[go: up one dir, main page]

RU2668154C2 - Нуклеиново-кислотный зонд - Google Patents

Нуклеиново-кислотный зонд Download PDF

Info

Publication number
RU2668154C2
RU2668154C2 RU2016112354A RU2016112354A RU2668154C2 RU 2668154 C2 RU2668154 C2 RU 2668154C2 RU 2016112354 A RU2016112354 A RU 2016112354A RU 2016112354 A RU2016112354 A RU 2016112354A RU 2668154 C2 RU2668154 C2 RU 2668154C2
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
probe
nucleic acid
target nucleic
sequence
sample
Prior art date
Application number
RU2016112354A
Other languages
English (en)
Other versions
RU2016112354A (ru
Inventor
Моника Ивона СУВАРА
Саджид ДЖЕЙВИД
Элизабет Энн ГИЛЛИС
Original Assignee
Маст Груп Лимитед
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Маст Груп Лимитед filed Critical Маст Груп Лимитед
Publication of RU2016112354A publication Critical patent/RU2016112354A/ru
Application granted granted Critical
Publication of RU2668154C2 publication Critical patent/RU2668154C2/ru

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
    • C12Q1/6825—Nucleic acid detection involving sensors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2531/00—Reactions of nucleic acids characterised by
    • C12Q2531/10—Reactions of nucleic acids characterised by the purpose being amplify/increase the copy number of target nucleic acid
    • C12Q2531/101—Linear amplification, i.e. non exponential
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2531/00—Reactions of nucleic acids characterised by
    • C12Q2531/10—Reactions of nucleic acids characterised by the purpose being amplify/increase the copy number of target nucleic acid
    • C12Q2531/119—Strand displacement amplification [SDA]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2533/00—Reactions characterised by the enzymatic reaction principle used
    • C12Q2533/10—Reactions characterised by the enzymatic reaction principle used the purpose being to increase the length of an oligonucleotide strand
    • C12Q2533/101—Primer extension
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2563/00—Nucleic acid detection characterized by the use of physical, structural and functional properties
    • C12Q2563/107—Nucleic acid detection characterized by the use of physical, structural and functional properties fluorescence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2565/00—Nucleic acid analysis characterised by mode or means of detection
    • C12Q2565/10—Detection mode being characterised by the assay principle
    • C12Q2565/107—Alteration in the property of hybridised versus free label oligonucleotides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/16—Primer sets for multiplex assays

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Изобретение относится к биотехнологии. Изобретение включает новые зонды для изотермической амплификации нуклеиновой кислоты и способы обнаружения последовательности-мишени нуклеиновой кислоты с использованием этих зондов. Зонды содержат последовательность олигонуклеотидного зонда, комплементарную области последовательности нуклеиновой кислоты-мишени. Последовательность олигонуклеотидного зонда имеет только одну флуорофорную метку, связанную с внутренним цитозиновым основанием, и не имеет терминатора на 3'-конце. Цитозиновое основание центрально расположено по длине олигонуклеотида, за исключением позиций 1-3 на 3'-конце и позиции 1 на 5'-конце. Данные зонды могут быть использованы для выявления хламидийной и гонорейной инфекций у пациента. 4 н. и 17 з.п. ф-лы, 12 ил., 1 табл., 12 пр.

