RU2522804C2 - METHOD OF SYNTHESIS OF N-SUBSTITUTED ACRYLAMIDES AND RECOMBINANT STRAIN Rhodococcus erythropolis FOR ITS IMPLEMENTATION (VERSIONS) - Google Patents
METHOD OF SYNTHESIS OF N-SUBSTITUTED ACRYLAMIDES AND RECOMBINANT STRAIN Rhodococcus erythropolis FOR ITS IMPLEMENTATION (VERSIONS) Download PDFInfo
- Publication number
- RU2522804C2 RU2522804C2 RU2012143354/10A RU2012143354A RU2522804C2 RU 2522804 C2 RU2522804 C2 RU 2522804C2 RU 2012143354/10 A RU2012143354/10 A RU 2012143354/10A RU 2012143354 A RU2012143354 A RU 2012143354A RU 2522804 C2 RU2522804 C2 RU 2522804C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- rhodococcus erythropolis
- vkpm
- strain
- ami
- synthesis
- Prior art date
Links
- 241000187561 Rhodococcus erythropolis Species 0.000 title claims abstract description 65
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 title claims abstract description 24
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 title claims abstract description 23
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 19
- 150000003926 acrylamides Chemical class 0.000 title 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims abstract description 25
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims abstract description 25
- 239000011942 biocatalyst Substances 0.000 claims abstract description 25
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 23
- -1 N-substituted acrylamides Chemical class 0.000 claims abstract description 21
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 12
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 108010024026 Nitrile hydratase Proteins 0.000 claims description 7
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims description 7
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims description 7
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 2
- 101710186969 Acylamidase Proteins 0.000 abstract description 14
- QNILTEGFHQSKFF-UHFFFAOYSA-N n-propan-2-ylprop-2-enamide Chemical compound CC(C)NC(=O)C=C QNILTEGFHQSKFF-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 11
- 102000005922 amidase Human genes 0.000 abstract description 9
- ADTJPOBHAXXXFS-UHFFFAOYSA-N n-[3-(dimethylamino)propyl]prop-2-enamide Chemical compound CN(C)CCCNC(=O)C=C ADTJPOBHAXXXFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 7
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 20
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 19
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 11
- XZNUGFQTQHRASN-XQENGBIVSA-N apramycin Chemical compound O([C@H]1O[C@@H]2[C@H](O)[C@@H]([C@H](O[C@H]2C[C@H]1N)O[C@@H]1[C@@H]([C@@H](O)[C@H](N)[C@@H](CO)O1)O)NC)[C@@H]1[C@@H](N)C[C@@H](N)[C@H](O)[C@H]1O XZNUGFQTQHRASN-XQENGBIVSA-N 0.000 description 7
- 229950006334 apramycin Drugs 0.000 description 7
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 7
- FZERHIULMFGESH-UHFFFAOYSA-N N-phenylacetamide Chemical compound CC(=O)NC1=CC=CC=C1 FZERHIULMFGESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 6
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 6
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 6
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 5
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 5
- 230000002210 biocatalytic effect Effects 0.000 description 4
- 238000004817 gas chromatography Methods 0.000 description 4
- JJWLVOIRVHMVIS-UHFFFAOYSA-N isopropylamine Chemical compound CC(C)N JJWLVOIRVHMVIS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 241000187693 Rhodococcus rhodochrous Species 0.000 description 3
- 229960001413 acetanilide Drugs 0.000 description 3
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 3
- IUNMPGNGSSIWFP-UHFFFAOYSA-N dimethylaminopropylamine Chemical compound CN(C)CCCN IUNMPGNGSSIWFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 3
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 150000003841 chloride salts Chemical class 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 2
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 2
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 2
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O Ammonium Chemical compound [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 241000239290 Araneae Species 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 241000316848 Rhodococcus <scale insect> Species 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-N acrylic acid group Chemical group C(C=C)(=O)O NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000010933 acylation Effects 0.000 description 1
- 238000005917 acylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003463 adsorbent Substances 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 description 1
- 239000007900 aqueous suspension Substances 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 239000008394 flocculating agent Substances 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 1
- 125000005395 methacrylic acid group Chemical class 0.000 description 1
- 235000013379 molasses Nutrition 0.000 description 1
- 150000002823 nitrates Chemical class 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 238000012916 structural analysis Methods 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 1
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 1
- 229920003169 water-soluble polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
Заявляемая группа изобретений относится к биотехнологии и касается рекомбинантных штаммов Rhodococcus erythropolis, а также способа синтеза N-замещенных акриламидов, в частности N-изопропилакриламида или N-диметиламинопропилакриламида, с использованием клеток этих штаммов в качестве биокатализатора.The claimed group of inventions relates to biotechnology and relates to recombinant strains of Rhodococcus erythropolis, as well as to a method for the synthesis of N-substituted acrylamides, in particular N-isopropyl acrylamide or N-dimethylaminopropyl acrylamide, using cells of these strains as a biocatalyst.
N-замещенные алифатические акриламиды находят широкое применение как мономеры для получения широкой гаммы водорастворимых полимеров, используемых в качестве флокулянтов, адсорбентов и структурообразователей в различных отраслях промышленности и сельского хозяйства (Полиакриламид. - М., 1992).N-substituted aliphatic acrylamides are widely used as monomers for the production of a wide range of water-soluble polymers used as flocculants, adsorbents and structure-forming agents in various industries and agriculture (Polyacrylamide. - M., 1992).
