RU2599289C2 - Tissue regeneration stimulating agent - Google Patents
Tissue regeneration stimulating agent Download PDFInfo
- Publication number
- RU2599289C2 RU2599289C2 RU2013156908/15A RU2013156908A RU2599289C2 RU 2599289 C2 RU2599289 C2 RU 2599289C2 RU 2013156908/15 A RU2013156908/15 A RU 2013156908/15A RU 2013156908 A RU2013156908 A RU 2013156908A RU 2599289 C2 RU2599289 C2 RU 2599289C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- pharmacological substance
- regeneration
- activator
- stimulating
- cfu
- Prior art date
Links
- 230000017423 tissue regeneration Effects 0.000 title claims abstract description 13
- 239000002269 analeptic agent Substances 0.000 title abstract 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims abstract description 60
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 57
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 claims abstract description 45
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 claims abstract description 44
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 claims abstract description 35
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 claims abstract description 16
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 claims abstract description 16
- 230000031146 intracellular signal transduction Effects 0.000 claims abstract description 8
- 102000005636 Cyclic AMP Response Element-Binding Protein Human genes 0.000 claims abstract description 6
- 108010045171 Cyclic AMP Response Element-Binding Protein Proteins 0.000 claims abstract description 6
- 239000012190 activator Substances 0.000 claims description 52
- 108090000315 Protein Kinase C Proteins 0.000 claims description 22
- 102000003923 Protein Kinase C Human genes 0.000 claims description 22
- 108091007960 PI3Ks Proteins 0.000 claims description 19
- 108090000430 Phosphatidylinositol 3-kinases Proteins 0.000 claims description 19
- 102000003993 Phosphatidylinositol 3-kinases Human genes 0.000 claims description 19
- 108091054455 MAP kinase family Proteins 0.000 claims description 15
- 102000043136 MAP kinase family Human genes 0.000 claims description 15
- 108091008611 Protein Kinase B Proteins 0.000 claims description 11
- 102000005765 Proto-Oncogene Proteins c-akt Human genes 0.000 claims description 11
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 claims description 11
- 239000000824 cytostatic agent Substances 0.000 claims description 10
- 230000001085 cytostatic effect Effects 0.000 claims description 10
- 229940122658 Adenylate cyclase inhibitor Drugs 0.000 claims description 9
- 229930013930 alkaloid Natural products 0.000 claims description 8
- 150000003797 alkaloid derivatives Chemical class 0.000 claims description 8
- XUHJBXVYNBQQBD-UHFFFAOYSA-N mesaconitine Natural products COC1CC(O)C2(COC)CN(C)C3C(C(C45)(OC(C)=O)C(O)C6OC)C(OC)C2C31C4CC6(O)C5OC(=O)C1=CC=CC=C1 XUHJBXVYNBQQBD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 206010016654 Fibrosis Diseases 0.000 claims description 7
- 208000019425 cirrhosis of liver Diseases 0.000 claims description 7
- 230000003394 haemopoietic effect Effects 0.000 claims description 7
- 206010065553 Bone marrow failure Diseases 0.000 claims description 6
- DPMGVDIWDTYPMP-UHFFFAOYSA-N Hypaconitine Natural products COCC12CCC(OC)C3(CN(C)C1)C4CC5(O)C(OC)C(O)C(CC(OC)C23)(OC(=O)C)C4C5OC(=O)c6ccccc6 DPMGVDIWDTYPMP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 208000032382 Ischaemic stroke Diseases 0.000 claims description 6
- AZAZKLKDEOMJBJ-UHFFFAOYSA-N Napellin-N-oxid Natural products C=C1C(O)C23CC1C(O)CC2C12C(O)CCC4(C)CN(CC)C2C3CC41 AZAZKLKDEOMJBJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 230000007882 cirrhosis Effects 0.000 claims description 6
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 claims description 6
- FFHPXOJTVQDVMO-DSYKOEDSSA-N (2r,3s,5r)-5-(6-aminopurin-9-yl)-2-methyloxolan-3-ol Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](C)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 FFHPXOJTVQDVMO-DSYKOEDSSA-N 0.000 claims description 5
- 208000014644 Brain disease Diseases 0.000 claims description 4
- 208000032274 Encephalopathy Diseases 0.000 claims description 4
- 102000003945 NF-kappa B Human genes 0.000 claims description 3
- 230000002124 endocrine Effects 0.000 claims description 3
- PHEDXBVPIONUQT-RGYGYFBISA-N phorbol 13-acetate 12-myristate Chemical compound C([C@]1(O)C(=O)C(C)=C[C@H]1[C@@]1(O)[C@H](C)[C@H]2OC(=O)CCCCCCCCCCCCC)C(CO)=C[C@H]1[C@H]1[C@]2(OC(C)=O)C1(C)C PHEDXBVPIONUQT-RGYGYFBISA-N 0.000 claims description 3
- PHEDXBVPIONUQT-UHFFFAOYSA-N Cocarcinogen A1 Natural products CCCCCCCCCCCCCC(=O)OC1C(C)C2(O)C3C=C(C)C(=O)C3(O)CC(CO)=CC2C2C1(OC(C)=O)C2(C)C PHEDXBVPIONUQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 102000015617 Janus Kinases Human genes 0.000 claims description 2
- 108010024121 Janus Kinases Proteins 0.000 claims description 2
- 108010057466 NF-kappa B Proteins 0.000 claims description 2
- -1 p-bromocinnamyl-amino Chemical group 0.000 claims description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 2
- FDDDEECHVMSUSB-UHFFFAOYSA-N sulfanilamide Chemical compound NC1=CC=C(S(N)(=O)=O)C=C1 FDDDEECHVMSUSB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 229940124530 sulfonamide Drugs 0.000 claims description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 claims description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 claims description 2
- 210000005013 brain tissue Anatomy 0.000 claims 2
- 231100000444 skin lesion Toxicity 0.000 claims 2
- 206010040882 skin lesion Diseases 0.000 claims 2
- 108010014632 NF-kappa B kinase Proteins 0.000 claims 1
- 210000004907 gland Anatomy 0.000 claims 1
- 229940043355 kinase inhibitor Drugs 0.000 claims 1
- 239000003909 protein kinase inhibitor Substances 0.000 claims 1
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 abstract description 31
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 abstract description 26
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 21
- 230000011664 signaling Effects 0.000 abstract description 20
- 230000006870 function Effects 0.000 abstract description 11
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 abstract description 11
- 230000009471 action Effects 0.000 abstract description 8
- 208000037273 Pathologic Processes Diseases 0.000 abstract description 3
- 230000004913 activation Effects 0.000 abstract description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 abstract description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 abstract description 3
- 230000009054 pathological process Effects 0.000 abstract description 3
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 abstract 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 31
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 28
- 206010052428 Wound Diseases 0.000 description 27
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 27
- 210000004271 bone marrow stromal cell Anatomy 0.000 description 24
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 21
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 17
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 16
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 15
- 238000000034 method Methods 0.000 description 14
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 14
- 238000011749 CBA mouse Methods 0.000 description 13
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 13
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 12
- 230000011514 reflex Effects 0.000 description 12
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 12
- 210000002798 bone marrow cell Anatomy 0.000 description 11
- 210000003013 erythroid precursor cell Anatomy 0.000 description 11
- 229940043437 protein kinase A inhibitor Drugs 0.000 description 11
- 238000011160 research Methods 0.000 description 11
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 11
- 102000008130 Cyclic AMP-Dependent Protein Kinases Human genes 0.000 description 10
- 108010049894 Cyclic AMP-Dependent Protein Kinases Proteins 0.000 description 10
- GHASVSINZRGABV-UHFFFAOYSA-N Fluorouracil Chemical compound FC1=CNC(=O)NC1=O GHASVSINZRGABV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 10
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 10
- 239000012656 protein kinase A inhibitor Substances 0.000 description 10
- 108010065251 protein kinase modulator Proteins 0.000 description 10
- 230000018199 S phase Effects 0.000 description 9
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 9
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 9
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 9
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 8
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 8
- 210000002901 mesenchymal stem cell Anatomy 0.000 description 8
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 8
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 8
- 208000007241 Experimental Diabetes Mellitus Diseases 0.000 description 7
- 238000011161 development Methods 0.000 description 7
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 7
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 7
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 7
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 6
- 206010030113 Oedema Diseases 0.000 description 6
- 238000000692 Student's t-test Methods 0.000 description 6
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 6
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 6
- 229960002949 fluorouracil Drugs 0.000 description 6
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 6
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 6
- 230000035876 healing Effects 0.000 description 6
- 238000010562 histological examination Methods 0.000 description 6
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 6
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 6
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 6
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 206010021143 Hypoxia Diseases 0.000 description 5
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 5
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- 210000004207 dermis Anatomy 0.000 description 5
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 5
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 5
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 5
- 210000000440 neutrophil Anatomy 0.000 description 5
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 5
- 230000008569 process Effects 0.000 description 5
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 5
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 4
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 4
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N Haematoxylin Chemical compound C12=CC(O)=C(O)C=C2CC2(O)C1C1=CC=C(O)C(O)=C1OC2 WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000012828 PI3K inhibitor Substances 0.000 description 4
- HIMXGTXNXJYFGB-UHFFFAOYSA-N alloxan Chemical compound O=C1NC(=O)C(=O)C(=O)N1 HIMXGTXNXJYFGB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 230000034994 death Effects 0.000 description 4
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 4
- 238000005755 formation reaction Methods 0.000 description 4
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 4
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 4
- 238000007474 nonparametric Mann- Whitney U test Methods 0.000 description 4
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 4
- 229940043441 phosphoinositide 3-kinase inhibitor Drugs 0.000 description 4
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 4
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 4
- 230000008054 signal transmission Effects 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- 206010000349 Acanthosis Diseases 0.000 description 3
- 206010063560 Excessive granulation tissue Diseases 0.000 description 3
- 206010067125 Liver injury Diseases 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 230000036770 blood supply Effects 0.000 description 3
- 210000001715 carotid artery Anatomy 0.000 description 3
- 230000001966 cerebroprotective effect Effects 0.000 description 3
- 210000002808 connective tissue Anatomy 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 230000003179 granulation Effects 0.000 description 3
- 238000005469 granulation Methods 0.000 description 3
- 210000001126 granulation tissue Anatomy 0.000 description 3
- 210000003714 granulocyte Anatomy 0.000 description 3
- 230000011132 hemopoiesis Effects 0.000 description 3
- 231100000234 hepatic damage Toxicity 0.000 description 3
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 description 3
- 230000001146 hypoxic effect Effects 0.000 description 3
- 210000004153 islets of langerhan Anatomy 0.000 description 3
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 3
- 230000008818 liver damage Effects 0.000 description 3
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 230000003448 neutrophilic effect Effects 0.000 description 3
- 239000002547 new drug Substances 0.000 description 3
- HYIMSNHJOBLJNT-UHFFFAOYSA-N nifedipine Chemical compound COC(=O)C1=C(C)NC(C)=C(C(=O)OC)C1C1=CC=CC=C1[N+]([O-])=O HYIMSNHJOBLJNT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000010606 normalization Methods 0.000 description 3
- 210000001995 reticulocyte Anatomy 0.000 description 3
- FAWLNURBQMTKEB-URDPEVQOSA-N 213546-53-3 Chemical compound N([C@@H](C)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(O)=O)C(C)C)C(C)C)C(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)N)C(C)C FAWLNURBQMTKEB-URDPEVQOSA-N 0.000 description 2
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 2
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 2
- 206010002091 Anaesthesia Diseases 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010020565 Hyperaemia Diseases 0.000 description 2
- 238000000585 Mann–Whitney U test Methods 0.000 description 2
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 2
- 241000772415 Neovison vison Species 0.000 description 2
- 206010057249 Phagocytosis Diseases 0.000 description 2
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 2
- 206010039509 Scab Diseases 0.000 description 2
- 206010072170 Skin wound Diseases 0.000 description 2
- 230000001133 acceleration Effects 0.000 description 2
- 108060000200 adenylate cyclase Proteins 0.000 description 2
- 102000030621 adenylate cyclase Human genes 0.000 description 2
- 230000037005 anaesthesia Effects 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 244000309464 bull Species 0.000 description 2
- 230000003915 cell function Effects 0.000 description 2
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 230000001143 conditioned effect Effects 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 2
- 230000007850 degeneration Effects 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N eosin Chemical compound [Na+].OC(=O)C1=CC=CC=C1C1=C2C=C(Br)C(=O)C(Br)=C2OC2=C(Br)C(O)=C(Br)C=C21 YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 2
- 230000005714 functional activity Effects 0.000 description 2
