RU2618989C1 - Способ лечения печеночной недостаточности - Google Patents
Способ лечения печеночной недостаточности Download PDFInfo
- Publication number
- RU2618989C1 RU2618989C1 RU2016108045A RU2016108045A RU2618989C1 RU 2618989 C1 RU2618989 C1 RU 2618989C1 RU 2016108045 A RU2016108045 A RU 2016108045A RU 2016108045 A RU2016108045 A RU 2016108045A RU 2618989 C1 RU2618989 C1 RU 2618989C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- liver
- matrix
- cells
- bone marrow
- allogeneic
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 53
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 claims abstract description 92
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 claims abstract description 88
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 64
- 210000005229 liver cell Anatomy 0.000 claims abstract description 59
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 claims abstract description 37
- 238000002513 implantation Methods 0.000 claims abstract description 23
- 206010019663 Hepatic failure Diseases 0.000 claims abstract description 21
- 208000007903 liver failure Diseases 0.000 claims abstract description 18
- 231100000835 liver failure Toxicity 0.000 claims abstract description 18
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims abstract description 16
- 239000000017 hydrogel Substances 0.000 claims abstract description 13
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 claims abstract description 11
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 claims abstract description 11
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 claims abstract description 11
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 10
- 229920001222 biopolymer Polymers 0.000 claims abstract description 9
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 claims abstract description 9
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims abstract description 9
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 claims abstract description 8
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 claims abstract description 7
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 claims abstract description 7
- 229940127219 anticoagulant drug Drugs 0.000 claims abstract description 7
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 claims abstract description 7
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 7
- 102000016359 Fibronectins Human genes 0.000 claims abstract description 6
- 108010067306 Fibronectins Proteins 0.000 claims abstract description 6
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims abstract description 3
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims abstract description 3
- 239000011148 porous material Substances 0.000 claims abstract description 3
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 claims description 52
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 claims description 14
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 9
- 229940127218 antiplatelet drug Drugs 0.000 claims description 6
- 239000000106 platelet aggregation inhibitor Substances 0.000 claims description 6
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 claims description 5
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 claims description 4
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 3
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 claims description 3
- 101100345589 Mus musculus Mical1 gene Proteins 0.000 claims 1
- 108010038862 laminin 10 Proteins 0.000 claims 1
- 210000002901 mesenchymal stem cell Anatomy 0.000 abstract description 18
- 210000002798 bone marrow cell Anatomy 0.000 abstract description 11
- 230000003993 interaction Effects 0.000 abstract description 9
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 abstract description 8
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 7
- 235000021317 phosphate Nutrition 0.000 abstract description 6
- 230000010354 integration Effects 0.000 abstract description 5
- 150000003013 phosphoric acid derivatives Chemical class 0.000 abstract description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 3
- 208000014392 Cat-eye syndrome Diseases 0.000 abstract 1
- 239000007836 KH2PO4 Substances 0.000 abstract 1
- 230000002744 anti-aggregatory effect Effects 0.000 abstract 1
- 230000002146 bilateral effect Effects 0.000 abstract 1
- 238000003501 co-culture Methods 0.000 abstract 1
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 abstract 1
- 229910000397 disodium phosphate Inorganic materials 0.000 abstract 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 abstract 1
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 abstract 1
- GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M potassium dihydrogen phosphate Chemical compound [K+].OP(O)([O-])=O GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 abstract 1
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 55
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 description 20
- 210000004271 bone marrow stromal cell Anatomy 0.000 description 18
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 13
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 12
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 206010062016 Immunosuppression Diseases 0.000 description 9
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 9
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 9
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 9
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 description 9
- 210000005228 liver tissue Anatomy 0.000 description 9
- 239000000463 material Substances 0.000 description 9
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 9
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 9
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 8
- 208000010334 End Stage Liver Disease Diseases 0.000 description 8
- 208000011444 chronic liver failure Diseases 0.000 description 8
- 239000007943 implant Substances 0.000 description 8
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 7
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 7
- 230000008569 process Effects 0.000 description 7
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 7
- HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 2-Aminoethan-1-ol Chemical compound NCCO HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 6
- WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N Haematoxylin Chemical compound C12=CC(O)=C(O)C=C2CC2(O)C1C1=CC=C(O)C(O)=C1OC2 WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 6
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 6
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 5
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 5
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 5
- 239000013256 coordination polymer Substances 0.000 description 5
- 230000035784 germination Effects 0.000 description 5
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 5
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 5
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 5
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 5
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 5
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 5
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 4
- 102000009016 Cholera Toxin Human genes 0.000 description 4
- 108010049048 Cholera Toxin Proteins 0.000 description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 4
- 102400001368 Epidermal growth factor Human genes 0.000 description 4
- 101800003838 Epidermal growth factor Proteins 0.000 description 4
- 102000051325 Glucagon Human genes 0.000 description 4
- 108060003199 Glucagon Proteins 0.000 description 4
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 4
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 4
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000003745 Hepatocyte Growth Factor Human genes 0.000 description 4
- 108090000100 Hepatocyte Growth Factor Proteins 0.000 description 4
- 102000004218 Insulin-Like Growth Factor I Human genes 0.000 description 4
- 108090000723 Insulin-Like Growth Factor I Proteins 0.000 description 4
- AHLPHDHHMVZTML-BYPYZUCNSA-N L-Ornithine Chemical compound NCCC[C@H](N)C(O)=O AHLPHDHHMVZTML-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 4
- AHLPHDHHMVZTML-UHFFFAOYSA-N Orn-delta-NH2 Natural products NCCCC(N)C(O)=O AHLPHDHHMVZTML-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- UTJLXEIPEHZYQJ-UHFFFAOYSA-N Ornithine Natural products OC(=O)C(C)CCCN UTJLXEIPEHZYQJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 description 4
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 description 4
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 description 4
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 4
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 4
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 4
- 229940116977 epidermal growth factor Drugs 0.000 description 4
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 4
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 4
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 4
- MASNOZXLGMXCHN-ZLPAWPGGSA-N glucagon Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O)C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC=1NC=NC=1)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C1=CC=CC=C1 MASNOZXLGMXCHN-ZLPAWPGGSA-N 0.000 description 4
- 229960004666 glucagon Drugs 0.000 description 4
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 4
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 4
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 4
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 4
- HYIMSNHJOBLJNT-UHFFFAOYSA-N nifedipine Chemical compound COC(=O)C1=C(C)NC(C)=C(C(=O)OC)C1C1=CC=CC=C1[N+]([O-])=O HYIMSNHJOBLJNT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229960003104 ornithine Drugs 0.000 description 4
- 210000004738 parenchymal cell Anatomy 0.000 description 4
- OIGNJSKKLXVSLS-VWUMJDOOSA-N prednisolone Chemical compound O=C1C=C[C@]2(C)[C@H]3[C@@H](O)C[C@](C)([C@@](CC4)(O)C(=O)CO)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 OIGNJSKKLXVSLS-VWUMJDOOSA-N 0.000 description 4
- 229960005205 prednisolone Drugs 0.000 description 4
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 4
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 4
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 4
- VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N uroanthelone Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)C(C)C)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CS)NC(=O)CNC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O)C(C)C)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N 0.000 description 4
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 4
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 3
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 3
- 102000029816 Collagenase Human genes 0.000 description 3
- 108060005980 Collagenase Proteins 0.000 description 3
- 208000000857 Hepatic Insufficiency Diseases 0.000 description 3
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 3
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 3
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 3
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 3
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000001164 bioregulatory effect Effects 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 229960002424 collagenase Drugs 0.000 description 3
- 230000001461 cytolytic effect Effects 0.000 description 3
- 238000012303 cytoplasmic staining Methods 0.000 description 3
