[go: up one dir, main page]

RU2620970C2 - Лечение связанных с эритропоэтином (еро) заболеваний путем ингибирования природного антисмыслового транскрипта к еро - Google Patents

Лечение связанных с эритропоэтином (еро) заболеваний путем ингибирования природного антисмыслового транскрипта к еро Download PDF

Info

Publication number
RU2620970C2
RU2620970C2 RU2011127200A RU2011127200A RU2620970C2 RU 2620970 C2 RU2620970 C2 RU 2620970C2 RU 2011127200 A RU2011127200 A RU 2011127200A RU 2011127200 A RU2011127200 A RU 2011127200A RU 2620970 C2 RU2620970 C2 RU 2620970C2
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
oligonucleotide
epo
erythropoietin
antisense
nucleic acid
Prior art date
Application number
RU2011127200A
Other languages
English (en)
Other versions
RU2011127200A (ru
Inventor
Джозеф КОЛЛАРД
ШЕРМАН Ольга ХОРЬКОВА
Original Assignee
КьюРНА,Инк.,
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by КьюРНА,Инк., filed Critical КьюРНА,Инк.,
Publication of RU2011127200A publication Critical patent/RU2011127200A/ru
Application granted granted Critical
Publication of RU2620970C2 publication Critical patent/RU2620970C2/ru

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1136—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against growth factors, growth regulators, cytokines, lymphokines or hormones
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/02—Drugs for disorders of the nervous system for peripheral neuropathies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/08—Antiepileptics; Anticonvulsants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A61P25/16—Anti-Parkinson drugs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/18—Antipsychotics, i.e. neuroleptics; Drugs for mania or schizophrenia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/22—Anxiolytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/24—Antidepressants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/30—Drugs for disorders of the nervous system for treating abuse or dependence
    • A61P25/32—Alcohol-abuse
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A61P27/06—Antiglaucoma agents or miotics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/06—Antianaemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/02—Non-specific cardiovascular stimulants, e.g. drugs for syncope, antihypotensives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/04—Inotropic agents, i.e. stimulants of cardiac contraction; Drugs for heart failure
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/12—Antihypertensives
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C07K14/505—Erythropoietin [EPO]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/11—Antisense
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/11—Antisense
    • C12N2310/113—Antisense targeting other non-coding nucleic acids, e.g. antagomirs
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/136—Screening for pharmacological compounds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/178—Oligonucleotides characterized by their use miRNA, siRNA or ncRNA
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
    • Y10T436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10T436/14—Heterocyclic carbon compound [i.e., O, S, N, Se, Te, as only ring hetero atom]
    • Y10T436/142222—Hetero-O [e.g., ascorbic acid, etc.]
    • Y10T436/143333—Saccharide [e.g., DNA, etc.]

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Psychiatry (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Ophthalmology & Optometry (AREA)

Abstract

Изобретение относится к биотехнологии. Описан синтетический, необязательно модифицированный олигонуклеотид длиной 10-30 нуклеотидов или длиной 19-30 нуклеотидов, где модификация выбрана из модифицированного сахарного фрагмента; модифицированной межнуклеотидной связи; модифицированного нуклеотида, а также из их сочетаний. При этом указанный олигонуклеотид является антисмысловым соединением, которое гибридизуется с природным антисмысловым полинуклеотидом, имеющим SEQ ID NO: 3, и вызывает стимуляцию экспрессии гена эритропоэтина. Также описан способ стимуляции экспрессии полинуклеотида эритропоэтина, имеющего последовательность SEQ ID NO: 1 или 2, в клетках или тканях пациента, предусматривающий использование описанного олигонуклеотида. Также описан способ стимуляции экспрессии гена эритропоэтина в клетках или тканях млекопитающего in vivo или in vitro, предусматривающий приведение указанных клеток или тканей в контакт по меньшей мере с одним олигонуклеотидом siPHK длиной в 19-30 нуклеотидов, где указанный по меньшей мере один олигонуклеотид siPHK является специфичным в отношении природного антисмыслового полинуклеотида эритропоэтина, выбранного из SEQ ID NO: 3. Представлена композиция для стимуляции экспрессии гена эритропоэтина в клетках или тканях млекопитающего, содержащая один или более описанный олигонуклеотид и фармацевтически приемлемый наполнитель. Изобретение расширяет арсенал лечения заболеваний, ассоциированных с эритропоэтином. 5 н. и 20 з.п. ф-лы, 6 ил., 5 пр.

