RU2662172C2 - Способ получения регенеративного ветеринарного препарата на основе экстракта мезенхимальных стволовых клеток и кондиционной среды - Google Patents
Способ получения регенеративного ветеринарного препарата на основе экстракта мезенхимальных стволовых клеток и кондиционной среды Download PDFInfo
- Publication number
- RU2662172C2 RU2662172C2 RU2016148715A RU2016148715A RU2662172C2 RU 2662172 C2 RU2662172 C2 RU 2662172C2 RU 2016148715 A RU2016148715 A RU 2016148715A RU 2016148715 A RU2016148715 A RU 2016148715A RU 2662172 C2 RU2662172 C2 RU 2662172C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- regenerative
- cells
- medium
- stem cells
- conditioned medium
- Prior art date
Links
- 239000003636 conditioned culture medium Substances 0.000 title claims abstract description 33
- 239000000284 extract Substances 0.000 title claims abstract description 25
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 title claims abstract description 24
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 18
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title abstract description 7
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 title description 6
- 210000002901 mesenchymal stem cell Anatomy 0.000 claims abstract description 48
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims abstract description 24
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 22
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 claims abstract description 19
- 210000000577 adipose tissue Anatomy 0.000 claims abstract description 14
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims abstract description 13
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 12
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 claims abstract description 9
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 claims abstract description 8
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 claims abstract description 6
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 claims abstract description 6
- 108090000174 Interleukin-10 Proteins 0.000 claims abstract description 6
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 claims abstract description 6
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 claims abstract description 6
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 claims abstract description 6
- 229940047122 interleukins Drugs 0.000 claims abstract description 6
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims abstract description 5
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 claims abstract description 5
- 238000010257 thawing Methods 0.000 claims abstract description 5
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims abstract description 4
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 claims abstract description 4
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 claims abstract description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims abstract 2
- 238000007710 freezing Methods 0.000 claims description 2
- 230000008014 freezing Effects 0.000 claims description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 28
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 15
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 abstract description 5
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 abstract description 2
- 239000000273 veterinary drug Substances 0.000 abstract 3
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 46
- 210000004271 bone marrow stromal cell Anatomy 0.000 description 27
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 21
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 16
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 15
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 11
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 11
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 9
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 9
- 230000001143 conditioned effect Effects 0.000 description 9
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 7
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 7
- 239000000047 product Substances 0.000 description 7
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 7
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 6
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 6
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 5
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 5
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 5
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 5
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 5
- 206010067125 Liver injury Diseases 0.000 description 5
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 5
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 description 5
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 5
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 5
- 230000008569 process Effects 0.000 description 5
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 5
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 5
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 5
- 102100036475 Alanine aminotransferase 1 Human genes 0.000 description 4
- 108010082126 Alanine transaminase Proteins 0.000 description 4
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 4
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 4
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 4
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 4
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 4
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 4
- APKFDSVGJQXUKY-INPOYWNPSA-N amphotericin B Chemical compound O[C@H]1[C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](C)O[C@H]1O[C@H]1/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)[C@H](C)OC(=O)C[C@H](O)C[C@H](O)CC[C@@H](O)[C@H](O)C[C@H](O)C[C@](O)(C[C@H](O)[C@H]2C(O)=O)O[C@H]2C1 APKFDSVGJQXUKY-INPOYWNPSA-N 0.000 description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 4
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 4
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 4
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 4
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 4
- APKFDSVGJQXUKY-KKGHZKTASA-N Amphotericin-B Natural products O[C@H]1[C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](C)O[C@H]1O[C@H]1C=CC=CC=CC=CC=CC=CC=C[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)[C@H](C)OC(=O)C[C@H](O)C[C@H](O)CC[C@@H](O)[C@H](O)C[C@H](O)C[C@](O)(C[C@H](O)[C@H]2C(O)=O)O[C@H]2C1 APKFDSVGJQXUKY-KKGHZKTASA-N 0.000 description 3
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 3
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 3
- 206010052428 Wound Diseases 0.000 description 3
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 3
- 229960003942 amphotericin b Drugs 0.000 description 3
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 3
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 3
- 230000006870 function Effects 0.000 description 3
- 231100000234 hepatic damage Toxicity 0.000 description 3
- 230000008818 liver damage Effects 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 3
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 3
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 3
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 3
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- NMUSYJAQQFHJEW-UHFFFAOYSA-N 5-Azacytidine Natural products O=C1N=C(N)N=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 NMUSYJAQQFHJEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NMUSYJAQQFHJEW-KVTDHHQDSA-N 5-azacytidine Chemical compound O=C1N=C(N)N=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 NMUSYJAQQFHJEW-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 2
- RZVAJINKPMORJF-UHFFFAOYSA-N Acetaminophen Chemical compound CC(=O)NC1=CC=C(O)C=C1 RZVAJINKPMORJF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 230000001857 anti-mycotic effect Effects 0.000 description 2
- 239000002543 antimycotic Substances 0.000 description 2
- 229960002756 azacitidine Drugs 0.000 description 2
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 2
- 210000005013 brain tissue Anatomy 0.000 description 2
- 210000004413 cardiac myocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000022131 cell cycle Effects 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- 210000001808 exosome Anatomy 0.000 description 2
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 2
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 2
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 2
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 2
