RU2668803C2 - Способ получения стволовых клеток с индуцированной плюрипотентностью из мезенхимальных стволовых клеток путем использования фракции флоротаннина - Google Patents
Способ получения стволовых клеток с индуцированной плюрипотентностью из мезенхимальных стволовых клеток путем использования фракции флоротаннина Download PDFInfo
- Publication number
- RU2668803C2 RU2668803C2 RU2016150687A RU2016150687A RU2668803C2 RU 2668803 C2 RU2668803 C2 RU 2668803C2 RU 2016150687 A RU2016150687 A RU 2016150687A RU 2016150687 A RU2016150687 A RU 2016150687A RU 2668803 C2 RU2668803 C2 RU 2668803C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- stem cells
- medium
- chemical formula
- fraction
- florotannin
- Prior art date
Links
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 62
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims description 19
- 229920001339 phlorotannin Polymers 0.000 title abstract 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims abstract description 78
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims abstract description 64
- 210000002901 mesenchymal stem cell Anatomy 0.000 claims abstract description 38
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims abstract description 33
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 33
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 31
- 230000032459 dedifferentiation Effects 0.000 claims abstract description 11
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 claims abstract description 8
- 241000199919 Phaeophyceae Species 0.000 claims description 24
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 claims description 20
- 239000013028 medium composition Substances 0.000 claims description 15
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- 241001512722 Ecklonia cava Species 0.000 claims description 10
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 7
- 241000631640 Ishige okamurae Species 0.000 claims description 5
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 claims description 4
- UZOVYGYOLBIAJR-UHFFFAOYSA-N 4-isocyanato-4'-methyldiphenylmethane Chemical compound C1=CC(C)=CC=C1CC1=CC=C(N=C=O)C=C1 UZOVYGYOLBIAJR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 229910018072 Al 2 O 3 Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 241000031729 Dictyopteris prolifera Species 0.000 claims description 3
- 241000199923 Dictyota dichotoma Species 0.000 claims description 3
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 claims description 3
- 241001260874 Sargassum horneri Species 0.000 claims description 3
- 241000593524 Sargassum patens Species 0.000 claims description 3
- 229910004298 SiO 2 Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 239000007640 basal medium Substances 0.000 claims description 3
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 claims description 3
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 claims description 3
- OGIDPMRJRNCKJF-UHFFFAOYSA-N titanium oxide Inorganic materials [Ti]=O OGIDPMRJRNCKJF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 abstract description 11
- SLWPBUMYPRVYIJ-UHFFFAOYSA-N phlorofucofuroeckol a Chemical compound OC1=CC(O)=CC(OC=2C=3OC4=C(C=5C6=C(O)C=C(O)C(OC=7C=C(O)C=C(O)C=7)=C6OC=5C=C4O)OC=3C(O)=CC=2O)=C1 SLWPBUMYPRVYIJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 8
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 6
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 abstract description 6
- YHMKGQNHXHEHMW-UHFFFAOYSA-N 4-(3,5-dihydroxyphenoxy)-9-[6-(3,5-dihydroxyphenoxy)-2,4,9-trihydroxy-7-(2,4,6-trihydroxyphenoxy)dibenzo-p-dioxin-1-yl]dibenzo-p-dioxin-1,3,6,8-tetrol Chemical compound OC1=CC(O)=CC(O)=C1OC1=CC(O)=C(OC=2C(=C(O)C=C(O)C=2O2)C=3C=4OC5=C(O)C=C(O)C(OC=6C=C(O)C=C(O)C=6)=C5OC=4C(O)=CC=3O)C2=C1OC1=CC(O)=CC(O)=C1 YHMKGQNHXHEHMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract 2
- 229920001372 Phlorofucofuroeckol A Polymers 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 49
- 210000001778 pluripotent stem cell Anatomy 0.000 description 31
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 27
- 210000003954 umbilical cord Anatomy 0.000 description 23
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 210000001671 embryonic stem cell Anatomy 0.000 description 18
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 17
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 16
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 15
- -1 2,4,6-trihydroxyphenyl Chemical group 0.000 description 14
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 14
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 13
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 13
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 11
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 11
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 11
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 10
- 229940018973 ecklonia cava extract Drugs 0.000 description 9
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 9
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 9
- 101000687905 Homo sapiens Transcription factor SOX-2 Proteins 0.000 description 8
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 8
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 8
- 102100024270 Transcription factor SOX-2 Human genes 0.000 description 8
- OKKJLVBELUTLKV-VMNATFBRSA-N methanol-d1 Chemical compound [2H]OC OKKJLVBELUTLKV-VMNATFBRSA-N 0.000 description 8
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 8
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 8
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 8
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 8
- VZSRBBMJRBPUNF-UHFFFAOYSA-N 2-(2,3-dihydro-1H-inden-2-ylamino)-N-[3-oxo-3-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)propyl]pyrimidine-5-carboxamide Chemical compound C1C(CC2=CC=CC=C12)NC1=NC=C(C=N1)C(=O)NCCC(N1CC2=C(CC1)NN=N2)=O VZSRBBMJRBPUNF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- AFCARXCZXQIEQB-UHFFFAOYSA-N N-[3-oxo-3-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)propyl]-2-[[3-(trifluoromethoxy)phenyl]methylamino]pyrimidine-5-carboxamide Chemical compound O=C(CCNC(=O)C=1C=NC(=NC=1)NCC1=CC(=CC=C1)OC(F)(F)F)N1CC2=C(CC1)NN=N2 AFCARXCZXQIEQB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 238000001644 13C nuclear magnetic resonance spectroscopy Methods 0.000 description 6
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 210000004504 adult stem cell Anatomy 0.000 description 6
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 6
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 description 6
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 5
- 102100035423 POU domain, class 5, transcription factor 1 Human genes 0.000 description 5
- 101710126211 POU domain, class 5, transcription factor 1 Proteins 0.000 description 5
- 238000001460 carbon-13 nuclear magnetic resonance spectrum Methods 0.000 description 5
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 5
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 5
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 5
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 5
- 238000001819 mass spectrum Methods 0.000 description 5
- 238000000425 proton nuclear magnetic resonance spectrum Methods 0.000 description 5
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 5
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 5
- 238000005160 1H NMR spectroscopy Methods 0.000 description 4
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102100039486 Dolichyl-diphosphooligosaccharide-protein glycosyltransferase subunit 4 Human genes 0.000 description 4
- 101000609775 Homo sapiens Dolichyl-diphosphooligosaccharide-protein glycosyltransferase subunit 4 Proteins 0.000 description 4
- LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N N-Butanol Chemical compound CCCCO LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 4
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 4
- 239000012046 mixed solvent Substances 0.000 description 4
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101000878457 Macrocallista nimbosa FMRFamide Proteins 0.000 description 3
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 3
- 229940125904 compound 1 Drugs 0.000 description 3
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 210000001654 germ layer Anatomy 0.000 description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 3
- VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N n-Hexane Chemical compound CCCCCC VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 3
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 3
- 150000008442 polyphenolic compounds Chemical group 0.000 description 3
- 235000013824 polyphenols Nutrition 0.000 description 3
- NLKNQRATVPKPDG-UHFFFAOYSA-M potassium iodide Chemical compound [K+].[I-] NLKNQRATVPKPDG-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- BDERNNFJNOPAEC-UHFFFAOYSA-N propan-1-ol Chemical compound CCCO BDERNNFJNOPAEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 3
- PUPZLCDOIYMWBV-UHFFFAOYSA-N (+/-)-1,3-Butanediol Chemical compound CC(O)CCO PUPZLCDOIYMWBV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012591 Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline Substances 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 2
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 2
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 2
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 2
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 2
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 2
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 2
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 2
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 210000003981 ectoderm Anatomy 0.000 description 2
- 210000001900 endoderm Anatomy 0.000 description 2
- 239000000469 ethanolic extract Substances 0.000 description 2
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 2
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 241000411851 herbal medicine Species 0.000 description 2
- 230000000984 immunochemical effect Effects 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- 235000015110 jellies Nutrition 0.000 description 2
- 239000008274 jelly Substances 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 210000003716 mesoderm Anatomy 0.000 description 2
- 239000000401 methanolic extract Substances 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 210000002894 multi-fate stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 2
- 101710135378 pH 6 antigen Proteins 0.000 description 2
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 230000008672 reprogramming Effects 0.000 description 2
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 2
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 2
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 2
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 2
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 2
- 210000002444 unipotent stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 2
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 2
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 2
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 2
- 229940058015 1,3-butylene glycol Drugs 0.000 description 1
- YLZOPXRUQYQQID-UHFFFAOYSA-N 3-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)-1-[4-[2-[[3-(trifluoromethoxy)phenyl]methylamino]pyrimidin-5-yl]piperazin-1-yl]propan-1-one Chemical compound N1N=NC=2CN(CCC=21)CCC(=O)N1CCN(CC1)C=1C=NC(=NC=1)NCC1=CC(=CC=C1)OC(F)(F)F YLZOPXRUQYQQID-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- 241000416162 Astragalus gummifer Species 0.000 description 1
- 208000012657 Atopic disease Diseases 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 208000017701 Endocrine disease Diseases 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 108010003272 Hyaluronate lyase Proteins 0.000 description 1
- 102000001974 Hyaluronidases Human genes 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 241000199900 Laminariales Species 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- NIPNSKYNPDTRPC-UHFFFAOYSA-N N-[2-oxo-2-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)ethyl]-2-[[3-(trifluoromethoxy)phenyl]methylamino]pyrimidine-5-carboxamide Chemical compound O=C(CNC(=O)C=1C=NC(=NC=1)NCC1=CC(=CC=C1)OC(F)(F)F)N1CC2=C(CC1)NN=N2 NIPNSKYNPDTRPC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 208000012902 Nervous system disease Diseases 0.000 description 1
- 208000025966 Neurological disease Diseases 0.000 description 1
- 102000043276 Oncogene Human genes 0.000 description 1
- 108700020796 Oncogene Proteins 0.000 description 1
- JPYHHZQJCSQRJY-UHFFFAOYSA-N Phloroglucinol Natural products CCC=CCC=CCC=CCC=CCCCCC(=O)C1=C(O)C=C(O)C=C1O JPYHHZQJCSQRJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101100247004 Rattus norvegicus Qsox1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000238370 Sepia Species 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 229920001615 Tragacanth Polymers 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 239000002250 absorbent Substances 0.000 description 1
- 230000002745 absorbent Effects 0.000 description 1
