RU2597978C2 - Материал для культур клеток, полученный из растений - Google Patents
Материал для культур клеток, полученный из растений Download PDFInfo
- Publication number
- RU2597978C2 RU2597978C2 RU2013122757/10A RU2013122757A RU2597978C2 RU 2597978 C2 RU2597978 C2 RU 2597978C2 RU 2013122757/10 A RU2013122757/10 A RU 2013122757/10A RU 2013122757 A RU2013122757 A RU 2013122757A RU 2597978 C2 RU2597978 C2 RU 2597978C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- cells
- hydrogel
- cnv
- nanofibers
- cell
- Prior art date
Links
- 239000000463 material Substances 0.000 title claims abstract description 76
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 title abstract description 48
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 261
- 239000000017 hydrogel Substances 0.000 claims abstract description 167
- 239000002121 nanofiber Substances 0.000 claims abstract description 110
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 claims abstract description 68
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 claims abstract description 68
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 claims abstract description 38
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims abstract description 36
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 32
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims abstract description 21
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 claims abstract description 12
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims abstract description 6
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims abstract description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 32
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 claims description 25
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 claims description 25
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 claims description 25
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 claims description 25
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 17
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims description 13
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 10
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 10
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 8
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 8
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 7
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 6
- 239000000654 additive Substances 0.000 claims description 5
- 238000010790 dilution Methods 0.000 claims description 5
- 239000012895 dilution Substances 0.000 claims description 5
- 238000010908 decantation Methods 0.000 claims description 4
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 claims description 4
- 238000004321 preservation Methods 0.000 claims description 4
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 claims description 3
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims description 3
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 claims 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 9
- 238000003860 storage Methods 0.000 abstract description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 3
- 238000009826 distribution Methods 0.000 abstract description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 35
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 23
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 18
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 17
- 238000012604 3D cell culture Methods 0.000 description 15
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 15
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 13
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 13
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 12
- 230000006870 function Effects 0.000 description 12
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 12
- 108010067306 Fibronectins Proteins 0.000 description 11
- 102000016359 Fibronectins Human genes 0.000 description 11
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 11
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 11
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 11
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 11
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 10
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 10
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 10
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 10
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 9
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 9
- 230000008569 process Effects 0.000 description 9
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 9
- 241000710137 Cucumber necrosis virus Species 0.000 description 8
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 8
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 7
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 7
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 7
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 7
- 210000001671 embryonic stem cell Anatomy 0.000 description 7
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 7
- 108010067520 RADA16-I Proteins 0.000 description 6
- PLXBWHJQWKZRKG-UHFFFAOYSA-N Resazurin Chemical compound C1=CC(=O)C=C2OC3=CC(O)=CC=C3[N+]([O-])=C21 PLXBWHJQWKZRKG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 6
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 6
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 6
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 6
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 6
- 239000004576 sand Substances 0.000 description 6
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 6
- 229920002749 Bacterial cellulose Polymers 0.000 description 5
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 5
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 5
- 239000005016 bacterial cellulose Substances 0.000 description 5
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 5
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 5
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 5
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 5
- 239000002023 wood Substances 0.000 description 5
- 108010084185 Cellulases Proteins 0.000 description 4
- 102000005575 Cellulases Human genes 0.000 description 4
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 4
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 4
- 238000003570 cell viability assay Methods 0.000 description 4
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 4
- 238000000604 cryogenic transmission electron microscopy Methods 0.000 description 4
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 4
- 230000007071 enzymatic hydrolysis Effects 0.000 description 4
- 238000006047 enzymatic hydrolysis reaction Methods 0.000 description 4
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 4
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 4
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 4
- 108010082117 matrigel Proteins 0.000 description 4
- 230000003534 oscillatory effect Effects 0.000 description 4
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 4
- 238000011160 research Methods 0.000 description 4
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 4
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 4
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 4
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 3
- 108010059892 Cellulase Proteins 0.000 description 3
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 3
- 229920001340 Microbial cellulose Polymers 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 3
- GTSMOYLSFUBTMV-UHFFFAOYSA-N ethidium homodimer Chemical compound [H+].[H+].[Cl-].[Cl-].[Cl-].[Cl-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2C(C)=[N+]1CCCNCCNCCC[N+](C1=CC(N)=CC=C1C1=CC=C(N)C=C11)=C1C1=CC=CC=C1 GTSMOYLSFUBTMV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 3
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 3
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 3
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 3
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 3
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 3
- GDOPTJXRTPNYNR-UHFFFAOYSA-N methyl-cyclopentane Natural products CC1CCCC1 GDOPTJXRTPNYNR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 3
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 3
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 3
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 3
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 3
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 3
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 3
- 238000010008 shearing Methods 0.000 description 3
- 239000010421 standard material Substances 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- VIEYMVWPECAOCY-UHFFFAOYSA-N 7-amino-4-(chloromethyl)chromen-2-one Chemical compound ClCC1=CC(=O)OC2=CC(N)=CC=C21 VIEYMVWPECAOCY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N Argon Chemical compound [Ar] XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 244000025254 Cannabis sativa Species 0.000 description 2
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000030453 Drug-Related Side Effects and Adverse reaction Diseases 0.000 description 2
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 2
- 101710112457 Exoglucanase Proteins 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 2
- 229920001046 Nanocellulose Polymers 0.000 description 2
- 241001602876 Nata Species 0.000 description 2
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 2
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 2
- 206010070863 Toxicity to various agents Diseases 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 239000002585 base Substances 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- 230000003592 biomimetic effect Effects 0.000 description 2
- BQRGNLJZBFXNCZ-UHFFFAOYSA-N calcein am Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC(CN(CC(=O)OCOC(C)=O)CC(=O)OCOC(C)=O)=C(OC(C)=O)C=C1OC1=C2C=C(CN(CC(=O)OCOC(C)=O)CC(=O)OCOC(=O)C)C(OC(C)=O)=C1 BQRGNLJZBFXNCZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000001516 cell proliferation assay Methods 0.000 description 2
- 238000001218 confocal laser scanning microscopy Methods 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 2
- 238000009509 drug development Methods 0.000 description 2
- 230000032050 esterification Effects 0.000 description 2
- 238000005886 esterification reaction Methods 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 description 2
- 210000005229 liver cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 2
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 2
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 2
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 description 2
- 230000000704 physical effect Effects 0.000 description 2
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 2
- 239000008104 plant cellulose Substances 0.000 description 2
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 2
- 229920000307 polymer substrate Polymers 0.000 description 2
- XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M propidium iodide Chemical compound [I-].[I-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CCC[N+](C)(CC)CC)=C1C1=CC=CC=C1 XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 210000000844 retinal pigment epithelial cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000000518 rheometry Methods 0.000 description 2
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 2
- DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M sodium pyruvate Chemical compound [Na+].CC(=O)C([O-])=O DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 230000003068 static effect Effects 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 2
- 239000004753 textile Substances 0.000 description 2
- 231100000041 toxicology testing Toxicity 0.000 description 2
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 2
- 230000029663 wound healing Effects 0.000 description 2
- KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N (2S,3S,4S,5R,6R)-6-[(2S,3R,4R,5S,6R)-3-Acetamido-2-[(2S,3S,4R,5R,6R)-6-[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-acetamido-2,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-2-carboxy-4,5-dihydroxyoxan-3-yl]oxy-5-hydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-3,4,5-trihydroxyoxane-2-carboxylic acid Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O3)C(O)=O)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)NC(C)=O)[C@@H](C(O)=O)O1 KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N 0.000 description 1
- VUZNLSBZRVZGIK-UHFFFAOYSA-N 2,2,6,6-Tetramethyl-1-piperidinol Chemical group CC1(C)CCCC(C)(C)N1O VUZNLSBZRVZGIK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012605 2D cell culture Methods 0.000 description 1
- 244000283070 Abies balsamea Species 0.000 description 1
- 235000007173 Abies balsamea Nutrition 0.000 description 1
- 244000198134 Agave sisalana Species 0.000 description 1
- 235000011624 Agave sisalana Nutrition 0.000 description 1
- 235000007319 Avena orientalis Nutrition 0.000 description 1
- 244000075850 Avena orientalis Species 0.000 description 1
- 235000017166 Bambusa arundinacea Nutrition 0.000 description 1
- 235000017491 Bambusa tulda Nutrition 0.000 description 1
- 235000018185 Betula X alpestris Nutrition 0.000 description 1
- 235000018212 Betula X uliginosa Nutrition 0.000 description 1
- 241000219495 Betulaceae Species 0.000 description 1
- 235000012766 Cannabis sativa ssp. sativa var. sativa Nutrition 0.000 description 1
- 235000012765 Cannabis sativa ssp. sativa var. spontanea Nutrition 0.000 description 1
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 229920003043 Cellulose fiber Polymers 0.000 description 1
- 208000017667 Chronic Disease Diseases 0.000 description 1
- 102000004266 Collagen Type IV Human genes 0.000 description 1
- 108010042086 Collagen Type IV Proteins 0.000 description 1
- 240000000491 Corchorus aestuans Species 0.000 description 1
- 235000011777 Corchorus aestuans Nutrition 0.000 description 1
- 235000010862 Corchorus capsularis Nutrition 0.000 description 1
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-CUHNMECISA-N D-Cellobiose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-CUHNMECISA-N 0.000 description 1
- 235000014466 Douglas bleu Nutrition 0.000 description 1
- 102000016942 Elastin Human genes 0.000 description 1
- 108010014258 Elastin Proteins 0.000 description 1
- 244000004281 Eucalyptus maculata Species 0.000 description 1
- 229920002683 Glycosaminoglycan Polymers 0.000 description 1
- 244000299507 Gossypium hirsutum Species 0.000 description 1
- 229920002488 Hemicellulose Polymers 0.000 description 1
- 240000000797 Hibiscus cannabinus Species 0.000 description 1
- 101001027128 Homo sapiens Fibronectin Proteins 0.000 description 1
- 240000005979 Hordeum vulgare Species 0.000 description 1
- 235000007340 Hordeum vulgare Nutrition 0.000 description 1
- 108010085895 Laminin Proteins 0.000 description 1
- 102000007547 Laminin Human genes 0.000 description 1
- 241000218652 Larix Species 0.000 description 1
- 235000005590 Larix decidua Nutrition 0.000 description 1
- 240000007472 Leucaena leucocephala Species 0.000 description 1
- 235000010643 Leucaena leucocephala Nutrition 0.000 description 1
- 235000004431 Linum usitatissimum Nutrition 0.000 description 1
- 240000006240 Linum usitatissimum Species 0.000 description 1
- 229920001410 Microfiber Polymers 0.000 description 1
- 240000000907 Musa textilis Species 0.000 description 1
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 1
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 1
- 244000082204 Phyllostachys viridis Species 0.000 description 1
- 235000015334 Phyllostachys viridis Nutrition 0.000 description 1
- 241000218657 Picea Species 0.000 description 1
- 235000008331 Pinus X rigitaeda Nutrition 0.000 description 1
- 241000018646 Pinus brutia Species 0.000 description 1
- 235000011613 Pinus brutia Nutrition 0.000 description 1
- 241000219000 Populus Species 0.000 description 1
- 241000183024 Populus tremula Species 0.000 description 1
- 240000001416 Pseudotsuga menziesii Species 0.000 description 1
- 235000005386 Pseudotsuga menziesii var menziesii Nutrition 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 240000000111 Saccharum officinarum Species 0.000 description 1
- 235000007201 Saccharum officinarum Nutrition 0.000 description 1
- 235000007238 Secale cereale Nutrition 0.000 description 1
- 244000082988 Secale cereale Species 0.000 description 1
- 240000000260 Typha latifolia Species 0.000 description 1
- 235000005324 Typha latifolia Nutrition 0.000 description 1
- 244000274883 Urtica dioica Species 0.000 description 1
- 235000009108 Urtica dioica Nutrition 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 1
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 1
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 241001148470 aerobic bacillus Species 0.000 description 1
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 1
- 239000002154 agricultural waste Substances 0.000 description 1
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 125000000129 anionic group Chemical group 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 229910052786 argon Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011425 bamboo Substances 0.000 description 1
- 108010047754 beta-Glucosidase Proteins 0.000 description 1
- 102000006995 beta-Glucosidase Human genes 0.000 description 1
- 239000013060 biological fluid Substances 0.000 description 1
- 238000004061 bleaching Methods 0.000 description 1
- DEGAKNSWVGKMLS-UHFFFAOYSA-N calcein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC(CN(CC(O)=O)CC(O)=O)=C(O)C=C1OC1=C2C=C(CN(CC(O)=O)CC(=O)O)C(O)=C1 DEGAKNSWVGKMLS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000009120 camo Nutrition 0.000 description 1
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 1
- 239000012598 cell culture matrix Substances 0.000 description 1
- 230000003915 cell function Effects 0.000 description 1
- 230000012292 cell migration Effects 0.000 description 1
- 238000002659 cell therapy Methods 0.000 description 1
- 238000012200 cell viability kit Methods 0.000 description 1
- 150000001773 cellobioses Chemical class 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 210000003850 cellular structure Anatomy 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 235000005607 chanvre indien Nutrition 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 230000002301 combined effect Effects 0.000 description 1
