RU2614697C1 - Neuroprotective agent - Google Patents
Neuroprotective agent Download PDFInfo
- Publication number
- RU2614697C1 RU2614697C1 RU2016114066A RU2016114066A RU2614697C1 RU 2614697 C1 RU2614697 C1 RU 2614697C1 RU 2016114066 A RU2016114066 A RU 2016114066A RU 2016114066 A RU2016114066 A RU 2016114066A RU 2614697 C1 RU2614697 C1 RU 2614697C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- glutamate
- lithium
- neurons
- ascorbate
- effect
- Prior art date
Links
- 239000004090 neuroprotective agent Substances 0.000 title claims description 4
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 claims abstract description 68
- 229930195712 glutamate Natural products 0.000 claims abstract description 64
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 claims abstract description 32
- 229910003002 lithium salt Inorganic materials 0.000 claims abstract description 13
- 159000000002 lithium salts Chemical class 0.000 claims abstract description 13
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 claims abstract description 12
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 claims abstract description 6
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 claims abstract description 6
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 claims abstract description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 12
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 abstract description 5
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 abstract description 5
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 abstract description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 4
- IHAQDFLGBNNAEH-RXSVEWSESA-M lithium (2R)-2-[(1S)-1,2-dihydroxyethyl]-4-hydroxy-5-oxo-2H-furan-3-olate Chemical compound O=C1C(O)=C([O-])[C@H](O1)[C@@H](O)CO.[Li+] IHAQDFLGBNNAEH-RXSVEWSESA-M 0.000 description 38
- 230000035882 stress Effects 0.000 description 20
- 230000000324 neuroprotective effect Effects 0.000 description 14
- 229910052744 lithium Inorganic materials 0.000 description 13
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 12
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 12
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 11
- WHXSMMKQMYFTQS-UHFFFAOYSA-N Lithium Chemical compound [Li] WHXSMMKQMYFTQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 10
- 210000001638 cerebellum Anatomy 0.000 description 8
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 8
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 8
- KWGKDLIKAYFUFQ-UHFFFAOYSA-M lithium chloride Chemical compound [Li+].[Cl-] KWGKDLIKAYFUFQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 8
- 238000000034 method Methods 0.000 description 8
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 8
- UUUICOMMFFTCHS-UHFFFAOYSA-N 5-hydroxy-4-oxopyran-2-carboxylic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC(=O)C(O)=CO1 UUUICOMMFFTCHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 6
- 230000009471 action Effects 0.000 description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 6
- 150000001450 anions Chemical class 0.000 description 6
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 6
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 6
- 238000005315 distribution function Methods 0.000 description 6
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 6
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 6
- 102000013498 tau Proteins Human genes 0.000 description 6
- 108010026424 tau Proteins Proteins 0.000 description 6
- GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J Trypan blue Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].C1=C(S([O-])(=O)=O)C=C2C=C(S([O-])(=O)=O)C(/N=N/C3=CC=C(C=C3C)C=3C=C(C(=CC=3)\N=N\C=3C(=CC4=CC(=CC(N)=C4C=3O)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)C)=C(O)C2=C1N GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J 0.000 description 5
- 230000002490 cerebral effect Effects 0.000 description 5
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 5
- 230000008569 process Effects 0.000 description 5
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Natural products CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000001276 Kolmogorov–Smirnov test Methods 0.000 description 4
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 4
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 4
- 230000004770 neurodegeneration Effects 0.000 description 4
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 4
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 4
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WMFOQBRAJBCJND-UHFFFAOYSA-M Lithium hydroxide Chemical compound [Li+].[OH-] WMFOQBRAJBCJND-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- 108090000189 Neuropeptides Proteins 0.000 description 3
- 238000000540 analysis of variance Methods 0.000 description 3
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 3
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 3
- 210000001320 hippocampus Anatomy 0.000 description 3
- 230000006951 hyperphosphorylation Effects 0.000 description 3
- -1 lithium cations Chemical class 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 3
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 3
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101000941893 Felis catus Leucine-rich repeat and calponin homology domain-containing protein 1 Proteins 0.000 description 2
- WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N Haematoxylin Chemical compound C12=CC(O)=C(O)C=C2CC2(O)C1C1=CC=C(O)C(O)=C1OC2 WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- HBBGRARXTFLTSG-UHFFFAOYSA-N Lithium ion Chemical compound [Li+] HBBGRARXTFLTSG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000029749 Microtubule Human genes 0.000 description 2
- 108091022875 Microtubule Proteins 0.000 description 2
- 101100075995 Schizosaccharomyces pombe (strain 972 / ATCC 24843) fma2 gene Proteins 0.000 description 2
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 2
- 229940009098 aspartate Drugs 0.000 description 2
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 2
- 229910001424 calcium ion Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 2
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 2
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 2
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 2
- 230000034994 death Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 2
- 230000009429 distress Effects 0.000 description 2
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 2
- 102000004963 gamma-Synuclein Human genes 0.000 description 2
- 108090001121 gamma-Synuclein Proteins 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 230000037417 hyperactivation Effects 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- XGZVUEUWXADBQD-UHFFFAOYSA-L lithium carbonate Chemical compound [Li+].[Li+].[O-]C([O-])=O XGZVUEUWXADBQD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 229910052808 lithium carbonate Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 210000004688 microtubule Anatomy 0.000 description 2
- 230000032405 negative regulation of neuron apoptotic process Effects 0.000 description 2
- 208000015122 neurodegenerative disease Diseases 0.000 description 2
- 230000000508 neurotrophic effect Effects 0.000 description 2
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 2
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 2
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 description 2
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 238000001953 recrystallisation Methods 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000003678 AMPA Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108090000078 AMPA Receptors Proteins 0.000 description 1
- 208000024827 Alzheimer disease Diseases 0.000 description 1
- 206010002091 Anaesthesia Diseases 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 201000002345 Brain compression Diseases 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N Calcium cation Chemical compound [Ca+2] BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 102000018899 Glutamate Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010027915 Glutamate Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000005720 Glutathione transferase Human genes 0.000 description 1
- 108010070675 Glutathione transferase Proteins 0.000 description 1
- 208000023329 Gun shot wound Diseases 0.000 description 1
- 208000010496 Heart Arrest Diseases 0.000 description 1
- 208000023105 Huntington disease Diseases 0.000 description 1
- 208000032382 Ischaemic stroke Diseases 0.000 description 1
- 108010044467 Isoenzymes Proteins 0.000 description 1
- JLVVSXFLKOJNIY-UHFFFAOYSA-N Magnesium ion Chemical compound [Mg+2] JLVVSXFLKOJNIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004868 N-Methyl-D-Aspartate Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108090001041 N-Methyl-D-Aspartate Receptors Proteins 0.000 description 1
- HOKKHZGPKSLGJE-GSVOUGTGSA-N N-Methyl-D-aspartic acid Chemical compound CN[C@@H](C(O)=O)CC(O)=O HOKKHZGPKSLGJE-GSVOUGTGSA-N 0.000 description 1
