RU2681651C1 - Способ дифференциальной диагностики острых лейкозов с помощью клеточного биочипа - Google Patents
Способ дифференциальной диагностики острых лейкозов с помощью клеточного биочипа Download PDFInfo
- Publication number
- RU2681651C1 RU2681651C1 RU2017144192A RU2017144192A RU2681651C1 RU 2681651 C1 RU2681651 C1 RU 2681651C1 RU 2017144192 A RU2017144192 A RU 2017144192A RU 2017144192 A RU2017144192 A RU 2017144192A RU 2681651 C1 RU2681651 C1 RU 2681651C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- cells
- biochip
- score
- diagnosis
- leukemia
- Prior art date
Links
- 238000000018 DNA microarray Methods 0.000 title claims abstract description 87
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 53
- 206010000830 Acute leukaemia Diseases 0.000 title claims abstract description 50
- 238000003748 differential diagnosis Methods 0.000 title claims abstract description 7
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 title 1
- 210000003969 blast cell Anatomy 0.000 claims abstract description 68
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 68
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 claims abstract description 53
- 208000031261 Acute myeloid leukaemia Diseases 0.000 claims abstract description 43
- 208000033776 Myeloid Acute Leukemia Diseases 0.000 claims abstract description 42
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims abstract description 28
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims abstract description 27
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims abstract description 27
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 claims abstract description 27
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims abstract description 17
- 208000006664 Precursor Cell Lymphoblastic Leukemia-Lymphoma Diseases 0.000 claims abstract description 16
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims abstract description 16
- 208000003747 lymphoid leukemia Diseases 0.000 claims abstract description 15
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 claims abstract description 13
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 claims abstract description 13
- 208000009052 Precursor T-Cell Lymphoblastic Leukemia-Lymphoma Diseases 0.000 claims abstract description 11
- 208000017414 Precursor T-cell acute lymphoblastic leukemia Diseases 0.000 claims abstract description 11
- 208000029052 T-cell acute lymphoblastic leukemia Diseases 0.000 claims abstract description 11
- 230000000093 cytochemical effect Effects 0.000 claims abstract description 9
- 102100024222 B-lymphocyte antigen CD19 Human genes 0.000 claims abstract description 8
- 101000980825 Homo sapiens B-lymphocyte antigen CD19 Proteins 0.000 claims abstract description 8
- 101001078143 Homo sapiens Integrin alpha-IIb Proteins 0.000 claims abstract description 7
- 101001015004 Homo sapiens Integrin beta-3 Proteins 0.000 claims abstract description 7
- 102100025306 Integrin alpha-IIb Human genes 0.000 claims abstract description 7
- 102100032999 Integrin beta-3 Human genes 0.000 claims abstract description 7
- 102100026122 High affinity immunoglobulin gamma Fc receptor I Human genes 0.000 claims abstract description 6
- 101000913074 Homo sapiens High affinity immunoglobulin gamma Fc receptor I Proteins 0.000 claims abstract description 6
- 101001046686 Homo sapiens Integrin alpha-M Proteins 0.000 claims abstract description 6
- 101000934338 Homo sapiens Myeloid cell surface antigen CD33 Proteins 0.000 claims abstract description 6
- 102100022338 Integrin alpha-M Human genes 0.000 claims abstract description 6
- 102100025243 Myeloid cell surface antigen CD33 Human genes 0.000 claims abstract description 6
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 claims abstract description 6
- 102100035248 Alpha-(1,3)-fucosyltransferase 4 Human genes 0.000 claims abstract description 5
- 102100038080 B-cell receptor CD22 Human genes 0.000 claims abstract description 5
- 101001022185 Homo sapiens Alpha-(1,3)-fucosyltransferase 4 Proteins 0.000 claims abstract description 5
- 101000884305 Homo sapiens B-cell receptor CD22 Proteins 0.000 claims abstract description 5
- 101001008874 Homo sapiens Mast/stem cell growth factor receptor Kit Proteins 0.000 claims abstract description 5
- 101000946889 Homo sapiens Monocyte differentiation antigen CD14 Proteins 0.000 claims abstract description 5
- 102100027754 Mast/stem cell growth factor receptor Kit Human genes 0.000 claims abstract description 5
- 102100035877 Monocyte differentiation antigen CD14 Human genes 0.000 claims abstract description 5
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 claims abstract description 3
- 102000003729 Neprilysin Human genes 0.000 claims abstract 6
- 108090000028 Neprilysin Proteins 0.000 claims abstract 6
- 102100022749 Aminopeptidase N Human genes 0.000 claims abstract 3
- 101000757160 Homo sapiens Aminopeptidase N Proteins 0.000 claims abstract 3
- 238000011206 morphological examination Methods 0.000 claims abstract 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 claims description 15
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 claims description 15
- 108010076527 naphthylbutyrate esterase Proteins 0.000 claims description 12
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 9
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 9
- 208000036762 Acute promyelocytic leukaemia Diseases 0.000 claims description 7
- 108010052989 Naphthol AS D Esterase Proteins 0.000 claims description 7
- 208000033826 Promyelocytic Acute Leukemia Diseases 0.000 claims description 7
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 7
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 claims description 6
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 claims description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 5
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 claims description 5
- 208000035330 Acute monoblastic/monocytic leukemia Diseases 0.000 claims description 4
- 206010000871 Acute monocytic leukaemia Diseases 0.000 claims description 4
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 claims description 4
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 claims description 4
- 101000738771 Homo sapiens Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Proteins 0.000 claims description 4
- 102100037422 Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Human genes 0.000 claims description 4
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 claims description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims description 4
- 102100031585 ADP-ribosyl cyclase/cyclic ADP-ribose hydrolase 1 Human genes 0.000 claims description 3
- 101000777636 Homo sapiens ADP-ribosyl cyclase/cyclic ADP-ribose hydrolase 1 Proteins 0.000 claims description 3
- 102100022297 Integrin alpha-X Human genes 0.000 claims description 3
- 102100036011 T-cell surface glycoprotein CD4 Human genes 0.000 claims description 3
- 102100034922 T-cell surface glycoprotein CD8 alpha chain Human genes 0.000 claims description 3
- 208000026784 acute myeloblastic leukemia with maturation Diseases 0.000 claims description 3
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical group O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 210000004765 promyelocyte Anatomy 0.000 claims description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 3
- 102100022005 B-lymphocyte antigen CD20 Human genes 0.000 claims description 2
- 102100027207 CD27 antigen Human genes 0.000 claims description 2
- 102000006354 HLA-DR Antigens Human genes 0.000 claims description 2
- 108010058597 HLA-DR Antigens Proteins 0.000 claims description 2
- 102100031573 Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Human genes 0.000 claims description 2
- 101000897405 Homo sapiens B-lymphocyte antigen CD20 Proteins 0.000 claims description 2
- 101000914511 Homo sapiens CD27 antigen Proteins 0.000 claims description 2
- 101000777663 Homo sapiens Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Proteins 0.000 claims description 2
- 101001046687 Homo sapiens Integrin alpha-E Proteins 0.000 claims description 2
- 101001057504 Homo sapiens Interferon-stimulated gene 20 kDa protein Proteins 0.000 claims description 2
- 101001055144 Homo sapiens Interleukin-2 receptor subunit alpha Proteins 0.000 claims description 2
- 101000998120 Homo sapiens Interleukin-3 receptor subunit alpha Proteins 0.000 claims description 2
- 101000608935 Homo sapiens Leukosialin Proteins 0.000 claims description 2
- 101000878605 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin epsilon Fc receptor Proteins 0.000 claims description 2
- 101000917858 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-A Proteins 0.000 claims description 2
- 101000917839 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-B Proteins 0.000 claims description 2
- 101000581981 Homo sapiens Neural cell adhesion molecule 1 Proteins 0.000 claims description 2
- 101001098352 Homo sapiens OX-2 membrane glycoprotein Proteins 0.000 claims description 2
- 101000610551 Homo sapiens Prominin-1 Proteins 0.000 claims description 2
- 101000914514 Homo sapiens T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Proteins 0.000 claims description 2
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 claims description 2
- -1 IgM Proteins 0.000 claims description 2
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 claims description 2
- 108010004020 Immunoglobulin lambda-Chains Proteins 0.000 claims description 2
- 102100022341 Integrin alpha-E Human genes 0.000 claims description 2
- 102100027268 Interferon-stimulated gene 20 kDa protein Human genes 0.000 claims description 2
- 102100033493 Interleukin-3 receptor subunit alpha Human genes 0.000 claims description 2
- 102100039564 Leukosialin Human genes 0.000 claims description 2
- 102100038007 Low affinity immunoglobulin epsilon Fc receptor Human genes 0.000 claims description 2
- 102100029185 Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-B Human genes 0.000 claims description 2
- 102100027347 Neural cell adhesion molecule 1 Human genes 0.000 claims description 2
- 102100037589 OX-2 membrane glycoprotein Human genes 0.000 claims description 2
- 102100027213 T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Human genes 0.000 claims description 2
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 claims description 2
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 claims description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 claims description 2
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 claims description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 claims description 2