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 3
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 3
- BVTBRVFYZUCAKH-UHFFFAOYSA-L disodium selenite Chemical compound [Na+].[Na+].[O-][Se]([O-])=O BVTBRVFYZUCAKH-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N eosin Chemical compound [Na+].OC(=O)C1=CC=CC=C1C1=C2C=C(Br)C(=O)C(Br)=C2OC2=C(Br)C(O)=C(Br)C=C21 YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000000925 erythroid effect Effects 0.000 description 3
- 229940031098 ethanolamine Drugs 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 230000006870 function Effects 0.000 description 3
- 230000005714 functional activity Effects 0.000 description 3
- 230000002055 immunohistochemical effect Effects 0.000 description 3
- 238000002650 immunosuppressive therapy Methods 0.000 description 3
- 238000010606 normalization Methods 0.000 description 3
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 3
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 3
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 3
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 3
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 3
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 3
- 229960001471 sodium selenite Drugs 0.000 description 3
- 235000015921 sodium selenite Nutrition 0.000 description 3
- 239000011781 sodium selenite Substances 0.000 description 3
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010057248 Cell death Diseases 0.000 description 2
- 229930105110 Cyclosporin A Natural products 0.000 description 2
- PMATZTZNYRCHOR-CGLBZJNRSA-N Cyclosporin A Chemical compound CC[C@@H]1NC(=O)[C@H]([C@H](O)[C@H](C)C\C=C\C)N(C)C(=O)[C@H](C(C)C)N(C)C(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C1=O PMATZTZNYRCHOR-CGLBZJNRSA-N 0.000 description 2
- 108010036949 Cyclosporine Proteins 0.000 description 2
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 2
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 2
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 2
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 2
- BYPFEZZEUUWMEJ-UHFFFAOYSA-N Pentoxifylline Chemical compound O=C1N(CCCCC(=O)C)C(=O)N(C)C2=C1N(C)C=N2 BYPFEZZEUUWMEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QJJXYPPXXYFBGM-LFZNUXCKSA-N Tacrolimus Chemical compound C1C[C@@H](O)[C@H](OC)C[C@@H]1\C=C(/C)[C@@H]1[C@H](C)[C@@H](O)CC(=O)[C@H](CC=C)/C=C(C)/C[C@H](C)C[C@H](OC)[C@H]([C@H](C[C@H]2C)OC)O[C@@]2(O)C(=O)C(=O)N2CCCC[C@H]2C(=O)O1 QJJXYPPXXYFBGM-LFZNUXCKSA-N 0.000 description 2
- GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J Trypan blue Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].C1=C(S([O-])(=O)=O)C=C2C=C(S([O-])(=O)=O)C(/N=N/C3=CC=C(C=C3C)C=3C=C(C(=CC=3)\N=N\C=3C(=CC4=CC(=CC(N)=C4C=3O)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)C)=C(O)C2=C1N GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 2
- 210000000013 bile duct Anatomy 0.000 description 2
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 2
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 2
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 208000020832 chronic kidney disease Diseases 0.000 description 2
- 208000022831 chronic renal failure syndrome Diseases 0.000 description 2
- 229960001265 ciclosporin Drugs 0.000 description 2
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 2
- 238000001784 detoxification Methods 0.000 description 2
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 2
- 210000003725 endotheliocyte Anatomy 0.000 description 2
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 2
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 2
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 2
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 description 2
- 238000000227 grinding Methods 0.000 description 2
- 230000003494 hepatotrophic effect Effects 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 2
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 2
- 230000004768 organ dysfunction Effects 0.000 description 2
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 2
- 229940072288 prograf Drugs 0.000 description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- WHBMMWSBFZVSSR-UHFFFAOYSA-N 3-hydroxybutyric acid Chemical compound CC(O)CC(O)=O WHBMMWSBFZVSSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920002527 Glycogen Polymers 0.000 description 1
- 239000012981 Hank's balanced salt solution Substances 0.000 description 1
- 206010067125 Liver injury Diseases 0.000 description 1
- 101000574441 Mus musculus Alkaline phosphatase, germ cell type Proteins 0.000 description 1
- BUGBHKTXTAQXES-UHFFFAOYSA-N Selenium Chemical compound [Se] BUGBHKTXTAQXES-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940122618 Trypsin inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 101710162629 Trypsin inhibitor Proteins 0.000 description 1
- HMNOVBZVCHMSQG-UHFFFAOYSA-N [Na].NCCO Chemical compound [Na].NCCO HMNOVBZVCHMSQG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 239000004621 biodegradable polymer Substances 0.000 description 1
- 229920002988 biodegradable polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 230000001851 biosynthetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000023555 blood coagulation Effects 0.000 description 1
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 1
- 239000008366 buffered solution Substances 0.000 description 1
- 244000309464 bull Species 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 230000008619 cell matrix interaction Effects 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 1
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 1
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 description 1
- 238000005138 cryopreservation Methods 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 210000003722 extracellular fluid Anatomy 0.000 description 1
- 238000013213 extrapolation Methods 0.000 description 1
- 239000010419 fine particle Substances 0.000 description 1
- -1 for example Substances 0.000 description 1
- 229940096919 glycogen Drugs 0.000 description 1
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002440 hepatic effect Effects 0.000 description 1
- 235000012907 honey Nutrition 0.000 description 1
- 210000003692 ilium Anatomy 0.000 description 1
- 230000002519 immonomodulatory effect Effects 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000006058 immune tolerance Effects 0.000 description 1
- 230000000403 immunocorrecting effect Effects 0.000 description 1
- 230000004957 immunoregulator effect Effects 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 1
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 1
- 230000008611 intercellular interaction Effects 0.000 description 1
- 230000016507 interphase Effects 0.000 description 1
- 238000002690 local anesthesia Methods 0.000 description 1
- 210000000713 mesentery Anatomy 0.000 description 1
- 230000008986 metabolic interaction Effects 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 1
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 230000009707 neogenesis Effects 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 230000035764 nutrition Effects 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 230000035479 physiological effects, processes and functions Effects 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920000728 polyester Polymers 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 1
- 238000002271 resection Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 229910052711 selenium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011669 selenium Substances 0.000 description 1
- 229940091258 selenium supplement Drugs 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 230000001568 sexual effect Effects 0.000 description 1
- 210000000813 small intestine Anatomy 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 1
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 description 1
- 210000002303 tibia Anatomy 0.000 description 1
- 239000002753 trypsin inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61B—DIAGNOSIS; SURGERY; IDENTIFICATION
- A61B17/00—Surgical instruments, devices or methods
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K33/00—Medicinal preparations containing inorganic active ingredients
- A61K33/14—Alkali metal chlorides; Alkaline earth metal chlorides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K33/00—Medicinal preparations containing inorganic active ingredients
- A61K33/44—Elemental carbon, e.g. charcoal, carbon black
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/28—Bone marrow; Haematopoietic stem cells; Mesenchymal stem cells of any origin, e.g. adipose-derived stem cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/37—Digestive system
- A61K35/407—Liver; Hepatocytes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/39—Connective tissue peptides, e.g. collagen, elastin, laminin, fibronectin, vitronectin, cold insoluble globulin [CIG]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
- A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
- A61K8/30—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds
- A61K8/64—Proteins; Peptides; Derivatives or degradation products thereof
- A61K8/65—Collagen; Gelatin; Keratin; Derivatives or degradation products thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61M—DEVICES FOR INTRODUCING MEDIA INTO, OR ONTO, THE BODY; DEVICES FOR TRANSDUCING BODY MEDIA OR FOR TAKING MEDIA FROM THE BODY; DEVICES FOR PRODUCING OR ENDING SLEEP OR STUPOR
- A61M37/00—Other apparatus for introducing media into the body; Percutany, i.e. introducing medicines into the body by diffusion through the skin
Landscapes
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Materials For Medical Uses (AREA)
Abstract
Изобретение относится к медицине, клеточной трансплантологии, гепатологии. Проводят имплантацию в паренхиму печени клеточно-инженерной конструкции (КИК) с последующим назначением антикоагулянтов и антиагрегантов в профилактической дозе. При этом сначала в течение 8-12 ч при 4°С инкубируют матрикс из децеллюляризированной донорской печени млекопитающего в физиологическом растворе, забуференном фосфатами и имеющем следующий состав: 138 мМ NaCl, 2,67 мМ KCl, 1,47 мМ KH2PO4, 8,1 мМ Na2HPO4, дистиллированная вода до 1 л и содержащем фибронектин и ламинин по 10 мкг/мл, с pH 7,4. Соотношение объемов матрикса и физраствора составляет 1:1. Затем на матриксе в течение 2-4 сут проводят сокультивирование свежевыделенных аллогенных клеток печени и предварительно культивированных аллогенных или аутологичных мезенхимальных стволовых клеток костного мозга при соотношении клеток костного мозга к клеткам печени от 1:1 до 1:10, обеспечивая прикрепление клеток в количестве 2×106-15×106 на 1 см3 матрикса. Общий объем матрикса с прикрепленными клетками составляет не менее 0,05 см3. Перед имплантацией получают КИК, смешивая матрикс с прикрепленными к нему клетками и биополимерным гетерогенным коллагенсодержащим гидрогелем в объемном соотношении 3:1. В частном случае матрикс получают из децеллюляризированной донорской печени человека. Матрикс может иметь размеры частиц от 200 до 700 мкм, размеры пор не более 50 мкм, суммарную пористость 70-85%. В качестве гетерогенного биосовместимого биодеградируемого геля может быть использован сферогель. Способ позволяет улучшить результаты лечения печеночной недостаточности путем активизации двухсторонних взаимодействий между имплантированными КИК как готовыми гепатоподобными структурами и паренхимой поврежденной печени реципиента с ускоренной интеграцией их с поврежденной печенью. 3 з.п. ф-лы, 5 ил.
