RU2537267C1 - Device for identification of nucleotide sequences - Google Patents
Device for identification of nucleotide sequences Download PDFInfo
- Publication number
- RU2537267C1 RU2537267C1 RU2013130177/10A RU2013130177A RU2537267C1 RU 2537267 C1 RU2537267 C1 RU 2537267C1 RU 2013130177/10 A RU2013130177/10 A RU 2013130177/10A RU 2013130177 A RU2013130177 A RU 2013130177A RU 2537267 C1 RU2537267 C1 RU 2537267C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- substrate
- nucleotide sequences
- oligonucleotides
- specific
- zone
- Prior art date
Links
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 title claims abstract description 42
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims abstract description 49
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 claims abstract description 34
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 34
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 27
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 26
- 230000005855 radiation Effects 0.000 claims abstract description 21
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 11
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 claims description 12
- 239000013307 optical fiber Substances 0.000 claims description 9
- 238000004451 qualitative analysis Methods 0.000 abstract description 9
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 abstract description 6
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 15
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 14
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 13
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 11
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 10
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 6
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 6
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 5
- 102000006635 beta-lactamase Human genes 0.000 description 5
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 5
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 5
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 5
- 239000012085 test solution Substances 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 230000004907 flux Effects 0.000 description 4
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 4
- 238000000034 method Methods 0.000 description 4
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 4
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- 108090000204 Dipeptidase 1 Proteins 0.000 description 3
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 3
- 238000013461 design Methods 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- 108020004256 Beta-lactamase Proteins 0.000 description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 2
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 2
- QSHDDOUJBYECFT-UHFFFAOYSA-N mercury Chemical compound [Hg] QSHDDOUJBYECFT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052753 mercury Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 2
- 238000002198 surface plasmon resonance spectroscopy Methods 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 238000002306 biochemical method Methods 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 230000001427 coherent effect Effects 0.000 description 1
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000009881 electrostatic interaction Effects 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- CPBQJMYROZQQJC-UHFFFAOYSA-N helium neon Chemical compound [He].[Ne] CPBQJMYROZQQJC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 229910044991 metal oxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000004706 metal oxides Chemical class 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 239000005543 nano-size silicon particle Substances 0.000 description 1
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 238000005192 partition Methods 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 239000004065 semiconductor Substances 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 238000009827 uniform distribution Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Landscapes
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к области молекулярной биологии и биохимии и может быть использовано для идентификации последовательностей нуклеотидов биологических и синтетических объектов, например, для идентификации генов, бактерий, вирусов и т.д.The invention relates to the field of molecular biology and biochemistry and can be used to identify nucleotide sequences of biological and synthetic objects, for example, to identify genes, bacteria, viruses, etc.
Известно устройство для идентификации последовательностей нуклеотидов, состоящее из источника света, излучение от которого направлено на отражающую подложку с иммобилизованными на ее поверхности олигонуклеотидами, и системы детекции отраженного от подложки света (Eliza Hutter, Marie-Paule Pileni, Detection of DNA Hybridization by Gold Nanoparticle Enhanced Transmission Surface Plasmon Resonance Spectroscopy // The Journal of Physical Chemistry B, V.107, №27, 2003, p.6497-6499).A device for identifying nucleotide sequences consisting of a light source, the radiation from which is directed to a reflective substrate with oligonucleotides immobilized on its surface, and a detection system for light reflected from a substrate (Eliza Hutter, Marie-Paule Pileni, Detection of DNA Hybridization by Gold Nanoparticle Enhanced Transmission Surface Plasmon Resonance Spectroscopy // The Journal of Physical Chemistry B, V.107, No. 27, 2003, p.6497-6499).
Известно устройство для идентификации последовательностей нуклеотидов, состоящее из просвечивающего электронного микроскопа, излучение от источника света которого направлено на прозрачную подложку с иммобилизованными на ее поверхности олигонуклеотидами (Eliza Hutter, Marie-Paule Pileni, Detection of DNA Hybridization by Gold Nanoparticle Enhanced Transmission Surface Plasmon Resonance Spectroscopy // The Journal of Physical Chemistry B, V.107, №27, 2003, p.6497-6499).A device for identifying nucleotide sequences consisting of a transmission electron microscope, the radiation from a light source of which is directed to a transparent substrate with oligonucleotides immobilized on its surface (Eliza Hutter, Marie-Paule Pileni, Detection of DNA Hybridization by Gold Nanoparticle Enhanced Transmission Surface Plasmon Resonance Spectroopy // The Journal of Physical Chemistry B, V. 107, No. 27, 2003, p. 6497-6499).
