RU2526811C1 - Способ местного лечения ран с помощью биологической повязки, содержащей живые клетки линии диплоидных фибробластов человека - Google Patents
Способ местного лечения ран с помощью биологической повязки, содержащей живые клетки линии диплоидных фибробластов человека Download PDFInfo
- Publication number
- RU2526811C1 RU2526811C1 RU2013131319/15A RU2013131319A RU2526811C1 RU 2526811 C1 RU2526811 C1 RU 2526811C1 RU 2013131319/15 A RU2013131319/15 A RU 2013131319/15A RU 2013131319 A RU2013131319 A RU 2013131319A RU 2526811 C1 RU2526811 C1 RU 2526811C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- dressing
- cells
- human
- wound
- biological dressing
- Prior art date
Links
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 38
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 title claims abstract description 19
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 13
- 230000029663 wound healing Effects 0.000 title abstract description 3
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 claims abstract description 50
- 206010052428 Wound Diseases 0.000 claims abstract description 41
- 210000001840 diploid cell Anatomy 0.000 claims abstract description 17
- 230000006378 damage Effects 0.000 claims abstract description 11
- 208000014674 injury Diseases 0.000 claims abstract description 9
- 239000010410 layer Substances 0.000 claims abstract description 9
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 claims abstract description 8
- 102000012422 Collagen Type I Human genes 0.000 claims abstract description 5
- 108010022452 Collagen Type I Proteins 0.000 claims abstract description 5
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 claims abstract description 5
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 claims abstract description 3
- 239000013553 cell monolayer Substances 0.000 claims abstract 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 8
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 5
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 claims description 5
- 239000002356 single layer Substances 0.000 claims description 4
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 claims description 3
- 230000035876 healing Effects 0.000 abstract description 8
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 3
- 229920006268 silicone film Polymers 0.000 abstract description 3
- 229940096422 collagen type i Drugs 0.000 abstract description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 abstract description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 7
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 5
- 108010044467 Isoenzymes Proteins 0.000 description 4
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 4
- AEFLONBTGZFSGQ-UHFFFAOYSA-N isoglutamine Chemical compound NC(=O)C(N)CCC(O)=O AEFLONBTGZFSGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 4
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 4
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 3
- 208000020584 Polyploidy Diseases 0.000 description 3
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 3
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 3
- 238000005138 cryopreservation Methods 0.000 description 3
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 3
- 230000019612 pigmentation Effects 0.000 description 3
- 210000001850 polyploid cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 101100284398 Bos taurus BoLA-DQB gene Proteins 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 2
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 2
- 206010011985 Decubitus ulcer Diseases 0.000 description 2
- 241000991587 Enterovirus C Species 0.000 description 2
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 2
- 101001100327 Homo sapiens RNA-binding protein 45 Proteins 0.000 description 2
- 206010020880 Hypertrophy Diseases 0.000 description 2
- 102000006992 Interferon-alpha Human genes 0.000 description 2
- 108010047761 Interferon-alpha Proteins 0.000 description 2
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 2
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 2
- 241001430197 Mollicutes Species 0.000 description 2
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 208000004210 Pressure Ulcer Diseases 0.000 description 2
- 102100038823 RNA-binding protein 45 Human genes 0.000 description 2
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 2
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 2
- 206010000210 abortion Diseases 0.000 description 2
- 231100000176 abortion Toxicity 0.000 description 2
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 2
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 2
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 2
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 2
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 2
- 230000000959 cryoprotective effect Effects 0.000 description 2
- 238000012364 cultivation method Methods 0.000 description 2
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 2
- 238000001493 electron microscopy Methods 0.000 description 2
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 2
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 2
- 239000012520 frozen sample Substances 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 2
- 229940047122 interleukins Drugs 0.000 description 2
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 2
- 230000002246 oncogenic effect Effects 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 238000009331 sowing Methods 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 2
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 2