Description
Изобретение относится к регенеративной медицине, трансплантологии, а именно к клеточной трансплантологии, и может быть использовано при коррекции и лечении печеночной недостаточности. Предлагаемый способ может быть использован в специализированных отделениях, занимающихся лечением и коррекцией печеночной недостаточности.
В настоящее время известно, что для повышения эффективности лечения поврежденной печени следует использовать приемы тканевой инженерии, предполагающие создание имплантируемых клеточно-инженерных конструкций (КИК).
Известны способы лечения печеночной недостаточности, основанные на использовании КИК, состоящих из изолированных аутологичных клеток печени и аутологичных мезенхимальных стволовых клеток костного мозга, адгезированных на биосовместимом биодеградируемом трехмерном матриксе из биодеградируемого бактериального сополимера β-оксибутирата и β-оксивалерата и полиэфира (ЭластоПОБ®) либо на биосовместимом биодеградируемом биополимерном гетерогенном коллагенсодержащем гидрогеле (СфероГЕЛЬ®) (Патенты РФ на изобретение №2425648 С1, №2425645, С1), которые имплантируют в ткань печени или в брыжейку тонкой кишки.
Также известны способы лечения печеночной недостаточности с помощью КИК, в которых для иммобилизации клеточного материала и пролонгирования выживания заключенных в них клеток использованы биосинтетические или синтетические матриксы [Kulig K.М. & Vacanti J.P. Hepatic tissue engineering. // Transpl. Immunol. - 2004. - Vol. 12. - p. 303-310].
В качестве прототипа нами выбран известный способ лечения печеночной недостаточности, в котором использовались трансплантаты, содержащие изолированные гепатоциты и мезенхимальные стромальные клетки костного мозга (МСК КМ) на биополимерном гетерогенном коллагенсодержащем гидрогеле (СфероГЕЛЬ®) для вспомогательной поддержки печени и восполнения дезинтоксикационной и биорегуляторной функции поврежденной печени, а также для активизации восстановительных процессов в ней (Патент РФ на изобретение №2425645 С1).
К недостаткам использования известных способов, в том числе и прототипа, предполагающих внутрипеченочную имплантацию КИК на основе биоматрикса, относят и трудности получения достаточного количества аутологичных клеток печени, а также недостаточный объем регуляторных возможностей используемых матриксов и, следовательно, недостаточную выраженность процессов регуляции восстановительных процессов в печени с использованием предложенных КИК.
Используемые в КИК матриксы:
- не обладают тканеспецифичностью и биоидентичностью, которые необходимы для активного взаимодействия адгезированных клеток с самим матриксом, так как не представляют собой активной живой регуляторной структуры;
- не участвуют в неогенезе гепатоподобных структур;
- имеют низкую (не оптимальную) плотность прикрепления клеток;
- не предотвращают гибель большого количества изолированных гепатоцитов;
- не оптимизируют сроки жизнедеятельности КИК и эффективность их регуляторного воздействия на поврежденную печень.
Задачей изобретения является разработка способа, повышающего эффективность лечения печеночной недостаточности за счет пролонгирования сроков выживания и большей плотности прикрепления клеток печени и МСК КМ в составе имплантируемых КИК, а также повышения ими регенераторной (восстановительной) активности ткани поврежденной печени (клетки печени и ее внеклеточный матрикс) путем имплантации КИК, в которых клетки адгезированы на предварительно инкубированном тканеспецифическом мелкодисперсном матриксе из децеллюляризированной донорской печени млекопитающих.
Технический результат, достигаемый при осуществлении заявляемого способа, заключается в:
- интенсивной и эффективной коррекции и лечении печеночной недостаточности путем активизации детоксикационных, синтетических и регенерационных (восстановительных) процессов в поврежденной печени за счет более активно функционирующих КИК, имплантированных в поврежденную печень;
- создании тканеспецифического каркаса, предназначенного для прикрепления клеток и формирования в КИК тканеподобных структур (ассоциаты клеток печени на тканеспецифическом матриксе), обеспечивающих физиологичные условия функционирования и взаимодействия находящихся в них клеток с матриксом;
- активизации процессов прикрепления и повышения плотности прикрепления клеток на тканеспецифическом матриксе за счет предварительного инкубирования (подготовки) этого матрикса в среде, содержащей растворимые компоненты внеклеточного (нативного) матрикса;
- пролонгировании сроков выживания клеточного материала в составе КИК с активизацией пролиферации в них клеток печени за счет активизации взаимодействия клеток печени и МСК КМ в результате их предварительного сокультивирования на тканеспецифическом матриксе с образованием клеточных ассоциатов;
- создании условий для прорастания в тканеспецифический каркас сосудов, диффузии питательных веществ, кислорода и факторов тканевой дифференцировки к иммобилизированным печеночным клеткам и МСК КМ, обеспечивающих образование в зонах имплантации КИК новых дополнительных центров устойчивой регенерации печени, повышающих терапевтический эффект;
- отсутствии отторжения имплантата (используемый нативный матрикс тканеспецифичен, но видонеспецифичен).
Достоинствами предложенного способа и имплантата для лечения печеночной недостаточности являются:
- создание с помощью предварительно подготовленного тканеспецифического матрикса культуральных условий для прикрепления и пролиферации клеток в пространстве КИК и формирования в нем дополнительной «тканеподобной» длительно функционирующей структуры (клетки печени, МСК КМ и нативный матрикс);
- создание физиологических условий для диффузии оксигенированной межтканевой жидкости и прорастания сосудов через тканеспецифический матрикс, что пролонгирует адекватные условия жизнеобеспечения и взаимодействия адгезированных клеток, матрикса и окружающей ткани печени;
- формирование КИК с длительно функционирующей тканеподобной структурой создает в поврежденной печени центры для ее устойчивой восстановительной регенерации, обеспечивающей выраженный лечебный эффект;
- использование в составе КИК аллогенных или аутологичных мезенхимальных стромальных клеток костного мозга позволяет значительно уменьшить реакцию иммунной системы на КИК печени после ее имплантации, оказывая длительное биорегуляторное воздействие на регенераторные процессы в поврежденной печени.
В предлагаемом изобретении не используются ткани и/или клеточный материал эмбрионов человека. Использован клеточный материал взрослых доноров.
Сокультивирование клеток печени и МСК КМ на предварительно подготовленном тканеспецифическом матриксе перед имплантацией позволяет активизировать трехсторонние взаимодействия (клетки печени, МСК КМ и тканеспецифический матрикс) и дополнительно повышать функциональную активность гепатоцитов и МСК КМ, способствуя формированию сосудов и прорастанию их в матрикс за счет дифференцировки МСК КМ в эндотелиоциты.
Эта процедура сокультивирования клеток печени и МСК КМ на предварительно подготовленном тканеспецифическом матриксе способствует более быстрой интеграции имплантата (КИК печени) в систему кровообращения поврежденной печени и доставки ее по вновь образованным и проросшим сосудам кислорода и питательных веществ, создающих более адекватные условия для жизнеобеспечения клеток в составе КИК.
Предлагаемый способ позволяет длительно и более интенсивно корригировать и лечить хроническую печеночную недостаточность за счет более эффективного и пролонгированного функционирования КИК, которое достигается путем обеспечения физиологичного взаимодействия предварительно инкубированного тканеспецифического матрикса с гликопротеинами (фибронектин, ламинин) и последующей посадки на этот матрикс и сокультивирования на нем клеток печени и МСК КМ с образованием ассоциатов, а также их индукционного воздействия на ткань поврежденной печени.