- 206010061323 Optic neuropathy Diseases 0.000 description 1
- 208000018737 Parkinson disease Diseases 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000015439 Phospholipases Human genes 0.000 description 1
- 108010064785 Phospholipases Proteins 0.000 description 1
- 229920002873 Polyethylenimine Polymers 0.000 description 1
- 108010039918 Polylysine Proteins 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 208000006011 Stroke Diseases 0.000 description 1
- 208000030886 Traumatic Brain injury Diseases 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 230000002730 additional effect Effects 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 206010002026 amyotrophic lateral sclerosis Diseases 0.000 description 1
- 230000037005 anaesthesia Effects 0.000 description 1
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 230000003078 antioxidant effect Effects 0.000 description 1
- 235000006708 antioxidants Nutrition 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 230000036983 biotransformation Effects 0.000 description 1
- 230000036770 blood supply Effects 0.000 description 1
- 230000006931 brain damage Effects 0.000 description 1
- 231100000874 brain damage Toxicity 0.000 description 1
- 208000029028 brain injury Diseases 0.000 description 1
- 210000005013 brain tissue Anatomy 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 230000003293 cardioprotective effect Effects 0.000 description 1
- 210000005056 cell body Anatomy 0.000 description 1
- 230000005779 cell damage Effects 0.000 description 1
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 1
- 208000037887 cell injury Diseases 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 230000037326 chronic stress Effects 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 description 1
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000007850 degeneration Effects 0.000 description 1
- 239000007857 degradation product Substances 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- PJNSMUBMSNAEEN-AWEZNQCLSA-N ethyl 2-[[(2s)-1-(2-phenylacetyl)pyrrolidine-2-carbonyl]amino]acetate Chemical compound CCOC(=O)CNC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)CC1=CC=CC=C1 PJNSMUBMSNAEEN-AWEZNQCLSA-N 0.000 description 1
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 108010016473 ethyl phenylacetyl-Pro-Gly Proteins 0.000 description 1
- 239000003257 excitatory amino acid Substances 0.000 description 1
- 230000002461 excitatory amino acid Effects 0.000 description 1
- 231100000318 excitotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003492 excitotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 239000004060 excitotoxin Substances 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-M hydroxide Chemical compound [OH-] XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 1
- 230000002055 immunohistochemical effect Effects 0.000 description 1
- 238000003364 immunohistochemistry Methods 0.000 description 1
- 230000003308 immunostimulating effect Effects 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 1
- 208000028867 ischemia Diseases 0.000 description 1
- 230000000302 ischemic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000636 lethal dose Toxicity 0.000 description 1
- 229940006487 lithium cation Drugs 0.000 description 1
- 150000002642 lithium compounds Chemical class 0.000 description 1
- 229910001416 lithium ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910001425 magnesium ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 150000007522 mineralic acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000004050 mood stabilizer Substances 0.000 description 1
- 229940127237 mood stabilizer Drugs 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 201000006417 multiple sclerosis Diseases 0.000 description 1
- 230000001607 nephroprotective effect Effects 0.000 description 1
- 210000005036 nerve Anatomy 0.000 description 1
- 230000001722 neurochemical effect Effects 0.000 description 1
- 230000003634 neurocytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 210000004498 neuroglial cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000000926 neurological effect Effects 0.000 description 1
- 230000001067 neuroprotector Effects 0.000 description 1
- 210000000440 neutrophil Anatomy 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 208000020911 optic nerve disease Diseases 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 210000001428 peripheral nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 230000003285 pharmacodynamic effect Effects 0.000 description 1
- 229920000656 polylysine Polymers 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 230000002488 pyknotic effect Effects 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 230000010410 reperfusion Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000816 toxic dose Toxicity 0.000 description 1
- 230000009529 traumatic brain injury Effects 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к области фармакологии и может быть использовано для профилактики и лечения, заболеваний, связанных с возникновением глутаматного стресса.The invention relates to the field of pharmacology and can be used for the prevention and treatment of diseases associated with the occurrence of glutamate stress.
Глутаматный стресс не является аналогом психологического и дезадаптационного понятия «стресс-дистресс», сформулированного Г.Селье. (Селье Г. Стресс без дистресса, М.: Прогресс, 1979, 123 с. Глутаматный стресс - это универсальный ответ клеток центральной и периферической нервной системы на воздействие избыточных (нефизиологических) концентраций возбуждающих аминокислот - глутамата и аспартата - вследствие ишемического (нарушение адекватного кровоснабжения участка мозга, очаг инсульта), генетически обусловленного иммунонейротоксического повреждения (рассеянный склероз, болезнь Гентингтона, болезнь Паркинсона, боковой амиотрофический склероз, болезнь Альцгеймера, глаукомная оптиконейропатия), температурного, физическое (ушибленная, резаная, рваная, огнестрельная рана, разрыв, сдавление тканей мозга и т.д.). Глутаматный стресс способствует ускорению гибели нейронов и является одним из факторов риска нейродегенерации, снижает выживаемость клеток в неблагоприятных условиях, увеличивает зону повреждения мозга, препятствует процессам регенерации мозга. Глутаматный стресс приводит к развитию каскада эксайтотоксичного повреждения ведущего к гибели нервных клеток. Под действием высоких концентраций глутамата отмечается гиперактивация NMDA- и АМРА-рецепторов на поверхности поврежденных клеток, затем в клетку поступает избыточное количество ионов кальция, что активирует ряд ферментов (протеазы, эндонуклеазы и фосфолипазы), цитозольные структуры клетки рушатся, и, как следствие, клетка запускает процесс самоуничтожения (апоптоз). Глутамат - основной эксайтотоксин проявляющий отчетливую дозозависимость: чем выше концентрация глутамата, тем больше очаг и тяжелее (в т.ч. необратимо) повреждаются нейроны.Glutamate stress is not an analogue of the psychological and maladaptive concept of “stress distress” formulated by G. Selye. (Selye G. Stress without distress, M .: Progress, 1979, 123 pp. Glutamate stress is the universal response of central and peripheral nervous system cells to the effects of excessive (non-physiological) concentrations of excitatory amino acids - glutamate and aspartate - due to ischemic (impaired adequate blood supply brain region, stroke focus), genetically determined immunoneurotoxic damage (multiple sclerosis, Huntington’s disease, Parkinson’s disease, amyotrophic lateral sclerosis, Alzheimer's disease, glauco optic neuropathy), temperature, physical (bruised, cut, lacerated, gunshot wound, rupture, compression of brain tissue, etc.) Glutamate stress helps accelerate the death of neurons and is one of the risk factors for neurodegeneration, reduces cell survival in adverse conditions, increases the area of brain damage, interferes with brain regeneration processes .. Glutamate stress leads to the development of a cascade of excitotoxic damage leading to the death of nerve cells. Under the influence of high concentrations of glutamate, hyperactivation of NMDA and AMPA receptors is observed on the surface of damaged cells, then an excess amount of calcium ions enters the cell, which activates a number of enzymes (proteases, endonucleases and phospholipases), the cytosolic structures of the cell collapse, and, as a result, the cell starts the process of self-destruction (apoptosis). Glutamate is the main excitotoxin with a clear dose dependence: the higher the concentration of glutamate, the larger the focus and the harder (including irreversibly) damaged neurons.
Известно применение литиевых солей в составе препаратов для лечения нейродегенеративных заболеваний, где оно используется в качестве вспомогательного компонента (US 20070298129, US 20070049565, US 20050233010).It is known the use of lithium salts in the composition of drugs for the treatment of neurodegenerative diseases, where it is used as an auxiliary component (US 20070298129, US 20070049565, US 20050233010).