- 210000003780 hair follicle Anatomy 0.000 description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 description 2
- 230000002440 hepatic effect Effects 0.000 description 2
- FIDOCHXHMJHKRW-GKVQVCCJSA-N hypaconitine Chemical compound O([C@H]1[C@]2(O)C[C@H]3[C@]45[C@@H](OC)CC[C@@]6([C@H]4[C@@H](OC)[C@H]([C@@](OC(C)=O)([C@H]31)[C@@H](O)[C@H]2OC)[C@H]5N(C)C6)COC)C(=O)C1=CC=CC=C1 FIDOCHXHMJHKRW-GKVQVCCJSA-N 0.000 description 2
- 230000007954 hypoxia Effects 0.000 description 2
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 2
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 2
- 231100000682 maximum tolerated dose Toxicity 0.000 description 2
- 239000003607 modifier Substances 0.000 description 2
- 230000037023 motor activity Effects 0.000 description 2
- 230000017128 negative regulation of NF-kappaB transcription factor activity Effects 0.000 description 2
- 210000001178 neural stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000008782 phagocytosis Effects 0.000 description 2
- 239000002644 phorbol ester Substances 0.000 description 2
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- ZRRGOUHITGRLBA-UHFFFAOYSA-N stattic Chemical compound [O-][N+](=O)C1=CC=C2C=CS(=O)(=O)C2=C1 ZRRGOUHITGRLBA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000000106 sweat gland Anatomy 0.000 description 2
- 210000003934 vacuole Anatomy 0.000 description 2
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 1
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 1
- 102100036475 Alanine aminotransferase 1 Human genes 0.000 description 1
- 108010082126 Alanine transaminase Proteins 0.000 description 1
- 108010003415 Aspartate Aminotransferases Proteins 0.000 description 1
- 102000004625 Aspartate Aminotransferases Human genes 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000009123 Fibrin Human genes 0.000 description 1
- 108010073385 Fibrin Proteins 0.000 description 1
- BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N Fibrin monomer Chemical compound CNC(=O)CNC(=O)CN BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000032843 Hemorrhage Diseases 0.000 description 1
- 206010020649 Hyperkeratosis Diseases 0.000 description 1
- 238000012404 In vitro experiment Methods 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 1
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 1
- 229940122245 Janus kinase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 102000019149 MAP kinase activity proteins Human genes 0.000 description 1
- 108040008097 MAP kinase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 229940126560 MAPK inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 210000002565 arteriole Anatomy 0.000 description 1
- 229940009098 aspartate Drugs 0.000 description 1
- 229940009100 aurothiomalate Drugs 0.000 description 1
- XJHSMFDIQHVMCY-UHFFFAOYSA-M aurothiomalic acid Chemical compound OC(=O)CC(S[Au])C(O)=O XJHSMFDIQHVMCY-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 1
- 210000000013 bile duct Anatomy 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 230000008499 blood brain barrier function Effects 0.000 description 1
- 238000004820 blood count Methods 0.000 description 1
- 210000001218 blood-brain barrier Anatomy 0.000 description 1
- 210000004958 brain cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000011496 cAMP-mediated signaling Effects 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 208000035269 cancer or benign tumor Diseases 0.000 description 1
- 230000022131 cell cycle Effects 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000009087 cell motility Effects 0.000 description 1
- 238000002659 cell therapy Methods 0.000 description 1
- 210000004720 cerebrum Anatomy 0.000 description 1
- 210000003459 common hepatic duct Anatomy 0.000 description 1
- 230000001447 compensatory effect Effects 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 210000004292 cytoskeleton Anatomy 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 210000002615 epidermis Anatomy 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000005081 epithelial layer Anatomy 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000000267 erythroid cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000000925 erythroid effect Effects 0.000 description 1
- 230000010437 erythropoiesis Effects 0.000 description 1
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 description 1
- 239000004744 fabric Substances 0.000 description 1
- 210000001105 femoral artery Anatomy 0.000 description 1
- 229950003499 fibrin Drugs 0.000 description 1
- 230000004761 fibrosis Effects 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 230000001553 hepatotropic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000086 high toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 210000001320 hippocampus Anatomy 0.000 description 1
- 230000000215 hyperchromic effect Effects 0.000 description 1
- 201000001421 hyperglycemia Diseases 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 1
- 208000028867 ischemia Diseases 0.000 description 1
- 210000005229 liver cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000005228 liver tissue Anatomy 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 229920000609 methyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000001923 methylcellulose Substances 0.000 description 1
- 235000010981 methylcellulose Nutrition 0.000 description 1
- 238000001000 micrograph Methods 0.000 description 1
- 239000003226 mitogen Substances 0.000 description 1
- XUHJBXVYNBQQBD-GQPWXMLZSA-N molport-002-525-145 Chemical compound O([C@H]1[C@]2(O)C[C@H]3[C@]45[C@@H]6[C@@H](OC)[C@H]([C@@]([C@H]31)(OC(C)=O)[C@@H](O)[C@@H]2OC)[C@H]4N(C)C[C@@]6([C@@H](C[C@@H]5OC)O)COC)C(=O)C1=CC=CC=C1 XUHJBXVYNBQQBD-GQPWXMLZSA-N 0.000 description 1
- 230000004660 morphological change Effects 0.000 description 1
- 210000005155 neural progenitor cell Anatomy 0.000 description 1
- 208000015122 neurodegenerative disease Diseases 0.000 description 1
- 210000004493 neutrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000004006 olive oil Substances 0.000 description 1
- 235000008390 olive oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 1
- 210000001539 phagocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000006611 pharmacological activation Effects 0.000 description 1
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 230000004983 pleiotropic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002574 poison Substances 0.000 description 1
- 231100000614 poison Toxicity 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 1
- 230000002488 pyknotic effect Effects 0.000 description 1
- 230000008521 reorganization Effects 0.000 description 1
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 1
- 231100000241 scar Toxicity 0.000 description 1
- 210000004927 skin cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 1
- 210000003699 striated muscle Anatomy 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- VZGDMQKNWNREIO-UHFFFAOYSA-N tetrachloromethane Chemical compound ClC(Cl)(Cl)Cl VZGDMQKNWNREIO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000008719 thickening Effects 0.000 description 1
- 210000000689 upper leg Anatomy 0.000 description 1
- 210000000264 venule Anatomy 0.000 description 1
- 230000029663 wound healing Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/21—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates
- A61K31/215—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates of carboxylic acids
- A61K31/22—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates of carboxylic acids of acyclic acids, e.g. pravastatin
- A61K31/23—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates of carboxylic acids of acyclic acids, e.g. pravastatin of acids having a carboxyl group bound to a chain of seven or more carbon atoms
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K2121/00—Preparations for use in therapy
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K2300/00—Mixtures or combinations of active ingredients, wherein at least one active ingredient is fully defined in groups A61K31/00 - A61K41/00
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Emergency Medicine (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к медицине, конкретно к фармакологии, клеточным технологиям и регенеративной медицине.The invention relates to medicine, specifically to pharmacology, cell technology and regenerative medicine.
Известны различные средства, стимулирующие регенерацию тканей [1-3].There are various means that stimulate tissue regeneration [1-3].
Наиболее близкими по техническому результату являются средства, стимулирующие регенерацию тканей, механизмом действия которых является воздействие на различные рецепторы к факторам роста [1, 3].The closest in technical result are funds that stimulate tissue regeneration, the mechanism of action of which is the effect on various receptors for growth factors [1, 3].
Недостатком данных средств является их недостаточная эффективность [3].The disadvantage of these funds is their lack of effectiveness [3].
Адекватных аналогов предлагаемые средства, стимулирующие регенерацию тканей, по технической сущности не имеют.The proposed analogues of stimulating tissue regeneration do not have adequate analogues.
Задачей, решаемой настоящим изобретением, является расширение арсенала эффективных средств, стимулирующих регенерацию тканей.The problem solved by the present invention is to expand the arsenal of effective tools that stimulate tissue regeneration.
Поставленная задача достигается применением в качестве средств, стимулирующих регенерацию тканей, фармакологических веществ, оказывающих прямое действие на PI3K-, PKB-, PKC-, NF-κВ-, MAPK-, JAK/STAT, цАМФ-, PKA/CREB-опосредованный сигналинг в прогениторных клетках.The problem is achieved by using tissue regeneration agents, pharmacological substances that have a direct effect on PI3K-, PKB-, PKC-, NF-κB-, MAPK-, JAK / STAT, cAMP-, PKA / CREB-mediated signaling in progenitor cells.
Новым в предлагаемом изобретении является использование в качестве средств, стимулирующих регенерацию тканей, фармакологических веществ, оказывающих прямое действие на PI3K-, PKB-, PKC-, NF-κВ-, MAPK-, JAK/STAT, цАМФ-, PKA/CREB-опосредованный сигналинг в прогениторных клетках.New in the present invention is the use as a means of stimulating tissue regeneration, pharmacological substances that have a direct effect on PI3K-, PKB-, PKC-, NF-κB-, MAPK-, JAK / STAT, cAMP, PKA / CREB-mediated signaling in progenitor cells.
Полученные в последние годы сведения о свойствах и закономерностях жизнедеятельности мультипотентных клеток-предшественников открыли возможность развития фармакологической стратегии клеточной терапии [1]. При этом наиболее физиологичным подходом к решению задач регенеративной медицины в рамках данной стратегии является стимуляция функций собственных стволовых клеток (СК) организма лекарственными средствами - аналогами регуляторов физиологических функций [2, 3]. Наиболее часто для этих целей используют генноинженерные ростовые факторы (аналоги цитокинов), воздействующие в каждом конкретном случае на специфические рецепторы тех или иных типов прогениторных клеток [1, 4]. Однако плейотропность и полифункциональность цитокинов в ряде случаев не позволяют рассматривать их (особенно аналоги раннедействующих факторов роста) в качестве оптимальных средств для решения задач регенеративной медицины. Кроме того, белковая природа этих веществ предопределяет их достаточно высокую токсичность, обусловленную иммуногенностью, а также неспособность использования внутрь [3, 4], хотя пероральный прием препаратов является наиболее комплаентным в регенеративной медицине, когда предполагается длительное, многократно повторяющимися курсами, применение лекарственных средств. Кроме того, существуют и другие «недостатки» цитокинов, определяемые их фармакокинетическими характеристиками (в частности, их неспособность проникать через гематоэнцефалицеский барьер, что делает невозможным их эффективное использование для воздействия на СК нервной ткани при заболеваниях ЦНС).Information obtained in recent years on the properties and patterns of life of multipotent progenitor cells has opened the possibility of developing a pharmacological strategy for cell therapy [1]. Moreover, the most physiological approach to solving the problems of regenerative medicine within the framework of this strategy is to stimulate the functions of the body's own stem cells (SC) with drugs - analogues of physiological function regulators [2, 3]. Most often, genetic engineering growth factors (analogues of cytokines) are used for these purposes, acting in each case on specific receptors of certain types of progenitor cells [1, 4]. However, the pleiotropic and polyfunctionality of cytokines in some cases does not allow us to consider them (especially analogues of early-acting growth factors) as optimal means for solving the problems of regenerative medicine. In addition, the protein nature of these substances predetermines their rather high toxicity due to immunogenicity, as well as their inability to use them internally [3, 4], although oral administration of drugs is the most complimentary in regenerative medicine, when it is assumed that drugs are used for a long time, repeatedly repeated. In addition, there are other "drawbacks" of cytokines, determined by their pharmacokinetic characteristics (in particular, their inability to penetrate the blood-brain barrier, which makes it impossible to effectively use them for SC nervous tissue in diseases of the central nervous system).
Указанное обстоятельство делает необходимым разработку новых патогенетически обоснованных способов и подходов к активации функций прогениторных клеток с целью использования их ростового потенциала для стимуляции регенерации тканей в условиях патологических состояний. При этом известно, что стимулирующее влияние факторов роста после их взаимодействия с рецепторами передается посредством передачи сигнала с помощью внутриклеточных вторичных мессенджеров сигнальной трансдукции [5-7]. Причем, существуют вещества, способные проникать через мембрану клеток и оказывать прямое влияние на отдельные звенья сигнального каскада, участвующего в реализации определенных функций клеток, в том числе пролиферации и дифференцировки [5-7].This circumstance makes it necessary to develop new pathogenetically substantiated methods and approaches to activating the functions of progenitor cells in order to use their growth potential to stimulate tissue regeneration under conditions of pathological conditions. It is also known that the stimulating effect of growth factors after their interaction with receptors is transmitted through signal transmission using intracellular secondary messenger signal transduction [5-7]. Moreover, there are substances that can penetrate through the cell membrane and have a direct effect on individual parts of the signaling cascade involved in the implementation of certain functions of cells, including proliferation and differentiation [5-7].