Предлагаемое изобретение позволяет также:
1. Создавать условия не только для прикрепления клеток печени и МСК КМ к трехмерному биосовместимому тканеспецифическому матриксу печени, но и создавать условия для их трехстороннего контактного и метаболического взаимодействия, которое активизирует пролиферацию и регуляторную активность клеток в составе КИК. Последнее поддерживается диффузией через тканеспецифический матрикс питательных веществ и кислорода, а также различных регуляторных пептидов и факторов, которые поддерживают в КИК метаболизм и функцию не только клеток, но также и самого матрикса;
2. Создать каркас на основе трехмерного биосовместимого тканеспецифического матрикса печени, полностью повторяющего пространственную структуру архитектоники печени для тканеобусловленного прикрепления клеток печени и МСК КМ и формирования в КИК гепатоподобных структурных единиц.
3. Создать условия для формирования и прорастания в этот нативный тканеспецифический каркас сосудов для питания прикрепленных клеток и ускоренной интеграции КИК с тканями поврежденной печени;
4. Создать условия, препятствующие клеточной инфильтрации имплантата и поддерживающие сформированные клеточные ассоциаты в жизнеспособном состоянии за счет использования антикоагулянтов и антиагрегантов;
5. Ускорить процесс реализации биорегуляторного и восстановительного воздействия КИК на поврежденную печень после имплантации за счет предварительного сокультивирования клеток печени и МСК КМ на мелкодисперсных частицах тканеспецифического матрикса, что позволяет имплантировать КИК в виде готовых жизнеспособных конструкций клеточных ассоциатов.
Предварительная обработка тканеспецифического матрикса гликопротеинами нативного внеклеточного матрикса повышает его адгезивные свойства, способствует повышению плотности посадки клеток и обеспечивает восстановление межклеточных и клеточно-матриксных взаимодействий, необходимых для интеграции КИК в поврежденную ткань печени.
Сущность изобретения заключается в следующем.
Способ лечения печеночной недостаточности включает имплантацию в паренхиму печени клеточно-инженерной конструкции (КИК) с последующим назначением антикоагулянтов и антиагрегентов в профилактической дозе. При этом сначала в течение 8-12 часов при температуре 4°С инкубируют матрикс из децеллюляризированной донорской печени млекопитающего в физиологическом растворе, забуференном фосфатами. Физиологический раствор, забуференный фосфатами имеет следующий состав: 138 мМ NaCl, 2,67 мМ KCl, 1,47 мМ KH2PO4, 8,1 мМ Na2HPO4, дистиллированная вода до 1 л, и содержит фибронектин и ламинин по 10 мкг/мл, имеет pH 7,4. Соотношение объемов матрикса и забуференного фосфатами физиологического раствора составляет 1:1. Затем на матриксе в течение 2-4 суток проводят сокультивирование свежевыделенных аллогенных клеток печени и предварительно культивированных аллогенных или аутологичных мезенхимальных стволовых клеток костного мозга при соотношении клеток костного мозга к клеткам печени - от 1:1 до 1:10, обеспечивая прикрепление клеток в количестве 2×106-15×106 на 1 см3 матрикса. При этом общий объем матрикса с прикрепленными клетками составляет не менее 0,05 см3. Перед имплантацией получают КИК, смешивая матрикс с прикрепленными к нему клетками и биополимерный гетерогенный коллагенсодержащий гидрогель в объемном соотношении 3:1.
В частном случае матрикс получают из децеллюляризированной донорской печени человека.
В частном случае матрикс имеет размеры частиц от 200 до 700 мкм, размеры пор не более 50 мкм и суммарную пористость 70-85%.
В качестве биополимерного гетерогенного коллагенсодержащего гидрогеля может быть использован СфероГЕЛЬ.
Способ осуществляют следующим образом, он включает в себя несколько последовательных этапов:
1. Выделение аллогенных или аутологичных мезенхимальных стволовых клеток костного мозга
Выделение мезенхимальных стволовых клеток костного мозга клеток костного мозга осуществляют по традиционной методике (Шумаков В.И., Онищенко Н.А., Крашенинников М.Е. и др. Костный мозг как источник получения мезенхимальных клеток для восстановления терапии поврежденных органов // Вестник трансплантологии и иск. органов 2002, 4, с. 3-6; Шумаков В.И., Онищенко Н.А. и соавт. Биологические резервы клеток костного мозга и коррекция органных дисфункций // Москва, «ЛАВР.». 2009. - с. 61-67). За 4-7 дней до основного оперативного вмешательства под местным обезболиванием пунктируют подвздошную кость пациента и забирают костный мозг в объеме 40-150 мл в стерильную емкость с раствором Хенкса, содержащим 200 мкг/мл гентамицина; 10,0 мкг/мл инсулина; 0,25 мкМ дексамезатона; 250 ед./мл гепарина. Суспензию клеток центрифугируют 5 мин при 1500 об/мин, осадок клеток ресуспендируют в лизирующем растворе (114 мМ NH4Cl; 7,5 мМ KHCO3; 100 мкМ EDTA) в соотношении 1:4 от исходного объема аспирата в течение 5-10 мин и центрифугируют 3 мин при 1500 об/мин при комнатной температуре. Гемолизированный суспернатант полностью удаляют отсасыванием. Добиваются полного лизиса эритроцитов, для чего процедуру лизирования проводят трижды с последующим отмыванием клеток центрифугированием. Клеточный осадок, свободный от эритроидных и тромбоцитарных форм, ресуспендируют в ростовой среде.
2. Культивирование аллогенных или аутологичных мезенхимальных стволовых клеток костного мозга in vitro
Культивирование мезенхимальных стволовых клеток костного мозга осуществляют по традиционной методике (Шумаков В.И., Онищенко Н.А., Крашенинников М.Е. и др. Костный мозг как источник получения мезенхимальных клеток для восстановления терапии поврежденных органов // Вестник трансплантологии и иск. Органов. 2002, 4, с. 3-6; Шумаков В.И., Онищенко Н.А. и соавт. Биологические резервы клеток костного мозга и коррекция органных дисфункций // Москва, Лавр. 2009. - с. 77-100). Частично очищенные мезенхимальные стволовые клетки костного мозга, высевают для культивирования на чашки Петри d=60 мм в количестве 1,5-2,0 млн клеток/мл. Культивируют при 37°С в CO2-инкубаторе, атмосфера 5% CO2 и 95% влажности в течение 7 суток с однократной сменой среды на третьи сутки. Через неделю культура клеток костного мозга содержала до 10% прикрепившихся к пластику распластанных фибробластоподобных и моноцитарных клеток и до 90% свободно плавающих в суспензии округлых не прикрепившихся клеток (гемопоэтические клетки). Не прикрепившиеся к пластику мезенхимальные стволовые клетки костного мозга отбирали и затем использовали для иммобилизации на мелкодисперсный тканеспецифический матрикс вместе со свежевыделенными клетками печени.
3. Предварительная подготовка мелкодисперсного тканеспецифического матрикса для посадки клеток
Мелкодисперсный тканеспецифический матрикс из децеллюляризированной донорской печени млекопитающих, изготовленный по патенту РФ №2539918 от 27.01.2015 г. «Способ получения тканеспецифического матрикса для тканевой инженерии паренхиматозного органа» инкубируют в течение 8-12 часов при температуре 4°С в физиологическом растворе, забуференном фосфатами. Фосфатный буфер имеет следующий состав: 138 мМ NaCl, 2,67 мМ KCl, 1,47 мМ KH2PO4, 8,1 мМ Na2HPO4, дистиллированная вода до 1 л, pH 7,4 с добавлением в него гликопротеинов (например фибронектина и ламинина по 10 мкг/мл), причем матрикс и физиологический раствор, забуференный фосфатами, используется для инкубации в равных объемах в соотношении 1:1.
