивают с пипеткой или легким перемешиванием на вортексе. Для каждого дня дозирования используют свежие пробирки, а макроциклы перед изготовлением лекарственного средства хранят в твердом виде при -20°C.

Для каждой наблюдаемой группы, у 2 крыс брали кровь (350 мкл) в определенных точках времени (5 мин, 15 мин, 30 мин, 1 час, 2 часа, 4 часа, 8 часов, 24 часа, и 48 часов) и забор 150 мкл крови осуществляли непосредственно перед введением дозы. Плазму получали в пробирки K2EDTA с помощью центрифугирования в течение 20 минуты при 4°C и 2000 G максимум через 30 минут после забора. Из каждых 350 мкл крови, 120 мкл переносят в одну из пробирок для исследования PD и 50 мкл в другую пробирку для исследования PD и немедленной заморозки. Из 150 мкл крови, 70 мкл переносят в одну пробирку для исследования PD и немедленной заморозки.

Результаты приведены на Фигурах 4-11.

Claims

1. Пептидомиметический макроцикл, который связывается с рецептором гормона, высвобождающего гормон роста (GHRH), содержащий аминокислотную последовательность, идентичную по меньшей мере приблизительно на 60% GHRH 1-29, включающий два макроцикл-образующих линкера, причем первый из указанных двух макроцикл-образующих линкеров соединяет первую аминокислоту со второй аминокислотой, и второй из указанных двух макроцикл-образующих линкеров соединяет третью аминокислоту с четвертой аминокислотой, причем пептидомиметический макроцикл включает аминокислотную последовательность формулы:

Х1-Х2-Х3-Х4-Х5-Х6-Х7-Х8-Х9-Х10-Х11-Х12-Х13-Х14-Х15-Х16-Х17-Х18-Х19-Х20-Х21-Х22-Х23-Х24-Х25-Х26-Х27-Х28-Х29,

где:

X1 представляет собой Tyr;

Х2 представляет собой D-Ala;

Х3 представляет собой Asp;

Х4 представляет собой сшитую аминокислоту;

Х5 представляет собой Ile;

Х6 представляет собой Phe;

Х7 представляет собой Thr;

Х8 представляет собой сшитую аминокислоту;

Х9 представляет собой Ser;

Х10 представляет собой Tyr;

X11 представляет собой Arg;

Х12 представляет собой Lys;

Х13 представляет собой Val;

Х14 представляет собой Leu;

Х15 представляет собой Gly;

Х16 представляет собой Gln;

Х17 представляет собой Leu;

Х18 представляет собой Ser;

Х19 представляет собой Ala;

Х20 представляет собой Arg;

Х21 представляет собой сшитую аминокислоту;

Х22 представляет собой Leu;

Х23 представляет собой Leu;

Х24 представляет собой Gln;

Х25 представляет собой сшитую аминокислоту;

Х26 представляет собой Ile;

Х27 представляет собой Nle;

Х28 представляет собой Ser;

Х29 представляет собой Arg;

где первый из указанных двух макроцикл-образующих линкеров соединяет пару аминокислот, соответствующих следующему расположению аминокислот: Х4 и Х8;

где второй из указанных двух макроцикл-образующих линкеров соединяет пару аминокислот, соответствующих следующему расположению аминокислот: Х21 и Х25;

где каждая сшитая аминокислота, соединенная одним из макроцикл-образующих линкеров, представляет собой α,α-двузамещенную аминокислоту;

где пептидомиметический макроцикл имеет формулу:

в которой каждый А, С, D и Е независимо обозначает аминокислоту;

В обозначает аминокислоту или

L обозначает макроцикл-образующий линкер формулы -L₁-L₂-;

L' обозначает макроцикл-образующий линкер формулы -L₁'-L₂'-;

и причем А, В, С, D и Е, вместе со сшитыми аминокислотами, соединенными макроцикл-образующими линкерами L и L', образуют аминокислотную последовательность пептидомиметического макроцикла;

R₁, R₁', R₂ и R₂' независимо обозначают -Н, C₁-С₁₀ алкил, С₂-С₂₀ алкенил, С₃-С₁₂ циклоалкил, незамещенный или замещенный галогеном;

L₁, L₁', L₂ и L₂' независимо обозначают С₃-С₁₀ алкилен, С₃-С₁₀ алкенилен или [-R₄-K-R₄-]_n, каждый из которых может быть замещен R₅;

каждый R₄ независимо обозначает С₃-С₁₀ алкилен или С₃-С₁₀ алкенилен;

каждый R₅ независимо обозначает галоген, C₁-С₁₀ алкил, -OR₆, -N(R₆)₂, -SR₆, -SOR₆, -SO₂R₆, -CO₂R₆, флуоресцентную группу или радиоизотоп;

каждый R₆ независимо обозначает -Н, C₁-С₁₀ алкил, С₂-С₂₀ алкенил, флуоресцентную группу или радиоизотоп;

каждый K независимо обозначает О, S, SO, SO₂, СО, СО₂ или CONR₃;

каждый R₃ независимо обозначает -Н, C₁-С₁₀ алкил, С₂-С₂₀ алкенил, С₃-С₁₂ циклоалкил, в случае необходимости замещенный R₅;

R₇ и R₇' независимо обозначают -Н, C₁-С₁₀ алкил, С₂-С₂₀ алкенил, С₃-С₁₂ циклоалкил, в случае необходимости замещенный R₅, или часть циклической структуры с остатком D;

R₈ и R₈' независимо обозначают -Н, C₁-С₁₀ алкил, С₂-С₂₀ алкенил, С₃-С₁₂ циклоалкил, в случае необходимости замещенный R₅, или часть циклической структуры с остатком Е;

v, v', w и w' независимо означают целые числа от 1 до 100;

x+y+z=3;

х'+у'+z'=3; и

n означает целое число от 1 до 5.