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000001674 Agaricus brunnescens Nutrition 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 238000011749 CBA mouse Methods 0.000 description 1
- 208000027205 Congenital disease Diseases 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 208000026350 Inborn Genetic disease Diseases 0.000 description 1
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 1
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 1
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 1
- 201000005505 Measles Diseases 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 102100029560 Nicotinamide riboside kinase 2 Human genes 0.000 description 1
- 101710134507 Nicotinamide riboside kinase 2 Proteins 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 208000019802 Sexually transmitted disease Diseases 0.000 description 1
- 241000711975 Vesicular stomatitis virus Species 0.000 description 1
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 238000002485 combustion reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 description 1
- 239000002577 cryoprotective agent Substances 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 229940124645 emergency medicine Drugs 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 210000002615 epidermis Anatomy 0.000 description 1
- 239000004744 fabric Substances 0.000 description 1
- 230000003480 fibrinolytic effect Effects 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 208000016361 genetic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000003779 hair growth Effects 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 230000036074 healthy skin Effects 0.000 description 1
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 description 1
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 244000005706 microflora Species 0.000 description 1
- RZJSUWQGFCHNFS-UHFFFAOYSA-N monoisobutyl phthalate Chemical compound CC(C)COC(=O)C1=CC=CC=C1C(O)=O RZJSUWQGFCHNFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000037311 normal skin Effects 0.000 description 1
- 231100000590 oncogenic Toxicity 0.000 description 1
- 229920001558 organosilicon polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 1
- 229960001539 poliomyelitis vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 238000007873 sieving Methods 0.000 description 1
- 206010040882 skin lesion Diseases 0.000 description 1
- 231100000444 skin lesion Toxicity 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 201000008827 tuberculosis Diseases 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
Abstract
Представленная группа изобретений относится к медицине, а именно к дерматологии и хирургии. Способ местного лечения ран, включающий использование биологической повязки, которую накладывают на поверхность раны. Биологическая повязка содержит полимерное основание из гидрофобной перфорированной кремнийорганической пленки, покрытой слоем человеческого коллагена типа I, и диплоидные клетки человека. При этом биологическая повязка изготовлена в форме «квадрата» и содержит в качестве диплоидных клеток охарактеризованные живые клетки фибробласты человека линии М-20 на уровне пассажей №20-33 в виде монослоя клеток 70-80% плотности насыщения, полученного при исходной плотности посева (4-5)×104 клеток на 1 см2 повязки и культивировании в питательной среде с добавлением фибринолитически активной плазмы. При обширных повреждениях возможно размещение необходимого числа повязок «встык» на раневом поле. Предпочтительно повязку применяют с 1-2 суток после травмы. Группа изобретений обеспечивает улучшение репаративных процессов в ране и сокращение времени заживления. 2 н. и 2 з.п. ф-лы, 4 пр., 1 табл., 3 ил.
Description
Изобретение относится к медицине, биотехнологии.
Современный уровень развития биологии и медицины позволяет создавать раневые покрытия, содержащие диплоидные клетки, что позволяет активно влиять на процесс ранозаживления [Д.С. Саркисов, А.А. Алексеев, В.П. Туманов в кн.: Новые методы лечения ожогов с использованием культивированных аллофибробластов. Международный симпозиум. Саратов, 1998, с.31]. Такой подход открывает пути повышения эффективности, в частности, местного лечения пограничных ожоговых ран [С.В. Смирнов, В.Б. Хватов. Инновационные технологии местного лечения ожогов в НИИ скорой помощи им. Н.В. Склифосовского. В книге: Новая экономика. Инновационный портрет России. М., Центр стратегического партнерства, 2009, с.388-390].
Прототип. Патент РФ на изобретение №2373944., 23.06.2008 (Способ лечения ожоговой раны. Ермолов А.С., Смирнов СВ., Хватов В.Б., Миронова Л.Л., Конюшко О.И., Жиркова Е.А., Бочарова B.C.). Способ местного лечения ожоговых ран включает туалет раны, наложение на ее поверхность биологической повязки, состоящей из гидрофобной перфорированной кремнийорганической пленки «Карбоксил П», покрытой
слоем человеческого коллагена 1 типа, и в качестве аллогенных фибробластов используют охарактеризованные клетки линии диплоидных фибробластов человека М-22 на уровне 15-25 пассажей, причем повязку применяют с первых двух суток после ожоговой травмы. Местное лечение ожоговых ран позволяло обеспечить быстрое полноценное восстановление эпителия по всей поверхности раны II-IIIA с хорошим функциональным и косметическим результатом. Однако используемый штамм диплоидных фибробластов человека М-22 весьма «капризен» и требователен к условиям культивирования, обладает недостаточной пролиферативной активностью, что удлиняет время изготовления биологических повязок и увеличивает расход клеток. В результате возникла необходимость в клеточной линии, также пригодной для местного лечения пролежней, укушенных ран, длительно не заживающих и ожоговых ран. Для местного лечения повреждений кожи предложено использовать диплоидные клетки человека - фибробласты линии М-20.