4. Выделение аллогенных клеток печени
Производят резекцию 2-4×2-4×1-2 см ткани печени у доноров для получения клеток печени. Выделение аллогенных клеток печени осуществляют по традиционной методике (Fontaine М, Schloo В, Jenkins R, Uyama S, Hansen L, Vacanti J.P. Human hepatocyte isolation and transplantation into an athymic rat, using prevascularized cell polymer constructs. // Pediatr. Surg. - 1995. - vol. 30(1). - P. 56-60; Hang H, Shi X, Gu G, Wu Y, Ding Y. A simple isolation and cryopreservation method for adult human hepatocytes // Int J Artif Organs. 2009 Oct; 32(10). - P. 720-7; Lehec S.C, Hughes RD, Mitry R.R, Graver M.A, Verma A, Wade J.J, Dhawan A. Experience of microbiological screening of human hepatocytes for clinical transplantation. // Cell Transplant. 2009; 18(8). - P. 941-947; Seglen O. Preparation of isolated rat liver cells. // Methods. Cell. Biol. 1976. - vol. 13. - P. 29-83).
Выделение аллогенных клеток печени производят из резецированного участка печени путем 3-х кратной отмывки кусочка печени от крови и измельчения его на холоду (t=4°С) в чашке Петри с 3-х кратной отмывкой образовавшейся взвеси буферным раствором без кальция [1000 мл дистиллированной воды, 8.3 г NaCl, 0.5 г KCl, 2.38 г HEPES, pH 7,4, 37°С] в течение 7 минут. После этого мелкие кусочки печени инкубируются 3 раза раствором коллагеназы [1000 мл дистиллированной воды, 8.3 г NaCl, 0.5 г KCl, 0.7 г CaCl2, 2.38 г HEPES, 7.5 мг ингибитор трипсина и 500 мг коллагеназы Тип IV-S (>125 CDU/mg), pH 7,3; 37°С] в течение 6-8 минут с последующей заменой ферментного раствора с использованием центрифугирования 500 об/мин в течение 1 минуты при t=37°C. Полученный материал переносят на сито с ячейками 200 мкм и фильтруют промыванием питательной средой William's Е с 10% фетальной бычьей сыворотки, после чего суспензию отдельных клеток и небольших агрегатов переносят в центрифужную пробирку и центрифугируют при 500 об/мин при 4°С в течение 1 минуты. Супернатант удаляют, осадок ресуспендируют в такой же свежей среде и опять центрифугируют. Процедуру повторяют 3 раза. Жизнеспособность клеток оценивают методом окрашивания трипановым синим. Добиваются получения количества клеток в пределах от 3,0×108 до 4,0×108 гепатоцитов на 12-15 г веса ткани печени. Клеточная суспензия должна содержать: гепатоциты, непаренхиматозные клетки печени, которые определяют при световой микроскопии. Разделение паренхиматозных и непаренхиматозных клеток не выполняют. Взвесь клеток печени концентрируют в 1-2 мл физиологического раствора.
5. Посадка (иммобилизация) аллогенных клеток печени и аллогенных или аутологичных мезенхимальных стволовых клеток костного мозга на мелкодисперсный тканеспецифический предварительно подготовленный матрикс печени для создания КИК печени
Посадку (иммобилизацию) клеточного материала осуществляют по традиционной методике (Mooney D.J., Sano K., Kaufmann P.M., Majahod K., Schloo B., Vacanti J.P., Langer R. Long-term engraftment of hepatocytes transplanted о biodegradable polymer sponges // J. Biomed. Mater. Res. - 1997. - Vol. 5. - P. 413-420).
Аллогенные клетки печени и аллогенные или аутологичные мезенхимальные стволовые клетки костного мозга ресуспендировали в ростовой среде [William's Е с заменой аргинина на орнитин с добавлением фетальной бычьей сыворотки, фактора роста гепатоцитов, эпидермального фактора роста, β-субъединицы холерного токсина, дексамезатона, этаноламина, селенита натрия, глюкагона, инсулина, инсулиноподобного фактора роста-I, аскорбиновой кислоты, линоленовой и линолевой жирных кислот] в концентрации 2,0-4,0×106 клеток печени/мл и 2,0-4,0×106 мезенхимальных стволовых клеток костного мозга/мл. Суммарную клеточную суспензию наносили на предварительно подготовленный матрикс в концентрации 2×106-15×106 на 1 см3.
В качестве матрикса может быть использован, например, биоматериал, созданный из децеллюляризированной печени млекопитающих - трехмерный биосовместимый тканеспецифический матрикс печени (Готье С.В. и соавт. Патент на изобретение №2539918 от 21.01.2015 г.), предварительно подготовленный по вышеописанному способу (пункт №3).
6. Сокультивирование аллогенных или аутологичных мезенхимальных стволовых клеток костного мозга и аллогенных клеток печени in vitro на предварительно подготовленном мелкодисперсном матриксе из децеллюляризированной печени млекопитающих
Выполняли сокультивирование аллогенных клеток печени и мезенхимальных стволовых клеток костного мозга по общепринятой методике (Kaufmann P.M., Sano K., Uyama S., Breuer C.K., Organ G.M., Schloo B.L., Kluth D., Vacanti J.P. Evaluation of Methods of Hepatotrophic Stimulation in Rat Heterotopic Hepatocyte Transplantation Using Polymers // J. of Pediatric Surgeru. - 1999. - Vol. 34. - P. 1118-1123; Uyama S., Kaufmann P.M., Takeda Т., Vacanti J.P. Delivery of whole liver equivalent hepatocyte mass using polymer devices and hepatotrophic stimulation // Transplantation. - 1993. - Vol. 55. - P. 932-935), используя соотношение клеток печени к МСК КМ от 1:1 до 1:10.
Это позволяло обеспечить возникновение трехсторонних взаимодействий (клетки печени, МСК КМ и предварительно подготовленный матрикс из децеллюляризированной печени млекопитающих) и до имплантации КИК в печень повысить жизнеспособность в них клеток печени и мезенхимальных стволовых клеток костного мозга и способность их к формированию печеночно-подобных структур, способных выполнять не только специфические функции, но и способствовать формированию из МСК КМ (эндотелиоцитов) сосудов и желчных протоков и их прорастанию как в КИК, так и в ткань печени.
Тканеспецифический матрикс печени с клетками помещали в стерильную камеру для инкубации in vitro в ростовой среде [William's Е с заменой аргинина на орнитин с добавлением фетальной бычьей сыворотки, фактора роста гепатоцитов, эпидермального фактора роста, β-субъединицы холерного токсина, дексамезатона, этаноламина, селенита натрия, глюкагона, инсулина, инсулиноподобного фактора роста-I, аскорбиновой кислоты, линоленовой и линолевой жирных кислот] на 2-4 суток.
7. Подготовка КИК печени для имплантации
Полученные КИК (предварительно подготовленный тканеспецифический матрикс печени с иммобилизированными аллогенными клетками печени и аллогенными или аутологичными мезенхимальными стволовыми клетками костного мозга с образованием клеточных ассоциатов) ресуспендировали из ростовой среды и смешивали с коллагенсодержащим гидрогелем, например с биополимерным гетерогенным коллагенсодержащим гидрогелем - СфероГЕЛЬ в соотношении объемов 3:1.
8. Имплантация КИК печени (предварительно подготовленный тканеспецифический матрикс печени с иммобилизированными аллогенными клетками печени и аллогенными или аутологичными мезенхимальными стволовыми клетками костного мозга в паренхиму поврежденной печени)
Имплантацию КИК печени (тканеспецифичный матрикс с иммобилизированными аллогенными клетками печени и аллогенными или аутологичными мезенхимальными стволовыми клетками костного мозга) осуществляют пациентам с печеночной недостаточностью в поврежденную печень.
9. Использование антикоагулянтов и антиагрегантов
После имплантации КИК печени (предварительно подготовленный тканеспецифический матрикс с иммобилизированными аллогенными клетками печени и аллогенными или аутологичными мезенхимальными стволовыми клетками костного мозга пациентам назначают антикоагулянты в профилактической дозе, например: гепарин 5000 ME каждые 12 часов в течение 7-10 дней под контролем свертывающей системы крови и антиагреганты, например трентал, из расчета 45 мг/м2 поверхности тела каждые 12 часов в течение 30-90 дней.
Предложенный имплантат (КИК печени) для лечения печеночной недостаточности состоит из предварительно подготовленного тканеспецифического матрикса печени млекопитающих и посаженых на него аллогенных или аутологичных мезенхимальных стволовых клеток костного мозга и аллогенных клеток печени с образованием ассоциатов до имплантации.