Наиболее близким к заявляемому является известное устройство для идентификации последовательностей нуклеотидов, состоящее из источника света, излучение от которого направлено на прозрачную подложку с иммобилизованными на ее поверхности олигонуклеотидами и расположенной под ней системой детекции интенсивности света, прошедшего через подложку (патент РСТ WO 01/18242 А1, кл. C12Q 1/68) - прототип. В данном техническом решении использована комбинированная горизонтальная подложка, способная как пропускать, так и частично отражать падающий на нее свет, состоящая из основания и верхней части подложки. На верхней внешней части подложки иммобилизованы олигонуклеотиды, специфические к различным последовательностям нуклеотидов исследуемых объектов. В данном техническом решении использованы источники света с высокостабилизированным по интенсивности потоком светового излучения, что обусловлено конструктивными особенностями известного устройства.Closest to the claimed is a known device for identifying nucleotide sequences, consisting of a light source, the radiation from which is directed to a transparent substrate with oligonucleotides immobilized on its surface and a system for detecting the light intensity transmitted through the substrate located under it (PCT patent WO 01/18242 A1 , CL C12Q 1/68) - prototype. In this technical solution, a combined horizontal substrate is used, capable of transmitting or partially reflecting the light incident on it, consisting of a base and an upper part of the substrate. On the upper outer part of the substrate, oligonucleotides specific for different nucleotide sequences of the studied objects are immobilized. In this technical solution, light sources with a highly stabilized in intensity flux of light radiation are used, which is due to the design features of the known device.
Недостатками известного технического решения является его относительная сложность, связанная с его конструктивными особенностями, а также то, что данное устройство не позволяет осуществлять анализ с последовательностей нуклеотидов с высокой точностью.The disadvantages of the known technical solution is its relative complexity associated with its design features, as well as the fact that this device does not allow analysis from nucleotide sequences with high accuracy.
Задачами изобретения являются упрощение известного устройства для идентификации последовательностей нуклеотидов, разработка устройства, позволяющего осуществлять идентификацию последовательностей нуклеотидов с более высокой точностью, а также расширение арсенала технических средств, дающих возможность идентифицировать последовательность нуклеотидов.The objectives of the invention are the simplification of the known device for identifying nucleotide sequences, the development of a device that allows for the identification of nucleotide sequences with higher accuracy, as well as expanding the arsenal of technical tools that make it possible to identify a nucleotide sequence.
Техническая задача изобретения заключается в упрощении устройства для идентификации последовательностей нуклеотидов и повышении точности идентификации последовательностей нуклеотидов.An object of the invention is to simplify a device for identifying nucleotide sequences and increasing the accuracy of identifying nucleotide sequences.
Указанный технический результат достигается тем, что в известном устройстве для идентификации последовательностей нуклеотидов, состоящем из источника света, излучение от которого направлено на прозрачную подложку с иммобилизованными на ее поверхности олигонуклеотидами и расположенной под ней системой детекции интенсивности света, прошедшего через подложку, подложка содержит не менее двух зон, на поверхности одной из которых иммобилизован слой олигонуклеотидов, неспецифических к исследуемой последовательности нуклеотидов, на поверхности другой зоны иммобилизован слой олигонуклеотидов, специфических к исследуемой последовательности нуклеотидов, а система детекции содержит не менее двух независимых фоточувствительных секций, каждая из которых освещена излучением, прошедшим только через одну зону.The specified technical result is achieved by the fact that in the known device for identifying nucleotide sequences consisting of a light source, the radiation from which is directed to a transparent substrate with oligonucleotides immobilized on its surface and a system for detecting the intensity of light transmitted through the substrate located below, the substrate contains at least two zones, on the surface of one of which a layer of oligonucleotides non-specific to the studied nucleotide sequence is immobilized ited another zone layer immobilized oligonucleotides specific for the target sequence of nucleotides and detection system comprises at least two independent photosensitive sections, each of which is illuminated by radiation transmitted through only one zone.
Указанный технический результат может быть достигнут, если в качестве подложки устройство содержит внешнюю поверхность светочувствительной матрицы.The specified technical result can be achieved if, as a substrate, the device contains the outer surface of the photosensitive matrix.
Указанный технический результат также может быть достигнут, если в качестве подложки устройство содержит не менее двух торцевых поверхностей от разных оптоволокон, причем каждая из поверхностей содержит не более одной зоны.The indicated technical result can also be achieved if the device contains at least two end surfaces from different optical fibers as a substrate, and each of the surfaces contains no more than one zone.
Предлагаемое техническое решение является новым и не описано в научно-технической литературе.The proposed technical solution is new and not described in the scientific and technical literature.
Предлагаемое изобретение может быть использовано для идентификации последовательностей нуклеотидов биологических и синтетических объектов, например, таких как гены, бактерии, вирусы и т.д. При этом исследуемые последовательности нуклеотидов могут отличаться как по химическому составу (строению), так и по количеству содержащихся в них звеньев.The present invention can be used to identify nucleotide sequences of biological and synthetic objects, for example, such as genes, bacteria, viruses, etc. Moreover, the studied nucleotide sequences may differ both in chemical composition (structure) and in the number of units contained in them.