- 238000004624 confocal microscopy Methods 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 238000013270 controlled release Methods 0.000 description 1
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 1
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 108010007093 dispase Proteins 0.000 description 1
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012377 drug delivery Methods 0.000 description 1
- 238000007877 drug screening Methods 0.000 description 1
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 1
- 229920002549 elastin Polymers 0.000 description 1
- 230000007515 enzymatic degradation Effects 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 238000013401 experimental design Methods 0.000 description 1
- 239000003889 eye drop Substances 0.000 description 1
- 229940012356 eye drops Drugs 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 238000007380 fibre production Methods 0.000 description 1
- 108060002894 fibrillar collagen Proteins 0.000 description 1
- 102000013373 fibrillar collagen Human genes 0.000 description 1
- 102000034240 fibrous proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091005899 fibrous proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000002292 fluorescence lifetime imaging microscopy Methods 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- 238000001879 gelation Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 230000005484 gravity Effects 0.000 description 1
- 239000011121 hardwood Substances 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 239000011487 hemp Substances 0.000 description 1
- 206010073071 hepatocellular carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 231100000844 hepatocellular carcinoma Toxicity 0.000 description 1
- 238000013537 high throughput screening Methods 0.000 description 1
- 238000012188 high-throughput screening assay Methods 0.000 description 1
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 1
- 239000010903 husk Substances 0.000 description 1
- 229920002674 hyaluronan Polymers 0.000 description 1
- 229960003160 hyaluronic acid Drugs 0.000 description 1
- 239000000416 hydrocolloid Substances 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 238000010874 in vitro model Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 239000007972 injectable composition Substances 0.000 description 1
- 150000007529 inorganic bases Chemical class 0.000 description 1
- 102000006495 integrins Human genes 0.000 description 1
- 108010044426 integrins Proteins 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 1
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 1
- 231100001231 less toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000031142 liver development Effects 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 238000010907 mechanical stirring Methods 0.000 description 1
- 230000005541 medical transmission Effects 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 150000002739 metals Chemical class 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 239000013081 microcrystal Substances 0.000 description 1
- 210000001724 microfibril Anatomy 0.000 description 1
- 108700005457 microfibrillar Proteins 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 1
- 238000000465 moulding Methods 0.000 description 1
- 239000002159 nanocrystal Substances 0.000 description 1
- 239000002070 nanowire Substances 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 229960002378 oftasceine Drugs 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 238000002203 pretreatment Methods 0.000 description 1
- 238000004537 pulping Methods 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- 229910001415 sodium ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940054269 sodium pyruvate Drugs 0.000 description 1
- 239000011122 softwood Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 239000012128 staining reagent Substances 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 239000010902 straw Substances 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 230000002459 sustained effect Effects 0.000 description 1
- 238000013268 sustained release Methods 0.000 description 1
- 230000000930 thermomechanical effect Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 230000002110 toxicologic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000027 toxicology Toxicity 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 241001148471 unidentified anaerobic bacterium Species 0.000 description 1
- 238000009827 uniform distribution Methods 0.000 description 1
- 238000003828 vacuum filtration Methods 0.000 description 1
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 1
- 229920003169 water-soluble polymer Polymers 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/067—Hepatocytes
- C12N5/0671—Three-dimensional culture, tissue culture or organ culture; Encapsulated cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/0062—General methods for three-dimensional culture
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
- A61K47/26—Carbohydrates, e.g. sugar alcohols, amino sugars, nucleic acids, mono-, di- or oligo-saccharides; Derivatives thereof, e.g. polysorbates, sorbitan fatty acid esters or glycyrrhizin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
- A61K47/36—Polysaccharides; Derivatives thereof, e.g. gums, starch, alginate, dextrin, hyaluronic acid, chitosan, inulin, agar or pectin
- A61K47/38—Cellulose; Derivatives thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/06—Ointments; Bases therefor; Other semi-solid forms, e.g. creams, sticks, gels
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
- A61L27/14—Macromolecular materials
- A61L27/20—Polysaccharides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
- A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
- A61L27/3637—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix characterised by the origin of the biological material other than human or animal, e.g. plant extracts, algae
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
- A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
- A61L27/38—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
- A61L27/50—Materials characterised by their function or physical properties, e.g. injectable or lubricating compositions, shape-memory materials, surface modified materials
- A61L27/52—Hydrogels or hydrocolloids
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B82—NANOTECHNOLOGY
- B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
- B82Y5/00—Nanobiotechnology or nanomedicine, e.g. protein engineering or drug delivery
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08J—WORKING-UP; GENERAL PROCESSES OF COMPOUNDING; AFTER-TREATMENT NOT COVERED BY SUBCLASSES C08B, C08C, C08F, C08G or C08H
- C08J3/00—Processes of treating or compounding macromolecular substances
- C08J3/02—Making solutions, dispersions, lattices or gels by other methods than by solution, emulsion or suspension polymerisation techniques
- C08J3/03—Making solutions, dispersions, lattices or gels by other methods than by solution, emulsion or suspension polymerisation techniques in aqueous media
- C08J3/075—Macromolecular gels
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08L—COMPOSITIONS OF MACROMOLECULAR COMPOUNDS
- C08L1/00—Compositions of cellulose, modified cellulose or cellulose derivatives
- C08L1/02—Cellulose; Modified cellulose
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08L—COMPOSITIONS OF MACROMOLECULAR COMPOUNDS
- C08L97/00—Compositions of lignin-containing materials
- C08L97/02—Lignocellulosic material, e.g. wood, straw or bagasse
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/22—Processes using, or culture media containing, cellulose or hydrolysates thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
- C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
- C12N11/04—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier entrapped within the carrier, e.g. gel or hollow fibres
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
- C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
- C12N11/10—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a carbohydrate
- C12N11/12—Cellulose or derivatives thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/0068—General culture methods using substrates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0603—Embryonic cells ; Embryoid bodies
- C12N5/0606—Pluripotent embryonic cells, e.g. embryonic stem cells [ES]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0618—Cells of the nervous system
- C12N5/0621—Eye cells, e.g. cornea, iris pigmented cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/067—Hepatocytes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/067—Hepatocytes
- C12N5/0672—Stem cells; Progenitor cells; Precursor cells; Oval cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08J—WORKING-UP; GENERAL PROCESSES OF COMPOUNDING; AFTER-TREATMENT NOT COVERED BY SUBCLASSES C08B, C08C, C08F, C08G or C08H
- C08J2301/00—Characterised by the use of cellulose, modified cellulose or cellulose derivatives
- C08J2301/02—Cellulose; Modified cellulose
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08J—WORKING-UP; GENERAL PROCESSES OF COMPOUNDING; AFTER-TREATMENT NOT COVERED BY SUBCLASSES C08B, C08C, C08F, C08G or C08H
- C08J2389/00—Characterised by the use of proteins; Derivatives thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
- C12N2533/70—Polysaccharides
- C12N2533/78—Cellulose
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Dispersion Chemistry (AREA)
- Oral & Maxillofacial Surgery (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Transplantation (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Polymers & Plastics (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Botany (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Gynecology & Obstetrics (AREA)
- Reproductive Health (AREA)
- Inorganic Chemistry (AREA)
- Materials Engineering (AREA)
- Nanotechnology (AREA)
- Ophthalmology & Optometry (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Neurology (AREA)
Abstract
Предложен материал для культивирования или доставки эукариотических клеток. Материал содержит происходящие из растений механически дезинтегрированные целлюлозные нановолокна и/или их производные в форме гидрогеля или мембраны во влажном состоянии. Диаметр целлюлозных нановолокон или пучков нановолокон в целлюлозных нановолокнах и/или их производных меньше 1 мкм, предпочтительно - меньше 200 нм, более предпочтительно - меньше 100 нм. Данный материал получают путем смешивания происходящих от растений механически дезинтегрированных целлюлозных нановолокон и/или их производных с водой. Предложен также матрикс для культивирования или доставки клеток, который содержит живые клетки и указанный материал, образующий гидрогель, при этом клетки находятся в этом матриксе в виде трехмерной или двухмерной структуры. Для культивирования клеток осуществляют контакт полученных клеток с материалом для образования матрикса, в котором культивирование клеток протекает в виде трехмерной или двухмерной структуры. Предложено также применение указанного материала для лабораторных и/или промышленных целей в качестве среды или компонента среды для сохранения клеток in vitro. Группа изобретений обеспечивает стабильность клеток в матриксе, а также гомогенное распределение их в указанном матриксе. 6 н. и 16 з.п. ф-лы, 15 ил., 11 пр.
Description
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
Изобретение относится к композициям для культивирования и доставки клеток, содержащим целлюлозные нановолокна и/или их производные.
ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Здравоохранение является одной из наиболее активно разрабатываемых областей научных исследований. Необходимость открывать и разрабатывать дешевые и безопасные лекарственные средства постоянно растет. Огромное значение имеет возможность точного моделирования клеточной структуры определенной ткани или органа. Точное копирование системы in vivo в условиях in vitro может потребовать трехмерного роста клеток (3D). Перекрестная связь, возникающая между клетками в 3D культуре клеток, является имитацией роста клеток в физиологических условиях. Действительно, 3D культуры клеток приобрели значение в исследованиях, посвященных регенеративной медицине, лучшему пониманию хронических болезней и получению превосходной модельной системы in vitro для скрининга лекарственных средств и токсикологических анализов. Поэтому их появление было достаточно точно названо «новым измерением в биологии».
Проводятся интенсивные научные исследования с целью выявления и разработки «факторов и подложек», которые могут способствовать 3D росту клеток in vitro. В физиологических условиях клетки не только обмениваются информацией друг с другом, но и взаимодействуют с клеточной микросредой и экстраклеточным матриксом (ЭКМ), в котором они расположены. ЭКМ обеспечивает структурную поддержку клеток, а также участвует в передаче сигналов и определении судьбы клеток. ЭСМ преимущественно состоит из гликозаминогликанов и волокнистых белков, таких как коллаген, эластин, ламинин и фибронектин, которые самоорганизуются в нанофибриллярную сеть. Идеальная подложка для 3D роста клеток должна быть способной имитировать структурный компонент нативного ЭКМ, способствовать росту и сохранению клеток, содержать сеть взаимосвязанных пор достаточного размера для эффективной миграции клеток и переноса питательных веществ в клетки. По существу, механические и химические свойства подложки должны обеспечивать такую же функцию клеток, как в нативном состоянии.
Гидрогели, как синтетические, так и природные, оказались подходящими подложками для 3D культуры клеток. Сеть взаимосвязанных пор в гидрогелях обеспечивает удержание большого объема биологической жидкости, способствует транспортировке кислорода, питательных веществ и отходов. Кроме того, большинство гидрогелей могут формироваться при мягких цитосовместимых условиях, а их биологические свойства можно модулировать с использованием химии поверхностных явлений. Специально разработанные гидрогели с модифицированными механическими, химическими и биологическими свойствами потенциально могут имитировать ЭКМ, что определяет их пригодность для 3D клеточных культур. Коммерческими продуктами для 3D культивирования клеток являются, например, PuraMatrix™ (производства компании 3DM Inc.) и Matrigel (производства компании BD Biosciences). PuraMatrix™ - это гидрогель, состоящий из самоорганизующихся пептидных нановолокон, который напоминает структуру природного фибриллярного коллагена в ЭКМ с диаметром волокон, равным 5-10 нм. Он также имеет высокое содержание воды, в характерном случае - 99,5%. В публикациях US 7,449,180 и WO 2004/007683 описаны пептидные гидрогели. Matrigel - это гелеобразная смесь белков, секретируемых опухолевыми клетками мышей. Смесь напоминает сложную экстраклеточную среду, обнаруживаемую во многих тканях, и используется специалистами по биологии клетки в качестве подложки для культур клеток. MaxGel™ ЕСМ Matrix (производства компании Sigma-Aldrich), который содержит смесь компонентов ЭКМ человека, образует гель при температуре окружающей среды.
Бактериальную целлюлозу использовали для получения ранозаживляющих мембран и в качестве подложки для культур клеток. Ограничением использования бактериальной целлюлозы для культивирования клеток является внутренняя структура ферментированного материала; после культивирования бактериальная целлюлоза образует очень плотные мембраны на границе раздела «воздух-вода» в ферментере. Образующиеся мембраны являются слишком плотными для многих прикладных задач, связанных с 3D культивированием клеток, поэтому необходимы различные модификации для повышения их пористости, которая требуется для проникновения клеток и формирования клеточных кластеров.
Гидрогелевые материалы также широко использовали в других типах прикладных задач, связанных с культивированием клеток, где необходим гидрофильный опорный материал, например - гидроколлоиды агарового типа широко использовали для культивирования растительных клеток, бактерий и грибов для различных микробиологических целей.
В публикации US 5,254,471 описан носитель для культивирования клеток, изготовленный из ультратонких волокон. В публикации WO 2009/126980 описан гидрогель на основе целлюлозы, который содержит целлюлозу со средней степенью полимеризации в диапазоне от 150 до 6200.
Показано, что решения, соответствующие предшествующему уровню техники, были относительно неудовлетворительными для культивирования клеток. Все существующие методы и матриксы для 2D и 3D культур требуют использования химических веществ или соединений животного происхождения в средах из биологических материалов для сохранения и размножения клеток. Сохранение стволовых клеток является особенно трудной задачей, и не существует простых решений для получения матрикса, используемого с культуральной средой, который сохранял бы стволовые клетки в живом состоянии. Присутствие соединений животного происхождения в среде, окружающей культуру клеток, создает высокий риск иммунных реакций и различные проблемы с токсичностью, которая в конечном итоге убивает культивируемые клетки. Матриксы для клеточных культур, содержащие добавки животного происхождения, не пригодны для использования со стволовыми клетками, в частности, если стволовые клетки необходимо использовать для трансплантации тканей и тканевой технологии (инженерии). Кроме того, многие полимеры, предложенные для использования в среде для культивирования клеток, не выдерживают физиологическую температуру или являются токсичными для клеток.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Существует явная необходимость в усовершенствованном материале для культивирования клеток, который мог бы обеспечить соответствующую трех- или двухмерную основу для различных типов клеток. Такие функциональные 3D клеточные модели можно использовать в качестве средств для обнаружения лекарственных средств вместо экспериментов на животных, и они являются более совершенными, чем используемые в настоящее время 2D клеточные модели. Также очень желателен перенос культивированных клеток, например, если целью является пересадка ткани или клеточная терапия. Возможность переноса культивированных кластеров клеток в 3D матриксе желательна при разработке различных клеточных моделей in vitro. Существующие биоматериалы с 3D культурами клеток не позволяют перемещать гидрогелевый матрикс с помощью иглы без существенного повреждения культивируемых клеток.