- 102000017420 CD3 protein, epsilon/gamma/delta subunit Human genes 0.000 claims 1
- 108010090227 Immunoglobulin kappa-Chains Proteins 0.000 claims 1
- 102100027208 T-cell antigen CD7 Human genes 0.000 claims 1
- 102100025237 T-cell surface antigen CD2 Human genes 0.000 claims 1
- 102100025244 T-cell surface glycoprotein CD5 Human genes 0.000 claims 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 6
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 abstract description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 abstract description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 21
- 208000025321 B-lymphoblastic leukemia/lymphoma Diseases 0.000 description 15
- 208000017426 precursor B-cell acute lymphoblastic leukemia Diseases 0.000 description 15
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 14
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 14
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 10
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 10
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 10
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 8
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 8
- 108010051152 Carboxylesterase Proteins 0.000 description 6
- 102000013392 Carboxylesterase Human genes 0.000 description 6
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 6
- 238000013394 immunophenotyping Methods 0.000 description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 208000032791 BCR-ABL1 positive chronic myelogenous leukemia Diseases 0.000 description 5
- 208000010833 Chronic myeloid leukaemia Diseases 0.000 description 5
- 208000013593 acute megakaryoblastic leukemia Diseases 0.000 description 5
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 5
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 5
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 5
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 5
- 208000033761 Myelogenous Chronic BCR-ABL Positive Leukemia Diseases 0.000 description 4
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 4
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 4
- 238000004163 cytometry Methods 0.000 description 4
- 239000012224 working solution Substances 0.000 description 4
- 201000003793 Myelodysplastic syndrome Diseases 0.000 description 3
- 102000003896 Myeloperoxidases Human genes 0.000 description 3
- 108090000235 Myeloperoxidases Proteins 0.000 description 3
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N acetone Substances CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 3
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 3
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 3
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 3
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 description 3
- GZCWLCBFPRFLKL-UHFFFAOYSA-N 1-prop-2-ynoxypropan-2-ol Chemical compound CC(O)COCC#C GZCWLCBFPRFLKL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010051457 Acid Phosphatase Proteins 0.000 description 2
- 102000013563 Acid Phosphatase Human genes 0.000 description 2
- 208000024893 Acute lymphoblastic leukemia Diseases 0.000 description 2
- 208000014697 Acute lymphocytic leukaemia Diseases 0.000 description 2
- 208000010581 Acute myeloid leukemia with minimal differentiation Diseases 0.000 description 2
- 108010077544 Chromatin Proteins 0.000 description 2
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 2
- YCUVUDODLRLVIC-UHFFFAOYSA-N Sudan black B Chemical compound C1=CC(=C23)NC(C)(C)NC2=CC=CC3=C1N=NC(C1=CC=CC=C11)=CC=C1N=NC1=CC=CC=C1 YCUVUDODLRLVIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FMVKYSCWHDVMGO-UHFFFAOYSA-N [3-[(2-methylphenyl)carbamoyl]naphthalen-2-yl] 2-chloroacetate Chemical compound CC1=CC=CC=C1NC(=O)C1=CC2=CC=CC=C2C=C1OC(=O)CCl FMVKYSCWHDVMGO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000000149 argon plasma sintering Methods 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 2
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 2
- 210000003483 chromatin Anatomy 0.000 description 2
- 208000024207 chronic leukemia Diseases 0.000 description 2
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 2
- 239000002360 explosive Substances 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 2
- 230000003394 haemopoietic effect Effects 0.000 description 2
- 210000003563 lymphoid tissue Anatomy 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 2
- XIVJNRXPRQKFRZ-UHFFFAOYSA-N naphthalen-1-yl butanoate Chemical compound C1=CC=C2C(OC(=O)CCC)=CC=CC2=C1 XIVJNRXPRQKFRZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 230000007480 spreading Effects 0.000 description 2
- 238000003892 spreading Methods 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- KJCVRFUGPWSIIH-UHFFFAOYSA-N 1-naphthol Chemical compound C1=CC=C2C(O)=CC=CC2=C1 KJCVRFUGPWSIIH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010013043 Acetylesterase Proteins 0.000 description 1
- 208000006888 Agnosia Diseases 0.000 description 1
- 241001047040 Agnosia Species 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108090000371 Esterases Proteins 0.000 description 1
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 description 1
- 229920002527 Glycogen Polymers 0.000 description 1
- 208000030289 Lymphoproliferative disease Diseases 0.000 description 1
- 208000035489 Monocytic Acute Leukemia Diseases 0.000 description 1
- 208000037538 Myelomonocytic Juvenile Leukemia Diseases 0.000 description 1
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 229920012485 Plasticized Polyvinyl chloride Polymers 0.000 description 1
- RVGRUAULSDPKGF-UHFFFAOYSA-N Poloxamer Chemical compound C1CO1.CC1CO1 RVGRUAULSDPKGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- 108010014608 Proto-Oncogene Proteins c-kit Proteins 0.000 description 1
- 102000016971 Proto-Oncogene Proteins c-kit Human genes 0.000 description 1
- 239000002262 Schiff base Substances 0.000 description 1
- 150000004753 Schiff bases Chemical class 0.000 description 1
- 230000001594 aberrant effect Effects 0.000 description 1
- 208000010816 acute myeloblastic leukemia without maturation Diseases 0.000 description 1
- 208000036676 acute undifferentiated leukemia Diseases 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 108010054191 butyrylesterase Proteins 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 239000011545 carbonate/bicarbonate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 108010004215 chloroacetate esterase Proteins 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 1
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002274 desiccant Substances 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 239000000834 fixative Substances 0.000 description 1
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 1
- 229960003180 glutathione Drugs 0.000 description 1
- 229940096919 glycogen Drugs 0.000 description 1
- QFWPJPIVLCBXFJ-UHFFFAOYSA-N glymidine Chemical compound N1=CC(OCCOC)=CN=C1NS(=O)(=O)C1=CC=CC=C1 QFWPJPIVLCBXFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 1
- 210000003714 granulocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 208000014951 hematologic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002489 hematologic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 description 1
- 201000005992 juvenile myelomonocytic leukemia Diseases 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 239000003287 lymphocyte surface marker Substances 0.000 description 1
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 238000002493 microarray Methods 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 210000003003 monocyte-macrophage precursor cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 208000025113 myeloid leukemia Diseases 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 239000013610 patient sample Substances 0.000 description 1
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 229960000502 poloxamer Drugs 0.000 description 1
- 229920001983 poloxamer Polymers 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- 229920000915 polyvinyl chloride Polymers 0.000 description 1
- 239000004800 polyvinyl chloride Substances 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 239000000376 reactant Substances 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 238000012549 training Methods 0.000 description 1
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Hematology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Изобретение относится к медицине, а именно к области диагностики онкогематологических заболеваний, и может быть использовано для дифференциальной диагностики острых лейкозов. Способ включает сортировку выделенной мононуклеарной фракции лейкоцитов по их поверхностным антигенам путем инкубации на трех клеточных биочипах с иммобилизованными на прозрачной подложке антителами. Затем биочипы отмывают от несвязавшихся лейкоцитов и высушивают, после чего биочип 1 окрашивают для морфологического исследования, биочип 2 используют для определения внутриклеточных маркеров, а биочип 3 - для анализа на цитохимическую активность. Наличие острого лейкоза устанавливают, если при морфологическом анализе лейкоцитов, связавшихся с анти-CD45RA на биочипе 1, доля бластных клеток среди них превышает 25%, в этом случае на основании наличия связывания бластных клеток с антителами к набору CD антигенов, характерных для миелоидных, моноцитарных и лимфоидных клеток, определяют миеломоноцитарный балл ММ по формуле ММ=p(CD13)+p(CD33)+p(CD117)+p(CD14)+p(CD64)+0.5*p(CD11b)+0.5*p(CD15) и В-лимфоцитарный балл В по формуле В=p(CD10)+p(CD19)+(CD22), где при наличии связывания бластных клеток с антителом к CDi p(CDi)=1, а при отсутствии связывания бластных клеток с антителом к CDi p(CDi)=0. При этом если миеломоноцитарный балл <2, а В-лимфоцитарный балл ≥2, устанавливают диагноз В-лимфобластный лейкоз (В-ОЛЛ), если миеломоноцитарный балл ≥2, устанавливают диагноз острый миелобластный лейкоз (ОМЛ) М2, М3, M4 или М5, если миеломоноцитарный балл <2 и В-лимфоцитарный балл <2, устанавливают диагноз острый миелобластный лейкоз М0, М1, М7 или Т-лимфобластный лейкоз (Т-ОЛЛ), при этом если бластные клетки присутствуют на антителах к CD41 и/или CD61, устанавливают диагноз острый миелобластный лейкоз, М7, а при наличии внутриклеточного CD3 в бластных клетках устанавливают диагноз Т-ОЛЛ. Использование изобретения позволяет повысить точность дифференциальной диагностики ОМЛ и ОЛЛ. 8 з.п. ф-лы, 2 табл., 8 ил., 5 пр.
Description
Область техники
Изобретение относится к медицине, а именно к области диагностики онкогематологических заболеваний.
