RU2532845C1 - FLUORESCENCE-LABELLED OLIGONUCLEOTIDE PROBE MS8 Flip-R FOR IDENTIFYING HISTOPLASMOSIS CAUSATIVE AGENT, Histoplasma capsulatum - Google Patents
FLUORESCENCE-LABELLED OLIGONUCLEOTIDE PROBE MS8 Flip-R FOR IDENTIFYING HISTOPLASMOSIS CAUSATIVE AGENT, Histoplasma capsulatum Download PDFInfo
- Publication number
- RU2532845C1 RU2532845C1 RU2013135302/10A RU2013135302A RU2532845C1 RU 2532845 C1 RU2532845 C1 RU 2532845C1 RU 2013135302/10 A RU2013135302/10 A RU 2013135302/10A RU 2013135302 A RU2013135302 A RU 2013135302A RU 2532845 C1 RU2532845 C1 RU 2532845C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- histoplasmosis
- flip
- capsulatum
- causative agent
- dna
- Prior art date
Links
Images
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к биотехнологии, молекулярной биологии и может быть использовано в медицине для выявления генетического материала возбудителя гистоплазмоза Histoplasma capsulatum в пробах как для диагностики в практическом здравоохранении и службе Роспотребнадзора, так и для научных исследований.The invention relates to biotechnology, molecular biology and can be used in medicine to identify the genetic material of the causative agent of histoplasmosis Histoplasma capsulatum in samples both for diagnosis in medical practice and the Rospotrebnadzor service, and for scientific research.
Гистоплазмоз - инфекционное заболевание, вызываемое диморфными грибами, относящимися к роду Н. capsulatum. В эндемичных областях условия окружающей среды представлены умеренным климатом с постоянной влажностью. Ареалами существования Н. capsulatum в естественных условиях служат многие азиатские страны, такие как Индонезия, Тайланд, Индия. Высокоэндемичные очаги Histoplasma capsulatum var. capsulatum - возбудителя классического (американского) гистоплазмоза, расположены вдоль реки Миссисипи (США), в Латинской Америке (Венесуэла, Эквадор, Бразилия, Парагвай, Уругвай, Аргентина). Histoplasma capsulatum var. duboisii - вариант африканского гистоплазмоза, эндемичен для тропических районов Африки. Еще один представитель рода Histoplasma, Histoplasma capsulatum var. farciminosum, вызывает эпизоотический лимфангоит у лошадей, ослов, мулов и в патологии людей какого-либо существенного значения не имеет. Ареал распространения включает средиземноморские страны, Северную Африку и государства Азии (Индия, Пакистан, Япония).Histoplasmosis is an infectious disease caused by dimorphic fungi belonging to the genus H. capsulatum. In endemic areas, environmental conditions are represented by a temperate climate with constant humidity. The natural habitats of N. capsulatum are many Asian countries, such as Indonesia, Thailand, and India. Highly endemic foci of Histoplasma capsulatum var. capsulatum - the causative agent of classical (American) histoplasmosis, located along the Mississippi River (USA), in Latin America (Venezuela, Ecuador, Brazil, Paraguay, Uruguay, Argentina). Histoplasma capsulatum var. duboisii - a variant of African histoplasmosis, is endemic to tropical regions of Africa. Another representative of the genus Histoplasma, Histoplasma capsulatum var. farciminosum, causes epizootic lymphangitis in horses, donkeys, mules and in the pathology of people does not have any significant value. Distribution range includes Mediterranean countries, North Africa and Asian states (India, Pakistan, Japan).
Возбудителя гистоплазмоза относят к агентам II группы патогенности, все работы с ними строго регламентированы СП 1.3.1285-03 «Безопасность работы с микроорганизмами I-II групп патогенности (опасности)». Манипуляции с данными грибами могут проводиться только в специализированных учреждениях, квалифицированными специалистами, имеющими опыт работы с возбудителями особо опасных инфекций.The causative agent of histoplasmosis is classified as an agent of the pathogenicity group II, all work with them is strictly regulated by SP 1.3.1285-03 “Safety of work with microorganisms of pathogenicity (hazard) I-II groups”. Manipulations with these mushrooms can only be carried out in specialized institutions, by qualified specialists with experience in working with pathogens of especially dangerous infections.