Поэтому задачей настоящего изобретения является обеспечение нового подхода, позволяющего по меньшей мере частично решить или уменьшить вышеуказанные проблемы, существовавшие на предшествующем уровне техники. Задачи настоящего изобретения решены за счет композиции для культивирования или доставки клеток, содержащей целлюлозные нановолокна или их производные, которая имеет признаки, указанные в независимых пунктах формулы изобретения. Предпочтительные варианты осуществления настоящего изобретения описаны в зависимых пунктах формулы изобретения.
Настоящее изобретение основано на использовании целлюлозных нановолокон и/или их производных в 2D или 3D матриксе для культур клеток. Настоящее изобретение обеспечивает использование целлюлозных нановолокон и/или их производных в матриксе для культур клеток. Использование целлюлозных нановолокон и/или их производных в качестве 2D или 3D матрикса для культур клеток исключает необходимость использования добавок животного происхождения для ускорения и обеспечения размножения клеток на матриксе, содержащем целлюлозные нановолокна и/или их производные.
Авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что полученный из растений гидрогель на основе целлюлозных нановолокон (ЦНВ) можно использовать без каких-либо модификаций в качестве биомиметика ЭКМ человека для 3D культур клеток. Данные о пролиферации и жизнеспособности клеток подтверждают, что ЦНВ-гидрогель является оптимальным биоматериалом для 3D подложек для клеток, позволяющим проводить высокопроизводительные скрининговые анализы с использованием функциональных клеток при разработке лекарственных средств, при исследовании токсичности лекарственных средств, в регенеративной медицине, а также для доставки клеток in vivo.
Авторы настоящего изобретения впервые описали физические свойства и свойства биосовместимости ЦНВ-гидрогеля, полученного из растений. Растительную целлюлозу широко используют в целлюлозно-бумажной и текстильной промышленности, и она широко распространена в природе. Нативный целлюлозный нановолоконный гидрогель является непрозрачным. Химическая модификация целлюлозной массы перед ее механической дезинтеграцией позволяет получить оптически прозрачные гидрогели.
Настоящее изобретение основано на экспериментальных исследованиях гидрогелей, состоящих из целлюлозных нановолокон (ЦНВ), которые диспергированы в водной среде. Нановолокна являются высокогидрофильными из-за наличия гидроксильных функциональных групп в полимерах целлюлозы и частично покрыты гемицеллюлозными полисахаридами.
Соответственно, настоящее изобретение в качестве первого аспекта обеспечивает композицию для культивирования или доставки клеток, содержащую целлюлозные нановолокна и/или их производные, причем целлюлозные нановолокна имеют форму гидрогеля или мембраны.
Важным преимуществом настоящего изобретения является то, что клетки могут сохраняться (и пролиферировать) на или в среде из биоматериала, не содержащей во внеклеточной среде химических веществ, происходящих от животного или человека. Клетки равномерно диспергированы на или в среде (матриксе), содержащей целлюлозные нановолокна или их производные. Клетки распределяются на или в среде, начинают пролиферировать, и клеточные кластеры начинают спонтанно расти без аккумуляции клеток на дне планшета для культивирования клеток. Гомогенное распределение клеток в целлюлозных нановолокнах или их производных является предпосылкой функционирования биоматериала в качестве 3D среды для культивирования клеток.
Другими преимуществами настоящего изобретения являются следующие: целлюлозные нановолокна и/или их производные являются инертными и не создают флуоресцирующего фона. Среды, содержащие целлюлозные нановолокна или их производные, можно вводить посредством инъекции. Инъецируемость объясняется их реологическими свойствами. Инъекцию можно осуществить таким образом, что клетки остаются стабильными внутри матрикса и гомогенно распределенными в матриксе после инъекции.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ
Фиг.1 изображает крио-ТЭМ снимки гидрогелей на основе целлюлозных нановолокон. Нативный ЦНВ-гидрогель изображен слева (А), а прозрачный ЦНВ-гидрогель - справа (В).
Фиг.2 демонстрирует жизнеспособность клеток HepG2 в коммерческих материалах для культивирования клеток [MaxGel™ (Sigma-Aldrich), HydroMatrix™ (Sigma-Aldrich) и PuraMatrix™ (3DM Inc.), в двух других материалах на основе целлюлозных нановолокон (нативный ЦНВ-гидрогель и прозрачный ЦНВ-гидрогель) и в ЦНВ-гидрогеле, в который добавлен фибронектин (ФН). В ходе анализа пролиферации с использованием Набора для анализа жизнеспособности клеток AlamarBlue™ клетки культивировали в течение 48 часов, а контрольные клетки культивировали в одинаковых условиях на полимерной поверхности.
Фиг.3 демонстрирует жизнеспособность клеток ARPE-19 в нативном ЦНВ-гидрогеле после переноса клеток иглами для шприца различного размера. Жизнеспособность представлена как относительная интенсивность флуоресценции.
Фиг.4 демонстрирует диффузию декстранов с различной молекулярной массой (20 кДа, 70 кДа и 250 кДа) через 1%-ный нативный гидрогель на основе целлюлозных нановолокон.
Фиг.5 представляет светомикроскопическое изображение клеток ARPE-19 на нативной ЦНВ-мембране. ЦНВ-мембрана поддерживает рост клеток в верхней части снимка, в нижней части снимка клетки растут на полимерной подложке для культивирования клеток. Увеличение 20×.
Фиг.6 представляет конфокально-микроскопические изображения срезов клеток HepG2 на полимерной подложке (A) для культивирования клеток и в нативном гидрогеле (B) на основе целлюлозных нановолокон.
Фиг.7 демонстрирует вязкоупругие свойства 0,5%-ного ЦНВ-гидрогеля, определенные посредством динамических осцилляторных реологических измерений. Показаны частотная зависимость G' (модуля накопления) и G'' (модуля потерь) 0,5%-ного нативного ЦНВ-гидрогеля.
Фиг.8 демонстрирует вязкость 0,5%-ных ЦНВ-гидрогелей как функцию приложенного сдвигающего напряжения по сравнению с 0,5%-ным раствором водорастворимого полимера полиакриламида (5000 кДа) и КМЦ (250 кДа).
Фиг.9 демонстрирует вязкость 0,5%-ных ЦНВ-гидрогелей как функцию измеренной скорости сдвига по сравнению с 0,5%-ным раствором полиакриламида и КМЦ. Характерные зоны скорости сдвига при различных физических процессах отмечены на рисунке стрелками.
Фиг.10 является схематическим изображением ЦНВ-гидрогеля, содержащего клетки, который течет в игле. Область высокой скорости сдвига (низкой вязкости) расположена на поверхности раздела «гель-игла», а область низкой скорости сдвига (очень высокой вязкости) - в центре иглы.
Фиг.11 демонстрирует изменение скорости сдвига и вязкости, когда 0,7%-ный ЦНВ-гель сдвигают в реометре с системой концентрических цилиндров при постоянном напряжении, равном 40 Па.
Фиг.12 демонстрирует восстановление структуры дисперсии в 0,7%-ном нативном ЦНВ-гидрогеле после сдвига с высокой скоростью сдвига по сравнению с осторожным перемешиванием стеклянной палочкой.
Фиг.13 демонстрирует стабильность двух суспензий песка в 0,5%-ном нативном ЦНВ-гидрогеле (верхний ряд) и в 0,5%-ном прозрачном ЦНВ-гидрогеле (нижний ряд) в течение периода, равного 17 дням. Был использован песок, соответствующий стандарту CEN (EN 196-1), со средним размером частиц, равным 1-2 мм и 2-3 мм. Образцы хранили при комнатной температуре.
Фиг.14 демонстрирует влияние ферментативного гидролиза на способность гелей на основе целлюлозных нановолокон к образованию суспензий. Был использован песок, соответствующий стандарту CEN (EN 196-1), со средним размером частиц, равным 1-2 мм.
Фиг.15 представляет конфокально-микроскопическое изображение прогениторных клеток печени, полученных из эмбриональных стволовых клеток человека, которые погружены в нативный ЦНВ-гидрогель. Длина измерительной линии: 70 мкм.
СВЕДЕНИЯ, ПОДТВЕРЖДАЮЩИЕ ВОЗМОЖНОСТЬ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение относится к композиции для культивирования или доставки клеток, содержащей целлюлозные нановолокна и/или их производные, причем целлюлозные нановолокна или их производные имеют форму гидрогеля или мембраны. Целлюлозные нановолокна или их производные можно получить из материала, не происходящего от животных, например - из сырьевого материала, содержащего растительный материал.
Если в явном виде не указано иное, то термины, которые использованы в описании и формуле изобретения, имеют значения, обычно используемые в области культивирования клеток. Более конкретно, следующие термины имеют значения, приведенные ниже.
Термин «композиция для культивирования или доставки клеток» относится к материалу, содержащему целлюлозные нановолокна или производные целлюлозных нановолокон, который используют в качестве среды для культивирования клеток или для доставки клеток. Эту композицию можно также использовать для переноса клеток или кластеров клеток. Целлюлозные нановолокна могут находиться в форме гидрогеля или мембраны. Композиция может дополнительно содержать различные добавки, такие как особые компоненты экстраклеточного матрикса, сыворотку, факторы роста и белки.
Термин «целлюлозный сырьевой материал» относится к любому источнику целлюлозного сырьевого материала, который может быть использован для получения целлюлозной массы, рафинированной целлюлозной массы или целлюлозных нановолокон. Сырьевой материал может иметь в основе любой растительный материал, содержащий целлюлозу. Растительным материалом может быть древесина. Древесина может быть получена от деревьев с мягкой древесиной, таких как ель, сосна, пихта, лиственница, дугласова пихта или хемлок, или от деревьев с твердой древесиной, таких как береза, осина, тополь, ольха, эвкалипт или акация, или быть смесью мягкой древесины и твердой древесины. Недревесный материал может происходить из сельскохозяйственных отходов, трав или других растительных веществ, таких как солома, листья, кора, семена, шелуха, цветки, растения или плоды хлопчатника, кукурузы, овса, ржи, ячменя, риса, льна, конопли, манильской конопли, сизалевой агавы, джута, китайской крапивы, кенафа, сахарного тростника, бамбука или камыша.
Термин «целлюлозная масса» относится к целлюлозным волокнам, которые выделены из любого целлюлозного сырьевого материала с использованием химических, механических, термомеханических или химикотермомеханических процессов варки целлюлозы. Обычно диаметр волокон лежит в диапазоне от 15 до 25 мкм, а их длина превышает 500 мкм, но настоящее изобретение не ограничено этими параметрами.
Целлюлоза в настоящем изобретении структурно является целлюлозой I типа.
Термин «целлюлозное нановолокно» относится к совокупности выделенных целлюлозных нановолокон (ЦНВ) или пучков нановолокон, полученных из целлюлозного сырьевого материала или целлюлозной массы. Нановолокна в характерном случае имеют большое характеристическое отношение: их длина может превышать один микрометр, тогда как среднечисловой диаметр обычно меньше 200 нм. Диаметр пучков нановолокон может быть и большим, но обычно он меньше 1 мкм. Самые мелкие нановолокна сходны с так называемыми элементарными фибриллами, которые обычно имеют диаметр в диапазоне от 2 до 12 нм. Размеры фибрилл или пучков фибрилл зависят от сырьевого материала и способа дезинтеграции. Целлюлозные нановолокна могут также содержать некоторое количество гемицеллюлоз; их содержание зависит от растительного источника.
Механическую дезинтеграцию целлюлозных нановолокон из целлюлозного сырьевого материала, целлюлозной массы или рафинированной целлюлозной массы осуществляют с использованием подходящего оборудования, например - рафинатора, дефибратора, гомогенизатора, аппарата для получения коллоидной целлюлозы, фрикционного дефибратора, ультразвукового аппарата, флюидизатора, например - микрофлюидизатора, макрофлюидизатора или гомогенизатора флюидизирующего типа. «Целлюлозные нановолокна» предпочтительно являются механически дезинтегрированным материалом.
«Целлюлозные нановолокна» или «целлюлозные нановолокна и/или их производные» могут также быть любыми химически или физически модифицированными производными целлюлозных нановолокон или пучков нановолокон. Химическая модификация может быть основана, например, на реакциях карбоксиметилирования, окисления, например - окисления с использованием TEMPO (2,2,6,6-тетраметилпиперидин-1-оксила), эстерификации (образования сложного эфира) и этерификации (образования простого эфира) молекул целлюлозы. Модификация может быть также осуществлена посредством физической адсорбции анионных, катионных или неионногенных веществ или любой их комбинации на поверхности целлюлозы. Описанную модификацию можно осуществить до, после или во время получения целлюлозных нановолокон. Некоторые модификации могут привести к получению ЦНВ-материалов, способных разлагаться в организме человека.
