RU2464318C1 - Oligonucleotide primers for identification of histoplasmosis agent histoplasma capsulatum - Google Patents
Oligonucleotide primers for identification of histoplasmosis agent histoplasma capsulatum Download PDFInfo
- Publication number
- RU2464318C1 RU2464318C1 RU2011127594/10A RU2011127594A RU2464318C1 RU 2464318 C1 RU2464318 C1 RU 2464318C1 RU 2011127594/10 A RU2011127594/10 A RU 2011127594/10A RU 2011127594 A RU2011127594 A RU 2011127594A RU 2464318 C1 RU2464318 C1 RU 2464318C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- primers
- histoplasmosis
- capsulatum
- dna
- oligonucleotide primers
- Prior art date
Links
- 201000002563 Histoplasmosis Diseases 0.000 title claims abstract description 25
- 241000228404 Histoplasma capsulatum Species 0.000 title claims abstract description 17
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 title claims abstract description 10
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 title abstract description 3
- 239000013615 primer Substances 0.000 claims abstract description 35
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 23
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 16
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims abstract description 14
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims abstract description 14
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 9
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 4
- 231100000676 disease causative agent Toxicity 0.000 claims description 10
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 10
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 5
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 claims description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 abstract description 5
- 238000001514 detection method Methods 0.000 abstract description 4
- 239000012620 biological material Substances 0.000 abstract description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 3
- 230000005180 public health Effects 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 abstract 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 26
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 14
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 10
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 8
- 238000000034 method Methods 0.000 description 8
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 8
- 241000487062 Histoplasma capsulatum var. capsulatum Species 0.000 description 4
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 4
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 4
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- 108091093088 Amplicon Proteins 0.000 description 3
- 241001354006 Histoplasma capsulatum var. duboisii Species 0.000 description 3
- 238000002944 PCR assay Methods 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 3
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 3
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 3
- 238000007857 nested PCR Methods 0.000 description 3
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 3
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 3
- 108020004463 18S ribosomal RNA Proteins 0.000 description 2
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 2
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 2
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 2
- 241001354007 Histoplasma capsulatum var. farciminosum Species 0.000 description 2
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 2
- 206010035148 Plague Diseases 0.000 description 2
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 2
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 230000007918 pathogenicity Effects 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 201000000674 African histoplasmosis Diseases 0.000 description 1
- 235000001674 Agaricus brunnescens Nutrition 0.000 description 1
- 241000228405 Blastomyces dermatitidis Species 0.000 description 1
- 102000016938 Catalase Human genes 0.000 description 1
- 108010053835 Catalase Proteins 0.000 description 1
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 1
- 230000004543 DNA replication Effects 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 208000031888 Mycoses Diseases 0.000 description 1
- 241000526686 Paracoccidioides brasiliensis Species 0.000 description 1
- 108020001027 Ribosomal DNA Proteins 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 102000006995 beta-Glucosidase Human genes 0.000 description 1
- 108010047754 beta-Glucosidase Proteins 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 238000012136 culture method Methods 0.000 description 1
- 239000005549 deoxyribonucleoside Substances 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 238000004362 fungal culture Methods 0.000 description 1
- -1 guanidinothiocyanatophenol Chemical compound 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 1
- 239000002480 mineral oil Substances 0.000 description 1
- 235000010446 mineral oil Nutrition 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- LCCNCVORNKJIRZ-UHFFFAOYSA-N parathion Chemical compound CCOP(=S)(OCC)OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 LCCNCVORNKJIRZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 239000002987 primer (paints) Substances 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000001226 reprecipitation Methods 0.000 description 1
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000007447 staining method Methods 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- RTKIYNMVFMVABJ-UHFFFAOYSA-L thimerosal Chemical compound [Na+].CC[Hg]SC1=CC=CC=C1C([O-])=O RTKIYNMVFMVABJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 1
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 1
- 125000002264 triphosphate group Chemical class [H]OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])O* 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к биотехнологии, молекулярной биологии и может быть использовано в медицине для выявления генетического материала возбудителя гистоплазмоза Н.capsulatum в пробах как для диагностики в практическом здравоохранении и службе Роспотребнадзора, так и для научных исследований.The invention relates to biotechnology, molecular biology, and can be used in medicine to identify the genetic material of the causative agent of histoplasmosis H. capsulatum in samples both for diagnosis in medical practice and the Rospotrebnadzor service, and for scientific research.