Традиционный способ промышленного производства N-замещенных акриламидов осуществляют путем химического синтеза, основанного на ацилировании алифатических аминов хлорангидридами акриловой и метакриловой кислот (MacWilliams D.S. Functional monomers. Their preparation, polymerization, and application. New York: M.Decker, 1973). Недостатком такого способа является использование крайне ядовитых хлорангидридов, а также токсичных органических растворителей.The traditional method of industrial production of N-substituted acrylamides is carried out by chemical synthesis based on the acylation of aliphatic amines with acid chlorides of acrylic and methacrylic acids (MacWilliams D. S. Functional monomers. Their preparation, polymerization, and application. New York: M. Decker, 1973). The disadvantage of this method is the use of highly toxic acid chlorides, as well as toxic organic solvents.
Альтернативным подходом к синтезу N-замещенных акриламидов является биокаталитический синтез, протекающий в водной среде. Известен способ биокаталитического синтеза N-замещенных акриламидов с помощью биокатализатора - клеток штамма Rhodococcus erythropolis 37 ВКПМ Ас-1793, обладающих ацилирующей активностью (RU 2399672), обусловленной наличием в них фермента ациламидазы.An alternative approach to the synthesis of N-substituted acrylamides is biocatalytic synthesis occurring in an aqueous medium. A known method of biocatalytic synthesis of N-substituted acrylamides using a biocatalyst - cells of the strain Rhodococcus erythropolis 37 VKPM Ac-1793, having acylating activity (RU 2399672), due to the presence of the acylamidase enzyme in them.
Штамм Rhodococcus erythropolis 37 ВКПМ Ас-1793 (RU 2399672) рассмотрим в качестве ближайшего аналога заявляемого штамма, а способ биокаталитического синтеза N-замещенных акриламидов с использованием в качестве биокатализатора клеток штамма Rhodococcus erythropolis 37 ВКПМ Ас-1793 (RU 2399672) - в качестве ближайшего аналога заявляемого способа.The strain Rhodococcus erythropolis 37 VKPM Ac-1793 (RU 2399672) will be considered as the closest analogue of the claimed strain, and the method of biocatalytic synthesis of N-substituted acrylamides using as a biocatalyst cell strain Rhodococcus erythropolis 37 VKPM Ac-1793 (RU 2399672) - analog of the proposed method.
Недостатком штамма Rhodococcus erythropolis 37 ВКПМ Ас-1793 является то, что его ацилирующая активность является индуцибельной, то есть требует наличия в среде культивирования дорогостоящего индуктора - ацетанилида. Это повышает стоимость и снижает конкурентоспособность способа - ближайшего аналога, основанного на использовании штамма ВКПМ Ас-1793 в качестве биокатализатора.The disadvantage of the strain Rhodococcus erythropolis 37 VKPM As-1793 is that its acylating activity is inducible, that is, it requires the presence of an expensive inducer, acetanilide, in the culture medium. This increases the cost and reduces the competitiveness of the method - the closest analogue based on the use of strain VKPM As-1793 as a biocatalyst.
В патенте RU 2439154 представлена нуклеотидная последовательность фрагмента ДНК DAA37 из Rhodococcus erythropolis 37 ВКПМ Ас-1793, кодирующего фермент ациламидазу. Эти сведения открыли перспективы для конструирования более совершенных биокатализаторов с ацилирующей активностью методами генетической инженерии.RU 2439154 provides the nucleotide sequence of a DAA37 DNA fragment from Rhodococcus erythropolis 37 VKPM Ac-1793 encoding the acylamidase enzyme. This information has opened up prospects for the design of more advanced biocatalysts with acylating activity by genetic engineering methods.
Задачей заявляемой группы изобретений является создание рекомбинантных штаммов Rhodococcus erythropolis, конститутивно синтезирующих ациламидазу и разработка биокаталитических способов синтеза N-замещенных акриламидов с использованием клеток этих штаммов в качестве биокатализатора.The task of the claimed group of inventions is the creation of recombinant strains of Rhodococcus erythropolis constitutively synthesizing acylamidase and the development of biocatalytic methods for the synthesis of N-substituted acrylamides using cells of these strains as a biocatalyst.
Задача решена путем:The problem is solved by:
- разработки способа синтеза N-замещенных акриламидов с использованием в качестве биокатализатора бактерий Rhodococcus erythropolis с конститутивной ацилирующей активностью;- development of a method for the synthesis of N-substituted acrylamides using Rhodococcus erythropolis with constitutive acylating activity as a biocatalyst;
- конструирования штамма с конститутивной ацилирующей активностью Rhodococcus erythropolis 37 p16-Ami ВКПМ Ac-1937, путем введения фрагмента ДНК DAA37 в составе гибридной плазмиды p16-Ami в реципиентный штамм Rhodococcus erythropolis 37 ВКПМ Ас-1793 для осуществления заявляемого способа;- designing a strain with constitutive acylating activity of Rhodococcus erythropolis 37 p16-Ami VKPM Ac-1937, by introducing a DAA37 DNA fragment of the hybrid plasmid p16-Ami in the recipient strain Rhodococcus erythropolis 37 VKPM Ac-1793 for the implementation of the proposed method;
- конструирования штамма с конститутивной ацилирующей активностью Rhodococcus erythropolis НХ7 p16-Ami ВКПМ Ас-1938, путем введения фрагмента ДНК DAA37 в составе гибридной плазмиды p16-Ami в реципиентный штамм Rhodococcus erythropolis НХ7 ВКПМ Ас-1267 для осуществления заявляемого способа.- constructing a strain with constitutive acylating activity of Rhodococcus erythropolis HX7 p16-Ami VKPM As-1938, by introducing a DAA37 DNA fragment as part of the hybrid plasmid p16-Ami into the recipient strain Rhodococcus erythropolis HX7 VKPM As-1267 to implement the proposed method.