Целлюлозный сырьевой материал, например - целлюлозную массу, перед механической дезинтеграцией предпочтительно предварительно обрабатывают кислотой или щелочью. Предварительную обработку проводят, подвергая целлюлозную массу обработке кислотой, предпочтительно - соляной кислотой, для удаления положительно заряженных ионов, имеющих заряд больше +1, с последующей обработкой неорганическим основанием, содержащим положительно заряженные ионы с зарядом +1, предпочтительно - NaOH, так что ионы Na+ замещают ранее присутствовавшие ионы. Такая предварительная обработка придает «целлюлозным нановолокнам» превосходные гелеобразующие свойства и прозрачность. Такой предварительно обработанный продукт называют прошедшими кислотно-щелочную обработку или ионозамещенными «целлюлозными нановолокнами».
Микробиологическая чистота «целлюлозных нановолокон» важна для качества клеточных культур. Поэтому «целлюлозные нановолокна» перед экспериментами с клеточными культурами стерилизуют в форме гидрогеля или в форме мембраны. Кроме того, важно минимизировать микробное загрязнение продукта до и во время получения волокон. Перед получением волокон предпочтительно асептически получить целлюлозную массу с целлюлозно-бумажного завода непосредственно после стадии отбеливания, пока масса еще остается стерильной.
Существует несколько широко используемых синонимов для целлюлозных нановолокон. Например: наноцеллюлоза, нанофибриллированная целлюлоза (ЦНФ), нанофибриллярная целлюлоза, целлюлозное нановолокно, целлюлоза, фибриллированная на наноуровне, микрофибриллярная целлюлоза, микрофибриллированная целлюлоза (ЦНФ) или целлюлозные микрофибриллы. Целлюлозные нановолокна, полученные с использованием некоторых микроорганизмов, также имеют различные синонимы, такие как бактериальная целлюлоза, микробная целлюлоза (МЦ), биоцеллюлоза, "nata de coco" (NDC) или "coco de nata".
Целлюлозные нановолокна, описанные в настоящем изобретении, не являются тем материалом, который называют целлюлозными вискерами, которые также известны под названиями: целлюлозные нановискеры, целлюлозные нанокристаллы, целлюлозные наноиглы, игольчатые микрокристаллы целлюлозы или целлюлозные нанонити. В некоторых случаях для обоих материалов используют одинаковую терминологию, например - в работе Kuthcarlapati et al. (Metals Materials and Processes 20(3):307-314, 2008), в которой исследованный материал был назван «целлюлозными нановолокнами», хотя они явно имели в виду целлюлозные нановискеры. Обычно эти материалы не имеют аморфных сегментов по длине волокнистой структуры, как целлюлозные нановолокна, что приводит к более жесткой структуре. Целлюлозные вискеры также короче, чем целлюлозные нановолокна; обычно их длина меньше одного микрометра.
Размеры отдельных целлюлозных нановолокон близки к указанным выше размерам коллагеновых волокон в ЭКМ, то есть 4-10 нм. Поэтому гидрогели на основе ЦНВ можно использовать в качестве 3D матрикса для культур клеток.
В экспериментах с клеточными культурами согласно настоящему изобретению было использовано два вида целлюлозных нановолокон: непрозрачные нативные ЦНВ и оптически прозрачные ЦНВ, которые представляли собой целлюлозу, окисленную с использованием TEMPO. Подробное описание материалов приведено в разделе «Описание примеров осуществления изобретения».
Термин «гидрогель на основе целлюлозных нановолокон» относится к водной дисперсии целлюлозных нановолокон.
Термин «мембрана из целлюлозных нановолокон» относится к влажной или сухой листовой структуре из целлюлозных нановолокон. Мембраны обычно получают посредством фильтрации разбавленной дисперсии целлюлозных нановолокон с использованием аппарата для вакуумной фильтрации с подходящим фильтром. Также для получения мембранных структур можно использовать формование из растворителя. Полученную мембрану можно использовать сразу же во влажном состоянии или высушить перед использованием.
Целлюлозные нановолокна или их производные согласно настоящему изобретению могут содержать химически или физически модифицированные производные целлюлозных нановолокон или пучков нановолокон.
Композиция для культивирования клеток или доставки клеток согласно настоящему изобретению может дополнительно содержать подходящие добавки, выбранные из группы, состоящей из специальных компонентов экстраклеточного матрикса, сыворотки, факторов роста и белков.
Настоящее изобретение также относится к матриксу для культивирования клеток или доставки клеток, который содержит живые клетки и композицию для культивирования клеток или доставки клеток, образующую гидрогель, причем клетки находятся в матриксе в виде трехмерной или двумерной структуры.
Клетками могут быть любые клетки. Любая эукариотическая клетка, например - животные клетки, растительные клетки или клетки грибов, входит в объем настоящего изобретения, также как и прокариотические клетки, такие как бактериальные клетки.
В зависимости от клеточной линии эксперименты проводят с использованием 2D или 3D матриксов, то есть либо клетки культивируют на ЦНВ-мембранах или ЦНВ-гелях, либо клетки равномерно диспергируют в ЦНВ гидрогелях или ЦНВ-мембранах. Конкретные примеры осуществления настоящего изобретения показывают, что спонтанно растущие клетки пигментного эпителия сетчатки (ARPE-19) образуют монослой, тогда как клетки гепатоклеточной карциномы человека (HepG2) образуют либо монослой, либо колонии клеток.
Клетки можно обнаружить с использованием любого средства обнаружения или красителя, известного в данной области техники.
Настоящее изобретение также относится к способу получения композиции согласно настоящему изобретению, включающему стадии получения целлюлозных нановолокон и/или их производных; необязательно - смешивания целлюлозных нановолокон и/или их производных с водой; и переноса или помещения целлюлозных нановолокон и/или их производных или полученной смеси в подходящую среду для культивирования или доставки клеток.
Гидрогели или мембраны на основе целлюлозных нановолокон или их производных или композицию согласно настоящему изобретению можно использовать в качестве материала для доставки клеток.
Гидрогели или мембраны на основе целлюлозных нановолокон или их производных или композицию для культивирования клеток или доставки клеток согласно настоящему изобретению можно использовать для доставки материала для клинического использования.
Настоящее изобретение относится к микробиологическому использованию целлюлозных нановолокон или их производных или композиции согласно настоящему изобретению для лабораторных и/или промышленных задач в качестве среды или компонента среды для сохранения клеток in vitro.
Композицию, содержащую целлюлозные нановолокна или их производные, можно использовать для иммобилизации клеток или ферментов.
Настоящее изобретение также относится к способу культивирования клеток, который включает стадии получения клеток; приведения в контакт клеток с композицией для культивирования клеток, содержащей целлюлозные нановолокна или их производные, с получением матрикса; и культивирования клеток в матриксе с получением трехмерной или двумерной структуры.
Настоящее изобретение также относится к композиции, способу или применению в случае, когда клетки являются эукариотическими клетками.
Настоящее изобретение также относится к композиции, способу или применению в случае, когда клетки являются прокариотическими клетками. Прокариотическими клетками являются микроорганизмы, такие как аэробные или анаэробные бактерии, вирусы или грибы, такие как дрожжевые и плесневые грибы.
Настоящее изобретение также относится к композиции, способу или применению в случае, когда клетки являются стволовыми клетками.
Удаление целлюлозных нановолокон можно произвести, например, с помощью ферментов, осуществив ферментативную деградацию молекул целлюлозы. Подходящими ферментами являются, например, коммерчески доступные целлюлазы. Культивируемые клеточные линии могут также быть модифицированы посредством генетической инженерии так, чтобы они выделяли необходимый белок-фермент в культуральную среду.
Настоящее изобретение также относится к способу удаления целлюлозных нановолокон или их производных из материала для роста клеток или культивирования клеток, который включает стадии получения материала, содержащего среду для роста клеток и клетки и, необязательно, медикамент; разбавления этого материала водной или неводной жидкостью; и удаления целлюлозных нановолокон посредством декантации. Умеренное центрифугирование можно использовать для осаждения клеток и агрегатов клеток перед декантацией.
Авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что ЦНВ-гидрогель, полученный из растений, можно использовать без каких-либо модификаций в качестве биомиметика ЭКМ человека для 3D культивирования клеток. Данные о пролиферации и жизнеспособности клеток свидетельствуют о том, что ЦНВ-гидрогель является оптимальным материалом для 3D-подложек для клеток, используемых для проведения на функциональных клетках высокопроизводительных скрининговых анализов при разработке лекарственных средств, при исследовании токсичности лекарственных средств и в регенеративной медицине, а также для доставки клеток in vivo.
Настоящее изобретение впервые описывает физические свойства ЦНВ-гидрогелей, полученных из растений, и их биосовместимость. Растительную целлюлозу широко используют в целлюлозно-бумажной и текстильной промышленности, и она широко распространена в природе. Нативный целлюлозный нановолоконный гидрогель является непрозрачным. Химическая модификация целлюлозной массы перед ее механической дезинтеграцией позволяет получить оптически прозрачные гидрогели.
Целлюлозные нановолокна согласно настоящему изобретению можно использовать в форме гидрогеля или влажной или сухой мембраны. Прочность ЦНВ-гидрогеля легко можно изменить посредством разбавления. Целлюлозные нановолокна или их производные, обладающие сходными свойствами, не токсичны для клеток.
Если сравнивать гидрогели на основе целлюлозных нановолокон с УФ-сшиваемыми гидрогелями дл культур клеток, такими как гидрогели на основе гиалуроновой кислоты или ПЭГ, то ЦНВ-материалы считаются гораздо менее токсичными. В УФ-сшиваемых гелях для инициации гелеобразования необходимо использовать вредные фотоинициаторы, тогда как ЦНВ-гидрогели образуются спонтанно. Нековалентный характер ЦНВ-гидрогелей обеспечивает также возможность регулирования их пористости посредством разбавления.
Клетки равномерно распределяются в гидрогелях на основе целлюлозных нановолокон и могут автоматически начать делиться и разрастаться с образованием 3D-кластеров без оседания на дно планшета для культивирования клеток. Все используемые в настоящее время коммерческие среды для 3D-культур клеток требуют добавления пептида адгезии для того, чтобы клетки могли сформировать 3D-структуру на планшете для культивирования клеток.
Целлюлозные нановолокна согласно настоящему изобретению или их производные можно использовать без пептида адгезии. Клетки прикрепляются к планшету и спонтанно равномерно распределяются в гидрогеле на основе целлюлозных нановолокон. Клетки образуют гомогенную суспензию в непрерывной фазе благодаря механической поддержке, обеспечиваемой целлюлозными нановолокнами. Достаточно высокий предел текучести стабилизирует клетки и растущие кластеры клеток, препятствуя их седиментации.
Гидрогели на основе целлюлозных нановолокон растительного происхождения функционируют без белка адгезии и/или искусственной пористости, тогда как бактериальные целлюлозные нановолокна требуют белка адгезии. Бактериальную целлюлозу используют непосредственно после ферментации, и в этом случае образующаяся мембранная структура является гораздо более плотной, чем гидрогель согласно настоящему изобретению, то есть гидрогель из целлюлозных нановолокон. Поэтому способы согласно предшествующему уровню техники требуют дополнительных процессов для придания гидрогелевому матриксу большей пористости.
Плотность среды для культивирования клеток, содержащей целлюлозные нановолокна, можно отрегулировать, не влияя на свойства культуры клеток. Целлюлозные нановолокна, происходящие от бактерий, также являются более толстыми, чем целлюлозные нановолокна из других источников, и поэтому они не являются свободно модифицируемыми для культивирования клеток.
Клетки растут в 3D-матриксе или на матриксе. Этот материал может быть инъецируемым или представлять собой плоскую мембрану с соответствующей топологией поверхности.
Свойства ЦНВ близки к оптимальным для 3D-культивирования клеток: прозрачные, не токсичные, высоковязкие, с высокой способностью к образованию суспензии, с высоким удержанием воды, с хорошей механической адгезией, не животного происхождения, по размерам напоминают ЭКМ, не чувствительны к солям, температуре или pH, не разлагаются, не автофлуоресцируют. ЦНВ обеспечивают пренебрежимо низкий флуоресцентный фон благодаря химической структуре материала. Кроме того, ЦНВ-гель не токсичен для клеток.
Клетки можно культивировать или выращивать на ЦНВ-гелях в течение длительного времени, например - в течение 2-7 дней или даже дольше. Клетки можно также культивировать или только суспендировать в гидрогеле в течение короткого времени, например - от нескольких минут до нескольких часов. Клетки используют наноцеллюлозные волокна как подложку/опору для роста, являющуюся платформой. Клетки образуют кластеры, что свидетельствует о пригодности целлюлозных нановолокон для использования в качестве подложки для 3D-культур клеток. Клетки растут в виде слоев или клеточных агрегатов на ЦНВ-геле или внутри него, в зависимости от метода нанесения и типа клеток.
Нетоксичный ЦНВ-гидрогель является таким же хорошим ЭКМ для исследованных клеток, как MaxGel™ на основе ЭКМ человека. Жизнеспособность клеток даже выше, чем в PuraMatrix™ или HydroMatrix™. В ЦНВ-гидрогели не добавляют компоненты ЭКМ человека или животных. Однако добавление фибронектина или коллагена IV в системы на основе ЦНВ в некоторых случаях может быть полезным. Судя по результатам исследования диффузии, ЦНВ-гидрогель является высоко проницаемым и способствует обмену кислорода, питательных веществ и водорастворимых метаболитов в клетках.