Для доказательства возможности достижения заявленного назначения и достижения указанного технического результата приводим следующие данные.
Пример осуществления предлагаемого способа с использованием предлагаемого имплантата в эксперименте.
Моделирование хронической печеночной недостаточности у животных (крысы) осуществляли по признанной и адекватной модели (Фишер А. Физиология и экспериментальная патология печени // А. Фишер. - Будапешт, 1961, - 230 с.; Колпащикова И.Ф. Влияние трансплантации клеток тимуса, костного мозга и селезенки на восстановительные процессы в патологически измененной печени // Бюл. эксперим. биол. и мед., - 1979, №10. - С. 477-480; Колпащикова И.Ф. Общие и местные изменения в организме при экспериментальном повреждении печени и ее регенерация // Автореф. докт. дисс. - 1982, Казань. - 41 с.) путем введения 60% раствора CCl4, первые два введения по 0,5 мл на 100 г массы, последующие по 0,3 мл на 100 г массы тела. Курс введения 6 недель с частотой 2 введения в неделю.
1. Осуществляли по традиционной методике выделение аллогенных или аутологичных мезенхимальных стволовых клеток костного мозга.
Получали клеточный аспират из костно-мозгового канала большеберцовых костей (крысы) путем промывания полости фосфатно-буферным раствором, содержащим 50 ед./мл гепарина и 0,25 мг/л гентамицина с помощью иглы 18G, насаженной на шприц. Суспензию клеток центрифугировали, осадок клеток ресуспендировали в лизирующем растворе при комнатной температуре в течение 3 мин и снова центрифугировали 3-5 мин при 1500 об/мин. Гемолизированный супернатант полностью удаляли отсасыванием, а клеточный осадок, содержащий мезенхимальные стволовые клетки костного мозга, ресуспендировали в ростовой среде. Интерфазу с мононуклеарными клетками собирали с поверхности эритроидного осадка и ресуспендировали в лизирующем растворе в соотношении 1:4 в течение 5-8 мин и центрифугировали 5 мин при 1500 об/мин при комнатной температуре. Гемолизированный супернатант полностью удаляли. Добивались полного лизиса эритроцитов, для чего процедуру лизирования проводили дважды или трижды с последующим отмыванием клеток центрифугированием. Клеточный осадок, свободный от эритроидных и тромбоцитарных форм, в количестве 60-150×106 клеток объединяли с осадком клеток, полученным из плазмы, и далее ресуспендировали в ростовой среде для стимуляции роста клеток.
2. Осуществляли по традиционной методике культивирование мезенхимальных стволовых клеток костного мозга.
Частично очищенные мезенхимальные стволовые клетки костного мозга высевали для культивирования в количестве 1,5-2,0 млн клеток/мл. Культивировали при 37°С в CO2-инкубаторе, атмосфере 5% CO2 и 95% влажности в течение 7 суток с однократной сменой среды на третьи сутки.
3. Мелкодисперсный тканеспецифический матрикс из децеллюляризированной донорской печени крысы, изготовленный по патенту №2539918 от 21.01.2015 г. «Способ получения тканеспецифического матрикса для тканевой инженерии паренхиматозного органа», инкубируется в течение 8-12 часов при температуре 4°С в физиологическом растворе, забуференном фосфатами, который имеет следующий состав: 138 мМ NaCl, 2,67 мМ KCl, 1,47 мМ KH2PO4, 8,1 мМ Na2HPO4, дистиллированная вода до 1 л, pH 7,4, с добавлением в него гликопротеинов (например, фибронектина и ламинина по 10 мкг/мл), причем матрикс и физиологический раствор, забуференный фосфатами, используется для инкубации в равных объемах, например в соотношении 1:1.
4. Выделение аллогенных клеток печени осуществляли по традиционной методике.
Выделение аутологичных клеток печени из резецированного участка печени (1×1×0,5 см у крыс) производилось путем 3-х кратной отмывки от крови и измельчения его на холоду (t=4°С) с 3-х кратной отмывкой образовавшейся взвеси буферным раствором без кальция в течение 7 минут. После этого мелкие кусочки печени были проинкубированы 3 раза раствором коллагеназы в течение 6-8 минут с последующей заменой ферментного раствора с использованием центрифугирования 500 об/мин в течение 1 минуты при t=37°C. Полученный материал переносился на сито с ячейками 200 мкм и фильтровался промыванием питательной средой William's Е с 10% фетальной бычьей сыворотки, после чего суспензию клеток центрифугировали при 500 об/мин при 4°С в течение 1 минуты. Супернатант удаляли, осадок ресуспендировали в такой же свежей среде и опять центрифугировали. Процедуру повторяли 3 раза. Жизнеспособность клеток, колебавшаяся в пределах от 83 до 95%, оценивали методом окрашивания трипановым синим. Количество клеток колебалось в пределах от 3,0×108 до 4,0×108 гепатоцитов на 15 г веса ткани печени. Клеточная суспензия содержала: гепатоциты ~95÷98% и ~5÷2% непаренхиматозных клеток печени, которые были определены при световой микроскопии. Разделение паренхиматозных и непаренхиматозных клеток не выполнялось. Взвесь клеток печени концентрировали в 1-2 мл физиологического раствора
5. Аллогенные клетки печени и аллогенные или аутологичные мезенхимальные стволовые клетки костного мозга ресуспендировали в ростовой среде [William's Е с заменой аргинина на орнитин с добавлением фетальной бычьей сыворотки, фактора роста гепатоцитов, эпидермального фактора роста, β-субъединицы холерного токсина, дексамезатона, этаноламина, селенита натрия, глюкагона, инсулина, инсулиноподобного фактора роста-I, аскорбиновой кислоты, линоленовой и линолевой жирных кислот] в концентрации 2,0-4,0×106 клеток печени/мл и 2,0-4,0×106 мезенхимальных стволовых клеток костного мозга/мл. Суммарную клеточную суспензию наносили на предварительно подготовленный матрикс в концентрации 2×106-15×106 на 1 см3.
6. Выполняли сокультивирование аллогенных клеток печени и аллогенных или аутологичных мезенхимальных стволовых клеток костного мозга. Для этого предварительно подготовленный тканеспецифический матрикс печени с клетками помещали в стерильную камеру для инкубации in vitro в ростовой среде [William's Е с заменой аргинина на орнитин с добавлением фетальной бычьей сыворотки, фактора роста гепатоцитов, эпидермального фактора роста, β-субъединицы холерного токсина, дексамезатона, этаноламина, селенита натрия, глюкагона, инсулина, инсулиноподобного фактора роста-I, аскорбиновой кислоты, линоленовой и линолевой жирных кислот] на 2-4 суток для формирования КИК (предварительно подготовленный тканеспецифический матрикс с клетками).
В качестве матрикса был использован, например, предварительно подготовленный тканеспецифический матрикс печени крысы.
7. Полученные КИК (предварительно подготовленный тканеспецифический матрикс печени с иммобилизированными аллогенными клетками печени и аллогенными или аутологичными мезенхимальными стволовыми клетками костного мозга с образованием клеточных ассоциатов) ресуспендировали из ростовой среды и смешивали с коллагенсодержащим гидрогелем, например с гетерогенным биосовместимым биодеградируемым гидрогелем - СфероГЕЛЬ® в соотношении объемов 3:1.
8. Имплантацию КИК печени (предварительно подготовленный тканеспецифичный матрикс с иммобилизированными аллогенными клетками печени и аллогенными или аутологичными мезенхимальными стволовыми клетками костного мозга) осуществляли крысам с печеночной недостаточностью в поврежденную печень на 7 сутки после окончания затравки ССl4 (затравка в течение 42 суток).
9. После имплантации КИК печени (предварительно подготовленный тканеспецифический матрикс с иммобилизированными аллогенными клетками печени и аллогенными или аутологичными мезенхимальными стволовыми клетками костного мозга крысам назначали антикоагулянты в профилактической дозе, например: гепарин 500 ME каждые 12 часов в течение 7-10 дней под контролем свертывающей системы крови и антиагреганты, например трентал, из расчета 45 мг/м2 поверхности тела каждые 12 часов в течение 30-90 дней.
По предложенному способу для коррекции и лечения хронической печеночной недостаточности нами проведено 30 экспериментов на крысах.