Description

ЗАЯВЛЕННЫЙ ПРИОРИТЕТ
В настоящей заявке испрашивается приоритет в соответствии с предварительной заявкой Соединенных Штатов Америки с регистрационным номером № 61/119961, поданной 4 декабря 2008 г., под названием "RNA Molecules Targeting Erythropoietin and Related Molecules", в полном объеме включенной в настоящее описание в виде ссылки.
ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Воплощения настоящего изобретения включают в себя олигонуклеотиды, модулирующие экспрессию и/или функцию EPO и ассоциированных с ним молекул.
ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
ДНК-РНК- и РНК-РНК-гибридизация важны для многих аспектов функционирования нуклеиновых кислот, включая репликацию, транскрипцию и трансляцию ДНК. Гибридизация является также центральным процессом для множества технологий, в которых производится либо детектирование конкретной нуклеиновой кислоты, либо изменение ее экспрессии. Антисмысловые нуклеотиды, например, прерывают экспрессию гена путем гибридизации с РНК-мишенью, мешая таким образом сплайсингу, транскрипции, трансляции и репликации РНК. Антисмысловая ДНК имеет еще и то дополнительное свойство, что ДНК-РНК-гибриды служат в качестве субстрата для расщепления под действием рибонуклеазы H - активность, которая имеет место в большинстве типов клеток. Антисмысловые молекулы могут быть доставлены в клетки, как это происходит в случае олигодезоксинуклеотидов (ODN), или же они могут быть экспрессированы на основе эндогенных генов, таких как молекулы РНК. В настоящее время комиссией FDA принято антисмысловое лекарственное средство, VITRAVENE(TM) (для лечения цитомегаловирусного ретинита), что свидетельствует о терапевтической применимости антисмысловых средств.
Повышенная продукция эритроцитов, опосредованная гормоном эритропоэтином (EPO), является хорошо известным адаптивным ответом человека на гипоксию (Bunn et al. (1996), Physiological Rev. 76, 839-845). Обычно продуцируемый почками взрослого человека и эмбриональной печенью, EPO стимулирует развитие в костном мозге предшественников эритроцитов, экспрессирующих рецептор EPO (EpoR).
EPO является гликопротеиновым гормоном (46 кДа), продуцируемым внутри почек почечными интерстициальными клетками, которые регулируют продукцию эритроцитов в костном мозге. Указанные клетки чувствительны к низкой концентрации артериального кислорода и при низких уровнях кислорода (гипоксия) выделяют эритропоэтин. Эритропоэтин стимулирует костный мозг к продуцированию большего количества эритроцитов, повышая таким образом способность переноса кислорода кровью. EPO осуществляет свое действие путем связывания с EpoR на поверхности предшественников эритроцитов в костном мозге. Однако экспрессия EPO обнаружена и на других клетках из других нормальных тканей, помимо почечных интерстициальных клеток, включая энтероциты, трофобласты и нейроны.
Измерение уровня EPO в кровотоке может способствовать выявлению расстройств костного мозга или почечного заболевания. Нормальные уровни эритропоэтина составляют от 0 до 19 мЕд./мл (миллиединиц на миллилитр). Повышенные уровни могут наблюдаться при истинной стойкой красной полицитемии, состоянии, характеризующемся увеличением селезенки и повышенной продукцией эритроцитов костным мозгом. Значения ниже нормальных являются показателем хронической почечной недостаточности, ведущей к анемии. Хроническая почечная недостаточность приводит к анемии отчасти в силу прогрессирующего отсутствия адекватной продукции EPO, необходимой для поддержания эритропоэза.
Гипоксия является доминирующим признаком солидных опухолей, охватывающим приблизительно девяносто процентов всех злокачественных опухолей человека. Адаптивные ответы на гипоксию при солидных опухолях коррелировали с повышенной агрессивностью, с пониженной степенью гибели опухолевых клеток и пониженной реакцией опухоли как на действие радиации, так и на химиотерапевтическое воздействие. Экспрессия EPO наблюдалась при различных гематопоэтических и негематопоэтических злокачественных новообразованиях, и, как было показано, этим был опосредован автономный рост клеток эритроцитарной лейкемии, экспрессирующих EpoR.
Многие распространенные виды злокачественных опухолей человека в повышенных количествах экспрессируют индуцируемый гипоксией фактор транскрипции, HIF-1, который регулирует экспрессию EPO, а также и нескольких генов, необходимых для повышения выживаемости клеток злокачественной опухоли в условиях гипоксии, включая гены, кодирующие гликолитические ферменты, переносчики глюкозы и фактор роста сосудистого эндотелия (Semenza (1999) Ann. Rev. Cell. Dev. Biol. 15, 551-578). Опухолевая гипоксия признана основным фактором в резистентности опухолей к химиотерапии и радиационной терапии, хотя и лежащие в основе этого механизмы неизвестны. Гипоксия индуцирует адаптивные ответы в клетках в большей степени за счет активации экспрессии нескольких генов под регуляторным воздействием индуцируемого гипоксией фактора транскрипции-1 (HIF-1), гетеродимерного фактора транскрипции, состоящего из субъединиц HIF-1α и HIF-1β.
РАСКРЫТИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее раскрытие представлено с целью резюмирования данного изобретения, с кратким указанием природы и предмета изобретения. Оно представлено с расчетом на понимание, что его не следует использовать для интерпретации или ограничения объема защиты изобретения или содержания формулы изобретения.
В одном из воплощений настоящего изобретения предложены способы ингибирования действия природного антисмыслового транскрипта путем применения антисмыслового олигонуклеотида (олигонуклеотидов), нацеленного на любую область природного антисмыслового транскрипта, что приводит к повышенной регуляции соответствующего смыслового гена. Здесь также предполагается, что ингибирование природного антисмыслового транскрипта может быть достигнуто посредством siРНК, рибозимов и малых молекул, которые считаются входящими в объем защиты настоящего изобретения.
Одно из воплощений связано со способом модуляции функции и/или экспрессии полинуклеотида EPO или другого продукта гена в клетках или тканях пациентов in vivo или in vitro, предусматривающим приведение указанных клеток или тканей в контакт по меньшей мере с одним антисмысловым олигонуклеотидом, насчитывающим от 5 до 30 нуклеотидов в длину, при этом указанный олигонуклеотид по меньшей мере на 50% идентичен последовательности обратного комплемента полинуклеотида, содержащего от 5 до 30 следующих друг за другом нуклеотидов от 1 до 156 в последовательности SEQ ID NO:2 (фигура 3), таким образом модулируя функцию и/или экспрессию полинуклеотида EPO в клетках или тканях пациента in vivo или in vitro.
В другом предпочтительном воплощении олигонуклеотид нацелен на природную антисмысловую последовательность полинуклеотидов EPO, например, нуклеотидов, указанных в последовательности SEQ ID NO:2, и любых их вариантов, аллелей, гомологов, мутантов, производных, фрагментов, и на комплементарные им последовательности. Примеры антисмысловых олигонуклеотидов приведены в последовательностях SEQ ID NO: 3-5 (фигура 4).
Другое воплощение связано со способом модуляции функции и/или экспрессии полинуклеотида EPO в клетках или тканях пациента in vivo или in vitro, предусматривающим приведение указанных клеток или тканей в контакт по меньшей мере с одним антисмысловым олигонуклеотидом, насчитывающим от 5 до 30 нуклеотидов в длину, при этом указанный олигонуклеотид по меньшей мере на 50% идентичен последовательности обратного комплемента антисмыслового полинуклеотида EPO; и таким образом модулирующим функцию и/или экспрессию полинуклеотида EPO в клетках или тканях пациента in vivo или in vitro.
Другое воплощение связано со способом модуляции функции и/или экспрессии полинуклеотида EPO в клетках или тканях пациента in vivo или in vitro, предусматривающим приведение указанных клеток или тканей в контакт с антисмысловым олигонуклеотидом, насчитывающим от 5 до 30 нуклеотидов в длину, при этом указанный олигонуклеотид по меньшей мере на 50% идентичен последовательности антисмыслового полинуклеотида EPO; и таким образом модулирующим функцию и/или экспрессию полинуклеотида EPO в клетках или тканях пациента in vivo или in vitro.
В предпочтительном воплощении композиция содержит один или более антисмысловых полинуклеотидов, которые связываются со смысловыми и/или антисмысловыми полинуклеотидами EPO.
В другом предпочтительном воплощении олигонуклеотиды содержат один или более модифицированных или замещенных нуклеотидов.
В другом предпочтительном воплощении олигонуклеотиды содержат одну или более модифицированных связей.
Еще в одном предпочтительном воплощении модифицированные нуклеотиды содержат модифицированные основания, содержащие фосфоротиоат, метилфосфонат, пептид-нуклеиновую кислоту, 2’-O-метил, фторо- или углерод, метилен или другие закрытые молекулы нуклеиновой кислоты (LNA). Предпочтительно, чтобы модифицированные нуклеотиды были закрытыми молекулами нуклеиновой кислоты, включая α-L-LNA.
В другом предпочтительном воплощении олигонуклеотиды вводят пациенту подкожно, внутримышечно, внутривенно или внутрибрюшинно.
В другом предпочтительном воплощении олигонуклеотиды вводят в составе фармацевтической композиции. Схема лечения включает в себя введение пациенту антисмысловых соединений по меньшей мере однократно, однако такое лечение может быть модифицировано, с тем, чтобы со временем оно включало в себя введение многократных доз. Такое лечение можно комбинировать с одним или несколькими другими видами терапии.
В другом предпочтительном воплощении олигонуклеотиды инкапсулированы в липосомы или прикреплены к молекуле-носителю (например, холестерину, пептиду TAT).
Другое воплощение связано со способом модуляции функции и/или экспрессии эритропоэтинового (EPO) полинуклеотида в клетках или тканях пациента in vivo или in vitro, предусматривающим приведение указанных клеток или тканей в контакт по меньшей мере с одним антисмысловым олигонуклеотидом, насчитывающим от 5 до 30 нуклеотидов в длину, при этом указанный олигонуклеотид по меньшей мере на 50% идентичен последовательности антисмыслового олигонуклеотида по отношению к эритропоэтиновому (EPO) полинуклеотиду; и таким образом модулирующим функцию и/или экспрессию эритропоэтинового (EPO) полинуклеотида в клетках или тканях пациента in vivo или in vitro.
Другое воплощение связано со способом модуляции функции и/или экспрессии эритропоэтинового (EPO) полинуклеотида в клетках или тканях пациента in vivo или in vitro, предусматривающим приведение указанных клеток или тканей в контакт по меньшей мере с одним антисмысловым олигонуклеотидом, который нацелен на область природного антисмыслового олигонуклеотида эритропоэтинового (EPO) полинуклеотида; и таким образом модулирующим функцию и/или экспрессию эритропоэтинового (EPO) полинуклеотида в клетках или тканях пациента in vivo или in vitro.
В одном из воплощений экспрессия и/или функция эритропоэтина (EPO) in vivo или in vitro повышена по сравнению с контролем.
В другом воплощении по меньшей мере один антисмысловой олигонуклеотид нацелен на природную антисмысловую последовательность олигонуклеотида эритропоэтинового (EPO) полинуклеотида.
В другом воплощении по меньшей мере один антисмысловой олигонуклеотид нацелен на последовательность нуклеиновой кислоты, содержащую кодирующую и/или некодирующую последовательности нуклеиновой кислоты эритропоэтинового (EPO) полинуклеотида.
В другом воплощении по меньшей мере один антисмысловой олигонуклеотид нацелен на перекрывающиеся и/или неперекрывающиеся последовательности эритропоэтинового (EPO) полинуклеотида.
В одном из воплощений по меньшей мере один антисмысловой олигонуклеотид содержит одну или несколько модификаций, выбранных из следующего: по меньшей мере одного модифицированного сахарного фрагмента, по меньшей мере одной модифицированной межнуклеозидной связи, по меньшей мере одного модифицированного нуклеотида, а также их сочетаний.
В связанном с этим воплощении одна или несколько модификаций включают в себя по меньшей мере один модифицированный сахарный фрагмент, выбранный из следующего: 2’-O-метоксиэтил-модифицированного сахарного фрагмента, 2’- метокси-модифицированного сахарного фрагмента, 2’-O-алкил-модифицированного сахарного фрагмента, бициклического сахарного фрагмента и их сочетаний.
В другом относящемся к этому воплощении одна или несколько модификаций включают в себя по меньшей мере одну модифицированную межнуклеозидную связь, выбранную из следующего: фосфоротиоата, 2’-O-метоксиэтила (МОЭ), 2’-фторо, алкилфосфоната, фосфородитиоата, алкилфосфонотиоата, фосфорамидата, карбамата, карбоната, сложного фосфатного триэфира, ацетамидата, сложного карбоксиметилового эфира и их сочетаний.
В другом относящемся к этому воплощении одна или несколько модификаций включают в себя по меньшей мере один модифицированный нуклеотид, выбранный из следующего: пептид-нуклеиновой кислоты (PNA), закрытой нуклеиновой кислоты (LNA), арабино-нуклеиновой кислоты (FANA), их аналогов, производных и их сочетаний.
В другом воплощении по меньшей мере один олигонуклеотид содержит по меньшей мере одну олигонуклеотидную последовательность, представленную в виде последовательностей SEQ ID NO: 3-5.
Другое воплощение связано со способом модуляции функции и/или экспрессии эритропоэтинового (EPO) гена в клетках или тканях млекопитающего in vivo или in vitro, предусматривающим приведение указанных клеток или тканей в контакт по меньшей мере с одним олигонуклеотидом короткой интерферирующей РНК (siРНК) длиной в 5-30 нуклеотидов, где последовательность указанного по меньшей мере одного олигонуклеотида siРНК по меньшей мере на 50% идентична комплементарной последовательности по меньшей мере приблизительно пяти следующих друг за другом нуклеотидов антисмысловой и/или смысловой молекулы нуклеиновой кислоты эритропоэтинового (EPO) полинуклеотида; и модуляцию экспрессии и/или функции гена эритропоэтина (EPO) в клетках или тканях млекопитающего in vivo или in vitro.
В одном из воплощений последовательность указанного олигонуклеотида по меньшей мере на 80% идентична последовательности по меньшей мере приблизительно пяти смежным нуклеиновым кислотам, которые комплементарны антисмысловой и/или смысловой молекуле нуклеиновой кислоты эритропоэтинового (EPO) полинуклеотида.
Другое воплощение связано со способом модуляции экспрессии и/или функции эритропоэтинового (EPO) гена в клетках или тканях млекопитающего in vivo или in vitro, предусматривающим приведение указанных клеток или тканей в контакт по меньшей мере с одним антисмысловым олигонуклеотидом длиной приблизительно в 5 - 30 нуклеотидов, специфичных в отношении некодирующей и/или кодирующей последовательностей смысловой и/или природной антисмысловой цепи полинуклеотида, кодирующего молекулу эритропоэтина (EPO), при этом последовательность по меньшей мере одного антисмыслового олигонуклеотида по меньшей мере на 50% идентична по меньшей мере одной последовательности нуклеиновой кислоты, представленной в виде последовательностей SEQ ID NO:1 и 2; и модуляцию экспрессии и/или функции гена эритропоэтина (EPO) в клетках или тканях млекопитающего in vivo или in vitro.
Другое воплощение настоящего изобретения связано с синтетическим, модифицированным олигонуклеотидом, содержащим по меньшей мере одну модификацию, причем по меньшей мере одна модификация выбрана из следующего: по меньшей мере одного модифицированного сахарного фрагмента; по меньшей мере одной модифицированной межнуклеотидной связи; по меньшей мере одного модифицированного нуклеотида; и их сочетаний; при этом указанный олигонуклеотид является антисмысловым соединением, которое гибридизуется с геном эритропоэтина (EPO) и модулирует экспрессию и/или функцию гена эритропоэтина (EPO) in vivo или in vitro по сравнению с нормальным контролем.
В одном из воплощений по меньшей мере одна модификация содержит по меньшей мере одну межнуклеотидную связь, выбранную из группы, состоящей из следующего: фосфоротиоата, алкилфосфоната, фосфородитиоата, алкилфосфонотиоата, фосфорамидата, карбамата, карбоната, сложного фосфатного триэфира, ацетамидата, сложного карбоксиметилового эфира и их сочетаний.
В другом воплощении указанный олигонуклеотид содержит по меньшей мере одну межнуклеотидную фосфоротиоатную связь.
В связанном с этим воплощении указанный олигонуклеотид содержит остов межнуклеотидных фосфоротиоатных связей.
В одном из воплощений указанный олигонуклеотид содержит по меньшей мере один модифицированный нуклеотид, выбранный из следующего: пептид-нуклеиновой кислоты, закрытой нуклеиновой кислоты (LNA), их аналога, производного, а также их сочетаний.
В другом воплощении указанный олигонуклеотид содержит модифицированный сахарный фрагмент, выбранный из следующего: 2’-O-метоксиэтил-модифицированного сахарного фрагмента, 2’- метокси-модифицированного сахарного фрагмента, 2’-O-алкил-модифицированного сахарного фрагмента, бициклического сахарного фрагмента и их сочетаний.
В другом воплощении указанный олигонуклеотид составляет в длину по меньшей мере приблизительно от 5 до 30 нуклеотидов и гибридизуется с антисмысловой и/или смысловой цепью эритропоэтинового (EPO) полинуклеотида, и при этом указанное антисмысловое соединение имеет последовательность, по меньшей мере приблизительно на 20% идентичную комплементарной последовательности по меньшей мере приблизительно пяти смежных нуклеиновых кислот антисмысловой и/или смысловой последовательности нуклеиновой кислоты эритропоэтинового (EPO) полинуклеотида.
В другом воплощении указанный олигонуклеотид имеет последовательность, по меньшей мере приблизительно на 80% идентичную комплементарной последовательности по меньшей мере приблизительно пяти смежным нуклеиновых кислот антисмысловой и/или смысловой кодирующей и/или некодирующей последовательностям эритропоэтинового (EPO) полинуклеотида.
В другом воплощении указанный олигонуклеотид гибридизуется с эритропоэтиновым (EPO) полинуклеотидом и модулирует экспрессию и/или функцию по меньшей мере одного эритропоэтинового (EPO) полинуклеотида in vivo или in vitro, по сравнению с нормальным контролем.
В связанном с этим воплощении указанный олигонуклеотид содержит одну из последовательностей, представленных в виде SEQ ID NO: 3-5.
Одно из воплощений настоящего изобретения связано с композицией, содержащей один или несколько олигонуклеотидов, специфичных в отношении одного или более эритропоэтиновых (EPO) полинуклеотидов, причем указанные полинуклеотиды содержат антисмысловые последовательности, комплементарные последовательности, аллели, гомологи, изоформы, варианты, производные, мутанты, фрагменты или их сочетания.
В связанном с этим воплощении указанные олигонуклеотиды имеют последовательности, по меньшей мере приблизительно на 40% идентичные любой из нуклеотидных последовательностей, представленных в виде SEQ ID NO: 3-5.
В определенном воплощении указанные олигонуклеотиды содержат любую из нуклеотидных последовательностей, представленных в виде SEQ ID NO: 3-5.
В одном из воплощений указанные олигонуклеотиды, представленные в виде SEQ ID NO: 3-5, содержат одну или несколько модификаций или нуклеотидных замен.
В другом воплощении одна или несколько модификаций или нуклеотидных замен выбраны из следующего: фосфоротиоата, метилфосфоната, пептид-нуклеиновой кислоты, молекул закрытой нуклеиновой кислоты (LNA) и их сочетаний.
Одно из воплощений настоящего изобретения связано со способом профилактики или лечения заболевания или расстройства, ассоциированного по меньшей мере с одним эритропоэтиновым (EPO) полинуклеотидом и/или по меньшей мере с одним кодируемым им продуктом, где указанный способ предусматривает следующее:
введение пациенту терапевтически эффективной дозы по меньшей мере одного антисмыслового олигонуклеотида, который связывается с природной антисмысловой последовательностью указанного по меньшей мере одного эритропоэтинового (EPO) полинуклеотида и модулирует экспрессию указанного по меньшей мере одного эритропоэтинового (EPO) полинуклеотида; в результате чего осуществляется профилактика или лечение заболевания или расстройства, ассоциированного по меньшей мере с одним эритропоэтиновым (EPO) полинуклеотидом и/или по меньшей мере с одним кодируемым им продуктом.
В одном из воплощений заболевание или расстройство, ассоциированное по меньшей мере с одним эритропоэтиновым (EPO) полинуклеотидом, выбрано из следующего: заболевания, расстройства или состояния гематологического нарушения, заболевания крови, характеризующегося низкой или дефективной продукцией эритроцитов, анемии, серповидноклеточной анемии, бета-талассемии, аномального эритропоэза, беременности или нарушения менструального цикла, ранней анемии недоношенных, почечной недостаточности, хронической почечной недостаточности, гипертонии, заболевания или расстройства, ассоциированного с хирургическим вмешательством, заболевания или расстройства у педиатрического пациента при диализе, заболевания или состояния, ассоциированного с низким гематокритным числом, СПИДа, расстройства, связанного с химиотерапевтическими воздействиями, кистозного фиброза, злокачественной опухоли или опухоли, инфекционного заболевания, венерического заболевания, иммунологически зависимого заболевания и/или аутоиммунного заболевания или расстройства, сердечно-сосудистого заболевания, например, инсульта, гипотонии, задержки сердечных сокращений, ишемии, в частности, ишемически-реперфузионного повреждения, инфаркта миокарда, такого как острый инфаркт миокарда, хронической сердечной недостаточности, стенокардии, гипертрофии сердца, заболевания сердца и легких, искусственного кровообращения, респираторного заболевания, почечного заболевания, заболевания мочевого пузыря/репродуктивной системы, эндокринных расстройств/расстройств метаболизма, желудочно-кишечного заболевания, болезни центральной нервной системы (ЦНС) или периферической нервной системы, при которой прежде всего имеют место неврологические или психиатрические симптомы, связанной с возрастом потери когнитивной функции, детского церебрального паралича, нейродегенертивного заболевания, болезни Альцгеймера, болезни Паркинсона, болезни Ли, деменции, потери памяти, амиотрофического бокового склероза, алкоголизма, расстройства настроения, тревожного расстройства, болезни дефицита внимания, гиперактивности, аутизма, шизофрении, депрессии, травмы или ишемии головного или спинного мозга, болезни Крейтцфельда-Якоба, офтальмологических заболеваний, эпилепсии, множественного склероза, воспаления, радиационного поражения, дегенерации желтого пятна, диабетической нейропатии, диабетической ретинопатии, глаукомы, ишемии сетчатки и травмы сетчатки, повреждения спинного мозга, состояния в связи с космическим полетом, острой потери крови, старения и состояний при неопластических заболеваниях.
Одно из воплощений настоящего изобретения связано со способом идентификации и селекции по меньшей мере одного олигонуклеотида для введения in vivo, предусматривающим выбор полинуклеотида-мишени, ассоциированного с состоянием болезни; идентификацию олигонуклеотидов, содержащих по меньшей мере пять смежных нуклеотидов, которые комплементарны, в смысловой или в антисмысловой ориентации, выбранному полинуклеотиду-мишени; и измерение температурной точки плавления гибрида антисмыслового олигонуклеотида и полинуклеотида-мишени при жестких условиях гибридизации; и, на основе полученной информации, выбор по меньшей мере одного олигонуклеотида для введения in vivo.
Другие аспекты описаны ниже.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА
Фигура 1 представляет собой графические результаты ПЦР в режиме реального времени, показывающие кратность различий уровней мРНК EPO после обработки клеток HepG2 фосфоротиоатными олигонуклеотидами, вводимыми с помощью полифектамина-2000, по сравнению с контролем. Результаты ПЦР в режиме реального времени показывают, что уровни мРНК EPO в клетках HepG2 значительно увеличиваются через 48 ч. после обработки двумя из siРНК, обозначаемыми как epoas (epoas_1, P=0,02, и epoas_2, P=0,04, Фиг. 1A). В тех же самых примерах уровни РНК epoas были значительно уменьшены после обработки siРНК к epoas (Фиг. 1B). Столбцы, обозначенные как epoas_1, epoas_2, epoas_3, соответствуют образцам, обработанным, соответственно, последовательностями SEQ ID NO. 3, 4 и 5.
На фигуре 2 приведена последовательность SEQ ID NO: 1: мРНК эритропоэтина (EPO), Homo sapiens (Номер доступа в NCBI No.: NM_000799.2), и последовательность SEQ ID NO: 1a означает геномную последовательность EPO (экзоны показаны заглавными буквами, а интроны маленькими).
На фигуре 3 приведена последовательность SEQ ID NO:2: природная антисмысловая последовательность EPO-AS (Номер доступа в NCBI No.: AW798641.1).
На фигуре 4 приведены антисмысловые олигонуклеотиды, SEQ ID NO: 3-5. «r» означает РНК.
На фигуре 5 приведены смысловые олигонуклеотиды, SEQ ID NO:6-8. «r» означает РНК. Это обратные комплементы последовательностей SEQ ID NO: 3-5.
На фигуре 6 показан прямой праймер (SEQ ID NO: 9), обратный праймер (SEQ ID NO: 10) и репортерная последовательность (SEQ ID NO: 11) для специальных анализов, разработанных компанией Applied Biosystems Taqman Gene Expression Assay (Hs00171267_ml).
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Ниже описано несколько аспектов настоящего изобретения, со ссылкой на примеры его приложений, приведенные для иллюстрации. Следует понимать, что многочисленные специфические подробности, взаимосвязи и методы приведены для более полного понимания изобретения. Однако рядовому специалисту в данной области будет очевидно, что настоящее изобретение может быть реализовано без какой-либо одной или нескольких из специфических подробностей, или же другими способами. Настоящее изобретение не ограничено порядком действий или процессов, поскольку некоторые действия могут быть выполнены в различном порядке и/или одновременно с другими действиями или процессами. Более того, не все проиллюстрированные действия или процессы являются необходимыми для осуществления методологии согласно настоящему изобретению.
Подразумевается, что все описанные здесь гены, названия генов и продукты генов соответствуют гомологам из любого биологического вида, к которому применимы описанные здесь композиции и способы. Таким образом, указанные термины включают в себя, но не ограничены генами и генными продуктами, полученными из организмов человека и мыши. Подразумевается, что если описан ген или генный продукт из конкретного вида, такое описание предусмотрено только в качестве примера и ни в коем случае не должно быть расценено как ограничение изобретения, если в контексте специально не оговорено иначе. Таким образом, например, в случае описанных здесь генов, которые в некоторых воплощениях связаны с последовательностями нуклеиновых кислот и аминокислотными последовательностями млекопитающих, подразумевается, что они охватывают гомологичные и/или ортологичные генные продукты и продукты генов из других животных, включая рыб, амфибий, рептилий и птиц, и не ограничиваясь остальными млекопитающими. В предпочтительных воплощениях указанные гены или последовательности нуклеиновых кислот относятся к человеку.
Определения
Используемая здесь терминология предназначена лишь для описания конкретных воплощений, а не для ограничения настоящего изобретения. Подразумевается, что использование формы единственного числа включает в себя также и форму множественного числа, если в контексте специально не оговорено иначе. Кроме того, в случае, если термины "включающий" "включает", "имеющий", "имеет" или их варианты используются в подробном описании и/или в формуле изобретения, подразумевается, что такие термины используются в значении "содержащий".
Термин "примерно" или "приблизительно" означает в рамках приемлемого разброса ошибки для конкретной величины, что определяется специалистом в данной области и что отчасти будет зависеть от того, как указанная конкретная величина измеряется или определяется, то есть имеются в виду ограничения измерительной системы. Например, "примерно" может означать в пределах 1 или более чем 1 стандартное отклонение, в соответствии с практикой, принятой в данной области. Альтернативно, "примерно" может означать область вплоть до 20%, предпочтительно, вплоть до 10%, более предпочтительно, вплоть до 5%, и наиболее предпочтительно, вплоть до 1% от данной величины. Альтернативно, в частности, в отношении биологических систем или процессов, указанный термин может означать в пределах порядка величин, предпочтительно, в пределах 5-кратной, и более предпочтительно, в пределах 2-кратной величины. При употреблении конкретных величин в настоящей заявке и в формуле изобретения, если специально не указано иное, должно подразумеваться, что термин "примерно" означает в пределах приемлемого разброса ошибки для конкретной величины.
Используемый здесь термин "мРНК" означает известный в настоящее время мРНК-транскрипт(транскрипты) гена-мишени, а также любые дополнительные транскрипты, которые могут быть выявлены.
Под "антисмысловыми олигонуклеотидами" или "антисмысловым соединением" подразумевается молекула РНК или ДНК, которая связывается с другой РНК или ДНК (РНК-мишень, ДНК-мишень). Например, если это олигонуклеотид РНК, он связывается с другой РНК-мишенью путем РНК-РНК-взаимодействий и изменяет активность РНК-мишени (Eguchi et al, (1991) Ann. Rev. Biochem. 60, 631-652). Антисмысловой олигонуклеотид может усиливать или ослаблять экспрессию и/или функцию конкретного полинуклеотида. Данное определение означает включение любой чужеродной молекулы РНК или ДНК, которая используется с терапевтической, диагностической или других точек зрения. Такие молекулы включают в себя, например, антисмысловые молекулы РНК или ДНК, РНК-интерференцию (РНКi), микро-РНК, молекулы РНК-ловушек, siРНК, энзиматическую РНК, терапевтическую корректирующую РНК и агонистическую РНК и антагонистическую РНК, антисмысловые олигомерные соединения, антисмысловые олигонуклеотиды, олигонуклеотиды внешней вспомогательной последовательности (EGS, external guide sequence), альтернативные сплайсеры, праймеры, зонды и другие олигомерные соединения, которые гибридизуются по меньшей мере с частью нуклеиновой кислоты-мишени. Как таковые, указанные соединения могут быть введены в виде одноцепочечных, двухцепочечных, частично одноцепочечных или кольцевых олигомерных соединений.
В контексте настоящего изобретения термин "олигонуклеотид" относится к олигомеру или полимеру рибонуклеиновой кислоты (РНК) или дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) или их миметикам. Термин "олигонуклеотид" включает в себя также линейные или кольцевые олигомеры природных и/или модифицированных мономеров или сочленений, включая дезоксирибонуклеозиды, рибонуклеозиды, их замещенные и альфа-аномерные формы, пептид-нуклеиновые кислоты (PNA), закрытые нуклеиновые кислоты (LNA), фосфоротиоат, метилфосфонат и т.п. Олигонуклеотиды способны к специфическому связыванию с полинуклеотидом-мишенью по регулярной схеме взаимодействий мономера с мономером, такой, какая имеет место при спаривании оснований Уотсона-Крика, спаривании хугстеновских и обратных хугстеновских пар оснований или прочего.
Олигонуклеотид может быть "химерным", то есть состоящим из разных областей. В контексте настоящего изобретения "химерные" соединения являются олигонуклеотидами, которые содержат две или более химических областей, например, область(области) ДНК, область(области) РНК, область(области) PNA и т.д. Каждая химическая область составлена по меньшей мере одной мономерной единицей, то есть нуклеотидом в случае олигонуклеотидного соединения. Такие олигонуклеотиды обычно содержат по меньшей мере одну область, в которой указанный олигонуклеотид модифицирован, с тем, чтобы он проявлял одно или более желательных свойств. Желательные свойства олигонуклеотида включают в себя, не ограничиваясь перечисленным, например, повышенную резистентность к деградации под действием нуклеаз, повышенное поглощение клетками и/или повышенную аффинность связывания с нуклеиновой кислотой-мишенью. Разные области олигонуклеотида могут, следовательно, обладать различными свойствами. Химерные олигонуклеотиды согласно настоящему изобретению, как описано выше, могут быть организованы в виде смешанных структур из двух или более олигонуклеотидов, модифицированных олигонуклеотидов, олигонуклеозидов и/или олигонуклеотидных аналогов.
Олигонуклеотид может состоять из областей, которые могут быть связаны в "регистр", то есть когда указанные мономеры связаны последовательно, как в нативной ДНК, или связаны посредством спейсеров. Подразумевается, что спейсеры образуют ковалентный "мостик" между указанными областями и в предпочтительных случаях имеет длину, не превышающую приблизительно 100 атомов углерода. Такие спейсеры могут быть наделены различными функциями, например, они могут нести положительный или отрицательный заряд, могут обладать специфическими свойствами связывания нуклеиновой кислоты (интеркаляторы, вещества, связывающиеся с канавкой, токсины, флюорофоры и т.д.), будучи липофильными, индуцировать образование специальных вторичных структур, например, наподобие аланин-содержащих пептидов, которые индуцируют образование альфа-спиралей.
Здесь термины "EPO" и "эритропоэтин" включают в себя все члены семейства, мутанты, аллели, фрагменты, виды, кодирующие и некодирующие последовательности, смысловые и антисмысловые полинуклеотидные цепи и т.д.
Здесь, в настоящей заявке, слова эритропоэтин, эпоэтин, EPO и hEPO (человеческий эритропоэтин) используются в качестве взаимозаменяемых понятий.
Здесь термин "олигонуклеотид, специфичный в отношении..." или "олигонуклеотид, который нацелен...", относится к олигонуклеотиду, имеющему последовательность, (i) способную к образованию стабильного комплекса с частью гена-мишени, или (ii) способную к образованию стабильного дуплекса с частью мРНК-транскрипта гена-мишени. Стабильность комплексов и дуплексов может быть определена путем теоретических расчетов и/или в результате анализов in vitro. Примеры анализов для определения стабильности гибридизации комплексов и дуплексов описаны ниже в Примерах.
Здесь термин "нуклеиновая кислота-мишень" включает в себя ДНК, РНК (включая пре-мРНК и мРНК), транскрибируемые с такой ДНК, а также кДНК, полученную с такой РНК, кодирующие, некодирующие последовательности, смысловые или антисмысловые полинуклеотиды. Специфическая гибридизация олигомерного соединения с его нуклеиновой кислотой-мишенью препятствует нормальному функционированию нуклеиновой кислоты. Такая модуляция функции нуклеиновой кислоты-мишени соединениями, которые специфически с ней гибридизуются, обычно называется "антисмысловой". Такие функции ДНК, которым можно препятствовать, включают в себя, например, репликацию и транскрипцию. Функции РНК, которым можно препятствовать, включают в себя все жизненные функции, такие, например, как транслокация РНК к месту трансляции белков, трансляцию белка с РНК, сплайсинг РНК, с получением одного или более видов мРНК, а также каталитическую активность, которая может быть блокирована или облегчена посредством РНК. Совокупным эффектом такой интерференции функции нуклеиновой кислоты-мишени является модуляция экспрессии кодируемого продукта или олигонуклеотидов.
Интерференция РНК, "РНКi", опосредована двухцепочечными молекулами РНК (дцРНК), которые имеют специфическую гомологию последовательностей с последовательностями своих нуклеиновых кислот-"мишеней" (Caplen, N. J., et al. (2001) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98: 9742-9747). В определенных воплощениях настоящего изобретения такими медиаторами являются "малые интерферирующие" РНК-дуплексы из 5-25 нуклеотидов (siРНК). siРНК получены в результате процессинга siРНК под действием фермента РНКазы, известного как «Dicer» (Bernstein, E., et al. (2001) Nature 409: 363-366). siРНК-дуплексные продукты собираются в мультибелковый комплекс siРНК, называемый RISC (RNA Induced Silencing Complex). Чтобы не связывать себя какой-либо конкретной теорией, будем считать, что RISC сориентирован на нуклеиновую кислоту-мишень (соответствующую мРНК), где siРНК-дуплекс взаимодействует специальным образом, обусловленным специфичностью последовательности, опосредуя каталитическое расщепление (Bernstein, E., et al. (2001) Nature 409: 363-366; Boutla, A., et al. (2001) Curr. Biol. 11: 1776-1780). Малые интерферирующие РНК, которые можно использовать в соответствии с настоящим изобретением, могут быть синтезированы и использованы соглано методикам, которые хорошо известны в данной области и которые знакомы рядовым специалистам. Малые интерферирующие РНК для применения в способах согласно изобретению, соответственно, содержат приблизительно от 1 примерно до 50 нуклеотидов (нтд.). В примерах неограничивающих воплощений siРНК могут содержать приблизительно от 5 примерно до 40 нтд., приблизительно от 5 примерно до 30 нтд., приблизительно от 10 примерно до 30 нтд., приблизительно от 15 примерно до 25 нтд., приблизительно 20-25 нуклеотидов.
Выбор подходящих олигонуклеотидов облегчается применением компьютерных программ, которые автоматически выравнивают последовательности нуклеиновых кислот и выделяют области идентичности или гомологии. Такие программы используются для сравнения последовательностей нуклеиновых кислот, полученных, например, в результате поиска в базах данных, таких как GenBank, или путем секвенирования продуктов ПЦР. Сравнение последовательностей нуклеиновых кислот из совокупности видов позволяет отобрать последовательности нуклеиновых кислот, в которых обнаруживается подходящая степень идентичности между видами. В случае генов, которые еще не секвенированы, для определения степени идентичности между генами искомых видов и других видов предпринимают саузерн-блоттинг. Предпринимая саузерн-блоттинг в условиях разной жесткости, можно получить, как это хорошо известно в данной области, приблизительную степень идентичности. Указанные процедуры позволяют выбрать олигонуклеотиды, которые проявляют высокую степень комплементарности в отношении последовательностей нуклеиновых кислот-мишеней у субъекта, который нуждается в осуществлении контроля, и низкую степень комплементарности в отношении соответствующих последовательностей нуклеиновых кислот у других видов. Специалисту должно быть очевидно, что есть определенная свобода в выборе соответствующих областей генов для применения в настоящем изобретении.
Под "ферментативной РНК" подразумевается молекула РНК с ферментативной активностью (Cech, (1988) J. American. Med. Assoc. 260, 3030-3035). Ферментативные нуклеиновые кислоты (рибозимы) действуют прежде всего путем связывания с РНК-мишенью. Такое связывание происходит на участке-мишени для связывания ферментативной нуклеиновой кислоты, которая удерживается в непосредственной близости от ферментативной части молекулы, которая действует, расщепляя РНК-мишень. Таким образом, ферментативная нуклеиновая кислота прежде всего распознает, а потом связывается с РНК-мишенью путем спаривания оснований, и при образовании связей с правильным участком проявляет свое энзиматическое действие, расщепляя РНК-мишень.
Под "ловушкой РНК" подразумевается молекула РНК, которая имитирует природный домен для связывания лиганда. Следовательно, ловушка РНК конкурирует с природной мишенью за связывание специфического лиганда. Например, показано, что повышенная экспрессия РНК в результате ее транс-активации (TAR, trans-activation response) в ответ на ВИЧ может действовать в качестве "ловушки" и эффективно связывать tat-белок ВИЧ, таким образом предотвращая связывание его с последовательностями TAR, кодирующими РНК ВИЧ (Sullenger et al. (1990) Cell, 63, 601-608). Это конкретный специфический пример. Специалистам должно быть очевидно, что это является всего лишь одним из примеров, и с использованием технологий, в целом известных в данной области, могут быть реализованы также и другие воплощения.
Здесь термин "мономеры" обычно относится к мономерам, связанным фосфодиэфирными связями, или их аналогам, образующим олигонуклеотиды, размер которых варьирует от нескольких мономерных единиц, например, приблизительно от 3-4, примерно до нескольких сотен мономерных единиц. Аналоги фосфодиэфирных связей включают в себя фосфоротиоат, фосфородитиоат, метилфосфонаты, фосфороселеноат, фосфорамидат и т.п., что более полно описано ниже.
Термин "нуклеотид" охватывает нуклеотиды, образующиеся природным образом, а также неприродным путем образующиеся нуклеотиды. Специалистам должно быть очевидно, что ряд нуклеотидов, которые первоначально считались образующимися "неприродным путем", впоследствии были обнаружены в природе. Таким образом, "нуклеотиды" включают в себя не только известные пуриновые и пиримидиновые молекулы, содержащие гетероцикл, но и их гетероциклические аналоги и таутомеры. Иллюстративными примерами других типов нуклеотидов являются молекулы, содержащие аденин, гуанин, тимин, цитозин, урацил, пурин, ксантин, диаминопурин, 8-оксо-N6-метиладенин, 7-деазаксантин, 7-деазагуанин, N4,N4-этаноцитозин, N6,N6-этано-2,6- диаминопурин, 5-метилцитозин, 5-(C3-C6)-алкинилцитозин, 5-фторурацил, 5-бромурацил, псевдоизоцитозин, 2-гидрокси-5-метил-4-триазолопиридин, изоцитозин, изогуанин, инозин и "неприродным путем образующиеся" нуклеотиды, описанные Benner с соавт., патент США № 5432272. Подразумевается, что термин "нуклеотид" охватывает каждый из приведенных примеров, также как и все эти примеры, а также их аналоги и таутомеры. Представляющими особый интерес нуклеотидами являются те из них, которые содержат гуанин, тимин, цитозин и урацил, которые считаются природным путем образующимися нуклеотидами, в связи с их терапевтическим и диагностическим применениями в отношении человека. Нуклеотиды включают в себя 2’-дезокси- и 2’-гидроксильные сахара, например, как описано у Kornberg and Baker, DNA Replication, 2nd Ed. (Freeman, San Francisco, 1992), а также их аналоги.
"Аналоги" в случае нуклеотидов включают в себя синтетические нуклеотиды, имеющие модифицрованные фрагменты оснований и/или модифицрованные сахарные фрагменты (см., например, общее описание у Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York, 1980; Freier & Altmann, (1997) Nucl. Acid. Res., 25(22), 4429-4443, Toulme, J.J., (2001) Nature Biotechnology 19: 17-18; Manoharan M., (1999) Biochemica et Biophysica Acta 1489: 117-139; Freier S. M., (1997) Nucleic Acid Research, 25: 4429-4443, Uhlman, E., (2000) Drug Discovery & Development, 3: 203-213, Herdewin P., (2000) Antisense & Nucleic Acid Drug Dev., 10: 297-310); 2’-O, 3’-C-связанные [3.2.0] бициклоарабинонуклеозиды (см., например, N. K. Christiensen., et al., (1998) J. Am. Chem. Soc., 120: 5458-5463; Prakash TP, Bhat B. (2007) Curr Top Med Chem. 7(7): 641-9; Cho EJ, et al. (2009) Annual Review of Analytical Chemistry, 2, 241-264). Такие аналоги включают в себя синтетические нуклеотиды, созданные для повышения связывающих свойств, например, стабильности дуплекса или триплекса, специфичности и т.п.
Здесь под "гибридизацией" подразумевается спаривание по существу комплементарных цепей олигомерных соединений. Один из механизмов спаривания включает в себя образование водородных связей, которое может быть образованием водородных связей по Уотсону-Крику, по Хугстену и образованием обратных хугстеновских пар между комплементарными нуклеозидами или нуклеотидными основаниями (нуклеотиды) цепей олигомерных соединений. Например, аденин и тимин являются комплементарными нуклеотидами, которые спариваются с образованием водородных связей. Гибридизация может возникать при различных обстоятельствах.
Антисмысловое соединение является "специфически гибридизующимся", если связывание этого соединения с нуклеиновой кислотой-мишенью мешает реализации нормальной функции нуклеиновой кислоты-мишени, вызывая модуляцию функции и/или активности, и если имеется существенная степень комплементарности, во избежание неспецифического связывания антисмыслового соединения с нецелевыми последовательностями нуклеиновых кислот в условиях, при которых требуется специфическое связывание, то есть при физиологических условиях в случае испытаний in vivo или терапевтического воздействия, и в условиях, при которых анализы предпринимаются in vitro.
Здесь фраза "жесткие условия гибридизации", или "жесткие условия", относится к условиям, при которых соединение согласно изобретению будет гибридизоваться со своей последовательностью-мишенью, но при этом с минимальным количеством других последовательностей. Жесткие условия являются зависимыми от конкретной последовательности и будут разными при различных обстоятельствах, и в контексте настоящего изобретения "жесткие условия", при которых олигомерные соединения гибридизуются с последовательностью-мишенью, определяются природой и составом олигомерных соединений, а также анализами, посредством которых они будут изучаться. Обычно жесткие условия гибридизации включают в себя низкие концентрации (<0,15 M) солей с неорганическими катионами, такими как Na++ или K++ (то есть низкую ионную силу), температуру выше 20°C-25°C, ниже Tm комплекса олигомерное соединение:последовательность-мишень, и присутствие денатурирующих средств, таких как формамид, диметилформамид, диметилсульфоксид, или детергента додецилсульфата натрия (ДСН). Например, каждый 1% формамида снижает степень гибридизации на 1,1%. Примером условий высокой жесткости гибридизации является 0,1X буфер хлорида и цитрата натрия (SSC)/0,1% (вес./об.) ДСН при 60°C в течение 30 минут.
Используемый здесь термин "комплементарность" относится к способности точного спаривания между двумя нуклеотидами одной или двух олигомерных цепей. Например, если основание нуклеиновой кислоты в определенном положении антисмыслового соединения способно образовывать водородную связь с основанием нуклеиновой кислоты в определенном положении нуклеиновой кислоты-мишени, будь указанная нуклеиновая кислота-мишень молекулой ДНК, РНК или олигонуклеотида, тогда положение водородной связи между данным олигонуклеотидом и нуклеиновой кислотой-мишенью считается комплементарным положением. Олигомерное соединение и молекула ДНК, РНК или олигонуклеотида являются комплементарными друг другу, если достаточное количество комплементарных положений в каждой молекуле занято нуклеотидами, которые могут образовывать друг с другом водородные связи. Таким образом, "специфически гибридизующийся" и "комплементарный" являются терминами, которые используются для обозначения достаточной степени точного спаривания или комплементарности на протяжении участка с достаточным количеством нуклеотидов, так, чтобы между олигомерным соединением и нуклеиновой кислотой-мишенью осуществлялось стабильное и специфическое связывание.
В данной области считается очевидным, что для того, чтобы осуществлялась специфическая гибридизация, последовательность олигомерного соединения необязательно должна быть на 100% комплементарна таковой ее нуклеиновой кислоты-мишени. Более того, олигонуклеотид может гибридизоваться с одним или более сегментами так, чтобы случайные или соседние сегменты не были вовлечены в процесс гибридизации (например, структура петли, некомплементарность или структура шпильки). Последовательность олигомерных соединений согласно изобретению по меньшей мере приблизительно на 70% или по меньшей мере приблизительно на 75%, или по меньшей мере приблизительно на 80%, или по меньшей мере приблизительно на 85%, или по меньшей мере приблизительно на 90%, или по меньшей мере приблизительно на 95%, или по меньшей мере приблизительно на 99% комплементарны области-мишени внутри целевой последовательности нуклеиновой кислоты, на которую они нацелены. Например, антисмысловое соединение, в котором 18 из 20 нуклеотидов антисмыслового соединения комплементарны области-мишени и, следовательно, будут с ним специфически гибридизоваться, будет иметь 90-процентную комплементарность. В данном примере оставшиеся некомплементарные нуклеотиды могут быть кластеризованы или разбросаны между комплементарными нуклеотидами и необязательно должны быть смежными между собой или с комплементарными нуклеотидами. Как таковое, антисмысловое соединение, которое составляет в длину 18 нуклеотидов и имеет 4 (четыре) некомплементарных нуклеотида, которые фланкированы двумя областями, полностью комплементарными нуклеиновой кислоте-мишени, будет в целом на 77,8% комплементарно нуклеиновой кислоте-мишени и может, таким образом, входить в объем, охватываемый настоящим изобретением. Процент комплементарности антисмыслового соединения области нуклеиновой кислоты-мишени может быть определен рутинным способом с использованием программ BLAST (основной поисковой инструмент при локальном выравнивании) и программ PowerBLAST, известных в данной области (Altschul et al., (1990) J. Mol. Biol., 215, 403-410; Zhang and Madden, (1997) Genome Res., 1, 649-656). Процент гомологии, идентичности или комплементарности последовательности может быть определен, например, с помощью программы Gap (Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 for Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, Madison Wis.), с использованием параметров по умолчанию, где используется алгоритм Смита и Ватермана (Adv. Appl. Math., (1981) 2, 482-489).
Здесь термин "температурная точка плавления (Tm)" относится к температуре, при определенной ионной силе, pH и концентрации нуклеиновой кислоты, при которой 50% олигонуклеотидов, комплементарных последовательности-мишени, при равновесии гибридизуется с последовательностью-мишенью. Как правило, жесткими условиями являются такие, при которых концентрация соли составляет по меньшей мере приблизительно от 0,01 до 1,0 M концентрации иона Na (или других солей) при pH от 7,0 до 8,3, и температура составляет по меньшей мере приблизительно 30°C для коротких олигонуклеотидов (например, от 10 до 50 нуклеотидов). Жесткие условия могут быть достигнуты также путем добавления дестабилизирующих агентов, таких как формамид.