Криотрансмиссионная электронная микроскопия демонстрирует, что ЦНВ-гидрогель состоит из смеси отдельных целлюлозных нанофибрилл и пучков волокон. Размеры ЦНВ близки к размерам нативного коллагена человека, который является природным компонентом ЭКМ и обычно используется в качестве опоры для клеток. Прочность (упругость) ЦНВ-гидрогеля остается примерно постоянной в диапазоне частот от 0,01 до 1 Гц. Реологические данные показывают сдвиговую вязкость порядка нескольких сотен килопаскаль в покое (при низком сдвиговом напряжении), которая снижается до нескольких паскаль при сдвиговом напряжении, равном одному паскалю. Такое поведение уникально для гидрогелей из биоматериалов. Оно обеспечивает исключительно высокую суспендирующую способность и опору для клеток, а благодаря разжижению при сдвиге обеспечивает легкое дозирование и инъецирование клеток в ЦНВ-гидрогеле независимо от размера используемых игл; такого поведения ранее не было у других гидрогелей из биоматериалов для культивирования клеток. Механические свойства упругости и жесткости ЦНВ-гидрогелей являются оптимальными для роста 3D-культур клеток и инъектирования клеток.
Преимуществом настоящего изобретения является то, что размеры фибриллярной сети из целлюлозных нановолокон или их производных очень близки к размерам природной ЭКМ-сети из коллагеновых нановолокон. Кроме того, целлюлозные нановолокна или их производные являются материалом не животного происхождения, то есть отсутствует риск передачи болезней. В настоящее время большинство коммерческих продуктов получают от животных. Кроме того, изобретение обеспечивает возможности регулировать физическую форму, так как можно использовать ЦНВ-материалы от гидрогелей до мембран.
Инъектируемый гидрогель образует поддерживающий матрикс вокруг клеток благодаря очень высокому пределу текучести. ЦНВ-мембраны являются прозрачными и высокопористыми. Массовое производство их является легким по сравнению с альтернативными вариантами.
Нативные целлюлозные нановолокна не токсичны для клеток. Пролиферация клеток почти в два раза выше в случае целлюлозных нановолокон или их производных по сравнению с контролем (только клетки). Клетки можно контролировать на ЦНВ-гидрогелях в течение длительного времени (например, в течение 2-7 дней). Клетки используют матрикс из целлюлозных нановолокон в качестве платформы для роста. Клетки образуют кластеры, что подтверждает пригодность целлюлозных нановолокон или их производных для использования в качестве подложки для 3D культур клеток. Клетки растут внутри ЦНВ-геля в виде слоев. Целлюлозные нановолокна или их производные создают пренебрежимо малый флуоресцирующий фон. Гидрогель на основе целлюлозных нановолокон обладает оптимальной упругостью, прочностью, сдвиговым напряжением, механической адгезией и пористостью для использования в качестве матрикса для 3D и 2D культур клеток.
В водной среде целлюлозные нановолокна образуют непрерывную гидрогелевую сеть из диспергированных нановолокон или пучков нановолокон. Гель образуют высокогидратированные фибриллы, которые перепутываются друг с другом, даже при очень низких концентрациях. Фибриллы могут также взаимодействовать через водородные связи. Макроскопическая структура легко разрушается при механическом взбалтывании, то есть гель начинает течь при повышенном сдвиговом напряжении. Применение гелей на основе целлюлозных нановолокон и/или их производных в качестве материала для культивирования клеток ранее описано не было.
Применения настоящего изобретения включают получение материала для культивирования клеток для биотехнологических исследований. Среды для роста клеток или культивирования клеток, содержащие ЦНВ, могут быть использованы для сохранения и роста клеток, а также для переноса клеток. Настоящее изобретение обеспечивает среду для культивирования клеток, которую можно использовать, например, для инженерии тканей и заживления ран. Другими применениями являются, например, применения, связанные с лекарственными формами, биотехнологическими или биологическими лекарственными средствами и их лекарственными формами, а также с 3D анализами лекарственных средств с использованием функциональных клеток. Уникальные реологические свойства ЦНВ-гидрогеля обеспечивают несколько применений, которые основаны на инъецируемости гидрогеля, такие как инъекция клеток или лекарственных средств, находящихся в ЦНВ-гидрогеле, в форме внутриглазных, внутримышечных или подкожных инъекций.
Следующие примеры приведены для дальнейшей иллюстрации изобретения и не предназначены для ограничения его объема. На основании описания примеров специалист в данной области техники сможет модифицировать изобретение различными способами.
ОПИСАНИЕ ПРИМЕРОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Материалы и методы
Получение ЦНВ-гидрогелей
Непрозрачный нативный ЦНВ-гидрогель (1,7 масс.%) был получен посредством гомогенизации под высоким давлением волокон влажной целлюлозной массы. Соответственно, непосредственным продуктом процесса является разбавленный гель на основе целлюлозных нановолокон. Прозрачный ЦНВ-гидрогель (0,9 масс.%) был получен с использованием сходного процесса гомогенизации химически модифицированной целлюлозной массы (окисленной с использованием TEMPO целлюлозной массы). Образцы были стерилизованы в автоклаве. Для исследований клеток ЦНВ-гидрогель разбавляли до нужной концентрации и гомогенизировали посредством механического перемешивания или обработки ультразвуком. Крио-ТЭМ изображения нативного ЦНВ-гидрогеля и прозрачного ЦНВ-гидрогеля представлены на Фиг.1. Нативный гель на основе целлюлозных нановолокон состоит из смеси отдельных целлюлозных нанофибрилл и пучков волокон (Фиг.1А). Диаметр наименьших волокон равен примерно 7 нм, однако большую часть целлюлозного материала образуют структуры в форме пучков размером 50-100 нм. Точный линейный размер невозможно определить по изображениям из-за того, что материал состоит из переплетенных волокон и пучков волокон, однако похоже, что отдельные нановолокна имеют длину, равную нескольким микрометрам. Крио-ТЭМ изображение оптически прозрачного ЦНВ-гидрогеля демонстрирует сеть, состоящую из равномерно распределенных отдельных целлюлозных нановолокон. Диаметр этих нановолокон равен примерно 7 нм, а длина превышает один микрометр. Нановолокна содержат длинные прямые сегменты длиной порядка 100-200 нм, за которыми следуют резкие изгибы вдоль оси волокна. Эти прямые сегменты состоят из высококристаллических целлюлозных доменов - места перегиба образованы аморфными частями.
Получение ЦНВ-мембран
ЦНВ-мембраны получали посредством вакуумной фильтрации водной дисперсии нативных ЦНВ с концентрацией 0,2 масс.%. После фильтрации влажные мембраны сушили под грузом в печи при 55°C в течение 48 часов. Сухие пленки были гладкими и непрозрачными и имели плотность, равную 70-80 г/м2.
Ферментативный гидролиз
Ферментативное разложение ЦНВ-гидрогелей было продемонстрировано посредством гидролиза песка, содержавшего 0,5%-ные гидрогели, препаратом Celluclast 1,5 LFG, CCN0367 (производства компании Novozymes, pHопт. 5), в концентрации 90 мг/мл. Разложение нативных ЦНВ производили при pH 5 и 50°C в течение 4 дней, а разложение прозрачных ЦНВ - при pH 7 и 21°C в течение одного часа. Доза фермента составляла 5 мг фермента на один грамм ЦНВ.
Клетки HepG2
Происхождение клеток HepG2
Клетки гепатоклеточной карциномы (HepG2) были получены из Американской коллекции типовых культур (АТСС, Манассас, Вирджиния, США).
Сохраняемая культура клеток HepG2
Клетки HepG2 сохраняли в среде Игла, модифицированной по Дальбекко (DMEM, производства компании Gibco), с добавлением 10% плодной сыворотки коров, пенициллина/стрептомицина (производства компании Gibco), 2 мМ L-глутамина (производства компании Gibco) и 100 мМ пирувата натрия (производства компании Gibco). Клетки сохраняли в колбах для клеточных культур объемом 75 см2 при 37°C в инкубаторе при относительной влажности воздуха, равной 95%, в атмосфере, содержавшей 5% CO2. Клетки пересевали 1:10 с использованием трипсинизации два раза в неделю с индексом разведения 1:10. Среду заменяли через каждые 48 часов, и клетки субкультивировали с 90%-ной конфлюентностью.
3D-культура клеток HepG2 на ЦНВ-гидрогеле
Гидрогель на основе целлюлозных нановолокон помещали на дно 96-луночного планшета для культур тканей, а суспензию HepG2 клеток в культуральной среде, содержавшую 25000-50000 клеток на ячейку, или засевали на поверхность ЦНВ-гидрогеля или смешивали с ним. Концентрации ЦНВ-гидрогеля варьировались от 0,01% до 1%.
Клетки ARPE-19
Происхождение клеток ARPE-19
Спонтанно возникающие клетки пигментного эпителия сетчатки (ARPE-19) были получены из Американской коллекции типовых культур (АТСС, Манассас, Вирджиния, США).
Сохраняемая культура клеток ARPE-19
Клетки ARPE-19 сохраняли в среде Игла, модифицированной по Дальбекко (DMEM, производства компании Gibco): питательная смесь F12, смесь в соотношении 1:1 с добавлением 10% плодной сыворотки коров (FBS), 2 мМ L-глутамина, 100 Ед./мл пенициллина и 100 Ед./мл стрептомицина. Клетки культивировали при 37°C в атмосфере, содержавшей 7% CO2. Культуральную среду заменяли через каждые 2-3 дня, и клетки использовали при пассаже 24-30.
Культивирование ARPE-19 клеток на ЦНВ-мембране
Гидрогель на основе целлюлозных нановолокон помещали на дно 96-луночного планшета для культур тканей, а суспензию клеток ARPE-19 в культуральной среде, содержавшую 25000-50000 клеток на ячейку, или засевали на поверхность ЦНВ-гидрогеля или смешивали с ним. Концентрации ЦНВ-гидрогеля варьировались от 0,01% до 1%.
Прогениторные клетки печени, полученные из эмбриональных стволовых клеток человека
Сохраняемая культура эмбриональных стволовых клеток человека
Для данного исследования были использованы эмбриональные стволовые клетки человека (hES) линии Н9 (Висконсинский международный банк стволовых клеток («WISC банк»), принадлежащий Научному институту WiCell, Мэдисон, Висконсин, США). Клетки Н9 стандартным образом культивировали на планшетах для культур тканей с покрытием из Matrigel в среде MTeSR1 и пересевали с использованием Dispase (производства компании StemCell Technologies) в концентрации 1 мг/мл. В этих условиях стволовые клетки образуют двумерные (2D) колонии в форме монослоев.
3D культура hES-клеток в ЦНВ
Колонии клеток Н9 смешивали либо с 0,3%-ным нативным ЦНВ-гидрогелем, либо с 0,3%-ным прозрачным ЦНВ-гидрогелем и культивировали в среде mTeSR1. hES-клетки в ЦНВ-гидрогеле образуют 3D агрегаты клеток. В некоторых экспериментах 0,3%-ный ЦНВ-гидрогель смешивали с 58 мкг/мл фибронектина человека (производства компании Sigma-Aldrich).
3D культура прогениторных клеток печени, полученных из клеток Н9, в ЦНВ-гидрогеле
Клетки Н9 дифференцируются в Прогениторные клетки печени через 11 дней согласно опубликованному протоколу [Hay D.C., Zhao D., Fletcher J., Hewitt Z.A., McLean D., Urruticoechea-Uriguen A., Black J.R., Elcombe C., Ross J.A., Wolf R., Cui W. Efficien differentiation of hepatocytes from human embryonic stem cells exhibiting markers recapitulating liver development in vivo. Stem Cells. 2008 Apr; 26(4):894-902]. Полученные прогениторные клетки печени культивировали в 3D среде с использованием либо 0,3%-ного нативного ЦНВ-гидрогеля, либо 0,3%-ного прозрачного ЦНВ-гидрогеля в течение 7 дней. В некоторых экспериментах 0,3%-ный ЦНВ-гидрогель смешивали с 13 мкг/мл коллагена типа IV мыши (производства компании Sigma-Aldrich).
Окрашивание для определения соотношения живых и мертвых клеток
Агрегаты клеток Н9 и прогениторных клеток печени в ЦНВ-гидрогеле совместно окрашивали красителем CellTracker Blue CMAC (20 мкМ) для выявления живых клеток и пропидия иодидом (25 мкг/мл) для выявления мертвых клеток. Изображения клеток получали посредством конфокальной лазерной сканирующей микроскопии (Leica TCS SP5 МР SMD FLIM) при длине волны возбуждения, равной 405 нм для CellTracker Blue CMAC и 514 нм для пропидия иодида.
Анализ жизнеспособности/пролиферации клеток с использованием AlamarBlue
Жизнеспособность клеток количественно оценивали с использованием Набора для анализа жизнеспособности клеток AlamarBlue™ (производства компании Biotium Inc., Хейворд, Калифорния, США). Гидрогель на основе целлюлозных нановолокон помещали на дно 96-луночного планшета для культур тканей, а суспензию клеток HepG2/ARPE-19 в культуральной среде, содержавшую 25.000-50.000 клеток на ячейку, или засевали на поверхность ЦНВ-гидрогеля или смешивали с ним. Концентрации ЦНВ-гидрогеля варьировали от 1% до 0,01%. Жизнеспособность и пролиферацию клеток измеряли как функцию времени в днях при культивировании клеток на гидрогеле на основе целлюлозных нановолокон в инкубаторе при 37°С в атмосфере с 5% CO2 и 95%-ной относительной влажностью.
Через 48 часов AlamarBlue добавляли непосредственно в культуральную среду 96-луночных планшетов до конечной концентрации, равной 10%. Планшеты инкубировали в течение 5 часов, возбуждали флуоресценцию при длине волны возбуждения, равной 530 нм, и измеряли излучение при длине волны, равной 590 нм с целью измерения флуоресценции. Процент жизнеспособности выражали как процентное отношение флуоресценции в присутствии ЦНВ-гидрогеля и флуоресценции в отсутствие гидрогеля на основе целлюлозных нановолокон (клетки росли на полимерной поверхности).
