[go: up one dir, main page]

RU2671482C2 - Маленькие липосомы для доставки кодирующей иммуноген рнк - Google Patents

Маленькие липосомы для доставки кодирующей иммуноген рнк Download PDF

Info

Publication number
RU2671482C2
RU2671482C2 RU2013114392A RU2013114392A RU2671482C2 RU 2671482 C2 RU2671482 C2 RU 2671482C2 RU 2013114392 A RU2013114392 A RU 2013114392A RU 2013114392 A RU2013114392 A RU 2013114392A RU 2671482 C2 RU2671482 C2 RU 2671482C2
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
rna
liposomes
liposome
immunogen
virus
Prior art date
Application number
RU2013114392A
Other languages
English (en)
Other versions
RU2013114392A (ru
Inventor
Эндрю ДЖИЛЛ
Аюш ВЕРМА
Original Assignee
Новартис Аг
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=44645813&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=RU2671482(C2) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Новартис Аг filed Critical Новартис Аг
Publication of RU2013114392A publication Critical patent/RU2013114392A/ru
Application granted granted Critical
Publication of RU2671482C2 publication Critical patent/RU2671482C2/ru

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Synthetic bilayered vehicles, e.g. liposomes or liposomes with cholesterol as the only non-phosphatidyl surfactant
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Synthetic bilayered vehicles, e.g. liposomes or liposomes with cholesterol as the only non-phosphatidyl surfactant
    • A61K9/1271—Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes or liposomes coated or grafted with polymers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Synthetic bilayered vehicles, e.g. liposomes or liposomes with cholesterol as the only non-phosphatidyl surfactant
    • A61K9/1271—Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes or liposomes coated or grafted with polymers
    • A61K9/1272—Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes or liposomes coated or grafted with polymers comprising non-phosphatidyl surfactants as bilayer-forming substances, e.g. cationic lipids or non-phosphatidyl liposomes coated or grafted with polymers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/10—Antimycotics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P33/00—Antiparasitic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/88—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation using microencapsulation, e.g. using amphiphile liposome vesicle
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/53—DNA (RNA) vaccination
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55555—Liposomes; Vesicles, e.g. nanoparticles; Spheres, e.g. nanospheres; Polymers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Synthetic bilayered vehicles, e.g. liposomes or liposomes with cholesterol as the only non-phosphatidyl surfactant
    • A61K9/1277—Preparation processes; Proliposomes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/16011—Herpesviridae
    • C12N2710/16111—Cytomegalovirus, e.g. human herpesvirus 5
    • C12N2710/16134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/18011—Paramyxoviridae
    • C12N2760/18511—Pneumovirus, e.g. human respiratory syncytial virus
    • C12N2760/18534—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/36011—Togaviridae
    • C12N2770/36111—Alphavirus, e.g. Sindbis virus, VEE, EEE, WEE, Semliki
    • C12N2770/36141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2770/36143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/36011—Togaviridae
    • C12N2770/36111—Alphavirus, e.g. Sindbis virus, VEE, EEE, WEE, Semliki
    • C12N2770/36171—Demonstrated in vivo effect
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

Настоящее изобретение относится к биотехнологии, в частности к липосоме длядоставки РНК в клетку позвоночного. Указанная липосома содержит инкапсулированную самореплицирующуюся РНК, кодирующей представляющий интерес иммуноген, в молярных процентах от 20% до 80% катионного липида, от 35% до 50% холестерина и цвиттерионный липид. Липосома имеет диаметр в интервале значений 60-180 нм. Указанный иммуноген, который инкапсулирован в липосому, вызывает иммунный ответ против бактерии, вируса, грибка или паразита. Настоящее изобретение раскрывает фармацевтическую композицию для иммунизации субъектов, содержащую эффективное количество указанной липосомы, и способ выработки защитной иммунной реакции у позвоночных с её использованием. Настоящее изобретение позволяет улучшить доставку вакцин из нуклеиновых кислот в организм субъекта. 3 н. и 7 з.п. ф-лы, 18 ил., 1 табл., 1 пр.