Однако возможность стимуляции ростового потенциала прогениторных клеток с целью терапии различных заболеваний путем ускорения регенерации органов и тканей организма фармакологическими веществами, оказывающими прямое воздействие на внутриклеточные пути передачи сигнала в прогениторных клетках, стимулирующие их функции, не изучена. Эксперимент показал непредсказуемые результаты.However, the possibility of stimulating the growth potential of progenitor cells for the treatment of various diseases by accelerating the regeneration of organs and tissues of the body by pharmacological substances that have a direct effect on the intracellular signal transmission pathways in progenitor cells, stimulating their functions, has not been studied. The experiment showed unpredictable results.
Факт применения фармакологических веществ, оказывающих прямое воздействие на внутриклеточные пути передачи сигнала в прогениторных клетках, с достижением нового технического результата, заключающегося в стимуляции регенерации тканей организма, для специалиста является неочевидным.The fact of the use of pharmacological substances that have a direct effect on the intracellular signal transmission pathways in progenitor cells, with the achievement of a new technical result, which consists in stimulating the regeneration of body tissues, is not obvious for a specialist.
Новые свойства не вытекают явным образом из уровня техники в данной области и не обнаружены в патентной и научно-технической литературе.New properties do not follow explicitly from the prior art in this field and are not found in the patent and scientific literature.
Предлагаемое изобретение может быть использовано в медицине.The present invention can be used in medicine.
Исходя из вышеизложенного, следует считать заявляемое техническое решение соответствующим критериям: «Новизна», «Изобретательский уровень», «Промышленная применимость».Based on the foregoing, the claimed technical solution should be considered relevant criteria: "Novelty", "Inventive step", "Industrial applicability".
Эксперименты проведены на экспериментальных животных, полученных из питомника отдела экспериментального биомедицинского моделирования ФГБУ «НИИ фармакологии имени Е.Д. Гольдберга» СО РАМН.The experiments were conducted on experimental animals obtained from the nursery of the experimental biomedical modeling department of the Federal State Budgetary Institution Scientific Research Institute of Pharmacology named after E.D. Goldberg »SB RAMS.
Исследования проводили в соответствии с правилами лабораторной практики (GLP), утвержденными Приказом МЗСР РФ №708н от 23.08.2010 «Об утверждении правил лабораторной практики» и «Методическими рекомендациями по изучению специфической активности средств для регенеративной медицины» (Дыгай A.M., Зюзьков Г.Н., Жданов В.В. и др.) // Руководства по проведению доклинических исследований новых лекарственных средств. Часть первая / Под ред. А.Н. Миронова. - М.: Гриф и К, 2013. - С.776-787 (944 с.) [2]. В качестве потенциальных «мишеней» воздействия фармакологических путей исследованы все основные пути внутриклеточной сигнальной трансдукции (PI3K-, PKB-, PKC-, NF-κВ-, цАМФ-, PKA/CREB-, MAPK-, JAK/STAT-сигнальные пути) [5-8]. В качестве фармакологических веществ, оказывающих прямое воздействие на внутриклеточную сигнальную трансдукцию, использовали широкий спектр как активаторов, так и ингибиторов отдельных сигнальных молекул [5-8]. Данное обстоятельство позволяет делать обобщенные выводы о принципиальной возможности и эффективности использования всех аналогичных по механизму действия веществ для достижения технического результата.The studies were carried out in accordance with the rules of laboratory practice (GLP), approved by Order of the Ministry of Health of the Russian Federation No. 708n dated 08/23/2010 “On the approval of laboratory practice rules” and “Methodological recommendations for the study of the specific activity of means for regenerative medicine” (Digay AM, Zyuzkov G.N. ., Zhdanov V.V. et al.) // Guidelines for preclinical studies of new drugs. Part One / Ed. A.N. Mironova. - M .: Grif and K, 2013. - S.776-787 (944 p.) [2]. As potential “targets” of pharmacological pathway effects, all the main pathways of intracellular signal transduction (PI3K-, PKB-, PKC-, NF-κB-, cAMP-, PKA / CREB-, MAPK-, JAK / STAT-signaling pathways) were studied [ 5-8]. A wide spectrum of both activators and inhibitors of individual signaling molecules was used as pharmacological substances that directly affect intracellular signal transduction [5–8]. This circumstance allows us to draw general conclusions about the fundamental possibility and effectiveness of using all substances similar in terms of the mechanism of action to achieve a technical result.
Пример 1Example 1
Изучение регенераторной (терапевтической) активности фармакологического вещества, оказывающего прямое воздействие на PKA (протеинкиназу А)The study of the regenerative (therapeutic) activity of a pharmacological substance that has a direct effect on PKA (protein kinase A)
В настоящее время известна важная роль PKA/CREB (cAMP response element-binding protein)-сигналинга в определении функционального состояния различных клеток, заключающаяся в его ингибирующем влиянии на их пролиферативную активность [6].Currently, the important role of PKA / CREB (cAMP response element-binding protein) signaling in determining the functional state of various cells, which consists in its inhibitory effect on their proliferative activity, is known [6].
Исследование проводилось на 46 беспородных мышах. Регенераторную (терапевтическую) активность фармакологического вещества, оказывающего прямое воздействие на РКА прогениторных клеток, и механизмы его действия изучали на модели плоскостной кожной раны [9]. На депилированном участке спины у мышей под легким эфирным наркозом вырезали лоскут кожи размером 10×10 мм. Для моделирования более длительного заживления струп с экспериментальной раны регулярно (через сутки) снимали.The study was conducted on 46 outbred mice. The regenerative (therapeutic) activity of a pharmacological substance that has a direct effect on the RCA of progenitor cells, and its mechanisms of action, were studied using a planar skin wound model [9]. A skin flap 10 × 10 mm in size was cut out on the depilated back area in mice under mild ether anesthesia. To simulate longer healing, the scabs were removed from the experimental wound regularly (every other day).
В качестве фармакологического вещества, оказывающего прямое воздействие на PKA-опосредованный сигналинг, использовали специфический ингибитор PKA N-2-(p-bromocinnamyl-amino)-ethyl-5-isoquinolihe sulfon-amide dihydrochloride (H-89) (Sigma, США) [9]. Вещество H-89 использовали в виде раствора наружно в объеме 30 мкл (микролитров) в концентрации 10 мкМ (микромоль), начиная с первого дня после моделирования раны, ежедневно в течение всего периода заживления. Режим применения вещества в предварительных экспериментах был определен как наиболее эффективный.A specific inhibitor of PKA N-2- (p-bromocinnamyl-amino) -ethyl-5-isoquinolihe sulfon-amide dihydrochloride (H-89) (Sigma, USA) was used as a pharmacological substance that directly affects PKA-mediated signaling [Sigma, USA] [ 9]. The substance H-89 was used as a solution externally in a volume of 30 μl (microliters) at a concentration of 10 μM (micromoles), starting from the first day after modeling the wound, daily for the entire healing period. The mode of application of the substance in preliminary experiments was determined as the most effective.
Критериями стимулирующего регенерацию действия служили средний диаметр раны и результаты гистологического исследования биоптатов кожи мышей, полученных на 3, 5 и 15-е сутки из края раневого дефекта. Биопсийные образцы раневого дефекта кожи окрашивали гематоксилин-эозином. Оценивали: рельеф регенерата кожи, степень и характер инфильтрации, наличие и выраженность отека, количество новообразованных сосудов, волосяных фолликулов и потовых желез. Изучали такие патоморфологические процессы, как акантоз, гиперкератоз, дискератоз. На 3-и и 5-е сут методом клонирования определяли содержание мезенхимальных клеток-предшественников (КОЕ-Ф) в раневой поверхности [2]. Кроме того, определяли прямое влияние Н-89 (в концентрации 10 мкМ) на рост КОЕ-Ф, их пролиферативную активность и интенсивность дифференцировки (ИД-КОЕ-Ф) [2]. Обработку результатов проводили методом вариационной статистики с использованием t критерия Стьюдента и непараметрического U критерия Манна-Уитни.The criteria for stimulating regeneration of action were the average diameter of the wound and the results of a histological examination of biopsy specimens of the skin of mice obtained on days 3, 5 and 15 from the edge of the wound defect. Biopsy samples of a wound skin defect were stained with hematoxylin-eosin. Evaluated: the skin regenerate relief, the degree and nature of infiltration, the presence and severity of edema, the number of newly formed vessels, hair follicles and sweat glands. We studied pathomorphological processes such as acanthosis, hyperkeratosis, and dyskeratosis. On days 3 and 5, the content of mesenchymal progenitor cells (CFU-F) in the wound surface was determined by cloning [2]. In addition, the direct effect of H-89 (at a concentration of 10 μM) on the growth of CFU-F, their proliferative activity, and differentiation intensity (ID- CFU-F ) were determined [2]. The results were processed by the method of variation statistics using the Student t test and the nonparametric Mann-Whitney U test.
В ходе эксперимента заживление ран у контрольных животных отмечалось к 18 сут опыта. Использование ингибитора PKA способствовало значительному ускорению процессов регенерации. Заживление дефекта в данном случае наблюдалось к 13-м сут опыта. При этом имело место наиболее выраженное снижение размера ран (табл.1).During the experiment, wound healing in control animals was noted by day 18 of the experiment. The use of a PKA inhibitor significantly accelerated the regeneration processes. In this case, the healing of the defect was observed by the 13th day of the experiment. In this case, there was the most pronounced decrease in the size of wounds (Table 1).
При гистологическом исследовании на 3-й день после воздействия в обеих группах на поверхности раны обнаруживался лейкоцитарно-некротический слой, содержащий фибрин, под которым находился тонкий слой грануляционной ткани с большим количеством клеточных элементов: в основном нейтрофилов и макрофагов. Воспалительный процесс распространялся на нижележащий слой поперечно-полосатых мышц. Межмышечные прослойки были отечны и инфильтрированы лейкоцитами. По краям раны отек и гиперемия дермы, разрастание эпидермиса, который содержал 8-10 слоев однородных, недифференцированных крупных клеток округлой формы и толстый роговой слой. На 5-е сут новообразованный эпителий по краям раны представлял собой пласт клеток неодинаковой толщины без вертикальной анизоморфности. Передний край эпителия был истончен и в виде клина наползал на рану, а в грануляционной ткани отмечалось большое количество капилляров, имеющих вертикальный ход. При этом наружное применение Н-89 существенно снижало лейкоцитарную инфильтрацию краев раны, дермы и нижележащих тканей на 3-и сут опыта. Кроме того, использование ингибитора PKA увеличивало на 5-е сут эксперимента количество фибробластов в слое грануляций, которые при этом образовывали значительные по размеру тяжи клеток.Histological examination on the 3rd day after exposure in both groups on the surface of the wound revealed a leukocyte-necrotic layer containing fibrin, under which was a thin layer of granulation tissue with a large number of cellular elements: mainly neutrophils and macrophages. The inflammatory process spread to the underlying layer of striated muscles. The intermuscular layers were swollen and infiltrated with white blood cells. At the edges of the wound, edema and hyperemia of the dermis, proliferation of the epidermis, which contained 8-10 layers of homogeneous, undifferentiated large cells of a round shape and a thick horny layer. On the 5th day, the newly formed epithelium at the edges of the wound was a layer of cells of unequal thickness without vertical anisomorphism. The front edge of the epithelium was thinned and crawled into the wound in the form of a wedge, and a large number of capillaries with a vertical course were noted in the granulation tissue. In this case, external use of H-89 significantly reduced leukocyte infiltration of the edges of the wound, dermis and underlying tissues on the 3rd day of the experiment. In addition, the use of a PKA inhibitor on the 5th day of the experiment increased the number of fibroblasts in the granulation layer, which at the same time formed significant cell strands.
