RU2157847C2 - Молекула днк для экспрессии, стимулируемой солями желчи липазы (bssl) - Google Patents
Молекула днк для экспрессии, стимулируемой солями желчи липазы (bssl) Download PDFInfo
- Publication number
- RU2157847C2 RU2157847C2 RU97117367/13A RU97117367A RU2157847C2 RU 2157847 C2 RU2157847 C2 RU 2157847C2 RU 97117367/13 A RU97117367/13 A RU 97117367/13A RU 97117367 A RU97117367 A RU 97117367A RU 2157847 C2 RU2157847 C2 RU 2157847C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- bssl
- parc
- polypeptide
- dna molecule
- seq
- Prior art date
Links
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 title claims abstract description 25
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 title claims abstract description 15
- 108010087173 bile salt-stimulated lipase Proteins 0.000 title description 71
- 102100035687 Bile salt-activated lipase Human genes 0.000 title description 60
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 claims abstract description 38
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 30
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 25
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims abstract description 24
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 claims abstract description 21
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 claims abstract description 17
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 15
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims abstract description 11
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 claims abstract description 8
- 230000028327 secretion Effects 0.000 claims abstract description 4
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims abstract description 3
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract 5
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 18
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 claims description 15
- 101100244726 Pisum sativum PPF-1 gene Proteins 0.000 claims description 12
- 108010025188 Alcohol oxidase Proteins 0.000 claims description 10
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 claims description 10
- 101000715643 Homo sapiens Bile salt-activated lipase Proteins 0.000 claims description 10
- 102000052905 human CEL Human genes 0.000 claims description 10
- 108010051210 beta-Fructofuranosidase Proteins 0.000 claims description 6
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 6
- 239000001573 invertase Substances 0.000 claims description 5
- 235000011073 invertase Nutrition 0.000 claims description 5
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims 1
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 33
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 20
- 108090001060 Lipase Proteins 0.000 abstract description 12
- 102000004882 Lipase Human genes 0.000 abstract description 12
- 239000004367 Lipase Substances 0.000 abstract description 12
- 235000019421 lipase Nutrition 0.000 abstract description 12
- 239000013598 vector Substances 0.000 abstract description 10
- 239000003833 bile salt Substances 0.000 abstract description 5
- 229940093761 bile salts Drugs 0.000 abstract description 5
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 abstract description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 2
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 abstract 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 abstract 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 abstract 1
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 abstract 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 38
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 30
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 30
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 21
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 14
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 14
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 13
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 12
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 12
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 11
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 9
- 108020003589 5' Untranslated Regions Proteins 0.000 description 7
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 7
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 7
- 108020005345 3' Untranslated Regions Proteins 0.000 description 6
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 6
- 101150005709 ARG4 gene Proteins 0.000 description 5
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 5
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 5
- 101150069554 HIS4 gene Proteins 0.000 description 5
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 5
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 5
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 5
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 5
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 5
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 5
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 125000001475 halogen functional group Chemical group 0.000 description 4
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 4
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 4
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 4
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 4
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 4
- 241000235648 Pichia Species 0.000 description 3
- 101100004044 Vigna radiata var. radiata AUX22B gene Proteins 0.000 description 3
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 3
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 3
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 3
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 3
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 3
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 3
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- FQVLRGLGWNWPSS-BXBUPLCLSA-N (4r,7s,10s,13s,16r)-16-acetamido-13-(1h-imidazol-5-ylmethyl)-10-methyl-6,9,12,15-tetraoxo-7-propan-2-yl-1,2-dithia-5,8,11,14-tetrazacycloheptadecane-4-carboxamide Chemical compound N1C(=O)[C@@H](NC(C)=O)CSSC[C@@H](C(N)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H]1CC1=CN=CN1 FQVLRGLGWNWPSS-BXBUPLCLSA-N 0.000 description 2
- UEJJHQNACJXSKW-UHFFFAOYSA-N 2-(2,6-dioxopiperidin-3-yl)-1H-isoindole-1,3(2H)-dione Chemical compound O=C1C2=CC=CC=C2C(=O)N1C1CCC(=O)NC1=O UEJJHQNACJXSKW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 2
- 102100034035 Alcohol dehydrogenase 1A Human genes 0.000 description 2
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 101150015280 Cel gene Proteins 0.000 description 2
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- 101000892220 Geobacillus thermodenitrificans (strain NG80-2) Long-chain-alcohol dehydrogenase 1 Proteins 0.000 description 2
- 101000780443 Homo sapiens Alcohol dehydrogenase 1A Proteins 0.000 description 2
- 241001506991 Komagataella phaffii GS115 Species 0.000 description 2
- 102000014171 Milk Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010011756 Milk Proteins Proteins 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 2
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 2
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 2
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 2
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 2
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 2
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 2
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 2
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 2
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 2
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 2
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 2
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 2
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 2
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 2
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 235000021239 milk protein Nutrition 0.000 description 2
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 2
- QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N nitrogen group Chemical group [N] QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 2
- 239000003208 petroleum Substances 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 150000003626 triacylglycerols Chemical class 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 2
- 102100033639 Acetylcholinesterase Human genes 0.000 description 1
- 108010022752 Acetylcholinesterase Proteins 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 108010039627 Aprotinin Proteins 0.000 description 1
- 108010023063 Bacto-peptone Proteins 0.000 description 1
- 241000588807 Bordetella Species 0.000 description 1
- 241000701822 Bovine papillomavirus Species 0.000 description 1
- SGHZXLIDFTYFHQ-UHFFFAOYSA-L Brilliant Blue Chemical compound [Na+].[Na+].C=1C=C(C(=C2C=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=2C(=CC=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=CC=1N(CC)CC1=CC=CC(S([O-])(=O)=O)=C1 SGHZXLIDFTYFHQ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100036806 Carboxylesterase 5A Human genes 0.000 description 1
- 108090000371 Esterases Proteins 0.000 description 1
- 108050001049 Extracellular proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 241000282575 Gorilla Species 0.000 description 1
- 241000700721 Hepatitis B virus Species 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101001018100 Homo sapiens Lysozyme C Proteins 0.000 description 1
- 101000611183 Homo sapiens Tumor necrosis factor Proteins 0.000 description 1
- 102000004157 Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108090000604 Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- 101150051118 PTM1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150003479 Parg gene Proteins 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150014136 SUC2 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000235070 Saccharomyces Species 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- UYXTWWCETRIEDR-UHFFFAOYSA-N Tributyrin Chemical compound CCCC(=O)OCC(OC(=O)CCC)COC(=O)CCC UYXTWWCETRIEDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091023045 Untranslated Region Proteins 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 229940022698 acetylcholinesterase Drugs 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 1
- 239000002518 antifoaming agent Substances 0.000 description 1
- 229960004405 aprotinin Drugs 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 239000001045 blue dye Substances 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000001733 carboxylic acid esters Chemical class 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 229940099352 cholate Drugs 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 1
- 230000037213 diet Effects 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 102000035122 glycosylated proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091005608 glycosylated proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000057041 human TNF Human genes 0.000 description 1
- 235000020256 human milk Nutrition 0.000 description 1
- 210000004251 human milk Anatomy 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N iniprol Chemical compound C([C@H]1C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@H]2CSSC[C@H]3C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@H](C(N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC=4C=CC=CC=4)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC2=O)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC=2C=CC=CC=2)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H]2N(CCC2)C(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N3)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@H](C(=O)N1)C(C)C)[C@@H](C)O)[C@@H](C)CC)=O)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 1
- 230000006651 lactation Effects 0.000 description 1
- 230000002366 lipolytic effect Effects 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 210000005075 mammary gland Anatomy 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 230000000737 periodic effect Effects 0.000 description 1
- 108010021711 pertactin Proteins 0.000 description 1
- 108010085336 phosphoribosyl-AMP cyclohydrolase Proteins 0.000 description 1
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 1
- 230000003234 polygenic effect Effects 0.000 description 1
- 229920001451 polypropylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 239000012465 retentate Substances 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 210000000813 small intestine Anatomy 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 230000001502 supplementing effect Effects 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 1
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
- C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
- C12N15/815—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts for yeasts other than Saccharomyces
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
- C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
- C12N1/16—Yeasts; Culture media therefor
- C12N1/18—Baker's yeast; Brewer's yeast
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
- C12N9/18—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
- C12N9/20—Triglyceride splitting, e.g. by means of lipase
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Mycology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Botany (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Virology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Изобретение относится к молекулам ДНК, рекомбинантным векторам и клеточным культурам, предназначенным для использования в способах экспрессии стимулируемой солями желчи липазы (BSSL) в метилтрофных дрожжах Pichia pastoris. Молекула ДНК содержит область кодирования полипептида, представляющего собой человеческую BSSL или ее биологический активный вариант с аминокислотной последовательностью, представленной в описании. К 5'-окончанию указанной области присоединен участок, кодирующий сигнальный пептид, способный управлять секрецией указанного полипептида из клеток Pichia pastoris, трансформированных указанной молекулой ДНК, с аминокислотной последовательностью, представленной в описании, а также оперативно связанный с указанными кодирующими областями метанолоксидазный промотор Pichia pastoris или функционально эквивалентный промотор. Описаны плазмидные векторы рARC 5771, рARC 5799, pARC 5797. Полипептид получают культивированием клеток-хозяев, трансформированных указанными плазмидами, с выделением его из культуральной среды. Изобретение позволяет увеличить выход целевого продукта по сравнению с известными способами. 5 с. и 3 з.п. ф-лы, 1 табл.