Приводим сравнительную характеристику свойств линии М-20 и лицензированной линии М-22 (используется в прототипе) (Таблица).
| Сравнительная характеристика линий диплоидных клеток человека М-20 и М22 | ||
| Характеристика | М-20 | М-22прототип) |
| Видовая принадлежность, ткань | Человек, кожа и мышцы 10-недельного эмбриона, полученного при выполнении аборта по медицинским показаниям. | Человек, кожа и мышцы 8-недельного эмбриона, полученного при выполнении аборта по медицинским показаниям. |
| Где и когда выделена | ИПВЭ им. М.Л. Лумакова РАМН, 1986 | ИПВЭ им. М.П. Чумакова РАМН, 1986 |
| Характеристика донора | Онкологических, венерических заболеваний, гепатита, туберкулеза в анамнезе не обнаружено; генетических и врожденных заболеваний в семье не обнаружено. | |
| Культуральные свойства | ||
| Тип роста | фибробластоподобный | фибробластоподобный |
| Жизненный цикл | ||
| Фазы жизненного цикла | Становление 1-3 пассажи, активный рост 4-40, старение от 41 до 48-52. | Становление 1-3 пассажи, активный рост 4-39, старение 40-70. |
| Способ культивирования | Стационарный, перевивки 2 раза в неделю в фазе активного роста с коэффициентом рассева 1:2-1:3. | |
| Условия культивирования | Среда ДМЕМ с α-глутамином с добавлением 10% фибринолитически активной плазмы (ФАП) при температуре 37°C и содержании CO2-5%. | Среда Игла MEM с α-глутамином и 10% эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота при температуре 37°C и содержании CO2-5%. |
| Отделение клеток от поверхности роста | Смесью 0,25% раствора трипсина. | |
| Условия криоконсервирования | Состав криозащитной среды: ДМСО 10%, эмбриональная сыворотка крупного рогатого скота 40%, среда Игла MEM 50% | |
| Режим криоконсервирования | Стартовая температура 20°C, снижение температуры до +4°C со скоростью 1 град./мин; выдержка 10 минут, снижение температуры до -30 град./мин со скоростью 1 град./мин; выдержка 10 минут; снижение температуры до -150°C со скоростью 10 град./мин. Перенос замороженных образцов в жидкий азот. | |
| Восстановление и жизнеспособность клеток после хранения в | На водяной бане при температуре 37°C. Жизнеспособность: не менее 75±5% клеток. Среда для культивирования та же. | |
| Продолжение | ||
| Кариологические свойства. | Кариотип человека 2n=46,ХУ Диплоидных клеток 93,3-96,9%. Полиплоидных клеток не более 1,6%. Штамм обладает высокой генетической стабильностью. | Кариотип человека 2n=46,ХУ Диплоидных клеток 89,7-93,6%). Полиплоидных клеток не более 2,3%. |
| Изоэнзимная характеристика | Количество полос изоэнзимов Г-6ФДГ и ЛДГ и их электрофоретическая подвижность совпадают с таковыми для эритроцитов человека. Г-6ФДГ медленного типа | |
| Контроль контаминации: | ||
| Бактериями | Отрицательный | Отрицательный |
| Грибами | Отрицательный | Отрицательный |
| Микоплазмами | Отрицательный | Отрицательный |
| Вирусами | Отрицательный | Отрицательный |
| Контроль на онкогенную активность | ||
| In vivo | Не обнаружено | Не обнаружено |
| In vitro | Не обнаружено | Не обнаружено |
| Чувствительность к вирусам | Полиовирус, штаммы А. Сэбина 1, 2, 3 типов, вирус везикулярногостоматита (ВВС). | Полиовирусу, штаммы А. Сэбина 1, 2, 3 типов, ECHO, кори, КЭ, ЛХМ. |
| Биохимические, генетические маркеры | HLA-маркеры. A*02,03; B*07,40; C*03, 07; DRB1*15, 16; DQB1*05, 06 | Не определяли. |
| Область применения | Тест-система для определения интерферонового статуса, для получения клеточного продукта, предназначенного для лечения ожоговых (II-IIIa степень) и длительно не заживающих ран. | Для приготовления полиомиелитной вакцины из штаммов А. Сэбина трех типов. |
Кроме того, показано, что клетки линии М-20 на уровне 20 пассажа продуцируют мРНК α-интерферона (ИФНα) и интерлейкинов: ИЛ 1β, 2, 4, 6, 8, 10, 18, что объясняет механизм улучшения репаративных процессов при ранозаживлении.
