RU2620938C2 - Дифференцирование эмбриональных стволовых клеток человека - Google Patents
Дифференцирование эмбриональных стволовых клеток человека Download PDFInfo
- Publication number
- RU2620938C2 RU2620938C2 RU2013114373A RU2013114373A RU2620938C2 RU 2620938 C2 RU2620938 C2 RU 2620938C2 RU 2013114373 A RU2013114373 A RU 2013114373A RU 2013114373 A RU2013114373 A RU 2013114373A RU 2620938 C2 RU2620938 C2 RU 2620938C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- cells
- cell
- human embryonic
- markers characteristic
- embryonic stem
- Prior art date
Links
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 title claims abstract description 66
- 210000001671 embryonic stem cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 48
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 285
- 210000001900 endoderm Anatomy 0.000 claims abstract description 98
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims abstract description 68
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 67
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims abstract description 57
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims abstract description 57
- 108010023082 activin A Proteins 0.000 claims abstract description 28
- 102100039939 Growth/differentiation factor 8 Human genes 0.000 claims abstract description 19
- 108010056852 Myostatin Proteins 0.000 claims abstract description 16
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 claims abstract description 14
- 239000003446 ligand Substances 0.000 claims abstract description 10
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 claims abstract description 6
- 102100031650 C-X-C chemokine receptor type 4 Human genes 0.000 claims description 24
- 101000922348 Homo sapiens C-X-C chemokine receptor type 4 Proteins 0.000 claims description 24
- -1 HNF3 beta Proteins 0.000 claims description 17
- 210000004039 endoderm cell Anatomy 0.000 claims description 12
- 101000652324 Homo sapiens Transcription factor SOX-17 Proteins 0.000 claims description 10
- 102100030243 Transcription factor SOX-17 Human genes 0.000 claims description 10
- 108060001253 CD99 Proteins 0.000 claims description 9
- 102000024905 CD99 Human genes 0.000 claims description 9
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 7
- 101000819074 Homo sapiens Transcription factor GATA-4 Proteins 0.000 claims description 6
- 102100021380 Transcription factor GATA-4 Human genes 0.000 claims description 6
- 102100025745 Cerberus Human genes 0.000 claims description 5
- 102100027754 Mast/stem cell growth factor receptor Kit Human genes 0.000 claims description 5
- 102100037986 Dickkopf-related protein 4 Human genes 0.000 claims description 4
- 102100035308 Fibroblast growth factor 17 Human genes 0.000 claims description 4
- 102100028072 Fibroblast growth factor 4 Human genes 0.000 claims description 4
- 102100037680 Fibroblast growth factor 8 Human genes 0.000 claims description 4
- 102100030634 Homeobox protein OTX2 Human genes 0.000 claims description 4
- 108010048671 Homeodomain Proteins Proteins 0.000 claims description 4
- 102000009331 Homeodomain Proteins Human genes 0.000 claims description 4
- 101000914195 Homo sapiens Cerberus Proteins 0.000 claims description 4
- 101000951340 Homo sapiens Dickkopf-related protein 4 Proteins 0.000 claims description 4
- 101000878124 Homo sapiens Fibroblast growth factor 17 Proteins 0.000 claims description 4
- 101001060274 Homo sapiens Fibroblast growth factor 4 Proteins 0.000 claims description 4
- 101001027382 Homo sapiens Fibroblast growth factor 8 Proteins 0.000 claims description 4
- 101000584400 Homo sapiens Homeobox protein OTX2 Proteins 0.000 claims description 4
- 101000819088 Homo sapiens Transcription factor GATA-6 Proteins 0.000 claims description 4
- 102100021382 Transcription factor GATA-6 Human genes 0.000 claims description 4
- 102100036008 CD48 antigen Human genes 0.000 claims description 3
- 101000716130 Homo sapiens CD48 antigen Proteins 0.000 claims description 3
- 241000282412 Homo Species 0.000 claims description 2
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 26
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 abstract description 15
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 abstract description 13
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 abstract description 13
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 abstract description 13
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 abstract description 13
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 10
- 210000000227 basophil cell of anterior lobe of hypophysis Anatomy 0.000 abstract description 9
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 abstract description 7
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 abstract description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 2
- 210000001778 pluripotent stem cell Anatomy 0.000 description 70
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 50
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 20
- 210000003890 endocrine cell Anatomy 0.000 description 20
- 101710183548 Pyridoxal 5'-phosphate synthase subunit PdxS Proteins 0.000 description 18
- 230000009996 pancreatic endocrine effect Effects 0.000 description 18
- HJCMDXDYPOUFDY-WHFBIAKZSA-N Ala-Gln Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(N)=O HJCMDXDYPOUFDY-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 13
- 102100037904 CD9 antigen Human genes 0.000 description 13
- 101000738354 Homo sapiens CD9 antigen Proteins 0.000 description 13
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 12
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 12
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 12
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 12
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 12
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 12
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 11
- 108050003627 Wnt Proteins 0.000 description 11
- 102000013814 Wnt Human genes 0.000 description 11
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 11
- 108090000379 Fibroblast growth factor 2 Proteins 0.000 description 10
- 102000003974 Fibroblast growth factor 2 Human genes 0.000 description 10
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 10
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 10
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 10
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 10
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 10
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 10
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 9
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 9
- 230000008569 process Effects 0.000 description 9
- 210000002308 embryonic cell Anatomy 0.000 description 8
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 8
- 108010051975 Glycogen Synthase Kinase 3 beta Proteins 0.000 description 7
- 102100038104 Glycogen synthase kinase-3 beta Human genes 0.000 description 7
- 102100035423 POU domain, class 5, transcription factor 1 Human genes 0.000 description 7
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 7
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 7
- 210000001654 germ layer Anatomy 0.000 description 7
- 108010082117 matrigel Proteins 0.000 description 7
- 102100041030 Pancreas/duodenum homeobox protein 1 Human genes 0.000 description 6
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 6
- 238000011161 development Methods 0.000 description 6
- 230000002124 endocrine Effects 0.000 description 6
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 6
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 6
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 6
- 101000576323 Homo sapiens Motor neuron and pancreas homeobox protein 1 Proteins 0.000 description 5
- 102100025170 Motor neuron and pancreas homeobox protein 1 Human genes 0.000 description 5
- 239000006146 Roswell Park Memorial Institute medium Substances 0.000 description 5
- UIIMBOGNXHQVGW-DEQYMQKBSA-M Sodium bicarbonate-14C Chemical compound [Na+].O[14C]([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-DEQYMQKBSA-M 0.000 description 5
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 5
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 5
- 210000003981 ectoderm Anatomy 0.000 description 5
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 5
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 5
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 5
- 102000051325 Glucagon Human genes 0.000 description 4
- 108060003199 Glucagon Proteins 0.000 description 4
- 102100028096 Homeobox protein Nkx-6.2 Human genes 0.000 description 4
- 101000578254 Homo sapiens Homeobox protein Nkx-6.1 Proteins 0.000 description 4
- 101000578258 Homo sapiens Homeobox protein Nkx-6.2 Proteins 0.000 description 4
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 4
- 102100038553 Neurogenin-3 Human genes 0.000 description 4
- 102000005157 Somatostatin Human genes 0.000 description 4
- 108010056088 Somatostatin Proteins 0.000 description 4
- 230000001143 conditioned effect Effects 0.000 description 4
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 4
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 4
- MASNOZXLGMXCHN-ZLPAWPGGSA-N glucagon Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O)C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC=1NC=NC=1)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C1=CC=CC=C1 MASNOZXLGMXCHN-ZLPAWPGGSA-N 0.000 description 4
- 229960004666 glucagon Drugs 0.000 description 4
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 4
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 4
- 210000004153 islets of langerhan Anatomy 0.000 description 4
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 4
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 4
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 4
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 4
- NHXLMOGPVYXJNR-ATOGVRKGSA-N somatostatin Chemical compound C([C@H]1C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@@H](CC=2C3=CC=CC=C3NC=2)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@H](C(=O)N1)[C@@H](C)O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)N)C(O)=O)=O)[C@H](O)C)C1=CC=CC=C1 NHXLMOGPVYXJNR-ATOGVRKGSA-N 0.000 description 4
- 229960000553 somatostatin Drugs 0.000 description 4
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 4
- HFDKKNHCYWNNNQ-YOGANYHLSA-N 75976-10-2 Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](C)N)C(C)C)[C@@H](C)O)C1=CC=C(O)C=C1 HFDKKNHCYWNNNQ-YOGANYHLSA-N 0.000 description 3
- 108010059616 Activins Proteins 0.000 description 3
- 102000005606 Activins Human genes 0.000 description 3
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-M Bicarbonate Chemical compound OC([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 102100029087 Hepatocyte nuclear factor 6 Human genes 0.000 description 3
- 108700005087 Homeobox Genes Proteins 0.000 description 3
- 101000886562 Homo sapiens Growth/differentiation factor 8 Proteins 0.000 description 3
- 101000988619 Homo sapiens Hepatocyte nuclear factor 6 Proteins 0.000 description 3
- 101000603702 Homo sapiens Neurogenin-3 Proteins 0.000 description 3
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 3
- 102000018886 Pancreatic Polypeptide Human genes 0.000 description 3
- 102000052651 Pancreatic hormone Human genes 0.000 description 3
- 101000983124 Sus scrofa Pancreatic prohormone precursor Proteins 0.000 description 3
- 108090001012 Transforming Growth Factor beta Proteins 0.000 description 3
- 102000004887 Transforming Growth Factor beta Human genes 0.000 description 3
- 239000000488 activin Substances 0.000 description 3
- SHGAZHPCJJPHSC-YCNIQYBTSA-N all-trans-retinoic acid Chemical compound OC(=O)\C=C(/C)\C=C\C=C(/C)\C=C\C1=C(C)CCCC1(C)C SHGAZHPCJJPHSC-YCNIQYBTSA-N 0.000 description 3
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 3
- 210000002459 blastocyst Anatomy 0.000 description 3
- 239000002771 cell marker Substances 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 3
- 230000007045 gastrulation Effects 0.000 description 3
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 description 3
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 3
- 210000003716 mesoderm Anatomy 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 3
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 3
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 3
- 239000004025 pancreas hormone Substances 0.000 description 3
- 229940032957 pancreatic hormone Drugs 0.000 description 3
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 3
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 229930002330 retinoic acid Natural products 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N tgfbeta Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CCSC)C(C)C)[C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N 0.000 description 3
- 229960001727 tretinoin Drugs 0.000 description 3
- 101000810330 Arabidopsis thaliana Eukaryotic translation initiation factor 3 subunit E Proteins 0.000 description 2
- 108010083123 CDX2 Transcription Factor Proteins 0.000 description 2
- 102000006277 CDX2 Transcription Factor Human genes 0.000 description 2
- 101100156752 Caenorhabditis elegans cwn-1 gene Proteins 0.000 description 2
- 108010069241 Connexin 43 Proteins 0.000 description 2
- 102000001045 Connexin 43 Human genes 0.000 description 2
- 101000704130 Escherichia coli (strain K12) Signal recognition particle protein Proteins 0.000 description 2
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 2
- 102100037060 Forkhead box protein D3 Human genes 0.000 description 2
- 102100039290 Gap junction gamma-1 protein Human genes 0.000 description 2
- 102100022057 Hepatocyte nuclear factor 1-alpha Human genes 0.000 description 2
- 102100022054 Hepatocyte nuclear factor 4-alpha Human genes 0.000 description 2
- 102100024208 Homeobox protein MIXL1 Human genes 0.000 description 2
- 101001029308 Homo sapiens Forkhead box protein D3 Proteins 0.000 description 2
- 101001045751 Homo sapiens Hepatocyte nuclear factor 1-alpha Proteins 0.000 description 2
- 101001045740 Homo sapiens Hepatocyte nuclear factor 4-alpha Proteins 0.000 description 2
- 101001052462 Homo sapiens Homeobox protein MIXL1 Proteins 0.000 description 2
- 101001053263 Homo sapiens Insulin gene enhancer protein ISL-1 Proteins 0.000 description 2
- 101000613495 Homo sapiens Paired box protein Pax-4 Proteins 0.000 description 2
- 101000738523 Homo sapiens Pancreas transcription factor 1 subunit alpha Proteins 0.000 description 2
- 101001069749 Homo sapiens Prospero homeobox protein 1 Proteins 0.000 description 2
- 101000687905 Homo sapiens Transcription factor SOX-2 Proteins 0.000 description 2
- 101000642523 Homo sapiens Transcription factor SOX-7 Proteins 0.000 description 2
- 101000711846 Homo sapiens Transcription factor SOX-9 Proteins 0.000 description 2
- 101000777245 Homo sapiens Undifferentiated embryonic cell transcription factor 1 Proteins 0.000 description 2
- 101000976622 Homo sapiens Zinc finger protein 42 homolog Proteins 0.000 description 2
- 102100024392 Insulin gene enhancer protein ISL-1 Human genes 0.000 description 2
- 108010090306 Member 2 Subfamily G ATP Binding Cassette Transporter Proteins 0.000 description 2
- 102000013013 Member 2 Subfamily G ATP Binding Cassette Transporter Human genes 0.000 description 2
- 101000720386 Mus musculus Acyl-coenzyme A thioesterase 9, mitochondrial Proteins 0.000 description 2
- 101100112791 Mus musculus Cd99 gene Proteins 0.000 description 2
- 101150079937 NEUROD1 gene Proteins 0.000 description 2
- 102100032063 Neurogenic differentiation factor 1 Human genes 0.000 description 2
- DFPAKSUCGFBDDF-UHFFFAOYSA-N Nicotinamide Chemical compound NC(=O)C1=CC=CN=C1 DFPAKSUCGFBDDF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101000741177 Oat chlorotic stunt virus (isolate United Kingdom) Capsid protein Proteins 0.000 description 2
- 101710126211 POU domain, class 5, transcription factor 1 Proteins 0.000 description 2
- 102100040909 Paired box protein Pax-4 Human genes 0.000 description 2
- 102100037878 Pancreas transcription factor 1 subunit alpha Human genes 0.000 description 2
- 101800001268 Pancreatic hormone Proteins 0.000 description 2
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 2
- 102100033880 Prospero homeobox protein 1 Human genes 0.000 description 2
- 241000508269 Psidium Species 0.000 description 2
- 102100024270 Transcription factor SOX-2 Human genes 0.000 description 2
- 102100036730 Transcription factor SOX-7 Human genes 0.000 description 2
- 102100034204 Transcription factor SOX-9 Human genes 0.000 description 2
- 102100031278 Undifferentiated embryonic cell transcription factor 1 Human genes 0.000 description 2
- 102000052547 Wnt-1 Human genes 0.000 description 2
- 108700020987 Wnt-1 Proteins 0.000 description 2
- 102100023550 Zinc finger protein 42 homolog Human genes 0.000 description 2
- SCVDQROBPYCNAO-UHFFFAOYSA-N aniline;pyrido[3,2-d]triazine Chemical compound NC1=CC=CC=C1.C1=NN=NC2=CC=CN=C21 SCVDQROBPYCNAO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000002469 basement membrane Anatomy 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 239000006172 buffering agent Substances 0.000 description 2
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 2
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 239000007376 cm-medium Substances 0.000 description 2
- 108010015426 connexin 45 Proteins 0.000 description 2
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 2
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 2
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 2
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 2
- 238000005206 flow analysis Methods 0.000 description 2
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 2
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 2
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 2
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 2
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 2
- 230000005305 organ development Effects 0.000 description 2
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- 230000035935 pregnancy Effects 0.000 description 2
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 239000012474 protein marker Substances 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 239000003590 rho kinase inhibitor Substances 0.000 description 2
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 2
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 2
- LAQPKDLYOBZWBT-NYLDSJSYSA-N (2s,4s,5r,6r)-5-acetamido-2-{[(2s,3r,4s,5s,6r)-2-{[(2r,3r,4r,5r)-5-acetamido-1,2-dihydroxy-6-oxo-4-{[(2s,3s,4r,5s,6s)-3,4,5-trihydroxy-6-methyloxan-2-yl]oxy}hexan-3-yl]oxy}-3,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy}-4-hydroxy-6-[(1r,2r)-1,2,3-trihydrox Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@H]([C@@H](NC(C)=O)C=O)[C@@H]([C@H](O)CO)O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@]2(O[C@H]([C@H](NC(C)=O)[C@@H](O)C2)[C@H](O)[C@H](O)CO)C(O)=O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 LAQPKDLYOBZWBT-NYLDSJSYSA-N 0.000 description 1
- PFVIQVXXPOHUPT-UHFFFAOYSA-N 1-[[5-[6-[4-(4-methylpiperazin-1-yl)sulfonylanilino]pyrazin-2-yl]thiophen-2-yl]methyl]piperidin-4-ol Chemical compound C1CN(C)CCN1S(=O)(=O)C(C=C1)=CC=C1NC1=CN=CC(C=2SC(CN3CCC(O)CC3)=CC=2)=N1 PFVIQVXXPOHUPT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BFLCELFLUWTJSN-UHFFFAOYSA-N 2-(4-propan-2-ylanilino)-n-(2-thiophen-2-ylethyl)-7,8-dihydro-5h-pyrido[4,3-d]pyrimidine-6-carboxamide Chemical compound C1=CC(C(C)C)=CC=C1NC1=NC=C(CN(CC2)C(=O)NCCC=3SC=CC=3)C2=N1 BFLCELFLUWTJSN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000004105 2-pyridyl group Chemical group N1=C([*])C([H])=C([H])C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- PHFWAZUKMCGITC-UHFFFAOYSA-N 3-[[3-[4-[2-[methyl(pyridin-2-yl)amino]ethylamino]-1,3,5-triazin-2-yl]pyridin-2-yl]amino]propan-1-ol Chemical compound C=1C=CC=NC=1N(C)CCNC(N=1)=NC=NC=1C1=CC=CN=C1NCCCO PHFWAZUKMCGITC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000004180 3-fluorophenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C(*)=C([H])C(F)=C1[H] 0.000 description 1
- DPBWFNDFMCCGGJ-UHFFFAOYSA-N 4-Piperidine carboxamide Chemical compound NC(=O)C1CCNCC1 DPBWFNDFMCCGGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 239000004382 Amylase Substances 0.000 description 1
- 102000013142 Amylases Human genes 0.000 description 1
- 108010065511 Amylases Proteins 0.000 description 1
- 101150066398 CXCR4 gene Proteins 0.000 description 1
- 101800001318 Capsid protein VP4 Proteins 0.000 description 1
- 241000202252 Cerberus Species 0.000 description 1
- 101710010675 Cerberus Proteins 0.000 description 1