Известно, что хлорид лития оказывает нейропротекторное действие при глутаматной токсичности нейронов мозжечка (Shao L., Cui J., Young L.T. and Wang J.F., The effect of Mood stabilizer lithium on expression and activity of glutathione-S-transferase isoenzymes, Neuroscience. 2008. v. 151(2), p.518-524).Lithium chloride is known to have a neuroprotective effect on glutamate toxicity of cerebellar neurons (Shao L., Cui J., Young LT and Wang JF, The effect of Mood stabilizer lithium on expression and activity of glutathione-S-transferase isoenzymes, Neuroscience. 2008. v. 151 (2), p. 518-524).
Известно наличие у катионов лития кардио- и нефропротекторных свойств. Изучается терапевтические механизмы действия солей лития при состояниях, связанных остановкой кровообращения, что открывает возможность использования солей лития в анестезиологии и реаниматологии (В.В. Мороз и др. Механизмы повреждения и защиты клетки при ишемии/реперфузии и экспериментальное обоснование применения препаратов на основе лития в анестезиологии, Обзор, Общая реаниматологии, 2013, IX. 1 стр. 63-72).The presence of lithium cations cardio and nephroprotective properties. The therapeutic mechanisms of the action of lithium salts in conditions associated with circulatory arrest are studied, which opens up the possibility of using lithium salts in anesthesiology and resuscitation (V.V. Moroz et al. Cell damage and protection mechanisms for ischemia / reperfusion and experimental justification for the use of lithium-based drugs in Anesthesiology, Review, General Reanimatology, 2013, IX. 1 pp. 63-72).
Известно существование нейропротективного и нейротрофического синергизма между катионами лития и нейропептидами церебролизина. Экспериментально подтверждено, что нейропептиды церебролизина потенцируют таргетную доставку ионов лития в мозг и усвоение их нейронами (О.А. Громова и др. Фармакокинетический и фармакодинамический синергизм между нейропептидами и литием в реализации нейротрофического и нейропротективного действия церебролизина. Неврология и психиатрия №3, 2015).The existence of neuroprotective and neurotrophic synergies between lithium cations and neuropeptides of cerebrolysin is known. It has been experimentally confirmed that the neuropeptides of cerebrolysin potentiate the targeted delivery of lithium ions to the brain and their uptake by neurons (OA Gromova et al. Pharmacokinetic and pharmacodynamic synergies between neuropeptides and lithium in the implementation of the neurotrophic and neuroprotective effects of cerebrolysin. Neurology and Psychiatry 2015, No. 3, 2015) 3. .
Однако в известных публикациях не прослеживается влияния аниона, с которым связан катион лития, на нейропротекторные свойства солей.However, the well-known publications do not trace the influence of the anion with which the lithium cation is associated on the neuroprotective properties of salts.
Наиболее близким по технической сущности и достигаемому результату к предложенному изобретению является техническое решение, в котором предложено в качестве нейропротекторного средства и средства защиты от глутаматного стресса нейронов использовать литиевую соль коменовой кислоты. Приведены сведения о влиянии литиевой соли коменовой кислоты на глутаматную цитотоксичность в культуре зернистых клеток мозжечка крысят. При этом действие комената лития на глутаматную цитотоксичность в культуре нейронов мозжечка крысят оценивалось по сравнению с действиями коменовой кислотой и хлорида лития по отдельности. Авторы указывают на больший эффект при применении комената лития по сравнению с коменовой кислотой и хлоридом лития (RU 247722, 2013).The closest in technical essence and the achieved result to the proposed invention is a technical solution in which it is proposed to use lithium salt of comenic acid as a neuroprotective agent and means of protection against glutamate stress of neurons. Information is presented on the effect of lithium salt of comenic acid on glutamate cytotoxicity in the culture of granular cells of the cerebellum of rat pups. In this case, the effect of coment lithium on glutamate cytotoxicity in the culture of neurons of the cerebellum of rat pups was evaluated in comparison with the actions of comenic acid and lithium chloride separately. The authors indicate a greater effect with the use of coment lithium compared with comenic acid and lithium chloride (RU 247722, 2013).
Недостатком известного средства является то, что анион коменовой кислоты не является эндогенной молекулой метаболома организма человека. В силу этого анион коменовой кислоты нуждается в биотрансформации и выведении продуктов деградации используемого средства из организма.A disadvantage of the known agent is that the anion of comenic acid is not an endogenous molecule of the metabolome of the human body. Due to this, the anion of comenic acid needs biotransformation and removal of degradation products of the used agent from the body.
Кроме того, увеличение в последние годы числа больных разнообразной неврологической патологией (например, цереброваскулярная патология, ишемический инсульт, черепно-мозговая травма, нейродегенеративные заболевания), при которой отмечается повышение выброса глутамата и аспартата нейронами, требует расширения арсенала доступных средств, обладающих выраженными свойствами для защиты нейронов от повышенного уровня глутамата (т.н. глутаматного стресса нейронов).In addition, an increase in the number of patients with various neurological pathologies in recent years (for example, cerebrovascular pathology, ischemic stroke, traumatic brain injury, neurodegenerative diseases), in which there is an increase in the release of glutamate and aspartate by neurons, requires an expansion of the arsenal of available drugs with pronounced properties for protecting neurons from elevated levels of glutamate (the so-called glutamate stress of neurons).
Задачей настоящего изобретения является создание доступного нейропротекторного средства, обладающего повышенной степенью защиты нейронов от глутаматного стресса при пониженной токсичности.The objective of the present invention is to provide an affordable neuroprotective agent with an increased degree of protection of neurons from glutamate stress with reduced toxicity.
Поставленная задача решается описываемым средством защиты нейронов от глутаматного стресса, в качестве которого используют литиевую соль аскорбиновой кислоты.The problem is solved by the described means of protecting neurons from glutamate stress, which is used as a lithium salt of ascorbic acid.
Сведения об использовании литиевой соли аскорбиновой кислоты (аскорбата лития) для защиты нейронов от глутаматного стресса не обнаружены авторами в известном уровне техники.Information on the use of the lithium salt of ascorbic acid (lithium ascorbate) to protect neurons from glutamate stress was not found by the authors in the prior art.
Ранее было предложено использовать аскорбат лития в следующих областях медицины. Известно использование аскорбата лития в качестве в качестве гемапротекторного средства (RU 2351326, 2009), в качестве средства, повышающего активность нейтрофилов (RU 2226391. 2004). Аскорбат лития рекомендован также для использования в составе средств, обладающих антибактериальной, антиоксидантной, и иммуностимулирующей активностью (RU 2535140, 2014, RU 2372081, 2009, RU 2444358, 2012).It was previously proposed to use lithium ascorbate in the following areas of medicine. It is known to use lithium ascorbate as a hemaprotective agent (RU 2351326, 2009), as a means of increasing the activity of neutrophils (RU 2226391. 2004). Lithium ascorbate is also recommended for use as part of agents with antibacterial, antioxidant, and immunostimulating activity (RU 2535140, 2014, RU 2372081, 2009, RU 2444358, 2012).
Использованная авторами литиевая соль аскорбиновой кислоты получена следующим образом.The lithium salt of ascorbic acid used by the authors was obtained as follows.