Метод полимеразной цепной реакции является прямым методом выявления ДНК данных микромицетов и обладает высокой специфичностью и чувствительностью. В основе метода ПЦР лежит природный процесс репликации ДНК - комплементарное достраивание ДНК матрицы, осуществляемое с помощью фермента ДНК-полимеразы.The polymerase chain reaction method is a direct method for detecting the DNA of these micromycetes and has high specificity and sensitivity. The PCR method is based on the natural process of DNA replication - the complementary completion of the DNA matrix, carried out using the enzyme DNA polymerase.
Процесс удвоения нуклеиновых кислот можно использовать для получения копий коротких участков ДНК, специфичных для конкретных микроорганизмов, т.е. осуществлять целенаправленный поиск таких специфических участков, что и является целью генодиагностики для выявления возбудителя гистоплазмоза.The nucleic acid doubling process can be used to obtain copies of short sections of DNA specific for specific microorganisms, i.e. to carry out a targeted search for such specific sites, which is the purpose of gene diagnostics to identify the causative agent of histoplasmosis.
Для эффективного проведения ПЦР необходимы праймеры - синтетические олигонуклеотиды определенного размера, специфические для каждого типа возбудителей. Праймеры комплементарны последовательностям ДНК на левой и правой границах специфического фрагмента и ориентированы таким образом, что достраивание новой цепи ДНК протекает только между ними. В результате ПЦР происходит многократное увеличение числа копий (амплификация) специфического участка гена, катализируемое ферментом ДНК-полимеразой. Выбор специфического фрагмента и подбор праймеров играет важнейшую роль в специфичности проведения амплификации, что сказывается на качестве проведения анализа исследуемых микромицетов.For effective PCR, primers are needed - synthetic oligonucleotides of a certain size, specific for each type of pathogen. The primers are complementary to the DNA sequences on the left and right borders of a specific fragment and are oriented in such a way that the completion of a new DNA chain proceeds only between them. As a result of PCR, there is a multiple increase in the number of copies (amplification) of a specific region of the gene, catalyzed by the DNA polymerase enzyme. The choice of a specific fragment and the selection of primers plays a crucial role in the specificity of the amplification, which affects the quality of the analysis of the studied micromycetes.
При детекции продуктов амплификации использование специальных флуоресцентных меток позволяет отказаться от стадии электрофореза, что не только сокращает время проведения анализа, но и снижает риск перекрестной контаминации продуктами ПЦР и, соответственно, уменьшает число ложноположительных результатов. Поскольку регистрация результатов проводится непосредственно в процессе реакции амплификации, весь анализ можно проводить в одной-двух комнатах лаборатории силами одного сотрудника. Этот подход позволяет проводить автоматическую интерпретацию полученных результатов и снимает проблему субъективной оценки электрофореграмм. Существует несколько флуоресцентных технологий, различающихся по способам генерации репортерной флуоресценции. В данной заявке используются зонды с комплементарными концевыми последовательностями по типу «молекулярных маяков» (molecular beacons).When detecting amplification products, the use of special fluorescence labels eliminates the electrophoresis stage, which not only reduces the analysis time, but also reduces the risk of cross-contamination with PCR products and, accordingly, reduces the number of false positive results. Since the results are recorded directly during the amplification reaction, the entire analysis can be carried out in one or two rooms of the laboratory by one employee. This approach allows automatic interpretation of the results and removes the problem of subjective assessment of electrophoregrams. There are several fluorescence technologies that differ in how reporter fluorescence is generated. In this application, probes with complementary terminal sequences of the molecular beacons type are used.