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UZOVYGYOLBIAJR-UHFFFAOYSA-N 4-isocyanato-4'-methyldiphenylmethane Chemical compound C1=CC(C)=CC=C1CC1=CC=C(N=C=O)C=C1 UZOVYGYOLBIAJR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930183010 Amphotericin Natural products 0.000 description 1
- QGGFZZLFKABGNL-UHFFFAOYSA-N Amphotericin A Natural products OC1C(N)C(O)C(C)OC1OC1C=CC=CC=CC=CCCC=CC=CC(C)C(O)C(C)C(C)OC(=O)CC(O)CC(O)CCC(O)C(O)CC(O)CC(O)(CC(O)C2C(O)=O)OC2C1 QGGFZZLFKABGNL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010002091 Anaesthesia Diseases 0.000 description 1
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 1
- 239000012591 Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline Substances 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 102000004269 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 description 1
- 108010017080 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 108010002352 Interleukin-1 Proteins 0.000 description 1
- 206010028400 Mutagenic effect Diseases 0.000 description 1
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 206010053615 Thermal burn Diseases 0.000 description 1
- GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J Trypan blue Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].C1=C(S([O-])(=O)=O)C=C2C=C(S([O-])(=O)=O)C(/N=N/C3=CC=C(C=C3C)C=3C=C(C(=CC=3)\N=N\C=3C(=CC4=CC(=CC(N)=C4C=3O)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)C)=C(O)C2=C1N GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 1
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 1
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 229940009444 amphotericin Drugs 0.000 description 1
- 230000037005 anaesthesia Effects 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000001557 animal structure Anatomy 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- OHJMTUPIZMNBFR-UHFFFAOYSA-N biuret Chemical compound NC(=O)NC(N)=O OHJMTUPIZMNBFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 239000013553 cell monolayer Substances 0.000 description 1
- 238000002659 cell therapy Methods 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- RNFNDJAIBTYOQL-UHFFFAOYSA-N chloral hydrate Chemical compound OC(O)C(Cl)(Cl)Cl RNFNDJAIBTYOQL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960002327 chloral hydrate Drugs 0.000 description 1
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 description 1
- 239000002577 cryoprotective agent Substances 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 230000007123 defense Effects 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 239000012649 demethylating agent Substances 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 1
- 238000002296 dynamic light scattering Methods 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 238000007667 floating Methods 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 239000006481 glucose medium Substances 0.000 description 1
- 229960002743 glutamine Drugs 0.000 description 1
- 244000144993 groups of animals Species 0.000 description 1
- 230000003779 hair growth Effects 0.000 description 1
- 230000035876 healing Effects 0.000 description 1
- 230000004217 heart function Effects 0.000 description 1
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000002519 immonomodulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 210000002346 musculoskeletal system Anatomy 0.000 description 1
- 231100000243 mutagenic effect Toxicity 0.000 description 1
- 230000003505 mutagenic effect Effects 0.000 description 1
- 208000010125 myocardial infarction Diseases 0.000 description 1
- 208000015122 neurodegenerative disease Diseases 0.000 description 1
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 1
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 1
- 230000004768 organ dysfunction Effects 0.000 description 1
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 1
- 210000000963 osteoblast Anatomy 0.000 description 1
- 206010033675 panniculitis Diseases 0.000 description 1
- 229960005489 paracetamol Drugs 0.000 description 1
- 230000003076 paracrine Effects 0.000 description 1
- 230000007310 pathophysiology Effects 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 238000007639 printing Methods 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 1
- 210000000512 proximal kidney tubule Anatomy 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 1
- 230000002784 sclerotic effect Effects 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 230000009759 skin aging Effects 0.000 description 1
- 208000017520 skin disease Diseases 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 239000000021 stimulant Substances 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 210000004003 subcutaneous fat Anatomy 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 230000036575 thermal burns Effects 0.000 description 1
- 210000001694 thigh bone Anatomy 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 230000002110 toxicologic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000027 toxicology Toxicity 0.000 description 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 1
- 238000000825 ultraviolet detection Methods 0.000 description 1
- 230000029663 wound healing Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/28—Bone marrow; Haematopoietic stem cells; Mesenchymal stem cells of any origin, e.g. adipose-derived stem cells
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Virology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Изобретение относится к ветеринарии и может быть использовано для получения регенеративного ветеринарного препарата. Способ получения регенеративного ветеринарного препарата включает: культивирование выделенных de novo или деконсервированных мезенхимальных стволовых клеток, получаемых из жировой ткани или костного мозга животного, в жидкой питательной среде с добавлением 10 % фетальной бычьей сыворотки. Получают кондиционную среду с содержанием интерлейкинов: ИЛ-1β, ИЛ-2, ИЛ-6 и ИЛ-10 в концентрациях не менее 2; 2; 10 и 2 пг/мл. Объединяют с экстрактом МСК, полученным путем замораживания-оттаивания клеточной суспензии. Добавляют глицин до конечной концентрации 20 мг/мл раствора для лиофилизации, проводят стерилизующую фильтрацию и лиофилизацию. Использование данного способа получения ветеринарного препарата с применением глицина в конечной концентрации 20 мг/мл позволяет стабилизировать рН и регенеративную активность препарата. 9 ил., 2 табл., 5 пр.
Description
Область техники
Изобретение относится к ветеринарии и может быть использовано для получения и применения в терапевтических целях регенеративного препарата, содержащего набор биологически активных веществ, выделенных из экстракта мезенхимальных стволовых клеток (МСК) костного мозга (КМ) или жировой ткани (ЖТ) животных и кондиционной среды, полученной в результате культивирования данных клеток. Предлагаемый способ позволяет получить препарат, который обеспечивает эффективное стимулирование собственных восстановительных процессов организма животных.
Предпосылки создания изобретения
В настоящее время интенсивно проводятся исследования возможности получения и дифференцировки клеток из различных типов стволовых клеток, применяемых для замещения утраченных или поврежденных клеток жизненно важных органов и тканей путем трансплантации. В ходе роста и при индукции дифференцировки исходных стволовых клеток в специализированные формируется кондиционная среда, которая также обладает различной биологической активностью, в том числе обладает терапевтическим эффектом.
Создание препарата фармацевтического назначения, содержащего биологически активные вещества, в частности, ростовые факторы, на основе экстракта мезенхимальных стволовых клеток и кондиционной среды, на которой данные клетки культивируются, предполагает использование биотехнологических подходов, а не клеточных технологий, что не противоречит требованиям биоэтики и нормам права. Вследствие замены клеточных технологий на биотехнологические подходы, устраняются препятствия на всех этапах промышленного внедрения препарата от доклинических исследований и до коммерциализации с последующим получением разрешения на реализацию.
Следует отметить, что дегенеративные заболевания обусловлены нарушением способности отдельных тканей организма к восстановлению за счет реализации собственного регенераторного потенциала и развитие дистрофических процессов на фоне разрастания склеротической ткани. Фармакологическое действие применяемых для лечения подобных состояний средств направлено на стимуляцию либо замещение функций сохранившихся клеточных элементов. Однако концепция компенсации нарушений органов-мишеней за счет адаптационных процессов часто оказывается несостоятельной. Представленные факты указывают на необходимость развития стратегии регенеративной медицины, которая заключается в замене погибших либо неправильно функционирующих клеточных элементов на новые.