Description

Настоящее изобретение относится к зонду для обнаружения нуклеиновой кислоты, способу с использованием упомянутого зонда и набору компонентов. Предпочтительно зонд по настоящему изобретению является применимым в способе обнаружения нуклеиновых кислот, происходящих из Chlamydia trachomatis и/или Neisseria gonorrhoeae, и может быть использован в диагностике хламидийной и/или гонорейной инфекций.
Амплификация нуклеиновых кислот является одним из наиболее ценных инструментов в области наук о жизни, включая такие ориентированные на практическое применение области, как клиническая медицина, где диагностика инфекционных заболеваний, генетических нарушений и генетических признаков особенно полезна. В дополнение к широко используемой детекции, основанной на ПЦР (полимерной цепной реакции, PCR, Saiki R.K., Scharf, S., Faloona, F., Mullis, K.B., Hom, G.T., Erlich, H.A. and Amheim, N. (1985) Science, 230, 1350-1354), было изобретено несколько способов амплификации. Примеры включают реакцию амплификации, основанной на последовательности нуклеиновой кислоты (nucleic acid sequence-based amplification (NASBA)), самоподдерживающуюся репликацию последовательности (self-sustained sequence replication (3SR)) и петлевую изотермическую амплификацию (loop-mediated isothermal amplification (LAMP)). ПЦР использует тепловую денатурацию двухцепочечных ДНК-продуктов с тем, чтобы способствовать следующему раунду синтеза ДНК. При 3SR и NASBA удается обходиться без тепловой денатурации, используя набор реакций транскрипции и обратной транскрипции для амплификации последовательности-мишени.
Данные способы могут обеспечивать одинаковую степень амплификации нуклеиновых кислот-мишеней, причем все способы характеризуются порогом обнаружения в менее 10 копий, причем для анализов достаточно часа или около того. Данные способы требуют либо точных приборов для амплификации, либо сложных способов для обнаружения амплифицированных продуктов из-за плохой специфичности при селекции последовательности-мишени. Несмотря на простоту и высокую степень амплификации, требование высокой точности к термоциклеру при ПЦР препятствует широкому применению данного мощного способа, например, в частных клиниках в качестве рутинного диагностического прибора. В противоположность этому, LAMP представляет собой способ, который может амплифицировать несколько копий ДНК до более 100 менее чем за час в изотермических условиях и с большей специфичностью.
Наряду с другими, упомянутыми выше технологиями, основанными на применении молекулярных зондов, анализы, основанные на петлевой изотермический амплификации (loop-mediated isothermal amplification, LAMP), могут использоваться для обнаружения присутствия специфических микроорганизмов в образце. Однако, данные способы обнаружения основаны на непосредственном визуальном обнаружении, оценке мутности или использовании неспецифичного ДНК-интеркалирующего красителя. Непосредственное визуальное измерение представляет собой измерение в конечной точке и не в состоянии обеспечить анализ в реальном времени. Измерение мутности и неспецифические интеркалирующие красители действительно обеспечивают анализ происходящей амплификации в реальном времени, который, однако, является неспецифическим, т.е. детектируется вся амплификация, будь то истинная положительная амплификация или ложная амплификация из-за ошибочного праймирования, перекрестной специфичности.
В соответствии с первым аспектом настоящего изобретения обеспечен зонд для применения при изотермической амплификации нуклеиновой кислоты, содержащий последовательность олигонуклеотидного зонда, комплементарную области целевой последовательности нуклеиновой кислоты, где упомянутая последовательность олигонуклеотидного зонда имеет только один флуорофор-лиганд, и данный лиганд связан с внутренним цитозиновым основанием, и где упомянутая последовательность олигонуклеотидного зонда не имеет терминатора на 3'-конце.
В предпочтительном варианте осуществления последовательность олигонуклеотидного зонда представляет собой ДНК-последовательность и целевая последовательность нуклеиновой кислоты представляет собой ДНК-последовательность.
Предпочтительно, флуоресценция увеличивается в том случае, когда надо указать на присутствие нуклеиновой кислоты-мишени в образце.
Предпочтительно, цитозиновое основание, по существу, центрально расположено по длине олигонуклеотида. Имеются определенные преимущества, связанные со внутренним мечением зонда по цитозиновому основанию. Специфичность ДНК-продукта, амплифицированного в изотермической реакции, может быть подтверждена с помощью анализа кривой плавления. Однако, из-за большого количества вариантов продукта, получаемых в данной реакции и низкого разрешения анализа кривой плавления с использованием интеркалирующих красителей, подобных V13, очень трудно различать специфические и неспецифические ДНК-продукты, полученные в изотермических условиях. Обычно используемые зонды, такие как зонд TaqMan®, не совместимы с LAMP-технологией в связи с активностью замещения цепи BST-полимеразы. Зонд по изобретению удлинен и оказывается включенным в ДНК-продукт в процессе изотермической амплификации, что позволяет осуществлять анализ кривой плавления на полученном продукте. В зонде по изобретению флуорофор конъюгирован с внутренним цитозином, комплементарным гуанину в антисмысловой цепи. Гуанин влияет на возбужденное состояние многих флуорофоров, что приводит к образованию уникальных "подписей" кривых плавления и позволяет различать специфические и неспецифические продукты, образующиеся в изотермических условиях.
Олигонуклеотид не содержит ддНТФ (дидезоксинуклеозидтрифосфата) с 3'-конца, что позволяет включение меченого олигонуклеотида в ампликон. Таким образом, 3'-конец зонда не "заблокирован".