Здесь термин "модуляция" означает либо увеличение (стимуляция), либо уменьшение (ингибирование) экспрессии гена.
Термин "вариант", при его использовании в контексте полинуклеотидной последовательности, может охватывать полинуклеотидную последовательность, связанную с геном дикого типа. Данное определение может включать в себя также, например, "аллельные", "слитые", "видовые" или "полиморфные" варианты. Слитый вариант может иметь значительную степень идентичности со ссылочной молекулой, но обычно он будет иметь большее или меньшее число полинуклеотидов в силу альтернативного сплайсинга экзонов в ходе процессинга мРНК. Соответствующий полипептид может иметь дополнительные функциональные домены, или же такие домены могут отсутствовать. Видовыми вариантами являются полинуклеотидные последовательности, которые варьируют от одного вида к другому. Особенно применимыми в настоящем изобретении являются варианты продуктов генов дикого типа. Варианты могут быть результатом по меньшей мере одной мутации в последовательности нуклеиновой кислоты и могут приводить к образованию измененных мРНК или полипептидов, структура или функции которых могут быть или могут не быть изменены. Любой конкретный природный или рекомбинантный ген может не иметь ни одной, иметь одну или много аллельных форм. Общие мутационные изменения, которые вызывают появление вариантов, обычно приписывают природным делециям, добавлениям или заменам нуклеотидов. Каждое из таких типов изменений может возникать в данной последовательности отдельно или в сочетании с другими один или более раз.
Полученные в результате полипептиды будут, как правило, иметь значительный уровень идентичности аминокислотных остатков по отношению друг к другу. Полиморфный вариант соответствует вариации в полинуклеотидной последовательности конкретного гена между индивидами данного вида. Полиморфные варианты могут также охватывать "однонуклеотидные полиморфизмы" (SNP), или мутации одного основания, при которых полинуклеотидная последовательность варьирует по одному основанию. Наличие полиморфизмов SNP может быть показательным, например, для определенной популяции с предрасположенностью к болезненному состоянию, которая является не чем иным как восприимчивостью к нему вместо резистентности.
Производные полинуклеотиды включают в себя нуклеиновые кислоты, подвергнутые химической модификации, например, замене водорода на алкил, ацил или аминогруппу. Производные, например, производные олигонуклеотиды, могут содержать неприродным образом возникшие участки, такие как измененные фрагменты сахара или связи между сахарами. Такими примерами могут служить фосфоротиоат и другие известные в данной области серосодержащие вещества. Производные нуклеиновые кислоты могут содержать также метки, включая радиоактивные нуклеотиды, ферменты, флуоресцирующие агенты, хемилюминесцентные агенты, хромогенные вещества, субстраты, кофакторы, ингибиторы, магнитные частицы и пр.
"Производным" полипептида или пептида является таковой, который модифицирован, например, путем гликозилирования, пэгилирования, фосфорилирования, сульфатации, восстановления/алкилирования, ацилирования, химического спаривания или мягкой обработки формалином. Производное может быть модифицировано также таким образом, чтобы оно, либо непосредственно, либо косвенно, содержало детектируемую метку, включая, но не ограничиваясь перечисленным, радиоактивный изотоп, флуоресцентную или ферментативную метку.
Здесь подразумевается, что термин "животное" или "пациент" включает в себя, например, людей, овец, лосей, оленей, чернохвостого оленя, норку, млекопитающих, обезьян, лошадей, крупный рогатый скот, свиней, коз, собак, кошек, крыс, мышей, птиц, цыплят, рептилий, рыб, насекомых и паукообразных.
Термин "млекопитающее" распространяется на теплокровных млекопитающих, в связи с которыми обычно обращаются за медицинской помощью (например, люди и одомашненные животные). Примеры включают в себя домашних кошек, собак, лошадей, жвачных животных и человека, а также только человека.
Термин "лечение" распространяется на лечение болезненного состояния у млекопитающего и включает в себя (a) предотвращение проявления болезненного состояния у млекопитающего, в частности, когда такое млекопитающее предрасположено к указанному болезненному состоянию, но наличие которого у млекопитающего еще не диагностировано; (b) ингибирование указанного болезненного состояния, например, задержку его развития; и/или (c) облегчение указанного болезненного состояния, например, путем регрессии указанного болезненного состояния до достижения определенного уровня. Лечение также включает в себя облегчение симптома заболевания (например, ослабление боли или уменьшение дискомфорта), при этом такое облегчение может воздействовать, а может напрямую и не воздействовать на заболевание (например, на причину, трансмиссию, экспрессию и т.д.).
Полинуклеотидные и олигонуклеотидные композиции и молекулы
Мишени: В одном из воплощений мишени включают в себя последовательности нуклеиновых кислот эритропоэтина (EPO), включая, без ограничения, смысловые и/или антисмысловые некодирующие и/или кодирующие последовательности, ассоциированные с EPO.
Эритропоэтин (EPO) является членом семейства гематопоэтических факторов роста, которые действуют в качестве гормона. EPO регулирует продукцию красных клеток крови (эритроцитов) (эритропоэз) и поддерживает общую массу эритроцитов в организме на оптимальном уровне. Продукция EPO стимулируется снижением содержания кислорода в ренальном артериальном кровообращении, опосредованным фактором транскрипции, который чувствителен к уровню кислорода. EPO продуцируется прежде всего клетками перитубулярного эндотелия почечных капилляров. Секретируемый EPO связывается с рецепторами EPO на поверхности костномозговых предшественников эритроцитов и вызывает их быструю репликацию и созревание до уровня функциональных красных клеток крови. Такая стимуляция приводит к быстрому подъему численности эритроцитов и в результате к увеличению гематокритного числа (% эритроцитов в крови) (D'Andrea et al. (1989) Cell 57: 277-285; Lodish et al. (1995) Cold Spring Harb Symp Quant Biol 60: 93-104).
Эритропоэтин стимулирует костный мозг к продуцированию большего количества эритроцитов. В результате увеличение количества эритроцитов повышает способность переноса кислорода кровью. Являясь первичным регулятором продукции красных клеток крови, эритропоэтин выполняет следующие основные функции: стимулирует развитие эритроцитов; инициирует синтез гемоглобина, молекулы, находящейся в красных клетках крови и переносящей кислород.
EPO стимулирует митотическое деление и дифференцировку клеток-предшественников эритроцитов и, таким образом, обеспечивает продуцирование эритроцитов. Он вырабатывается в почке в условиях гипоксии. В процессе индуцируемой EPO дифференцировки клеток-предшественников эритроцитов происходит индукция синтеза глобулинов и повышение синтеза комплекса гема и количества ферритиновых рецепторов. Это дает возможность клетке присоединять больше ионов и синтезировать функциональный гемоглобин. Гемоглобин в зрелых эритроцитах связывает кислород. Таким образом, эритроциты и содержащийся в них гемоглобин играют ключевую роль в снабжении организма кислородом. Сложные процессы, которые описаны, инициированы взаимодействием EPO с соответствующим рецептором на клеточной поверхности предшественников эритроцитов.
В здоровом состоянии организма, когда ткани получают достаточное количество кислорода от существующего в нем количества эритроцитов, EPO присутствует в плазме в очень малых концентрациях. Этой низкой в норме концентрации достаточно для стимуляции возмещения эритроцитов, которые с возрастом обычно убывают.
Количество EPO в кровообращении повышается в условиях гипоксии, когда в циркуляции уменьшается перенос кислорода клетками крови. Гипоксия может быть вызвана потерей большого количества крови в результате кровотечения, деструкцией красных кровяных клеток в результате радиационного воздействия, уменьшения поглощения кислорода, вызванного условиями высокогорья или длительным пребыванием в бессознательном состоянии, или же различными формами анемии. В ответ на то, что ткани подвергаются гипоксическому стрессу, EPO будет способствовать повышению продукции эритроцитов путем стимуляции пролиферации эритроидных клеток-предшественников. Когда количество эритроцитов в циркуляции становится выше уровня, необходимого для потребностей нормальных тканей в кислороде, уровень EPO в крови снижается.
Поскольку EPO играет основополагающую роль в процессе образования эритроцитов, этот гормон имеет потенциально полезные применения как в диагностике, так и в лечении болезней крови, характеризующихся низким уровнем продуцирования эритроцитов или их дефективной продукцией. Примеры опосредованных эритропоэтином заболеваний и расстройств, которые можно лечить с помощью клеток/тканей, регенерировавших из стволовых клеток, полученных с применением антисмысловых соединений, включают в себя заболевания или состояния, при которых используется защитная активность полипептида EPO для защиты от повреждения или для восстановления функции после повреждения реактивных клеток, тканей или органов. Примеры таких заболеваний или состояний включают в себя, но не ограничиваются болезненными состояниями, расстройствами и состояниями гематологических нарушений, болезней крови, характеризующихся низким уровнем продуцирования эритроцитов или их дефективной продукцией, анемией, серповидноклеточной анемией, бета-талассемией, аномальным эритропоэзом, нарушениями беременности и менструального цикла, ранней анемией недоношенных, почечной недостаточностью, хронической почечной недостаточностью, гипертонией, заболеванием или расстройством, ассоциированным с хирургическим вмешательством, заболеванием или расстройством у педиатрического пациента при диализе, заболеванием или расстройством, ассоциированным с низким гематокритным числом, СПИДом, расстройствами, связанными с химиотерапевтическими воздействиями, кистозным фиброзом, злокачественной опухолью или опухолью, инфекционными заболеваниями, венерическими заболеваниями, иммунологически зависимыми заболеваниями и/или аутоиммунными заболеваниями или расстройствами, сердечно-сосудистыми заболеваниями, например, инсультом, гипотонией, задержкой сердечных сокращений, ишемией, в частности, ишемически-реперфузионным повреждением, инфарктом миокарда, таким как острый инфаркт миокарда, хронической сердечной недостаточностью, стенокардией, гипертрофией сердца, заболеваниями сердца и легких, искусственным кровообращением, респираторными заболеваниями, почечными заболеваниями, заболеваниями мочеполовой и репродуктивной системы, эндокринными расстройствами/расстройствами метаболизма, желудочно-кишечными заболеваниями, болезнями центральной нервной системы (ЦНС) или периферической нервной системы, при которых прежде всего имеют место неврологические или психиатрические симптомы, связанной с возрастом потерей когнитивной функции, детским церебральным параличом, нейродегенертивным заболеванием, болезнью Альцгеймера, болезнью Паркинсона, болезнью Ли, деменцией, потерей памяти, амиотрофическим боковым склерозом, алкоголизмом, расстройством настроения, тревожным расстройством, болезнью дефицита внимания, гиперактивностью, аутизмом, шизофренией, депрессией, травмой или ишемией головного или спинного мозга, болезнью Крейтцфельда-Якоба, офтальмологическими заболеваниями, эпилепсией, множественным склерозом, воспалением, радиационным поражением, дегенерацией желтого пятна, диабетической нейропатией, диабетической ретинопатией, глаукомой, ишемией сетчатки и травмой сетчатки, повреждением спинного мозга, состоянием в связи с космическим полетом, острой потерей крови, старением и состоянием при неопластических заболеваниях.
В одном из воплощений способы и композиции согласно изобретению используются для модуляции любой из функций эритропоэтина. Анализы для определения модуляции функций эритропоэтина известны в данной области и описаны в литературе. Например, в патенте США № 5688679, "Human erythropoietin gene; high level expression in stably transfected mammalian cells", включенном в настоящее описание в виде ссылки, сообщается об использовании in vitro анализа биологической активности эритропоэтина, который основан на образовании эритроидных колоний (из CFU-E; эритроидных колониеобразующих клеток) в культурах мышиных костномозговых клеток в сгустке плазмы (Blood Cells 4: 89-103, 1978). Согласно литературным данным, чувствительность такого анализа оценивается приблизительно в 5 миллиединиц/мл. Эритропоэтин, используемый в качестве стандарта для такого анализа, представлял собой частично очищенный препарат из плазмы анемичных овец. Производили оценку супернатантов из пересеваемых клеточных линий, растущих в течение 24 часов в свежей среде без добавления метотрексата. Такой супернатант разбавляли 1:200 средой, и в количестве от 1 до 10 микролитров добавляли на миллилитр анализируемой культуры, содержащей 2×105 клеток костного мозга, 10% бычьей цитратной плазмы, 20% эмбриональной бычьей сыворотки, 1% альбумина сыворотки крупного рогатого скота и 1,6% бычьего эмбрионального экстракта (Gibco). После инкубации в течение 36-48 часов сгустки плазмы фиксировали на предметном стекле микроскопа, окрашивали бензидином для выявления гемоглобина и подсчитывали эритроидные колонии.
В патенте США № 5688679, включенном в настоящее описание в виде ссылки, также сообщается о применении супернатантов из выбранных клеточных линий для количественного определения иммунологически реактивного эритропоэтина с помощью конкурентного радиоиммуноанализа с использованием поливалентной антисыворотки, полученной у кролика против эритропоэтина человека (J. Cell. Physiol. 118: 87-96, 1984). Эритропоэтин может определяться также и с помощью других иммунологических методов, например, вестерн-блоттинга и иммунофлуоресценции.
Более того, в этом же самом патенте описан количественный анализ эритропоэтина, секретируемого в клеточный супернатант и оказывающего воздействие на пролиферацию других костномозговых клеток-предшественников. Может быть изучено влияние эритропоэтина на различные предшественники из костного мозга мыши и человека, включая эритроидные колониеобразующие клетки (CFU-E), эритроидные бурст-образующие клетки (BFU-E), предшественники гранулоцитов-макрофагов (CFU-GM) и колониеобразующие клетки в смеси клеток (CFU-Mix) (J. Cell. Physiol. Suppl. 1: 79-85, 1982; J. Cell. Physiol. 118: 87-96, 1984); указанные ссылки также включены в настоящее описание.
Сообщалось также, что эритропоэтин воздействует и на другие типы клеток, отличные от клеток эритроидного ряда. Например, в публикации Lifshitz, et al., 2009, "Non-erythroid activities of erythropoietin: Functional effects on murine dendritic cells", Mol. Immunol. 46(4): 713-21, включенной в настоящее описание в виде ссылки, сообщается об экспериментах in vivo на мышах, которым инъецировали EPO, и на трансгенных мышах, в повышенном количестве экспрессирующих человеческий EPO, у которых обнаруживали повышенное содержание популяции дендритных клеток (ДК) в селезенке с повышенной экспрессией CD80 и CD86 на клеточной поверхности. Prutchi с соавт., 2008, "Erythropoietin effects on dendritic cells: potential mediators in its function as an immunomodulator?" Exp Hematol. 36(12): 1682-90, сообщают о том, что при воздействии in vitro, EPO способствовал повышению содержания ДК в периферической крови и полученных из моноцитов дендритных клеток (MoДК), экспрессирующих костимуляторные молекулы CD80 и CD86.
В предпочтительном воплощении указанные олигонуклеотиды специфичны в отношении полинуклеотидов EPO, которые включают в себя, без ограничения, некодирующие области. EPO-мишени содержат варианты EPO; мутанты EPO, включая SNP; некодирующие последовательности EPO; аллели, фрагменты и т.п. Предпочтительно, чтобы указанный олигонуклеотид представлял собой антисмысловую молекулу РНК.
В соответствии с воплощениями настоящего изобретения, молекула нуклеиновой кислоты-мишени не ограничена только лишь полинуклеотидами EPO, но распространяется также и на любую из изоформ EPO, его рецепторов, гомологов, некодирующих областей и т.п.
В другом предпочтительном воплощении олигонуклеотид направлен на природную антисмысловую последовательность (природную последовательность, антисмысловую по отношению к кодирующим и некодирующим областям) EPO-мишеней, включая, без ограничения, их варианты, аллели, гомологи, мутанты, производные, фрагменты и комплементарные последовательности. Предпочтительно, чтобы указанный олигонуклеотид представлял собой антисмысловую молекулу РНК или ДНК.
В другом предпочтительном воплощении олигомерные соединения согласно изобретению включают в себя также варианты, в которых отличающиеся основания встречаются в одном или нескольких положениях нуклеотидов в указанном соединении. Например, если первым нуклеотидом является аденин, могут быть получены варианты, которые содержат в этом положении тимидин, гуанозин, цитидин или другие природные или неприродные нуклеотиды. Это может быть произведено в любых положениях антисмыслового соединения. Затем эти соединения тестируют, с использованием описанных здесь способов, с целью определения их способности ингибировать экспрессию нуклеиновой кислоты-мишени.
В определенных воплощениях гомология, идентичность последовательностей или комплементарность между антисмысловым соединением и мишенью составляет приблизительно от 50% примерно до 60%. В некоторых воплощениях гомология, идентичность последовательностей или комплементарность составляет приблизительно от 60% примерно до 70%. В определенных воплощениях гомология, идентичность последовательностей или комплементарность составляет приблизительно от 70% примерно до 80%. В определенных воплощениях гомология, идентичность последовательностей или комплементарность составляет приблизительно от 80% примерно до 90%. В определенных воплощениях гомология, идентичность последовательностей или комплементарность составляет приблизительно 90%, приблизительно 92%, приблизительно 94%, приблизительно 95%, приблизительно 96%, приблизительно 97%, приблизительно 98%, приблизительно 99% или приблизительно 100%.
Антисмысловое соединение является специфически гибридизуемым, если связывание указанного соединения с нуклеиновой кислотой-мишенью препятствует нормальному функционированию нуклеиновой кислоты-мишени, вызывая потерю ее активности, и при этом оно должно обладать достаточной степенью комплементарности, чтобы было исключено неспецифическое связывание антисмыслового соединения с нецелевыми последовательностями в условиях, благоприятных для специфического связывания. Такие условия включают в себя, например, физиологические условия в случае анализов in vivo или терапевтического воздействия, и условия, при которых предпринимаются анализы в случае количественных оценок in vitro.
Антисмысловое соединение, будь то ДНК, РНК, химерное, замещенное соединение и т.д., является специфически гибридизуемым, если связывание указанного соединения с молекулой ДНК-мишени или РНК-мишени препятствует нормальному функционированию ДНК-мишени или РНК-мишени, вызывая потерю ее функциональности, и при этом должна иметь место достаточная степень комплементарности, чтобы было исключено неспецифическое связывание антисмыслового соединения с нецелевыми последовательностями в условиях, благоприятных для специфического связывания, то есть в физиологических условиях в случае анализов in vivo или терапевтического воздействия, и в условиях, при которых предпринимаются анализы в случае количественных оценок in vitro.
В другом предпочтительном воплощении нацеливание на EPO, включая, без ограничения, антисмысловые последовательности, которые идентифицированы и объем которых увеличен, например, с помощью ПЦР, гибридизации и т.д., где одна или более из указанных последовательностей представлены в виде SEQ ID NO: 2 и пр., модулирует экспрессию или функцию EPO. В одном из воплощений экспрессия или функция повышается по сравнению с контролем. В другом предпочтительном воплощении экспрессия или функция понижается по сравнению с контролем.
В другом предпочтительном воплощении олигонуклеотиды содержат последовательности нуклеиновых кислот, представленные в виде SEQ ID NO: 3-5, включая антисмысловые последовательности, которые идентифицированы и объем которых увеличен, например, с помощью ПЦР, гибридизации и т.д. Указанные олигонуклеотиды могут содержать один или более модифицированных нуклеотидов, более коротких или более длинных фрагментов, модифицированных связей и пр. Примеры модифицированных связей или межнуклеотидных соединений включают в себя фосфоротиоаты, фосфородитиоаты и пр. В другом предпочтительном воплощении нуклеотиды содержат фосфорное производное. Фосфорное производное (или модифицированная фосфатная группа), которое может быть присоединено к сахару или к фрагменту сахарного аналога в модифицированных олигонуклеотидах согласно настоящему изобретению, может быть монофосфатом, дифосфатом, трифосфатом, алкилфосфатом, алканфосфатом, фосфоротиоатом и пр. Приемы получения указанных выше фосфатных аналогов и их включения в нуклеотиды, модифицированные нуклеотиды и олигонуклеотиды, как таковые, известны, и нет необходимости их здесь описывать.
Специфичность и чувствительность антисмысловых соединений также используется специалистами в данной области для терапевтических применений. Антисмысловые олигонуклеотиды используются в качестве терапевтических компонентов при лечении болезненных состояний у животных и человека. Антисмысловые олигонуклеотиды безопасно и эффективно вводят человеку, и в настоящее время проводится целый ряд клинических испытаний. Таким образом, установлено, что олигонуклеотиды могут быть полезными терапевтическими средствами, которые можно скомпоновать таким образом, чтобы они использовались в лечебных схемах для обработки клеток, тканей и для лечения животных, в частности, человека.
В воплощениях согласно изобретению олигомерные антисмысловые соединения, в частности, олигонуклеотиды, связываются с молекулами нуклеиновых кислот-мишеней и модулируют экспрессию и/или функцию молекул, кодируемых геном-мишенью. Функции ДНК, которым предполагается противостоять, включают в себя, например, репликацию и транскрипцию. Функции РНК, которым предполагается противостоять, включают в себя все жизненные функции, такие, например, как транслокация РНК к месту трансляции белков, трансляция белка с РНК, сплайсинг РНК, с получением одного или более видов мРНК, а также каталитическая активность, которая может быть блокирована или облегчена посредством РНК. Указанные функции могут быть усилены или могут ингибироваться, в зависимости от потребностей.
Антисмысловые соединения включают в себя антисмысловые олигомерные соединения, антисмысловые олигонуклеотиды, олигонуклеотиды внешней вспомогательной последовательности (EGS), альтернативные сплайсеры, праймеры, зонды и другие олигомерные соединения, которые гибридизуются по меньшей мере с частью нуклеиновой кислоты-мишени. Как таковые, указанные соединения могут быть введены в виде одноцепочечных, двухцепочечных, частично одноцепочечных или кольцевых олигомерных соединений.
Нацеливание антисмысловых соединений на конкретную молекулу нуклеиновой кислоты, в контексте настоящего изобретения, может быть многоступенчатым процессом. Указанный процесс обычно начинается с идентификации нуклеиновой кислоты-мишени, функция которой подлежит модуляции. Указанной нуклеиновой кислотой-мишенью может быть, например, клеточный ген (или мРНК, транскрибируемая с указанного гена), экспрессия которого ассоциирована с конкретным расстройством или болезненным состоянием, или же молекула нуклеиновой кислоты из инфекционного агента. В настоящем изобретении нуклеиновая кислота-мишень кодирует эритропоэтин (EPO).
Процесс нацеливания обычно включает в себя также определение по меньшей мере одной области-, сегмента- или участка-мишени внутри целевой нуклеиновой кислоты для взаимодействия с антисмысловым соединением, осуществляемого таким образом, чтобы в результате был получен требуемый эффект, например, модуляция экспрессии. В контексте настоящего изобретения термин "область" определяется как часть нуклеиновой кислоты-мишени, имеющая по меньшей мере одну идентифицируемую структуру, функцию или характеристику. Внутри областей нуклеиновых кислот-мишеней находятся сегменты. "Сегменты" определяются как менее крупные или как суб-части областей внутри нуклеиновой кислоты-мишени. Используемый в настоящем изобретении термин "участки" определяется как положения внутри нуклеиновой кислоты-мишени.
В предпочтительном воплощении антисмысловые олигонуклеотиды связываются с природными антисмысловыми последовательностями эритропоэтина (EPO) и модулируют экспрессию и/или функцию эритропоэтина (EPO) (SEQ ID NO: 1). Примеры антисмысловых последовательностей включают в себя последовательности SEQ ID NO: 2-5.
В другом предпочтительном воплощении антисмысловые олигонуклеотиды связываются с одним или более сегментами полинуклеотидов эритропоэтина (EPO) и модулируют экспрессию и/или функцию эритропоэтина (EPO). Указанные сегменты содержат по меньшей мере пять последовательных нуклеотидов смысловых или антисмысловых полинуклеотидов эритропоэтина (EPO).
В другом предпочтительном воплощении антисмысловые олигонуклеотиды являются специфичными в отношении природных антисмысловых последовательностей эритропоэтина (EPO), при этом связывание олигонуклеотидов с природными антисмысловыми последовательностями эритропоэтина (EPO) модулирует экспрессию и/или функцию эритропоэтина (EPO).
В другом предпочтительном воплощении олигонуклеотидные соединения содержат последовательности, представленные в виде SEQ ID NO: 3-5, антисмысловые последовательности, которые идентифицированы и объем которых увеличен, например, с помощью ПЦР, гибридизации и т.д. Указанные олигонуклеотиды могут содержать один или несколько модифицированных нуклеотидов, более коротких или более длинных фрагментов, модифицированных связей и пр. Примеры модифицированных связей или межнуклеотидных соединений включают в себя фосфоротиоаты, фосфородитиоаты и пр. В другом предпочтительном воплощении нуклеотиды содержат фосфорное производное. Фосфорное производное (или модифицированная фосфатная группа), которое может быть присоединено к сахару или к фрагменту сахарного аналога в модифицированных олигонуклеотидах согласно настоящему изобретению, может быть монофосфатом, дифосфатом, трифосфатом, алкилфосфатом, алканфосфатом, фосфоротиоатом и пр. Приемы получения указанных выше фосфатных аналогов и их включения в нуклеотиды, модифицированные нуклеотиды и олигонуклеотиды, как таковые, известны, и нет необходимости их здесь описывать.
Поскольку, как известно в данной области, кодоном инициации трансляции обычно является 5’-AUG (в молекулах транскрибированной мРНК; 5’-ATG в соответствующей молекуле ДНК), кодон инициации трансляции обозначается также как "кодон AUG", "старт-кодон" или "старт-кодон AUG". Меньшая часть генов имеет кодон инициации трансляции, имеющий РНК-последовательность 5’-GUG, 5’-UUG или 5’-CUG; а 5’-AUA, 5’-ACG и 5’-CUG, как было показано, функционируют in vivo. Таким образом, термины "кодон инициации трансляции" и "старт-кодон" могут охватывать многие последовательности кодонов, несмотря даже на то, что инициирующей аминокислотой в каждом случае обычно является метионин (у эукариот) или формилметионин (у прокариот). Гены эукариот могут иметь два или более альтернативных старт-кодонов, любой из которых может быть предпочтительно использован для инициации трансляции в конкретный тип клеток или ткани или при особом наборе условий. В контексте настоящего изобретения, "старт-кодон" и "кодон инициации трансляции" относятся к кодону или кодонам, которые используются in vivo для инициации трансляции мРНК, транскрибированной с гена, кодирующего эритропоэтин (EPO), независимо от последовательности (последовательностей) таких кодонов. Кодон терминации трансляции (или "стоп-кодон") гена может иметь от одной до трех последовательностей, то есть 5’-UAA, 5’-UAG и 5’-UGA (соответствующими ДНК-последовательностями являются, соответственно, 5’-TAA, 5’- TAG и 5’-TGA).
Термины "область старт-кодона" и "область кодона инициации трансляции" относятся к части такой мРНК или гена, которая охватывает приблизительно от 25 примерно до 50 смежных нуклеотидов в любом направлении (то есть 5’- или 3’-) от кодона инициации трансляции. Сходным образом, термины "область стоп-кодона" и "область кодона терминации трансляции" относятся к части такой мРНК или гена, которая охватывает приблизительно от 25 примерно до 50 смежных нуклеотидов в любом направлении (то есть 5’- или 3’-) от кодона терминации трансляции. Следовательно, все эти области, и "область старт-кодона" (или "область кодона инициации трансляции"), и "область стоп-кодона" (или "область кодона терминации трансляции"), являются областями, на которые могут быть эффективно нацелены антисмысловые соединения согласно изобретению.
Открытая рамка считывания (ORF), или "кодирующая область", которая известна специалистам как область между кодоном инициации трансляции и кодоном терминации трансляции, также является областью, которая может быть эффективной целевой областью. В контексте настоящего изобретения, целевой областью (или областью-мишенью) является внутригенная область, охватывающая кодон инициации трансляции или кодон терминации трансляции открытой рамки считывания (ORF) гена.
Другая целевая область включает в себя 5’-нетранслируемую область (5’UTR), известную специалистам как часть мРНК в 5’-направлении от кодона инициации трансляции и, таким образом, включающую в себя нуклеотиды между 5’-сайтом кэпирования и кодоном инициации трансляции мРНК (или соответствующие нуклеотиды гена). Еще одна целевая область включает в себя 3’-нетранслируемую область (3’UTR), известную специалистам как часть мРНК в 3’-направлении от кодона терминации трансляции и, таким образом, включающую в себя нуклеотиды между кодоном терминации трансляции и 3’-концом мРНК (или соответствующие нуклеотиды гена). 5’-сайт кэпирования мРНК содержит N7-метилированный остаток гуанозина, соединенный с крайним 5’-остатком мРНК посредством 5’-5’-трифосфатного звена. Считается, что 5’-сайт кэпирования мРНК включает в себя структуру 5’-сайта как таковую, а также первые 50 нуклеотидов, примыкающих к 5’-сайту. Другой целевой областью в настоящем изобретении является 5’-сайт кэпирования.
Хотя некоторые мРНК-транскрипты эукариот транслируются в прямом направлении, многие содержат одну или более областей, известных как "интроны", которые вырезаются из транскрипта перед его трансляцией. Остальные (и, следовательно, транслируемые) области известны как "экзоны", они соединяются вместе посредством сплайсинга, образуя непрерывную последовательность мРНК. В одном из воплощений нацеливание на участки сплайсинга, то есть интрон-экзонные соединения или экзон-интронные соединения, является особенно полезным в ситуации, когда при том или ином заболевании происходит аберрантный сплайсинг или когда имеет место сверхпродуцирование конкретного продукта сплайсинга. Образование аберрантных соединений при сплайсинге в результате реаранжировки является еще одним воплощением целевого участка. мРНК-транскрипты, продуцируемые посредством процесса сплайсинга двух (или более) мРНК из разных генов, известны как "слитые транскрипты." Нацеливание на интроны может быть эффективно осуществлено с помощью антисмысловых соединений, нацеленных, например, на ДНК или на пре-мРНК.
В другом предпочтительном воплощении антисмысловые олигонуклеотиды связываются с кодирующей и/или некодирующей областями полинуклеотида-мишени и модулируют экспрессию и/или функцию молекулы-мишени.
В другом предпочтительном воплощении антисмысловые олигонуклеотиды связываются с природными антисмысловыми полинуклеотидами и модулируют экспрессию и/или функцию молекулы-мишени.
В другом предпочтительном воплощении антисмысловые олигонуклеотиды связываются со смысловыми полинуклеотидами и модулируют экспрессию и/или функцию молекулы-мишени.
Альтернативные РНК-транскрипты могут быть получены из одной и той же области геномной ДНК. Указанные альтернативные транскрипты обычно известны как "варианты". Более конкретно, "варианты пре-мРНК" являются транскриптами, продуцируемыми из одной и той же геномной ДНК, которые отличаются от других транскриптов, продуцируемых из той же самой геномной ДНК, либо своим старт-положением, либо стоп-положением, и содержат как интронную, так и экзонную последовательности.
При вырезании одной или более экзонных или интронных областей или их частей в процессе сплайсинга, варианты пре-мРНК продуцируют более короткие "варианты мРНК". Следовательно, варианты мРНК являются прошедшими стадию процессинга вариантами пре-мРНК, и каждый уникальный вариант пре-мРНК должен в результате сплайсинга всегда продуцировать уникальный вариант мРНК. Указанные варианты мРНК известны также как "варианты альтернативного сплайсинга". Если вариант сплайсинга пре-мРНК не образуется, тогда вариант пре-мРНК идентичен варианту мРНК.
Варианты могут быть получены с использованием альтернативных сигналов запуска и остановки транскрипции. Транскрипты пре-мРНК и мРНК могут иметь более одного старт-кодона или стоп-кодона. Варианты, которые происходят из пре-мРНК или мРНК, в которых используются альтернативные старт-кодоны, известны как "альтернативные старт-варианты" указанных пре-мРНК или мРНК. Те транскрипты, в которых используется альтернативный стоп-кодон, известны как "альтернативные стоп-варианты" указанных пре-мРНК или мРНК. Одним специфическим типом альтернативного стоп-варианта является "вариант поли-A", при котором аппаратом транскрипции продуцируются множественные транскрипты, являющиеся результатом альтернативной селекции одного из "стоп-сигналов поли-A", и таким образом продуцируются транскрипты, которые заканчиваются уникальными участками поли-А. В контексте настоящего изобретения описанные здесь типы вариантов также являются воплощениями нуклеиновых кислот-мишеней.
Локализации участков на нуклеиновой кислоте-мишени, с которыми гибридизуются антисмысловые соединения, определяются как участки длиной по меньшей мере в 5 нуклеотидов области-мишени, на которую нацелено активное антисмысловое соединение.
Хотя здесь для примера и приведены специфические последовательности определенных сегментов-мишеней, специалисту в данной области должно быть очевидно, что они служат лишь для иллюстративных целей и описывают конкретные воплощения, входящие в объем, охватываемый настоящим изобретением. Дополнительные сегменты-мишени с легкостью могут быть идентифицированы рядовым специалистом в данной области на основании приведенного здесь описания.
Сегменты-мишени длиной в 5-100 нуклеотидов, содержащие отрезки по меньшей мере в пять (5) смежных нуклеотидов, выбранных среди предпочтительных иллюстративных сегментов-мишеней, также считаются подходящими для осуществления нацеливания.
Сегменты-мишени могут включать в себя последовательности ДНК или РНК, которые содержат по меньшей мере 5 смежных нуклеотидов от 5’-конца одного из иллюстративных предпочтительных сегментов-мишеней (остальные нуклеотиды образуют отрезок из следующих друг за другом нуклеотидов той же самой ДНК или РНК, начиная непосредственно выше 5’-конца сегмента-мишени и продолжая вдоль ДНК или РНК приблизительно на расстояние от 5 примерно до 100 нуклеотидов). Сходным образом, предпочтительные сегменты-мишени представлены последовательностями ДНК или РНК, которые содержат по меньшей мере 5 смежных нуклеотидов от 3’-конца одного из иллюстративных предпочтительных сегментов-мишеней (остальные нуклеотиды образуют отрезок из следующих друг за другом нуклеотидов той же самой ДНК или РНК, начиная непосредственно ниже 3’-конца сегмента-мишени и продолжая вдоль ДНК или РНК приблизительно на расстояние от 5 примерно до 100 нуклеотидов). Специалисты в данной области на основании проиллюстрированных здесь сегментов-мишеней смогут без излишнего экспериментирования идентифицировать дальнейшие предпочтительные сегменты-мишени.
Как только будут идентифицированы одна или более областей-мишеней, сегментов или участков, выбирают антисмысловые соединения, которые имеют достаточную комплементарность в отношении мишени, то есть будут достаточно хорошо гибридизоваться и с достаточной специфичностью, чтобы можно было ожидать требуемого эффекта.
В воплощениях настоящего изобретения олигонуклеотиды связываются с антисмысловой цепью конкретной мишени. Такие олигонуклеотиды имеют по меньшей мере 5 нуклеотидов в длину и могут быть синтезированы таким образом, чтобы каждый олигонуклеотид был нацелен на перекрывающиеся последовательности, так, чтобы в результате синтезированные олигонуклеотиды покрывали полную длину полинуклеотида-мишени. Мишени также включают в себя как кодирующие, так и некодирующие области.
В одном из воплощений предпочтительно на специфические нуклеиновые кислоты нацеливать антисмысловые олигонуклеотиды. Нацеливание антисмысловых соединений на конкретную нуклеиновую кислоту является многоступенчатым процессом. Обычно такой процесс начинается с идентификации последовательности нуклеиновой кислоты, функция которой подлежит модуляции. Это может, например, быть клеточным геном (или мРНК, транскрибированной с такого гена), экспрессия которого ассоциирована с конкретным расстройством или болезненным состоянием, или некодирующим полинуклеотидом, таким, например, как некодирующая РНК (нкРНК).
РНК могут быть классифицированы на (1) матричные РНК (мРНК), которые транслируются в белки, и (2) некодирующие белок РНК (нкРНК). нкРНК содержат микроРНК, антисмысловые транскрипты и другие транскрипционные единицы (TU), содержащие высокую плотность стоп-кодонов и лишенные сколько-нибудь обширной "открытой рамки считывания". По-видимому, многие нкРНК начинаются с участков инициации 3’-нетранслируемых областей (3’UTR) кодирующего белок локуса. Обычно нкРНК являются редкими, и по меньшей мере половина нкРНК, которые секвенированы ассоциацией FANTOM, по-видимому, не полиаденилированы. Большинство исследователей с полным основанием сосредоточены на полиаденилированных мРНК, которые проходят стадию процессинга и экспортируются в цитоплазму. В настоящее время показано, что набор неполиаденилированных ядерных РНК может быть очень обширным, и что многие такие транскрипты происходят из так называемых межгенных областей (Cheng, J. et al. (2005) Science 308 (5725), 1149-1154; Kapranov, P. et al (2005). Genome Res 15 (7), 987-997). Механизмом, посредством которого нкРНК могут регулировать экспрессию генов, является спаривание оснований с транскриптами-мишенями. РНК, которые функционируют путем спаривания оснований, могут быть сгруппированы в (1) цис-кодируемые РНК, которые кодируются на одном и том же участке генетической локализации, но на противоположной цепи РНК, на которую они воздействуют, и, следовательно, они полностью комплементарны своей мишени, и (2) транс-кодируемые РНК, кодирование которых имеет иную хромосомную локализацию, нежели РНК, на которую они воздействуют, и обычно проявляемый ими потенциал спаривания оснований со своими мишенями не так высок.
Не желая связывать себя какой бы то ни было теорией, можно, тем не менее, утверждать, что описанное здесь нарушение на уровне антисмыслового полинуклеотида, вызываемое антисмысловыми олигонуклеотидами, может изменять экспрессию соответствующих смысловых матричных РНК. Однако такая регуляция может быть либо дискордантной (нарушение антисмысловой цепи приводит к повышению уровней матричной РНК), либо конкордантной (нарушение антисмысловой цепи одновременно приводит к снижению уровней матричной РНК). В этих случаях антисмысловые олигонуклеотиды могут быть нацелены на перекрывающиеся или неперекрывающиеся части антисмыслового транскрипта, приводя к его разрушению или удалению. Кодирующие, также как и некодирующие, соединения могут быть нацелены идентичным образом, и при этом каждая из категорий способна регулировать соответствующие смысловые транскрипты - либо конкордантным, либо дискордантным образом. Стратегии, которые используются при идентификации новых олигонуклеотидов для их использования против мишени, могут быть основаны на разрушении антисмысловых РНК-транскриптов антисмысловыми олигонуклеотидами или любым другим способом модуляции представляющей интерес мишени.
Стратегия 1: В случае дискордантной регуляции выведение из строя антисмыслового транскрипта повышает экспрессию типового (смыслового) гена. Если бы этот последний ген кодировал известную или мнимую мишень лекарственного средства, тогда удаление его антисмыслового эквивалента предположительно могло бы имитировать действие агониста рецептора или ферментативного стимулятора.
Стратегия 2: В случае конкордантной регуляции можно одновременно подавить оба транскрипта, антисмысловой и смысловой, и таким образом добиться синергического уменьшения экспрессии типового (смыслового) гена. Если, например, антисмысловой олигонуклеотид используется для достижения нокдауна, тогда такая стратегия может быть использована таким образом, чтобы один антисмысловой олигонуклеотид был нацелен на смысловой транскрипт, а другой антисмысловой олигонуклеотид был нацелен на соответствующий антисмысловой транскрипт, или чтобы единственный энергетически симметричный антисмысловой олигонуклеотид одновременно был нацелен на область перекрывания смыслового и антисмыслового транскриптов.
Согласно настоящему изобретению, антисмысловые соединения включают в себя антисмысловые олигонуклеотиды, рибозимы, олигонуклеотиды внешней вспомогательной последовательности (EGS), соединения siРНК, одно- или двухцепочечные соединения [системы] интерференции РНК (РНКi), такие как соединения siРНК, и другие олигомерные соединения, которые гибридизуются по меньшей мере с частью нуклеиновой кислоты-мишени и модулируют их функции. Как таковые, они могут представлять собой ДНК, РНК, ДНК-подобные, РНК-подобные соединения или их смеси, или могут быть миметиками одного или нескольких из указанных соединений. Такие соединения могут быть одноцепочечными, двухцепочечными, кольцевыми или U-образными олигомерными соединениями и могут содержать такие структурные элементы как внутренние или концевые выпячивания, ошибочные спаривания или петли. Антисмысловые соединения обычно получают линейно, но они могут быть соединены или получены иным способом, с получением кольцевых и/или разветвленных соединений. Антисмысловые соединения могут включать в себя конструкции, такие, например, как две цепи, гибридизованные таким образом, чтобы получилось полностью или частично двухцепочечное соединение или одноцепочечное соединение с достаточной само-комплементарностью для обеспечения гибридизации и образования полного или частичного двухцепочечного соединения. Двухцепочечные соединения могут быть соединены внутренними участками, оставляя свободными 3’- или 5’-концы, или же они могут быть соединены, образуя непрерывную структуру шпильки или петли. Структура шпильки может содержать нависающий край либо с 5’-, либо с 3’-конца, продуцируя удлинение одноцепочечного характера. Двухцепочечные соединения необязательно могут включают в себя нависающие края на обоих концах. Дополнительные модификации могут включать в себя конъюгатные группы, присоединенные к одному из концов, к избранным нуклеотидным положениям, положениям сахара или к одной из межнуклеозидных связей. Альтернативно, такие две цепи могут быть соединены через фрагмент ненуклеиновой кислоты или линкерную группу. При образовании только из одной цепи дцРНК могут принимать форму само-комплементарной молекулы шпилечного типа (U-образной), которая дуплицируется сама с собой в обратном направлении с образованием дуплекса. Таким образом, такие дцРНК могут быть полностью или частично двухцепочечными. Специфической модуляции экспрессии гена можно достичь путем стабильной экспрессии шпилечной (U-образной) дцРНК в трансгенных клеточных линиях, однако в некоторых воплощениях экспрессия или функция гена повышается. При образовании из двух цепей или одной цепи, которая принимает форму само-комплементарной молекулы шпилечного типа (U-образной), которая дуплицируется сама с собой в обратном направлении с образованием дуплекса, две указанные цепи (или дуплекс-образующие области одной цепи) являются комплементарными цепями РНК, между которыми спаривание оснований происходит по схеме Уотсона-Крика.
Сразу же после введения в систему, соединения согласно изобретению могут выявить действие одного или более ферментов или структурных белков, вызывая расщепление или другую модификацию нуклеиновой кислоты-мишени, или же могут действовать на основе механизмов заселения (связывания). Обычно нуклеиновые кислоты (включая олигонуклеотиды) могут быть описаны как "ДНК-подобные" (то есть в целом имеющие один или более 2’-дезокси-сахаров и обычно содержащие, вместо оснований U, основания T) или "РНК-подобные" (то есть в общем имеющие один или более 2’-гидроксила или 2’-модифицированных сахаров и обычно содержащие, вместо оснований T, основания U). Спирали нуклеиновых кислот могут принимать структуру более чем одного типа, наиболее часто, A- и B-формы. Обычно считается, что олигонуклеотиды, которые имеют структуру наподобие B-формы, являются "ДНК-подобными", тогда как имеющие A-подобную структуру являются "РНК-подобными. В некоторых воплощениях (в случаях химер) антисмысловое соединение может содержать области как в A-, так и в B-форме.
В другом предпочтительном воплощении требуемые олигонуклеотиды или антисмысловые соединения содержат по меньшей мере одно из нижеуказанного: антисмысловую РНК, антисмысловую ДНК, химерные антисмысловые олигонуклеотиды, антисмысловые олигонуклеотиды, содержащие модифицированные связи, РНК-интерференцию (РНКi), короткую интерферирующую РНК (siРНК); микро-интерферирующую РНК (miРНК); малую временную РНК (stРНК); или короткую шпилечную (U-образную) РНК (shРНК); короткие РНК, способствующие активации экспрессии генов (РНКa); малые активирующие РНК (saРНК) или их сочетания.
дцРНК также могут активировать экспрессию генов - механизм, который был назван "процессом активации экспрессии генов короткими РНК ", или РНКa. дцРНК, нацеленные на генные промоторы, вызывают сильную активацию транскрипции ассоциированных генов. РНКa в клетках человека была обнаружена с помощью искусственных дцРНК, названных "малыми активирующими РНК" (saРНК). В настоящее время неизвестно, сохранились ли РНКa в других организмах.
Обнаружено, что малая двухцепочечная РНК (дцРНК), такая как короткая интерферирующая РНК (siРНК) и микро-РНК (miРНК), запускает эволюционно консервативный механизм, известный как РНК-интерференция (РНКi). РНКi неизменно приводит к молчанию (сайленсингу) гена путем ремоделирования хроматина, с последующей супрессией транскрипции, деградацией комплементарной мРНК или блокированием трансляции белка. Однако в случаях, подробно описываемых в нижеследующем разделе примеров, показано, что олигонуклеотиды повышают экспрессию и/или функцию полинуклеотидов эритропоэтина (EPO) и кодируемых ими продуктов. дцРНК могут действовать также как малые активирующие РНК (saРНК). Не желая связывать себя какой бы то ни было теорией, отметим лишь, что путем нацеливания последовательностей на генные промоторы, saРНК будут вызывать экспрессию гена - явление, названное процессом дцРНК-индуцированной активации транскрипции" (РНКa).
Еще в одном воплощении идентифицированные здесь "предпочтительные сегменты-мишени" могут быть использованы в скрининге дополнительных соединений, которые модулируют экспрессию полинуклеотидов эритропоэтина (EPO). "Модуляторами" являются такие соединения, которые уменьшают или увеличивают экспрессию молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей эритропоэтин (EPO), и которые содержат участок по меньшей мере из 5 нуклеотидов, который является комплементарным предпочтительному сегменту-мишени. Способ скрининга включает в себя стадии приведения в контакт предпочтительного сегмента-мишени молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей смысловые или природные антисмысловые полинуклеотиды эритропоэтина (EPO) с одним или более модуляторами-кандидатами, и выбора одного или более модуляторов-кандидатов, которые уменьшают или увеличивают экспрессию молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей полинуклеотиды эритропоэтина (EPO), например, SEQ ID NO: 3-5. Сразу после обнаружения того, что модулятор- или модуляторы-кандидаты способны модулировать (например, либо уменьшать, либо увеличивать) экспрессию молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей полинуклеотиды эритропоэтина (EPO), указанный модулятор может быть использован в дальнейших исследованиях функции полинуклеотидов эритропоэтина (EPO) или для применения в качестве экспериментального, диагностического или терапевтического средства согласно настоящему изобретению.