Уровень техники
Известен ряд кондиционных сред и фармацевтических композиций, получаемых из питательных сред в результате культивирования мезенхимальных стволовых клеток стабильной культуры, данные среды могут содержать также факторы дифференцировки. Подобные аналоги обеспечивают стимуляцию регенерационных процессов, однако обладают слишком узконаправленным действием. Так, известны среды, направленные на восстановление опорно-двигательного аппарата - хрящевой [заявка на изобретение РФ 2001116126 от 08.11.1999 г., приоритет Италия] и костной ткани [Mbalaviele G, Jaiswal N et al., Endocrinology, 1999]. Известна композиция, содержащая костномозговые МСК человека в количестве не менее 105 клеток/мл и культуральную питательную среду, которая используется только для регенерации кожных покровов [патент RU 2455354 С1]. Разработана кондиционная среда Majumdar MK, Thiede MA, et al., Stem Cell Res., 2000], в которой поддерживают дифференцировку МСК в механоциты или остеобласты, выделяющие цитокины, которая способна активировать продолжительный рост гемопоэтических стволовых клеток.
Известна фармацевтическая композиция, содержащая кондиционную питательную среду, поддерживавшую рост эукариотических клеток и фармацевтический носитель [RU 2001133453/13. Заявка от 12.05.2000 г., приоритет US: 09/313,538 от 14.05.1999]. Композиция может иметь различную лекарственную форму. Фармацевтический носитель может включать один или несколько внеклеточных продуктов (компонентов кондиционной среды) выделяемых методами разделения белков. Данную композицию используют для стимуляции заживления ран и ожогов. К недостаткам рассматриваемой фармацевтической композиции можно отнести то, что лечебное действие обеспечивается не применением самой кондиционной среды, а комплексом внеклеточных продуктов и других элементов композиции. При этом, роль среды заключается в поддержании жизнедеятельности используемых в композиции клеток и среды для сохранения фармацевтического носителя.
В регенеративной медицине возможно использование частиц, секретируемых МСК. Так, для лечения кожных заболеваний и ожогов могут быть применены везикулы, или экзосомы [WO 2009105044 А1]. Описан способ получения частиц, включающий получение среды, кондиционированной МСК, ее концентрирование, обработку путем гель-фильтрации, отбор фракции с динамическим рассеянием света, путем УФ-детектирования при 220 нм (сбор фракций, элюирующих со временем удерживания 11-13 минут). Полученная частица может быть использована в составе фармацевтической композиции, применяемой для лечения заболеваний. Несмотря на то, что имеются данные, указывающие на важную роль экзосом в реализации паракринных эффектов МСК, нет доказательств того, что именно фракция, описанная в изобретении, является ключевой для регенеративного действия этих клеток. Также описанная технология довольно сложно применима в процессе производства и не обеспечивает должной стандартизации конечного продукта.
Аналогом является ростовая среда, получаемая при выращивании кардиомиоцитов из МСК костного мозга [Fukuda К., Artificial Organs, 2001]. Основа рассматриваемой среды составляет IMDM, к которой добавлены антибиотики, антимикотики, L-глютамин и 20% фетальной сыворотки крови КРС, а также индуктор дифференцировки 5-азацитидин (деметилирующий агент). В ходе роста и пролиферации МСК и их дифференцировки в кардиомиоциты в среде накапливаются продукты жизнедеятельности, которые также являются компонентами данной среды. Недостатками указанной среды является то, что свойства продуктов жизнедеятельности не идентифицированы и эффект их не изучен. Кроме того, в среде сохраняются остатки препарата 5-азацитидин, которые обладают мутагенным действием.
В качестве прототипа предлагаемого изобретения рассматривается кондиционная среда, обладающая лечебным эффектом при термических ожогах [патент RU №2292212, 27.01.07]. Данная среда содержит минеральные соли и аминокислоты, пенициллин, амфотерицин, L-глутамин и эмбриональную телячью сыворотку, достаточные для поддержания жизнеспособности и роста МСК костного мозга человека, среду получают на стадии стационарного роста культуры стабильной клеточной линии мезенхимальных стволовых клеток, находящихся в G0 периоде клеточного цикла. Описанный прототип имеет ряд недостатков - ограниченный выбор сырья (МСК, получаемые только из костного мозга, не предполагает использование накопленной ранее и криоконсервированной культуры), узкий спектр регенеративного действия, а биологически активные вещества, входящие в клетки МСК в значительном количестве в состав препарата не входят. Определение времени сбора кондиционной среды косвенным путем (по фазе клеточного цикла), не позволяет получить продукт с максимальным содержанием цитокинов.
Сущность изобретения
Краткое описание изобретения
Способ получения регенеративного препарата на основе экстракта МСК и кондиционной среды, образующейся в процессе роста клеток, включает следующие этапы: деконсервирование или выделение de novo клеточного материала из косного мозга или жировой ткани животных, культивирование МСК в среде на основе DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) с 10 % содержанием фетальной бычьей сыворотки (ФБС) до образования кондиционной среды с определенным содержанием ключевых интерлейкинов - ИЛ-β, ИЛ-2, ИЛ-6, ИЛ-10, сбор кондиционной среды, получение экстракта МСК, путем замораживания-оттаивания клеточной суспензии, объединение экстракта с кондиционной средой МСК, стабилизация компонентов полученного препарата посредством глицина в конечной концентрации 20 мг/мл, стерилизующая фильтрация, розлив во флаконы и лиофильная сушка.
Подробное описание изобретения
При создании настоящего изобретения была поставлена задача по применению концепции регенеративной медицины в ветеринарии для восстановления функции жизненно важных органов животных путем замены дефективных клеточных элементов на новые за счет активации прогениторных клеток пораженной ткани.
Технический результат достигается посредством разработки способа получения препарата для ветеринарии, обладающего комплексным воздействием на регенеративные процессы в организме.