В изобретении могут быть использованы различные источники света, например, такие как лазерный модуль, ртутная лампа, светодиод и т.д. При этом в отличие от прототипа в устройстве не обязательно использовать источники света с высокостабилизированным по интенсивности потоком светового излучения, что упрощает предлагаемое устройство.Various light sources can be used in the invention, for example, such as a laser module, mercury lamp, LED, etc. In this case, unlike the prototype, the device does not have to use light sources with a highly stabilized in intensity flux of light radiation, which simplifies the proposed device.
Предлагаемое техническое решение позволяет проводить как качественный, так и количественный анализ последовательностей нуклеотидов в исследуемых объектах. При проведении количественного анализа целесообразнее использовать источники света с равномерным распределением интенсивности светового излучения. В данном техническом решении источник света должен располагаться так, чтобы его излучение было направлено на каждую из зон прозрачной подложки.The proposed technical solution allows both qualitative and quantitative analysis of nucleotide sequences in the studied objects. When conducting a quantitative analysis, it is more expedient to use light sources with a uniform distribution of the intensity of light radiation. In this technical solution, the light source should be located so that its radiation is directed to each of the zones of the transparent substrate.
В предлагаемом устройстве подложка содержит не менее двух зон, на поверхности одной из которых иммобилизован слой олигонуклеотидов, неспецифических к исследуемой последовательности нуклеотидов, а на поверхности другой зоны иммобилизован слой олигонуклеотидов, специфических к исследуемой последовательности нуклеотидов. При этом зоны могут как соприкасаться, но не пересекаться друг с другом, так и быть отделены друг от друга пространством, перегородкой и т.д. Наличие в предлагаемом техническом решении в отличие от прототипа не менее двух зон в сочетании с нижеописанной системой детекции дает возможность повысить точность идентификации последовательностей нуклеотидов. При этом на одной из зон обязательно должны быть иммобилизованы неспецифические олигонуклеотиды для того, чтобы исключить влияние актов неспецифического связывания, а также исключить нежелательное влияние флуктуации интенсивности света по ходу эксперимента. Каждая другая зона содержит иммобилизованные на поверхности подложки олигонуклеотиды, специфические только к одному исследуемому объекту. Площадь каждой из зон может быть как одинаковой, так и отличаться друг от друга. Во втором случае вводят поправочные коэффициенты, учитывающие площадь каждой из зон.In the proposed device, the substrate contains at least two zones, on the surface of one of which is immobilized a layer of oligonucleotides that are not specific to the nucleotide sequence being studied, and on the surface of the other zone, a layer of oligonucleotides specific to the nucleotide sequence being studied is immobilized. Moreover, the zones can either adjoin, but not intersect with each other, and can be separated from each other by space, a partition, etc. The presence in the proposed technical solution, in contrast to the prototype, of at least two zones in combination with the detection system described below makes it possible to increase the accuracy of identification of nucleotide sequences. Moreover, non-specific oligonucleotides must be immobilized in one of the zones in order to exclude the influence of acts of non-specific binding, and also to exclude the undesirable effect of fluctuations in light intensity during the experiment. Each other zone contains oligonucleotides immobilized on the surface of the substrate, specific for only one studied object. The area of each of the zones can be either the same or different from each other. In the second case, correction factors are introduced that take into account the area of each of the zones.