Измерения фоновой флуоресценции (отрицательный контроль) производили на ячейках, содержавших гидрогель и красящий реагент в культуральной среде, но в отсутствие клеток. Рассчитывали среднее значение и стандартное отклонение для всех измерений флуоресценции, которые затем корректировали с учетом фона и выражали как относительную флуоресценцию.
Конфокальная лазерная микроскопия
Жизнеспособность клеток HepG2, культивированных на гидрогеле, и образование 3D сфероидов HepG2 клетками оценивали с использованием Набора для анализа жизнеспособности Live/Dead® (производства компании Invitrogen), состоящего из кальцеина AM и гомодимера этидия.
В кратком изложении, клетки HepG2 суспендировали в 1%-ном нативном или прозрачном ЦНВ-гидрогеле с фибронектином или без фибронектина. Суспензию клеток в гидрогеле переносили в каждую ячейку вместе с клетками. В каждую ячейку добавляли культуральную среду для клеток. Клетки HepG2, инкапсулированные в гидрогеле, культивировали в течение 5 дней, причем среду освежали через каждые 48 часов. Через 5 дней среду удаляли из ячеек, а инкапсулированные клетки промывали фосфатным буфером и инкубировали в растворе «Live/Dead», содержавшем 0,2 мкМ кальцеина AM и 1,0 мкМ гомодимера этидия, в течение 45 минут при комнатной температуре. Изображения живых клеток получали с использованием конфокального лазерного сканирующего микроскопа (CLSM, инвертированный микроскоп Leica SP2, Цюрих, Швейцария), оборудованного аргоновым лазером (488 нм/35 мВт), объективами НС PL APO 10×/0,4 CS и НС PL APO 20×/0,7 CS (воздушный), инкубаторной камерой с воздухонагревательной системой (производства компании Life Imaging/Services, Швейцария) и СО2-миксером (Okolab). Изображения получали с двух детекторов (одного для кальцеина, а другого для гомодимера этидия). Изображения воспроизводили и редактировали с использованием программы Imaris 7.0 (Bitpane). Деконволюцию не производили.
Пример 1
Сравнение жизнеспособности клеток HepG2 в различных материалах для культивирования клеток
Гидрогели на основе целлюлозных нановолокон помещали на дно 96-луночного планшета для культур тканей и суспензию клеток HepG2 в среде, поддерживающей рост, содержавшую 25000-50000 клеток на ячейку, либо засевали на поверхность гидрогеля, либо смешивали с ним. Концентрация гидрогеля лежала в диапазоне от 1 до 0,01%. Интенсивность флуоресценции, которая свидетельствует о жизнеспособности и пролиферации клеток, измеряли как функцию времени в днях после культивирования клеток на гидрогеле на основе целлюлозных нановолокон в инкубаторе при 37°C в атмосфере с 5% CO2 и 95%-ной влажностью.
Три коммерчески доступных материала для культивирования клеток были использованы в качестве стандартных материалов для 3D-культур: MaxGel™ (производства компании Sigma-Aldrich), HydroMatrix™ (производства компании Sigma-Aldrich) и PuraMatrix™ (производства компании 3DM Inc.). План эксперимента был идентичным для всех исследованных материалов.
Жизнеспособность клеток HepG2 количественно оценивали с использованием Набора для анализа жизнеспособности клеток AlamarBlue™ (производства компании Biotium Inc., Хейворд, Калифорния, США), как описано выше в разделе «Материалы и методы. Анализ жизнеспособности/пролиферации клеток с использованием AlamarBlue».
Процент жизнеспособных клеток HepG2 в исследованных материалах представлен на Фиг.2. Оба типа гидрогелей на основе целлюлозных нановолокон, то есть нативный и прозрачный ЦНВ-гели, показали более высокие значения жизнеспособности, чем коммерческие стандартные материалы HydroMatrix™ и PuraMatrix™. Если к ЦНВ-гелям добавляли фибронектин, то жизнеспособность была близка к коммерческому продукту MaxGel™. Кроме того, пролиферация и жизнеспособность клеток линейно возрастала как функция концентрации клеток в обоих гидрогелях. Это наблюдение подтверждает гипотезу о том, что гидрогель имитирует компоненты ЭКМ человека. Он содержит все ключевые компоненты ЭКМ.
Пример 2
Перенос клеток ARPE-19 с помощью иглы от шприца
Клетки ARPE-19 (25.000 клеток на лунку) засевали и культивировали на ЦНВ-матриксе на дне 96-луночного планшета. Жизнеспособность клеток ARPE-19 после переноса с помощью игл от шприца различного размера представлена на Фиг.3. Можно наблюдать тот же феномен, что и в случае других клеток, таких как HepG2 и ES.
Более подробное разъяснение по поводу переноса клеток ARPE-19 с помощью иглы от шприца является следующим: при переносе 1 на Фиг.3 клетки инкубировали в течение 48 часов с 1,66%-ным ЦНВ-гелем, после чего клетки с помощью шприца (20П-27П) переносили в объеме, примерно равном 100 мкл, на 96-луночный планшет. После переноса с помощью шприца клетки инкубировали в течение 24 часов и измеряли жизнеспособность клеток в ЦНВ-гидрогеле.
При Переносе 2 клетки, инкубированные в течение 24 часов в 1,66%-ном ЦНВ-гидрогеле, переносили в свежую среду с помощью шприца калибра 27G (примерно 2 мл). После переноса клетки инкубировали в течение 24 часов, затем клетки снова переносили с помощью шприца (20G-27G) в объеме, примерно равном 100 мкл, на 96-луночный планшет, снова инкубировали в течение 24 часов и измеряли жизнеспособность клеток, дважды перенесенных в 1,66%-ном ЦНВ-гидрогеле.
Эти эксперименты подтвердили, что можно переносить клетки в ЦНВ-гидрогеле; процесс переноса был успешным, и клетки были живыми и оставались живыми в процессе переноса с помощью шприца. Этот феномен наблюдали даже при использовании иглы наименьшего калибра, равного 27G, и не наблюдали отсечки по размеру иглы, использованной в процессе переноса. Образцы, которые были перенесены два раза (Перенос 2), показали меньшие скорости пролиферации, по-видимому, обусловленные более коротким 24-часовым периодом инкубации в начале эксперимента. Перенос клеток в ЦНВ-гидрогеле подтвердил, что клетки действительно находились в гидрогеле и оставались в нем, поскольку клетки, прикрепленные к планшету, не переносились (не производилась трипсинизация). Эти эксперименты показали, что клетки остаются жизнеспособными во время переноса.
Пример 3
Стволовые клетки
Окрашивание живых и мертвых прогениторных клеток печени, полученных из hES клеток
Прогениторные клетки печени, полученные из эмбриональных стволовых клеток человека, погружали в нативный ЦНВ-гидрогель (Фиг.15) и культивировали в течение 7 дней с добавлением и без добавления коллагена IV. Не было обнаружено фона. Прогениторные клетки печени, полученные из ЭС-клеток человека, погружали в прозрачный ЦНВ-гидрогель и культивировали в течение 7 дней с добавлением и без добавления коллагена IV. Не было обнаружено фона, что делает этот материал исключительно легким для использования в данном контексте. Другие используемые материалы, например - MatriGel и MaxGel, обычно дают значительный флуоресцирующий фон, и поэтому с этими матриксами трудно работать. Эмбриональные стволовые клетки можно сохранять в ЦНВ-гидрогеле, они выживают, и данный материал пригоден для сохранения их в жизнеспособном состоянии. Кроме того, ЭС-клетки также формируют 3D-структуру, которую не наблюдали ранее при использовании других материалов.
Пример 4
Диффузия декстранов через ЦНВ-гидрогели
Важно детально знать диффузионные свойства материала для культивирования клеток. Материал для культивирования клеток должен быть достаточно пористым для того, чтобы обеспечивать диффузию питательных веществ и кислорода к культивируемым клеткам и эффективную диффузию метаболитов от клеток. Диффузионные свойства ЦНВ-гидрогеля были продемонстрированы с использованием декстранов с различной молекулярной массой следующим образом:
400 мкл прозрачного или непрозрачного ЦНВ-гидрогеля (1%) наносили через фильтр на апикальный отсек планшетов с фильтрами Transwell™ (размер пор фильтра 0,4 мкм). 1 мл фосфатного буферного раствора добавляли с базолатеральной стороны, а 100 мкл (25 мкг) декстранов с флуоресцентными метками добавляли поверх гидрогелей (с молекулярной массой 20 кДа, 70 кДа и 250 кДа). Планшеты прочно фиксировали и оставляли в покое на качалке для луночных планшетов. Образцы объемом 100 мкл брали с базолатеральной стороны и восполняли объем равным количеством фосфатного буферного раствора. Первые образцы брали через 15-минутные интервалы, последующие образцы брали в различные моменты времени, варьировавшиеся от 30 минут до 24 часов, а последние образцы - через 24 часа. Всего было взято 168 образцов. Целевой планшет (OptiPlate™-96 F) измеряли при длинах волн возбуждения и эмиссии, равных 490 нм и 520 нм, соответственно.
Диффузия декстранов с различными молекулярными массамм через 1%-ный нативный гель на основе целлюлозных нановолокон представлена на Фиг.4. Диффузия модельных соединений происходила с постоянной скоростью и очень сильно зависела от молекулярной массы (размера) соединения. Очевидно, что в ЦНВ-гидрогелях молекулы способны эффективно диффундировать, несмотря на то, что структура геля является достаточно плотной для стабилизации суспензии клеток.
Полученный профиль диффузии можно использовать в различных композициях для доставки лекарственных средств и прикладных задачах. Диффузию лекарственных средств можно регулировать как функцию размера молекулы лекарственного средства или белка (используемого в качестве лекарственного средства) или концентрации ЦНВ-гидрогеля. Явный стабильный профиль выделения особенно полезен для некоторых видов лечения, где предпочтительно длительное выделение, в частности - в случае пептидных или белковых лекарственных средств.
Пример 5
Пролиферация клеток ARPE19 на ЦНВ-мембране
Нативную ЦНВ-мембрану помещали на дно 96-луночного планшета для культивирования тканей и на поверхность мембраны засевали суспензию клеток в среде, поддерживающей рост, содержавшей 25000-50000 клеток на ячейку. Концентрация мембран варьировалась от 1,6% до 0,01%. Жизнеспособность и пролиферацию клеток измеряли как функцию количества дней культивирования клеток на нативной ЦНВ-мембране в инкубаторе при 37°C в атмосфере с 5% CO2 и 95%-ной относительной влажностью.
Изображения клеток ARPE-19 на нативной ЦНВ-мембране получали с использованием световой микроскопии. ЦНВ-мембрана поддерживает рост клеток в верхней части изображения (Фиг.5), что показывает, что клетки ARPE-19 способны к 2D-росту на ЦНВ-мембране, и что ЦНВ-мембрану можно использовать в качестве 2D-матрикса для роста клеток.
Клетки ARPE-19 хорошо пролиферировали в гидрогелях, независимо от использованной концентрации клеток. Значимых различий между гидрогелями не было. Пролиферация клеток возрастала примерно в 2 раза при культивировании на гидрогеле, по сравнению с клетками, культивировавшимися в отсутствие гидрогеля.
Пример 6
Морфология кластеров клеток HepG2 в 3D культурах
Конфокальная лазерная микроскопия
Лазерную конфокальную микроскопию использовали для получения изображений живых клеток. Сфероидная форма инкапсулированных HepG2 клеток в ЦНВ-гидрогеле отчетливо свидетельствует о том, что клетки захватываются гидрогелем и растут в трех измерениях (Фиг.6). Изображения клеток, полученные после 5 дней культивирования, представлены на Фиг.6 и показывают, что клетки жизнеспособны в 3D-сфероидах в обоих гидрогелях. Жизнеспособность клеток не зависела от концентрации клеток в гидрогелях, а размер сфероидов увеличивался как функция времени во всех культурах (Фиг.6).
Среду освежали через каждые 48 часов, и размер сфероидов в культуре увеличивался как функция времени. Если к ЦНВ-гелю добавляли фибронектин, жизнеспособность клеток в 3D-сфероидах увеличивалась. Конфокально-микроскопические снимки с Live/dead окрашиванием показали, что клетки оставались жизнеспособными в течение 5-дневного периода культивирования. Эти результаты совпадают с результатами анализа пролиферации клеток с окрашиванием Alamar blue (Фиг.2). Это наблюдение подтверждает гипотезу авторов о том, что ЦНВ-гидрогель имитирует компоненты ЭКМ человека. Он содержит все ключевые компоненты ЭКМ, за исключением фибронектина. Поэтому добавление фибронектина увеличивает жизнеспособность клеток в 3D-кластерах. Фибронектин способствовал прикреплению клеток и повышал их жизнеспособность. Ранее было показано, что фибронектин увеличивает переживание гепатоцитов и снижает апоптоз за счет связывания с интегрином р1.
Кроме того, удалось показать, что можно получить 3D-структуру из HepG2 клеток без какого-либо иного поддерживающего материала или компонентов ЭКМ, кроме ЦНВ-гидрогеля. Это доказывает применимость и легкость использования ЦНВ-гидрогеля в качестве 3D матрикса для культуры клеток.