Предлагаемый способ обеспечивает получение препарата обладающего высокой эффективностью, которая обусловлена действием сбалансированного комплекса цитокинов, содержащихся в экстрактах и секретируемых мезенхимальными стволовыми клетками в культуральную среду. Для реализации регенеративного действия МСК было подобрано содержание ключевых интерлейкинов, а именно ИЛ-1β, ИЛ-2, ИЛ-6, ИЛ-10, являющихся основными стимуляторами механизмов неспецифической защиты организма и специфического иммунного ответа, а также активаторами репаративных процессов в поврежденных тканях.
Предлагаемый способ предполагает следующие операции: выделение мезенхимальных стволовых клеток из косного мозга или жировой ткани животных (de novo) или деконсервирование готовой клеточной культуры, культивирование МСК в среде на основе DMEM с 10 % содержанием ФБС до образования кондиционной среды (в которой определяется содержание ключевых интерлейкинов: ИЛ-1β - не менее 2 пг/мл, ИЛ-2 - не менее 2 пг/мл, ИЛ-6 - не менее 10 пг/мл, ИЛ-10 - не менее 2 пг/мл, определяемых при помощи иммуноферментного анализа (ELISA)), сбор кондиционной среды, получение экстракта МСК, путем замораживания-оттаивания клеточной суспензии, объединение экстракта с кондиционной средой МСК, стабилизация компонентов полученного препарата (добавление глицина до конечной концентрации 20 мг/мл), розлив во флаконы по 1 мл и лиофильная сушка.
В данном изобретении могут быть использованы МСК, полученные самостоятельно по любому известному способу, и в виде коммерческих культур МСК, имеющих сертификат качества и предназначенных, в том числе, для клинического применения (например, такие как АТСС).
Краткое описание фигур
Изобретение поясняется фото, графиками и таблицами:
Фото 1. Мезенхимальные стволовые клетки из КМ крысы, нулевой пассаж (световая микроскопия, увеличение окуляра 10× и объектива 10×).
Фото 2. Мезенхимальные стволовые клетки из КМ крысы, третий пассаж (световая микроскопия, увеличение окуляра 10× и объектива 40×).
Фото 3. Колония МСК из ЖТ крысы, нулевой пассаж (световая микроскопия, увеличение окуляра 10× и объектива 40×).
График 1. Влияние препарата на основе экстракта и кондиционной среды мезенхимальных стволовых клеток костного мозга (КС МСК КМ) на пролиферативный индекс культур клеток ФЭЧ и МСК.
График 2. Влияние препарата на основе экстракта и кондиционной среды мезенхимальных стволовых клеток жировой ткани (КС МСК ЖТ) на пролиферативный индекс культур клеток ФЭЧ и МСК.
График 3. Влияние препарата на основе экстракта и кондиционной среды деконсервированных мезенхимальных стволовых клеток (КС МСК КМ деконс.) на пролиферативный индекс культур клеток ФЭЧ и МСК.
График 4. Влияние препарата на основе экстракта и кондиционной среды мезенхимальных стволовых клеток костного мозга (КС+МСК КМ), жировой ткани (КС+МСК ЖТ) и деконсервированных МСК костного мозга (СК+МСК КМ деконс) на активность АлТ в сыворотке крови крыс при моделировании острой патологии печени (ОПП).
График 5. Влияние препарата на основе экстракта и кондиционной среды мезенхимальных стволовых клеток костного мозга (КС+МСК КМ), жировой ткани (КС+МСК ЖТ) и деконсервированных МСК костного мозга (СК+МСК КМ деконс.) на активность АсТ в сыворотке крови крыс при моделировании острой патологии печени (ОПП).
График 6. Влияние препарата на основе экстракта и кондиционной среды мезенхимальных стволовых клеток костного мозга (КС+МСК КМ), жировой ткани (КС+МСК ЖТ) и деконсервированных МСК костного мозга (СК+МСК КМ деконс.) на содержание белка в сыворотке крови крыс при моделировании острой патологии печени (ОПП).
Таблица 1. Значение ИП культур клеток ФЭП и МСК при добавлении разных концентраций регенеративного препарата.
Таблица 2. Биохимические параметры поражения печени в исследуемых группах животных.
Возможность осуществления изобретения и эффективность его применения подтверждаются следующими примерами:
Пример 1. Клетки костного мозга (КМ) выделяли из бедренных костей крыс (в количестве, обеспечивающем посевную концентрацию не менее 1×106 кл/мл) сразу после декапитации, помещали в охлажденную среду DMEM/F12 (Biowest, USA), содержащую гентамицин (80 мкг/мл, Биолот, Россия) и амфотерицин Б (0,25 мкг/мл, Biowest, USA), дважды отмывали от крови указанной средой центрифугированием при 1200 об/мин в течение 5 минут.
Клетки высевали с концентрацией 1×106 кл/мл (для чего производили предварительный подсчет клеток в камере Горяева с учетом жизнеспособности путем субвитального окрашивания трипановым синим) культивировали в пластиковых флаконах (SPL, Корея) с площадью ростовой поверхности 175 см2 при температуре 37°С в атмосфере с 5%-м содержанием СО2. В состав ростовой среды входила питательная среда DMEM high glucose (Biowest, USA), L-glutamine, 10 % ФБС (Sigma Aldrich, USA), гентамицин (80 мкг/мл), амфотерицин Б (25 мкг/мл, Biowest, USA). Выделение клеточной фракции МСК основано на адгезии данных клеток к культуральному пластику, как субстрату.
Спустя сутки после начала культивирования производили ополаскивание средой с антибиотиком для удаления флотирующей фракции клеток и производили замену ростовой среды. В дальнейшем замену среды выполняли раз в 3-4 суток. По достижению конфлюентности монослоя (контролируется визуально при помощи инвертированного микроскопа) не менее 85%, его дезагрегировали диспергирующим раствором (0,05-0,1% трипсина (Biowest, USA) в растворе Версена (ПанЭко, Россия)) и проводили посев в новые культуральные флаконы с коэффициентом пересева 1:3.
Для получения кондиционной среды культуру вели в течение 3-4 пассажей, затем выполняли посев в культуральные флаконы из расчета 5-15×103 клеток на 1 см2 площади ростовой поверхности в 90±5 мл ростовой среды и культивировали в описанных выше условиях до достижения необходимой концентрации интерлейкинов в среде.