В данном техническом решении подложка и система детекции фактически совмещены, поэтому количество зон всегда совпадает с количеством фоточувствительных секций. Для изготовления подложки могут быть использованы внешняя поверхность светочувствительной матрицы или не менее двух торцевых поверхностей от разных оптоволокон. При этом геометрические размеры подложки в зависимости от решаемой задачи могут варьироваться в широких пределах. В предлагаемом изобретении система детекции содержит не менее двух фоточувствительных независимых секций, каждая из которых освещена излучением, прошедшим только через одну зону, в качестве которых могут быть использованы, например, двухсекционный фотодиод, КМОП матрица (светочувствительная матрица, выполненная на основе комплементарной металлооксидной полупроводниковой технологии), прибор с зарядовой связью (ПЗС матрица) и т.д. Устройство может содержать в качестве подложки внешнюю поверхность светочувствительной матрицы, т.е. олигонуклеотиды иммобилизованы непосредственно на поверхности светочувствительных секций. При использовании в качестве подложки не менее двух торцевых поверхностей от разных оптоволокон нуклеотиды иммобилизуются непосредственно на торцевых поверхностях оптоволокон. При этом излучение, прошедшее через модифицированный торец оптоволокна, попадает на одну из фоточувствительных секций, а фоточувствительная секция может располагаться как со стороны модифицированного, так и немодифицированного торца оптоволокна. Стоит отметить, что в предлагаемом техническом решении каждая из торцевых поверхностей оптоволокон содержит не более одной зоны. Каждая из фоточувствительных секций может состоять, например, как из одной, так и нескольких фотодиодных секций, может представлять собой как всю матрицу, так и часть КМОП матрицы, ПЗС матрицы или других фоточувствительных элементов. Рассеянное излучение, обусловленное методикой эксперимента, может попадать только на одну фоточувствительную секцию, что позволяет повысить точность экспериментальных измерений.In this technical solution, the substrate and the detection system are actually combined, so the number of zones always coincides with the number of photosensitive sections. For the manufacture of the substrate, the outer surface of the photosensitive matrix or at least two end surfaces from different optical fibers can be used. In this case, the geometric dimensions of the substrate, depending on the problem to be solved, can vary within wide limits. In the present invention, the detection system contains at least two photosensitive independent sections, each of which is illuminated by radiation that has passed through only one zone, for which, for example, a two-section photodiode, CMOS sensor (photosensitive matrix made on the basis of complementary metal oxide semiconductor technology can be used) ), a charge-coupled device (CCD), etc. The device may comprise, as a substrate, the outer surface of the photosensitive matrix, i.e. oligonucleotides are immobilized directly on the surface of the photosensitive sections. When using at least two end surfaces from different optical fibers as a substrate, nucleotides are immobilized directly on the end surfaces of the optical fibers. In this case, the radiation transmitted through the modified end face of the optical fiber enters one of the photosensitive sections, and the photosensitive section can be located both on the side of the modified or unmodified end of the optical fiber. It should be noted that in the proposed technical solution, each of the end surfaces of the optical fibers contains no more than one zone. Each of the photosensitive sections can consist, for example, of one or several photodiode sections, can represent both the entire matrix and part of the CMOS matrix, CCD matrix or other photosensitive elements. The scattered radiation, due to the experimental technique, can fall on only one photosensitive section, which allows to increase the accuracy of experimental measurements.
Иммобилизацию специфических и неспецифических олигонуклеотидов на поверхности подложки любого вышеописанного типа можно осуществлять различными известными методами. При этом возможна как химическая иммобилизация олигонуклеотидов с использованием различных химических соединений, содержащих якорные группы, так и физическая иммобилизация, основанная, например, на электростатическом взаимодействии. Плотность иммобилизованных на поверхности подложки специфических и неспецифических олигонуклеотидов может варьироваться в широких пределах в зависимости от решаемой конкретной технической задачи.The immobilization of specific and non-specific oligonucleotides on the surface of a substrate of any type described above can be carried out by various known methods. In this case, both chemical immobilization of oligonucleotides using various chemical compounds containing anchor groups and physical immobilization, based, for example, on electrostatic interaction, are possible. The density of specific and nonspecific oligonucleotides immobilized on the surface of the substrate can vary widely depending on the specific technical problem being solved.
Предлагаемое изобретение работает следующим образом. На поверхности разных зон подложки известными приемами иммобилизуют специфические и неспецифические олигонуклеотиды к исследуемому объекту. После этого проводят измерения разности интенсивности света, прошедшего через разные зоны подложки. Таким образом, получают сигнал, соответствующий нулевой концентрации исследуемых соединений. Известными биохимическими методами нарабатывают исследуемые последовательности нуклеотидов. Дальнейший анализ может проводиться, например, двумя известными способами. Первый из них заключается в предварительной иммобилизации исследуемых последовательностей нуклеотидов на поверхности носителя (наночастиц) с последующей обработкой вышеназванных зон подложки суспензией модифицированных наночастиц. При этом происходит адсорбция наночастиц на поверхности соответствующих зон подложки за счет комплементарного связывания специфических олигонуклеотидов с идентифицируемой последовательностью нуклеотидов. В зонах, содержащих неспецифические олигонуклеотиды к идентифицируемой последовательности нуклеотидов, вышеуказанного комплементарного связывания не происходит, в результате сорбция наночастиц на поверхности этих зон практически отсутствует.The present invention works as follows. Specific and nonspecific oligonucleotides are immobilized on the surface of different zones of the substrate by known methods to the studied object. After that, measurements are made of the difference in the intensity of light transmitted through different zones of the substrate. Thus, a signal corresponding to a zero concentration of the test compounds is obtained. Known biochemical methods produce the studied nucleotide sequence. Further analysis can be carried out, for example, in two known ways. The first of these consists in preliminary immobilization of the studied nucleotide sequences on the surface of the carrier (nanoparticles) with subsequent processing of the above-mentioned zones of the substrate with a suspension of modified nanoparticles. In this case, adsorption of nanoparticles on the surface of the corresponding zones of the substrate occurs due to the complementary binding of specific oligonucleotides with an identifiable nucleotide sequence. In zones containing nonspecific oligonucleotides to an identifiable nucleotide sequence, the above complementary binding does not occur, as a result, sorption of nanoparticles on the surface of these zones is practically absent.