Готовят суспензию аскорбиновой кислоты в дистиллированной воде. При нагревании и постоянном перемешивании в суспензию порционно вводят карбонат лития, или гидроксид лития, либо оба упомянутых соединения лития. Производят нагревание суспензии до полного растворения компонентов реакционной смеси, осуществляют кристаллизацию осадка, промывку и сушку. Высушенные кристаллы соли подвергают двойной перекристаллизации в растворе этилового или изопропилового спирта при охлаждении, последующей промывке спиртом и сушке. В результате был получен высокочистый аскорбат лития с выходом до 95%. Использование в процессе получения аскорбата лития метода двойной перекристаллизации соли в указанных спиртовых растворах позволило получить продукт, не содержащий посторонних анионов в виде гидроксида или карбоната, что способствует получению дополнительного эффекта, касающегося пониженной токсичности получаемого средства. Высокий выход целевого продукта позволяет масштабировать технологию получения соли до промышленного производства.A suspension of ascorbic acid in distilled water is prepared. With heating and constant stirring, lithium carbonate, or lithium hydroxide, or both of the above lithium compounds are portioned into the suspension. The suspension is heated to completely dissolve the components of the reaction mixture, crystallization of the precipitate, washing and drying are carried out. The dried salt crystals are subjected to double recrystallization in a solution of ethyl or isopropyl alcohol under cooling, followed by washing with alcohol and drying. As a result, high-purity lithium ascorbate was obtained with a yield of up to 95%. The use of the double recrystallization method of salt in the indicated alcohol solutions in the process of obtaining lithium ascorbate made it possible to obtain a product that does not contain extraneous anions in the form of hydroxide or carbonate, which contributes to an additional effect regarding the reduced toxicity of the obtained agent. The high yield of the target product allows you to scale the technology of salt production to industrial production.
Ниже в виде примеров представлены результаты экспериментов in vivo, подтверждающие наличие высоких адаптогенных свойств у аскорбата лития, а также результаты воздействия аскорбата лития на выживаемость нейронов in vitro в условиях глутаматного стресса.The results of in vivo experiments are presented below as examples, confirming the presence of high adaptogenic properties in lithium ascorbate, as well as the results of the effect of lithium ascorbate on the survival of neurons in vitro under conditions of glutamate stress.
В дальнейшем изобретение поясняется конкретными примерами и проиллюстрировано на фигурах, на которых представлены:The invention is further illustrated by specific examples and illustrated in the figures, which represent:
На фиг. 1 - Фиксированная культура клеток мозжечка, окрашенная трипановым синим.In FIG. 1 - Fixed cerebellum cell culture stained with trypan blue.
На фиг. 2 - Дозозависимый глутамат защитный эффект аскорбата лития.In FIG. 2 - Dose-dependent glutamate protective effect of lithium ascorbate.
На фиг. 3 - Эмпирические функции распределения чисел выживших КЗН при различных концентрациях аскорбата лития (мМ).In FIG. 3 - Empirical distribution functions of the number of survivors of SCW at various concentrations of lithium ascorbate (mm).
На фиг. 4 - Нейропротекторный эффект аскорбата лития при цитотоксическом действии глутамата (100 мМ) на КЗН.In FIG. 4 - Neuroprotective effect of lithium ascorbate during the cytotoxic effect of glutamate (100 mM) on SCN.
На фиг. 5 - Нейропротекторный эффект аскорбата лития при цитотоксическом воздействии глутамата.In FIG. 5 - Neuroprotective effect of lithium ascorbate during the cytotoxic effect of glutamate.
На фиг.6 - Нейропротекторный эффект аскорбата лития, введенного в культуру за 3 часа до цитотоксического воздействия глутамата.Figure 6 - Neuroprotective effect of lithium ascorbate introduced into the culture 3 hours before the cytotoxic effect of glutamate.
На фиг. 7 - Число выживших нейронов, подсчитанное на окрашенных препаратах.In FIG. 7 - The number of surviving neurons, calculated on stained preparations.
На фиг. 8 - Гиперфосфорилирование тау-белка в гиппокампе крыс в условиях хронического стресса по сравнению с контролем.In FIG. 8 - Hyperphosphorylation of tau protein in the hippocampus of rats under chronic stress compared with control.
Пример 1.Example 1
В эксперименте использованы 7-8-суточные культуры зернистых нейронов мозжечка, полученные методом ферментно-механической диссоциации клеток мозжечка 7-дневных крыс по методике [Andreeva N.A., Stel'mashuk E.V., Isaev N.K., Ostrovskaya R.U., Gudasheva Т.A., Viktorov I.V. Neiroprotektornye effekty nootropnogo dipeptida GVS-111 pri kislorodno-glyukoznoi deprivatsii, glutamatnoi toksichnosti i oksidativnom stresse in vitro. // Byull. eksperim. biol. med. 2000. т.130. №10. с. 418-421.]. Крыс подвергали летальной дозе эфирного наркоза, после чего 5 минут стерилизовали 70% спиртом, извлекали мозжечок и переносили его в пластиковую чашку Петри с фосфатным буфером, лишенным ионов кальция и магния. Фрагменты ткани инкубировали 15 мин при 37°С в фосфатном буфере, содержащем 0,05% трипсина, 0,2% ЭДТА и 0,8% глюкозы. После инкубации ткань промывали в двух сменах фосфатного буфера и один раз в питательной среде культивирования, в которой затем подвергали механической диссоциации. В состав среды входило 90% минимальной среды «Игла», 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 2 мМ глутамина, 5 мМ КС1 и 10 мМ буфера Hepes, рН 7,2-7,4.The experiment used 7-8-day-old cultures of granular cerebellar neurons obtained by enzyme-mechanical dissociation of cerebellar cells of 7-day-old rats according to the method [Andreeva N.A., Stel'mashuk E.V., Isaev N.K., Ostrovskaya R.U., Gudasheva T.A., Viktorov I.V. Neiroprotektornye effekty nootropnogo dipeptida GVS-111 pri kislorodno-glyukoznoi deprivatsii, glutamatnoi toksichnosti i oksidativnom stresse in vitro. // Byull. eksperim. biol. med. 2000.V. 130. No. 10. from. 418-421.]. The rats were subjected to a lethal dose of ether anesthesia, after which they were sterilized with 70% alcohol for 5 minutes, the cerebellum was removed and transferred to a plastic Petri dish with a phosphate buffer devoid of calcium and magnesium ions. Tissue fragments were incubated for 15 min at 37 ° C in phosphate buffer containing 0.05% trypsin, 0.2% EDTA and 0.8% glucose. After incubation, the tissue was washed in two shifts of phosphate buffer and once in a culture medium, in which it was then subjected to mechanical dissociation. The composition of the medium included 90% of the minimal Igla medium, 10% fetal calf serum, 2 mM glutamine, 5 mM KCl and 10 mM Hepes buffer, pH 7.2-7.4.