Наиболее близким аналогом являются олигонуклеотидные зонды, разработанные для выявления продуктов амплификации в режиме реального времени J. Martagon-Villamil с соавторами в 2003 году. Авторы используют 2 зонда с резонансным переносом энергии (LightCycler assay). Принцип метода основан на переносе энергии с одного флуорофора, находящегося на 3′-конце первого зонда, ко второму флуорофору, находящемуся на 5′- конце второго зонда. Излучение детектируется при одновременном связывании обоих зондов с ДНК-матрицей. В качестве ДНК-мишеней для выявления возбудителя гистоплазмоза были выбраны спейсерные области рибосомальных генов [Identification of Histoplasma capsulatum from culture extracts by real-time PCR / Martagon-Villamil J., Shrestha N., Sholtis M., et al. // J. Clin. Microbiol. - 2003. - Vol.41, №3, - p.1295-1298].The closest analogue is oligonucleotide probes designed to detect real-time amplification products of J. Martagon-Villamil et al. In 2003. The authors use 2 probes with resonant energy transfer (LightCycler assay). The principle of the method is based on the transfer of energy from one fluorophore located at the 3′-end of the first probe to the second fluorophore located at the 5′-end of the second probe. Radiation is detected when both probes are coupled to a DNA template. The spacer regions of the ribosomal genes [Identification of Histoplasma capsulatum from culture extracts by real-time PCR / Martagon-Villamil J., Shrestha N., Sholtis M., et al. Were selected as target DNA for identifying the causative agent of histoplasmosis. // J. Clin. Microbiol. - 2003. - Vol.41, No. 3, - p.1295-1298].
S.J. Buitrago с соавторами в 2009 году предложили использование двух гибридизационных зондов для одновременного обнаружения ДНК Н. capsulatum и Paracoccidioides brasiïiensis методом ПЦР в режиме реального времени (патент №ЕР 2339026). В качестве ДНК-мишеней авторы выбрали спейсерные области рибосомальных генов. Однако, данные фрагменты генома, как правило, являются высококонсервативными у близкородственных микромицетов, что может приводить к ложноположительным результатам при проведении анализа.S.J. Buitrago et al. In 2009 proposed the use of two hybridization probes for the simultaneous detection of N. capsulatum and Paracoccidioides brasiïiensis DNA by real-time PCR (patent No.EP 2339026). The authors selected spacer regions of ribosomal genes as target DNAs. However, these fragments of the genome, as a rule, are highly conserved in closely related micromycetes, which can lead to false positive results during the analysis.
Целью настоящего изобретения является разработка олигонуклеотидного зонда для флуоресцентной детекции результатов анализа методом полимеразной цепной реакции при идентификации H. capsulatum в режиме реального времени.An object of the present invention is to provide an oligonucleotide probe for fluorescence detection of polymerase chain reaction analysis results in real-time identification of H. capsulatum.
Цель достигается конструированием специфичного олигонуклеотида, имеющего структуру «шпильки» с флуорофором и гасителем флуоресценции на концах и обладающего комплементарностью к продукту реакции амплификации с праймерами HcMs8s/HcMs8as3 (патент №2464318):The goal is achieved by constructing a specific oligonucleotide having a hairpin structure with a fluorophore and a fluorescence quencher at the ends and having complementarity to the product of the amplification reaction with HcMs8s / HcMs8as3 primers (patent No. 2464318):
MS8 Flip-R5/(ROX)-GGCCTGACCAGTATAACCAAGGCC-(BHQ2)3/ MS8 Flip-R5 / (ROX) -GGCCTGACCAGTATAACCAAGGCC- (BHQ2) 3 /
Где ROX - карбокси-Х-родамин, флуоресцентный краситель, длина волны поглощения которого сотавляет 580 нм, а длина волны флуоресценции - 605 нм. BHQ2 - гаситель флуоресценции с диапазоном гашения 550-650 нм.Where ROX is carboxy-X-rhodamine, a fluorescent dye whose absorption wavelength is 580 nm and the fluorescence wavelength is 605 nm. BHQ2 is a fluorescence quencher with a quenching range of 550-650 nm.