Гистоплазмоз - инфекционное заболевание, вызываемое диморфными грибами, относящимися к виду Н.capsulatum. Высокоэндемичные очаги Histoplasma capsulatum var. capsulatum - возбудителя классического (американского) гистоплазмоза, расположены вдоль реки Миссисипи (США), в Латинской Америке (Венесуэла, Эквадор, Бразилия, Парагвай, Уругвай, Аргентина). Условия окружающей среды в областях высокой эндемичности представлены умеренным климатом с постоянной влажностью. Ареалами существования Н.capsulatum в естественных условиях служат многие азиатские страны, такие как Индонезия, Таиланд, Индия. Histoplasma capsulatum var. duboisii - вариант африканского гистоплазмоза, эндемичен для тропических районов Африки.Histoplasmosis is an infectious disease caused by dimorphic fungi belonging to the species H. capsulatum. Highly endemic foci of Histoplasma capsulatum var. capsulatum - the causative agent of classical (American) histoplasmosis, located along the Mississippi River (USA), in Latin America (Venezuela, Ecuador, Brazil, Paraguay, Uruguay, Argentina). Environmental conditions in areas of high endemicity are represented by a temperate climate with constant humidity. The natural habitats of H. capsulatum are many Asian countries, such as Indonesia, Thailand, and India. Histoplasma capsulatum var. duboisii - a variant of African histoplasmosis, is endemic to tropical regions of Africa.
Возбудителя гистоплазмоза относят к агентам II группы патогенности, все работы с ними строго регламентированы СП 1.3.1285-03 «Безопасность работы с микроорганизмами I-II групп патогенности (опасности)». Манипуляции с данными грибами могут проводиться только в специализированных учреждениях, квалифицированными специалистами, имеющими опыт работы с возбудителями особо опасных инфекций.The causative agent of histoplasmosis is classified as an agent of the second group of pathogenicity, all work with them is strictly regulated by SP 1.3.1285-03 “Safety of work with microorganisms of the first and second groups of pathogenicity (danger)”. Manipulations with these mushrooms can only be carried out in specialized institutions, by qualified specialists with experience in working with pathogens of especially dangerous infections.
Метод полимеразной цепной реакции является прямым методом выявления ДНК данных микромицетов и обладает высокой специфичностью и чувствительностью. В основе метода ПЦР лежит природный процесс репликации ДНК - комплементарное достраивание ДНК матрицы, осуществляемое с помощью фермента ДНК-полимеразы.The polymerase chain reaction method is a direct method for detecting the DNA of these micromycetes and has high specificity and sensitivity. The PCR method is based on the natural process of DNA replication - the complementary completion of the DNA matrix, carried out using the enzyme DNA polymerase.
Процесс удвоения нуклеиновых кислот можно использовать для получения копий коротких участков ДНК, специфичных для конкретных микроорганизмов, т.е. осуществлять целенаправленный поиск таких специфических участков, что и является целью генодиагностики для выявления возбудителя гистоплазмоза.The nucleic acid doubling process can be used to obtain copies of short sections of DNA specific for specific microorganisms, i.e. to carry out a targeted search for such specific sites, which is the purpose of gene diagnostics to identify the causative agent of histoplasmosis.
Для эффективного проведения ПНР необходимы праймеры - синтетические олигонуклеотиды определенного размера, специфические для каждого типа возбудителей. Праймеры комплементарны последовательностям ДНК на левой и правой границах специфического фрагмента и ориентированы таким образом, что достраивание новой цепи ДНК протекает только между ними. В результате ПЦР происходит многократное увеличение числа копий (амплификация) специфического участка гена, катализируемое ферментом ДНК-полимеразой. Выбор специфического фрагмента и подбор праймеров играет важнейшую роль в специфичности проведения амплификации, что сказывается на качестве проведения анализа исследуемых микромицетов.For effective NDP, primers are needed - synthetic oligonucleotides of a certain size, specific for each type of pathogen. The primers are complementary to the DNA sequences on the left and right borders of a specific fragment and are oriented in such a way that the completion of a new DNA chain proceeds only between them. As a result of PCR, there is a multiple increase in the number of copies (amplification) of a specific region of the gene, catalyzed by the DNA polymerase enzyme. The choice of a specific fragment and the selection of primers plays a crucial role in the specificity of the amplification, which affects the quality of the analysis of the studied micromycetes.