Суспензию клеток центрифугировали 1 мин при 1000 об/мин, супернатант удаляли, а осадок ресуспендировали в питательной среде. Культивирование производили в 96-луночных пластиковых планшетах, покрытых полиэтиленимином или полилизином, в питательной среде, где уровень хлорида калия был доведен до 25 мМ. В каждую ячейку планшета добавляли по 0,1 мл суспензии клеток.The cell suspension was centrifuged for 1 min at 1000 rpm, the supernatant was removed, and the pellet was resuspended in a nutrient medium. Cultivation was carried out in 96-well plastic plates coated with polyethyleneimine or polylysine in a nutrient medium, where the level of potassium chloride was brought to 25 mm. 0.1 ml of cell suspension was added to each cell of the plate.
Культивирование производили 7-8 суток в СO2-инкубаторе, заполненном газовой смесью (95% воздуха +5% СO2), при температуре 35,5°С и относительной влажности 98%. К этому сроку культивированные зернистые нейроны (КЗН) достигают своей морфологической и нейрохимической зрелости. Состояние культур контролировали ежедневно и на каждом этапе эксперимента путем визуального просмотра в инвертированном микроскопе при фазовом контрасте.Cultivation was performed for 7-8 days in a CO 2 incubator filled with a gas mixture (95% air + 5% CO 2 ), at a temperature of 35.5 ° C and a relative humidity of 98%. By this time, cultured granular neurons (CZN) reach their morphological and neurochemical maturity. The condition of the cultures was monitored daily and at each stage of the experiment by visual viewing in an inverted microscope with phase contrast.
Раствор аскорбата лития готовили из свежеприготовленного сухого вещества, полученного способом, описанным выше, непосредственно перед внесением в среду культивирования. Препарат взвешивали, растворяли в PBS, раствор стерилизовали фильтрацией и добавляли в питательную среду на вторые сутки in vitro на весь срок культивирования (до 7 суток). Исходя из исходной концентрации вещества (10 мМ) его минимально возможное разведение для добавления к культурам, при условии сохранения необходимых свойств питательной среды, составляло 1:10, т.е. 1 мМ. 96-луночные пластиковые планшеты позволяли тестировать сразу 4 различные концентрации образцов. Были выбраны следующие концентрации: 0,1, 0,2, 0,5 и1,0 мМ.A lithium ascorbate solution was prepared from a freshly prepared dry substance obtained by the method described above, immediately before being introduced into the culture medium. The drug was weighed, dissolved in PBS, the solution was sterilized by filtration and added to the nutrient medium on the second day in vitro for the entire cultivation period (up to 7 days). Based on the initial concentration of the substance (10 mM), its minimum possible dilution for addition to the cultures, provided that the necessary properties of the nutrient medium were preserved, was 1:10, i.e. 1 mM. 96-well plastic plates allowed 4 different concentrations of samples to be tested immediately. The following concentrations were selected: 0.1, 0.2, 0.5, and 1.0 mM.
Зернистые нейроны мозжечка легко идентифицировались в культурах прижизненно как небольшие, 7-10 мкм в диаметре, округлые или овальные клетки. Количественную оценку выживаемости производили с помощью прямого подсчета КЗН с нормальной морфологией на фиксированных препаратах, окрашенных трипановым синим. На этих препаратах хорошо видны ядра нейронов, занимающие большую часть тела клетки и окруженные тонким ободком цитоплазмы (см. фиг. 1).Grain cerebellar neurons were easily identified in cultures as small, 7-10 microns in diameter, round or oval cells in cultures. Survival was quantified using direct scoring of CZN with normal morphology on fixed trypan blue stained preparations. On these preparations, the nuclei of neurons are clearly visible, occupying a large part of the cell body and surrounded by a thin rim of the cytoplasm (see Fig. 1).
На фиг. 1 представлена фиксированная культура клеток мозжечка, окрашенная трипановым синим. А - контроль, Б - обработка 24 часа глутаматом. Зеленые стрелки указывают на КЗН с нормальной морфологией, желтые - на ядра глиальных клеток, красные - на пикнотические ядра погибших КЗН. Масштаб 15 мкм.In FIG. 1 shows a fixed cerebellar cell culture stained with trypan blue. A - control, B - 24 hours treatment with glutamate. Green arrows indicate CZN with normal morphology, yellow - glial cell nuclei, red - pyknotic nuclei of dead CZN.
На каждую точку брали по 3 культуры, в каждой из которых фотографировали и просчитывали последовательно по 5 полей зрения (как минимум 45 полей из 9 культур в 3 независимых экспериментов). Количество нейронов с неизмененной морфологией в контрольных культурах принимали за 100% выживаемости. Для статистического анализа использовали тест ANOVA с поправками Бонферрони/Даннетта и непараметрический тест Колмогорова-Смирнова, который отличается высокой чувствительностью и применим к анализу выборок чисел вне зависимости от выполнимости условия нормальности распределения. Различия между группами считали достоверными при р<0,05. Результаты выражали как среднее±стандартное отклонение.For each point, 3 cultures were taken, in each of which 5 fields of view were photographed and calculated successively (at least 45 fields from 9 cultures in 3 independent experiments). The number of neurons with unchanged morphology in control cultures was taken as 100% survival. For statistical analysis, we used the ANOVA test with Bonferroni / Dannett corrections and the non-parametric Kolmogorov-Smirnov test, which is highly sensitive and is applicable to the analysis of samples of numbers regardless of the fulfillment of the normality distribution condition. Differences between groups were considered significant at p <0.05. The results were expressed as mean ± standard deviation.
Глутамат (Sigma, USA, N.G-1626) при добавлении к культурам оказывал дозозависимый токсический эффект (см. фиг. 2).Glutamate (Sigma, USA, N.G-1626), when added to cultures, had a dose-dependent toxic effect (see FIG. 2).
На фиг. 2 показано влияние глутамата (Glu) на выживаемость культур (подсчет морфологически не измененных нейронов на фиксированных препаратах, окрашенных трипановым синим).In FIG. Figure 2 shows the effect of glutamate (Glu) on crop survival (counting morphologically unchanged neurons on fixed preparations stained with trypan blue).
Выбор концентрации (из трех использованных) проводили в каждом опыте таким образом, чтобы выживаемость КЗН составляла 30-80% от контроля. Именно такая выживаемость позволяет выявить действие различных веществ на процесс гибели клеток. При выживаемости менее 30 или более 80% нейропротекторные эффекты могут не обнаружиться. В исследованиях использовали подсчет клеток при действии предполагаемых нейропротекторов, добавляя в питательную среду подобранные токсические концентрации глутамата (100-500 мкМ).The choice of concentration (out of the three used) was carried out in each experiment in such a way that the survival rate of CZN was 30-80% of the control. It is this survival rate that makes it possible to identify the effect of various substances on the process of cell death. With a survival rate of less than 30 or more than 80%, neuroprotective effects may not be detected. The studies used cell counting under the action of putative neuroprotectors, adding selected toxic concentrations of glutamate (100-500 μM) to the nutrient medium.
Дозозависимый глутамат защитный эффект аскорбата литияDose-dependent glutamate protective effect of lithium ascorbate
Как показал анализ эмпирических функций распределения средних чисел с использованием теста Колмогорова-Смирнова, в культуре клеток мозжечка аскорбат лития (без добавления глутамата) в диапазоне концентраций от 0,1 до 1,0 мМ нетоксичен для КЗН (см. фиг. 3).As shown by the analysis of the empirical distribution functions of the averages using the Kolmogorov-Smirnov test, lithium ascorbate (without the addition of glutamate) in the cerebellum cell culture in a concentration range from 0.1 to 1.0 mM is non-toxic to CZN (see Fig. 3).