Флуорофор может содержать любое одно или более из следующих: FAM, JOE, ТЕТ, HEX, TAMRA, ROX, ALEXA и АТТО.
Зонд может содержать следующую последовательность:
5' Xn С* Xm 3' (SEQ ID NO. 1)
где n>1, m>3, X представляет собой нуклеотидное основание; и * представляет собой флуорофор. Предпочтительно, нуклеотидное основание выбрано из А, Т, С и G. Предпочтительно, n более чем от 1 до 20 или менее, более предпочтительно более чем от 1 до 10 или менее. Предпочтительно, m более, чем от 3 до 20 или менее, более предпочтительно более чем от 3 до 10 или менее. Предполагается, что вышеупомянутые интервалы значений раскрывают все комбинации длин зонда, охватываемые возможными значениями числа нуклеотидов, которые n или m могут принимать.
Предпочтительно, зонд может содержать последовательность, выбранную из любой из следующих последовательностей:
SEQ ID NO.3:
Figure 00000001
SEQ ID NO.5:
Figure 00000002
Figure 00000003
or
SEQ ID NO.6:
Figure 00000004
Флуоресценция предпочтительно увеличивается, когда олигонуклеотид включается в последовательность нуклеиновой кислоты-мишени, что приводит к изменению в конфигурации комплекса ампликон-зонд, приводящему к изменению возбужденного состояния флуорофора.
Цитозин, связанный с флуорофором-лигандом, не расположен на 5'- или 3'-конце или в непосредственной близости к 5'- или 3'-концу. Более предпочтительно он не расположен в позиции, соответствующей первым 3 основаниям либо от 5'-, либо от 3'-конца. Предпочтительно цитозин, связанный с флуорофором, расположен в позиции, соответствующей основанию, расположенному посредине зонда.
В соответствии с еще одним аспектом настоящего изобретения, обеспечивается зонд для изотермической амплификации нуклеиновой кислоты, как описано выше.
В соответствии с еще одним аспектом настоящего изобретения, обеспечивается зонд для петлевой изотермический амплификации, как описано выше.
Способы и композиции для определения по меньшей мере одной нуклеиновой кислоты-мишени в смеси нуклеиновых кислот, как правило, используют зонд, реагент гибридизации, а также один или более образующих фосфатную связь ферментов, ассоциированных с любыми требуемыми нуклеозидтрифосфатами, чтобы образовать цепь нуклеиновой кислоты.
Данные способы обычно включают амплификацию, такую, как включающую использование промотора вместе с РНК-полимеразой, сайта рестрикции, когда только одна цепь расщепляется и затем вытесняется удлинением с помощью ДНК-полимеразы, или реагента циклической гибридизации, когда производятся сцепленные повторы. Обнаружение амплифицированной нуклеиновой кислоты может осуществляться различными способами, но предпочтительно осуществляется с помощью флуорофора.
В соответствии с еще одним аспектом настоящего изобретения обеспечивается способ обнаружения нуклеиновой кислоты-мишени в образце, включающий:
a. амплификацию нуклеиновой кислоты-мишени в образце, чтобы обеспечить амплифицированную нуклеиновую кислоту;
b. зондирование амплифицированной нуклеиновой кислоты с помощью зонда, как описано выше; и
c. обнаружение присутствия одной или нескольких нуклеиновых кислот-мишеней. Нуклеиновая кислота-мишень может быть нуклеиновой кислотой из
микроорганизмов, грибов, дрожжей, вирусов, человека, животных, растений и т.д. Нуклеиновая кислота-мишень для LAMP, как известно, допускает синтез LAMP-праймеров и соответствующих специфичных зондов. Таким образом, может быть определено наличие или отсутствие упомянутых микроорганизмов, грибов, дрожжей, вирусов, человека, животных, растений в образце. Предпочтительно нуклеиновая кислота-мишень происходит из Chlamydia trachomatis или Neisseria gonorrhoeae.
Предпочтительно, флуоресценция увеличивается, что указывает на присутствие нуклеиновой кислоты-мишени в образце.
Процесс является изотермическим и позволяет проведение амплификации в одну стадию или последовательными стадиями в одном сосуде, где все реагенты совместимы.
В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к способу диагностики хламидиоза и/или гонореи у пациента, включающему
предоставление образца, полученного от пациента;
добавление одного или более зондов по настоящему изобретению к образцу; и детектирование присутствия нуклеиновой кислоты, полученной из Chlamydia trachomatis или Neisseria gonorrhoeae, причем увеличение флуоресценции зонда указывает на наличие инфекции Chlamydia trachomatis и/или Neisseria gonorrhoeae.
Образец может быть обработан обычными способами для того, чтобы зонд связывался с любым нуклеотидом-мишенью, присутствующим в образце. Такая обработка может включать в себя центрифугирование и лизис образца, чтобы высвободить любую нуклеиновую кислоту-мишень из инфицирующего микроорганизма.
В одном варианте осуществления один тип зонда, специфичного для нуклеиновой кислоты либо из Chlamydia trachomatis либо из Neisseria gonorrhoeae, используется в способе, так что в образце детектируется либо только Chlamydia trachomatis, либо только Neisseria gonorrhoeae.
В предпочтительном варианте осуществления к образцу добавляют по меньшей мере два различных зонда, причем первый зонд помечен первой флуоресцентной меткой и является специфическим для зондирования нуклеиновой кислоты Chlamydia trachomatis и второй зонд помечен флуоресцентной меткой, отличающейся от метки первого зонда, и является специфическим для зондирования нуклеиновой кислоты Neisseria gonorrhoeae. В данном варианте осуществления можно одновременно обнаружить хламидийную и гонорейную инфекцию в одном образце, взятом у пациента.
В одном аспекте способа по настоящему изобретению образец от пациента может представлять собой образец крови, образец мочи, образец сыворотки или образец слюны.