Description
Изобретение относится к молекулам ДНК, рекомбинантным векторам и клеточным культурам, предназначенным для использования в способах экспрессии стимулируемой солями желчи липазы (BSSL) в метилотрофных дрожжах Pichia pastoris.
Считается, что стимулируемая солями желчи липаза (BSSL; EC 3.1.1.1) (см. ссылку на работу Wang и Hartsuck, 1993) ответственна за основную часть липолитической активности человеческого молока. Отличительный признак такой липазы состоит в том, что необходимо наличие первичных солей желчи для обеспечения ее активности в отношении эмульгированных длинных цепей триацилглицеринов. BSSL к настоящему времени была обнаружена только в молоке людей, горилл, кошек и собак (Hernell с сотр., 1989).
BSSL приписывается решающая роль в процессе переваривания молочных липидов в кишечнике детей, кормящихся грудью (Fredrikzon с сотр., 1978). BSSL синтезируется в организме женщин в период лактации молочных желез и секретируется с молоком (Bläckberg с сотр., 1987). Считается, что она обеспечивает примерно 1% общего количества молочного белка (Bläckberg & Hernell, 1981).
Предполагается, что BSSL является основным лимитирующим скорость фактором в абсорбции жира и последующем росте, особенно в возрасте полового созревания, у детей с дефицитом собственного продуцирования BSSL и что добавка в рацион питания упомянутых выше детей рецептур, содержащих очищенный энзим, существенно улучшает пищеварение и способствует росту детей (US 4944944; Медицинский Исследовательский Фонд Оклахомы). Этот факт является весьма важным в клинической практике в области составления детских рецептур, содержащих относительно высокое процентное содержание триглицеридов и основанных на молочных белках растительного или нечеловеческого происхождения, так как новорожденные, питающиеся такими рецептурами, не способны переваривать жир в отсутствие добавляемой BSSL.
Структуры кДНК как молочной BSSL, так и карбонового сложного эфира гидролазы поджелудочной железы (СЕН) были охарактеризованы (Baba с сотр., 1991; Hui и Kissel, 1991; Nilsson с сотр., 1991; Reue с сотр., 1991) и был сделан вывод, что молочный энзим и фермент поджелудочной железы являются продуктами одного и того же гена, гена CEL. Последовательность кДНК (SEQ ID N: 1) CEL гена раскрыта в патенте США 5200183 (Медицинский Исследовательский Фонд Оклахомы); WO 91/18293 (Actiebolaret Astra); Nilsson с сотр. (1990); a также Baba с сотр. (1991). Выведенная аминокислотная последовательность белка BSSL, включающая сигнальную последовательность из 23 аминокислот, представлена как Последовательность SEQ ID N: 2 в Перечне последовательностей, приведенном в конце описания, тогда как последовательность нативного белка, состоящего из 722 аминокислот, представлена как SEQ ID N: 3.
C-терминальная область белка содержит 16 повторов из 11 аминокислотных остатков каждый, за которыми следует консервативный участок из 11 аминокислот. Нативный белок имеет высокую степень гликозилирования, и имеются сообщения о широком интервале наблюдаемых молекулярных весов. Вероятно, этот факт может быть объяснен изменением степени гликозилирования (Abouakil с сотр., 1988). N-терминальная половина белка гомологична ацетилхолинэстеразе и некоторым другим эстеразам (Nilsson с сотр., 1990).
Рекомбинантная BSSL может быть продуцирована экспрессией в таком подходящем хозяине, как E.coli, Saccharomyces serevisiae или клеточные линии млекопитающих. Для масштабирования системы экспрессии BSSL с целью достижения коммерчески приемлемой стоимости производства может рассматриваться применение гетерологических экспрессирующих систем. Как упоминалось выше, человеческая BSSL имеет 16 повторов из 11 аминокислот на C-терминальном конце. Для определения биологической значимости такого участка повторов конструировались различные мутанты человеческой BSSL, у которых частично или полностью отсутствовали участки повтора (Hansson с сотр., 1993). Так, например, вариант BSSL-C (SEQ ID N: 4) имеет делеции от аминокислотных остатков 536-568 и аминокислотных остатков 591-711. Исследования экспрессии с использованием линии клеток млекопитающего C127 и сектора экспрессии на основе вируса коровьей папиломы показали, что различные варианты могут экспрессироваться в активных формах (Hansson с сотр., 1993). Из исследований экспрессии был также сделан вывод, что повторы, обогащенные пролином, в человеческой BSSL не играют существенной роли в каталитической активности или активации BSSL солями желчи. Однако получение BSSL или ее мутантов в экспрессионной системе млекопитающего оказывается слишком дорогостоящим для рутинного терапевтического использования.
Эукариотическая система, например дрожжи, может обеспечить значительные преимущества по сравнению с использованием прокариотических систем в плане получения некоторых полипептидов, кодируемых рекомбинантной ДНК. Так, например, дрожжи обычно могут расти до более высокой плотности клеток, чем бактерии, и могут оказаться способными к гликозилированию экспрессированных полипептидов в том случае, когда такое гликозилирование важно для биологической активности. Однако применение дрожжей разновидности Saccharomyces cerevisiae в качестве организма-хозяина часто приводит к плохим уровням экспрессии и плохой секреции рекомбинантного белка (Cregg с сотр., 1987). Максимальные уровни содержания гетерологических белков в S.cerevisiae составляют величину порядка 5% от общего количества клеточного белка (Kingsman с сотр., 1985). Дополнительным недостатком применения Saccharomyces cerevisiae в качестве хозяина является то, что рекомбинантные белки проявляют тенденцию к сверхгликозилированию, которое может оказывать влияние на активность гликозилированных белков млекопитающих.