Существующий уровень техники
Диагностика острых лейкозов состоит из двух этапов. Первый из них (этап 1) - определение в пунктате костного мозга незрелых (бластных) клеток. Если их количество превышает 20% от всех ядерных клеток в образце, у пациента острый лейкоз, в противном случае диагноз «острый лейкоз» исключается. Второй этап (этап 2) - определение принадлежности обнаруженных бластных клеток к тому или иному подтипу лейкоцитов и определение степени их созревания. В зависимости от природы бластных клеток острые лейкозы разделяют на лимфобластные (ОЛЛ) и миелоидные (ОМЛ), и каждый из указанных типов делится на подгруппы в зависимости от стадии созревания бластных клеток (Т-ОЛЛ 1-4, В-ОЛЛ 1-4, ОМЛ М0-М7). Данная подгруппа фактически является диагнозом по т.н. франко-американско-британской (FAB) классификации. Несмотря на то, что современная классификация лейкозов (Swerdlow, S., Campo, Е., Harris, N. L, Jaffe, E. S., Pileri, S. A., Stein, H., … & Vardiman, J. W. (2008). WHO Classification of Tumors of Hematopoietic and Lymphoid Tissues 4th Ed.) учитывает присутствие различных мутаций, в случае невозможности проведения соответствующих исследований диагноз по FAB-классификации позволяет в случае необходимости назначить лечение.
Существует метод диагностики острых лейкозов с помощью проточной цитометрии. В основе метода лежит инкубация клеток пунктата костного мозга с антителами к поверхностным или внутриклеточным дифференцировочным антигенам лейкоцитов человека (cluster-of-differentiation, CD) с последующим определением количества клеток, несущих те или иные CD-антигены, с помощью проточного цитометра (патент «Method for the classification and monitoring of leukemias», US 5234816 А). В данном методе бластные клетки определяются по уровню бокового светорассеяния и экспрессии пан-лейкоцитарного антигена CD45 (этап 1), а дальнейшее определение природы обнаруженных бластов (этап 2) производится на основании набора CD-антигенов, обнаруженных на этой популяции клеток. В настоящий момент в литературе и медицинской практике параллельно существует несколько схем диагностики лейкозов методом проточной цитометрии, отличающихся последовательностью применения антител к различным антигенам, их набором и методами их сочетания, а также клонами используемых антител и выбором флуоресцентных меток на них (Van Dongen, J. J. M., Lhermitte, L, Bottcher, S., Almeida, J., Van der Velden, V. H. J., Flores-Montero, J., & Mejstrikova, E. (2012). EuroFlow antibody panels for standardized n-dimensional flow cytometric immunophenotyping of normal, reactive and malignant leukocytes. Leukemia, 26(9), 1908; Bene, M. C, Nebe, Т., Bettelheim, P., Buldini, В., Bumbea, H., Kern, W., & Maynadie, M. (2011). Immunophenotyping of acute leukemia and lymphoproliferative disorders: a consensus proposal of the European LeukemiaNet Work Package 10. Leukemia, 25(4), 567).
Основным недостатком данного метода является затруднительность разделения различных подвидов ОМЛ, за исключением ОМЛ М7, имеющего характерный иммунофенотип опухолевых клеток. Кроме того, данный метод требует использования дорогостоящего оборудования и реактивов (проточного цитометра и флуоресцентно меченых моноклональных антител).
Существует способ диагностики острых лейкозов с помощью подложки из нитроцеллюлозы с иммобилизованными на ней антителами (патент «Ап assay to detect a binding partner» ЕР 1151300 A4; Christopherson, R. I., Stoner, K., Barber, N., Belov, L, Woolfson, A., Scott, M., … & Mulligan, S. P. (2006). Classification of AML using a monoclonal antibody microarray. Myeloid Leukemia: Methods and Protocols, 241-251)
Основу метода составляет исследование «расширенного иммунофенотипа» мононуклеаров, выделенных из периферической крови или пунктата костного мозга методом центрифугирования в градиенте плотности Histopaque 1077. Расширенный иммунофенотип определяется как набор плотностей связывания клеток с каждым из 96 антител к CD (cluster of differentiation)-антигенам после инкубации суспензии клеток с биочипом без перемешивания. Авторами метода выделены расширенные иммунофенотипы, в большей степени характерные для разных подтипов ОМЛ. Поскольку в этом способе нет разделения на этап 1 и этап 2, основной проблемой при использовании данного способа является его недостаточная точность, особенно при небольших бластных популяциях, и затруднения в отделении острых лейкозов с небольшой бластной популяцией от хронических лейкозов с повышенной концентрацией бластов. Кроме того, недостатком данного способа является необходимость использования специального оборудования для сканирования биочипов с связавшимися клетками, а также невозможность его применения в случае бифенотипических или билинейных лейкозов.
Существует способ диагностики с использованием морфологии и проточной цитометрии. При этом исследования пунктата костного мозга пациента проводятся параллельно в мазках методами морфологии и цитохимии.
Этап 1 проводится параллельно в мазках с использованием морфологического способа подсчета бластных клеток, и методом проточной цитометрии, с определением бластной популяции по боковому светорассеянию и уровню экспрессии CD45.
Этап 2 также проводится параллельно в мазках с определением линейной принадлежности бластных клеток на основании их морфологии и активности линиеспецифичных ферментов в лейкоцитах костного мозга и методом проточной цитометрии на основании экспрессируемых на бластных клетках дифференцировочных антигенов. Данные морфологии и цитохимии с одной стороны и цитометрии с другой стороны комбинируются для формулировки диагноза. Этот метод является наиболее точным из описанных, закреплен в медицинских стандартах и рекомендуется Всемирной организацией здравоохранения (Swerdlow, S., Campo, Е., Harris, N. L, Jaffe, E. S., Pileri, S. A., Stein, H., & Vardiman, J. W. (2008). WHO Classification of Tumors of Hematopoietic and Lymphoid Tissues 4th Ed., c. 110-139, c. 168-178).
Основным недостатком данного способа является невозможность его использования в учреждениях, не оснащенных проточной цитометрией и не имеющих специалистов для проведения данного типа анализа. Кроме того, при работе по данному способу требуется сравнивать данные, полученные с помощью двух диагностических методов, причем бластная популяция в них определяется по-разному. Это может приводить к затруднению в сопоставлении данных и постановке диагноза.
Существует способ диагностики острых лейкозов с определением подгруппы по FAB-классификации на основании морфологии и цитохимических реакций на миелопероксидазу, Судан черный, неспецифическую эстеразу с подавлением NaF, а также кислую фосфатазу и реакцию на определение гликогена с помощью Шиффовых оснований (по методу йодная кислота -реактив Шиффа, ШИК-реакция) (Р. В. Neame, P. Soamboonsrup, G. Р Browman, R. М. Meyer, A. Benger, W. Е. Wilson, &, J. А. McBride (1986). Classifying acute leukemia by immunophenotyping: a combined FAB-immunologic classification of AML. Blood, 68(6), 1355-1362; Dacie and Lewis Practical Hematology, ed. B.J. Bain, I. Bates, M.A. Laffan, A.M. Lewis (2011) 11th ed., Elsevier Churchill Livingstone). При этом количество бластных клеток определяется морфологически (по характерной «бластной» структуре хроматина, этап 1), а диагноз ставится на основании морфологических особенностей бластов (формы ядра, наличия гранул или их конгломератов, т.н. палочек Ауэра) и цитохимических реакций (этап 2). Соотношение клеток, положительных по миелопероксидазе, присутствующей в созревающих гранулоцитах, и неспецифической эстеразе, подавляемой NaF, характерной для монобластов, позволяет различить различные подтипы ОМЛ (Dacie and Lewis Practical Hematology, ed. B.J. Bain, I. Bates, M.A. Laffan, A.M. Lewis (2011) 11th ed., Elsevier Churchill Livingstone). Учитывается также, что опухолевые клетки при лимфобластных лейкозах отрицательны по миелопероксидазе, Судану черному и неспецифической эстеразе и в различной степени положительны по ШИК-реакции, а Т-лимфобластные лейкозы часто положительны по кислой фосфатазе. Основными недостатками данного метода являются сложности в дифференциальной диагностике лимфобластного лейкоза, поскольку данный метод не позволяет уверенно различать Т-лимфобластные и В-лимфобластные лейкозы и разделять различные подвиды В-лимфобластного лейкоза. Главным достоинством способа является его дешевизна и нетребовательность к оборудованию (достаточно светового микроскопа). Данный способ выбирается в качестве ближайшего аналога.
Раскрытие изобретения
Задачей при создании описываемого способа является разработка способа диагностики острых лейкозов до подгруппы острого лейкоза по FAB-классификации, осуществимого при помощи светового микроскопа, при котором этап 1, определение количества бластных клеток, осуществлялся бы на основании анализа морфологических характеристик, а определение принадлежности обнаруженных бластных клеток к тому или иному подтипу лейкоцитов и определение степени их созревания (этап 2) осуществлялся бы как на основании их морфологии и цитохимической активности, так и на основании экспрессируемых на бластных клетках дифференцировочных антигенов.