- DPXJVFZANSGRMM-UHFFFAOYSA-N acetic acid;2,3,4,5,6-pentahydroxyhexanal;sodium Chemical compound [Na].CC(O)=O.OCC(O)C(O)C(O)C(O)C=O DPXJVFZANSGRMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 210000001789 adipocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 235000010419 agar Nutrition 0.000 description 1
- 235000010443 alginic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000000783 alginic acid Substances 0.000 description 1
- 229920000615 alginic acid Polymers 0.000 description 1
- 229960001126 alginic acid Drugs 0.000 description 1
- 150000004781 alginic acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 description 1
- XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N aluminium Chemical compound [Al] XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000010210 aluminium Nutrition 0.000 description 1
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 1
- 229910052787 antimony Inorganic materials 0.000 description 1
- WATWJIUSRGPENY-UHFFFAOYSA-N antimony atom Chemical compound [Sb] WATWJIUSRGPENY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003078 antioxidant effect Effects 0.000 description 1
- 239000006286 aqueous extract Substances 0.000 description 1
- 206010003246 arthritis Diseases 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 210000002459 blastocyst Anatomy 0.000 description 1
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000017531 blood circulation Effects 0.000 description 1
- 210000003995 blood forming stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000001772 blood platelet Anatomy 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- 210000004271 bone marrow stromal cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 235000019437 butane-1,3-diol Nutrition 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 1
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 1
- 239000001768 carboxy methyl cellulose Substances 0.000 description 1
- 230000000747 cardiac effect Effects 0.000 description 1
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 210000001612 chondrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 230000005757 colony formation Effects 0.000 description 1
- 239000003086 colorant Substances 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 239000007884 disintegrant Substances 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 1
- 230000002849 elastaseinhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 238000004945 emulsification Methods 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- IDGUHHHQCWSQLU-UHFFFAOYSA-N ethanol;hydrate Chemical compound O.CCO IDGUHHHQCWSQLU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004720 fertilization Effects 0.000 description 1
- 210000003754 fetus Anatomy 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 239000000796 flavoring agent Substances 0.000 description 1
- 235000003599 food sweetener Nutrition 0.000 description 1
- 239000003517 fume Substances 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 230000002443 hepatoprotective effect Effects 0.000 description 1
- 239000003906 humectant Substances 0.000 description 1
- 229960002773 hyaluronidase Drugs 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 208000019423 liver disease Diseases 0.000 description 1
- HCWCAKKEBCNQJP-UHFFFAOYSA-N magnesium orthosilicate Chemical compound [Mg+2].[Mg+2].[O-][Si]([O-])([O-])[O-] HCWCAKKEBCNQJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000391 magnesium silicate Substances 0.000 description 1
- 229910052919 magnesium silicate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019792 magnesium silicate Nutrition 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 210000000107 myocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000005445 natural material Substances 0.000 description 1
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 1
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 1
- 210000000963 osteoblast Anatomy 0.000 description 1
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- QCDYQQDYXPDABM-UHFFFAOYSA-N phloroglucinol Chemical compound OC1=CC(O)=CC(O)=C1 QCDYQQDYXPDABM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960001553 phloroglucinol Drugs 0.000 description 1
- 210000002826 placenta Anatomy 0.000 description 1
- 239000000737 potassium alginate Substances 0.000 description 1
- 235000010408 potassium alginate Nutrition 0.000 description 1
- MZYRDLHIWXQJCQ-YZOKENDUSA-L potassium alginate Chemical compound [K+].[K+].O1[C@@H](C([O-])=O)[C@@H](OC)[C@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](C([O-])=O)O[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O MZYRDLHIWXQJCQ-YZOKENDUSA-L 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 238000010992 reflux Methods 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 235000019812 sodium carboxymethyl cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 229920001027 sodium carboxymethylcellulose Polymers 0.000 description 1
- 159000000000 sodium salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000010374 somatic cell nuclear transfer Methods 0.000 description 1
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 1
- 238000004611 spectroscopical analysis Methods 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 229910001220 stainless steel Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010935 stainless steel Substances 0.000 description 1
- 238000012916 structural analysis Methods 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 239000003765 sweetening agent Substances 0.000 description 1
- 210000000115 thoracic cavity Anatomy 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0696—Artificially induced pluripotent stem cells, e.g. iPS
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/33—Heterocyclic compounds
- A61K31/335—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin
- A61K31/357—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having two or more oxygen atoms in the same ring, e.g. crown ethers, guanadrel
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/0018—Culture media for cell or tissue culture
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
- C12N5/0662—Stem cells
- C12N5/0668—Mesenchymal stem cells from other natural sources
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/70—Undefined extracts
- C12N2500/76—Undefined extracts from plants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/999—Small molecules not provided for elsewhere
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
- C12N2506/02—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from embryonic cells
- C12N2506/025—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from embryonic cells from extra-embryonic cells, e.g. trophoblast, placenta
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
- C12N2506/13—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells
- C12N2506/1346—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells from mesenchymal stem cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
- C12N2506/13—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells
- C12N2506/1346—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells from mesenchymal stem cells
- C12N2506/1392—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells from mesenchymal stem cells from mesenchymal stem cells from other natural sources
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Transplantation (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Plant Substances (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области клеточной биологии и биотехнологии, в частности к композиции среды для дедифференцировки мезенхимальных стволовых клеток, полученных без повреждения эмбриона, в стволовые клетки с индуцированной плюрипотентностью и способу получения стволовых клеток с индуцированной плюрипотентностью. Композиция содержит фракцию флоротаннина, которая содержит одно или более соединений, выбранных из группы, состоящей из 2-О-(2,4,6-тригидроксифенил)-6,6’-биэкола, флорофукофуроэкола-А, флоротаннина 974-А и флоротаннина 974-B. Далее композиция добавляется в клеточную культуральную среду для дедифференцировки мезенхимальных стволовых клеток, полученных без повреждения эмбриона, в стволовые клетки с индуцированной плюрипотентностью. Изобретение позволяет осуществлять дедифференцировку мезенхимальных стволовых клеток, полученных без повреждения эмбриона, в стволовые клетки с индуцированной плюрипотентностью. 2 н. и 5 з.п. ф-лы, 22 ил, 1 табл., 3 пр.
Description
Область изобретения
Изобретение относится к композиции среды стволовых клеток с индуцированной плюрипотентностью из мезенхимальных стволовых клеток, содержащей фракцию флоротаннина, экстрагированного из бурых водорослей, и к способу получения стволовых клеток с индуцированной плюрипотентностью с использованием указанной среды.
Предшествующий уровень техники
Стволовые клетки представляют собой клетки, которые могут быть дифференцированы в различные клетки, формирующие ткань организма и вместе называемые до дифференцировки недифференцированными клетками, которые могут быть получены из каждой ткани эмбриона, зародыша и взрослого организма. Стволовые клетки можно классифицировать различными способами. Один из наиболее распространенных способов зависит от объекта, из которого выделяют стволовые клетки, и указанные стволовые клетки могут быть разделены на эмбриональные стволовые клетки (клетки ES), выделенные у эмбриона, и стволовые клетки взрослых, выделенные у взрослого организма. Еще одна распространенная классификация соответствует способности к дифференцировке стволовых клеток, и стволовые клетки могут быть разделены на плюрипотентные, мультипотентные и унипотентные стволовые клетки. Плюрипотентными стволовыми клетками называют стволовые клетки, обладающие мультифункциональностью, которые могут быть дифференцированы в три зародышевых слоя, формирующие живой организм, и, как правило, им соответствуют эмбриональные стволовые клетки.
Стволовые клетки взрослых могут быть классифицированы на мультипотентные или унипотентные стволовые клетки. Типичные стволовые клетки взрослых включают мезенхимальные стволовые клетки (MSC) и гематопоэтические стволовые клетки (HSC). Известно, что MSC дифференцируются в хондробласт, остеобласт, адипоцит, миоцит и нейрон, а HSC дифференцируются в клетки крови в кровотоке, включающие красные кровяные тельца, белые кровяные тельца, тромбоциты и т.п. Стволовые клетки взрослых могут быть получены из костного мозга, крови, головного мозга, кожи и т.п., что создает меньше этических аспектов, но они обладают ограниченной мультипотентностью по сравнению с эмбриональными стволовыми клетками.
С другой стороны, плюрипотентные стволовые клетки названы стволовыми клетками, обладающими мультифункциональностью, которые могут быть дифференцированы в три зародышевых слоя, формирующих живой организм для дифференцировки на все клетки или ткани органов человеческого организма, и, как правило, им соответствуют эмбриональные стволовые клетки. Эмбриональные стволовые клетки представляют собой плюрипотентные стволовые клетки, обладающие возможностью к дифференцировке в клетки всех тканей, формирующих один субъект, но имеющие серьезные этические аспекты, заключающимися в том, что эмбрионы разрушаются в процессе получения клеток.
В качестве альтернативы для решения этих проблем предприняты различные способы получения адаптированных плюрипотентных стволовых клеток, похожих на эмбриональные стволовые клетки, путем дедифференцировки клеток, полученных у взрослого организма. Известно, что человеческие эмбриональные стволовые клетки получают у эмбрионов, которые могут формировать человеческий организм, и, таким образом, существует множество этических аспектов, однако эмбриональные стволовые клетки обладают превосходной клеточной пролиферацией и мультипотентностью по сравнению со стволовыми клетками взрослых. Стволовые клетки взрослых могут быть получены из костного мозга, крови, головного мозга, кожи и т.п., что создает меньше этических аспектов, но они обладают ограниченной мультипотентностью по сравнению с эмбриональными стволовыми клетками.
В качестве типичного способа существуют следующие способы, например слияние с клеткой ES, перенос ядер соматической клетки, перепрограммирование при помощи генетического фактора и т.п. Слияние с клеткой ES представляет проблему с точки зрения клеточной стабильности, поскольку индуцированные клетки дополнительно имеют две пары генов, а перенос ядер соматической клетки создает проблему, заключающуюся в том, что требуется множество яйцеклеток, и эффективность является слишком низкой. Дополнительно, перепрограммирование при помощи генетического фактора представляет собой способ с использованием вируса, содержащего онкогены, для того, чтобы вызвать дидифференцировку, путем встраивания специфических генов, и, таким образом, имеет высокий риск возникновения рака, а также оно создает проблемы с точки зрения разработки клеточных терапевтических агентов вследствие низкой эффективности и сложности методического аспекта.
Для того чтобы успешно получать большое количество плюрипотентных стволовых клеток, композиция культуры очень важна для культивирования мононуклеарных клеток, получаемых из выделенной пуповины, и, таким образом, требуются исследования, относящиеся к получению большего количества плюрипотентных стволовых клеток при помощи способа индукции с высокой эффективностью.