- 206010010099 Combined immunodeficiency Diseases 0.000 description 1
- 101100518002 Danio rerio nkx2.2a gene Proteins 0.000 description 1
- 239000006145 Eagle's minimal essential medium Substances 0.000 description 1
- 239000007755 F10 Nutrient Mixture Substances 0.000 description 1
- 102100028412 Fibroblast growth factor 10 Human genes 0.000 description 1
- 108090001047 Fibroblast growth factor 10 Proteins 0.000 description 1
- 102100028071 Fibroblast growth factor 7 Human genes 0.000 description 1
- 102100037362 Fibronectin Human genes 0.000 description 1
- 108010067306 Fibronectins Proteins 0.000 description 1
- 102000012004 Ghrelin Human genes 0.000 description 1
- 101800001586 Ghrelin Proteins 0.000 description 1
- 102000030595 Glucokinase Human genes 0.000 description 1
- 108010021582 Glucokinase Proteins 0.000 description 1
- 108700031316 Goosecoid Proteins 0.000 description 1
- 102000050057 Goosecoid Human genes 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- 239000007756 Ham's F12 Nutrient Mixture Substances 0.000 description 1
- 229920002971 Heparan sulfate Polymers 0.000 description 1
- 108700014808 Homeobox Protein Nkx-2.2 Proteins 0.000 description 1
- 102100027886 Homeobox protein Nkx-2.2 Human genes 0.000 description 1
- 101001060261 Homo sapiens Fibroblast growth factor 7 Proteins 0.000 description 1
- 101000971533 Homo sapiens Killer cell lectin-like receptor subfamily G member 1 Proteins 0.000 description 1
- 101100460496 Homo sapiens NKX2-2 gene Proteins 0.000 description 1
- 101000855004 Homo sapiens Protein Wnt-7a Proteins 0.000 description 1
- 101000835745 Homo sapiens Teratocarcinoma-derived growth factor 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000979205 Homo sapiens Transcription factor MafA Proteins 0.000 description 1
- 102100021457 Killer cell lectin-like receptor subfamily G member 1 Human genes 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 1
- 108010085895 Laminin Proteins 0.000 description 1
- 102000007547 Laminin Human genes 0.000 description 1
- 102000004083 Lymphotoxin-alpha Human genes 0.000 description 1
- 108090000542 Lymphotoxin-alpha Proteins 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 101100369076 Mus musculus Tdgf1 gene Proteins 0.000 description 1
- RPTQGXFGURRWAE-UHFFFAOYSA-N N-[4-(4-methylpiperazin-1-yl)sulfonylphenyl]-6-[5-(piperidin-1-ylmethyl)thiophen-3-yl]pyrazin-2-amine Chemical compound CN1CCN(CC1)S(=O)(=O)C1=CC=C(C=C1)NC1=CN=CC(=N1)C=1C=C(SC=1)CN1CCCCC1 RPTQGXFGURRWAE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710096141 Neurogenin-3 Proteins 0.000 description 1
- 102100037369 Nidogen-1 Human genes 0.000 description 1
- 238000000636 Northern blotting Methods 0.000 description 1
- 101150092239 OTX2 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000007354 PAX6 Transcription Factor Human genes 0.000 description 1
- 108010032788 PAX6 Transcription Factor Proteins 0.000 description 1
- 101150081664 PAX6 gene Proteins 0.000 description 1
- 102100037506 Paired box protein Pax-6 Human genes 0.000 description 1
- 108700020479 Pancreatic hormone Proteins 0.000 description 1
- 101150075928 Pax4 gene Proteins 0.000 description 1
- BELBBZDIHDAJOR-UHFFFAOYSA-N Phenolsulfonephthalein Chemical compound C1=CC(O)=CC=C1C1(C=2C=CC(O)=CC=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 BELBBZDIHDAJOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 1
- 102000001253 Protein Kinase Human genes 0.000 description 1
- 102100020729 Protein Wnt-7a Human genes 0.000 description 1
- 108010067787 Proteoglycans Proteins 0.000 description 1
- 102000016611 Proteoglycans Human genes 0.000 description 1
- ZSJLQEPLLKMAKR-UHFFFAOYSA-N Streptozotocin Natural products O=NN(C)C(=O)NC1C(O)OC(CO)C(O)C1O ZSJLQEPLLKMAKR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100026404 Teratocarcinoma-derived growth factor 1 Human genes 0.000 description 1
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 1
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 1
- 102000011117 Transforming Growth Factor beta2 Human genes 0.000 description 1
- 101800000304 Transforming growth factor beta-2 Proteins 0.000 description 1
- 206010067584 Type 1 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 1
- 101150109862 WNT-5A gene Proteins 0.000 description 1
- 102000043366 Wnt-5a Human genes 0.000 description 1
- 108700020483 Wnt-5a Proteins 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 239000012790 adhesive layer Substances 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000019418 amylase Nutrition 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 125000001797 benzyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 239000002876 beta blocker Substances 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 125000002915 carbonyl group Chemical group [*:2]C([*:1])=O 0.000 description 1
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 1
- 230000011712 cell development Effects 0.000 description 1
- 239000002458 cell surface marker Substances 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000003636 conditioned culture medium Substances 0.000 description 1
- 238000012136 culture method Methods 0.000 description 1
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 230000032459 dedifferentiation Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 108010007093 dispase Proteins 0.000 description 1
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 1
- 230000013020 embryo development Effects 0.000 description 1
- 210000002242 embryoid body Anatomy 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 210000000646 extraembryonic cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000003754 fetus Anatomy 0.000 description 1
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 1
- GNKDKYIHGQKHHM-RJKLHVOGSA-N ghrelin Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CN)COC(=O)CCCCCCC)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1N=CNC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)C1=CC=CC=C1 GNKDKYIHGQKHHM-RJKLHVOGSA-N 0.000 description 1
- 210000004907 gland Anatomy 0.000 description 1
- 230000036252 glycation Effects 0.000 description 1
- 125000003630 glycyl group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 210000003917 human chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 238000002991 immunohistochemical analysis Methods 0.000 description 1
- 238000007901 in situ hybridization Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 210000002660 insulin-secreting cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- OGQSCIYDJSNCMY-UHFFFAOYSA-H iron(3+);methyl-dioxido-oxo-$l^{5}-arsane Chemical compound [Fe+3].[Fe+3].C[As]([O-])([O-])=O.C[As]([O-])([O-])=O.C[As]([O-])([O-])=O OGQSCIYDJSNCMY-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 238000011005 laboratory method Methods 0.000 description 1
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 1
- 210000002894 multi-fate stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000000663 muscle cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 1
- 229960003966 nicotinamide Drugs 0.000 description 1
- 235000005152 nicotinamide Nutrition 0.000 description 1
- 239000011570 nicotinamide Substances 0.000 description 1
- 108010008217 nidogen Proteins 0.000 description 1
- 102000045246 noggin Human genes 0.000 description 1
- 108700007229 noggin Proteins 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 230000035764 nutrition Effects 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 description 1
- 239000007793 ph indicator Substances 0.000 description 1
- 229960003531 phenolsulfonphthalein Drugs 0.000 description 1
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000002935 phosphatidylinositol 3 kinase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 229940043441 phosphoinositide 3-kinase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 108060006633 protein kinase Proteins 0.000 description 1
- 238000009256 replacement therapy Methods 0.000 description 1
- 230000001850 reproductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- MFBOGIVSZKQAPD-UHFFFAOYSA-M sodium butyrate Chemical compound [Na+].CCCC([O-])=O MFBOGIVSZKQAPD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 230000000920 spermatogeneic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000010473 stable expression Effects 0.000 description 1
- 238000007447 staining method Methods 0.000 description 1
- ZSJLQEPLLKMAKR-GKHCUFPYSA-N streptozocin Chemical compound O=NN(C)C(=O)N[C@H]1[C@@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O ZSJLQEPLLKMAKR-GKHCUFPYSA-N 0.000 description 1
- 229960001052 streptozocin Drugs 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 description 1
- 210000001685 thyroid gland Anatomy 0.000 description 1
- 125000002023 trifluoromethyl group Chemical group FC(F)(F)* 0.000 description 1
- 230000001960 triggered effect Effects 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000036266 weeks of gestation Effects 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0613—Cells from endocrine organs
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0676—Pancreatic cells
- C12N5/0678—Stem cells; Progenitor cells; Precursor cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
- A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/0018—Culture media for cell or tissue culture
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/30—Organic components
- C12N2500/34—Sugars
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/90—Serum-free medium, which may still contain naturally-sourced components
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/10—Growth factors
- C12N2501/115—Basic fibroblast growth factor (bFGF, FGF-2)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/10—Growth factors
- C12N2501/19—Growth and differentiation factors [GDF]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/70—Enzymes
- C12N2501/72—Transferases [EC 2.]
- C12N2501/727—Kinases (EC 2.7.)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
- C12N2506/02—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from embryonic cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
- C12N2533/50—Proteins
- C12N2533/54—Collagen; Gelatin
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Obesity (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Emergency Medicine (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Hematology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Plural Heterocyclic Compounds (AREA)
Abstract
Изобретения касаются способов (варианты) формирования и дифференциации популяции клеток, в которой более 80% клеток популяции экспрессирует маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы. Способ включает дифференциацию популяции эмбриональных стволовых клеток человека в среде DMEM или MCDB-131, содержащей активин А и лиганд Wnt, или GDF-8 и 14-проп-2-ен-1-ил-3,5,7,14,17,23,27-гептаазатетрацикло[19.3.1.1~2,6~.1~8,12~]гептакоза-1(25),2(27),3,5,8(26),9,11,21,23-нонаен-16-он, где концентрация глюкозы не превышает 10,5 ммоль/л, где эмбриональные стволовые клетки человека представляют собой клетки стабильных линий эмбриональных стволовых клеток человека, клетки стабильных линий эмбриональных зародышевых клеток человека, такие как клетки H1, клетки Н7, клетки Н9 или клетки BG01V. Изобретения могут быть использованы в лабораторной практике для создания in vitro функциональной экспрессирующей инсулин клетки, которая была бы более близка к β-клетке. 3 н. и 7 з.п. ф-лы, 9 ил., 2 табл., 4 пр.
Description
ПЕРЕКРЕСТНЫЕ ССЫЛКИ НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ
Настоящая заявка притязает на приоритет предварительной патентной заявки серийный номер 61/378448, поданной 31 августа 2010 г, которая включена в настоящий документ посредством ссылки.
Область применения изобретения
В данном изобретении описываются способы содействия дифференциации плюрипотентных стволовых клеток в клетки, вырабатывающие инсулин. В частности, настоящее изобретение относится к способу получения популяции клеток, в которой более 80% клеток экспрессирует маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы.
ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Последние достижения в области заместительной клеточной терапии для лечения сахарного диабета 1 типа и нехватка островков Лангерганса для трансплантации заставили обратить внимание на разработку источников инсулин-продуцирующих клеток, или β-клеток, подходящих для трансплантации. Одним из подходов является формирование функциональных β-клеток из плюрипотентных стволовых клеток, таких как, например, эмбриональные стволовые клетки.
При эмбриональном развитии позвоночных плюрипотентные клетки дают начало группе клеток, формирующих три зародышевых листка (эктодерму, мезодерму и эндодерму) в ходе процесса, именуемого гаструляцией. Такие ткани, как, например, щитовидная железа, тимус, поджелудочная железа, кишечник и печень, будут развиваться из эндодермы через промежуточную стадию. Промежуточной стадией данного процесса является образование сформированной эндодермы. Клетки сформированной энтодермы экспрессируют ряд маркеров, как например, HNF3 бета, GATA4, MIXL1, CXCR4 и SOX17.
Формирование поджелудочной железы происходит при дифференцировании сформированной эндодермы в панкреатическую эндодерму. Клетки панкреатической эндодермы экспрессируют ген панкреатическо-дуоденального гомеобокса, Pdx1. При отсутствии Pdx1 развитие поджелудочной железы не идет дальше формирования вентрального и дорзального зачатков. Таким образом, экспрессия PDX1 характеризует критическую стадию органогенеза поджелудочной железы. Зрелая поджелудочная железа содержит, помимо других типов клеток, экзокринную ткань и эндокринную ткань. Экзокринная и эндокринная ткани образуются при дифференцировании панкреатической эндодермы.
По имеющимся данным, клетки, обладающие свойствами островковых клеток, были получены из эмбриональных клеток мыши. Например, Lumelsky et al. описывают дифференцирование мышиных эмбриональных стволовых клеток в инсулин-секретирующие структуры, аналогичные островкам поджелудочной железы. Soria et al. (Diabetes 49:157, 2000) описывают инсулин-секретирующие клетки, производные мышиных эмбриональных стволовых клеток, которые нормализуют гликемию у мышей с диабетом, индуцированным стрептозотоцином.
В одном примере, Hori et al. (PNAS 99: 16105, 2002) описывается, что обработка мышиных эмбриональных стволовых клеток ингибиторами фосфоинозитид-3-киназы (LY294002) приводила к получению клеток, подобных β-клеткам.
В другом примере, Blyszczuk et al. (PNAS 100:998, 2003), сообщается о получении инсулин-продуцирующих клеток из мышиных эмбриональных стволовых клеток с конститутивной экспрессией Pax4.
В публикации Micallef et al. сообщается, что ретиноевая кислота может регулировать способность эмбриональных стволовых клеток формировать Pdx1-положительную панкреатическую эндодерму. Ретиноевая кислота с наибольшей эффективностью индуцирует экспрессию Pdx1 при добавлении в культуру на 4 день дифференцирования эмбриональных стволовых клеток в течение периода, соответствующего концу гаструляции эмбриона (Diabetes 54:301, 2005).
В публикации Miyazaki et al. сообщается о линии мышиных эмбриональных стволовых клеток со сверхэкспрессией Pdx1. Результаты показывают, что экспрессия экзогенного Pdx1 очевидно повышает экспрессию генов инсулина, соматостатина, глюкокиназы, нейрогенина 3, p48, Pax6 и HNF6 в образующихся дифференцированных клетках (Diabetes 53: 1030, 2004).
В публикации Skoudy et al. сообщается, что активин A (входящий в надсемейство TGF-β) повышает экспрессию экзокринных панкреатических генов (p48 и амилазы) и генов эндокринных клеток (Pdx1, инсулина и глюкагона) в эмбриональных стволовых клетках мыши. Максимальный эффект наблюдался при добавлении 1 нмоль/л активина A. Кроме того, авторы отметили, что экспрессия мРНК инсулина и Pdx1 не изменялась под действием ретиноевой кислоты; однако добавление 3nM FGF7 привело к повышению концентрации транскрипта Pdx1 (Biochem. J. 379: 749, 2004).
В работе Shiraki et al. изучались эффекты факторов роста, специфически ускоряющих дифференцирование эмбриональных стволовых клеток в Pdx1-положительные клетки. По наблюдению этих авторов, TGF-β2 приводил к воспроизводимому увеличению доли Pdx1-положительных клеток (Genes Cells. 2005 Jun; 10(6): 503-16).
В работе Gordon et al. показана индукция образования брахиурических [положительных]/HNF3 бета [положительных] энтодермальных клеток из эмбриональных стволовых клеток мыши в отсутствие сыворотки и в присутствии активина в сочетании с ингибитором сигнального каскада Wnt (патент США № 2006/0003446A1).
Gordon et al. (PNAS, т. 103, с. 16806“, 2006) утверждают: «Для образования передней первичной полоски одновременно требовались сигнальные пути Wnt и TGF-бета/nodal/активин».
Однако модель развития эмбриональных стволовых клеток на мышах может не имитировать в точности программу развития у высших млекопитающих, например, у человека.
В работе Thomson et al. эмбриональные стволовые клетки выделяли из человеческих бластоцист (Science 282:114, 1998). Параллельно с этим Gearhart и соавторы получили клеточные линии эмбриональных зародышевых клеток человека (hEG) из ткани половых желез эмбриона (Shamblott et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:13726, 1998). В отличие от эмбриональных стволовых клеток мыши, воспрепятствовать дифференцированию которых можно путем простого культивирования с фактором, ингибирующим лейкемию (LIF), эмбриональные стволовые клетки человека необходимо культивировать в крайне специфических условиях (патент США № 6,200,806; WO 99/20741, WO 01/51616).
D’Amour et al. описывают производство обогащенных культур сформированной эндодермы, производной от человеческих эмбриональных стволовых клеток, в присутствии высокой концентрации активина и низкой концентрации сыворотки (Nature Biotechnology 2005). Трансплантация этих клеток под почечную капсулу мышей привела к их дифференцированию в более зрелые клетки, обладающие характерными особенностями некоторых эндодермальных органов. Клетки сформированной эндодермы, производные от эмбриональных стволовых клеток человека, могут подвергаться дальнейшему дифференцированию в Pdx1-положительные клетки после добавления FGF-10 (US 2005/0266554A1).
D’Amour et al. (Nature Biotechnology-24, 1392-1401 (2006)) утверждают: “Мы разработали процесс дифференцировки, преобразующий эмбриональные клетки человека (hES) в эндокринные клетки, способные синтезировать гормоны поджелудочной железы: инсулин, глюкагон, соматостатин, панкреатический полипептид и грелин. Данный процесс имитирует органогенез поджелудочной железы in vivo, проводя клетки через фазы, напоминающие образование сформированной эндодермы, эндодермы кишечной трубки, панкреатической эндодермы и превращение предшественников эндокринных клеток в клетки, экспрессирующие эндокринные гормоны”.
В другом примере, в публикации Fisk et al., сообщается о системе для производства островковых клеток поджелудочной железы из эмбриональных стволовых клеток человека (US2006/0040387A1). В данном случае процесс дифференцирования был разделен на три стадии. Человеческие эмбриональные стволовые клетки были впервые дифференцированы до эндодермы с помощью сочетания бутирата натрия и активина A. Затем клетки культивировали с антагонистами ФНО-β, например, Noggin в сочетании с EGF или бетацеллюлином для получения PDX1-положительных клеток. Окончательное дифференцирование запускалось никотинамидом.
Таким образом, сохраняется значительная потребность в разработке лабораторных способов создания in vitro функциональной экспрессирующей инсулин клетки, которая была бы более близка к β-клетке. Настоящее изобретение представляет альтернативный подход к повышению эффективности дифференцирования эмбриональных стволовых клеток человека в экспрессирующие инсулин клетки путем получения популяции клеток, в которых более 80% клеток экспрессирует маркеры, характерные для линии сформированной панкреатической энтодермы.
Краткое описание
В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу получения популяции клеток, в которой более 80% клеток экспрессирует маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения представлен метод получения популяции клеток, более 80% которых экспрессирует маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы, состоящий из следующих стадий:
a) культивирование популяции плюрипотентных стволовых клеток;
b) дифференциация популяции плюрипотентных стволовых клеток в популяцию, в которой более 80% клеток экспрессирует маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы, в среде с концентрацией глюкозы не более 10,5 ммоль/л.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
На фиг. 1 показаны результаты анализа экспрессии белков в клетках человеческой эмбриональной линии H1, дифференцированной по способам, описанным в Примере 1, методом флуоресцентной проточной цитометрии (FACS, ФПЦ).