Указанная задача решается за счет того, что создан способ дифференциальной диагностики острых лейкозов на основании исследования морфологии и цитохимической активности лейкоцитов пунктата костного мозга, при этом для анализа выделяют мононуклеарную фракцию лейкоцитов и сортируют выделенные клетки по их поверхностным антигенам путем инкубации на трех клеточных биочипах с иммобилизованными на прозрачной подложке антителами, затем биочипы отмывают от несвязавшихся лейкоцитов и высушивают, после чего биочип 1 окрашивают для морфологического исследования, биочип 2 используют для определения внутриклеточных маркеров, а биочип 3 - для анализа на цитохимическую активность, наличие острого лейкоза устанавливают, если при морфологическом анализе лейкоцитов, связавшихся с анти-CD45RA на биочипе 1, доля бластных клеток среди них превышает пороговое значение, а линейная принадлежность бластных клеток определяют на основании набора антител, с которыми связываются бластные клетки, определяемого по биочипу 1, анализа на внутриклеточные линиеспецифичные антигены на биочипе 2 и анализа цитохимической активности лейкоцитов на биочипе 3. В заявленном способе на биочип наносят антитела ко всем или части из следующего списка антигенов: CD1a, CD2, CD3, CD4, CD5, CD7, CD8, CD10, CD11b, CD11c, CD13, CD14, CD15, CD16, CD19, CD20, CD22, CD23, CD25, CD27, CD28, CD33, CD34, CD38, CD41, CD42, CD43, CD45, CD45RA, CD45R0, CD56, CD61, CD64, CD103, CD117, CD123, CD200, CD235, HLA-DR, IgM, к и λ легкие цепи иммуноглобулинов, CD133, отрицательный контроль (смесь иммуноглобулинов). При этом после отмывки биочипов от неспецифически связавшихся лейкоцитов для подготовки к окраске для морфологического исследования биочипы заливают фетальной телячьей сывороткой или инактивированной человеческой плазмой и высушивают с помощью вращения вокруг оси, перпендикулярной его плоскости и проходящей через его центр. Пороговое значение для доли бластных клеток среди всех клеток, связавшихся с анти-CD45RA, при превышении которого устанавливают диагноз «острый лейкоз», составляет 25%. Если доля бластных клеток среди всех клеток, связавшихся с антителом к CD45RA, превышает пороговое значение, то на основании наличия связывания бластных клеток с антителами к набору CD антигенов, характерных для миелоидных, моноцитарных и лимфоидных клеток, определяют миеломоноцитарный и В-лимфоцитарный баллы. По заявленному способу миеломоноцитарный балл вычисляют по формуле ММ=p(CD13)+p(CD33)+p(CD117)+p(CD14)+p(CD64)+0.5*p (CD11b)+0.5*p(CD15), причем при наличии связывания бластных клеток с антителом к CDi p(CDi)=1, а при отсутствии связывания бластных клеток с антителом к CDi p(CDi)=0. В-лимфоцитарный балл вычисляют по формуле В=p(CD10)+p(CD19)+(CD22), где при наличии связывания бластных клеток с антителом к CDi p(CDi)=1, а при отсутствии связывания бластных клеток с антителом к CDi p(CDi)=0. Пороговые значения для В-лимфоцитарного и миеломоноцитарного баллов составляют 2.
Если миеломоноцитарный балл ниже его порогового значения, а В-лимфоцитарный балл больше либо равен его пороговому значению, ставят диагноз «В-лимфобластный лейкоз» и определяют подвид В-ОЛЛ (В1, В2-В3, В4). Для уточнения подвида В-ОЛЛ в случае связывания бластных клеток с антителами к CD10 и CD19 и отсутствия связывания с анти-IgM, устанавливают диагноз ОЛЛ В2-В3, а если бластные клетки отрицательны и по CD10, и по IgM, устанавливают диагноз ОЛЛ В1.
Для миеломоноцитарного балла большего либо равного его пороговому значению, устанавливают диагноз «острый миелобластный лейкоз подварианты М2, М3, М4 или М5» и далее производят анализ биочипа 3 на активность α-нафтилбутират эстеразы и нафтол AS-D-хлорацетат эстеразы. При доле клеток, положительных по α-нафтилбутират эстеразе среди всех клеток, связавшихся с антителом к CD45RA, не ниже порога 1, устанавливают диагноз ОМЛ М5, а при доле клеток, положительных по α-нафтилбутират эстеразе среди всех клеток, связавшихся с антителом к CD45RA, ниже порога 2, и доле клеток, положительных по нафтол AS-D-хлорацетат эстеразе, не ниже порога 3, устанавливают диагноз ОМЛ М2 или ОМЛ М3, причем ОМЛ М3 определяют по характерной морфологии патологических промиелоцитов. Причем порог 1 составляет 40%, порог 2 - 2%, а порог 3 - 20%.
При миеломоноцитарном балле ниже его порогового значения и В-лимфоцитарном балле ниже его порогового значения, ставят диагноз «острый миелобластный лейкоз М0, М1, М7 или Т-лимфобластный лейкоз», при этом если бластные клетки присутствуют на антителах к CD41 и/или CD61, устанавливают диагноз «острый миелобластный лейкоз, М7». Для дифференциальной диагностики ОМЛ М0-М1 от Т-ОЛЛ используют анализ клеток, связавшихся с биочипом 2, на наличие внутриклеточного CD3, и при наличии внутриклеточного CD3 в бластных клетках устанавливают диагноз Т-ОЛЛ. При этом биочип 2 со связавшимися клетками фиксируют, промывают, сушат, инкубируют в забивочном растворе, затем с раствором антитела к CD3, конъюгированного с антигенной детерминантой (первичного антитела), затем с раствором антитела к антигенной детерминанте, конъюгированным с ферментом (вторичного антитела) и затем с колориметрическим субстратом для используемого фермента, дающим при реакции с ферментом цветной нерастворимый осадок. Для фиксации используют смесь формалина (40%) с чистым этанолом 1:10. При этом антигенной детерминантой является FITC, а ферментом, конъюгированным с вторичным антителом, выступает щелочная фосфатаза или пероксидаза хрена.
Краткое описание фигур
Фиг. 1.
Зависимость чувствительности и специфичности определения наличия (N=91) или отсутствия (N=60) острого лейкоза от порога процентной доли бластных клеток среди всех, связавшихся с антителом к CD45RA. Для определения чувствительности и специфичности у пациентов с долей бластных клеток выше порогового значения предполагали острый лейкоз, затем результат сравнивали с диагнозом, установленным стандартными диагностическими методами.
Фиг. 2.
ROC кривая для определения наличия (N=91) или отсутствия (N=60) острого лейкоза на основании порога процентной доли бластных клеток среди всех, связавшихся с антителом к CD45RA. Для определения чувствительности и специфичности у пациентов с долей бластных клеток выше порогового значения предполагали острый лейкоз, затем результат сравнивали с диагнозом, установленным стандартными диагностическими методами.
Фиг. 3.
Зависимость чувствительности и специфичности установления диагноза ОМЛ для пациентов, имеющих долю бластных клеток, связавшихся с анти-CD45RA на биочипе, более 25%, от порога миеломоноцитарного балла на основе данных 69 пациентов с ОМЛ и 29 пациентов с ОЛЛ. Для определения чувствительности и специфичности у пациентов с миеломоноцитарным баллом выше порога предполагался диагноз ОМЛ, и полученный результат сравнивался с диагнозом, поставленным стандартными диагностическими методами.
Фиг. 4.
ROC кривая для установления диагноза ОМЛ для пациентов с уровнем бластов, связавшихся с анти-CD45RA на биочипе выше 25%, на основании значения миеломоноцитарного балла. Для определения чувствительности и специфичности у пациентов с миеломоноцитарным баллом выше порога предполагался диагноз ОМЛ, и полученный результат сравнивался с диагнозом, поставленным стандартными диагностическими методами.
Фиг. 5.
Зависимость чувствительности и специфичности установления диагноза В-ОЛЛ для пациентов с уровнем бластов, связавшихся с анти-CD45RA на биочипе, выше 25% от порога В-лимфоцитарного балла на основе данных 60 пациентов с ОМЛ и 29 пациентов с ОЛЛ. Для определения чувствительности и специфичности у пациентов с В-лимфоцитарным баллом выше порога предполагался диагноз В-ОЛЛ, и полученный результат сравнивался с диагнозом, поставленным стандартными диагностическими методами.
Фиг.
6. ROC кривая для установления диагноза В-ОЛЛ для пациентов с уровнем бластов, связавшихся с анти-CD45RA на биочипе, выше 25% от порога В-лимфоцитарного балла на основании данных 69 пациентов с ОМЛ и 29 пациентов с ОЛЛ. Для определения чувствительности и специфичности у пациентов с В-лимфоцитарным баллом выше порога предполагался диагноз В-ОЛЛ, и полученный результат сравнивался с диагнозом, поставленным стандартными диагностическими методами.
Фиг. 7.
а) Доля клеток, положительных по α-нафтил бутират эстеразе, от всех клеток, связавшихся на биочипе с анти-CD45RA, для здорового контроля и различных острых и хронических миелоидных лейкозов; б) Доля клеток, положительных по нафтол AS-D хлорацетат эстеразе, от всех клеток, связавшихся на биочипе с анти-CD45RA, для здорового контроля и различных острых и хронических миелоидных лейкозов.