A.Bracca et al. разработали полугнездную ПЦР с олигонуклеотидными затравками, фланкирующими фрагменты гена Н-антигена, кодирующего фермент каталазу. В работе использовали пробы крови, биоптата и кожных покровов. Все пробы анализировали с помощью микроскопии, культуральным методом и ПЦР. При исследовании биопсии и кожи результаты всех трех методов совпадали. 4 образца крови были положительные в ПЦР, хотя в двух из них не определялись другими используемыми в работе методами [Molecular detection of Histoplasma capsulatum var. capsulatum in human clinical samples / Bracca A., Tosello M. E., Girardini J.E. et al. // J.Clin.Microbiol. - 2003. - Vol.41, №4. - Р.1753-1755].A. Bracca et al. developed semi-nested PCR with oligonucleotide seeds flanking fragments of the H-antigen gene encoding the catalase enzyme. In the work used blood samples, biopsy and skin integument. All samples were analyzed using microscopy, culture method and PCR. In the study of biopsy and skin, the results of all three methods coincided. 4 blood samples were positive in PCR, although in two of them were not determined by other methods used in the work [Molecular detection of Histoplasma capsulatum var. capsulatum in human clinical samples / Bracca A., Tosello M. E., Girardini J.E. et al. // J. Clin. Microbiol. - 2003. - Vol.41, No. 4. - R.1753-1755].
Применение гнездной и полугнездой ПЦР имеет определенный недостаток - это высокий риск контаминации проб на втором этапе постановки реакции.The use of nested and half-nested PCR has a certain drawback - this is a high risk of sample contamination at the second stage of the reaction.
Разработаны праймеры на основе нуклеотидных последовательностей гена М-антигена, кодирующего продукцию β-глюкозидазы. Авторы исследовали чистые культуры, пробы почвы и клинические образцы. Праймеры детектировали H.capsulatum var. capsulatum и H.capsulatum var. duboisii, в то время как пробы, содержащие Н.capsulatum var. farciminosum, были отрицательными [PCR assay for identification of Histoplasma capsulatum based on the nucleotide sequence of the M antigen / Н.L. de Matos Guedes, Guimaraes A.J., Peralta J.M. et al. // J.Clin.Microbiol. - 2003. - Vol.41, №2. - Р.535-539].Primers based on the nucleotide sequences of the M-antigen gene encoding β-glucosidase production have been developed. The authors examined pure cultures, soil samples, and clinical samples. Primers were detected by H. capsulatum var. capsulatum and H. capsulatum var. duboisii, while samples containing H. capsulatum var. farciminosum, were negative [PCR assay for identification of Histoplasma capsulatum based on the nucleotide sequence of the M antigen / H.L. de Matos Guedes, Guimaraes A.J., Peralta J.M. et al. // J. Clin. Microbiol. - 2003. - Vol.41, No. 2. - P.535-539].
Разработана «гнездная» ПЦР с использованием праймеров на основе фрагментов гена 18S рРНК, предложенные Bialek R. в 2001 г. [Diagnosis and monitoring of murine histoplasmosis by a nested PCR assay / Bialek R., Fischer J.R, Feucht A. et al. // J.Clin.Microbiol. - 2001. - Vol.39, №4. - Р.1506-1509]. Преимуществом данной ДНК-мишени для ПЦР является консервативность и мультикопийность этого гена. Однако в реакции амплификации при использовании праймеров, сконструированных на основе рибосомальных генов, могут быть получены ложноположительные результаты. Так, в ходе исследований выявлено, что праймеры, комплементарные последовательностям гена 18S рРНК, детектируют не только H.capsulatum, но и ДНК Paracoccidioides brasiliensis и Blastomyces dermatitidis. Поэтому авторы в работе рекомендуют дополнительно использовать секвенирование для подтверждения специфичности синтезируемых в реакции ампликонов.Nesting PCR was developed using primers based on 18S rRNA gene fragments, proposed by Bialek R. in 2001 [Diagnosis and monitoring of murine histoplasmosis by a tested PCR assay / Bialek R., Fischer J.R, Feucht A. et al. // J. Clin. Microbiol. - 2001. - Vol. 39, No. 4. - R.1506-1509]. The advantage of this target DNA for PCR is the conservatism and multicopy of this gene. However, in the amplification reaction using primers designed based on ribosomal genes, false-positive results can be obtained. Thus, in the course of studies it was found that primers complementary to the sequences of the 18S rRNA gene detect not only H. capsulatum, but also the DNA of Paracoccidioides brasiliensis and Blastomyces dermatitidis. Therefore, the authors recommend additionally using sequencing to confirm the specificity of the amplicons synthesized in the reaction.