Description

Рассматриваемая заявка заявляет приоритет относительно U.S. предварительной заявки номер 61/378831, поданной 31 августа 2010, полное содержание которой включено сюда по ссылке во всех отношениях.
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ НАСТОЯЩЕЕ ИЗОБРЕТЕНИЕ
Настоящее изобретение относится к области невирусной доставки РНК для иммунизации.
ИЗВЕСТНЫЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Доставка нуклеиновых кислот для иммунизации животных являлась задачей в течение нескольких лет. Были тестированы различные подходы, включая использование ДНК или РНК, вирусных или невирусных носителей доставки (или даже без носителей доставки, в "оголенной" вакцине), реплицирующихся или нереплицирующихся векторов, или вирусных или невирусных векторов.
Остается необходимость в дальнейшем усовершенствовании вакцин из нуклеиновых кислот и, в частности, разработке усовершенствованных способов доставки вакцин из нуклеиновых кислот.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
В соответствии с настоящим изобретением иммунизацию нуклеиновыми кислотами обеспечивают путем введения РНК, инкапсулированной в липосомы. РНК кодирует представляющий интерес иммуноген, и диаметр липосом находится в интервале 60-180 нм, и идеально в интервале 80-160 нм. Такой размер сравним, например, с диаметром ~40 нм для лишенного оболочки изометрического белкового капсида альфавируса. Комбинация эффективного инкапсулирования РНК (особенно самореплицирующейся РНК) внутри маленькой липосомы обеспечивает эффективную доставку для выработки сильной иммунной реакции.
Таким образом, в настоящем изобретении предложена липосома, внутри которой инкапсулирована РНК, кодирующая представляющий интерес иммуноген, где диаметр липосомы находится в интервале 60-180 нм. Такие липосомы можно использовать для in vivo доставки РНК в клетки позвоночных, и таким образом они оказываются полезными в качестве компонентов фармацевтических композиций для иммунизации субъектов против различных заболеваний.
В настоящем изобретении также предложен способ получения содержащих РНК липосом, включающий стадию смешивания РНК с одним или более из липидов, в таких условиях, в которых липиды образуют липосомы с диаметром в интервале 60-180 нм и в которых РНК инкапсулирована.
Липосомы
В настоящем изобретении используют липосомы, внутри которых инкапсулированы кодирующие иммуноген РНК. Таким образом, РНК (как и в природном вирусе) оказывается изолированной от любой внешней среды. Обнаружено, что инкапсулирование в липосомы защищает РНК от расщепления РНКазой. Такие липосомы могут включать некоторые внешние РНК (например, на их поверхности), но по меньшей мере, половина РНК (а в идеале все они) инкапсулированы в ядре липосом. Инкапсулирование внутри липосом отличается от, например, комплексов липид/РНК, раскрытых в ссылке 1, где РНК смешивают с предварительно сформированными липосомами. Различные амфифильные липиды могут образовывать двойные слои в водном окружении, чтобы инкапсулировать РНК-содержащее водное ядро, по типу липосомы. Указанные липиды могут иметь анионные, катионные или цвиттерионные концевые группы. Образование липосом из анионных фосфолипидов относится к 1960-м, и липиды, образующие катионные липосомы, исследовали, начиная с 1990-х. Некоторые фосфолипиды являются анионными, тогда как другие являются цвиттерионными а другие являются катионными. Подходящие классы фосфолипидов включают, но ими не ограничиваются, фосфатидилэтаноламины, фосфатидилхолины, фосфатидилсерины и фосфатидилглицерины и некоторые полезные фосфолипиды перечислены в таблице 1. Подходящие катионные липиды включают, но ими не ограничиваются, диолеоилтриметиламмонийпропан (DOTAP), 1,2-дистеарилокси-N,N-диметил-3-аминопропан (DSDMA), 1,2-диолеилокси-N,N-диметил-3-аминопропан (DODMA), 1,2-ди-О-октадеценил-3-триметиламмонийпропан (DOTMA), 1,2-дилинолеилокси-N,N-диметил-3-аминопропан (DLinDMA), 1,2-дилиноленилокси-N,N-диметил-3-аминопропан (DLenDMA). Цвиттерионные липиды включают, но ими не ограничиваются, ацил-цвиттерионные липиды и эфир-цвиттерионные липиды. Примерами подходящих цвиттерионных липидов являются DPPC, DOPC, DSPC, додецилфосфохолин, 1,2-диолеоил-sn-глицеро-3-фосфатидилэтаноламин (DOPE), и 1,2-дифитаноил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин (DPyPE). Указанные липиды могут быть насыщенными или ненасыщенными. Для получения липосом, предпочтительно использовать по меньшей мере один ненасыщенный липид. Если ненасыщенный липид имеет две концевые группы, обе концевые группы могут быть ненасыщенными, или у него может быть одна насыщенная концевая группа и одна ненасыщенная концевая группа. Липиды могут включать стероидную группу на одном конце, например, как в RV05 (см. также ФИГ.16A и C-K).
Так, в некоторых вариантах, в настоящем изобретении предложены липосомы, содержащие липидный бислой, инкапсулирующий водное ядро, где: (i) липосомы имеют диаметр в интервале 60-180 нм; и (ii) водное ядро включает РНК, которая кодирует иммуноген.
Липосомы настоящего изобретения можно сформировать из одного липида или из смеси липидов. Такая смесь может включать (i) смесь анионных липидов, (ii) смесь катионных липидов, (iii) смесь цвиттерионных липидов, (iv) смесь анионных липидов и катионных липидов, (v) смесь анионных липидов и цвиттерионных липидов, (vi) смесь цвиттерионных липидов и катионных липидов, или (vii) смесь анионных липидов, катионных липидов и цвиттерионных липидов. Аналогично, смесь может включать как насыщенные, так и ненасыщенные липиды. Например, смесь может включать DSPC (цвиттерионный, насыщенный), DlinDMA (катионный, ненасыщенный) и/или DMG (анионный, насыщенный). Если используют смесь липидов, вовсе не все компоненты липидов в смеси должны быть амфифильными, например, один или более из амфифильных липидов может быть смешан с холестерином.
Если липосомы настоящего изобретения образуются из смеси липидов, предпочтительно, чтобы доля указанных катионных липидов составляла от 20 до 80% от полного количества липидов, например, между 30-70%, или между 40-60%. Остальное может составлять, например, холестерин (например, 35-50% холестерина) и/или DMG (необязательно пегилированный) и/или DSPC. Использование таких смесей представлено далее. Приводимые процентные значения являются мольными процентами.
Липосомы могут включать амфифильные липиды, гидрофильная часть которых пегилирована (т.е. модифицирована за счет ковалентного присоединения полиэтиленгликоля). Такая модификация может повысить стабильность и предотвратить неспецифическую адсорбцию указанных липосом. Например, липиды могут быть конъюгированы с ПЭГ с использованием способов, таких как те, что раскрыты в ссылках 2 и 3. ПЭГ снабжает липосомы оболочкой, которая может придавать подходящие фармакокинетические характеристики. Можно использовать ПЭГ различной длины, например, между 0,5 и 8 кДа.
Итак, липосомы можно сформировать из катионных липидов (например, DlinDMA, RV05), цвиттерионных липидов (например, DSPC, DPyPE), холестерина и пегилированных липидов. В представленных примерах используют смесь DSPC, DlinDMA, ПЭГ-DMG и холестерина, также как некоторые другие смеси.
Липосомы обычно подразделяют на три группы: многослойные пузырьки (MLV); маленькие однослойные пузырьки (SUV); и крупные однослойные пузырьки (LUV). MLV имеют множество бислоев в каждом пузырьке, образующих несколько отдельных водных отделений. SUV и LUV имеют один бислой, инкапсулирующий водное ядро; SUV обычно имеют диаметр ≤50 нм, и LUV имеют диаметр >50 нм. Липосомы настоящего изобретения представляют собой идеальные LUV с диаметром в интервале 60-180 нм, и предпочтительно в интервале 80-160 нм. Указанные липосомы предпочтительно являются практически сферическими. Если они не являются сферическими, указанный термин "диаметр " относится к наибольшему диаметру поперечного сечения липосомы.
Липосомы настоящего изобретения могут составлять часть композиции, включающей множество липосом, и липосомы, составляющие указанное множество, могут иметь различные диаметры. Для композиции, включающей популяцию липосом с различными диаметрами: (i) по меньшей мере 80% от числа липосом должны иметь диаметры в интервале 60-180 нм, и предпочтительно, в интервале 80-160 нм, и/или (ii) средний диаметр (определенный по интенсивности, например, Z-среднее) популяции идеально находится в интервале 60-180 нм, и предпочтительно, в интервале 80-160 нм.
Идеально, если распределение липосом по размерам (по интенсивности) имеет только один максимум, т.е. существует одна популяция липосом с распределением вокруг среднего значения (вид), скорее не имеющая двух максимумов. Диаметры внутри популяции липосом в идеале должны иметь показатель полидисперсности <0,2, и иногда <0,1. Ожидают, что комплексы липосома/РНК, раскрытые в ссылке 1, должны иметь диаметры в интервале 600-800 нм и должны отличаться высокой степенью полидисперсности.
Аппаратура для определения среднего диаметра частиц в суспензии липосом и распределения по размерам, коммерчески доступна. Указанные типично используемые методы динамического светорассеяния и/или оптического определение одиночных частиц, представляет собой например, серии приборов Accusizer™ и Nicomp™, доступные от Particle Sizing Systems (Santa Barbara, USA), или приборы Zetasizer™ от Malvern Instruments (UK), или анализатор Particle Size Distribution Analyzer от Horiba (Kyoto, Japan). Метод динамического светорассеяния является предпочтительным методом, с помощью которого определяют размеры липосом. Для популяции липосом, предпочтительным способом определения среднего диаметра липосом в композициях настоящего изобретения является определение величины Z-среднего, т.е. средневзвешенной интенсивности гидродинамического размера общей совокупности липосом, измеренного методом динамического светорассеяния (DLS). Z-среднее определяют с помощью кумулятивного анализа измеренной корреляционной кривой, где принимают размер отдельной частицы (диаметр липосомы) и применяют простое экспоненциальное приближение к автокорреляционной функции. Алгоритм кумулятивного анализа не дает распределения, но, в дополнении к определенному по средневзвешенной интенсивности Z-среднему, определяет коэффициент полидисперсности.
Способы получения подходящих липосомы хорошо известны специалистам, например, смотри ссылки 4-6. Один подходящий способ раскрыт в ссылке 7 и включает смешивание (i) этанольного раствора липидов, (ii) водного раствора нуклеиновой кислоты и (iii) буфера, с последующим перемешиванием, уравновешиванием, разбавлением и очисткой. Предпочтительные липосомы настоящего изобретения можно получить таким способом смешивания. Для получения липосом с нужным диаметром(ами), смешивание можно осуществить, используя способ, в котором два сырьевых потока водного РНК раствора объединяют в единой зоне смешивания с одним потоком этанольного липидного раствора, причем все потоки поступают с одинаковой скоростью например, в микрофлюидизированный канал, как раскрыто далее.
РНК
Липосомы настоящего изобретения включают РНК молекулы, которые (в отличие от siРНК (короткая интерферирующая РНК)) кодируют иммуноген. После in vivo введения частиц, РНК выделяются из частиц и транслируются внутрь клетки для создания иммуногена in situ.
РНК является +-цепочечной, и поэтому она может транслироваться клетками без необходимости в каких-либо промежуточных стадиях репликации, таких как обратная транскрипция. РНК может также связаться с TLR7 рецепторами, экспрессируемыми иммунными клетками, тем самым инициируя эффект адъюванта.
Предпочтительные +-цепочечные РНК являются самореплицирующимися. Самореплицирующиеся молекулы РНК (репликоны) могут, если они введены в клетки позвоночных животных, даже без каких-либо белков, привести к продуцированию множества дочерних РНК за счет собственной транскрипции (через антисмысловые копии, которые они создают сами из себя). Самореплицирующиеся молекулы РНК являются типичными +-цепочечными молекулами, которые могут непосредственно транслироваться после доставки в клетку, и в результате такой трансляции получают РНК-зависимую РНК-полимеразу, которая затем продуцирует как антисмысловые, так и смысловые транскрипты из введенной РНК. Таким образом, введенная РНК приводит к продуцированию множества дочерних РНК. Такие дочерние РНК, также как коллинеарные субгеномные транскрипты, могут быть транслированы ими самими, что приводит к in situ экспрессии кодированного иммуногена, или могут быть транскрибированы, обеспечивая дальнейшие транскрипты с тем же смыслом, что и введенные РНК, которые транслируются для обеспечения in situ экспрессии иммуногена. Итоговым результатом указанной последовательности транскрипций является колоссальное увеличение количества введенных репликоновых РНК, и таким образом кодированный иммуноген становится основным полипептидным продуктом клеток.
Одной из подходящих систем для достижения саморепликации является использование РНК репликона на основе альфавируса. Такие +-цепочечные репликоны транслируются после доставки в клетку, приводя к образованию репликазы (или репликаза-транскриптазы). Такая репликаза транслируется как полипротеин, который авто-расщепляется, обеспечивая репликацию комплекса, который создает копии геномной --цепочки из +-цепочки, поставляемой РНК. Указанные --цепочечные транскрипты сами могут быть транскрибированы с созданием дальнейших копий +-цепочечных исходных РНК и также обеспечивают получение субгеномного транскрипта, который кодирует иммуноген. Таким образом, трансляция субгеномного транскрипта приводит к in situ экспрессии указанного иммуногена инфицированной клеткой. Подходящие альфавирусные репликоны могут использовать репликазу из Sindbis вируса, вируса леса Семлики, вируса восточного энцефалита лошадей и вируса венесуэльского энцефалита лошадей и т.д. Можно использовать последовательности мутантных или дикого типа вирусов, например, ослабленный TC83 мутант VEEV был использован в репликонах [8].
Предпочтительные самореплицирующиеся молекулы РНК кодируют (i) РНК-зависимую РНК полимеразу, которая может транскрибировать РНК из самореплицирующейся РНК молекулы, и (ii) иммуноген. Такая полимераза может быть альфавирусной репликазой, например, включающей один или более из альфавирусных белков nsP1, nsP2, nsP3 и nsP4.
Несмотря на то что природные альфавирусные геномы кодируют структурные белки вирионов в дополнение к неструктурным полипротеинам репликазы, предпочтительно, чтобы самореплицирующиеся молекулы РНК настоящего изобретения не кодировали структурные альфавирусные белки. Таким образом, предпочтительные самореплицирующиеся РНК могут привести к продуцированию своих копий геномных РНК в клетке, но не к продуцированию содержащих РНК вирионов. Неспособность продуцировать указанные вирионы означает, что в отличие от альфавируса дикого типа самореплицирующаяся молекула РНК не может сохраняться в инфекционной форме. Структурные белки альфавируса, которые необходимы для сохранения в вирусах дикого типа, отсутствуют в самореплицирующихся РНК настоящего изобретения и их место занимает ген(ы), кодирующий представляющий интерес иммуноген, так что субгеномный транскрипт кодирует скорее иммуноген, нежели структурные белки альфавирусного вириона.
Так, самореплицирующиеся РНК молекулы, которые можно использовать в настоящем изобретении, могут иметь две открытые считывающие рамки. Первая (5’) открытая считывающая рамка кодирует репликазу; вторая (3’) открытая считывающая рамка кодирует иммуноген. В некоторых вариантах РНК могут иметь (например, в прямом направлении) открытые считывающие рамки, например, для кодирования дополнительных иммуногенов (см. далее) или для кодирования вспомогательных полипептидов.
Самореплицирующаяся РНК молекула может иметь 5’ последовательность, которая совместима с закодированной репликазой.
Самореплицирующиеся молекулы РНК могут быть различной длины, но обычно они состоят из 5000-25000 нуклеотидов в длину, например, 8000-15000 нуклеотидов или 9000-12000 нуклеотидов. Таким образом, РНК оказывается длиннее, чем видно в siРНК доставке.
РНК молекула, которую можно использовать в настоящем изобретении, может иметь 5’-кэп (например, 7-метилгуанозин). Такой кэп может усилить in vivo трансляцию РНК.
5’-нуклеотид молекулы РНК, который можно использовать в настоящем изобретении, может содержать 5’-трифосфатную группу. В кэпированной РНК указанная группа может быть связана с 7-метилгуанозином посредством 5’-до-5’ мостика. 5’ трифосфат может усиливать RIG-I связывание, и таким образом промотировать эффекты адъюванта.
Молекула РНК может содержать 3’ поли-A концевую группу. Она также может включать последовательность, распознающую поли-А полимеразу (например, AAUAAA) вблизи ее 3’ конца.
Молекула РНК, которую можно использовать в настоящем изобретении, обычно является одноцепочечной. Одноцепочечные РНК обычно могут инициировать эффект адъюванта, путем связывания с TLR7, TLR8, РНК-геликазами и/или PKR. РНК, введенная в двухцепочечной форме (дцДНК), может связываться с TLR3, и указанный рецептор также может быть стимулирован за счет дцДНК, которая образуется или во время репликации одноцепочечной РНК или внутри вторичной структуры одноцепочечной РНК.
Молекулы РНК, которые можно использовать в настоящем изобретении, обычно удобно получать путем in vitro транскрипции (IVT). IVT может использовать (кДНК) матрицу, созданную и размноженную в плазмидной форме в бактериях, или созданную синтетически (например в результате использования способов генного синтеза и/или полимеразной цепной реакции). Например, ДНК-зависимая РНК полимераза (такая как бактериофаг T7, T3 или SP6 РНК полимеразы) может быть использована для транскрибирования РНК из ДНК матрицы. Подходящие реакции кэппинга и поли-А присоединения можно использовать при необходимости (хотя поли-А репликона обычно кодируется внутри ДНК матрицы). Такие РНК полимеразы могут выдвигать жесткие требования в отношении транскрибированного 5’ нуклеотида (нуклеотидов) и в некоторых вариантах указанные требования должны удовлетворять требованиям кодированной репликазы, чтобы обеспечить способность IVT-транскрибированной РНК функционировать эффективно в качестве субстрата для ее самокодирующейся репликазы.
Как обсуждалось в ссылке 9, самореплицирующиеся РНК могут включать (в дополнении к любой 5’-кэп структуре) один или более из нуклеотидов, содержащих модифицированное нуклеооснование. Так, РНК может включать m5C (5-метилцитидин), m5U (5-метилуридин), m6A (N6-метиладенозин), s2U (2-тиоуридин), Um (2’-O-метилуридин), m1A (1-метиладенозин); m2A (2-метиладенозин); Am (2’-О-метиладенозин); ms2m6A (2-метилтио-N6-метиладенозин); i6A (N6-изопентинаденозин); ms2i6A (2-метилтио-N6-изопентинаденозин); io6A (N6-(цис-гидроксиизопентин)аденозин); ms2io6A (2-метилтио-N6-(цис-гидроксиизопентин)аденозин); g6A (N6-глицинилкарбамоиладенозин); t6A (N6-треонилкарбамоиладенозин); ms2t6A (2-метилтио-N6 треонилкарбамоиладенозин); m6t6A (N6-метил-N6-треонилкарбамоиладенозин); hn6A(N6.-гидроксинорвалилкарбамоиладенозин); ms2hn6A (2-метилтио-N6-гидроксинорвалилкарбамоиладенозин); Ar(p) (2’-О-рибозиладенозин (фосфат)); I (инозин); ml1 (1-метилинозин); m’Im (1,2’-О-диметилинозин); m3C (3-метилцитидин); Cm (2T-О-метилцитидин); s2C (2-тиоцитидин); ac4C (N4-ацетилцитидин); f5C (5-формилцитидин); m5Cm (5,2-О-диметилцитидин); ac4Cm (N4ацетил2TOметилцитидин); k2C (лизидин); m1G (1-метилгуанозин); m2G (N2-метилгуанозин); m7G (7-метилгуанозин); Gm (2’-О-метилгуанозин); m22G (N2,N2-диметилгуанозин); m2Gm (N2,2’-О-диметилгуанозин); m22Gm (N2,N2,2’-О-триметилгуанозин); Gr(p) (2’-О-рибозилгуанозин (фосфат)); yW (вибутозин); o2yW (пероксивибутозин); OHyW (гидроксивибутозин); OHyW* (недомодифицированный гидроксивибутозин); imG (виозин); mimG (метилгуанозин); Q (куэозин); oQ (эпоксикуэозин); galQ (галтаклозил-куэозин); manQ (маннозил-куэозин); preQo (7-циано-7-деазагуанозин); preQi (7-аминометил-7-деазагуанозин); G* (архаэозин); D (дигидроуридин); m5Um (5,2’-О-диметилуридин); s4U (4-тиоуридин); m5s2U (5-метил-2-тиоуридин); s2Um (2-тио-2’-О-метилуридин); acp3U (3-(3-амино-3-карбоксипропил)уридин); ho5U (5-гидроксиуридин); mo5U (5-метоксиуридин); cmo5U (уридин 5-оксиуксусная кислота); mcmo5U (уридин 5-оксиуксусной кислоты метиловый эфир); chm5U (5-(карбоксигидроксиметил)уридин)); mchm5U (5-(карбоксигидроксиметил)уридина метиловый эфир); mcm5U (5-метоксикарбонилметилуридин); mcm5Um (S-метоксикарбонилметил-2-O-метилуридин); mcm5s2U (5-метоксикарбонилметил-2-тиоуридин); nm5s2U (5-аминометил-2-тиоуридин); mnm5U (5-метиламинометилуридин); mnm5s2U (5-метиламинометил-2- тиоуридин); mnm5se2U (5-метиламинометил-2-селеноуридин); ncm5U (5-карбамоилметилуридин); ncm5Um (5-карбамоилметил-2’-О-метилуридин); cmnm5U (5-карбоксиметиламинометилуридин); cnmm5Um (5-карбоксиметиламинометил-2-L-O-метилуридин); cmnm5s2U (5-карбоксиметиламинометил-2-тиоуридин); m62A (N6,N6- диметиладенозин); Tm (2’-О-метилинозин); m4C (N4-метилцитидин); m4Cm (N4,2-О-диметилцитидин); hm5C (5-гидроксиметилцитидин); m3U (3-метилуридин); cm5U (5-карбоксиметилуридин); m6Am (N6,T-О-диметиладенозин); rn62Am (N6,N6,-О-2-триметиладенозин); m2’7G (N2,7-диметилгуанозин); m2’2’7G (N2,N2,7-триметилгуанозин); m3Um (3,2T-О-диметилуридин); m5D (5-метилдигидроуридин) f5Cm (5-формил-2’-О-метилцитидин); m1Gm (1,2’-О-диметилгуанозин); m’Am (1,2-O-диметиладенозин)иринометилуридин); tm5s2U (S-тауринометил-2-тиоуридин)); imG-14 (4-деметилгуанозин); imG2 (изогуанозин); или ac6A (N6-ацетиладенозин), гипоксантин, инозин, 8-оксо-аденин, 7-замещенные их производные, дигидроурацил, псевдоурацил, 2-тиоурацил, 4-тиоурацил, 5-аминоурацил, 5-(C1-C6)-алкилурацил, 5-метилурацил, 5-(C2-C6)-алкенилурацил, 5-(C2-C6)-алкинилурацил, 5-(гидроксиметил)урацил, 5-хлорурацил, 5-фторурацил, 5-бромурацил, 5-гидроксицитозин, 5-(C1-C6)-алкилцитозин, 5-метилцитозин, 5-(C2-C6)-алкенилцитозин, 5-(C2-C6)-алкинилцитозин, 5-хлорцитозин, 5-фторцитозин, 5-бромцитозин, N2-диметилгуанин, 7-деазагуанин, 8-азагуанин, 7-деаза-7-замещенный гуанин, 7-деаза-7-(C2-C6)алкинилгуанин, 7-деаза-8-замещенный гуанин, 8-гидроксигуанин, 6-тиогуанин, 8-оксогуанин, 2-аминопурин, 2-амино-6-хлорпурин, 2,4-диаминопурин, 2,6-диаминопурин, 8-азапурин, замещенный 7-деазапурин, 7-деаза-7-замещенный пурин, 7-деаза-8-замещенный пурин, или абазический нуклеотид. Например, самореплицирующиеся РНК могут включать одно или более из модифицированных пиримидиновых нуклеооснований, таких как остатки псевдоуридина и/или 5-метилцитозина. В некоторых вариантах, однако, РНК включают немодифицированные нуклеооснования, и могут включать немодифицированные нуклеотиды т.е. все нуклеотиды в РНК представляют собой стандартные A, C, G и U рибонуклеотиды (за исключением любых 5’-кэп структур, которые могут включать 7’-метилгуанозин). В других вариантах, РНК могут включать 5’-кэп, включающий 7’-метилгуанозин, и первые 1, 2 или 3 5’-рибонуклеотида могут быть метилированы по 2’-положению рибозы.
РНК, которые используют в настоящем изобретении, в идеале включают только фосфодиэфирные связи между нуклеозидами, но в некоторых вариантах они могут содержать фосфорамидатные, фосфоротиоатные и/или метилфосфонатные связи.
Идеально, если липосомы настоящего изобретения включают меньше, чем 10 различных видов РНК, например, 5, 4, 3 или 2 различных вида; наиболее предпочтительно, если липосомы включают один вид РНК, т.е. все молекулы РНК в липосомах содержат одинаковые последовательности, причем одинаковой длины.
Количество РНК в липосоме может варьироваться. Число индивидуальных самореплицирующихся молекул РНК в липосоме обычно составляет ≤50, например, <20, <10, <5 или 1-4 на липосому.
Иммуноген
Молекулы РНК, используемые в настоящем изобретении, кодируют полипептидный иммуноген. После введения липосом РНК транслируется in vivo, и указанный иммуноген может вызвать иммунную реакцию у реципиента. Указанный иммуноген может вызвать иммунную реакцию против бактерии, вируса, грибков или паразита (или, в некоторых вариантах, против аллергена; и в других вариантах, против опухолевого антигена). Иммунная реакция может включать реакцию антител (обычно включающую IgG) и/или опосредованную клеткой иммунную реакцию. Полипептидный иммуноген обычно вызывает иммунную реакцию, которая распознает соответствующий бактериальный, вирусный, грибковый или паразитарный (или аллергена или опухоли) полипептид, но в некоторых вариантах такой полипептид может действовать как мимеотоп, вызывая иммунную реакцию, которая распознает бактериальный, вирусный, грибковый или паразитарный сахарид. Указанный иммуноген обычно представляет собой поверхностный полипептид, например, адгезин, гемагглютинин, оболочковый гликопротеин, спайковый гликопротеин и т.д.
Молекула РНК может кодировать один полипептидный иммуноген или множественные полипептиды. Множественные иммуногены могут присутствовать в виде одного полипептидного иммуногена (фьюжн полипептид) или в виде отельных полипептидов. Если иммуногены экспрессируются в виде отдельных полипептидов репликона, тогда один или более из них может быть снабжен в обратном направлении IRES или дополнительным вирусным промоторным элементом. Альтернативно, множественные иммуногены могут экспрессироваться из полипротеина, который кодирует отдельные иммуногены, слитые с короткой автокаталитической протеазой (например, 2A белком вируса ящура), или в виде интеинов.
В отличие от ссылок 1 и 10, РНК кодирует иммуноген. Во избежание сомнений, настоящее изобретение не включает РНК, которые кодируют люциферазу светлячков или кодируют рекомбинантный белок E.coli β-галактозидазы или кодируют зеленый флуоресцентный белок (GFP). Такие полипептиды могут быть полезны в качестве маркеров, или даже в контексте генной терапии, но настоящее изобретение касается доставки РНК стимуляции системы иммунологической реакции. Оптимальный диаметр липосом для генной терапии может отличаться от диаметра липосом для целей иммунизации, так как мишеневые клетки и ткани различны для указанных двух подходов. Так иммуноген также не является самостоятельным белком, который вводят для дополнения или замены дефективного белка хозяина (что происходит в генной терапии). Также указанная РНК не является полной РНК мышиного тимуса.
В некоторых вариантах иммуноген вызывает иммунную реакцию против одной из указанных бактерий:
Neisseria meningitidis: подходящие иммуногены включают, но ими не ограничиваются, мембранные белки, такие как адгезины, автотранспортеры, токсины, накапливающие железо белки и белок, связывающий фактор H. Комбинация их трех подходящих полипептидов раскрыта в ссылке 11.
Streptococcus pneumoniae: подходящие полипептидные иммуногены раскрыты в ссылке 12. Они включают, но ими не ограничиваются, RrgB плюс субъединицу, предшественник бета-N-ацетилгексозаминидазы (spr0057), spr0096, белок общего стресса GSP-781 (spr2021, SP2216), серин/треонинкиназу StkP (SP1732) и пневмококковый поверхностный адгезин PsaA.
Streptococcus pyogenes: подходящие иммуногены включают, но ими не ограничиваются, полипептиды, раскрытые в ссылках 13 и 14.
Moraxella catarrhalis
Bordetella pertussis: Подходящие коклюшевые иммуногены включают, но ими не ограничиваются, токсин коклюша или коклюшевый токсоид (PT), филаментный гемагглютинин (FHA), пертактин, и агглютиногены 2 и 3.
Staphylococcus aureus: Подходящие иммуногены включают, но ими не ограничиваются, полипептиды, раскрытые в ссылке 15, такие как гемолизин, esxA, esxB, белок, связывающий феррихром (sta006) и/или sta011 липопротеин.
Clostridium tetani: типичный иммуноген представляет собой столбнячный токсоид.
Corynebacterium diphtheriae: типичный иммуноген представляет собой дифтерийный токсоид.
Haemophilus influenzae: Подходящие иммуногены включают, но ими не ограничиваются, полипептиды, раскрытые в ссылках 16 и 17.
Pseudomonas aeruginosa
Streptococcus agalactiae: подходящие иммуногены включают, но ими не ограничиваются, полипептиды, раскрытые в ссылке 13.
Chlamydia trachomatis: Подходящие иммуногены включают, но ими не ограничиваются, PepA, LcrE, ArtJ, DnaK, CT398, OmpH-подобный, L7/L12, OmcA, AtoS, CT547, Eno, HtrA и MurG (например, как раскрыто в ссылке 18. LcrE [19] и HtrA [20] представляют собой два предпочтительных иммуногена).
Chlamydia pneumoniae: Подходящие иммуногены включают, но ими не ограничиваются, полипептиды, раскрытые в ссылке 21.
Helicobacter pylori: Подходящие иммуногены включают, но ими не ограничиваются, CagA, VacA, NAP и/или уреазу [22].
Escherichia coli: Подходящие иммуногены включают, но ими не ограничиваются, иммуногены, полученные из энтеротоксигенной E. coli (ETEC), энтероаггреативной E. coli (EAggEC), диффузно приклеивающейся E. coli (DAEC), энтеропатогенной E. coli (EPEC), экстраинтестинальной патогенной E. coli (ExPEC) и/или энтерогеморрагической E. coli (EHEC). ExPEC штаммы включают уропатогенную E.coli (UPEC) и связанную с менингитом/сепсисом E.coli (MNEC). Подходящие UPEC полипептидные иммуногены раскрыты в ссылках 23 и 24. Подходящие MNEC иммуногены раскрыты в ссылке 25. Подходящим иммуногеном для некоторых типов E.coli является AcfD [26].
Bacillus anthracis
Yersinia pestis: Подходящие иммуногены включают, но ими не ограничиваются, те, что раскрыты в ссылках 27 и 28.
Staphylococcus epidermis
Clostridium perfringens или Clostridium botulinums
Legionella pneumophila
Coxiella burnetii
Brucella, такие как B. abortus, B.canis, B.melitensis, B.neotomae, B.ovis, B.suis, B.pinnipediae.
Francisella, такие как F.novicida, F.philomiragia, F.tularensis.
Neisseria gonorrhoeae
Treponema pallidum
Haemophilus ducreyi
Enterococcus faecalis или Enterococcus faecium
Staphylococcus saprophyticus
Yersinia enterocolitica
Mycobacterium tuberculosis
Rickettsia
Listeria monocytogenes
Vibrio cholerae
Salmonella typhi
Borrelia burgdorferi
Porphyromonas gingivalis
Klebsiella
В некоторых вариантах иммуноген вызывает иммунную реакцию против одного из следующих вирусов:
Orthomyxovirus: Подходящие иммуногены могут быть из вирусов гриппа A, B или C, таких как гемагглютинин, нейраминидаза или матричные M2 белки. Если иммуноген представляет собой гемагглютинин вируса гриппа A, он может быть из любого субтипа, например, H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15 или H16.
Paramyxoviridae viruses: Вирусные иммуногены включают, но ими не ограничиваются, иммуногены, полученные из пневмовирусов (например, респираторного синцитиального вируса, RSV), Rubulaviruses (например, вируса свинки), Paramyxoviruses (например, вируса парагриппа), Metapneumoviruses и Morbilliviruses (например, вируса кори).
Poxviridaevirus: Вирусные иммуногены включают, но ими не ограничиваются, те, которые получены из Orthopoxvirus, такие как Variola vera, включая, но ими не ограничиваясь, Variola major и Variola minor.
Picornavirus: Вирусные иммуногены включают, но ими не ограничиваются, те, которые полученные из Picornaviruses, такие как энтеровирусы, риновирусы, гепаРНКвирусы, кардиовирусы и Aphthoviruses. В одном варианте, энтеровирус представляет собой полиовирус, например, типа 1, типа 2 и/или типа 3 полиовирус. В другом варианте, энтеровирус представляет собой EV71 энтеровирус. В другом варианте, энтеровирус представляет собой вирус Коксэки A или B.
Bunyavirus: Вирусные иммуногены включают, но ими не ограничиваются, те, которые получены из Orthobunyavirus, такие как калифорнийский энцефалитный вирус, Phlebovirus, такие как вирус лихорадки Рифт-Вэлли, или Nairovirus, такие как вирус конго-крымской геморрагической лихорадки.
Heparnavirus: Вирусные иммуногены включают, но ими не ограничиваются, те, которые получены из Heparnavirus, такие как вирус гепатита A (HAV).
Filovirus: Вирусные иммуногены включают, но ими не ограничиваются, те, которые получены из филовируса, такие как вирусы Эбола (включая эболавирус Заира, берега слоновой кости, Рестона или Судана) или Марбург-вирус.
Togavirus: Вирусные иммуногены включают, но ими не ограничиваются, те, которые получены из Togavirus, такие как Rubivirus, Alphavirus или an Arterivirus. Перечисление включает рубеллавирус.
Flavivirus: Вирусные иммуногены включают, но ими не ограничиваются, те, которые получены из Flavivirus, такие как вирус клещевого энцефалита (TBE), Денге (типы 1, 2, 3 или 4) вирус, вирус желтой лихорадки, вирус японского энцефалита, вирус болезни Кьясанурского леса, вирус лихорадки Западного Нила, вирус лихорадки Сент-Луиса, вирус российского весенне-летнего энцефалита, вирус энцефалита Повассан.
Pestivirus: Вирусные иммуногены включают, но ими не ограничиваются, те, которые получены из Pestivirus, такие как вирус диареи крупного рогатого скота (BVDV), вирус классической чумы свиней (CSFV) или вирус пограничной болезни овец (BDV).
Hepadnavirus: Вирусные иммуногены включают, но ими не ограничиваются, те, которые получены из Hepadnavirus, такие как вирус гепатита В. Композиции могут включать поверхностный антиген вируса гепатита В (HBsAg).
Другие гепатитные вирусы: Композиции могут включать иммуноген из вируса гепатита С, вируса гепатита дельта, вируса гепатита E или вируса гепатита G.
Rhabdovirus: Вирусные иммуногены включают, но ими не ограничиваются, те, которые получены из Rhabdovirus, такие как лиссавирус (например, вирус бешенства) и везикуловирусы (VSV).
Caliciviridae: Вирусные иммуногены включают, но ими не ограничиваются, те, которые получены из Caliciviridae, такие как Норволквирус (Норовирус), и Норволк-подобные вирусы, такие как вирус Гавайских островов и вирус снежных гор.
Coronavirus: Вирусные иммуногены включают, но ими не ограничиваются, те, которые получены из SARS коронавируса, инфекционного вируса птичьего гриппа (IBV), вируса мышиного гепатита (MHV) и передаваемого вируса гастроэнтерита свиней (TGEV). Иммуноген коронавируса может быть спайк-полипептидом.
Retrovirus: Вирусные иммуногены включают, но ими не ограничиваются, те, которые получены из онковирусов, лентивирусов (например, HIV-1 или HIV-2) или спумавирусов.
Reovirus: Вирусные иммуногены включают, но ими не ограничиваются, те, которые получены из ортореовирусов, ротавирусов, орбивирусов или колтивирусов.
Parvovirus: Вирусные иммуногены включают, но ими не ограничиваются, те, которые получены из парвавируса B19.
Herpesvirus: Вирусные иммуногены включают, но ими не ограничиваются, те, которые получены из герпесвируса человека, такие как (только в качестве примера), простой герпесвирус (HSV) (например, HSV типов 1 и 2), вирус ветряной оспы (VZV), вирус Эпштейна-Барра (EBV), цитомегаловирус (ЦМВ), человеческий герпесвирус 6 (HHV6), человеческий герпесвирус 7 (HHV7), и человеческий герпесвирус 8 (HHV8).
Papovaviruses: Вирусные иммуногены включают, но ими не ограничиваются, те, которые получены из папилломавирусов и полиомавирусов. Указанные (человеческие) папилломавирусы могут принадлежать к серотипам 1, 2, 4, 5, 6, 8, 11, 13, 16, 18, 31, 33, 35, 39, 41, 42, 47, 51, 57, 58, 63 или 65, например, из одного или более из серотипов 6, 11, 16 и/или 18.
Adenovirus: Вирусные иммуногены включают те, которые получены из аденовируса серотипа 36 (Ad-36).
В некоторых вариантах, иммуноген вызывает иммунную реакцию против вирусов, которые инфицируют рыбу, таких как: инфекционный вирус анемии лосося (ISAV), вирус панкреатита лосося (SPDV), инфекционный вирус некроза поджелудочной железы (IPNV), вирус болезни американского проточного сома (CCV), вирус лимфотического заболевания рыб (FLDV), инфекционный вирус гематопоэтического некроза (IHNV), вирус герпеса карпов кои, пикорна-подобный вирус лосося (также известный как пикорна-подобный вирус атлантического лосося), вирус садкового лосося (LSV), ротавирус атлантического лосося (ASR), вирус язвенной болезни форели (TSD), вирус опухоли кижуча (CSTV) или вирус вирусной геморрагической септицемии (VHSV).
Грибковые иммуногены можно получить из Dermatophytres, включая: Epidermophyton floccusum, Microsporum audouini, Microsporum canis, Microsporum distortum, Microsporum equinum, Microsporum gypsum, Microsporum nanum, Trichophyton concentricum, Trichophyton equinum, Trichophyton gallinae, Trichophyton gypseum, Trichophyton megnini, Trichophyton mentagrophytes, Trichophyton quinckeanum, Trichophyton rubrum, Trichophyton schoenleini, Trichophyton tonsurans, Trichophyton verrucosum, T. verrucosum var. album, var. discoides, var. ochraceum, Trichophyton violaceum и/или Trichophyton faviforme; или из Aspergillus fumigatus, Aspergillus flavus, Aspergillus niger, Aspergillus nidulans, Aspergillus terreus, Aspergillus sydowi, Aspergillus flavatus, Aspergillus glaucus, Blastoschizomyces capitatus, Candida albicans, Candida enolase, Candida tropicalis, Candida glabrata, Candida krusei, Candida parapsilosis, Candida stellatoidea, Candida kusei, Candida parakwsei, Candida lusitaniae, Candida pseudo-tropicalis, Candida guilliermondi, Cladosporium carrionii, Coccidioides immitis, Blastomyces dermatidis, Cryptococcus neoformans, Geotrichum clavatum, Histoplasma capsulatum, Klebsiella pneumoniae, Microsporidia, Encephalitozoon spp., Septata intestinalis и Enterocytozoon bieneusi; реже встречаются Brachiola spp, Microsporidium spp., Nosema spp., Pleistophora spp., Trachipleistophora spp., Vittaforma spp Paracoccidioides brasiliensis, Pneumocystis carinii, Pythiumn insidiosum, Pityrosporum ovale, Sacharomyces cerevisae, Saccharomyces boulardii, Saccharomyces pombe, Scedosporium apiosperum, Sporothrix schenckii, Trichosporon beigelii, Toxoplasma gondii, Penicillium marneffei, Malassezia spp., Fonsecaea spp., Wangiella spp., Sporothrix spp., Basidiobolus spp., Conidiobolus spp., Rhizopus spp, Mucor spp, Absidia spp, Mortierella spp, Cunninghamella spp, Saksenaea spp., Alternaria spp, Curvularia spp, Helminthosporium spp, Fusarium spp, Aspergillus spp, Penicillium spp, Monolinia spp, Rhizoctonia spp, Paecilomyces spp, Pithomyces spp и Cladosporium spp.
В некоторых вариантах иммуноген вызывает иммунную реакцию против паразитов рода Plasmodium, таких как P. falciparum, P.vivax, P.malariae или P.ovale. Таким образом, настоящее изобретение можно использовать для иммунизации против малярии. В некоторых вариантах указанный иммуноген вызывает иммунную реакцию против паразитов семейства Caligidae, особенно принадлежащих к родам Lepeophtheirus и Caligus, например, морских вшей, таких как Lepeophtheirus salmonis или Caligus rogercresseyi.
В некоторых вариантах указанный иммуноген вызывает иммунную реакцию против: пыльцевых аллергенов (аллергенов пыльцы деревьев, лекарственных растений, сорняков и трав); аллергенов насекомых или клещей (аллергенов летучих веществ, слюны и яда, например, аллергенов клещей, аллергенов тараканов и комаров, аллергенов яда перепончатокрылых насекомых); аллергенов шерсти животных и аллергенов перхоти животных (например, собак, кошек, лошадей, крыс, мышей и т.д.); и пищевых аллергенов (например, глиадина). Важными пыльцевыми аллергенами деревьев, трав и лекарственных растений являются аллергены таксономических отрядов Fagales, Oleales, Pinales и Platanaceae, включая, но ими не ограничиваясь, березу (Betula), ольху (Alnus), орех (Corylus), граб (Carpinus) и оливу (Olea), кедр (Cryptomeria и Juniperus), платан (Platanus), отряд Poales, включая травы родов Lolium, Phleum, Poa, Cynodon, Dactylis, Holcus, Phalaris, Secale, и Sorghum, отряды Asterales и Urticales, включая травы родов Ambrosia, Artemisia и Parietaria. Другими важными аллергенами летучих веществ являются аллергены клещей домашней пыли родов Dermatophagoides и Euroglyphus, амбарных клещей, например, Lepidoglyphys, Glycyphagus и Tyrophagus, аллергены тараканов, москитов и мух, например, Blatella, Periplaneta, Chironomus и Ctenocepphalides, и аллергены млекопитающих, таких как кошки, собаки и лошади, аллергены ядов, включая яды жалящих и кусающих насекомых, таких или такие как насекомые отряда жесткокрылых, включая пчел (Apidae), ос (Vespidea) и комаров (Formicoidae).