Штаммы Rhodоcoccus erythropolis, в которые введена плазмида с фрагментом ДНК DAA37 из Rhodococcus erythropolis 37 ВКПМ Ас-1793, приобретают конститутивную ацилирующую активность и способность синтезировать N-замещенные алифатические акриламиды. При смешивании водных растворов акриламида и аминов в присутствии клеток Rhodococcus erythropolis 37 p16-Ami ВКПМ Ac-1937 и Rhodococcus erythropolis HX7 p16-Ami ВКПМ Ac-1938 (используемых в качестве биокатализатора) происходит синтез N-замещенных акриламидов, в частности N-изопропилакриламида или N-диметиламинопропилакриламида.Strains of Rhodococcus erythropolis, into which a plasmid with a DAA37 DNA fragment from Rhodococcus erythropolis 37 VKPM As-1793 was introduced, acquires constitutive acylating activity and the ability to synthesize N-substituted aliphatic acrylamides. When aqueous solutions of acrylamide and amines are mixed in the presence of Rhodococcus erythropolis 37 p16-Ami VKPM Ac-1937 and Rhodococcus erythropolis HX7 p16-Ami VKPM Ac-1938 cells (used as a biocatalyst), N-substituted acrylamides, in particular N-isopropylacrylamide, are synthesized N-dimethylaminopropylacrylamide.
Характеристика заявляемых штаммов.Characterization of the claimed strains.
Rhodococcus erythropolis 37 p16-Ami ВКПМ Ac-193 7 является производным штамма Rhodococcus erythropolis 37 ВКПМ Ас-1793, в который введена плазмида с фрагментом ДНК DAA37, кодирующим синтез ациламидазы. Штамм Rhodococcus erythropolis 37 p16-Ami ВКПМ Ac-1937 дополнительно приобрел маркер устойчивости к апрамицину.Rhodococcus erythropolis 37 p16-Ami VKPM Ac-193 7 is a derivative of the strain Rhodococcus erythropolis 37 VKPM Ac-1793, into which a plasmid with a DAA37 DNA fragment encoding acylamidase synthesis was introduced. The strain Rhodococcus erythropolis 37 p16-Ami VKPM Ac-1937 additionally acquired a marker of resistance to apramycin.
Rhodococcus erythropolis HX7 p16-Ami ВКПМ Ac-1938 является производным штамма Rhodococcus erythropolis HX7 ВКПМ Ac-1267, в который введена плазмида с фрагментом ДНК DAA37, кодирующим синтез ациламидазы. Штамм Rhodococcus erythropolis НХ7 p16-Ami ВКПМ Ас-1938 дополнительно приобрел маркер устойчивости к апрамицину.Rhodococcus erythropolis HX7 VKPM Ac-1938 is a derivative of the strain Rhodococcus erythropolis HX7 VKPM Ac-1267, into which a plasmid with a DAA37 DNA fragment encoding acylamidase synthesis was introduced. The strain Rhodococcus erythropolis HX7 p16-Ami VKPM Ac-1938 additionally acquired a marker of resistance to apramycin.
Оптимальные условия культивирования.Optimum cultivation conditions.
Для получения клеток заявляемых штаммов в больших количествах и с высокой активностью ациламидазы штаммы выращивают при 25-30°C в течение 24-72 часов на синтетических средах, содержащих в качестве источника углерода сахарозу, ацетат или мелассу в концентрациях 0.1-4%, а в качестве источника азота аммонийные или нитратные соли в концентрациях 0.4-2%.To obtain the cells of the claimed strains in large quantities and with high acylamidase activity, the strains are grown at 25-30 ° C for 24-72 hours on synthetic media containing sucrose, acetate or molasses in concentrations of 0.1-4% as a carbon source, and in as a source of nitrogen, ammonium or nitrate salts in concentrations of 0.4-2%.
Получение биокатализатора.Obtaining a biocatalyst.
Клетки биокатализаторов - рекомбинантных штаммов Rhodococcus erythropolis, обладающие конститутивной ацилирующей активностью, получают следующим образом.Cells of biocatalysts - recombinant strains of Rhodococcus erythropolis with constitutive acylating activity are obtained as follows.
Посевной материал, представляющий собой культуру бактерий Rhodococcus erythropolis, несущих плазмиду p16-Ami, выращивают в жидкой среде Лурия Бертани (ЛБ), имеющей состав в мас.%: триптон 0,5, дрожжевой экстракт 0,25, NaCl 0,5, вода - остальное) с апрамицином 100-200 мкг/мл при 20-30°C до достижения оптической плотности 4-5 единиц при 540 нм. После инкубации в течение 24-30 часов клетки осаждают, промывают и используют в качестве биокатализатора.The seed, representing a culture of bacteria Rhodococcus erythropolis, carrying the p16-Ami plasmid, is grown in Luria Bertani (LB) liquid medium having a composition in wt.%: Tryptone 0.5, yeast extract 0.25, NaCl 0.5, water - the rest) with apramycin 100-200 μg / ml at 20-30 ° C until an optical density of 4-5 units is reached at 540 nm. After incubation for 24-30 hours, the cells are precipitated, washed and used as a biocatalyst.
Полученные клетки хранят и используют в виде водной суспензии, полученной путем отделения клеток от культуральной жидкости центрифугированием при 5-16 тыс. об/мин и последующим суспендированием в 10 мМ фосфатном буфере pH 7,0-8,0 до концентрации 20-40 г сухого веса/л.The obtained cells are stored and used in the form of an aqueous suspension obtained by separating the cells from the culture fluid by centrifugation at 5-16 thousand rpm and subsequent suspension in 10 mm phosphate buffer pH 7.0-8.0 to a concentration of 20-40 g dry weight / l
Ацилирующую активность штаммов определяют по скорости синтеза N-изопропилакриламида по следующей методике:The acylating activity of the strains is determined by the rate of synthesis of N-isopropylacrylamide according to the following procedure:
Смешивают 300 мкл 10% водного раствора акриламида, 250 мкл 10% водного раствора изопропиламина (pH 10), 450 мкл культуры. Инкубируют при 37°C 2 часа, отделяют клетки центрифугированием в течение 1 минуты при 10 тыс. об/мин, определяют содержание N-изопропилакриламида с помощью газовой хроматографии.Mix 300 μl of a 10% aqueous solution of acrylamide, 250 μl of a 10% aqueous solution of isopropylamine (pH 10), 450 μl of culture. Incubated at 37 ° C for 2 hours, cells are separated by centrifugation for 1 minute at 10 thousand rpm, the content of N-isopropylacrylamide is determined by gas chromatography.