Анализ морфологических процессов, протекающих в области раневого дефекта кожи мышей на 15-е сут, показал, что в контрольной группе имело место формирование неполноценного регенерата. В подавляющем большинстве случаев поверхностный эпителий наблюдался не на всем протяжении, встречались небольшие участки отслойки эпидермиса от дермы с наличием субэпидермальных щелей, отмечалось резкое утолщение эпителиального пласта с нечеткой дифференцировкой слоев и увеличение количества базального, зернистого и рогового слоев. Внутриэпителиально обнаруживались нейтрофильные лейкоциты с формированием микроабсцессов, наблюдались слабовыраженные явления акантоза, гипер- и дискератоза. Подлежащая ткань была представлена созревающими грануляциями с умеренной гистиоцитарно-лейкоцитарной инфильтрацией, явлением отека и очагами кровоизлияний в верхних слоях дермы. Во всех образцах в прилежащей к зоне дефекта ткани отмечалось малое количество волосяных фолликулов и потовых желез. Регенерат кожи у животных контрольной группы характеризовался умеренным воспалением, что привело к усиленной пролиферации эпителия, для которой характерны атипические разрастания и изменения эпителия в виде акантоза, гипер- и дискератоза. Изучение гистоструктуры раневого дефекта в группе животных, получавших терапию ингибитором PKA, показало формирование более полноценного регенерата - в большей степени эпителизированного соединительнотканного рубца.An analysis of the morphological processes occurring in the wound defect area of the skin of mice on the 15th day showed that in the control group the formation of an inferior regenerate took place. In the vast majority of cases, the surface epithelium was not observed throughout, there were small areas of epidermal detachment from the dermis with the presence of subepidermal fissures, a sharp thickening of the epithelial layer with fuzzy differentiation of the layers and an increase in the number of basal, granular and horny layers were noted. Neutrophilic leukocytes with the formation of microabscesses were detected intraepithelially, mild manifestations of acanthosis, hyper- and diskeratosis were observed. The underlying tissue was represented by maturing granulations with moderate histiocytic-leukocyte infiltration, the phenomenon of edema and foci of hemorrhage in the upper layers of the dermis. In all samples, a small number of hair follicles and sweat glands were observed in the adjacent tissue defect zone. The skin regenerate in animals of the control group was characterized by moderate inflammation, which led to increased proliferation of the epithelium, which is characterized by atypical growths and changes in the epithelium in the form of acanthosis, hyper- and diskeratosis. The study of the histostructure of the wound defect in the group of animals treated with the PKA inhibitor showed the formation of a more complete regenerate - a more epithelized connective tissue scar.
Изучение механизмов регенеративного действия Н-89 выявило его выраженное влияние на резидентные клетки-предшественники. Применение специфического ингибитора PKA сопровождалось существенным увеличением числа КОЕ-Ф в раневой поверхности (табл.2). В то же время было выявлено и выраженное прямое влияние Н-89 на прогениторные клетки. Внесение ингибитора PKA в культуру миелокариоцитов сопровождалось значительным увеличением выхода в метилцеллюлозной среде числа КОЕ-Ф, их пролиферативной активности и интенсивности дифференцировки (табл.3).Studying the mechanisms of the regenerative action of N-89 revealed its pronounced effect on resident progenitor cells. The use of a specific PKA inhibitor was accompanied by a significant increase in the number of CFU-F in the wound surface (Table 2). At the same time, a pronounced direct effect of H-89 on progenitor cells was revealed. The introduction of a PKA inhibitor into the myelocaryocyte culture was accompanied by a significant increase in the yield of CFU-F in methyl cellulose medium, their proliferative activity, and differentiation intensity (Table 3).
В целом, полученные результаты свидетельствуют о наличии выраженной регенеративной активности у фармакологического вещества, оказывающего прямое воздействие на PKA-опосредованный сигналинг в прогениторных клетках, специфического ингибитора PKA. При этом в основе его терапевтического действия лежит активация функций резидентных мезенхимальных предшественников (содержащих в своем составе помимо стромальных прекурсоров мультипотентные (истинные) СК, способные дифференцироваться в эпителиоциты [6]), связанная с прямым влиянием ингибитора сигнальной молекулы PKA на предшественники. Выявленная специфика механизмов действия Н-89 указывает на принципиальную возможность и перспективность разработки на основе специфических ингибиторов PKA средства для регенеративной медицины [2, 6].In general, the obtained results indicate the presence of pronounced regenerative activity in a pharmacological substance that has a direct effect on PKA-mediated signaling in progenitor cells, a specific PKA inhibitor. Moreover, its therapeutic effect is based on the activation of the functions of resident mesenchymal precursors (containing, in addition to stromal precursors, multipotent (true) SCs that can differentiate into epithelial cells [6]), associated with the direct effect of the PKA signal molecule inhibitor on precursors. The revealed specificity of the mechanisms of action of N-89 indicates the fundamental possibility and prospects of developing a means for regenerative medicine based on specific PKA inhibitors [2, 6].
Пример 2Example 2
Изучение регенераторной (терапевтической) активности фармакологического вещества, оказывающего прямое воздействие на аденилатциклазуThe study of the regenerative (therapeutic) activity of a pharmacological substance that has a direct effect on adenylate cyclase
В настоящее время известно ингибирующее влияние цАМФ-зависимых сигнальных путей на пролиферативную активность клеточных элементов [6].Currently, the inhibitory effect of cAMP-dependent signaling pathways on the proliferative activity of cellular elements is known [6].
Исследование проводилось на 42 беспородных мышах. Регенераторную (терапевтическую) активность изучали на модели плоскостной кожной раны. На депилированном участке спины у мышей под легким эфирным наркозом вырезали лоскут кожи размером 10×10 мм. Для моделирования более длительного заживления струп с экспериментальной раны регулярно (через сутки) снимали [9].The study was conducted on 42 outbred mice. Regenerative (therapeutic) activity was studied on a model of planar skin wounds. A skin flap 10 × 10 mm in size was cut out on the depilated back area in mice under mild ether anesthesia. To simulate longer healing, the scabs were removed from the experimental wound regularly (every other day) [9].
В качестве фармакологического вещества, оказывающего прямое воздействие на цАМФ-опосредованный сигналинг, использовали блокатор (ингибитор) аденилатциклазы (2′,5′-дидеоксиаденозин, 2′,5′-dideoxyadenosine) (Calbiochem, США) [6]. Вещество использовали наружно (в объеме 30 мкл раствора) в концентрации 30 мкМ, начиная с первого дня после моделирования раны, ежедневно в течение всего периода заживления. Режим применения вещества в предварительных экспериментах был определен как наиболее эффективный.The adenylate cyclase blocker (inhibitor) (2 ′, 5′-dideoxyadenosine, 2 ′, 5′-dideoxyadenosine) (Calbiochem, USA) was used as a pharmacological substance that directly affects cAMP-mediated signaling [6]. The substance was used externally (in a volume of 30 μl of the solution) at a concentration of 30 μM, starting from the first day after modeling the wound, daily for the entire healing period. The mode of application of the substance in preliminary experiments was determined as the most effective.
Критериями стимулирующего регенерацию действия служили средний диаметр раны и результаты гистологического исследования биоптатов кожи мышей, полученных на 3, 5 и 15-е сутки из края раневого дефекта. Биопсийные образцы раневого дефекта кожи окрашивали гематоксилин-эозином. На 3-и и 5-е сут методом клонирования определяли содержание мезенхимальных клеток-предшественников (КОЕ-Ф) в раневой поверхности [2]. Кроме того, определяли прямое влияние 2′,5′-dideoxyadenosine (в концентрации 30 мкМ) на рост КОЕ-Ф и их пролиферативную активность [2]. Обработку результатов проводили методом вариационной статистики с использованием t критерия Стьюдента и непараметрического U критерия Манна-Уитни.The criteria for stimulating regeneration of action were the average diameter of the wound and the results of a histological examination of biopsy specimens of the skin of mice obtained on days 3, 5 and 15 from the edge of the wound defect. Biopsy samples of a wound skin defect were stained with hematoxylin-eosin. On days 3 and 5, the content of mesenchymal progenitor cells (CFU-F) in the wound surface was determined by cloning [2]. In addition, the direct effect of 2 ′, 5′-dideoxyadenosine (at a concentration of 30 μM) on the growth of CFU-F and their proliferative activity was determined [2]. The results were processed by the method of variation statistics using the Student t test and the nonparametric Mann-Whitney U test.
Использование ингибитора аденилатциклазы способствовало значительному ускорению процессов регенерации. Заживление дефекта в данном случае наблюдалось к 14 сут опыта (табл.4).The use of an adenylate cyclase inhibitor significantly accelerated the regeneration processes. In this case, the healing of the defect was observed by the 14th day of the experiment (Table 4).
В ходе гистологического исследования имело место снижение лейкоцитарной инфильтрации краев раны, дермы и нижележащих тканей и увеличение количества фибробластов в слое грануляций под влиянием ингибитора аденилатциклазы.During the histological examination, there was a decrease in leukocyte infiltration of the edges of the wound, dermis and underlying tissues and an increase in the number of fibroblasts in the granulation layer under the influence of an adenylate cyclase inhibitor.
При этом изучение механизмов регенеративного действия ингибитора аденилатциклазы выявило существенное увеличение числа КОЕ-Ф в раневой поверхности (табл.5), обусловленное его прямым влиянием на прогениторные клетки. Кроме того, внесение 2′,5′-dideoxyadenosine в культуру интактных миелокариоцитов сопровождалось значительным увеличением КОЕ-Ф в культуральной среде и количества КОЕ-Ф в S-фазе клеточного цикла (табл.6).Moreover, a study of the mechanisms of the regenerative action of the adenylate cyclase inhibitor revealed a significant increase in the number of CFU-F in the wound surface (Table 5), due to its direct effect on progenitor cells. In addition, the introduction of 2 ′, 5′-dideoxyadenosine into the culture of intact myelocaryocytes was accompanied by a significant increase in CFU-F in the culture medium and the number of CFU-F in the S-phase of the cell cycle (Table 6).
Таким образом, модуляция внутриклеточной передачи сигнала с помощью специфического ингибитора аденилатциклазы сопровождалось значительным ускорением регенерации поверхностных тканей в результате повышения пролиферативной активности резидентных прогениторных клеток кожи.Thus, the modulation of intracellular signal transmission using a specific adenylate cyclase inhibitor was accompanied by a significant acceleration of the regeneration of surface tissues as a result of an increase in the proliferative activity of resident progenitor skin cells.
Пример 3Example 3
Изучение регенераторной (терапевтической) активности фармакологического вещества, оказывающего прямое воздействие на PKC (протеинкиназу С)The study of the regenerative (therapeutic) activity of a pharmacological substance that has a direct effect on PKC (protein kinase C)
Известно стимулирующее влияние активации PKC на функциональную активность (процессы пролиферации и дифференцировки) клеточных элементов [5].The stimulating effect of PKC activation on the functional activity (proliferation and differentiation processes) of cellular elements is known [5].
Исследование проводилось на 48 беспородных крысах. Регенераторную (терапевтическую) активность фармакологического вещества, оказывающего прямое воздействие на PKC-опосредованный сигналинг (активатора PKC), изучали на модели дегенеративного заболевания [2] - цирроза печени.The study was conducted on 48 outbred rats. The regenerative (therapeutic) activity of a pharmacological substance that directly affects PKC-mediated signaling (PKC activator) was studied in a model of degenerative disease [2] - liver cirrhosis.
Цирроз вызывали совместным внутрижелудочным введением 50% раствора CCl4 (гепатотропный яд) на оливковом масле в дозе 2 мл/кг в течение 3-х недель 2 раза в неделю (6 раз)). При этом вместо воды животные в течение всего периода эксперимента получали 10% раствор этилового спирта. Опытным животным, начиная со следующего дня после последнего введения тетрахлоруглерода, через день в течение 10 сут внутрибрюшинно вводили активатор PKC - форболовый эфир (Phorbol12-myristate 13-acetate, Sigma, США) [11], в дозе 10 мкг/кг. Режим и доза введения вещества в предварительных экспериментах были определены как наиболее эффективные. Контрольным животным по той же схеме в эквивалентном объеме (0,5 мл) вводили дистиллированную воду.Cirrhosis caused joint intragastric administration of 50% CCl 4 solution (hepatotropic poison) in olive oil at a dose of 2 mL / kg for 3 weeks, 2 times a week (6 times)). Moreover, instead of water, animals received a 10% solution of ethyl alcohol throughout the entire period of the experiment. Starting from the day after the last administration of tetrachlorocarbon, experimental animals received PKC activator - phorbol ester (Phorbol12-myristate 13-acetate, Sigma, USA) [11] at a dose of 10 μg / kg every other day for 10 days. The regimen and dose of the substance in preliminary experiments were identified as the most effective. To the control animals, according to the same scheme, distilled water was injected in an equivalent volume (0.5 ml).