При достижения необходимой концентрации биологически активных веществ кондиционную среду, содержащую все продукты секреции МСК, собирали в стерильные центрифужные пробирки, очищали путем центрифугирования при 3000 об/мин и температуре 5±1°С в течение 10 минут от клеточного дебриса.
Полученная кондиционная среда может использоваться непосредственно по назначению или храниться в течение продолжительного времени в определенных условиях (до семи суток - при температуре 3±1°С, более длительно хранение требует температуры не выше минус 20°С).
После сбора кондиционной среды, получали экстракт МСК КМ: клеточный монослой, при конфлюентности не менее 90%, дезагрегировали указанным выше диспергирующим раствором, добавляли 0,9%-й раствор хлорида натрия (5-10 мл на 1 культуральный флакон), подвергали замораживанию при температуре минус 20±2°С, после чего выполняли оттаивание при комнатной температуре. Полученный экстракт МСК КМ собирали в стерильные центрифужные пробирки, очищали от клеточного дебриса путем центрифугирования при 3000 об/мин и температуре 5±3°С в течение 10 минут.
Для получения регенеративного препарата, осадок после центрифугирования, представляющий собой экстракт МСК КМ, объединяли с кондиционной средой, измеряли содержание ИЛ-1, ИЛ-2, ИЛ-6, ИЛ-10, добавляли глицин (до конечной концентрации 20 мг/мл), разливали во флаконы по 1 мл и лиофильно высушивали.
Так, к концу четвертой недели от начала культивирования МСК КМ крыс можно получить до 3000 мл (при посевной концентрации на этапе выделения не менее 1×106 кл/мл) раствора для лиофилизации на основе экстракта и кондиционной среды МСК КМ, который может быть использован для приготовления препарата, стимулирующего регенеративные процессы организма животного.
Пример 2. Клеточный материал получали из подкожной жировой ткани (ЖТ) крысы (в количестве, обеспечивающем посевную концентрацию не менее 1×106 кл/мл) в стерильных условиях, после декапитации животного. Жировую ткань помещали в буферный раствор Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) (Biowest, USA), содержащий гентамицин (80 мкг/мл, Биолот, Россия), фрагментировали до однородной массы, используя стерильные инструменты, после чего подвергали ступенчатой ферментативной обработке. Ферментативную обработку выполняли следующим образом: к измельченной жировой ткани добавляли питательную среду DMEM high glucose (Biowest, USA) с добавлением антибиотика и антимикотика, а также фермента трипсина до концентрации 0,1-0,15%, выдерживали 30±5 минут при температуре 37±1°С и постоянном перемешивании на магнитной мешалке, затем среду с клетками фильтровали через нейлоновые мембраны с размером пор 100 мкм (BD) и добавляли 0,2-0,5% ФБС (Sigma-Aldrich, USA), для инактивации трипсина. Повторяли описанную операцию дважды со снижением времени инкубации до 15±5 минут.
После фильтрации клеточную суспензию центрифугировали в течение 10 мин при 1200 об/мин, супернатант полностью удаляли. Полученный осадок ресуспендировали в питательной среде DMEM high glucose (Biowest, USA) с 10% ФБС (Sigma-Aldrich, USA), после чего клетки высевали в культуральные флаконы (70±5 мл клеточной суспензии/флакон) с площадью ростовой поверхности 175 см2 (SPL, Корея) с концентрацией 1×106 кл/мл и культивировали при 37°С с 5%-ной концентрацией СО2.
Выделение клеточной фракции МСК, как и в предыдущем примере, основано на адгезии данных клеток к культуральному пластику, как субстрату. Накопление клеточной массы, формирование кондиционной среды и получение регенеративного препарата выполняли аналогичным образом примеру 1. Время производства препарата также составляло 4 недели, количество продукта - до 3000 мл (при посевной концентрации на этапе выделения не менее 1×106 кл/мл) раствора для лиофилизации на основе экстракта и кондиционной среды
Пример 3. Клеточный материал получали путем деконсервирования культур клеток МСК (КМ или ЖТ крыс). Криопробирку с клетками (концентрация клеток не менее 1×106 кл/мл, объем клеточной суспензии - 1 мл) помещали на водяную баню с температурой воды 37±1°С, периодически встряхивая, до полного размораживания. Производили отмывку клеток от криопротектора при помощи питательной среды DMEM high glucose (Biowest, USA). Для этого клеточную суспензию переносили в стерильный культуральный флакон с площадью ростовой поверхности S=25 см2, добавляли небольшими дозами, чтобы исключить осмотическое повреждение, питательную среду DMEM high glucose (10-15 мл), полученную взвесь равномерно распределяли на две центрифужные пробирки и центрифугировали при 1200 об/мин в течение 10 минут. Супернатант удаляли, осадок ресуспендировали в ростовой среде, содержащую питательную среду DMEM high glucose (Biowest, USA), L-glutamine, 10% ФБС (Sigma-Aldrich, USA), гентамицин (40 мкг/мл, Биолот, Россия), амфотерицин Б (25 мкг/мл, Biowest, USA). Производили посев клеток (70±5 мл клеточной суспензии/флакон) в концентрации 8-10×104 кл/мл в культуральные флаконы с площадью ростовой поверхности 175 см2 (SPL, Корея) и культивировали при 37°С с 5% содержанием СО2. Ростовую среду меняли каждые 3-4 суток. Накопление клеточной биомассы, получение кондиционной среды и препарата осуществляли аналогично как в Примере 1.
Пример 4. Свойства лекарственного средства на основе экстракта и кондиционной среды МСК костного мозга и жировой ткани оценивали по влиянию на пролиферацию культуры клеток фибробластов эмбрионов человека (ФЭЧ) и мезенхимальных стволовых клеток, выделенных из костного мозга крыс (in vitro).
Для этого, модельные культуры клеток брали на третьем пассаже, производили посев в 12-ти-луночные культуральные планшеты (SPL, Германия) с добавлением исследуемого регенеративного препарата в ростовую среду в различных концентрациях (1%, 5%, 10%) культивировали в течение трех суток в стандартных условиях (инкубировали во влажной камере в CO2-инкубаторе при 37°С и 5% СО2) с добавлением 10% ФБС (Sigma-Aldrich, USA) к среде 199 (ГУП ИПВЭ им. М.П. Чумакова, Россия) для ФЭЧ и DMEM/F12 (1:1) (Biowest, USA) - для МСК. Посевная концентрация клеток ФЭК - 8-10×104 кл/мл, МСК - 7-9×104 кл/мл среды. В качестве контроля использовали клетки, выращенные в ростовой среде без добавления регенеративного препарата.