В то же самое время, в публикации патента Кореи №2009-0043115 раскрыта композиция для лечения или предупреждения атопических заболеваний путем использования Ecklonia cava из бурых водорослей, и в публикации патента Кореи №2012-0126148 раскрыта композиция сурьмы для окислительного окрашивания.
Авторы настоящего изобретения успешно разработали композицию среды для дедифференцировки стволовых клеток с индуцированной плюрипотентностью путем использования экстракта Ecklonia cava (публикация патента Кореи №2015-0050823). Тем не менее, какой именно компонент экстракта Ecklonia cava обладает дедифференцирующим действием на стволовые клетки с индуцированной плюрипотентностью еще не известно.
Подробная информация, описанная в разделе предшествующего уровня техники, приведена только для усиления понимания предшествующего уровня техники по настоящему изобретению и, таким образом, она может содержать информацию, которая не образует предшествующий уровень техники, который уже известен в данной стране специалисту в данной области техники.
Описание изобретения
Техническая проблема, решаемая в изобретении
Авторы настоящего изобретения приложили усилия для разработки высокоэффективного способа индуцирования плюрипотентности стволовых клеток, для того, чтобы организовать серийное производство клеточных терапевтических агентов с высокой стабильностью и высокой эффективностью получения. В результате, авторы изобретения подтвердили, что когда некоторые соединения, экстрагированные и выделенные из бурых водорослей в виде стабильного природного вещества, добавляют в клеточную культуральную среду, тогда могут быть получены стволовые клетки с индуцированной плюрипотентностью со стабильностью и высокой эффективностью путем использования мезенхимальных стволовых клеток, и таким образом, завершили настоящее изобретение.
Настоящее изобретение направлено на то, чтобы обеспечить композицию среды, содержащую фракцию флоротаннина, для дедифференцировки мезенхимальных стволовых клеток в стволовые клетки с индуцированной плюрипотентностью.
Настоящее изобретение также направлено на то, чтобы обеспечить способ получения стволовых клеток с индуцированной плюрипотентностью, включающий дедифференцировку плюрипотентных стволовых клеток в стволовые клетки с индуцированной плюрипотентностью в среде, включающей фракцию флоротаннина. Кроме того, настоящее изобретение также направлено на то, чтобы обеспечить клеточную терапевтическую композицию, включающую стволовые клетки с индуцированной плюрипотентностью, полученные при помощи способа получения. Другие задачи и преимущества настоящего изобретения станут яснее благодаря подробному описанию изобретения, формуле изобретения и графическим материалам, описанным ниже.
Техническое решение
В одном аспекте настоящего изобретения предложена композиция среды, содержащая фракцию флоротаннина, для дедифференцировки мезенхимальных стволовых клеток в стволовые клетки с индуцированной плюрипотентностью.
Предпочтительно, фракция флоротаннина может представлять собой биэкольное соединение, представленное следующей химической формулой 1 или ее солями.
[Химическая формула 1]
Предпочтительно фракция флоротаннина может быть экстрагирована и выделена из одного из видов бурых водорослей, выбранных из группы, состоящей из Ecklonia cava, Dictyopteris prolifera Okamura, Dictyota dichotoma Lamouroux, Sargassum horneri C. Agardh, Sargassum patens C. Agardh и Ishige okamurae Yendo, или искусственно синтезирована.
Предпочтительно, фракция флоротаннина может быть экстрагирована и выделена из Ecklonia cava.
Предпочтительно, фракция флоротаннина может быть включена в среду, выбранную из группы, состоящей из DMEM (среда Игла, модифицированная Дульбекко), MEM (минимальная поддерживающая среда), ВМЕ (базальная среда Игла), RPMI 1640, F-10, F-12, DMEM F-12, α-МЕМ (α-минимальная поддерживающая среда), G-MEM (минимальная поддерживающая среда Глазго), IMDM (среда Дульбекко, модифицированная по способу Исков), среды MacCoy's 5А, полной среды AminoMax II и среды MesenCult-XF.
Предпочтительно, фракция флоротаннина может быть включена в количестве от 10 до 500 мкг/мл относительно композиции среды.
Предпочтительно, композиция среды может дополнительно включать от 1 до 10% об./об. энергетической воды.
В еще одном аспекте настоящего изобретения предложен способ получения стволовых клеток с индуцированной плюрипотентностью, включающий: добавление фракции флоротаннина в клеточную культуральную среду; и дедифференцировку мезенхимальных стволовых клеток в среде в стволовые клетки с индуцированной плюрипотентностью.
Предпочтительно, фракция флоротаннина может представлять собой биэкольное соединение, представленное следующей химической формулой 1 или ее солями.
[Химическая формула 1]
Предпочтительно, в еще одном аспекте настоящего изобретения предложена клеточная терапевтическая композиция, содержащая стволовые клетки с индуцированной плюрипотентностью, полученные при помощи указанного способа.
Преимущества
Особенности и преимущества настоящего изобретения являются следующими.
(1) В настоящем изобретении предложена композиция среды для дедифференцировки стволовых клеток с индуцированной плюрипотентностью путем использования фракции флоротаннина, экстрагированной из бурых водорослей.
(2) Кроме того, в настоящем изобретении предложен способ получения стволовых клеток с индуцированной плюрипотентностью с использованием композиции среды.
(3) Стволовые клетки с индуцированной плюрипотентностью могут быть эффективно получены путем использования мезенхимальных стволовых клеток путем использования композиции среды по настоящему изобретению, и полученные стволовые клетки с индуцированной плюрипотентностью могут быть дифференцированы в различные клетки, и таким образом могут быть полезны в качестве клеточного терапевтического агента.
Описание графических материалов
На ФИГ. 1 показано условие для выделения фракции из экстракта Ecklonia cava.
На ФИГ. 2 показан результат масс-спектроскопии для 2-O-(2,4,6-тригидроксифенил)-6,6'-биэкола, представленного химической формулой 1.
На ФИГ. 3 показан результат спектроскопии 1H-NMR (ядерный магнитный резонанс) для 2-O-(2,4,6-тригидроксифенил)-6,6'-биэкола, представленного химической формулой 1.
На ФИГ. 4 показан результат спектроскопии 13C-NMR для 2-O-(2,4,6-тригидроксифенил)-6,6'-биэкола, представленного химической формулой 1.
На ФИГ. 5 показан результат масс-спектроскопии для диэкола, представленного химической формулой 2.
На ФИГ. 6 показан результат спектроскопии 1H-NMR для диэкола, представленного химической формулой 2.
На ФИГ. 7 показан результат спектроскопии 13C-NMR для диэкола, представленного химической формулой 2.
На ФИГ. 8 показан результат масс-спектроскопии для флорофукофуроэкола-А (PFF-A), представленного химической формулой 3.
На ФИГ. 9 показан результат спектроскопии 1H-NMR для флорофукофуроэкола-А (PFF-A), представленного химической формулой 3.
На ФИГ. 10 показан результат спектроскопии 13C-NMR для флорофукофуроэкола-А (PFF-A), представленного химической формулой 3.
На ФИГ. 11 показан результат масс-спектроскопии для 974-А, представленного химической формулой 4.
На ФИГ. 12 показан результат спектроскопии 1H-NMR для 974-А, представленного химической формулой 4.
На ФИГ. 13 показан результат спектроскопии 13C-NMR для 974-А, представленного химической формулой 4.
На ФИГ. 14 показан результат масс-спектроскопии для 974-В, представленного химической формулой 4.
На ФИГ. 15 показан результат спектроскопии 1H-NMR для 974-В, представленного химической формулой 5.
На ФИГ. 16 показан результат спектроскопии 13C-NMR для 974-В, представленного химической формулой 5.
На ФИГ. 17 показано образование колоний стволовых клеток с индуцированной плюрипотентностью в зависимости от концентрации за счет обработки фракцией флоротаннина из экстракта Ecklonia cava с использованием способа (экспериментальный пример 1-1) по настоящему изобретению.
На ФИГ. 18 подтверждено, что клетки, индуцированные способом по настоящему изобретению (экспериментальный пример 1-1), представляют собой плюрипотентные стволовые клетки, за счет использования экспрессии SSEA-4 и щелочной фосфатазы, которые представляют собой белки, специфические для плюрипотентных стволовых клеток.
На ФИГ. 19 подтверждено, что клетки, индуцированные способом по настоящему изобретению (экспериментальный пример 1-1), представляют собой плюрипотентные стволовые клетки, за счет использования экспрессии ОСТ4 и SOX2, которые представляют собой гены, специфические для плюрипотентных стволовых клеток.
На ФИГ. 20 показано образование колоний плюрипотентных стволовых клеток, индуцированных в зависимости от концентрации за счет обработки соединением из фракции флоротаннина с использованием способа (экспериментальный пример 1-2) по настоящему изобретению.
На ФИГ. 21 подтверждено, что клетки, индуцированные способом по настоящему изобретению (экспериментальный пример 1-2), представляют собой плюрипотентные стволовые клетки, за ьсчет использования экспрессии SSEA-4 и щелочной фосфатазы, которые представляют собой белки, специфические для плюрипотентных стволовых клеток.
На ФИГ. 22 подтверждено, что клетки, индуцированные способом по настоящему изобретению (экспериментальный пример 1-2), представляют собой плюрипотентные стволовые клетки, за счет использования экспрессии ОСТ4 и SOX2, которые представляют собой гены, специфические для плюрипотентных стволовых клеток.
Осуществление изобретения
В соответствии с аспектом настоящего изобретения в настоящем изобретении предложена композиция среды, содержащая фракцию флоротаннина, экстрагированную и выделенную из бурых водорослей, для дедифференцировки мезенхимальных стволовых клеток в стволовые клетки с индуцированной плюрипотентностью.
Авторы настоящего изобретения сделали попытку разработать способ индуцирования плюрипотентности с высокой эффективностью у стволовых клеток, для того, чтобы запустить в серийное производство разработку клеточных терапевтических агентов, обладающих стабильностью и высокой эффективностью продукции без этического аспекта повреждения эмбрионов. В результате подтвердили, что когда фракцию флоротаннина, выделенную из экстракта бурых водорослей в виде стабильного природного экстракта, предпочтительно, экстракта Ecklonia cava, добавляют в клеточную культуральную среду, то неожиданно с высокой эффективностью могут быть получены стволовые клетки с индуцированной плюрипотентностью.
В соответствии с иллюстративным воплощением настоящего изобретения экстракт из бурых водорослей может представлять собой водный экстракт из бурых водорослей, этанольный экстракт из бурых водорослей, метанольный экстракт из бурых водорослей или экстракт из бурых водорослей при использовании смешанного растворителя из двух или более чем двух, выбранных из воды, этанола и метанола.