Активность культуры выражают в мМ ИПАА, синтезированного за 1 час на л культуры.Culture activity is expressed in mm IPAA synthesized in 1 hour per liter of culture.
Отличительная особенность заявляемых штаммов состоит в их способности синтезировать фермент ациламидазу конститутивно, т.е. в отсутствие в среде известных индукторов, таких как ацетанилид (табл.1). При этом рекомбинатные штаммы Rhodococcus erythropolis проявляют более высокую активность, чем штаммы-реципиенты Rhodococcus erythropolis, не содержащие фрагмент ДНК DAA37, кодирующий синтез ациламидазы, в составе рекомбинантной плазмиды р16-Ami.A distinctive feature of the claimed strains is their ability to synthesize the enzyme acylamidase constitutively, i.e. in the absence of known inducers in the medium, such as acetanilide (Table 1). Moreover, the recombinant strains of Rhodococcus erythropolis exhibit higher activity than the recipient strains of Rhodococcus erythropolis that do not contain the DAA37 DNA fragment encoding acylamidase synthesis in the recombinant plasmid p16-Ami.
Ac-1793 **Rhodococcus erythropolis 37 VKPM
Ac-1793 **
* выращен как в примере 4;* grown as in example 4;
**выращен на средах следующего состава (мас.%):** grown on media of the following composition (wt.%):
среда с индуктором: ацетанилид-4, NH4NO3 - 2, K2HPO4*3H2O - 7, KH2PO4 - 3, MgSO4 - 0.5, FeSO4 - 0.005, вода деионизированная - остальное;medium with inducer: acetanilide-4, NH 4 NO 3 - 2, K 2 HPO 4 * 3H 2 O - 7, KH 2 PO 4 - 3, MgSO 4 - 0.5, FeSO 4 - 0.005, deionized water - the rest;
среда без индуктора: сахароза - 4, NH4NO3 - 2, K2HPO4*3H2O - 7, KH2PO4 - 3, MgSO4 - 0.5, FeSO4 - 0.005, вода деионизированная - остальное.medium without inducer: sucrose - 4, NH 4 NO 3 - 2, K 2 HPO 4 * 3H 2 O - 7, KH 2 PO 4 - 3, MgSO 4 - 0.5, FeSO 4 - 0.005, deionized water - the rest.
Способ синтеза N-замещенных акриламидов в общем видеThe method of synthesis of N-substituted acrylamides in General
Синтез N-замещенных акриламидов, в частности N-изопропилакриламида или N-диметиламинопропилакриламида, осуществляют смешиванием водных растворов акриламида и алифатических первичных аминов, в частности изопропиламина и диметиламинопропиламина, в концентрациях от 1% до 10% с суспензией биокатализатора (от 1 до 10 г клеток по сухой массе на 1 л реакционной смеси) в термостатируемом сосуде (при температуре от 20 до 40°C, предпочтительнее от 25 до 30°C) и последующим перемешиванием (от 100 до 250 об/мин) в течение 1-48 ч. Значение pH варьирует от 8,5 до 11, предпочтительнее от 9 до 11.The synthesis of N-substituted acrylamides, in particular N-isopropylacrylamide or N-dimethylaminopropylacrylamide, is carried out by mixing aqueous solutions of acrylamide and aliphatic primary amines, in particular isopropylamine and dimethylaminopropylamine, in concentrations from 1% to 10% with a suspension of biocatalyst (g from 1 to 10% by dry weight per 1 liter of the reaction mixture) in a thermostatic vessel (at a temperature of 20 to 40 ° C, preferably 25 to 30 ° C) and subsequent stirring (100 to 250 rpm) for 1-48 hours. pH varies from 8.5 to 11, preferably more precisely from 9 to 11.
Содержание конечного продукта - N-замещенного акриламида определяют с помощью газовой хроматографииThe content of the final product, N-substituted acrylamide, is determined by gas chromatography.
Заявляемый способ позволяет получать растворы, содержащие от 1 до 20 г/л N-замещенных акриламидов.The inventive method allows to obtain solutions containing from 1 to 20 g / l of N-substituted acrylamides.
Изобретение поясняется следующими примерами.The invention is illustrated by the following examples.
Пример 1. Конструирование рекомбинантной плазмиды p16-Ami.Example 1. Construction of a recombinant plasmid p16-Ami.
