RU2697218C1 - Использование сигнальных пептидов митохондриальной локализации для увеличения уровня гетерологической экспрессии белков в P.pastoris и S.cerevisiae - Google Patents
Использование сигнальных пептидов митохондриальной локализации для увеличения уровня гетерологической экспрессии белков в P.pastoris и S.cerevisiae Download PDFInfo
- Publication number
- RU2697218C1 RU2697218C1 RU2018125360A RU2018125360A RU2697218C1 RU 2697218 C1 RU2697218 C1 RU 2697218C1 RU 2018125360 A RU2018125360 A RU 2018125360A RU 2018125360 A RU2018125360 A RU 2018125360A RU 2697218 C1 RU2697218 C1 RU 2697218C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- seq
- proteins
- signal peptides
- pichia pastoris
- saccharomyces cerevisiae
- Prior art date
Links
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 title claims abstract description 23
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 title claims abstract description 14
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 title claims abstract description 9
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title abstract description 37
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title abstract description 31
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 title abstract description 11
- 230000025608 mitochondrion localization Effects 0.000 title abstract description 7
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 title abstract 4
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 claims abstract description 14
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 claims abstract description 14
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 12
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 12
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims abstract description 9
- 230000008859 change Effects 0.000 abstract description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 238000000034 method Methods 0.000 description 8
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 7
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 5
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 3
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000002438 mitochondrial effect Effects 0.000 description 3
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- 101000645266 Homo sapiens Mitochondrial import inner membrane translocase subunit Tim22 Proteins 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 102100026258 Mitochondrial import inner membrane translocase subunit Tim22 Human genes 0.000 description 2
- 101000948431 Synechocystis sp. (strain PCC 6803 / Kazusa) Membrane protein insertase YidC Proteins 0.000 description 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 description 2
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 2
- 210000002472 endoplasmic reticulum Anatomy 0.000 description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 2
- 210000001700 mitochondrial membrane Anatomy 0.000 description 2
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 2
- 235000019833 protease Nutrition 0.000 description 2
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 2
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 1
- -1 Cox18 / Oha2 Proteins 0.000 description 1
- 101800000778 Cytochrome b-c1 complex subunit 9 Proteins 0.000 description 1
- 102400000011 Cytochrome b-c1 complex subunit 9 Human genes 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 101150005497 MRS2 gene Proteins 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108020005196 Mitochondrial DNA Proteins 0.000 description 1
- 102000005431 Molecular Chaperones Human genes 0.000 description 1
- 108010006519 Molecular Chaperones Proteins 0.000 description 1
- 241000221961 Neurospora crassa Species 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 102000015176 Proton-Translocating ATPases Human genes 0.000 description 1
- 108010039518 Proton-Translocating ATPases Proteins 0.000 description 1
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000030570 cellular localization Effects 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 102000035175 foldases Human genes 0.000 description 1
- 108091005749 foldases Proteins 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 230000036512 infertility Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 210000003470 mitochondria Anatomy 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 230000001323 posttranslational effect Effects 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Настоящее изобретение относится к области биотехнологии и молекулярной биологии. Описаны сигнальные пептиды митохондриальной локализации (последовательности представлены в табл. 1: SEQ ID 1, SEQ ID 2, SEQ ID 3, SEQ ID 4, SEQ ID 5, SEQ ID 6, SEQ ID 7, SEQ ID 8, SEQ ID 9, SEQ ID 10). При использовании указанных пептидов в слитной полипептидной цепи с целевыми рекомбинантными белками увеличивается уровень выхода целевых рекомбинантных белков, изменяется качество их фолдинга при их экспрессии с использованием штаммов-продуцентов на основе дрожжей, в частности P.pastoris и S.cerevisiae. Изобретение может быть использовано для увеличения уровня выхода рекомбинантных белков и изменения качества их фолдинга при их экспрессии с использованием штаммов-продуцентов на основе дрожжей, в частности P.pastoris и S.cerevisiae. 2 табл.
Description
Настоящее изобретение относится к области биотехнологии и молекулярной биологии и может быть использовано для увеличения уровня выхода рекомбинантных белков и изменения качества их фолдинга при их экспрессии с использованием штаммов-продуцентов на основе дрожжей, в частности P. pastoris и S. cerevisiae.