Оценивали гибель крыс, проводили биохимические исследования содержания в сыворотке крови аспартат- и аланин-аминотрансфераз (АсАТ, АлАТ) на 40-е сутки, а также морфологическое исследование печени на 40-е сутки опыта. Активность ферментов сыворотки крови определяли общепринятыми методами, используя полуавтоматический биохимический анализатор фирмы Cormay и стандартные наборы к нему. Кровь для исследования получали из бедренной артерии через катетер. На гистологических препаратах печени, окрашенных гематоксилином и эозином, определяли количество клеток инфильтрата с помощью окулярной сетки Автандилова, содержащей 25 тест-точек [9]. В 20 полях зрения подсчитывали количество клеток, попадающих на тест-точки сетки. Относительную площадь инфильтрации высчитывали как отношение точек сетки, приходящихся на клетки инфильтрата, ко всем точкам сетки в 20 полях зрения. Площадь соединительной ткани определяли с помощью средств компьютерной обработки графических данных. Для этого на стандартной площади среза печени (последовательные микрофотографии 10 полей зрения, выполненные микровидеокамерой "Digital micro", с программой передачи изображения на компьютер фирмы «Элекард», Томск) измеряли площадь структур, окрашенных пикрофуксином, и вычисляли процентное отношение к выбранной стандартной площади. Кроме того, с помощью культуральных методов изучали влияние активатора PKC на состояние пула регионарных стволовых клеток (СК) в печени - КОЕ-Печ [2]. Обработку результатов проводили методом вариационной статистики с использованием t-критерия Стьюдента и непараметрического U-критерия Вилкоксона-Манна-Уитни.Rat death was assessed, biochemical studies of serum levels of aspartate and alanine aminotransferases (AsAT, AlAT) were performed on the 40th day, as well as a morphological study of the liver on the 40th day of the experiment. The activity of serum enzymes was determined by conventional methods using a Cormay semi-automatic biochemical analyzer and standard kits for it. Blood for the study was obtained from the femoral artery through a catheter. On histological preparations of the liver stained with hematoxylin and eosin, the number of cells of the infiltrate was determined using the Avtandilov ocular network containing 25 test points [9]. In 20 fields of view, the number of cells reaching the test points of the grid was counted. The relative area of infiltration was calculated as the ratio of the grid points per cell of the infiltrate to all grid points in 20 fields of view. The area of connective tissue was determined using computer graphics processing. For this, the area of structures stained with picrofuchsin was measured on a standard area of a liver section (successive microphotographs of 10 fields of view performed by a Digital micro video camera with an image transfer program to a computer from Elecard, Tomsk) and the percentage of the selected standard area was calculated. In addition, using the cultural methods, the effect of PKC activator on the state of the regional stem cell pool (SC) in the liver, CFU-Pech, was studied [2]. The results were processed by the method of variation statistics using Student's t-test and non-parametric Wilcoxon-Mann-Whitney U-test.
Биохимические исследования сыворотки крови выявили повышение активности АлАТ, и АсАТ и ЩФ на 40-е сутки опыта после начала введения CCl4 в контрольной группе (табл.7). В то время как использование активатора PKC сопровождалось существенным снижением ферментативной активности сыворотки крови.Biochemical studies of blood serum revealed an increase in the activity of AlAT, and AsAT and alkaline phosphatase on the 40th day of the experiment after the start of CCl 4 administration in the control group (Table 7). While the use of PKC activator was accompanied by a significant decrease in the enzymatic activity of blood serum.
При исследовании гистологических препаратов печени в контрольной группе крыс отмечалось выраженное нарушение долькового строения органа. Имела место деформация терминальных печеночных венул, артериол и желчных протоков. Поля грануляционной ткани, замещали погибшие гепатоциты, в которых происходило новообразование сосудов и печеночных протоков, были видны фиброзные тяжи и микроузлы (псевдодоли). Последние представляли собой группы гепатоцитов, окруженных участками фиброза. В сохранившихся гепатоцитах наблюдалась выраженная крупнокапельная жировая дистрофия. Введение активатора PKC приводило к значительному регрессу морфологических признаков цирроза. При этом наблюдалось восстановление долькового строения печени, хотя признаки мелкокапельной жировой дистрофии и портальной инфильтрации сохранялись до конца периода наблюдения.In the study of histological preparations of the liver in the control group of rats, a marked violation of the lobular structure of the organ was noted. There was a deformation of the terminal hepatic venules, arterioles, and bile ducts. Fields of granulation tissue replaced the dead hepatocytes, in which the neoplasm of the vessels and hepatic ducts occurred, fibrous strands and micro nodes (pseudo-fractions) were visible. The latter were a group of hepatocytes surrounded by patches of fibrosis. In preserved hepatocytes, pronounced large-drop fatty degeneration was observed. The introduction of PKC activator led to a significant regression of morphological signs of cirrhosis. At the same time, restoration of the lobular structure of the liver was observed, although signs of small-drop fatty degeneration and portal infiltration persisted until the end of the observation period.
Подсчет содержания клеток инфильтрата и площади соединительной ткани показал падение данных показателей в группе крыс, получавших форболовый эфир (табл.8).Calculation of the content of infiltrate cells and the area of connective tissue showed a drop in these indicators in the group of rats treated with phorbol ester (Table 8).
Таким образом, активатор PKC обладал выраженным противоцирротическим действием.Thus, the PKC activator had a pronounced anti-cirrhotic effect.
В ходе изучения механизмов терапевтического (регенеративного) действия активатора PKC было выявлено значительное возрастание числа печеночных СК в органе-мишени (табл.9).During the study of the mechanisms of therapeutic (regenerative) action of PKC activator, a significant increase in the number of hepatic SC in the target organ was revealed (Table 9).
При этом в экспериментах in vitro было показано прямое стимулирующее влияние активатора PKC на прогениторные клетки. Внесение 50 нг/мл модификатора сигнальной трансдукции в культуру клеток печени сопровождалось значительным увеличением количества КОЕ-Печ в культуральной среде (табл.10).Moreover, in vitro experiments showed a direct stimulating effect of PKC activator on progenitor cells. The addition of 50 ng / ml signal transduction modifier to the liver cell culture was accompanied by a significant increase in the number of CFU-Pech in the culture medium (Table 10).
Таким образом, стимуляция PKC-зависимого сигналинга в региональных СК с помощью активатора PKC сопровождалось значительным ускорением регенерации ткани печени, пораженной патологическим процессом, характеризующимся неспособностью компенсации нарушений путем реализации собственного регенераторного потенциала.Thus, the stimulation of PKC-dependent signaling in regional SCs with the PKC activator was accompanied by a significant acceleration of liver tissue regeneration, affected by a pathological process characterized by the inability to compensate for violations by realizing its own regenerative potential.
Пример 4Example 4
Изучение регенераторной (терапевтической) активности фармакологического вещества, оказывающего прямое воздействие на фосфатидилинозитол-3-киназа (PI3K)-опосредованный сигналинг, играющий важную роль в стимуляции функций прогениторных клеток [7]Study of the regenerative (therapeutic) activity of a pharmacological substance that directly affects phosphatidylinositol-3-kinase (PI3K) -mediated signaling, which plays an important role in stimulating the functions of progenitor cells [7]
Исследование проводилось на 34 беспородных крысах и 10 мышах линии CBA. Регенераторную (терапевтическую) активность фармакологического вещества, оказывающего прямое воздействие на PI3K-опосредованный сигналинг (активатор (стимулятор) PI3K), изучали на модели ишемического инсульта, вызываемого полуторной перевязкой сонных артерий у крыс [9].The study was conducted on 34 outbred rats and 10 CBA mice. The regenerative (therapeutic) activity of a pharmacological substance that directly affects PI3K-mediated signaling (PI3K activator (stimulator)) was studied in a model of ischemic stroke caused by one and a half carotid artery ligation in rats [9].
В качестве фармакологического вещества, оказывающего прямое стимулирующее воздействие на PI3K-опосредованный сигналинг в прогениторных клетках, использовали низкомолекулярный алкалоид зонгорин. Вещество вводили крысам в дозе 2 мл перорально в виде 0,0005%-раствора 1 раз в сутки в течение 10 дней после моделирования патологического состояния. Режим и доза введения вещества в предварительных экспериментах были определены как наиболее эффективные. Контрольным животным по той же схеме в эквивалентном объеме вводили дистиллированную воду.As a pharmacological substance that has a direct stimulating effect on PI3K-mediated signaling in progenitor cells, a low molecular weight alkaloid zgororin was used. The substance was administered to rats at a dose of 2 ml orally in the form of a 0.0005% solution 1 time per day for 10 days after modeling the pathological condition. The regimen and dose of the substance in preliminary experiments were identified as the most effective. To the control animals, distilled water was injected in an equivalent volume in the same way.
Прямое стимулирующее воздействие зонгорина на PI3K в прогениторных клетках было показано в предварительных экспетиментах путем установления факта отмены ингибитором PI3K (LY294002) («Calbiochem», США) [7] стимулирующего действия зонгорина на рост КОЕ-Н (нейральных стволовых клеток) - нейросфер (клеточных образований, получаемых из нейральных клеток-предшественников) [1, 2] в культуре клеток пара-вентрикулярной области головного мозга мышей линии CBA in vitro. Рабочая концентрация ингибитора PI3K составляла 50 мкМ (микромоль). Клетки паравентрикулярной области головного мозга культивировали в жидкой культуральной среде [2], содержащей 10 нг/мл зонгорина. Внесение в культуру клеток головного мозга ингибитора PI3K отменяло стимулирующее влияние зонгорина на рост КОЕ-Н (табл.11).The direct stimulating effect of zongorin on PI3K in progenitor cells was shown in preliminary experiments by establishing the fact that the PI3K inhibitor (LY294002) (Calbiochem, USA) [7] canceled the stimulating effect of zongorin on the growth of CFU-H (neural stem cells) - neurospheres (cell formations obtained from neural progenitor cells) [1, 2] in the cell culture of the paraventricular region of the brain of CBA mice in vitro. The working concentration of the PI3K inhibitor was 50 μM (micromol). The cells of the paraventricular region of the brain were cultured in a liquid culture medium [2] containing 10 ng / ml of zgororin. The introduction of a PI3K inhibitor into the brain cell culture reversed the stimulating effect of zongorin on the growth of CFU-H (Table 11).
Критериями терапевтической (регенераторной) активности активатора PI3K являлись результаты гистологического исследования головного мозга (на 10-е сут после моделирования ишемического инсульта), а также коррекция изменений функционального характера, вызванных перевязкой сонных артерий, которые регистрировались на основании изменения ориентировочно-исследовательского поведения животных в открытом поле и сохранности УРПИ [1, 9]. Ориентировочно-исследовательское поведение оценивали на 7, 14-е сут. Рефлекс пассивного избегания вырабатывался на 5 сут после моделирования патологического состояния, а его воспроизводимость оценивалась на 21-е сут эксперимента. Обработку результатов проводили методом вариационной статистики с использованием t критерия Стьюдента и непараметрического U критерия Манна-Уитни.The criteria for the therapeutic (regenerative) activity of the PI3K activator were the results of a histological examination of the brain (on the 10th day after modeling of ischemic stroke), as well as the correction of functional changes caused by ligation of the carotid arteries, which were recorded on the basis of changes in the orientation and research behavior of animals in the open field and safety passive avoidance reaction [1, 9]. Approximate research behavior was evaluated on the 7th, 14th day. The passive avoidance reflex was developed on the 5th day after modeling the pathological condition, and its reproducibility was evaluated on the 21st day of the experiment. The results were processed by the method of variation statistics using the Student t test and the nonparametric Mann-Whitney U test.
Проведенные исследования показали, что полуторная перевязка сонных артерий приводила к нарушению ориентировочно-исследовательского поведения животных в открытом поле (табл.12) и падению уровня воспроизведения УРПИ (табл.13).Studies have shown that one and a half ligation of the carotid arteries led to a violation of the orientational-research behavior of animals in an open field (Table 12) and a decrease in the level of passive avoidance reaction (Table 13).
При гистологическом исследовании мозга животных с ишемией наблюдалось неравномерное кровенаполнение полушарий головного мозга. Часть сосудов коры была в спавшемся состоянии, встречались сосуды со слабым кровенаполнением и, много сосудов с пустыми просветами. Имел место выраженный периваскулярный и перицеллюлярный отек. В области гиппокампа наблюдалось значительное количество нейронов с гиперхромными ядрами, вакуольной дистрофией, нейроны, окруженные фагоцитами, нейроны с пикнотичным ядром и сморщенной цитоплазмой, нейроны в состоянии фагоцитоза.During histological examination of the brain of animals with ischemia, uneven blood supply to the cerebral hemispheres was observed. Part of the vessels of the cortex was in a collapsed state, there were vessels with weak blood supply and, many vessels with empty gaps. There was a pronounced perivascular and pericellular edema. A significant number of neurons with hyperchromic nuclei, vacuole dystrophy, neurons surrounded by phagocytes, neurons with a pyknotic nucleus and shrunken cytoplasm, and neurons in the state of phagocytosis were observed in the hippocampus region.