Фиг. 8.
Властные клетки пациента с ОМЛ М3, связавшиеся на биочипе с антителами к CD38. Окраска по Паппенгейму, увеличение x1000.
Реализация изобретения
Подробное описание проведения диагностики ОЛ по предлагаемому способу:
1. Изготовление биочипа
- На прозрачные пластиковые подложки, например, из пластифицированного поливинилхлорида или полистирола с или без предварительной обработки наносят капли раствора моноклональных анти-CD антител в карбонат-бикарбонатном буфере рН 9.2-9.4, концентрация антител 0.25-0.75 мкг/мл; все описанные далее в методике и примерах результаты получены с использованием поливинилхлоридных покровных стекол производства Fisher Scientific размером 22×22 мм без предварительной обработки;
- Подложка с нанесенным каплями антител инкубируют во влажной камере при 4°С не менее 10 часов;
- Подложки вынимают из влажной камеры и высушивают при 4°С не менее 2 часов (до полного высыхания);
- Подложки с высохшими антителами заливают забивочным раствором, например 5% раствором бычьего сывороточного альбумина (BSA) на фосфатном буфере рН 7.2-7.4 (phosphate buffered saline, PBS) или 1% раствором полоксамера на фосфатном буфере рН 7.2-7.4 (phosphate buffered saline, PBS) и инкубируют при комнатной температуре 1 час;
- Подложки ополаскивают дистиллированной водой, заливают 0.1% раствором глютатиона в воде, инкубируют 10 минут с покачиванием и затем высушивают;
- Высушенные подложки запаковывают в герметичные контейнеры с осушителем и хранят при 4°С до использования;
- Перед использованием (до нанесения суспензии клеток) подложки инкубируют в 1% растворе BSA на PBS не менее 10 минут.
Высушивание антител при температуре 4°С является оптимальным протоколом иммобилизации антител по сравнению с отсутствием высушивания и высушиванием при комнатной температуре. Наши данные показывают, что при отсутствии высушивания плотность связывания клеток с иммобилизованными таким образом антителами ниже, чем при высушивании при температуре 4°С, а высушивание при комнатной температуре приводит к неравномерному распределению связывающихся клеток по площади пятна иммобилизованных антител.
2. Панель антител.
На биочипе для диагностики ОЛ по предлагаемому способу иммобилизуются антитела к следующим CD антигенам В таблице 1 представлены CD антигены, входящие в панель биочипа, и нормальные лейкоциты, на которых они экспрессируются..
3. Сортировка клеток с помощью клеточного биочипа.
- Из пунктата костного мозга, взятого на ЭДТА, выделяют мононуклеарную фракцию с помощью центрифугирования в градиенте плотности Histopaque 1077 в соответствии с инструкцией производителя;
- Полученную суспензию мононуклеарных клеток ресуспендируют в растворе, содержащем более 50% фетальной телячей сыворотки или инактивированной человеческой плазмы в 1% растворе BSA на PBS. Целевое количество клеток в области над биочипом от 5 до 8⋅106.
- Полученную суспензию наносят на три биочипа (биочипы 1, 2 и 3) и инкубируют на охлаждающем элементе с температурой +7°С без перемешивания в течение 45 минут.
- Биочипы со связавшимися клетками ополаскивают в стакане с 1% BSA на PBS, остаток жидкости стряхивают, затем биочипы заливают чистой фетальной телячьей сывороткой или инактивированной человеческой плазмой и инкубируют несколько минут.
- Фетальную телячью сыворотку или инактивированную человеческую плазму сливают с биочипов, затем биочипы по очереди помещают в пазы специальной цитоцентрифуги, обеспечивающей вращение подложки в горизонтальной плоскости вокруг вертикальной оси, проходящей через ее центр, со скоростью от 4 до 7 тысяч об/мин в течение 10-30 секунд. Данная процедура обеспечивает быстрое высушивание клеток без нарушений осмотичности окружающего раствора и распластывание клеток по поверхности подложки. Распластывание клеток с помощью центрифугирования обеспечивает максимальное морфологическое сходство клеток с клетками в мазке, поскольку при приготовлении мазка клетки также распластываются по поверхности стекла за счет сил поверхностного натяжения.
4. Биочип 1 со связавшимися клетками окрашивают для морфологического исследования по Паппенгейму в соответствии со стандартными протоколами. Второй биочип (биочип 2) в случае попадания образца пациента в «серую зону» (см. ниже) может быть окрашен на внутриклеточный маркер CD3 по описанному ниже протоколу. Третий биочип (биочип 3) окрашивают для определения активности специфической и неспецифической эстераз по протоколу, описанному в работе (Dacie and Lewis Practical Hematology, ed. BJ Bain, I. Bates, MA Laffan, AM Lewis (2011) 11th ed., Elsevier Churchill Livingstone) с небольшими модификациями (см. ниже).
5. Анализ активности нафтол AS-D-хлорацетат эстеразы и а-нафтил бутират эстеразы.
Биочип 3 со связавшимися клетками фиксируется 30 с в охлажденном до 4°С формол-ацетоновом фиксаторе, отмывается проточной водой и высушивается. Для приготовления рабочего раствора 1 в 20 мл фосфатного буфера 100 мМ, рН 8.0 растворяют 18 мг соли прочного синего ВВ, затем добавляют 0.4 мл раствора (4 мг/мл) α-нафтил бутирата в ацетоне. Биочип 3 с зафиксированными клетками инкубируется в рабочем растворе 1 45 минут в темноте при комнатной температуре, затем отмывается проточной водой. Для приготовления рабочего раствора 2 10 мг соли прочного синего ВВ растворяют в 19 мл фосфатного буфера 66 мМ, рН 7.4, добавляют 1 мл раствора (2.5 мг/мл) нафтол AS-D-хлорацетата в N-диметилформамиде. Тот же биочип 3 заливают рабочим раствором 2, инкубируют 30 минут в темноте при комнатной температуре, затем отмывают проточной водой и высушивают (Dacie and Lewis Practical Hematology, ed. BJ Bain, I. Bates, MA Laffan, AM Lewis (2011) 11th ed., Elsevier Churchill Livingstone). Продукт реакции неспецифических эстераз с α-нафтил бутиратом выпадает в виде бурого осадка, продукт реакции специфических эстераз с нафтол AS-D-хлорацетатом - в виде синего или фиолетового осадка (Федянина, О.С, Закирова, А.О., Задорожная, А.Е., Капранов, Н.М., Хвастунова, А.Н., Ядгарова, П.А., … & Кузнецова, С.А. (2016) Исследование морфологии и распределения α-нафтилбутиратэстеразы и нафтол-АБ-О-хлор ацетат-эстеразы в нормальных предшественниках лейкоцитов миелоидного ростка с помощью клеточного биочипа. Онкогематология, 4, 74-79.).
6. Исследование наличия внутриклеточных маркеров Биочип 2 со связавшимися клетками после сушки в цитоцентрифуге фиксируют 10 сек в смеси формалина (40%) с чистым этанолом 1:10, промывают фосфатно-солевым буфером (PBS, рН 7.2-7.4) и высушивают на воздухе. Высушенный биочип 2 инкубируют в забивочном растворе, 1% растворе бычьего сывороточного альбумина (BSA) на PBS 30 мин при комнатной температуре. Забивочный раствор сливают, заливают биочип 2 с клетками раствором первичного антитела (моноклонального антитела к определяемому антигену, конъюгированного с FITC), в FACS буфере (5% телячей сыворотки в PBS) и инкубируют 30 минут при комнатной температуре. Затем биочип 2 отмывают от несвязавшихся антител отмывочным буфером (0.05% Tween 20 в PBS), заливают биочип 2 раствором вторичных антител (анти-FITC, конъюгированных с щелочной фосфатазой), инкубируют 30 минут при комнатной температуре, отмывают дважды отмывочным раствором, затем деионизованной водой. После этого биочип 2 инкубируют с готовым раствором колориметрического субстрата для щелочной фосфатазы в соответствии с рекомендациями производителя.
7. Определение бластоза (доли бластных клеток) для дифференцировки острых лейкозов от других заболеваний (этап 1).
На биочипе 1, окрашенном по Паппенгейму, с помощью световой микроскопии в светлом поле при увеличении х1000 производят подсчет клеток с бластной морфологией (бластной структурой хроматина), связавшихся на биочипе с антителом к CD45RA. В случае если доля бластных клеток от всех мононуклеаров, связавшихся с анти-CD45RA, составляет более 25%, у пациента предполагают острый лейкоз.
Пороговое значение доли бластных клеток среди всех связавшихся с антителом к CD45RA на биочипе 1, выше которого у пациента следует предполагать острый лейкоз, получено из зависимости чувствительности и специфичности от порогового значения при предположении наличия острого лейкоза у пациентов с долей бластных клеток выше порога для 40 пунктатов нормального костного мозга, и образцы пунктатов костного мозга 17 пациентов с хроническими лейкозами, 3 пациентов с ОЛ в ремиссии, поступивших с подозрением на рецидив и 91 пациентов с острыми лейкозами (Фиг. 1). На фиг. 2 представлена ROC - кривая для использования процентной доли бластных клеток среди всех, связавшихся с антителом к CD45RA, для выделения пациентов с острым лейкозом. Площадь под ROC-кривой составляет 0.976, что свидетельствует о высокой надежности использования данного критерия выделения острых лейкозов.