Характеристика олигонуклеотидного зонда и ДНК-мишени для его гибридизации.Characterization of the oligonucleotide probe and the target DNA for its hybridization.
Основываясь на данных, представленных в базе GenBank NCBI (National Center for Biotechnology Information), был подобран олигонуклеотид, обладающий активностью гибридизационного зонда по типу «молекулярного маяка» к фрагменту генома возбудителя гистоплазмоза, фланкированному праймерами HcMs8s-HcMs8as3. Данный зонд обеспечивает флуоресцентную детекцию продуктов амплификации фрагмента гена MS8 (mold-specific MS8 protein) (GenBank NCBI, AY049031), кодирующего белок H. capsulatum, экспрессия которого происходит в мицелиальной фазе. Протеин ms8 участвует в образовании клеточной стенки гиф, придавая ей гидрофильность и гибкость.Based on the data presented in the GenBank NCBI database (National Center for Biotechnology Information), an oligonucleotide with a “molecular beacon” type hybridization probe was selected for a histoplasmosis pathogen fragment flanked by HcMs8s-HcMs8as3 primers. This probe provides fluorescence detection of amplification products of the MS8 gene fragment (mold-specific MS8 protein) (GenBank NCBI, AY049031) encoding the H. capsulatum protein, the expression of which occurs in the mycelial phase. Protein ms8 is involved in the formation of the cell wall of hyphae, giving it hydrophilicity and flexibility.
В качестве положительного контроля эксперименты проводили на штаммах H.capsulatum var. capsulatum 6650, 6651, 6652, H. capsulatum var. duboisii 630, 638, H. capsulatum var. farciminosum 12-89, используя для выделения ДНК обеззараженные суспензии микромицета в концентрациях от 1×106 клеток/мл до 1×101 клеток/мл. Подсчет клеток дрожжевой фазы проводили в камере Горяева. Апробация флуоресцентного зонда была осуществлена на наборе штаммов возбудителя гистоплазмоза коллекционного центра МЖК ФКУЗ Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора.As a positive control, experiments were performed on strains of H. capsulatum var. capsulatum 6650, 6651, 6652, H. capsulatum var. duboisii 630, 638, H. capsulatum var. farciminosum 12-89, using disinfected micromycete suspensions in concentrations from 1 × 10 6 cells / ml to 1 × 10 1 cells / ml for DNA extraction. The yeast phase cells were counted in a Goryaev chamber. The fluorescence probe was tested on a set of histoplasmosis pathogen strains at the collection center of MFK FKUZ Volgograd Research Anti-Plague Institute of Rospotrebnadzor.
Чувствительность реакции амплификации с флуоресцентно-меченым зондом MS8 Flip-R оценивалась при исследовании проб ДНК, выделенных из десятикратных разведений чистых культур возбудителя гистоплазмоза, и составила- 1×102-1×104 клеток/мл.The sensitivity of the amplification reaction with the fluorescently-labeled probe MS8 Flip-R was evaluated by studying DNA samples isolated from ten-fold dilutions of pure cultures of the histoplasmosis pathogen, and amounted to 1 × 10 2 -1 × 10 4 cells / ml.
Для обнаружения возбудителя гистоплазмоза методом ПЦР в режиме реального времени оценена возможность использования сконструированного олигонуклеотидного зонда для анализа биологического материала (кровь, суспензия органов, искусственно контаминированные клетками Н. capsulation). Показано, что использование разработанного зонда при постановке реакции амплификации позволяет выявлять ДНК возбудителей гистоплазмоза с чувствительностью 1×104 кл/мл.To detect the causative agent of histoplasmosis by real-time PCR, the possibility of using the designed oligonucleotide probe to analyze biological material (blood, organ suspension, artificially contaminated with H. capsulation cells) was evaluated. It was shown that the use of the developed probe in the formulation of the amplification reaction allows the detection of histoplasmosis pathogens DNA with a sensitivity of 1 × 10 4 cells / ml.