Введение активатора PI3K оказывало выраженное церебропротекторное действие. Наблюдалось повышение уровня воспроизводимости рефлекса, выраженная коррекция нарушений ориентировочно-исследовательского поведения и предотвращение гибели животных (табл.12, 13). При этом морфологическая картина головного мозга характеризовалась относительно равномерным кровенаполнением сосудов правого и левого полушария, отменой развития периваскулярного и перицеллюлярного отека и снижением количества нейронов с вакуольной дистрофией и нейронов в состоянии фагоцитоза по сравнению с контрольными животными.The introduction of the PI3K activator had a pronounced cerebroprotective effect. There was an increase in the level of reproducibility of the reflex, a pronounced correction of violations of orientational-research behavior and the prevention of death of animals (Tables 12, 13). At the same time, the morphological picture of the brain was characterized by relatively uniform blood supply to the vessels of the right and left hemisphere, the abolition of the development of perivascular and pericellular edema, and a decrease in the number of neurons with vacuole dystrophy and neurons in a state of phagocytosis compared with control animals.
Полученные результаты свидетельствуют о выраженной церебропротекторной активности активатора PI3K, связанной с его регенеративной активностью, определяемой стимулирующим влиянием данного вещества на нейральные стволовые клетки в результате реализации PI3K-опосредованного сигналинга.The results indicate a marked cerebroprotective activity of the PI3K activator associated with its regenerative activity, determined by the stimulating effect of this substance on neural stem cells as a result of the implementation of PI3K-mediated signaling.
Пример 5Example 5
Изучение регенераторной (терапевтической) активности фармакологического вещества, оказывающего прямое воздействие на митоген-активируемые киназы (МАРК) и протеинкиназу В (PKB) [7, 8], играющие важную роль в сигнальной трансдукции при стимуляции функций клетокStudy of the regenerative (therapeutic) activity of a pharmacological substance that directly affects mitogen-activated kinases (MAPK) and protein kinase B (PKB) [7, 8], which play an important role in signal transduction during cell function stimulation
Исследование проводилось на 58 мышах линии CBA. Регенераторную (терапевтическую) активность фармакологического вещества, оказывающего прямое воздействие на МАРК и PKB, изучали на модели постгипоксической энцефалопатии.The study was conducted on 58 CBA mice. The regenerative (therapeutic) activity of a pharmacological substance that has a direct effect on MAPK and PKB was studied in a model of posthypoxic encephalopathy.
В качестве фармакологического вещества, оказывающего прямое активирующее воздействие на МАРК- и PKB-опосредованный сигналинг в прогениторных клетках (активатора МАРК и PKB), использовали низкомолекулярный алкалоид гипаконитин. Вещество вводили мышам в дозе 0,2 мл перорально в виде 0,0005% - раствора 1 раз в сутки в течение 7 дней после моделирования патологического состояния. Режим и доза введения вещества в предварительных экспериментах были определены как наиболее эффективные. Контрольным животным по той же схеме в эквивалентном объеме вводили дистиллированную воду.As a pharmacological substance that has a direct activating effect on MAPK and PKB-mediated signaling in progenitor cells (activator of MAPK and PKB), low molecular weight alkaloid hypakonitin was used. The substance was administered to mice at a dose of 0.2 ml orally in the form of 0,0005% solution once a day for 7 days after modeling the pathological condition. The regimen and dose of the substance in preliminary experiments were identified as the most effective. To the control animals, distilled water was injected in an equivalent volume in the same way.
Постгипоксическую энцефалопатию моделировали с помощью гермокамеры [1]. Функциональные нарушения со стороны центральной нервной системы, вызванные гипоксическим воздействием, оценивались по изменению ориентировочно-исследовательского поведения в открытом поле и сохранности УРПИ [1, 9]. Ориентировочно-исследовательское поведение оценивали на 7, 14, 21-е сут. Рефлекс пассивного избегания вырабатывался на 5 сут после моделирования патологического состояния, а его воспроизводимость оценивалась на 21-е сут эксперимента. Обработку результатов проводили методом вариационной статистики с использованием t критерия Стьюдента и непараметрического U критерия Манна-Уитни.Posthypoxic encephalopathy was simulated using a pressure chamber [1]. Functional disorders from the side of the central nervous system caused by hypoxic exposure were assessed by changes in orientational research behavior in the open field and the safety of passive avoidance reaction [1, 9]. Approximate research behavior was evaluated on the 7th, 14th, 21st day. The passive avoidance reflex was developed on the 5th day after modeling the pathological condition, and its reproducibility was evaluated on the 21st day of the experiment. The results were processed by the method of variation statistics using the Student t test and the nonparametric Mann-Whitney U test.
Прямое активирующее влияние гипаконитина на МАРК и PKB в прогениторных клетках было показано в предварительных экспериментах путем установления факта отмены ингибитором МАРК р38 и PKB (SB203580) (Calbiochem, США) [7] стимулирующего действия гипаконитина на рост КОЕ-Ф (мезенхимальных стволовых клеток) [2] в культуре клеток костного мозга мышей линии CBA in vitro. Рабочая концентрация ингибитора МАРК и PKB составляла 10 мкМ (микромоль). Клетки костного мозга культивировали в полувязкой культуральной среде [2], содержащей 10 нг/мл гипаконитина. Внесение в культуру клеток костного мозга ингибитора МАРК и PKB отменяло стимулирующее влияние гипаконитина на рост КОЕ-Ф и повышение их пролиферативной активности (табл.14).The direct activating effect of hypaconitin on MAPK and PKB in progenitor cells was shown in preliminary experiments by establishing the fact that the MAPK p38 and PKB inhibitor (SB203580) (Calbiochem, USA) [7] canceled the stimulating effect of hypaconitine on the growth of CFU-F (mesenchymal stem cells) [ 2] in an in vitro bone marrow cell culture of CBA mice. The working concentration of the MAPK inhibitor and PKB was 10 μM (micromole). Bone marrow cells were cultured in a semi-viscous culture medium [2] containing 10 ng / ml hypaconitine. The introduction of the inhibitor of MAPK and PKB into the bone marrow cell culture canceled the stimulating effect of hypaconitin on the growth of CFU-F and an increase in their proliferative activity (Table 14).
Проведенные исследования показали (табл.15), что перенесенная гипоксия вызывала нарушение ориентировочно-исследовательского поведения в открытом поле. В группе гипоксического контроля отмечалось увеличение латентного времени захода в темную камеру при выработке рефлекса, что свидетельствует о нарушении ориентировочного рефлекса. Применение активатора МАРК и РКВ приводило к нормализации ориентировочно-исследовательского поведения в открытом поле (табл.15).The studies showed (Table 15) that the transferred hypoxia caused a violation of the orientational research behavior in the open field. In the hypoxic control group, an increase in the latent time of entry into the dark chamber during the development of the reflex was noted, which indicates a violation of the orientational reflex. The use of the activator MAPK and RKV led to the normalization of orienting-research behavior in an open field (Table 15).
Кроме того, проявления постгипоксической энцефалопатии у животных гипоксического контроля регистрировались по нарушению мнестических функций. Имело место падение уровня воспроизводимости УРПИ и значительная гибель животных. Применение гипаконитина оказало защитное действие на животных. Имело место повышение уровня воспроизводимости рефлекса и предотвращение гибели животных (табл.16).In addition, the manifestations of posthypoxic encephalopathy in animals of hypoxic control were recorded for violation of mnestic functions. There was a drop in the level of reproducibility of passive avoidance reaction and significant death of animals. The use of hypakonitin had a protective effect on animals. There was an increase in the level of reproducibility of the reflex and the prevention of death of animals (Table 16).
Таким образом, фармакологическая активация МАРК и РКВ в прогениторных элементах, сопровождающаяся стимуляцией их функций, приводила к развитию выраженных церебропротекторных эффектов.Thus, the pharmacological activation of MAPK and RKV in progenitor elements, accompanied by stimulation of their functions, led to the development of pronounced cerebroprotective effects.
Пример 6Example 6
Изучение регенераторной (терапевтической) активности фармакологического вещества, оказывающего прямое стимулирующее воздействие на NF-κB (ядерный фактор «каппа-би»)-сигналинг, играющий важную роль в сигнальной трансдукции в прогениторных клетках при стимуляции их пролиферации и дифференцировки [5, 8]The study of the regenerative (therapeutic) activity of a pharmacological substance that has a direct stimulating effect on NF-κB (Kappa-bi nuclear factor) is a signaling that plays an important role in signal transduction in progenitor cells during stimulation of their proliferation and differentiation [5, 8]
Исследование проводилось на 36 мышах линии СВА. Регенераторную (терапевтическую) активность фармакологического вещества, оказывающего прямое воздействие на NF-κB, изучали на модели системы крови в условиях цитостатической миелосупрессии.The study was conducted on 36 CBA mice. The regenerative (therapeutic) activity of a pharmacological substance that has a direct effect on NF-κB was studied on a model of the blood system under conditions of cytostatic myelosuppression.
В качестве фармакологического вещества, оказывающего прямое стимулирующее воздействие на NF-κB (активатора NF-κB) в прогениторных клетках, использовали низкомолекулярный алкалоид мезаконитин. Вещество вводили мышам в дозе 0,2 мл перорально в виде 0,0005%-раствора 1 раз в сутки в течение 5 дней после моделирования патологического состояния. Режим и доза введения вещества в предварительных экспериментах были определены как наиболее эффективные. Контрольным животным по той же схеме в эквивалентном объеме вводили дистиллированную воду.As a pharmacological substance that has a direct stimulating effect on NF-κB (NF-κB activator) in progenitor cells, a low-molecular alkaloid mesaconitin was used. The substance was administered to mice at a dose of 0.2 ml orally in the form of a 0.0005% solution 1 time per day for 5 days after modeling the pathological condition. The regimen and dose of the substance in preliminary experiments were identified as the most effective. To the control animals, distilled water was injected in an equivalent volume in the same way.
Цитостатическую миелосупрессию моделировали путем однократного внутрибрюшинного введения раствора 5-фторурацила (5-ФУ) в ½ максимально переносимой дозы (МПД) (114 мг/кг). На 5, 8-е и 12-е сут после введения цитостатика животных умерщвляли путем ингаляции CO2. У опытных и контрольных мышей общепринятыми методами определяли содержание ретикулоцитов в периферической крови, а также показатели костномозгового кроветворения (общее количество миелокариоцитов, миелограмма). Содержание коммитированных клеток-предшественников эритропоэза (КОЕ-Э) и гранулоцитопоэза (КОЕ-ГМ) в костном мозге и индекс их дифференцировки [9]. Статистическую обработку полученных данных проводили методом вариационной статистики с использованием t-критерия Стьюдента и Уилкоксона-Манна-Уитни.Cytostatic myelosuppression was modeled by a single intraperitoneal injection of a solution of 5-fluorouracil (5-FU) in ½ of the maximum tolerated dose (MTD) (114 mg / kg). On days 5, 8, and 12 after administration of the cytostatic, the animals were killed by inhalation of CO 2 . In experimental and control mice, the content of reticulocytes in peripheral blood, as well as indicators of bone marrow hematopoiesis (total number of myelocaryocytes, myelogram) were determined by conventional methods. The content of committed progenitor cells of erythropoiesis (CFU-E) and granulocytopoiesis (CFU-GM) in the bone marrow and their differentiation index [9]. Statistical processing of the data was carried out by the method of variation statistics using t-student test and Wilcoxon-Mann-Whitney.
Прямое активирующее влияние мезаконитина на NF-κB-сигналинг в прогениторных клетках, было показано в предварительных экспетиментах путем установления факта отмены ингибитором активности NF-κB ауротиомалатом (Calbiochem, США) [5] стимулирующего действия мезаконитина на рост КОЕ-Э и КОЕ-ГМ [9] в культуре клеток костного мозга мышей линии CBA in vitro и их пролиферативную активность. Рабочая концентрация ингибитора NF-κB составляла 50 мкМ (микромоль). Клетки костного мозга культивировали в полувязкой культуральной среде [2], содержащей 10 нг/мл мезаконитина. Внесение в культуру клеток костного мозга ингибитора NF-κB отменяло стимулирующее влияние мезаконитина на рост КОЕ-Э и КОЕ-ГМ и их пролиферативную активность (табл.17).The direct activating effect of mesaconitin on NF-κB signaling in progenitor cells was shown in preliminary experiments by establishing the fact that the inhibitor of NF-κB activity by aurothiomalate (Calbiochem, USA) [5] cancels the stimulating effect of mesaconitin on the growth of CFU-E and CFU-GM [5] 9] in a bone marrow cell culture of CBA mice in vitro and their proliferative activity. The working concentration of the NF-κB inhibitor was 50 μM (micromole). Bone marrow cells were cultured in a semi-viscous culture medium [2] containing 10 ng / ml mesaconitine. The introduction of an NF-κB inhibitor into the bone marrow cell culture canceled the stimulating effect of mesaconitin on the growth of CFU-E and CFU-GM and their proliferative activity (Table 17).