На фиг. 2 показано влияние концентрации глюкозы в среде на степень экспрессии CXCR4 (панель B) и число клеток, а также жизнеспособность клеток (панель В) человеческой эмбриональной клеточной линии H1, дифференцированной по способам, описанным в примере 2.
На фиг. 3 показано влияние концентрации глюкозы в среде на степень экспрессии CXCR4 и внешний вид культуры (панель А) и экспрессию SOX17 в клетках человеческой эмбриональной клеточной линии H1, дифференцированной по способам, описанным в примере 2.
На фиг. 4 показаны результаты анализа экспрессии генов в клетках человеческой эмбриональной линии H1, дифференцированной по первому способу, описанному в Примере 2, методом ПЦР в реальном времени.
На фиг. 5 показан анализ экспрессии генов в клетках человеческой эмбриональной линии H1, дифференцированной по второму способу, описанному в Примере 2, методом ПЦР в реальном времени.
На фиг. 6 показан рН разных сред после 24-часового культивирования клеток на 1-4 сутки согласно способам, описанным в Примере 2.
На фиг. 7 показано влияние рН на экспрессию указанных генов в клетках человеческой эмбриональной линии H1, дифференцированной по второму способу, описанному в Примере 3.
На фиг. 8 показан анализ экспрессии генов в клетках человеческой эмбриональной линии H1, дифференцированной по способу, описанному в Примере 4, методом ПЦР в реальном времени.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Для ясности описания, а не для ограничения изобретения, подробное описание изобретения разделено на следующие подразделы, описывающие или иллюстрирующие определенные особенности, варианты осуществления или области применения настоящего изобретения.
Определения
Стволовые клетки представляют собой недифференцированные клетки, определяемые по их способности на уровне единичной клетки как самообновляться, так и дифференцироваться с образованием клеток-потомков, таких как самообновляющиеся клетки-предшественники, необновляющиеся клетки-предшественники и окончательно дифференцированные клетки. Стволовые клетки также характеризуются способностью дифференцироваться in vitro в функциональные клетки различных клеточных линий дифференцирования из нескольких зародышевых листков (эндодермы, мезодермы и эктодермы), а также после трансплантации давать начало тканям, происходящим от нескольких зародышевых листков, и вносить существенный вклад в формирование большинства, если не всех, тканей после инъекции в бластоцисты.
Стволовые клетки классифицируют по потенциалу развития: (1) тотипотентные, то есть способные преобразоваться в любой из эмбриональных и внеэмбриональных типов клеток; (2) плюрипотентные, то есть способные преобразоваться во все типы эмбриональных клеток; (3) мультипотентные, то есть способные преобразоваться во множество клеточных линий, но в рамках одной ткани, органа или физиологической системы (например, гемопоэтические стволовые клетки (ГСК) могут порождать ГСК (самообновление), олигопотентные ограниченные клетки-предшественники крови и все типы клеток и элементов (например, тромбоциты), являющиеся стандартными составляющими крови); (4) олигопотентные, то есть способные преобразоваться в более ограниченное подмножество клеточных линий, чем мультипотентные стволовые клетки; и (5) унипотентные, то есть способные преобразоваться в единственную клеточную линию (например, сперматогенные стволовые клетки).
Дифференцирование представляет собой процесс, при помощи которого неспециализированная («некоммитированная») или менее специализированная клетка приобретает свойства специализированной клетки, например, нервной или мышечной клетки. Дифференцированная клетка или клетка с индуцированным дифференцированием представляет собой клетку, занявшую более специализированное («коммитированное») положение в линии дифференцирования клетки. Термин «коммитированная» применительно к процессу дифференцирования обозначает клетку, дошедшую в ходе процесса дифференцирования до стадии, от которой в нормальных условиях она продолжит дифференцироваться до определенного типа клеток или набора типов клеток и не сможет в нормальных условиях дифференцироваться в иной тип клеток или вернуться обратно к менее дифференцированному типу. Дедифференцированием называется процесс, в ходе которого клетка возвращается к менее специализированному (или коммитированному) положению в линии дифференцирования. Используемый в настоящей заявке термин «линия дифференцирования клетки» определяет наследственность клетки, то есть определяет, из какой клетки произошла данная клетка и каким клеткам она может дать начало. В линии дифференцирования клетка помещается в наследственную схему развития и дифференцирования. Маркером, специфичным для линии дифференцирования, называется характерная особенность, специфически ассоциированная с фенотипом клеток конкретной линии дифференцирования, которая может использоваться для оценки дифференцирования некоммитированных клеток в клетки данной линии дифференцирования.
Используемые в настоящей заявке термины «клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы», «клетки стадии 1» или «стадия 1», относятся к клеткам, экспрессирующим по меньшей мере один из следующих маркеров: SOX17, GATA4, HNF3 beta, GSC, CER1, Nodal, FGF8, Brachyury, Mix-подобный гомеобоксовый белок, FGF4 CD48, эомезодермин (EOMES), DKK4, FGF17, GATA6, CXCR4, C-Kit, CD99 или OTX2. К клеткам, экспрессирующим маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы, относятся клетки-предшественники первичной полоски, клетки первичной полоски, клетки мезэндодермы и клетки сформированной эндодермы.
Используемый в настоящей заявке термин «клетки с экспрессией маркеров, характерных для линии панкреатической эндодермы» относится к клеткам с экспрессией по меньшей мере одного из следующих маркеров: PDX1, NKX6.1, HNF1-бета, PTF1-альфа, HNF6, HNF4-альфа, SOX9, HB9 или PROX1. К клеткам, экспрессирующим маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, относятся клетки панкреатической эндодермы, клетки первичной кишечной трубки и клетки поздней передней кишки.
Используемый в настоящей заявке термин «сформированная эндодерма» относится к клеткам, обладающим характерными особенностями клеток, происходящих в ходе гаструляции от эпибласта, и формирующим желудочно-кишечный тракт и его производные. Клетки сформированной энтодермы экспрессируют следующие маркеры: HNF3-бета, GATA4, SOX17, Cerberus, OTX2, goosecoid, C-Kit, CD99 и MIXL1.
Используемый в настоящей заявке термин «маркеры» означает молекулы нуклеиновых кислот или полипептидов с дифференциальной экспрессией в интересующих клетках. В данном контексте под дифференциальной экспрессией подразумевается повышение уровня экспрессии для положительного маркера и понижение уровня экспрессии для отрицательного маркера. Поддающийся обнаружению уровень маркерной нуклеиновой кислоты или полипептида в интересующих клетках оказывается значительно выше или ниже по сравнению с другими клетками, что позволяет идентифицировать интересующую клетку и отличить ее от других клеток с помощью любого из множества известных в данной области способов.
«Панкреатической эндокринной клеткой», «клеткой, экспрессирующей гормон поджелудочной железы» или «клеткой, экспрессирующей характеристики эндокринной линии поджелудочной железы» в настоящем документе называется клетка, способная экспрессировать по меньшей мере один из следующих гормонов: инсулин, глюкагон, соматостатин и панкреатический полипептид.
Выделение, размножение и культивирование полипотентных стволовых клеток
Характеристика плюрипотентных стволовых клеток
Плюрипотентные стволовые клетки могут экспрессировать один или более стадийно-специфичных эмбриональных антигенов (SSEA) 3 и 4, а также маркеры, определяемые антителами, обозначенными как Tra-1-60 и Tra-1-81 (Thomson et al., Science 282:1145, 1998). Дифференцирование плюрипотентных стволовых клеток in vitro приводит к потере экспрессии SSEA-4, Tra 1-60 и Tra 1-81 (при наличии) и к повышению экспрессии SSEA-1. В недифференцированных полипотентных стволовых клетках, как правило, активна щелочная фосфатаза, которая может быть обнаружена путем фиксации клеток с помощью 4% параформальдегида, с последующим обнаружением с помощью Vector Red, применяемого в качестве субстрата, в соответствии с инструкциями производителя (Vector Laboratories, Burlingame Calif.). Недифференцированные плюрипотентные стволовые клетки также, как правило, экспрессируют OCT4 и TERT, определяемые с помощью ПЦР в реальном времени.Другим желательным фенотипическим свойством выращенных плюрипотентных стволовых клеток является потенциал дифференцирования в клетки всех трех зародышевых листков: в энтодермальные, мезодермальные и эктодермальные ткани. Полипотентность полипотентных стволовых клеток может быть подтверждена, например, путем инъекции клеток мышам с тяжелым комбинированным иммунодефицитом (SCID), фиксирования образующихся тератом с помощью 4% параформальдегида, и их гистологического исследования для получения доказательств наличия клеточных типов, происходящих от трех зародышевых листков. В качестве альтернативы плюрипотентность можно определить по созданию эмбриоидных телец и анализа их на предмет присутствия маркеров, ассоциирующихся с тремя зародышевыми листками.
Выращенные линии плюрипотентных стволовых клеток могут быть кариотипированы с применением стандартного способа окрашивания с использованием красителя Гимза (G-banding) и сравнения с опубликованными кариотипами соответствующих видов приматов. Желательно получить клетки, имеющие «нормальный кариотип», т.е. эуплоидные клетки, в которых все человеческие хромосомы присутствуют и не имеют видимых изменений.
Источники плюрипотентных стволовых клеток
К типам плюрипотентных стволовых клеток, которые можно использовать, относятся устойчивые линии плюрипотентных клеток, получаемые из формируемой после вынашивания плода ткани, в том числе из преэмбриональной ткани (такой как бластоциста), эмбриональной ткани или ткани плода, взятой в любой момент в ходе вынашивания, как правило, но не обязательно, до срока приблизительно 10-12 недель беременности. Примерами, не ограничивающими настоящее изобретение, являются стабильные линии человеческих эмбриональных стволовых клеток или человеческих эмбриональных зародышевых клеток, например, клеточные линии человеческих эмбриональных стволовых клеток H1, H7 и H9 (WiCell). Также возможно использование описываемых в настоящей заявке составов в ходе первоначального установления или стабилизации таких клеток, в этом случае исходными клетками являются первичные плюрипотентные клетки, взятые напрямую из тканей-источников. Также соответствуют целям настоящего изобретения клетки, взятые из популяции плюрипотентных стволовых клеток, уже культивированных в отсутствие питающих клеток. Также соответствуют целям настоящего изобретения клетки мутантных линий эмбриональных стволовых клеток человека, таких как, например, BG01v (BresaGen, Атенс, Джорджия, США).
В одном варианте осуществления подготовка человеческих эмбриональных стволовых клеток была описана Thomson et al. (патент США № 5843780; Science 282:1145, 1998; Curr. Top. Dev. Biol. 38:133 ff., 1998; Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92:7844, 1995).
Культивирование плюрипотентных стволовых клеток
В одном варианте осуществления плюрипотентные стволовые клетки культивируют на слое питающих клеток, которые поддерживают плюрипотентные стволовые клетки в различных отношениях. Как вариант, полипотентные стволовые клетки культивируются в культуральной системе, по существу не содержащей питающих клеток, но, тем не менее, поддерживающей пролиферацию полипотентных стволовых клеток и не допускающей существенной дифференцировки. Рост плюрипотентных стволовых клеток в свободной от питающих клеток культуральной системе без дифференцирования поддерживается путем использования среды, кондиционированной посредством предварительного культивирования клеток иного типа. В качестве альтернативы рост плюрипотентных стволовых клеток в свободной от питающих клеток культуральной системе без дифференцирования поддерживается путем использования среды с химически определенным составом.
В одном варианте осуществления изобретения плюрипотентные стволовые клетки можно культивировать на питающем слое фибробластов эмбриона мыши в соответствии со способами, изложенными в работе Reubinoff et al. (Nature Biotechnology 18: 399-404 (2000)). В альтернативном варианте осуществления плюрипотентные стволовые клетки можно культивировать на питающем слое фибробластов эмбриона мыши в соответствии со способами, изложенными в работе Thompson et al. (Science 6, ноябрь 1998 г.: Vol. 282. no. 5391, pp. 1145-1147). В альтернативном варианте осуществления плюрипотентные стволовые клетки можно культивировать на любом из питающих слоев клеток, описанных в работе Richards et al. (Stem Cells 21: 546-556, 2003).
В одном варианте осуществления плюрипотентные стволовые клетки можно культивировать на питающем слое клеток человека в соответствии со способами, изложенными в работе Wang et al. (Stem Cells 23: 1221-1227, 2005). В альтернативном варианте осуществления плюрипотентные стволовые клетки можно культивировать на питающем слое клеток человека, описанном в работе Stojkovic et al. (Stem Cells 2005 23: 306-314, 2005). В альтернативном варианте осуществления плюрипотентные стволовые клетки можно культивировать на питающем слое клеток человека, описанном в работе Miyamoto et al. (Stem Cells 22: 433-440, 2004). В альтернативном варианте осуществления плюрипотентные стволовые клетки можно культивировать на питающем слое клеток человека, описанном в работе Amit et al. (Biol. Reprod 68: 2150-2156, 2003). В альтернативном варианте осуществления плюрипотентные стволовые клетки можно культивировать на питающем слое клеток человека, описанном в работе Inzunza et al. (Stem Cells 23: 544-549, 2005).
В одном варианте осуществления плюрипотентные стволовые клетки можно культивировать в культуральной среде, полученной в соответствии со способами, представленными в патенте США № 20020072117. В альтернативном варианте осуществления плюрипотентные стволовые клетки можно культивировать в культуральной среде, полученной в соответствии со способами, представленными в патенте США № 6642048. В альтернативном варианте осуществления изобретения плюрипотентные стволовые клетки можно культивировать в культуральной среде, полученной в соответствии со способами, представленными в международной заявке WO2005014799. В альтернативном варианте осуществления изобретения плюрипотентные стволовые клетки можно культивировать в культуральной среде, полученной в соответствии со способами, представленными в работе Xu et al. (Stem Cells 22: 972-980, 2004). В альтернативном варианте осуществления плюрипотентные стволовые клетки можно культивировать в культуральной среде, полученной в соответствии со способами, представленными в патенте США № 20070010011. В альтернативном варианте осуществления плюрипотентные стволовые клетки можно культивировать в культуральной среде, полученной в соответствии со способами, представленными в патенте США № 20050233446. В альтернативном варианте осуществления плюрипотентные стволовые клетки можно культивировать в культуральной среде, полученной в соответствии со способами, представленными в патенте США № 6800480. В альтернативном варианте осуществления изобретения плюрипотентные стволовые клетки можно культивировать в культуральной среде, полученной в соответствии со способами, описанными в международной заявке WO2005065354.
В одном варианте осуществления изобретения плюрипотентные стволовые клетки можно культивировать в среде, описанной в международной заявке WO2005065354. Альтернативно, плюрипотентные стволовые клетки можно культивировать в среде, описанной в международной заявке WO2005086845.
В одном варианте осуществления плюрипотентные стволовые клетки можно культивировать по методам, описанным Cheon et al. (BioReprod DOI:10.1095/biolreprod.105.046870, October 19, 2005). В альтернативном варианте осуществления плюрипотентные стволовые клетки можно культивировать в соответствии со способами, представленными в работе Levenstein et al. (Stem Cells 24: 568-574, 2006). В альтернативном варианте осуществления плюрипотентные стволовые клетки можно культивировать в соответствии со способами, представленными в патенте США № 20050148070. В альтернативном варианте осуществления плюрипотентные стволовые клетки можно культивировать в соответствии со способами, представленными в патенте США № 20050244962. В альтернативном варианте осуществления изобретения плюрипотентные стволовые клетки можно культивировать в соответствии со способами, описанными в международной заявке WO2005086845.
Плюрипотентные стволовые клетки могут быть высеяны на соответствующий культуральный субстрат. В одном из вариантов осуществления соответствующим культуральным субстратом является компонент внеклеточного матрикса, такой как, например, компонент, полученный из базальной мембраны, или компонент, который может участвовать в лиганд-рецепторном взаимодействии с участием молекулы адгезивного слоя. В одном из вариантов осуществления подходящим культуральным субстратом является МАТРИГЕЛЬ® (Becton Dickenson). МАТРИГЕЛЬ® представляет собой растворимый препарат из клеток опухоли Энгельбрета-Холма-Суорма, который при комнатной температуре превращается в гель и образует восстановленную базальную мембрану.
В качестве альтернативы можно использовать другие компоненты внеклеточного матрикса и смеси компонентов. В зависимости от типа пролиферирующих клеток, это может быть ламинин, фибронектин, протеогликан, энтактин, гепарансульфат и т.п., по отдельности или в различных сочетаниях.
Плюрипотентные стволовые клетки могут высеиваться на субстрат с соответствующим распределением по поверхности и в присутствии среды, поддерживающей выживание, размножение и сохранение требуемых характеристик клеток. Все эти характеристики улучшаются при тщательном подходе к распределению клеток при посеве и могут быть определены специалистом в данной области.
Подходящая культуральная среда может быть изготовлена, например, из следующих компонентов модифицированная по способу Дульбекко среда Игла (DMEM), Gibco № 11965-092, нокаутная модифицированная по способу Дульбекко среда Игла (KO DMEM), Gibco №10829-018, базовая среда Хэма F12/50% DMEM, 200 ммоль/л L-глутамина, Gibco № 15039-027; раствор неосновных аминокислот, Gibco 11140-050; β-меркаптоэтанол, Sigma № M7522; человеческий рекомбинантный основной фактор роста фибробластов (bFGF), Gibco № 13256-029.
Формирование клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии сформированной панкреатической энтодермы, из плюрипотентных стволовых клеток
Настоящее изобретение представляет способы получения популяций клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для клеточной линии сформированной эндодермы, из популяций плюрипотентных стволовых клеток. В одном варианте осуществления настоящее изобретение представляет способы дальнейшей дифференциации клеток, экспрессирующих маркеры ростка эндокринных клеток поджелудочной железы. В одном варианте осуществления это достигается пошаговым протоколом дифференцирования, в котором популяции плюрипотентных стволовых клеток сначала дифференцируются в популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы. Далее, популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для клеточной линии сформированной эндодермы, дополнительно дифференцируются в популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы. Далее, популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, дополнительно дифференцируются в популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии эндокринных клеток поджелудочной железы.
В настоящем изобретении представлена популяция, в которой более 80% клеток экспрессирует маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы. Популяция клеток может подвергаться дальнейшей обработке для получения популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы. Популяция клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, можно дополнительно обрабатывать для получения популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии эндокринных клеток поджелудочной железы.
Эффективность дифференцирования может быть определена путем обработки популяции клеток агентом (например, антителом), специфически распознающим белковый маркер, экспрессируемый клетками, экспрессирующими маркеры, характерные для желательного вида клеток.