Паспорт линии диплоидных клеток человека М-20
Наименование линии: М-20; Видовая принадлежность: человек; линия установлена в 1986 году в ГУ ИПВЭ им. М.П. Чумакова РАМН
Культуральные свойства:
1. Тип роста: фибробластоподобный
2. Количество пассажей: 50±2
3. Фазы роста: I-1-3 пассажи, II-4-40, III-41-(50±2)
4. Способ культивирования: стационарный, перевивки 2 раза в неделю
5. Условия культивирования: среда ДМЕМ с α-глутамином с добавлением 10% фибринолитически активной плазмы (ФАП) при температуре 37°C и 5% CO2 в атмосфере.
6. Метод отделения клеток от поверхности роста: смесью 0,25% раствора трипсина и 0,02% раствора Версена в отношении (1:1)
Условия хранения: при температуре минус 196°C (в жидком азоте); а) состав криозащитной среды: среда ДМЕМ-50%, криопротектор ДМСО-10%, сыворотка эмбрионов коров - 40%. б) Режим замораживания: стартовая температура 20°C, снижение температуры до +4°C со скоростью 1 град./мин; выдержка 10 минут, снижение температуры до -30 град./мин со скоростью 1 град./мин; выдержка 10 минут; снижение температуры до -150°C со скоростью 10 град./мин. Перенос замороженных образцов в жидкий азот.
Восстановление и жизнеспособность клеток после криохранения:
на водяной бане при температуре 37°C. Жизнеспособность: не менее 75±5% клеток. Среда для культивирования та же.
Изоэнзимная характеристика: Количество полос изоэнзимов Г-6ФДГ и ЛДГ и их электрофоретическая подвижность совпадают с таковыми для эритроцитов человека. Г-6ФДГ медленного типа.
Кариологическая характеристика: Кариотип человека 2n=46, ХУ. Диплоидных клеток 93,3-96,9%. Полиплоидных клеток не более 1,6%. Штамм обладает высокой генетической стабильностью.
Контроль контаминации: бактерий, грибов, микоплазм при посеве на селективные питательные среды, заражении куриных эмбрионов и при электронно-микроскопическом исследовании не выявлено, вирусов не обнаружено в исследованиях на животных, в клеточных культурах, в куриных эмбрионах, методами электронной микроскопии.
Онкогенная безопасность: in vivo - при исследовании с использованием линейных мышей СВА опухоли не образовывались; in vitro - контроль на обратную транскриптазу отрицательный.
Биохимические, генетические маркеры: а) HLA - маркеры: A*02, 03; B*07, 40; C*03, 07; DRB1*15, 16; DQB1*05, 06. б) Клетки линии М-20 на уровне 20 пассажа продуцируют мРНК α-интерферона (ИФНα) и интерлейкинов: ИЛ 1β, 2, 4, 6, 8.10, 18.
Таким образом, линия диплоидных клеток человека М-20 охарактеризована согласно методическим рекомендациям «Аттестация перевиваемых клеточных линий - субстратов производства и контроля медицинских иммунобиологических препаратов» РД-42-28-10-89. МЗ СССР. М., 1989.- С.16]. Она охарактеризована на безопасность в соответствии с рекомендациями ВОЗ и требованиями ГНИИСиК МИБП им. Л.А. Тарасевича. В ИПВЭ им. М.П. Чумакова РАМН имеются банки посевных и рабочих клеток, способные обеспечить все потребности производства и научных исследований. Линия М-20 обладает более высокой пролиферативной активностью, чем линия М-22, за счет использования при культивировании клеток ФАП.
Эти данные являются обоснованием к применению этих клеток в новой биологической повязке для ускорения процессов заживления при лечении пролежней, ожоговых, укушенных и длительно не заживающих ран.