8. Определение природы бластных клеток (этап 2).
- Для определения природы бластных клеток на биочипе 1, окрашенном по Паппенгейму, с помощью световой микроскопии в светлом поле при увеличении х1000 производят морфологический анализ не менее 100 клеток на каждом из пятен антител, присутствующих на биочипе, и определяют среди них долю клеток с бластной морфологией.
- В случае, если доля бластов среди клеток, связавшихся с анти-CDx, больше либо равна 2%, бластные клетки в образце пациента считают положительными по CDx.
- После определения набора CD-антигенов из панели биочипа, по которым положительны бластные клетки, производят подсчет В-лимфоцитарного и миело-моноцитарного баллов в соответствии с таблицей 2. В таблице 2 представлен пособ расчета миеломоноцитарного и В-лимфоцитарного баллов на основании связывания бластных клеток с антителами к различным CD-антигенам на биочипе. Миеломоноцитарный балл вычисляется как сумма моноцитарных и миелоидных баллов.
В основе таблицы 2 лежит балльная система, предложенная Европейской группой по иммунологической характеризации лейкозов (Bene, М.С, Castoldi, G., Knapp, W., Ludwig, W.D., Matutes, E., Orfao, A., & Van't Veer, M. B. (1995). Proposals for the immunological classification of acute leukemias. European Group for the Immunological Characterization of Leukemias (EGIL). Leukemia, 9(10), 1783-1786) с добавлением маркера CD117 (Bene, M.С, Bernier, М., Casasnovas, R.О., Castoldi, G., Knapp, W., Lanza, F., … & Van't Veer, M. B. (1998). The reliability and specificity of c-kit for the diagnosis of acute myeloid leukemias and undifferentiated leukemias. Blood, 92(2), 596-599). Балл 0.5 характеризует миелоидные маркеры с частой аберрантной экспрессией на опухолевых клетках лимфобластных лейкозов (Bene, М.С, Castoldi, G., Knapp, W., Ludwig, W.D., Matutes, E., Orfao, A., & Van't Veer, M. B. (1995). Proposals for the immunological classification of acute leukemias. European Group for the Immunological Characterization of Leukemias (EGIL). Leukemia, 9(10), 1783-1786; Orfao, A., Ortuno, F., de Santiago, M., Lopez, A., & San Miguel, J. (2004). Immunophenotyping of acute leukemias and myelodysplastic syndromes. Cytometry Part A, 58(1), 62-71)
- В случае, если миеломоноцитарный балл больше либо равен 2, устанавливают диагноз ОМЛ. Определение порога миеломоноцитарного балла, выше которого у пациента предполагают ОМЛ, полученный на основе данных 69 пациентов с ОМЛ и 29 пациентов с ОЛЛ, представлен на Фиг. 3. На Фиг. 4 представлена ROC - кривая для использования значения миеломоноцитарного балла для выделения пациентов с ОМЛ из пациентов с острыми лейкозами. Площадь под ROC-кривой составляет 0.994, что свидетельствует о высокой надежности использования данного критерия выделения ОМЛ из всех острых лейкозов.
- В случае, если миеломоноцитарный балл меньше 2, а В-лимфоцитарный балл больше, либо равен 2, устанавливают диагноз В-ОЛЛ. Определение порога В-лимфоцитарного балла, выше которого у пациента предполагают В-ОЛЛ, полученный на основе данных 69 пациентов с ОМЛ и 29 пациентов с ОЛЛ, представлен на Фиг. 5. На Фиг. 6 представлена ROC - кривая для использования значения В-лимфоцитарного балла для выделения пациентов с В-ОЛЛ из пациентов с острыми лейкозами. Площадь под ROC-кривой составляет 0.998, что свидетельствует о высокой надежности использования данного критерия выделения ОМЛ из всех острых лейкозов.
- В случае, если миеломоноцитарный балл менее 2 и В-лимфоцитарный балл менее 2, пациентов относят к так называемой «серой зоне», включающей ОМЛ-М0, ОМЛ-М1, ОМЛ-М7 и Т-ОЛЛ. Если бластные клетки связываются на биочипе с антителами к CD41 и CD61, у пациента предполагают диагноз ОМЛ-М7. Подтверждением диагноза ОМЛ М7 может также служить характерная морфология опухолевых клеток при мегакариобластном лейкозе (ОМЛ М7).
- Для образцов пациентов, отнесенных на основании описанного алгоритма к «серой зоне», в которых на поверхности бластных клеток присутствует более одного Т-лимфоцитарного маркера (CD1a, CD2, CD5, CD7), на биочипе 2 проводят реакцию на цитоплазматический CD3 по протоколу исследования на наличие внутриклеточных маркеров, описанному выше. В случае положительности бластных клеток по цитоплазматическому CD3 пациенту устанавливают диагноз «Т-лимфобластный лейкоз», поскольку наличие цитоплазматического CD3 является наиболее специфичным маркером Т-клеточной принадлежности, наличия которого достаточно для отнесения клеток к Т-лимфоцитам (Orfao, A., Ortuno, F., de Santiago, М., Lopez, А., & San Miguel, J. (2004). Immunophenotyping of acute leukemias and myelodysplastic syndromes. Cytometry Part A, 58(1), 62-71). Для определения подвида Т-ОЛЛ используют данные о более подробном иммунофенотипе опухолевых клеток: бластные клетки при ОЛЛ Т1 положительны по CD7 и отрицательны по другим Т-клеточным маркерам, при ОЛЛ Т2 могут экспрессировать также CD2 и/или CD5, но не CD1a или поверхностный CD3, при ОЛЛ Т3-положительны по CD1a, но не поверхностному CD3, при ОЛЛ Т4 - отрицательны по CD1a, положительны по поверхностным CD3, CD4 или CD8 (Orfao, A., Ortuno, F., de Santiago, М., Lopez, А., & San Miguel, J. (2004). Immunophenotyping of acute leukemias and myelodysplastic syndromes. Cytometry Part A, 58(1), 62-71).
- В случае, если пациенты отнесены к группе В-ОЛЛ на основании значений миеломоноцитарного и В-лимфоцитарного баллов, для уточнения подгруппы по FAB классификации используют следующие данные. Если бластные клетки пациента положительны по поверхностным IgM и имеют морфологию типа L3 (Hann, I.М., Evans, D. I. К., Palmer, М.К., Jones, Р.М., & Haworth, С. (1979). The prognostic significance of morphological features in childhood acute lymphoblastic leukaemia. International Journal of Laboratory Hematology, 1(3), 215-226), устанавливают диагноз ОЛЛ B4. Если бластные клетки положительны по CD10, отрицательны по IgM и не имеют L3 морфологии, то устанавливают диагноз ОЛЛ В2-В3. Если бластные клетки отрицательны и по CD10, и по IgM, устанавливается диагноз ОЛЛ В1. Подтип В ОЛЛ В1 является редким (10% от всех случаев В-ОЛЛ) и в исследованной нами выборке 94 пациентов, поступивших с подозрением на острый лейкоз не встречался.
- В случае, если пациенты отнесены к группе ОМЛ на основании значения миеломоноцитарного балла, то для определения подвида ОМЛ используют данные анализа на специфическую и неспецифическую эстеразы по описанному выше протоколу. При этом оценивают долю клеток, положительных по α-нафтил бутират эстеразе и нафтол AS-D-хлорацетат эстеразе, среди всех лейкоцитов, связавшихся на биочипе с антителом к CD45RA.
- Если доля клеток, положительных по α-нафтил бутират эстеразе, составляет более 40% среди всех клеток, связавшихся с анти-CD45RA, то устанавливают диагноз ОМЛ М5 (острый монобластный лейкоз) (см. Фиг. 7а).
- Если доля клеток, положительных по α-нафтил бутират эстеразе, среди клеток, связавшихся с анти-CD45RA, составляет менее 2%, а доля клеток, положительных по нафтол AS-D-хлорацетат эстеразе, среди клеток, связавшихся с анти-CD45RA, составляет более 20%, то у пациента предполагают диагноз ОМЛ М2 или ОМЛ М3 (см. Фиг. 76). При этом ОМЛ М3 определяют по характерной морфологии бластных клеток -промиелоцитам, часто с палочками Ауэра, представленной на Фиг. 8.
Пример 1.
В ходе работы нами были исследованы пунктаты костного мозга 66 пациентов с известными острыми лейкозами (обучающая выборка). На основании полученных данных были сформулированы основные принципы описываемого способа диагностики. Для определения пороговых значений доли бластных клеток, миеломоноцитарного и В-лимфоцитарного балла были использованы данные 105 исследованных нами пациентов, поступивших с подозрением на первичный ОЛ или рецидив, из них у 58 пациентов был обнаружен ОМЛ М2-М5 (М2 15 пациентов, М3 6 пациентов, М4 13 пациентов, М5 24 пациента), у 28 пациентов - В-ОЛЛ (В1 2 пациента, В2-В3 26 пациента), к «серой зоне» были отнесены 19 пациентов, из них у 9 на основании алгоритма, изложенного выше, мы предположили диагноз ОМЛ М7, у 5 был предположен диагноз Т-ОЛЛ, у 5 был предположен диагноз М0-М1, которые во всех случаях были подтверждены стандартными методами диагностики.