Штаммы-продуценты на основе прокариотического организма бактерии E. coli часто не пригодны для гетерологической экспрессии белков, которым требуются посттрансляционные модификации, эукариотические шапероны и процессинг для образования биологически активного состояния. Белки эукариотических организмов как правило имеют более сложную структуру, чем у прокариотических. Правильный фолдинг и процессинг является необходимым условием для их функционирования. Для синтеза сложных белков используют системы экспрессии, созданные на основе многоклеточных эукариотических организмов (культуры клеток млекопитающих, трансгенные растения и животные), которые позволяют получать гетерологичные белки. Существенным недостатком этих систем является достаточная сложность работы с такими культурами клеток, особенные требования к стерильности, аэрации биомассы, механическая непрочность клеток, дороговизна и трудоемкость получения трансгенных растений и животных, при недостаточном выходе целевых белков. Для рекомбинантного синтеза некоторых белков достаточно использовать штаммы-продуценты на основе дрожжей, такие как S. cerevisiae и P. pastoris. Данные штаммы-продуценты имеют ряд преимуществ. У дрожжей так же подробно как у E. coli изучены процессы метаболизма, при работе с ними используются стандартные методы генетической инженерии, дрожжи легко культивировать на относительно дешевых субстратах, все это делает возможным масштабирование процесса культивирования штаммов-продуцентов на основе дрожжей. Применение данной системы экспрессии позволяет сочетать простоту бактериальных систем экспрессии и возможности пострансляционных модификаций и фолдинга рекомбинантных белков [1]. Еще одни достоинством этой системы гетерологичной экспрессии является возможность осуществления процессинга целевого рекомбинантного белка. Использование лидерных пептидов в слитной полипептидной цепи с целевыми белками позволяет задать их направления их транспорта и процессинга внутри клетки штамма продуцента [2]. Например, данный подход необходим для белков со сложной структурой, а также для различных ферментов, обладающих токсичностью внутри клетки, в последнем случае используются секреторные лидерные пептиды направляющие рекомбинантные белки из цитоплазмы в культуральную жидкость. Культуральная жидкость после культивирования P. pastoris, содержит относительно небольшое количество собственных белков штамма-продуцента, поэтому секретированный целевой белок можно достаточно легко очистить от примесных белков и компонентов питательной среды. Так же возможно использовать для экспрессии не секреторные сигнальные пептиды, а сигналы внутриклеточной локализации. В значительной степени изучены сигнальные пептиды митохондриальной локализации. На данный момент известно 3 варианта встраивания белков во внутреннюю мембрану митохондрий [3]: 1) путь через белковый комплекс TIM22 («TIM22 pathway»): используется для некоторых белков, имеющих мотивы распознавания внутри своей структуры или последовательности иминокислотных остатков. Этот путь не задействует лидерные пептиды. 2) Путь остановки транспорта («Stop transfer pathway»): присущ белкам с одной трансмембранной спиралью. Данные белки экспрессируются с лидерной последовательностью, которая удаляется комплексом протеаз сразу после встраивания во внутреннюю мембрану митохондрий. 3) Консервативная сортировка («Conservative sorting))): белки транслируются с лидерным сигнальным пептидом, транспортируются в митохондриальный матрикс, затем сигнальный пептид отщепляется митондриальной пептидазой [4] и белок претерпевает фолдинг и, если это мембранный белок, встраивается в мембрану при помощи фермента Oxa1 [6]. Данный способ используется преимущественно для белков, кодируемых митохондриальной ДНК, а также для белков, кодируемых ядерными генами, но имеющих прокариотические аналоги [6], например, субъединица 9 F0F1 ATPase N. crassa, Oxa1, Сох18/Оха2, Mrs2.