В некоторых вариантах иммуноген представляет собой опухолевый антиген, выбранный из: (a) антигенов рака яичек, таких как NY-ESO-1, SSX2, SCP1, также как RAGE, BAGE, GAGE и MAGE семейств полипептидов, например, GAGE-1, GAGE-2, MAGE-1, MAGE-2, MAGE-3, MAGE-4, MAGE-5, MAGE-6 и MAGE-12 (которые можно использовать, например, при лечении меланомы, опухолей легких, головы и шеи, NSCLC, груди, желудочно-кишечного тракта и мочевого пузыря; (b) мутантных антигенов, например, p53 (связанных с различными твердыми опухолями, например, раком прямой кишки, легких, головы и шеи), p21/Ras (связанных, например, с меланомой, раком поджелудочной железы и раком прямой кишки), CDK4 (связанных, например, с меланомой), MUM1 (связанных, например, с меланомой), капсазы-8 (связанной, например, с раком головы и шеи), CIA 0205 (связанных, например, с раком мочевого пузыря), HLA-A2-R1701, бета-катехина (связанным, например, с меланомой), TCR (связанных, например, с T-клеточной лимфомой не-Ходжкина), BCR-abl (связанных, например, с хронической миелогенной лейкемией), триосефосфатизомеразы, KIA 0205, CDC-27 и LDLR-FUT; (c) сверхэкспрессированных антигенов, например, галектина 4 (связанного, например, с раком прямой кишки), галектина 9 (связанного, например, с болезнью Ходжкина), протеиназы 3 (связанной, например, с хронической миелогенной лейкемией), WT 1 (связанных, например, с различными лейкемиями), карбоангидразы (связанной, например, с раком почек), альдолазы A (связанной, например, с раком легких), PRAME (связанным, например, с меланомой), HER-2/neu (связанным, например, с раком груди, прямой кишки, легких и яичников), маммаглобина, альфа-фетопротеина (связанного, например, с гепатомой), KSA (связанной например, с раком прямой кишки), гастрина (связанного, например, с раком поджелудочной железы и желудка), каталитического белка теломеразы, MUC-1 (связанного, например, с раком молочной железы и яичников), G-250 (связанных, например, с клеточной карциномой почек), p53 (связанных, например, с раком груди и прямой кишки) и карциноэмбрионного антигена (связанного, например, с раком груди, раком легких, раковыми заболеваниями желудочно-кишечного тракта, такими как рак прямой кишки); (d) перекрестно-реагирующих антигенов, например, меланома-меланоцитных дифференцирующих антигенов, такие как MART-1/Melan A, gp100, MC1R, рецепторов меланоцит-стимулирующего гормона, тирозиназы, тирозиназо-родственного белка-1/TRP1 и тирозиназо-родственного белка-2/TRP2 (связанных, например, с меланомой); (e) связанных с простатой антигенов, таких как PAP, PSA, PSMA, PSH-P1, PSM-P1, PSM-P2, связанные с раком простаты, например; (f) идиотипов иммуноглобулина (связанных, например, с миеломой и B клеточными лимфомами). В некоторых вариантах опухолевые иммуногены включают, но ими не ограничиваются, p15, Hom/Mel-40, H-Ras, E2A-PRL, H4-RET, IGH-IGK, MYL-RAR, антигены вируса Эпштейн-Барра, EBNA, антигены человеческого папилломавируса (HPV), включая E6 и E7, антигены вирусов гепатита В и С, антигены человеческого Т-клеточного лимфотропического вируса, TSP-180, p185erbB2, p180erbB-3, c-met, mn-23H1, TAG-72-4, CA 19-9, CA 72-4, CAM 17.1, NuMa, K-ras, p16, TAGE, PSCA, CT7, 43-9F, 5T4, 791 Tgp72, бета-HCG, BCA225, BTAA, CA 125, CA 15-3 (CA 27.29\BCAA), CA 195, CA 242, CA-50, CAM43, CD68\KP1, CO-029, FGF-5, Ga733 (EpCAM), HTgp-175, M344, MA-50, MG7-Ag, MOV18, NB/70K, NY-CO-1, RCAS1, SDCCAG16, TA-90 (Mac-2-связывающий белок/циклофилин C-связанный белок), TAAL6, TAG72, TLP, TPS и т.п.
Фармацевтические композиции
Липосомы настоящего изобретения можно использовать в качестве компонентов фармацевтических композиций для иммунизации субъектов против различных заболеваний. Такие композиции обычно включают в дополнение к липосомам фармацевтически приемлемый носитель. Исчерпывающее обсуждение фармацевтически приемлемых носителей можно найти в ссылке 29.
Фармацевтические композиции настоящего изобретения могут включать одну или больше из маленьких молекул иммуностимуляторов. Например, такие композиции могут включать агонисты TLR2 (например, Pam3CSK4), агонисты TLR4 (например, аминоалкилглюкозаминидфосфат, такие как E6020), агонисты TLR7 (например, имиквимод), агонисты TLR8 (например, резиквимод) и/или агонисты TLR9 (например, IC31). В идеале любой такой агонист имеет молекулярный вес <2000 Да. В некоторых вариантах такой агонист(ы) также инкапсулированы с РНК внутри липосом, но в других вариантах они не являются инкапсулированными.
Фармацевтические композиции настоящего изобретения могут включать липосомы в чистой воде (например, в воде для инъекций) или в буфере, например, в фосфатном буфере, в Трис-буфере, в боратном буфере, в сукцинатном буфере, в гистидиновом буфере или в цитратном буфере. Содержание солей в буфере обычно находится в интервале концентраций 5-20 мМ.
Фармацевтические композиции настоящего изобретения могут иметь pH между 5,0 и 9,5, например, между 6,0 и 8,0.
Композиции настоящего изобретения могут включать соли натрия (например, хлорид натрия) для обеспечения тоничности. Типичной является концентрация 10±2 мг/мл NaCl и обычно, например, около 9 мг/мл.
Композиции настоящего изобретения могут включать ионы металлов в качестве хелатирующих агентов. Они могут пролонгировать стабильность РНК, удаляя ионы, которые могут ускорять фосфодиэфирный гидролиз. Так, композиции могут включать один или более из EDTA, EGTA, BAPTA, триамина пентауксусной кислоты и т.д. Такие хелатирующие агенты обычно присутствуют в концентрациях между 10-500 мкМ, например, 0,1 мМ. Цитратная соль, такая как цитрат натрия, также может действовать как хелатирующий агент, при этом с выгодой обеспечивая буферирующую активность.
Фармацевтические композиции настоящего изобретения могут иметь значение осмоляльности между 200 мОсм/кг и 400 мОсм/кг, например, между 240-360 мОсм/кг, или между 290-310 мОсм/кг.
Фармацевтические композиции настоящего изобретения могут включать один или более из консервантов, таких как тиомерсал или 2-феноксиэтанол. Предпочтительны композиции, которые не содержат ртуть, и можно приготовить вакцины, которые не содержат консервантов.
Фармацевтические композиции настоящего изобретения предпочтительно являются стерильными.
Фармацевтические композиции настоящего изобретения предпочтительно являются непирогенными, например, содержащими <1 EU (единиц эндотоксина, стандартное измерение) на дозу, и предпочтительно <0,1 EU на дозу.
Фармацевтические композиции настоящего изобретения предпочтительно не содержат глютена.
Фармацевтические композиции настоящего изобретения можно приготовить в единичной дозовой форме. В некоторых вариантах единичная доза может иметь объем между 0,1-1,0 мл, например, около 0,5 мл.
Композиции настоящего изобретения можно приготовить в виде, пригодном для инъекций, или в виде растворов или в виде суспензий. Такие композиции можно приготовить для пульмонарного введения, например, с помощью ингаляции, используя мелкокапельный спрей. Указанную композицию можно приготовить для назального, ушного или окулярного введения, например, в виде спрея или капель. Типичными являются препараты для инъекций для внутримышечного введения.
Композиции включают иммунологически эффективное количество липосом, также как любые другие необходимые компоненты. Под выражением "иммунологически эффективное количество" подразумевают, что введение указанного количества индивидууму, или в виде одной дозы, или как часть серии, является эффективным для лечения или профилактики. Указанное количество меняется в зависимости от состояния здоровья и физического состояния подлежащего лечению индивидуума, возраста, таксономической группы подлежащего лечению индивидуума (например, нечеловеческого примата, примата, и т.д.), способности иммунной системы индивидуума синтезировать антитела, от степени необходимой защиты, от лекарственной формы вакцины, от оценки лечащим врачом медицинской ситуации и других важных факторов. Ожидают, что такое количество попадает в относительно широкий интервал значений, который можно определить, используя рутинные испытания. Содержание липосом и РНК в композициях настоящего изобретения обычно выражают в терминах количества РНК на дозу. Предпочтительная доза содержит ≤100 мкг РНК (например, от 10 до 100 мкг, например, около 10 мкг, 25 мкг, 50 мкг, 75 мкг или 100 мкг), величина дозы может быть выражена в гораздо более низких уровнях, например, ≤1 мкг/дозу, ≤100 нг/дозу, ≤10 нг/дозу, ≤1 нг/дозу и т.д.
В настоящем изобретении также предложены устройства для введения (например, шприц, небулайзер, распылитель, ингалятор, накожный пластырь и т.д.), содержащие фармацевтическую композицию настоящего изобретения. Указанные устройства можно использовать для введения композиций настоящего изобретения позвоночным.
Липосомы настоящего изобретения не должны содержать рибосом.
Способы лечения и использование в медицине
В противоположность частицам, раскрытым в ссылке 10, липосомы и фармацевтические композиции настоящего изобретения предназначены для in vivo использования для выработки иммунной реакции на представляющий интерес иммуноген.
В настоящем изобретении предложен способ усиления иммунной реакции у позвоночных, включающий стадию введения эффективного количества липосом или фармацевтической композиции настоящего изобретения. Иммунная реакция является предпочтительно защитной и, предпочтительно, включает иммунитет, опосредованный антителами и/или клетками. Указанный способ может вызвать бустерную реакцию.
В настоящем изобретении также предложены липосома или фармацевтическая композиция настоящего изобретения для использования в способе для усиления иммунной реакции у позвоночных.
В настоящем изобретении также предложено использование липосом настоящего изобретения при изготовлении лекарственных средств для усиления иммунной реакции у позвоночных.
За счет усиления иммунной реакции у позвоночных с помощью указанных лекарственных средств и способов, позвоночные могут быть защищены от различных заболеваний и/или инфекций, например, от бактериальных и/или вирусных заболеваний, как здесь раскрыто. Указанные липосомы и композиции являются иммуногенными, и более предпочтительно, являются композициями вакцин. Вакцины в соответствии с настоящим изобретением могут быть или профилактическими (т.е. предназначенными для предотвращения инфекции), или терапевтическими (т.е. предназначенными для лечения инфекции), но обычно они являются профилактическими.
Позвоночное является, предпочтительно, млекопитающим, таким как человек или крупное ветеринарное млекопитающее (например, лошади, крупный рогатый скот, олени, козы, свиньи). Если вакцина предназначена для профилактического использования, человеком, предпочтительно, является ребенок (например, начинающий ходить ребенок или младенец) или тинэйджер; если вакцина предназначена для терапевтического использования, человеком, предпочтительно, является тинэйджер или взрослый. Вакцину, предназначенную для детей, можно также вводить взрослым, например, для оценки безопасности, дозировки, иммуногенности и т.д.
Вакцины, полученные в соответствии с настоящим изобретением, можно использовать для лечения как детей, так и взрослых. Так возраст пациентов-людей может быть меньше 1 года, меньше 5 лет, в интервале 1-5 лет, 5-15 лет, 15-55 лет, или по меньшей мере 55 лет. Предпочтительными пациентами, которым вводят вакцину, являются старшие (например, ≥50 лет, ≥60 лет, и предпочтительно ≥65 лет), молодые (например, ≤5 лет), госпитализированные пациенты, медицинские работники, военнослужащие и военный персонал, беременные женщины, хронические больные или пациенты с иммунодефицитом. Однако указанные вакцины не предназначены исключительно для указанных групп и их можно более широко использовать для населения.
Композиции настоящего изобретения обычно вводят непосредственно пациенту. Прямое введение можно осуществить, используя парентеральные инъекции (например, подкожные, внутрибрюшинные, внутривенные, внутримышечные, внутрикожные или инъекции в интерстициальное пространство тканей; в отличие от ссылки 1, инъекции в язык в настоящем изобретении обычно не используют). Альтернативные способы введения включают ректальный, пероральный (например, в виде таблеток, спреев), буккальный, сублингвальный, вагинальный, наружный, трансдермальный или транскутанный, интраназальный, окулярный, ушной, пульмонарный или другие способы введения через слизистую. Чрескожное и внутримышечное введение являются двумя предпочтительными способами. Инъекции можно осуществлять через иглы (например, используя шприцы для инъекций), но альтернативно можно использовать шприцы без иголки. Типичная доза для внутримышечного введения составляет 0,5 мл.
Настоящее изобретение можно использовать для выработки системного иммунитета и/или иммунитета слизистых оболочек, предпочтительно для выработки повышенного системного иммунитета и/или иммунитета слизистых оболочек.
Дозы можно вводить или по схеме разовой дозы, или по схеме введения нескольких доз. Множество доз можно использовать в схеме первичной иммунизации и/или в схеме бустерной иммунизации. В схеме множества доз различные дозы можно вводить одним и тем же или различными способами, например, как парентеральную первичную и через слизистую бустерную, через слизистую первичную и парентеральную бустерную и т.д. Множественные дозы обычно вводят с промежутком по меньшей мере в 1 неделю (например, с интервалом около 2 недель, около 3 недель, около 4 недель, около 6 недель, около 8 недель, около 10 недель, около 12 недель, около 16 недель и т.д.). В одном варианте множественные дозы можно вводить через примерно 6 недель, 10 недель и 14 недель после рождения, например, в возрасте 6 недель, 10 недель и 14 недель, как часто используют по расширенной программе иммунизации Всемирной Организации Здравоохранения ("EPI"). В альтернативном варианте, две первичные дозы вводят с промежутком около двух месяцев, например, с промежутком около 7, 8 или 9 недель, после чего вводят одну или более из бустерных доз через от около 6 месяцев до 1 года после введения второй первичной дозы, например, спустя около 6, 8, 10 или 12 месяцев после второй первичной дозы. В следующем варианте три первичные дозы вводят с промежутком около двух месяцев, например, с промежутком около 7, 8 или 9 недель, после чего вводят одну или более из бустерных доз через примерно 6-12 месяцев после третьей первичной дозы, например, около 6, 8, 10 или 12 месяцев после третьей первичной дозы.
Общая часть
В практике настоящего изобретения используют, если не указано иначе, обычные способы химии, биохимии, молекулярной биологии, иммунологии и фармакологии, которые известны специалистам в указанных областях. Такие способы полностью раскрыты в литературе. См., например, ссылки 30-36 и т.д.
Термин "включающий" охватывает "включая", также как "состоящий" например, композиция "включающая" X может состоять исключительно из X или может включать что-либо дополнительно, например, X+Y.
Термин "около" в отношении численного значения x является необязательным и означает, например, x±10%.
Выражение "практически" не исключает "полностью", например, композиция, которая "практически не содержит" Y может полностью не содержать Y. При необходимости, выражение "практически" можно опустить из определения настоящего изобретения.
Ссылки на заряд, катионы, анионы, цвиттерионы и т.д. получены при pH 7.
TLR3 представляет собой Toll-подобный рецептор 3. Он представляет собой простой одиночный трансмембранный рецептор, который играет ключевую роль во врожденной иммунной системе. Известные агонисты TLR3 включают поли(I:C). "TLR3" представляет собой принятое название HGNC для гена, кодирующего указанный рецептор, и его уникальное HGNC ID является HGNC: 11849. Ссылочная последовательность для человеческого TLR3 представляет собой GI:2459625.
TLR7 представляет собой Toll-подобный рецептор 7. Он представляет собой одиночный трансмембранный рецептор, который играет ключевую роль во врожденной иммунной системе. Известные агонисты TLR7 включают, например, имиквимод. "TLR7" представляет собой принятое HGNC название для гена, кодирующего указанный рецептор, и его уникальная HGNC ID представляет собой HGNC: 15631. Ссылочная последовательность для человеческого TLR7 гена представляет собой GI:67944638.
TLR8 представляет собой Toll-подобный рецептор 8. Он представляет собой одиночный трансмембранный рецептор, который играет ключевую роль во врожденной иммунной системе. Известные агонисты TLR8 включают, например, резиквимод. "TLR8" представляет собой принятое HGNC название для гена, кодирующего указанный рецептор, и его уникальный HGNC ID представляет собой HGNC: 15632. Ссылочная последовательность для человеческого TLR8 гена представляет собой GI:20302165.
Семейство RIG-I-подобных рецепторов ("RLR") включает различные РНК геликазы, которые играют ключевую роль во врожденной иммунной системе [37]. RLR-1 (также известный как RIG-I или ген I, индуцируемый ретиновой кислотой) имеет два домена рекрутирования каспазы вблизи его N-конца. Принятое HGNC название для гена, кодирующего геликазу RLR-1, представляет собой "DDX58" (для DEAD (Asp-Glu-Ala-Asp) бокс-полипептид 58) и уникальный HGNC ID представляет собой HGNC: 19102. Сравнительная последовательность для человеческого RLR-1 гена представляет собой GI:77732514. RLR-2 (известный также как MDA5 или ген 5, ассоциированный с дифференцированием меланомы) также содержит два домена рекрутирования каспазы вблизи своего N-конца. Принятое название HGNC для гена, кодирующего геликазу RLR-2, представляет собой "IFIH1" (для интерферона, индуцируемого доменом 1 геликазы С) и уникальный HGNC ID представляет собой HGNC: 18873. Сравнительная последовательность для человеческого гена RLR-2 представляет собой GI: 27886567. RLR-3 (также известный как LGP2 или лаборатория генетики и физиологии 2) не содержит доменов рекрутирования каспазы. Принятое наименование HGNC для гена, кодирующего геликазу RLR-3, представляет собой "DHX58" (для DEXH (Asp-Glu-X-His) бокс-полипептида 58) и уникальный HGNC ID представляет собой HGNC:29517. Сравнительная последовательность для человеческого гена RLR-3 представляет собой GI: 149408121.
PKR представляет собой двухцепочечную РНК-зависимую протеинкиназу. Она играет ключевую роль во врожденной иммунной системе. "EIF2AK2" (для эукариотного фактора инициации трансляции 2-альфакиназы 2) представляет собой принятое название HGNC для гена, кодирующего указанный фермент, и его уникальный HGNC ID представляет собой HGNC:9437. Сравнительная последовательность для человеческого гена PKR представляет собой GI:208431825.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
ФИГ.1 демонстрирует гель с окрашенной РНК. Полоски демонстрируют (1) маркеры, (2) оголенный репликон, (3) репликон после обработки РНКазой, (4) репликон, инкапсулированный в липосоме, (5) липосома после обработки РНКазой, (6) липосома, обработанная РНКазой, и затем подвергнутая экстрагированию фенолом/хлороформом.
ФИГ.2 представляет собой электронную микрофотографию липосомы.
ФИГ.3 демонстрирует экспрессию белка (в виде относительных световых единиц, RLU) в дни 1, 3 и 6 после введения РНК в крупные (нижняя линия) или мелкие (верхняя линия) липосомы.
ФИГ.4 демонстрирует гель с окрашенной РНК. Полоски демонстрируют (1) маркеры, (2) оголенный репликон, (3) репликон, инкапсулированный в липосому, (4) липосома, обработанная РНКазой и затем подвергнутая экстрагированию фенолом/хлороформом.
ФИГ.5 демонстрирует экспрессию белка в дни 1, 3 и 6 после введения РНК в виде репликона, упакованного в вирион (квадраты), в виде оголенной РНК (звездочки), или в липосомы (+=0,1 мкг, x=1 мкг).
ФИГ.6 демонстрирует экспрессию в дни 1, 3 и 6 после введения четырех различных инкапсулированных в липосомы РНК.
ФИГ.7 демонстрирует титры анти-F IgG у животных, которым вводили упакованный в вирион репликон (VRP или VSRP), 1 мкг оголенной РНК и 1 мкг инкапсулированной в липосомы РНК.
ФИГ.8 демонстрирует титры анти-F IgG у животных, которым вводили VRP, 1 мкг оголенной РНК и 0,1 г или 1 мкг инкапсулированной в липосомы РНК.
ФИГ.9 демонстрирует титры нейтрализующих антител у животных, которым вводили VRP, или 0,1 г или 1 мкг инкапсулированных в липосомах РНК.
ФИГ.10 демонстрирует уровни экспрессии после введения репликона в виде оголенной РНК (окружности), инкапсулированной в липосомах РНК (треугольники и квадраты), или в виде липоплекса (перевернутые треугольники).
ФИГ.11 демонстрирует титры F-специфических IgG (2 недели после второй дозы) после введения репликона в виде оголенной РНК (0,01-1 мкг), инкапсулированной в липосомы РНК (0,01-10 мкг), или упакованной в виде вириона (VRP, 106 инфекционная доза или IU).
ФИГ.12 демонстрирует титры F-специфических IgG (окружности) и титры PRNT (квадраты) после введения репликона в виде оголенной РНК (1 мкг), инкапсулированной в липосомы РНК (0,1 или 1 мкг), или упакованной в виде вириона (VRP, 106 IU). Также показаны титры у интактных мышей. Жирные линии демонстрируют геометрию.
ФИГ.13 демонстрирует продуцирование внутриклеточного цитокина после повторной стимуляции синтетическими пептидами, представляющими основные эпитопы F белка, через 4 недели после второй дозы. По оси y отложен % цитокинов+ из CD8+CD4-.
ФИГ.14 демонстрирует титры F-специфических IgG (средние log10 титры ± ср.откл.) через 210 дней после иммунизации телят. Три линии четко различимы к 63 дню и представляют собой, снизу вверх: PBS негативный контроль; доставленные липосомами РНК; и "Треугольники 4" продукт.
ФИГ.15 демонстрирует увеличение (относительное) титров анти-F через две недели после первой дозы репликона, кодирующего F белок. Значения титров отложены против среднего диаметра липосом Z (нм).
ФИГ.16A-16M демонстрируют структуру альтернативных катионных липидов: (A) RV05; (B) RV02; (C) RV04; (D) RV07; (E) RV03; (F) RV08; (G) RV09; (H) RV14; (I) RV10; (J) RV11; (K) RV15; (L) RV16; (M) RV17.
ФИГ.17 демонстрирует структуру полезных "сплит" ПЭГ-конъюгированных липидов. Полный молекулярный вес ПЭГ внутри бокса составляет 2000 для тестированных липосом.
ФИГ.18A-18E демонстрируют структуры различных ПЭГ-конъюгированных липидов, где R представляет собой ПЭГ необходимой длины.
ПРЕДПОЧТИТЕЛЬНЫЙ ВАРИАНТ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ НАСТОЯЩЕГО ИЗОБРЕТЕНИЯ
РНК репликоны
Далее использованы различные репликоны. Вообще они основаны на гибридном геноме альфавируса с неструктурными белками вируса Венесуэльского лошадиного энцефалита (VEEV), сигнала упаковки из VEEV, и 3’ UTR из Синдбис вируса или VEEV мутанта. Указанный репликон имеет около 10 кб в длину и содержит поли-A концевую группу.
Плазмидная ДНК, кодирующая репликоны альфавируса (называемые: pT7-mVEEV-FL.RSVF или A317; pT7-mVEEV-SEAP или A306; pSP6-VCR-GFP или A50), служит в качестве матрицы для синтеза РНК in vitro. Такие репликоны содержат генетические элементы альфавируса, необходимые для репликации РНК, но не содержат тех кодирующих генных продуктов, которые необходимы для сборки частиц; структурные белки вместо этого заменены представляющим интерес белком (или репортером, таким как SEAP или GFP, или иммуногеном, таким как полной длины RSV F белок) и поэтому указанные репликоны не способны индуцировать образование инфекционных частиц. Промотор бактериофага (T7 или SP6) в обратном направлении от альфавирусной кДНК облегчает синтез РНК репликона in vitro, и рибозим вируса дельта гепатита (HDV) непосредственно в прямом направлении от поли(A)-концевой группы образует правильный 3’-конец за счет активности саморасщепления.
После линеаризации плазмидной ДНК, расположенной в прямом направлении от рибозима HDV, подходящей рестрикционной эндонуклеазой, ран-офф транскрипты синтезируют in vitro, используя ДНК-зависимые РНК полимеразы бактериофагов T7 или SP6. Ионы транскриптов выдерживают в течение 2 часов при 37°C в присутствии 7,5 мМ (T7 РНК полимеразы) или 5 мМ (SP6 РНК полимеразы) каждого из нуклеозидтрифосфатов (ATP, CTP, GTP и UTP) в соответствии с инструкциями, предоставленными изготовителем (Ambion). После транскрипции матричную ДНК переваривают, используя TURBO ДНКазу (Ambion). РНК репликон осаждают, используя LiCl и восстанавливают в не содержащей нуклеазы воде. Для некэпированной РНК создают кэп-группировку посттранскриптционно, используя кэпирующий вакцину фермент (Vaccinia Capping Enzyme (VCE)), используя систему кэпинга ScriptCap m7G (Epicentre Biotechnologies) в соответствии с рекомендациями для пользователя; репликонам, снабженным такой кэп-группой присваивают приставку "v", например, vA317 представляет собой A317 репликон, кэпированный VCE. Посттранскрипционно кэпированные РНК осаждают, используя LiCl, и восстанавливают в не содержащей нуклеазы воде. Концентрацию образцов РНК определяют, измеряя OD260нм. Целостность in vitro транскриптов подтверждают, используя электрофорез в агарозном геле в условиях денатурации.
Липосомальное инкапсулирование
РНК инкапсулируют в липосомы практически по способу, представленному в ссылках 7 и 38. Липосомы получают из 10% DSPC (цвиттерионный), 40% DlinDMA (катионный), 48% холестерина и 2% ПЭГ-конъюгированного DMG (2 кДа ПЭГ). Указанные пропорции относятся к молярному % в полном количестве липосом.
DlinDMA (1,2-дилинолеилокси-N,N-диметил-3-аминопропан) синтезируют, используя способ, раскрытый в ссылке 2. DSPC (1,2-диастеароил-sn-глицеро-3-фосфохолин) получают от Genzyme. Холестерин получают от Sigma-Aldrich. ПЭГ-конъюгированный DMG (1,2-димиристоил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин-N-[метокси(полиэтиленгликоль), аммониевая соль), DOTAP (1,2-диолеоил-3-триметиламмонийпропан, хлоридная соль) и DC-chol (3P-[N-(N’,N’-диметиламиноэтан)карбамоил]холестерин гидрохлорид) получают от Avanti Polar Lipids.
Короче, липиды растворяют в этаноле (2 мл), РНК репликон растворяют в буфере (2 мл, 100 мМ цитрата натрия, pH 6) и все это смешивают с 2 мл буфера, затем уравновешивают в течение 1 часа. Полученную смесь разбавляют 6 мл буфера, затем фильтруют. Полученный продукт содержит липосомы с эффективностью инкапсулирования ~95%.
Например, в одном конкретном способе свежие липидные исходные растворы приготавливают в этаноле. 37 мг DlinDMA, 11,8 мг DSPC, 27,8 мг холестерина и 8,07 мг ПЭГ-DMG взвешивают и растворяют в 7,55 мл этанола. Свежеприготовленный липидный исходный раствор осторожно встряхивают при 37°C в течение около 15 мин, получая гомогенную смесь. Затем 755 мкл исходного раствора добавляют к 1,245 мл этанола, получая рабочий липидный исходный раствор в количестве 2 мл. Указанное количество липидов используют для создания липосом с 250 мкг РНК. 2 мл рабочего раствора РНК также приготавливают из исходного раствора ~1 мкг/мкл в 100 мМ цитратном буфере (pH 6). Три стеклянные ампулы объемом 20 мл (с якорями мешалки) промывают раствором RNase Away (Molecular BioProducts) и промывают большим количеством MilliQ воды перед тем, как используют для очищения ампул от РНКаз. Одну из ампул используют для РНК рабочего раствора и другие для сбора смесей липида и РНК (как раскрыто далее). Рабочие липидный и РНК растворы нагревают при 37°C в течение 10 мин перед тем, как помещают в 3 см3 шприцы с люэровским клапаном. 2 мл цитратного буфера (pH 6) помещают в другой 3 см3 шприц. Шприцы, содержащие РНК и липиды, соединяют с T миксером (PEEK™ 500 мкм ID соединение, Idex Health Science), используя FEP трубку (фторированный этилен-пропилен; все используемые FEP трубки имеют внутренний диаметр 2 мм и внешний диаметр 3 мм; получены от Idex Health Science). На выходе из T миксера находится также FEP трубка. Третий шприц, содержащий цитратный буфер, соединен с отдельным отрезком трубки. Затем все шприцы прокачивают со скоростью 7 мл/мин, используя шприцевый инфузионный насос. Выходы трубок расположены таким образом, чтобы собирать смеси в 20 мл стеклянные ампулы (при перемешивании). Якоря мешалок удаляют и дают возможность этанольному/водному раствору уравновеситься при комнатной температуре в течение 1 часа. 4 мл смеси помещают в 5 см3 шприц, который соединен с отрезком FEP трубки, и в другой 5 см3 шприц, соединенный с равной длины отрезком FEP трубки, помещают одинаковое количество 100 мМ цитратного буфера (pH 6). Два шприца прокачивают со скоростью потока 7 мл/мин, используя шприцевый инфузионный насос, и конечную смесь собирают в 20 мл стеклянную ампулу (при перемешивании). Затем смесь, собранную на второй стадии смешивания (липосомы), пропускают через мембрану Mustang Q (анионообменная подложка, которая связывает и удаляет анионные молекулы, получена от Pall Corporation). Перед использованием указанной мембраны для липосом, через нее последовательно пропускают 4 мл 1 M NaOH, 4 мл 1 M NaCl и 10 мл 100 мМ цитратного буфера (pH 6). Липосомы нагревают в течение 10 мин при 37°C перед тем, как их пропускают через мембрану. Затем липосомы концентрируют до 2 мл и осуществляют диализ против 10-15 объемов 1X PBS, используя фильтрование тангенциальным потоком перед тем, как выделяют конечный продукт. Систему TFF и половолоконные фильтрационные мембраны закупают у Spectrum Labs (Rancho Dominguez) и используют в соответствии с рекомендациями изготовителей. Используют полисульфоновые половолоконные фильтрационные мембраны с отсечением по размеру пор 100 кД и площадью поверхности 8 см2. Для экспериментов in vitro и in vivo полученные композиции разбавляют 1X PBS до необходимой концентрации РНК.
ФИГ.2 представляет собой пример электронной микрофотографии липосом, полученных указанными способами. Эти липосомы содержат инкапсулированные РНК, кодирующие полной длины антиген RSV F. По данным динамического светорассеяния одна партия имеет средний диаметр 141 нм (по интенсивности) или 78 нм (по числу).
Процент инкапсулированных РНК и концентрацию РНК определяют, используя реагентный набор Quant-iT RiboGreen RNA (Invitrogen), в соответствии с инструкциями изготовителей. Рибосомальный РНК стандарт, предоставленный в наборе, используют для построения стандартной кривой. Липосомы разбавляют 10× или 100× в 1X TE буфере (из набора) перед добавлением красителя. Отдельно липосомы разбавляют 10× или 100× в 1X TE буфере, содержащем 0,5% Triton X перед добавлением красителя (для разрушения липосом и определения таким образом полного содержания РНК). После этого равное количество красителя добавляют в каждый раствор и затем ~180 мкл каждого раствора после добавления красителя помещают в двойном экземпляре в 96-луночные планшеты для культуры тканей. Интенсивность флуоресценции (возбуждение на 485 нм, эмиссия на 528 нм) считывают, используя считывающее устройство для микропланшетов. Все композиции липосом дозируют in vivo на основании количества инкапсулированных РНК.
Было показано, что инкапсулирование в липосомы защищает РНК от расщепления РНКазой. В экспериментах используют 3,8 мАЕд (mAU - единицы оптической плотности) РНКазы A на микрограмм РНК, инкубированные в течение 30 минут при комнатной температуре. РНКазу инактивируют, используя протеиназу K при 55°C в течение 10 минут. Затем добавляют смесь A 1:1 об/об образца к смеси 25:24:1 об/об/об фенол:хлороформ:изоамиловый спирт для экстрагирования РНК из липидов в водную фазу. Образцы перемешивают на вортексе в течение нескольких секунд и затем помещают в центрифугу на 15 минут при скорости 1200 об/мин. Водную фазу (содержащую РНК) удаляют и используют для анализа РНК. Перед загрузкой (400 нг РНК на ячейку) все образцы инкубируют с формальдегидным красителем, денатурируют в течение 10 минут при 65°C и охлаждают до комнатной температуры. Маркеры Ambion Millennium используют для аппроксимации молекулярного веса конструкции РНК. Гель обрабатывают при 90 Вольт. Гель окрашивают, используя 0,1% SYBR золото в соответствии с рекомендациями изготовителей в воде на качалке при комнатной температуре в течение 1 часа. ФИГ.1 демонстрирует, что РНКаза полностью расщепила РНК в отсутствии инкапсуляции (полоска 3). РНК не детектируется после инкапсуляции (полоска 4), и никаких изменений не наблюдают, для липосом, не обработанных РНКазой (полоска 4). После того, как обработанные РНКазой липосомы экстрагируют фенолом, видны нерасщепленные РНК (полоска 6). Даже после 1 недели при 4°C можно наблюдать РНК без какой-либо фрагментации (ФИГ.4, стрелки). Экспрессия белка in vivo остается неизменной после 6 недель при 4°C и одного цикла замораживание-оттаивание. То есть, инкапсулированные в липосомы РНК стабильны.
Для оценки экспрессии РНК in vivo фермент-репортер (SEAP; секретируемая щелочная фосфатаза) кодируют скорее в репликон, чем в иммуноген. Уровни экспрессии определяют в сыворотке, разбавленной 1:4 в 1X Phospha-Light буфере для разбавления, используя хемилюминесцентный щелочной фосфатный субстрат. 8-10 недельным мышам BALB/c (5/группу) внутримышечно вводят инъекции в день 0,50 мкл в лапу дозу РНК 0,1 мкг или 1 мкг. Тот же самый вектор вводят без липосом (в не содержащем РНКазы 1X PBS) в дозе 1 мкг. Тестируют также упакованные в вирион репликоны. Используемые здесь упакованные в вирион репликоны (называемые "VRP") получают по способу ссылки 39, где альфавирусный репликон получают из мутантного VEEV или химеры, полученной из генома VEEV, сконструированного так, чтобы содержать 3’ UTR Синдбис вируса и сигнал упаковки Синдбис вируса (PS), упакованные путем совместной их электропорации в BHK клетки с дефективными хелперными РНК, кодирующими гены капсида Синдбис вируса и гликопротеин.
Как представлено на ФИГ.5, инкапсулирование повышает SEAP уровни на около ½log при дозе 1 мкг, и в день 6 экспрессия за счет 0,1 мкг инкапсулированной дозы соответствует значениям для 1 мкг неинкапсулированной дозы. К 3 дню уровни экспрессии превышают уровни, достигнутые с VRP (квадраты). Таким образом, экспрессия возрастает, если РНК инкапсулированы в липосомы при сравнении с контрольными оголенными РНК, даже при дозе, которая в 10 раз ниже. Экспрессия также оказывается выше по сравнению с VRP контролем, но кинетики экспрессии значительно отличаются (см. ФИГ.5). Введение РНК путем электропорации приводит к возрастанию экспрессии по сравнению с контрольными оголенными РНК, но эти уровни оказываются ниже, чем с липосомами.
Для выяснения того, связан ли наблюдаемый эффект в группе липосом просто с компонентами липосом, или он связан с инкапсулированием, репликон вводят в инкапсулированной форме (для двух различных протоколов очистки, 0,1 мкг РНК), или в смеси с липосомами после их образования (неинкапсулированный "липоплекс", 0,1 мкг РНК), или в виде оголенной РНК (1 мкг). ФИГ.10 демонстрирует, что использование липоплекса приводит к самым низким уровням экспрессии, свидетельствуя о том, что инкапсулирование существенно для эффективной экспрессии.
Дальнейшие SEAP эксперименты демонстрируют отчетливую зависимость реакции от дозы in vivo, когда экспрессия заметна уже после введения столь малого количества, как 1 нг РНК (ФИГ.6). Дальнейшие эксперименты по сравнению экспрессии за счет инкапсулированных и оголенных репликонов показывают, что эффект от 0,01 мкг инкапсулированных РНК эквивалентен 1 мкг оголенных РНК. В дозе 0,5 мкг РНК инкапсулированный материал обеспечивает в 12 раз более высокую экспрессию в день 6; в дозе 0,1 мкг уровни экспрессии оказываются в 24 раза выше в день 6.
Были исследованы не только средние значения в группе животных, но исследовали также отдельных животных. Хотя несколько животных не реагировали на оголенные репликоны, инкапсулирование исключает неотвечающие особи.
В дальнейших экспериментах DlinDMA заменяют на DOTAP. Хотя DOTAP липосомы приводят к более высокой экспрессии, чем оголенные репликоны, их результаты оказались хуже, чем для DlinDMA липосом (различие в 2-3 раза в день 1).
Для оценки in vivo иммуногенности конструируют репликон для экспрессии полной длины F белка из респираторно-синтициального вируса (RSV). Его вводят оголенным (1 мкг), инкапсулированным в липосомы (0,1 или 1 мкг), или упакованным в вирионы (106 IU; "VRP") в дни 0 и 21. ФИГ.7 демонстрирует титры анти-F IgG через 2 недели после введения второй дозы, и отчетливо видно, что липосомы повышают иммуногенность. ФИГ.8 демонстрирует титры спустя 2 недели, причем к этому моменту не наблюдается статистических различий между инкапсулированными РНК в дозе 0,1 мкг, инкапсулированными РНК в дозе 1 мкг, или VRP группой. Титры нейтрализации (измеренные как 60% уменьшения бляшек, "PRNT60") заметно не отличались от указанных трех групп через 2 недели после введения второй дозы (ФИГ.9). ФИГ.12 демонстрирует титры как IgG, так и PRNT, через 4 недели после введения второй дозы.
ФИГ.13 подтверждает тот факт, что РНК вызывает значительную реакцию CD8 T клеток.
В дальнейших экспериментах проводят сравнение титров F-специфичных IgG у мышей, которым вводили VRP, 0,1 мкг инкапсулированных в липосомы РНК, или 1 мкг инкапсулированных в липосомы РНК. Отношения титров (VRP: липосомы) в различные моменты времени после введения второй дозы оказались следующими:
2 недели 4 недели 8 недель
0,1 мкг 2,9 1,0 1,1
1 мкг 2,3 0,9 0,9
Таким образом, инкапсулированные в липосомы РНК индуцируют иммунную реакцию практически той же величины, что наблюдается при введении вирионов.
Дальнейшие эксперименты демонстрируют превосходящие F-специфические IgG реакции в дозе 10 мкг, эквивалентные реакции для доз 1 мкг и 0,1 мкг и более слабые реакции в дозе 0,01 мкг. ФИГ.11 демонстрирует титры антител IgG для мышей, которым вводили репликон в оголенной форме в 3 различных дозах, в липосомах в 4 различных дозах, или в виде VRP (106 IU). Реакция, которую наблюдали при введении 1 мкг инкапсулированных в липосомы РНК, оказалась статистически незначительной (ANOVA) при сравнении с VRP, но более значительная реакция, которую наблюдали при введении 10 мкг инкапсулированных в липосомы РНК, оказалась статистически значимой (p<0,05) по сравнению с обеими указанными группами.
Дальнейшие исследования подтверждают, что 0,1 мкг инкапсулированных в липосомы РНК вызывают гораздо более сильные анти-F IgG реакции (через 15 дней после введения второй дозы), чем 0,1 мкг введенной ДНК, и оказываются даже более иммуногенными чем 20 мкг плазмидной ДНК, кодирующей F антиген, введенный с помощью электропорации (Elgen™ ДНК Delivery System, Inovio).
Хлопковые хомяки
В исследованиях используют хлопковых хомяков (Sigmodon hispidis) вместо мышей. В дозе 2 мкг инкапсулирование липосом увеличивает титры F-специфических IgG в 8,3 раза по сравнению с оголенными РНК и повышает титры PRNT в 9,5 раза. Интенсивность реакции антител оказалась эквивалентной интенсивности реакции, вызванной 5×106 ИмЕд VRP. Как оголенные, так и инкапсулированные в липосомы РНК оказались способны защитить хлопковых хомяков от заражения RSV (1×105 бляшкообразующих единиц), уменьшая концентрацию вируса в легких по меньшей мере в 3,5 log. Инкапсулирование усиливает уменьшение примерно в 2 раза.