Другой известный способ заключается в предварительном введении биотина в исследуемую последовательность нуклеотидов. Затем поверхность подложки, содержащую иммобилизованные олигонуклеотиды, обрабатывают раствором исследуемых последовательностей нуклеотидов, модифицированных биотином, в результате чего происходит комплементарное связывание специфических олигонуклеотидов с идентифицируемой последовательностью нуклеотидов на поверхности зон подложки. После этого модифицированную таким образом подложку обрабатывают суспензией наночастиц, содержащих химически связанный с ними стрептавидин. При этом наночастицы сорбируются только в тех зонах, где произошло комплементарное связывание биотина со стрептавидином.Another known method is the preliminary introduction of biotin into the studied nucleotide sequence. Then, the surface of the substrate containing immobilized oligonucleotides is treated with a solution of the studied nucleotide sequences modified with biotin, resulting in the complementary binding of specific oligonucleotides with an identifiable sequence of nucleotides on the surface of the zones of the substrate. After that, the substrate thus modified is treated with a suspension of nanoparticles containing chemically bound streptavidin. In this case, nanoparticles are sorbed only in those zones where the complementary binding of biotin to streptavidin occurred.
В обоих способах перед измерениями подложку промывают для удаления не вступивших в реакцию реагентов. Затем измеряют разность интенсивности света, прошедшего через специфические и неспецифическую зоны подложки. Изменение разности интенсивности пропорционально количеству сорбированных наночастиц, которая соответствует определенной концентрации исследуемых последовательностей нуклеотидов в растворе. Это позволяет проводить как качественный, так и количественный анализ исследуемых последовательностей нуклеотидов.In both methods, the substrate is washed prior to measurement to remove unreacted reagents. Then measure the difference in the intensity of the light transmitted through the specific and non-specific areas of the substrate. The change in the intensity difference is proportional to the number of adsorbed nanoparticles, which corresponds to a certain concentration of the studied nucleotide sequences in solution. This allows both qualitative and quantitative analysis of the studied nucleotide sequences.
Преимущества предлагаемого изобретения иллюстрируют следующие примеры.The advantages of the invention are illustrated by the following examples.
Пример 1 (качественный анализ)Example 1 (qualitative analysis)
В опыте используют устройство (систему) для идентификации последовательностей нуклеотидов, имеющее источник света, в качестве которого оно содержит светодиод белого света, излучение от которого направлено на поверхность светочувствительной матрицы с двумя отделенными друг от друга зонами. Одна из зон содержит на рабочей поверхности химически иммобилизованные олигонуклеотиды, специфические к последовательности нуклеотидов бактерии Е.coli, а другая зона содержит на рабочей поверхности химически иммобилизованные олигонуклеотиды, неспецифические к последовательностям нуклеотидов Е.coli. В качестве светочувствительной матрицы устройство содержит ПЗС матрицу марки Hamamatsu (Япония). При таких конструктивных особенностях устройства на каждую независимую фоточувствительную секцию устройства попадает излучение, прошедшее только через одну зону.In the experiment, a device (system) is used to identify nucleotide sequences having a light source, in which it contains a white light LED, the radiation from which is directed to the surface of the photosensitive matrix with two zones separated from each other. One zone contains chemically immobilized oligonucleotides on the working surface that are specific for the nucleotide sequence of the E. coli bacteria, and the other zone contains chemically immobilized oligonucleotides on the working surface that are nonspecific to the E. coli nucleotide sequences. As a photosensitive matrix, the device contains a CCD matrix of the brand Hamamatsu (Japan). With such design features of the device, radiation that has passed through only one zone is incident on each independent photosensitive section of the device.