Пример 7
Прочность геля
Важной функцией среды для 3D культур клеток является сохранение клеток в форме равномерной суспензии в матриксе и предотвращение седиментации. ЦНВ удовлетворяют этому требованию благодаря их способности формировать гелевую сеть в очень низкой концентрации (0,5%). Гелеподобная структура ЦНВ была продемонстрирована при определении их вязкоупругих свойств посредством динамических осцилляторных реологических измерений. Результаты, полученные при качании частоты, демонстрируют характерное гелеподобное поведение. Модуль накопления (G') на несколько порядков больше по величине, чем модуль потерь (G''), и почти не зависит от частоты, что означает, что упругие (напоминающие свойства твердого тела) свойства более выражены, чем вязкие (напоминающие жидкость) характеристики (Фиг.7). Характерным для гелей является также то, что G' и G'' относительно не зависят от частоты. Вязкоупругие свойства ЦНВ-гелей были определены посредством осцилляторного измерения с качанием частоты в реометре (AR-G2, производства компании ТА Instruments) при деформации, равной 0,1%.
Пример 8
Характеристики текучести ЦНВ-гидрогелей
Реологические характеристики текучести ЦНВ-гидрогелей демонстрируют ряд особенностей, которые выгодны при использовании их для культивирования клеток. Гидрогели обладают высокой вязкостью при низком сдвиговом усилии (или в покое), что обеспечивает оптимальную способность суспендировать клетки, но при более высоких сдвиговых усилиях демонстрируют разжижение, что обеспечивает их легкое дозирование и инъецирование. Способность ЦНВ проявлять такие реологические свойства была продемонстрирована в серии опытов, в которых вязкость ЦНВ-дисперсии измеряли в широком диапазоне напряжений сдвига (скоростей сдвига) в ротационном вискозиметре (AR-G2, ТА Instruments, Соединенное Королевство).
Дисперсии ЦНВ показали значительно более высокие значения вязкости при нулевом сдвиге (область постоянных значений вязкости при малых напряжениях сдвига), чем другие водорастворимые полимеры, как показано на Фиг.8. Вязкость ЦНВ при нулевом сдвиге заметно увеличивается при уменьшении диаметра нанофибрилл, вызванном предварительной химической обработкой исходного материала. Напряжение, при котором начинается разжижение при сдвиге («предел текучести»), у ЦНВ-дисперсий также заметно выше. Суспендирующая способность материала тем больше, чем выше предел текучести. Клетки эффективно стабилизируются против седиментации за счет объединенных эффектов высокой вязкости при нулевом сдвиге, высокого предела текучести и высокого модуля накопления. Сила тяжести, приложенная к клеткам, гораздо слабее, чем предел текучести. Поэтому суспендированные клетки «замораживаются» в гелевом матриксе, если они смешаны с ЦНВ, или «замораживаются» на геле, если они нанесены на поверхность геля.
На Фиг.9 вязкость изображена как функция измеренной скорости сдвига. Из этой Фиг.9 очевидно, что вязкость дисперсий ЦНВ снижается при относительно низких скоростях сдвига и достигает значений, сходных со значениями, измеренными у стандартных материалов, при скоростях сдвига порядка 200 с-1.
Сетчатая структура ЦНВ разрушается при сдвиге (Фиг.7). При приложении определенного напряжения вязкость системы резко снижается, и происходит переход от поведения, характерного для твердого тела, к поведению, характерному для жидкости. Такое поведение является выгодным, так как оно позволяет гомогенное смешивание клеток с суспензией ЦНВ при умеренном механическом сдвиге. При сдвиге в двухфазных жидкостях, таких как флоккулированные дисперсии ЦНВ, (например, в реометре или в трубе) дисперсная фаза имеет тенденцию к удалению от границ с твердым телом, что приводит к образованию слоя менее вязкой жидкости у стенок контейнера (Фиг.10). Это феномен означает, что сопротивление течению, то есть вязкость, меньше у стенок, чем в объеме дисперсии (Barnes, 1995). Соответственно, инъекцию ЦНВ-гидрогеля с помощью шприца с иглой или пипетки легко можно выполнить даже при высоких концентрациях (1-4%). Этот феномен обеспечивает также легкое дозирование суспензий клеток с минимальным смещением клеток, то есть большинство клеток расположено в центре иглы и практически находится в покое (Фиг.10).
Легкая инъецируемость ЦНВ-гидрогелей является важной характеристикой и в том случае, если разрабатываются инъецируемые композиции. Как описано в Примере 6, ЦНВ-гидрогели имеют профили выделения, которые можно использовать в прикладных задачах, связанных с устойчивым и регулируемым выделением лекарственных средств. Эти два свойства ЦНВ-гидрогелей обеспечивают возможность использования в различных прикладных задачах, связанных с лекарственными средствами, например - в композициях для внутриглазного, внутримышечного и подкожного введения или, например, в вязкоупругих композициях глазных капель.
Пример 9
Восстановление структуры после прекращения сдвига
Дополнительным важным реологическим свойством ЦНВ-гидрогелей является то, что высокий уровень вязкости восстанавливается после прекращения сдвига (например, после инъекции или перемешивания). Восстановление структуры дисперсии ЦНВ было продемонстрировано в серии опытов, в которой материал вначале сдвигали в реометре (StressTech, производства компании Reologica Instruments Ab) при высокой скорости сдвига, а после прекращения сдвига контролировали восстановление прочности геля (G') посредством осцилляторного измерения с временной разверткой. Цикл сдвига осуществляли с использованием системы концентрических цилиндров при постоянном напряжении, равном 40 Па, в течение 61 с. Изменения скорости сдвига и вязкости во время этого испытания показаны на Фиг.10. Материал сдвигали при относительно высокой скорости сдвига (1000 с-1) в течение периода времени не менее 40 с, и в этот период вязкость материала падала ниже 40 мПа·с.
После прекращения сдвига за изменениями G' (мера прочности геля) наблюдали посредством осцилляторного измерения при постоянной частоте (1 Гц) и небольшом напряжении (0,5 Па). Измерение начинали ровно через 10 с после прекращения сдвига. Из Фиг.11 видно, что сетчатая структура геля очень быстро формируется после того, как гель оставляют в покое после сдвига с высокой скоростью сдвига. Существенное восстановление структуры наблюдается уже через 10 с после прекращения сдвига (что соответствует нулевому значению времени на Фиг.11). Постоянный уровень модуля накопления (G') достигается менее чем через 10 минут нахождения дисперсии ЦНВ в покое. Значение G', достигнутое у дисперсии ЦНВ при интенсивном сдвиге, было сопоставимым со значением у дисперсии ЦНВ, которую осторожно перемешивали стеклянной палочкой перед испытанием на восстановление структуры.
Изменения скорости сдвига и вязкости, полученные при сдвиге 0,7%-ной нативной дисперсии ЦНВ в реометре с системой концентрических цилиндров при постоянном напряжении, равном 40 Па, представлены на Фиг.11.
Восстановление структуры 0,7%-ной нативной дисперсии ЦНВ при сдвиге с высокой скоростью сдвига по сравнению с осторожным перемешиванием стеклянной палочкой показано на Фиг.12.
Быстрое восстановление структуры является важным для материалов для культивирования клеток гидрогелевого типа по двум причинам. Во-первых, оно обеспечивает равномерное распределение клеток в ЦНВ-гидрогелях после их смешивания с гидрогелем. Во-вторых, если ЦНВ-гидрогели используют для транспортировки культивируемых клеток, то быстрое восстановление структуры геля эффективно удерживает клетки на месте, и их миграция минимальна, например в тех случаях, когда речь идет о пересадке клеток. Быстрое восстановление структуры также является важным в инъецируемых композициях, выделяющих лекарственные средства.
Пример 10
Стабильность
Как показано в Примере 1, даже очень разбавленные дисперсии ЦНВ обладают очень высокой вязкостью при низких скоростях сдвига. Кроме того, структура гидрогеля восстанавливается после прекращения сдвига, например - после инъекции. В статических условиях ЦНВ образуют сетчатую структуру гидрогеля с высоким модулем упругости и исключительно высоким пределом текучести. Благодаря этим свойствам, ЦНВ обладают очень высокой способностью суспендировать твердые частицы даже при очень низких концентрациях.
Суспендирующая способность в статических условиях была продемонстрирована с использованием суспензий песка. 0,5%-ные дисперсии нативных ЦНВ и прозрачных ЦНВ способны стабилизировать даже частицы песка диаметром 2-3 мм в течение очень длительного времени, см. Фиг.13. Следует отметить, что прозрачный ЦНВ-гидрогель способен стабилизировать суспензии твердых частиц при меньшей концентрации, чем нативный ЦНВ-гидрогель.
Пример 11
Ферментативный гидролиз
Общеизвестно, что определенные ферменты (целлюлазы) способны гидролизовать β-(1-4)-связи в целлюлозе. Например, эндо-1,-4-β-глюканазы (ЭГ), которые расщепляют целлюлозные цепи в случайных положениях, удаленных от концов цепей; экзоглюканазы или экзоцеллобиогидролазы (ЦБГ), которые расщепляют целлюлозу путем отщепления молекул от обоих концов цепи, продуцируя димеры целлобиозы; и β-глюкозидазы (БГЛ), которые гидролизуют молекулы целлобиозы (образовавшиеся после воздействия ЭГ и ЦБГ) до глюкозы. Соответственно, целлюлозные нановолокна можно ферментативно гидролизовать до глюкозы с помощью целлюлаз (Ahola S., Turon X., Osterberg M., Laine J., Rojas O.J., Langmuir, 2008, 24, 11592-11599).
Ферментативный гидролиз целлюлозы можно использовать в системах для культивирования клеток, содержащих целлюлозные нановолокна, по различным причинам. При гидролизе ЦНВ-гидрогеля вязкость среды резко снижается, и культивируемые клеточные структуры становятся легкодоступными, например, для окрашивания. Кроме того, после гидролиза клеточные структуры можно переносить или трансплантировать без материала, содержащего целлюлозу. Продукт разложения - глюкоза - является нетоксичным для клеток, и его можно использовать в качестве питательного вещества при культивировании клеток.
Ферментативный гидролиз целлюлозных нановолокн можно провести с использованием различных целлюлаз в различных средах. На Фиг.14 продемонстрирован эффект коммерческих ферментов Cellucast на суспендирующую способность гелей. И нативный, и прозрачный ЦНВ-гели теряли суспендирующую способность из-за ферментативного разрушения структуры геля. Культивируемые линии клеток можно также подвергнуть генетическому инжинирингу, чтобы они выделяли необходимый белок-фермент в систему культуры.
Claims (22)
1. Материал для культивирования или доставки эукариотических клеток, отличающийся тем, что он содержит происходящие из растений механически дезинтегрированные целлюлозные нановолокна и/или их производные в форме гидрогеля или мембраны во влажном состоянии, причем диаметр целлюлозных нановолокон или пучков нановолокон в целлюлозных нановолокнах и/или их производных меньше 1 мкм, предпочтительно - меньше 200 нм, более предпочтительно - меньше 100 нм.
2. Материал по п.1, отличающийся тем, что целлюлозные нановолокна содержат химически или физически модифицированные производные целлюлозных нановолокон или пучков нановолокон.
3. Материал по п.1, отличающийся тем, что механически дезинтегрированные целлюлозные нановолокна предварительно подвергнуты кислотно-щелочной обработке.
4. Материал по п.1, отличающийся тем, что он дополнительно содержит добавки, выбранные из группы, состоящей из компонентов экстраклеточного матрикса, сыворотки, факторов роста и белков.
5. Матрикс для культивирования клеток или доставки клеток, отличающийся тем, что он содержит живые клетки и материал по любому из пп. 1-4, образующий гидрогель, и клетки находятся в этом матриксе в виде трехмерной или двухмерной структуры.
6. Матрикс по п.5, отличающийся тем, что клетки являются эукариотическими клетками или стволовыми клетками.
7. Способ получения материала по любому из пп. 1-4, отличающийся тем, что он включает стадии:
- получения происходящих от растений механически дезинтегрированных целлюлозных нановолокон и/или их производных,
- смешивания целлюлозных нановолокон и/или их производных с водой.
- получения происходящих от растений механически дезинтегрированных целлюлозных нановолокон и/или их производных,
- смешивания целлюлозных нановолокон и/или их производных с водой.
8. Способ по п.7, отличающийся тем, что он дополнительно включает объединение смеси с подходящим медикаментом.
9. Способ по п.7, отличающийся тем, что механически дезинтегрированные целлюлозные нановолокна предварительно подвергнуты кислотно-щелочной обработке.
10. Микробиологическое применение происходящих из растений механически дезинтегрированных целлюлозных нановолокон и/или их производных или материала по любому из пп. 1-4 для лабораторных и/или промышленных целей в качестве среды или компонента среды для сохранения клеток in vitro.
11. Применение материала по любому из пп. 1-4 для иммобилизации клеток.
12. Способ культивирования клеток, отличающийся тем, что он включает стадии:
- получения клеток;
- приведения в контакт клеток с материалом по любому из пп. 1-4 с образованием матрикса;
- культивирования клеток в матриксе в виде трехмерной или двухмерной структуры.
- получения клеток;
- приведения в контакт клеток с материалом по любому из пп. 1-4 с образованием матрикса;
- культивирования клеток в матриксе в виде трехмерной или двухмерной структуры.
13. Способ по п.12, отличающийся тем, что он дополнительно включает стадии:
- разбавления материала водной или неводной жидкостью;
- необязательно - центрифугирования материала для осаждения клеток и клеточных агрегатов;
- удаления целлюлозных нановолокон посредством декантации.
- разбавления материала водной или неводной жидкостью;
- необязательно - центрифугирования материала для осаждения клеток и клеточных агрегатов;
- удаления целлюлозных нановолокон посредством декантации.