Нацеливание природной антисмысловой последовательности предпочтительно модулирует функцию гена-мишени, например, гена EPO (например, с номером доступа NM 000799.2, Фиг. 2). В предпочтительном воплощении мишенью является антисмысловой полинуклеотид эритропоэтинового гена. В предпочтительном воплощении антисмысловой олигонуклеотид нацелен на смысловую и/или природную антисмысловую последовательности полинуклеотидов эритропоэтина (EPO) (например, с номером доступа NM 000799.2, Фиг. 2), их варианты, аллели, изоформы, гомологи, мутанты, производные, фрагменты и комплементарные им последовательности. Предпочтительно, чтобы олигонуклеотид был антисмысловой молекулой, а мишени включали в себя кодирующую и некодирующую области антисмысловых и/или смысловых полинуклеотидов EPO.
Природные антисмысловые полинуклеотиды могут быть идентифицированы, как описано, например, в международной заявке WO 2007/087113 и патентной заявке США № 2009/0258925, обе они называются "Natural Antisense and Non-coding RNA Transcripts as Drug Targets" и в полном объеме включены в настоящее описание в виде ссылок.
Предпочтительные сегменты-мишени согласно настоящему изобретению можно также комбинировать с соответствующими им комплементарными антисмысловыми соединениями согласно изобретению, с образованием стабилизированных двухцепочечных (сдвоенных) олигонуклеотидов.
В данной области было показано, что такие двухцепочечные олигонуклеотидные фрагменты модулируют экспрессию мишени и регулируют трансляцию, а также процессинг РНК посредством антисмыслового механизма. Кроме того, такие двухцепочечные фрагменты могут быть подвергнуты химическим модификациям (Fire et al, (1998) Nature, 391, 806-811; Timmons and Fire, (1998) Nature, 395, 854; Timmons et al, (2001) Gene, 263, 103-112; Tabara et al, (1998) Science, 282, 430-431; Montgomery et al, (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 15502-15507; Tuschl et al, (1999) Genes Dev., 13, 3191-3197; Elbashir et al, (2001) Nature, 411, 494-498; Elbashir et al, (2001) Genes Dev. 15, 188-200). Например, было показано, что такие двухцепочечные фрагменты ингибируют мишень путем классической гибридизации антисмысловой цепи дуплекса с мишенью, таким образом запуская процесс ферментативной деградации мишени (Tijsterman et al., (2002) Science, 295, 694-697).
В предпочтительном воплощении антисмысловой олигонуклеотид направляют на полинуклеотиды эритропоэтина (EPO) (например, с номером доступа NM 000799.2), их варианты, аллели, изоформы, гомологи, мутанты, производные, фрагменты и комплементарные им последовательности. Предпочтительно, чтобы олигонуклеотид был антисмысловой молекулой.
В соответствии с воплощениями настоящего изобретения, нуклеиновая кислота-мишень не ограничена только эритропоэтином (EPO), но распространяется также и на любые изоформы, рецепторы, гомологи и пр. молекул эритропоэтина (EPO).
В другом предпочтительном воплощении олигонуклеотид нацелен на природную антисмысловую последовательность полинуклеотидов EPO, например, полинуклеотидов, представленных в виде SEQ ID NO: 2, а также любых ее вариантов, аллелей, гомологов, мутантов, производных, фрагментов и комплементарных ей последовательностей. Примеры антисмысловых олигонуклеотидов представлены в виде SEQ ID NO: 3-5.
В одном из воплощений указанные олигонуклеотиды комплементарны или связаны с последовательностями нуклеиновых кислот антисмыслового эритропоэтина (EPO), включая, без ограничения, некодирующие смысловую и/или антисмысловую последовательности, ассоциированные с полинуклеотидами эритропоэтина (EPO), и модулируют экспрессию и/или функцию молекул эритропоэтина (EPO).
В другом предпочтительном воплощении указанные олигонуклеотиды комплементарны или связаны с последовательностями нуклеиновых кислот природного антисмыслового EPO, представленными в виде SEQ ID NO: 2, и модулируют экспрессию и/или функцию молекул эритропоэтина (EPO).
В предпочтительном воплощении олигонуклеотиды включают в себя последовательности по меньшей мере из 5 смежных нуклеотидов последовательностей SEQ ID NO: 3-5 и модулируют экспрессию и/или функцию молекул эритропоэтина (EPO).
Мишени указанного полинуклеотида включают в себя EPO, включая членов его семейства, варианты EPO; мутанты EPO, включая SNP; некодирующие последовательности EPO; аллели EPO; видовые варианты, фрагменты и т.п. Предпочтительно, чтобы олигонуклеотид был антисмысловой молекулой.
В другом предпочтительном воплощении олигонуклеотид, нацеленный на полинуклеотиды эритропоэтина (EPO), включают в себя антисмысловую РНК, РНК-интерференцию (РНКi), короткую интерферирующую РНК (siРНК); микро-интерферирующую РНК (miРНК); малую временную РНК (stРНК); или короткую шпилечную (U-образную) РНК (shРНК); короткие РНК, способствующие активации экспрессии генов (РНКa); или малые активирующие РНК (saРНК).
В другом предпочтительном воплощении нацеливание на полинуклеотиды эритропоэтина (EPO), например, SEQ ID NO: 2, модулирует экспрессию или функцию указанных мишеней. В одном из воплощений экспрессия или функция повышается по сравнению с контролем. В другом предпочтительном воплощении экспрессия или функция понижается по сравнению с контролем.
В другом предпочтительном воплощении антисмысловые соединения содержат последовательности, представленные в виде SEQ ID NO: 3-5. Указанные олигонуклеотиды могут содержать один или более модифицированных нуклеотидов, более коротких или более длинных фрагментов, модифицированных связей и пр.
В другом предпочтительном воплощении SEQ ID NO: 3-5 включают в себя один или более нуклеотидов LNA.
Модуляция требуемой нуклеиновой кислоты-мишени может быть достигнута несколькими путями, известными в данной области. Например, с помощью антисмысловых олигонуклеотидов, siРНК и т.д. Молекулы ферментативных нуклеиновых кислот (например, рибозимы) являются молекулами нуклеиновых кислот, способными катализировать одну или более различных реакций, включая способность неоднократно расщеплять другие отдельные молекулы нуклеиновых кислот способом, который специфичен в отношении последовательности нуклеотидных оснований. Такие ферментативные молекулы нуклеиновых кислот могут быть использованы, например, для нацеливания виртуально на любой РНК-транскрипт (Zaug et al, 324, Nature 429 1986; Cech, 260 JAMA 3030, 1988; и Jefferies et al, 17 Nucleic Acids Research 1371, 1989).
В силу того, что они специфичны в отношении последовательности, транс-расщепляющие ферментативные молекулы нуклеиновых кислот являются перспективными в качестве терапевтических средств для лечения заболеваний человека (Usman & McSwiggen, (1995) Ann. Rep. Med. Chem. 30, 285-294; Christoffersen and Marr, (1995) J. Med. Chem. 38, 2023-2037). Ферментативные молекулы нуклеиновых кислот могут быть сконструированы таким образом, чтобы расщеплять специфические РНК-мишени среди основных клеточных РНК. Явление такого расщепления делает мРНК нефункциональной и нарушает экспрессию белка с указанной РНК. Таким образом можно селективно ингибировать синтез белка, ассоциированного с болезненным состоянием.
Обычно ферментативные нуклеиновые кислоты с расщепляющей РНК активностью действуют прежде всего путем связывания с РНК-мишенью. Такое связывание происходит на участке-мишени для связывания ферментативной нуклеиновой кислоты, которая удерживается в непосредственной близости от ферментативной части молекулы, которая действует, расщепляя РНК-мишень. Таким образом, ферментативная нуклеиновая кислота прежде всего распознает, а потом связывается с РНК-мишенью путем образования комплементарных пар оснований, и при образовании связей с правильным участком, проявляет свое ферментативное действие, расщепляя указанную РНК-мишень. Стратегическое расщепление такой РНК-мишени нарушит ее способность к прямому синтезу кодируемого белка. После того как ферментативная нуклеиновая кислота свяжется и расщепит свою РНК-мишень, она избавляется от связи с данной РНК, в поисках другой мишени, и может многократно связываться и расщеплять новые мишени.
Для разработки новых нуклеиновых кислот-катализаторов, способных катализировать различные реакции, такие как расщепление и лигирование фосфодиэфирных связей и амидных связей (Joyce, (1989) Gene, 82, 83-87; Beaudry et al, (1992) Science 257, 635-641; Joyce, (1992) Scientific American 267, 90-97; Breaker et al, (1994) TIBTECH 12, 268; Bartel et al, (1993) Science 261: 1411-1418; Szostak, (1993) TIBS 17, 89-93; Kumar et al, (1995) FASEB J., 9, 1183; Breaker, (1996) Curr. Op. Biotech., 1, 442), было использовано несколько подходов, таких как стратегии селекции (эволюции) in vitro (Orgel, (1979) Proc. R. Soc. London, B 205, 435).
Разработка рибозимов, которые являются оптимальными для каталитической активности, была бы существенным вкладом в любую стратегию, в которой используются РНК-расщепляющие рибозимы в целях регуляции экспрессии генов. Рибозим в виде «головки молотка», например, функционирует со скоростью катализа (kcat), приблизительно составляющей 1 мин-1 в присутствии насыщающих (10 мМ) концентраций кофактора Mg2+. Было показано, что искусственный рибозим "РНК-лигаза" катализирует соответствующую реакцию самомодификации со скоростью, приблизительно составляющей 100 мин-1. Кроме того, известно, что определенные модифицированные рибозимы в виде «головки молотка», которые имеют субстрат-связывающие «лапки», сделанные из ДНК, катализирующей расщепление РНК со скоростями многократной оборачиваемости, приближающимися к 100 мин-1. Наконец, при замене специфического остатка внутри каталитического ядра «головки молотка» определенными нуклеотидными аналогами образуются модифицированные рибозимы, которые приобретают 10-кратно увеличенную скорость катализа. Такие достижения показывают, что рибозимы могут вызывать химические трансформации, со скоростями катализа, которые значительно выше, чем скорости, присущие in vitro большей части природных саморасщепляющихся рибозимов. В таком случае возможно, что структуры определенных саморасщепляющихся рибозимов могут быть оптимизированы для получения максимальной каталитической активности, или что могут быть получены полностью новые РНК-мотивы, которые развивают значительно более высокие скорости расщепления фосфодиэфирной связи РНК.
Межмолекулярное расщепление РНК-субстрата РНК-катализатором, который соответствует модели «головки молотка», было впервые показано в 1987 (Uhlenbeck, O. C. (1987) Nature, 328: 596-600). РНК-катализатор был получен и введен в реакцию со множеством молекул РНК, и в результате было продемонстрировано то, что он является истинным каталитзатором.
Каталитические РНК, сконструированные на основе мотива «головки молотка», используются для расщепления специфических последовательностей-мишеней путем подходящих замен оснований в каталитической РНК, с сохранением необходимого спаривания оснований с последовательностями-мишенями (Haseloff and Gerlach, (1988) Nature, 334, 585; Walbot and Bruening, (1988) Nature, 334, 196; Uhlenbeck, O. C. (1987) Nature, 328: 596-600; Koizumi, M., et al. (1988) FEBS Lett., 228: 228-230). Это позволяет использовать каталитическую РНК для расщепления специфических последовательностей-мишеней и указывает на то, что каталитические РНК, сконструированные в соответствии с моделью «головки молотка», возможно, смогут расщепить специфические субстраты РНК in vivo (см. Haseloff and Gerlach, (1988) Nature, 334, 585; Walbot and Bruening, (1988) Nature, 334, 196; Uhlenbeck, O. C. (1987) Nature, 328: 596-600).
РНК-интерференция (РНКi) стала исключительным инструментом для модуляции экспрессии генов у млекопитающих и в клетках млекопитающих. Такой подход требует доставки малых интерферирующих РНК (siРНК) либо в виде РНК как таковой, либо в виде ДНК, с использованием экспрессирующей плазмиды или вируса и кодирующей последовательности для малых шпилечных (U-образных) РНК, которые в результате процессинга превращаются в siРНК. Такая система способствует эффективному транспорту пре-siРНК в цитоплазму, где они являются активными, и позволяет использовать регулируемые и тканеспецифические промоторы для экспрессии генов.
В предпочтительном воплощении олигонуклеотид или антисмысловое соединение содержит олигомер или полимер рибонуклеиновой кислоты (РНК) и/или дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК), или их миметик, химеру, аналог или гомолог. Указанный термин включает в себя олигонуклеотиды, состоящие из образующихся природным путем нуклеотидов, сахаров и ковалентных межнуклеозидных (остов) связей, а также олигонуклеотиды, имеющие участки, которые образуются неприродным путем и которые функционируют сходным образом. Такие модифицированные или замещенные олигонуклеотиды часто бывают востребованы в большей степени, чем нативные формы, поскольку они обладают желательными свойствами, такими, например, как усиленное поглощение клетками, повышенная аффинность в отношении нуклеиновой кислоты-мишени и повышенная стабильность в присутствии нуклеаз.
Согласно настоящему изобретению, олигонуклеотиды или "антисмысловые соединения" включают в себя антисмысловые олигонуклеотиды (например, РНК, ДНК, их миметики, химеры, аналоги или гомологи), рибозимы, олигонуклеотиды внешней вспомогательной последовательности (EGS), соединения siРНК, соединения одно- или двухцепочечной интерферирующей РНК (РНКi), такие соединения как siРНК, saРНК, aРНК и другие олигомерные соединения, которые гибридизуются по меньшей мере с частью нуклеиновой кислоты-мишени и модулируют ее функцию. Как таковые, они могут представлять собой ДНК, РНК, ДНК-подобные, РНК-подобные соединения или их смеси, или же могут быть миметиками одного или нескольких из них. Указанные соединения могут быть одноцепочечными, двухцепочечными, кольцевыми или олигомерными соединениями шпилечного типа и могут содержать такие структурные элементы как внутренние или концевые выпячивания, ошибочные спаривания или петли. Антисмысловые соединения обычно получают линейно, но они могут быть соединены или получены и иным способом, с получением кольцевых и/или разветвленных соединений. Антисмысловые соединения могут включать в себя конструкции, такие, например, как две цепи, гибридизованные таким образом, чтобы получилось полностью или частично двухцепочечное соединение или одноцепочечное соединение с достаточной само-комплементарностью для обеспечения гибридизации и образования полного или частичного двухцепочечного соединения. Двухцепочечные соединения могут быть соединены внутренними участками, оставляя свободными 3’- или 5’-концы, или же они могут быть соединены, образуя непрерывную структуру шпильки или петли. Структура шпильки может содержать нависающий край либо с 5’-, либо с 3’-конца, продуцируя удлинение одноцепочечного характера. Двухцепочечные соединения необязательно могут включать в себя нависающие края на обоих концах. Дополнительные модификации могут включать в себя конъюгатные группы, присоединенные к одному из концов, к избранным нуклеотидным положениям, положениям сахара или к одной из межнуклеозидных связей. Альтернативно, такие две цепи могут быть соединены через фрагмент ненуклеиновой кислоты или линкерную группу. При образовании только из одной цепи дцРНК могут принимать форму само-комплементарной молекулы шпилечного типа, которая дуплицируется сама с собой в обратном направлении с образованием дуплекса. Таким образом, такие дцРНК могут быть полностью или частично двухцепочечными. Специфической модуляции экспрессии гена можно достичь путем стабильной экспрессии дцРНК шпилек в трансгенных клеточных линиях (Hammond et al., (1991) Nat. Rev. Genet, 2, 110-119; Matzke et al., (2001) Curr. Opin. Genet. Dev., 11, 221-227; Sharp, (2001) Genes Dev., 15, 485-490). При образовании из двух цепей или одной цепи, которая принимает форму само-комплементарной молекулы шпилечного типа, которая дуплицируется сама с собой в обратном направлении с образованием дуплекса, две указанные цепи (или дуплекс-образующие области одной цепи) являются комплементарными цепями РНК, между которыми спаривание оснований происходит по схеме Уотсона-Крика.
Сразу же после введения в систему, соединения согласно изобретению могут выявить действие одного или более ферментов или структурных белков, вызывая расщепление или другую модификацию нуклеиновой кислоты-мишени, или же могут действовать на основе механизмов заселения (связывания). Обычно нуклеиновые кислоты (включая олигонуклеотиды) могут быть описаны как "ДНК-подобные" (то есть в целом имеющие один или более 2’-дезокси-сахаров и обычно содержащие, вместо оснований U, основания T) или "РНК-подобные" (то есть в общем имеющие один или более 2’-гидроксила или 2’-модифицированных сахаров и обычно содержащие, вместо оснований T, основания U). Спирали нуклеиновых кислот могут принимать структуру более чем одного типа, чаще всего, A- и B-формы. Обычно считается, что олигонуклеотиды, которые имеют структуру наподобие B-формы, являются "ДНК-подобными", в то время как имеющие A-подобную структуру являются "РНК-подобными. В некоторых воплощениях (в случаях химер) антисмысловое соединение может содержать области как в A-, так и в B-форме.
Антисмысловые соединения согласно настоящему изобретению могут содержать антисмысловую часть длиной приблизительно от 5 примерно до 80 нуклеотидов (то есть приблизительно от 5 примерно до 80 связанных друг с другом нуклеозидов). Это соотносится с длиной антисмысловой цепи или части антисмыслового соединения. Иными словами, одноцепочечное антисмысловое соединение согласно изобретению содержит от 5 приблизительно до 80 нуклеотидов, а двухцепочечное антисмысловое соединение согласно изобретению (такое, например, как дцРНК) содержит смысловую и антисмысловую цепь или ее часть длиной от 5 приблизительно до 80 нуклеотидов. Специалисту в данной области должно быть понятно, что под этим подразумеваются антисмысловые участки длиной в 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79 или 80 нуклеотидов или в некотором диапазоне указанных длин.
В одном из воплощений антисмысловые соединения согласно изобретению имеют антисмысловые участки длиной от 10 до 50 нуклеотидов. Рядовому специалисту в данной области должно быть понятно, что под этим подразумеваются антисмысловые участки длиной в 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 или 50 нуклеотидов или в некотором диапазоне указанных длин. В некоторых воплощениях указанные олигонуклеотиды составляют 15 нуклеотидов в длину.
В одном из воплощений антисмысловые или олигонуклеотидные соединения согласно изобретению имеют антисмысловые участки длиной от 12 или 13 до 30 нуклеотидов. Рядовому специалисту в данной области должно быть понятно, что под этим подразумеваются антисмысловые участки длиной в 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов или в некотором диапазоне указанных длин.
В другом предпочтительном воплощении олигомерные соединения согласно изобретению включают в себя также варианты, в которых в одном или нескольких нуклеотидных положениях в таких соединениях встречаются разные основания. Например, если первым нуклеотидом является аденозин, могут быть получены варианты, которые в указанном положении содержат тимидин, гуанозин или цитидин. Указанное относится к любому из положений в антисмысловых соединениях или в соединениях дцРНК. Затем указанные соединения тестируют с помощью описанных здесь способов с целью определения их способности ингибировать экспрессию нуклеиновой кислоты-мишени.
В некоторых воплощениях степень гомологии, идентичности последовательностей или комплементарности между антисмысловым соединением и мишенью составляет приблизительно от 40% примерно до 60%. В определенных воплощениях степень гомологии, идентичности последовательностей или комплементарности составляет приблизительно от 60% примерно до 70%. В определенных воплощениях степень гомологии, идентичности последовательностей или комплементарности составляет приблизительно от 70% примерно до 80%. В определенных воплощениях степень гомологии, идентичности последовательностей или комплементарности составляет приблизительно от 80% примерно до 90%. В определенных воплощениях степень гомологии, идентичности последовательностей или комплементарности приблизительно составляет 92%, приблизительно 94%, приблизительно 95%, приблизительно 96%, приблизительно 97%, приблизительно 98%, приблизительно 99% или приблизительно 100%.
В другом предпочтительном воплощении антисмысловые олигонуклеотиды, такие, например, как молекулы нуклеиновых кислот, представленные последовательностями SEQ ID NO: 2-5, содержат одну или более замен или модификаций. В одном из воплощений нуклеотиды заменены закрытыми нуклеиновыми кислотами (LNA).
В другом предпочтительном воплощении олигонуклеотиды направлены на одну или несколько областей молекул нуклеиновой кислоты, их смысловые и/или антисмысловые последовательности кодирующих и/или некодирующих последовательностей, ассоциированных с EPO и с последовательностями, представленными как SEQ ID NO: 1, 2. Указанные олигонуклеотиды направлены также на перекрывающиеся области последовательностей SEQ ID NO: 1, 2.
Определенные предпочтительные олигонуклеотиды согласно изобретению являются химерными олигонуклеотидами. "Химерные олигонуклеотиды", или "химеры", в контексте настоящего изобретения, являются олигонуклеотидами, которые содержат две или более химически различных областей, каждая из которых состоит по меньшей мере из одного нуклеотида. Указанные олигонуклеотиды обычно содержат по меньшей мере одну область модифицированных нуклеотидов, которые наделены одним или несколькими благоприятными свойствами (такими, например, как повышенная резистентность к действию нуклеаз, улучшенное поглощение клетками, повышенная аффинность связывания с мишенью), и область, которая является субстратом для ферментов, способных к расщеплению гибридов РНК:ДНК или РНК:РНК. В качестве примера, РНКаза H является клеточной эндонуклеазой, которая расщепляет цепь РНК дуплекса РНК:ДНК. Следовательно, активация РНКазы H приводит к расщеплению РНК-мишени, таким образом сильно увеличивая эффективность антисмысловой модуляции экспрессии генов. И, следовательно, сравнимые результаты могут быть часто получены с более короткими олигонуклеотидами при использовании химерных олигонуклеотидов, по сравнению с фосфоротиоатными дезоксиолигонуклеотидами, гибридизующимися с той же самой областью-мишенью. Расщепление РНК-мишени может, как обычно, определяться методом гель-электрофореза, а в случае необходимости, с помощью известных в данной области ассоциированных технологий гибридизации нуклеиновых кислот. В одном из предпочтительных воплощений химерный олигонуклеотид содержит по меньшей мере одну область, модифицированную таким образом, чтобы увеличить аффинность связывания с мишенью, и, как правило, область, которая действует в качестве субстрата для РНКазы H. Аффинность олигонуклеотида в отношении его мишени (в данном случае, нуклеиновой кислоты, кодирующей ras) обычно определяют путем измерения Tm олигонуклеотида/пары-мишени, которая является температурой, при которой происходит диссоциация олигонуклеотида с мишенью; диссоциацию определяют спектрофотометрически. Чем выше Tm, тем больше аффинность олигонуклеотида в отношении мишени.
Химерные антисмысловые соединения согласно изобретению могут быть образованы в виде композитной структуры двух или более олигонуклеотидов, модифицированных олигонуклеотидов, олигонуклеотидов и/или миметиков олигонуклеотидов, как описано выше. В данной области такие соединения еще называются гибридами или гапмерами. Примеры патентов Соединенных Штатов, в которых описано получение таких гибридных структур, включают в себя, не ограничиваясь перечисленными, патенты США № 5013830; 5149797; 5220007; 5256775; 5366878; 5403711; 5491133; 5565350; 5623065; 5652355; 5652356 и 5700922, каждый из которых включен в настоящее описание в виде ссылки.
В другом предпочтительном воплощении область олигонуклеотида, которая модифицирована, включает в себя по меньшей мере один нуклеотид, модифицированный в 2’-положении сахара, наиболее предпочтительно, 2’-O-алкила, 2’-O-алкил-O-алкила или 2’-фтор-модифицированный нуклеотид. В других предпочтительных воплощениях, модификации РНК включают в себя 2’-фтор-, 2’-амино- и 2’-O-метил-модификации на рибозе пиримидинов, остатки рибозы, лишенные азотистого основания, или инвертированное основание на 3’-конце РНК. Обычно такие модификации стандартными методами вносят в олигонуклеотиды, и показано, что такие олигонуклеотиды имеют более высокое значение Tm (то есть более высокую аффинность в отношении мишени), чем 2’-дезоксиолигонуклеотиды против данной мишени. Эффектом такой повышенной аффинности является еще более усиленное ингибирование РНКi-олигонуклеотидом экспрессии генов. РНКаза H является клеточной эндонуклеазой, которая расщепляет цепь РНК в РНК:ДНК-дуплексах; следовательно, активация РНКазы H приводит к расщеплению РНК-мишени, таким образом сильно увеличивая эффективность РНКi-ингибирования. Расщепление РНК-мишени может определяться, как обычно, методом гель-электрофореза. В другом предпочтительном воплощении химерный олигонуклеотид модифицируют также с целью повышения резистентности в отношении действия нуклеаз. Клетки содержат различные экзо- и эндонуклеазы, которые могут вызывать деградацию нуклеиновых кислот. Было показано, что целый ряд нуклеотидных и нуклеозидных модификаций придают олигонуклеотиду, в который они встроены, дополнительную резистентность к расщеплению под действием нуклеаз по сравнению с нативным олигодезоксинуклеотидом. Резистентность к нуклеазам обычно измеряют путем инкубации олигонуклеотидов с клеточными экстрактами или изолированными растворами нуклеаз, а затем через некоторое время определяют количество оставшегося интактным олигонуклеотида, обычно используя метод гель-электрофореза. Олигонуклеотиды, которые модифицируют для повышения их резистентности к действию нуклеаз, остаются интактными в течение более продолжительного времени, чем немодифицированные олигонуклеотиды. Как было показано, к усилению или приданию резистентности к действию нуклеаз приводят разные модификации олигонуклеотидов. В настоящее время более предпочтительными являются олигонуклеотиды, которые содержат по меньшей мере одну фосфоротиоатную модификацию. В некоторых случаях модификации олигонуклеотидов, которые повышают аффинность их связывания с мишенью, способны также независимо повышать их резистентность к действию нуклеаз. Некоторые полезные модификации можно найти у De Mesmaeker с соавт. (1995) Acc. Chem. Res., 28: 366-374.
Специфические примеры некоторых предпочтительных олигонуклеотидов, предусмотренных в настоящем изобретении, включают в себя олигонуклеотиды, содержащие модифицированный остов, например, фосфоротиоатные связи между сахарами, связи из сложного фосфатного триэфира, метилфосфонатов, из алкила или циклоалкила с короткой цепью, или гетероатомные или гетероциклические связи с короткой цепью между сахарами. Наиболее предпочтительными являются олигонуклеотиды с фосфоротиоатным остовом и таковые с гетероатомным остовом, в частности, CH2-NH-O-CH2, CH,-N(CH3)-O-CH2 [известным как (метилимино) или MMI-остов], CH2-O-N (CH3)-CH2, CH2-N(CH3)-N (CH3)-CH2 и остов O-N(CH3)-CH2-CH2, в которых природный фосфодиэфирный остов представлен в виде O-P-O-CH). Амидные остовы, описанные De Mesmaeker с соавт., (1995) Ace. Chem. Res. 28: 366-374, также являются предпочтительными. Предпочтительными являются также олигонуклеотиды, имеющие морфолино-структуры остова (Summerton and Weller, патент США No. 5,034,506). В других предпочтительных воплощениях, таких как остов пептид-нуклеиновая кислота (PNA), фосфодиэфирный остов олигонуклеотида заменен полиамидным остовом, с нуклеотидами, прямо или косвенно соединенными с аза-атомами азота полиамидного остова (Nielsen et al. (1991) Science 254, 1497). Олигонуклеотиды могут содержать также один или более замещенных сахарных фрагментов. Предпочтительные олигонуклеотиды включают в себя одно из следующего в 2’-положении: OH, SH, SCH3, F, OCN, OCH3 OCH3, OCH3 O(CH2)n CH3, O(CH2)n NH2 или O(CH2)n CH3, где n принимает значения от 1 приблизительно до 10; низший C1-C10-алкил, алкоксиалкокси, замещенный низший алкил, алкарил или аралкил; Cl; Br; CN; CF3; OCF3; O-, S- или N-алкил; O-, S- или N-алкенил; SOCH3; SO2 CH3; ONO2; NO2; N3; NH2; гетероциклоалкил; гетероциклоалкарил; аминоалкиламино; полиалкиламино; замещенный силил; РНК-расщепляющую группу; репортерную группу; интеркалятор; группу для улучшения фармакокинетических свойств олигонуклеотида; или группу для улучшения фармакодинамических свойств олигонуклеотида, и другие заместители, обладающие сходными свойствами.
Предпочтительная модификация включает в себя 2’-метоксиэтокси [2’-O-CH2 CH2 OCH3, известную также как 2’-O-(2-метоксиэтил)] (Martin et al, (1995) Helv. Chim. Acta, 78, 486). Другие предпочтительные модификации включают в себя 2’-метокси (2’-O-CH3), 2’-пропокси (2’-OCH2 CH2CH3) и 2’-фтор (2’-F). Сходные модификации могут быть произведены также и в других положениях олигонуклеотида, в частности, в 3’-положении сахара на 3’-концевом нуклеотиде и в 5’-положении 5’-концевого нуклеотида. Олигонуклеотиды могут содержать также сахарные миметики, такие как циклобутилы вместо пентофуранозильной группы.
Олигонуклеотиды могут также включать в себя, дополнительно или альтернативно, модификации или замены нуклеинового основания (часто называемого в данной области просто "основанием"). Здесь "немодифицированные" или "природные" нуклеотиды включают в себя аденин (A), гуанин (G), тимин (T), цитозин (C) и урацил (U). Модифицированные нуклеотиды включают в себя нуклеотиды, обнаруживаемые в природных нуклеиновых кислотах только в редких случаях или транзитно, например, гипоксантин, 6-метиладенин, 5-метилпиримидины, в частности, 5-метилцитозин (также называемый 5-метил-2’-дезоксицитозином и часто обозначаемый в данной области как 5-Me-C), 5-гидроксиметилцитозин (hMeC), гликозил-hMeC и гентобиозил-hMeC, а также синтетические нуклеотиды, например, 2-аминоаденин, 2-(метиламино)аденин, 2-(имидазолилалкил)аденин, 2-(аминоалкиламино)аденин или другие гетерозамещенные алкиладенины, 2-тиоурацил, 2-тиотимин, 5-бромурацил, 5-гидроксиметилурацил, 8-азагуанин, 7-деазагуанин, N6(6-аминогексил)аденин и 2,6-диаминопурин. (Kornberg, A., DNA Replication, W. H. Freeman & Co., San Francisco, 1980, pp. 75-77; Gebeyehu, G., (1987) et al. Nucl. Acids Res. 15: 4513). Может быть включено "универсальное" основание, известное в данной области, например, инозин. Было показано, что замещения 5-Me-C повышают стабильность дуплекса нуклеиновой кислоты на 0,6-1,2°C (Sanghvi, Y. S., in Crooke, S. T. and Lebleu, B., eds., Antisense Research and Applications, CRC Press, Boca Raton, 1993, pp. 276-278) и в настоящее время являются предпочтительными замещениями.
Другие модификации олигонуклеотидов согласно изобретению включают в себя химически связанные с олигонуклеотидом один или несколько фрагментов или конъюгатов, которые повышают активность или клеточное поглощение олигонуклеотидов. Такие фрагменты включают в себя, но не ограничены липидными фрагментами, такими как фрагмент холестерина (Letsinger et al, (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 6553), холевую кислоту (Manoharan et al. (1994) Bioorg. Med. Chem. Let. 4, 1053), тиоэфира, например, гексил-S-тритилтиол (Manoharan et al. (1992) Ann. KY. Acad. Sci. 660, 306; Manoharan et al. (1993) Bioorg. Med. Chem. Let. 3, 2765), тиохолестерин (Oberhauser et al, (1992) Nucl. Acids Res. 20, 533), алифатическую цепь, например, остатки додекандиола или ундецила (Saison-Behmoaras et al. EMBO J. 1991, 10, 111; Kabanov et al. (1990) FEBS Lett. 259, 327; Svinarchuk et al. (1993) Biochimie 75, 49), фосфолипид, например, ди-гексадецил-rac-глицерин или триэтиламмоний-1,2-ди-O-гексадецил-rac-глицеро-3-H-фосфат (Manoharan et al. (1995) Tetrahedron Lett. 36, 3651; Shea et al. (1990) Nucl. Acids Res. 18, 3777), цепи полиамина или полиэтиленгликоля (Manoharan et al. (1995) Nucleosides & Nucleotides, 14, 969) или адамантануксусной кислоты (Manoharan et al. (1995) Tetrahedron Lett. 36, 3651). Олигонуклеотиды, содержащие липофильные фрагменты, и способы получения таких олигонуклеотидов известны в данной области, например, см. патенты США № 5138045, 5218105 и 5459255.
Необязательно, чтобы все положения в данном олигонуклеотиде были модифицированы одинаковым образом, и на самом деле в отдельный олигонуклеотид или даже в отдельный нуклеозид внутри олигонуклеотида можно встроить более одной из указанных выше модификаций. Настоящее изобретение включает в себя также олигонуклеотиды, которые, как указано выше, являются химерными олигонуклеотидами.
В другом воплощении молекула нуклеиновой кислоты конъюгирована с другим фрагментом, включая, но не ограничиваясь перечисленным, лишенные азотистого основания остатки дезоксирибозы или рибозы, простой полиэфир, полиамин, полиамиды, пептиды, углеводороды, липиды или соединения полиуглеводорода. Специалистам в данной области должно быть понятно, что такие молекулы могут быть связаны с любым одним или несколькими нуклеотидами, содержащимися в указанной молекуле нуклеиновой кислоты в нескольких положениях на группе сахара, группе основания или фосфатной группе.
Олигонуклеотиды, используемые согласно настоящему изобретению, могут быть получены с помощью стандартной и удобной технологии твердофазного синтеза, хорошо известной в данной области. Оборудование для такого синтеза продается несколькими торговыми организациями, включая Applied Biosystems. Могут быть использованы также любые другие способы такого синтеза; современный синтез олигонуклеотидов без каких-либо трудностей может быть осуществлен рядовым специалистом в данной области. Хорошо известно также применение сходных технологий для получения других олигонуклеотидов, таких как фосфоротиоатные алкилированные производные. Хорошо известно также применение сходных технологий и коммерчески доступных продуктов модифицированных амидитов и стекла с контролируемым размером пор (CPG), таких как биотин, флуоресцеин, акридин или псорален-модифицированные амидиты и/или CPG (доступные от компании Glen Research, Sterling VA), для синтезирования флуоресцентно меченных, биотинилированных или иным образом модифицированных олигонуклеотидов, таких как холестерин-модифицированные олигонуклеотиды.
В соответствии с настоящим изобретением, использование модификаций, например, применение мономеров LNA, приводит к усилению, повышению специфичности и продолжительности действия и расширению возможностей введения олигонуклеотидов, содержащихся в используемых в настоящее время химических составах, таких как MOE, ANA, FANA, PS и т.д. (Uhlman, et al. (2000) Current Opinions in Drug Discovery & Development Vol. 3 No 2). Этого можно достичь путем замены некоторых из мономеров в современных олигонуклеотидах мономерами LNA. LNA-модифицированный олигонуклеотид может иметь размер, сходный с таковым родительского соединения, или может иметь больший или, предпочтительно, меньший размер. Предпочтительно, чтобы такие LNA-модифицированные олигонуклеотиды содержали менее чем приблизительно 70%, более предпочтительно, менее чем приблизительно 60%, наиболее предпочтительно, менее чем приблизительно 50% мономеров LNA, и чтобы их размеры составляли приблизительно от 5 до 25 нуклеотидов, более предпочтительно, приблизительно от 12 до 20 нуклеотидов.
Предпочтительным образом модифицированные олигонуклеотидные остовы включают в себя, не ограничиваясь перечисленным, фосфоротиоаты, хиральные фосфоротиоаты, фосфородитиоаты, сложные фосфатные триэфиры, сложные фосфатные аминоалкилтриэфиры, метильные и другие алкилфосфонаты, содержащие 3’-алкиленфосфонаты и хиральные фосфонаты, фосфинаты, фосфорамидаты, содержащие 3’-аминофосфорамидат и аминоалкилфосфорамидаты, тионофосфорамидаты, тионоалкилфосфонаты, сложные фосфатные тионоалкилтриэфиры и боранофосфаты, имеющие в норме 3’-5’-связи, их 2’-5’-связанные аналоги, а также имеющие обратную полярность, при этом соседние пары нуклеозидных элементов связаны в направлении от 3’-5’ к 5’-3’ или от 2’-5’ к 5’-2’. Включены также различные соли, смеси солей и свободные формы кислот.
Репрезентативные патенты Соединенных Штатов, в которых описано получение указанных выше фосфор-содержащих связей, включают в себя, но не ограничены ими, патенты США № 3687808; 4469863; 4476301; 5023243; 5177196; 5188897; 5264423; 5276019; 5278302; 5286717; 5321131; 5399676; 5405939; 5453496; 5455233; 5466677; 5476925; 5519126; 5536821; 5541306; 5550111; 5563253; 5571799; 5587361 и 5625050, каждый из которых включен в настоящее описание в виде ссылки.
Предпочтительные модифицированные олигонуклеотидные остовы, которые не включают в себя атом фосфора, имеют остовы, которые образованы межнуклеозидными алкильными или циклоалкильными связями с короткой цепью, межнуклеозидными смешанными гетероатомными и алкильными или циклоалкильными связями, или одной или несколькими межнуклеозидными гетероатомными или гетероциклическими связями с короткой цепью. Они содержат таковые, имеющие связи морфолино (частично образованные из сахарного фрагмента нуклеозида); силоксановые остовы; сульфидные, сульфоксидные и сульфоновые остовы; формацетиловые и тиоформацетиловые остовы; метиленформацетиловые и тиоформацетиловые остовы; алкенсодержащие остовы; сульфаматные остовы; остовы метиленимино и метиленгидразино; сульфонатные и сульфонамидные остовы; амидные остовы; и другие, имеющие смешанные части из компонентов N, O, S и CH2.
Репрезентативные патенты Соединенных Штатов, в которых описано получение указанных выше олигонуклеозидов, включают в себя, но не ограничены ими, патенты США № 5034506; 5166315; 5185444; 5214134; 5216141; 5235033; 5264 562; 5 264564; 5405938; 5434257; 5466677; 5470967; 5489677; 5541307; 5561225; 5596 086; 5602240; 5610289; 5602240; 5608046; 5610289; 5618704; 5623 070; 5663312; 5633360; 5677437; и 5677439, каждый из которых включен в настоящее описание в виде ссылки.
В других предпочтительных олигонуклеотидных миметиках как сахарная, так и межнуклеозидная связь, то есть остов, нуклеотидных элементов заменены новыми группами. Элементы оснований поддерживаются для гибридизации с соответствующим соединением нуклеиновой кислоты-мишени. Одно из таких олигомерных соединений, миметик олигонуклеотида, который, как было показано, обладает исключительными гибридизационными свойствами, называется пептидом-нуклеиновой кислотой (PNA). В соединениях PNA сахарный остов олигонуклеотида заменен амид-содержащим остовом, в частности, аминоэтилглициновым остовом. Нуклеиновые основания сохранены и прямо или косвенно соединены с аза-атомами азота амидной части остова. Репрезентативные патенты Соединенных Штатов, в которых описано получение соединений PNA, включают в себя, но не ограничены ими, патенты США № 5539082; 5714331 и 5719262, каждый из которых включен в настоящее описание в виде ссылки. Дополнительные сведения о соединениях PNA можно найти у Nielsen с соавт., (1991) Science 254, 1497-1500.
В другом воплощении настоящего изобретения предпочтительными являются олигонуклеотиды с фосфоротиоатными остовами и олигонуклеотиды с гетероатомными остовами, и, в частности, CH2-NH-O-CH2-N(CH3)-O-CH2, известным как (метилимино), или MMI-остов, CH2-O-N(CH3)-CH2, CH2N(CH3)-N(CH3)CH2 и O-N(CH3)-CH2-CH2, где природный фосфодиэфирный остов представлен в виде O-P-O-CH2- в указанном выше патенте США № 5489677, и амидные остовы, описанные у De Mesmaeker с соавт., (1995) Ace. Chem. Res. 28: 366-374. Предпочтительными являются также олигонуклеотиды, имеющие структуры остова морфолино приведенного выше патента США № 5034506.
Модифицированные олигонуклеотиды могут содержать также один или несколько замещенных сахарных фрагментов. Предпочтительные олигонуклеотиды включают в себя одно из следующего в 2’-положении: OH, F, O-, S- или N-алкил; O-, S- или N-алкенил; O-, S- или N-алкинил; или O-алкил-О-алкил, где алкил, алкенил и алкинил могут быть замещены или не замещены С-СО-алкилом или С2-СО-алкенилом и алкинилом. Особенно предпочтительными являются O(CH2)nOmCH3, O(CH2)n, OmCH3, O(CH2)nNH2, O(CH2)nCH3, O(CH2)nONH2 и O(CH2)nONCH2)nCH3)2, где n и m принимают значения от 1 приблизительно до 10. Другие предпочтительные олигонуклеотиды содержат одно из следующего в 2’-положении: С-СО, (низший алкил, замещенный низший алкил, алкарил, аралкил, О-алкарил или О-аралкил), SH, SCH3, OCN, Cl, Br, CN, CF3, OCF3, SOCH3, SO2CH3, ONO2, NO2, N3, NH2, гетероциклоалкил, гетероциклоалкарил, аминоалкиламино, полиалкиламино, замещенный силил, РНК-расщепляющую группу, репортерную группу, интеркалятор, группу для улучшения фармакокинетических свойств олигонуклеотида или группу для улучшения фармакодинамических свойств олигонуклеотида, и другие заместители, обладающие сходными свойствами. Предпочтительная модификация включает в себя 2’-метоксиэтокси (2’-O-CH2CH2OCH3, известную также как 2’-O-(2-метоксиэтил), или 2’-MOE) (Martin et al., (1995) Helv. Chim. Acta, 78, 486-504), то есть алкокси-алкокси-группу. Дополнительная предпочтительная модификация содержит 2’-диметиламинооксиэтокси, то есть группу O(CH2)2ON(CH3)2, известную также как 2’-DMAOE, как здесь описано ниже в примерах, и 2’-диметиламиноэтоксиэтокси (также известную в данной области как 2’-O-диметиламиноэтоксиэтил или 2’-DMAEOE), то есть 2'-O-CH2-O-CH2-N(CH2)2.
Другие предпочтительные модификации включают в себя 2’-метокси (2’-O-CH3), 2’-аминопропокси (2’-OCH2CH2CH2NH2) и 2’-фтор (2’-F). Сходные модификации могут быть произведены также и в других положениях олигонуклеотида, в частности, в 3’-положении сахара на 3’-концевом нуклеотиде или в 2’-5’-связанных олигонуклеотидах и в 5’-положении 5’-концевого нуклеотида. Олигонуклеотиды могут содержать также миметики сахаров, такие как циклобутильные фрагменты вместо пентофуранозильной группы. Репрезентативные патенты Соединенных Штатов, в которых описано получение таких модифицированных структур сахара, включают в себя, но не ограничены ими, патенты США № 4981957; 5118800; 5319080; 5359044; 5393878; 5446137; 5466786; 5514785; 5519134; 5567811; 5576427; 5591722; 5597909; 5610300; 5627053; 5639873; 5646265; 5658873; 5670633 и 5700920, каждый из которых включен в настоящее описание в виде ссылки.
Олигонуклеотиды могут также включать в себя модификации или замены нуклеинового основания (часто называемого в данной области просто "основанием"). Здесь "немодифицированные" или "природные" нуклеотиды включают в себя пуриновые основания аденин (A) и гуанин (G), а также пиримидиновые основания тимин (T), цитозин (C) и урацил (U). Модифицированные нуклеотиды включают в себя также и другие синтетические и природные нуклеотиды, такие как 5-метилцитозин (5-Me-C), 5-гидроксиметилцитозин, ксантин, гипоксантин, 2-аминоаденин, 6-метил и другие алкильные производные аденина и гуанина, 2-пропил и другие алкильные производные аденина и гуанина, 2-тиоурацил, 2-тиотимин и 2-тиоцитозин, 5-галоурацил и цитозин, 5-пропинилурацил и цитозин, 6-азо-урацил, цитозин и тимин, 5-урацил (псевдоурацил), 4-тиоурацил, 8-гало, 8-амино, 8-тиол, 8-тиоалкил, 8-гидроксил и другие 8-замещенные аденины и гуанины, 5-гало, в частности, 5-бром, 5-трифторметил и другие 5-замещенные урацилы и цитозины, 7-метилгуанин и 7-метиладенин, 8-азагуанин и 8-азааденин, 7-деазагуанин и 7-деазааденин и 3-деазагуанин и 3-деазааденин.
Кроме того, нуклеотиды содержат также и материал, описанный в патенте Соединенных Штатов № 3687808, описанный в издании 'The Concise Encyclopedia of Polymer Science And Engineering' на страницах 858-859, Kroschwitz, J.I., ed. John Wiley & Sons, 1990, описанный у Englisch с соавт., Angewandle Chemie, International Edition', 1991, 30, страница 613, а также описанный у Sanghvi, Y. S., Chapter 15, Antisense Research and Applications', на страницах 289-302, Crooke, S.T. and Lebleu, B. ea., CRC Press, 1993. Определенные из указанных нуклеотидов являются особенно полезными для повышения аффинности связывания олигомерных соединений согласно изобретению. Они включают в себя 5-замещенные пиримидины, 6-азапиримидины и N-2, N-6 и 0-6-замещенные пурины, содержащие 2-аминопропиладенин, 5-пропинилурацил и 5-пропинилцитозин. Было показано, что замещения 5-метилцитозина повышают стабильность дуплекса нуклеиновой кислоты на 0,6-1,2°C (Sanghvi, Y. S., Crooke, S.T. and Lebleu, B., eds., Antisense Research and Applications, CRC Press, Boca Raton, 1993, pp. 276-278) и в настоящее время являются предпочтительными замещениями, даже еще конкретнее, в сочетании с модификациями 2’-O-метоксиэтилсахара.
Репрезентативные патенты Соединенных Штатов, в которых описано получение указанных выше модифицированных нуклеотидов, также как и других модифицированных нуклеотидов, включают в себя, но не ограничены ими, патенты США № 3687808, а также 4845205; 5130302; 5134066; 5175 273; 5 367066; 5432272; 5457187; 5459255; 5484908; 5502177; 5525711; 5552540; 5587469; 5596091; 5614617; 5750692 и 5681941, каждый из которых включен в настоящее описание в виде ссылки.
Другая модификация олигонуклеотидов согласно изобретению включает в себя химическое связывание с олигонуклеотидом одного или более фрагментов или конъюгатов, которые повышают активность, клеточное распределение или клеточное поглощение такого олигонуклеотида.
Такие фрагменты включают в себя, но не ограничены перечисленным, липидные фрагменты, такие как холестериновый фрагмент (Letsinger et al, (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 6553-6556), холевую кислоту (Manoharan et al, (1994) Bioorg. Med. Chem. Let., 4, 1053-1060), тиоэфир, например, гексил-S-тритилтиол (Manoharan et al, (1992) Ann. N. Y. Acad. Sci., 660, 306-309; Manoharan et al., (1993) Bioorg. Med. Chem. Let., 3, 2765-2770), тиохолестерин (Oberhauser et al, (1992) Nucl. Acids Res., 20, 533-538), алифатическую цепь, например, остатки додекандиола или ундецила (Kabanov et al, (1990) FEBS Lett., 259, 327-330; Svinarchuk et al, (1993) Biochimie 75, 49-54), фосфолипид, например, ди-гексадецил-rac-глицерин или триэтиламмоний 1,2-ди-O-гексадецил-rac-глицеро-3-H-фосфонат (Manoharan et al, (1995) Tetrahedron Lett., 36, 3651-3654; Shea et al., (1990) Nucl. Acids Res., 18, 3777-3783), цепь полиамина или цепь полиэтиленгликоля (Mancharan et al, (1995) Nucleosides & Nucleotides, 14, 969-973), или адамантануксусную кислоту (Manoharan et al, (1995) Tetrahedron Lett., 36, 3651-3654), фрагмент пальмитила (Mishra et al, (1995) Biochim. Biophys. Acta, 1264, 229-237), или октадециламин или фрагмент гексиламинокарбонил-т-оксихолестерина (Crooke et al, (1996) J. Pharmacol. Exp. Ther., 277, 923-937).
Репрезентативные патенты Соединенных Штатов, в которых описано получение таких олигонуклеотидных конъюгатов, включают в себя, но не ограничены ими, патенты США № 4828979; 4948882; 5218105; 5525465; 5541313; 5545730; 5552538; 5578717 5580731; 5580731; 5591584; 5109124; 5118802; 5138045; 5414077; 5486 603; 5512439; 5578718; 5608046; 4587044; 4605735; 4667025; 4762779; 4789737; 4824941; 4835263; 4876335; 4904582; 4958013; 5082830; 5112963; 5214136; 5082830; 5112963; 5214136; 5245022; 5254469; 5258506; 5262536; 5272250; 5292873; 5317098; 5371241 5391723; 5416203 5451463; 5510475; 5512667; 5514785; 5565552; 5567810; 5574142; 5585481; 5587371; 5595726; 5597696; 5599923; 5599928 и 5688941, каждый из которых включен в настоящее описание в виде ссылки.
Поиск новых лекарственных средств: Соединения согласно настоящему изобретению могут найти применение в областях, связанных с поиском и целевой направленностью новых лекарственных средств. Настоящее изобретение включает в себя применение соединений и предпочтительных сегментов-мишеней, идентифицированных здесь при попытках поиска новых лекарственных средств для выяснения взаимоотношений, которые существуют между полинуклеотидами эритропоэтина (EPO) и состоянием, фенотипом или условиями болезни. Такие способы включают в себя детектирование или модуляцию полинуклеотидов эритропоэтина (EPO), включая приведение образца, ткани, клетки или организма в контакт с соединениями согласно изобретению, количественное определение нуклеиновой кислоты или белкового уровня эритропоэтина (EPO), и/или связанный с этим фенотипический или химический конечный результат в определенной временнóй точке после введения, и, необязательно, сравнение полученного значения с таковым в необработанном образце или в образце, обработанном дополнительным соединением согласно изобретению. Такие способы могут быть предприняты также параллельно или в сочетании с другими экспериментами для определения функции неизвестных генов в подтверждение их целевой направленности или для определения валидности продукта конкретного гена в качестве мишени для лечения или предотвращения конкретного заболевания, состояния или фенотипа.
Оценка стимуляции или ингибирования экспрессии гена:
Перенос экзогенной нуклеиновой кислоты в клетку или организм хозяина может быть установлен путем прямого детектирования присутствия указанной нуклеиновой кислоты в указанной клетке или организме. Такое детектирование может быть достигнуто несколькими способами, хорошо известными в данной области. Например, присутствие экзогенной нуклеиновой кислоты может быть установлено путем саузерн-блоттинга или с помощью технологии полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием праймеров, которые способствуют специфической амплификации нуклеотидных последовательностей, ассоциированных с указанной нуклеиновой кислотой. Экспрессия экзогенных нуклеиновых кислот может быть количественно оценена также и с помощью обычных методов, включая анализ экспрессии гена. Например, мРНК, продуцируемая на основе экзогенной нуклеиновой кислоты, может быть определена и количественно оценена с помощью нозерн-блоттинга или ПЦР с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР).