В соответствии с иллюстративным воплощением настоящего изобретения водный экстракт из бурых водорослей может быть приготовлен путем экстрагирования бурых водорослей водой при температуре от 40 до 100°С в течение от 2 до 48 часов. Этанольный экстракт из бурых водорослей может быть приготовлен путем экстрагирования бурых водорослей 35-80% этанолом при 20-60°С в течение от 2 до 36 часов. Кроме того, метанольный экстракт из бурых водорослей может быть приготовлен путем экстрагирования бурых водорослей 35-80% метанолом при 20-60°С в течение от 2 до 36 часов.
Ecklonia cava среди бурых водорослей, включенных в композицию среды по настоящему изобретению, представляет собой многолетнюю водоросль из бурых водорослей laminariaceous laminariales, которые преимущественно обитают на южном берегу, берегу острова Чеджу и берегу острова Уллеунгдо, в основном представляя собой корм для морского ушка, turban и т.п, и используется в качестве основного сырьевого материала для получения альгината или йодида калия либо в пищевом продукте.
Экстракт Ecklonia cava, включенный в настоящее изобретение, может быть экстрагирован путем использования воды и органических растворителей, включающих (а) безводный или содержащий воду низший спирт, имеющий от 1 до 4 атомов углерода (метанол, этанол, пропанол, бутанол, н-пропанол, изопропанол, н-бутанол и т.п.), (б) смешанный растворитель из низшего спирта и воды, (в) ацетон, (г) этилацетат, (д) хлороформ, (е) 1,3-бутиленгликоль, (ж) гексан, (з) диэтиловый эфир и т.п., и предпочтительно может быть экстрагирован путем использования смешанного растворителя из метанола или этанола и воды. В случае экстракции экстракта Ecklonia cava путем использования смешанного растворителя содержание метанола или этанола может составлять от 50 до 80% об./об. Тем не менее, настоящее изобретение не обязательно ограничено ими.
Флоротаннин, выделенный из экстракта бурых водорослей, представляет собой основанное на полифеноле соединение, содержащее флороглюцинол в качестве основной составляющей единицы. Флоротаннин обнаружен во множестве морских растений, в частности, в бурых водорослях в природе, и сообщается о том, что флоротаннин обладает различными полезными эффектами, такими как антибактериальный эффект, антиоксидантный эффект, гепатопротекторное действие, ингибирующее эластазу действие, ингибирующее гиалуронидазу действие, эффект защиту сердечно-сосудистой системы, и противовирусное действие.
В настоящем изобретении, в частности, биэкольное соединение, представленное следующей химической формулой 1, диэкольное соединение, представленное следующей химической формулой 2, флорофукофуроэкольное соединение, представленное следующей химической формулой 3, основанное на эколе соединение, представленное следующей химической формулой 4, и основанное на эколе соединение, представленное следующей химической формулой 5, выделены и идентифицированы из фракции флоротаннина экстракта из Ecklonia cava, и экспрессирующая способность стволовых клеток с индуцированной плюрипотентностью подтверждена. Когда биэкольное соединение, представленное следующей химической формула 1, среди других соединений добавляют в клеточную культуральную среду, то подтверждается, что стволовые клетки с индуцированной плюрипотентностью могут быть получены с высокой эффективностью.
[Химическая формула 1]
[Химическая формула 2]
[Химическая формула 3]
[Химическая формула 4]
[Химическая формула 5]
Более конкретно, химическая формула 1 представлена 2-O-(2,4,6-тригидроксифенил)-6,6'-биэколом, химическая формула 2 представлена диэколом, химическая формула 3 представлена флорофукофуроэколом-А (PFF-A), химическая формула 4 представлена 974-А и химическая формула 5 представлена 974-В, и в настоящем изобретении соединения могут быть добавлены в клеточную культуральную среду сами по себе или в их комбинации.
Используемый в настоящем изобретении термин "эмбриональные стволовые клетки" относится к клеткам, обладающим плюрипотентностью, таким как клетки, выделенные и культивируемые из внутренней клеточной массы бластоциста на раннем этапе его развития после оплодотворения. Используемый в настоящем изобретении термин "плюрипотентные стволовые клетки" относится к стволовым клеткам, обладающим плюрипотентностью, которые могут быть дифференцированы в три зародышевых слоя, формирующих взрослый организм, а именно эндодерму, мезодерму и эктодерму.
Используемый в настоящем изобретении термин "дифференцировка" означает, что по мере того, как клетки делятся, пролиферируют и растут, их структуры и функции специализируются, то есть, формы или функции меняются для того, чтобы осуществлять задачи, которые заданы клеткам, тканям, и т.п. в организме.
Термин "клеточный терапевтический агент" по настоящему изобретению, относящийся к лекарственному средству, используемому для лечения, диагностики и предупреждения за счет использования клеток и тканей, которые получают путем выделения у человека, культивирования и специфических манипуляций, означает лекарственное средство, используемое для лечения, диагностики и предупреждения путем серий действий, таких как пролиферация и скрининг гомогенных или гетерогенных клеток для восстановления функций клеток или тканей, изменения биологических характеристик клеток при помощи еще одного способа и т.п. Клеточный терапевтический агент, главным образом, классифицируют на терапевтический агент на основе соматических клеток, терапевтический агент на основе стволовых клеток в соответствии с дифференцировкой клеток, и настоящее изобретение в частности относится к терапевтическому агенту на основе стволовых клеток.
Мезенхимальные стволовые клетки по настоящему изобретению представляют собой клетки, выделенные из эмбриональных стволовых клеток или зрелых стволовых клеток, полученных от млекопитающего, предпочтительно мезенхимальных стволовых клеток, полученных из пуповины, и более предпочтительно, мезенхимальных стволовых клеток, полученных из человеческой пуповины. Стволовые клетки могут быть экстрагированы и получены из пуповины, которая связывает плаценту и плод в организме человека. Экстракция мезенхимальных стволовых клеток из пуповины может быть осуществлена путем использования различных способов, и например, пуповину экстрагируют из человеческого организма, промывая DPBS (фосфатно-солевым буфером Дульбекко) до тех пор, пока кровь не будет течь, и промытую пуповину режут при помощи лезвия скальпеля и инкубируют при 37°С для получения раствора, содержащего мононуклеарные клетки.
Используемый в настоящем изобретении термин "среда" обозначает смесь для культивирования или дифференцировки клеток in vitro, таких как стволовые клетки, которая содержит требуемые элементы для роста и пролиферации клеток, включающие сахара, аминокислоты, различные питательные вещества, сыворотку крови, факторы роста, неорганические вещества и т.п.
Различные среды запущены в серийное производство, и могут быть искусственно приготовлены и использованы в области техники. В качестве запущенной в серийное производство среды включены DMEM (среда Игла, модифицированная Дульбекко), MEM (минимальная поддерживающая среда), ВМЕ (базальная среда Игла), RPMI 1640, F-10, F-12, DMEM F-12, α-MEM (α-минимальная поддерживающая среда), G-MEM (минимальная поддерживающая среда Глазго), IMDM (среда Дульбекко, модифицированная по способу Исков), AmnioMax, полная среда AminoMaxII (Gibco, Newyork, USA), среда MesenCult-XF и т.п., и могут быть использованы в качестве основной среды, включенной в композицию среды дополнительно к среде, которая может быть искусственно приготовлена.
В основную среду могут быть добавлены типично добавляемые компоненты сыворотки крови (например, фетальная телячья сыворотка (FBS)), антибиотики (например, пенициллин и стрептомицин) и т.п. Концентрация компонента сыворотки крови или антибиотического компонента, которые добавляют в основную среду, могут быть модифицированы в пределах диапазона, который может обеспечивать достижение эффекта настоящего изобретения, и предпочтительно могут быть добавлены 10% FBS, 100 Е/мл пенициллина, 50 мкг/мл стрептомицина и т.п.
В то же самое время, концентрация соединения, добавляемого к DMEM, может быть модифицирована в пределах диапазона, который может обеспечить достижение эффекта настоящего изобретения.
Кроме того, среда по настоящему изобретению может дополнительно включать питательную смесь. Питательная смесь представляет собой смесь, содержащую различные аминокислоты, витамины, неорганические соли и т.п., которые обычно используют в клеточной культуре, и может использоваться питательная смесь, которую готовят путем смешивания аминокислот, витаминов, неорганических солей и т.п., или которая приготовлена путем запуска в серийное производство. Приготовленная путем запуска в серийное производство питательная смесь может включать М199, MCDB110, MCDB202, MCDB302 и т.п. в качестве примера, но не ограничиваясь ими.
Кроме того, среда по настоящему изобретению может дополнительно включать энергетическую воду для индукции и стабилизации плюрипотентности стволовых клеток. Энергетическую воду предпочтительно добавляют в количестве от 0,05 до 20% об./об., и более предпочтительно от 0,1 до 10% об./об.
Композиция среды по настоящему изобретению представляет собой специфическую среду для индукции плюрипотентности стволовых клеток, и может быть получена путем добавления фракции флоротаннина, выделенной из экстракта бурых водорослей в основной среде, и может включать фракцию флоротаннина, выделенную из экстракта Ecklonia cava предпочтительно в концентрации от 1 до 1000 мкг/мл и более, предпочтительно в концентрации от 10 до 50 мкг/мл относительно полной композиции среды.
Кроме того, по меньшей мере один тип, выбранный из группы, состоящей из 2-O-(2,4,6-тригидроксифенил)-6,6'-биэкола химической формулы 1, диэкола химической формулы 2, флорофукофуроэкола-А (PFF-A) химической формулы 3, 974-А химической формулы 4 и 974-В химической формулы 5, можно использовать в количестве от 10 до 200 мкг/мл, более предпочтительно, от 20 до 150 мкг/мл относительно полной композиции среды.
В соответствии с еще одним аспектом настоящего изобретения в настоящем изобретении предложен способ получения стволовых клеток с индуцированной плюрипотентностью, включающий: добавление фракции флоротаннина, выделенной из экстракта Ecklonia cava, в клеточную культуральную среду; и дедифференцировку мезенхимальных стволовых клеток в стволовые клетки с индуцированной плюрипотентностью в этой среде.
В этом случае, мононуклеарные клетки, полученные из пуповины, добавляют в основную композицию среды, содержащую 2-O-(2,4,6-тригидроксифенил)-6,6'-биэкол, или смесь, содержащую 2-O-(2,4,6-тригидроксифенил)-6,6'-биэкол, и могут быть инкубированы в инкубаторе в условиях влажности 95%, 37°С и 5% СО2.