Решение задачи увеличения уровня экспрессии генов рекомбинантных белков при использовании штаммов-продуцентов на основе дрожжей актуально с момента разработки технологии их культивирования. Предлагаемый нами способ увеличения уровня экспрессии генов целевых рекомбинантных белков заключается в добавлении на 5"-конец генов, кодирующих данные рекомбинантные белки, - генов, кодирующих последовательности лидерных пептидов митохондриальной локализации (при сохранении рамки считывания). Аминокислотные последовательности данных лидерных пептидов представлены в таблице 1. Таким образом, при экспрессии генов целевых рекомбинантных белков с генами, кодирующими лидерные пептиды, целевые рекомбинантные белки будут нести на своем N-конце пептиды митохондриальной локализации в слитной полипептидной цепи. Данные сигнальные пептиды будут приводить к транспорту целевых полипептидов (белков) в митохондрии (в некоторых случаях через эндоплазматический ретикулум, в зависимости от выбранного сигнального пептида), что приведет: 1) к задействованию митохондриальных пептидаз в специфическом гидролизе слитной последовательности аминокислотных остатков после сигнальных пептидов, 2) процессингу целевых полипептидов в соответствии с выбранным сигнальным пептидом, при этом отличном от процессинга, которому подвергается целевой полипептид без сигнального пептида, 3) участию в фолдинге целевых полипептидов шаперонов (митохондриальных и эндоплазматического ретикулума) соответствующих данному сигнальному пептиду. Процессы 2 и 3, вызванные использованием сигнальных пептидов, для некоторых рекомбинантных белков приводят к увеличению общего уровня их экспрессии, то есть приводят к увеличению их количества содержащегося в цитоплазме и мембранах клеток штамма-продуцента. Это вероятно обусловлено изменениями в процессах внутриклеточного процессинга полипептидов (2) и фолдинга (3) происходящими при наличии пептидов митохондриальной локализации на N-конце белков.
При осуществлении изобретения, помимо методов, подробно раскрытых в нижеследующем примере, используются хорошо известные специалистам методики, описанные в руководствах по молекулярной биологии и генетической инженерии [7].
Пример 1. Выбор сигнальных лидерных пептидов.
Были проанализированы аминокислотные последовательности белков, имеющих митохондриальную локализацию, а также для белков, кодируемых ядерными генами, но имеющих прокариотические аналоги. Их последовательности и идентификационные номера в базе данных белков приведены в Таблица 2. Данные последовательности аминокислотных остатков построены автоматически по кДНК белков, соответствуют последовательности мРНК белков, согласно принципам формирования базы данных. Таким образом, последовательности аминокислотных остатков белков содержат полную последовательность незрелых белков до их посттрансляционного процессинга и модификаций. В частности, данные последовательности аминокислотных остатков включают в себя последовательности лидерных сигнальных пептидов. Данные лидерные пептиды и были выбраны для использования.
Источники информации.
1. J.M. Cregg, Higgins D.R. 1995. Production of foreign proteins in the yeast Pichia pastoris. // Canadian J. Botany Supp.73, 5981-5987.
2. Герасимов A.C., Шульга A.A., Зейналов O.A., Скрябин К.Г. Синтез гетерологичных рецепторов, связанных с G-белком, в клетках метилотрофных дрожжей P. pastoris. Доклады Академии Наук. Т.441 (5), с. 1-4, 2011. Pichia pastoris. Nat Biotechnol. 27: 561-566, 2009
3. Mossmann, D., Meisinger, C, 
F. N. 2012. Processing of mitochondrial presequences. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Gene Regulatory Mechanisms, 1819(9), 1098-1106.
4. 
F.N., Wortelkamp, S., Zahedi, R.P., Becker, D., Leidhold, C., Gevaert, K., … & Meisinger, C. 2009. Global analysis of the mitochondrial N-proteome identifies a processing peptidase critical for protein stability. Cell, 139(2), 428-439.
5. Stuart, Rosemary A. 2002. Insertion of proteins into the inner membrane of mitochondria: the role of the Oxal complex. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Molecular Cell Research 1592.1: 79-87.
6. Rojo, E.E., Stuart, R.A., & Neupert, W. (1995). Conservative sorting of F0-ATPase subunit 9: export from matrix requires delta pH across inner membrane and matrix ATP. The EMBO journal, 14(14), 3445.
7. Ausubel F.M., Brent, R., Kingston, R.E., Moore, D.D., Seidman, J.G., Smith, J.A., and Struhl, K. (1997) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, New York.