Способы оценки экспрессии маркеров белков и нуклеиновых кислот в культивированных или выделенных клетках являются стандартными для данной области. Сюда относятся количественная ревертазная полимеразная цепная реакция (ОТ-ПЦР), Нозерн-блот, гибридизация in situ (см., например, Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds. 2001, доп.)), а также способы иммунологического анализа, такие как иммуногистохимический анализ среза материала, Вестерн-блоттинг, а для маркеров, доступных в интактных клетках, - способ проточной цитометрии (FACS) (см., например, Harlow and Lane, Using Antibodies: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press (1998)).
Характеристики плюрипотентных стволовых клеток хорошо известны специалистам в данной области, и продолжается выявление дополнительных характеристик плюрипотентных стволовых клеток. К маркерам плюрипотентных стволовых клеток относится, например, экспрессия одного или нескольких следующих маркеров: ABCG2, CRIPTO, FOXD3, Connexin43, Connexin45, OCT4, SOX2, Nanog, hTERT, UTF1, ZFP42, SSEA-3, SSEA-4, Tra 1-60, Tra 1-81.
После обработки плюрипотентных стволовых клеток с применением способов, составляющих предмет настоящего изобретения, дифференцированные клетки могут быть выделены путем воздействия на популяцию клеток агентом (например, антителом), специфически распознающим белковый маркер, например CXCR4, экспрессируемый клетками, экспрессирующими маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы.
К плюрипотентным стволовым клеткам, которые могут использоваться в настоящем изобретении, относятся, например, человеческие эмбриональные стволовые клетки линии H9 (код NIH: WA09), человеческие эмбриональные стволовые клетки линии H1 (код NIH: WA01), человеческие эмбриональные стволовые клетки линии H7 (код NIH: WA07) и человеческие эмбриональные стволовые клетки линии SA002 (Cellartis, Швеция). Также для использования в рамках настоящего изобретения подходят клетки, экспрессирующие по меньшей мере один из следующих маркеров, характерных для плюрипотентных клеток: ABCG2, cripto, CD9, FOXD3, CONNEXIN43, CONNEXIN45, OCT4, SOX2, Nanog, hTERT, UTF1, ZFP42, SSEA-3, SSEA-4, Tra 1-60 и Tra 1-81.
Маркеры, характерные для сформированной линии энтодермы, выбираются из группы, содержащей SOX17, GATA4, HNF3-бета, GSC, CER1, Nodal, FGF8, Brachyury, Mix-подобный гомеобоксовый белок, FGF4, CD48, эомезодермин (EOMES), DKK4, FGF17, GATA6, CXCR4, C-Kit, CD99 и Otx2. Подходит для использования в настоящем изобретении клетка, экспрессирующая, как минимум, один из маркеров, характерных для линии сформированной эндодермы. В одном из аспектов настоящего изобретения клетка, экспрессирующая маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы, представляет собой клетку-предшественника первичной полоски. В другом аспекте настоящего изобретения клетка, экспрессирующая маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы, представляет собой мезэндодермальную клетку. В другом аспекте настоящего изобретения клетка, экспрессирующая маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы, представляет собой клетку сформированной эндодермы.
Маркеры, характерные для линии энтодермы поджелудочной железы, выбираются из группы, содержащей PDX1, NKX6.1, HNF1-бета, PTF1-альфа, HNF6, HNF4-альфа, SOX9, HB9 и PROX1. Подходит для использования в настоящем изобретении клетка, экспрессирующая, как минимум, один из маркеров, характерных для линии панкреатической эндодермы. В одном из аспектов настоящего изобретения клетка, экспрессирующая маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, представляет собой клетку панкреатической эндодермы.
Маркеры, характерные для линии дифференцирования панкреатических эндокринных клеток, выбирают из группы, состоящей из следующих маркеров: NGN3, NEUROD, ISL1, PDX1, NKX6.1, PAX4, NGN3 и PTF-1-альфа. В одном варианте осуществления панкреатическая эндокринная клетка способна к экспрессии по меньшей мере одного из следующих гормонов: инсулин, глюкагон, соматостатин и панкреатический полипептид. Соответствующей целям настоящего изобретения является клетка, экспрессирующая по меньшей мере один из маркеров, характерных для линии панкреатических эндокринных клеток. В одном из аспектов настоящего изобретения клетка, экспрессирующая маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток, представляет собой панкреатическую эндокринную клетку. Панкреатическая эндокринная клетка может представлять собой панкреатическую клетку, экспрессирующую гормоны. В альтернативном варианте осуществления панкреатическая эндокринная клетка может представлять собой панкреатическую клетку, секретирующую гормоны.
В одном аспекте настоящего изобретения панкреатическая эндокринная клетка представляет собой клетку с экспрессией маркеров, характерных для линии дифференцирования β-клеток. Клетка с экспрессией маркеров, характерных для линии β-клеток, экспрессирует PDX1 и по меньшей мере один из следующих транскрипционных факторов: NGN3, NKX2.2, NKX6.1, NEUROD, ISL1, HNF3-бета, MAFA, PAX4 и PAX6. В одном аспекте настоящего изобретения клетка с экспрессией маркеров, характерных для линии дифференцирования β-клеток, представляет собой β-клетку.
Получение клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы, из плюрипотентных стволовых клеток
В одном аспекте настоящего изобретения популяции плюрипотентных стволовых клеток могут дифференцироваться в популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы, путем культивирования плюрипотентных стволовых клеток в среде с концентрацией глюкозы, не превышающей 10,5 ммоль/л. В одном варианте осуществления изобретения дифференциация популяции плюрипотентных стволовых клеток в направлении популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы, достигается обработкой плюрипотентных стволовых клеток активином А и лигандом Wnt.
В альтернативном варианте осуществления дифференциация популяции плюрипотентных стволовых клеток в направлении популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы, достигается обработкой плюрипотентных стволовых клеток GDF-8 и по меньшей мере одним из факторов, выбранных из группы, состоящей из нижеперечисленных: анилин-пиридинотриазин, циклический анилин-пиридинотриазин, N-{[1-(фенилметил)азепан-4-ил]метил}-2-пиридин-3-илацетамид, 4-{[4-(4-{[2-(пиридин-2-иламино)этил]амино}-1,3,5-триазин-2-ил)пиридин-2-ил]окси}бутан-1-ол, 3-({3-[4-({2-[метил(пиридин-2-ил)амино]этил}амино)-1,3,5-триазин-2-ил]пиридин-2-ил}амино)пропан-1-ол, N~4~-[2-(3-фторфенил)этил]-N~2~-[3-(4-метилпиперазин-1-ил)пропил]пиридо[2,3-d]пиримидин-2,4-диамин, 1-метил-N-[(4-пиридин-3-ил-2-{[3-(трифторметил)фенил]амино}-1,3-тиазол-5-ил)метил]пиперидин-4-карбоксамид, 1,1-диметилэтил {2-[4-({5-[3-(3-гидроксипропил)фенил]-4H-1,2,4-триазол-3-ил}амино)фенил]этил}карбамат, 1,1-диметилэтил{[3-({5-[5-(3-гидроксипропил)-2-(метилокси)фенил]-1,3-оксазол-2-ил}амино)фенил]метил}карбамат, 1-({5-[6-({4-[(4-метилпиперазин-1-ил)сульфонил]фенил}амино)пиразин-2-ил]тиофен-2-ил}метил)пиперидин-4-ол, 1-({4-[6-({4-[(4-метилпиперазин-1-ил)сульфонил]фенил}амино)пиразин-2-ил]тиофен-2-ил}метил)пиперидин-4-карбоксамид и 2-{[4-(1-метилэтил)фенил]амино}-N-(2-тиофен-2-илэтил)-7,8-дигидропиридо[4,3-d]пиримидин-6(5H)-карбоксамид. Примеры факторов, подходящих для использования, можно найти в заявке на патент США с серийным № 12/494789. В одном варианте осуществления по меньшей мере один из факторов представляет собой 14-проп-2-ен-1-ил-3,5,7,14,17,23,27-гептаазатетрацикло[19.3.1.1~2,6~.1~8,12~]гептакоза-1(25),2(27),3,5,8(26),9,11,21,23-нонаен-16-он.
Популяция плюрипотентных стволовых клеток может культивироваться в среде с концентрацией глюкозы не более 10,5 ммоль/л от примерно одних суток до примерно семи суток. Альтернативно, популяция плюрипотентных стволовых клеток может культивироваться в среде с концентрацией глюкозы не более 10,5 ммоль/л от примерно одних суток до примерно шести суток. Альтернативно, популяция плюрипотентных стволовых клеток может культивироваться в среде с концентрацией глюкозы не более 10,5 ммоль/л от примерно одних суток до примерно пяти суток. Альтернативно, популяция плюрипотентных стволовых клеток может культивироваться в среде с концентрацией глюкозы не более 10,5 ммоль/л от примерно одних суток до примерно четырех суток. Альтернативно, популяция плюрипотентных стволовых клеток может культивироваться в среде с концентрацией глюкозы не более 10,5 ммоль/л от примерно одних суток до примерно четырех суток.
В одном из вариантов осуществления GDF-8 используется в концентрации от приблизительно 5 нг/мл до приблизительно 500 нг/мл. В альтернативном варианте осуществления GDF-8 используется в концентрации от приблизительно 5 нг/мл до приблизительно 50 нг/мл. В альтернативном варианте осуществления GDF-8 используется в концентрации от приблизительно 5 нг/мл до приблизительно 25 нг/мл. В альтернативном варианте осуществления GDF-8 используется в концентрации приблизительно 25 нг/мл.
Активин-А может использоваться в концентрациях от приблизительно 1 пг/мл до приблизительно 100 мкг/мл. В альтернативном варианте осуществления концентрация может составлять от примерно 1 пг/мл до примерно 1 мкг/мл. В другом альтернативном варианте осуществления концентрация может составлять от примерно 1 пг/мл до примерно 100 нг/мл. В другом альтернативном варианте осуществления концентрация может составлять от приблизительно 1 пг/мл до приблизительно 100 нг/мл. В другом альтернативном варианте осуществления концентрация может составлять примерно 100 нг/мл.
Лиганд Wnt может выбираться из группы, состоящей из Wnt-1, Wnt-3a, Wnt-5a и Wnt-7a. В одном варианте осуществления лиганд Wnt представляет собой Wnt-1. В альтернативном варианте осуществления лиганд Wnt представляет собой Wnt-3a.
Лиганд Wnt может использоваться в концентрации от приблизительно 1 нг/мл до приблизительно 1000 нг/мл. В альтернативном варианте осуществления лиганд Wnt может использоваться в концентрации от приблизительно 10 нг/мл до приблизительно 100 нг/мл. В одном варианте осуществления лиганд Wnt используется в концентрации приблизительно 20 нг/мл.
Образование клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы
В одном варианте осуществления изобретения популяцию клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы, которая была получена методами настоящего изобретения, далее дифференцируют в популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, любым известным способом.
Например, популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы, полученные в соответствии со способами настоящего изобретения, могут быть дополнительно дифференцированы в популяции клеток, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, путем обработки популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы, в соответствии со способами, представленными в работе D’Amour et al., Nature Biotechnology, 24, 1392-1401 (2006)
Например, популяции клеток, экспрессирующие маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы, полученные по способам настоящего изобретения, могут быть дополнительно дифференцированы в популяции клеток, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, путем обработки популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы, в соответствии со способами, представленными в заявке на патент США Сер. № 11/736908.
Создание клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток
В одном варианте осуществления популяции клеток, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, дополнительно дифференцируются в популяции клеток, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток, с использованием любого способа, известного специалистам в данной области.
Например, популяции клеток, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, могут быть дополнительно дифференцированы в популяции клеток, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток, путем обработки популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, в соответствии со способами, представленными в работе D’Amour et al., Nature Biotechnology, 2006.
Например, популяции клеток, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, могут быть дополнительно дифференцированы в популяции клеток, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток, путем обработки популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, в соответствии со способами, представленными в работе D’Amour et al., Nature Biotechnology, 2006.
Например, популяции клеток, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, могут далее дифференцироваться в популяции клеток, экспрессирующие маркеры, характерные для линии эндокринных клеток поджелудочной железы, путем обработки популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, в соответствии с методами, описанными в заявке на патент США Сер. № 11/736908.
Например, популяции клеток, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, могут далее дифференцироваться в популяции клеток, экспрессирующие маркеры, характерные для линии эндокринных панкреатических клеток, путем обработки популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, в соответствии с методами, описанными в заявке на патент США Сер. № 11/779311.
Например, популяции клеток, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, могут далее дифференцироваться в популяции клеток, экспрессирующие маркеры, характерные для линии эндокринных панкреатических клеток, путем обработки популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, в соответствии с методами, описанными в заявке на патент США Сер. № 60/953178.
Например, популяции клеток, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, могут далее дифференцироваться в популяции клеток, экспрессирующие маркеры, характерные для линии эндокринных панкреатических клеток, путем обработки популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, в соответствии с методами, описанными в заявке на патент США Сер. № 60/990529.
Настоящее изобретение далее иллюстрируется, помимо прочих, следующими примерами.
ПРИМЕРЫ
Пример 1
Роль среды и методики посева в дифференциации человеческих плюрипотентных клеток в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы
Клетки эмбриональной линии стволовых клеток H1 при 41 пересеве (p41) обрабатывали реактивом для диссоциации TrypLE (кат. № 12604-013, Invitrogen, Калифорния), высевали как отдельные клетки из суспензии с плотностью 100000 кл./см2 на чашки, покрытые субстратом МАТРИГЕЛЬ® (разведение 1:30), и культивировали в среде, кондиционированной мышиными эмбриональными фибробластами (MEF-CM), с добавлением 20 нг/мл FGF2 (кат. № 100-18B, PeproTech, Нью Джерси) и 10 мкМ Y-27632 (Ингибитор Rho киназы, Кат. № Y0503, Sigma, Миссури).
Параллельно клетки человеческой эмбриональной клеточной линии H1 после 41 пересева высевали в виде колоний на чашки, покрытые субстратом МАТРИГЕЛЬ® (разведение 1:30), соотношение объемов культуры и свежей среды составляло 1:3, для диссоциации клеток использовали диспазу (кат. № 17105-041, Invitrogen, Калифорния), и культивировали клетки на чашках с MEF-CM+20 нг/мл FGF2. В обеих культурах после посева одиночных клеток и колоний среду заменяли через 24 и 48 ч после посева свежей средой MEF-CM с добавлением 20 нг/мл FGF2.
Через 72 ч после посева культуры дифференцировали в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы, описанным ниже способом:
a) Среда MCDB-131 (кат. № 10372-019, Invitrogen, Калифорния) с добавлением 0,0025 г/мл натрия бикарбоната (кат. № S3187, Sigma, Миссури) и 2% БСА без жирных кислот (кат. № 68700, Proliant, Айова), 1X ГлутаМакса™ (кат. № 35050-079, Invitrogen, Калифорния) и 100 нг/мл активина A (RD Systems, Миннесота)+20 нг/мл WNT-3a (кат. № 1324-WN-002, RD Systems, Миннесота) в первые сутки, затем MCDB-131 с добавлением 0,0025 г/мл натрия бикарбоната, 2% БСА, Глутамакса и 100 нг/мл активина A в течение трех суток (Условие 1); или
b) Среда RPMI-1640 (Кат. № 22400-105, Invitrogen, Калифорния) с добавлением 2% БСА без жирных кислот (кат. № 68700, Proliant, Айова) и 100 нг/мл активина A (RD Systems, Миннесота)+20 нг/мл WNT-3a (Кат. № 1324-WN-002, RD Systems, Миннесота) в течение одних суток, затем среда RPMI-1640 с добавлением 2% БСА и 100 нг/мл активина A ежедневно на протяжении трех суток (Условие 2).
На 4 день отбирали пробы для анализа методом флуоресцентной проточной цитометрии. На фиг. 1 показаны результаты флуоресцентной проточной цитометрии для определения экспрессии CXCR4 и CD9 в виде графика разброса с экспрессией CXCR4 по оси Y и экспрессией CD9 по оси Х. Процент клеток, экспресирующих CXCR4, CD9 и CD99 (дополнительный маркер дифференциации), представлен в таблице 1. Дифференциация, измеряемая по усилению экспрессии поверхностных маркеров CXCR4 и CD99, была более выраженной при использовании сред MCDB-131, а экспрессия CXCR4 и CD99 повышалась еще сильнее при переходе от культивирования колоний к культивированию отдельных клеток. Кроме того, по результатам проточной цитометрии эти данные коррелировали со снижением экспрессии CD9 - клеточного маркера недифференцированных клеток.
Интересно, что при использовании MCDB-131 в формате кластеров или колоний отмечено меньшее число клеток, отрицательных по CXCR4-/CD9-, на фиг. 1, что указывает на меньшую частоту неспецифичной дифференциации или меньшее число клеток, не экспрессирующих маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы, в культурах на среде MCDB-131. В целом эти данные указывают, что человеческие эмбриональные стволовые клетки эффективнее дифференцируются в присутствии среды MCDB-131, чем среды RPMI-1640, и дифференциацию клеток MCDB-131 можно дополнительно улучшить посевом и культивированием отдельных клеток по сравнению с посевом и культивированием колоний.
| Таблица 1 | |||
| CXCR4 | CD9 | CD99 | |
| MCDB (кластер) | 88,6 | 10,1 | 21,7 |
| RPMI (кластер) | 81,8 | 8,8 | 30,5 |
| MCDB (одиночная клетка) |
92,3 | 6,7 | 62,2 |
| RPMI (одиночная клетка) |
72,4 | 12,7 | 43,1 |
Пример 2
Роль глюкозы в дифференциации человеческих плюрипотентных клеток в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы
Глюкоза представляет собой растворимый сахар - гексозу, входящую в состав почти всех питательных сред, включая следующие: среду Эймса; Основную среду Игла (BME); Модификацию среды Фиттона-Джексона BGJb; Среду Клика; Среду CMRL-1066; Среду Игла, модифицированную Дульбекко (DMEM); Питательную смесь DMEM/Хэма F-12 (50:50); Модификацию Куна F-12; Среду Фишера; Среду H-Y (Hybri-Max®); Среду Искова - модифицированную среду Дульбекко (IMDM); Модифицированную среду МакКоя 5A; Среды MCDB; Среду 199; Минимальную питательную среду Игла (EMEM); Среду NCTC; Питательную смесь Хэма F-10; Питательную смесь Хэма F-12; Питательную смесь Хэма F-12 в модификации Кайна (F12K); RPMI-1640; Бессывороточную/безбелковую среду для гибридом; Среду Веймаута MB; Среду Вильямса и различные патентованные среды (См. http://www.sigmaaldrich.com/life-science/cell-culture/learning-center/media-expert/glucose.html).