Качественную идентификацию (анализ) последовательностей нуклеотидов Е.coli с помощью данного устройства проводят следующим образом. Предварительно проводят измерения разности интенсивности света, прошедшего через разные зоны подложки. После этого биотин химически прививают к исследуемой последовательности нуклеотидов Е.coli, а белок стрептавидин к поверхности наночастиц кремния с диаметром частиц 100 нанометр (нм). Затем поверхность подложки, содержащую иммобилизованные олигонуклеотиды, обрабатывают исследуемым раствором последовательностей нуклеотидов, модифицированных биотином, в результате чего происходит комплементарное связывание специфических олигонукелотидов с идентифицируемой последовательностью нуклеотидов на поверхности зоны подложки. После этого модифицированную таким образом подложку обрабатывают суспензией наночастиц, содержащих химически связанный с ними стрептавидин. При этом наночастицы сорбируются только в зоне, где произошло связывание биотина со стрептавидином. После этого промывают подложку в буферном растворе и бидистиллированной воде для удаления не вступивших в реакцию реагентов и высушивают до постоянной массы. Затем измеряют разность интенсивности света, прошедшего через специфические и неспецифическую зоны подложки. Отклонение разности интенсивности от базового уровня говорит о присутствии последовательностей нуклеотидов Е.coli в исследуемом растворе. Таким образом, данное устройство позволяет проводить качественный анализ последовательностей нуклеотидов с точностью 92%.Qualitative identification (analysis) of the sequences of E. coli nucleotides using this device is as follows. Preliminarily, measurements are made of the difference in the intensity of light transmitted through different zones of the substrate. After this, biotin is chemically grafted to the studied nucleotide sequence of E. coli, and the streptavidin protein is attached to the surface of silicon nanoparticles with a particle diameter of 100 nanometers (nm). Then, the substrate surface containing immobilized oligonucleotides is treated with the test solution of biotin-modified nucleotide sequences, resulting in the complementary binding of specific oligonucleotides to an identifiable nucleotide sequence on the surface of the substrate zone. After that, the substrate thus modified is treated with a suspension of nanoparticles containing chemically bound streptavidin. In this case, nanoparticles are sorbed only in the zone where the binding of biotin to streptavidin took place. After that, the substrate is washed in buffer solution and bidistilled water to remove unreacted reagents and dried to constant weight. Then measure the difference in the intensity of the light transmitted through the specific and non-specific areas of the substrate. The deviation of the intensity difference from the baseline indicates the presence of E. coli nucleotide sequences in the test solution. Thus, this device allows for a qualitative analysis of nucleotide sequences with an accuracy of 92%.
Затем производят аналогичный эксперимент, но только используют раствор с последовательностями нуклеотидов, не принадлежащих Е.coli. Нулевое отклонение разности интенсивности от базового уровня говорит об отсутствии последовательностей нуклеотидов Е.coli в исследуемом раствореThen a similar experiment is performed, but only a solution with nucleotide sequences not belonging to E. coli is used. A zero deviation of the intensity difference from the baseline indicates the absence of E. coli nucleotide sequences in the test solution
Пример 2 (количественный анализ)Example 2 (quantitative analysis)
В опыте используют устройство, аналогичное описанному в примере 1, однако используют набор растворов, содержащих известные концентрации последовательностей нуклеотидов Е.Coli от 0 до 5 нанограмм/миллилитр (нг/мл). Для каждого раствора определяют отклонение разности интенсивности света, прошедшего через разные зоны, от базового уровня. На основе этих данных строят градуировочный график зависимости отклонения разности интенсивности света от концентрации последовательностей нуклеотидов в исследуемом растворе.In the experiment, a device similar to that described in example 1 is used, however, a set of solutions containing known concentrations of E. Coli nucleotide sequences from 0 to 5 nanograms / milliliter (ng / ml) is used. For each solution, the deviation of the difference in the intensity of light passing through different zones from the base level is determined. Based on these data, a calibration graph is plotted for the deviation of the difference in light intensity from the concentration of nucleotide sequences in the test solution.
Затем проводят аналогичный эксперимент с использованием раствора последовательностей нуклеотидов Е.coli, взятых в концентрации 11 нг/мл. Измеряют отклонение разности интенсивности света, прошедшего через разные зоны, от базового уровня и по градуировочному графику определяют, что в исследуемом растворе присутствует последовательность нуклеотидов Е.Coli в концентрации 12 нг/мл.Then, a similar experiment is carried out using a solution of E. coli nucleotide sequences taken at a concentration of 11 ng / ml. The deviation of the difference in the intensity of light transmitted through different zones from the base level is measured, and it is determined from the calibration graph that the test solution contains an E. Coli nucleotide sequence at a concentration of 12 ng / ml.
Эксперимент был проведен 5 раз, в результате было установлено, что точность определения концентрации последовательностей нуклеотидов составляет 91%.The experiment was carried out 5 times, as a result it was found that the accuracy of determining the concentration of nucleotide sequences is 91%.
Пример 3Example 3
Опыт проводят аналогично примеру 1, однако используют устройство, имеющее в виде подложки 3 торцевые поверхности (зоны) от трех различных оптоволокон. Одна из зон содержит на рабочей поверхности химически иммобилизованные олигонуклеотиды, специфические к последовательности нуклеотидов бактерии Е coli, а другая зона содержит на рабочей поверхности иммобилизованные олигонуклеотиды, соответствующие специфическим участкам кодирующих генов бактериальных ферментов бета-лактамаз СТХ-М типа, а третья зона содержит олигонуклеотиды, неспецифические к последовательностям нуклеотидов Е coli и бета-лактамаз СТХ-М.The experiment is carried out analogously to example 1, but using a device having in the form of a substrate 3 end surfaces (zones) from three different optical fibers. One of the zones contains chemically immobilized oligonucleotides on the working surface that are specific for the nucleotide sequence of the bacterium E coli, and the other zone contains immobilized oligonucleotides on the working surface that correspond to specific sections of the STX-M type beta-lactamase coding genes, and the third zone contains oligonucleotides, nonspecific to the nucleotide sequences of E coli and beta-lactamase CTX-M.