Claims (1)
- Использование одного из сигнальных пептидов SEQ ID 1, SEQ ID 2, SEQ ID 3, SEQ ID 4, SEQ ID 5, SEQ ID 6, SEQ ID 7, SEQ ID 8, SEQ ID 9, SEQ ID 10 для гетерологической экспрессии в слитной полипептидной цепи с рекомбинантным белком в штаммах-продуцентах на основе P.pastoris и S. cerevisiae для увеличения уровня экспрессии рекомбинантных белков.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2018125360A RU2697218C1 (ru) | 2018-07-11 | 2018-07-11 | Использование сигнальных пептидов митохондриальной локализации для увеличения уровня гетерологической экспрессии белков в P.pastoris и S.cerevisiae |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2018125360A RU2697218C1 (ru) | 2018-07-11 | 2018-07-11 | Использование сигнальных пептидов митохондриальной локализации для увеличения уровня гетерологической экспрессии белков в P.pastoris и S.cerevisiae |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2697218C1 true RU2697218C1 (ru) | 2019-08-13 |
Family
ID=67640535
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2018125360A RU2697218C1 (ru) | 2018-07-11 | 2018-07-11 | Использование сигнальных пептидов митохондриальной локализации для увеличения уровня гетерологической экспрессии белков в P.pastoris и S.cerevisiae |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2697218C1 (ru) |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2157847C2 (ru) * | 1995-05-24 | 2000-10-20 | Астра Актиеболаг (пабл) | Молекула днк для экспрессии, стимулируемой солями желчи липазы (bssl) |
| EA022946B1 (ru) * | 2009-07-15 | 2016-03-31 | ЛАБОРАТОРИОС БЕТА Эс.Эй. | Способ получения инсулина аспарт при помощи штамма дрожжей pichia pastoris |
-
2018
- 2018-07-11 RU RU2018125360A patent/RU2697218C1/ru active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2157847C2 (ru) * | 1995-05-24 | 2000-10-20 | Астра Актиеболаг (пабл) | Молекула днк для экспрессии, стимулируемой солями желчи липазы (bssl) |
| EA022946B1 (ru) * | 2009-07-15 | 2016-03-31 | ЛАБОРАТОРИОС БЕТА Эс.Эй. | Способ получения инсулина аспарт при помощи штамма дрожжей pichia pastoris |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Chen et al. | An N-end rule pathway that recognizes proline and destroys gluconeogenic enzymes | |
| Braun et al. | The protein-import apparatus of plant mitochondria | |
| US20250277249A1 (en) | Archaeal pyrrolysyl trna synthetases for orthogonal use | |
| RU2429243C2 (ru) | Производство белков | |
| US10174304B2 (en) | Expression vector and method for producing protein | |
| Chaudhuri et al. | Tim17 updates: A comprehensive review of an ancient mitochondrial protein translocator | |
| Popova et al. | Yeast heterologous expression systems for the Study of Plant Membrane Proteins | |
| Futai et al. | Molecular cloning of PalBH, a mammalian homologue of the Aspergillus atypical calpain PalB | |
| CN103819546A (zh) | 一种以水蛭素为融合伴侣制备重组小分子蛋白或多肽的方法 | |
| RU2697218C1 (ru) | Использование сигнальных пептидов митохондриальной локализации для увеличения уровня гетерологической экспрессии белков в P.pastoris и S.cerevisiae | |
| Liu et al. | Scale high-cell-density fermentation of Pichia pastoris | |
| Werner et al. | The glyoxysomal protease LON2 is involved in fruiting-body development, ascosporogenesis and stress resistance in Sordaria macrospora | |
| CN109439643A (zh) | 一种新型赖氨酸特异性内切酶及其制备方法 | |
| Huang et al. | Expression of recombinant human octamer-binding transcription factor 4 in rice suspension cells | |
| Li et al. | Amino Acid Substitutions at P1 Position Change the Inhibitory Activity and Specificity of Protease Inhibitors BmSPI38 and BmSPI39 from Bombyx mori | |
| Covaleda-Cortés et al. | Characterization, recombinant production and structure-function analysis of NvCI, A picomolar metallocarboxypeptidase inhibitor from the marine snail nerita versicolor | |
| Reyes-Ruiz et al. | Proteins in a DNA world: expression systems for their study | |
| JP7641024B2 (ja) | ポリペプチドタグ及び体外タンパク質合成におけるその使用 | |
| US6890730B1 (en) | Sequence and method for increasing protein expression in cellular expression systems | |
| CN114703215A (zh) | 使用真核细胞发酵表达血管紧张素转化酶2的方法 | |
| Altamura et al. | Systems for production of proteins for biomimetic membrane devices | |
| CN114560911B (zh) | 一种抗真菌肽及其制备方法 | |
| Sun et al. | Modifications of constitutive promoter to large-scale synthesize porcine myoglobin in Komagataella phaffii | |
| Gurskaya et al. | The coding region of far-red fluorescent protein Katushka contains a strong donor splice site | |
| CN102654504A (zh) | 一种快速检测重组蛋白表达量的方法 |