На фиг. 1 изображена динамика показателей цитолиза при моделированной хронической печеночной недостаточности в контроле, где: А-Б: АлАТ, В-Г: АсАТ, Д-Е: ЩФ. После завершения моделирования хронической печеночной недостаточности (на 42-е сутки от начала затравки) во всех группах нами было выявлено повышение уровня цитолитических ферментов - гипертрансфераземия. Так, уровень АлАТ и АсАТ повышался в 3-4,5 раза, а ЩФ в 5 раз. Из представленных данных следует, что в контрольной и экспериментальных группах динамика биохимических показателей, характеризующих печеночную недостаточность, на этапе затравки была сходной. В дальнейшем эти показатели постепенно начинали снижаться во всех исследуемых группах, но темп снижения в разных группах был разным. Наиболее длительно гипертрансфераземия сохранялась в контрольной группе, где клеточный материал не применялся. Лечение хронической печеночной недостаточности с помощью КИК печени, содержащих КП и ММСК КМ, по способу-прототипу и по предлагаемому способу также сопровождалось цитолитическими процессами в паренхиматозных клетках печени. Однако эти показатели достигали нормальных значений уже к 30 суткам после имплантации КИК печени, тогда как в контроле нормализация показателей цитолитического синдрома наступала к 180 суткам исследования, а затем показатель АсАТ вновь повышался и не достигал нормальных значений вплоть до конца наблюдения. Динамика нормализации уровня АлАТ, АсАТ и ЩФ в сыворотке крови крыс при лечении по способу-прототипу и по предлагаемому способу достоверно различалась между собой на отдельных сроках наблюдения (более высокий темп нормализации показателей по предлагаемому способу), что свидетельствовало о более высокой степени активности клеток в составе КИК, изготовленных по предлагаемому способу. На фиг. 1 А, В, Д - срок наблюдения 28 суток; Б, Г, Е - срок наблюдения 365 суток; АлАТ для здоровых животных - до 40 ед./л; АсАТ для здоровых животных - до 60 ед./л; ЩФ для здоровых животных - до 350 ед./л. А, В, Д - срок наблюдения 28 суток; Б, Г, Е - срок наблюдения 365 суток.
* - Различие достоверно по сравнению с уровнем ферментов в контроле; p<0,05.
На фиг. 2 представлены гистологические препараты печени в зоне имплантации КИК (КЛ : ММСК КМ = 5:1) в паренхиму поврежденной печени на сроке 90 суток после моделирования хронической печеночной недостаточности.
Фиг. 2, А - КИК на основе децеллюляризированного матрикса печени с аллогенными КП и ММСК КМ (90 суток). Окраска по Массону. Увеличение микроскопа × 400. В - Жизнеспособные гепатоциты в структуре КИК. Иммуногистохимическое исследование с гепатоцитспецифическими антигенами (ОСН1ЕБ) - положительное гранулярное цитоплазматическое окрашивание. Увеличение микроскопа × 600.
На этом сроке аллогенные клетки печени, сокультивированные с аллогенными или аутологичными мезенхимальными стволовыми клетками костного мозга и имплантированные в виде КИК (ассоциаты клеток в составе тканеспецифического матрикса из децеллюляризированной печени), сохраняли свою жизнеспособность и функциональную активность в составе имплантированных КИК печени. Признаки отторжения отсутствовали.
Возможность имплантировать КИК печени с аллогенным клеточным материалом без иммуносупрессивной терапии доказана путем использования ММСК КМ, обладающих иммуномодулирующим (иммунокорригирующим) воздействием, способствующих развитию иммунной толерантности.
На фиг. 3 представлены гистологические препараты КИК печени, в состав которых входили аллогенные КП и ММСК в соотношении 5:1 без и с иммуносупрессией в организме (контроль, без иммуносупрессии с иммуносупрессией: Програф + преднизолон с иммуносупрессией: Циклоспорин А + преднизолон) на сроке 90 суток после моделирования хронической печеночной недостаточности. Исследования показали, что так же, как и при динамическом исследовании показателей уровня цитолиза во всех этих группах, на 90 сутки нами также не были выявлены отчетливые различия в структуре КИК в группах с использованием иммуносупрессирующей терапии и без нее. Достоверных отличий в гистологических срезах не выявлено.
Фиг. 3 - Гистологические препараты печени в зоне имплантации КИК в паренхиму поврежденной печени на сроке 90 суток после моделирования хронической печеночной недостаточности. Увеличение микроскопа ×400: А - КИК на основе децеллюляризированного матрикса печени с аллогенными КП и ММСК КМ. КИК снаружи окружена тонким слоем фиброзной ткани. Окраска по Массону; В - КИК на основе матрикса СфероГЕЛЬ с аллогенными КП и ММСК КМ КИК без иммуносупрессии. КИК снаружи окружена тонким слоем фиброзной ткани. Окраска гематоксилином и эозином. С - КИК на основе матрикса СфероГЕЛЬ с аллогенными КП и ММСК КМ с имуносупрессией Програф + преднизолон. Окраска гематоксилином и эозином. D - КИК на основе матрикса Сферогель с аллогенными КП и ММСК КМ с иммуносупрессией Циклоспорин А + преднизолон. Окраска гематоксилином и эозином.
Пролонгирование жизнеспособности клеток печени в составе КИК в присутствии ММСК КМ и отсутствие морфологических различий КИК между группой без иммуносупрессии и группами с иммуносупрессией позволяет предположить реализацию важной иммунорегуляторной (супрессирующей) роли ММСК КМ в составе КИК. Таким образом, использование мезенхимальных стромальных клеток костного мозга позволяет избегать или существенно снизить дозу иммуносупрессивной терапии.
На сроке 180 суток использовались КИК печени на основе тканеспецифического матрикса из децеллюляризированной печени в соотношении 5:1. На фиг. 4 представлены гистологические препараты печени в зоне трансплантации КИК в паренхиму поврежденной печени на сроке 180 сутки после моделирования ХПН: А - КИК на основе децеллюляризированного матрикса печени с аллогенными КП и ММСК КМ. Окраска по Массону. Увеличение микроскопа ×400. В - Жизнеспособные гепатоциты в структуре КИК. Иммуногистохимическое исследование с гепатоцитспецифическими антигенами (ОСН1ЕБ) - положительное гранулярное цитоплазматическое окрашивание. Увеличение микроскопа ×600.
Аналогичные результаты были получены на сроке 365 суток. На фиг. 5 представлены гистологические препараты печени в зоне трансплантации КИК в паренхиму поврежденной печени на сроке 365 суток после моделирования ХПН: А - Высокое содержание гликогена в пролифератах аллогенных гепатоцитов. PAS-реакция. Увеличение микроскопа ×400. В - Жизнеспособные гепатоциты в структуре КИК. Иммуногистохимическое исследование с гепатоцитспецифическими антигенами (ОСН1ЕБ) - положительное гранулярное цитоплазматическое окрашивание. Увеличение микроскопа ×400.
Сравнивая степень сохранения жизнеспособности и функциональной активности клеток в КИК на основе тканеспецифического матрикса из децеллюляризированной печени, а также отсутствие в ней отторжения, можно прийти к заключению, что КИК печени является оптимальной.
Во всех случаях был достигнут желаемый результат, а именно были получены данные, свидетельствующие о более эффективном лечении печеночной недостаточности. Способ позволяет улучшить результаты лечения печеночной недостаточности путем активизации двухсторонних взаимодействий между имплантированными КИК - готовыми гепатоподобными структурами (адгезированные клетки печени, МСК КМ на предварительно подготовленном матриксе из децеллюляризированной печени млекопитающих) и паренхимой поврежденной печени реципиента с ускоренной интеграцией их с поврежденной печенью.
Таким образом, приведенные данные четко свидетельствуют о том, что коррекция и лечение печеночной недостаточности происходят значительно быстрее и адекватнее при применении предлагаемого способа коррекции и лечения печеночной недостаточности. Кроме того, нами доказано длительное выживание клеток печени и появление вновь образованных сосудов и желчных протоков в имплантате спустя 90, 180 и 365 суток после имплантации животному КИК печени (предварительно подготовленный тканеспецифический децеллюляризированный матрикс печени млекопитающих с аллогенными клетками печени и аллогенными или аутологичными мезенхимальными стволовыми клетками костного мозга в виде ассоциатов).