В опыте используют устройство, содержащее в качестве источника света твердотельный лазерный модуль LDM-5 Laserex Ltd. (Австралия), а в качестве системы детекции устройство содержит трехсекционный фотодиод.In the experiment, a device containing an LDM-5 Laserex Ltd. solid-state laser module as a light source is used (Australia), and as a detection system, the device contains a three-section photodiode.
Эксперимент показывает, что данное устройство позволяет одновременно проводить качественный анализ различных последовательностей нуклеотидов с точностью 90%.The experiment shows that this device allows simultaneous qualitative analysis of various nucleotide sequences with an accuracy of 90%.
Пример 4Example 4
Опыт проводят аналогично примеру 1, однако используют устройство, содержащее в качестве источника света ртутную лампу и имеющее подложку, представляющую собой КМОП матрицу, разделенную на две секции. При этом одна из зон содержит на рабочей поверхности физически иммобилизованные олигонуклеотиды, соответствующие специфическим участкам кодирующих генов бактериальных ферментов бета-лактамаз ТЕМ типа, а другая зона содержит на рабочей поверхности физически иммобилизованные олигонуклеотиды, неспецифические к последовательностям нуклеотидов бета-лактамаз ТЕМ типа.The experiment is carried out analogously to example 1, but using a device containing a mercury lamp as a light source and having a substrate, which is a CMOS matrix, divided into two sections. In this case, one of the zones on the working surface contains physically immobilized oligonucleotides corresponding to specific regions of the TEM type beta-lactamase coding genes for bacterial enzymes, and the other zone contains physically immobilized oligonucleotides on the working surface that are non-specific for TEM type beta-lactamases nucleotide sequences.
Эксперимент показывает, что данное устройство позволяет проводить качественный анализ последовательности нуклеотидов бета-лактамаз ТЕМ типа с точностью 92%.The experiment shows that this device allows a qualitative analysis of the nucleotide sequence of beta-lactamases TEM type with an accuracy of 92%.
Пример 5 (контрольный, по прототипу)Example 5 (control, prototype)
В опыте используют устройство для идентификации последовательностей нуклеотидов, состоящее из источника света, в качестве которого оно содержит гелий-неоновый лазер марки Coherent Inc с высокостабилизированным по интенсивности потоком светового излучения. Излучение от лазера направлено на прозрачную стеклянную подложку, содержащую только одну зону, на поверхности которой химически иммобилизованы олигонуклеотиды, специфические к последовательности нуклеотидов бактерии Е.Coli. В качестве системы детекции устройство содержит фотодиод марки Hamamatsu (Япония).In the experiment, a device for identifying nucleotide sequences consisting of a light source, in which it contains a helium-neon laser of the brand Coherent Inc with a highly stable intensity flux of light radiation, is used. Laser radiation is directed to a transparent glass substrate containing only one zone, on the surface of which oligonucleotides specific for the nucleotide sequence of E. coli are chemically immobilized. As a detection system, the device contains a photodiode brand Hamamatsu (Japan).
Качественную идентификацию (анализ) последовательностей нуклеотидов Е.coli с помощью данного устройства проводят аналогично примеру 1, за исключением того, что определяют не разность интенсивностей от различных фоточувствительных секций, а проводят определение изменения интенсивности света на одной секции.Qualitative identification (analysis) of the E. coli nucleotide sequences using this device is carried out analogously to example 1, except that it is not the intensity difference from the various photosensitive sections that is determined, but the change in the light intensity in one section is determined.
Эксперимент показывает, что данное устройство позволяет проводить качественный анализ последовательности нуклеотидов бактерии Е.coli с точностью 75%.The experiment shows that this device allows a qualitative analysis of the nucleotide sequence of the E. coli bacterium with an accuracy of 75%.
Таким образом, из приведенных примеров видно, что предложенное устройство действительно позволяет проводить качественный и количественный анализ последовательностей нуклеотидов, упрощает известное устройство для идентификации последовательности нуклеотидов за счет устранения необходимости использования источника света с высокостабилизированным по интенсивности потоком светового излучения, повышает точность идентификации последовательностей нуклеотидов с 75% (прототип) до 92% и расширяет арсенал технических средств, которые могут быть использованы для идентификации последовательностей нуклеотидов.Thus, from the above examples it is seen that the proposed device does allow a qualitative and quantitative analysis of nucleotide sequences, simplifies the known device for identifying a nucleotide sequence by eliminating the need to use a light source with a highly stable intensity flux of light radiation, and improves the accuracy of identifying nucleotide sequences from 75 % (prototype) to 92% and expands the arsenal of technical means that I can It is used to identify nucleotide sequences.