Пример 2.
Пациентка 9 месяцев, поступила в ФНКЦ ДГОИ им. Рогачева с подозрением на острый лейкоз. По данным анализа клеток пунктата костного мозга на биочипе 1 доля бластов среди всех лейкоцитов, связавшихся с антителом к CD45RA, составляет 51%, то есть по предлагаемому способу можно предполагать у пациента острый лейкоз. При анализе связывания бластных клеток с антителами к различным CD антигенам на биочипе 1 было определено значение миеломоноцитарного балла 0 (бласты положительны по CD13 и отрицательны по остальным антигенам, используемым при расчете миеломоноцитарного балла), что ниже используемого нами порога. Значение В-лимфоцитарного балла равно 0, что ниже используемого нами порога 2. Поскольку бластные клетки были обнаружены на биочипе 1 на антителах к CD41 и CD61, пациентке был установлен диагноз ОМЛ М7. Данный диагноз подтвержден стандартными диагностическими методами (морфологией и проточной цитометрией).
Пример 3.
Пациент с хроническим миелоидным лейкозом в анамнезе госпитализирован в ФНКЦ ДГОИ им. Дм. Рогачева. По данным анализа клеток пунктата костного мозга на биочипе 1 доля бластов среди всех лейкоцитов, связавшихся с антителом к CD45RA, составляет 42%, то есть по предлагаемому способу можно предполагать у пациента острый лейкоз. При анализе связывания бластных клеток с антителами к различным CD антигенам на биочипе 1 было определено значение миеломоноцитарного балла 1 (бласты положительны по CD13 и отрицательны по остальным антигенам, используемым при расчете миеломоноцитарного балла), что ниже используемого нами порога. Значение В-лимфоцитарного балла равно 2 (CD10+CD19+CD22-), что выше используемого нами порога (В≥2). В соответствии с предлагаемым способом пациенту был установлен диагноз В-ОЛЛ В2/В3. Данный диагноз подтвержден стандартными диагностическими методами (морфологией и проточной цитометрией).
Пример 4.
Пациент с ОМЛ М3 в анамнезе после рецидива во второй клинико-гематологической ремиссии, поступил с подозрением на второй рецидив. По данным анализа клеток пунктата костного мозга на биочипе 1 доля бластов среди всех лейкоцитов, связавшихся с антителом к CD45RA, составляет 14%, то есть по предлагаемому способу острого лейкоза у пациента нет. Отсутствие рецидива подтверждено стандартными диагностическими методами (морфологией и проточной цитометрией).
Пример 5.
Пациент поступил первично с подозрением на острый лейкоз. По данным анализа клеток пунктата костного мозга на биочипе 1 доля бластов среди всех лейкоцитов, связавшихся с антителом к CD45RA, составляет 90%, то есть по предлагаемому способу можно предполагать у пациента острый лейкоз. При анализе связывания бластных клеток с антителами к различным CD антигенам на биочипе 1 было определено значение миеломоноцитарного балла 4,5 (бласты положительны по CD11b, CD11c, CD13, CD33, CD64), что выше используемого нами порога (ММ≥2), то есть при диагностике по предлагаемому способу предполагаемый диагноз пациента острый миелобластный лейкоз (ОМЛ) М2, М3, М4 или М5. Для уточнения подвида ОМЛ в соответствии с описанным способом было проведено исследование биочипа 3 на активность α-нафтилбутират эстеразы и нафтол AS-D-хлорацетат эстеразы. Доля клеток с активной α-нафтилбутират эстеразой среди всех клеток, связавшихся на биочипе 3 с анти-CD45RA, составляет 80%, что выше используемого нами порога 40%. В соответствии с предлагаемым способом у пациента предполагается диагноз ОМЛ М5. Данный диагноз подтвержден стандартными диагностическими методами (морфологией и проточной цитометрией).
Все вышеприведенные примеры подтверждают выполнение поставленной задачи и промышленную применимость изобретения.
Список сокращений
ОЛ - острый лейкоз;
ОЛЛ - острый лимфобластный лейкоз;
В-ОЛЛ - острый В-лимфобластный лейкоз;
Т-ОЛЛ - острый Т-лимфобластный лейкоз;
ОМЛ - острый миелоидный лейкоз;
ХМЛ - хронический миелоидный лейкоз;
ЮММЛ - ювенильный миеломоноцитарный лейкоз;
FAB-классификация - франко-америко-британская классификация, классификация острых лейкозов по морфологическим и иммунофенотипическим характеристикам;
CD - cluster of differentiation, дифференцировочные антигены лейкоцитов человека;
BSA - bovine serum albumin, бычий сывороточный альбумин;
PBS - phosphate buffered saline, тип фосфатного буфера;
ROC-кривая - receiver operating characteristic, кривая, позволяющая оценить качество бинарной классификации.
Claims (9)
1. Способ дифференциальной диагностики острых лейкозов на основании исследования морфологии и цитохимической активности лейкоцитов пунктата костного мозга, при котором выделенную мононуклеарную фракцию лейкоцитов сортируют по их поверхностным антигенам путем инкубации на трех клеточных биочипах с иммобилизованными на прозрачной подложке антителами, затем биочипы отмывают от несвязавшихся лейкоцитов и высушивают, после чего биочип 1 окрашивают для морфологического исследования, биочип 2 используют для определения внутриклеточных маркеров, а биочип 3 - для анализа на цитохимическую активность, отличающийся тем, что наличие острого лейкоза устанавливают, если при морфологическом анализе лейкоцитов, связавшихся с анти-CD45RA на биочипе 1, доля бластных клеток среди них превышает 25%, в этом случае на основании наличия связывания бластных клеток с антителами к набору CD антигенов, характерных для миелоидных, моноцитарных и лимфоидных клеток, определяют миеломоноцитарный балл ММ по формуле ММ=p(CD13)+p(CD33)+p(CD117)+p(CD14)+p(CD64)+0.5*p(CD11b)+0.5*p(CD15) и В-лимфоцитарный балл В по формуле В=p(CD10)+p(CD19)+(CD22), где при наличии связывания бластных клеток с антителом к CDi p(CDi)=1, а при отсутствии связывания бластных клеток с антителом к CDi p(CDi)=0, при этом если миеломоноцитарный балл <2, а В-лимфоцитарный балл ≥2, устанавливают диагноз В-лимфобластный лейкоз (В-ОЛЛ), если миеломоноцитарный балл ≥2, устанавливают диагноз острый миелобластный лейкоз (ОМЛ) М2, М3, M4 или М5, если миеломоноцитарный балл <2 и В-лимфоцитарный балл <2, устанавливают диагноз острый миелобластный лейкоз М0, М1, М7 или Т-лимфобластный лейкоз (Т-ОЛЛ), при этом если бластные клетки присутствуют на антителах к CD41 и/или CD61, устанавливают диагноз острый миелобластный лейкоз, М7, а при наличии внутриклеточного CD3 в бластных клетках устанавливают диагноз Т-ОЛЛ.
2. Способ по п. 1, при котором на биочип наносят антитела ко всем или части из следующего списка антигенов: CD1a, CD2, CD3, CD4, CD5, CD7, CD8, CD10, CD11b, CD11c, CD13, CD14, CD15, CD16, CD19, CD20, CD22, CD23, CD25, CD27, CD28, CD33, CD34, CD38, CD41, CD42, CD43, CD45, CD45RA, CD45R0, CD56, CD61, CD64, CD103, CD117, CD123, CD200, CD235, HLA-DR, IgM, κ и λ легкие цепи иммуноглобулинов, CD133, отрицательный контроль (смесь иммуноглобулинов).
3. Способ по п. 1, при котором после отмывки биочипов от неспецифически связавшихся лейкоцитов для подготовки к окраске для морфологического исследования биочипы заливают фетальной телячьей сывороткой или инактивированной человеческой плазмой и высушивают с помощью вращения вокруг оси, перпендикулярной его плоскости и проходящей через его центр.
4. Способ по любому из пп. 1-3, при котором для пациентов с В-ОЛЛ в случае связывания бластных клеток с антителами к CD10 и CD19 и отсутствия связывания с анти-IgM устанавливают диагноз ОЛЛ В2-В3, если бластные клетки отрицательны и по CD10, и по IgM, устанавливают диагноз ОЛЛ В1, а если бластные клетки отрицательны по CD10 и положительны по IgM, устанавливают диагноз ОЛЛ В4.