Рекомбинантная плазмида p16-Ami является производной плазмиды pN30, содержащей репликон для автономной репликации в родококках (Рябченко Л.Е., Новиков А.Д., Голышин П.Н., Яненко А.С. Определение нуклеотидной последовательности и структурный анализ криптической плазмиды pN30 из нефтеокисляющего штамма Rhodococcus erythropolis. Генетика, 2005, том 41, N12, стр.1725-1727), и плазмиды pBlueScript, содержащей репликон для автономной репликации в Е. coli (М.А. Alting-Mees, J.A. Sorge, J.M. Short. pBluescriptll: Multifunctional cloning and mapping vectors. Methods in Enzymology, Volume 216, 1992, Pages 483-495). Плазмида pl6-Ami также содержит ген ациламидазы из Rhodococcus erythropolis 37 ВКПМ Ас-1793 и регуляторную область гена нитрилгидратазы из штамма Rhodococcus rhodochrous М8 (Вейко В., Яненко А., Алексеева М., Синтин А., Гулько Л., Ратманова К., Овчарова И., Андреева Л., Астаурова О., Полякова И., Пауков В., Воронин С, Дебабов В. Клонирование и определение нуклеотидной последовательности гена нитрилгидратазы из Rhodococcus rhodochrous М8. // Биотехнология. 1995. №5-6. С.3-5). Фрагменты ДНК, содержащие ген ациламидазы и регуляторную область получают с помощью ПЦР-амплификации. Для получения гена ациламидазы в качестве матрицы используется ДНК плазмиды pET16b-ami, в которой этот ген клонирован без флангов (RU 2439154), а в качестве праймеров - олигонуклеотиды, гомологичные концам гена ациламидазы с добавлением сайтов эндунуклеаз NcoI и EcoRI. Для получения фрагмента ДНК, содержащего регуляторную область гена нитрилгидратазы в качестве матрицы используют хромосому штамма М8, а в качестве праймеров - олигонуклеотиды, гомологичные концам регуляторной области гена нитрилгидратазы с добавлением сайтов эндунуклеаз PstI и Ncol.Recombinant plasmid p16-Ami is a derivative of plasmid pN30 containing a replicon for autonomous replication in Rhodococcus (Ryabchenko L.E., Novikov A.D., Golyshin P.N., Yanenko A.S. Determination of the nucleotide sequence and structural analysis of the cryptic plasmid pN30 from the oil oxidizing strain of Rhodococcus erythropolis, Genetics, 2005, Volume 41, N12, pp. 1725-1727), and the plasmid pBlueScript containing replicon for autonomous replication in E. coli (M.A. Alting-Mees, JA Sorge, JM Short. pBluescriptll: Multifunctional cloning and mapping vectors. Methods in Enzymology, Volume 216, 1992, Pages 483-495). Plasmid pl6-Ami also contains the acylamidase gene from Rhodococcus erythropolis 37 VKPM Ac-1793 and the regulatory region of the nitrile hydratase gene from the strain Rhodococcus rhodochrous M8 (Veiko V., Yanenko A., Alekseeva M., Sintin A., Gulko L., Ratmanova K. , Ovcharova I., Andreeva L., Astaurova O., Polyakova I., Spiders V., Voronin S, Debabov V. Cloning and determination of the nucleotide sequence of the nitrile hydratase gene from Rhodococcus rhodochrous M8. // Biotechnology. 1995. No. 5-6. S.3-5). DNA fragments containing the acylamidase gene and regulatory region are obtained by PCR amplification. To obtain the acylamidase gene, the DNA of the pET16b-ami plasmid is used as a matrix, in which this gene is cloned without flanks (RU 2439154), and oligonucleotides homologous to the ends of the acylamidase gene with the addition of NcoI and EcoRI endunuclease sites are used as primers. To obtain a DNA fragment containing the regulatory region of the nitrile hydratase gene, the chromosome of strain M8 is used as a matrix, and oligonucleotides homologous to the ends of the regulatory region of the nitrile hydratase gene with the addition of PstI and Ncol endunuclease sites are used as primers.
Амплифицированные таким образом фрагменты ДНК вставляют в плазмиду pRY16 по сайтам PstI и EcoRI (фиг.1) и используют ее для трансформации реципиентного штамма Е. coli XL1 Blue. Полученные трансформанты устойчивы к ампициллину 100 мкг/мл, содержат плазмиду p16-Ami, включающую ген ациламидазы и регуляторную область нитрилгидратазы из Rhodococcus rhodochrous М8.The DNA fragments thus amplified are inserted into the pRY16 plasmid at the PstI and EcoRI sites (FIG. 1) and used to transform the E. coli XL1 Blue recipient strain. The obtained transformants are resistant to ampicillin 100 μg / ml, contain the plasmid p16-Ami, including the acylamidase gene and the regulatory region of nitrile hydratase from Rhodococcus rhodochrous M8.
Пример 2. Конструирование заявляемого штамма Rhodococcus erythropolis 37 p16-Ami ВКПМ Ас-1937Example 2. Construction of the claimed strain of Rhodococcus erythropolis 37 p16-Ami VKPM Ac-1937
Плазмиду p16-Ami, полученную как в примере 1, вводят в штамм Rhodococcus erythropolis 37 с помощью электротрансформации. Трансформанты, отобранные на среде ЛБ с апрамицином (100 мкг/мл) после инкубации чашек в течение 48 ч при 30°C, являются штаммом Rhodococcus erythropolis 37, содержащим плазмиду р16-Ami. Такой штамм депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) как Rhodococcus erythropolis ВКПМ Ас-1937.The plasmid p16-Ami, obtained as in example 1, was introduced into the strain Rhodococcus erythropolis 37 using electrotransformation. Transformants selected on LB medium with apramycin (100 μg / ml) after incubation of the plates for 48 h at 30 ° C are a strain of Rhodococcus erythropolis 37 containing the plasmid p16-Ami. Such a strain was deposited in the All-Russian Collection of Industrial Microorganisms (VKPM) as Rhodococcus erythropolis VKPM Ac-1937.
Пример 3. Конструирование заявляемого штамма Rhodococcus erythropolis ВКПМ НХ7 p16-Ami Ас-1938Example 3. Construction of the claimed strain of Rhodococcus erythropolis VKPM HX7 p16-Ami Ac-1938
Плазмиду p16-Ami, полученную как в примере 1, вводят в штамм Rhodococcus erythropolis НХ7 с помощью электротрансформации. Трансформанты, отобранные на среде ЛБ с апрамицином (100 мкг/мл) после инкубации чашек в течение 48 ч при 30°C, являются штаммом Rhodococcus erythropolis НХ7, содержащим плазмиду p16-Ami. Такой штамм депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) как Rhodococcus erythropolis ВКПМ Ас-1938.Plasmid p16-Ami, obtained as in example 1, was introduced into the strain Rhodococcus erythropolis HX7 using electro-transformation. Transformants selected on LB medium with apramycin (100 μg / ml) after incubation of the plates for 48 h at 30 ° C are a strain of Rhodococcus erythropolis HX7 containing the plasmid p16-Ami. Such a strain was deposited in the All-Russian Collection of Industrial Microorganisms (VKPM) as Rhodococcus erythropolis VKPM Ac-1938.