Содержание глюкозы в средах для культур клеток варьируется. Хотя среды серии MCDB содержат глюкозу в концентрации от 3,9 до 10 ммоль/л, концентрация глюкозы в большинстве сред составляет от 1 г/л (5,5 ммоль/л) до 10 г/л (55 ммоль/л), а среда RPMI-1640 содержит 11 ммоль/л глюкозы. Концентрации глюкозы выше 10 ммоль/л аналогичны диабетическому состоянию в культуре клеток. Это важно, так как процессы, воздействующие на клетки и молекулы in vivo, могут действовать и in vitro. Последствия роста клеток в условиях, по существу являющихся диабетическими, выражаются в том, что клетки и клеточные продукты изменяются из-за процессов гликирования и глиоксидации, и могут повреждаться из-за окислительного и карбонильного стресса, опосредованного глюкозой (См. http://www.sigmaaldrich.com/life-science/cell-culture/learning-center/media-expert/glucose.html).
Одной из сред, в настоящее время использующихся для получения клеток сформированной эндодермы, является среда Дульбекко в модификации Искова (IMDM), содержащая 25 ммоль/л глюкозы (Kubo et al; April 1, 2004, Development 131, 1651-1662), RPMI с 11 ммоль/л глюкозы (D’Amour et al. Nat Biotechnol. 2005 Dec; 23(12):1534-41), или среда DMEM-F12 с 17,5 ммоль/л глюкозы. Каждая из этих сред содержит более 10 ммоль/л глюкозы, что аналогично условиям при диабете. Следовательно, для уменьшения стресса для клеток, который может индуцироваться высокой концентрацией глюкозы в культуральной среде, мы предприняли попытку найти среду с концентрацией глюкозы ниже 10 ммоль/л для дифференциации человеческих эмбриональных стволовых клеток в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы. Одной из таких сред с концентрацией глюкозы ниже 10 ммоль/л является MCDB-131, содержащая глюкозу в концентрации 5,5 ммоль/л.
Клетки эмбриональной линии стволовых клеток H1 после 41 пересева (p41) были обработаны реактивом для диссоциации TrypLE (кат. № 12604-013, Invitrogen, Калифорния), высеяны как отдельные клетки из суспензии с плотностью 100000 кл./см2 на чашки, покрытые субстратом МАТРИГЕЛЬ® (разведение 1:30), и культивировались в среде, кондиционированной мышиными эмбриональными фибробластами (MEF-CM), с добавкой 20 нг/мл FGF2 (кат. № 100-18B PeproTech, Нью Джерси) и 10 мкмоль/л Y-27632 (Ингибитор Rho киназы, Кат. № Y0503, Sigma, Миссури). Среды заменяли через 24 и 48 ч после посева свежей средой MEF-CM с 20 нг/мл FGF2. Через 72 ч после посева культуры дифференцировали в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы, описанным ниже способом:
a) Среда MCDB-131 (Кат. № 10372-019, Invitrogen, Калифорния) с добавлением 2% БСА без жирных кислот (Кат. № 68700, Proliant, Айова), 0,0025 г/мл натрия бикарбоната (Кат. № S3187, Sigma, Миссури), 1X ГлутаМакса™ (Кат. № 35050-079, Invitrogen, Калифорния), 100 нг/мл активина A (RD Systems, Миннесота), 20 нг/мл WNT-3a (Кат. № 1324-WN-002, RD Systems, Миннесота), и 0, 5, 10, 15, 20 или 25 ммоль/л глюкозы (Кат. № G8769, Sigma, Миссури) в течение одних суток, затем
b) среда MCDB-131 с добавлением 2% БСА, бикарбоната натрия, Глутамакса, 100 нг/мл активина A и 0, 5, 10, 15, 20, или 25 ммоль/л глюкозы еще в течение 3 суток.
На 4 день собирали образцы для анализа методом флуоресцентной проточной цитометрии и анализа генной экспрессии с использованием ПЦР в реальном времени, а также подсчета с помощью ViaCount® (Guava®, Millipore, Биллерика, Массачусетс). В соответствии с результатами, приведенными в Примере 1, дифференциация плюрипотентных стволовых клеток в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы, приводила к устойчивой экспрессии маркеров, связанных с линией сформированной эндодермы (фиг. 2A). Когда к среде, содержащей глюкозу, добавляли дополнительно 0, 5, 10, 15, 20 или 25 ммоль/л глюкозы (конечная концентрация: 5,5, 10,5, 15,5, 20,5, 25,5 или 30,5 ммоль/л глюкозы соответственно), в образцах с добавлением дополнительных 10 ммоль/л глюкозы (конечная концентрация глюкозы 15,5 ммоль/л) было отмечено умеренное увеличение концентрации клеток, как показано на фиг. 2B. Умеренное повышение экспрессии CXCR4 наблюдали также в клетках на среде с добавлением 5 ммоль/л глюкозы (конечная концентрация глюкозы 10,5 ммоль/л), как показано на фиг. 2A. Однако такое увеличение числа клеток CXCR4 было нивелировано снижением общей жизнеспособности клеток (фиг. 2B).
При исходной концентрации глюкозы (5,5 ммоль/л) почти все клетки в культуре были SOX17-положительными, и клетки распределялись по культуральной чашке однородно (фиг. 3 A и B). При увеличении концентрации глюкозы высокая экспрессия SOX17 сохранялась, однако клетки образовывали скопления. Следовательно, распределение таких клеток в группах по поверхности среды было менее однородным, чем при обычной концентрации глюкозы в среде. Этот эффект коррелировал с незначительным усилением экспрессии клеточных маркеров CD9 и OCT4- маркеров недифференцированных клеток, SOX7-клеточного маркера экстраэмбриональной эктодермы, а также со снижением генной экспрессии гомеобокса 1 поджелудочной железы (MNX1), также известного как гомеобокс HB9 (HLXB9), в клетках, располагающихся группами (фиг. 4).
Сходное влияние глюкозы на дифференциацию наблюдали также в культурах, дифференцированных с помощью среды DMEM, содержащей 5,5 ммоль/л (низкую концентрацию) или 24 ммоль/л (высокую концентрацию) глюкозы (кат. №10567-014 и 21063-029, Invitrogen, Калифорния). Как описано выше, для контроля клетки высевали одиночно, культивировали 3 дня в среде, кондиционированной MEF, и дифференцировали в среде MCDB-131 с 5,5 или 25 ммоль/л глюкозы, или в среде DMEM с высокой концентрацией глюкозы и добавлением 2% БСА без жирных кислот, 100 нг/мл активина A и 20 нг/мл WNT-3a на первый день и 2% БСА без жирных кислот и 100 нг/мл активина А в следующие три дня с ежедневной заменой среды.
Сходно с результатами, полученными на средах MCDB-131, когда повышенная концентрация глюкозы подавляла образование клеток сформированной эндодермы по сравнению с низкой концентрацией глюкозы, на среде DMEM с высокой концентрацией глюкозы также отмечено снижение дифференциации клеток hES. Исследование методом проточной цитометрии после дифференциации до сформированной эндодермы показало, что в средах, содержащих 5,5 ммоль/л глюкозы, 88,6% клеток были положительны по CXCR4, в то время как в средах, содержащих 25 ммоль/л глюкозы, эта доля составила 80%. Кроме того, в средах с высокой концентрацией глюкозы концентрация маркеров дифференциации сформированной эндодермы по результатам ОТ-ПЦР (SOX17) была снижена, а маркеров недифференцированных клеток (OCT4) или альтернативной дифференциации (CDX2) - повышена по сравнению со средами с низкой концентрацией глюкозы (фиг. 5). Этот эффект был по меньшей мере частично обусловлен рН среды, поскольку мы отметили снижение рН среды через 48 ч после 48 ч дифференциации на протяжении четырех дней дифференциации. Кроме того, чем выше был начальный и конечный рН питательной среды (8,1>pH>7,6) (фиг. 6) при получении сформированной эндодермы, тем более полной была конверсия в сформированную эндодерму.
В целом, наши результаты показывают, что исходная концентрация глюкозы (5,5 ммоль/л) в среде для дифференциации достаточна для получения популяции клеток, в которой более 80% клеток экспрессирует маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы. Повышение концентрации глюкозы в среде для дифференциации до 10,5 ммоль/л достаточно для получения сходной популяции, однако повышение концентрации глюкозы свыше 10,5 ммоль/л может привести к усилению экспрессии маркеров плюрипотентности/меньшей дифференциации, например, CD9 или OCT4, или повышению экспрессии маркеров альтернативной дифференциации/экстраэмбриональной эктодермы, например, SOX7 или CDX2.
Пример 3
Роль контроля рН в дифференциации человеческих плюрипотентных клеток в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы
Параллельно с этим клетки человеческой эмбриональной клеточной линии H1 (hES) после 46 пересевов (p46) высевали как клеточные колонии на чашки с субстратом МАТРИГЕЛЬ (разведение 1:30), соотношение культуры и свежей среды при пересеве составляло 1:3, для диссоциации клеток использовали диспазу (кат. № 17105-041, Invitrogen, Калифорния) и культивировали на чашках с MEF-CM с 20 нг/мл FGF2. Среды заменяли свежими средами MEF-CM с 20 нг/мл FGF2 до начала дифференциации в сформированную эндодерму (СЭ) описанным ниже способом:
a. Среда MCDB-131 (кат № 10372-019, Invitrogen, Калифорния) с добавлением 2% БСА без жирных кислот (кат. № 68700, Proliant, Айова), 1X ГлутаМакса™ (кат. № 35050-079, Invitrogen, Калифорния) и 100 нг/мл активина A (R&D Systems, Миннесота)+20 нг/мл WNT-3a (кат № 1324-WN-002, R&D Systems, Миннесота) в течение одних суток, затем использовали MCDB-131 с добавлением 2% БСА, Глутамакса и 100 нг/мл активина А ежедневно в течение дополнительных трех суток; или
b. среда MCDB131 с добавлением 0,0025 г/мл натрия бикарбоната (кат. № S3187, Sigma, Миссури) с добавлением 2% БСА без жирных кислот (кат. № 68700, Proliant, Айова), 1X ГлутаМакса™ (кат. № 35050-079, Invitrogen, Калифорния) и 100 нг/мл активина A (R&D Systems, Миннесота)+20 нг/мл WNT-3a (кат. № 1324-WN-002, R&D Systems, Миннесота) в течение суток, затем использовали MCDB-131 с добавлением 0,0025 г/мл натрия бикарбоната с 2% БСА, Глутамакса и 100 нг/мл активина A ежедневно в течение последующих трех суток.
На 4 день отбирали пробы для анализа методом флуоресцентной проточной цитометрии и анализа генной экспрессии методом ПЦР в реальном времени, а также подсчитывали клетки с помощью ViaCount® (Guava®, Millipore, Биллерика, Массачусетс). Как показано в примере 2, мы отметили, что относительно большая кислотность среды для дифференциации (<7,6 pH) может уменьшить экспрессию CXCR4 за счет менее направленной дифференциации и усиления альтернативной дифференциации.
Чтобы установить, обусловлен ли этот эффект рН, мы дифференцировали клетки на основной среде MCDB-131, содержавшей согласно описанию 1 г/л натрия бикарбоната, а также в среде DMEM с добавлением бикарбоната до концентрации 3,7 г/л. Мы отметили, что дифференциация, измеряемая по усиленной экспрессии маркеров клеточной поверхности CXCR4 и сниженной экспрессии CD9, была лучше в присутствии буферного агента. Среда MCDB-131 с концентрацией натрия бикарбоната 3,7 г/л в качестве буфера обеспечивала значительно более выраженную экспрессию CXCR4 и меньшую экспрессию CD9 в сравнении с клетками, дифференцированными на среде MCDB-131 с обычной концентрацией бикарбоната (1 г/л) (фиг. 7А и B). Это частично обусловлено тем, что среды MCDB-131 обладают рН 7,5, и добавление 2,7 г/л бикарбоната натрия повышает рН до 7,6.
Кроме того, в конце дифференциации среды (содержащие рН-индикатор феноловый красный) с культурами, выращенными на недифференцирующей среде, имели значительно более выраженную желтую окраску и более кислую реакцию, чем среды культур с дополнительным добавлением бикарбоната натрия, которые оставались красными. Эти результаты показывают, что повышение рН до 7,6 или более способствует более эффективной дифференциации эндодермы из плюрипотентных стволовых клеток, и что повышение и стабилизация рН среды возможна с помощью альтернативных буферных агентов, кроме бикарбоната, неограниченно включая повышение концентрации CO2 в инкубаторе или использование растворимых буферных систем, например, HEPES или фосфатного буфера.
Пример 4
Роль сред RPMI-1640 или MCDB-131 и членов надсемейства TGF-бета, активина A и GDF-8 в дифференциации человеческих плюрипотентных клеток в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы
Клетки эмбриональной линии стволовых клеток H1 после 47 пересевов (р47) обрабатывали реактивом для диссоциации TrypLE (кат. № 12604-013, Invitrogen, Калифорния), высевали как отдельные клетки из суспензии 100000 кл./см2 на чашки с субстратом МАТРИГЕЛЬ® (разведение 1:30) и культивировали в среде, кондиционированной мышиными эмбриональными фибробластами (MEF-CM), с добавкой 20 нг/мл FGF2 (кат. № 100-18B, PeproTech, Нью Джерси) и 3 мкм Н-1152, глицила (Ингибитор Rho киназы, кат. № 555554, EMD chemicals, Гиббстаун, Нью Джерси).
Через 72 ч после посева культуры дифференцировали в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы, описанным ниже способом:
a) Среда MCDB-131 (кат. № 10372-019, Invitrogen, Калифорния) с добавлением 0,0025 г/мл натрия бикарбоната (кат. № S3187, Sigma, Миссури) и 2% БСА без жирных кислот (кат. № 68700, Proliant, Айова), 1X Глутамакса™ (кат. № 35050-079, Invitrogen, Калифорния) и 100 нг/мл активина A (R&D Systems, Миннесота) + 20 нг/мл WNT-3a (кат. № 1324-WN-002, R&D Systems, Миннесота) в первые сутки, затем среда MCDB-131 с добавлением 0,0025 г/мл натрия бикарбоната, 2% БСА, Глутамакса и 100 нг/мл активина A в течение трех суток, или
b) Среда MCDB-131 (кат. № 10372-019, Invitrogen, Калифорния) с добавлением 0,0025 г/мл натрия бикарбоната (кат. № S3187, Sigma, Миссури), 2% БСА без жирных кислот (кат. № 68700, Proliant, Айова), 1X ГлутаМакса™ (кат. № 35050-079, Invitrogen, Калифорния) и 100 нг/мл GDF (R&D Systems, Миннесота)+2,5 мкмоль/л ингибитора GSK3B+2 нг/мл проп-2-ен-1-ил-3,5,7,14,17,23,27-гептаазатетрацикло[19.3.1.1~2,6~.1~8,12~]гептакоза-1(25),2(27),3,5,8(26),9,11,21,23-нонаен-16-она первые сутки, затем среда MCDB-131 с добавлением 0,0025 г/мл натрия бикарбоната, 2% БСА, Глутамакса и 100 нг/мл GDF-8 в течение трех суток, или
с) Среда MCDB-131 (Кат. № 10372-019, Invitrogen, Калифорния) с добавлением 0,0025 г/мл натрия бикарбоната (Кат. № S3187, Sigma, Миссури), 2% БА без жирных кислот (Кат. № 68700, Proliant, Айова), 1X Глутамакса™ (Кат. № 35050-079, Invitrogen, Калифорния) и 100 нг/мл GDF-8 (R&D Systems, Миннесота) в течение 4 суток, или
d). Среда RPMI-1640 (Кат. № 22400-105, Invitrogen, Калифорния) с добавлением 2% БСА без жирных кислот (кат. № 68700, Proliant, Айова) и 100 нг/мл активина A (R&D Systems, Миннесота)+20 нг/мл WNT-3a (Кат. № 1324-WN-002, R&D Systems, Миннесота) в течение одних суток, затем среда RPMI-1640 с добавкой 2% БСА и 100 нг/мл активина A ежедневно на протяжении трех суток.
е) Среда RPMI-1640 (Кат. № 22400-105, Invitrogen, Калифорния) с добавлением 2% БСА без жирных кислот (Кат. № 68700, Proliant, Айова) и 100 нг/мл GDF-8 (R&D Systems, Миннесота)+2,5 мкмоль/л ингибитора GSK3B 14-проп-2-ен-1-ил-3,5,7,14,17,23,27-гептаазатетрацикло[19.3.1.1~2,6~.1~8,12~]гептакоза-1(25),2(27),3,5,8(26),9,11,21,23-нонаен-16-он в течение одних суток, затем среда PMI-1640 с добавлением 2% БСА и 100 нг/мл GDF-8 ежедневно в течение трех дополнительных суток.
На 4 день отбирали пробы для анализа методом флуоресцентной проточной цитометрии и количественной ОТ-ПЦР. В таблице 2 показан процент клеток, экспрессирующих CXCR4, CD9 и CD99 (дополнительный маркер дифференциации). Дифференциация, измеряемая по усилению экспрессии маркера клеточной поверхности CXCR4, усиливалась при использовании сред MCDB-131 по сравнению с RPMI-1640, а экспрессия CXCR4 дополнительно усиливалась при использовании GDF-8 в сочетании с ингибитором GSK3B по сравнению с добавлением активина А и Wnt3a. Сходные результаты, показывающие усиление дифференциации при использовании сред MCDB-131 по сравнению со средами RPMI-1640, а также при использовании GDF-8 в сочетании с ингибитором GSK3B по сравнению с активином А и Wnt3a, получены при анализе гена MNX-1 методом количественной ОТ-ПЦР (фиг. 8). Кроме того, эти данные коррелируют со сниженной экспрессией CD9, клеточного маркера недифференцированных клеток, по результатам проточной цитометрии (таблица 2), или с OCT4 и CD9 по результатам измерения методом количественной ОТ-ПЦР (фиг. 8). Эти данные показывают, что эмбриональные стволовые клетки человека H1 эффективнее дифференцируются в присутствии среды MCDB-131, чем RPMI-1640, и что дифференциация в MCDB-131 может быть дополнительно улучшена в присутствии GDF-8 и ингибитора GSK3B по сравнению с активином A и Wnt3a.
| Таблица 2 | |||
| Среда | CD184 | CD9 | CD99 |
| RPMI+AA+Wnt | 77,8 | 20,9 | 77,8 |
| RPMI+GDF8+ингибитор GSK3B | 81,6 | 13,8 | 83,4 |
| MCDB131+AA+Wnt | 81,2 | 21,1 | 60,0 |
| MCDB131+GDF8+ ингибитор GSK3B | 87,1 | 14,3 | 50,9 |
| MCDB131+GDF8 | 43,2 | 31,2 | 23,7 |
Публикации, цитируемые в настоящем документе, полностью включаются в настоящий документ посредством ссылки. Хотя различные аспекты изобретения иллюстрируются выше ссылками на примеры и предпочтительные варианты осуществления, подразумевается, что область изобретения ограничивается не упомянутым выше описанием, а следующими пунктами формулы изобретения, составленными в соответствии с принципами патентного законодательства.