Экспрессия РНК с экзогенной нуклеиновой кислоты может быть детектирована также путем количественного определения ферментативной активности или активности репортерного белка. Например, модулирующую активность антисмыслового соединения можно измерить непрямым путем по снижению или повышению экспрессии нуклеиновой кислоты-мишени в качестве показателя того, что экзогенная нуклеиновая кислота является продуцентом эффекторной РНК. На основе консервативности последовательности могут быть созданы праймеры, которые можно использовать для амплификации кодирующих областей генов-мишеней. Прежде всего, для построения модели контроля гена можно использовать наиболее сильно экспрессируемую кодирующую область из каждого гена, хотя можно использовать и любую кодирующую или некодирующую область. Каждый контролируемый ген комплектуют путем встраивания каждой кодирующей области между репортерной кодирующей областью и ее поли(A)-сигналом. Такие плазмиды будут продуцировать мРНК с репортерным геном в вышерасположенной части указанного гена и потенциальную РНКi-мишень в 3’-некодирующей области. Эффективность индивидуальных антисмысловых олигонуклеотидов может быть оценена по модуляции репортерного гена. Репортерные гены, используемые в способах согласно настоящему изобретению, включают в себя синтазу ацетогидроксикислот (AHAS), щелочную фосфатазу (ЩФ), бета-галактозидазу (LacZ), бета-глюкуронидазу (GUS), хлорамфениколацетилтрансферазу (CAT), зеленый флуоресцирующий белок (GFP), красный флуоресцирующий белок (RFP), желтый флуоресцирующий белок (YFP), голубой флуоресцирующий белок (CFP), пероксидазу хрена (HRP), люциферазу (Luc), нопалинсинтазу (NOS), октопинсинтазу (OCS) и их производные. Доступно множество селективных маркеров, которые придают резистентность к ампициллину, блеомицину, хлорамфениколу, гентамицину, гигромицину, канамицину, линкомицину, метотрексату, фосфинотрицину, пуромицину и тетрациклину. Способы определения модуляции репортерного гена хорошо известны в данной области и включают в себя, но не ограничены перечисленным, флуориметрические методы (например, метод флуоресцентной спектроскопии, метод сортировки флуоресцентно активированных клеток (FACS), метод флуоресцентной микроскопии), методы определения резистентности к антибиотикам.
Наборы, реагенты для научных исследований, диагностика и терапия
Соединения согласно настоящему изобретению могут быть использованы для диагностики, терапии и профилактики, а также в качестве реагентов для научных исследований и компонентов наборов. Кроме того, антисмысловые олигонуклеотиды, которые способны ингибировать экспрессию генов с исключительной специфичностью, часто используются специалистами в данной области для выявления функции конкретных генов или для выявления различий между функциями разных членов биологического пути обмена.
Для применения в наборах и в диагностике и в различных биологических системах, соединения согласно настоящему изобретению, либо отдельно, либо в сочетании с другими соединениями или терапиями, используются в качестве инструментария в дифференциальных и/или комбинаторных анализах для выявления характера экспрессии части или полного набора генов, экспрессируемых внутри клеток и тканей.
Здесь термин "биологическая система", или "система", определяется как любой организм, клетка, клеточная культура или ткань, которая экспрессирует или становится компетентной в отношении экспрессии продуктов эритропоэтиновых (EPO) генов. Таковые включают в себя, но не ограничены указанным, человека, трансгенных животных, клетки, клеточные культуры, ткани, ксенотрансплантаты, трансплантаты и их сочетания.
В качестве одного неограничивающего примера, характер экспрессии внутри клеток и тканей, обработанных одним или несколькими антисмысловыми соединениями, сравнивают с контрольными клетками или тканями, не обработанными антисмысловыми соединениями, и полученную картину анализируют на разных уровнях экспрессии генов, которые связаны, например, с ассоциацией с заболеванием, с сигнальным путем, клеточной локализацией, уровнем экспрессии, с размером, структурой или функцией исследуемых генов. Такие анализы могут быть предприняты на стимулированных или нестимулированных клетках и в присутствии или в отсутствие других соединений, которые действуют на характер экспрессии.
Примеры известных в данной области способов анализа экспрессии генов включают в себя массив ДНК-матриц или микрочипов (Brazma and Vilo, (2000) FEBS Lett., 480, 17-24; Celis, et al., (2000) FEBS Lett., 480, 2-16), SAGE (серийный анализ экспрессии генов) (Madden, et al., (2000) Drug Discov. Today, 5, 415-425), READS (амплификация ферментов рестрикции расщепленных кДНК) (Prashar and Weissman, (1999) Methods Enzymol., 303, 258-72), TOGA (анализ полной экспрессии гена) (Sutcliffe, et al, (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 97, 1976-81), белковые чипы и протеомику (Celis, et al., (2000) FEBS Lett., 480, 2-16; Jungblut, et al., Electrophoresis, 1999, 20, 2100-10), секвенирование экспрессируемой последовательности tag (EST) (Celis, et al., FEBS Lett., 2000, 480, 2-16; Larsson, et al., J. Biotechnol., 2000, 80, 143-57), субстрактивный фингерпринтинг РНК (SuRF) (Fuchs, et al., (2000) Anal. Biochem. 286, 91-98; Larson, et al., (2000) Cytometry 41, 203-208), субстрактивное клонирование, дифференциальный дисплей (DD) (Jurecic and Belmont, (2000) Curr. Opin. Microbiol. 3, 316-21), сравнительную геномную гибридизацию (Carulli, et al., (1998) J. Cell Biochem. Suppl., 31, 286-96), технологии FISH (флуоресцентная in situ гибридизация) (Going and Gusterson, (1999) Eur. J. Cancer, 35, 1895-904) и методы масс-спектрометрии (To, Comb. (2000) Chem. High Throughput Screen, 3, 235-41).
Соединения согласно изобретению полезны для научных исследований и диагностики, поскольку эти соединения гибридизуются с нуклеиновыми кислотами, кодирующими эритропоэтин (EPO). Например, олигонуклеотиды, которые гибридизуются с такой же эффективностью и в тех же условиях, что и соединения, описанные здесь в качестве эффективных модуляторов эритропоэтина (EPO), являются эффективными праймерами или зондами в условиях, способствующих, соответственно, амплификации или детектированию. Такие праймеры и зонды используются в способах, требующих специфического детектирования молекул нуклеиновой кислоты, кодирующих эритропоэтин (EPO), и при амплификации указанных молекул нуклеиновой кислоты для детектирования или для применения в дальнейших исследованиях эритропоэтина (EPO). Гибридизацию антисмысловых олигонуклеотидов согласно изобретению, в частности, праймеров и зондов, с нуклеиновой кислотой, кодирующей эритропоэтин (EPO), можно обнаружить способами, известными в данной области. Такие способы могут включать в себя конъюгацию фермента с олигонуклеотидом, радиоактивное мечение олигонуклеотида или любые иные подходящие для детектирования средства. Могут быть получены также наборы, в которых используются такие средства для детектирования уровня эритропоэтина (EPO) в образце.
Специфичность и чувствительность антисмысловых соединений используются специалистами в данной области также и в терапевтических целях. Антисмысловые соединения используются в качестве терапевтических составляющих при лечении болезненных состояний у животных, включая человека. Антисмысловые олигонуклеотидные лекарственные средства безопасно и эффективно вводили человеку, и в настоящее время производится целый ряд клинических испытаний. Таким образом, установлено, что антисмысловые соединения могут служить полезными способами воздействия, которые можно отработать для применения в схемах лечения клеток, тканей и животных, в частности, человека.
В терапевтических целях животное, предпочтительно, человека, у которого предполагается наличие заболевания или расстройства, которые можно лечить путем модуляции экспрессии полинуклеотидов эритропоэтина (EPO), лечат путем введения антисмысловых соединений в соответствии с настоящим изобретением. Например, в одном неограничивающем воплощении указанные способы включают в себя стадию введения животному, в случае необходимости лечения, терапевтически эффективное количество модулятора эритропоэтина (EPO). Модуляторы эритропоэтина (EPO) согласно настоящему изобретению эффективно регулируют активность (EPO) или изменяют экспрессию эритропоэтинового (EPO) белка. В одном из воплощений активность или экспрессия эритропоэтина (EPO) у животного ингибируется приблизительно на 10% по сравнению с контролем. Предпочтительно, чтобы активность или экспрессия эритропоэтина (EPO) у животного ингибировалась приблизительно на 30%. Более предпочтительно, чтобы активность или экспрессия эритропоэтина (EPO) у животного ингибировалась приблизительно на 50% или более. Таким образом, олигомерные соединения модулируют экспрессию мРНК эритропоэтина (EPO) по меньшей мере на 10%, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 25%, по меньшей мере на 30%, по меньшей мере на 40%, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 99% или на 100% по сравнению с контролем.
В одном из воплощений активность и/или экспрессия эритропоэтина (EPO) у животного повышена приблизительно на 10% по сравнению с контролем. Предпочтительно, если активность или экспрессия эритропоэтина (EPO) у животного повышена приблизительно на 30%. Более предпочтительно, если активность или экспрессия эритропоэтина (EPO) у животного повышена на 50% или более. Таким образом, олигомерные соединения модулируют экспрессию мРНК эритропоэтина (EPO) по меньшей мере на 10%, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 25%, по меньшей мере на 30%, по меньшей мере на 40%, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 99% или на 100% по сравнению с контролем.
Например, снижение экспрессии эритропоэтина (EPO) может быть измерено в сыворотке, в крови, в жировой ткани, в печени или в любой другой жидкости, ткани или органе животного с использованием методов, описанных в литературе и известных специалистам в данной области. Предпочтительно, чтобы подвергаемые анализу клетки, содержащиеся внутри указанных жидкостей, тканей или органов, содержали молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую пептиды эритропоэтина (EPO) и/или как таковой эритропоэтиновый (EPO) белок.
Соединения согласно изобретению могут быть использованы в фармацевтических композициях путем добавления эффективного количества соединения к подходящему фармацевтически приемлемому разбавителю или носителю. Применение соединений и способов согласно изобретению может быть использовано также и в профилактических целях.
Конъюгаты
Другая модификация олигонуклеотидов согласно изобретению включает в себя химическое связывание с олигонуклеотидом одного или более фрагментов или конъюгатов, которые повышают активность, клеточное распределение или клеточное поглощение указанного олигонуклеотида. Такие фрагменты или конъюгаты могут включать в себя конъюгатные группы, ковалентно связанные с функциональными группами, такими как первичные или вторичные гидроксильные группы. Конъюгатные группы согласно изобретению включают в себя интеркаляторы, репортерные молекулы, полиамины, полиамиды, полиэтиленгликоли, простые полиэфиры, группы, которые усиливают фармакодинамические свойства олигомеров, и группы, которые усиливают фармакокинетические свойства олигомеров. Типичные конъюгатные группы включают в себя холестерины, липиды, фосфолипиды, биотин, феназин, фолат, фенантридин, антрахинон, акридин, флуоресцеин, родамины, кумарины и красители. Группы, которые усиливают фармакодинамические свойства олигомеров, в контексте данного изобретения, включают в себя группы, которые улучшают поглощение, повышают резистентность к деградации и/или усиливают специфичную в отношении последовательности гибридизацию с нуклеиновой кислотой-мишенью. Группы, которые усиливают фармакокинетические свойства, в контексте данного изобретения, включают в себя группы, которые улучшают поглощение, распределение, метаболизм или выведение из организма соединений согласно изобретению. Репрезентативные конъюгатные группы описаны в международной патентной заявке № PCT/US92/09196, поданной 23 октября 1992 г., и в патенте США № 6287860, "Antisense inhibition of MEKK2 expression", при этом оба указанных документа включены в настоящее описание в виде ссылок. Конъюгатные фрагменты включают в себя, но не ограничены перечисленным, липидные фрагменты, такие как холестериновый фрагмент, холевая кислота, тиоэфир, например, гексил-5-тритилтиол, трихолестерин, алифатическую цепь, например, остатки додекандиола или ундецила, фосфолипид, например, ди-гексадецил-rac-глицерин или триэтиламмоний 1,2-ди-O-гексадецил-rac-глицеро-3-H-фосфат, цепь полиамина или полиэтиленгликоля, или адамантануксусную кислоту, пальмитиловый фрагмент, или октадециламиновый или гексиламинокарбонилоксихолестериновый фрагмент. Олигонуклеотиды согласно изобретению могут быть конъюгированы также с активными лекарственными средствами, например, с аспирином, варфарином, фенилбутазоном, ибупрофеном, супрофеном, фенбуфеном, кетопрофеном, (S)-(+)-пранопрофеном, карпрофеном, дансилсаркозином, 2,3,5-трийодбензойной кислотой, флуфенамовой кислотой, фолиновой кислотой, бензотиадиазидом, хлоротиазидом, диазепином, индометацином, барбитуратом, цефалоспорином, лекарственным сульфамидным препаратом, противодиабетическим препаратом, антибактериальным средством или антибиотиком.
Репрезентативные патенты Соединенных Штатов, в которых описано получение таких олигонуклеотидных конъюгатов, включают в себя, но не ограничены ими, патенты США № 4828979; 4948882; 5218105; 5525465; 5541313; 5545730; 5552538; 5578717 5580731; 5580731; 5591584; 5109124; 5118802; 5138045; 5414077; 5486603; 5512439; 5578718; 5608046; 4587044; 4605735; 4667025; 4762779; 4789737; 4824941; 4835263; 4876335; 4904582; 4958013; 5082830; 5112963; 5214136; 5082830; 5112963; 5214136; 5245022; 5254469; 5258506; 5262536; 5272250; 5292873; 5317098; 5371241 5391723; 5416203 5451463; 5510475; 5512667; 5514785; 5565552; 5567810; 5574142; 5585481; 5587371; 5595726; 5597696; 5599923; 5599928 и 5688941.
Композиции
Соединения согласно изобретению могут быть также смешаны, инкапсулированы, конъюгированы или иным способом ассоциированы с другими молекулами, молекулярными структурами или смесями соединений, как, например, липосомы, направленные на рецептор молекулы, пероральные, ректальные, местные или другие композиции, способствующие поглощению, распределению и/или абсорбции. Репрезентативные патенты Соединенных Штатов, в которых описано получение таких способствующих поглощению, распределению и/или абсорбции композиций, включают в себя, но не ограничены перечисленными, патенты США № 5108921; 5354844; 5416016; 5459127; 5521291; 5543165; 5547932; 5583020; 5591721; 4426330; 4534899; 5013556; 5108921; 5213804; 5227170; 5264221; 5356633; 5395619; 5416016; 5417978; 5462854; 5469854; 5512295; 5527528; 5534259; 5543152; 5556948; 5580575; и 5595756, каждый из которых включен в настоящее описание в виде ссылки.
Хотя для модуляции целевой экспрессии и/или функции нет необходимости вводить указанные здесь антисмысловые олигонуклеотиды в формате вектора, воплощения настоящего изобретения связаны с экспрессией векторных конструкций для экспрессии антисмысловых олигонуклеотидов, содержащих промоторы, гибридные промоторные геномные последовательности и обладающих высокой активностью конститутивного промотора или промоторной активностью, которая может быть индуцирована в случае необходимости.
В одном из воплощений осуществление изобретения включает в себя введение по меньшей мере одного из указанных выше антисмысловых олигонуклеотидов с помощью соответствующей системы доставки нуклеиновых кислот. В одном из воплощений такая система включает в себя невирусный вектор, оперативно связанный с полинуклеотидом. Примеры таких невирусных векторов включают в себя олигонуклеотид как таковой (например, любую одну или более из последовательностей SEQ ID NO: 3-5) или в сочетании с соответствующей белковой, полисахаридной или липидной композицией.
Дополнительные подходящие системы доставки нуклеиновых кислот включают в себя вирусный вектор, типичную последовательность по меньшей мере одного из аденовирусов, аденовирус-ассоциированных вирусов (AAV), хелпер-зависимых аденовирусов, ретровирусов или японских гемагглютинирующих вирусов (HVJ) липосомного комплекса. Предпочтительно, чтобы вирусный вектор содержал сильный эукариотический промотор, оперативно связанный с полинуклеотидом, например, промотор цитомегаловируса (CMV).
Дополнительно предпочтительные векторы включают в себя вирусные векторы, слитые белки и химические конъюгаты. Ретровирусные векторы включают в себя вирус мышиного лейкоза Молони и вирусы на основе ВИЧ. Один из предпочтительных вирусов на основе ВИЧ включает в себя по меньшей мере два вектора, в которых гены gag и pol происходят из генома ВИЧ, а ген env происходит из другого вируса. Векторы ДНК-вирусов являются предпочтительными. Такие векторы включают в себя векторы pox, такие как векторы orthopox или avipox, герпес-вирусные векторы, такие как вектор вируса простого герпеса I (HSV) [Geller, A.I. et al., (1995) J. Neurochem, 64: 487; Lim, F., et al., in DNA Cloning: Mammalian Systems, D. Glover, Ed. (Oxford Univ. Press, Oxford England) (1995); Geller, A.I. et al., (1993) Proc Natl. Acad. Sci.: U.S.A.: 90 7603; Geller, A.I., et al., (1990) Proc Natl. Acad. Sci USA: 87: 1149], аденовирусные векторы (LeGal LaSalle et al., Science, 259: 988 (1993); Davidson, et al., (1993) Nat. Genet. 3: 219; Yang, et al., (1995) J. Virol. 69: 2004) и адено-ассоциированные вирусные векторы (Kaplitt, M.G., et al., (1994) Nat. Genet. 8: 148).
Антисмысловые соединения согласно изобретению охватывают любые фармацевтически приемлемые соли, сложные эфиры или соли таких сложных эфиров, или любое другое соединение, которое, при его введении животному, включая человека, способно его обеспечить (прямо или косвенно) их биологически активным метаболитом или остатком.
Термин "фармацевтически приемлемые соли" относится к физиологически и фармацевтически приемлемым солям соединений согласно изобретению: то есть солям, которые сохраняют требуемую биологическую активность родительского соединения и не придают ему нежелательных токсикологических эффектов. Для олигонуклеотидов предпочтительные примеры фармацевтически приемлемых солей и их применений дополнительно описаны в патенте США № 6287860, который включен в настоящее описание в виде ссылки.
Настоящее изобретение включает в себя также фармацевтические композиции и составы, которые содержат антисмысловые соединения согласно изобретению. Фармацевтические композиции согласно изобретению могут быть введены разными путями, в зависимости от того, требуется ли локальное или системное лечение, и от той области, которая должна быть подвергнута лечению. Введение может быть местным (включая офтальмическое, а также слизистые мембраны, включая вагинальную и ректальную доставку), пульмональным, например, путем ингаляции или инсуффляции порошков или аэрозолей, включая введение с помощью небулайзера; интратрахеальным, интраназальным, эпидермальным и трансдермальным), пероральным или парентеральным. Парентеральное введение включает в себя внутривенную, внутриартериальную, подкожную, внутрибрюшинную или внутримышечную инъекцию или инфузию; или внутричерепное, например, интратекальное или интравентрикулярное, введение. Олигонуклеотиды по меньшей мере с одной 2’-O-метоксиэтил-модификацией считаются особенно эффективными для перорального введения. Фармацевтические композиции и составы для местного введения могут включать в себя трансдермальные пластыри, мази, лосьоны, кремы, гели, капли, суппозитории, спреи, жидкости и порошки. Могут быть необходимы или желательны подходящие фармацевтически приемлемые носители, водные, порошковые или масляные основы, загустители и пр. Могут быть использованы также снабженные покрытием презервативы, перчатки и пр.
Фармацевтические композиции согласно настоящему изобретению, которые могут быть представлены в удобной дозированной лекарственной форме, можно получить в соответствии с общепринятой технологией, хорошо известной в фармацевтической индустрии. Такие технологии включают в себя стадию приведения в соприкосновение активных ингредиентов с фармацевтически приемлемым носителем (носителями) или наполнителем (наполнителями). Обычно указанные композиции получают путем равномерного приведения в тесный контакт активных ингредиентов с жидкими носителями или мелкоизмельченными твердыми носителями, или же и с тем, и с другим, а затем, если это необходимо, придания полученному продукту формы.
Композиции согласно настоящему изобретению могут быть составлены в любую из возможных дозированных лекарственных форм, включая, но ими не ограничиваясь, таблетки, капсулы, мягкие капсулы, жидкие сиропы, мягкие гели, суппозитории и спринцовки. Композиции согласно настоящему изобретению могут быть составлены также в виде суспензий в водной, неводной или смешанной среде. Водные суспензии могут дополнительно содержать вещества, которые повышают вязкость суспензии, включая, например, натрийкарбоксиметилцеллюлозу, сорбит и/или декстран. Такая суспензия может содержать также стабилизаторы.
Фармацевтические композиции согласно настоящему изобретению включают в себя, но не ограничиваются перечисленным, растворы, эмульсии, пены и содержащие липосомы составы. Фармацевтические композиции и составы согласно настоящему изобретению могут содержать одно или более веществ, способствующих проникновению, носителей, наполнителей или других активных или неактивных ингредиентов.
Эмульсии обычно представляют собой гетерогенные системы одной жидкости, диспергированной в другой в виде капель, обычно превышающих 0,1 мкм в диаметре. Эмульсии, помимо диспергированных фаз, могут содержать дополнительные компоненты и активное начало, которое может быть представлено в виде раствора в водной фазе, в масляной фазе либо самостоятельно в отдельной фазе. Микроэмульсии составляют отдельное воплощение настоящего изобретения. Эмульсии и их применение хорошо известны специалистам в данной области и дополнительно описаны в патенте США № 6287860.
Составы согласно настоящему изобретению включают в себя липосомные композиции. В настоящем изобретении термин "липосома" означает частицу, составленную из амфифильных липидов, окруженных сферическим бислоем или бислоями. Липосомы представляют собой униламеллярные или мультиламеллярные везикулы, имеющие мембрану, образованную липофильным материалом, и водное содержимое, которое включает в себя композицию, предназначенную для доставки. Катионные липосомы являются положительно заряженными липосомами, которые, как считается, взаимодействуют с отрицательно заряженными молекулами ДНК, с образованием стабильного комплекса. Считается, что чувствительные к pH или отрицательно заряженные липосомы захватывают ДНК, не образуя с ней комплекс. Как катионные, так и некатионные липосомы используются для доставки ДНК к клеткам.
Липосомы включают в себя также "стерически стабилизированные" липосомы, термин, который используется здесь в отношении липосом, содержащих один или более специализированных липидов. При включении их в состав липосом такие специализированные липиды способствуют повышению времени жизни липосом в циркуляции по сравнению с липосомами, не содержащими таких специализированных липидов. Примерами стерически стабилизированных липосом являются такие липосомы, в которых часть образующего везикулы липидного компонента липосом содержит один или более гликолипидов или дериватизирована одним или несколькими гидрофильными полимерами, такими как фрагмент полиэтиленгликоля (PEG). Липосомы и их применение дополнительно описаны в патенте США № 6287860.
Терапевтические составы и композиции согласно изобретению могут также включать в себя поверхностно-активные вещества. Применение поверхностно-активных веществ в производстве лекарственных средств, композиций и в эмульсиях хорошо известно в данной области. Поверхностно-активные вещества и их применение дополнительно описаны в патенте США № 6287860, который включен в настоящее описание в виде ссылки.
В одном из воплощений в настоящем изобретении используются различные вещества, способствующие проникновению, для повышения эффективности доставки нуклеиновых кислот, в частности, олигонуклеотидов. Помимо усиления диффузии нелипофильных лекарственных средств через клеточные мембраны, вещества, способствующие проникновению, усиливают также проникающую способность липофильных лекарственных средств. Вещества, способствующие проникновению, могут быть классифицированы и отнесены к одной из пяти обширных категорий, то есть к поверхностно-активным веществам, жирным кислотам, солям желчных кислот, хелатообразующим агентам и к веществам, не являющимся ни хелатообразующими, ни поверхностно-активными. Вещества, способствующие проникновению, и их применение дополнительно описаны в патенте США № 6287860, который включен в настоящее описание в виде ссылки.
Специалистам в данной области должно быть понятно, что обычно композиции составляют в соответствии с их предполагаемым применением, то есть со способом введения.
Предпочтительные композиции для местного введения включают в себя композиции, в которых олигонуклеотиды согласно изобретению смешивают со средствами для местной доставки, такими как липиды, липосомы, жирные кислоты, эфиры жирных кислот, стероиды, хелатообразующие агенты и поверхностно-активные вещества. Предпочтительными липидами и липосомами являются нейтральные (например, диолеоилфосфатидилэтаноламин DOPE, димиристиоилфосфатидилхолин DMPC, дистеаролифосфатидилхолин), отрицательно заряженные (например, димиристиоилфосфатидилглицерин DMPG) и катионные (например, диолеоилтетраметиламинопропил DOTAP и диолеоилфосфатидилэтаноламин DOTMA).
Для местного или других путей введения олигонуклеотиды согласно изобретению могут быть инкапсулированы в липосомы или могут образовывать с ними комплексы, в частности, с катионными липосомами. Альтернативно, олигонуклеотиды могут образовывать комплекс с липидами, в частности, с катионными липидами. Предпочтительные жирные кислоты и эфиры жирных кислот, их фармацевтически приемлемые соли, а также их применение дополнительно описаны в патенте США № 6287860.
Композиции и составы для перорального введения включают в себя порошки или гранулы, микрочастицы, наночастицы, суспензии или растворы в водной или неводной среде, капсулы, гелевые капсулы, саше, таблетки или мини-таблетки. Могут быть желательны также загустители, вкусовые добавки, разбавители, эмульгаторы, диспергирующие агенты или связующие вещества. Предпочтительными пероральными композициями являются такие композиции, в которые олигонуклеотиды согласно изобретению вводят в сочетании с одним или несколькими веществами, способствующими проникновению, и хелатообразующими веществами. Предпочтительные поверхностно-активные вещества включают в себя жирные кислоты и/или их эфиры и соли, желчные кислоты и/или их соли. Предпочтительные желчные кислоты/соли и их применение дополнительно описаны в патенте США № 6287860, который включен в настоящее описание в виде ссылки. Предпочтительными являются также комбинации веществ, способствующих проникновению, например, жирные кислоты/соли в сочетании с желчными кислотами/солями. Особенно предпочтительной комбинацией является натриевая соль лауриновой кислоты, каприновой кислоты и UDCA. Дополнительные вещества, способствующие проникновению, включают в себя полиоксиэтилен-9-лауриловый эфир, полиоксиэтилен-20-цетиловый эфир. Олигонуклеотиды согласно изобретению могут быть доставлены перорально, в виде гранул, включая распыляемые высушенные частицы, или в виде комплексов, с образованием микро- или наночастиц. Вещества, способствующие образованию олигонуклеотидных комплексов, и их применение дополнительно описаны в патенте США № 6287860, который включен в настоящее описание в виде ссылки. In vivo введение интерферирующих РНК описано, например, в патенте США № 7528118, "RNAi modulation of ApoB and uses thereof", включенном в настоящее описание в виде ссылки.
Композиции и составы для парентерального, интратекального или интравентрикулярного введения могут включать в себя стерильные водные растворы, которые могут содержать также буферы, разбавители и другие подходящие добавки, такие, например, но ими не ограничиваясь, как вещества, способствующие проникновению, соединения-носители и другие фармацевтически приемлемые носители или наполнители.
Определенные воплощения настоящего изобретения связаны с фармацевтическими композициями, содержащими одно или несколько олигомерных соединений и одно или несколько других химиотерапевтических агентов, функционирование которых основано не на антисмысловом механизме. Примеры таких химиотерапевтических агентов включают в себя, но не ограничены противоопухолевыми химиотерапевтическими агентами, такими как даунорубицин, дауномицин, дактиномицин, доксорубицин, эпирубицин, идарубицин, эзорубицин, блеомицин, мафосфамид, ифосфамид, цитозин-арабинозид, бисхлорэтил-нитрозомочевина, бусульфан, митомицин C, актиномицин D, митрамицин, преднизон, гидроксипрогестерон, тестостерон, тамоксифен, дакарбазин, прокарбазин, гексаметилмеламин, пентаметилмеламин, митоксантрон, амсакрин, хлорамбуцил, метилциклогексил-нитрозомочевина, азотистый иприт, мелфалан, циклофосфамид, 6-меркаптопурин, 6-тиогуанин, цитарабин, 5-азацитидин, гидроксимочевину, дезоксикоформицин, 4-гидроксиперокси-циклофосфамид, 5-фторурацил (5-FU), 5-фтордезоксиуридин (5-FUdR), метотрексат (MTX), колхицин, таксол, винкристин, винбластин, этопозид (VP-16), триметрексат, иринотекан, топотекан, гемцитабин, тенипозид, цисплатин и диэтилстилбестрол (DES). При использовании с соединениями согласно изобретению такие химиотерапевтические агенты можно использовать индивидуально (например, 5-FU и олигонуклеотид), последовательно (например, 5-FU и олигонуклеотид в течение определенного периода, после которого вводят MTX и олигонуклеотид), или в сочетании с одним или несколькими другими химиотерапевтическими агентами (например, 5-FU, MTX и олигонуклеотидом, или 5-FU, рентгенотерапией и олигонуклеотидом). Противовоспалительные лекарственные средства, включая, но не ограничиваясь ими, нестероидные противовоспалительные лекарственные средства и кортикостероиды, и антивирусные лекарственные средства, включая, но не ограничиваясь ими, рибивирин, видарабин, ацикловир и ганцикловир, также можно объединять в композиции согласно изобретению. Комбинации антисмысловых соединений и других неантисмысловых лекарственных средств также входят в объем, охватываемый настоящим изобретением. Сочетания из двух или нескольких соединений могут быть использованы вместе или последовательно.
В другом относящемся к этому воплощении, композиции согласно изобретению могут содержать одно или несколько антисмысловых соединений, в частности, олигонуклеотидов, нацеленных на первую нуклеиновую кислоту, и одно или несколько дополнительных антисмысловых соединений, нацеленных на вторую нуклеиновую кислоту-мишень. Например, первой мишенью может быть антисмысловая последовательность эритропоэтина (EPO), а второй мишенью может быть область из другой нуклеотидной последовательности. Альтернативно, композиции согласно изобретению могут содержать два или более антисмысловых соединений, нацеленных на разные области одной и той же эритропоэтиновой (EPO) нуклеиновой кислоты-мишени. Здесь проиллюстрирован целый ряд примеров антисмысловых соединений, а другие могут быть выбраны среди подходящих из известных в данной области соединений. Сочетания из двух или нескольких соединений могут быть использованы вместе или последовательно.
Дозирование
Считается, что состав фармацевтических композиций и их последующее введение (дозирование) входят в компетенцию специалистов в данной области. Дозирование зависит от тяжести и реактивности болезненного состояния, подвергаемого лечению, при этом курс лечения длится от нескольких дней до нескольких месяцев, или до тех пор, пока не наступит выздоровление, или же до тех пор, когда будет достигнуто облегчение состояния болезни. Оптимальные схемы дозирования можно вывести из расчетов, связанных с накоплением лекарственного средства в организме пациента. Рядовой специалист может с легкостью определить оптимальные дозы, способы введения дозировок и частоту введения. Оптимальные дозировки могут варьировать, в зависимости от относительной эффективности индивидуальных олигонуклеотидов, и в целом могут быть оценены на основе показателей EC50, которые были признаны эффективными как in vitro, так и на животных моделях in vivo. Обычно дозировка составляет от 0,01 мкг до 100 г/кг веса тела, и ее можно вводить один или более раз в день, в неделю, в месяц или в год, или даже один раз каждые 2-20 лет. Рядовые специалисты в данной области могут с легкостью оценить частоту введения дозировок на основе измеряемых времени удерживания и концентраций лекарственного средства в жидкостях или тканях организма. После успешного лечения может быть уместно подвергнуть пациента поддерживающей терапии для предупреждения рецидива болезненного состояния, при этом олигонуклеотид вводят в поддерживающих дозах, которые варьируют от 0,01 мкг до 100 г/кг веса тела, от одного или более раз в день до одного раза в каждые 20 лет. Введение антисмыслового олигонуклеотида рибонуклеотидредуктазы пациентам с острым миелолейкозом при изучении действия возрастающих доз было описано в публикации Klisovic с соавт., 2008, "Phase I study of GTI-2040, an antisense to ribonucleotide reductase, in combination with high-dose cytarabine in patients with acute myeloid leukemia," Clin. Cancer Research: 14(12): 3889-95, включенной в настоящее описание в виде ссылки.
Хоть здесь и описаны различные воплощения настоящего изобретения, следует, однако, понимать, что они приведены лишь в качестве примера и ни в коей мере не являются ограничительными. В соответствии с описанием настоящей заявки, можно осуществить целый ряд изменений в отношении описанных здесь воплощений, не выходя за рамки объема или концепции настоящего изобретения. Таким образом, ширина охвата и объем настоящего изобретения не должны быть ограничены ни одним из описанных выше воплощений.
Все указанные здесь документы включены в настоящее описание в виде ссылки. Все цитируемые в настоящей заявке публикации и патентные документы включены в одинаковой степени в виде ссылок, для всех возможных применений, как если бы каждая индивидуальная публикация или патентный документ были указаны отдельно. Цитируя в настоящем документе различные публикации, Заявитель не имеет в виду, что та или иная конкретная ссылка относится к "предшествующему уровню техники" по отношению к настоящему изобретению. Воплощение композиций и способов согласно изобретению проиллюстрировано в приводимых ниже примерах.
ПРИМЕРЫ
Следующие неограничивающие примеры служат для иллюстрации отдельных воплощений настоящего изобретения. Следует понимать, что варианты в соотношениях и альтернативы в элементах приведенных компонентов будут считаться очевидными для специалистов в данной области и входящими в объем воплощений, охватываемых настоящим изобретением.
Пример 1: Конструирование антисмысловых олигонуклеотидов, специфичных в отношении молекулы нуклеиновой кислоты, являющейся антисмысловой и/или смысловой цепью полинуклеотида эритропоэтина (EPO)
Указанный выше термин "олигонуклеотид, специфичный в отношении" или "нацеленный олигонуклеотид" относится к олигонуклеотиду, имеющему последовательность (i) способную образовывать стабильный комплекс с частью гена-мишени, или (ii) способную образовывать стабильный комплекс с частью мРНК-транскрипта гена-мишени.
Выбор соответствующих олигонуклеотидов облегчается использованием компьютерных программ, которые автоматически выравнивают последовательности нуклеиновых кислот и выявляют идентичные или гомологичные области. Такие программы используются для сравнения последовательностей нуклеиновых кислот, полученных, например, путем изучения баз данных, таких как GenBank, или путем секвенирования продуктов ПЦР. Сравнение последовательностей нуклеиновых кислот из разных видов позволяет выбрать последовательности нуклеиновых кислот, имеющие подходящую степень межвидовой идентичности. В случае генов, которые не секвенированы, предпринимают саузерн-блоттинг, позволяющий определить степень идентичности между генами у вида, являющегося мишенью, и у других видов. Как известно в данной области, предпринимая саузерн-блоттинг разных степеней жесткости, можно получить приближенную оценку степени идентичности. Такие процедуры позволяют выбрать олигонуклеотиды, которые обладают высокой степенью комплементарности в отношении последовательностей нуклеиновых кислот-мишеней у субъекта, который нуждается в терапевтическом вмешательстве, и более низкой степенью комплементарности в отношении последовательностей нуклеиновых кислот у других видов. Специалистам в данной области должно быть очевидно, что существует определенный разброс при выборе соответствующих областей генов для применения в настоящем изобретении.
Антисмысловое соединение является "специфически гибридизующимся", если связывание указанного соединения с нуклеиновой кислотой-мишенью мешает осуществлению нормальной функции нуклеиновой кислоты-мишени, вызывая модуляцию функции и/или активности, и имеется степень комплементарности, достаточная для того, чтобы избежать неспецифического связывания антисмыслового соединения с нецелевыми последовательностями нуклеиновых кислот в условиях, при которых желательно осуществление специфического связывания, то есть при физиологических условиях в случаях осуществления анализов in vivo или терапевтического воздействия, и в тех условиях, когда предпринимаются анализы in vitro.
Как известно в данной области, гибридизационные свойства описанных здесь олигонуклеотидов могут определяться посредством одного или более анализов in vitro. Например, указанные свойства описанных здесь олигонуклеотидов могут быть получены путем определения прочности связывания между природной антисмысловой последовательностью-мишенью и потенциальными лекарственными молекулами путем изучения кривых плавления.
Сила связывания между природной антисмысловой последовательностью-мишенью и потенциальной лекарственной молекулой (Молекула) может быть установлена с помощью любого из способов, используемых для оценки силы межмолекулярных взаимодействий, например, анализа кривых плавления.
Путем анализа кривых плавления определяют температуру, при которой происходит быстрый переход из двухцепочечной в одноцепочечную конформацию в случае комплекса между природной антисмысловой последовательностью и Молекулой. Такая температура является широко распространенным критерием надежной оценки силы взаимодействия между двумя такими молекулами.
Анализ кривых плавления может быть предпринят с использованием кДНК-копии природной антисмысловой молекулы РНК или синтетического ДНК- или РНК-нуклеотида, соответствующего участку связывания Молекулы. Доступно множество наборов (например, Applied Biosystems Inc. MeltDoctor kit), содержащих все необходимые реагенты для реализации указанного анализа. Такие наборы включают в себя подходящий буферный раствор, содержащий один из красителей, связывающихся с двухцепочечной ДНК (дцДНК) (такой как красители ABI HRM, SYBR Green, SYTO и т.д.). Свойства красителей дцДНК таковы, что они в свободной форме почти не флуоресцируют, но при связывании с дцДНК продуцируют высокий уровень флуоресценции.
Для выполнения указанного анализа, кДНК или соответствующий олигонуклеотид смешивают с Молекулой в концентрации, определяемой в соответствии с инструкциями конкретного производителя. Полученную смесь нагревают до 95°C, чтобы произошла диссоциация всех образовавшихся ранее комплексов дцДНК, затем медленно охлаждают до комнатной температуры или другой, более низкой, температуры, определяемой производителем такого набора, позволяя молекулам ДНК ренатурировать. Затем вновь образованные комплексы медленно нагревают до 95°C, одновременно регистрируя в непрерывном режиме данные по уровню флуоресценции, продуцируемой в результате такой реакции. Интенсивность флуоресценции обратно пропорциональна количеству присутствующей в реакционной смеси дцДНК. Указанные данные можно получать, используя инструментарий ПЦР в реальном масштабе времени, совместимый с таким набором (например, ABI’s StepOne Plus Real Time PCR System или LightTyper instrument, Roche Diagnostics, Lewes, UK).
Пики плавления выстраивают путем нанесения отрицательной производной значения флуоресценции от температуры (-d(флуоресценции)/dT) по оси Y) против температуры (ось Х), используя для этого соответствующую компьютерную программу (например, LightTyper (Roche) или SDS Dissociation Curve, ABI). Полученные данные анализируют на предмет определения температуры быстрого перехода из состояния комплексной дцДНК в одноцепочечные молекулы. Эту температуру обозначают Tm, и она обратно пропорциональна силе взаимодействия между двумя указанными молекулами. Обычно Tm превышает 40°C.
Пример 2: Модуляция полинуклеотидов EPO
Клетки HepG2 из ATCC (cat# HB-8065) выращивали в ростовой среде (MEM/EBSS (Hyclone cat #SH30024, или Mediatech cat # MT-10-010-CV) +10% FBS (Mediatech cat# MT35-OH-CV)+ пенициллин/стрептомицин (Mediatech cat# MT30-002-CI)) при 37°C и 5% CO2. За день до эксперимента клетки пересевали при плотности 1,5×105/мл в 6-луночные планшеты и инкубировали при 37°C и 5% CO2. В день эксперимента среду в 6-луночных планшетах заменяли свежей ростовой средой. Все антисмысловые олигонуклеотиды разбавляли до концентрации 20 мкМ. Два мкл указанного раствора инкубировали с 400 мкл среды Opti-MEM media (Gibco cat#31985-070) и 4 мкл липофектамина-2000 (Invitrogen cat# 11668019) при комнатной температуре в течение 20 мин и добавляли к каждой лунке 6-луночных планшетов, содержащей клетки HepG2. Сходную смесь, которая содержала 2 мкл воды вместо раствора олигонуклеотида, использовали для mock-трансфицированных контролей. Через 3-18 ч инкубации при 37°C и 5% CO2 среду заменяли свежей ростовой средой. Через 48 час после добавления антисмысловых олигонуклеотидов среду удаляли, и из клеток выделяли РНК, используя систему SV Total РНК Isolation System компании Promega (cat#Z3105) или же набор RNeasy Total РНК Isolation kit компании Qiagen (cat#74181), в соответствии с инструкциями производителя. 600 нг РНК добавляли к реакции обратной транскрипции, проводимой с использованием набора Verso кДНК от компании Thermo Scientific (cat#AB1453B) или же набора High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (cat#4368813), как описано в протоколе производителя. кДНК из указанной реакции обратной транскрипции использовали для мониторинга экспрессии гена в методе ПЦР в реальном масштабе времени с использованием смеси ABI Taqman Gene Expression Mix (cat#4369510) для анализа экспрессии гена и праймеры/зонды от компании ABI (Applied Biosystems Taqman Gene Expression Assay: Hs00171267_ml by Applied Biosystems Inc., Foster City CA). В следующем цикле ПЦР использовали условия: 50°C в течение 2 мин, 95°C в течение 10 мин, 40 циклов (95°C в течение 15 секунд, 60°C в течение 1 мин) с использованием инструментария ПЦР в реальном масштабе времени, StepOne Plus (Applied Biosystems).
Кратность изменений генной экспрессии после обработки антисмысловыми олигонуклеотидами вычисляли на основе различий в 18S-нормализованных значениях dCt между обработанными и mock-трансфицированными образцами.
Праймеры и зонды для специально разработанного Taqman-анализа для EPOAS, антисмысловые в отношении природного EPO, (SEQ ID NO: 2): Последовательность прямого праймера Seq. ACCACCCCGGTGTCAAG (SEQ ID NO: 9)
Последовательность обратного праймера Seq. TTTACCTGTTTTCGCACCTACCAT (SEQ ID NO: 10)
Репортерная последовательность Seq. CAAGCTGTGACTTCTC (SEQ ID NO: 11) Краситель репортера 1: FAM
Результаты
Результаты ПЦР в реальном масштабе времени показали, что уровни мРНК EPO в клетках HepG2 значительно повышаются через 48 час после обработки двумя siРНК, созданными для epoas (epoas_1, P=0,02, и epoas_2, P=0,04, Фиг. 1A). В тех же самых образцах уровни РНК epoas были, возможно, снижены после обработки указанными siРНК для epoas (Фиг. 1B).
Пример 3: Модуляция белкового продукта EPO in vitro
Клетки HepG2, обработанные антисмысловыми олигонуклеотидами EPO, как описано в примере 2, изучали на предмет экспрессии белка EPO. Концентрацию и уровни секреции человеческого белка EPO, присутствующего в клеточных супернатантах, изучали с помощью набора для твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA) (например, коммерчески доступного человеческого эритропоэтина производства компании Quantikine, R&D Systems, Minneapolis, MN), в соответствии с инструкциями производителя, и сравнивали с уровнями в нетрансфицированных контрольных областях.
Пример 4: Модуляция полинуклеотида и белкового продукта EPO у мышей ICGN
Антисмысловые олигонуклеотиды, специфичные в отношении EPO-AS, вводили мышам ICGN (мыши с гломерулонефритом, полученные из линии мышей ICR), являющимся генетической моделью анемии у мышей, и осуществляли мониторинг улучшения состояния анемии. См., например, публикацию Nagasaki, et al., 2009, "Amelioration of Anemia in the ICGN Mouse, a Renal Anemia Model, with a Subcutaneous Bolus Injection of Erythropoietin Adsorbed to Hydroxyapatite Matrix," J. Vet. Med. Sci. 71(10): 1365-1371, включенную в настоящее описание в виде ссылки. Олигонуклеотиды вводят в хвостовую вену путем инъекции иглой 27G. Болюсную дозу антисмысловых олигонуклеотидов (SEQ ID NO: 3, 4 и 5) растворяли в PBS до концентрации, предусматривающей доставку предполагаемой дозы в 8 мкл/г веса тела. Мышей держали под инфракрасной лампой приблизительно в течение 3 мин перед введением дозы для облегчения проведения инъекции. Контрольным мышам вводили такой же объем чистого PBS.
Предварительно, в течение нескольких дней до начала введения указанных дозировок, из хвостовой вены собирали по 4-7 капель образцов крови.
Образцы крови брали из нижней полой вены под CO2-анестезией или эфирным наркозом и использовали для генетических анализов. Уровни мРНК EPO измеряли методом ОТ-ПЦР, как было описано ранее. Твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA) был предпринят с помощью набора Human EPO ELISA Kit (например, человеческого эритропоэтина, доступного от компании Quantikine, R&D Systems, Minneapolis, MN, или Stemcell Technologies, Vancouver, BC, Canada) для определения концентрации rhEPO в плазме. Гематологические анализы предпринимали с помощью автоматического счетчика (KX-21NV; Sysmex, Kobe, Japan), в соответствии с прилагаемым руководством. Ретикулоциты считали на предметных стеклах в мазках крови, окрашенных раствором метиленового синего (Brecher's New Methylene Blue Solution), и вычисляли процент ретикулоцитов. Количество эритроцитов, концентрацию гемоглобина, гематокритное число и степень удерживания (sustaining rate), которая представляет собой отношение значения на день 21 к таковому на день 0, оценивают как удерживание эффективности гематопоэза. Мышей умерщвляли под эфирным наркозом, и изъятые из них печень, почки и селезенку взвешивали. Печень, селезенку и подкожную ткань фиксировали в 10% нейтральном забуференном формалине, и, после окрашивания гематоксилином и эозином, проводили гистопатологический анализ.
Пример 5: Модуляция экспрессии полинуклеотида и белкового продукта EPO у пациентов с анемией
Пациентов с анемией лечили антисмысловыми олигонуклеотидами EPO. Пациентам вводили антисмысловые олигонуклеотиды (SEQ ID NO: 3, 4 и 5) путем в/в инфузии из расчета 5 мг/кг, от одного до пяти раз в неделю. Гемоглобин определяли регулярно, например, раз в неделю, стандартным спектрофотометрическим методом. Лечение корректировали, соответственно, в зависимости от относительного изменения от недели к неделе наблюдаемого уровня гемоглобина. Дозировку снижали, когда уровень гемоглобина приближался к 12 г/дл или повышался более чем на 1 г/дл за какой-нибудь из 2-недельных периодов. (См., например, руководство по введению эритропоэтина на вкладыше в упаковке для Epogen®, доступном по адресу в Интернете http://www.epogen.com/pdf/epogen_pi.pdf, включенному в настоящее описание в виде ссылки.)
Изучали экспрессию белка и мРНК EPO. Концентрацию и уровни секреции белка EPO определяли с помощью набора для твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA) (например, человеческого эритропоэтина, коммерчески доступного от компании Quantikine, R&D Systems, Minneapolis, MN), в соответствии с инструкциями производителя. мРНК изучали с помощью ОТ-ПЦР, как описано в другой части настоящего описания.
Хоть изобретение проиллюстрировано и описано применительно к одному или нескольким воплощениям, у специалистов в данной области, при ознакомлении с настоящим описанием и прилагаемым графическим материалом и их осмыслении, могут возникнуть определенные эквивалентные идеи и модификации. Кроме того, даже если какой-нибудь конкретный признак настоящего изобретения описан здесь со ссылкой только на одно из целого ряда возможных применений, такой признак может быть сочетан с одним или несколькими другими признаками, связанными с другими применениями, поскольку это может оказаться востребованным и эффективным для любого какого-нибудь или для конкретного практического применения.
Реферат, прилагаемый к описанию, позволит читателю быстро установить сущность данного технического описания. Он представлен с учетом того, что не будет использован для интерпретации или ограничения объема или значения нижеследующей формулы изобретения.