Pichia pastoris представляют собой метилотрофные дрожжи, которые способны расти на метаноле в качестве единственного источника углерода и энергии, поскольку для такого микроорганизма характерен высокорегулируемый путь утилизации метанола (Ellis с сотр., 1985). P. pastoris также способны подвергаться эффективной технологии ферментации с высокой плотностью клеточной популяции. В связи с этим технология рекомбинантной ДНК и эффективные способы трансформации дрожжей позволили использовать P.pastoris в качестве хозяина для экспрессии гетерологического белка в большом количестве с помощью экспрессионной системы на основе метанолоксидазного промотора (Cregg с сотр. , 1987).
Применение Pichia pastoris в качестве хозяина для экспрессии известно из литературы, например, следующих гетерологических белков: фактора некроза человеческих опухолей (EP-A-0263311); пертактиновых антигенов Bordetella (WO 91/15571); поверхностного антигена вируса гепатита В (Cregg с сотр., 1987); человеческого лизоцимного белка (WO 92/04441); апротинина (WO 92/01048). Однако успешная экспрессия гетерологического белка в активной, растворимой и секретированной форме зависит от большого числа факторов, например правильного выбора сигнального пептида, надлежащего конструирования участка слияния между сигнальным пептидом и зрелым белком, условий роста и т.д.
Цель настоящего изобретения состоит в преодолении упомянутых выше недостатков известных систем и разработке способа получения человеческой BSSL, который являлся бы экономически выгодным и давал выходы продукта, сравнимые или превосходящие производительность процесса в других микроорганизмах. Эта цель была достигнута разработкой способов экспрессии BSSL в клетках Pachia pastoris.
Таким образом, с помощью настоящего изобретения было показано, что человеческая BSSL и вариантная BSSL-C могут экспрессироваться в активной форме, секретируемой из P. pastoris. Нативный сигнальный пептид, а также гетерологический сигнальный пептид, являющийся произведенным белка инвертазы S. cerevisiae, были использованы для транслокации зрелого белка в культуральную среду в активной, надлежащим образом процессированной форме.
В соответствии с первым аспектом изобретение предусматривает ДНК-молекулу, содержащую:
(a) область, кодирующую полипептид, представляющий собой человеческую BSSL или ее биологически активный вариант;
(b) присоединенный к 5'-концу области, кодирующей полипептид, участок, кодирующий сигнальный пептид, способный управлять секрецией указанного полипептида из клеток Pichia pastoris, трансформированных с помощью указанной ДНК-молекулы; и
(c) оперативно связанный с кодирующими областями, указанными в (a) и (b), метанолоксидазный промотор Pichia pastoris или функционально эквивалентный промотор.
(a) область, кодирующую полипептид, представляющий собой человеческую BSSL или ее биологически активный вариант;
(b) присоединенный к 5'-концу области, кодирующей полипептид, участок, кодирующий сигнальный пептид, способный управлять секрецией указанного полипептида из клеток Pichia pastoris, трансформированных с помощью указанной ДНК-молекулы; и
(c) оперативно связанный с кодирующими областями, указанными в (a) и (b), метанолоксидазный промотор Pichia pastoris или функционально эквивалентный промотор.
Под термином "биологически активный вариант" BSSL понимается полипептид, обладающий BSSL активностью и содержащий часть аминокислотной последовательности, представленной последовательностью SEQ ID N: 3 в Перечне последовательностей (Перечень последовательностей приведен в конце описания). Под термином "полипептид, обладающий BSSL активностью", в настоящем контексте понимается полипептид, обладающий следующими свойствами: (a) пригодностью для орального применения; (b) способностью активироваться специфическими солями желчи; и (c) способностью к действию в качестве неспецифической липазы в содержимом тонкого кишечника, т.е. способностью к гидролизу липидов независимо от их химической структуры и физического состояния (эмульгированного, мицеллярного, растворимого).
Указанный BSSL-вариант может представлять собой, например, вариант, содержащий менее 16 повторяющихся единиц, вследствие чего термин "повторяющаяся единица" понимается как повторяющаяся единица из 11 аминокислот, закодированных нуклеотидной последовательностью, обозначенной как "повторяющаяся единица" в разделе под заголовком "(IX) Отличительный признак" в "Информации для SEQ ID N: 1" в Перечне последовательностей. Главным образом BSSL-вариант может представлять собой вариант BSSL-C, в котором аминокислоты 536-568 и 591-711 подвергнуты делеции (SEQ ID N: 4 в Перечне последовательностей).
Следовательно, ДНК-молекула в соответствии с изобретением предпочтительно представляет собой молекулу ДНК, которая кодирует BSSL (SEQ ID N: 3) или BSSL-C (SEQ ID N: 4).
Однако ДНК-молекулы согласно настоящему изобретению не должны строго ограничиваться молекулами ДНК, кодирующими полипептиды с аминокислотными последовательностями, идентичными SEQ ID N: 3 или 4 в Перечне последовательностей. Наоборот, изобретение охватывает молекулы ДНК, кодирующие полипептиды, несущие такие модификации, как замены, небольшие делеции, инсерции или инверсии, причем такие полипептиды в значительной мере обладают биологическими активностями BSSL. Таким образом, настоящее изобретение включает молекулы ДНК, кодирующие BSSL-варианты, упомянутые выше, а также молекулы ДНМ, кодирующие полипептиды, аминокислотные последовательности которых по крайней мере на 90% гомологичны, предпочтительно по крайней мере на 95% гомологичны аминокислотной последовательности, представленной последовательностью SEQ ID N: 3 или 4 в Перечне последовательностей.
Сигнальный пептид, на который ссылались выше, может представлять собой пептид, идентичный или в значительной мере подобный пептиду с аминокислотной последовательностью, представленной как аминокислоты от -20 до -1 в SEQ ID N: 2 в Перечне последовательностей. С другой стороны, это может быть пептид, включающий сигнальный пептид инвертазы Saccharomyces cerevisiae.
В соответствии с другим аспектом изобретение предусматривает вектор, содержащий молекулу ДНК, упомянутую выше. Предпочтительно такой вектор представляет собой способный к репликации вектор экспрессии, который несет и способен управлять экспрессией в клетках вида Pichia ДНК-последовательности, кодирующей человеческую BSSL или ее биологически активный вариант. Такой вектор может представлять собой, например, плазмидный вектор pARC 5771 (NCIMB 40721), pARC 5799 (NCIMB 40723) или pARC 5797 (NCIMB 40722).
Согласно еще одному аспекту изобретение предусматривает культуру клеток-хозяев, содержащую клетки вида Pichia, трансформированные с помощью упомянутых выше молекулы ДНК или вектора. Предпочтительно клетки-хозяева представляют собой клетки Pichia pastoris такого штамма, как PPF-1 или GS115. В качестве указанных клеточных культур могут использоваться, например, культура PPF-1 [pARC 5771] (NCIMB 40721), GS115 [pARC 5799] (NCIMB 40723) или GS115 [pARC 5797] (NCIMB 40722).
В соответствии с еще одним аспектом изобретение предусматривает способ получения полипептида, представляющего собой человеческую BSSL или ее биологически активный вариант, заключающийся в культивировании клеток-хозяев согласно изобретению в условиях, при которых указанный полипептид секретируется в культурную среду, и выделении указанного полипептида из культурной среды.
ПРИМЕР 1: Экспрессия BSSL в Pichia pastoris PPF-1.
1.1. Конструкция pARC 0770.