Техническое решение направлено на создание биологической повязки с улучшенными свойствами за счет применения фибробластов человека линии М-20, обладающих более высокой пролиферативной активностью в результате культивирования их с добавлением фибринолитически активной плазмы (ФАП), что обеспечивает улучшение репаративных процессов в ране и сокращение времени заживления. При этом повязку изготавливают в больших по площади чашках квадратной формы, что обеспечивает дополнительные преимущества - возможность покрытия раневой поверхности большой площади, в том числе путем размещения необходимого числа повязок «встык» на раневом поле, что позволяет закрыть все раневое поле при обширных повреждениях.
Таким образом, объектом изобретения является биологическая повязка для местного лечения ран, содержащая полимерное основание из гидрофобной перфорированной кремнийорганической пленки, покрытое слоем человеческого коллагена типа I, и диплоидные клетки человека, которая в качестве диплоидных клеток содержит охарактеризованные живые клетки фибробласты человека линии М-20 на уровне пассажей №20-33 в виде монослоя клеток 70-80% плотности насыщения, полученного при исходной плотности посева (4-5)×104 клеток на 1 см2 повязки и культивировании в питательной среде с добавлением фибринолитически активной плазмы (ФАП), при этом повязка имеет форму квадрата.
Объектом изобретения является также способ местного лечения ран, включающий наложение на поверхность раны биологической повязки, содержащей полимерное основание из гидрофобной перфорированной кремнийорганической пленки, покрытой слоем человеческого коллагена типа I, и диплоидные клетки человека, в котором биологическая повязка изготовлена в форме «квадрата» и содержит в качестве диплоидных клеток охарактеризованные живые клетки фибробласты человека линии М-20 на уровне пассажей №20-33 в виде монослоя клеток 70-80% плотности насыщения, полученного при исходной плотности посева (4-5)×104 клеток на 1 см2 повязки и культивировании в питательной среде с добавлением ФАП. При обширных повреждениях возможно размещение необходимого числа повязок «встык» на раневом поле. Предпочтительно повязку применяют с 1-2 суток после травмы.
Пример 1. Пример изготовления биологической повязки.
На дне квадратной чашки Петри (12×12 см) площадью 144 см2 (в прототипе использовали круглые чашки диаметром 9 см и площадью 63 см2) помещают гидрофобную, прозрачную, перфорированную кремнийорганическую пленку «Карбоксил-П», покрывают слоем коллагена 1 типа человека, высушивают, подвергают стерилизации гамма-лучами. В стерильном боксе в подготовленные чаши Петри помещают суспензию фибробластов линии М-20 (20-33 пассажа), плотность посева клеток составляет (4-5)×104 клеток на 1 см2. Клетки культивируют в течение суток в CO2-инкубаторе при 37°C и в атмосфере, содержащей 5% CO2. Используют питательную среду ДМЕМ с α-глутамином для культур клеток, содержащую 10% ФАП. Через 18-24 часа клетки формируют монослой 70-80% плотностью насыщения. Подготовленную таким образом биологическую повязку доставляют в клинику в герметичном термоконтейнере (рис.1, 2).
Рис 1. Биологическая повязка на основе культивированных аллофибробластов линии М-20 (а. внешний вид повязки, в. схема повязки, с. клетки линии М-20).
Рис 2. Биологическая повязка, содержащая фибробласты линии М-20 перед наложением на рану.
Пример 2. Наложение биологической повязки на примере ожоговой раны: с раневой поверхности удаляют мертвые ткани, продукты горения и загрязнения. На подготовленную рану накладывают биологическую повязку, клетками (фибробластами М-20) обращая к поверхности раны. Раневое покрытие фиксируют влажно-высыхающей марлевой повязкой. Повязку применяют с 1-2 суток после ожоговой травмы. Следующую перевязку выполняют через 2-3 дня. Прозрачность кремнийорганического полимерного основания позволяет наблюдать за состоянием раны и контролировать ее заживление, а газопроницаемость пленки, сравнимая с показателями здоровой кожи, обеспечивает метаболический комфорт в ране. Гидрофобная природа пленки способствует легкому, безболезненному ее удалению при перевязке без повреждения сформировавшегося на поверхности раны регенерировавшего слоя неоэпителия.