Примеры конкретного выполнения.Examples of specific performance.
Пример 1. Методика конструирования флуоресцентно-меченого олигонуклеотидного зонда MS8 Flip-R для идентификации ДНК возбудителя гистоплазмоза методом ПЦР с флуоресцентной детекцией.Example 1. The method of constructing a fluorescently-labeled oligonucleotide probe MS8 Flip-R to identify DNA of the causative agent of histoplasmosis by PCR with fluorescence detection.
На основе анализа in silico нуклеотидной последовательности фрагмента гена MS8 возбудителя гистоплазмоза, фланкированной праймерами HcMs8s/HcMs8as3 и имеющей длину 361 п.н., сконструирован гибридизационный зонд размером 24 п.н. (таблица 1).Based on the in silico analysis of the nucleotide sequence of the MS8 gene fragment of the histoplasmosis pathogen flanked by HcMs8s / HcMs8as3 primers and having a length of 361 bp, a 24 bp hybridization probe was constructed. (Table 1).
Полученный олигонуклеотид был проанализирован с помощью компьютерной программы Vector NTI Express v.1.1.2 (Life Technologies, США) на предмет образования вторичных структур с праймерами HcMs8s/HcMs8as3, а также с использованием ресурса BLAST на web-сервере Национального Центра Биотехнологической Информации (NCBI) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) для установления гомологии между ним и нуклеотидными последовательностями близкородственных возбудителей особо опасных микозов и гетерологичных микроорганизмов, присутствующих в базах данных (EMBL, GenBank, DDBJ). На момент проведения компьютерного анализа, гомологии выявлено не было.The obtained oligonucleotide was analyzed using the Vector NTI Express v.1.1.2 computer program (Life Technologies, USA) for the formation of secondary structures with HcMs8s / HcMs8as3 primers, as well as using the BLAST resource on the web server of the National Center for Biotechnological Information (NCBI) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) to establish homology between it and the nucleotide sequences of closely related pathogens of especially dangerous mycoses and heterologous microorganisms present in the databases (EMBL, GenBank, DDBJ). At the time of the computer analysis, homology was not detected.
Пример 2. Детекция специфических фрагментов ДНК с помощью разработанного зонда MS8 Flip-R для идентификации ДНК возбудителя гистоплазмоза методом ПЦР в режиме реального времени.Example 2. Detection of specific DNA fragments using the developed MS8 Flip-R probe to identify histoplasmosis pathogen DNA by real-time PCR.
В состав реакционных смесей, помимо анализируемой ДНК, входили комплементарные специфическому фрагменту ДНК Н. capsulatum олигонуклеотидные зонды, меченые флуорофором ROX и гасителем флуоресценции (BHQ2), а также праймеры HcMs8s/HcMs8as3, дезоксирибонуклеозидтрифосфаты, буферный раствор и фермент Taq-F-ДНК-полимераза. Праймеры и зонд для внутреннего контроля использовали при проверке тест-систем на специфичность и при анализе способов выделения ДНК. В качестве отрицательного контроля в пробирку вместо образца вносили такой же объем дистиллированной воды.In addition to the analyzed DNA, the reaction mixtures included oligonucleotide probes, complementary to a specific DNA fragment of H. capsulatum, labeled with a ROX fluorophore and a fluorescence quencher (BHQ2), as well as HcMs8s / HcMs8as3 primers, DNA deoxyribonucleoside triphosphate, and . Primers and a probe for internal control were used to test the test systems for specificity and in the analysis of DNA isolation methods. As a negative control, the same volume of distilled water was added to the tube instead of the sample.