По окончании инкубации проводили снятие выросших культур с поверхности пластика и определение пролиферативного индекса. Индекс пролиферации (ИП) определяли, как отношение количества клеток в 1 мл суспензии, полученной в результате снятия клеток с подложки по достижению конфлюентности монослоя к посевной концентрации клеток (количество клеток в мл раствора при посеве на культуральные планшеты).
Полученные данные для культур двух морфологических типов свидетельствуют (табл. 1, графики 1-3) о повышении уровня пролиферативных свойств клеток обеих культур при добавлении в ростовые среды предлагаемого регенеративного препарата (полученного всеми тремя описанными в предыдущих примерах модификациях способа) на 10-85% для ФЭЧ и 2-25 % для МСК по сравнению с ростовой средой, при этом наблюдалась линейная зависимость между концентрацией препарата и значением индекса пролиферации.
Пример 5. Регенеративное действие препарата на основе экстракта и кондиционной среды культуры мезенхимальных стволовых клеток костного мозга или жировой ткани было изучено на модели острого поражения печени (МОПП) крыс (in vivo). Модель острого поражения печени была выполнена путем однократного введения крысам в желудок через зонд парацетамола (N-(4-гидроксифенил)ацетамида) в виде суспензии в дозе 700 мг на 1 кг массы тела. Процедура лечения после МОПП заключалась в ежедневном внутримышечном введении 0,5 мл исследуемого препарата животным опытной группы в течение 5 дней. В качестве контроля использовали крыс с МОПП, которые не подвергались терапевтическим воздействиям.
Спустя сутки после окончания курса лечения крыс выводили из эксперимента путем декапитации, предварительно обеспечив наркоз за счет внутрибрюшинного введения хлоралгидрата в дозе 400 мг на 1 кг массы тела животного. В сыворотке крови определили активность ферментов аспартат-(АсТ) и аланинаминотрансферазы (АлТ) с помощью стандартного набора Vital и содержание общего белка - биуретовым методом. Исследованные биохимические параметры отражают функциональное состояние печени. Ферменты АсТ и АлТ присутствуют в значительных количествах в печени и почках, поэтому в норме концентрации АсТ и АлТ в крови невелики. При повреждении гепатоцитов происходит потеря ферментов АсТ и АлТ, и концентрация этих биохимических маркеров в крови возрастает. Изменение уровня общего белка (признак грубой патологии печени) не наблюдалось.
Результаты исследования (табл. 2 и графики 4-6) показывают, что применение в течение 5 дней предлагаемого регенеративного препарата на основе экстракта и кондиционной среды с использованием мезенхимальных стволовых клеток, как полученных de novo из костного мозга и жировой ткани, так и деконсервированных, приводило к значительному улучшению состояния животных с ОПП, что подтверждается концентрацией исследованных маркеров повреждения печени (показатели уровней АсТ, АлТ). Так, концентрации указанных ферментов в группе животных, получавших регенеративный препарат, значимо не отличались от показателей в группе интактных крыс (не подвергшихся МОПП).
Таким образом, предлагаемый регенеративный препарат обладает терапевтическим эффектом при остром поражении печени животных. Существенных различий в эффективности препарата, полученного из различных источников культур мезенхимальных стволовых клеток, также не было выявлено.
Источники информации:
1. Адамс Р. Методы культуры клеток для биохимиков - М.: Мир, 1983. - 264 с.
2. Дыгай A.M., Зюзьков Г.Н. Клеточная терапия: новые подходы // Наука в России. - Москва: Изд-во «Наука», 2009. - Том. 169. - №1. С. 4-8.
3. Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., Жданов В.В., Зюзьков Г.Н., Мирошниченко Л.А., Симанина Е.В., Ставрова Л.А., Удут Е.В., Фонима Т.Н., Ветошкина Т.В., Хричкова Т.Ю., Ермакова Н.Н., Плотников М.Б., Алиев О.И., Чернышева Г.А. Фармакологические аспекты регенеративной медицины // Бюл. эксперим. биол. и медицины. - 2008. - Приложение 2. - С. 14-21.
4. Патофизиология: Учебник для медицинских ВУЗов. / Под ред. В.В. Новицкого, Е.Д. Гольдберга. - Томск: Изд-во Томского ун-та, 2001. - 681-687.
5. Дыгай A.M., Зюзьков Т.Н., Жданов В.В., Мадонов П.Г., Артамонов А.В., Бекарев А.А., Удут В.В. Иммобилизированный гранулоцитарный колониестимулирующий фактор. Фармакологические свойства и перспективы использования. - Томск: Изд-во: ООО «Печатная мануфактура», 2011. - 149 с.
6. Культура животных клеток. Методы / Под ред. Р. Френши - М.: Мир, 1989. - 333 с.