Наиболее близким аналогом являются специфичные праймеры на основе фрагментов гена, кодирующего уникальный 100 кДа белок H.capsulatum. Все пробы при последующем секвенировании доказали 100% специфичность этих праймеров [Comparison of staining methods and a nested PCR assay to detect Histoplasma capsulatum in tissue sections / Bialek R., Ernst F., Dietz K. et al. // Microbiology and Infectious Disease. - 2002. - Vol.117. - P.597-603; Evaluation of two nested PCR assays for detection of Histoplasma capsulatum DNA in human tissue / Bialek R., Feucht A., Aepinus C. et al. // J.Сlin.Microbiol. - 2002. - Vоl.40, №5. - Р.1644-1647].The closest analogue is specific primers based on fragments of a gene encoding a unique 100 kDa H. capsulatum protein. All samples during subsequent sequencing proved 100% specificity of these primers [Comparison of staining methods and a tested PCR assay to detect Histoplasma capsulatum in tissue sections / Bialek R., Ernst F., Dietz K. et al. // Microbiology and Infectious Disease. - 2002. - Vol. 117. - P.597-603; Evaluation of two nested PCR assays for detection of Histoplasma capsulatum DNA in human tissue / Bialek R., Feucht A., Aepinus C. et al. // J. Clin. Microbiol. - 2002. - Vol. 40, No. 5. - R.1644-1647].
Целью настоящего изобретения является разработка олигонуклеотидных праймеров для идентификации Н.capsulatum методом полимеразной цепной реакции.An object of the present invention is to provide oligonucleotide primers for the identification of H. capsulatum by polymerase chain reaction.
Цель достигается конструированием специфичных олигонуклеотидных праймеров для идентификации ДНК возбудителя гистоплазмоза, обладающих активностью прямого и обратного праймеров в реакции амплификации, имеющих следующую структуру:The goal is achieved by designing specific oligonucleotide primers for identifying DNA of the causative agent of histoplasmosis, with forward and reverse primer activity in the amplification reaction, having the following structure:
5'-СССАСАTAGAAAGCCTCGТТСС-3'-HcMs8s5'-СССАСАТAGAAAGCCTCGТТСС-3'-HcMs8s
5'-TAGСССTGCTGTTCGTTGС-3'-HcMs8as35'-TAGSSСTGCTGTTCGTTGС-3'-HcMs8as3
Характеристика олигонуклеотидных праймеров и участка амплифицируемой ДНК.Characterization of oligonucleotide primers and amplified DNA site.
Основываясь на данных, представленных в базе GenBank NCBI (National Center for Biotechnology Information), была подобрана пара праймеров, обозначенных HcMs8s-HcMs8as3, комплементарная фрагментам гена MS8 (mold-specific MS8 protein) (GenBank NCBI, AY049031), кодирующего белок Н.capsulatum, экспрессия которого происходит в мицелиальной фазе. Протеин ms8 участвует в образовании клеточной стенки гиф, придавая ей гидрофильность и гибкость. Расчетная длина специфического фрагмента составляла 361 п.н.Based on the data presented in the GenBank database of NCBI (National Center for Biotechnology Information), a pair of primers designated HcMs8s-HcMs8as3, complementary to fragments of the MS8 (mold-specific MS8 protein) gene (GenBank NCBI, AY049031) encoding the H. capsules protein was selected. , the expression of which occurs in the mycelial phase. Protein ms8 is involved in the formation of the cell wall of hyphae, giving it hydrophilicity and flexibility. The estimated length of the specific fragment was 361 bp
В качестве положительного контроля эксперименты проводили на штаммах Н.capsulatum var. capsulatum 6650, 6651, 6652, Н.capsulatum var. duboisii 630, 638, Н.capsulatum var. farciminosum 12-89, используя для выделения ДНК обеззараженные суспензии микромицета в концентрациях от 1×106 клеток/мл до 1×101 клеток/мл. Подсчет клеток дрожжевой фазы проводили в камере Горяева. Апробация праймеров была осуществлена на наборе штаммов возбудителя гистоплазмоза коллекционного центра МЖК Волгоградского научно-исследовательского противочумного института.As a positive control, experiments were performed on strains of H. capsulatum var. capsulatum 6650, 6651, 6652, H. capsulatum var. duboisii 630, 638, H. capsulatum var. farciminosum 12-89, using disinfected micromycete suspensions in concentrations from 1 × 10 6 cells / ml to 1 × 10 1 cells / ml for DNA extraction. The yeast phase cells were counted in a Goryaev chamber. Testing of the primers was carried out on a set of strains of the causative agent of histoplasmosis collection center MZHK Volgograd Research Anti-Plague Institute.