В ходе эксперимента введение 5-ФУ проводило к развитию глубокой продолжительной депрессии эритроидного и гранулоцитарного ростков кроветворения. На протяжении всего сроки исследования отмечалось падение содержания эритрокариоцитов, незрелых и зрелых нейтрофильных гранулоцитов в гемопоэтической ткани (табл.18) и количества нейтрофилов в периферической крови (табл.19). Вместе с тем имела место выраженная компенсаторная реакция со стороны пула кроветворных предшественников. Регистрировалось возрастание числа костномозговых КОЕ-Э и КОЕ-ГМ на фоне увеличения интенсивности их дифференцировки (табл.20).During the experiment, the introduction of 5-FU led to the development of a deep, prolonged depression of erythroid and granulocytic hematopoietic germs. Throughout the duration of the study, there was a decrease in the content of red blood cells, immature and mature neutrophilic granulocytes in the hematopoietic tissue (Table 18) and the number of neutrophils in peripheral blood (Table 19). At the same time, there was a pronounced compensatory reaction from the pool of hematopoietic predecessors. An increase in the number of bone marrow CFU-E and CFU-GM was recorded against the background of an increase in the intensity of their differentiation (Table 20).
Введение активатора NF-κB приводило к значительному повышению интенсивности восстановления процессов гемопоэза. Наблюдалось увеличение содержания морфологически распознаваемых клеток в костном мозге, сопровождаемое возрастанием числа ретикулоцитов, палочко- и сегментоядерных нейтрофилов в периферической крови (табл.18, 19). Причем указанные изменения явились закономерным следствием повышения функциональной активности КОЕ-Э и КОЕ-ГМ и увеличения их содержания в гемопоэтической ткани (табл.20).The introduction of the activator NF-κB led to a significant increase in the intensity of restoration of hematopoiesis processes. An increase in the content of morphologically recognizable cells in the bone marrow was observed, accompanied by an increase in the number of reticulocytes, rod and segmented neutrophils in the peripheral blood (Tables 18, 19). Moreover, these changes were a natural consequence of an increase in the functional activity of CFU-E and CFU-GM and an increase in their content in hematopoietic tissue (Table 20).
Полученные результаты свидетельствуют о выраженной стимуляции регенерации кроветворной ткани под влиянием активатора NF-κB, играющего важную роль во внутриклеточной сигнальной трансдукции процессов пролиферации и дифференцировки кроветворных прекурсоров.The results obtained indicate a pronounced stimulation of hematopoietic tissue regeneration under the influence of the activator NF-κB, which plays an important role in intracellular signal transduction of proliferation and differentiation of hematopoietic precursors.
Пример 7Example 7
Изучение регенераторной (терапевтической) активности фармакологического вещества, оказывающего прямое стимулирующее воздействие на JAK (Janus kinase или just another kinase)/STAT (signal transducer and activator of transcription)-сигналинг, играющий важную роль в сигнальной трансдукции в прогениторных клетках при стимуляции их функций, в том числе различными цитокинами [8]The study of the regenerative (therapeutic) activity of a pharmacological substance that has a direct stimulating effect on JAK (Janus kinase or just another kinase) / STAT (signal transducer and activator of transcription) signaling, which plays an important role in signal transduction in progenitor cells when stimulating their functions, including various cytokines [8]
Исследование проводилось на 36 мышах линии СВА. Регенераторную (терапевтическую) активность фармакологического вещества, оказывающего прямое воздействие на NF-κB, изучали на модели сахарного диабета.The study was conducted on 36 CBA mice. The regenerative (therapeutic) activity of a pharmacological substance that has a direct effect on NF-κB was studied in a model of diabetes mellitus.
В качестве фармакологического вещества, оказывающего прямое стимулирующее воздействие на JAK/STAT-сигналинг (активатор JAK и STAT) в прогениторных клетках, использовали низкомолекулярный алкалоид напеллин. Вещество вводили мышам в дозе 0,2 мл перорально в виде 0,0005%-раствора 1 раз в сутки в течение 3 дней после моделирования патологического состояния. Режим и доза введения вещества в предварительных экспериментах были определены как наиболее эффективные. Контрольным животным по той же схеме в эквивалентном объеме вводили дистиллированную воду.As a pharmacological substance that has a direct stimulating effect on JAK / STAT signaling (JAK activator and STAT) in progenitor cells, a low molecular weight alkaloid napellin was used. The substance was administered to mice at a dose of 0.2 ml orally in the form of a 0.0005% solution 1 time per day for 3 days after modeling the pathological condition. The regimen and dose of the substance in preliminary experiments were identified as the most effective. To the control animals, distilled water was injected in an equivalent volume in the same way.
Экспериментальной моделью сахарного диабета служил аллоксановый диабет [12]. У мышей диабет моделировали подкожным введением 1-водного аллоксана по следующей схеме: в течение 4-х дней ежедневно по 300 мг/кг, затем еще раз в той же дозе на 7-й день после последнего введения в объеме 0,2 мл/мышь.The experimental model of diabetes mellitus was alloxan diabetes [12]. In mice, diabetes was modeled by subcutaneous administration of 1-aqueous alloxan according to the following scheme: for 4 days, 300 mg / kg daily, then again in the same dose on the 7th day after the last injection in a volume of 0.2 ml / mouse .
Оценку состояния эндокринного аппарата поджелудочной железы животных производили по регистрации уровня глюкозы в периферической крови и с помощью морфологического исследовании органа. Содержание глюкозы определяли утром натощак на 11-е и 21-е сут опыта с помощью глюкометра «Optilite» (Венгрия) и прилагаемых к нему полосок «Optilite test strip». Для морфологического исследования на 8, 12, 21-е сут эксперимента часть поджелудочной железы, прилегающую к селезенке, фиксировали в 10% растворе формалина и заливали в парафин. Депарафинизированные срезы толщиной 5 мкм окрашивали гематоксилином и эозином. На срезах определяли площадь 10-ти последовательных островков Лангерганса методом графического компьютерного анализа и подсчитывали в них общее количество клеток, число пикнотизированных клеточных элементов и вычисляли содержание клеток на единицу площади островка и процент пикнотизированных клеток. С целью исследования механизма действия средства изучали динамику содержания регионарных стволовых клеток в поджелудочной железе (КОЕпж) на 8, 12, 21-е сут [12]. Обработку результатов проводили методом вариационной статистики с использованием t-критерия Стьюдента и непараметрического U-критерия Вилкоксона-Манна-Уитни.The state of the endocrine apparatus of the pancreas of animals was assessed by recording the level of glucose in peripheral blood and using a morphological study of the organ. Glucose was determined on an empty stomach in the morning on the 11th and 21st days of the experiment using the Optilite glucometer (Hungary) and the Optilite test strip attached to it. For morphological studies on the 8th, 12th, 21st day of the experiment, the part of the pancreas adjacent to the spleen was fixed in a 10% formalin solution and embedded in paraffin. Deparaffinized sections with a thickness of 5 μm were stained with hematoxylin and eosin. The sections were used to determine the area of 10 consecutive islets of Langerhans by means of a graphical computer analysis and the total number of cells, the number of pyknotized cell elements were calculated in them, and the cell content per unit area of the island and the percentage of pyknotized cells were calculated. In order to study the mechanism of action of the drug, the dynamics of the content of regional stem cells in the pancreas (CFU pzh ) was studied on days 8, 12, 21 [12]. The results were processed by the method of variation statistics using Student's t-test and non-parametric Wilcoxon-Mann-Whitney U-test.
Прямое активирующее влияние напеллина на JAK/STAT-сигналинг (JAK и STAT) в прогениторных клетках, было показано в предварительных экспетиментах путем установления факта отмены ингибиторами активности JAK и STAT Ruxolkinib (Pan JAK Inhibitor) (InvivoGen, США) и 6-Nitrobenzo[b]thiophene-1,1-dioxide, STAT3 Inhibitor V, Stattic (Calbiochem, США) стимулирующего действия напеллина на рост КОЕпж [9, 12] в культуре клеток поджелудочной железы мышей линии CBA in vitro и их пролиферативную активность. Рабочая концентрация ингибиторов JAK и STAT составляла 1000 нМ (наномоль) и 50 мкМ соответственно. Клетки поджелудочной железы культивировали в жидкой культуральной среде [9, 12], содержащей 10 нг/мл напелллина. Внесение в культуру клеток костного мозга каждого из ингибиторов JAK и STAT отдельно значительно снижало стимулирующее влияние напеллина на рост КОЕпж и их пролиферативную активность, а их совместное использование сопровождалось полной отменой способности алкалоида активировать клетки-предшественники (табл.21).The direct activating effect of napellin on JAK / STAT signaling (JAK and STAT) in progenitor cells was shown in preliminary experiments by establishing the fact that the inhibitors cancel the activity of JAK and STAT Ruxolkinib (Pan JAK Inhibitor) (InvivoGen, USA) and 6-Nitrobenzo [b ] thiophene-1,1-dioxide, STAT3 Inhibitor V, Stattic (Calbiochem, USA) the stimulating effect of napellin on the growth of CFU of pancreas [9, 12] in the pancreatic cell culture of CBA mice in vitro and their proliferative activity. The working concentration of JAK and STAT inhibitors was 1000 nM (nanomole) and 50 μM, respectively. Pancreatic cells were cultured in a liquid culture medium [9, 12] containing 10 ng / ml napellin. The introduction of each of the JAK and STAT inhibitors into the bone marrow cell culture separately significantly reduced the stimulating effect of napellin on the growth of CFU of the pancreas and their proliferative activity, and their joint use was accompanied by the complete abolition of the alkaloid's ability to activate progenitor cells (Table 21).
В ходе эксперимента введение аллоксана приводило к пикнозу значительной части клеток островков Лангерганса, наблюдаемому во все сроки исследования. Кроме того, отмечались выраженные явления отека и гиперемии эндокринного аппарата с развитием значительной лимфомакрофагальной инфильтрации ткани (табл.22). Закономерным отражением морфологических изменений со стороны поджелудочной железы явилось значительное возрастание содержания глюкозы в периферической крови и развитие гипергликемии (табл.23)During the experiment, the administration of alloxan led to the pycnosis of a significant part of the cells of the islets of Langerhans, observed at all stages of the study. In addition, pronounced phenomena of edema and hyperemia of the endocrine apparatus with the development of significant lymphomacrophageal tissue infiltration were noted (Table 22). A logical reflection of morphological changes in the pancreas was a significant increase in glucose in the peripheral blood and the development of hyperglycemia (Table 23)
При этом курсовое введение активатора JAK и STAT после моделирования аллоксанового диабета приводило к достоверному снижению процента пикнотизированных клеток в островках Лангерганса на фоне уменьшения общего количества клеток на единицу площади островка в результате значительного снижения инфильтрации островков (табл.22). Описанная патоморфологическая картина сопровождалась нормализацией уровня глюкозы в крови (табл.23)Moreover, the course administration of the JAK and STAT activator after modeling alloxan diabetes led to a significant decrease in the percentage of pycnotized cells in the islets of Langerhans against the background of a decrease in the total number of cells per unit area of the islet as a result of a significant decrease in islet infiltration (Table 22). The described pathomorphological picture was accompanied by normalization of blood glucose levels (Table 23)
При исследовании механизмов действия выявленной высокой эффективности активатора JAK и STAT при экспериментальной терапии сахарного диабета было обнаружено, что в контрольной группе отмечалось выраженное падение содержания регионарных стволовых клеток в поджелудочной железе, в то время как у опытных мышей имело место значительное возрастание количества КОЕпж (табл.24).When studying the mechanisms of action of the revealed high efficiency of the JAK and STAT activator in the experimental treatment of diabetes mellitus, it was found that in the control group there was a pronounced decrease in the content of regional stem cells in the pancreas, while in experimental mice there was a significant increase in the number of CFU of pancreas (table .24).
Таким образом, введение активатора JAK и STAT позволяет проводить эффективную терапию сахарного диабета путем стимуляции эндогенных стволовых клеток, сопровождаемой репарацией инсулинпродуцирующего аппарата органа и нормализацией уровня глюкозы в периферической крови.Thus, the introduction of the activator JAK and STAT allows for the effective treatment of diabetes mellitus by stimulating endogenous stem cells, accompanied by the repair of the insulin-producing apparatus of the organ and the normalization of the level of glucose in peripheral blood.