Последовательность кДНК (SEQ ID N: 1), кодирующую BSSL-белок, включающий нативный сигнальный пептид (на который ниже ссылаются, как на NSP), клонировали в pTZl9R (Фармация) в виде фрагмента EcoRI-SacI. Клонирование кДНК NSP-BSSL в S.cerevisiae экспрессионный вектор pSCW 231 (полученный от профессора L. Prakash, Рочестерский университет, NY, США), представляющий собой вектор экспрессии дрожжей с низким числом копий, в котором экспрессия осуществляется под контролем конститутивного ADH1 промотора, проводили в две стадии. Вначале кДНК NSP-BSSL клонировали в pYES 2.0 (Инвитроген, США) в виде фрагмента EcoRI-SpbI из pTZ19R-SP-BSSL. Избыточные 89 пар оснований между EcoRI и NcoI в начале кодирующей последовательности сигнального пептида удаляли созданием слияния EcoRI/NcoI (89) и регенерацией EcoRI сайта. Полученный в результате клон pARC 0770 содержал ATG кодон, первоначально закодированный в NcoI сайте, за которым сразу же располагался регенерированный EcoRI сайт в рамке считывания информации с оставшейся NSP-BSSL последовательностью.
1.2. Конструкция pARC 5771 плазмиды.
Для конструирования подходящего экспрессионного вектора для экспрессии BSSL, кДНК фрагмент, кодирующий BSSL белок, совместно с его нативным сигнальным пептидом клонировали с экспрессионным вектором pDM 148 P.pastoris. Векторный pDM 148 (полученный от д-ра S. Subramani, UCSD) конструировали следующим образом: расположенную против хода транскрипции нетранслированную область (5'-UTR) и расположенную по ходу транскрипции нетранслированную область (3'-UTR) гена метанолоксидазы (MOX1) выделяли методом PCR и помещали тандемно в множественную клонирующую последовательность (MCS) вектора pSK+ E.coli (полученного от Стратаген, США).
Для надлежащего отбора предполагаемых трансформантов Р.pastoris ДНК последовательность, кодирующую ген ARG4 S.cerevisiae совместно с его собственной промоторной последовательностью, вставляли между 5'- и 3'-UTR в pSK-. Полученная в результате конструкция pDM 148 имела следующие отличительные признаки: в MCS области pSK- клонировали 5'-UTR МОХ, геномную последовательность ARG4 S.cerevisiae и 3'-UTR МОХ. Между 5'-UTR MOX и геномной последовательностью ARG4 располагали серии уникальных рестрикционных сайтов (SalI, ClaI, EcoRI, PstI, SmaI и BamHI) так, что кодирующая последовательность гетерологического белка может клонироваться для экспрессии под контролем MOX промотора в P.pastoris. Для облегчения интеграции такого полигенного экспрессирующего кластера в MOX1-локус в хромосоме Р.pastoris такой экспрессирующий полигенный кластер может быть отщеплен от оставшейся части pSK- вектора путем расщепления рестрикционным энзимом NotI.
5'-UTR MOX1 разновидности P. pastoris, клонированная в pDM 148, имела длину около 150 bp, тогда как 3'-UTR MOX1 из Р.pastoris, клонированная в pDM 148, имела длину около 1000 bp. Для инсерции NSP-BSSL кДНК-последовательности между 5'-UTR MOX1 и ARG4 кодирующей последовательностью S.cerevisiae в pDM 148, кДНК-вставку (SP-BSSL) выделяли из pARC 0770 путем расщепления EcoRI и BamHI (фрагмент ДНК размером примерно 2.2 kb) и клонировали между EcoRI и BamHI сайтами в pDM 148.
Полученная в результате конструкция pARG 5771 (NCIMB 40721) содержала 5'-UTR MOX1 P. pastoris с последующей NSP-BSSL кодирующей последовательностью, за которой следовала ARG4 генная последовательность S.cerevisiae и 3'-UTR MOX1 гена P.pastoris, тогда как ДНК сегмент от 5'-UTR MOX1 до 3'-UTR MOX1 клонировали в MCS pSK-.
1.3. Трансформация BSSL в P.pastoris PPF-1.
Для экспрессии BSSL в P.pastoris PPF-1 (his4, arg4; получено от Филлипс Петролеум Ко.) плазмиду pARC 5771 переваривали NotI и всю расщепленную смесь (10 мкг общей ДНК) использовали для трансформации PPF-1. Используемый протокол трансформации был практически таким же, как метод для дрожжевого сферопласта, описанный Cragg с сотр. (1987). Трансформанты регенерировали на минимальной среде с дефицитом аргинина так, чтобы можно было осуществлять селекцию Arg+ колоний. Регенерационный верхний агар, содержащий трансформанты, снимали и гомогенизировали в воде и дрожжевые клетки культивировали до образования примерно 250 колоний в расчете на пластину на минимальных глюкозных пластинах с дефицитом аргинина. Затем мутантные колонии идентифицировали методом реплик на минимальных метанольных пластинах. Примерно 15% от всего числа трансформантов образовывалось в виде Muts (медленный рост в метаноле) фенотипа.
1.4. Скрининг трансформантов у экспрессирующих BSSL.
С целью быстрого скрининга большого числа трансформантов на экспрессию липазы был разработан метод анализа липазы на платах. Использовали следующую методику для приготовления таких пластин: к раствору 2% агарозы (конечная концентрация) добавляли 10 х Na-холатный раствор в воде до конечной концентрации 1%. Липидный субстратный трибутин добавляли в смесь до конечной концентрации 1% (об./об.). Для поддержания роста трансформантов смесь дополняли 0.25% дрожжевого азотистого основания (конечное значение) и 0.5% метанола (конечная концентрация). Ингредиенты тщательно перемешивали и переливали на пластины до толщины 3-5 мм. Сразу после отвердевания смеси трансформанты полосками наносили на пластины и полученные пластины дополнительно инкубировали при +37oC в течение 12 часов. Липаза-продуцирующие клоны демонстрировали прозрачный гало вокруг клона. В типичном эксперименте 7 из 93 трансформантов идентифицировали, как BSSL продуцирующие трансформанты. Два клона (NN 39 и 86), продуцирующие самые крупные гало (ореолы) вокруг полоски колонии, отбирали для дальнейшей характеристики.
1.5. Экспрессия BSSL из PPF-1 [pARC 5771].
Два трансформанта NN 39 и 86, описанные в Разделе 1.4, отбирали и выращивали в BMGY жидкой среде (1% дрожжевого экстракта, 2% бактопептона, 1.34% дрожжевого азотистого основания без аминокислоты, 100 мМ KPO4 буфера, pH 6.0, 400 мкг/л биотина и 2% глицерина) в течение 24 часов при 30oC до достижения культурами значения A600, близкого к 40. Культуры осаждали и ресуспендировали в BMMY (2% глицерина, замененного 0.5% метанола в BMGY) среде при A600 = 300. Индуцированные культуры инкубировали при 30oC при встряхивании в течение 120 часов. Супернатанты культуры отбирали через различные промежутки времени для анализа на экспрессию BSSL путем осуществления анализа на активность энзима, SDS-PAGE анализа и вестерн-блоттинга.
1.6. Детекция ферментативной активности BSSL в культуральных супернатантах клонов NN 39 и 86.
Для определения ферментативной активности в бесклеточном культуральном супернатанте индуцированных культур NN 39 и 86, как описано в Разделе 1.5, культуры центрифугировали и 2 мкл бесклеточного супернатанта анализировали на BSSL-энзимную активность в соответствии со способом, описанным Hernell и Olivecrona (1974). Как показано в таблице, было установлено, что обе культуры содержат BSSL-энзимную активность при максимальном значении активности на 96 час после индукции.