На фигуре 3 представлены эмпирические функции распределения чисел выживших КЗН при различных концентрациях концентраций от 0,1 до 1,0 мМ аскорбата лития (мМ). В культуре клеток мозжечка аскорбат лития (без добавления глутамата) нетоксичен для КЗН.The figure 3 presents the empirical distribution function of the number of survivors of SCW at various concentrations of concentrations from 0.1 to 1.0 mm lithium ascorbate (mm). In a cerebellum cell culture, lithium ascorbate (without glutamate addition) is not toxic to CZN.
Тест Колмогорова-СмирноваKolmogorov-Smirnov test
В культуре клеток мозжечка аскорбат лития (без добавления глутамата) в диапазоне концентраций от 0,1 до 1,0 мМ нетоксичен для КЗН.In a cerebellum cell culture, lithium ascorbate (without the addition of glutamate) in a concentration range from 0.1 to 1.0 mM is not toxic to CZN.
С помощью фигур 4-6 проиллюстрировано решение поставленной задачи с достижением заявленного технического результатаUsing figures 4-6 illustrated the solution to the problem with the achievement of the claimed technical result
На фигуре 4 показан нейропротекторный эффект аскорбата лития при цитотоксическом действии глутамата (100 мМ) на КЗН. Эмпирические функции распределения чисел (тест Колмогорова-Смирнова) выживших КЗН при действии глутамата в отсутствие (Glu) и в присутствии (Glu+) аскорбата лития в диапазоне концентраций от 0,1 до 1,0 мМ. Показаны достоверные отличия для всех использованных концентраций аскорбата лития по сравнению с действием глутамата без добавления препарата. Указаны значения максимального отклонения «D», на основе которого рассчитывается статистическая достоверность отличий между функциями распределения.The figure 4 shows the neuroprotective effect of lithium ascorbate with the cytotoxic effect of glutamate (100 mm) on CZN. Empirical distribution functions of numbers (Kolmogorov-Smirnov test) of surviving SCN under the action of glutamate in the absence (Glu) and in the presence of (Glu +) lithium ascorbate in the concentration range from 0.1 to 1.0 mM. Significant differences are shown for all used concentrations of lithium ascorbate compared with the action of glutamate without the addition of the drug. The values of the maximum deviation “D” are indicated, on the basis of which the statistical significance of the differences between the distribution functions is calculated.
На фигуре 5 показан нейропротекторный эффект аскорбата лития при цитотоксическом воздействии глутамата. Белые столбики - аскорбат лития (0,1-1,0 мМ) в отсутствие глутамата, черные - в тех же концентрациях в присутствии 100 мкМ глутамата (Glu). К - контроль. Для каждого столбика просчитано по 30 полей зрения. * - р<0,01 по сравнению с глутаматом без добавления препарата.The figure 5 shows the neuroprotective effect of lithium ascorbate during the cytotoxic effect of glutamate. White bars are lithium ascorbate (0.1-1.0 mM) in the absence of glutamate, black bars at the same concentrations in the presence of 100 μM glutamate (Glu). To - control. For each column, 30 fields of view were calculated. * - p <0.01 compared with glutamate without the addition of the drug.
Анализ полученных данных с использованием теста ANOVA показал, что выживаемость нейронов при цитотоксическом действии глутамата в присутствии аскорбата лития в диапазоне концентраций от 0,1 до 1 мМ начиная с концентрации 0,2 мМ достоверно повышалась в среднем на 12%, причем наблюдался дозозависимый эффект (см. фиг. 5).An analysis of the data using the ANOVA test showed that the survival of neurons during the cytotoxic effect of glutamate in the presence of lithium ascorbate in the concentration range from 0.1 to 1 mM, starting from a concentration of 0.2 mM, significantly increased on average by 12%, and a dose-dependent effect was observed ( see Fig. 5).
Исследованы нейропротекторные свойства аскорбата лития при его добавлении в культуры всего за 3 часа до воздействия глутамата. В соответствии с результатами теста ANOVA обнаружен защитный эффект, хотя и менее выраженный, при котором выживаемость нейронов достоверно повышалась на 8% при концентрации препарата 0,5 мМ (фиг. 6).The neuroprotective properties of lithium ascorbate were studied when it was added to cultures just 3 hours before exposure to glutamate. In accordance with the results of the ANOVA test, a protective effect was found, although less pronounced, in which neuron survival was significantly increased by 8% at a drug concentration of 0.5 mM (Fig. 6).
На фигуре 6 продемонстрирован нейропротекторный эффект аскорбата лития, введенного в культуру за 3 часа до цитотоксического воздействия глутамата. Белые столбики - аскорбат лития (0,1-1,0 мМ) в отсутствие глутамата, черные - в тех же концентрациях в присутствии 100 мкМ глутамата (Glu). К - контроль. Для каждого столбика просчитано по 15 полей зрения. * - р<0,01 по сравнению с глутаматом без добавления препарата.Figure 6 shows the neuroprotective effect of lithium ascorbate introduced into the culture 3 hours before the cytotoxic effect of glutamate. White bars are lithium ascorbate (0.1-1.0 mM) in the absence of glutamate, black bars at the same concentrations in the presence of 100 μM glutamate (Glu). To - control. For each column, 15 fields of view were calculated. * - p <0.01 compared with glutamate without the addition of the drug.
На фигуре 7 продемонстрировано число выживших нейронов, подсчитанное на окрашенных препаратах, на которых хорошо заметно, что присутствие в питательной среде аскорбата лития препятствует деструкции КЗН под воздействием глутамата. На данной фигуре нейропротекторное действие аскорбата лития при нейроцитотоксическом действии глутамата (100 мкМ, 24 ч) в культуре клеток мозжечка. КЗН указано стрелками. Нейроны после апоптоза выглядят как круги темного оттенка с меньшим радиусом, чем выжившие нейроны. Окраска фиксированных культур трипановым синим. Масштаб 15 мкм.The figure 7 shows the number of surviving neurons, calculated on stained preparations, which clearly shows that the presence in the nutrient medium of lithium ascorbate prevents the destruction of SCN under the influence of glutamate. In this figure, the neuroprotective effect of lithium ascorbate with the neurocytotoxic effect of glutamate (100 μM, 24 h) in cerebellum cell culture. KZN is indicated by arrows. Neurons after apoptosis look like circles of a dark shade with a smaller radius than the surviving neurons. Color fixed cultures trypan blue.
Анализ данных, представленных в виде иллюстраций, показал следующее.Analysis of the data presented in the form of illustrations showed the following.