Claims (10)
1. Способ формирования популяции клеток, в которой более 80% клеток популяции экспрессирует маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы, который включает дифференциацию популяции эмбриональных стволовых клеток человека в популяцию клеток, в которой более 80% клеток популяции экспрессирует маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы, в среде DMEM или MCDB-131, содержащей активин А и лиганд Wnt, где концентрация глюкозы не превышает 10,5 ммоль/л, где эмбриональные стволовые клетки человека представляют собой клетки стабильных линий эмбриональных стволовых клеток человека, клетки стабильных линий эмбриональных зародышевых клеток человека, клетки H1, клетки Н7, клетки Н9 или клетки BG01V.
2. Способ формирования популяции клеток, в которой более 80% клеток популяции экспрессирует маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы, который включает дифференциацию популяции эмбриональных стволовых клеток человека в популяцию клеток, в которой более 80% клеток популяции экспрессирует маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы, в среде DMEM или MCDB-131, содержащей GDF-8 и 14-проп-2-ен-1-ил-3,5,7,14,17,23,27-гептаазатетрацикло[19.3.1.1~2,6~.1~8,12~]гептакоза-1(25),2(27),3,5,8(26),9,11,21,23-нонаен-16-он, где эмбриональные стволовые клетки человека представляют собой клетки стабильных линий эмбриональных стволовых клеток человека, клетки стабильных линий эмбриональных зародышевых клеток человека, клетки H1, клетки Н7, клетки Н9 или клетки BG01V.
3. Способ по п. 1, в котором маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы, выбраны из группы, состоящей из SOX17, GATA4, HNF3 бета, GSC, CER1, Nodal, FGF8, Brachyury, Mix-подобный гомеобоксовый белок, FGF4 CD4 8, эомезодермин (EOMES), DKK4, FGF17, GATA6, CXCR4, C-Kit, CD99 и ОТХ2.
4. Способ по п. 1, в котором клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии сформированной энтодермы, являются клетками сформированной энтодермы.
5. Способ дифференциации эмбриональных стволовых клеток человека в клетки сформированной эндодермы, включающий культивирование эмбриональных стволовых клеток человека в среде DMEM или MCDB-131, дополненной (1) активином А и лигандом Wnt или (2), GDF-8 и 14-проп-2-ен-1-ил-3,5,7,14,17,23,27-гептаазатетрацикло[19.3.1.1~2,6~.1~8,12~]гептакоза-1(25),2(27),3,5,8(26),9,11,21,23-нонаен-16-оном, где концентрация глюкозы не превышает 10,5 ммоль/л, где эмбриональные стволовые клетки человека представляют собой клетки стабильных линий эмбриональных стволовых клеток человека, клетки стабильных линий эмбриональных зародышевых клеток человека, клетки H1, клетки Н7, клетки Н9 или клетки BG01V.
6. Способ по любому из пп. 1-5, отличающийся тем, что концентрация глюкозы не превышает 5,5 ммоль/л.
7. Способ по любому из пп. 1-5, отличающийся тем, что способ дополнительно включает культивирование эмбриональных стволовых клеток человека до дифференцировки.
8. Способ по любому из пп. 1-5, отличающийся тем, что среда обладает рН 7,6 или выше.
9. Способ по п. 2, в котором маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы, выбраны из группы, состоящей из SOX17, GATA4, HNF3 бета, GSC, CER1, Nodal, FGF8, Brachyury, Mix-подобный гомеобоксовый белок, FGF4 CD48, эомезодермин (EOMES), DKK4, FGF17, GATA6, CXCR4, C-Kit, CD99 и ОТХ2.
10. Способ по п. 2, в котором клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии сформированной энтодермы, являются клетками сформированной энтодермы.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US37844810P | 2010-08-31 | 2010-08-31 | |
| US61/378,448 | 2010-08-31 | ||
| PCT/US2011/048127 WO2012030538A2 (en) | 2010-08-31 | 2011-08-17 | Differentiation of human embryonic stem cells |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2013114373A RU2013114373A (ru) | 2014-10-10 |
| RU2620938C2 true RU2620938C2 (ru) | 2017-05-30 |
Family
ID=45697773
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2013114373A RU2620938C2 (ru) | 2010-08-31 | 2011-08-17 | Дифференцирование эмбриональных стволовых клеток человека |
Country Status (16)
| Country | Link |
|---|---|
| US (3) | US9506036B2 (ru) |
| EP (2) | EP2611909B1 (ru) |
| JP (2) | JP6168991B2 (ru) |
| KR (1) | KR101851956B1 (ru) |
| CN (1) | CN103221536B (ru) |
| AR (1) | AR082819A1 (ru) |
| AU (1) | AU2011296381B2 (ru) |
| BR (1) | BR112013004616A2 (ru) |
| CA (1) | CA2809300A1 (ru) |
| ES (1) | ES2660897T3 (ru) |
| MX (1) | MX355340B (ru) |
| PH (1) | PH12013500367A1 (ru) |
| PL (1) | PL2611909T3 (ru) |
| RU (1) | RU2620938C2 (ru) |
| SG (2) | SG187946A1 (ru) |
| WO (1) | WO2012030538A2 (ru) |
Families Citing this family (17)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103221536B (zh) * | 2010-08-31 | 2016-08-31 | 詹森生物科技公司 | 人胚胎干细胞的分化 |
| CN108220224A (zh) | 2011-06-21 | 2018-06-29 | 诺沃—诺迪斯克有限公司 | 自多潜能干细胞有效诱导定形内胚层 |
| US20140242038A1 (en) * | 2011-10-11 | 2014-08-28 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Method for generating beta cells |
| WO2013186946A1 (ja) * | 2012-06-11 | 2013-12-19 | 国立大学法人北海道大学 | 多能性幹細胞の選別方法 |
| EP3008170A4 (en) | 2013-06-11 | 2016-11-09 | Harvard College | SC-CELLS AND COMPOSITIONS AND METHOD FOR THE PRODUCTION THEREOF |
| ES2985135T3 (es) | 2014-12-18 | 2024-11-04 | Harvard College | Procedimientos para generar células ß derivadas de células madre y usos de las mismas |
| US10443042B2 (en) | 2014-12-18 | 2019-10-15 | President And Fellows Of Harvard College | Serum-free in vitro directed differentiation protocol for generating stem cell-derived beta cells and uses thereof |
| CN107614678B (zh) | 2014-12-18 | 2021-04-30 | 哈佛学院校长同事会 | 干细胞来源的β细胞的产生方法及其使用方法 |
| JP7107504B2 (ja) * | 2017-01-27 | 2022-07-27 | 株式会社カネカ | 内胚葉系細胞集団、及び多能性細胞から三胚葉のいずれかの細胞集団を製造する方法 |
| US10767164B2 (en) | 2017-03-30 | 2020-09-08 | The Research Foundation For The State University Of New York | Microenvironments for self-assembly of islet organoids from stem cells differentiation |
| CA3081762A1 (en) | 2017-11-15 | 2019-05-23 | Semma Therapeutics, Inc. | Islet cell manufacturing compositions and methods of use |
| CA3108275A1 (en) | 2018-08-10 | 2020-02-13 | Vertex Pharmaceuticals Incorporated | Stem cell derived islet differentiation |
| US20220234006A1 (en) | 2019-05-31 | 2022-07-28 | W. L. Gore & Associates, Inc. | A biocompatible membrane composite |
| AU2020283150B2 (en) | 2019-05-31 | 2023-08-17 | Viacyte, Inc. | Cell encapsulation devices with controlled oxygen diffusion distances |
| AU2020283056B2 (en) | 2019-05-31 | 2023-06-08 | Viacyte, Inc. | A biocompatible membrane composite |
| US20220233298A1 (en) | 2019-05-31 | 2022-07-28 | W. L. Gore & Associates, Inc. | A biocompatible membrane composite |
| WO2022169375A2 (en) * | 2021-02-08 | 2022-08-11 | Qatar Foundation For Education, Science And Community Development | Generation of induced pluripotent stem cell lines from human patients with mutations in the glucokinase gene |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20050158853A1 (en) * | 2003-12-23 | 2005-07-21 | D' Amour Kevin A. | Definitive endoderm |
| US20070254359A1 (en) * | 2006-04-28 | 2007-11-01 | Lifescan, Inc. | Differentiation of human embryonic stem cells |
| KR20080020098A (ko) * | 2006-08-30 | 2008-03-05 | 동아제약주식회사 | 저농도의 포도당을 함유하는 인간 배아줄기세포용 배지조성물 및 이를 이용한 인간 배아 줄기세포로부터 인슐린생산 세포 또는 세포괴로 분화시키는 방법, 그리고그로부터 유도된 인슐린 생산 세포 또는 세포괴 |
| RU2359030C1 (ru) * | 2008-03-19 | 2009-06-20 | Общество С Ограниченной Ответственностью "Лаборатория Клеточных Технологий" | Способ получения эндотелиальных клеток из эмбриональных стволовых клеток человека (варианты) |
Family Cites Families (247)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3209652A (en) | 1961-03-30 | 1965-10-05 | Burgsmueller Karl | Thread whirling method |
| AT326803B (de) | 1968-08-26 | 1975-12-29 | Binder Fa G | Maschenware sowie verfahren zur herstellung derselben |
| US3935067A (en) | 1974-11-22 | 1976-01-27 | Wyo-Ben Products, Inc. | Inorganic support for culture media |
| CA1201400A (en) | 1982-04-16 | 1986-03-04 | Joel L. Williams | Chemically specific surfaces for influencing cell activity during culture |
| US4499802A (en) | 1982-09-29 | 1985-02-19 | Container Graphics Corporation | Rotary cutting die with scrap ejection |
| US4537773A (en) | 1983-12-05 | 1985-08-27 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | α-Aminoboronic acid derivatives |
| US4557264A (en) | 1984-04-09 | 1985-12-10 | Ethicon Inc. | Surgical filament from polypropylene blended with polyethylene |
| US5089396A (en) | 1985-10-03 | 1992-02-18 | Genentech, Inc. | Nucleic acid encoding β chain prodomains of inhibin and method for synthesizing polypeptides using such nucleic acid |
| US5215893A (en) | 1985-10-03 | 1993-06-01 | Genentech, Inc. | Nucleic acid encoding the ba chain prodomains of inhibin and method for synthesizing polypeptides using such nucleic acid |
| US4737578A (en) | 1986-02-10 | 1988-04-12 | The Salk Institute For Biological Studies | Human inhibin |
| US5863531A (en) | 1986-04-18 | 1999-01-26 | Advanced Tissue Sciences, Inc. | In vitro preparation of tubular tissue structures by stromal cell culture on a three-dimensional framework |
| US5567612A (en) | 1986-11-20 | 1996-10-22 | Massachusetts Institute Of Technology | Genitourinary cell-matrix structure for implantation into a human and a method of making |
| CA1340581C (en) | 1986-11-20 | 1999-06-08 | Joseph P. Vacanti | Chimeric neomorphogenesis of organs by controlled cellular implantation using artificial matrices |
| US5759830A (en) | 1986-11-20 | 1998-06-02 | Massachusetts Institute Of Technology | Three-dimensional fibrous scaffold containing attached cells for producing vascularized tissue in vivo |
| NZ229354A (en) | 1988-07-01 | 1990-09-26 | Becton Dickinson Co | Treating polymer surfaces with a gas plasma and then applying a layer of endothelial cells to the surface |
| EP0363125A3 (en) | 1988-10-03 | 1990-08-16 | Hana Biologics Inc. | Proliferated pancreatic endocrine cell product and process |
| US5837539A (en) | 1990-11-16 | 1998-11-17 | Osiris Therapeutics, Inc. | Monoclonal antibodies for human mesenchymal stem cells |
| TW205553B (ru) | 1991-04-25 | 1993-05-11 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | |
| US5449383A (en) | 1992-03-18 | 1995-09-12 | Chatelier; Ronald C. | Cell growth substrates |
| GB9206861D0 (en) | 1992-03-28 | 1992-05-13 | Univ Manchester | Wound healing and treatment of fibrotic disorders |
| CA2114282A1 (en) | 1993-01-28 | 1994-07-29 | Lothar Schilder | Multi-layered implant |
| JP3525221B2 (ja) | 1993-02-17 | 2004-05-10 | 味の素株式会社 | 免疫抑制剤 |
| WO1994023572A1 (en) | 1993-04-08 | 1994-10-27 | Human Cell Cultures, Inc. | Cell culturing method and medium |
| US5523226A (en) | 1993-05-14 | 1996-06-04 | Biotechnology Research And Development Corp. | Transgenic swine compositions and methods |
| GB9310557D0 (en) | 1993-05-21 | 1993-07-07 | Smithkline Beecham Plc | Novel process and apparatus |
| TW257671B (ru) | 1993-11-19 | 1995-09-21 | Ciba Geigy | |
| US5834308A (en) | 1994-04-28 | 1998-11-10 | University Of Florida Research Foundation, Inc. | In vitro growth of functional islets of Langerhans |
| US6703017B1 (en) | 1994-04-28 | 2004-03-09 | Ixion Biotechnology, Inc. | Reversal of insulin-dependent diabetes by islet-producing stem cells, islet progenitor cells and islet-like structures |
| US6001647A (en) | 1994-04-28 | 1999-12-14 | Ixion Biotechnology, Inc. | In vitro growth of functional islets of Langerhans and in vivo uses thereof |
| US6083903A (en) | 1994-10-28 | 2000-07-04 | Leukosite, Inc. | Boronic ester and acid compounds, synthesis and uses |
| AU704723B2 (en) | 1994-12-29 | 1999-04-29 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Antitumor agent effect enhancer containing IL-6 antagonist |
| US5843780A (en) | 1995-01-20 | 1998-12-01 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Primate embryonic stem cells |
| US5718922A (en) | 1995-05-31 | 1998-02-17 | Schepens Eye Research Institute, Inc. | Intravitreal microsphere drug delivery and method of preparation |
| US5908782A (en) | 1995-06-05 | 1999-06-01 | Osiris Therapeutics, Inc. | Chemically defined medium for human mesenchymal stem cells |
| US5681561A (en) | 1995-06-07 | 1997-10-28 | Life Medical Sciences, Inc. | Compositions and methods for improving autologous fat grafting |
| AU7138298A (en) | 1997-04-24 | 1998-11-13 | Ortho-Mcneil Corporation, Inc. | Substituted imidazoles useful in the treatment of inflammatory diseases |
| DE69837491T2 (de) | 1997-07-03 | 2008-01-17 | Osiris Therapeutics, Inc. | Menschliche mesenchymale stammzellen aus peripherem blut |
| DE69830065T2 (de) | 1997-09-16 | 2006-01-19 | Egea Biosciences, LLC, San Diego | Methoden zur kompletten chemischen synthese und zusammensetzung von genen und genomen |
| US6670127B2 (en) | 1997-09-16 | 2003-12-30 | Egea Biosciences, Inc. | Method for assembly of a polynucleotide encoding a target polypeptide |
| WO1999020741A1 (en) | 1997-10-23 | 1999-04-29 | Geron Corporation | Methods and materials for the growth of primate-derived primordial stem cells |
| ZA9811898B (en) | 1997-12-29 | 2000-06-28 | Ortho Mcneil Pharm Inc | Anti-Inflammatory Compounds. |
| WO1999047163A2 (en) | 1998-03-18 | 1999-09-23 | Osiris Therapeutics, Inc. | Mesenchymal stem cells for prevention and treatment of immune responses in transplantation |
| MY132496A (en) | 1998-05-11 | 2007-10-31 | Vertex Pharma | Inhibitors of p38 |
| US6413773B1 (en) | 1998-06-01 | 2002-07-02 | The Regents Of The University Of California | Phosphatidylinositol 3-kinase inhibitors as stimulators of endocrine differentiation |
| US6667176B1 (en) | 2000-01-11 | 2003-12-23 | Geron Corporation | cDNA libraries reflecting gene expression during growth and differentiation of human pluripotent stem cells |
| US7410798B2 (en) | 2001-01-10 | 2008-08-12 | Geron Corporation | Culture system for rapid expansion of human embryonic stem cells |
| US6610540B1 (en) | 1998-11-18 | 2003-08-26 | California Institute Of Technology | Low oxygen culturing of central nervous system progenitor cells |
| US6413556B1 (en) | 1999-01-08 | 2002-07-02 | Sky High, Llc | Aqueous anti-apoptotic compositions |
| IL144359A0 (en) | 1999-01-21 | 2002-05-23 | Vitro Diagnostics Inc | Immortalized cell lines and methods of making the same |
| US6815203B1 (en) | 1999-06-23 | 2004-11-09 | Joslin Diabetes Center, Inc. | Methods of making pancreatic islet cells |
| US6333029B1 (en) | 1999-06-30 | 2001-12-25 | Ethicon, Inc. | Porous tissue scaffoldings for the repair of regeneration of tissue |
| US6306424B1 (en) | 1999-06-30 | 2001-10-23 | Ethicon, Inc. | Foam composite for the repair or regeneration of tissue |
| EP1224259A4 (en) | 1999-09-27 | 2005-04-27 | Univ Florida | INVERSION OF INSULIN DEPENDENT DIABETES BY ISOLATED STEM CELLS, PROGENITOR ISLANDIC CELLS, AND INSULAR TYPE STRUCTURES |
| US6685936B2 (en) | 1999-10-12 | 2004-02-03 | Osiris Therapeutics, Inc. | Suppressor cells induced by culture with mesenchymal stem cells for treatment of immune responses in transplantation |
| US20030082155A1 (en) | 1999-12-06 | 2003-05-01 | Habener Joel F. | Stem cells of the islets of langerhans and their use in treating diabetes mellitus |