1.7. Вестерн-блоттинг анализ культуральных супернатантов PPF-1: pARC 5771 трансформантов (NN 39 и 86).
Для определения наличия рекомбинантной BSSL в культуральных супернатантах NN 39 и 86 PPF-1 [pARC 5771] трансформантов, культуры выращивали и индуцировали, как описано в Разделе 1.5. Культуры отбирали через различные промежутки времени после индукции и подвергали Вестерн-блоттинг анализу с использованием анти-BSSL поликлонального антитела. Полученные результаты указывают на присутствие BSSL в культуральном супернатанте в виде полосы в 116 кДа.
ПРИМЕР 2: Экспрессия BSSL в Pichia pastoris GS115.
2.1. Конструкция pARC 5799.
Поскольку 5'-MOX UTR и 3'-MOX UTR не выражены надлежащим образом и поскольку в pDM 148 векторе отсутствует какой-либо другой подходящий маркер (например, G418 устойчивый ген) для мониторинга числа копий BSSL, интегрированных в Pichia хромосоме, кДНК вставку нативной BSSL совместно с ее сигнальным пептидом клонировали в другой P. pastoris экспрессионный вектор, pHIL D4. Интеграционную плазмиду pHIL D4 получали от Филлипс Петролеум Компани. Плазмида содержала 5'-MOX1, сегмент алкогольоксидазного промотора размером примерно 1000 bp и уникальный EcoRI - клонирующий сайт. Она также содержала примерно 250 bp 3'-MOX1 участка, содержащего терминационную последовательность алкогольоксидазы после EcoRI-сайта. Район "терминации" сопровождался гистидинолдегидрогеназным геном HIS4 P.pastoris, содержащимся на 2.8-kb фрагменте для комплементации дефектного HIS4 гена в хозяине GS115 (см. ниже). 650-bp участок, содержащий 3'-MOX1 ДНК, был слит с 3'-окончанием HIS4 гена, что совместно с 5'-MOX1 участком необходимо для сайт-направленной интеграции. Бактериальный канамицин-устойчивый ген из pUC-4K (PL-Биокэмикал) подвергали инсерции по уникальному NaeI-сайту между HIS4 и 3'-MOX1 участку на 3'-окончании HIS4 гена.
Для клонирования NSP-BSSL-кодирующего фрагмента кДНК по уникальному EcoRI сайту pHIL D4, двухнитевой олиголинкер с положением расщепления BamHI-EcoRI лигировали с BamHI переваренной плазмидой pARC 5771, и полную NSP-BSSL-кодирующую последовательность объединяли в виде EcoRI-фрагмента размером 2.2 kb. Этот фрагмент клонировали в EcoRI-сайт pHIL D4 и правильно ориентированную плазмиду обозначали как pARC 5799 (NCIMB 40723).
2.2. Трансформация pARC 5799.
Для облегчения интеграции NSP-BSSL кодирующей последовательности по геномному локусу MOX1 в P.pastoris плазмиду pARC 5799 переваривали BglII и использовали для трансформации P.pastoris штамма GS115(his4) (Филлипс Петролеум Компани) в соответствии с протоколом, описанным в Разделе 1.5. Однако в этом случае селекцию проводили на His прототрофность. Трансформанты отбирали после серийно разбавленного посева регенерированного верхнего агара и непосредственно тестировали анализом культивирования липазы, как описано в Разделе 1.4. Два трансформированных клона (NN 9 и 21) отбирали на основе размера ореола на пластинке для анализа липазы и дополнительно проверяли на экспрессию BSSL. Было установлено, что такие клоны являются Mut+.
2.3. Определение BSSL энзимной активности в культуральных супернатантах GS115[pARC 5799] трансформантов NN 9 и 21.
Два этих трансформированных клона NN 9 и 21 GS115[pARC 5799] выращивали практически полностью следуя протоколу, описанному в Разделе 1.5. Культуральные супернатанты в различные периоды времени после индукции анализировали на BSSL-энзимную активность в соответствии с описанным в Разделе 1.6. Как показано в таблице, было установлено, что оба культуральных супернатанта содержат BSSL-энзимную активность, причем наивысшая энзимная активность наблюдалась через 72 часа индукции. Оба клона демонстрировали улучшенную экспрессию BSSL по сравнению с клонами PPF-1[pARC 5771].
2.4. SDS-PAGE и Вестерн-блоттинг анализ культуральных супернатантов GS115 [pARC 5799] трансформантов NN 9 и 21.
Культуральные супернатанты, собранные в различные периоды времени, как описано в Разделе 2.3, подвергали анализу SDS-PAGE и Вестерн-блоттингу. Из SDS-PAGE профиля было оценено, что около 60-75% общего белка, присутствующего в культуральных супернатантах индуцированных культур, представляет собой BSSL. Молекулярный вес такого белка составил величину около 116 кДа. Данные Вестерн-блоттинга также подтвердили, что основная часть белка, присутствующего в культуральном супернатанте, представляет собой BSSL. Такой белок, по-видимому, имеет тот же молекулярный вес, что нативная BSSL.
ПРИМЕР 3: Масштабирование BSSL экспрессии.
3.1. Масштабирование экспрессии BSSL из трансформированного клона GS115 [pARC 5799] (N 21).
Использовали ферментер Б. Брауна емкостью 23 л. Пять литров среды, содержащей 1% YE, 2% Пептона, 1.34 YNB и 4% вес./об. глицерина обрабатывали в автоклаве при 121oC в течение 30 минут и биотин (400 мкг/л, конечная концентрация) добавляли в ходе инокуляции после фильтрационной стерилизации. В качестве прививочного материала глицериновую массу GS115 [pARC 5799] (N 21) инокулировали в синтетическую среду, содержащую YNB (67%) плюс 2% глицерина (150 мл), и выращивание проводили в течение 36 часов при +30oC. Применяли следующие условия ферментации: температура составляла +30oC; pH 5.0 поддерживали с использованием 3.5 N NH4OH и 2 N HCl; концентрация растворенного кислорода составляла 20-40% от насыщения воздуха; в качестве противопенного агента использовали полипропиленгликоль 2000.
За ходом роста следили через регулярные интервалы времени, определяя значение оптической плотности (OD) при длине волны 600 нм. Величина A600 достигала максимума, равного 50-60, за 24 часа. К этому моменту протекала фаза периодического роста, о чем свидетельствовали повышенные уровни растворенного кислорода.
Фаза роста сразу сопровождалась фазой индукции. В ходе этой фазы загружали метанол, содержащий 12 мл/л PTM1 солей. Скорость подачи метанола составляла 6 мкл/ч в ходе первых 10-12 часов, после чего скорость постепенно повышали каждые 7-8 часов на 6 мл/ч, до максимального значения 36 мл/ч. Аммиак, используемый для регулирования pH, выполнял функции источника азота. Накопление метанола проверяли каждые 6-8 часов путем зондирования растворенного кислорода, и было установлено, что такая аккумуляция является ограниченной в ходе всей фазы индукции. Значение OD при 600 нм увеличивалось от 50-60 до 150-170 в ходе 86 часов подачи метанола. Дрожжевой экстракт и пептон добавляли каждые 24 часа до получения конечной концентрации 0.25% и 0.5% соответственно.
Образцы отбирали через 24-часовые промежутки времени и анализировали на BSSL-энзимную активность в бесклеточном бульоне. Бульон также подвергали анализу SDS-PAGE и Вестерн-блоттингу.
3.2. Белковый анализ секретированной BSSL из выращенной в ферментере культуры GS115 [pARC 5799] (N 21).