Пример 4. Получение биокатализатора на основе заявляемого штамма Rhodococcus erythropolis pl6-Ami ВКПМ Ас-1937Example 4. Obtaining a biocatalyst based on the inventive strain Rhodococcus erythropolis pl6-Ami VKPM Ac-1937
В колбу Эрленмейера (объемом 750 мл), содержащую 100 мл среды ЛБ, содержащей апрамицин в концентрации 100 мкг/мл, добавляют 1 мл культуры (109кл/мл) штамма Rhodococcus erythropolis 37 p16-Ami ВКПМ Ас-1937, предварительно выращенного на той же среде в течение 16 ч при 30°C с перемешиванием (300 об/мин). Затем колбу инкубируют с перемешиванием (300 об/мин) в течение 36 ч при 30°C. Полученная таким образом культура заявляемого штамма Rhodococcus erythropolis 37 p16-Ami ВКПМ Ас-1937 обладает ацилирующей активностью 5 мМ ИПАА/мл*ч. Биомассу клеток отделяют центрифугированием при 5 тыс. об/мин и хранят при +4°C.In an Erlenmeyer flask (750 ml) containing 100 ml of LB medium containing apramycin at a concentration of 100 μg / ml, add 1 ml of culture (109cl / ml) of the strain Rhodococcus erythropolis 37 p16-Ami VKPM Ac-1937, previously grown on the same medium for 16 hours at 30 ° C with stirring (300 rpm). The flask was then incubated with stirring (300 rpm) for 36 hours at 30 ° C. Thus obtained culture of the inventive strain Rhodococcus erythropolis 37 p16-Ami VKPM Ac-1937 has an acylating activity of 5 mm IPAA / ml * h. Cell biomass is separated by centrifugation at 5 thousand rpm and stored at + 4 ° C.
Пример 5. Получение биокатализатора на основе заявляемого штамма Rhodococcus erythropolis НХ7 p16-Ami ВКПМ Ас-1938Example 5. Obtaining a biocatalyst based on the inventive strain Rhodococcus erythropolis HX7 p16-Ami VKPM Ac-1938
В колбу Эрленмейера (объемом 750 мл), содержащую 100 мл среды ЛБ, содержащей апрамицин в концентрации 100 мкг/мл, добавляют 1 мл культуры (109 кл./мл) штамма Rhodococcus erythropolis НХ7 p16-Ami ВКПМ Ас-1938, предварительно выращенного на той же среде в течение 16 ч при 30°C с перемешиванием (300 об/мин). Затем колбу инкубируют с перемешиванием (300 об/мин) в течение 36 ч при 30°C. Полученная таким образом культура заявляемого штамма Rhodococcus erythropolis НХ7 p16-Ami ВКПМ Ас-1938 обладает ацилирующей активностью 5 мМ ИПАА/мл*ч. Биомассу клеток отделяют центрифугированием при 5 тыс. об/мин и хранят при +4°C.In an Erlenmeyer flask (750 ml) containing 100 ml of LB medium containing apramycin at a concentration of 100 μg / ml, 1 ml of culture (109 cells / ml) of Rhodococcus erythropolis strain HX7 p16-Ami VKPM Ac-1938, previously grown on the same medium for 16 hours at 30 ° C with stirring (300 rpm). The flask was then incubated with stirring (300 rpm) for 36 hours at 30 ° C. Thus obtained culture of the inventive strain Rhodococcus erythropolis HX7 p16-Ami VKPM Ac-1938 has an acylating activity of 5 mm IPAA / ml * h. Cell biomass is separated by centrifugation at 5 thousand rpm and stored at + 4 ° C.
Пример 6. Синтез N-изопропилакриламида с использованием биокатализатора на основе заявляемого штамма Rhodococcus erythropolis 37 p16-Ami ВКПМ Ас-1937Example 6. Synthesis of N-isopropylacrylamide using a biocatalyst based on the inventive strain Rhodococcus erythropolis 37 p16-Ami VKPM Ac-1937
Водные растворы акриламида и изопропиламина (pH 10) смешивают, затем к реакционной смеси добавляют суспензию клеток штамма Rhodococcus erythropolis 37 p16-Ami ВКПМ Ас-1937, полученную как в примере 4. Концентрации акриламида и изопропиламина в смеси составляют 6% и 3% соответственно. Концентрация биокатализатора в смеси составляет 8 г сухого веса/л. Реакционную смесь инкубируют при 37°C в течение 7 часов. Затем клетки отделяют центрифугированием (5 тыс. об/мин). Концентрацию N-изопропилакриламида в реакционной смеси определяют с помощью газовой хроматографии. Концентрация N-изопропилакриламида в полученном образце составляет 10 г/л.Aqueous solutions of acrylamide and isopropylamine (pH 10) are mixed, then a suspension of Rhodococcus erythropolis 37 p16-Ami VKPM Ac-1937 strain obtained in Example 4 is added to the reaction mixture. The concentrations of acrylamide and isopropylamine in the mixture are 6% and 3%, respectively. The concentration of the biocatalyst in the mixture is 8 g dry weight / L. The reaction mixture was incubated at 37 ° C for 7 hours. Then the cells are separated by centrifugation (5 thousand rpm). The concentration of N-isopropylacrylamide in the reaction mixture was determined by gas chromatography. The concentration of N-isopropylacrylamide in the resulting sample is 10 g / L.