В иллюстративном воплощении настоящего изобретения мононуклеарные клетки, полученные из пуповины, инкубируют в инкубаторе в указанных условиях, и затем клеточный супернатант отбирают через 5 суток, и клетки инкубируют, заменяя среду каждые 3-4 суток. Когда стволовые клетки инкубируют путем использования композиции культуральной среды, содержащей 2-O-(2,4,6-тригидроксифенил)-6,6'-биэкол, тогда обнаруживают индукцию плюрипотентности стволовых клеток в зависимости от концентрации 2-O-(2,4,6-тригидроксифенил)-6,6'-биэкола. Среду DMEM F-12 используют в качестве контрольной группы, а среду, содержащую -O-(2,4,6-тригидроксифенил)-6,6'-биэкол в среде DMEM F-12, используют в качестве экспериментальной группы, и мезенхимальные стволовые клетки, полученные из человеческой пуповины, инкубируют в среде, обработанной каждой концентрацией.
В результате можно видеть, что когда мезенхимальные стволовые клетки инкубируют в композиции среды по настоящему изобретению, тогда образуются колонии, такие как колонии плюрипотентных стволовых клеток. Мезенхимальные стволовые клетки, полученные из человеческой пуповины, образуют колонии стволовых клеток в среде по настоящему изобретению на 10-14 сутки. То есть, можно видеть то, что в композиции культуральной среды по настоящему изобретению образуются колонии плюрипотентных стволовых клеток из мезенхимальных стволовых клеток, полученных из человеческой пуповины (см. Фиг. 17-19).
В соответствии с еще одним аспектом настоящего изобретения в настоящем изобретении предложены стволовые клетки с индуцированной плюрипотентностью, полученные при помощи способа получения.
Стволовые клетки с индуцированной плюрипотентностью по настоящему изобретению обладают той же самой дифференцировкой как эмбриональные стволовые клетки, и почти являются такими же, как эмбриональные стволовые клетки, даже по форме клеток. В соответствии с примером воплощения настоящего изобретения эмбриональные стволовые клетки исследовали в отношении экспрессии специфического гена (Nanog, Oct4, Sox2, Klf) и белка (SSEA-4), и в результате можно видеть, что указанные ген и белок экспрессируются в плюрипотентных стволовых клетках, индуцированных при помощи настоящего изобретения, таких как эмбриональные стволовые клетки (см. Фиг. 19).
В соответствии с еще одним аспектом настоящего изобретения в настоящем изобретении предложена клеточная терапевтическая композиция, содержащая стволовые клетки с индуцированной плюрипотентностью, полученные при помощи способа получения.
Можно видеть, что стволовые клетки с индуцированной плюрипотентностью по настоящему изобретению обладают той же самой плюрипотентностью, что и эмбриональные стволовые клетки, и в соответствии с примером воплощения настоящего изобретения обладают плюрипотентностью, то есть могут быть дифференцированы в эктодерму, мезодерму и эндодерму.
Соответственно, стволовые клетки с индуцированной плюрипотентностью по настоящему изобретению могут быть использованы в качестве эффективного клеточного терапевтического агента.
Композиция по настоящему изобретению может быть введена при помощи любого пути введения, в частности, способа, такого как перитонеальное введение или введение в грудную полость, подкожное введение, внутривенное или внутрисосудистое введение, внутримышечное введение, местное введение путем инъекции и т.п.
В настоящем изобретении композиция может быть введена в форме, такой как инъекции, суспензии и эмульсии на основе общего способа, и, при необходимости, может быть суспендирована в адъюванте, таком как полный адъювант Фрейнда, или введена вместе с веществом, обладающим адъювантной активностью, таким как BCG (БЦЖ). Композиция стерилизована или может содержать адъюванты, включающие стабилизаторы, увлажнители или ускорители эмульгирования, соли или буферы для приведения к осмотическому давлению и т.п. и другие терапевтически ценные вещества, и может быть приготовлена путем общего смешивания, гранулирования или нанесения оболочки.
Клеточная терапевтическая композиция в соответствии с настоящим изобретением может содержать фармацевтически приемлемые носители или добавки, и может содержать дополнительно к активным ингредиентам разбавители (например, декстрозу, сорбит, целлюлозу, глицин, лактозу, сахарозу и маннит), связывающие вещества (например, силикат магния и алюминия, крахмальную пасту, трагакантовую камедь, карбоксиметилцеллюлозу натрия), разрыхлители (например, крахмал, агар, альгиновую кислоту или ее натриевые соли), или смесь для кипения и/или абсорбирующие агенты, подсластители, корригенты и красители.
Клеточная терапевтическая композиция в соответствии с настоящим изобретением может быть применена в отношении артрита, неврологических расстройств, эндокринных расстройств, заболеваний печени и т.п. и обеспечивает возможность для более позднего проявления результатов аллогенного терапевтического агента для человека в соответствии с результатами клинического исследования.
Далее настоящее изобретение более подробно будет описано при помощи примеров. Тем не менее, настоящее изобретение не ограничивается раскрытыми ниже примерами воплощений, а может быть реализовано в различных формах. Следующие примеры воплощений описаны для того, чтобы дать возможность специалисту в данной области техники воплотить и осуществить практическую реализацию изобретения.
Примеры
Пример 1: Приготовление фракции флоротаннина и соединений химических формул 1-5
Пример 1-1: Приготовление фракции флоротаннина из экстракта Ecklonia cava
Используемые в эксперименте образцы растительного медицинского препарата приобретали в Jeju Island, получали оценку эксперта и использовали в эксперименте. 100 г высушенного образца растительного медицинского препарата добавляли в 1 л 70% метанола, экстрагировали путем кипения с обратным холодильником в течение 16 часов, и фильтровали с использованием фильтра. Фильтрат концентрировали в ротационном вакуумном испарителе и немедленно лиофилизировали для приготовления экстракта Ecklonia cava.
5 г экстракта Ecklonia cava растворяли в 500 мкл метанола, абсорбировали на смоле С4 (Sepia tech), подвергали вакуумной сушке при 30°С при использовании ротационного вакуумного испарителя, и разделяли для каждого растворителя путем использования Diaion НР-20 для небольших фракций. Прикладывали градиент, и готовили метанольные растворители, имеющие концентрации 0%, 25%, 50%, 75% и 100% для получения фракций. Разделяли на 5 небольших фракций и контролировали профиль HPLC (высокоэффективная жидкостная хроматография) (см. Фиг. 1). Отбирали фракцию, имеющую самый высокий пик HPLC среди пяти небольших фракций.
Пример 1-2: Выделение и очистка фракции флоротаннина
Фракции, полученные в примере 1-1, подвергали обращенно-фазовой С-18 HPLC в условиях градиента растворителя в течение 60 мин: ацетонитрил в течение 10 мин, от 20 до 55% ацетонитрила в течение 40 мин, и от 55 до 100% ацетонитрила в течение 10 мин при использовании колонки С18 (оборудование Phenomenex Luna С18, 10 мкм, 21,2 × 250 мм) и при использовании в качестве растворителей ацетонитрил, содержащий 0,02% TFA (трифторуксусная кислота), и воду, при скорости потока 10 мл/мин и УФ 243 нм, с получением пиков С (RT 25 мин), Е (RT 33 мин), G (RT 37,5 мин), Н (RT 38 мин) и I (RT 38,5 мин). Фракция от времени удерживания 0 до пика С названа с, фракция между пиком С и пиком Е названа D, фракция между пиками Е и G названа F и фракция после пика I названа J.
Каждый пик очищали путем использования колонки С18 (оборудование Phenomenex Luna С18, 10 мкм, 21,2 × 250 мм) при использовании в качестве растворителей ацетонитрил, содержащий 0,02% TFA, метанол и воду при скорости потока 4 мл/мин и УФ 230 нм для каждого в изократических условиях. При изократических условиях с 28% ацетонитрилом соответственно очищали пик Е (RT 10 мин), пик G (RT 22 мин), пик Н (RT 23 мин) и пик I (RT 27 мин).
Тем не менее, при анализе результата после очистки подтвердили, что в пике С смешаны два вещества, и затем два вещества повторно разделяли на С-1 (RT 10 мин) и С-2 (RT 13,5 мин) в изократических условиях с 26% метанолом.
Пример 1-3: Структурный анализ основанного на полифеноле соединения
Молекулярную массу и молекулярную формулу соединения, очищенного в примере 1-2, определяли путем использования высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрией (HPLC-MS), и структурную идентификацию соединения осуществляли путем анализа спектров 1Н NMR и 13C-NMR при помощи ядерного магнитного резонанса (NMR).
В качестве результата идентифицировали, что химическая формула 1 представляла собой 2-O-(2,4,6-тригидроксифенил)-6,6'-биэкол, химическая формула 2 представляла собой диэкол, химическая формула 3 представляла собой флорофукофуроэкол-А, химическая формула 4 представляла собой 974-А, химическая формула 3 представляла собой 974-В. Структура выделенного основанного на полифеноле соединения проиллюстрирована в следующей таблице 1, и структурные особенности каждого соединения были следующими.
[Химическая формула 1] 2-O-(2,4,6-тригидроксифенил)-6,6'-биэкол
1) Молекулярная масса: 866,65
2) Молекулярная формула: С42Н26О21
3) 1Н NMR (400 МГц, DMSO (диметилсульфоксид)) δ 9.28, 9.25, 9.14, 9.09, 9.06, 9.04, 8.95, 8.66, 8.61, 6.09, 6.07, 6.05, 5.91 (d, J=2,0 Гц, 1Н), 5.84, 5.80,6, 5.75 (d, J=2,0 Гц, 1Н).
4) 13С NMR (100 МГц, DMSO) δ 160.6, 160.5, 158.9, 158.9, 154.8, 151.5, 151.4, 151.2, 147.4, 146.5, 144.6, 144.6, 141.7, 141.6, 141.5, 141.5, 137.4, 137.4, 125.0, 123.9, 123.0, 123.0, 122.8, 122.3, 122.3, 99.9, 99.8, 98.1, 98.1, 98.0, 96.2, 96.2, 96.1, 95.0, 94.3, 94.1.
На Фиг. 2 показан масс-спектр 2-O-(2,4,6-тригидроксифенил)-6,6'-биэкола. Кроме того, на Фиг. 3 и 4 показаны спектр 1H-NMR и спектр 13C-NMR для 2-O-(2,4,6-тригидроксифенил)-6,6'-биэкола, соответственно, и значения, указанные для каждого пика, соответствуют значениям, указанным в химических формулах на Фиг. 3 и 4.