Claims (25)

1. Способ стимуляции экспрессии полинуклеотида эритропоэтина (ЕРО), имеющего последовательность SEQ ID NO: 1 или 2, в клетках или тканях пациента in vivo или in vitro, предусматривающий приведение указанных клеток или тканей в контакт по меньшей мере с одним одноцепочечным, необязательно модифицированным, антисмысловым олигонуклеотидом длиной в 10-30 нуклеотидов или необязательно модифицированным двухцепочечным антисмысловым олигонуклеотидом длиной в 19-30 нуклеотидов, который нацелен на комплементарную область природного антисмыслового олигонуклеотида полинуклеотида эритропоэтина (ЕРО), где природный антисмысловой олигонуклеотид содержит SEQ ID NO: 3; в результате этого происходит стимуляция экспрессии полинуклеотида эритропоэтина (ЕРО) в клетках или тканях пациента in vivo или in vitro.
2. Способ по п. 1, в котором экспрессия эритропоэтина (ЕРО) in vivo или in vitro повышается по сравнению с контролем.
3. Способ по п. 1, в котором по меньшей мере один антисмысловой олигонуклеотид нацелен на последовательность нуклеиновой кислоты указанного природного антисмыслового олигонуклеотида, которая комплементарна указанной природной антисмысловой последовательности.
4. Способ по п. 1, в котором по меньшей мере один антисмысловой олигонуклеотид нацелен на природный антисмысловой олигонуклеотид, имеющий перекрывающиеся или неперекрывающиеся последовательности эритропоэтинового (ЕРО) полинуклеотида.
5. Способ по п. 1, в котором по меньшей мере один антисмысловой олигонуклеотид содержит одну или несколько модификаций, выбранных по меньшей мере из одного модифицированного сахарного фрагмента, по меньшей мере из одной модифицированной межнуклеозидной связи, по меньшей мере из одного модифицированного нуклеотида, а также их сочетаний.
6. Способ по п. 5, в котором указанные одна или несколько модификаций содержат по меньшей мере один модифицированный сахарный фрагмент, выбранный из 2'-О-метоксиэтил-модифицированного сахарного фрагмента, 2'-метокси-модифицированного сахарного фрагмента, 2'-O-алкил-модифицированного сахарного фрагмента, бициклического сахарного фрагмента и их сочетаний.
7. Способ по п. 5, в котором указанные одна или несколько модификаций содержат по меньшей мере одну модифицированную межнуклеозидную связь, выбранную из фосфоротиоата, 2'-O-метоксиэтила (МОЕ), 2'-фторо, алкилфосфоната, фосфородитионата, алкилфосфонотиоата, фосфорамидата, карбамата, карбоната, сложного фосфатного триэфира, ацетамида, сложного карбоксиметилового эфира и их сочетаний.
8. Способ по п. 5, в котором указанные одна или несколько модификаций содержат по меньшей мере один модифицированный нуклеотид, выбранный из пептид-нуклеиновой кислоты (PNA), закрытой нуклеиновой кислоты (LNA), арабино-нуклеиновой кислоты (FANA), их аналогов, производных, а также их сочетаний.
9. Способ по п. 1, в котором по меньшей мере один олигонуклеотид содержит олигонуклеотидную последовательность, приведенную в виде SEQ ID NO: 4.
10. Способ стимуляции экспрессии гена эритропоэтина (ЕРО) в клетках или тканях млекопитающего in vivo или in vitro, предусматривающий приведение указанных клеток или тканей в контакт по меньшей мере с одним олигонуклеотидом короткой интерферирующей РНК (siPHK) длиной в 19-30 нуклеотидов, где указанный по меньшей мере один олигонуклеотид siPHK является специфичным в отношении природного антисмыслового полинуклеотида эритропоэтина (ЕРО), выбранного из SEQ ID NO: 3.
11. Способ по п. 10, согласно которому указанный олигонуклеотид имеет последовательность, по меньшей мере на 90% комплементарную последовательности природного антисмыслового эритропоэтинового (ЕРО) полинуклеотида.
12. Синтетический, необязательно модифицированный олигонуклеотид длиной в 10-30 нуклеотидов или длиной в 19-30 нуклеотидов, где по меньшей мере одна модификация выбрана по меньшей мере из одного модифицированного сахарного фрагмента; по меньшей мере из одной модифицированной межнуклеотидной связи; по меньшей мере из одного модифицированного нуклеотида, а также из их сочетаний; при этом указанный олигонуклеотид является антисмысловым соединением, которое гибридизуется с природным антисмысловым полинуклеотидом, имеющим SEQ ID NO: 3, и вызывает стимуляцию экспрессии гена эритропоэтина (ЕРО) in vivo или in vitro, по сравнению с нормальным контролем.
13. Олигонуклеотид по п. 12, в котором по меньшей мере одна модификация содержит по меньшей мере одну межнуклеотидную связь, выбранную из группы, состоящей из фосфоротиоата, алкилфосфоната, фосфородитиоата, алкилфосфонотиоата, фосфорамидата, карбамата, карбоната, сложного фосфатного триэфира, ацетамида, сложного карбоксиметилового эфира и их сочетаний.
14. Олигонуклеотид по п. 12, где указанный олигонуклеотид содержит по меньшей мере одну фосфоротиоатную межнуклеотидную связь.
15. Олигонуклеотид по п. 12, где указанный олигонуклеотид содержит остов из фосфоротиоатных межнуклеотидных связей.
16. Олигонуклеотид по п. 12, где указанный олигонуклеотид содержит по меньшей мере один модифицированный нуклеотид, выбранный из пептид-нуклеиновой кислоты, закрытой нуклеиновой кислоты (LNA), их аналога, производного, а также их сочетаний.
17. Олигонуклеотид по п. 12, где указанный олигонуклеотид содержит модифицированный сахарный фрагмент, выбранный из 2'-O-метилоксиэтил-модифицированного сахарного фрагмента, 2'-метокси-модифицированного сахарного фрагмента, 2'-O-алкил-модифицированного сахарного фрагмента, бициклического сахарного фрагмента, а также их сочетаний.
18. Олигонуклеотид по п. 12, где указанный олигонуклеотид имеет последовательность, по меньшей мере приблизительно на 80% идентичную комплементарной последовательности по меньшей мере приблизительно пяти смежных нуклеиновых кислот антисмысловой и/или смысловой кодирующей и/или некодирующей последовательностей нуклеиновой кислоты эритропоэтинового (ЕРО) полинуклеотида.
19. Олигонуклеотид по п. 12, где указанный олигонуклеотид содержит последовательность, представленную в виде SEQ ID NO: 4.
20. Композиция для стимуляции экспрессии гена эритропоэтина (ЕРО) в клетках или тканях млекопитающего in vivo или in vitro, содержащая один или более олигонуклеотидов по п. 12 и фармацевтически приемлемый наполнитель.
21. Композиция по п. 20, в которой указанные олигонуклеотиды имеют последовательность, по меньшей мере приблизительно на 40% идентичную нуклеотидной последовательности, представленной в виде SEQ ID NO: 4.
22. Композиция по п. 20, в которой указанные олигонуклеотиды содержат нуклеотидную последовательность, представленную в виде SEQ ID NO: 4.
23. Композиция по п. 20, в которой указанный олигонуклеотид, представленный в виде SEQ ID NO: 4, содержит одну или более модификаций или нуклеотидных замен.
24. Композиция по п. 23, в которой указанные одна или более модификаций или нуклеотидных замен выбраны из фосфоротиоата, метилфосфоната, пептид-нуклеиновой кислоты, молекул закрытой нуклеиновой кислоты (LNA), а также из их сочетаний.
25. Способ лечения заболевания или расстройства, ассоциированного по меньшей мере с одним эритропоэтиновым (ЕРО) полинуклеотидом, имеющим последовательность SEQ ID NO: 1 или 2, и/или по меньшей мере с одним кодируемым им продуктом, где заболевание или расстройство, ассоциированное по меньшей мере с одним эритропоэтиновым (ЕРО) полинуклеотидом, выбрано из следующего: заболевания, расстройства или состояния гематологического нарушения, заболевания крови, характеризующегося низкой или дефективной продукцией эритроцитов, анемии, где способ предусматривает введение пациенту терапевтически эффективной дозы по меньшей мере одного антисмыслового олигонуклеотида длиной 10-30 нуклеотидов, который связывается с природной антисмысловой последовательностью указанного по меньшей мере одного эритропоэтинового (ЕРО) полинуклеотида, имеющего SEQ ID NO: 3, и вызывает стимуляцию экспрессии указанного по меньшей мере одного эритропоэтинового (ЕРО) полинуклеотида; в результате чего осуществляется лечение заболевания или расстройства, ассоциированного по меньшей мере с одним эритропоэтиновым (ЕРО) полинуклеотидом и/или по меньшей мере с одним кодируемым им продуктом.
RU2011127200A 2008-12-04 2009-12-03 Лечение связанных с эритропоэтином (еро) заболеваний путем ингибирования природного антисмыслового транскрипта к еро RU2620970C2 (ru)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US11996108P 2008-12-04 2008-12-04
US61/119,961 2008-12-04
PCT/US2009/066659 WO2010065792A2 (en) 2008-12-04 2009-12-03 Treatment of erythropoietin (epo) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to epo