В дальнейшей работе с хлопковыми хомяками используют четыре различных репликона: vA317 экспрессирует полной длины RSV-F; vA318 экспрессирует усеченный (с удаленными трансмембранным и цитоплазмическим концевыми сегментами) RSV-F; vA142 экспрессирует RSV-F с исключенным фьюжн пептидом; vA140 экспрессирует усеченный RSV-F также без своего пептида. Хлопковым хомякам, от 4 до 8 животных в группе, проводят внутримышечную вакцинацию (100 мл в одну лапу) в дни 0 и 21 четырьмя различными репликонами, введенными в липосомы в двух дозах (1,0 и 0,1 мкг), используя 2 кДа ПЭГ-конъюгированный DMG по способу (D), но с порцией 150 мкг РНК. Контрольным группам вводят вакцину белка RSV-F-субъединицы (5 мкг) с адъювантом - квасцами (8 животных/группу), VRP экспрессирующие полной длины RSV-F (1×106 IU, 8 животных/группу), или интактный контроль (4 животных/группу). Сыворотку собирают для анализа антител в дни 0, 21 и 34.
Титры F-специфических сывороточных IgG и титры сывороточных антител, нейтрализующих RSV, в дни 21 и 34 были:
Группа IgG, день 21 IgG, день 34 NT, день 21 NT, день34
1 мкг vA317 915 2249 115 459
0,1 мкг vA317 343 734 87 95
1 мкг vA318 335 1861 50 277
0,1 мкг vA318 129 926 66 239
1 мкг vA142 778 4819 92 211
0,1 мкг vA142 554 2549 78 141
1 мкг vA140 182 919 96 194
0,1 мкг vA140 61 332 29 72
5 мкг F тримерная субъединица/квасцы 13765 86506 930 4744
1×106 IU VPR-F полная 1877 19179 104 4528
Интактная 5 5 10 15
Все четыре репликона, которые оценивают в данном исследовании (vA317, vA318, vA142, vA140), являются иммуногенными для хлопковых хомяков, если их вводят в липосомах, хотя титры нейтрализации сыворотки были по меньшей мере в десять раз ниже, чем в случае индуцирования белковыми вакцинами с адъювантами, или в случае VRP. Вакцины липосомы/РНК вызывают выработку сывороточных F-специфических IgG и нейтрализующих RSV антител после первой вакцинации, и вторая вакцинация эффективно усиливает реакцию. Титры F-специфических IgG после второй вакцинации 1 мкг репликонов оказываются в 2-3 раза выше, чем после второй вакцинации 0,1 мкг репликонов. Указанные четыре репликона приводят к сопоставимым титрам антител, позволяя предположить, что полной длины и усеченный RSV-F, каждый с фьюжн пептидами или без них, оказываются одинаково иммуногенными для хлопковых хомяков.
В следующем эксперименте с хлопковыми хомяками снова используют vA317, vA318 и vA142 репликоны. Хлопковым хомякам, по 2-8 животных в группе, проводят внутримышечные вакцинации (100 мкл в одну лапу) в дни 0 и 21, используя репликоны (0,1 или 1 мкг), инкапсулированные в RV01 липосомы (с ПЭГ-2000), полученные по способу (D), но с порцией 150 мкг РНК. Контрольным группам вводят RSV-F субъединичную белковую вакцину (5 мкг), дополненную квасцами или VRP эксперессирующими полной длины RSV-F (1×106 IU, 8 животных/группу). Всем животным проводят третью вакцинацию (день 56), используя RSV-F субъединичную белковую вакцину (5 мкг) с адъювантом - квасцами. Кроме того, был интактный контроль (4 животных/группу). Кроме того, дополнительной группе проводят внутримышечно бактериальные вакцинации (50 мкл в лапу) в дни 0 и 56, используя 1 мкг vA317 РНК в липосомах, но не проводят третью вакцинацию субъединичной белковой вакциной.
Сыворотку собирают для анализа антител в дни 0, 21, 35, 56, 70, плюс дни 14, 28 и 42 для дополнительной группы. Титры сывороточного F-специфического IgG (GMT) оказались следующими:
День 21 День 35 День 56 День 70
1 мкг vA318 260 1027 332 14263
0,1 мкг vA318 95 274 144 2017
1 мкг vA142 483 1847 1124 11168
0,1 мкг vA142 314 871 418 11023
1 мкг vA317 841 4032 1452 13852
1×106 IU VPR (F-полная) 2075 3938 1596 14574
5 мкг F тримерная субъединица/квасцы 12685 54526 25846 48864
Интактная 5 5 5 5
Титры нейтрализации сыворотки были следующими (60% RSV титр нейтрализации для 2 групп по 3-4 животных в группе, GMT для указанных 2 групп были на группу):
День 21 День 35 День 56 День 70
1 мкг vA318 58 134 111 6344
0,1 мкг vA318 41 102 63 6647
1 мкг vA142 77 340 202 5427
0,1 мкг vA142 35 65 56 2223
1 мкг vA317 19 290 200 4189
1×106 IU VPR (F-полная) 104 1539 558 2876
5 мкг F тримерная субъединица/квасцы 448 4457 1630 3631
Интактная 10 10 10
Сывороточные титры и титры нейтрализующих антител для дополнительной группы были следующими:
День 14 21 28 35 42 56 70
IgG 397 561 535 501 405 295 3589
NT 52 82 90 106 80 101 1348
Подтверждено, что указанные репликоны являются иммуногенными для хлопковых хомяков, вырабатывая сывороточные F-специфические IgG и нейтрализующие RSV антитела после первой вакцинации. Вторая вакцинация повышает эффективность реакций. Титры F-специфических IgG после второй вакцинация 1,0 мкг репликона оказались в 1,5-4 раза выше, чем после второй вакцинации 0,1 мкг репликона.
Третья вакцинация (белок в 56 день) не повышает титры у хлопковых хомяков, которые ранее были вакцинированы F тримерной субъединицей + квасцы, но она обеспечила значительное увеличение титров у хлопковых хомяков, которые предварительно были вакцинированы репликонами. В большинстве случаев сывороточные титры нейтрализующих RSV антител после двух вакцинаций репликонами с последующим введением белка оказались равными или больше, чем титры, стимулированные двумя или тремя последовательными вакцинациями белком.
В рассматриваемом исследовании также оценивают кинетические особенности реакции антител на 1,0 мкг vA317. Титры сывороточных F-специфических IgG и титры нейтрализующих RSV антител, стимулированные одной вакцинацией, достигают своих пиковых значений примерно на 21 день, и сохраняются по меньшей мере до 56 дня (50-70% капель в титр F-специфических IgG, мало изменений в титре нейтрализующих RSV антител). Вторую гомологичную вакцинацию проводят для указанных животных в день 56, и повышают титры антител до уровня по меньшей мере равного тому, которого достигают, если вторую вакцинацию проводят в день 21.
Дальнейшие эксперименты включают заражение вирусами. vA368 репликон кодирует полной длины дикого типа поверхностный фьюжн гликопротеин RSV, из которого удален фьюжн пептид, причем экспрессию стимулируют EV71 IRES. Хлопковым хомякам, по 7 в группе, проводят внутримышечную вакцинацию (100 мкл в лапу) в дни 0 и 21, используя vA368 в липосомах, полученный по способу (H), размер порции 175 мкг РНК, или VRP с тем же самым репликоном. Указанные липосомы включают 2 кДа ПЭГ, конъюгированного с DMG. Контрольной группе вводят 5 мкг белка, дополненного квасцами, и включают также интактную контрольную группу.
Для всех групп осуществляют интраназальное заражение (i.n.), используя 1×106 БОЕ RSV, через четыре недели после окончательной иммунизации. Сыворотку собирают для анализа антител в дни 0, 21, 35. Титры вируса в легких измеряют на 5 день после заражения. Получены следующие результаты:
Липосомы VRP Белок Интактные
Титры сывороточных F-специфических IgG (GMT)
День 21 370 1017 28988 5
День 35 2636 2002 113843 5
Титры нейтрализации (GMT)
День 21 47 65 336 10
День 35 308 271 5188 10
Содержание вируса в легких (БОЕ на г ткани легкого)
День 54 422 225 124 694110
Таким образом, РНК вакцина снижает содержание вирусов в более чем 1000 раз, с приблизительно 106 БОЕ/г у невакцинированных контрольных хлопковых хомяков до менее чем 103 БОЕ/г у вакцинированных контрольных хлопковых хомяков
Исследования, проводимые на крупных млекопитающих
Исследования осуществляют на крупном рогатом скоте. Проводят иммунизацию телят (4-6 недельные, ~60-80 кг, 5 в группе), используя 66 мкг репликона vA317, кодирующего полной длины F белок RSV, в дни 0, 21, 86 и 146. Указанные репликоны включены в липосомы по способу (E), но с добавлением 1,5 мг РНК; они содержат 40% DlinDMA, 10% DSPC, 48% холестерина и 2% ПЭГ-2000, конъюгированного с DMG. Один только PBS используют в качестве негативного контроля, и в качестве позитивного контроля используют лицензионную вакцину ("Triangle 4" от Fort Dodge, содержащую убитый вирус). Всем телятам вводят 15 мкг F белка, дополненного MF59 эмульсией в день 146.
РНК вакцины кодируют человеческий RSV F, тогда как вакцины "Triangle 4" содержат коровий RSV F, но RSV F белок является высоко консервативным между BRSV и HRSV.
Телятам вводят по 2 мл каждой экспериментальной вакцины, внутримышечно как инъекции 2×1 мл в обе стороны шеи. Напротив, вакцину "Triangle 4" вводят как инъекцию одной 2 мл дозы в шею.
Сыворотку собирают для анализа антител в дни 0, 14, 21, 35, 42, 56, 63, 86, 100, 107, 114, 121, 128, 135, 146, 160, 167, 174, 181, 188, 195 и 202. Если у отдельного животного значение титра находится ниже предела определения, этот титр оценивают как 5.
ФИГ.14 демонстрирует титры F-специфических IgG за 210 дней. В течение первых 63 дней РНК репликон является иммуногенным для телят за счет липосом, хотя он дает более низкие титры, чем лицензионная вакцина. У всех вакцинированных телят наблюдают F-специфические антитела после второй дозы, и их титры оказываются очень стабильными в течение 2-6 недель после введения второй дозы (и оказываются особенно стабильными для РНК вакцины). Титры вплоть до дня 202 были следующими:
Figure 00000001
Титры сывороточных антител, нейтрализующих RSV, были следующими:
Figure 00000002
Материал, который был использован для второй липосомальной дозы, не был свежеприготовленным, и та же партия РНК продемонстрировала снижение эффективности в исследованиях иммуногенности на мышах. Поэтому существует вероятность того, что указанная вакцина была бы более иммуногенной, если бы для всех вакцинаций были использованы свежие материалы.
При проведении анализов с комплементом, нейтрализующие антитела детектировались у всех вакцинированных телят. В указанном анализе у всех вакцинированных телят были хорошие титры нейтрализующих антител после второй РНК вакцинации. Кроме того, РНК вакцина приводит к появлению титров сывороточных F-специфических IgG, которые наблюдались у нескольких телят после второй вакцинация и у всех телят после третьей вакцинации.
RSV-F с добавленным в качестве адъюванта MF59 оказался способным бустировать реакцию IgG у всех ранее вакцинированных телят, и бустировать титры комплемент-независимых нейтрализующих антител у телят, предварительно вакцинированных РНК.
Доказательство концепции РНК вакцины для крупных животных является особенно важным в свете потерь эффективности, наблюдавшейся ранее для вакцин на базе ДНК, при переходе от моделей с мелкими животными к крупным животным и людям. Типичная доза ДНК вакцины для коров должна составлять 0,5-1 мг [40, 41], и поэтому весьма обнадеживает тот факт, что иммунные реакции можно вызывать, используя всего лишь 66 мкг РНК.
Влияние диаметра липосом
Для получения более мелких липосом способ со шприцом/трубкой заменяют способом, в котором растворы липидов и РНК смешивают в каналах микрожидкостного чипа.
Приготавливают свежие исходные растворы липидов в этаноле. Взвешивают 37 мг DlinDMA, 11,8 мг DSPC, 27,8 мг холестерина и 8,07 мг ПЭГ-DMG и растворяют в 7,55 мл этанола. Свежеприготовленный липидный исходный раствор осторожно встряхивают при 37°C в течение около 15 мин для получения гомогенной смеси. Затем 226,7 мкл исходного раствора добавляют к 1,773 мл этанола для получения 2 мл исходного рабочего раствора липидов. 4 мл рабочего раствора РНК также приготавливают из исходного раствора ~1 мкг/мкл в 100 мМ цитратном буфере (pH 6). Четыре 20 мл стеклянные ампулы (с магнитными якорями) промывают раствором РНКазы Away и обильно промывают водой MilliQ перед тем, как используют для очищения ампул от РНКаз. Две из ампул используют для рабочего раствора РНК (по 2 мл в каждой ампуле) и остальные используют для сбора смесей липидов и РНК. Рабочие липидный и РНК растворы нагревают при 37°C в течение 10 мин перед тем, как помещают в 3 см3 шприцы с люэровским клапаном. Шприцы, содержащие РНК и липиды, соединяют с Mitos Droplet junction Chip (стеклянное микрожидкостное устройство от Syrris, Part № 3000158), используя PTFE трубки с внутренним диаметром 0,076 см и внешним диаметром 0,16 см, (Syrris) используя 4-сторонний краевой разъем. Два потока РНК и один липидный поток направляют с помощью шприцевых насосов, и смешение этанольной и водной фаз происходит в X соединении чипа (100 мкм × 105 мкм). Скорости всех трех потоков поддерживают при 1,5 мл/мин, следовательно, отношение полного количества водной фазы к этанольной составляет 2:1. Выходную трубку располагают таким образом, чтобы собирать смеси в 20 мл стеклянные ампулы (при перемешивании). Магнитные якоря убирают и этанольный/водный раствор оставляют уравновешиваться до комнатной температуры в течение 1 часа. Затем полученную смесь помещают в 5 см3 шприц, снабженный кусочком PTFE трубки с внутренним диаметром 0,076 см и внешним диаметром 0,16 см, и в другой 5 см3 шприц с равной длины PTFE трубкой, и вводят равные объемы 100 мМ цитратного буфера (pH 6). Скорости в шприцах поддерживают 3 мл/мин, используя шприцевые насосы, и конечную смесь собирают в 20 мл стеклянную ампулу (при перемешивании). Затем липосомы концентрируют до 2 мл и осуществляют диализ против 10-15 объемов 1X PBS, используя систему TFF, перед тем, как выделяют конечный продукт. Используют половолоконные фильтрационные мембраны с отсечением по размеру пор 100 кДа и площадью поверхности 20 см2. Для in vitro и in vivo экспериментов состав разбавляют до нужной концентрации РНК, используя 1X PBS.
Если липосомы, полученные с использованием способа шприц/трубка для 75 мкг РНК имеют средний диаметр Z 148 нм и показатель полидисперсности 0,122, смешивание с использованием микрожидкостного чипа обеспечивает получение среднего диаметра Z 97 нм и с показателем полидисперсности 0,086. Доля инкапсулированных РНК несколько снижается с 90% до 87%. Указанные диаметры и показатели полидисперсности измеряют, используя зетасайзер (прибор для измерения размеров наночастиц) Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments, Worcestershire, UK) в соответствии с инструкциями изготовителя. Перед измерением липосомы разбавляют в 1X PBS.
Полученные липосомы вводят 8-10 недельным BALB/c мышам путем внутримышечной инъекции в день 0, 50 мкл в лапу. Образцы синус-орбитального кровотечения отбирают в дни 1 и 3, и окончательно в день 6. Измеряют сывороточные уровни SEAP, используя хемилюминесцентный анализ. Как видно на ФИГ.3, более мелкие липосомы повышают уровни SEAP примерно в 2 раза в день 1 и примерно в 5 раз в день 6.
Липосомы, полученные двумя различными способами, оценивают также в отношении доставки репликонов, кодирующих полной длины RSV-F белок. Титры F-специфического сывороточного IgG у мышей, по 8 животных в группе, определяют после внутримышечных вакцинаций в дни 0 и 21. Сыворотку собирают для анализа антител в дни 14 (2wp1) и 35 (2wp2). Если титры у отдельного животного оказываются <25 (предел детектирования), их оценивают как титры 5. Далее представлены результаты в виде среднего геометрического значения для титров каждой группы:
Figure 00000003
Таким образом, более мелкие липосомы, полученные способом смешивания в чипе, обеспечивают примерно двукратное увеличение GMT для 2wp1 и 2wp2. Вариации различных липосом с различными диаметрами также используют для доставки репликонов, кодирующих полной длины RSV F белок. На ФИГ.15 представлен график зависимости полных титров IgG против F белка через две недели после первой дозы от диаметров липосом.
Способы получения липосом
Вообще для получения липосом в соответствии с настоящим изобретением были использованы восемь различных способов. В тексте их обозначают как способы (A) до (H) и они отличаются, главным образом, стадиями фильтрации и TFF стадиями. Далее приводятся подробности способов:
(A) Приготавливают свежие исходные липидные растворы в этаноле. Взвешивают 37 мг DlinDMA, 11,8 мг DSPC, 27,8 мг холестерина и 8,07 мг ПЭГ DMG 2000 и растворяют в 7,55 мл этанола. Свежеприготовленный липидный исходный раствор осторожно встряхивают при 37°C в течение около 15 мин для получения гомогенной смеси. Затем 755 мкл исходного раствора добавляют к 1,245 мл этанола для получения 2 мл исходного рабочего липидного раствора. Указанное количество липидов используют для создания липосом с 250 мкг РНК. Также приготавливают 2 мл рабочего раствора РНК из исходного раствора ~1 мкг/мкл в 100 мМ цитратном буфере (pH 6). Три стеклянные 20 мл ампулы (с магнитными якорями) промывают раствором РНКазы Away (Molecular BioProducts, San Diego, CA) и обильно промывают водой MilliQ перед тем, как используют для очистки ампул от РНКаз. Одну из ампул используют для рабочего раствора РНК и остальные для сбора смесей липидов и РНК (как раскрыто далее). Рабочие липидный и РНК растворы нагревают при 37°C в течение 10 мин перед тем, как помещают в 3 см3 шприцы с люэровским клапаном. 2 мл цитратного буфера (pH 6) помещают в другой 3 см3 шприц. Шприцы, содержащие РНК и липиды, соединяют в T смесителе (PEEK™ с 500 мкм внутренним диаметром соединения, Idex Health Science, Oak Harbor, WA), используя FEP трубки (фторированный этилен-пропилен; причем размер всех FEP трубок: 2 мм внутренний диаметр × 3 мм внешний диаметр, поставка от Idex Health Science). На выходе T смесителя также расположена FEP трубка. Третий шприц, содержащий цитратный буфер, соединен с отдельным отрезком FEP трубки. Скорость потока во всех шприцах поддерживается шприцевыми насосами на уровне 7 мл/мин. Выходы трубок располагают таким образом, чтобы собирать смеси в 20 мл стеклянную ампулу (при перемешивании). Магнитный якорь удаляют, и этанольно/водный раствор оставляют для уравновешивания до комнатной температуры в течение 1 часа. 4 мл полученной смеси помещают в 5 см3 шприц, который соединен с отрезком FEP трубки, и в другой 5 см3 шприц, соединенный с равной длины FEP трубкой, и загружают равные количества 100 мМ цитратного буфера (pH 6). Скорость потока через оба шприца, которую обеспечивают шприцевые насосы, составляет 7 мл/мин, и конечную смесь собирают в 20 мл стеклянную ампулу (при перемешивании). Затем смесь, собранную на второй стадии смешивания (липосомы), пропускают через мембрану Mustang Q (анионообменная подложка, которая связывает и удаляет анионные молекулы, от Pall Corporation, AnnArbor, MI, USA). Перед тем, как через Mustang мембрану пропускают липосомы, через нее последовательно пропускают 4 мл 1 M NaOH, 4 мл 1 M NaCl и 10 мл 100 мМ цитратного буфера (pH 6). Липосомы нагревают в течение 10 мин при 37°C перед тем, как их пропускают через мембрану. Затем липосомы концентрируют до объема 2 мл и осуществляют диализ против 10-15 объемов 1X PBS, используя TFF, перед выделением конечного продукта. Систему TFF и половолоконные фильтрационные мембраны закупают у Spectrum Labs и используют в соответствии с рекомендациями изготовителя. Используют полисульфонные половолоконные фильтрационные мембраны (№ по каталогу P/N: X1AB-100-20P) с отсечением по размеру пор 100 кДа и площадью поверхности 8 см2. Для in vitro и in vivo экспериментов композиции разбавляют до нужной концентрации РНК, используя 1X PBS.
(B) По способу (A) за исключением того, что после встряхивания 226,7 мкл исходного раствора добавляют к 1,773 мл этанола для получения 2 мл исходного липидного раствора, тем самым изменяя отношение липиды:РНК.
(C) По способу (B) за исключением того, что фильтрацию с использованием системы Mustang опускают, при этом липосомы поступают из 20 мл стеклянной ампулы в систему TFF для диализа.
(D) По способу (C) за исключением того, что в TFF используют полиэфирсульфонные (PES) половолоконные мембраны (номер по каталогу P-C1-100E-100-01N) с отсечением по размеру пор 100 кДа и площадью поверхности 20 см2.
(E) По способу (D) за исключением того, что используют мембрану Mustang, как в способе (A).
(F) По способу (A) за исключением того, что фильтрацию на системе Mustang опускают, при этом липосомы поступают из 20 мл стеклянной ампулы в систему TFF диализа.
(G) По способу (D) за исключением того, что 4 мл рабочего раствора РНК приготавливают из исходного раствора ~1 мкг/мкл в 100 мМ цитратном буфере (pH 6). Затем четыре 20 мл стеклянные ампулы подготавливают аналогичным образом. Две из них используют для рабочего раствора РНК (2 мл в каждой ампуле) и остальные используют для сбора смесей липидов и РНК, по способу (C). Вместо использования T миксера, шприцы, содержащие РНК и липиды, соединяют с чипом Mitos Droplet junction Chip (стеклянное микрожидкостное устройство, полученное от Syrris, номер по каталогу 3000158), используя PTFE трубки (внутренний диаметр 0,076 см × 0,16 см внешний диаметр), используя 4-сторонний краевой разъем (Syrris). Два потока РНК и один липидный поток перемещаются с помощью шприцевых насосов, и смешивание этанольной и водной фаз происходит в X соединении (100 мкм × 105 мкм) чипа. Скорости всех трех потоков поддерживают на 1,5 мл/мин, поэтому отношение количества полной водной фазы к этанольной фазе составляет 2:1. Выход трубки расположен таким образом, чтобы собирать смеси в 20 мл стеклянную ампулу (при перемешивании). Магнитный якорь удаляют и этанольно/водный раствор оставляют для уравновешивания до комнатной температуры в течение 1 часа. Затем смесь помещают в 5 см3 шприц, который соединен с другим отрезком FEP трубки; и в другой 5 см3 шприц, соединенный с равной длины FEP трубкой, загружают равное количество 100 мМ цитратного буфера (pH 6). Скорость потока через оба шприца, которую обеспечивают шприцевые насосы, составляет 3 мл/мин и конечную смесь собирают в 20 мл стеклянную ампулу (при перемешивании). Затем липосомы концентрируют до 2 мл и осуществляют диализ против 10-15 объемов 1X PBS, используя TFF, по способу (D).
(H) По способу (A), за исключением того, что 2 мл рабочего исходного липидного раствора приготавливают, перемешивая 120,9 мкл липидного исходного раствора с 1,879 мл этанола. Также после смешивания в T миксере липосомы из 20 мл ампулы помещают в кассету для диализа Pierce Slide-A-Lyzer Dialysis Cassette (Thermo Scientific, extra strength, 0,5-3 мл емкости) и осуществляют диализ против 400-500 мл 1X PBS в течение ночи при 4°C в подвергнутом обработке в автоклаве пластиковом контейнере перед выделением конечного продукта.
RSV иммуногенность
vA317 самореплицирующийся репликон, кодирующий белок RSV F, вводят мышам штамма BALB/c, по 4 или 8 животных в группе, путем бактериальных внутримышечных вакцинаций (50 мкл в лапу) в дни 0 и 21 только с репликоном (1 мкг), или в виде липосом с DlinDMA ("RV01"), или DOTAP ("RV13"), или с липидами, как представлено на ФИГ.16A-16M ("RV05"). RV01 липосомы содержат 40% DlinDMA, 10% DSPC, 48% холестерина и 2% ПЭГ-DMG, но различные количества РНК. RV05 липосомы содержат или 40% RV05, 10% DSPC, 48% холестерина и 2% ПЭГ-DMG или 60% RV05, 38% холестерина и 2% ПЭГ-DMG. RV13 липосомы содержат 40% DOTAP, 10% DOPE, 48% холестерина и 2% ПЭГ-DMG. Для сравнения оголенные плазмидные ДНК (20 мкг), экспрессирующие тот же самый RSV-F антиген, вводят или используя электропорацию, или с RV01(10) липосомами (0,1 мкг ДНК). Четырех мышей используют в качестве интактной контрольной группы.
Липосомы приготавливают по способу (A) или по способу (B). Для некоторых липосом, полученных по способу (A), используют двойное или половинное количество РНК. Средний диаметр частиц Z и коэффициент полидисперсности составляют:
Figure 00000004
Сыворотку собирают для анализа антител в дни 14, 36 и 49. Селезенки извлекают в день 49 для анализа T клеток.
Титры сывороточных F-специфических IgG (GMT) следующие:
Figure 00000005
Количество цитокин-положительных Т клеток и специфических в отношении пептида RSV F51-66 оказались следующими, приведены только те значения, которые статистически значимы выше 0:
Figure 00000006
Figure 00000007
Таким образом, липосомальные композиции значительно повышают иммуногенность в отношении оголенных РНК контролей, что определено по увеличению титров F-специфических IgG и количеству T клеток. Композиции плазмидных ДНК с липосомами, или оголенные, введенные с использованием электропорации, оказываются значительно менее иммуногенными, чем самореплицирующиеся РНК в композиции с липосомами.
Далее RV01 липосомы приготавливают по способу (H), используя или короткий (2 кДа) или длинный (5 кДа) ПЭГ, конъюгированный с DMG, и инкапсулируя 150 мкг РНК (vA375 репликон, кодирующий поверхностный фьюжн гликопротеин RSV), или инкапсулируя только буфер. Указанные липосомы содержат 40% DlinDMA, 10% DSPC, 48% Chol, и 2% ПЭГ-DMG. Размеры и инкапсулирование были следующими:
Figure 00000008
Указанные липосомы вводят BALB/c мышам (по 10 в группе) путем бактериальных внутримышечных инъекций (50 мкл в лапу) в дни 0 и 21. Дозы составляют 0,01, 0,03, 0,1, 0,3 или 1 мкг. Титры сывороточных F-специфических IgG и титры PRNT60 (GMT) через 2 недели после первой или второй инъекции были следующими:
Figure 00000009
Figure 00000010
Липосомы - требования для инкапсулирования
Как было указано выше со ссылкой на ФИГ.10, способ инкапсулирования является существенным для эффективной экспрессии. В дальнейших экспериментах используют три различные РНК: (i) ‘vΑ317’ репликон, который экспрессирует RSV-F т.е. поверхностный фьюжн гикопротеин RSV; (ii) ‘vΑ17’ репликон, который экспрессирует GFP; и (iii) ‘vΑ336’, который является репликационно-дефектным и кодирует GFP. РНК вводят или оголенными, или в липосомах, полученных по способу (D). Пустые липосомы получают по способу (D), но совсем без каких-либо РНК. Липосомные композиции имеют следующие характеристики:
Figure 00000011
BALB/c мышам, по 5 животных в группе, проводят бактериальную внутримышечную вакцинацию (50 мкл в лапу) в дни 0 и 21, используя:
Группа 1 оголенные самореплицирующиеся RSV-F РНК (vA317, 0,1 мкг)
Группа 2 самореплицирующиеся RSV-F РНК (vA317, 0,1 мкг), инкапсулированные в липосомы
Группа 3 самореплицирующиеся RSV-F РНК (vA317, 0,1 мкг), добавленные к пустым липосомам
Группа 4 F субъединичный белок (5 мкг)
Сыворотку собирают для анализа антител в дни 14, 35 и 51. Измеряют титры F-специфических сывороточных IgG (GMT); если у отдельных животных титр оказывается меньше <25 (предел детектирования), его оценивают как титр 5. Кроме того в день 51 извлекают селезенки для анализа Т клеток, для определения клеток, которые оказываются цитокин-позитивными и специфическими в отношении RSV F51-66 пептида (CD4+) или в отношении RSV пептидов F85-93 и F249-258 (CD8+).
Титры IgG для 10 групп и для неиммунизированных контрольных мышей следующие:
Figure 00000012
Титры сывороточных нейтрализующих RSV антител в день 51 были следующими:
Figure 00000013
Для животных, демонстрирующих RSV F-специфические CD4+ селезеночные T клетки в день 51, были следующими, где число (% позитивных клеток) приводится, только если статистическая значимость стимулированной реакции оказывается больше нуля:
Figure 00000014
Для животных, демонстрирующих RSV F-специфические CD8+ селезеночные T клетки в день 51, были следующими, где число (% позитивных клеток) приводится, только если статистическая значимость стимулированной реакции оказывается больше нуля:
Figure 00000015
Таким образом, инкапсулирование РНК внутри липосом является необходимым условием для высокой степени иммуногенности, в то время как простая смесь РНК и указанных липосом (группа 3) оказалась неиммуногенной (в действительности, менее иммуногенной, чем оголенные РНК).
Различные катионные липиды с vA317 RSV репликоном
В дальнейших экспериментах проводят сравнение четырех различных катионных липидов (DlinDMA, RV02, RV04 и RV07). Все липосомы содержат 2% ПЭГ-DMG 2000, но остальная часть липидной композиции варьируется. Состав и физические характеристики приводятся далее:
Figure 00000016
BALB/c мышам, по 8 в группе, проводят бактериальную внутримышечную вакцинацию (50 мкл в лапу) в дни 0 и 21, используя оголенный репликон (1 мкг) или 0,1 мкг инкапсулированной РНК. Титры сывороточных F-специфических IgG (GMT) через 2 недели после двух указанных инъекций оказались следующими:
Figure 00000017
Для RV07 отсутствие DSPC вызывает значительное снижение иммуногенности.
Аналогичным образом тестируют другие липиды (RV03, RV08, RV09, RV14 [42]):
Figure 00000018
Figure 00000019
Результаты для липосомы M (с DC-холестерином) оказались неудовлетворительными, даже хуже, чем для контрольной оголенной РНК. Напротив, для остальных катионных липидов результаты оказались удовлетворительными. Липосомы способа N были получены способом (способ (G) с микрожидкостным чипом), который отличался от способа получения липосом G (способ (D)) и такие более маленькие липосомы обеспечили лучшие результаты с примерно таким же инкапсулированием.
Другие липиды (RV01, RV10, RV11, RV15) тестируют аналогичным образом:
Figure 00000020
Figure 00000021
За исключением липосом способа Q, результаты для каждой из указанных липосом были лучше, чем для контроля. RV10 липид в липосомах Q имеет значение pKa 7,86, что по-видимому слишком велико, чтобы их можно было использовать in vivo. Однако даже внутри подходящего интервала значений pKa 5,0-7,6, хотя результаты были неплохими, ни один из липидов с одним алкильным концевым сегментом и одним стероид-содержащим концевым сегментом не обеспечил столь же хорошие результаты как RV01.
Другие липосомы получают с RV05. Все указанные липосомы содержат 40% RV05 и 2% пегилированного липида, но остальные компоненты варьируют (хотя во всех случаях холестерин включают). Далее приводятся физические характеристики:
Figure 00000022
BALB/c мышей тестируют как и раньше:
Figure 00000023
Для катионных липидов с асимметричными концевыми сегментами (алкил + холестерин), замена нейтрального липида из DSPC (насыщенный C18 липидный сегмент) на 18:2 или 18:3 PC (с 2 и 3 ненасыщенными двойными связями в концевом сегменте) увеличивает титры полного IgG. Сравнимые результаты получают при замене DSPC на DPyPE.
Другие различные катионные липиды с vA317 RSV репликоном
Катионные липиды, раскрытые в ссылке 43, также используют для получения липосом для vA317 репликона. Указанные катионные липиды имеют значение pKa между 5,8 и 6,1. Для сравнения также тестируют DODMA, DlinDMA и DOTMA. Катионный липид всегда присутствует в количестве 40%. Все липосомы содержат холестерин и 2% пегилированный DMG (ПЭГ2000, за исключением липосом E, которые содержат ПЭГ5000), и их получают по способу (H). Физические характеристики следующие:
Figure 00000024
Указанные липосомы используют для вакцинации BALB/c мышей, также как раньше. Титры сывороточных F-специфических IgG (GMT) были следующими:
Figure 00000025
Указанные RV05 липосомы оказались более иммуногенными, чем оголенные РНК, но менее иммуногенными, чем RV01 липосомы. Селезенку вырезают на 49 день для анализа Т клеток. Все липосомы дают F-специфические цитокин-позитивные T клеточные частоты (CD4+ и CD8+), статистическая значимость которых оказывается выше нуля.
Различные липиды и различные длины ПЭГ
vA317 репликоны вводят в липосомы с различными липидами с различными длинами ПЭГ. Все указанные липосомы содержат 40% DlinDMA, 10% DSPC и 48% холестерина, но остальные 2% варьируют, используя различные пегилированные липиды (например, ФИГ.18A-18E) и различной длины ПЭГ.
Физические характеристики липосом, полученных по способу (H), следующие:
Figure 00000026
BALB/c мышам, по 8 в группе, проводят внутримышечные вакцинации (50 мкл в лапу) в дни 0 и 21 репликонами, или оголенными (1 мкг) или инкапсулированными (0,1 мкг). Сыворотку собирают для анализа антител в дни 14 и 35.
Титры сывороточных F-специфических IgG (GMT) через 2 недели после двух инъекций (2wp1) были следующими:
Figure 00000027
Указанные результаты демонстрируют тенденцию, свидетельствующую о том, что ПЭГ концевые группы с более высоким молекулярным весом более иммуногены. По мере увеличения длины DMG-конъюгированного ПЭГ (увеличение со 1000 Да до 3000 Да) титры 2wp2 F-специфических IgG увеличиваются с 7412 до 15659 до 22378.
Изменение линкерного участка со сложноэфирного до простого эфира практически не влияют на титры. Также, притом же самом молекулярном весе концевой группы (2000) наблюдается тенденция того, что увеличение длины липидных концов снижает титры (H с C14 диалкилом против I с C18 диалкилом). Замена ПЭГ диалкильного липидного концевого сегмента холестерином оказывает мало влияния на иммуногенность (A с DMG против G с холестерином).
Аналогичные эксперименты осуществляют с различными липидами, в которых 2 кДа ПЭГ расщеплен на 2× 1 кДа группы (ФИГ.17). Снова используют vA317 репликон, BALB/c мышами, по 8 в группе, проводят бактериальную вакцинацию (50 мкл в лапу) в дни 0 и 21, используя 1 мкг оголенных РНК или 0,1 мкг инкапсулированных в липосомы РНК. Все липосомы содержат 40% катионный липид (DlinDMA), 10% DSPC и 48% холестерина, но остальные 2% варьируют, используя различные пегилированные липиды (но все содержат 2 кДа ПЭГ). Их получают по способу (H).
Физические характеристики липосом оказываются:
Figure 00000028
Далее липосомы получают, используя RV05. Все липосомы содержат 40% катионного липида (RV05) и 2% пегилированного липида (2 кДа ПЭГ), но остальные компоненты варьируют (хотя холестерин включают всегда). Указанные липосомы получают по способу (H), но при pH 5. Физические характеристики следующие:
Figure 00000029
BALB/c мышам, по 8 в группе, проводят бактериальную внутримышечную вакцинацию (50 мкл в лапу) в дни 0 и 21, используя репликон, или оголенный (1 мкг) или инкапсулированный (0,1 мкг). Сыворотку собирают для анализа антител в дни 14 и 35. Титры сывороточных F-специфических IgG (GMT) через 2 недели после двух инъекций оказались следующими (2wp1):
Figure 00000030
Таким образом, расщепление концевых сегментов ПЭГ понижает титры in vivo. Включение двойной связи (1 степень ненасыщенности на алкильный концевой сегмент) в ПЭГ липидные концевые сегменты повышает титры IgG в 6 раз в день 14 и в 7 раз в день 35. Для катионных липидов с асимметрическими липидными концевыми сегментами (алкил + холестерин), изменение нейтрального липида с DSPC (насыщенный, C18 липидная концевая группа) на 18:2 или 18:3 PC (с 2 и 3 ненасыщенными двойными связями на концевой сегмент) приводит к повышению титров полного IgG. Сопоставимые результаты наблюдают при замене DSPC на DPyPE.
ЦМВ иммуногенность
RV01 липосомы с DLinDMA в качестве катионного липида используют для доставки РНК репликонов, кодирующих цитомегаловирусные (ЦМВ) гликопротеины. Репликон "vA160" кодирует полной длины гликопротеины H и L (gH/gL), тогда как репликон "vA322" кодирует растворимую форму (gHраств./gL). Указанные два белка находятся под контролем отдельных субгеномных промоторов в одном репликоне; совместное введение двух отдельных векторов, один из которых кодирует gH и один кодирует gL, не дает хороших результатов.
BALB/c мышам, по 10 в группе, проводят бактериальную внутримышечную вакцинацию (50 мкл в лапу) в дни 0, 21 и 42, используя VRP, экспрессирующие gH/gL (1×106 ИмЕд (IU иммунизирующие единицы)), VRP, экспрессирующие gHраств./gL (1×106 ИмЕд) и PBS в качестве контролей. Двум тестируемым группам вводят 1 мкг vA160 или vA322 репликонов, заключенных в липосомы (40% DlinDMA, 10% DSPC, 48% холестерина, 2% ПЭГ-DMG; полученные по способу (D), но содержащие порции 150 мкг РНК).
Zсредн. диаметр vA160 липосом составляет 168,8 нм, pdI равно 0,144, и процент инкапсулирования 87,4%. Zсредн. диаметр vA322 липосомы составляет 162 нм, pdI равно 0,131, и процент инкапсулирования 90%.
Указанные репликоны способны экспрессировать два белка из одного вектора.
Сыворотку для иммунологических анализов собирают в день 63 (3wp3). Титры антител, нейтрализующих ЦМВ (обратная величина от разбавлений сыворотки, обеспечивающих 50% снижение количества позитивных вирусных очагов на лунку, относительно контроля), имеют следующие значения:
Figure 00000031
РНК, экспрессирующие или полной длины или растворимую форму комплекса ЦМВ gH/gL, вызывают высокие титры нейтрализующих антител, по оценкам, проведенным для эпителиальных клеток. Средние титры, вызванные инкапсулированными в липосомах РНК, оказываются по меньшей мере столь же высокими, что и соответствующие значения для VRP.
Повторные эксперименты подтверждают тот факт, что репликон способен экспрессировать два белка из одного вектора. РНК репликон приводит к значению титра 3wp3 11457, по сравнению с 5516 для VRP.
Следует принять во внимание, что настоящее изобретение было раскрыто с помощью только одного примера, и модификации можно осуществить, при этом оставаясь в рамках объема и сути настоящего изобретения.
Таблица 1
подходящие фосфолипиды
DDPC 1,2-дидеканоил-sn-глицеро-3-фосфатидилхолин
DEPA 1,2-диэрукоил-sn-глицеро-3-фосфат
DEPC 1,2-эрукоил-sn-глицеро-3-фосфатидилхолин
DEPE 1,2-диэрукоил-sn-глицеро-3-фосфатидилэтаноламин
DEPG 1,2-диэрукоил-sn-глицеро-3[фосфатидил-rac-(1-глицерин...)
DLOPC 1,2-линолеоил-sn-глицеро-3-фосфатидилхолин
DLPA 1,2-дилауроил-sn-глицеро-3-фосфат
DLPC 1,2-дилауроил-sn-глицеро-3-фосфатидилхолин
DLPE 1,2-дилауроил-sn-глицеро-3-фосфатидилэтаноламин
DLPG 1,2-дилауроил-sn-глицеро-3-[фосфатидил-rac-(1 -глицерин...)
DLPS 1,2-дилауроил-sn-глицеро-3-фосфатидилсерин
DMG 1,2-димиристоил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин
DMPA 1,2-димиристоил-sn-глицеро-3-фосфат
DMPC 1,2-димиристоил-sn-глицеро-3-фосфатидилхолин
DMPE 1,2-димиристоил-sn-глицеро-3-фосфатидилэтаноламин
DMPG 1,2-миристоил-sn-глицеро-3-[фосфатидил-rac-(1-глицерин...)
DMPS 1,2-димиристоил-sn-глицеро-3-фосфатидилсерин
DOPA 1,2-диолеоил-sn-глицеро-3-фосфат
DOPC 1,2-диолеоил-sn-глицеро-3-фосфатидилхолин
DOPE 1,2-диолеоил-sn-глицеро-3-фосфатидилэтаноламин
DOPG 1,2-диолеоил-sn-глицеро-3-[фосфатидил-rac-(1-глицерин...)
DOPS 1,2-диолеоил-sn-глицеро-3-фосфатидилсерин
DPPA 1,2-дипальмитоил-sn-глицеро-3-фосфат
DPPC 1,2-дипальмитоил-sn-глицеро-3-фосфатидилхолин
DPPE 1,2-дипальмитоил-sn-глицеро-3-фосфатидилэтаноламин
DPPG 1,2-дипальмитоил-sn-глицеро-3-[фосфатидил-rac-(1-глицерин...)
DPPS 1,2-дипальмитоил-sn-глицеро-3-фосфатидилсерин
DPyPE 1,2-дифитаноил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин
DSPA 1,2-дистеароил-sn-глицеро-3-фосфат
DSPC 1,2-дистеароил-sn-глицеро-3-фосфатидилхолин
DSPE 1,2-дистеароил-sn-глицеро-3-фосфатидилэтаноламин
DSPG 1,2-дистеароил-sn-глицеро-3-[фосфатидил-rac-(1 -глицерин...)
DSPS 1,2-дистеароил-sn-глицеро-3-фосфатидилсерин
EPC (Egg-PC) яичный фосфатидилхолин
HEPC гидрированный яичный фосфатидилхолин
HSPC Высокой степени очистки гидрированный соевый фосфатидилхолин
HSPC Гидрированный соевый фосфатидилхолин
LYSOPC MYRISTIC 1-миристоил-sn-глицеро-3-фосфатидилхолин
LYSOPC PALMITIC 1-пальмитоил-sn-глицеро-3-фосфатидилхолин
LYSOPC STEARIC 1-стеароил-sn-глицеро-3-фосфатидилхолин
Молочный сфингомиелин MPPC 1-миристоил-1,2-пальмитоил-sn-глицеро-3-фосфатидилхолин
MSPC 1-миристоил-1,2-стеароил-sn-глицеро-3-фосфатидилхолин
PMPC 1-пальмитоил-1,2-миристоил-sn-глицеро-3-фосфатидилхолин
POPC 1-пальмитоил-1,2-олеоил-sn-глицеро-3-фосфатидилхолин
POPE 1-пальмитоил-2-олеоил-sn-глицеро-3-фосфатидилэтаноламин
POPG 1,2-диолеоил-sn-глицеро-3-[фосфатидил-rac-(1-глицерин)...]
PSPC 1-пальмитоил-1,2-стеароил-sn-глицеро-3-фосфатидилхолин
SMPC 1-стеароил-1,2-миристоил-sn-глицеро-3-фосфатидилхолин
SOPC 1-стеароил-1,2-олеоил-sn-глицеро-3-фосфатидилхолин
SPPC 1-стеароил-1,2-пальмитоил-sn-глицеро-3-фосфатидилхолин
Ссылки
Figure 00000032
Figure 00000033