Чувствительность реакции амплификации с праймерами HcMs8s-HcMs8as3 оценивалась при исследовании проб ДНК, выделенных из десятикратных разведений чистых культур возбудителя гистоплазмоза, и составила - 1×102-1×104 клеток/мл.The sensitivity of the amplification reaction with HcMs8s-HcMs8as3 primers was evaluated by studying DNA samples isolated from ten-fold dilutions of pure cultures of the histoplasmosis pathogen and amounted to - 1 × 10 2 -1 × 10 4 cells / ml.
Для обнаружения возбудителя гистоплазмоза методом ПЦР оценена возможность использования сконструированных праймеров для анализа биологического материала (кровь, искусственно контаминированная клетками H.capsulatum). Показано, что использование разработанных праймеров при постановке реакции амплификации позволяет выявлять ДНК возбудителей гистоплазмоза с чувствительностью 1×104 клеток/мл.To detect the causative agent of histoplasmosis by PCR, the possibility of using designed primers for the analysis of biological material (blood artificially contaminated with H. capsulatum cells) was evaluated. It was shown that the use of the developed primers for the amplification reaction allows revealing the DNA of histoplasmosis pathogens with a sensitivity of 1 × 10 4 cells / ml.
Примеры конкретного выполнения.Examples of specific performance.
Пример 1. Методика конструирования олигонуклеотидных праймеров для идентификации ДНК возбудителя гистоплазмоза методом ПЦР.Example 1. The method of designing oligonucleotide primers for identification of DNA of the causative agent of histoplasmosis by PCR.
На основе теоретического изучения секвенированных нуклеотидных последовательностей возбудителя гистоплазмоза, присутствующих в базах данных (EMBL, Genbank, DDBJ), для конструирования праймеров была выбрана последовательность гена MS8 H.capsulatum (mold-specific MS8 protein) (GenBank NCBI, AY049031). Расчетная длина фрагмента ДНК, фланкируемого предлагаемыми праймерами, - 361 п.н. (таблица 1).Based on a theoretical study of the sequenced nucleotide sequences of the histoplasmosis pathogen that are present in the databases (EMBL, Genbank, DDBJ), the H.capsulatum (mold-specific MS8 protein) MS8 gene sequence (GenBank NCBI, AY049031) was selected for primer design. The estimated length of the DNA fragment flanked by the proposed primers is 361 bp (Table 1).
Праймеры были проанализированы с помощью компьютерной программы BLAST на web-сервере Национального Центра Биотехнологической Информации (NCBI) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) для установления гомологии между ними и нуклеотидными последовательностями близкородственных возбудителей особо опасных микозов и гетерологичных микроорганизмов, присутствующих в базах данных (EMBL, GenBank, DDBJ). На момент проведения компьютерного анализа гомологии выявлено не было.The primers were analyzed using the BLAST computer program on the web server of the National Center for Biotechnological Information (NCBI) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) to establish homology between them and the nucleotide sequences of closely related pathogens of especially dangerous mycoses and heterologous microorganisms present in the databases (EMBL, GenBank, DDBJ). At the time of the computer analysis, no homology was detected.
Пример 2. Амплификация специфического фрагмента гена MS8 с помощью разработанных праймеров для идентификации ДНК возбудителя гистоплазмоза.Example 2. Amplification of a specific fragment of the MS8 gene using the designed primers to identify DNA of the causative agent of histoplasmosis.
Для исключения возможности неспецифического отжига праймеров до достижения заданных температурных параметров используют режим «горячего старта». «Горячий старт» обеспечивается приготовлением реакционной смеси, состоящей из двух слоев (верхнего и нижнего), разделенных прослойкой воска. Нижний слой содержит предлагаемые праймеры и дезоксирибонуклеозидтрифосфаты, верхний - реакционный буфер, фермент Taq-полимеразу и ДНК-матрицу. Плавление воска и перемешивание реакционных компонентов происходит на этапе предварительной денатурации ДНК при 95°С.To exclude the possibility of nonspecific annealing of the primers before reaching the set temperature parameters, the “hot start” mode is used. A “hot start” is provided by preparing a reaction mixture consisting of two layers (upper and lower) separated by a layer of wax. The lower layer contains the proposed primers and deoxyribonucleoside triphosphates, the upper one contains the reaction buffer, Taq polymerase enzyme and DNA template. Melting of wax and mixing of the reaction components occurs at the stage of preliminary denaturation of DNA at 95 ° C.