В целом, представленные данные свидетельствуют о высокой эффективности стимуляции регенерации тканей, пораженных патологическими процессами, с помощью различных фармакологических веществ, стимулирующих функции прогениторных клеток за счет прямого воздействия на ключевые звенья внутриклеточной сигнальной трансдукции. При этом выявленные феномены могут послужить основой разработки в рамках предлагаемой нами принципиально новой концепции решения задач регенеративной медицины «Стратегии фармакологической регуляции внутриклеточной сигнальной трансдукции в прогениторных клетках», новых лекарственных средств, «мишенью» действия которых будут являться отдельные звенья (молекулы, вторичные мессенджеры) внутриклеточных путей передачи сигнала в прогениторных клетках различных классов.In general, the data presented indicate a high efficiency in stimulating the regeneration of tissues affected by pathological processes with the help of various pharmacological substances that stimulate the function of progenitor cells due to the direct effect on key links of intracellular signal transduction. Moreover, the revealed phenomena can serve as the basis for the development, within the framework of our proposed fundamentally new concept of solving the problems of regenerative medicine, “Strategies for the pharmacological regulation of intracellular signal transduction in progenitor cells”, new drugs whose “target” actions will be individual units (molecules, secondary messengers) intracellular signal transduction pathways in progenitor cells of various classes.
ЛитератураLiterature
1. Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., Зюзьков Г.Н. Гипоксия и система крови. - Томск: Изд-во Том. ун-та, 2006. - 142 с.1. Goldberg E.D., Dygay A.M., Zyuzkov G.N. Hypoxia and the blood system. - Tomsk: Publishing house Tom. University, 2006 .-- 142 p.
2. Дыгай A.M., Зюзьков Г.Н., Жданов В.В. и др. Методические рекомендации по изучению специфической активности средств для регенеративной медицины // Руководство по проведению доклинических исследований новых лекарственных средств. Часть первая / Под ред. А.Н. Миронова. - М.: Гриф и К, 2013. - С.776-787 (944 с.).2. Digay A.M., Zyuzkov G.N., Zhdanov V.V. and other guidelines for the study of the specific activity of funds for regenerative medicine // Guidelines for preclinical studies of new drugs. Part One / Ed. A.N. Mironova. - M.: Grif and K, 2013 .-- S.776-787 (944 p.).
3. Дыгай A.M., Зюзьков Г.Н. Фундаментальные аспекты перспективы использования нанотехнологичных модификаторов функций стволовых клеток в регенеративной медицине // Нанотехнологии и охрана здоровья. - 2012. - Том IV. - №2 (11). - С.30-38.3. Digay A.M., Zyuzkov G.N. Fundamental aspects of the prospect of using nanotechnological modifiers of stem cell functions in regenerative medicine // Nanotechnology and Health. - 2012. - Volume IV. - No. 2 (11). - S.30-38.
4. Дыгай A.M., Артамонов А.В, Бекарев А.А., Жданов В.В., Зюзьков Г.Н., Мадонов П.Г., Удут В.В. Нанотехнологии в фармакологии. - М.: Издательство РАМН, 2011. - 136 с.4. Digay A.M., Artamonov A.V., Bekarev A.A., Zhdanov V.V., Zyuzkov G.N., Madonov P.G., Udut V.V. Nanotechnology in pharmacology. - M.: Publishing House of the Russian Academy of Medical Sciences, 2011 .-- 136 p.
5. Зюзьков Г.Н., Данилец М.Г., Лигачева А.А. и др. Роль NF-kB-зависимого сигналинга в реализации ростового потенциала мезенхимальных клеток-предшественников в условиях in vitro // Бюл. эксперим. биол. и медицины. - 013. - №5. - С.682-684.5. Zyuzkov G.N., Danilets M.G., Ligacheva A.A. et al. Role of NF-kB-dependent signaling in realizing the growth potential of mesenchymal progenitor cells in vitro // Bull. an experiment. biol. and medicine. - 013. - No. 5. - S.682-684.
6. Зюзьков Г.Н., Жданов В.В., Данилец М.Г. и др. Участие цАМФ- и IKK-2-зависимых сигнальных путей в реализации ростового потенциала мезенхимальных прогениторных клеток // Бюл. эксперим. биол. и медицины. - 2013.- №8. - С.195-198.6. Zyuzkov G.N., Zhdanov V.V., Danilets M.G. et al. Participation of cAMP and IKK-2-dependent signaling pathways in realizing the growth potential of mesenchymal progenitor cells // Bull. an experiment. biol. and medicine. - 2013.- No. 8. - S. 195-198.
7. Зюзьков Г.Н., Данилец М.Г., Лигачева А.А. и др. Участие PI3K, МАРК ERK1/2 и p38 в реализации ростового потенциала мезенхимальных клеток-предшественников в условиях in vitro // Клеточные технологии в биологии и медицине. - 2013. - №4. - С.206-209.7. Zyuzkov G.N., Danilets M.G., Ligacheva A.A. et al. Participation of PI3K, MAPK ERK1 / 2 and p38 in realizing the growth potential of mesenchymal progenitor cells in vitro // Cellular Technologies in Biology and Medicine. - 2013. - No. 4. - S.206-209.
8. Новик А.А., Камилова Т.А., Цыган В.Н. Введение в молекулярную биологию канцерогенеза / Учебное пособие. - 2004, Изд-во «ГЭОТАР-МЕД». - 224 с.8. Novik A.A., Kamilova T.A., Gypsy V.N. Introduction to the molecular biology of carcinogenesis / Textbook. - 2004, Publishing House "GEOTAR-MED". - 224 p.
9. Руководство по проведению доклинических исследований новых лекарственных средств. Часть первая / Под ред. А.Н. Миронова. - М.: Гриф и К, 2013. - 944 с.9. Guidelines for preclinical studies of new drugs. Part One / Ed. A.N. Mironova. - M .: Grif and K, 2013 .-- 944 p.
10. Ситдикова Г.Ф. Газообразные посредники как эндогенные модуляторы освобождения медиатора в нервно-мышечном синапсе / Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук по специальности 03.00.13 - физиология, Казань, 2008. - 46 с.10. Sitdikova G.F. Gaseous mediators as endogenous modulators of mediator release in the neuromuscular synapse / Abstract of dissertation for the degree of Doctor of Biological Sciences in the specialty 03.00.13 - Physiology, Kazan, 2008. - 46 p.
11. Александрова А.Ю. Реорганизация актинового цитоскелета, лежащая в основе движения клеток Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук по специальности 03.03.04 - Клеточная биология, цитология, гистология, Москва, 2011 - 42 с.11. Alexandrova A.Yu. Reorganization of the actin cytoskeleton underlying cell movement. Abstract of dissertation for the degree of Doctor of Biological Sciences, specialty 03.03.04 - Cellular Biology, Cytology, Histology, Moscow, 2011 - 42 pp.
12. Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., Зюзьков Г.Н. и др. Патент (RU) на изобретение №2313361 «Средство, обладающее антидиабетической активностью», 2007 г. (опубл. 27.12.2007., Бюл. №36).12. Goldberg E.D., Dygay A.M., Zyuzkov G.N. and other Patent (RU) for the invention No. 2313361 "Tool having antidiabetic activity", 2007 (publ. 12/27/2007., Bull. No. 36).
Claims (8)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2013156908/15A RU2599289C2 (en) | 2013-12-20 | 2013-12-20 | Tissue regeneration stimulating agent |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2013156908/15A RU2599289C2 (en) | 2013-12-20 | 2013-12-20 | Tissue regeneration stimulating agent |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2013156908A RU2013156908A (en) | 2015-07-10 |
| RU2599289C2 true RU2599289C2 (en) | 2016-10-10 |
Family
ID=53538012
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2013156908/15A RU2599289C2 (en) | 2013-12-20 | 2013-12-20 | Tissue regeneration stimulating agent |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2599289C2 (en) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2665818C1 (en) * | 2017-05-16 | 2018-09-04 | Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Томский национальный исследовательский медицинский центр Российской академии наук" (Томский НИМЦ) | Method for stimulating granulocyte colony stimulating factor production by bone marrow cells in vitro |
-
2013
- 2013-12-20 RU RU2013156908/15A patent/RU2599289C2/en active
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| KERPEDJIEVA SS et al. EGFR ligands drive multipotential stromal cells to produce multiple gfowth factors and cytokines via early growth response-1. Stem Cells Dev. 2012 Sep 1;21(13):2541-51 Реферат [он-лайн] [найдено 23.09.2014] (Найдено из Интернет: www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22316125). НAM O et al. The role of microRNA-23b in the differentiation of MSC into chondrocyte by targeting protein kinase A signaling. Biomaterials. 2012 Jun;33(18):4500-7 Реферат [он-лайн] [найдено 23.09.2014] (Найдено из Интернет: www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22449550). ZYUKOV GN et al. Mechanisms of regeneratory effects of Baikal aconite diterpene alkaloids. Bull.Exp.Biol.Med. 2012 Oct;153(6):846-50 Реферат [он-лайн] [найдено 23.09.2014] (Найдено из Интернет: www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23113300). COMPOUND SUMMARY FOR: CID 449241 N-(2-(4-bromocinnamylamino)ethyl-5-isoquinolinesulfonamide Реферат [он-лайн] [найдено 23.09.2014] (Найдено из Интернет: www.pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/summary/summary.cgi?cid=449241&l * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2665818C1 (en) * | 2017-05-16 | 2018-09-04 | Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Томский национальный исследовательский медицинский центр Российской академии наук" (Томский НИМЦ) | Method for stimulating granulocyte colony stimulating factor production by bone marrow cells in vitro |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2013156908A (en) | 2015-07-10 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Khan et al. | Selective estrogen receptor modulators (SERMs) enhance neurogenesis and spine density following focal cerebral ischemia | |
| Roé et al. | Description and management of cutaneous side effects during cetuximab or erlotinib treatments: a prospective study of 30 patients | |
| RU2533458C2 (en) | Compositions containing berberine or its analogues for treating skin diseases related to rosacea or blush | |
| Brown et al. | Collagenase inhibitors in prevention of ulcers of alkali-burned cornea | |
| Ellington et al. | The effect of cannabinoids on capsaicin-evoked calcitonin gene-related peptide (CGRP) release from the isolated paw skin of diabetic and non-diabetic rats | |
| Hosford et al. | Differential effects mediated by GABAA receptors in thalamic nuclei in lh/lh model of absence seizures | |
| Güran et al. | Dextrose solution used for prolotherapy decreases cell viability and increases gene expressions of angiogenic and apopitotic factors | |
| Wang et al. | MicroRNA-21 silencing prolongs islet allograft survival by inhibiting Th17 cells | |
| Lyons et al. | Commercial amniotic membrane extract for treatment of corneal ulcers in adult horses | |
| Lee et al. | Antifibrotic effects of sakuraso-saponin in primary cultured pterygium fibroblasts in comparison with mitomycin C | |
| KR101799114B1 (en) | Method and compositions for increasing trichogenic potency of dermal cells | |
| RU2599289C2 (en) | Tissue regeneration stimulating agent | |
| US12233063B2 (en) | Compositions and methods for treating eye disorders | |
| US20200171021A1 (en) | Methods of Managing Conditioned Fear with Neurokinin Receptor Antagonists | |
| US11766467B2 (en) | Methods of treating wounds using cathepsin K inhibitors | |
| CN104902901A (en) | Treatment of hyperproliferative and pre-cancerous skin diseases using an inhibitor of CBP/catenin | |
| US9566262B2 (en) | Itch suppression by fucoxanthin | |
| WO2017209270A1 (en) | Activated t cell- and/or b cell-selective cell death inducer or cell death promoter comprising as active ingredient 25-hydroxycholesterol or cholesterol analogous thereto | |
| JP5697099B2 (en) | Pruritus inhibitor | |
| Matsuda et al. | Corneal endothelial healing rate and the effect of topical retinoic acid. | |
| Martin | Effect of topical vitamin A, antibiotic, mineral oil, and subconjunctival corticosteroid on corneal epithelial wound healing in the dog | |
| Guo et al. | Cholesterol promotes hair growth through activating sympathetic nerves and enhancing the proliferation of hair follicle stem cells | |
| EP1305016B1 (en) | Use of n-oleoylethanolamine for treating psoriasis | |
| WO2014159771A1 (en) | Prevention of rosacea inflammation | |
| CN110742876A (en) | Application of thymol in preparation of medicine for treating psoriasis |