[Химическая формула 2] Диэкол
1) Молекулярная масса: 742,08
2) Молекулярная формула: С36Н22О18
3) 1Н NMR (400 МГц, MeOD) δ 6.16 (s, 1Н), 6.14 (s, 1Н), 6.10 (s, 2Н), 6.07 (d, J=2,9 Гц, 1H), 6.06 (d, J=2,9 Гц, 1H), 5.99 (d, J=2,8 Гц, 1H), 5.96 (d, J=2,8 Гц, 1H).
4) 13С NMR (125 и МГц, MeOD) δ 162.70, 160.95, 160.91, 158.63, 156.82, 155.34, 153.22, 148.17, 148.13, 147.97, 147.75, 145.11, 144.95, 144.22, 144.13, 139.46, 139.29, 127.22, 126.98, 126.42, 126.37, 125.66, 125.40, 125.34, 100.65, 100.51, 100.25, 100.14, 98.44, 96.99, 96.63, 96.55, 96.15.
На Фиг. 5 показан масс-спектр для диэкола. Кроме того, на Фиг. 6 и 7 показаны спектр 1H-NMR и спектр 13C-NMR для диэкола, соответственно, и значения, указанные для каждого пика, соответствуют значениям, указанным в химических формулах на Фиг. 6 и 7.
[Химическая формула 3] флорофукофуроэкол-А
1) Молекулярная масса: 602,07
2) Молекулярная формула: С30Н18О14
3) 1Н NMR (400 МГц, MeOD) δ 6.63 (s, 1Н), 6.40 (s, 1Н), 6.26 (s, 1Н), 5.96 (d, J=2,1 Гц, 2Н), 5.955.93 (t. подобный, 1Н), 5.92 (t, J=2,1 Гц, 1Н), 5.88(d, J=2,1 Гц, 2Н).
4) 13С NMR (125 МГц, MeOD) δ 161.87, 161.84, 160.18, 153.15, 151.73, 151.15, 148.31, 148.21, 145.97, 143.92, 138.37, 135.29, 128.04, 124.94, 124.64, 122.27, 105.29, 99.91, 99.28, 97.69, 97.57, 96.18, 95.35, 95.29.
На Фиг. 8 показан масс-спектр для флорофукофуроэкола-А (PFF-A). Кроме того, на Фиг. 9 и 10 показаны спектр 1H-NMR и спектр 13C-NMR для PFF-A, соответственно, и значения, указанные для каждого пика, соответствуют значениям, указанным в химических формулах на Фиг. 9 и 10.
[Химическая формула 4] 974-А
1) Молекулярная масса: 974,73
2) Молекулярная формула: С48Н30О23
3) 1Н NMR (400 МГц, MeOD) δ 6.63 (s, 1Н), 6.40 (s, 1Н), 6.25 (s, 1Н), 6.20 (d, J=2,3 Гц, 1Н), 6.18 (d, J=2,3 Гц, 1Н), 6.12 (d, J=2,3 Гц, 1Н, 6.04 (d, J=2,8 Гц, 1H), 5.92 (s, 2H), 5.925.91 (m, 1H), 5.90 (d, J=2,3 Гц, 1H), 5.87(d, J=2,1 Гц, 2H), 5.74 (d, J=2,8 Гц, 1H).
4) 13C NMR (125 МГц, MeOD) δ 163.16, 162.88, 161.83, 160.16, 159.64, 159.54, 159.14, 159.09, 156.55, 156.49, 156.48, 153.85, 153.35, 152.26, 151.92, 151.77, 151.18, 148.21, 147.78, 145.82, 144.31, 138.15, 135.16, 127.62, 124.93, 124.90, 124.25, 124.22, 122.27, 119.40, 118.15, 105.22, 105.21, 102.62, 102.44, 99.91, 99.24, 98.61, 98.32, 97.68, 97.57, 96.34, 96.11, 95.28, 95.20, 94.37, 94.18.
На Фиг. 11 показан масс-спектр для 974-А. Кроме того, на Фиг. 12 и 13 показаны спектр 1H-NMR спектр и спектр 13C-NMR для 974-А, соответственно, и значения, указанные для каждого пика, соответствуют значениям, указанным в химических формулах на Фиг. 12 и 13.
[Химическая формула 5] 974-В
1) Молекулярная масса: 947,73
2) Молекулярная формула: С48Н30О23
3) 1Н NMR (400 МГц, MeOD) δ 6.69 (s, 1Н), 6.38 (s, 1Н), 6.21 (d, J=2,3 Гц, 1Н), 6.19 (d, J=2.,3 Гц, 1Н), 6.17 (s, 1Н), 6.14 (d, J=2,3 Гц, 1Н), 6.05 (d, J=2,8 Гц, 1Н), 6.00 (s, 2Н), 5.91 (t, J=2,1 Гц, 1Н), 5.89 (d, J=2,3 Гц, 1Н), 5.87 (d, J=2,1 Гц, 2Н), 5.76 (d, J=2,8 Гц, 1Н).
4) 13С NMR (125 МГц, MeOD) δ 161.85, 160.16, 159.64, 159.53, 159.19, 158.97, 157.45, 156.81, 156.63, 156.47, 153.79, 152.65, 152.22, 151.95, 151.66, 150.89, 148.32, 147.03, 143.86, 142.83, 138.07, 137.95, 127.35, 125.23, 124.65, 124.01, 123.93, 122.11, 109.85, 106.33, 102.68, 102.49, 99.62, 99.47, 98.61, 98.32, 97.61, 97.56, 96.45, 95.28, 95.13, 94.23, 92.83.
На Фиг. 14 показан масс-спектр для 974-В. Кроме того, на Фиг. 15 и 16 показаны спектр 1H-NMR и спектр 13C-NMR для 974-В, соответственно, и значения, указанные для каждого пика, соответствуют значениям, указанным в химических формулах на Фиг. 15 и 16.
Пример 2: Выделение и инкубирование мезенхимальных стволовых клеток из человеческой пуповины
Пример 2-1: Выделение человеческой пуповины
Ткань пуповины отбирали непосредственно после рождения. Образец сначала промывали дочиста перед доставкой в лабораторию и затем немедленно переносили в стерильный стеклянный сосуд объемом 500 мл, содержащий среду F-12, к которой была добавлена среда для переноса (50 мкг/мл пенициллина и 50 мкг/мл стрептомицина (приобретенного в Invitrogen)). В лаборатории стволовые клетки экстрагировали в вытяжном шкафу класса 100 в стерильных условиях. Образец сначала переносили в контейнер из нержавеющей стали. Образец несколько раз промывали PBS и затем образцы ткани пуповины нарезали на куски длиной 2 см и переносили в чашку для культур клеток диаметром 10 см и дополнительно промывали и обрабатывали 70% этанолом для предотвращения инфекции, и затем несколько раз промывали PBS, добавляемым со смесью антибиотиков (50 мкг/мл пенициллина и 50 мкг/мл стрептомицина (приобретенных в Invitrogen) до тех пор, пока раствор не станет прозрачным.
Пример 2-2: Выделение и инкубирование стволовых клеток из человеческой пуповины
Для того чтобы отделить вартонов студень (основание пуповины) от кровеносного сосуда пуповины и других внутренних элементов, сначала нарезали ткань пуповины. Вартонов студень, выделенный после удаления кровеносного сосуда, нарезали на небольшие кусочки размером (0,5 см × 0,5 см) для экстракции клеток. Эксплантацию осуществляли путем добавления кусочков вартонова студня пуповины в различные чашки для культуры ткани, которые имеют условия для культивирования клеток, подходящие для экстракции эпителиальных стволовых клеток или мезенхимальных стволовых клеток.
Для выделения/инкубирования мезенхимальных стволовых клеток эксплантированную ткань погружали в 5 мл DMEM (среда Игла, модифицированная Дульбекко) F-12 (Gibco) с добавлением 10% фетальной телячьей сывороткой (FBS, Hyclone), 10% FBS, 100 Е/мл пенициллина и 50 мкг/мл стрептомицина и поддерживали при 37°С в клеточном инкубаторе с диоксидом углерода. Среду заменяли каждые 3 или 4 суток. Разрастание клеток контролировали при помощи оптического микроскопа. Разросшиеся клетки обрабатывали трипсином (0,125% трипсин/0,05% EDTA (этилендиаминтетрауксусная кислота)) для дополнительного разрастания и охлаждали (с использованием DMEM/10% FBS).
Среду заменяли каждые 3 или 4 суток. Разрастание клеток из эксплантированной ткани контролировали при помощи оптического микроскопа.
Для экстракции мезенхимальных стволовых клеток осадки клеток ресуспендировали и подсчитывали в среде DMEM F-12 (Gibco), 10% FBS, 100 Е/мл пенициллина и 50 мкг/мл стрептомицина, и инокулировали на чашку для культивирования клеток размером 10 см с плотностью 1×106 клеток/чашку. Среду заменяли каждые 3 или 4 суток. Разрастание и образование колоний клеток контролировали при помощи оптического микроскопа. При приблизительно 90% количестве клеток (конфлюэнтность), клетки субкультивировали, как описано выше.
Экспериментальный пример 1: Индукция плюрипотентных стволовых клеток из мезенхимальных стволовых клеток
Экспериментальный пример 1-1: Получение плюрипотентных стволовых клеток из мезенхимальных стволовых клеток, полученных от человека, в зависимости от концентрации фракции флоротаннина.
Осуществляли эксперимент по измерению способности к индукции плюрипотентных стволовых клеток из мезенхимальных стволовых клеток, полученных из пуповины человека, в зависимости от концентрации фракции флоротаннина, приготовленной в примере 1-1. В контрольной группе DMEM F-12 (Gibco) использовали в качестве специализированной среды MSC, 10% FBS, 100 Е/мл пенициллина и 50 мкг/мл стрептомицина использовали в качестве основной среды (Normal), а в экспериментальной группе использовали мезенхимальные стволовые клетки, полученные у человека, которые подвергали трем процедурам субкультивирования, и в среду добавляли фракции флоротаннина, имеющие концентрации 1 мкг/мл, 20 мкг/мл, 50 мкг/мл, 100 мкг/мл, 400 мкг/мл, 800 мкг/мл и 1000 мкг/мл и 0,1% об./об. энергетическую воду (очищенная деионизированная вода, содержащая SiO2, Al2O3, TiO3, Fe2O3, CaO, Na2O, K2O, и LiO, STC). Мезенхимальные стволовые клетки, полученные из человеческой пуповины, выделяли и промывали, и мононуклеарные клетки инокул провал и в 6-луночный планшет (чашку) в количестве 1×104 клеток поддерживали и инкубировали при 37°С и 5% CO2.