Общий объем реакционной смеси 25 мкл на 1 пробу.The total volume of the reaction mixture is 25 μl per 1 sample.
Приготовление «нижней» реакционной смеси:Preparation of the “lower” reaction mixture:
Раствор dNTP (2,5 мМ) - 2 мклDNTP solution (2.5 mM) - 2 μl
Праймер HcMs8s (12 пМ/мкл) - 1 мклHcMs8s primer (12 pM / μl) - 1 μl
Праймер Ms8as3 (12 пМ/мкл) - 1 мклPrimer Ms8as3 (12 pM / μl) - 1 μl
Вода деиоинизированная - 1 мклDeioinized Water - 1 μl
Сверху наслаивается расплавленный воск 11 мкл.Melted wax 11 µl is layered on top.
(Приготовленные таким образом смеси можно хранить при t +8°С до 6 мес.)(Mixtures prepared in this way can be stored at t + 8 ° C for up to 6 months.)
Состав «верхней» реакционной смеси:The composition of the "upper" reaction mixture:
Буферный раствор ПЦР-смесь-2-blue или 2,5× ПЦР буфер 7,5 мMBuffer solution PCR-mixture-2-blue or 2.5 × PCR buffer 7.5 mm
MgCl2 коммерческий препарат фирмы «ЦНИИ Эпидемиологии» (Россия) - 10 мклMgCl 2 commercial preparation of the Central Research Institute of Epidemiology (Russia) - 10 μl
Исследуемая проба ДНК - 10 мкл.Test DNA sample - 10 μl.
Сверху наслаивают по 30 мкл минерального масла.On top lay 30 μl of mineral oil.
Условия проведения реакции для амплификатора «Терцик» (Россия): этап предварительной денатурации ДНК при 95°С - 5 мин, затем в течение 45 циклов - денатурация ДНК при 95°С - 10 сек; отжиг праймеров при 62°С - 10 сек; элонгация цепи при 72°С - 10 сек, с финальной полимеризацией в течение 1 мин.Reaction conditions for the Tertsik amplifier (Russia): stage of preliminary DNA denaturation at 95 ° C for 5 minutes, then for 45 cycles - DNA denaturation at 95 ° C for 10 seconds; primer annealing at 62 ° С - 10 sec; chain elongation at 72 ° C for 10 sec, with final polymerization for 1 min.
После этого продукты реакции разделяют путем электрофореза в 1,5% агарозном геле, сравнивая его подвижность с подвижностью полос маркеров молекулярного веса. При использовании разработанного набора праймеров в реакции амплификации с ДНК возбудителя гистоплазмоза синтезируемые ампликоны по электрофоретической подвижности соответствуют расчетным данным (рис.1).After this, the reaction products are separated by electrophoresis in a 1.5% agarose gel, comparing its mobility with the mobility of the molecular weight marker bands. Using the developed set of primers in the amplification reaction with DNA of the histoplasmosis pathogen, the synthesized amplicons according to electrophoretic mobility correspond to the calculated data (Fig. 1).
Пример 3. Определение чувствительности и специфичности реакции амплификации с помощью разработанных олигонуклеотидных праймеров для идентификации ДНК возбудителя гистоплазмоза.Example 3. Determination of the sensitivity and specificity of the amplification reaction using the developed oligonucleotide primers to identify DNA of the pathogen of histoplasmosis.
Чувствительность реакции амплификации с разработанными специфичными праймерами оценивалась при исследовании проб ДНК, выделенных из десятикратных разведений клеток чистых культур возбудителя гистоплазмоза.The sensitivity of the amplification reaction with the developed specific primers was evaluated by studying DNA samples isolated from ten-fold dilutions of cells of pure cultures of the histoplasmosis pathogen.