В соответствии с еще одним аспектом настоящего изобретения, обеспечивается набор, включающий зонд, как описано выше, буфер для проведения LAMP-реакции, содержащий фермент полимеразу, дНТФ и LAMP-праймеры для мишени.
В одном варианте осуществления положительный и отрицательный контроль могут быть включены в набор. Реагенты могут быть представлены в виде влажных реагентов или в лиофилизированной форме.
Буфер, используемый в способе или наборе по настоящему изобретению, включает в себя дНТФ в концентрации от 1 до 10 мМ, одну или более солей в концентрации от 2 до 20 мМ, Трис-буфер рН 8,8 в концентрации от 10 до 100 мМ, трегалозу в концентрации от 10 до 100 мМ, BST-полимеразу в количестве от 1Е до 12Е и от 0,01% до 1% 1,2-пропандиола.
Сокращения
СТ - Chlamydia trachomatis
GC - Neisseria gonorrhoeae
GlnA7 - глутаминсинтетаза
PorA7 - пориновый белок А7
LAMP - петлевая изотермическая амплификация
ПЦР - полимеразная цепная реакция.
Настоящее изобретение будет описано, только в качестве примера, со ссылкой на следующие примеры и фигуры.
LAMP-реакция
Основанную на V13 детекцию СТ и GT ДНК-мишени LAMP-реакцией проводили с использованием LAMP-реакционного буфера V6.21, разработанного заявителем. Основанную на применении зонда детекцию ДНК-мишени проводили в V6.21p (без V13). Концентрации LAMP-праймеров были следующими: СТ РВ1 - 0,8 мкМ FIP & BIP праймера, 0,2 мкМ F3 & В3 и 0,4 мкМ Loop-праймеров, GC porA7 и GC glnA7 - 2 мкМ FIP & BIP праймера, 0,25 мкМ F3 & В3 и 0,5 мкМ Loop-праймеров. Все зонды использовали при конечной концентрации 0,625 мкМ. LAMP-реакции проводили в течение 60 мин при постоянной температуре 63°C с использованием прибора ABI7500 для проведения ПЦР в реальном времени. Показания флуоресцентного сигнала были получены в канале SybrGreen/FAM, Joe или Су3, в зависимости от обстоятельств.
Последовательности зондов
SEQ ID NO.2:
Figure 00000005
SEQ ID NO.3:
Figure 00000006
SEQ ID NO.4:
Figure 00000007
SEQ ID NO.5:
Figure 00000008
Figure 00000009
SEQ ID NO.6:
Figure 00000010
или
SEQ ID NO.7:
Figure 00000011
Целевые последовательности
Целевые последовательности ДНК, используемые в примерах, представляют собой
SEQ ID NO: 8: полная последовательность плазмиды pSotonGl Chlamydia trachomatis G/SotonG1 (GenBank: HE603235.1)
Figure 00000012
Figure 00000013
Figure 00000014
SEQ ID NO: 9: частичный ген porA для белка класса 1 наружной мембраны Neisseria gonorrhoeae, изолят GC3 (GenBank: НЕ681886.1)
Figure 00000015
SEQ ID NO: 10: ген глутаминсинтетазы (glnA), аллель glnA-14, Neisseria gonorrhoeae частичная cds (GenBank: AF520262.1)
Figure 00000016
Последовательности праймеров, используемые в LAMP-реакции, являются следующими:
СТ плазмида
Figure 00000017
GC porA7
Figure 00000018
GC glnA7
Figure 00000019
Буфер
Заявитель разработал буферную систему для использования с зондами по изобретению, которая обозначается V6.21 (или V6.21p без присутствующего красителя V13) в следующих примерах. Концентрации буферных компонентов после восстановления буфера:
V6.21
от 4 до 10 мМ дНТФ, 10 мМ соли, 30 мМ Трис рН 8,8, 30 мМ трегалозы, от 1 до 8Е Bst-полимеразы, краситель и 0,05% пропандиола.
V6.21p
от 4 до 10 мМ дНТФ, 10 мМ соли, 30 мМ Трис рН 8,8, 30 мМ трегалозы, от 1 до 8Е Bst-полимеразы и 0,05% пропандиола. ПЦР
Обнаружение CT/GC в клинических образцах с помощью ПЦР в реальном времени проводили с использованием анализа APTIMA CT/GC multiplex (Gen-Probe) в соответствии с инструкциями изготовителя.
Электрофорез в агарозном геле
Электрофорез ДНК проводили в 1% агарозном геле в 1×TAE буфере при 100 В. ДНК-продукты LAMP-реакции визуализировали с GelRed (Invitrogen) с трансиллюминатором.
Буферы V6.21 и V6.21p были разработаны заявителем. LAMP-праймеры были получены от Eurofins. Меченные флуорофором олигонуклеотиды были приобретены у компании Integrated DNA technologies. Трис-буфер, агарозный гель и вода ПЦР-класса были приобретены у компании Sigma. Стандарты СТ и GC ДНК были получены от АТСС.
Фигуры
На фигуре 1 представлена схема ДНК-зонда по настоящему изобретению. Зонд состоит из олигонуклеотида с внутренним цитозином, конъюгированным с определенным флуорофором. Зонд может быть комплементарным к внутренней области ампликона, фланкированной праймерами FIP и BIP, или он может представлять собой модифицированный праймер LoopF или LoopB, изнутри меченный флуорофором.
Пример 1
На фигурах от 2А до 2F приведены графики амплификации, полученные с СТ РВ1-праймерами (фигура 2А и фигура 2D), GC glnA7-праймерами (фигура 2В и фигура 2Е) и GC porA7-праймерами (фигура 2С и фигура 2F) в буфере V6.21, содержащем V13 (фигуры 2А, 2В и 2С), или буфере V6.21p без красителя V13 (фигуры 2D, 2Е и 2F). Целевые последовательности показаны в SEQ ID NO: от 8 до 10, с СТ РВ1-внутренним зондом, конъюгированным с FAM, GC glnA7-петлевым зондом, конъюгированным с Joe, и GC porA7-петлевым зондом, конъюгированным с Alexa546, соответственно. Все реакции проводили в течение 60 мин при постоянной температуре 63°C с прибором ABI7500.
Пример 2
Фигуры 3А и 3В представляют собой анализы кривых плавления LAMP-продуктов, образующихся с праймерами СТ РВ1 в присутствии СТ РВ1-внутреннего зонда, конъюгированного с FAM. 100 пг на реакцию стандартной АТТС СТ ДНК использовали в качестве положительного контроля. А - нормированный репортерный график, В -производный репортерный график. Графики кривых плавления были получены на основе считываний в канале FAM с прибором ABI7500.
Пример 3
На фигурах 4А и В представлены анализы кривых плавления LAMP-продукта, образовавшегося с праймерами GC glnA7 в присутствии GC glnA7-петлевого зонда, конъюгированного с JOE. 100 пг на реакцию стандартной АТТС GC ДНК использовали в качестве положительного контроля. На фигуре 4А приведен нормированный репортерный график, и на фигуре 4 В приведен производный репортерный график. Графики кривых плавления были получены на основе считываний в канале JOE с прибором ABI7500.