| US6753153B2 (en) | 1999-12-13 | 2004-06-22 | The Scripps Research Institute | Markers for identification and isolation of pancreatic islet α and β progenitors |
| US7439064B2 (en) | 2000-03-09 | 2008-10-21 | Wicell Research Institute, Inc. | Cultivation of human embryonic stem cells in the absence of feeder cells or without conditioned medium |
| US7005252B1 (en) | 2000-03-09 | 2006-02-28 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Serum free cultivation of primate embryonic stem cells |
| US6436704B1 (en) | 2000-04-10 | 2002-08-20 | Raven Biotechnologies, Inc. | Human pancreatic epithelial progenitor cells and methods of isolation and use thereof |
| US6458589B1 (en) | 2000-04-27 | 2002-10-01 | Geron Corporation | Hepatocyte lineage cells derived from pluripotent stem cells |
| KR100947577B1 (ko) | 2000-06-26 | 2010-03-15 | 엔씨 메디컬 리서치 가부시키가이샤 | 신경계 세포로 분화할 수 있는 세포를 포함하는 세포분획 |
| EP2404603A1 (en) | 2000-10-23 | 2012-01-11 | Glaxosmithkline LLC | Novel trisubstituted-8H-pyrido[2,3-d]pyrimidin-7-one compounds for the treatment of CSBP/p38 kinase mediated diseases |
| ATE301661T1 (de) | 2000-12-08 | 2005-08-15 | Ortho Mcneil Pharm Inc | Makroheterocyclische verbindungen als kinase inhibitoren |
| CZ20031594A3 (cs) | 2000-12-08 | 2004-06-16 | Ortho-Mcneil Pharmaceutical, Inc. | Pyrrolinové sloučeniny substituované indazolylovou skupinou jako inhibitory kinázy |
| US6599323B2 (en) | 2000-12-21 | 2003-07-29 | Ethicon, Inc. | Reinforced tissue implants and methods of manufacture and use |
| EP1366148A2 (en) | 2001-01-24 | 2003-12-03 | THE GOVERNMENT OF THE UNITED STATES OF AMERICA, represented by THE DEPARTMENT OF HEALTH & HUMAN SERVICES | Differentiation of stem cells to pancreatic endocrine cells |
| US6699835B2 (en) | 2001-01-25 | 2004-03-02 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Formulation of boronic acid compounds |
| US6656488B2 (en) | 2001-04-11 | 2003-12-02 | Ethicon Endo-Surgery, Inc. | Bioabsorbable bag containing bioabsorbable materials of different bioabsorption rates for tissue engineering |
| JP2004527249A (ja) | 2001-04-19 | 2004-09-09 | デヴェロゲン アクチエンゲゼルシャフト フュア エントヴィックルングスビオローギッシェ フォルシュング | 幹細胞をインスリン産生細胞に分化する方法 |
| JP4296781B2 (ja) | 2001-04-24 | 2009-07-15 | 味の素株式会社 | 幹細胞及びその分離方法 |
| EP1393066A4 (en) | 2001-05-15 | 2006-01-25 | Rappaport Family Inst For Res | INSULIN-PRODUCING CELLS DERIVED FROM HUMAN EMBRYONIC STEM CELLS |
| US6626950B2 (en) | 2001-06-28 | 2003-09-30 | Ethicon, Inc. | Composite scaffold with post anchor for the repair and regeneration of tissue |
| KR100418195B1 (ko) | 2001-07-05 | 2004-02-11 | 주식회사 우리기술 | 전력케이블의 다중절연진단장치 및 그 방법 |
| GB0117583D0 (en) | 2001-07-19 | 2001-09-12 | Astrazeneca Ab | Novel compounds |
| CA2456981C (en) | 2001-08-06 | 2012-02-28 | Bresagen, Inc. | Alternative compositions and methods for the culture of stem cells |
| US6617152B2 (en) | 2001-09-04 | 2003-09-09 | Corning Inc | Method for creating a cell growth surface on a polymeric substrate |
| EP1298201A1 (en) | 2001-09-27 | 2003-04-02 | Cardion AG | Process for the production of cells exhibiting an islet-beta-cell-like state |
| JP2005506074A (ja) | 2001-10-18 | 2005-03-03 | イクシオン・バイオテクノロジー・インコーポレーテッド | 肝臓の幹細胞および前駆細胞の膵臓機能細胞への転換 |
| CA2468171C (en) | 2001-11-15 | 2015-10-06 | Children's Medical Center Corporation | Methods of isolation, expansion and differentiation of fetal stem cells from chorionic villus, amniotic fluid, and placenta and therapeutic uses thereof |
| KR101083454B1 (ko) | 2001-12-07 | 2011-11-16 | 사이토리 테라퓨틱스, 인크. | 처리된 리포애스퍼레이트 세포로 환자를 치료하기 위한 시스템 및 방법 |
| CA2692325C (en) | 2001-12-07 | 2015-10-20 | Geron Corporation | Islet cells from human embryonic stem cells |
| AU2002218893A1 (en) | 2001-12-21 | 2003-07-09 | Thromb-X Nv | Compositions for the in vitro derivation and culture of embryonic stem (es) cell lines with germline transmission capability |
| JP2005512593A (ja) | 2001-12-28 | 2005-05-12 | セルアーティス アーベー | 多能性のヒト胚盤胞由来幹細胞株の樹立方法 |
| US20030162290A1 (en) | 2002-01-25 | 2003-08-28 | Kazutomo Inoue | Method for inducing differentiation of embryonic stem cells into functioning cells |
| US20030180268A1 (en) | 2002-02-05 | 2003-09-25 | Anthony Atala | Tissue engineered construct for supplementing or replacing a damaged organ |
| US20050208029A1 (en) | 2002-04-17 | 2005-09-22 | Akihiro Umezawa | Method of forming pancreatic beta cells from mesenchymal cells |
| US20040161419A1 (en) | 2002-04-19 | 2004-08-19 | Strom Stephen C. | Placental stem cells and uses thereof |
| JP2005529918A (ja) | 2002-05-08 | 2005-10-06 | ジヤンセン・フアーマシユーチカ・ナームローゼ・フエンノートシヤツプ | 置換されたピロリンキナーゼ阻害剤 |
| US20060003446A1 (en) | 2002-05-17 | 2006-01-05 | Gordon Keller | Mesoderm and definitive endoderm cell populations |
| WO2003102134A2 (en) | 2002-05-28 | 2003-12-11 | Becton, Dickinson And Company | Pancreatic acinar cells into insulin producing cells |
| WO2003104222A1 (en) | 2002-06-05 | 2003-12-18 | Janssen Pharmaceutica N.V. | Bisindolyl-maleimid derivatives as kinase inhibitors |
| GB0212976D0 (en) | 2002-06-06 | 2002-07-17 | Tonejet Corp Pty Ltd | Ejection method and apparatus |
| CN1171991C (zh) | 2002-07-08 | 2004-10-20 | 徐如祥 | 人神经干细胞的培养方法 |
| US6877147B2 (en) | 2002-07-22 | 2005-04-05 | Broadcom Corporation | Technique to assess timing delay by use of layout quality analyzer comparison |
| US7838290B2 (en) | 2002-07-25 | 2010-11-23 | The Scripps Research Institute | Hematopoietic stem cells and methods of treatment of neovascular eye diseases therewith |
| WO2004011621A2 (en) | 2002-07-29 | 2004-02-05 | Es Cell International Pte Ltd. | Multi-step method for the differentiation of insulin positive, glucose |
| AU2003262628A1 (en) | 2002-08-14 | 2004-03-03 | University Of Florida | Bone marrow cell differentiation |
| EP1539928A4 (en) | 2002-09-06 | 2006-09-06 | Amcyte Inc | POSIOTIVE PANCREATIC ENDOCRINE PROGENITOR CELLS CD56 IN ADULT HUMAN BEINGS |
| US9969977B2 (en) | 2002-09-20 | 2018-05-15 | Garnet Biotherapeutics | Cell populations which co-express CD49c and CD90 |
| US20040062753A1 (en) | 2002-09-27 | 2004-04-01 | Alireza Rezania | Composite scaffolds seeded with mammalian cells |
| US20060252150A1 (en) | 2002-11-08 | 2006-11-09 | Linzhao Cheng | Human embryonic stem cell cultures, and compositions and methods for growing same |
| US7144999B2 (en) | 2002-11-23 | 2006-12-05 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Modulation of hypoxia-inducible factor 1 alpha expression |
| WO2004050827A2 (en) | 2002-12-05 | 2004-06-17 | Technion Research & Development Foundation Ltd. | Cultured human pancreatic islets, and uses thereof |
| ES2705683T3 (es) | 2002-12-16 | 2019-03-26 | Technion Res & Dev Foundation | Medio de cultivo de células madre pluripotentes |
| AU2004208606B2 (en) | 2003-01-29 | 2009-09-24 | Takeda Pharmaceutical Company Limited | Process for producing coated preparation |
| RU2359671C2 (ru) | 2003-01-29 | 2009-06-27 | Такеда Фармасьютикал Компани Лимитед | Способ получения препарата с покрытием |
| US20070155661A1 (en) | 2003-02-14 | 2007-07-05 | The Board Of Trustees Of The Leland Standord Junior University | Methods and compositions for modulating the development of stem cells |
| US20070154981A1 (en) | 2003-02-14 | 2007-07-05 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Insulin-producing cells derived from stem cells |
| CA2520861A1 (en) | 2003-03-27 | 2004-10-14 | Ixion Biotechnology, Inc. | Method for transdifferentiation of non-pancreatic stem cells to the pancreatic pathway |
| US20060194315A1 (en) | 2003-03-31 | 2006-08-31 | Condie Brian G | Compositions and methods for the control, differentiaton and/or manipulation of pluripotent cells through a gamma-secretase signaling pathway |
| US20090203141A1 (en) | 2003-05-15 | 2009-08-13 | Shi-Lung Lin | Generation of tumor-free embryonic stem-like pluripotent cells using inducible recombinant RNA agents |
| EP1641915B1 (en) | 2003-06-27 | 2016-07-27 | DePuy Synthes Products, Inc. | Repair and regeneration of ocular tissue using postpartum-derived cells |
| IL161903A0 (en) | 2003-07-17 | 2005-11-20 | Gamida Cell Ltd | Ex vivo progenitor and stem cell expansion for usein the treatment of disease of endodermally- deri ved organs |
| ITRM20030395A1 (it) | 2003-08-12 | 2005-02-13 | Istituto Naz Per Le Malattie Infettive Lazz | Terreno di coltura per il mantenimento, la proliferazione e il differenziamento di cellule di mammifero. |
| US20050042595A1 (en) | 2003-08-14 | 2005-02-24 | Martin Haas | Banking of multipotent amniotic fetal stem cells |
| US7157275B2 (en) | 2003-08-15 | 2007-01-02 | Becton, Dickinson And Company | Peptides for enhanced cell attachment and growth |
| AU2004269395A1 (en) | 2003-08-27 | 2005-03-10 | Stemcells California, Inc. | Enriched pancreatic stem cell and progenitor cell populations, and methods for identifying, isolating and enriching for these populations |
| WO2005058301A1 (en) | 2003-12-17 | 2005-06-30 | Allergan, Inc. | Methods for treating retinoid responsive disorders using selective inhibitors of cyp26a and cyp26b |
| US20060030042A1 (en) | 2003-12-19 | 2006-02-09 | Ali Brivanlou | Maintenance of embryonic stem cells by the GSK-3 inhibitor 6-bromoindirubin-3'-oxime |
| CN112813019A (zh) | 2003-12-23 | 2021-05-18 | 维亚希特公司 | 定形内胚层 |
| US7625753B2 (en) | 2003-12-23 | 2009-12-01 | Cythera, Inc. | Expansion of definitive endoderm cells |
| US20050266554A1 (en) | 2004-04-27 | 2005-12-01 | D Amour Kevin A | PDX1 expressing endoderm |
| TWI334443B (en) | 2003-12-31 | 2010-12-11 | Ind Tech Res Inst | Method of single cell culture of undifferentiated human embryonic stem cells |
| WO2005065354A2 (en) | 2003-12-31 | 2005-07-21 | The Burnham Institute | Defined media for pluripotent stem cell culture |
| US7794704B2 (en) | 2004-01-23 | 2010-09-14 | Advanced Cell Technology, Inc. | Methods for producing enriched populations of human retinal pigment epithelium cells for treatment of retinal degeneration |
| US20080241107A1 (en) | 2004-01-23 | 2008-10-02 | Copland Iii John A | Methods and Compositions For Preparing Pancreatic Insulin Secreting Cells |
| GB2441530B (en) | 2004-02-12 | 2009-09-23 | Univ Newcastle | Stem Cells |
| JP4901471B2 (ja) | 2004-02-19 | 2012-03-21 | 国立大学法人京都大学 | 体細胞核初期化物質のスクリーニング方法 |
| US20060281174A1 (en) | 2004-03-09 | 2006-12-14 | Gang Xu | Methods for generating insulin-producing cells |
| EP1730261A4 (en) | 2004-03-10 | 2007-11-28 | Univ California | COMPOSITIONS AND METHODS FOR GROWING EMBRYONIC STEM CELLS |
| JP4688793B2 (ja) | 2004-03-23 | 2011-05-25 | 敏宏 赤池 | 多能性幹細胞の増殖方法 |
| WO2005097980A2 (en) | 2004-03-26 | 2005-10-20 | Geron Corporation | New protocols for making hepatocytes from embryonic stem cells |
| WO2005097977A2 (en) | 2004-04-01 | 2005-10-20 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Differentiation of stem cells to endoderm and pancreatic lineage |
| DK2377922T3 (da) | 2004-04-27 | 2020-05-04 | Viacyte Inc | PDX1-eksprimerende endoderm |
| CA2573283C (en) | 2004-07-09 | 2023-03-14 | Cythera, Inc. | Methods for identifying factors for differentiating definitive endoderm |
| WO2006020919A2 (en) | 2004-08-13 | 2006-02-23 | University Of Georgia Research Foundation, Inc. | Compositions and methods for self-renewal and differentiation in human embryonic stem cells |
| US20080268533A1 (en) | 2004-08-25 | 2008-10-30 | University Of Georgia Research Foundation, Inc. | Methods and Compositions Utilizing Myc and Gsk3Beta to Manipulate the Pluripotency of Embryonic Stem Cells |
| DE102004043256B4 (de) | 2004-09-07 | 2013-09-19 | Rheinische Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn | Skalierbarer Prozess zur Kultivierung undifferenzierter Stammzellen in Suspension |
| KR101264940B1 (ko) | 2004-09-08 | 2013-05-15 | 위스콘신 얼럼나이 리서어치 화운데이션 | 배아 줄기 세포용 배지 및 이의 배양물 |
| DK3196296T3 (en) | 2004-09-08 | 2019-02-04 | Wisconsin Alumini Res Foundation | Cultivation of human embryonic stem cells |
| CA2596231A1 (en) | 2005-01-28 | 2006-08-03 | Novathera Ltd | Methods for embryonic stem cell culture |
| AU2006210955A1 (en) | 2005-01-31 | 2006-08-10 | Es Cell International Pte Ltd. | Directed differentiation of embryonic stem cells and uses thereof |
| WO2006088867A2 (en) | 2005-02-15 | 2006-08-24 | Medistem Laboratories, Incorporated | Method for expansion of stem cells |
| EP1860950B1 (en) | 2005-03-04 | 2017-04-19 | Lifescan, Inc. | Adult pancreatic derived stromal cells |
| GB0505970D0 (en) | 2005-03-23 | 2005-04-27 | Univ Edinburgh | Culture medium containing kinase inhibitor, and uses thereof |
| EP1876893B1 (en) | 2005-04-15 | 2012-04-11 | Geron Corporation | Cancer treatment by combined inhibition of proteasome and telomerase activities |
| CN100425694C (zh) | 2005-04-15 | 2008-10-15 | 北京大学 | 诱导胚胎干细胞向胰腺细胞分化的方法 |
| WO2006114097A2 (en) | 2005-04-26 | 2006-11-02 | Aarhus Universitet | Biosurface structure array |
| JP5092124B2 (ja) | 2005-05-24 | 2012-12-05 | 国立大学法人 熊本大学 | Ｅｓ細胞の分化誘導方法 |
| AU2006202209B2 (en) | 2005-05-27 | 2011-04-14 | Lifescan, Inc. | Amniotic fluid derived cells |
| KR20080024194A (ko) | 2005-06-10 | 2008-03-17 | 아이알엠 엘엘씨 | 배아 줄기 세포의 다능성을 유지하는 화합물 |
| WO2006138433A2 (en) | 2005-06-14 | 2006-12-28 | The Regents Of The University Of California | Induction of cell differentiation by class i bhlh polypeptides |
| US20080199959A1 (en) | 2005-06-21 | 2008-08-21 | Ge Healthcare Bio-Sciences Ab | Method For Cell Culture |
| EP1910516B1 (en) | 2005-06-22 | 2019-06-19 | Asterias Biotherapeutics, Inc. | Suspension culture of human embryonic stem cells |
| ES2330789T3 (es) | 2005-06-30 | 2009-12-15 | Janssen Pharmaceutica Nv | Anilino-piridinotriazinas ciclicas como inhibidores de gsk-3. |
| CA2616863A1 (en) | 2005-07-29 | 2007-02-01 | Australian Stem Cell Centre Limited | Compositions and methods for growth of pluripotent cells |
| US20080194021A1 (en) | 2005-07-29 | 2008-08-14 | Mays Robert W | Use of a Gsk-3 Inhibitor to Maintain Potency of Culture Cells |
| WO2007025234A2 (en) | 2005-08-26 | 2007-03-01 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Generation of pancreatic endocrine cells from primary duct cell cultures and methods of use for treatment of diabetes |
| EP3354723B1 (en) | 2005-08-29 | 2023-12-13 | Technion Research & Development Foundation Ltd. | Media for culturing stem cells |
| US20080199849A1 (en) | 2005-09-02 | 2008-08-21 | Agency For Science, Technology And Research | Method of Deriving Progenitor Cell Line |
| AU2006292021B2 (en) | 2005-09-12 | 2012-05-31 | Es Cell International Pte Ltd. | Cardiomyocyte production |
| WO2008048671A1 (en) | 2006-10-18 | 2008-04-24 | University Of Illinois | Embryonic-like stem cells derived from adult human peripheral blood and methods of use |
| EP1941032A2 (en) | 2005-10-14 | 2008-07-09 | Regents Of The University Of Minnesota | Differentiation of non-embryonic stem cells to cells having a pancreatic phenotype |
| JP5404047B2 (ja) | 2005-10-27 | 2014-01-29 | ヴィアサイト，インコーポレイテッド | Ｐｄｘ１発現背側及び腹側前腸内胚葉 |
| US8048999B2 (en) | 2005-12-13 | 2011-11-01 | Kyoto University | Nuclear reprogramming factor |