Claims (10)

1. Липосома для in vivo доставки РНК в клетку позвоночного, в которой инкапсулирована самореплицирующаяся РНК, кодирующая представляющий интерес иммуноген, и где липосома имеет диаметр в интервале значений 60-180 нм, где липосома содержит (i) от 20% до 80% (молярный процент) катионного липида, (ii) цвиттерионный липид и (iii) от 35% до 50% (молярный процент) холестерина, где иммуноген вызывает иммунный ответ против бактерии, вируса, грибка или паразита.
2. Липосома по п.1, где липосома имеет диаметр в интервале 80-160 нм.
3. Липосома по п.1, отличающаяся тем, что липосома имеет диаметр около 97 нм.
4. Липосома по п. 1, где указанная липосома содержит DlinDMA (1,2-дилинолеилокси-N,N-диметил-3-аминопропан), DSPC (1,2-диастеароил-sn-глицеро-3-фосфохолин), DPyPE (1,2-дифитаноил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин), холестерин, ПЭГилированный липид или комбинацию перечисленного.
5. Липосома по п.1, где самореплицирующаяся РНК кодирует (i) РНК-зависимую РНК полимеразу, которая может транскрибировать РНК из самореплицирующейся РНК, и (ii) иммуноген.
6. Липосома по п.1, где самореплицирующаяся РНК содержит две открытые считывающие рамки, причем первая из них кодирует альфавирусную репликазу и вторая из них кодирует иммуноген.
7. Липосома по п.1, где длина самореплицирующейся РНК составляет 9000-12000 нуклеотидов.
8. Липосома по п.1, где длина самореплицирующейся РНК составляет 5000-25000 нуклеотидов.
9. Фармацевтическая композиция для иммунизации субъектов, содержащая эффективное количество липосомы по любому из пп.1-8.
10. Способ выработки защитной иммунной реакции у позвоночных, включающий стадию введения позвоночному эффективного количества липосомы по любому из пп. 1-8.
RU2013114392A 2010-08-31 2011-08-31 Маленькие липосомы для доставки кодирующей иммуноген рнк RU2671482C2 (ru)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US37883110P 2010-08-31 2010-08-31
US61/378,831 2010-08-31
PCT/US2011/049873 WO2012030901A1 (en) 2010-08-31 2011-08-31 Small liposomes for delivery of immunogen-encoding rna