Publications (2)

Publication Number Publication Date
RU2011127200A RU2011127200A (ru) 2013-01-10
RU2620970C2 true RU2620970C2 (ru) 2017-05-30

Family

ID=42233874

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2011127200A RU2620970C2 (ru) 2008-12-04 2009-12-03 Лечение связанных с эритропоэтином (еро) заболеваний путем ингибирования природного антисмыслового транскрипта к еро

Country Status (10)

Country Link
US (3) US8921329B2 (ru)
EP (1) EP2370579B1 (ru)
JP (1) JP6091752B2 (ru)
KR (1) KR101829469B1 (ru)
CN (1) CN102317458B (ru)
CA (1) CA2745329C (ru)
ES (1) ES2629630T3 (ru)
MX (2) MX2011005910A (ru)
RU (1) RU2620970C2 (ru)
WO (1) WO2010065792A2 (ru)

Families Citing this family (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102317458B (zh) 2008-12-04 2018-01-02 库尔纳公司 通过红细胞生成素(epo)天然反义转录物的抑制对epo相关疾病的治疗
JP6023705B2 (ja) 2010-06-23 2016-11-09 カッパーアールエヌエー，インコーポレイテッド ナトリウムチャネル、電位依存性、αサブユニット（ＳＣＮＡ）に対する天然アンチセンス転写物の阻害によるＳＣＮＡ関連疾患の治療
CN103068982B (zh) * 2010-07-14 2017-06-09 库尔纳公司 通过抑制盘状大同系物(dlg)的天然反义转录物而治疗dlg相关疾病
WO2012054723A2 (en) * 2010-10-22 2012-04-26 Opko Curna Llc Treatment of alpha-l-iduronidase (idua) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to idua
US9920317B2 (en) 2010-11-12 2018-03-20 The General Hospital Corporation Polycomb-associated non-coding RNAs
DK2638163T3 (en) 2010-11-12 2017-07-24 Massachusetts Gen Hospital POLYCOMB-ASSOCIATED NON-CODING RNAs
EP2643463B1 (en) 2010-11-23 2017-09-27 CuRNA, Inc. Treatment of nanog related diseases by inhibition of natural antisense transcript to nanog
US9402919B2 (en) * 2011-03-04 2016-08-02 Intrexon Corporation Vectors conditionally expressing protein
AU2012225298B2 (en) * 2011-03-09 2017-05-11 The Johns Hopkins University Compounds and methods of use in ablative radiotherapy
EP2718439B1 (en) * 2011-06-09 2017-08-09 CuRNA, Inc. Treatment of frataxin (fxn) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to fxn
JP2015518712A (ja) 2012-05-16 2015-07-06 ラナ セラピューティクス インコーポレイテッド Ｍｅｃｐ２発現を調節するための組成物及び方法
WO2013173638A1 (en) 2012-05-16 2013-11-21 Rana Therapeutics, Inc. Compositions and methods for modulating smn gene family expression
JP2015518713A (ja) 2012-05-16 2015-07-06 ラナ セラピューティクス インコーポレイテッド Ｕｔｒｎ発現を調節するための組成物及び方法
US10837014B2 (en) 2012-05-16 2020-11-17 Translate Bio Ma, Inc. Compositions and methods for modulating SMN gene family expression
EP2850188A4 (en) 2012-05-16 2016-01-20 Rana Therapeutics Inc COMPOSITIONS AND METHOD FOR MODULATING THE EXPRESSION OF THE HEMOGLOBIN GENE FAMILIES
EA201492114A1 (ru) 2012-05-16 2015-04-30 Рана Терапьютикс, Инк. Композиции и способы для модулирования экспрессии генов
CN104583401A (zh) 2012-05-16 2015-04-29 Rana医疗有限公司 用于调节atp2a2表达的组合物和方法
CN102872464A (zh) * 2012-10-17 2013-01-16 汕头大学·香港中文大学联合汕头国际眼科中心 一种新型脉络膜新生血管基因治疗药物及其用途
KR101500368B1 (ko) * 2013-07-08 2015-03-10 현대자동차 주식회사 충전 장치 및 충전 방법
US10858650B2 (en) 2014-10-30 2020-12-08 The General Hospital Corporation Methods for modulating ATRX-dependent gene repression
WO2016149455A2 (en) 2015-03-17 2016-09-22 The General Hospital Corporation The rna interactome of polycomb repressive complex 1 (prc1)
US10912791B2 (en) 2016-09-14 2021-02-09 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Compositions comprising antisense-encoded erythropoietin receptor and use thereof
CN112639467B (zh) * 2018-12-25 2024-04-09 深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司 血小板模拟粒子及其制备方法以及含该模拟粒子的质控物或校准物

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2233333C2 (ru) * 1993-05-18 2004-07-27 Рон-Пуленк Роре С.А. Вирусные векторы и их применение в генной терапии
WO2008091703A2 (en) * 2007-01-24 2008-07-31 The Rockefeller University Chemically modified oligonucleotides for use in modulating micro rna and uses thereof
US20090258925A1 (en) * 2005-12-28 2009-10-15 Claes Wahlestedt Natural antisense and non-coding rna transcripts as drug targets