Пример 4
Фигуры 5А и 5В представляют собой анализы кривых плавления LAMP-продукта, образовавшегося с праймерами GC porA7 в присутствии GC porA7-петлевого зонда, конъюгированного с ALEXA546. 100 пг на реакцию стандартной АТТС GC ДНК использовали в качестве положительного контроля. На фигуре 5А приведен нормированный репортерный график и на фигуре 5В производный репортерный график. Графики кривых плавления были получены на основе считываний в канале Су3 с прибором ABI7500
Пример 5
На фигурах 6A-6D показаны результаты теста для подтверждения специфичности ДНК-продукта с зондом по изобретению в петлевой изотермической амплификации. Запаздывание амплификации в ложно-положительных случаях (более чем на 30 минут относительно самой низкой концентрации ДНК-мишени, выявляемой в LAMP-реакции (100 фг GC ДНК), указывает на то, что неспецифическая амплификация может быть результатом образования димера праймера. Стандартный анализ кривой плавления не позволяет различать специфический и неспецифический продукт в данной LAMP-реакции, но неспецифический продукт может быть распознан с помощью зонда по изобретению. GC ДНК амплифицировали с помощью праймеров GC porA7 и визуализировали с помощью красителя V13 или GC porA7-ALEXA546-зондом, в зависимости от обстоятельств.
Пример 6
На фигуре 7 приведены графики амплификации, полученные с СТ РВ1-праймерами в буфере V6.21, содержащем V13, или буфере V6.21p без красителя V13, но при наличии СТ РВ1-терминального зонда (комплементарного к области петли) с внутренним С, конъюгированным с FAM, и 3'-терминатором (3'ddC). Несмотря на успешную амплификацию ДНК-мишени, подтвержденную возбуждением красителя V13 в контрольной реакции, зонд СТ РВ1 с 3'-терминатором не дает положительного сигнала.
Пример 7
На фигурах 8А и 8В приведены графики амплификации, полученные в буфере V6.21p, содержащем ROX, в присутствии СТ PB1-праймеров и СТ РВ1-терминального зонда с внутренним цитозином, конъюгированным с FAM (фигура 8А), и универсальных праймеров и зонда 3'UP с 3'-терминальным цитозином, конъюгированным с FAM (фигура 8В). Первая кривая представляет собой сигналы, генерируемые ROX, а вторая кривая соответствует сигналу, генерируемому в канале FAM. Связывание зонда с изнутри меченным цитозином с ДНК-мишенью приводит к возбуждению FAM. Связывание зонда с меченным на 3'-конце цитозином с мишенью не изменяет возбужденное состояние FAM.
Пример 8
На фигурах 9А-9С приведены графики амплификации, полученные с СТ РВ1-праймерами в буфере V6.21p без V13 в присутствии СТ РВ1-внутреннего зонда с внутренним С, конъюгированным с FAM, и эталонного красителя (ROX). На фигуре 9А приведены необработанные данные, считывания из канала FAM в первой линии и из канала ROX во второй линии. На фигуре 9В приведены графики амплификации (генерируемые в канале FAM), нормированные в отношении ROX. На фигуре 9С приведены производные репортерные графики кривых плавления.
Пример 9
На фигурах 10А-10С представлены результаты проверки специфичности зонда СТ PB1-FAM. На фигуре 10А приведены графики амплификации, полученные с помощью зонда СТ PB1-FAM в присутствии СТ ДНК и СТ-праймеров. В качестве контроля, были проведены два набора реакций, где неспецифические гены, GC glnA7 и GC porA7, амплифицировались с соответствующими LAMP-праймерами в присутствии зонда СТ PB1-FAM. При проведении эксперимента в буфере V6.21p, графики амплификации в присутствии зонда СТ РВ1 в канале FAM были получены только в том случае, когда в реакционной смеси присутствовала СТ ДНК, и сигнал не генерировался, когда амплифицировались неспецифические гены (GC glnA7 и GC porA7). Сигнал также не генерировался, когда в реакции использовали неспецифической зонд, где СТ ДНК амплифицировали с помощью СТ-праймеров. На фигуре 10С приведены данные, полученные в аналогичном эксперименте, но проведенном в буфере V6.21, содержащем интеркалирующий краситель V31. На фигуре 10С показаны ДНК-продукты, генерируемые в эксперименте, описанном на фигуре 10A.
Пример 10
На фигурах 11А и 11В представлены результаты проверки специфичности зонда СТ PB1-FAM в отношении анализа APTIMA СТ. Пятьдесят клинических образцов, подтвержденных как дающие положительный ответ (n=29) (фигура 11А) или дающие отрицательный ответ (n=21) (фигура 11В) на СТ, были протестированы в буфере V6.21p с зондом СТ PB1-FAM. Из 50 образцов 24 дали отрицательный результат (фигура 11А) и 26 дали положительный результат (фигура 11В) для СТ с зондом СТ PB1-FAM. Имелось 86%-ное согласие между тестами Aptima и СТ PB-FAM.
Пример 11
На фигурах 12А и 12В приведены графики амплификации, полученные в мультиплексе CT/GC с зондами СТ PB1-FAM+GC porA7-Alexa546. СТ и GC ДНК амплифицировали в отдельных реакциях или в конъюгировании в буфере V6.21p в присутствии зондов СТ Pb1-FAM и GC porA7-Alexa546. Считывания производились в каналах Су3 (фигура 12А) и FAM (фигура 12В). Эксперимент показал, что две ДНК-мишени могут быть амплифицированы и обнаружены в одновременном взаимодействии с зондами, меченными FAM и Alexa546, и что не было перекрестной реактивности между СТ РВ1- и GC porA7-праймерами и зондами.
Пример 12
Таблица 1 показывает результаты сравнения между V13 LAMP для СТ и GC, CT/GC Aptima и CT/GC мультиплексор (СТ PB1-FAM+GC porA7-Alexa546). ДНК, экстрагированную из 136 клинических образцов, испытывали с мультиплексом CT/GC Aptima, СТ РВ1-праймерами и GC porA7-праймерами в буфере V6.21, содержащем V13, или в мультиплексной реакции в буфере v6.21p в присутствии СТ PB1-праймеров и GC porA7-праймеров и зондов СТ PB1-FAM и GC porA7-Alexa546. В контрольном эксперименте образцы были также испытаны в симплексной реакции с зондом GC glnA7-Joe. В таблице приведены показатели степени согласия результатов между испытаниями.