7. «Кондиционная среда, обладающая лечебным эффектом», № патента 2292212, дата публикации 27.01.07 г, авторы: Коноплянников А.Г., Колесникова А.И., Саенко А.С., Бардычев М.С., Пасов В.В., Курпешева А.К., Крикунова Л.И.;
8. «Биологически активный препарат "лимфокинин", обладающий иммуномодулирующими свойствами», № патента 2048816, № заявки 93031657/14, дата подачи заявки 06.07.1993, дата публикации 27.11.1995, авторы: Быковская С.Н., Шадрин О.В., Дворянченко Д.Ю., патентообладатель ЗАО «Симера»;
9. «Средство для лечения ожогов и ран на основе цитокинов и факторов роста, секретируемых мезенхимными клетками человека, способ получения средства и способ лечения ожогов и ран», № патента 2574017, авторы: Стамбольский Д.В., Ткачук В.А., Семина Е.В., Тарасова Е.В., Рубина К.А., Кочегура Т.Н., Сысоева В.Ю., Ефименко А.Ю., Акопян Ж.А.;
10. «Средство для изменения скорости роста или репродукции клеток, способ его получения, способ стимуляции заживления ран или лечения ожогов, способ коррекции косметического дефекта, способ ингибирования старения кожи и способ стимуляции роста волос», № патента 2280459, № заявки 2001133453/13, дата публикации заявки 20.01.2005, дата публикации 27.07.2006, авторы: Нотон Г.К. (Us), Хорвитз Д.Л. (Us), Эпплгейт М.А. (Us), Зелтинджер Дж. (Us), Мэнсбридж Дж.Н. (Us), Керн A. (Us), Лэндин Л.К. (Us), Рэтклифф Э. (Us), Пинни Р.Э. (Us); патентообладатель: Скинмедика, Инк. (Us);
11. «Mesenchymal stem cell conditioned medium», № патента WO 2008020815 A1, № заявки PCT/SG2007/000257, дата публикации 21.02.2008 г., авторы: Sai Kiang Lim, Elias Lye, патентообладатель Agency For Science, Technology And Research;
12. A. van Koppen, J.A. Joles, B. W. M. van Balkom et al., "Human embryonic mesenchymal stem cell-derived conditioned medium rescues kidney function in rats with established chronic kidney disease," PLoS ONE, vol. 7, no. 6, Article ID e38746, 2012;
13. В.R. Zhou, Y. Xu, S.L. Guo et al., "The effect of conditioned media of adipose-derived stem cells on wound healing after ablative fractional carbon dioxide laser resurfacing," BioMed Research International, vol. 2013, Article ID 519126, 9 pages, 2013;
14. M.K. Jr. Patterson, Measurement of growth and viability of cells in culture. In: W.B. Jakoby, I.H. Pastin, eds., Methods in Enzymology, New York: Academic Press Inc., Vol. 58, 141-152, 1979;
15. Mbalaviele G, Jaiswal N, Meng A, Cheng L, Van Den Bos C, Thiede M. Human mesenchymal stem cells promote human osteoclast differentiation from CD34+ bone marrow hematopoietic progenitors // Endocrinology. 1999 Aug; 140 (8): 3736-3743;
16. S.H. Bhang, S. Lee, J.Y. Shin, T.J. Lee, H.K. Jang, and B.S. Kim, "Efficacious and clinically relevant conditioned medium of human adipose-derived stem cells for therapeutic angiogenesis," Molecular Therapy, vol. 22, no. 4, p. 862, 2014;
17. Leo Timmers, Sai Kiang Lim, Imo E. Hoefer «Human mesenchymal stem cell conditioned medium improves cardiac function following myocardial infarction», Stem Cell Research vol. 6, pp. 206-214, 2011;
18. Reza Moghadasali, Henricus A.M. Mutsaers, Mahnaz Azarnia "Mesenchymal stem cell-conditioned medium accelerates regeneration of human renal proximal tubule epithelial cells after gentamicin toxicity" - Experimental and Toxicologic Pathology - vol. 65, pp.. 595-600, 2013.
Claims (1)
- Способ получения регенеративного ветеринарного препарата включает: культивирование выделенных de novo или деконсервированных мезенхимальных стволовых клеток, получаемых из жировой ткани или костного мозга животного, в жидкой питательной среде с добавлением 10 % фетальной бычьей сыворотки, получение кондиционной среды с содержанием интерлейкинов: ИЛ-1β, ИЛ-2, ИЛ-6 и ИЛ-10 в концентрациях не менее 2; 2; 10 и 2 пг/мл, добавление экстракта МСК, полученного путем замораживания-оттаивания клеточной суспензии, добавление глицина до конечной концентрации 20 мг/мл раствора для лиофилизации, стерилизующую фильтрацию и лиофилизацию.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2016148715A RU2662172C2 (ru) | 2016-12-13 | 2016-12-13 | Способ получения регенеративного ветеринарного препарата на основе экстракта мезенхимальных стволовых клеток и кондиционной среды |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2016148715A RU2662172C2 (ru) | 2016-12-13 | 2016-12-13 | Способ получения регенеративного ветеринарного препарата на основе экстракта мезенхимальных стволовых клеток и кондиционной среды |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2016148715A3 RU2016148715A3 (ru) | 2018-06-13 |
| RU2016148715A RU2016148715A (ru) | 2018-06-13 |
| RU2662172C2 true RU2662172C2 (ru) | 2018-07-24 |
Family
ID=62619402
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2016148715A RU2662172C2 (ru) | 2016-12-13 | 2016-12-13 | Способ получения регенеративного ветеринарного препарата на основе экстракта мезенхимальных стволовых клеток и кондиционной среды |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2662172C2 (ru) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2720800C1 (ru) * | 2018-11-28 | 2020-05-13 | Общество с ограниченной ответственностью "НОВИСТЕМ" | Средство для крупного рогатого скота, обладающее противовоспалительной, регенеративной, иммуномодулирующей, детоксикационной, адаптогенной активностью и способное регулировать метаболизм |
| RU2720812C1 (ru) * | 2018-11-28 | 2020-05-13 | Общество с ограниченной ответственностью "НОВИСТЕМ" | Способ получения средства, обладающего противовоспалительной, регенеративной, иммуномодулирующей, детоксикационной, адаптогенной активностью и способного регулировать метаболизм |
| RU2844821C1 (ru) * | 2024-07-10 | 2025-08-07 | Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Федеральный научный центр - Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии имени К.И. Скрябина и Я.Р. Коваленко Российской академии наук" (ФГБНУ ФНЦ ВИЭВ РАН) | Способ восстановления культур клеток рыб после криоконсервации |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2111426C1 (ru) * | 1995-11-03 | 1998-05-20 | Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" | Способ лиофильной сушки биопрепарата |