Пример 7. Синтез N-изопропилакриламида с использованием биокатализатора на основе заявляемого штамма Rhodococcus erythropolis НХ7 p16-Ami ВКПМ Ас-1938Example 7. Synthesis of N-isopropylacrylamide using a biocatalyst based on the inventive strain Rhodococcus erythropolis HX7 p16-Ami VKPM Ac-1938
Синтез осуществляют как в примере 7, но в качестве катализатора используют суспензию клеток штамма Rhodococcus erythropolis НХ7 p16-Ami ВКПМ Ас-1938, полученную как в примере 5. Концентрация полученного раствора N-изопропилакриламида составляет 10 г/л.The synthesis is carried out as in example 7, but as a catalyst, a suspension of cells of the strain Rhodococcus erythropolis HX7 p16-Ami VKPM Ac-1938, obtained as in example 5, is used. The concentration of the resulting solution of N-isopropylacrylamide is 10 g / L.
Пример 8. Синтез N-диметиламинопропилакриламида с использованием биокатализатора на основе заявляемого штамма Rhodococcus erythropolis 37 pl6-Ami ВКПМ Ас-1937Example 8. Synthesis of N-dimethylaminopropylacrylamide using a biocatalyst based on the inventive strain Rhodococcus erythropolis 37 pl6-Ami VKPM Ac-1937
Водные растворы акриламида и диметиламинопропиламина (pH 10) смешивают, затем к реакционной смеси в качестве биокатализатора добавляют суспензию клеток штамма Rhodococcus erythropolis 37 p16-Ami ВКПМ Ас-1937, полученную как в примере 4. Концентрации акриламида и диметиламинопропиламина в смеси составляют 6% и 2.5% соответственно. Концентрация клеток в смеси составляет 8 г сухого веса/л. Реакционную смесь инкубируют при 37°C в течение 24 часов. Затем клетки отделяют центрифугированием (5 тыс. об/мин) и количество конечного продукта определяют методом газовой хроматографии. Концентрация полученного раствора N-диметиламинопропилакриламида составляет 2 г/л.Aqueous solutions of acrylamide and dimethylaminopropylamine (pH 10) are mixed, then a suspension of Rhodococcus erythropolis 37 p16-Ami VKPM Ac-1937 strain obtained as in Example 4 is added to the reaction mixture as a biocatalyst. The concentration of acrylamide and dimethylaminopropylamine in the mixture is 6% and 2.5 % respectively. The concentration of cells in the mixture is 8 g dry weight / L. The reaction mixture was incubated at 37 ° C for 24 hours. Then the cells are separated by centrifugation (5 thousand rpm) and the amount of the final product is determined by gas chromatography. The concentration of the resulting solution of N-dimethylaminopropylacrylamide is 2 g / L.
Пример 9. Синтез N-диметиламинопропилакриламида с использованием биокатализатора на основе заявляемого штамма Rhodococcus erythropolis НХ7 p16-Ami ВКПМ Ас-1938Example 9. Synthesis of N-dimethylaminopropylacrylamide using a biocatalyst based on the inventive strain Rhodococcus erythropolis HX7 p16-Ami VKPM Ac-1938
Синтез осуществляют как в примере 9, но в качестве биокатализатора используют суспензию клеток штамма Rhodococcus erythropolis НХ7 p16-Ami ВКПМ Ас-1938, полученную как в примере 5. Концентрация полученного раствора N-диметиламинопропилакриламида составляет 2 г/л.The synthesis is carried out as in example 9, but as a biocatalyst, a suspension of cells of the strain Rhodococcus erythropolis HX7 p16-Ami VKPM Ac-1938, obtained as in example 5, is used. The concentration of the resulting solution of N-dimethylaminopropylacrylamide is 2 g / l.
Таким образом, заявляемый способ синтеза N-замещенных акриламидов дешевле и эффективнее способа - ближайшего аналога, так как основан на использовании в качестве биокатализатора рекомбинантных штаммов бактерий Rhodococcus erythropolis ВКПМ Ас-1937 или Rhodococcus erythropolis ВКПМ Ас-1938, которые обладают конститутивной ацилирующей активностью в 2,5 раза превосходящей уровень активности исходного штамма (который является штаммом - ближайшим аналогом) и не требуют при выращивании наличия в среде дорогостоящего индуктора - ацетанилида.Thus, the claimed method for the synthesis of N-substituted acrylamides is cheaper and more efficient than the closest analogue, as it is based on the use of recombinant bacterial strains of Rhodococcus erythropolis VKPM Ac-1937 or Rhodococcus erythropolis VKPM Ac-1938, which have constitutive acylating activity in 2, as a biocatalyst , 5 times higher than the activity level of the initial strain (which is the closest analogue strain) and does not require the presence of an expensive inducer, acetanilide, in the medium when grown.