Амплификацию продолжительностью 45 циклов проводили в объеме 25 мкл с использованием «горячего старта».Amplification of 45 cycles was carried out in a volume of 25 μl using a “hot start”.
Анализ продуктов ПЦР осуществляли в режиме реального времени на приборе «Rotor-Gene 6000» («Corbett Research», Австралия). Регистрацию результатов проводили в табличной и графической форме с помощью компьютерных программ. Результаты оценивали по наличию или отсутствию пересечения кривой флуоресценции с пороговой линией, что определяется значением порогового цикла «Ct» в соответствующей графе в таблице результатов (рис.1).PCR products were analyzed in real time on a Rotor-Gene 6000 instrument (Corbett Research, Australia). The results were recorded in tabular and graphical form using computer programs. The results were evaluated by the presence or absence of intersection of the fluorescence curve with the threshold line, which is determined by the value of the threshold cycle “Ct” in the corresponding column in the results table (Fig. 1).
Пример 3. Определение чувствительности и специфичности реакции амплификации в режиме реального времени с помощью разработанного флуоресцентно-меченого олигонуклеотидного зонда для идентификации ДНК возбудителя гистоплазмоза.Example 3. The determination of the sensitivity and specificity of the amplification reaction in real time using the developed fluorescently-labeled oligonucleotide probe to identify DNA of the causative agent of histoplasmosis.
Чувствительность реакции амплификации с разработанным гибридизационным зондом MS8 Flip-R оценивалась при исследовании проб ДНК, выделенных из десятикратных разведений клеток чистых культур возбудителя гистоплазмоза.The sensitivity of the amplification reaction with the developed MS8 Flip-R hybridization probe was evaluated by studying DNA samples isolated from ten-fold dilutions of cells of pure cultures of the histoplasmosis pathogen.
Обеззараживание исследуемых проб производили добавлением раствора мертиолята натрия до конечной концентрации 0,1%, прогреванием в течение 40 мин при температуре 56°С и инкубированием при комнатной температуре 24 ч. Выделение ДНК из чистых культур микромицетов осуществляли с помощью метода гуанидинтиоцианат-фенольной экстракции с переосаждением ДНК изопропанолом (Sandhu G.S. et al., 1995). Постановку реакции ПЦР осуществляли как описано в примере 2. При тестировании коллекции грибных культур Н. capsulatum ФКУЗ Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора с использованием разработанного флуоресцентно-меченого олигонуклеотидного зонда MS8 Flip-R продукт амплификации детектировался с ДНК всех штаммов возбудителя гистоплазмоза с чувствительностью 1×102-1×104 клеток/мл (рис.1). С другими видами близкородственных грибов и гетерологичных микроорганизмов в реакции ПЦР с разработанными праймерами в 100% случаев получен отрицательный результат.The test samples were disinfected by adding sodium merthiolate solution to a final concentration of 0.1%, heating for 40 minutes at 56 ° C and incubating at room temperature for 24 hours. DNA was isolated from pure micromycete cultures using guanidine thiocyanate-phenolic extraction with reprecipitation DNA isopropanol (Sandhu GS et al., 1995). The PCR reaction was carried out as described in Example 2. When testing the collection of fungal cultures of N. capsulatum FKUZ Volgograd Research Anti-Plague Institute of Rospotrebnadzor using the developed fluorescently-labeled oligonucleotide probe MS8 Flip-R, the amplification product was detected with the DNA of all histopathological pathogen strains with sensitivity 1 × 10 2 -1 × 10 4 cells / ml (Fig. 1). With other species of closely related fungi and heterologous microorganisms in the PCR reaction with the developed primers, a negative result was obtained in 100% of cases.
Таким образом, разработанный гибридизационный зонд может быть использован для идентификации возбудителя гистоплазмоза и позволяет в короткий срок с высокой чувствительностью и специфичностью детектировать ДНК возбудителя гистоплазмоза в чистой культуре и биологическом материале.Thus, the developed hybridization probe can be used to identify the causative agent of histoplasmosis and allows, in a short time, with high sensitivity and specificity to detect the DNA of the causative agent of histoplasmosis in pure culture and biological material.