Учитывая вышеизложенное, экстраполяция результатов проведенных экспериментов в клинику правомерна, предложенный метод, обеспечивая пролонгированную жезнедеятельность КИК печени, может быть использован для коррекции печеночной недостаточности.
Claims (4)
1. Способ лечения печеночной недостаточности, включающий имплантацию в паренхиму печени клеточно-инженерной конструкции (КИК), содержащей аллогенные клетки печени, аллогенные или аутологичные мезенхимальные стволовые клетки костного мозга, биополимерный гетерогенный коллагенсодержащий гидрогель с последующим назначением антикоагулянтов и антиагрегантов в профилактической дозе, отличающийся тем, что сначала в течение 8-12 часов при температуре 4°С инкубируют матрикс из децеллюляризированной донорской печени млекопитающего в физиологическом растворе, забуференном фосфатами, имеющем следующий состав: 138 мМ NaCl, 2,67 мМ KCl, 1,47 мМ KH2PO4, 8,1 мМ Na2HPO4, дистиллированная вода до 1 л и содержащем фибронектин и ламинин по 10 мкг/мл, с рН 7,4, при этом соотношение объемов матрикса и физиологического раствора составляет 1:1; затем на матриксе в течение 2-4 суток проводят сокультивирование свежевыделенных аллогенных клеток печени и предварительно культивированных аллогенных или аутологичных мезенхимальных стволовых клеток костного мозга при соотношении клеток костного мозга к клеткам печени - от 1:1 до 1:10, обеспечивая прикрепление клеток в количестве 2×106-15×106 на 1 см3 матрикса, при этом общий объем матрикса с прикрепленными клетками составляет не менее 0,05 см3; перед имплантацией получают КИК, смешивая матрикс с прикрепленными к нему клетками и биополимерный гетерогенный коллагенсодержащий гидрогель в объемном соотношении 3:1.
2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что матрикс получают из децеллюляризированной донорской печени человека.
3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что матрикс имеет размеры частиц от 200 до 700 мкм, размеры пор не более 50 мкм и суммарную пористость 70-85%.
4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве биополимерного гетерогенного коллагенсодержащего гидрогеля используют Сферогель.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2016108045A RU2618989C1 (ru) | 2016-03-09 | 2016-03-09 | Способ лечения печеночной недостаточности |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2016108045A RU2618989C1 (ru) | 2016-03-09 | 2016-03-09 | Способ лечения печеночной недостаточности |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2618989C1 true RU2618989C1 (ru) | 2017-05-11 |
Family
ID=58715774
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2016108045A RU2618989C1 (ru) | 2016-03-09 | 2016-03-09 | Способ лечения печеночной недостаточности |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2618989C1 (ru) |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2007059501A2 (en) * | 2005-11-16 | 2007-05-24 | University Of North Carolina At Chapel Hill | Extracellular matrix components for expansion or differentiation of hepatic progenitors |
| WO2010124837A2 (en) * | 2009-04-27 | 2010-11-04 | Cytonet Gmbh & Co. Kg | Encapsulated liver cell composition |
| RU2539918C1 (ru) * | 2013-11-29 | 2015-01-27 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Федеральный научный центр трансплантологии и искусственных органов имени академика В.И. Шумакова" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Способ получения тканеспецифического матрикса для тканевой инженерии паренхиматозного органа |
| RU2574364C2 (ru) * | 2010-05-07 | 2016-02-10 | Юниверсити Оф Норт Каролина Эт Чепел Хилл | Способ трансплантации клеток из плотных тканей |
-
2016
- 2016-03-09 RU RU2016108045A patent/RU2618989C1/ru active
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2007059501A2 (en) * | 2005-11-16 | 2007-05-24 | University Of North Carolina At Chapel Hill | Extracellular matrix components for expansion or differentiation of hepatic progenitors |
| WO2010124837A2 (en) * | 2009-04-27 | 2010-11-04 | Cytonet Gmbh & Co. Kg | Encapsulated liver cell composition |
| RU2574364C2 (ru) * | 2010-05-07 | 2016-02-10 | Юниверсити Оф Норт Каролина Эт Чепел Хилл | Способ трансплантации клеток из плотных тканей |
| RU2539918C1 (ru) * | 2013-11-29 | 2015-01-27 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Федеральный научный центр трансплантологии и искусственных органов имени академика В.И. Шумакова" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Способ получения тканеспецифического матрикса для тканевой инженерии паренхиматозного органа |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| LEE J.S. et al. Liver extracellular matrix providing dual functions of two-dimensional substrate coating and three-dimensional injectable hydrogel platform for liver tissue engineering// Biomacromolecules. 2014 Jan 13;15(1):206-18, реф.PubMed. * |
| ГУЛАЙ Ю.С.и др. Тканевая инженерия печени (современное состояние проблемы по данным зарубежных источников). Вестник трансплант. и искусств. органов, 2014, т.XVI, 2, с. 103-113. * |
| ГУЛАЙ Ю.С.и др. Тканевая инженерия печени (современное состояние проблемы по данным зарубежных источников). Вестник трансплант. и искусств. органов, 2014, т.XVI, 2, с. 103-113. LEE J.S. et al. Liver extracellular matrix providing dual functions of two-dimensional substrate coating and three-dimensional injectable hydrogel platform for liver tissue engineering// Biomacromolecules. 2014 Jan 13;15(1):206-18, реф.PubMed. * |
| ШАГИДУЛИН М.Ю. и др. Трансплантация клеточно-инженерных конструкций в печень обеспечивает длительную поддержку процессов восстановительной регенерации в поврежденной печени// Вестник трансплант. и искусств. органов, 2013, т.XV, 2, с.65. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP3808900B2 (ja) | 結合組織細胞に部分的又は完全に分化した骨髄幹細胞の有効培養物及びヒアルロン酸誘導体より成る三次元の生体親和性で且つ生分解性のマトリックスから構成される生物学的物質 | |
| EP2815773B1 (en) | Matrix and implant for tissue engineering | |
| US5695998A (en) | Submucosa as a growth substrate for islet cells | |
| KR100968164B1 (ko) | 지방 유래 간세포 및 격자 | |
| US9375514B2 (en) | Multicellular tissue and organ culture systems | |
| KR102282769B1 (ko) | 탈세포화된 기관 및 조직에 대한 마이크로입자 및 내피 세포의 용도 | |
| JPWO2011016423A1 (ja) | 膵島細胞シート、製造方法及びその利用方法 | |
| CN104312970A (zh) | 一种细胞治疗用临床治疗级表皮干细胞应用人类细胞外基质筛选及规模化培养制备方法 | |
| CN104263699A (zh) | 细胞移植用临床治疗级真皮多能干细胞规模化制备培养方法 | |
| EP0788381B1 (en) | Biomaterial containing epithelial cells and use thereof as a transplant | |
| US5980888A (en) | Keratinocytes attached to microcarriers for treatment of skin wounds | |
| KR20150014369A (ko) | 구슬형 연골세포 치료제의 제조방법 | |
| RU2539918C1 (ru) | Способ получения тканеспецифического матрикса для тканевой инженерии паренхиматозного органа | |
| RU2425645C1 (ru) | Способ и трансплантат для лечения печеночной недостаточности | |
| Parekh et al. | Reconstruction and regeneration of corneal endothelium: a review on current methods and future aspects | |
| WO2009080794A1 (en) | Method for preparing cell-specific extracellular matrices | |
| RU2586952C1 (ru) | Способ лечения печеночной недостаточности | |
| RU2272638C1 (ru) | Биотрансплантат, способ его получения и способ лечения хронического гепатита и цирроза печени (варианты) | |
| JP7105487B2 (ja) | 凍結移植体及び凍結移植体の製造方法 | |
| CN105238739A (zh) | 临床治疗级细胞治疗用黑色素细胞(melanocytes)规模化制备人类细胞外基质筛选培养方法 | |
| RU2618989C1 (ru) | Способ лечения печеночной недостаточности | |
| CN105963795A (zh) | 一种基于胶原制备组织工程表皮的方法 | |
| US20200197572A1 (en) | Three-dimensional (3d) tissue-like implant and preparation and application thereof | |
| CN105238740A (zh) | 组织工程皮肤种子表皮角质形成细胞高拟体内细胞外基质附着体外筛选培养方法 | |
| RU2425648C1 (ru) | Способ и трансплантат для лечения печеночной недостаточности |