Family Cites Families (394)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3687808A (en) 1969-08-14 1972-08-29 Univ Leland Stanford Junior Synthetic polynucleotides
US4469863A (en) 1980-11-12 1984-09-04 Ts O Paul O P Nonionic nucleic acid alkyl and aryl phosphonates and processes for manufacture and use thereof
US4534899A (en) 1981-07-20 1985-08-13 Lipid Specialties, Inc. Synthetic phospholipid compounds
US4426330A (en) 1981-07-20 1984-01-17 Lipid Specialties, Inc. Synthetic phospholipid compounds
US5023243A (en) 1981-10-23 1991-06-11 Molecular Biosystems, Inc. Oligonucleotide therapeutic agent and method of making same
US4476301A (en) 1982-04-29 1984-10-09 Centre National De La Recherche Scientifique Oligonucleotides, a process for preparing the same and their application as mediators of the action of interferon
JPS5927900A (ja) 1982-08-09 1984-02-14 Wakunaga Seiyaku Kk 固定化オリゴヌクレオチド
FR2540122B1 (fr) 1983-01-27 1985-11-29 Centre Nat Rech Scient Nouveaux composes comportant une sequence d'oligonucleotide liee a un agent d'intercalation, leur procede de synthese et leur application
US4605735A (en) 1983-02-14 1986-08-12 Wakunaga Seiyaku Kabushiki Kaisha Oligonucleotide derivatives
US4948882A (en) 1983-02-22 1990-08-14 Syngene, Inc. Single-stranded labelled oligonucleotides, reactive monomers and methods of synthesis
NZ207394A (en) 1983-03-08 1987-03-06 Commw Serum Lab Commission Detecting or determining sequence of amino acids
US4824941A (en) 1983-03-10 1989-04-25 Julian Gordon Specific antibody to the native form of 2'5'-oligonucleotides, the method of preparation and the use as reagents in immunoassays or for binding 2'5'-oligonucleotides in biological systems
US4587044A (en) 1983-09-01 1986-05-06 The Johns Hopkins University Linkage of proteins to nucleic acids
US5118802A (en) 1983-12-20 1992-06-02 California Institute Of Technology DNA-reporter conjugates linked via the 2' or 5'-primary amino group of the 5'-terminal nucleoside
US5118800A (en) 1983-12-20 1992-06-02 California Institute Of Technology Oligonucleotides possessing a primary amino group in the terminal nucleotide
US5550111A (en) 1984-07-11 1996-08-27 Temple University-Of The Commonwealth System Of Higher Education Dual action 2',5'-oligoadenylate antiviral derivatives and uses thereof
FR2567892B1 (fr) 1984-07-19 1989-02-17 Centre Nat Rech Scient Nouveaux oligonucleotides, leur procede de preparation et leurs applications comme mediateurs dans le developpement des effets des interferons
US5430136A (en) 1984-10-16 1995-07-04 Chiron Corporation Oligonucleotides having selectably cleavable and/or abasic sites
US5367066A (en) 1984-10-16 1994-11-22 Chiron Corporation Oligonucleotides with selectably cleavable and/or abasic sites
US5258506A (en) 1984-10-16 1993-11-02 Chiron Corporation Photolabile reagents for incorporation into oligonucleotide chains
US4828979A (en) 1984-11-08 1989-05-09 Life Technologies, Inc. Nucleotide analogs for nucleic acid labeling and detection
US4754065A (en) * 1984-12-18 1988-06-28 Cetus Corporation Precursor to nucleic acid probe
FR2575751B1 (fr) 1985-01-08 1987-04-03 Pasteur Institut Nouveaux nucleosides de derives de l'adenosine, leur preparation et leurs applications biologiques
US5506337A (en) * 1985-03-15 1996-04-09 Antivirals Inc. Morpholino-subunit combinatorial library and method
US5185444A (en) 1985-03-15 1993-02-09 Anti-Gene Deveopment Group Uncharged morpolino-based polymers having phosphorous containing chiral intersubunit linkages
US5034506A (en) * 1985-03-15 1991-07-23 Anti-Gene Development Group Uncharged morpholino-based polymers having achiral intersubunit linkages
US5166315A (en) 1989-12-20 1992-11-24 Anti-Gene Development Group Sequence-specific binding polymers for duplex nucleic acids
US5235033A (en) 1985-03-15 1993-08-10 Anti-Gene Development Group Alpha-morpholino ribonucleoside derivatives and polymers thereof
US5405938A (en) 1989-12-20 1995-04-11 Anti-Gene Development Group Sequence-specific binding polymers for duplex nucleic acids
US4683195A (en) * 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
US4683202A (en) * 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
US4762779A (en) 1985-06-13 1988-08-09 Amgen Inc. Compositions and methods for functionalizing nucleic acids
US4800159A (en) * 1986-02-07 1989-01-24 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or cloning nucleic acid sequences
US5317098A (en) 1986-03-17 1994-05-31 Hiroaki Shizuya Non-radioisotope tagging of fragments
DK173067B1 (da) 1986-06-27 1999-12-13 Univ Washington Humant erythropoietin-gen, fremgangsmåde til ekspression deraf i transficerede cellelinier, de transficerede cellelinier sa
JPS638396A (ja) 1986-06-30 1988-01-14 Wakunaga Pharmaceut Co Ltd ポリ標識化オリゴヌクレオチド誘導体
EP0260032B1 (en) 1986-09-08 1994-01-26 Ajinomoto Co., Inc. Compounds for the cleavage at a specific position of RNA, oligomers employed for the formation of said compounds, and starting materials for the synthesis of said oligomers
US5276019A (en) 1987-03-25 1994-01-04 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Inhibitors for replication of retroviruses and for the expression of oncogene products
US5264423A (en) 1987-03-25 1993-11-23 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Inhibitors for replication of retroviruses and for the expression of oncogene products
US4904582A (en) 1987-06-11 1990-02-27 Synthetic Genetics Novel amphiphilic nucleic acid conjugates
DE3851889T2 (de) 1987-06-24 1995-04-13 Florey Howard Inst Nukleosid-derivate.
US5585481A (en) 1987-09-21 1996-12-17 Gen-Probe Incorporated Linking reagents for nucleotide probes
US5188897A (en) 1987-10-22 1993-02-23 Temple University Of The Commonwealth System Of Higher Education Encapsulated 2',5'-phosphorothioate oligoadenylates
US4924624A (en) 1987-10-22 1990-05-15 Temple University-Of The Commonwealth System Of Higher Education 2,',5'-phosphorothioate oligoadenylates and plant antiviral uses thereof
US5525465A (en) 1987-10-28 1996-06-11 Howard Florey Institute Of Experimental Physiology And Medicine Oligonucleotide-polyamide conjugates and methods of production and applications of the same
DE3738460A1 (de) 1987-11-12 1989-05-24 Max Planck Gesellschaft Modifizierte oligonukleotide
US5403711A (en) 1987-11-30 1995-04-04 University Of Iowa Research Foundation Nucleic acid hybridization and amplification method for detection of specific sequences in which a complementary labeled nucleic acid probe is cleaved
JP3019994B2 (ja) 1987-11-30 2000-03-15 ユニバーシティ オブ アイオワ リサーチ ファウンデーション 新規なオリゴデオキシヌクレオチド、それを使用した標的遺伝子の発現をブロックする方法、及び新規なオリゴデオキシヌクレオチド並びにそれを使用した標的遺伝子の発現を阻止する方法
US5288512A (en) * 1987-12-15 1994-02-22 The Procter & Gamble Company Reduced calorie fats made from triglycerides containing medium and long chain fatty acids
US5082830A (en) 1988-02-26 1992-01-21 Enzo Biochem, Inc. End labeled nucleotide probe
WO1989009221A1 (en) 1988-03-25 1989-10-05 University Of Virginia Alumni Patents Foundation Oligonucleotide n-alkylphosphoramidates
NL8800756A (nl) 1988-03-25 1989-10-16 Vereniging Voor Christelijk Wetenschappelijk Onderwijs Genetisch gemanipuleerde plantecellen en planten, alsmede daarvoor bruikbaar recombinant dna.
US5278302A (en) 1988-05-26 1994-01-11 University Patents, Inc. Polynucleotide phosphorodithioates
US5109124A (en) 1988-06-01 1992-04-28 Biogen, Inc. Nucleic acid probe linked to a label having a terminal cysteine
US5216141A (en) 1988-06-06 1993-06-01 Benner Steven A Oligonucleotide analogs containing sulfur linkages
US5175273A (en) 1988-07-01 1992-12-29 Genentech, Inc. Nucleic acid intercalating agents
US5262536A (en) 1988-09-15 1993-11-16 E. I. Du Pont De Nemours And Company Reagents for the preparation of 5'-tagged oligonucleotides
US5512439A (en) 1988-11-21 1996-04-30 Dynal As Oligonucleotide-linked magnetic particles and uses thereof
US5457183A (en) 1989-03-06 1995-10-10 Board Of Regents, The University Of Texas System Hydroxylated texaphyrins
US5599923A (en) 1989-03-06 1997-02-04 Board Of Regents, University Of Tx Texaphyrin metal complexes having improved functionalization
US5354844A (en) 1989-03-16 1994-10-11 Boehringer Ingelheim International Gmbh Protein-polycation conjugates
US5108921A (en) 1989-04-03 1992-04-28 Purdue Research Foundation Method for enhanced transmembrane transport of exogenous molecules
US5391723A (en) 1989-05-31 1995-02-21 Neorx Corporation Oligonucleotide conjugates
US5256775A (en) 1989-06-05 1993-10-26 Gilead Sciences, Inc. Exonuclease-resistant oligonucleotides
US4958013A (en) 1989-06-06 1990-09-18 Northwestern University Cholesteryl modified oligonucleotides
US5227170A (en) 1989-06-22 1993-07-13 Vestar, Inc. Encapsulation process
US6203976B1 (en) 1989-07-18 2001-03-20 Osi Pharmaceuticals, Inc. Methods of preparing compositions comprising chemicals capable of transcriptional modulation
US5451463A (en) 1989-08-28 1995-09-19 Clontech Laboratories, Inc. Non-nucleoside 1,3-diol reagents for labeling synthetic oligonucleotides
US5134066A (en) 1989-08-29 1992-07-28 Monsanto Company Improved probes using nucleosides containing 3-dezauracil analogs
US5254469A (en) 1989-09-12 1993-10-19 Eastman Kodak Company Oligonucleotide-enzyme conjugate that can be used as a probe in hybridization assays and polymerase chain reaction procedures
US5591722A (en) 1989-09-15 1997-01-07 Southern Research Institute 2'-deoxy-4'-thioribonucleosides and their antiviral activity
US5356633A (en) 1989-10-20 1994-10-18 Liposome Technology, Inc. Method of treatment of inflamed tissues
US5527528A (en) 1989-10-20 1996-06-18 Sequus Pharmaceuticals, Inc. Solid-tumor treatment method
US5013556A (en) 1989-10-20 1991-05-07 Liposome Technology, Inc. Liposomes with enhanced circulation time
US5399676A (en) 1989-10-23 1995-03-21 Gilead Sciences Oligonucleotides with inverted polarity
US5264564A (en) 1989-10-24 1993-11-23 Gilead Sciences Oligonucleotide analogs with novel linkages
US5264562A (en) 1989-10-24 1993-11-23 Gilead Sciences, Inc. Oligonucleotide analogs with novel linkages
DE69033495T2 (de) 1989-10-24 2000-07-20 Isis Pharmaceuticals, Inc. 2'-modifizierte nukleotide
US5292873A (en) 1989-11-29 1994-03-08 The Research Foundation Of State University Of New York Nucleic acids labeled with naphthoquinone probe
US5177198A (en) 1989-11-30 1993-01-05 University Of N.C. At Chapel Hill Process for preparing oligoribonucleoside and oligodeoxyribonucleoside boranophosphates
US5457189A (en) 1989-12-04 1995-10-10 Isis Pharmaceuticals Antisense oligonucleotide inhibition of papillomavirus
US5130302A (en) 1989-12-20 1992-07-14 Boron Bilogicals, Inc. Boronated nucleoside, nucleotide and oligonucleotide compounds, compositions and methods for using same
US5580575A (en) 1989-12-22 1996-12-03 Imarx Pharmaceutical Corp. Therapeutic drug delivery systems
US5469854A (en) 1989-12-22 1995-11-28 Imarx Pharmaceutical Corp. Methods of preparing gas-filled liposomes
US5486603A (en) 1990-01-08 1996-01-23 Gilead Sciences, Inc. Oligonucleotide having enhanced binding affinity
US5681941A (en) 1990-01-11 1997-10-28 Isis Pharmaceuticals, Inc. Substituted purines and oligonucleotide cross-linking
US5670633A (en) 1990-01-11 1997-09-23 Isis Pharmaceuticals, Inc. Sugar modified oligonucleotides that detect and modulate gene expression
US5623065A (en) 1990-08-13 1997-04-22 Isis Pharmaceuticals, Inc. Gapped 2' modified oligonucleotides
US5578718A (en) 1990-01-11 1996-11-26 Isis Pharmaceuticals, Inc. Thiol-derivatized nucleosides
US5587470A (en) 1990-01-11 1996-12-24 Isis Pharmaceuticals, Inc. 3-deazapurines
US5459255A (en) 1990-01-11 1995-10-17 Isis Pharmaceuticals, Inc. N-2 substituted purines
US5646265A (en) 1990-01-11 1997-07-08 Isis Pharmceuticals, Inc. Process for the preparation of 2'-O-alkyl purine phosphoramidites
US5852188A (en) * 1990-01-11 1998-12-22 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotides having chiral phosphorus linkages
US5587361A (en) 1991-10-15 1996-12-24 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotides having phosphorothioate linkages of high chiral purity
US5220007A (en) 1990-02-15 1993-06-15 The Worcester Foundation For Experimental Biology Method of site-specific alteration of RNA and production of encoded polypeptides
US5149797A (en) 1990-02-15 1992-09-22 The Worcester Foundation For Experimental Biology Method of site-specific alteration of rna and production of encoded polypeptides
AU7579991A (en) 1990-02-20 1991-09-18 Gilead Sciences, Inc. Pseudonucleosides and pseudonucleotides and their polymers
US5214136A (en) 1990-02-20 1993-05-25 Gilead Sciences, Inc. Anthraquinone-derivatives oligonucleotides
US5321131A (en) 1990-03-08 1994-06-14 Hybridon, Inc. Site-specific functionalization of oligodeoxynucleotides for non-radioactive labelling
US5470967A (en) 1990-04-10 1995-11-28 The Dupont Merck Pharmaceutical Company Oligonucleotide analogs with sulfamate linkages
US5264618A (en) 1990-04-19 1993-11-23 Vical, Inc. Cationic lipids for intracellular delivery of biologically active molecules
GB9009980D0 (en) 1990-05-03 1990-06-27 Amersham Int Plc Phosphoramidite derivatives,their preparation and the use thereof in the incorporation of reporter groups on synthetic oligonucleotides
FI924964L (fi) * 1990-05-04 1992-11-03 Isis Pharmaceuticals Inc Modulering av genexpression genom stoerande inverkan pao sekundaerstrukturen hos rna
EP0455905B1 (en) 1990-05-11 1998-06-17 Microprobe Corporation Dipsticks for nucleic acid hybridization assays and methods for covalently immobilizing oligonucleotides
IE66205B1 (en) 1990-06-14 1995-12-13 Paul A Bartlett Polypeptide analogs
US5650489A (en) 1990-07-02 1997-07-22 The Arizona Board Of Regents Random bio-oligomer library, a method of synthesis thereof, and a method of use thereof
US5602240A (en) 1990-07-27 1997-02-11 Ciba Geigy Ag. Backbone modified oligonucleotide analogs
US5138045A (en) 1990-07-27 1992-08-11 Isis Pharmaceuticals Polyamine conjugated oligonucleotides
US5610289A (en) 1990-07-27 1997-03-11 Isis Pharmaceuticals, Inc. Backbone modified oligonucleotide analogues
US5541307A (en) 1990-07-27 1996-07-30 Isis Pharmaceuticals, Inc. Backbone modified oligonucleotide analogs and solid phase synthesis thereof
US5608046A (en) 1990-07-27 1997-03-04 Isis Pharmaceuticals, Inc. Conjugated 4'-desmethyl nucleoside analog compounds
US5218105A (en) * 1990-07-27 1993-06-08 Isis Pharmaceuticals Polyamine conjugated oligonucleotides
US5688941A (en) 1990-07-27 1997-11-18 Isis Pharmaceuticals, Inc. Methods of making conjugated 4' desmethyl nucleoside analog compounds
US5618704A (en) 1990-07-27 1997-04-08 Isis Pharmacueticals, Inc. Backbone-modified oligonucleotide analogs and preparation thereof through radical coupling
US5489677A (en) 1990-07-27 1996-02-06 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleoside linkages containing adjacent oxygen and nitrogen atoms
US5677437A (en) 1990-07-27 1997-10-14 Isis Pharmaceuticals, Inc. Heteroatomic oligonucleoside linkages
CA2088258C (en) 1990-07-27 2004-09-14 Phillip Dan Cook Nuclease resistant, pyrimidine modified oligonucleotides that detect and modulate gene expression
US5623070A (en) 1990-07-27 1997-04-22 Isis Pharmaceuticals, Inc. Heteroatomic oligonucleoside linkages
US5245022A (en) 1990-08-03 1993-09-14 Sterling Drug, Inc. Exonuclease resistant terminally substituted oligonucleotides
KR100211552B1 (ko) 1990-08-03 1999-08-02 디. 꼬쉬 유전자 발현 억제용 화합물 및 방법
US5177196A (en) 1990-08-16 1993-01-05 Microprobe Corporation Oligo (α-arabinofuranosyl nucleotides) and α-arabinofuranosyl precursors thereof
US5512667A (en) 1990-08-28 1996-04-30 Reed; Michael W. Trifunctional intermediates for preparing 3'-tailed oligonucleotides
US5214134A (en) 1990-09-12 1993-05-25 Sterling Winthrop Inc. Process of linking nucleosides with a siloxane bridge
US5561225A (en) 1990-09-19 1996-10-01 Southern Research Institute Polynucleotide analogs containing sulfonate and sulfonamide internucleoside linkages
JPH06505704A (ja) 1990-09-20 1994-06-30 ギリアド　サイエンシズ，インコーポレイテッド 改変ヌクレオシド間結合
US5432272A (en) 1990-10-09 1995-07-11 Benner; Steven A. Method for incorporating into a DNA or RNA oligonucleotide using nucleotides bearing heterocyclic bases
KR930702373A (ko) 1990-11-08 1993-09-08 안토니 제이. 페이네 합성 올리고누클레오티드에 대한 다중 리포터(Reporter)그룹의 첨합
EP0557459B1 (en) 1990-11-13 1997-10-22 Immunex Corporation Bifunctional selectable fusion genes
JP3220180B2 (ja) 1991-05-23 2001-10-22 三菱化学株式会社 薬剤含有タンパク質結合リポソーム
US5539082A (en) 1993-04-26 1996-07-23 Nielsen; Peter E. Peptide nucleic acids
US5719262A (en) 1993-11-22 1998-02-17 Buchardt, Deceased; Ole Peptide nucleic acids having amino acid side chains
US5714331A (en) 1991-05-24 1998-02-03 Buchardt, Deceased; Ole Peptide nucleic acids having enhanced binding affinity, sequence specificity and solubility
US5371241A (en) 1991-07-19 1994-12-06 Pharmacia P-L Biochemicals Inc. Fluorescein labelled phosphoramidites
US5571799A (en) 1991-08-12 1996-11-05 Basco, Ltd. (2'-5') oligoadenylate analogues useful as inhibitors of host-v5.-graft response
US6307040B1 (en) 1992-03-05 2001-10-23 Isis Pharmaceuticals, Inc. Sugar modified oligonucleotides that detect and modulate gene expression
US5474796A (en) 1991-09-04 1995-12-12 Protogene Laboratories, Inc. Method and apparatus for conducting an array of chemical reactions on a support surface
US5521291A (en) 1991-09-30 1996-05-28 Boehringer Ingelheim International, Gmbh Conjugates for introducing nucleic acid into higher eucaryotic cells
NZ244306A (en) 1991-09-30 1995-07-26 Boehringer Ingelheim Int Composition for introducing nucleic acid complexes into eucaryotic cells, complex containing nucleic acid and endosomolytic agent, peptide with endosomolytic domain and nucleic acid binding domain and preparation
US5576302A (en) 1991-10-15 1996-11-19 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotides for modulating hepatitis C virus having phosphorothioate linkages of high chiral purity
US5661134A (en) 1991-10-15 1997-08-26 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotides for modulating Ha-ras or Ki-ras having phosphorothioate linkages of high chiral purity
DE59208572D1 (de) * 1991-10-17 1997-07-10 Ciba Geigy Ag Bicyclische Nukleoside, Oligonukleotide, Verfahren zu deren Herstellung und Zwischenprodukte
US6335434B1 (en) * 1998-06-16 2002-01-01 Isis Pharmaceuticals, Inc., Nucleosidic and non-nucleosidic folate conjugates
US5605662A (en) * 1993-11-01 1997-02-25 Nanogen, Inc. Active programmable electronic devices for molecular biological analysis and diagnostics
US5484908A (en) 1991-11-26 1996-01-16 Gilead Sciences, Inc. Oligonucleotides containing 5-propynyl pyrimidines
US5359044A (en) 1991-12-13 1994-10-25 Isis Pharmaceuticals Cyclobutyl oligonucleotide surrogates
US5700922A (en) 1991-12-24 1997-12-23 Isis Pharmaceuticals, Inc. PNA-DNA-PNA chimeric macromolecules
US5565552A (en) 1992-01-21 1996-10-15 Pharmacyclics, Inc. Method of expanded porphyrin-oligonucleotide conjugate synthesis
US5595726A (en) 1992-01-21 1997-01-21 Pharmacyclics, Inc. Chromophore probe for detection of nucleic acid
FR2687679B1 (fr) 1992-02-05 1994-10-28 Centre Nat Rech Scient Oligothionucleotides.
US5573905A (en) 1992-03-30 1996-11-12 The Scripps Research Institute Encoded combinatorial chemical libraries
US5633360A (en) 1992-04-14 1997-05-27 Gilead Sciences, Inc. Oligonucleotide analogs capable of passive cell membrane permeation
IL101600A (en) * 1992-04-15 2000-02-29 Yissum Res Dev Co Synthetic partially phosphorothioated antisense oligodeoxynucleotides and pharmaceutical compositions containing them
US5434257A (en) 1992-06-01 1995-07-18 Gilead Sciences, Inc. Binding compentent oligomers containing unsaturated 3',5' and 2',5' linkages
EP0577558A2 (de) 1992-07-01 1994-01-05 Ciba-Geigy Ag Carbocyclische Nukleoside mit bicyclischen Ringen, Oligonukleotide daraus, Verfahren zu deren Herstellung, deren Verwendung und Zwischenproduckte
US5272250A (en) 1992-07-10 1993-12-21 Spielvogel Bernard F Boronated phosphoramidate compounds
US5652355A (en) 1992-07-23 1997-07-29 Worcester Foundation For Experimental Biology Hybrid oligonucleotide phosphorothioates
US5288514A (en) * 1992-09-14 1994-02-22 The Regents Of The University Of California Solid phase and combinatorial synthesis of benzodiazepine compounds on a solid support
US6710174B2 (en) * 2001-09-13 2004-03-23 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense inhibition of vascular endothelial growth factor receptor-1 expression
WO1994009148A1 (fr) 1992-10-15 1994-04-28 Toray Industries, Inc. Procede pour produire une proteine d'antigenes majeurs d'hystocompatibilite classe ii et materiau sur lequel elle est immobilisee
US5583020A (en) 1992-11-24 1996-12-10 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. Permeability enhancers for negatively charged polynucleotides
US5574142A (en) 1992-12-15 1996-11-12 Microprobe Corporation Peptide linkers for improved oligonucleotide delivery
CA2153158A1 (en) * 1993-01-07 1994-07-21 Andrew Zalewski Antisense inhibition of c-myc to modulate the proliferation of smooth muscle cells
JP3351476B2 (ja) 1993-01-22 2002-11-25 三菱化学株式会社 リン脂質誘導体及びそれを含有するリポソーム
US5476925A (en) 1993-02-01 1995-12-19 Northwestern University Oligodeoxyribonucleotides including 3'-aminonucleoside-phosphoramidate linkages and terminal 3'-amino groups
US5395619A (en) 1993-03-03 1995-03-07 Liposome Technology, Inc. Lipid-polymer conjugates and liposomes
GB9304618D0 (en) 1993-03-06 1993-04-21 Ciba Geigy Ag Chemical compounds
CA2159631A1 (en) 1993-03-30 1994-10-13 Sanofi Acyclic nucleoside analogs and oligonucleotide sequences containing them
WO1994022891A1 (en) 1993-03-31 1994-10-13 Sterling Winthrop Inc. Oligonucleotides with amide linkages replacing phosphodiester linkages
DE4311944A1 (de) 1993-04-10 1994-10-13 Degussa Umhüllte Natriumpercarbonatpartikel, Verfahren zu deren Herstellung und sie enthaltende Wasch-, Reinigungs- und Bleichmittelzusammensetzungen
US5462854A (en) 1993-04-19 1995-10-31 Beckman Instruments, Inc. Inverse linkage oligonucleotides for chemical and enzymatic processes
PT698092E (pt) 1993-05-11 2007-10-29 Univ North Carolina Oligonucleótidos complementares de uma cadeia codificadora que combatem splicing aberrante e métodos para a sua utilização
WO1994028143A1 (en) 1993-05-21 1994-12-08 Targeted Genetics Corporation Bifunctional selectable fusion genes based on the cytosine deaminase (cd) gene
US5534259A (en) 1993-07-08 1996-07-09 Liposome Technology, Inc. Polymer compound and coated particle composition
FR2707990B1 (fr) 1993-07-20 1995-10-20 Centre Nat Rech Scient Nouvelles nitrones utilisables pour le piégeage des radicaux libres.
US5417978A (en) 1993-07-29 1995-05-23 Board Of Regents, The University Of Texas System Liposomal antisense methyl phosphonate oligonucleotides and methods for their preparation and use
DE69433036T2 (de) * 1993-09-03 2004-05-27 Isis Pharmaceuticals, Inc., Carlsbad Aminoderivatisierte nukleoside und oligonukleoside
US5491084A (en) * 1993-09-10 1996-02-13 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Uses of green-fluorescent protein
US5502177A (en) 1993-09-17 1996-03-26 Gilead Sciences, Inc. Pyrimidine derivatives for labeled binding partners
DE69417918T2 (de) 1993-11-30 2000-01-05 Mcgill University, Montreal Dna methyltransferase inhibierung
US5908779A (en) * 1993-12-01 1999-06-01 University Of Connecticut Targeted RNA degradation using nuclear antisense RNA
US5457187A (en) 1993-12-08 1995-10-10 Board Of Regents University Of Nebraska Oligonucleotides containing 5-fluorouracil
KR100386337B1 (ko) 1993-12-09 2004-03-24 토마스 제퍼슨 대학교 진핵세포에서부위-특이적돌연변이를위한화합물과그방법
US5446137B1 (en) 1993-12-09 1998-10-06 Behringwerke Ag Oligonucleotides containing 4'-substituted nucleotides
US5595756A (en) 1993-12-22 1997-01-21 Inex Pharmaceuticals Corporation Liposomal compositions for enhanced retention of bioactive agents
US5519134A (en) 1994-01-11 1996-05-21 Isis Pharmaceuticals, Inc. Pyrrolidine-containing monomers and oligomers
US5593853A (en) * 1994-02-09 1997-01-14 Martek Corporation Generation and screening of synthetic drug libraries
EP0745134A1 (en) 1994-02-22 1996-12-04 Danafarber Cancer Institute Nucleic acid delivery system, method of synthesis and uses thereof
US5539083A (en) 1994-02-23 1996-07-23 Isis Pharmaceuticals, Inc. Peptide nucleic acid combinatorial libraries and improved methods of synthesis
US5902880A (en) * 1994-08-19 1999-05-11 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. RNA polymerase III-based expression of therapeutic RNAs
US6551618B2 (en) 1994-03-15 2003-04-22 University Of Birmingham Compositions and methods for delivery of agents for neuronal regeneration and survival
US6015880A (en) 1994-03-16 2000-01-18 California Institute Of Technology Method and substrate for performing multiple sequential reactions on a matrix
US5596091A (en) 1994-03-18 1997-01-21 The Regents Of The University Of California Antisense oligonucleotides comprising 5-aminoalkyl pyrimidine nucleotides
US5627053A (en) 1994-03-29 1997-05-06 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. 2'deoxy-2'-alkylnucleotide containing nucleic acid
US5625050A (en) 1994-03-31 1997-04-29 Amgen Inc. Modified oligonucleotides and intermediates useful in nucleic acid therapeutics
US5525711A (en) 1994-05-18 1996-06-11 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Pteridine nucleotide analogs as fluorescent DNA probes
US5807522A (en) 1994-06-17 1998-09-15 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods for fabricating microarrays of biological samples
US5543152A (en) 1994-06-20 1996-08-06 Inex Pharmaceuticals Corporation Sphingosomes for enhanced drug delivery
US5525735A (en) * 1994-06-22 1996-06-11 Affymax Technologies Nv Methods for synthesizing diverse collections of pyrrolidine compounds
US5549974A (en) 1994-06-23 1996-08-27 Affymax Technologies Nv Methods for the solid phase synthesis of thiazolidinones, metathiazanones, and derivatives thereof
US5597696A (en) 1994-07-18 1997-01-28 Becton Dickinson And Company Covalent cyanine dye oligonucleotide conjugates
US5597909A (en) 1994-08-25 1997-01-28 Chiron Corporation Polynucleotide reagents containing modified deoxyribose moieties, and associated methods of synthesis and use
US5580731A (en) 1994-08-25 1996-12-03 Chiron Corporation N-4 modified pyrimidine deoxynucleotides and oligonucleotide probes synthesized therewith
US5591721A (en) 1994-10-25 1997-01-07 Hybridon, Inc. Method of down-regulating gene expression
US6645943B1 (en) 1994-10-25 2003-11-11 Hybridon, Inc. Method of down-regulating gene expression
US5512295A (en) 1994-11-10 1996-04-30 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Synthetic liposomes for enhanced uptake and delivery
GB9501465D0 (en) * 1995-01-25 1995-03-15 King S College London Nucleoside phosphorothioate derivatives,synthesis and use thereof
DE19502912A1 (de) * 1995-01-31 1996-08-01 Hoechst Ag G-Cap Stabilisierte Oligonucleotide
DE19507532C2 (de) 1995-03-03 2000-01-05 Henkel Ecolab Gmbh & Co Ohg Pastenförmiges Reinigungsmittel
IT1276642B1 (it) 1995-03-03 1997-11-03 Consiglio Nazionale Ricerche Trascritto antisenso presente in linfociti b ed oligodeossinucleotidi sintetici utili per inibirne l'azione
IT1275862B1 (it) 1995-03-03 1997-10-24 Consiglio Nazionale Ricerche Trascritto antisenso associato ad alcuni tipi di cellule tumorali ed oligodeossinucleotidi sintetici utili nella diagnosi e nel trattamento
US5543165A (en) 1995-06-06 1996-08-06 Hill; Julie B. Process of making a soluble tea product with champagne-like properties
US5739311A (en) * 1995-06-07 1998-04-14 Gen-Probe Incorporated Enzymatic synthesis of phosphorothioate oligonucleotides using restriction endonucleases
US5569588A (en) 1995-08-09 1996-10-29 The Regents Of The University Of California Methods for drug screening
US5652356A (en) 1995-08-17 1997-07-29 Hybridon, Inc. Inverted chimeric and hybrid oligonucleotides
ES2221039T3 (es) 1996-02-14 2004-12-16 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotidos abiertos modificados con azucar.
AU719482B2 (en) * 1996-03-14 2000-05-11 Genentech Inc. Uses of GDNF and GDNF receptor
AU2733697A (en) 1996-04-17 1997-11-07 Aronex Pharmaceuticals, Inc. Antisense inhibitors of vascular endothelial growth factor (vegf/vpf) expression
US5786213A (en) 1996-04-18 1998-07-28 Board Of Regents, The University Of Texas System Inhibition of endogenous gastrin expression for treatment of colorectal cancer
US5756710A (en) * 1996-06-05 1998-05-26 The Trustees Of Columbia University In City Of New York Phosphorothioate oligonucleotides that bind to the V3-loop and uses thereof
US5898031A (en) * 1996-06-06 1999-04-27 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligoribonucleotides for cleaving RNA
US5849902A (en) 1996-09-26 1998-12-15 Oligos Etc. Inc. Three component chimeric antisense oligonucleotides
US5739119A (en) * 1996-11-15 1998-04-14 Galli; Rachel L. Antisense oligonucleotides specific for the muscarinic type 2 acetylcholine receptor MRNA
US7008776B1 (en) 1996-12-06 2006-03-07 Aventis Pharmaceuticals Inc. Compositions and methods for effecting the levels of high density lipoprotein (HDL) cholesterol and apolipoprotein AI very low density lipoprotein (VLDL) cholesterol and low density lipoprotein (LDL) cholesterol
US7235653B2 (en) * 1996-12-31 2007-06-26 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotide compositions and methods for the modulation of the expression of B7 protein
JP3756313B2 (ja) 1997-03-07 2006-03-15 武 今西 新規ビシクロヌクレオシド及びオリゴヌクレオチド類縁体
US6013786A (en) * 1997-08-22 2000-01-11 Hybridon, Inc. MDM2-specific antisense oligonucleotides
US7572582B2 (en) 1997-09-12 2009-08-11 Exiqon A/S Oligonucleotide analogues
US6794499B2 (en) 1997-09-12 2004-09-21 Exiqon A/S Oligonucleotide analogues
KR100414936B1 (ko) 1997-09-12 2004-01-13 엑시콘 에이/에스 이환 및 삼환 뉴클레오시드, 뉴클레오타이드 및올리고뉴클레오타이드 동족체
US7285288B1 (en) 1997-10-03 2007-10-23 Board Of Regents, The University Of Texas System Inhibition of Bcl-2 protein expression by liposomal antisense oligodeoxynucleotides
US6034883A (en) 1998-01-29 2000-03-07 Tinney; Charles E. Solid state director for beams
US6175409B1 (en) * 1999-04-02 2001-01-16 Symyx Technologies, Inc. Flow-injection analysis and variable-flow light-scattering methods and apparatus for characterizing polymers
US7321828B2 (en) * 1998-04-13 2008-01-22 Isis Pharmaceuticals, Inc. System of components for preparing oligonucleotides
US20040186071A1 (en) * 1998-04-13 2004-09-23 Bennett C. Frank Antisense modulation of CD40 expression
US6221587B1 (en) * 1998-05-12 2001-04-24 Isis Pharmceuticals, Inc. Identification of molecular interaction sites in RNA for novel drug discovery
US6833361B2 (en) 1998-05-26 2004-12-21 Ribapharm, Inc. Nucleosides having bicyclic sugar moiety
SI20474A (sl) * 1998-05-26 2001-08-31 Icn Pharmaceuticals, Inc. Novi nukleozidi, ki imajo bicikličen sladkorni del
US6100090A (en) 1999-06-25 2000-08-08 Isis Pharmaceuticals Inc. Antisense inhibition of PI3K p85 expression
US20030139359A1 (en) 2001-12-04 2003-07-24 Isis Pharmaceuticals Inc. Antisense modulation of phospholipid scramblase 3 expression
US6242589B1 (en) * 1998-07-14 2001-06-05 Isis Pharmaceuticals, Inc. Phosphorothioate oligonucleotides having modified internucleoside linkages
US6867294B1 (en) * 1998-07-14 2005-03-15 Isis Pharmaceuticals, Inc. Gapped oligomers having site specific chiral phosphorothioate internucleoside linkages
US6214986B1 (en) 1998-10-07 2001-04-10 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of bcl-x expression
AU1607100A (en) * 1998-11-06 2000-05-29 Alcon Laboratories, Inc. Upregulation of endogenous prostaglandins to lower intraocular pressure
US5985663A (en) 1998-11-25 1999-11-16 Isis Pharmaceuticals Inc. Antisense inhibition of interleukin-15 expression
PT1146908E (pt) 1999-01-27 2005-10-31 David Dr Becker Formulacoes que contem nucleotidos de anti-sentido para conexinas
NZ513402A (en) * 1999-02-12 2003-06-30 Sankyo Co Novel nucleosides and oligonucleotide analogues
IL144975A0 (en) * 1999-02-26 2002-06-30 Univ British Columbia A composition containing an antisense oligonucleotide
DE60035163T2 (de) 1999-03-15 2008-02-21 University Of British Columbia, Vancouver Abc1 polypeptide und verfahren und reagenzien zur modulation des cholesterolgehalts
US20040137423A1 (en) 1999-03-15 2004-07-15 Hayden Michael R. Compositions and methods for modulating HDL cholesterol and triglyceride levels
US7084125B2 (en) 1999-03-18 2006-08-01 Exiqon A/S Xylo-LNA analogues
HK1048339A1 (zh) 1999-03-18 2003-03-28 埃克西库恩公司 利用特异性lna引物检测基因突变
WO2000056746A2 (en) 1999-03-24 2000-09-28 Exiqon A/S Improved synthesis of [2.2.1]bicyclo nucleosides
US6734291B2 (en) * 1999-03-24 2004-05-11 Exiqon A/S Synthesis of [2.2.1]bicyclo nucleosides
EP1171078A4 (en) 1999-03-26 2002-11-06 Aventis Pharma Inc COMPOSITIONS AND METHODS FOR INFLUENCING THE BLOOD LEVELS OF HIGH DENSITY LIPOPROTEIN (HDL) CHOLESTEROL AND APOLIPOPROTEIN AI, VERY LOW DENSITY LIPOROTEIN (VLDL) CHOLESTEROL AND LOW DENSITY LIPOPROTEIN (LDL) CHOLESTER
ATE386127T1 (de) 1999-04-08 2008-03-15 Novartis Vaccines & Diagnostic Verbesserung der immunantwort als anwendung in impfstoff und gentherapie
AU4657500A (en) 1999-04-21 2000-11-02 Pangene Corporation Locked nucleic acid hybrids and methods of use
PT1178999E (pt) * 1999-05-04 2007-06-26 Santaris Pharma As Análogos de l-ribo-lna
US6525191B1 (en) * 1999-05-11 2003-02-25 Kanda S. Ramasamy Conformationally constrained L-nucleosides
DE19925073C2 (de) * 1999-06-01 2001-07-19 Stefan Weiss Nucleinsäuremoleküle mit spezifischer Erkennung von nativem PrP·S··c·, Herstellung und Verwendung
US6656730B1 (en) 1999-06-15 2003-12-02 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotides conjugated to protein-binding drugs
EP1189940A2 (en) 1999-06-25 2002-03-27 Genset A bap28 gene and protein
US20040006031A1 (en) * 2002-07-02 2004-01-08 Isis Pharmaceuticals Inc. Antisense modulation of HMG-CoA reductase expression
US6147200A (en) 1999-08-19 2000-11-14 Isis Pharmaceuticals, Inc. 2'-O-acetamido modified monomers and oligomers
AU7602400A (en) 1999-09-20 2001-04-24 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Secreted proteins and uses thereof
US6617442B1 (en) 1999-09-30 2003-09-09 Isis Pharmaceuticals, Inc. Human Rnase H1 and oligonucleotide compositions thereof
US6528262B1 (en) * 1999-10-06 2003-03-04 Quark Biotech, Inc. Method for enrichment of natural antisense messenger RNA
US6986988B2 (en) * 1999-10-06 2006-01-17 Quark Biotech, Inc. Method for enrichment of natural antisense messenger RNA
WO2001051630A1 (en) 2000-01-07 2001-07-19 Baylor University Antisense compositions and methods
US7087589B2 (en) 2000-01-14 2006-08-08 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Methanocarba cycloakyl nucleoside analogues
JP3786874B2 (ja) 2000-01-14 2006-06-14 株式会社ファンケル 低刺激性高分子抗菌剤
US6303374B1 (en) 2000-01-18 2001-10-16 Isis Pharmaceuticals Inc. Antisense modulation of caspase 3 expression
US6287860B1 (en) 2000-01-20 2001-09-11 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense inhibition of MEKK2 expression
JP2001247459A (ja) 2000-03-03 2001-09-11 Oakland Uniservices Ltd 癌の組み合わせ療法
US6936467B2 (en) 2000-03-27 2005-08-30 University Of Delaware Targeted chromosomal genomic alterations with modified single stranded oligonucleotides
OA12240A (en) * 2000-03-27 2006-05-10 Univ Delaware Targeted chromosomal genomic alterations with modified single stranded oligonucleotides.
US7402434B2 (en) 2000-05-08 2008-07-22 Newman Stuart A Splice choice antagonists as therapeutic agents
US6713276B2 (en) 2000-06-28 2004-03-30 Scios, Inc. Modulation of Aβ levels by β-secretase BACE2
EP1294754A1 (en) 2000-06-29 2003-03-26 Pharma Pacific Pty. Ltd. Interferon-alpha induced gene
EP1311262A4 (en) * 2000-07-28 2005-06-01 Cancer Rec Tech Ltd COMBINED TREATMENT AGAINST CANCER
US7053199B2 (en) * 2000-08-29 2006-05-30 Takeshi Imanishi Nucleoside analogs and oligonucleotide derivatives containing these analogs
US20050209179A1 (en) 2000-08-30 2005-09-22 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated treatment of Alzheimer's disease using short interfering nucleic acid (siNA)
US20030190635A1 (en) 2002-02-20 2003-10-09 Mcswiggen James A. RNA interference mediated treatment of Alzheimer's disease using short interfering RNA
NZ524894A (en) * 2000-09-02 2005-03-24 Gruenenthal Chemie Antisense oligonucleotides against VR1
US6444464B1 (en) 2000-09-08 2002-09-03 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of E2F transcription factor 2 expression
WO2002024717A1 (en) 2000-09-20 2002-03-28 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of flip-c expression
US20030186920A1 (en) 2000-10-13 2003-10-02 Sirois Martin G. Antisense oligonucleotide directed toward mammalian vegf receptor genes and uses thereof
US20020157122A1 (en) 2000-10-27 2002-10-24 Wong Philip C. Beta-secretase transgenic organisms, anti-beta-secretase antibodies, and methods of use thereof
US20030228618A1 (en) 2000-11-24 2003-12-11 Erez Levanon Methods and systems for identifying naturally occurring antisense transcripts and methods, kits and arrays utilizing same
US20050222029A1 (en) 2001-01-04 2005-10-06 Myriad Genetics, Incorporated Compositions and methods for treating diseases
US7423142B2 (en) 2001-01-09 2008-09-09 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting expression of anti-apoptotic genes
WO2002068470A2 (en) 2001-02-26 2002-09-06 Pharma Pacific Pty Ltd Interferon-alpha induced gene
US20020147165A1 (en) 2001-02-22 2002-10-10 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of calreticulin expression
AUPR497101A0 (en) 2001-05-14 2001-06-07 Queensland University Of Technology Polynucleotides and polypeptides linked to cancer and/or tumorigenesi
IL143379A (en) 2001-05-24 2013-11-28 Yissum Res Dev Co Oligonucleotide against human ache isoform r and its uses
US7053195B1 (en) * 2001-06-12 2006-05-30 Syngenta Participatious Ag Locked nucleic acid containing heteropolymers and related methods
US7153954B2 (en) 2001-07-12 2006-12-26 Santaris Pharma A/S Method for preparation of LNA phosphoramidites
ES2566561T3 (es) * 2001-07-12 2016-04-13 University Of Massachusetts Producción in vivo de ARN pequeños de interferencia que median el silenciamiento génico
US7425545B2 (en) 2001-07-25 2008-09-16 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of C-reactive protein expression
US20030096772A1 (en) * 2001-07-30 2003-05-22 Crooke Rosanne M. Antisense modulation of acyl CoA cholesterol acyltransferase-2 expression
US7259150B2 (en) * 2001-08-07 2007-08-21 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of apolipoprotein (a) expression
WO2003020739A2 (en) * 2001-09-04 2003-03-13 Exiqon A/S Novel lna compositions and uses thereof
US20040214766A1 (en) * 2001-10-01 2004-10-28 Kari Alitalo VEGF-C or VEGF-D materials and methods for treatment of neuropathologies
EP1436402B1 (en) 2001-10-10 2006-02-22 Société des Produits Nestlé S.A. Coffee plant with reduced alpha-d-galactosidase activity
AR037699A1 (es) 2001-12-04 2004-12-01 Monsanto Technology Llc Maiz transgenico con fenotipo mejorado
US7125982B1 (en) 2001-12-05 2006-10-24 Frayne Consultants Microbial production of nuclease resistant DNA, RNA, and oligo mixtures
WO2003053997A2 (en) * 2001-12-06 2003-07-03 Fibrogen, Inc. Methods of increasing endogenous erythropoietin (epo)
US6965025B2 (en) * 2001-12-10 2005-11-15 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of connective tissue growth factor expression
CA2365811A1 (en) * 2001-12-21 2003-06-21 Institut De Cardiologie A new gene therapy using antisense strategy to estrogen receptors (er .alpha. and/or er .beta.) to optimize vascular healing and cardioprotection after vascular injury
KR20030056538A (ko) 2001-12-28 2003-07-04 주식회사 웰진 리본형 안티센스 올리고뉴클레오티드에 의한 형질전이성장 인자-β1의 효과적 저해제 개발
US20030191075A1 (en) 2002-02-22 2003-10-09 Cook Phillip Dan Method of using modified oligonucleotides for hepatic delivery
US20050143357A1 (en) * 2002-02-25 2005-06-30 Ake Pousette Vitamin d upregulated protein 1 (vdup-) methods and uses thereof
US7144995B2 (en) 2002-03-08 2006-12-05 Glen Research Corporation Fluorescent nitrogenous base and nucleosides incorporating same
GB2386836B (en) 2002-03-22 2006-07-26 Cancer Res Ventures Ltd Anti-cancer combinations
US7169916B2 (en) * 2002-04-01 2007-01-30 Isis Pharmaceuticals, Inc. Chloral-free DCA in oligonucleotide synthesis
US20050215504A1 (en) 2002-04-02 2005-09-29 Bennett C F Antisense modulation of sterol regulatory element-binding protein-1 expression
ES2649817T3 (es) * 2002-04-05 2018-01-15 Roche Innovation Center Copenhagen A/S Compuestos oligom¿¿ricos para la modulaci¿®n de la expresi¿®n de HIF-1¿Á
US7569575B2 (en) 2002-05-08 2009-08-04 Santaris Pharma A/S Synthesis of locked nucleic acid derivatives
US6808906B2 (en) * 2002-05-08 2004-10-26 Rigel Pharmaceuticals, Inc. Directionally cloned random cDNA expression vector libraries, compositions and methods of use
US7199107B2 (en) * 2002-05-23 2007-04-03 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of kinesin-like 1 expression
US7148342B2 (en) * 2002-07-24 2006-12-12 The Trustees Of The University Of Pennyslvania Compositions and methods for sirna inhibition of angiogenesis
US20040033480A1 (en) 2002-08-15 2004-02-19 Wong Norman C.W. Use of resveratrol to regulate expression of apolipoprotein A1
WO2004024079A2 (en) 2002-09-10 2004-03-25 The Samuel Roberts Noble Foundation, Inc. Methods and compositions for production of flavonoid and isoflavonoid nutraceuticals
US20060211640A1 (en) 2002-09-25 2006-09-21 Kane Christopher D Antisense modulation of farnesoid X receptor expression
WO2004031350A2 (en) * 2002-09-26 2004-04-15 Amgen, Inc. Modulation of forkhead box o1a expression
US20040152651A1 (en) 2002-11-01 2004-08-05 Rana Tariq M. Regulation of transcription elongation factors
GB2394658A (en) 2002-11-01 2004-05-05 Cancer Rec Tech Ltd Oral anti-cancer composition
KR20120038546A (ko) 2002-11-01 2012-04-23 더 트러스티스 오브 더 유니버시티 오브 펜실바니아 ＨＩＦ-1 알파의 ｓｉＲＮＡ 억제를 위한 조성물 및 방법
EP1560840B1 (en) * 2002-11-05 2015-05-06 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compositions comprising alternating 2'-modified nucleosides for use in gene modulation
CA2504694C (en) * 2002-11-05 2013-10-01 Isis Pharmaceuticals, Inc. Polycyclic sugar surrogate-containing oligomeric compounds and compositions for use in gene modulation
US20060009410A1 (en) * 2002-11-13 2006-01-12 Crooke Rosanne M Effects of apolipoprotein B inhibition on gene expression profiles in animals
DK2752488T3 (da) * 2002-11-18 2020-04-20 Roche Innovation Ct Copenhagen As Antisense-design
US7144999B2 (en) * 2002-11-23 2006-12-05 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of hypoxia-inducible factor 1 alpha expression
US7713738B2 (en) * 2003-02-10 2010-05-11 Enzon Pharmaceuticals, Inc. Oligomeric compounds for the modulation of survivin expression
US7598227B2 (en) 2003-04-16 2009-10-06 Isis Pharmaceuticals Inc. Modulation of apolipoprotein C-III expression
US7339051B2 (en) * 2003-04-28 2008-03-04 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for the treatment of severe acute respiratory syndrome (SARS)
US7709610B2 (en) 2003-05-08 2010-05-04 Facet Biotech Corporation Therapeutic use of anti-CS1 antibodies
US7276599B2 (en) 2003-06-02 2007-10-02 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotide synthesis with alternative solvents
US7541344B2 (en) * 2003-06-03 2009-06-02 Eli Lilly And Company Modulation of survivin expression
US7568709B2 (en) 2003-07-03 2009-08-04 Massachusetts Institute Of Technology Passive stabilization systems for wheeled objects
US7825235B2 (en) * 2003-08-18 2010-11-02 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of diacylglycerol acyltransferase 2 expression
BRPI0413930A (pt) 2003-09-18 2006-10-24 Isis Pharmaceuticals Inc composto oligomérico ou sal farmaceuticamente aceitável deste, composição farmacêutica ou veterinária, métodos para inibir a expressão de eif4e em uma célula, tecido ou órgão, para diminuir a proliferação de uma célula em que eif4e é expressado, e para prevenir ou tratar uma condição ou doença métodos para prevenir ou diminuir a angiogênese, e o crescimento de tumor em um paciente, oligonucleotìdeo de anti-sentido, composição farmacêutica ou veterinária, e, uso de um composto oligomérico ou sal farmaceuticamente aceitável deste
EP1687410A4 (en) * 2003-10-07 2008-04-09 Isis Pharmaceuticals Inc ANTISENSE OLIGONUCLEOTIDE OPTIMIZED FOR KIDNEY TARGETING
EP1675948A2 (en) 2003-10-23 2006-07-05 Sirna Therapeutics, Inc. RNA INTERFERENCE MEDIATED TREATMENT OF PARKINSON DISEASE USING SHORT INTERERING NUCLEIC ACID (siNA)
CN100569945C (zh) 2003-12-23 2009-12-16 桑塔里斯制药公司 用于调节bcl-2的寡聚化合物
KR101324824B1 (ko) 2004-01-12 2013-11-01 더 트러스티스 오브 더 유니버시티 오브 펜실바니아 특이적이고 선택적인 전기 신호 및 전자기 신호에 의해생성된 장의 적용을 통해 골 세포에서의 골 형태형성단백질 (ｂｍｐ) 유전자 발현을 상향-조절하는 시스템 및방법
US7468431B2 (en) 2004-01-22 2008-12-23 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of eIF4E-BP2 expression
GB0403041D0 (en) 2004-02-11 2004-03-17 Milner Anne J Induction of apoptosis
EP1566202A1 (en) 2004-02-23 2005-08-24 Sahltech I Göteborg AB Use of resistin antagonists in the treatment of rheumatoid arthritis
US7402574B2 (en) 2004-03-12 2008-07-22 Avi Biopharma, Inc. Antisense composition and method for treating cancer
US8394947B2 (en) * 2004-06-03 2013-03-12 Isis Pharmaceuticals, Inc. Positionally modified siRNA constructs
US7297786B2 (en) 2004-07-09 2007-11-20 University Of Iowa Research Foundation RNA interference in respiratory epitheial cells
US7427675B2 (en) 2004-08-23 2008-09-23 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compounds and methods for the characterization of oligonucleotides
WO2006034354A2 (en) * 2004-09-20 2006-03-30 Government Of The United States Of America Methods of diagnosing and treating vhl associated tumors and sporadic renal cell carcinoma, other vhl sporadic counterpart tumors and non-tumor lesions which co-express epo and the epo receptor
AU2005289588B2 (en) 2004-09-24 2011-12-22 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. RNAi modulation of ApoB and uses thereof
NZ555644A (en) 2004-11-09 2009-04-30 Santaris Pharma As Potent LNA oligonucleotides for the inhibition of HIF-1A expression
US7220549B2 (en) * 2004-12-30 2007-05-22 Helicos Biosciences Corporation Stabilizing a nucleic acid for nucleic acid sequencing
EP1896084A4 (en) * 2005-06-27 2010-10-20 Alnylam Pharmaceuticals Inc RNAI MODULATION OF HIF-1 AND THERAPEUTIC APPLICATIONS THEREOF
WO2007028065A2 (en) 2005-08-30 2007-03-08 Isis Pharmaceuticals, Inc. Chimeric oligomeric compounds for modulation of splicing
US7320965B2 (en) * 2005-10-28 2008-01-22 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting expression of Huntingtin gene
CA2626584A1 (en) 2005-11-04 2007-05-18 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting expression of nav1.8 gene
EP2431467A3 (en) * 2005-11-17 2012-05-02 Board Of Regents, The University Of Texas Modulation of gene expression by oligomers targeted to chromosomal DNA
EP1957109A2 (en) 2005-12-02 2008-08-20 Sirtris Pharmaceuticals, Inc. Modulators of cdc2-like kinases (clks) and methods of use thereof
CN101374964B (zh) 2005-12-09 2013-07-17 贝勒研究院 外周血液白细胞转录模式的模块水平分析
CN100356377C (zh) 2005-12-20 2007-12-19 无锡永中科技有限公司 文档显示方法
US20070213274A1 (en) 2005-12-20 2007-09-13 Oy Jurilab Ltd Novel genes and markers associated with high-density lipoprotein-cholesterol (HDL-C)
US7569686B1 (en) 2006-01-27 2009-08-04 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compounds and methods for synthesis of bicyclic nucleic acid analogs
ES2516815T3 (es) 2006-01-27 2014-10-31 Isis Pharmaceuticals, Inc. Análogos de ácidos nucleicos bicíclicos modificados en la posición 6
WO2007115168A2 (en) * 2006-03-31 2007-10-11 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting expression of eg5 gene
KR101407707B1 (ko) * 2006-04-03 2014-06-19 산타리스 팔마 에이/에스 Ａｎｔｉ-ｍｉｒｎａ 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 함유하는 약학적 조성물
US20070258952A1 (en) * 2006-05-04 2007-11-08 Baylor Research Institute Anti-Tumor Activity of an Oncolytic Adenovirus-Delivered Oncogene siRNA
WO2007136989A2 (en) 2006-05-05 2007-11-29 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compounds and methods for modulating expression of dgat2
CA2651453C (en) * 2006-05-11 2014-10-14 Isis Pharmaceuticals, Inc. 5'-modified bicyclic nucleic acid analogs
US7666854B2 (en) * 2006-05-11 2010-02-23 Isis Pharmaceuticals, Inc. Bis-modified bicyclic nucleic acid analogs
SG171676A1 (en) 2006-05-11 2011-06-29 Alnylam Pharmaceuticals Inc Compositions and methods for inhibiting expression of the pcsk9 gene
EP1867338A1 (en) 2006-05-30 2007-12-19 Université Libre De Bruxelles Pharmaceutical composition comprising apolipoproteins for the treatment of human diseases
US8337483B2 (en) 2006-11-02 2012-12-25 Becton, Dickinson And Company Vascular access device chamber replacement
WO2008057556A2 (en) 2006-11-06 2008-05-15 Beth Israel Deaconess Medical Center Identification and use of small molecules to modulate ese-1 transcription factor function and to treat ese-1 transcription factor associated diseases
WO2008066672A2 (en) 2006-11-06 2008-06-05 Beth Israel Deaconess Medical Center Identification and use of small molecules to modulate transcription factor function and to treat transcription factor associated diseases
US8093222B2 (en) 2006-11-27 2012-01-10 Isis Pharmaceuticals, Inc. Methods for treating hypercholesterolemia
BRPI0806902A2 (pt) 2007-01-19 2014-06-17 Plant Bioscience Ltd MÉTODOS E COMPOSIÇÕES PARA MODULAÇÃO DAS VIAS DE METILAÇÃO DE DNA DIRECIONADA POR sIRNA E RNA
US7601399B2 (en) * 2007-01-31 2009-10-13 Surface Modification Systems, Inc. High density low pressure plasma sprayed focal tracks for X-ray anodes
CA2686933A1 (en) 2007-04-06 2008-10-16 The Johns Hopkins University Methods and compositions for the treatment of cancer
US20080293142A1 (en) 2007-04-19 2008-11-27 The Board Of Regents For Oklahoma State University Multiple shRNA Expression Vectors and Methods of Construction
JP2010539978A (ja) * 2007-10-02 2010-12-24 アムジェン インコーポレイテッド マイクロ−ｒｎａおよびその前駆体にハイブリダイズしうる核酸を用いるエリスロポエチンの増加
CN106995819B (zh) 2008-07-01 2020-10-20 孟山都技术公司 用于调控靶基因表达的重组dna构建体和方法
CN108165548B (zh) * 2008-09-22 2022-10-14 菲奥医药公司 减小大小的自递送RNAi化合物
US8153606B2 (en) * 2008-10-03 2012-04-10 Opko Curna, Llc Treatment of apolipoprotein-A1 related diseases by inhibition of natural antisense transcript to apolipoprotein-A1
EP2177615A1 (en) 2008-10-10 2010-04-21 Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e.V. Method for a genome wide identification of expression regulatory sequences and use of genes and molecules derived thereof for the diagnosis and therapy of metabolic and/or tumorous diseases
US8606289B2 (en) 2008-11-10 2013-12-10 Qualcomm Incorporated Power headroom-sensitive scheduling
WO2010058227A2 (en) 2008-11-22 2010-05-27 The University Of Bristol NOVEL USES OF VEGFxxxB
EP2370582B1 (en) 2008-12-04 2017-05-10 CuRNA, Inc. Treatment of tumor suppressor gene related diseases by inhibition of natural antisense transcript to the gene
CN102317458B (zh) 2008-12-04 2018-01-02 库尔纳公司 通过红细胞生成素(epo)天然反义转录物的抑制对epo相关疾病的治疗
DK2638163T3 (en) * 2010-11-12 2017-07-24 Massachusetts Gen Hospital POLYCOMB-ASSOCIATED NON-CODING RNAs
WO2013080784A1 (ja) 2011-11-30 2013-06-06 シャープ株式会社 メモリ回路とその駆動方法、及び、これを用いた不揮発性記憶装置、並びに、液晶表示装置

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2233333C2 (ru) * 1993-05-18 2004-07-27 Рон-Пуленк Роре С.А. Вирусные векторы и их применение в генной терапии
US20090258925A1 (en) * 2005-12-28 2009-10-15 Claes Wahlestedt Natural antisense and non-coding rna transcripts as drug targets
WO2008091703A2 (en) * 2007-01-24 2008-07-31 The Rockefeller University Chemically modified oligonucleotides for use in modulating micro rna and uses thereof
WO2008091703A3 (en) * 2007-01-24 2008-11-13 Univ Rockefeller Chemically modified oligonucleotides for use in modulating micro rna and uses thereof

Also Published As

Publication number Publication date
JP6091752B2 (ja) 2017-03-08
EP2370579A2 (en) 2011-10-05
KR101829469B1 (ko) 2018-03-30
US20150087695A1 (en) 2015-03-26
MX352412B (es) 2017-11-23
WO2010065792A2 (en) 2010-06-10
US20110237651A1 (en) 2011-09-29
US10358645B2 (en) 2019-07-23
EP2370579A4 (en) 2012-11-14
US20180010131A1 (en) 2018-01-11
US9765336B2 (en) 2017-09-19
WO2010065792A3 (en) 2010-12-02
CN102317458A (zh) 2012-01-11
RU2011127200A (ru) 2013-01-10
KR20110091790A (ko) 2011-08-12
CA2745329C (en) 2022-07-12
US8921329B2 (en) 2014-12-30
CA2745329A1 (en) 2010-06-10
CN102317458B (zh) 2018-01-02
JP2012510819A (ja) 2012-05-17
MX2011005910A (es) 2011-06-17
ES2629630T3 (es) 2017-08-11
EP2370579B1 (en) 2017-03-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
RU2620970C2 (ru) Лечение связанных с эритропоэтином (еро) заболеваний путем ингибирования природного антисмыслового транскрипта к еро
EP2424987B1 (en) Treatment of hemoglobin (hbf/hbg) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to hbf/hbg
RU2569182C2 (ru) Лечение заболеваний, связанных с фактором роста эндотелия сосудов (vegf), посредством ингибирования природного антисмыслового транскрипта к vegf
JP6066035B2 (ja) グリア細胞由来神経栄養因子（ｇｄｎｆ）関連疾病の、ｇｄｎｆに対する天然アンチセンス転写物の抑制による治療
JP2019206564A (ja) 脳由来神経栄養因子（ｂｄｎｆ）関連疾病の、ｂｄｎｆに対する天然アンチセンス転写物の抑制による治療
KR20130126577A (ko) 디스크 라지 호모로그(dlg)에 대한 자연 안티센스 전사체의 저해에 의한 dlg 관련된 질환의 치료
JP6407912B2 (ja) ヘモグロビン（ｈｂｆ／ｈｂｇ）に対する天然アンチセンス転写物の抑制によるｈｂｆ／ｈｂｇ関連疾患の治療
HK1162050B (en) Treatment of erythropoietin (epo) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to epo
HK1162050A (en) Treatment of erythropoietin (epo) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to epo
HK1162045A (en) Treatment of hemoglobin (hbf/hbg) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to hbf/hbg
HK1162045B (en) Treatment of hemoglobin (hbf/hbg) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to hbf/hbg

Legal Events

Date Code Title Description
FA92 Acknowledgement of application withdrawn (lack of supplementary materials submitted)

Effective date: 20150812

FZ9A Application not withdrawn (correction of the notice of withdrawal)

Effective date: 20160624