Claims (3)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2012143354/10A RU2522804C2 (en) | 2012-10-10 | 2012-10-10 | METHOD OF SYNTHESIS OF N-SUBSTITUTED ACRYLAMIDES AND RECOMBINANT STRAIN Rhodococcus erythropolis FOR ITS IMPLEMENTATION (VERSIONS) |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2012143354/10A RU2522804C2 (en) | 2012-10-10 | 2012-10-10 | METHOD OF SYNTHESIS OF N-SUBSTITUTED ACRYLAMIDES AND RECOMBINANT STRAIN Rhodococcus erythropolis FOR ITS IMPLEMENTATION (VERSIONS) |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2012143354A RU2012143354A (en) | 2014-04-20 |
| RU2522804C2 true RU2522804C2 (en) | 2014-07-20 |
Family
ID=50480468
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2012143354/10A RU2522804C2 (en) | 2012-10-10 | 2012-10-10 | METHOD OF SYNTHESIS OF N-SUBSTITUTED ACRYLAMIDES AND RECOMBINANT STRAIN Rhodococcus erythropolis FOR ITS IMPLEMENTATION (VERSIONS) |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2522804C2 (en) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2824559C2 (en) * | 2022-12-22 | 2024-08-12 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный исследовательский центр "Курчатовский институт" | Method of producing mixed solution of acrylic monomers and bacterial strain for implementation thereof |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2399672C1 (en) * | 2009-04-29 | 2010-09-20 | Федеральное государственное унитарное предприятие "Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов" (ФГУП ГосНИИгенетика) | Biocatalytic method of n-substituted aliphatic acrylamide synthesis and rhodococcus erythropolis bacteria strain for implementation thereof |
| RU2439154C1 (en) * | 2010-12-03 | 2012-01-10 | Федеральное государственное унитарное предприятие "Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов" (ФГУП "ГосНИИгенетика") | Acylamidase enzyme, dna fragment coding said enzyme, and biocatalytic method for synthesis of n-substituted acrylamides using acylamidase |
-
2012
- 2012-10-10 RU RU2012143354/10A patent/RU2522804C2/en active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2399672C1 (en) * | 2009-04-29 | 2010-09-20 | Федеральное государственное унитарное предприятие "Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов" (ФГУП ГосНИИгенетика) | Biocatalytic method of n-substituted aliphatic acrylamide synthesis and rhodococcus erythropolis bacteria strain for implementation thereof |
| RU2439154C1 (en) * | 2010-12-03 | 2012-01-10 | Федеральное государственное унитарное предприятие "Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов" (ФГУП "ГосНИИгенетика") | Acylamidase enzyme, dna fragment coding said enzyme, and biocatalytic method for synthesis of n-substituted acrylamides using acylamidase |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| . * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2824559C2 (en) * | 2022-12-22 | 2024-08-12 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный исследовательский центр "Курчатовский институт" | Method of producing mixed solution of acrylic monomers and bacterial strain for implementation thereof |
| RU2824556C2 (en) * | 2022-12-27 | 2024-08-12 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный исследовательский центр "Курчатовский институт" | Method of producing mixed solution of acrylic monomers and bacterial strain for implementation thereof |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2012143354A (en) | 2014-04-20 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN104087560B (en) | Bacterial laccase mutant protein, recombinant expression plasmid thereof, transformed engineering strain and fermentation preparation method thereof | |
| KR102126985B1 (en) | Protein synthesis system for kit synthesis in vitro, kit and method for manufacturing the same | |
| CN117660399A (en) | Thermostable DNA polymerase mutants with high amplification activity | |
| CN107257856B (en) | An expression system for psicose epimerase and its use for the production of psicose | |
| CN103626852A (en) | AraC mutant protein and application thereof | |
| CN104371966A (en) | Gene engineering strain capable of synthesizing phloroglucinol from acetic acid and construction method and application thereof | |
| RU2546239C1 (en) | RECOMBINANT STRAIN Escherichia coli, HAVING CONSTITUTIVE ASPARTASE ACTIVITY AND METHOD OF SYNTHESIS OF L-ASPARTIC ACID USING THIS STRAIN AS BIOCATALYST | |
| RU2522804C2 (en) | METHOD OF SYNTHESIS OF N-SUBSTITUTED ACRYLAMIDES AND RECOMBINANT STRAIN Rhodococcus erythropolis FOR ITS IMPLEMENTATION (VERSIONS) | |
| CN105296513B (en) | A kind of ocean esterase and its encoding gene E22 and application | |
| CN117511915A (en) | Method for preparing formamide pyrimidine DNA glycosylase | |
| RU2539033C1 (en) | RECOMBINANT BACTERIUM STRAIN Rhodococcus rhodochrous HAVING CONSTITUTIVE ACYLATING ACTIVITY, AND METHOD OF SYNTHESIS OF N-REPLACED ACRYLAMIDES USING THIS STRAIN AS BIOCATALYST | |
| RU2399672C1 (en) | Biocatalytic method of n-substituted aliphatic acrylamide synthesis and rhodococcus erythropolis bacteria strain for implementation thereof | |
| RU2439154C1 (en) | Acylamidase enzyme, dna fragment coding said enzyme, and biocatalytic method for synthesis of n-substituted acrylamides using acylamidase | |
| WO2018127143A1 (en) | Highly active s-cyanohydrin lyase and application thereof | |
| CA2622710A1 (en) | Hybrid portable origin of replication plasmids | |
| CN108277216A (en) | High activity S- cyanalcohols lyases and its application | |
| RU2824556C2 (en) | Method of producing mixed solution of acrylic monomers and bacterial strain for implementation thereof | |
| JP2023548278A (en) | Genetically modified Methylobacillus bacteria with improved properties | |
| CN116254244B (en) | Glutamine transaminase mutant and its application | |
| CN117402846B (en) | L-alanine dehydrogenase mutant and preparation method and application thereof | |
| WO2025181305A1 (en) | Yeasts for the treatment of saline wastewater comprising formate | |
| CN117402802A (en) | Method and application of high-production ectoine in Bacillus licheniformis by weakening the phosphoenolpyruvate carboxykinase gene | |
| CN107236718B (en) | A low-temperature esterase derived from metagenomic, encoding gene and application thereof | |
| CN118119704A (en) | Systems and methods for transposing cargo nucleotide sequences | |
| CN118109365A (en) | Azo dye degrading bacteria, azoreductase produced by the bacteria and application thereof |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PC43 | Official registration of the transfer of the exclusive right without contract for inventions |
Effective date: 20170327 |
|
| PD4A | Correction of name of patent owner |