2. Пептидомиметический макроцикл по п. 1, содержащий аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере приблизительно 60% идентична аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NOS: 2, 75, 89, 91, 122-136, 151-158, 166-168, 177 и 178.

3. Пептидомиметический макроцикл по п. 1, где аминокислотная последовательность указанного пептидомиметического макроцикла на по меньшей мере приблизительно 80% идентична аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NOS: 2, 75, 89, 91, 122-136, 151-158, 166-168, 177 и 178.

4. Пептидомиметический макроцикл по п. 1, в котором аминокислотная последовательность указанного пептидомиметического макроцикла на по меньшей мере приблизительно 90% идентична аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NOS: 2, 75, 89, 91, 122-136, 151-158, 166-168, 177 и 178.

5. Пептидомиметический макроцикл по п. 1, причем аминокислотная последовательность указанного пептидомиметического макроцикла выбрана из группы, состоящей из SEQ ID NOS: 2, 75, 89, 91, 122-136, 151-158, 166-168, 177 и 178.

6. Пептидомиметический макроцикл по п. 1, причем пептидомиметический макроцикл содержит спираль.

7. Пептидомиметический макроцикл по п. 1, причем пептидомиметический макроцикл содержит α-спираль.

8. Пептидомиметический макроцикл по п. 1, в котором каждый из v и w независимо представляет собой целое число от 1 до 25.

9. Пептидомиметический макроцикл по любому из пп. 1-8, в котором L₁ и L₂ независимо представляют собой С₃-С₁₀ алкилен или С₃-С₁₀ алкенилен.

10. Пептидомиметический макроцикл по п. 9, в котором L₁ и L₂ независимо представляют собой С₃-С₁₀ алкилен или алкенилен.

11. Пептидомиметический макроцикл по п. 9, в котором L₁ и L₂ независимо представляют собой С₃-С₆ алкилен или алкенилен.

12. Пептидомиметический макроцикл по любому из пп. 1-8, в котором R₁ и R₂ независимо представляют собой Н.

13. Пептидомиметический макроцикл по любому из пп. 1-8, в котором R₁ и R₂ независимо обозначают C₁-С₁₀ алкил.

14. Пептидомиметический макроцикл по любому из пп. 1-8, в котором R₁ и R₂ обозначают метил.

15. Пептидомиметический макроцикл по любому из пп. 1-8, в котором R₁ и R₂ независимо обозначают C₁-С₁₀ алкил, С₂-С₁₀ алкенил, С₂-С₁₀ алкинил или С₃-С₁₂ циклоалкил, незамещенный или замещенный галогеном.

16. Пептидомиметический макроцикл по любому из пп. 1-8, в котором один из R₁ и R₂ обозначает -Н, а другой из R₁ и R₂ обозначает C₁-С₁₀ алкил.

17. Пептидомиметический макроцикл по п. 1, включающий аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 80% идентичную GHRH 1-29.

18. Фармацевтическая композиция для увеличения циркулирующего уровня гормона роста (GH) у пациента, содержащая терапевтически эффективное количество пептидомиметического макроцикла по любому из пп. 1-17.

19. Фармацевтическая композиция по п. 18, дополнительно содержащая фармацевтически приемлемый эксципиент.

20. Применение пептидомиметического макроцикла по любому из пп. 1-17 в получении лекарственного средства для повышения циркулирующего уровня гормона роста (GH) у пациента.

21. Применение пептидомиметического макроцикла по любому из пп. 1-17 в получении лекарственного средства для увеличения сухой мышечной массы у пациента.

22. Применение пептидомиметического макроцикла по любому из пп. 1-17 в получении лекарственного средства для уменьшения жировой ткани у пациента.

23. Применение по п. 22, в котором жировая ткань представляет собой абдоминальную ткань.

24. Применение по п. 23, в котором пациент страдает ожирением.

25. Применение пептидомиметического макроцикла по любому из пп. 1-17 в получении лекарственного средства для лечения мышечной атрофии у пациента.

26. Применение пептидомиметического макроцикла по любому из пп. 1-17 в получении лекарственного средства для лечения липодистрофии у пациента.

27. Применение пептидомиметического макроцикла по любому из пп. 1-17 в получении лекарственного средства для лечения нарушения гормона роста у пациента.

28. Применение по п. 27, в котором нарушение представляет собой недостаток гормона роста у взрослых.

29. Применение по п. 27, в котором нарушение представляет собой недостаток гормона роста у детей.

30. Применение по п. 29, в котором недостаток гормона роста у детей является сопутствующим с идиопатической низкорослостью, SGA (низкая масса для данного гестационного возраста у новорожденного), хронической почечной недостаточностью, синдромом Прадера-Вилли, синдромом Тернера, дефектом гена SHOX (shortstaturehomeobox) или первичным недостатком IGF-1.

31. Применение пептидомиметического макроцикла по любому из пп. 1-17 в получении лекарственного средства для лечения пареза желудка или синдрома короткой кишки у пациента.