Claims (1)
где ROX - флуоресцентный краситель карбокси-Х-родамин, BHQ2 - гаситель флуоресценции "Black Hole 2". MS8 Flip-R oligonucleotide probe for fluorescence detection of the histoplasmosis pathogen Histoplasma capsulatum by polymerase chain reaction with oligonucleotide primers HcMs8s, HcMs8as3, having the following structure: MS8 Flip-R 5 '(ROX) -GGCCTAC
where ROX is the carboxy-X-rhodamine fluorescent dye, BHQ2 is the Black Hole 2 fluorescence quencher.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2013135302/10A RU2532845C1 (en) | 2013-07-26 | 2013-07-26 | FLUORESCENCE-LABELLED OLIGONUCLEOTIDE PROBE MS8 Flip-R FOR IDENTIFYING HISTOPLASMOSIS CAUSATIVE AGENT, Histoplasma capsulatum |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2013135302/10A RU2532845C1 (en) | 2013-07-26 | 2013-07-26 | FLUORESCENCE-LABELLED OLIGONUCLEOTIDE PROBE MS8 Flip-R FOR IDENTIFYING HISTOPLASMOSIS CAUSATIVE AGENT, Histoplasma capsulatum |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2532845C1 true RU2532845C1 (en) | 2014-11-10 |
Family
ID=53382507
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2013135302/10A RU2532845C1 (en) | 2013-07-26 | 2013-07-26 | FLUORESCENCE-LABELLED OLIGONUCLEOTIDE PROBE MS8 Flip-R FOR IDENTIFYING HISTOPLASMOSIS CAUSATIVE AGENT, Histoplasma capsulatum |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2532845C1 (en) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110760606A (en) * | 2019-10-31 | 2020-02-07 | 中国人民解放军疾病预防控制中心 | Real-time fluorescence quantitative PCR detection kit for histoplasma capsulatum, special primer and TaqMan probe thereof |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5693501A (en) * | 1995-03-08 | 1997-12-02 | Indiana University Advanced Research & Technology Institute | Compounds and methods to determine presence of Histoplasma capsulatum |
| US20050065330A1 (en) * | 2002-04-24 | 2005-03-24 | The Cleveland Clinic Foundation | Identification of Histoplasma capsulatum using a PCR assay |
| RU2464318C1 (en) * | 2011-07-05 | 2012-10-20 | Федеральное государственное учреждение здравоохранения Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора | Oligonucleotide primers for identification of histoplasmosis agent histoplasma capsulatum |
-
2013
- 2013-07-26 RU RU2013135302/10A patent/RU2532845C1/en not_active IP Right Cessation
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5693501A (en) * | 1995-03-08 | 1997-12-02 | Indiana University Advanced Research & Technology Institute | Compounds and methods to determine presence of Histoplasma capsulatum |
| US20050065330A1 (en) * | 2002-04-24 | 2005-03-24 | The Cleveland Clinic Foundation | Identification of Histoplasma capsulatum using a PCR assay |
| RU2464318C1 (en) * | 2011-07-05 | 2012-10-20 | Федеральное государственное учреждение здравоохранения Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора | Oligonucleotide primers for identification of histoplasmosis agent histoplasma capsulatum |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110760606A (en) * | 2019-10-31 | 2020-02-07 | 中国人民解放军疾病预防控制中心 | Real-time fluorescence quantitative PCR detection kit for histoplasma capsulatum, special primer and TaqMan probe thereof |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Lin et al. | Identification of novel Bartonella spp. in bats and evidence of Asian gray shrew as a new potential reservoir of Bartonella | |