Claims (30)

1. Зонд для изотермической амплификации нуклеиновой кислоты, содержащий последовательность олигонуклеотидного зонда, комплементарную области последовательности нуклеиновой кислоты-мишени, причем упомянутая последовательность олигонуклеотидного зонда имеет только одну флуорофорную метку, и данная метка связана с внутренним цитозиновым основанием, и упомянутая последовательность олигонуклеотидного зонда не имеет терминатора на 3'-конце, причем цитозиновое основание, по существу, центрально расположено по длине олигонуклеотида, за исключением позиций 1-3 на 3'-конце и позиции 1 на 5'-конце.
2. Зонд по п. 1, в котором последовательность олигонуклеотидного зонда представляет собой ДНК-последовательность и последовательность нуклеиновой кислоты-мишени представляет собой ДНК-последовательность.
3. Зонд по п. 1, в котором флуорофор включает любой один или более, выбранный из следующего: FAM, JOE, ТЕТ, HEX, TAMRA, ROX, ALEXA и АТТО.
4. Зонд по п. 3, в котором флуорофор представляет собой FAM, Joe или Alexa546.
5. Зонд по любому из пп. 1 или 4, содержащий следующую последовательность:
5' Xn С * Xm 3' (SEQ ID NO. 1),
где n>1, m>3, X представляет собой нуклеотидное основание и * представляет собой флуорофор.
6. Зонд по п. 5, в котором нуклеотидное основание выбрано из А, Т, С и G, n равен более чем 1 до 20 или менее, более предпочтительно более чем 1 до 10 или менее и m равен более чем 3 до 20 или менее, предпочтительно более чем 3 до 10 или менее.
7. Зонд по любому из пп. 1, 4 или 6, содержащий одну или более из следующих последовательностей:
Figure 00000020
8. Зонд по любому из пп. 1, 4 или 6, в котором нуклеиновая кислота-мишень происходит из микроорганизма, грибов, дрожжей или вируса.
9. Зонд для петлевой изотермический амплификации по любому из пп. 1-4, 6.
10. Способ обнаружения последовательности нуклеиновой кислоты-мишени в образце, включающий:
амплификацию нуклеиновой кислоты-мишени в образце, чтобы обеспечить амплифицированную нуклеиновую кислоту;
зондирование амплифицированной нуклеиновой кислоты зондом по любому из пп. 1-8; и
обнаружение присутствия нуклеиновой кислоты-мишени, причем увеличение флуоресценции зонда указывает на присутствие нуклеиновой кислоты-мишени в образце.
11. Способ по п. 10, в котором нуклеиновая кислота-мишень происходит из микроорганизма, грибов, дрожжей или вируса.
12. Способ по п. 10 или 11, в котором нуклеиновая кислота-мишень происходит из Chlamydia trachomatis или Neisseria gonorrhoeae.
13. Способ диагностики хламидийной и/или гонорейной инфекции у пациента, включающий:
предоставление образца, полученного от пациента;
добавление одного или более зондов по любому из пп. 1-8 к образцу; и
обнаружение присутствия нуклеиновой кислоты, происходящей из Chlamydia trachomatis и/или Neisseria gonorrhoeae, причем увеличение флуоресценции зонда указывает на наличие инфекции, вызванной Chlamydia trachomatis и/или Neisseria gonorrhoeae.
14. Способ по п. 13, в котором к образцу добавляют один тип зонда, специфичного для нуклеиновой кислоты либо из Chlamydia trachomatis, либо из Neisseria gonorrhoeae.
15. Способ по п. 13, в котором к образцу добавляют по меньшей мере два различных зонда, причем первый зонд помечен первой флуоресцентной меткой и является специфическим для зондирования нуклеиновой кислоты из Chlamydia trachomatis и второй зонд помечен флуоресцентной меткой, отличающейся от метки первого зонда, и является специфическим для зондирования нуклеиновой кислоты из Neisseria gonorrhoeae.
16. Способ по любому из пп. 10-15, в котором зонды предоставлены в буферной системе, содержащей дНТФы в концентрации от 1 до 10 мМ, одну или более солей в концентрации каждой соли от 2 до 20 мМ, Трис-буфер рН 8,8 в концентрации от 10 до 100 мМ, трегалозу в концентрации от 10 до 100 мМ, BST-полимеразу в количестве от 1Е до 12Е и от 0,01% до 1% 1,2-пропандиола.
17. Способ по п. 16, в котором одна или более солей выбраны из группы, состоящей из KCl, (NH4)2SO4 и MgSO4.
18. Набор для обнаружения нуклеиновой кислоты-мишени, содержащий зонд по любому из пп. 1-9, реагентный буфер петлевой изотермической амплификации, фермент, дНТФ и один или более праймеров петлевой изотермической амплификации.
19. Набор по п. 18, дополнительно содержащий положительный и отрицательный контроль.
20. Набор по п. 18 или 19, в котором реагентный буфер содержит дНТФы в концентрации от 1 до 10 мМ, одну или более солей в концентрации от 2 до 20 мМ, Трис-буфер рН 8,8 в концентрации от 10 до 100 мМ, трегалозу в концентрации от 10 до 100 мМ, BST-полимеразу в количестве от 1Е до 12Е и от 0,01% до 1% 1,2-пропандиола.
21. Набор по п. 20, в котором одна или более солей выбраны из группы, состоящей из KCl, (NH4)2SO4 и MgSO4.
RU2016112354A 2013-10-30 2014-10-30 Нуклеиново-кислотный зонд RU2668154C2 (ru)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GB1319180.4 2013-10-30
GBGB1319180.4A GB201319180D0 (en) 2013-10-30 2013-10-30 Nucleic acid probe
PCT/GB2014/053238 WO2015063498A2 (en) 2013-10-30 2014-10-30 Nucleic acid probe