Плюрипотентные стволовые клетки, индуцированные при помощи способа по настоящему изобретению, анализировали в отношении того, экспрессируют ли они стадиеспецифический эмбриональный антиген 4 (SSEA-4), щелочную фосфатазу (АР), ОСТ4 и SOX2 в качестве специфических для эмбриональных стволовых клеток белков путем использования антител к ним и способа иммунохимического окрашивания. Во время процесса окрашивания клетки сначала фиксировали путем использования 4% параформальдегида и промывали PBS, и блокировали 1% раствором BSA. Клетки обрабатывали первичными антителами против ОСТ4, SOX2 и SSEA-4, и реакцию осуществляли при 4°С в течение 18 часов, и затем промывали PBS, обрабатывали вторичными антителами с флуоресценцией (FITC (флуоресцеин изотиоцианат)) против первичных антител, и подвергали реакции при комнатной температуре в течение 1 часа. Клетки промывали PBS, и затем экспрессию анализировали путем использования конфокального микроскопа. BF обозначает светлое поле, и на втором изображении показан результат окрашивания для определения белковой экспрессии, а на третьем изображении показано объединение двух изображений (смотри Фиг. 19А, 19В, 20А и 20В). Окрашивание АР осуществляли с использованием проницаемого для клеток флуорогенного субстрата-красителя для щелочной фосфатазы, где флуорогенный краситель для АР разбавляли в культуральном растворе DMEM F-12, которым обрабатывали колонии, и затем подвергали реакции в течение от 20 до 30 мин, дважды промывали культуральным раствором DMEM F-12, и экспрессию анализировали путем использования конфокального микроскопа, и результат проиллюстрирован на Фиг. 17.
В результате в экспериментальной группе обнаружили, что только когда концентрация фракции флоротаннина составляла от 10 до 500 мкг/мл, образовывались колонии через 10 суток (см. Фиг. 17), и подтвердили, что только колонии, окрашиваемые ОСТ4, SOX2, SSEA-4 и АР в качестве маркеров, специфических для плюрипотентных стволовых клеток, представляют собой плюрипотентные стволовые клетки (см. Фиг. 18 и 19).
Экспериментальный пример 1-2: Получение плюрипотентных стволовых клеток из мезенхимальных стволовых клеток, полученных у человека, в зависимости от концентрации соединения во фракции флоротаннина
Осуществляли эксперимент по измерению способности индукции плюрипотентных стволовых клеток из мезенхимальных стволовых клеток, полученных от человека, в зависимости от концентрации соединения 1 среди соединений, выделенных в примере 1-2. В контрольной группе DMEM F-12 (Gibco) использовали в качестве специализированной среды MSC, 10% FBS, 100 Е/мл пенициллина и 50 мкг/мл стрептомицина использовали в качестве основной среды (Normal), и в экспериментальной группе использовали мезенхимальные стволовые клетки, полученные из человеческой пуповины, которые подвергали трем процедурам субкультивирования, и в среду добавляли биэкольное соединение 1, представленное химической формулой 1, имеющее концентрации 1 мкг/мл, 20 мкг/мл, 50 мкг/мл, 100 мкг/мл, 400 мкг/мл, 800 мкг/мл и 1000 мкг/мл, и 0,1% об./об. энергетической воды (очищенной деионизированной воды, содержащей SiO2, Al2O3, TiO3, Fe2O3, CaO, Na2O, K2O, и LiO, STC). Мезенхимальные стволовые клетки, полученные из человеческой пуповины, выделяли и промывали, и мононуклеарные клетки инокулировали в 6-луночный планшет (чашку) в количестве 1×104 клеток, и поддерживали и инкубировали при 37°С и 5% CO2.
Стволовые клетки с индуцированной плюрипотентностью, анализировали в отношении того, экспрессируют ли они стадиеспецифический эмбриональный антиген 4 (SSEA-4), щелочную фосфатазу, ОСТ4 и SOX2 в качестве специфических для эмбриональных стволовых клеток белков путем использования антител к ним и способа иммунохимического окрашивания. Во время процесса окрашивания клетки сначала фиксировали путем использования 4% параформальдегида и промывали PBS, и блокировали 1% раствором BSA. Клетки обрабатывали первичными антителами против ОСТ4, SOX2 и SSEA-4, и реакцию осуществляли при 4°С в течение 18 часов, и затем промывали PBS, обрабатывали вторичными антителами с флуоресценцией (FITC) против первичных антител, и подвергали реакции при комнатной температуре в течение 1 часа. Клетки промывали PBS, и затем экспрессию анализировали путем использования конфокального микроскопа, и результат проиллюстрирован на Фиг. 20. BF обозначает светлое поле, на втором изображении показан результат окрашивания для определения белковой экспрессии, а на третьем изображении показано объединение двух изображений (см. Фиг. 21А, 21В, 22А и 22В).
Окрашивание АР осуществляли с использованием проницаемого для клеток флуорогенного субстрата-красителя для щелочной фосфатазы, где флуорогенный краситель для АР разбавляли в культуральном растворе DMEM F-12, которым обрабатывали колонии, и затем подвергали реакции в течение от 20 до 30 мин, дважды промывали культуральным раствором DMEM F-12, и экспрессию анализировали путем использования конфокального микроскопа, и результат проиллюстрирован на Фиг. 22В.
В результате в экспериментальной группе обнаружили, что только когда концентрация биэкольного соединения 1, представленного химической формулой 1, составляла от 50 до 100 мкг/мл, образовывались колонии через 14 суток (см. Фиг. 20), и подтвердили, что только колонии, окрашиваемые ОСТ4, SOX2, SSEA-4 и АР в качестве маркеров, специфических для плюрипотентных стволовых клеток, представляют собой плюрипотентные стволовые клетки (см. Фиг. 21 и 22).
Claims (31)
1. Композиция среды для дедифференцировки мезенхимальных стволовых клеток в стволовые клетки с индуцированной плюрипотентностью, содержащая фракцию флоротаннина, где фракция флоротаннина содержит одно или более соединений, выбранных из группы, состоящей из биэкольного соединения, представленного химической формулой 1
[Химическая формула 1]
флорофукофуроэкольного соединения, представленного химической формулой 3,
[Химическая формула 3]
основанного на эколе соединения, представленного химической формулой 4
[Химическая формула 4]
и основанного на эколе соединения, представленного химической формулой 5
[Формула 5]
или их солей.
2. Композиция среды по п. 1, где фракция флоротаннина экстрагирована и выделена из одного из видов бурых водорослей, выбранных из группы, состоящей из Ecklonia cava, Dictyopteris prolifera Okamura, Dictyota dichotoma Lamouroux, Sargassum horneri C. Agardh, Sargassum patens C. Agardh и Ishige okamurae Yendo, или искусственно синтезирована.
3. Композиция среды по п. 1, где фракция флоротаннина включена в среду, выбранную из группы, состоящей из DMEM (среда Игла, модифицированная Дульбекко), MEM (минимальная поддерживающая среда), ВМЕ (базальная среда Игла), RPMI 1640, F-10, F-12, DMEM F-12, α-МЕМ (α-минимальная поддерживающая среда), G-MEM (минимальная поддерживающая среда Глазго), IMDM (среда Дульбекко, модифицированная по способу Исков), среды MacCoy's 5А, полной среды AminoMax II и среды MesenCult-XF.
4. Композиция среды по п. 1, где фракция флоротаннина включена в количестве от 10 до 500 мкг/мл относительно композиции среды.
5. Композиция среды по п. 1, дополнительно содержащая от 1 до 10% об./об. очищенной деионизированной воды, содержащей SiO2, Al2O3, TiO3, Fe2O3, СаО, Na2O, K2O, и LiO.
6. Способ получения стволовых клеток с индуцированной плюрипотентностью, включающий: добавление фракции флоротаннина в клеточную культуральную среду и дедифференцировку мезенхимальных стволовых клеток, полученных без повреждения эмбрионов, в стволовые клетки с индуцированной плюрипотентностью в этой среде, где фракция флоротаннина содержит одно или более соединений, выбранных из группы, состоящей из биэкольного соединения, представленного химической формулой 1
[Химическая формула 1]
флорофукофуроэкольного соединения, представленного химической формулой 3,
[Химическая формула 3]
основанного на эколе соединения, представленного химической формулой 4
[Химическая формула 4]
и основанного на эколе соединения, представленного химической формулой 5
[Формула 5]
или их солей.
7. Способ по п. 6, где фракция флоротаннина экстрагирована и выделена из одного из видов бурых водорослей, выбранных из группы, состоящей из Ecklonia cava, Dictyopteris prolifera Okamura, Dictyota dichotoma Lamouroux, Sargassum horneri C. Agardh, Sargassum patens C. Agardh и Ishige okamurae Yendo, или искусственно синтезирована.