BSSL-энзимная активность в бесклеточном бульоне повышалась от 40-70 мг/л (что эквивалентно для нативного белка) к 24 часу до максимального значения 200-227.0 мг/л (что эквивалентно нативному белку) к концу 86-90 часа. SDS-PAGE анализ бесклеточного бульона показал полосу интенсивного окрашивания Кумасс голубым с мол. вес. порядка 116 кДа. Идентичность такой полосы была подтверждена Вестерн-блоттингом, осуществленным, как описано в Разделе 1.7, для нативного BSSL.
3.3. Очистка рекомбинантной BSSL, секретированной в культуральный супернатант GS115 [pARC 5799] (N 21) клонов.
P. pastoris клон GS115 [pARC 5799] выращивали и индуцировали в ферментере, как описано в Разделе 3.1. Для очистки рекомбинантной BSSL 250 мл культурной среды (индуцированной к 90 часу) центрифугировали с силой 12.000 х г в течение 30 минут для удаления всего мелкозернистого материала. Бесклеточный культуральный супернатант ультрафильтровали в устройстве Амикон с использованием мембраны, отсекающей фракции 10 кДа. Соли и низкомолекулярные белки, а также пептиды культурального супернатанта удаляли повторным разбавлением в ходе фильтрации. Буфер, используемый для такого разбавления, представлял собой 5 мМ Барбитола при pH 7.4. После концентрирования культурального супернатанта ретентат доводили до объема 250 мл с использованием 5 мМ Барбитола, pH 7.4 и 50 мМ NaCl и загружали в Гепарин-Сефарозную колонку (объем слоя 15 мл), которую предварительно уравновешивали с помощью того же буфера. Загрузку образца осуществляли с объемной скоростью 10 мл/ч. После загрузки колонку промывали 5 мМ Барбитола, pH 7.4 и 0.1 M NaCl (200 мкл промывного буфера) до тех пор, пока поглощение при длине волны 250 нм не становилось ниже уровня детекции. BSSL элюировали 200 мл Барбитольного буфера (5 мМ, pH 7.4) и линейным градиентом NaCl в интервале 0.1 М - 0.7 М. Фракции (2.5 мл) собирали и анализировали на элюированный белок путем мониторинга поглощения при 250 нм. Фракции, содержащие белок, анализировали на BSSL-энзимную активность. Соответствующие фракции анализировали на 8.0% SDS-PAGE для проверки профиля очистки.
3.4. Характеристика очищенной рекомбинантной BSSL, секретированной в культуральный супернатант GS115 [pARC 5799].
SDS-PAGE и Вестерн-блоттинг анализы фракций (описанных в Разделе 3.3), проявляющих максимальную BSSL-энзимную) активность, продемонстрировали, что рекомбинантный белок имеет чистоту примерно 90%. В соответствии с данными SDS-PAGE и Вестерн-блоттинг анализов молекулярный вес очищенного белка имел величину около 116 кДа. При перегрузке образцов для SDS-PAGE анализа полоса, соответствующая низкомолекулярному белку, может быть детектирована окрашиванием красителем Кумасс Бриллиантовым голубым, которая не проявляется при Вестерн-блоттинге. Очищенный белок подвергали N-терминальному анализу в автоматизированном белковом секвенаторе. Полученные результаты показали, что белок соответствующим образом процессирован из нативного сигнального пептида и что рекомбинантный белок имеет N-терминальную последовательность A K L G A V Y. Удельная активность очищенного рекомбинантного белка, как было установлено, аналогична активности нативного белка. Сведения о ферментативной активности в культуральных супернатантах трансформантов Pichia pastoris приведены в таблице.
ПРИМЕР 4: Экспрессия BSSL-C в Pichia pastoris GS115.
4.1. Конструкция pARC 5797.
кДНК кодирующую последовательность для BSSL варианта BSSL-C сливали по ее 5'-окончанию с кодирующей последовательностью сигнального пептида S.cerevisiae SUC2 генного продукта (инвертаза), сохраняя целостность открытой рамки считывания, инициированной по первому ATG кодону сигнального пептида инвертазы. Такую слитую генную конструкцию вначале клонировали в S.cerevisiae экспрессионный вектор pSCW 231 (pSCW 231 представляет собой вектор экспрессии дрожжей с низким числом копий, и экспрессия осуществляется под контролем конститутивного ADH1 промотора) между свитами EcoRI и BamHI с целью создания экспрессионного вектора pARC 0788.
кДНК слитого гена дополнительно субклонировали в P.pastoris экспрессионный вектор pDM 148 (описанный в разделе 1.2) путем высвобождения соответствующего 1.8-kb фрагмента с помощью EcoRI и BamHI переваривания pARC 0788 и субклонирования фрагмента в pDM 148 переваренную с EcoRI и BamHI. Сконструированный в результате pARC 5790 переваривали с BamHI и двухнитевой олигонуклеотидный линкер физической структуры BamHI-EcoRI-BamHI подвергали лигированию для создания сконструированной pARC 5796, главным образом, для выделения кДНК фрагмента слитого гена, следуя при этом стратегии, описанной в Разделе 2.1.
Наконец, 1.8-kb фрагмент, содержащий систему сигнальный пептид инвертазы/BSSL-C слитый ген, высвобождали из pARC 5796 путем EcoRI переваривания и клонировали в pHIL D4 по EcoRI сайту. В результате соответствующего рестрикционного анализа был идентифицирован вектор экспрессии, содержащий вставку в надлежащей ориентации, и он был обозначен как pARC 5797 (NCIMB 40722).
4.2. Экспрессия рекомбинантной BSSL-C из P.pastoris.
Для экспрессии рекомбинантной BSSL-C из P.pastoris Р. pastoris хозяин GS115 трансформировали с pARC 5797 по способу, описанному в Разделах 1.3 и 2.2. Трансформанты проверяли на продуцирование липазы по способу, описанному в Разделах 1.4 и 2.2. Единственный трансформант (N 3) отбирали на основе высокой липаза-продуцирующей способности с помощью метода детекции при анализе липазных пластин и дополнительно анализировали на продуцирование BSSL-энзимной активности в культуральном супернатанте, следуя, по существу, способу, описанному в разделах 1.6 и 2.3. Как следует из данных, представленных в таблице, культуральный супернатант GS115 [pARC 5797] (N 3) содержал BSSL-энзимную активность, и ее количество прогрессивно увеличивалось вплоть до 72 часа после индукции.
4.3. SDS-PAGE и Вестерн-блоттинг анализы культурального супернатанта GS115 [pARC 5797] трансформанта (N 3).
Культуральный супернатант, собранный в различные периоды времени, как описано в Разделе 4.2, подвергали SDS-PAGE и Вестерн-блоттинг анализам в соответствии с описанным в разделах 1.7 и 2.4. Из SDS-PAGE профиля было установлено, что примерно 75-80% общего количества внеклеточного белка представляет собой BSSL. В соответствии с данными SDS-PAGE анализа молекулярный вес белка составил примерно 66 кДа. При Вестерн-блоттинге было обнаружено, что лишь две полосы (дублет) в области 66 кДа являются иммунореактивными, и эти данные подтверждают экспрессию рекомбинантной BSSL-C.
СРАВНИТЕЛЬНЫЙ ПРИМЕР: Экспрессия BSSL в S.cerevisiae.
Были предприняты попытки экспрессии BSSL в Saccharomyces cerevisiae. BSSL плохо секретировалась в S. cerevisiae, и нативный сигнальный пептид функционировал неэффективно. Кроме этого, нативный сигнальный пептид не отщеплялся от зрелого белка в S.cerevisiae.
Депонирование микроорганизмов.