При цитотоксическом действии глутамата (100 мкМ) аскорбат лития в исследованном диапазоне концентраций оказывал выраженный нейропротекторный эффект. Результаты анализа функций распределения средних чисел выживших нейронов при всех концентрациях аскорбата лития показал достоверное отличие от результатов, полученных при действии глутамата без добавления препарата (фиг. 5). Использование даже минимальной концентрации аскорбата лития (0,1 мМ) приводило к достоверному отличию (D=0,19, Р=0,049). При повышении концентрации заявленного средства выраженность отличий возрастала (значения максимального уклонения «D» возрастали, а значения Р снижались), а при самой высокой концентрации (1,0 мМ) отличия между глутаматной токсичностью и интактным контролем были на грани статистической значимости (D=0,17, Р=0,059).Under the cytotoxic effect of glutamate (100 μM), lithium ascorbate in the studied concentration range had a pronounced neuroprotective effect. The results of the analysis of the distribution functions of the average numbers of surviving neurons at all concentrations of lithium ascorbate showed a significant difference from the results obtained with the action of glutamate without adding the drug (Fig. 5). The use of even a minimal concentration of lithium ascorbate (0.1 mM) led to a significant difference (D = 0.19, P = 0.049). With an increase in the concentration of the claimed drug, the severity of differences increased (the values of the maximum deviation "D" increased and the P values decreased), and at the highest concentration (1.0 mmol) the differences between glutamate toxicity and intact control were on the verge of statistical significance (D = 0 , 17, P = 0.059).
Таким образом, аскорбат лития во всем исследованном диапазоне концентраций (0,1-1,0 мМ) достоверно повышает выживаемость нейронов при воздействии глутамата.Thus, lithium ascorbate in the entire studied range of concentrations (0.1-1.0 mm) significantly increases the survival of neurons when exposed to glutamate.
Были проведены сравнительные исследования солей лития с разными анионами. Проведенные исследования показали следующее.Comparative studies of lithium salts with different anions were carried out. Studies have shown the following.
Использование хлорида лития и комената лития также демонстрировало защитный эффект при глутаматном стрессе, однако выживаемость нейронов была достоверное ниже (р=0,0048, р=0,006). Карбонат лития вообще не оказывал защитного действия и даже снижал выживаемость нейронов на фоне концентраций глутамата 250 мкМ и 500 мкМ. Низкая биодоступность катионов лития, связанных с другими анионами неорганических кислот, недостаточно защищает клетки, особенно при высоких концентрациях глутамата. Коменат лития, принятый за прототип предложенного изобретения, оказывает выраженное дозозависимое защитное действие при концентрациях глутатмата 50...250 мкМ, но по сравнению с аскобатом лития коменат лития является достоверно менее эффектным средством защиты от глутаматного стресса.The use of lithium chloride and coment lithium also showed a protective effect under glutamate stress, but neuron survival was significantly lower (p = 0.0048, p = 0.006). Lithium carbonate did not have a protective effect at all and even reduced the survival of neurons against the background of glutamate concentrations of 250 μM and 500 μM. The low bioavailability of lithium cations associated with other anions of inorganic acids does not protect cells well, especially at high concentrations of glutamate. Lithium coment taken as a prototype of the proposed invention has a pronounced dose-dependent protective effect at glutathate concentrations of 50 ... 250 μM, but compared with lithium ascobate, coment lithium is a significantly less effective means of protection against glutamate stress.
Полученные сравнительные результаты приведены ниже в таблице 1.The obtained comparative results are shown below in table 1.
Динамика изменения выживаемости нейронов в процентах подверженных воздействию глутамата в концентрации 50, 100 и 250 мкМ на фоне превентивного внесения (за 3 часа до воздействия глутамата) препаратов лития в культуру нейроцитов.The dynamics of changes in the survival of neurons in percent exposed to glutamate at a concentration of 50, 100 and 250 μM against the background of the preventive introduction (3 hours before exposure to glutamate) of lithium preparations in a neurocyte culture.
Пример 2Example 2
Содержание животных в очень тесной клетке, исключающей движение животного, - т.н. иммобилизационный стресс - провоцирует развитие дегенерации нервных структур. Хронический иммобилизационый стресс в течение 4 недель приводил к повышенному выбросу глутамата и гиперфосфорилированию тау-белка в гиппокампе. Другими признаками глутамат индуцированной нейродегенерации являлось снижение уровней структурных нейрональных белков - белка, ассоциированного с микротрубочками (map2) и гамма-синуклеина. Идентификация гиперфосфорилированного тау-белка с использованием антител подтвердила данные иммуногистохимии и указала на повышение его уровня при хронической иммобилизации, сопровождающейся повышенным выбросом глутамата в течение 4 недель, по сравнению с группой животных, также подверженных в течение 4 недель хронической иммобилизации, но получающих аскорбат лития в дозе 1…50 мкг/кг веса, проиллюстрирована на фиг. 8. Дотации аскорбата лития 1…50 мкг/кг веса в течение 4…12 недель до проведения эксперимента и 1…6 недель после показали выраженный защитный эффект.Keeping animals in a very tight cage, excluding the movement of the animal - the so-called immobilization stress - provokes the development of degeneration of nerve structures. Chronic immobilization stress for 4 weeks led to an increased release of glutamate and hyperphosphorylation of the tau protein in the hippocampus. Other signs of glutamate-induced neurodegeneration were a decrease in the levels of structural neuronal proteins — a protein associated with microtubules (map2) and gamma synuclein. The identification of hyperphosphorylated tau protein using antibodies confirmed the data of immunohistochemistry and indicated an increase in its level during chronic immobilization, accompanied by an increased release of glutamate for 4 weeks, compared with a group of animals also exposed to chronic immobilization for 4 weeks, but receiving lithium ascorbate in a dose of 1 ... 50 μg / kg of body weight is illustrated in FIG. 8. Subsidies of
На фигуре 8 представлены данные по гиперфосфорилированию тау-белка в гиппокампе крыс в условиях 4 недельного иммобилизационного хронического стресса (рис. сверху) и при превентивном использовании аскорбата лития в дозе 30 мкг/кг веса в течение 4 недель до создания модели (рис. снизу).The figure 8 presents data on the hyperphosphorylation of tau protein in the rat hippocampus under conditions of 4 weeks of chronic immobilization of stress (Fig. Above) and with the preventive use of lithium ascorbate at a dose of 30 μg / kg of weight for 4 weeks before the creation of the model (Fig. Below) .
А. Иммуногистохимическая идентификация гиперфосфорилированного тау-белка (анти-PHF). Окрашивание ядер гематоксилином. Масштаб 200 мкм.A. Immunohistochemical identification of hyperphosphorylated tau protein (anti-PHF). Hematoxylin staining of nuclei. Scale 200 microns.
Б. Идентификация гиперфосфорилированного тау-белка с использованием антител (иммуноблот).B. Identification of hyperphosphorylated tau protein using antibodies (immunoblot).
Полученные авторами данные свидетельствуют о выраженных адаптогенных свойствах аскорбата лития в условиях стресса, моделируемого in vivo и in vitro, и о тесной взаимосвязи между стрессом и нейродеструктивными процессами на клеточном уровне, индуцируемых гиперактивацией глутаматных рецепторов.The data obtained by the authors indicate the expressed adaptogenic properties of lithium ascorbate under stress modeled in vivo and in vitro, and the close relationship between stress and neurodestructive processes at the cellular level induced by hyperactivation of glutamate receptors.
Данные о защитном действие соли лития на основе коменовой кислоты (средство по прототипу) на уровни структурных нейрональных белков, ассоциированных с воздействием глутамата на белки, поддерживающие синтез микротрубочек (map2), и уровнем гамма-синуклеина, в прототипе отсутствуют.Data on the protective effect of lithium salts based on comenic acid (prototype agent) on the levels of structural neuronal proteins associated with the effects of glutamate on proteins supporting microtubule synthesis (map2) and the level of gamma synuclein are absent in the prototype.