Примеры 3-4. Клинические примеры применения биологической повязки, содержащей фибробласты человека линии М-20 (рис 3, а. - пример 3, в - пример 4):
Пример 3. Больной К, 32 лет, диагноз: ожог пламенем I-II-IIIA степени 65% поверхности тела. Через 18 часов после травмы произведена первичная хирургическая обработка раны и на площадь 2260 см2 наложены 15 биологических повязок, содержащих живые фибробласты линии М-20 (90 млн клеток). На 4 сутки после наложения биологической повязки (80 млн клеток) на всей раневой поверхности спины сформировался слой неоэпидермиса; на 6 сутки в местах наложения повязок наблюдалась полная эпителизация раневой поверхности без признаков гипертрофии эпидермиса. Мазки-отпечатки с поверхности неотэпителия свидетельствовали о наличии микрофлоры, типичной для нормальной кожи. К 12 суткам в сформированном эпителии появлялись признаки восстановления пигментации и волосы.
Пример 4. Больной С., 35 лет, диагноз: ожог пламенем I-II-IIIA степени 25% поверхности тела. Через 24 часа после травмы произведена первичная хирургическая обработка раны и на площадь 1200 см2 наложены 8 биологических повязок, содержащих живые фибробласты линии М-20 (40 млн клеток). На 4 сутки наложены биологические повязки, содержащие живые фибробласты (40 млн клеток), на 7 сутки в местах наложения повязок наблюдалась полная эпителизация раневой поверхности без признаков гипертрофии эпидермиса. К 15 суткам в сформированном эпителии появлялись признаки восстановления пигментации и волосы.
Наблюдение за больными в течение последующих 2-3 месяцев свидетельствует о формировании полноценного кожного покрова с нормальной эластичностью, пигментацией и ростом волос. При контрольном осмотре через 3-6 месяцев кожа в зоне применения аллофибробластов гладкая, эластичная, нормального цвета с наличием волос. Использование в составе биологической повязки всесторонне обследованной клеточной линии живых диплоидных фибробластов М-20 гарантирует биологическую безопасность клеточного материала и обеспечивает улучшение репаративных процессов в ожоговой ране. Наличие банков посевных и рабочих клеток из детально охарактеризованных клеточных линий позволяет своевременно и в полном объеме обеспечивать потребности клиники.
Claims (4)
2. Способ местного лечения ран, включающий наложение на поверхность раны биологической повязки, содержащей полимерное основание из гидрофобной перфорированной кремнийорганической пленки, покрытой слоем человеческого коллагена типа I, и диплоидные клетки человека, отличающийся тем, что биологическая повязка изготовлена в форме «квадрата» и содержит в качестве диплоидных клеток охарактеризованные живые клетки фибробласты человека линии М-20 на уровне пассажей №20-33 в виде монослоя клеток 70-80% плотности насыщения, полученного при исходной плотности посева (4-5)×104 клеток на 1 см2 повязки и культивировании в питательной среде с добавлением ФАП.
3. Способ по п.2, отличающийся тем, что при обширных повреждениях размещают необходимое число повязок «встык» на раневом поле.
4. Способ по любому из пп.2-3, отличающийся тем, что повязку применяют с 1-2 суток после травмы.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2013131319/15A RU2526811C1 (ru) | 2013-07-09 | 2013-07-09 | Способ местного лечения ран с помощью биологической повязки, содержащей живые клетки линии диплоидных фибробластов человека |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2013131319/15A RU2526811C1 (ru) | 2013-07-09 | 2013-07-09 | Способ местного лечения ран с помощью биологической повязки, содержащей живые клетки линии диплоидных фибробластов человека |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2526811C1 true RU2526811C1 (ru) | 2014-08-27 |
Family
ID=51456261