Следующие плазмиды, трансформированные в Pichia pastoris культуры, были депонированы в соответствии с Будапештским договором в Национальных коллекциях Промышленных и морских бактерий (NCIMB), Абердин, Шотландия, Великобритания. Дата депонирования - 2 мая 1995 г.
Штамм [плазмида] - N по NCIMB
PPF-1[pARC 5771] - 40721
GS115[pARC 5799] - 40723
GS115[pARC 5797] - 40722
Список литературы
Abouakil, N., Rogalska, E., Bonicel, J. and Lombardo, D. (1988) Biochim. Biophys. Acta. 961, 299-308.
PPF-1[pARC 5771] - 40721
GS115[pARC 5799] - 40723
GS115[pARC 5797] - 40722
Список литературы
Abouakil, N., Rogalska, E., Bonicel, J. and Lombardo, D. (1988) Biochim. Biophys. Acta. 961, 299-308.
Baba, Т., Downs, D., Jackson, K.W., Tang, J. and Wang, C-S (1991) Biochemistry 30, 500-510.
Bläckberg, L. and Hernell, O. (1981) Eur. J. Biochem. 116, 221-225.
Bläckberg,L.,Ängquist, K.A. and Hernell, O. (1987) FEBS Lett. 217, 37-41.
Cregg, J.M. et al. (1987) Bio/Technology 5, 479-485.
Ellis, S.B. et al. (1985) Mol. CelL Biol 5, 1111-1121.
Fredrikzon, В. , Hernell, О., Bläckberg, L. and Olivecrona, T. (1978) Pediatric Res. 12, 1048-1052.
Hansson, L., Bläckberg, L., Edlund, M., Lundberg, L., Strömqvist, M. and Hernell, O. (1993) J. Biol. Chem. 268, 26692-26698.
Hernell, O. and Olivecrona, T. (1974) Biochim. Biophys. Acta 369, 234-244.
Hernell, O. , Bläckberg, L. and Olivecrona, T. (1989) in: Textbook of gastroenterology and nutrition in infancy (Lebenthal, E., ed.) 347-354, Raven Press, NY.
Hernell, O. and Bläckberg, L. (1982) Pediatric Res. 16, 882-885.
Hui, D. Y. and Kissel, J. A. (1990) FEBS Letters 276, 131-134.
Kingsman, et al. (1985) Biotechnology and Genetic Engineering Reviews 3, 377-416.
Nilsson, J., Bläckberg, L., Carlsson, P., Enerbäck, S., Hernell, O. and Bjursell, G. (1990) Eur. J. Biochem. 192, 543-550.
Reue, К. , Zambaux, J., Wong, H., Lee, G., Leete, T.H., Ronk, M., Shively, J. E., Sternby, B., Borgström, B., Ameis, D. and Scholtz, M.C. (1991) J. Lipid. Res. 32, 267-276.
Wang, C-S, and Hartsuck, J.A. (1993) Biochim. Biphys Acta 1166, 1-19.
Claims (8)
1. Молекула ДНК, содержащая: (а) область, кодирующую полипептид, который представляет собой BSSL человека, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO : 3, или его биологически активный вариант, в котором: аминокислоты 536-568 и 591-711 могут быть делетированы, как представлено в SEQ ID NO : 4, или по крайней мере одна из повторяющихся единиц из 11 аминокислот, указанная в SEQ ID NO : 1, соответствующая аминокислотам 679-689, 690-700 и 701-711 в SEQ ID NO : 3, делетирована, при том, что указанная аминокислотная последовательность может быть по крайней мере на 95% гомологична последовательности, соответствующей SEQ ID NO : 3 или SEQ ID NO : 4; (b) присоединенный к 5'-окончанию указанной области, кодирующей полипептид, участок, кодирующий сигнальный пептид, который идентичен или в значительной мере подобен пептиду с аминокислотной последовательностью, показанной аминокислотами от -20 до -1 в последовательности SEQ ID NO : 2 в Перечне последовательностей, способный управлять секрецией полипептида из клеток Pichia pastoris, трансформированных указанной молекулой ДНК, или указанный сигнальный пептид может содержать сигнальный пептид инвертазы Saccharomyces cerevisiae; и (с) операбельно связанный с указанными кодирующими областями, определенными в (а) и (b),
промотор метанолоксидазы Pichia pastoris или функционально эквивалентный промотор.
промотор метанолоксидазы Pichia pastoris или функционально эквивалентный промотор.
2. Плазмидный вектор pARC 5771 (NCIMB 40721), содержащий молекулу ДНК по п.1.
3. Плазмидный вектор по п.2, трансформированный в штамм PPF-1 (NCIMB 40721) Pichia pastoris.
4. Плазмидный вектор pARC 5799 (NCIMB 40723), содержащий молекулу ДНК по п.1.
5. Плазмидный вектор по п.4, трансформированный в штамм GS115 (NCIMB 40723) Pichia pastoris.
6. Плазмидный вектор pARC 5797 (NCIMB 40722), содержащий молекулу ДНК по п.1.
7. Плазмидный вектор по п.6, трансформированный в штамм GS115 (NCIMB 40722) Pichia pastoris.
8. Способ получения полипептида, представляющего собой BSSL человека или его биологически активный вариант, который заключается в культивировании клеток-хозяев, трансформированных плазмидой, включающей молекулу ДНК по п.1, в условиях, когда указанный полипептид секретируется в культуральную среду, и выделении указанного полипептида из культуральной среды.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| IN351/MAS/95 | 1995-03-23 | ||
| SE9501939A SE9501939D0 (sv) | 1995-05-24 | 1995-05-24 | DNA molecules for expression of polypeptides |
| SE9501939-4 | 1995-06-24 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU97117367A RU97117367A (ru) | 1999-07-10 |
| RU2157847C2 true RU2157847C2 (ru) | 2000-10-20 |
Family
ID=20398427
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU97117367/13A RU2157847C2 (ru) | 1995-05-24 | 1996-03-12 | Молекула днк для экспрессии, стимулируемой солями желчи липазы (bssl) |
Country Status (15)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0832257A1 (ru) |
| JP (1) | JP2000510683A (ru) |
| KR (1) | KR19980703238A (ru) |
| CN (1) | CN1185812A (ru) |
| AU (1) | AU5165696A (ru) |
| CZ (1) | CZ297397A3 (ru) |
| EE (1) | EE9700321A (ru) |
| HU (1) | HUP9802388A3 (ru) |
| IL (1) | IL118335A0 (ru) |
| PL (1) | PL322848A1 (ru) |
| RU (1) | RU2157847C2 (ru) |
| SE (1) | SE9501939D0 (ru) |
| TR (1) | TR199701010T1 (ru) |
| TW (1) | TW434314B (ru) |
| WO (1) | WO1996037622A1 (ru) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2697218C1 (ru) * | 2018-07-11 | 2019-08-13 | федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Московский физико-технический институт (национальный исследовательский университет)" | Использование сигнальных пептидов митохондриальной локализации для увеличения уровня гетерологической экспрессии белков в P.pastoris и S.cerevisiae |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2001081368A2 (en) * | 2000-04-21 | 2001-11-01 | Monsanto Technology Llc | Blood-pressure reducing polypeptides containing vpp derived from microorganisms |
| KR100717353B1 (ko) * | 2006-04-12 | 2007-05-11 | 한국생명공학연구원 | 피키아 파스토리스 유래의 자동 유도성 ｎｐｓ 프로모터 및이를 이용한 이종 단백질의 제조방법 |