Publications (2)

Publication Number Publication Date
RU2016112354A RU2016112354A (ru) 2017-12-01
RU2668154C2 true RU2668154C2 (ru) 2018-09-26

Family

ID=49767396

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2016112354A RU2668154C2 (ru) 2013-10-30 2014-10-30 Нуклеиново-кислотный зонд

Country Status (22)

Country Link
US (2) US20160273029A1 (ru)
EP (1) EP3063292B1 (ru)
JP (2) JP2016534722A (ru)
CN (1) CN105899674A (ru)
AU (2) AU2014343439A1 (ru)
CA (1) CA2926317C (ru)
CY (1) CY1124064T1 (ru)
DK (1) DK3063292T3 (ru)
ES (1) ES2773313T3 (ru)
GB (2) GB201319180D0 (ru)
HR (1) HRP20200264T1 (ru)
HU (1) HUE048579T2 (ru)
LT (1) LT3063292T (ru)
PL (1) PL3063292T3 (ru)
PT (1) PT3063292T (ru)
RS (1) RS59988B1 (ru)
RU (1) RU2668154C2 (ru)
SA (1) SA516371023B1 (ru)
SI (1) SI3063292T1 (ru)
SM (1) SMT202000176T1 (ru)
WO (1) WO2015063498A2 (ru)
ZA (1) ZA201602247B (ru)

Families Citing this family (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB201402591D0 (en) * 2014-02-14 2014-04-02 Memo Therapeutics Ag Method for recovering two or more genes, or gene products, encoding an immunoreceptor
KR101875662B1 (ko) * 2015-12-01 2018-08-02 에스디 바이오센서 주식회사 등온 핵산 증폭을 위한 리포터 염료, 퀀처가 포함되는 등온 기반 이중 기능성 올리고뉴클레오타이드 및 이를 이용한 핵산 증폭과 측정 방법
WO2017103269A1 (en) * 2015-12-18 2017-06-22 Selfdiagnostics Deutschland Gmbh Method for the detection of a sexually transmitted infectious pathogen
CN110225919A (zh) * 2016-11-10 2019-09-10 达丽斯生物医学公司 用于扩增和检测淋病奈瑟氏菌的多核苷酸
WO2018089942A1 (en) * 2016-11-10 2018-05-17 Slipchip Corporation Polynucleotides for the amplification and detection of chlamydia trachomatis
CN107022645A (zh) * 2017-06-14 2017-08-08 苏州承美生物科技有限公司 检测泌尿生殖道病原体淋球菌的分子信标探针及试剂盒
US10450616B1 (en) 2018-05-09 2019-10-22 Talis Biomedical Corporation Polynucleotides for the amplification and detection of Chlamydia trachomatis
KR102705173B1 (ko) 2018-11-30 2024-09-12 삼성디스플레이 주식회사 표시패널 및 이를 포함하는 전자장치
US10954572B2 (en) * 2019-07-25 2021-03-23 Talis Biomedical Corporation Polynucleotides for the amplification and detection of Neisseria gonorrhoeae
US11891662B2 (en) 2019-12-02 2024-02-06 Talis Biomedical Corporation Polynucleotides for amplification and detection of human beta actin
US11047007B1 (en) 2020-03-23 2021-06-29 Talis Biomedical Corporation Polynucleotides for amplification and detection of SARS-CoV-2
PL435634A1 (pl) * 2020-10-09 2022-04-11 Genomtec Spółka Akcyjna Zestaw starterów, skład reagentów oraz metoda wykrywania bakterii atypowych
PL437280A1 (pl) * 2021-03-12 2022-09-19 Genomtec Spółka Akcyjna Zestaw starterów do powielania, sposób wykrywania infekcji bakteryjnej przenoszonej drogą płciową oraz zestaw do wykrywania infekcji
CN114182031A (zh) * 2021-12-22 2022-03-15 江苏猎阵生物科技有限公司 一种核酸探针及其应用
GB2620948A (en) * 2022-07-26 2024-01-31 Mast Group Ltd Method and kit

Family Cites Families (25)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2069145C (en) * 1991-05-22 2007-07-31 Edwin F. Ullman Assay method utilizing induced luminescence
WO2000079009A2 (en) 1999-06-22 2000-12-28 Invitrogen Corporation Improved primers and methods for the detection and discrimination of nucleic acids
US7998673B2 (en) 2000-03-29 2011-08-16 Lgc Limited Hybridisation beacon and method of rapid sequence detection and discrimination
WO2002008414A1 (en) * 2000-06-27 2002-01-31 National Institute Of Advanced Industrial Science And Technology Novel nucleic acid probes and method of assaying nucleic acid by using the same
CA2417986C (en) * 2000-08-11 2013-11-26 University Of Utah Research Foundation Single-labeled oligonucleotide probes
GB0103424D0 (en) * 2001-02-12 2001-03-28 Chiron Spa Gonococcus proteins
US6960436B2 (en) 2002-02-06 2005-11-01 Epigenomics Ag Quantitative methylation detection in DNA samples
JP2004261017A (ja) * 2003-02-27 2004-09-24 Arkray Inc クラミジア・トラコマティスの検出方法およびそのためのキット
KR100885177B1 (ko) 2004-04-12 2009-02-23 학교법인 포항공과대학교 표적 ｄｎａ 또는 ｒｎａ 탐지용 올리고뉴클레오티드
GB0514889D0 (en) 2005-07-20 2005-08-24 Lgc Ltd Oligonucleotides
JP2007275006A (ja) 2006-04-10 2007-10-25 Hitachi High-Technologies Corp 核酸検出用プローブ作製法
CN101903520B (zh) * 2007-10-19 2013-11-13 荣研化学株式会社 核酸扩增方法以及在该方法中使用的试剂和试剂套件
US8900807B2 (en) * 2008-02-25 2014-12-02 The United States Of America As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Composition and methods for rapid detection of HIV by loop-mediated isothermal amplification (LAMP)
CN102084004B (zh) * 2008-05-27 2016-01-20 丹麦达科有限公司 杂交组合物和方法
US20110244460A1 (en) * 2008-12-16 2011-10-06 Arkray, Inc. Method for detecting controls for nucleic acid amplification and use thereof
JP2012528571A (ja) * 2009-05-29 2012-11-15 サイシス ダイアグノスティックス 先進的病原体検出およびスクリーニング
KR101536318B1 (ko) * 2010-10-29 2015-07-13 아크레이 가부시키가이샤 Ｅｇｆｒ 유전자의 다형(多型) 검출용 프로브, 증폭용 프라이머 및 그 용도
JP2013074888A (ja) * 2011-09-15 2013-04-25 Arkray Inc ＩＬ２８Ｂ（ｒｓ８０９９９１７）とＩＴＰＡ（ｒｓ１１２７３５４）の変異を検出する方法
JP2013081450A (ja) * 2011-09-27 2013-05-09 Arkray Inc 多型検出用プローブ、多型検出方法、薬効判定方法及び多型検出用試薬キット
ES2755934T3 (es) * 2011-10-31 2020-04-24 Eiken Chemical Método para detectar ácido nucleico diana
US9121051B2 (en) * 2011-10-31 2015-09-01 Arkray, Inc. Method of determining the abundance of a target nucleotide sequence of a gene of interest
JP6153758B2 (ja) * 2012-04-20 2017-06-28 アークレイ株式会社 多型検出用プローブ、多型検出方法、薬効判定方法及び多型検出用キット
CN102703433B (zh) * 2012-06-12 2014-10-08 中国水产科学研究院黄海水产研究所 基于多孔材料的核酸等温扩增试剂的保存方法及试剂
EP2878673B1 (en) * 2012-07-25 2017-08-09 Sony Corporation Preparation method and preparation device for sample for nucleic acid amplification reaction
JP2014093996A (ja) * 2012-11-12 2014-05-22 Sony Corp 核酸等温増幅方法