| RU2178309C2 (ru) * | 2000-01-12 | 2002-01-20 | Российский научно-исследовательский институт геронтологии | Антитимоцитарный глобулин для внутривенного введения и способ его получения |
| RU2341270C2 (ru) * | 2006-12-28 | 2008-12-20 | Александр Сергеевич Ботин | Композиция для стимулирования роста и регенерации клеток, а также способы ее получения |
| RU2409350C2 (ru) * | 2005-03-08 | 2011-01-20 | Интервет Интернэшнл Б.В. | Химически определенный стабилизатор |
| RU2495565C1 (ru) * | 2012-10-03 | 2013-10-20 | Игорь Николаевич Габриэль | Способ стимуляции роста и повышения резистентности сельскохозяйственных животных |
-
2016
- 2016-12-13 RU RU2016148715A patent/RU2662172C2/ru not_active IP Right Cessation
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2111426C1 (ru) * | 1995-11-03 | 1998-05-20 | Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" | Способ лиофильной сушки биопрепарата |
| RU2178309C2 (ru) * | 2000-01-12 | 2002-01-20 | Российский научно-исследовательский институт геронтологии | Антитимоцитарный глобулин для внутривенного введения и способ его получения |
| RU2409350C2 (ru) * | 2005-03-08 | 2011-01-20 | Интервет Интернэшнл Б.В. | Химически определенный стабилизатор |
| RU2341270C2 (ru) * | 2006-12-28 | 2008-12-20 | Александр Сергеевич Ботин | Композиция для стимулирования роста и регенерации клеток, а также способы ее получения |
| RU2495565C1 (ru) * | 2012-10-03 | 2013-10-20 | Игорь Николаевич Габриэль | Способ стимуляции роста и повышения резистентности сельскохозяйственных животных |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| АНДРЕЕВА Е.Р. "Мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки при моделировании тканевой ("физиологической") гипоксии in vitro" // Авто дмн, Москва, 2016, стр.17, 18, 24, [он-лайн], [найдено 03.11.2017]. * |
| АНДРЕЕВА Е.Р. "Мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки при моделировании тканевой ("физиологической") гипоксии in vitro" // Автореферат дмн, Москва, 2016, стр.17, 18, 24, [он-лайн], [найдено 03.11.2017]. Найдено из Интернет: URL: http://www.imbp.ru/webpages/win1251/Science/DisserSov/Andreeva2016/Andreeva-ref.pdf. * |
| Найдено из Интернет: URL: http://www.imbp.ru/webpages/win1251/Science/DisserSov/Andreeva2016/Andreeva-ref.pdf. * |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2720800C1 (ru) * | 2018-11-28 | 2020-05-13 | Общество с ограниченной ответственностью "НОВИСТЕМ" | Средство для крупного рогатого скота, обладающее противовоспалительной, регенеративной, иммуномодулирующей, детоксикационной, адаптогенной активностью и способное регулировать метаболизм |
| RU2720812C1 (ru) * | 2018-11-28 | 2020-05-13 | Общество с ограниченной ответственностью "НОВИСТЕМ" | Способ получения средства, обладающего противовоспалительной, регенеративной, иммуномодулирующей, детоксикационной, адаптогенной активностью и способного регулировать метаболизм |
| RU2844821C1 (ru) * | 2024-07-10 | 2025-08-07 | Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Федеральный научный центр - Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии имени К.И. Скрябина и Я.Р. Коваленко Российской академии наук" (ФГБНУ ФНЦ ВИЭВ РАН) | Способ восстановления культур клеток рыб после криоконсервации |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2016148715A3 (ru) | 2018-06-13 |
| RU2016148715A (ru) | 2018-06-13 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Yang et al. | Comparison of mesenchymal stem cells derived from gingival tissue and periodontal ligament in different incubation conditions | |
| CN106109496B (zh) | 人脐带间充质干细胞提取物冻干粉及制备方法 | |
| CN101748096B (zh) | 亚全能干细胞、其制备方法及其用途 | |
| CN103070161B (zh) | 一种脂肪间充质干细胞冻存液及冻存方法 | |
| CN1860222A (zh) | 用于临床和商业用途的干细胞 | |
| CN105112362B (zh) | 一种胎盘间充质干细胞的无血清培养基及其制备方法 | |
| Veron et al. | Isolation and characterization of olfactory ecto-mesenchymal stem cells from eight mammalian genera | |
| JP2010538681A (ja) | 人または動物胚から間葉系幹細胞を抽出及びその分泌物を抽出する方法 | |
| US20200360443A1 (en) | Stem cell material and method of manufacturing | |
| CN102732586A (zh) | 一种间充质干细胞分泌素的培养方法 | |
| US20170240856A1 (en) | Placenta-derived potential cells and preparing method thereof | |
| RU2323252C1 (ru) | Способ культивирования мезенхимальных стволовых клеток человека ex vivo | |
| RU2662172C2 (ru) | Способ получения регенеративного ветеринарного препарата на основе экстракта мезенхимальных стволовых клеток и кондиционной среды | |
| JP2017104091A (ja) | 間葉系細胞の製造方法 | |
| CN106701670A (zh) | 一种增强间充质干细胞分泌生物活性因子能力及培养液中活性因子的提取方法 | |
| RU2640556C2 (ru) | Культуральная среда для мезенхимальных стволовых клеток человека | |
| Schwarz et al. | Characterization of adipose-derived equine and canine mesenchymal stem cells after incubation in agarose-hydrogel | |
| Samadikuchaksaraei et al. | How does the supernatant of Lactobacillus acidophilus affect the proliferation and differentiation activities of rat bone marrow-derived stromal cells? | |
| JP2022501034A (ja) | 軟骨組織の生成に使用される単離された中隔軟骨エクソソーム | |
| Putra et al. | Evaluation of secretome tenogenic potential from adipose stem cells (ACS) in hypoxic condition with fresh frozen tendon scaffold using scleraxis (Scx), insulin-like growth factor 1 (IGF-1) and collagen type 1 | |
| Citro et al. | Mesenchymal Stem Cells | |
| US20250352699A1 (en) | Cell sheets and uses | |
| KR101538969B1 (ko) | 감태 추출물을 포함하는 중간엽 줄기세포 배양용 배지 조성물 | |
| Chailakhyan et al. | Proline-rich hypothalamic polypeptide has opposite effects on the proliferation of human normal bone marrow stromal cells and human giant-cell tumour stromal cells | |
| Sarsenova et al. | Synovium-Derived Mesenchymal Stem Cells in Combination with Low Molecular Weight Hyaluronic Acid for Cartilage Repair |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20191214 |
|
| TK4A | Correction to the publication in the bulletin (patent) |
Free format text: CORRECTION TO CHAPTER -MM4A- IN JOURNAL 28-2020 |