Claims (3)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2013130177/10A RU2537267C1 (en) | 2013-07-03 | 2013-07-03 | Device for identification of nucleotide sequences |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2013130177/10A RU2537267C1 (en) | 2013-07-03 | 2013-07-03 | Device for identification of nucleotide sequences |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2537267C1 true RU2537267C1 (en) | 2014-12-27 |
| RU2013130177A RU2013130177A (en) | 2015-01-10 |
Family
ID=53278952
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2013130177/10A RU2537267C1 (en) | 2013-07-03 | 2013-07-03 | Device for identification of nucleotide sequences |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2537267C1 (en) |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2001018242A1 (en) * | 1999-09-08 | 2001-03-15 | Institut für Physikalische Hochtechnologie e.V. | Affinity sensor for the detection of biological and/or chemical species and use thereof |
| RU69866U1 (en) * | 2007-09-14 | 2008-01-10 | Игорь Эдуардович Грановский | BIOCHIP |
| RU2011117264A (en) * | 2008-10-01 | 2012-11-10 | Конинклейке Филипс Электроникс Н.В. (Nl) | METHOD FOR TESTING AND QUALITY CONTROL OF NUCLEIC ACIDS ON A SUBSTRATE |
-
2013
- 2013-07-03 RU RU2013130177/10A patent/RU2537267C1/en active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2001018242A1 (en) * | 1999-09-08 | 2001-03-15 | Institut für Physikalische Hochtechnologie e.V. | Affinity sensor for the detection of biological and/or chemical species and use thereof |
| RU69866U1 (en) * | 2007-09-14 | 2008-01-10 | Игорь Эдуардович Грановский | BIOCHIP |
| RU2011117264A (en) * | 2008-10-01 | 2012-11-10 | Конинклейке Филипс Электроникс Н.В. (Nl) | METHOD FOR TESTING AND QUALITY CONTROL OF NUCLEIC ACIDS ON A SUBSTRATE |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2013130177A (en) | 2015-01-10 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CA2707600C (en) | Alternate labeling strategies for single molecule sequencing | |
| RU2731841C2 (en) | Device and method based on photon structures for use in obtaining luminescent images of sites within pixel | |
| Kleinjung et al. | Fibre-optic genosensor for specific determination of femtomolar DNA oligomers | |
| JP4949560B2 (en) | Nucleic acid based detection | |
| NL2020612B1 (en) | Light detection devices with protective liner and methods of manufacturing same | |
| US7122384B2 (en) | Resonant light scattering microparticle methods | |
| US20130244895A1 (en) | Microwell Arrays for Direct Quantification of Analytes on a Flat Sample | |
| JP2009540326A (en) | Increased specificity of analyte detection by measuring bound and unbound labels | |
| Kim et al. | A non-spectroscopic optical biosensor for the detection of pathogenic Salmonella Typhimurium based on a stem-loop DNA probe and retro-reflective signaling | |
| Lu et al. | Electro‐Optical Detection of Single Molecules Based on Solid‐State Nanopores | |
| CN101346626A (en) | Method for measuring one or multiple analysis articles in samples with biological source and complex composition | |
| EP3788374A1 (en) | Imaging assays | |
| EP0851228A1 (en) | Highly sensitive fluorescent immunoassay | |
| Ekiz-Kanik et al. | Surface chemistry and morphology in single particle optical imaging | |
| Nikitin et al. | Picoscope, a new label-free biosensor | |
| TW201403048A (en) | Sensor for detection of a target of interest | |
| CA2669398C (en) | Detecting molecular interactions comprising a target-selective binding agent and a target molecule with fluorescence resonance energy transfer (fret) | |
| Baldini et al. | A new optical platform for biosensing based on fluorescence anisotropy | |
| RU2537267C1 (en) | Device for identification of nucleotide sequences | |
| Wang et al. | Aptamer-based silver nanosensor for multiple protein detection | |
| RU140943U1 (en) | DEVICE FOR IDENTIFICATION OF NUCLEOTIDE SEQUENCES | |
| Grzelak et al. | Capturing fluorescing viruses with silver nanowires | |
| JP5133895B2 (en) | Method for measuring affinity of biomolecules | |
| Schäferling et al. | Förster resonance energy transfer methods for quantification of protein–protein interactions on microarrays | |
| US10099195B2 (en) | Method for positioning structures in indentations and arrangements thus obtainable |