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
IkedaS. etal. Doubly thiazide orange-labeled cytidine for functional expansion of a hybridization-sensitive probe //Tetrahedron Letters. - 2009. - Vol. 50. - n. 51. - P. 7191-7195. *
IkedaS. etal. Doubly thiazide orange-labeled cytidine for functional expansion of a hybridization-sensitive probe //Tetrahedron Letters. - 2009. - Vol. 50. - n. 51. - P. 7191-7195. IkedaS. etal. Doubly thiazide orange-labeled cytidine for functional expansion of a hybridization-sensitive probe //Tetrahedron Letters. - 2009. - Vol. 50. - n. 51. - P. 7191-7195. Tong C. Y. W., Malison H. Moving to nucleic acid-based detection of genital Chlamydia trachomatis //Expert review of molecular diagnostics. - 2002. - Vol. 2. - n. 3. - P. 257-266. Позняк А. Л. и др. Современные аспекты диагностики мочеполовой хламидийной инфекции //Редакционная коллегия. - 2009. - С. 7. *
Tong C. Y. W., Malison H. Moving to nucleic acid-based detection of genital Chlamydia trachomatis //Expert review of molecular diagnostics. - 2002. - Vol. 2. - n. 3. - P. 257-266. *
Позняк А. Л. и др. Современные аспекты диагностики мочеполовой хламидийной инфекции //Редакционная коллегия. - 2009. - С. 7. *

Also Published As

Publication number Publication date
CY1124064T1 (el) 2022-03-24
JP2016534722A (ja) 2016-11-10
CA2926317A1 (en) 2015-05-07
RS59988B1 (sr) 2020-03-31
US20160273029A1 (en) 2016-09-22
AU2014343439A1 (en) 2016-04-21
CN105899674A (zh) 2016-08-24
EP3063292B1 (en) 2019-11-20
WO2015063498A3 (en) 2015-07-16
AU2020294316A1 (en) 2021-04-15
GB201419367D0 (en) 2014-12-17
CA2926317C (en) 2023-05-23
SMT202000176T1 (it) 2020-05-08
PL3063292T3 (pl) 2020-06-29
ZA201602247B (en) 2022-05-25
NZ719238A (en) 2022-03-25
DK3063292T3 (da) 2020-02-24
SI3063292T1 (sl) 2020-03-31
SA516371023B1 (ar) 2021-01-12
GB201319180D0 (en) 2013-12-11
HRP20200264T1 (hr) 2020-05-29
JP6983201B2 (ja) 2021-12-17
US20190127785A1 (en) 2019-05-02
US11111523B2 (en) 2021-09-07
PT3063292T (pt) 2020-02-14
AU2020294316B2 (en) 2023-02-02
LT3063292T (lt) 2020-02-25
RU2016112354A (ru) 2017-12-01
WO2015063498A2 (en) 2015-05-07
GB2524603A (en) 2015-09-30
ES2773313T3 (es) 2020-07-10
JP2019216722A (ja) 2019-12-26
EP3063292A2 (en) 2016-09-07
HUE048579T2 (hu) 2020-07-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
RU2668154C2 (ru) Нуклеиново-кислотный зонд
US12077811B2 (en) Compositions of toehold primer duplexes and methods of use
US9845495B2 (en) Method and kit for detecting target nucleic acid
US11753679B2 (en) Looped primer and loop-de-loop method for detecting target nucleic acid
KR102030244B1 (ko) 뎅기 바이러스 검출용 올리고뉴클레오티드 세트 및 이의 용도
KR20210080220A (ko) 극소량의 희귀 단일 염기 변이체 검출용 프라이머 및 이를 이용하여 극소량의 희귀 단일 염기 변이체를 특이적이고 민감하게 검출하는 방법
US12110542B2 (en) Isothermal amplification
JP6673832B2 (ja) アッセイ認識のための多重ｐｃｒ反応のコード化法
WO2024023510A1 (en) Method and kit for detecting single nucleotide polymorphisms (snp) by loop-mediated isothermal amplification (lamp)
NZ719238B2 (en) Nucleic acid probe with single fluorophore label bound to internal cytosine for use in loop mediated isothermal amplification
WO2016065182A1 (en) Systems and methods for nucleic acid capture