Publications (2)

Publication Number Publication Date
RU2013114392A RU2013114392A (ru) 2014-10-10
RU2671482C2 true RU2671482C2 (ru) 2018-10-31

Family

ID=44645813

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2013114392A RU2671482C2 (ru) 2010-08-31 2011-08-31 Маленькие липосомы для доставки кодирующей иммуноген рнк

Country Status (21)

Country Link
US (1) US9254265B2 (ru)
EP (6) EP4008357B1 (ru)
JP (2) JP2013538569A (ru)
CN (1) CN103179989A (ru)
AU (8) AU2011296062A1 (ru)
BR (1) BR112013004879A2 (ru)
CA (1) CA2809678A1 (ru)
DK (4) DK4043040T3 (ru)
ES (4) ES2941244T3 (ru)
FI (3) FI4008357T3 (ru)
HR (4) HRP20221048T1 (ru)
HU (4) HUE061275T2 (ru)
LT (4) LT4008357T (ru)
MX (1) MX341989B (ru)
PL (4) PL4043040T3 (ru)
PT (4) PT4043040T (ru)
RS (4) RS63890B1 (ru)
RU (1) RU2671482C2 (ru)
SI (4) SI4043040T1 (ru)
SM (4) SMT202300096T1 (ru)
WO (1) WO2012030901A1 (ru)