5. Способ по любому из пп. 1-3, при котором при доле клеток, положительных по α-нафтилбутират эстеразе среди всех клеток, связавшихся с антителом к CD45RA, не ниже 40% устанавливают диагноз ОМЛ М5, а при доле клеток, положительных по α-нафтилбутират эстеразе среди всех клеток, связавшихся с антителом к CD45RA, ниже 2% и доле клеток, положительных по нафтол AS-D-хлорацетат эстеразе, не ниже 20% устанавливают диагноз ОМЛ М2 или ОМЛ М3, причем ОМЛ М3 определяют по характерной морфологии патологических промиелоцитов.
6. Способ по любому из пп. 1-3, при котором для определения внутриклеточного CD3 биочип 2 со связавшимися клетками фиксируют, промывают, сушат, инкубируют в забивочном растворе, затем с раствором антитела к CD3, конъюгированного с антигенной детерминантой (первичного антитела), затем с раствором антитела к антигенной детерминанте, конъюгированным с ферментом (вторичного антитела) и затем с колориметрическим субстратом для используемого фермента, дающим при реакции с ферментом цветной нерастворимый осадок.
7. Способ по п. 6, при котором для фиксации используют смесь формалина (40%) с чистым этанолом 1:10.
8. Способ по п. 6, при котором антигенной детерминантой является FITC.
9. Способ по п. 6, при котором ферментом, конъюгированным с вторичным антителом, выступает щелочная фосфатаза или пероксидаза хрена.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2017144192A RU2681651C1 (ru) | 2017-12-18 | 2017-12-18 | Способ дифференциальной диагностики острых лейкозов с помощью клеточного биочипа |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2017144192A RU2681651C1 (ru) | 2017-12-18 | 2017-12-18 | Способ дифференциальной диагностики острых лейкозов с помощью клеточного биочипа |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2681651C1 true RU2681651C1 (ru) | 2019-03-12 |
Family
ID=65805667
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2017144192A RU2681651C1 (ru) | 2017-12-18 | 2017-12-18 | Способ дифференциальной диагностики острых лейкозов с помощью клеточного биочипа |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2681651C1 (ru) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN115615786A (zh) * | 2022-10-17 | 2023-01-17 | 河南赛诺特生物技术有限公司 | 骨髓涂片小巨核细胞染色试剂盒、染色方法及应用 |
| RU2818950C1 (ru) * | 2022-11-21 | 2024-05-07 | федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный медицинский исследовательский центр детской гематологии, онкологии и иммунологии имени Дмитрия Рогачева" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Метод определения минимальной остаточной болезни методом мультипараметрической проточной цитометрии у детей и взрослых с В-линейным острым лимфобластным лейкозом в условиях применения CD19-направленной иммунотерапии |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2286798C2 (ru) * | 2004-07-08 | 2006-11-10 | Институт Молекулярной Биологии Им. В.А. Энгельгардта Российской Академии Наук | Способ идентификации хромосомных транслокаций, приводящих к развитию злокачественных заболеваний крови (лейкозов), с использованием олигонуклеотидного биологического микрочипа (биочипа) |
| WO2013052318A1 (en) * | 2011-09-25 | 2013-04-11 | Theranos, Inc. | Systems and methods for multi-analysis |
-
2017
- 2017-12-18 RU RU2017144192A patent/RU2681651C1/ru active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2286798C2 (ru) * | 2004-07-08 | 2006-11-10 | Институт Молекулярной Биологии Им. В.А. Энгельгардта Российской Академии Наук | Способ идентификации хромосомных транслокаций, приводящих к развитию злокачественных заболеваний крови (лейкозов), с использованием олигонуклеотидного биологического микрочипа (биочипа) |
| WO2013052318A1 (en) * | 2011-09-25 | 2013-04-11 | Theranos, Inc. | Systems and methods for multi-analysis |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| КУЗНЕЦОВА С.А. и др. Возможности применения клеточных биочипов//Материалы доклада на симпозиальном заседании "Индивидуализированная диагностика и терапия онкологических заболеваний" 15.09.2016, XX Форум "Национальные дни лабораторной медицины России - 2016" 14 - 16 сентября 2016 г. * |
| ФЕДЯНИНА О.С. и др. Исследование морфологии и распределения α-нафтилбутиратэстеразы и нафтол-as-d-хлор ацетатэстеразы в нормальных предшественниках лейкоцитов миелоидного ростка с помощью клеточного биочипа//Онкогематология, 2016. - Т.11(4), с.74-79. * |
| ФЕДЯНИНА О.С. и др. Исследование морфологии и распределения α-нафтилбутиратэстеразы и нафтол-as-d-хлор ацетатэстеразы в нормальных предшественниках лейкоцитов миелоидного ростка с помощью клеточного биочипа//Онкогематология, 2016. - Т.11(4), с.74-79. ХВАСТУНОВА А.Н. Параллельное исследование морфологии и иммунофенотипа нормальных и патологических лимфоцитов с помощью клеточного биочипа. Дисс.к.б.н., Москва, 2016. * |
| ХВАСТУНОВА А.Н. Параллельное исследование морфологии и иммунофенотипа нормальных и патологических лимфоцитов с помощью клеточного биочипа. Дисс.к.б.н., Москва, 2016. * |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN115615786A (zh) * | 2022-10-17 | 2023-01-17 | 河南赛诺特生物技术有限公司 | 骨髓涂片小巨核细胞染色试剂盒、染色方法及应用 |
| RU2818950C1 (ru) * | 2022-11-21 | 2024-05-07 | федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный медицинский исследовательский центр детской гематологии, онкологии и иммунологии имени Дмитрия Рогачева" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Метод определения минимальной остаточной болезни методом мультипараметрической проточной цитометрии у детей и взрослых с В-линейным острым лимфобластным лейкозом в условиях применения CD19-направленной иммунотерапии |
| RU2835519C2 (ru) * | 2023-05-29 | 2025-02-26 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Дагестанский федеральный исследовательский центр Российская академия наук | Гамма-резонансный метод ранней диагностики лейкоза |
| RU2835466C1 (ru) * | 2023-12-28 | 2025-02-25 | Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Научно-исследовательский институт общей патологии и патофизиологии" (ФГБНУ "НИИОПП") | Способ определения хронического лимфоцитарного лейкоза |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Wood et al. | P‐glycoprotein expression on acute myeloid leukaemia blast cells at diagnosis predicts response to chemotherapy and survival | |
| Paietta et al. | A surrogate marker profile for PML/RARα expressing acute promyelocytic leukemia and the association of immunophenotypic markers with morphologic and molecular subtypes | |
| US7364906B2 (en) | Products and methods for single parameter and multiparameter phenotyping of cells | |
| Kaleem et al. | Flow cytometric analysis of acute leukemias | |
| Farahat et al. | Quantitative flow cytometry can distinguish between normal and leukaemic B‐cell precursors | |
| US7537907B2 (en) | Products and methods for single parameter and multiparameter phenotyping of cells | |
| US20090269773A1 (en) | Methods of determining the health status of an individual | |
| Kularatne et al. | Monitoring tumour cells in the peripheral blood of small cell lung cancer patients | |
| US20100261204A1 (en) | Composite Profiles of Cell Antigens and Target Signal Transduction Proteins for Analysis and Clinical Management of Hematologic Cancers | |
| MX2014008928A (es) | Metodo para detectar celulas tumorales circunlantes 5t4-positivas y metodos de diagnostico de cancer 5t4-positivo en un sujeto mamifero. | |
| JP2008178421A (ja) | リンパ球機能の測定方法 | |
| Höchsmann et al. | Paroxysmal nocturnal hemoglobinuria (PNH): higher sensitivity and validity in diagnosis and serial monitoring by flow cytometric analysis of reticulocytes | |
| Abdel-Ghafar et al. | Immunophenotyping of chronic B-cell neoplasms: flow cytometry versus immunohistochemistry | |
| Churchill et al. | Leukocyte immunoglobulin‐like receptor B1 and B4 (LILRB1 and LILRB4): highly sensitive and specific markers of acute myeloid leukemia with monocytic differentiation | |
| Chen et al. | Immunophenotyping by multiparameter flow cytometry | |
| Fisher et al. | Immunophenotyping lymphomas in dogs: a comparison of results from fine needle aspirate and needle biopsy samples | |
| CN112578117B (zh) | 抗体组合物及其筛查移植后淋巴细胞增殖性疾病的应用 | |
| Boris et al. | Immunophenotypic portrait of leukemia‐associated‐phenotype markers in B acute lymphoblastic leukemia | |
| Palacio et al. | Flow cytometry in the bone marrow evaluation of follicular and diffuse large B-cell lymphomas | |
| Kotylo et al. | Flow cytometric immunophenotypic characterization of pediatric and adult minimally differentiated acute myeloid leukemia (AML-M0) | |
| RU2681651C1 (ru) | Способ дифференциальной диагностики острых лейкозов с помощью клеточного биочипа | |
| Hjalmar et al. | Trisomy 12 and lymphoplasmacytoid lymphocytes in chronic leukemic B-cell disorders | |
| Rico et al. | Is alkaline phosphatase the smoking gun for highly refractory primitive leukemic cells? | |
| EP1181551B1 (en) | Products and methods for single parameter and multiparameter phenotyping of cells | |
| Magnano et al. | T-cell subsets in lymph nodes identify a subgroup of follicular lymphoma patients with favorable outcome |