Анализ вышеприведенных результатов подтверждает достижение заявленного технического результата в объеме совокупности существенных признаков, включенных в формулу изобретения.Analysis of the above results confirms the achievement of the claimed technical result in the amount of the essential features included in the claims.
Claims (1)
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2016114066A RU2614697C1 (en) | 2016-04-12 | 2016-04-12 | Neuroprotective agent |
| PCT/RU2017/000215 WO2017180025A2 (en) | 2016-04-12 | 2017-04-10 | Neuroprotective agent |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2016114066A RU2614697C1 (en) | 2016-04-12 | 2016-04-12 | Neuroprotective agent |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2614697C1 true RU2614697C1 (en) | 2017-03-28 |
Family
ID=58505663
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2016114066A RU2614697C1 (en) | 2016-04-12 | 2016-04-12 | Neuroprotective agent |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2614697C1 (en) |
| WO (1) | WO2017180025A2 (en) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2675601C1 (en) * | 2018-06-26 | 2018-12-20 | Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Национальный исследовательский Томский политехнический университет" | Agent with anti-stroke action |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3654316A (en) * | 1967-12-15 | 1972-04-04 | Daiichi Sciyaku Co Ltd | Method of preparing comenic acid and derivatives thereof |
| RU2458691C2 (en) * | 2007-07-23 | 2012-08-20 | Синошиа Терапьютикс | Treating posttraumatic stress disorder |
| RU2477722C1 (en) * | 2011-07-27 | 2013-03-20 | Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Кубанский государственный университет" (ГОУ ВПО КубГУ) | Method for preparing lithium salt of comenic acid and using it as antioxidant, stress- and neuroprotective agent |
| RU2501792C2 (en) * | 2008-10-03 | 2013-12-20 | Протеотек Инк. | Compounds, compositions and methods for treating beta-amyloid diseases and synucleinopathies |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20070298129A1 (en) * | 2005-08-24 | 2007-12-27 | Neurotech Pharmaceuticals Co., Ltd. | Compounds and compositions for treating neuronal death or neurological dysfunction |
| RU2351326C2 (en) * | 2006-03-09 | 2009-04-10 | Петр Прокопьевич Балашов | Mediation, possessing haematoprotacting effect |
-
2016
- 2016-04-12 RU RU2016114066A patent/RU2614697C1/en not_active IP Right Cessation
-
2017
- 2017-04-10 WO PCT/RU2017/000215 patent/WO2017180025A2/en not_active Ceased
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3654316A (en) * | 1967-12-15 | 1972-04-04 | Daiichi Sciyaku Co Ltd | Method of preparing comenic acid and derivatives thereof |
| RU2458691C2 (en) * | 2007-07-23 | 2012-08-20 | Синошиа Терапьютикс | Treating posttraumatic stress disorder |
| RU2501792C2 (en) * | 2008-10-03 | 2013-12-20 | Протеотек Инк. | Compounds, compositions and methods for treating beta-amyloid diseases and synucleinopathies |
| RU2477722C1 (en) * | 2011-07-27 | 2013-03-20 | Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Кубанский государственный университет" (ГОУ ВПО КубГУ) | Method for preparing lithium salt of comenic acid and using it as antioxidant, stress- and neuroprotective agent |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| HAMNER M.B. Plasma dopamine beta-hydroxylase activity in psychotic and non-psychotic post-traumatic stress disorder. Psychiatry Res. 1998 Feb 27; 77(3): 175-181. * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2675601C1 (en) * | 2018-06-26 | 2018-12-20 | Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Национальный исследовательский Томский политехнический университет" | Agent with anti-stroke action |
| WO2020005113A1 (en) * | 2018-06-26 | 2020-01-02 | Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Национальный исследовательский Томский политехнический университет" | Anti-stroke agent |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2017180025A2 (en) | 2017-10-19 |
| WO2017180025A3 (en) | 2018-01-04 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Wang et al. | Mechanisms and roles of mitophagy in neurodegenerative diseases | |
| Ekundayo et al. | Oxidative stress, endoplasmic reticulum stress and apoptosis in the pathology of Alzheimer’s disease | |
| Nazıroğlu et al. | Neuroprotection induced by N-acetylcysteine and selenium against traumatic brain injury-induced apoptosis and calcium entry in hippocampus of rat | |
| Han et al. | Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide protects against β-amyloid toxicity | |
| Wang et al. | Parkin, an E3 ubiquitin ligase, plays an essential role in mitochondrial quality control in Parkinson’s disease | |
| Sai et al. | The Parkinson's disease-related genes act in mitochondrial homeostasis | |
| Zhou et al. | TIGAR attenuates high glucose-induced neuronal apoptosis via an autophagy pathway | |
| Zhu et al. | The roles of p38 MAPK/MSK1 signaling pathway in the neuroprotection of hypoxic postconditioning against transient global cerebral ischemia in adult rats | |
| Yang et al. | Cerebral ischemia/stroke and small ubiquitin‐like modifier (SUMO) conjugation–a new target for therapeutic intervention? | |
| Kyselova | Different experimental approaches in modelling cataractogenesis: an overview of selenite-induced nuclear cataract in rats | |
| Reiner et al. | 9-Cis retinoic acid protects against methamphetamine-induced neurotoxicity in nigrostriatal dopamine neurons | |
| Wang et al. | Lipin1 alleviates autophagy disorder in sciatic nerve and improves diabetic peripheral neuropathy | |
| Tsai et al. | Protective effect of the extremolytes ectoine and hydroxyectoine in a porcine organ culture | |
| RU2614697C1 (en) | Neuroprotective agent | |
| Stępkowski et al. | 6-OHDA-induced changes in Parkinsons disease-related gene expression are not affected by the overexpression of PGAM5 in in vitro differentiated embryonic mesencephalic cells | |
| Akiyama et al. | Edaravone prevents retinal degeneration in adult mice following optic nerve injury | |
| Yilmaz et al. | Effect of three-week zinc and melatonin supplementation on the oxidant-antioxidant system in experimental renal ischemia-reperfusion in rats | |
| EP3785715B1 (en) | Pharmaceutical composition comprising ibrutinib for use in the prevention or treatment of alzheimer's disease | |
| US20190105341A1 (en) | Compositions and Methods for Treating Alzheimer's Disease and Other Tauopathies | |
| Jung et al. | Calbindin-D9k is a novel risk gene for neurodegenerative disease | |
| Nath et al. | Evidence for Paracrine Protective Role of Exogenous αA-Crystallin in Retinal Ganglion Cells | |
| KR101910717B1 (en) | Composition for Treating or Preventing Dementia Comprising Nannochloropsis oceanica Extracts As Active Ingredient | |
| Bele et al. | Caloric restriction mimetic 2-deoxyglucose maintains cytoarchitecture and reduces tau phosphorylation in primary culture of mouse hippocampal pyramidal neurons | |
| US20210253511A1 (en) | Compounds and uses for the treatment and prevention of diseases and conditions associate with or aggrevated by impared mitophagy | |
| Jahromi et al. | Neuroprotective and antiapoptotic effects of N-acetylcystein and Crocus sativus aqueous extract on arsenic-induced neurotoxicity in SH-SY5Y human dopaminergic neuroblastoma cells |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20190413 |