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2013131319/15A RU2526811C1 (ru) | 2013-07-09 | 2013-07-09 | Способ местного лечения ран с помощью биологической повязки, содержащей живые клетки линии диплоидных фибробластов человека |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2526811C1 (ru) |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2198685C1 (ru) * | 2001-12-18 | 2003-02-20 | Пашкин Игорь Иванович | Медицинский полимерный гелевый материал и лечебные средства на его основе |
| RU2373944C1 (ru) * | 2008-06-23 | 2009-11-27 | Государственное учреждение здравоохранения г. Москвы Научно-исследовательский институт скорой помощи им. Н.В.Склифосовского Департамента здравоохранения г. Москвы | Способ лечения ожоговой раны |
| RU2433834C2 (ru) * | 2006-11-09 | 2011-11-20 | КейСиАй Лайсензинг Инк. | Пористая биологически рассасываемая включающая микросферы повязка и способ ее изготовления |
-
2013
- 2013-07-09 RU RU2013131319/15A patent/RU2526811C1/ru active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2198685C1 (ru) * | 2001-12-18 | 2003-02-20 | Пашкин Игорь Иванович | Медицинский полимерный гелевый материал и лечебные средства на его основе |
| RU2433834C2 (ru) * | 2006-11-09 | 2011-11-20 | КейСиАй Лайсензинг Инк. | Пористая биологически рассасываемая включающая микросферы повязка и способ ее изготовления |
| RU2373944C1 (ru) * | 2008-06-23 | 2009-11-27 | Государственное учреждение здравоохранения г. Москвы Научно-исследовательский институт скорой помощи им. Н.В.Склифосовского Департамента здравоохранения г. Москвы | Способ лечения ожоговой раны |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| ПРИХОДЬКО Л. Н. Применение кремнийорганических сорбентов для местного лечения ожоговых ран. Клин. хирургия. 1989. N3. C. 25-27. ЖИЛЯЕВ Е. Г. Применение кремнийорганических сорбентов при лечении экспериментальных гнойных ран. Воен.- мед. журн. 1995. N1. C. 55. ШИН Ф. Е. Лечение гнойных ран кремнийорганическими сорбентами и комплексным применением сорбента аэросила с УФО-аутокрови. автореф. дисс. к.м.н. Москва. 1995 c.6-14 * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| ES2252830T3 (es) | Soportes recubiertos por celulas. | |
| CN100432220C (zh) | 在创伤治疗中可用作生物活性物质的角质细胞 | |
| CN102985534A (zh) | 用于体外大量扩增毛囊干细胞的培养方法 | |
| JPH02174848A (ja) | 表皮シート並びにその製法、貯蔵方法および用途 | |
| CN101856517A (zh) | 基于组织工程材料的黑素细胞的培养方法及其应用 | |
| CN104087551A (zh) | 一种体外分离培养人的表皮细胞的新方法 | |
| Boyce | Methods for the Serum-Free Culture of Keratinocytes and Transplantation of Collagen—GAG-Based Skin Substitutes | |
| CN103550828B (zh) | 一种基于毛囊干细胞和硅凝胶敷料的皮肤重建方法 | |
| CN103436444A (zh) | 温度敏感型细胞培养装置及制备方法、细胞培养方法 | |
| KR20210084527A (ko) | 줄기세포 재료 및 그 제조방법 | |
| CN108938669B (zh) | 一种用于治疗皮肤损伤的干细胞软膏及其制备方法 | |
| CN106701670A (zh) | 一种增强间充质干细胞分泌生物活性因子能力及培养液中活性因子的提取方法 | |
| CN102161981B (zh) | 一种重组蛋白联合诱导骨髓间充质干细胞转变为汗腺细胞的方法 | |
| CN108350420A (zh) | 培养细胞的方法 | |
| RU2526811C1 (ru) | Способ местного лечения ран с помощью биологической повязки, содержащей живые клетки линии диплоидных фибробластов человека | |
| RU2010028C1 (ru) | Способ восстановления кожного покрова у тяжелообожженных | |
| CN105154388B (zh) | 一种皮肤角质细胞分离、培养方法 | |
| CN105963795A (zh) | 一种基于胶原制备组织工程表皮的方法 | |
| RU2373944C1 (ru) | Способ лечения ожоговой раны | |
| CN103468745B (zh) | 一种用vegf165基因修饰的毛囊干细胞作为种子细胞的人工皮肤的制备方法 | |
| RU2142820C1 (ru) | Аллотрансплантат для восстановления кожного покрова, способ его получения и способ восстановления кожного покрова при повреждениях различной этиологии | |
| CN103487585B (zh) | 蛋白印迹法检测毛囊干细胞vegf165蛋白表达的方法 | |
| RU2526813C1 (ru) | Комбинированный трансплантат дермального матрикса с мезенхимальными мультипотентными стромальными клетками, способ его получения и способ лечения ран с его использованием | |
| RU103474U1 (ru) | Перевязочное средство | |
| US20250352699A1 (en) | Cell sheets and uses |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PD4A | Correction of name of patent owner | ||
| PD4A | Correction of name of patent owner | ||
| PC43 | Official registration of the transfer of the exclusive right without contract for inventions |
Effective date: 20190301 |
|
| PD4A | Correction of name of patent owner |