Обеззараживание исследуемых проб производят добавлением раствора мертиолята натрия до конечной концентрации 0,1% и прогреванием в течение 40 мин при температуре 56°С. Выделение ДНК из чистых культур микромицетов осуществляют с помощью метода гуанидинтиоцианатфенольной экстракции с переосаждением ДНК изопропанолом (Sandhu G.S. et al., 1995). Постановку реакции ПЦР осуществляют, как описано в примере 2. При тестировании коллекции грибных культур H.capsulatum Волгоградского научно-исследовательского противочумного института с использованием разработанных олигонуклеотидных праймеров продукт амплификации синтезировался с ДНК всех штаммов возбудителя гистоплазмоза с чувствительностью 1×102-1×104 клеток/мл. С другими видами близкородственных грибов и гетерологичных микроорганизмов в реакции ПЦР с разработанными праймерами в 100% случаев получен отрицательный результат.The disinfection of the test samples is carried out by adding a solution of sodium merthiolate to a final concentration of 0.1% and heating for 40 minutes at a temperature of 56 ° C. DNA is isolated from pure micromycete cultures using the guanidinothiocyanatophenol extraction method with DNA reprecipitation with isopropanol (Sandhu GS et al., 1995). The PCR reaction is carried out as described in example 2. When testing the collection of fungal cultures of H.capsulatum of the Volgograd Research Anti-Plague Institute using the developed oligonucleotide primers, the amplification product was synthesized with DNA of all histoplasmosis pathogen strains with a sensitivity of 1 × 10 2 -1 × 10 4 cells / ml With other species of closely related fungi and heterologous microorganisms in the PCR reaction with the developed primers, a negative result was obtained in 100% of cases.
В качестве примера на рисунке 2 показана электрофореграмма результатов реакции амплификации при определении чувствительности сконструированных праймеров с ДНК различных штаммов возбудителя гистоплазмоза.As an example, Figure 2 shows an electrophoregram of the results of the amplification reaction in determining the sensitivity of the designed primers with DNA of various strains of the histoplasmosis pathogen.
Таким образом, разработанные праймеры могут быть использованы для идентификации возбудителя гистоплазмоза и позволяют в короткий срок с высокой чувствительностью и специфичностью детектировать возбудителя гистоплазмоза в чистой культуре и биологическом материале.Thus, the developed primers can be used to identify the pathogen of histoplasmosis and make it possible to quickly detect the pathogen of histoplasmosis in high culture and biological material with high sensitivity and specificity.
Claims (1)
5'-CCCACATAGAAAGCCTCGTTCC-3'-HcMs8s
5'-TAGCCCTGCTGTTCGTTGC-3'-HcMs8as3
комплементарные фрагментам гена MS8 (mold-specific MS8 protein), кодирующего белок H.capsulatum, экспрессия которого происходит в мицелиальной фазе. Oligonucleotide primers for identifying the causative agent of histoplasmosis Histoplasma capsulatum by polymerase chain reaction, with direct and reverse primer activity in the amplification reaction, having the following structure:
5'-CCCACATAGAAAGCCTCGTTCC-3'-HcMs8s
5'-TAGCCCTGCTGTTCGTTGC-3'-HcMs8as3
complementary to fragments of the MS8 gene (mold-specific MS8 protein), encoding the H. capsulatum protein, the expression of which occurs in the mycelial phase.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2011127594/10A RU2464318C1 (en) | 2011-07-05 | 2011-07-05 | Oligonucleotide primers for identification of histoplasmosis agent histoplasma capsulatum |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2011127594/10A RU2464318C1 (en) | 2011-07-05 | 2011-07-05 | Oligonucleotide primers for identification of histoplasmosis agent histoplasma capsulatum |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2464318C1 true RU2464318C1 (en) | 2012-10-20 |
Family
ID=47145397
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2011127594/10A RU2464318C1 (en) | 2011-07-05 | 2011-07-05 | Oligonucleotide primers for identification of histoplasmosis agent histoplasma capsulatum |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2464318C1 (en) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2532845C1 (en) * | 2013-07-26 | 2014-11-10 | Федеральное казенное учреждение здравоохранения Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека | FLUORESCENCE-LABELLED OLIGONUCLEOTIDE PROBE MS8 Flip-R FOR IDENTIFYING HISTOPLASMOSIS CAUSATIVE AGENT, Histoplasma capsulatum |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SU897851A1 (en) * | 1980-02-05 | 1982-01-15 | Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт | Method of differentiating insentives of coccidioidosis and histoplasmosis |