Families Citing this family (248)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
LT3243526T (lt) 2010-07-06 2020-02-10 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Rnr pristatymas, skirtas keleto imuninio atsako paleidimui
US11291635B2 (en) 2010-07-06 2022-04-05 Glaxosmithkline Biological Sa Virion-like delivery particles for self-replicating RNA molecules
US9770463B2 (en) 2010-07-06 2017-09-26 Glaxosmithkline Biologicals Sa Delivery of RNA to different cell types
CA2804396C (en) 2010-07-06 2021-06-29 Novartis Ag Liposomes with lipids having an advantageous pka-value for rna delivery
HRP20160805T1 (hr) 2010-07-06 2016-08-12 Glaxosmithkline Biologicals Sa Imuniziranje velikih sisavaca malim dozama rna
WO2012019168A2 (en) 2010-08-06 2012-02-09 Moderna Therapeutics, Inc. Engineered nucleic acids and methods of use thereof
RS63890B1 (sr) 2010-08-31 2023-02-28 Glaxosmithkline Biologicals Sa Mali lipozomi za isporuku rnk koja kodira imunogen
SI3981427T1 (sl) 2010-08-31 2022-08-31 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Pegilirani liposomi za dostavo imunogen-kodirajoče RNA
ES3005233T3 (en) 2010-10-01 2025-03-14 Modernatx Inc Modified nucleosides, nucleotides, and nucleic acids, and uses thereof
CN103269713B (zh) * 2010-10-11 2016-01-20 诺华有限公司 抗原递送平台
WO2012116715A1 (en) 2011-03-02 2012-09-07 Curevac Gmbh Vaccination in newborns and infants
WO2012116714A1 (en) 2011-03-02 2012-09-07 Curevac Gmbh Vaccination in elderly patients
DE12722942T1 (de) 2011-03-31 2021-09-30 Modernatx, Inc. Freisetzung und formulierung von manipulierten nukleinsäuren
CA3198966A1 (en) 2011-06-08 2012-12-13 Translate Bio, Inc. Cleavable lipids
EP2717893B1 (en) 2011-06-08 2019-05-08 Translate Bio, Inc. Lipid nanoparticle compositions and methods for mrna delivery
BR112014000236A2 (pt) * 2011-07-06 2017-02-14 Novartis Ag lipossomas com razão n:p útil para a liberação de moléculas de rna, composição e uso de ditos lipossomas
EP3854413A1 (en) 2011-07-06 2021-07-28 GlaxoSmithKline Biologicals SA Immunogenic combination compositions and uses thereof
EP2729168A2 (en) * 2011-07-06 2014-05-14 Novartis AG Immunogenic compositions and uses thereof
HUE041800T2 (hu) * 2011-08-31 2019-05-28 Glaxosmithkline Biologicals Sa Pegilált liposzómák immunogént kódoló RNS bejuttatására
US9464124B2 (en) 2011-09-12 2016-10-11 Moderna Therapeutics, Inc. Engineered nucleic acids and methods of use thereof
RU2648950C2 (ru) 2011-10-03 2018-04-02 Модерна Терапьютикс, Инк. Модифицированные нуклеозиды, нуклеотиды и нуклеиновые кислоты и их применение
AU2012352180A1 (en) 2011-12-16 2014-07-31 Moderna Therapeutics, Inc. Modified nucleoside, nucleotide, and nucleic acid compositions
WO2013143555A1 (en) * 2012-03-26 2013-10-03 Biontech Ag Rna formulation for immunotherapy
AU2013243949A1 (en) 2012-04-02 2014-10-30 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides for the production of biologics and proteins associated with human disease
WO2013151663A1 (en) 2012-04-02 2013-10-10 modeRNA Therapeutics Modified polynucleotides for the production of membrane proteins
US10501513B2 (en) * 2012-04-02 2019-12-10 Modernatx, Inc. Modified polynucleotides for the production of oncology-related proteins and peptides
US9572897B2 (en) 2012-04-02 2017-02-21 Modernatx, Inc. Modified polynucleotides for the production of cytoplasmic and cytoskeletal proteins
US9254311B2 (en) 2012-04-02 2016-02-09 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides for the production of proteins
US9283287B2 (en) 2012-04-02 2016-03-15 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides for the production of nuclear proteins
EP2885419A4 (en) 2012-08-14 2016-05-25 Moderna Therapeutics Inc ENZYMES AND POLYMERASES FOR RNA SYNTHESIS
HRP20220607T1 (hr) 2012-11-26 2022-06-24 Modernatx, Inc. Terminalno modificirana rna
CA2897752A1 (en) * 2013-01-10 2014-07-17 Novartis Ag Influenza virus immunogenic compositions and uses thereof
EP2968391A1 (en) 2013-03-13 2016-01-20 Moderna Therapeutics, Inc. Long-lived polynucleotide molecules
EP2971010B1 (en) 2013-03-14 2020-06-10 ModernaTX, Inc. Formulation and delivery of modified nucleoside, nucleotide, and nucleic acid compositions
US8980864B2 (en) 2013-03-15 2015-03-17 Moderna Therapeutics, Inc. Compositions and methods of altering cholesterol levels
CN105283548A (zh) 2013-03-15 2016-01-27 葛兰素史密斯克莱生物公司 Rna纯化方法
EP3041938A1 (en) 2013-09-03 2016-07-13 Moderna Therapeutics, Inc. Circular polynucleotides
EP3041934A1 (en) 2013-09-03 2016-07-13 Moderna Therapeutics, Inc. Chimeric polynucleotides
EP3052106A4 (en) 2013-09-30 2017-07-19 ModernaTX, Inc. Polynucleotides encoding immune modulating polypeptides
KR20160067219A (ko) 2013-10-03 2016-06-13 모더나 세라퓨틱스, 인코포레이티드 저밀도 지단백질 수용체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드
WO2015144732A2 (en) 2014-03-25 2015-10-01 Yale University Uses of parasite macrophage migration inhibitory factors
ES3009962T3 (en) * 2014-04-23 2025-03-31 Modernatx Inc Nucleic acid vaccines
EP2974739A1 (en) 2014-07-15 2016-01-20 Novartis AG RSVF trimerization domains
CN106795096B (zh) 2014-06-25 2020-05-29 爱康泰生治疗公司 用于递送核酸的新型脂质和脂质纳米颗粒制剂
US20170204152A1 (en) 2014-07-16 2017-07-20 Moderna Therapeutics, Inc. Chimeric polynucleotides
US20170210788A1 (en) 2014-07-23 2017-07-27 Modernatx, Inc. Modified polynucleotides for the production of intrabodies
EP3061826A1 (en) 2015-02-27 2016-08-31 Novartis AG Flavivirus replicons
EP3283059B1 (en) 2015-04-13 2024-01-03 CureVac Manufacturing GmbH Method for producing rna compositions
WO2016197133A1 (en) 2015-06-04 2016-12-08 Protiva Biotherapeutics, Inc. Delivering crispr therapeutics with lipid nanoparticles
HRP20240865T1 (hr) 2015-06-29 2024-10-11 Acuitas Therapeutics Inc. Lipidi i formulacije lipidnih nanočestica za isporuku nukleinskih kiselina
MA42502A (fr) 2015-07-21 2018-05-30 Modernatx Inc Vaccins contre une maladie infectieuse
US11364292B2 (en) 2015-07-21 2022-06-21 Modernatx, Inc. CHIKV RNA vaccines
ES2910425T3 (es) 2015-09-17 2022-05-12 Modernatx Inc Compuestos y composiciones para la administración intracelular de agentes terapéuticos
US10849920B2 (en) 2015-10-05 2020-12-01 Modernatx, Inc. Methods for therapeutic administration of messenger ribonucleic acid drugs
CA3002922A1 (en) 2015-10-22 2017-04-27 Modernatx, Inc. Human cytomegalovirus vaccine
PE20181529A1 (es) 2015-10-22 2018-09-26 Modernatx Inc Vacunas de acido nucleico para el virus varicela-zoster (vzv)
WO2017070624A1 (en) 2015-10-22 2017-04-27 Modernatx, Inc. Tropical disease vaccines
MD3718565T2 (ro) 2015-10-22 2022-09-30 Modernatx Inc Vaccinuri împotriva virusului respirator
US20180289792A1 (en) 2015-10-22 2018-10-11 ModernaTX. Inc. Sexually transmitted disease vaccines
AU2016343803B2 (en) 2015-10-28 2021-04-29 Acuitas Therapeutics, Inc. Novel lipids and lipid nanoparticle formulations for delivery of nucleic acids
AU2016366978B2 (en) 2015-12-10 2022-07-28 Modernatx, Inc. Compositions and methods for delivery of therapeutic agents
SMT202200252T1 (it) 2015-12-22 2022-07-21 Modernatx Inc Composti e composizioni per il rilascio intracellulare di agenti
HRP20220525T1 (hr) 2015-12-23 2022-05-27 Modernatx, Inc. Postupci uporabe polinukleotida koji kodiraju ligand ox40
MA43587A (fr) 2016-01-10 2018-11-14 Modernatx Inc Arnm thérapeutiques codant pour des anticorps anti-ctla-4
WO2017162266A1 (en) 2016-03-21 2017-09-28 Biontech Rna Pharmaceuticals Gmbh Rna replicon for versatile and efficient gene expression
WO2017162265A1 (en) 2016-03-21 2017-09-28 Biontech Rna Pharmaceuticals Gmbh Trans-replicating rna
US12128113B2 (en) 2016-05-18 2024-10-29 Modernatx, Inc. Polynucleotides encoding JAGGED1 for the treatment of Alagille syndrome
KR102533456B1 (ko) 2016-05-18 2023-05-17 모더나티엑스, 인크. 릴랙신을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드
WO2017208191A1 (en) 2016-06-02 2017-12-07 Glaxosmithkline Biologicals Sa Zika viral antigen constructs
JP2019528312A (ja) * 2016-08-07 2019-10-10 ノバルティス アーゲー ｍＲＮＡ媒介性の免疫化方法
US20190185859A1 (en) 2016-08-19 2019-06-20 Curevac Ag Rna for cancer therapy
US11466292B2 (en) 2016-09-29 2022-10-11 Glaxosmithkline Biologicals Sa Compositions and methods of treatment
GB201616904D0 (en) 2016-10-05 2016-11-16 Glaxosmithkline Biologicals Sa Vaccine
EP3528821A4 (en) 2016-10-21 2020-07-01 ModernaTX, Inc. HUMAN CYTOMEGALOVIRUS VACCINE
US12491261B2 (en) 2016-10-26 2025-12-09 Acuitas Therapeutics, Inc. Lipid nanoparticle formulations
US11583504B2 (en) 2016-11-08 2023-02-21 Modernatx, Inc. Stabilized formulations of lipid nanoparticles
CN110167587A (zh) 2016-11-11 2019-08-23 摩登纳特斯有限公司 流感疫苗
US11780885B2 (en) 2016-11-17 2023-10-10 Glaxosmithkline Biologicals Sa Zika viral antigen constructs
US11103578B2 (en) 2016-12-08 2021-08-31 Modernatx, Inc. Respiratory virus nucleic acid vaccines
WO2018104540A1 (en) 2016-12-08 2018-06-14 Curevac Ag Rnas for wound healing
EP3551230A1 (en) 2016-12-08 2019-10-16 CureVac AG Rna for treatment or prophylaxis of a liver disease
EP3558354A1 (en) 2016-12-23 2019-10-30 CureVac AG Lassa virus vaccine
WO2018115527A2 (en) 2016-12-23 2018-06-28 Curevac Ag Mers coronavirus vaccine
EP3576780A1 (en) * 2017-02-01 2019-12-11 Modernatx, Inc. Immunomodulatory therapeutic mrna compositions encoding activating oncogene mutation peptides
WO2018151816A1 (en) 2017-02-16 2018-08-23 Modernatx, Inc. High potency immunogenic compositions
US11752206B2 (en) 2017-03-15 2023-09-12 Modernatx, Inc. Herpes simplex virus vaccine
SI3596041T1 (sl) 2017-03-15 2023-02-28 Modernatx, Inc. Spojina in sestavki za intracelično dostavljanje terapevtskih sredstev
CA3056133A1 (en) 2017-03-15 2018-09-20 Modernatx, Inc. Crystal forms of amino lipids
MA47787A (fr) 2017-03-15 2020-01-22 Modernatx Inc Vaccin contre le virus respiratoire syncytial
EP3609534A4 (en) 2017-03-15 2021-01-13 ModernaTX, Inc. WIDE SPECTRUM INFLUENZA VIRUS VACCINE
US11045540B2 (en) 2017-03-15 2021-06-29 Modernatx, Inc. Varicella zoster virus (VZV) vaccine
CA3055653A1 (en) 2017-03-15 2018-09-20 Modernatx, Inc. Lipid nanoparticle formulation
CA3050614A1 (en) 2017-03-17 2018-09-20 Curevac Ag Rna vaccine and immune checkpoint inhibitors for combined anticancer therapy
EP3595676A4 (en) 2017-03-17 2021-05-05 Modernatx, Inc. RNA VACCINES AGAINST ZOONOSES
JP2020513824A (ja) 2017-03-24 2020-05-21 キュアバック アーゲー Ｃｒｉｓｐｒ関連タンパク質をコードする核酸、及びその使用
MA48047A (fr) 2017-04-05 2020-02-12 Modernatx Inc Réduction ou élimination de réponses immunitaires à des protéines thérapeutiques administrées par voie non intraveineuse, par exemple par voie sous-cutanée
JP2018188434A (ja) * 2017-04-28 2018-11-29 味の素株式会社 免疫賦活剤
TW201907937A (zh) 2017-05-08 2019-03-01 美商葛利史東腫瘤科技公司 阿爾法病毒新抗原載體
WO2018213789A1 (en) 2017-05-18 2018-11-22 Modernatx, Inc. Modified messenger rna comprising functional rna elements
EP3625246A1 (en) 2017-05-18 2020-03-25 ModernaTX, Inc. Polynucleotides encoding tethered interleukin-12 (il12) polypeptides and uses thereof
GB2600654B (en) 2017-05-30 2022-11-02 Glaxosmithkline Biologicals Sa Novel devices
EP3630076A1 (en) * 2017-05-30 2020-04-08 GlaxoSmithKline Biologicals SA Methods for manufacturing a liposome encapsulated rna
EP3630985B1 (en) 2017-05-31 2025-08-27 Arcturus Therapeutics, Inc. Synthesis and structure of high potency rna therapeutics
EP3638678B1 (en) 2017-06-14 2025-12-03 ModernaTX, Inc. Compounds and compositions for intracellular delivery of agents
WO2018232006A1 (en) 2017-06-14 2018-12-20 Modernatx, Inc. Polynucleotides encoding coagulation factor viii
EP3638215A4 (en) 2017-06-15 2021-03-24 Modernatx, Inc. RNA FORMULATIONS
EP4494652A3 (en) 2017-07-04 2025-05-14 CureVac SE Cancer rna-vaccine
WO2019036008A1 (en) 2017-08-16 2019-02-21 Acuitas Therapeutics, Inc. LIPIDS FOR USE IN LIPID NANOPARTICULAR FORMULATIONS
WO2019046809A1 (en) 2017-08-31 2019-03-07 Modernatx, Inc. METHODS OF MANUFACTURING LIPID NANOPARTICLES
CN111094549B (zh) 2017-09-13 2024-11-01 生物技术公司 用于将体细胞重编程的rna复制子
US20200283497A1 (en) 2017-09-13 2020-09-10 Biontech Cell & Gene Therapies Gmbh Rna replicon for expressing at cell receptor or an artificial t cell receptor
US10653767B2 (en) 2017-09-14 2020-05-19 Modernatx, Inc. Zika virus MRNA vaccines
EP3461497A1 (en) 2017-09-27 2019-04-03 GlaxoSmithKline Biologicals S.A. Viral antigens
RU2020115287A (ru) 2017-10-19 2021-11-19 Куревак Аг Новые молекулы искусственных нуклеиновых кислот
US20210236644A1 (en) 2017-11-10 2021-08-05 Cocoon Biotech Inc. Ocular applications of silk-based products
CA3079428A1 (en) 2017-11-22 2019-05-31 Modernatx, Inc. Polynucleotides encoding ornithine transcarbamylase for the treatment of urea cycle disorders
US20220265856A1 (en) 2017-11-22 2022-08-25 Modernatx, Inc. Polynucleotides encoding propionyl-coa carboxylase alpha and beta subunits for the treatment of propionic acidemia
MA50801A (fr) 2017-11-22 2020-09-30 Modernatx Inc Polynucléotides codant pour la phénylalanine hydroxylase pour le traitement de la phénylcétonurie
AU2019205330B2 (en) 2018-01-04 2025-09-11 Iconic Therapeutics Llc Anti-tissue factor antibodies, antibody-drug conjugates, and related methods
MA51523A (fr) 2018-01-05 2020-11-11 Modernatx Inc Polynucléotides codant pour des anticorps anti-virus du chikungunya
CN111971066B (zh) * 2018-01-18 2025-03-11 伊泽阿恩埃免疫疗法股份有限公司 脂质纳米颗粒
WO2019143969A1 (en) * 2018-01-18 2019-07-25 Claudio Maldonado Treating microvascular dysfunction
WO2019148101A1 (en) 2018-01-29 2019-08-01 Modernatx, Inc. Rsv rna vaccines
EP3773745A1 (en) 2018-04-11 2021-02-17 ModernaTX, Inc. Messenger rna comprising functional rna elements
MA52709A (fr) 2018-05-23 2021-03-31 Modernatx Inc Administration d'adn
US20220184185A1 (en) 2018-07-25 2022-06-16 Modernatx, Inc. Mrna based enzyme replacement therapy combined with a pharmacological chaperone for the treatment of lysosomal storage disorders
WO2020035609A2 (en) 2018-08-17 2020-02-20 Glaxosmithkline Biologicals Sa Immunogenic compositions and uses thereof
WO2020047201A1 (en) 2018-09-02 2020-03-05 Modernatx, Inc. Polynucleotides encoding very long-chain acyl-coa dehydrogenase for the treatment of very long-chain acyl-coa dehydrogenase deficiency
MA53608A (fr) 2018-09-13 2021-07-21 Modernatx Inc Polynucléotides codant pour les sous-unités e1-alpha, e1-beta et e2 du complexe alpha-cétoacide déshydrogénase à chaîne ramifiée pour le traitement de la leucinose
WO2020056147A2 (en) 2018-09-13 2020-03-19 Modernatx, Inc. Polynucleotides encoding glucose-6-phosphatase for the treatment of glycogen storage disease
EP3850102A1 (en) 2018-09-14 2021-07-21 ModernaTX, Inc. Polynucleotides encoding uridine diphosphate glycosyltransferase 1 family, polypeptide a1 for the treatment of crigler-najjar syndrome
MA53650A (fr) 2018-09-19 2021-07-28 Modernatx Inc Lipides peg et leurs utilisations
AU2019345067A1 (en) 2018-09-19 2021-04-08 Modernatx, Inc. High-purity peg lipids and uses thereof
US12263248B2 (en) 2018-09-19 2025-04-01 Modernatx, Inc. Compounds and compositions for intracellular delivery of therapeutic agents
WO2020061457A1 (en) 2018-09-20 2020-03-26 Modernatx, Inc. Preparation of lipid nanoparticles and methods of administration thereof
IL322436A (en) 2018-09-21 2025-09-01 Acuitas Therapeutics Inc Systems and methods for producing lipid nanoparticles and liposomes
WO2020069169A1 (en) 2018-09-27 2020-04-02 Modernatx, Inc. Polynucleotides encoding arginase 1 for the treatment of arginase deficiency
EP4379053A3 (en) 2018-10-09 2024-09-18 The University of British Columbia Compositions and systems comprising transfection-competent vesicles free of organic-solvents and detergents and methods related thereto
WO2020097409A2 (en) 2018-11-08 2020-05-14 Modernatx, Inc. Use of mrna encoding ox40l to treat cancer in human patients
WO2020109365A1 (en) * 2018-11-29 2020-06-04 Glaxosmithkline Biologicals Sa Methods for manufacturing an adjuvant
TWI852977B (zh) 2019-01-10 2024-08-21 美商健生生物科技公司 前列腺新抗原及其用途
WO2020144295A1 (en) 2019-01-10 2020-07-16 Biontech Rna Pharmaceuticals Gmbh Localized administration of rna molecules for therapy
US11453639B2 (en) 2019-01-11 2022-09-27 Acuitas Therapeutics, Inc. Lipids for lipid nanoparticle delivery of active agents
US11351242B1 (en) 2019-02-12 2022-06-07 Modernatx, Inc. HMPV/hPIV3 mRNA vaccine composition
EP3938379A4 (en) 2019-03-15 2023-02-22 ModernaTX, Inc. Hiv rna vaccines
WO2020227642A1 (en) 2019-05-08 2020-11-12 Modernatx, Inc. Compositions for skin and wounds and methods of use thereof
IL288283B2 (en) 2019-05-30 2025-05-01 Gritstone Bio Inc Modified adenovirus
MA56539A (fr) 2019-06-24 2022-04-27 Modernatx Inc Arn messager résistant à l'endonucléase et utilisations correspondantes
WO2020263985A1 (en) 2019-06-24 2020-12-30 Modernatx, Inc. Messenger rna comprising functional rna elements and uses thereof
CN112237628A (zh) * 2019-07-17 2021-01-19 四川大学华西医院 靶向EBV的LMP2-mRNA纳米疫苗
ES2982157T3 (es) 2019-07-18 2024-10-14 Institut Nat De La Sante Et De Larecherche Medicale Inserm Mutante de RAC2 para su uso en la ablación de la hematopoyesis y en el tratamiento de neoplasias malignas hematopoyéticas
CA3146900A1 (en) 2019-07-21 2021-01-28 Glaxosmithkline Biologicals Sa Therapeutic viral vaccine
WO2021038508A1 (en) * 2019-08-30 2021-03-04 Glaxosmithkline Biologicals Sa Jet mixing lipid nanoparticle manufacturing process
CN120423969A (zh) 2019-09-19 2025-08-05 摩登纳特斯有限公司 用于治疗剂的细胞内递送的支链尾端脂质化合物和组合物
AU2020355000A1 (en) 2019-09-23 2022-03-17 Omega Therapeutics, Inc. Compositions and methods for modulating apolipoprotein B (APOB) gene expression
JP2022548399A (ja) 2019-09-23 2022-11-18 オメガ セラピューティクス， インコーポレイテッド 肝細胞核因子４－アルファ（ＨＮＦ４α）遺伝子発現をモジュレートするための組成物および方法
EP3819377A1 (en) 2019-11-08 2021-05-12 Justus-Liebig-Universität Gießen Circular rna and uses thereof for inhibiting rna-binding proteins
MX2022005980A (es) 2019-11-18 2022-09-07 Janssen Biotech Inc Vacunas basadas en calr y jak2 mutantes y sus usos.
US12194089B2 (en) 2020-02-04 2025-01-14 CureVac SE Coronavirus vaccine
EP4117725A4 (en) 2020-03-09 2024-05-29 Arcturus Therapeutics, Inc. CORONAVIRUS VACCINE COMPOSITIONS AND METHODS
JP2023517326A (ja) 2020-03-11 2023-04-25 オメガ セラピューティクス， インコーポレイテッド フォークヘッドボックスｐ３（ｆｏｘｐ３）遺伝子発現をモジュレートするための組成物および方法
EP4135761A1 (en) 2020-04-16 2023-02-22 GlaxoSmithKline Biologicals S.A. Sars cov-2 spike protein construct
WO2021213924A1 (en) * 2020-04-22 2021-10-28 BioNTech SE Coronavirus vaccine
IL298363A (en) * 2020-05-20 2023-01-01 Flagship Pioneering Innovations Vi Llc Immunogenic compositions and uses thereof
JP2023527875A (ja) 2020-06-01 2023-06-30 モダーナティエックス・インコーポレイテッド フェニルアラニンヒドロキシラーゼバリアント及びその使用
US20230265454A1 (en) 2020-06-04 2023-08-24 BioNTech SE RNA Replicon for Versatile and Efficient Gene Expression
EP4161570A1 (en) 2020-06-05 2023-04-12 GlaxoSmithKline Biologicals S.A. Modified betacoronavirus spike proteins
US20230256090A1 (en) 2020-06-29 2023-08-17 Glaxosmithkline Biologicals Sa Adjuvants
US12295997B2 (en) 2020-07-06 2025-05-13 Janssen Biotech, Inc. Prostate neoantigens and their uses
FI4182297T3 (fi) 2020-07-16 2025-12-05 Acuitas Therapeutics Inc Kationisia lipidejä käytettäväksi lipidinanohiukkasissa
IL300026A (en) 2020-08-06 2023-03-01 Gritstone Bio Inc Multiepitope vaccine cassettes
IL300519A (en) 2020-08-14 2023-04-01 Arcturus Therapeutics Inc Method for lyophilization of lipid nanoparticles
US11406703B2 (en) 2020-08-25 2022-08-09 Modernatx, Inc. Human cytomegalovirus vaccine
CA3199784A1 (en) 2020-11-13 2022-05-19 Modernatx, Inc. Polynucleotides encoding cystic fibrosis transmembrane conductance regulator for the treatment of cystic fibrosis
EP4008785A1 (en) 2020-12-03 2022-06-08 Justus-Liebig-Universität Gießen Circular nucleic acids and uses thereof for interfering with genome expression and proliferation of coronaviruses
CA3205569A1 (en) 2020-12-22 2022-06-30 CureVac SE Rna vaccine against sars-cov-2 variants
US12263217B2 (en) 2020-12-23 2025-04-01 Daykin Molecular Systems, LLC Nucleic acid stabilizing solution for vaccines, therapy, diagnostics, storage, and transport
EP4267593A2 (en) 2020-12-23 2023-11-01 GlaxoSmithKline Biologicals SA Self-amplifying messenger rna
CA3208643A1 (en) 2021-01-18 2022-07-21 Conserv Bioscience Limited Coronavirus immunogenic compositions, methods and uses thereof
EP4032546A1 (en) 2021-01-20 2022-07-27 GlaxoSmithKline Biologicals S.A. Therapeutic viral vaccine
US11524023B2 (en) 2021-02-19 2022-12-13 Modernatx, Inc. Lipid nanoparticle compositions and methods of formulating the same
WO2022204390A1 (en) 2021-03-24 2022-09-29 Modernatx, Inc. Lipid nanoparticles containing polynucleotides encoding phenylalanine hydroxylase and uses thereof
US20240216288A1 (en) 2021-03-24 2024-07-04 Modernatx, Inc. Lipid nanoparticles containing polynucleotides encoding propionyl-coa carboxylase alpha and beta subunits and uses thereof
US20240189449A1 (en) 2021-03-24 2024-06-13 Modernatx, Inc. Lipid nanoparticles and polynucleotides encoding ornithine transcarbamylase for the treatment of ornithine transcarbamylase deficiency
WO2022204369A1 (en) 2021-03-24 2022-09-29 Modernatx, Inc. Polynucleotides encoding methylmalonyl-coa mutase for the treatment of methylmalonic acidemia
US20240207374A1 (en) 2021-03-24 2024-06-27 Modernatx, Inc. Lipid nanoparticles containing polynucleotides encoding glucose-6-phosphatase and uses thereof
JP2024511206A (ja) 2021-03-26 2024-03-12 グラクソスミスクライン バイオロジカルズ ソシエテ アノニム 免疫原性組成物
CN113230394B (zh) * 2021-04-30 2024-04-30 广州源博医药科技有限公司 一种用于牛病毒性腹泻的rna疫苗及其构建方法
US20240285755A1 (en) 2021-05-24 2024-08-29 Glaxosmithkline Biologicals Sa Adjuvants
US20240272143A1 (en) 2021-06-09 2024-08-15 Glaxosmithkline Biologicals Sa Release assay for determining potency of self-amplifying rna drug product and methods for using
EP4355882A2 (en) 2021-06-15 2024-04-24 Modernatx, Inc. Engineered polynucleotides for cell-type or microenvironment-specific expression
US20240376445A1 (en) 2021-06-22 2024-11-14 Modernatx, Inc. Polynucleotides encoding uridine diphosphate glycosyltransferase 1 family, polypeptide a1 for the treatment of crigler-najjar syndrome
EP4367242A2 (en) 2021-07-07 2024-05-15 Omega Therapeutics, Inc. Compositions and methods for modulating secreted frizzled receptor protein 1 (sfrp1) gene expression
US20240342206A1 (en) 2021-07-30 2024-10-17 CureVac SE mRNAS FOR TREATMENT OR PROPHYLAXIS OF LIVER DISEASES
WO2023020994A1 (en) 2021-08-16 2023-02-23 Glaxosmithkline Biologicals Sa Novel methods
US20250134824A1 (en) 2021-08-16 2025-05-01 Glaxosmithkline Biologicals Sa Low-dose lyophilized rna vaccines and methods for preparing and using the same
WO2023020992A1 (en) 2021-08-16 2023-02-23 Glaxosmithkline Biologicals Sa Novel methods
EP4387597A1 (en) 2021-08-16 2024-06-26 GlaxoSmithKline Biologicals SA Freeze-drying of lipid nanoparticles (lnps) encapsulating rna and formulations thereof
WO2023020993A1 (en) 2021-08-16 2023-02-23 Glaxosmithkline Biologicals Sa Novel methods
CA3229889A1 (en) 2021-09-03 2023-03-09 Glaxosmithkline Biologicals Sa Substitution of nucleotide bases in self-amplifying messenger ribonucleic acids
WO2023056044A1 (en) 2021-10-01 2023-04-06 Modernatx, Inc. Polynucleotides encoding relaxin for the treatment of fibrosis and/or cardiovascular disease
AU2022369342A1 (en) 2021-10-18 2024-03-14 BioNTech SE Modified replicable rna and related compositions and their use
CN118451194A (zh) 2021-10-18 2024-08-06 生物技术公司 用于确定用于提高经修饰可复制rna功能的突变的方法以及相关组合物及其用途
US12129223B2 (en) 2021-12-16 2024-10-29 Acuitas Therapeutics, Inc. Lipids for use in lipid nanoparticle formulations
JP2025502257A (ja) 2022-01-17 2025-01-24 アンスティチュ ナショナル ドゥ ラ サンテ エ ドゥ ラ ルシェルシュ メディカル 固形腫瘍細胞の集団の細胞死を誘導する方法
WO2023144193A1 (en) 2022-01-25 2023-08-03 CureVac SE Mrnas for treatment of hereditary tyrosinemia type i
CN116554125B (zh) * 2022-01-27 2024-04-05 广州立得生物医药科技有限公司 一种阳离子脂质类似物、其组合物及应用
WO2023152365A1 (en) 2022-02-14 2023-08-17 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Use of the 15-lipoxygenase for the treatment of lymphedema
US20250327041A1 (en) 2022-02-24 2025-10-23 Io Biotech Aps Nucleotide delivery of cancer therapy
EP4499153A2 (en) 2022-03-25 2025-02-05 ModernaTX, Inc. Polynucleotides encoding fanconi anemia, complementation group proteins for the treatment of fanconi anemia
WO2023213378A1 (en) 2022-05-02 2023-11-09 BioNTech SE Replicon compositions and methods of using same for the treatment of diseases
EP4539876A2 (en) 2022-06-18 2025-04-23 GlaxoSmithKline Biologicals S.A. Recombinant rna molecules comprising untranslated regions or segments encoding spike protein from the omicron strain of severe acute respiratory coronavirus-2
WO2024017479A1 (en) 2022-07-21 2024-01-25 BioNTech SE Multifunctional cells transiently expressing an immune receptor and one or more cytokines, their use and methods for their production
WO2024023034A1 (en) 2022-07-25 2024-02-01 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Use of apelin for the treatment of lymphedema
EP4562163A1 (en) 2022-07-26 2025-06-04 ModernaTX, Inc. Engineered polynucleotides for temporal control of expression
WO2024044147A1 (en) 2022-08-23 2024-02-29 Modernatx, Inc. Methods for purification of ionizable lipids
WO2024047247A1 (en) 2022-09-02 2024-03-07 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Base editing approaches for the treatment of amyotrophic lateral sclerosis
EP4587579A1 (en) 2022-09-15 2025-07-23 BioNTech SE Systems and compositions comprising trans-amplifying rna vectors with mirna
AU2023353931A1 (en) 2022-09-26 2025-03-20 Glaxosmithkline Biologicals Sa Influenza virus vaccines
US12186389B2 (en) 2022-10-28 2025-01-07 Glaxosmithkline Biologicals Sa Nucleic acid base vaccine against emerging SARS-CoV-2 variants
WO2024102954A1 (en) 2022-11-10 2024-05-16 Massachusetts Institute Of Technology Activation induced clipping system (aics)
EP4630033A1 (en) 2022-12-09 2025-10-15 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Novel human antiviral genes related to the eleos and lamassu prokaryotic systems
EP4637812A1 (en) 2022-12-19 2025-10-29 GlaxoSmithKline Biologicals S.A. Hepatitis b compositions
EP4648789A1 (en) 2023-01-09 2025-11-19 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Use of the recombinant fibrinogen-like domain of angiopoietin-like 4 for treating adverse post-ischemic cardiac remodeling in a patient who experienced a myocardial infarction
WO2024153636A1 (en) 2023-01-17 2024-07-25 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Vasorin as a biomarker and biotarget in nephrology
EP4654984A1 (en) 2023-01-27 2025-12-03 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Use of amphiregulin (areg) in methods of treating vascular hyperpermeability
EP4658239A1 (en) 2023-02-03 2025-12-10 GlaxoSmithKline Biologicals S.A. Rna formulation
GB202302092D0 (en) 2023-02-14 2023-03-29 Glaxosmithkline Biologicals Sa Analytical method
WO2024197033A1 (en) 2023-03-21 2024-09-26 Modernatx, Inc. Polynucleotides encoding relaxin for the treatment of heart failure
WO2024194484A1 (en) 2023-03-23 2024-09-26 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Modulating the expression and/or activity of gas7 for modulating viral replication
WO2024223728A1 (en) 2023-04-27 2024-10-31 Glaxosmithkline Biologicals Sa Influenza virus vaccines
WO2024223724A1 (en) 2023-04-27 2024-10-31 Glaxosmithkline Biologicals Sa Influenza virus vaccines
WO2024229321A1 (en) 2023-05-03 2024-11-07 Modernatx, Inc. Polynucleotides encoding cystic fibrosis transmembrane conductance regulator for the treatment of cystic fibrosis
WO2024243438A2 (en) 2023-05-23 2024-11-28 Omega Therapeutics, Inc. Compositions and methods for reducing cxcl9, cxcl10, and cxcl11 gene expression
WO2025011529A2 (en) 2023-07-07 2025-01-16 Shanghai Circode Biomed Co., Ltd. Circular rna vaccines for seasonal flu and methods of uses
WO2025040709A1 (en) 2023-08-24 2025-02-27 BioNTech SE Systems and compositions comprising highly active trans-amplifying replicases
WO2025045142A1 (en) 2023-08-29 2025-03-06 Shanghai Circode Biomed Co., Ltd. Circular rna encoding vegf polypeptides, formulations, and methods of uses
EP4520345A1 (en) 2023-09-06 2025-03-12 Myneo Nv Product
WO2025051381A1 (en) 2023-09-08 2025-03-13 BioNTech SE Methods and compositions for localized expression of administered rna
WO2025072482A1 (en) 2023-09-27 2025-04-03 Modernatx, Inc. Immunoglobulin a protease polypeptides, polynucleotides, and uses thereof
WO2025083211A1 (en) 2023-10-20 2025-04-24 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Use of factor h for the treatment of dementia
WO2025132839A1 (en) 2023-12-21 2025-06-26 Glaxosmithkline Biologicals Sa Influenza virus vaccines
GB202404607D0 (en) 2024-03-29 2024-05-15 Glaxosmithkline Biologicals Sa RNA formulation
WO2025215072A1 (en) 2024-04-10 2025-10-16 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Class i lanthipeptides with anti-viral function
WO2025229572A1 (en) 2024-05-01 2025-11-06 Glaxosmithkline Biologicals Sa Epstein-barr virus antigen-encoding messenger ribonucleic acid and antigen protein vaccines
WO2025235862A1 (en) 2024-05-10 2025-11-13 Inndura Therapeutics Inc. A modified immune cell receptor comprising a target-binding domain and the extracellular domain of cd16a
WO2025248096A1 (en) 2024-05-31 2025-12-04 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Antimicrobial peptides having liquid-liquid phase separation activities
WO2025255199A1 (en) 2024-06-05 2025-12-11 Modernatx, Inc. Argininosuccinate synthase 1 and argininosuccinate lyase polypeptides and polynucleotides and uses thereof