| US9523131B2 (en) | PCR diagnostics of dermatophytes and other pathogenic fungi | |
| Shen et al. | Development of a loop-mediated isothermal amplification method for the rapid detection of Pythium ultimum | |
| Malele et al. | Comparative diagnostic and analytical performance of PCR and LAMP-based trypanosome detection methods estimated using pooled whole tsetse flies and midguts | |
| Modise et al. | A novel multiplex qPCR‑HRM assay for the simultaneous detection of four abortive zoonotic agents in cattle, sheep, and goats | |
| Pérez et al. | A minimally invasive, field‐applicable CRISPR/Cas biosensor to aid in the detection of Pseudogymnoascus destructans, the causative fungal agent of white‐nose syndrome in bats | |
| US11549153B2 (en) | Methods of detecting and typing pathogenic strains of Francisella tularensis | |
| Pornprasert et al. | Development of TaqMan real‐time polymerase chain reaction for the detection and identification of Penicillium marneffei | |
| CN102409102B (en) | PCR(Polymerase Chain Reaction) primers and method for identifying mycobacterium bovis | |
| RU2612137C1 (en) | Method for identification of tularemia pathogen subspecies francisella tularensis subsp tularensis, francisella tularensis subsp mediasiatica and francisella tularensis subsp holarctica | |
| RU2435860C1 (en) | FLUORESCENT-MARKED OLIGONUCLEOTIDE PROBE FOR IDENTIFICATION OF GLANDERS AND MELIOIDOSIS AGENTS Bpseudomallei AND Bmallei | |
| CN102329864A (en) | Fluorescence PCR (polymerase chain reaction) kit for detecting yersinia enterocolitica | |
| RU2532845C1 (en) | FLUORESCENCE-LABELLED OLIGONUCLEOTIDE PROBE MS8 Flip-R FOR IDENTIFYING HISTOPLASMOSIS CAUSATIVE AGENT, Histoplasma capsulatum | |
| Zhou et al. | Development of a Loop‐Mediated Isothermal Amplification Assay for Rapid Detection of Trichosporon asahii in Experimental and Clinical Samples | |
| Motamedi et al. | Evaluation of different DNA extraction methods based on steel‐bullet beating for molecular diagnosis of onychomycosis | |
| CN105695584B (en) | gyrB Primer Combination for Detecting Staphylococcus aureus in Experimental Animals | |
| RU2550257C2 (en) | METHOD OF DIFFERENTIATING TYPICAL AND ATYPICAL STRAINS Yersinia pestis OF MEDIEVAL BIOVAR BY PCR METHOD WITH HYBRIDISATION-FLUORESCENT RECORDING RESULTS | |
| Al-Khafajii | Myco-epidemiologic and genetic study of dermatophytosis and non-dermatophytes in Middle Euphrates, Iraq | |
| RU2539108C1 (en) | FLUORESCENTLY-LABELLED OLIGINUCLEOTIDE PROBE PR-SOW FOR IDENTIFICATION OF COCCIDIOIDOMYCOSIS CAUSATIVE AGENT Coccidioides posadasii | |
| RU2486252C1 (en) | METHOD OF SPECIFIC IDENTIFICATION AND DIFFERENTIATION OF STRAINS Yersinia pseudotuberculosis FROM Yersinia pestis AND Yersinia enterocolitica | |
| RU2346045C1 (en) | OLIGONUCLEOTIDE PRIMERS FOR IDENTIFYING Coccidioides posadasii | |
| Alcoba-Flórez et al. | Yeast molecular identification and typing | |
| Graciele-Melo et al. | Use of polymerase chain reaction for Cryptococcus neoformans genome detection in cerebrospinal fluid for neurocryptococcosis diagnosis | |
| RU2464318C1 (en) | Oligonucleotide primers for identification of histoplasmosis agent histoplasma capsulatum | |
| RU2639498C1 (en) | Set of oligonucleotide primers and fluorescence marked probes for identifying of blastomycesis dermatitis irritant |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20150727 |