| US20050065330A1 (en) * | 2002-04-24 | 2005-03-24 | The Cleveland Clinic Foundation | Identification of Histoplasma capsulatum using a PCR assay |
| EP2339026A1 (en) * | 2008-09-19 | 2011-06-29 | Instituto de Salud Carlos III | Method for simultaneously detecting histoplasma capsulatum and paracoccidioides brasiliensis |
-
2011
- 2011-07-05 RU RU2011127594/10A patent/RU2464318C1/en not_active IP Right Cessation
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SU897851A1 (en) * | 1980-02-05 | 1982-01-15 | Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт | Method of differentiating insentives of coccidioidosis and histoplasmosis |
| US20050065330A1 (en) * | 2002-04-24 | 2005-03-24 | The Cleveland Clinic Foundation | Identification of Histoplasma capsulatum using a PCR assay |
| EP2339026A1 (en) * | 2008-09-19 | 2011-06-29 | Instituto de Salud Carlos III | Method for simultaneously detecting histoplasma capsulatum and paracoccidioides brasiliensis |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2532845C1 (en) * | 2013-07-26 | 2014-11-10 | Федеральное казенное учреждение здравоохранения Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека | FLUORESCENCE-LABELLED OLIGONUCLEOTIDE PROBE MS8 Flip-R FOR IDENTIFYING HISTOPLASMOSIS CAUSATIVE AGENT, Histoplasma capsulatum |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Arantes et al. | Environmental mapping of Paracoccidioides spp. in Brazil reveals new clues into genetic diversity, biogeography and wild host association | |
| RU2385941C1 (en) | METHOD OF DETECTION BACTERIA Yersinia AND DIFFERENTIATION OF YERSINIA PATHOGENIC FOR HUMAN BY MULTIPLEX POLYMERASE CHAIN REACTION | |
| Vuran et al. | Identification of Malassezia species from pityriasis versicolor lesions with a new multiplex PCR method | |
| Dąbrowska et al. | The use of a one-step PCR method for the identification of Microsporum canis and Trichophyton mentagrophytes infection of pets | |
| Ilahi et al. | Real-time PCR identification of six Malassezia species | |
| EP1891232B1 (en) | Pcr diagnostics of dermatophytes and other pathogenic fungi | |
| Zamanian et al. | Evaluation of different primers for detection of Brucella in human and animal serum samples by using PCR method | |
| RU2422535C1 (en) | METHOD FOR Yersinia pestis Yersinia pseudotuberculosis STRAIN IDENTIFICATION | |
| Dhib et al. | Evaluation of Chitine synthase (CHS1) polymerase chain reaction assay in diagnosis of dermatophyte onychomycosis | |
| JP5522820B2 (en) | Method for detecting pathogens of strawberry important diseases and primers for detection | |
| Gupta et al. | Single-step PCR for detection of Brucella melitensis from tissue and blood of goats | |
| Wang et al. | Performance of the Real Fungus‐ID kit based on multiplex RT‐PCR assay for the rapid detection and identification of Trichophyton spp. and Microsporum spp. in clinical specimens with suspected dermatophyte infection | |
| RU2464318C1 (en) | Oligonucleotide primers for identification of histoplasmosis agent histoplasma capsulatum | |
| Brilhante et al. | RYP1 gene as a target for molecular diagnosis of histoplasmosis | |
| SG176989A1 (en) | Method and/or primers for the detection of mycobacterium tuberculosis | |
| Ahmad et al. | Development of a nested PCR assay for the detection of Fusarium solani DNA and its evaluation in the diagnosis of invasive fusariosis using an experimental mouse model | |
| Das et al. | Standardization of a two-step real-time polymerase chain reaction based method for species-specific detection of medically important Aspergillus species | |
| RU2346045C1 (en) | OLIGONUCLEOTIDE PRIMERS FOR IDENTIFYING Coccidioides posadasii | |
| CN107683338A (en) | Microorganism inspection method, microorganism inspection kit, microarray for microorganism inspection, carrier for mold detection, mold detection method, and mold detection kit | |
| Al-Khafajii | Myco-epidemiologic and genetic study of dermatophytosis and non-dermatophytes in Middle Euphrates, Iraq | |
| RU2486252C1 (en) | METHOD OF SPECIFIC IDENTIFICATION AND DIFFERENTIATION OF STRAINS Yersinia pseudotuberculosis FROM Yersinia pestis AND Yersinia enterocolitica | |
| Graciele-Melo et al. | Use of polymerase chain reaction for Cryptococcus neoformans genome detection in cerebrospinal fluid for neurocryptococcosis diagnosis | |
| Mohammed et al. | Identification of some dermatophytes isolated by PCR technique in Misan Province/Iraq | |
| RU2532845C1 (en) | FLUORESCENCE-LABELLED OLIGONUCLEOTIDE PROBE MS8 Flip-R FOR IDENTIFYING HISTOPLASMOSIS CAUSATIVE AGENT, Histoplasma capsulatum | |
| Liu et al. | Species-Specific DNA Probe for the Detection ofPorphyromonas gingivalisfrom Adult Chinese Periodontal Patients and Healthy Subjects |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20130706 |