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20060083780A1 (en) * 2004-06-07 2006-04-20 Protiva Biotherapeutics, Inc. Cationic lipids and methods of use
RU2294192C2 (ru) * 2001-05-30 2007-02-27 Дзе Скриппс Рисерч Инститьют Система доставки нуклеиновых кислот

Family Cites Families (66)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2200016T3 (es) 1989-03-21 2004-03-01 Vical Incorporated Expresion de secuencias polinucleotidicas exogenas en un vertebrado.
US6867195B1 (en) 1989-03-21 2005-03-15 Vical Incorporated Lipid-mediated polynucleotide administration to reduce likelihood of subject's becoming infected
US5013556A (en) 1989-10-20 1991-05-07 Liposome Technology, Inc. Liposomes with enhanced circulation time
US5279833A (en) 1990-04-04 1994-01-18 Yale University Liposomal transfection of nucleic acids into animal cells
US5750390A (en) 1992-08-26 1998-05-12 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. Method and reagent for treatment of diseases caused by expression of the bcl-2 gene
US5693535A (en) * 1992-05-14 1997-12-02 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. HIV targeted ribozymes
JPH07509133A (ja) * 1992-07-17 1995-10-12 リボザイム・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド 動物疾患の処置のための方法および剤
EP1624068A1 (en) 1993-06-01 2006-02-08 Life Technologies Inc. Genetic immunization with cationic lipids
AU727923B2 (en) * 1995-09-27 2001-01-04 Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services, The Production of infectious respiratory syncytial virus from cloned nucleotide sequences
US7384923B2 (en) 1999-05-14 2008-06-10 Lipoxen Technologies Limited Liposomes
DE69841002D1 (de) 1997-05-14 2009-09-03 Univ British Columbia Hochwirksame verkapselung von nukleinsäuren in lipidvesikeln
US6432925B1 (en) * 1998-04-16 2002-08-13 John Wayne Cancer Institute RNA cancer vaccine and methods for its use
EP1222289B1 (en) * 1999-10-20 2008-04-16 The Johns Hopkins University School Of Medicine Chimeric immunogenic compositions and nucleic acids encoding them
US8541008B2 (en) * 1999-11-19 2013-09-24 Los Angeles Biomedical Research Institute At Harbor-Ucla Medical Center Pharmaceutical compositions and methods to vaccinate against candidiasis
US20030212022A1 (en) 2001-03-23 2003-11-13 Jean-Marie Vogel Compositions and methods for gene therapy
WO2002061113A2 (en) 2001-02-01 2002-08-08 The Johns Hopkins University Nucleic acid derived vaccine that encodes an antigen linked to a polypeptide that promotes antigen presentation
US20030077251A1 (en) * 2001-05-23 2003-04-24 Nicolas Escriou Replicons derived from positive strand RNA virus genomes useful for the production of heterologous proteins
JP4790984B2 (ja) * 2001-09-06 2011-10-12 アルファヴァックス，インコーポレイテッド アルファウイルスレプリコンベクター系
US20050163832A1 (en) 2002-02-13 2005-07-28 Vladimir Torchilin Intracellular delivery of therapeutic agents
AU2003225479A1 (en) * 2002-04-26 2003-11-10 Pfizer Inc. Reporter-selectable hepatitis c virus replicon
BR0314236A (pt) 2002-09-13 2005-08-09 Replicor Inc Formulação de oligonucleotìdeo, composição farmacêutica, kit, composto antiviral, preparação de oligonucleotìdeo e métodos para seleção de um oligonucleotìdeo antiviral para uso como um agente antiviral, para profilaxia ou tratamento de uma infecção viral em um paciente, para tratamento profilático de câncer causado por oncovìrus, para identificação de um composto que altera a ligação de um oligonucleotìdeo a pelo menos um componente viral, para purificação da ligação de oligonucleotìdeos a pelo menos um componente viral e para enriquecimento de oligonucleotìdeos a partir de um agrupamento de oligonucleotìdeos
JP4623426B2 (ja) * 2003-05-30 2011-02-02 日本新薬株式会社 オリゴ核酸担持複合体、当該複合体を含有する医薬組成物
ES2327643T3 (es) 2003-07-11 2009-11-02 Alphavax, Inc. Vacunas contra citomegalovirus basadas en alfavirus.
US7368537B2 (en) * 2003-07-15 2008-05-06 Id Biomedical Corporation Of Quebec Subunit vaccine against respiratory syncytial virus infection
US7303881B2 (en) 2004-04-30 2007-12-04 Pds Biotechnology Corporation Antigen delivery compositions and methods of use
US20050266550A1 (en) * 2004-05-18 2005-12-01 Alphavax, Inc. TC-83-derived alphavirus vectors, particles and methods
EP1766034B1 (en) 2004-05-21 2014-03-19 Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. Alphavirus vectors for influenza virus vaccines
AU2005252273B2 (en) 2004-06-07 2011-04-28 Arbutus Biopharma Corporation Lipid encapsulated interfering RNA
CA2572439A1 (en) * 2004-07-02 2006-01-12 Protiva Biotherapeutics, Inc. Immunostimulatory sirna molecules and uses therefor
WO2006007712A1 (en) * 2004-07-19 2006-01-26 Protiva Biotherapeutics, Inc. Methods comprising polyethylene glycol-lipid conjugates for delivery of therapeutic agents
JP2009511636A (ja) 2005-10-18 2009-03-19 ノバルティス ヴァクシンズ アンド ダイアグノスティクス， インコーポレイテッド アルファウイルスレプリコン粒子による粘膜免疫および全身免疫
JP2007112768A (ja) 2005-10-24 2007-05-10 Kyoto Univ 肝指向性リポソーム組成物
EP2521786B1 (en) * 2006-07-20 2015-06-24 Vical Incorporated Compositions for vaccinating against hsv-2
AU2008219165A1 (en) 2007-02-16 2008-08-28 Merck Sharp & Dohme Corp. Compositions and methods for potentiated activity of biologicaly active molecules
US8877206B2 (en) 2007-03-22 2014-11-04 Pds Biotechnology Corporation Stimulation of an immune response by cationic lipids
AU2008247488B2 (en) 2007-05-04 2014-02-27 Marina Biotech, Inc. Amino acid lipids and uses thereof
WO2009009054A1 (en) * 2007-07-09 2009-01-15 Georgetown University Methods for generating immune response using cationic-liposome-mediated nucleic acid delivery
US20110165223A1 (en) 2008-01-02 2011-07-07 The Johns Hopkins University Antitumor Immunization by Liposomal Delivery of Vaccine to the Spleen
EP3100718B1 (en) 2008-01-02 2019-11-27 Arbutus Biopharma Corporation Improved compositions and methods for the delivery of nucleic acids
JP5475753B2 (ja) 2008-04-15 2014-04-16 プロチバ バイオセラピューティクス インコーポレイティッド 核酸送達用の脂質製剤
US8827316B2 (en) 2008-04-24 2014-09-09 National Oilwell Varco, L.P. Torque member for threaded connections
US20100040650A1 (en) * 2008-05-30 2010-02-18 Crowe Jr James E Virus-Like paramyxovirus particles and vaccines
CL2008002322A1 (es) 2008-08-07 2009-06-05 Univ Concepcion Formulacion farmaceutica veterinaria que comprende un sistema vectorial viral constituido por una particula recombinante de arn que codifica una cu/zn superoxido dismutasa de la bacteria patogena de bovinos brucella abortus, y al menos un alfavirus arn perteneciente a la familia del virus semliki forest (sfv), util como vacuna.
WO2010037408A1 (en) 2008-09-30 2010-04-08 Curevac Gmbh Composition comprising a complexed (m)rna and a naked mrna for providing or enhancing an immunostimulatory response in a mammal and uses thereof
JP4900536B2 (ja) * 2009-07-02 2012-03-21 コニカミノルタホールディングス株式会社 特定の分散剤を含有する外水相を利用する二段階乳化法による単胞リポソームの製造方法、ならびに当該単胞リポソームの製造方法を用いる単胞リポソーム分散液またはその乾燥粉末の製造方法
WO2011005799A2 (en) 2009-07-06 2011-01-13 Novartis Ag Self replicating rna molecules and uses thereof
CN102639147B (zh) 2009-07-15 2015-11-25 诺华股份有限公司 Rsv f 蛋白组合物和其制作方法
KR20120128598A (ko) 2009-11-04 2012-11-27 마리나 바이오테크, 인크. 활성 생성 전달 분자들
EP3318248B1 (en) 2009-12-01 2019-04-10 Translate Bio, Inc. Delivery of mrna for the augmentation of proteins and enzymes in human genetic diseases
WO2011076807A2 (en) 2009-12-23 2011-06-30 Novartis Ag Lipids, lipid compositions, and methods of using them
HRP20160805T1 (hr) 2010-07-06 2016-08-12 Glaxosmithkline Biologicals Sa Imuniziranje velikih sisavaca malim dozama rna
US11291635B2 (en) * 2010-07-06 2022-04-05 Glaxosmithkline Biological Sa Virion-like delivery particles for self-replicating RNA molecules
CA2804396C (en) 2010-07-06 2021-06-29 Novartis Ag Liposomes with lipids having an advantageous pka-value for rna delivery
US9770463B2 (en) 2010-07-06 2017-09-26 Glaxosmithkline Biologicals Sa Delivery of RNA to different cell types
LT3243526T (lt) 2010-07-06 2020-02-10 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Rnr pristatymas, skirtas keleto imuninio atsako paleidimui
SI3981427T1 (sl) 2010-08-31 2022-08-31 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Pegilirani liposomi za dostavo imunogen-kodirajoče RNA
RS63890B1 (sr) 2010-08-31 2023-02-28 Glaxosmithkline Biologicals Sa Mali lipozomi za isporuku rnk koja kodira imunogen
US20130189351A1 (en) * 2010-08-31 2013-07-25 Novartis Ag Lipids suitable for liposomal delivery of protein coding rna
BR112014000236A2 (pt) * 2011-07-06 2017-02-14 Novartis Ag lipossomas com razão n:p útil para a liberação de moléculas de rna, composição e uso de ditos lipossomas
HUE041800T2 (hu) 2011-08-31 2019-05-28 Glaxosmithkline Biologicals Sa Pegilált liposzómák immunogént kódoló RNS bejuttatására
WO2014160243A1 (en) 2013-03-14 2014-10-02 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Purification and purity assessment of rna molecules synthesized with modified nucleosides
HRP20240865T1 (hr) 2015-06-29 2024-10-11 Acuitas Therapeutics Inc. Lipidi i formulacije lipidnih nanočestica za isporuku nukleinskih kiselina
AU2016343803B2 (en) 2015-10-28 2021-04-29 Acuitas Therapeutics, Inc. Novel lipids and lipid nanoparticle formulations for delivery of nucleic acids
EP3528821A4 (en) 2016-10-21 2020-07-01 ModernaTX, Inc. HUMAN CYTOMEGALOVIRUS VACCINE
WO2022137133A1 (en) 2020-12-22 2022-06-30 Curevac Ag Rna vaccine against sars-cov-2 variants
WO2022150717A1 (en) 2021-01-11 2022-07-14 Modernatx, Inc. Seasonal rna influenza virus vaccines

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2294192C2 (ru) * 2001-05-30 2007-02-27 Дзе Скриппс Рисерч Инститьют Система доставки нуклеиновых кислот
US20060083780A1 (en) * 2004-06-07 2006-04-20 Protiva Biotherapeutics, Inc. Cationic lipids and methods of use

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
F. MARTINON, S. KRISHNAN et al., Induction of virus-specific cytotoxic T lymphocytes in vivo by liposome-entrapped mRNA, Eur. J. Immunol., 1993, vol.23, pp.1719-1722. *
F. MARTINON, S. KRISHNAN et al., Induction of virus-specific cytotoxic T lymphocytes in vivo by liposome-entrapped mRNA, Eur. J. Immunol., 1993, vol.23, pp.1719-1722. S. SAXENA et al., Induction of immune responses and protection in mice against rabies using a self-replicating RNA vaccine encoding rabies virus glycoprotein, Veterinary Microbiology, 2009, vol.136, pp.36-44. *
S. SAXENA et al., Induction of immune responses and protection in mice against rabies using a self-replicating RNA vaccine encoding rabies virus glycoprotein, Veterinary Microbiology, 2009, vol.136, pp.36-44. *

Also Published As

Publication number Publication date
MX341989B (es) 2016-09-09
RS63890B1 (sr) 2023-02-28
LT4043040T (lt) 2023-03-27
EP4043040A8 (en) 2022-09-28
SI2611467T1 (sl) 2022-10-28
RS64084B1 (sr) 2023-04-28
EP4066819B1 (en) 2023-03-01
HRP20230017T1 (hr) 2023-02-17
PT4043040T (pt) 2023-03-24
AU2011296062A1 (en) 2013-04-04
DK4043040T3 (da) 2023-03-20
EP4008357A1 (en) 2022-06-08
JP2016169230A (ja) 2016-09-23
EP2611467B1 (en) 2022-07-20
SI4008357T1 (sl) 2023-04-28
ES2935542T3 (es) 2023-03-07
DK2611467T3 (da) 2022-08-01
EP4008357B1 (en) 2022-12-28
RU2013114392A (ru) 2014-10-10
EP4043040A1 (en) 2022-08-17
DK4066819T3 (da) 2023-04-24
EP4122451A8 (en) 2023-08-30
SMT202200312T1 (it) 2022-09-14
PL4008357T3 (pl) 2023-03-06
FI4008357T3 (fi) 2023-01-13
HUE061275T2 (hu) 2023-06-28
AU2022204491B2 (en) 2022-12-15
HRP20230501T1 (hr) 2023-08-04
HRP20221048T1 (hr) 2022-11-11
SMT202200504T1 (it) 2023-01-13
CA2809678A1 (en) 2012-03-08
AU2018204178A1 (en) 2018-07-05
AU2022271508A1 (en) 2022-12-22
MX2013002337A (es) 2013-03-18
LT2611467T (lt) 2022-08-10
EP4066819A1 (en) 2022-10-05
PL4043040T3 (pl) 2023-04-17
FI4043040T3 (fi) 2023-04-04
PL2611467T3 (pl) 2022-08-16
DK4008357T3 (da) 2023-02-20
AU2020205236B2 (en) 2022-11-17
PT4008357T (pt) 2023-01-11
RS63984B1 (sr) 2023-03-31
US9254265B2 (en) 2016-02-09
AU2022205179A1 (en) 2022-07-28
HUE060958T2 (hu) 2023-04-28
SI4066819T1 (sl) 2023-07-31
BR112013004879A2 (pt) 2018-04-24
JP2013538569A (ja) 2013-10-17
AU2022204487A1 (en) 2022-07-14
PL4066819T3 (pl) 2023-06-05
AU2022204487B2 (en) 2022-12-15
LT4066819T (lt) 2023-04-11
AU2022205179B2 (en) 2022-12-15
PT4066819T (pt) 2023-03-30
HUE059214T2 (hu) 2022-10-28
LT4008357T (lt) 2023-01-25
AU2018204178B2 (en) 2020-04-16
HUE061463T2 (hu) 2023-06-28
WO2012030901A1 (en) 2012-03-08
SMT202300096T1 (it) 2023-05-12
ES2941244T3 (es) 2023-05-19
ES2939732T3 (es) 2023-04-26
EP2611467A1 (en) 2013-07-10
CN103179989A (zh) 2013-06-26
AU2022204491A1 (en) 2022-07-14
EP4233841A2 (en) 2023-08-30
RS63404B1 (sr) 2022-08-31
FI4066819T3 (fi) 2023-05-19
SI4043040T1 (sl) 2023-04-28
EP4122451A1 (en) 2023-01-25
PT2611467T (pt) 2022-08-01
US20130195969A1 (en) 2013-08-01
HRP20230326T1 (hr) 2023-06-09
EP4043040B1 (en) 2023-01-11
SMT202300144T1 (it) 2023-07-20
AU2016213772A1 (en) 2016-09-01
ES2923634T3 (es) 2022-09-29
AU2020205236A1 (en) 2020-07-30
EP4233841A3 (en) 2023-11-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11850305B2 (en) Method of making lipid formulations with RNA encoding immunogens
AU2022204491B2 (en) Small liposomes for delivery of immunogen-encoding RNA
EP4005592B1 (en) Virion-like delivery particles for self-replicating rna molecules
HK40082652A (en) Small liposomes for delivery of immunogen-encoding rna
HK40092401A (en) Small liposomes for delivery of immunogen-encoding rna
HK40087666A (en) Small liposomes for delivery of immunogen-encoding rna
HK40076055A (en) Small liposomes for delivery of immunogen-encoding rna
HK40079415A (en) Small liposomes for delivery of immunogen-encoding rna
HK40071976B (en) Virion-like delivery particles for self-replicating rna molecules
HK40088259A (en) Virion-like delivery particles for self-replicating rna molecules
HK40071976A (en) Virion-like delivery particles for self-replicating rna molecules

Legal Events

Date Code Title Description
PC41 Official registration of the transfer of exclusive right

Effective date: 20220127