| WO2007082963A1 (es) | 2006-01-18 | 2007-07-26 | Fundación Instituto Valenciano De Infertilidad | Líneas de células madre embrionarias humanas y métodos para usar las mismas |
| JP5830217B2 (ja) | 2006-02-23 | 2015-12-09 | ヴィアサイト インコーポレイテッド | 分化可能細胞の培養に有用な組成物及び方法 |
| US7695965B2 (en) | 2006-03-02 | 2010-04-13 | Cythera, Inc. | Methods of producing pancreatic hormones |
| EP1999253B1 (en) | 2006-03-02 | 2019-05-22 | Viacyte, Inc. | Endocrine precursor cells, pancreatic hormone-expressing cells and methods of production |
| ES2725601T3 (es) | 2006-04-28 | 2019-09-25 | Lifescan Inc | Diferenciación de células madre embriónicas humanas |
| GB2452186B (en) | 2006-05-02 | 2011-01-26 | Wisconsin Alumni Res Found | Method of differentiating stem cells into cells of the endoderm and pancreatic lineage |
| US8685730B2 (en) | 2006-05-02 | 2014-04-01 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Methods and devices for differentiating pluripotent stem cells into cells of the pancreatic lineage |
| US9598673B2 (en) * | 2006-05-19 | 2017-03-21 | Creative Medical Health | Treatment of disc degenerative disease |
| US7964402B2 (en) | 2006-05-25 | 2011-06-21 | Sanford-Burnham Medical Research Institute | Methods for culture and production of single cell populations of human embryonic stem cells |
| US20090298169A1 (en) * | 2006-06-02 | 2009-12-03 | The University Of Georgia Research Foundation | Pancreatic and Liver Endoderm Cells and Tissue by Differentiation of Definitive Endoderm Cells Obtained from Human Embryonic Stems |
| CN101541953A (zh) | 2006-06-02 | 2009-09-23 | 佐治亚大学研究基金会 | 通过从人胚胎干细胞获得的定形内胚层细胞的分化得到胰和肝内胚层细胞及组织 |
| US8415153B2 (en) | 2006-06-19 | 2013-04-09 | Geron Corporation | Differentiation and enrichment of islet-like cells from human pluripotent stem cells |
| CN100494359C (zh) | 2006-06-23 | 2009-06-03 | 中日友好医院 | 神经干细胞三维立体培养体外扩增的方法 |
| CA2656175C (en) | 2006-06-26 | 2018-08-28 | Lifescan, Inc. | Conditioned media obtained from amniotic fluid-derived cells for pluripotent stem cell culture |
| US20080003676A1 (en) | 2006-06-26 | 2008-01-03 | Millipore Corporation | Growth of embryonic stem cells |
| US8968994B2 (en) | 2006-07-06 | 2015-03-03 | Jeremy Micah Crook | Method for stem cell culture and cells derived therefrom |
| AU2007277364B2 (en) | 2006-07-26 | 2010-08-12 | Viacyte, Inc. | Methods of producing pancreatic hormones |
| US9040297B2 (en) | 2006-08-02 | 2015-05-26 | Technion Research & Development Foundation Limited | Methods of expanding embryonic stem cells in a suspension culture |
| JP2008099662A (ja) | 2006-09-22 | 2008-05-01 | Institute Of Physical & Chemical Research | 幹細胞の培養方法 |
| US20080091234A1 (en) | 2006-09-26 | 2008-04-17 | Kladakis Stephanie M | Method for modifying a medical implant surface for promoting tissue growth |
| WO2008048647A1 (en) | 2006-10-17 | 2008-04-24 | Cythera, Inc. | Modulation of the phosphatidylinositol-3-kinase pathway in the differentiation of human embryonic stem cells |
| CA2667053C (en) | 2006-10-17 | 2015-04-28 | Stiefel Laboratories, Inc. | Talarazole metabolites |
| WO2008056779A1 (fr) | 2006-11-09 | 2008-05-15 | Japan As Represented By The President Of International Medical Center Of Japan | Procédé destiné à la culture et au passage d'une cellule souche embryonnaire de primate, et procédé destiné à induire la différenciation de la cellule souche embryonnaire |
| WO2008086005A1 (en) | 2007-01-09 | 2008-07-17 | University Of South Florida | Compositions including triciribine and bortezomib and derivatives thereof and methods of use thereof |
| CN101641436A (zh) | 2007-01-30 | 2010-02-03 | 佐治亚大学研究基金会 | 用于产生内胚层和中胚层细胞系及多能游走细胞（mmc）的早期中胚层细胞即稳定的中内胚层细胞群 |
| GB0703188D0 (en) | 2007-02-19 | 2007-03-28 | Roger Land Building | Large scale production of stem cells |
| WO2008148105A1 (en) | 2007-05-25 | 2008-12-04 | Medistem Laboratories, Inc. | Endometrial stem cells and methods of making and using same |
| AU2008272949B2 (en) | 2007-06-29 | 2014-05-15 | FUJIFILM Cellular Dynamics, Inc. | Automated method and apparatus for embryonic stem cell culture |
| PL2185695T3 (pl) | 2007-07-18 | 2015-08-31 | Lifescan Inc | Różnicowanie ludzkich zarodkowych komórek macierzystych |
| CA3207103A1 (en) | 2007-07-31 | 2009-02-05 | Janssen Biotech, Inc. | Differentiation of human embryonic stem cells to pancreatic endocrine |
| BRPI0815052A2 (pt) | 2007-07-31 | 2014-10-21 | Lifescan Inc | Diferenciação de células-tronco pluripotentes por meio de uso de células nutrizes humanas |
| KR101544498B1 (ko) | 2007-08-24 | 2015-08-17 | 스티칭 허트 네덜란드 칸커 인스티튜트 | 종양성 질환의 치료를 위한 조성물 |
| WO2009061442A1 (en) | 2007-11-06 | 2009-05-14 | Children's Medical Center Corporation | Method to produce induced pluripotent stem (ips) cells form non-embryonic human cells |
| ATE523585T1 (de) | 2007-11-27 | 2011-09-15 | Lifescan Inc | Differenzierung menschlicher embryonaler stammzellen |
| SG154367A1 (en) | 2008-01-31 | 2009-08-28 | Es Cell Int Pte Ltd | Method of differentiating stem cells |
| WO2009096049A1 (ja) | 2008-02-01 | 2009-08-06 | Kyoto University | 人工多能性幹細胞由来分化細胞 |
| US20100330677A1 (en) | 2008-02-11 | 2010-12-30 | Cambridge Enterprise Limited | Improved Reprogramming of Mammalian Cells, and Cells Obtained |
| RU2551772C2 (ru) | 2008-02-21 | 2015-05-27 | Сентокор Орто Байотек Инк. | Способы, поверхностно-модифицированные носители и композиции для иммобилизации, культивирования и открепления клеток |
| WO2009110215A1 (ja) * | 2008-03-03 | 2009-09-11 | 独立行政法人 科学技術振興機構 | 繊毛細胞の分化誘導方法 |
| US8716018B2 (en) | 2008-03-17 | 2014-05-06 | Agency For Science, Technology And Research | Microcarriers for stem cell culture |
| US8338170B2 (en) | 2008-04-21 | 2012-12-25 | Viacyte, Inc. | Methods for purifying endoderm and pancreatic endoderm cells derived from human embryonic stem cells |
| WO2009131568A1 (en) | 2008-04-21 | 2009-10-29 | Cythera, Inc. | Methods for purifying endoderm and pancreatic endoderm cells derived from human embryonic stem cells |
| US8728812B2 (en) | 2008-04-22 | 2014-05-20 | President And Fellows Of Harvard College | Compositions and methods for promoting the generation of PDX1+ pancreatic cells |
| US7939322B2 (en) | 2008-04-24 | 2011-05-10 | Centocor Ortho Biotech Inc. | Cells expressing pluripotency markers and expressing markers characteristic of the definitive endoderm |
| US8623648B2 (en) | 2008-04-24 | 2014-01-07 | Janssen Biotech, Inc. | Treatment of pluripotent cells |
| US20090298178A1 (en) | 2008-06-03 | 2009-12-03 | D Amour Kevin Allen | Growth factors for production of definitive endoderm |
| WO2009154606A1 (en) * | 2008-06-03 | 2009-12-23 | Cythera, Inc. | Growth factors for production of definitive endoderm |
| BRPI0914116A2 (pt) | 2008-06-30 | 2019-09-17 | Centocor Ortho Biotech Inc | diferenciação de células-tronco pluripotentes |
| DE102008032236A1 (de) | 2008-06-30 | 2010-04-01 | Eberhard-Karls-Universität Tübingen | Isolierung und/oder Identifizierung von Stammzellen mit adipozytärem, chondrozytärem und pankreatischem Differenzierungspotential |
| US20100028307A1 (en) | 2008-07-31 | 2010-02-04 | O'neil John J | Pluripotent stem cell differentiation |
| US9683215B2 (en) | 2008-08-22 | 2017-06-20 | President And Fellows Of Harvard College | Methods of reprogramming cells |
| RU2522001C2 (ru) | 2008-10-31 | 2014-07-10 | Сентокор Орто Байотек Инк. | Дифференцирование человеческих эмбриональных стволовых клеток в линию панкреатических эндокринных клеток |
| CN107435038B (zh) | 2008-10-31 | 2021-07-09 | 詹森生物科技公司 | 人胚胎干细胞向胰腺内分泌谱系的分化 |
| CA2742583C (en) | 2008-11-04 | 2022-09-27 | Viacyte, Inc. | Stem cell aggregate suspension compositions and methods for differentiation thereof |
| US8008075B2 (en) | 2008-11-04 | 2011-08-30 | Viacyte, Inc. | Stem cell aggregate suspension compositions and methods of differentiation thereof |
| CA2743641C (en) | 2008-11-14 | 2024-03-26 | Viacyte, Inc. | Encapsulation of pancreatic cells derived from human pluripotent stem cells |
| JP2012509085A (ja) | 2008-11-20 | 2012-04-19 | ヤンセン バイオテツク，インコーポレーテツド | マイクロキャリア上での多能性幹細胞の培養 |
| DK2356218T3 (en) | 2008-12-05 | 2017-08-21 | Inserm (Institut Nat De La Santé Et De La Rech Médicale) | METHOD AND MEDIUM FOR NEURAL DIFFERENTIZATION OF PLURIPOTENT CELLS |
| SG177481A1 (en) | 2009-07-20 | 2012-02-28 | Janssen Biotech Inc | Differentiation of human embryonic stem cells |
| CA2768720C (en) | 2009-07-20 | 2018-12-18 | Janssen Biotech, Inc. | Differentiation of human embryonic stem cells |
| PH12012500818A1 (en) | 2009-10-29 | 2019-11-29 | Janssen Biotech Inc | Pluripotent stem cells |
| FI20096288A0 (fi) | 2009-12-04 | 2009-12-04 | Kristiina Rajala | Formulations and methods for culturing stem cells |
| CA2784415C (en) | 2009-12-23 | 2019-06-18 | Jean Xu | Differentiation of human embryonic stem cells |
| SG181685A1 (en) | 2009-12-23 | 2012-07-30 | Centocor Ortho Biotech Inc | Differentiation of human embryonic stem cells |
| US20120322152A1 (en) | 2010-03-02 | 2012-12-20 | Michael Raghunath | Culture Additives To Boost Stem Cell Proliferation And Differentiation Response |
| AU2011235212B2 (en) | 2010-03-31 | 2014-07-31 | The Scripps Research Institute | Reprogramming cells |
| CN103068970A (zh) | 2010-04-25 | 2013-04-24 | 西奈山医学院 | 来自多能细胞的前部前肠内胚层的形成 |
| MX351515B (es) | 2010-05-12 | 2017-10-17 | Janssen Biotech Inc | Diferenciacion de celulas madre embrionarias humanas. |
| US9279103B2 (en) | 2010-08-05 | 2016-03-08 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Simplified basic media for human pluripotent cell culture |
| CN103221536B (zh) * | 2010-08-31 | 2016-08-31 | 詹森生物科技公司 | 人胚胎干细胞的分化 |
| AU2011296383B2 (en) | 2010-08-31 | 2016-03-10 | Janssen Biotech, Inc. | Differentiation of pluripotent stem cells |
| WO2012117333A1 (en) | 2011-02-28 | 2012-09-07 | Stempeutics Research Malaysia Sdn Bhd | Isolation and expansion of adult stem cells, their therapeutic composition and uses thereof |
| WO2013055834A2 (en) | 2011-10-11 | 2013-04-18 | The New York Stem Cell Foundation | Er stress relievers in beta cell protection |
| EP2766474B1 (en) | 2011-10-14 | 2020-10-07 | Children's Medical Center Corporation | Inhibition and enhancement of reprogramming by chromatin modifying enzymes |
| AU2012355698B2 (en) | 2011-12-22 | 2018-11-29 | Janssen Biotech, Inc. | Differentiation of human embryonic stem cells into single hormonal insulin positive cells |
| US10519422B2 (en) | 2012-02-29 | 2019-12-31 | Riken | Method of producing human retinal pigment epithelial cells |
| MX358590B (es) * | 2012-06-08 | 2018-08-24 | Janssen Biotech Inc | Diferenciacion de celulas madre embrionarias humanas en celulas endocrinas pancreaticas. |
| JP6470687B2 (ja) | 2012-09-03 | 2019-02-13 | ノヴォ ノルディスク アー／エス | 小分子を用いた多能性幹細胞からの膵臓内胚葉の作製 |
| SG10201707811XA (en) | 2012-12-31 | 2017-11-29 | Janssen Biotech Inc | Differentiation of human embryonic stem cells into pancreatic endocrine cells using hb9 regulators |
| US8859286B2 (en) | 2013-03-14 | 2014-10-14 | Viacyte, Inc. | In vitro differentiation of pluripotent stem cells to pancreatic endoderm cells (PEC) and endocrine cells |
| AU2014239954B2 (en) | 2013-03-15 | 2020-07-16 | The Jackson Laboratory | Isolation of non-embryonic stem cells and uses thereof |
| US11779311B2 (en) | 2018-09-14 | 2023-10-10 | Fujifilm Sonosite, Inc. | Method and apparatus for performing spectral doppler imaging |
-
2011
- 2011-08-17 CN CN201180041677.4A patent/CN103221536B/zh active Active
- 2011-08-17 EP EP11822349.4A patent/EP2611909B1/en active Active
- 2011-08-17 BR BR112013004616A patent/BR112013004616A2/pt not_active Application Discontinuation
- 2011-08-17 US US13/211,951 patent/US9506036B2/en active Active
- 2011-08-17 JP JP2013527098A patent/JP6168991B2/ja active Active
- 2011-08-17 EP EP18151479.5A patent/EP3372672A1/en not_active Withdrawn
- 2011-08-17 MX MX2013002405A patent/MX355340B/es active IP Right Grant
- 2011-08-17 ES ES11822349.4T patent/ES2660897T3/es active Active
- 2011-08-17 KR KR1020137007513A patent/KR101851956B1/ko active Active
- 2011-08-17 PH PH1/2013/500367A patent/PH12013500367A1/en unknown
- 2011-08-17 AU AU2011296381A patent/AU2011296381B2/en active Active
- 2011-08-17 CA CA2809300A patent/CA2809300A1/en not_active Abandoned
- 2011-08-17 WO PCT/US2011/048127 patent/WO2012030538A2/en not_active Ceased
- 2011-08-17 SG SG2013013586A patent/SG187946A1/en unknown
- 2011-08-17 PL PL11822349T patent/PL2611909T3/pl unknown
- 2011-08-17 SG SG10201506855RA patent/SG10201506855RA/en unknown
- 2011-08-17 RU RU2013114373A patent/RU2620938C2/ru active
- 2011-08-31 AR ARP110103175A patent/AR082819A1/es unknown
-
2016
- 2016-09-23 US US15/274,749 patent/US9951314B2/en active Active
- 2016-10-07 JP JP2016199159A patent/JP6449829B2/ja active Active
-
2018
- 2018-04-20 US US15/958,824 patent/US20180237752A1/en not_active Abandoned
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20050158853A1 (en) * | 2003-12-23 | 2005-07-21 | D' Amour Kevin A. | Definitive endoderm |
| US20070254359A1 (en) * | 2006-04-28 | 2007-11-01 | Lifescan, Inc. | Differentiation of human embryonic stem cells |
| KR20080020098A (ko) * | 2006-08-30 | 2008-03-05 | 동아제약주식회사 | 저농도의 포도당을 함유하는 인간 배아줄기세포용 배지조성물 및 이를 이용한 인간 배아 줄기세포로부터 인슐린생산 세포 또는 세포괴로 분화시키는 방법, 그리고그로부터 유도된 인슐린 생산 세포 또는 세포괴 |
| RU2359030C1 (ru) * | 2008-03-19 | 2009-06-20 | Общество С Ограниченной Ответственностью "Лаборатория Клеточных Технологий" | Способ получения эндотелиальных клеток из эмбриональных стволовых клеток человека (варианты) |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| KR 1020080020098 A,, 05.03.2008. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP2611909A2 (en) | 2013-07-10 |
| AU2011296381B2 (en) | 2016-03-31 |
| CA2809300A1 (en) | 2012-03-08 |
| MX2013002405A (es) | 2013-04-05 |
| US20170009212A1 (en) | 2017-01-12 |
| WO2012030538A3 (en) | 2012-06-07 |
| KR20130138761A (ko) | 2013-12-19 |
| CN103221536B (zh) | 2016-08-31 |
| AU2011296381A1 (en) | 2013-03-14 |
| SG10201506855RA (en) | 2015-10-29 |
| JP6168991B2 (ja) | 2017-07-26 |
| US20120052571A1 (en) | 2012-03-01 |
| EP2611909B1 (en) | 2018-01-17 |
| ES2660897T3 (es) | 2018-03-26 |
| SG187946A1 (en) | 2013-03-28 |
| WO2012030538A2 (en) | 2012-03-08 |
| AR082819A1 (es) | 2013-01-09 |
| PL2611909T3 (pl) | 2018-05-30 |
| KR101851956B1 (ko) | 2018-04-25 |
| BR112013004616A2 (pt) | 2016-07-05 |
| EP3372672A1 (en) | 2018-09-12 |
| US20180237752A1 (en) | 2018-08-23 |
| RU2013114373A (ru) | 2014-10-10 |
| EP2611909A4 (en) | 2014-03-05 |
| CN103221536A (zh) | 2013-07-24 |
| US9506036B2 (en) | 2016-11-29 |
| MX355340B (es) | 2018-04-16 |
| US9951314B2 (en) | 2018-04-24 |
| JP6449829B2 (ja) | 2019-01-09 |
| JP2013536685A (ja) | 2013-09-26 |
| PH12013500367A1 (en) | 2013-04-01 |
| JP2017038614A (ja) | 2017-02-23 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RU2620938C2 (ru) | Дифференцирование эмбриональных стволовых клеток человека | |
| RU2627168C2 (ru) | Дифференцирование эмбриональных стволовых клеток человека | |
| RU2673946C1 (ru) | Дифференцирование плюрипотентных стволовых клеток | |
| HK1186491A (en) | Differentiation of human embryonic stem cells | |
| HK1186491B (en) | Differentiation of human embryonic stem cells |