| CN103952386A (zh) * | 2014-03-31 | 2014-07-30 | 四川农业大学 | 利用毕赤酵母高效分泌表达重组猪胰腺脂肪酶ppl的方法 |
| AU2020315684A1 (en) * | 2019-07-12 | 2021-12-16 | Lipum Ab | Novel BSSL antibodies |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0443063A1 (en) * | 1990-02-22 | 1991-08-28 | Henkel Research Corporation | Pseudomonas lipase gene, vectors for the expression thereof, production of the lipase by transformed microorganisms and uses of this enzyme |
| DE4111321A1 (de) * | 1990-04-14 | 1991-10-17 | Kali Chemie Ag | Alkalische bacillus-lipasen, hierfuer codierende dna-sequenzen sowie bacilli, die diese lipasen produzieren |
| US5200183A (en) * | 1987-11-19 | 1993-04-06 | Oklahoma Medical Research Foundation | Recombinant bile salt activated lipases |
| US5306636A (en) * | 1990-10-31 | 1994-04-26 | Kurita Water Industries Ltd. | Gene, vector and transformant for thermostable lipase and preparation of them and thermostable lipase |
| RU2060275C1 (ru) * | 1988-09-26 | 1996-05-20 | Лябофина С.А. | Способ получения человеческого лизоцима |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH05184352A (ja) * | 1990-01-16 | 1993-07-27 | Centro De Ing Genetica Y Biotecnol | ピヒア パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）酵母中での異種遺伝子の発現方法、発現ベクターおよび形質転換微生物 |
| IS4130A (is) * | 1993-03-01 | 1994-09-02 | Ab Astra | Ný fjölpeptíð |
-
1995
- 1995-05-24 SE SE9501939A patent/SE9501939D0/xx unknown
-
1996
- 1996-03-12 EE EE9700321A patent/EE9700321A/xx unknown
- 1996-03-12 WO PCT/SE1996/000318 patent/WO1996037622A1/en not_active Ceased
- 1996-03-12 TR TR97/01010T patent/TR199701010T1/xx unknown
- 1996-03-12 JP JP08535592A patent/JP2000510683A/ja not_active Abandoned
- 1996-03-12 PL PL96322848A patent/PL322848A1/xx unknown
- 1996-03-12 CN CN96194083A patent/CN1185812A/zh active Pending
- 1996-03-12 HU HU9802388A patent/HUP9802388A3/hu unknown
- 1996-03-12 EP EP96908415A patent/EP0832257A1/en not_active Withdrawn
- 1996-03-12 CZ CZ972973A patent/CZ297397A3/cs unknown
- 1996-03-12 AU AU51656/96A patent/AU5165696A/en not_active Abandoned
- 1996-03-12 KR KR1019970706642A patent/KR19980703238A/ko not_active Ceased
- 1996-03-12 RU RU97117367/13A patent/RU2157847C2/ru not_active IP Right Cessation
- 1996-04-10 TW TW085104253A patent/TW434314B/zh active
- 1996-05-20 IL IL11833596A patent/IL118335A0/xx unknown
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5200183A (en) * | 1987-11-19 | 1993-04-06 | Oklahoma Medical Research Foundation | Recombinant bile salt activated lipases |
| RU2060275C1 (ru) * | 1988-09-26 | 1996-05-20 | Лябофина С.А. | Способ получения человеческого лизоцима |
| EP0443063A1 (en) * | 1990-02-22 | 1991-08-28 | Henkel Research Corporation | Pseudomonas lipase gene, vectors for the expression thereof, production of the lipase by transformed microorganisms and uses of this enzyme |
| DE4111321A1 (de) * | 1990-04-14 | 1991-10-17 | Kali Chemie Ag | Alkalische bacillus-lipasen, hierfuer codierende dna-sequenzen sowie bacilli, die diese lipasen produzieren |
| US5306636A (en) * | 1990-10-31 | 1994-04-26 | Kurita Water Industries Ltd. | Gene, vector and transformant for thermostable lipase and preparation of them and thermostable lipase |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2697218C1 (ru) * | 2018-07-11 | 2019-08-13 | федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Московский физико-технический институт (национальный исследовательский университет)" | Использование сигнальных пептидов митохондриальной локализации для увеличения уровня гетерологической экспрессии белков в P.pastoris и S.cerevisiae |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| PL322848A1 (en) | 1998-02-16 |
| JP2000510683A (ja) | 2000-08-22 |
| HUP9802388A2 (hu) | 1999-02-01 |
| TW434314B (en) | 2001-05-16 |
| HUP9802388A3 (en) | 2000-10-30 |
| SE9501939D0 (sv) | 1995-05-24 |
| AU5165696A (en) | 1996-12-11 |
| KR19980703238A (ko) | 1998-10-15 |
| WO1996037622A1 (en) | 1996-11-28 |
| IL118335A0 (en) | 1996-09-12 |
| CZ297397A3 (cs) | 1998-03-18 |
| EP0832257A1 (en) | 1998-04-01 |
| TR199701010T1 (xx) | 1998-01-21 |
| EE9700321A (et) | 1998-06-15 |
| CN1185812A (zh) | 1998-06-24 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP0301670B2 (en) | Kluyveromyces as a host strain | |
| Christensen et al. | High level expression of recombinant genes in Aspergillus oryzae | |
| US6602682B1 (en) | Kluyveromyces as a host strain | |
| KR0184693B1 (ko) | 재조합 사람 락토페린 생산방법 | |
| KR0181179B1 (ko) | 피치아 파스토리스 산성 인산효소 유전자의 디앤에이 단편 및 이를 사용하는 방법 | |
| US20020132335A1 (en) | System for expressing hyperthermostable protein | |
| JPWO2001088143A1 (ja) | 酸性糖鎖減少蛋白質の製造方法および該製造された糖蛋白質 | |
| JPH04501662A (ja) | 混合給送組換え酵母発酵 | |
| HK1053145B (zh) | 一种来自yarrowia lypolytica的抗酸性细胞外脂酶的克隆和表达 | |
| US5705358A (en) | Process for producing/secreting a protein by a transformed mould using expression/secretion regulating regions derived from a aspergillus endoxylanase II gene | |
| CN100432099C (zh) | 转录因子 | |
| WO1991013971A1 (en) | Neurospora expression system | |
| RU2157847C2 (ru) | Молекула днк для экспрессии, стимулируемой солями желчи липазы (bssl) | |
| US5516679A (en) | Penicillin V amidohydrolase gene from Fusarium oxysporum | |
| Rodriguez et al. | Invertase secretion in Hansenula polymorpha under the AOX1 promoter from Pichia pastoris | |
| EP0362183A2 (en) | Process for the production of human lysozyme | |
| Phongdara et al. | Cloning and characterization of the gene encoding a repressible acid phosphatase (PHO1) from the methylotrophic yeast Hansenula polymorpha | |
| US4757020A (en) | Novel expression plasmids containing the full cDNA sequence of calf prochymosin | |
| US6025159A (en) | D-amino acid oxidase promoter from T. variabilis | |
| US20030040040A1 (en) | Dna molecules for expression of bile salt-stimulated lipase | |
| JPH06503718A (ja) | メチロトローフ酵母細胞におけるヒトリゾチムの産生とその効率的な分泌 | |
| MXPA97006853A (en) | A dna molecule for expression of bile salt-stimulated lipase (bssl) | |
| JPH09505989A (ja) | 菌類からのα‐１，４‐グルカンリアーゼ、その精製、遺伝子クローニングおよび微生物での発現 | |
| JP3383341B2 (ja) | 糸状菌および酵母で使用可能なポリペプチド発現用プラスミドおよびそれを用いたポリペプチドの製造法 | |
| JPH08228779A (ja) | 組換え胆汁酸塩活性化リパーゼの高収率発現方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20050313 |