Applications Claiming Priority (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR20140062526 | 2014-05-23 | ||
| KR10-2014-0062526 | 2014-05-23 | ||
| KR10-2015-0071240 | 2015-05-21 | ||
| KR1020150071240A KR101699761B1 (ko) | 2014-05-23 | 2015-05-21 | 플로로탄닌 분획물을 이용한 중간엽 줄기세포로부터 유도만능 줄기세포를 제조하는 방법 |
| PCT/KR2015/005183 WO2015178728A1 (ko) | 2014-05-23 | 2015-05-22 | 플로로탄닌 분획물을 이용한 중간엽 줄기세포로부터 유도만능 줄기세포를 제조하는 방법 |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2016150687A RU2016150687A (ru) | 2018-06-25 |
| RU2016150687A3 RU2016150687A3 (ru) | 2018-06-25 |
| RU2668803C2 true RU2668803C2 (ru) | 2018-10-02 |
Family
ID=54883407
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2016150687A RU2668803C2 (ru) | 2014-05-23 | 2015-05-22 | Способ получения стволовых клеток с индуцированной плюрипотентностью из мезенхимальных стволовых клеток путем использования фракции флоротаннина |
Country Status (24)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US10131881B2 (ru) |
| EP (1) | EP3147352B1 (ru) |
| JP (1) | JP6839982B2 (ru) |
| KR (1) | KR101699761B1 (ru) |
| CN (1) | CN105960452B (ru) |
| AU (1) | AU2015262123B2 (ru) |
| CA (1) | CA2949949C (ru) |
| CY (1) | CY1123348T1 (ru) |
| DK (1) | DK3147352T3 (ru) |
| ES (1) | ES2820577T3 (ru) |
| HR (1) | HRP20201525T1 (ru) |
| HU (1) | HUE050877T2 (ru) |
| IL (1) | IL249170A0 (ru) |
| LT (1) | LT3147352T (ru) |
| MX (1) | MX380687B (ru) |
| MY (1) | MY179152A (ru) |
| PH (1) | PH12016502330B1 (ru) |
| PL (1) | PL3147352T3 (ru) |
| PT (1) | PT3147352T (ru) |
| RS (1) | RS60817B1 (ru) |
| RU (1) | RU2668803C2 (ru) |
| SG (1) | SG11201609804RA (ru) |
| SI (1) | SI3147352T1 (ru) |
| SM (1) | SMT202000487T1 (ru) |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SG11201508796SA (en) | 2013-11-01 | 2015-11-27 | Bbhc Co Ltd | Method for producing induced pluripotent stem cell from mesenchymal stem cell and induced pluripotent stem cell produced by the method |
| KR101966315B1 (ko) * | 2017-04-26 | 2019-04-08 | 제주대학교 산학협력단 | 감태 추출물과 괭생이모자반 추출물을 이용한 면역억제용 조성물 |
| WO2020116890A1 (ko) * | 2018-12-05 | 2020-06-11 | 주식회사 보타메디 | 플로로탄닌을 유효성분으로 포함하는 음식 향미 개선용 조성물 |
| WO2021145742A1 (ko) * | 2020-01-17 | 2021-07-22 | 주식회사 만나스 | 플로로탄닌을 유효성분으로 포함하는 운동 기능 개선용 조성물 |
| CN111557869A (zh) * | 2020-06-19 | 2020-08-21 | 湖北楚天香妆生物科技有限公司 | 昆布提取物的应用 |
| CN114438037B (zh) * | 2022-01-25 | 2024-06-04 | 深圳市乐土生物医药有限公司 | 一种制备诱导性间充质干细胞的方法 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20070077201A1 (en) * | 2004-09-29 | 2007-04-05 | Reading Christopher L | Stem cell expansion and uses |
| WO2009157610A1 (en) * | 2008-06-26 | 2009-12-30 | Pusan National University Industry-University Cooperation Foundation | Selenium dedifferentiated cell, preparation method and usage thereof |
| WO2012035539A1 (en) * | 2010-09-15 | 2012-03-22 | Ramot At Tel-Aviv University Ltd. | Methods of expanding and redifferentiating islet beta cells |
Family Cites Families (15)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5818874A (ja) * | 1981-07-28 | 1983-02-03 | Shin Kobe Electric Mach Co Ltd | 鉛蓄電池の製造法 |
| JP2932660B2 (ja) | 1990-10-09 | 1999-08-09 | 松下電器産業株式会社 | スクリーン印刷用スキージ装置 |
| JP4146146B2 (ja) | 2002-03-25 | 2008-09-03 | 熊本県 | フロロタンニン類を主成分とする抗菌剤 |
| EP2500413A1 (en) * | 2006-09-13 | 2012-09-19 | Abbott Laboratories | Cell culture improvements |
| JP2010030917A (ja) * | 2008-07-25 | 2010-02-12 | Guraiko Materials:Kk | 肝炎予防剤又は肝炎治療剤 |
| CN101748096B (zh) * | 2008-12-17 | 2013-03-13 | 北京汉氏联合生物技术有限公司 | 亚全能干细胞、其制备方法及其用途 |
| KR101166257B1 (ko) | 2009-06-16 | 2012-07-19 | 한국생명공학연구원 | 미분화 다능성줄기세포의 제작, 유지 및 증식을 위한 뉴로펩타이드 ｙ를 포함하는 배지 조성물 및 이를 이용한 다능성줄기세포의 배양 방법 |
| KR101807704B1 (ko) | 2011-04-12 | 2017-12-13 | 차의과학대학교 산학협력단 | 역분화-증진제를 이용한 역분화 만능 줄기세포의 제조방법 |
| US20150072416A1 (en) | 2012-05-29 | 2015-03-12 | Korea Research Institute Of Bioscience And Biotech | Metabolite for improving production, maintenance and proliferation of pluripotent stem cells, composition comprising the same, and method of culturing pluripotent stem cell using the same |
| KR101544195B1 (ko) | 2013-11-01 | 2015-08-12 | 주식회사 비비에이치씨 | 중간엽 줄기세포로부터 유도만능 줄기세포를 제조하는 방법 및 그 방법에 의해 제조된 유도만능 줄기세포 |
| KR101542849B1 (ko) * | 2013-11-01 | 2015-08-10 | 주식회사 비비에이치씨 | 중간엽 줄기세포로부터 유도된 만능 줄기세포를 이용하여 간세포로 분화시키는 방법 |
| KR101542850B1 (ko) * | 2013-11-01 | 2015-08-10 | 주식회사 비비에이치씨 | 중간엽 줄기세포로부터 유도된 만능 줄기세포를 이용하여 지방세포로 분화시키는 방법 |
| KR101542848B1 (ko) * | 2013-11-01 | 2015-08-10 | 주식회사 비비에이치씨 | 중간엽 줄기세포로부터 유도된 만능 줄기세포를 이용하여 골아세포로 분화시키는 방법 |
| KR101542846B1 (ko) * | 2013-11-01 | 2015-08-10 | 주식회사 비비에이치씨 | 중간엽 줄기세포로부터 유도된 만능 줄기세포를 이용하여 연골세포로 분화시키는 방법 |
| KR101542847B1 (ko) * | 2013-11-01 | 2015-08-10 | 주식회사 비비에이치씨 | 중간엽 줄기세포로부터 유도된 만능 줄기세포를 이용하여 신경세포로 분화시키는 방법 |
-
2015
- 2015-05-21 KR KR1020150071240A patent/KR101699761B1/ko active Active
- 2015-05-22 MY MYPI2016704340A patent/MY179152A/en unknown
- 2015-05-22 HR HRP20201525TT patent/HRP20201525T1/hr unknown
- 2015-05-22 HU HUE15795825A patent/HUE050877T2/hu unknown
- 2015-05-22 CA CA2949949A patent/CA2949949C/en active Active
- 2015-05-22 ES ES15795825T patent/ES2820577T3/es active Active
- 2015-05-22 CN CN201580007099.0A patent/CN105960452B/zh active Active
- 2015-05-22 DK DK15795825.7T patent/DK3147352T3/da active
- 2015-05-22 US US15/116,210 patent/US10131881B2/en active Active
- 2015-05-22 AU AU2015262123A patent/AU2015262123B2/en active Active
- 2015-05-22 PL PL15795825T patent/PL3147352T3/pl unknown
- 2015-05-22 MX MX2016015357A patent/MX380687B/es unknown
- 2015-05-22 RU RU2016150687A patent/RU2668803C2/ru active
- 2015-05-22 JP JP2016548353A patent/JP6839982B2/ja active Active
- 2015-05-22 RS RS20201114A patent/RS60817B1/sr unknown
- 2015-05-22 SM SM20200487T patent/SMT202000487T1/it unknown
- 2015-05-22 EP EP15795825.7A patent/EP3147352B1/en active Active
- 2015-05-22 PT PT157958257T patent/PT3147352T/pt unknown
- 2015-05-22 LT LTEP15795825.7T patent/LT3147352T/lt unknown
- 2015-05-22 SI SI201531351T patent/SI3147352T1/sl unknown
- 2015-05-22 SG SG11201609804RA patent/SG11201609804RA/en unknown
-
2016
- 2016-11-23 IL IL249170A patent/IL249170A0/en active IP Right Grant
- 2016-11-23 PH PH12016502330A patent/PH12016502330B1/en unknown
-
2020
- 2020-09-21 CY CY20201100887T patent/CY1123348T1/el unknown
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20070077201A1 (en) * | 2004-09-29 | 2007-04-05 | Reading Christopher L | Stem cell expansion and uses |
| WO2009157610A1 (en) * | 2008-06-26 | 2009-12-30 | Pusan National University Industry-University Cooperation Foundation | Selenium dedifferentiated cell, preparation method and usage thereof |
| WO2012035539A1 (en) * | 2010-09-15 | 2012-03-22 | Ramot At Tel-Aviv University Ltd. | Methods of expanding and redifferentiating islet beta cells |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| RYU B. et al. "Differentiation of human osteosarcoma cells by isolated phlorotannins is subtly linked to COX-2, iNOS, MMPs, and MARK signaling: implication for chronic articular disease", Chem Biol Interact. 2009; 179(2-3):192-201. * |
| RYU B. et al. "Differentiation of human osteosarcoma cells by isolated phlorotannins is subtly linked to COX-2, iNOS, MMPs, and MARK signaling: implication for chronic articular disease", Chem Biol Interact. 2009; 179(2-3):192-201. Биология стволовых клеток и клеточные технологии. Том 1 / Под ред. М.А. Пальцева. - М.: ОАО "Издательство "Медицина", издательство "Шико", 2009. - 272 с. * |
| Биология стволовых клеток и клеточные технологии. Том 1 / Под ред. М.А. Пальцева. - М.: ОАО "Издательство "Медицина", издательство "Шико", 2009. - 272 с. * |
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RU2668803C2 (ru) | Способ получения стволовых клеток с индуцированной плюрипотентностью из мезенхимальных стволовых клеток путем использования фракции флоротаннина | |
| CN105683359B (zh) | 将从间充质干细胞诱导的多能干细胞分化为肝细胞的方法 | |
| CN105705632B (zh) | 将从间充质干细胞诱导的多能干细胞分化为软骨细胞的方法 | |
| JP6711759B2 (ja) | 間葉系幹細胞から誘導された万能幹細胞を利用して神経細胞に分化させる方法 | |
| US11186828B2 (en) | Method of making human cells expressing OCT4, SOX2, and Nanog using an Ecklonia cava extract | |
| CN105683358B (zh) | 将从间充质干细胞诱导的多能干细胞分化为脂肪细胞的方法 | |
| CN105705631B (zh) | 将从间充质干细胞诱导的多能干细胞分化为造骨细胞的方法 | |
| KR101544195B1 (ko) | 중간엽 줄기세포로부터 유도만능 줄기세포를 제조하는 방법 및 그 방법에 의해 제조된 유도만능 줄기세포 | |
| CN105264066B (zh) | 由间充质干细胞生产诱导性多能干细胞的方法以及由该方法生产的诱导性多能干细胞 | |
| KR101982835B1 (ko) | 중간엽 줄기세포로부터 유도된 만능 줄기세포를 췌장의 베타세포로 분화시키는 방법 | |
| WO2016088932A1 (ko) | 지방-유래 중간엽 줄기세포로부터 유도만능 줄기세포를 제조하여 지방세포로 분화시키는 방법 |