14. Способ по п.12, отличающийся тем, что он дополнительно включает стадии:
- приведения в контакт материала для культивирования клеток с разлагающим ферментом;
- необязательно - центрифугирования материала для осаждения клеток и клеточных агрегатов;
- удаления целлюлозных нановолокон посредством декантации.
- приведения в контакт материала для культивирования клеток с разлагающим ферментом;
- необязательно - центрифугирования материала для осаждения клеток и клеточных агрегатов;
- удаления целлюлозных нановолокон посредством декантации.
15. Способ по п. 12, отличающийся тем, что перед культивированием матрикс переносят или помещают в среду для культивирования клеток или доставки клеток.
16. Материал по п.1, отличающийся тем, что клетки являются эукариотическими клетками или стволовыми клетками.
17. Способ по п.7, отличающийся тем, что клетки являются эукариотическими клетками или стволовыми клетками.
18. Способ по п.12, отличающийся тем, что клетки являются эукариотическими клетками или стволовыми клетками.
19. Способ по п.13, отличающийся тем, что клетки являются эукариотическими клетками или стволовыми клетками.
20. Способ по п.14, отличающийся тем, что клетки являются эукариотическими клетками или стволовыми клетками.
21. Применение по п.10, отличающееся тем, что клетки являются эукариотическими клетками или стволовыми клетками.
22. Применение по п.11, отличающееся тем, что клетки являются эукариотическими клетками или стволовыми клетками.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FI20106121 | 2010-10-27 | ||
| FI20106121A FI123988B (fi) | 2010-10-27 | 2010-10-27 | Soluviljelymateriaali |
| PCT/FI2011/050939 WO2012056109A2 (en) | 2010-10-27 | 2011-10-26 | Plant derived cell culture material |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2013122757A RU2013122757A (ru) | 2014-12-10 |
| RU2597978C2 true RU2597978C2 (ru) | 2016-09-20 |
Family
ID=43064279
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2013122757/10A RU2597978C2 (ru) | 2010-10-27 | 2011-10-26 | Материал для культур клеток, полученный из растений |
Country Status (15)
| Country | Link |
|---|---|
| US (3) | US10612003B2 (ru) |
| EP (4) | EP2633033B1 (ru) |
| JP (3) | JP2013541956A (ru) |
| CN (2) | CN107557330B (ru) |
| AU (1) | AU2011322363B2 (ru) |
| BR (1) | BR112013010377B1 (ru) |
| CA (1) | CA2815276C (ru) |
| DK (3) | DK2633032T3 (ru) |
| ES (3) | ES2565958T3 (ru) |
| FI (1) | FI123988B (ru) |
| IL (1) | IL225923B (ru) |
| PL (2) | PL2975115T3 (ru) |
| RU (1) | RU2597978C2 (ru) |
| SG (1) | SG189966A1 (ru) |
| WO (3) | WO2012056111A2 (ru) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2018191244A1 (en) * | 2017-04-10 | 2018-10-18 | TheWell Bioscience | Hydrogel for cell culture and biomedical applications |
Families Citing this family (84)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FI123988B (fi) | 2010-10-27 | 2014-01-31 | Upm Kymmene Corp | Soluviljelymateriaali |
| FI130619B (en) | 2011-11-15 | 2023-12-15 | Upm Kymmene Corp | Matrix for sustained delivery of bioactive agents |
| FI123694B (en) * | 2011-12-22 | 2013-09-30 | Upm Kymmene Corp | Matrix and composition for microbial cultivation of gram-positive bacteria |
| FI123715B (en) * | 2011-12-22 | 2013-09-30 | Upm Kymmene Corp | Composition for embedded microbial culture |
| FI126055B (en) | 2012-05-14 | 2016-06-15 | Upm Kymmene Corp | A method of making a film from fibril pulp and a fibril pulp film |
| FI125965B (en) * | 2012-09-25 | 2016-04-29 | Upm Kymmene Corp | Three-dimensional cell culture |
| JP5846449B2 (ja) * | 2012-11-12 | 2016-01-20 | 北越紀州製紙株式会社 | 電池用セパレータの製造方法及び電池用セパレータ |
| CN102978256B (zh) * | 2012-12-26 | 2013-11-20 | 东华大学 | 一种连续生产细菌纤维素的方法 |
| FI126109B (en) | 2013-02-22 | 2016-06-30 | Upm Kymmene Corp | Nanofibril polysaccharide for use in the control and prevention of constriction and scarring |
| AU2014292781B2 (en) | 2013-07-18 | 2018-05-24 | The Governors Of The University Of Alberta | Parallel organic synthesis on patterned paper using a solvent-repelling material |
| CN103422379B (zh) * | 2013-08-19 | 2016-03-30 | 南京林业大学 | 一种甘蔗渣纤维素纳米纤维膜的制备方法 |
| FI126854B (en) * | 2013-12-30 | 2017-06-30 | Upm Kymmene Corp | The membrane, its use and the method for making the membrane |
| JP6512662B2 (ja) * | 2014-01-23 | 2019-05-15 | 日産化学株式会社 | 未分化性維持培養材料 |
| KR102359148B1 (ko) * | 2014-01-23 | 2022-02-08 | 닛산 가가쿠 가부시키가이샤 | 배양 배지 조성물 |
| JP6369044B2 (ja) * | 2014-02-19 | 2018-08-08 | 凸版印刷株式会社 | 培養装置およびその製造方法 |
| JP2015159778A (ja) * | 2014-02-28 | 2015-09-07 | 日本バイリーン株式会社 | 光学的測定用細胞培養担体、光学的測定用ウェルプレート、及び細胞の光学的測定方法 |
| JP6684719B2 (ja) | 2014-03-10 | 2020-04-22 | 株式会社スリー・ディー・マトリックス | ペプチド組成物の滅菌および濾過 |
| EP3119448B1 (en) * | 2014-03-21 | 2020-04-22 | University of Pittsburgh- Of the Commonwealth System of Higher Education | Methods for preparation of a terminally sterilized hydrogel derived from extracellular matrix |
| JP5727657B1 (ja) * | 2014-09-22 | 2015-06-03 | 第一工業製薬株式会社 | セルロースナノファイバー分散体の製造方法。 |
| EP3011952A1 (en) * | 2014-10-24 | 2016-04-27 | Centre National De La Recherche Scientifique -Cnrs- | Time-controlled glucose releasing hydrogels and applications thereof |
| PT3233493T (pt) | 2014-12-18 | 2021-09-07 | Cellink Ab | Biotinta nanofibrilar de celulose para bioimpressão em 3d para cultura celular, aplicações de engenharia de tecidos e medicina regenerativa |
| FI126398B (en) * | 2014-12-18 | 2016-11-15 | Upm Kymmene Corp | Method for chemical testing |
| FI125883B (en) | 2014-12-22 | 2016-03-31 | Upm Kymmene Corp | Treatment of Catalytically Oxidized Nanofibril Cellulose Hydrogel |
| FI125884B2 (en) | 2014-12-22 | 2019-03-29 | Upm Kymmene Corp | High Temperature Treatment of Nanofibril Cellulose Hydrogel |
| FI125758B (en) * | 2014-12-22 | 2016-02-15 | Upm Kymmene Corp | A method for reducing the viscosity of nanofibrillar cellulose hydrogel |
| FI126120B (en) * | 2014-12-22 | 2016-06-30 | Upm Kymmene Corp | Process for the production of oxidized nanofibril cellulose hydrogel |
| WO2016146616A1 (en) | 2015-03-16 | 2016-09-22 | Ventana Medical Systems, Inc. | Control slides for immunohistochemistry generated from three-dimensional cell line cultures |
| US11390835B2 (en) * | 2015-05-08 | 2022-07-19 | University Of Florida Research Foundation, Inc. | Growth media for three-dimensional cell culture |
| FI127834B (en) * | 2015-06-04 | 2019-03-29 | Upm Kymmene Corp | Process for producing a nanofibrillar cellulose hydrogel |
| WO2017040655A1 (en) * | 2015-08-31 | 2017-03-09 | Cormedix Inc. | Delivery of active agents using nanofiber webs |
| EP3398189B1 (de) * | 2015-12-30 | 2019-10-30 | EMPA Eidgenössische Materialprüfungs- und Forschungsanstalt | Verfahren zur verbesserung der akustischen eigenschaften von fichten-klangholz |
| EP3232432A1 (de) * | 2016-04-11 | 2017-10-18 | EMPA Eidgenössische Materialprüfungs- und Forschungsanstalt | Verfahren zur verbesserung der akustischen eigenschaften von fichten-klangholz |
| JP2017127264A (ja) * | 2016-01-21 | 2017-07-27 | 株式会社スギノマシン | アスペルギルス・オリゼ由来のホルムアルデヒド分解酵素およびホルムアルデヒド分解酵素を用いたホルムアルデヒドの分解方法 |
| JP2017189164A (ja) * | 2016-04-08 | 2017-10-19 | 三菱ケミカル株式会社 | 細胞及び／又は細胞外マトリックス成分を含む組成物 |
| JPWO2017199737A1 (ja) * | 2016-05-16 | 2019-03-07 | 富士フイルム株式会社 | 培養細胞の回収方法および培養細胞分散液 |
| EP3469004A4 (en) * | 2016-06-09 | 2020-05-06 | Cellink AB | PRODUCTION OF MODIFIED CELLULOSE ANOFIBRILLS WITH EXTRACELLULAR MATRIX COMPONENTS AS BIOTINKS FOR 3D BIODINTING |
| CN109563314A (zh) * | 2016-08-10 | 2019-04-02 | 王子控股株式会社 | 含纤维状纤维素的组合物及片材 |
| WO2018074432A1 (ja) * | 2016-10-17 | 2018-04-26 | 株式会社日本触媒 | 細胞培養用基材およびその製造方法、ならびにこれを利用した細胞培養容器および細胞培養方法 |
| JP6874329B2 (ja) * | 2016-11-01 | 2021-05-19 | 凸版印刷株式会社 | ホルムアルデヒド除去組成物およびその製造方法、ホルムアルデヒド除去シート |
| KR102805966B1 (ko) * | 2016-12-01 | 2025-05-12 | 주식회사 포스코 | 바이오프린팅 기술을 이용한 셀룰로오스 나노섬유 전달체 및 이를 이용한 선택적 방출 방법 |
| CN106544281B (zh) * | 2016-12-07 | 2019-07-02 | 哈尔滨工业大学 | 一种基于蛋白质和多糖构筑生物体保护层的制备方法 |
| EP3335740B1 (en) * | 2016-12-15 | 2024-07-24 | UPM-Kymmene Corporation | Medical hydrogel |
| DE102017000368A1 (de) | 2017-01-16 | 2018-07-19 | Gabriele Blume | Einbringen von schwer und/oder nicht wasserlöslichen Wirkstoffen mittels auf Lipiden basierenden Nanopartikeln/Vesikeln in ein hydrophiles aus Cellulose bestehendes dreidimensionales Netzwerk. |
| US20200040304A1 (en) * | 2017-03-30 | 2020-02-06 | Nissan Chemical Corporation | Cell culturing using nanofibers |
| EP3418377B1 (en) | 2017-06-22 | 2024-04-17 | UPM-Kymmene Corporation | Supportive nanofibrillar cellulose scaffold for expanding cells |
| JP7132566B2 (ja) * | 2017-09-04 | 2022-09-07 | 学校法人早稲田大学 | チキソトロピー性を有するゲルを用いる多層３次元細胞培養足場システム |
| EP3489732A1 (en) | 2017-11-24 | 2019-05-29 | Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. | Apparatus and method for simultaneous imaging and execution of contact-free directed hydrodynamic flow |
| CN111526857B (zh) * | 2017-12-21 | 2023-07-04 | H&A帕玛科株式会社 | 利用金属-有机骨架材料和纳米纤维素的用于透皮递送的复合物 |
| CN108300713A (zh) * | 2017-12-31 | 2018-07-20 | 宁波大学 | 固定细胞的方法及装置 |
| WO2019145795A2 (en) | 2018-01-26 | 2019-08-01 | Cellink Ab | Systems and methods for optical assessments of bioink printability |
| EP3533458B1 (en) * | 2018-03-02 | 2023-05-03 | UPM-Kymmene Corporation | A medical product comprising a bioactive molecule immobilized to nanofibrillar cellulose, and a method for preparing thereof |
| WO2019181294A1 (ja) * | 2018-03-23 | 2019-09-26 | 国立研究開発法人物質・材料研究機構 | スルホン化セルロースナノファイバーを含むハイドロゲル |
| EP3581591A1 (en) * | 2018-06-13 | 2019-12-18 | UPM-Kymmene Corporation | A nanofibrillar cellulose product and a method for manufacturing thereof |
| EP3827116A4 (en) | 2018-07-23 | 2022-05-11 | The Governors of the University of Alberta | Genetically-encoded bicyclic peptide libraries |
| EP3616730A1 (en) * | 2018-08-28 | 2020-03-04 | UPM-Kymmene Corporation | Composition or matrix for storage of bacteriophages comprising nanofibrillar cellulose |
| US11186736B2 (en) | 2018-10-10 | 2021-11-30 | Cellink Ab | Double network bioinks |
| CN114072127A (zh) * | 2019-04-22 | 2022-02-18 | Elc管理有限责任公司 | 含有纤维素纳米纤维的局部递送系统 |
| EP3750982A1 (en) * | 2019-06-10 | 2020-12-16 | UPM-Kymmene Corporation | Cell culture plate, method for preparing thereof and method for detecting a substance |
| HUP1900226A1 (hu) * | 2019-06-21 | 2020-12-28 | Hummel Zoltan Dr | Hidrofil mikrobiális cellulóz nanorostokat tartalmazó hordozóanyag (gél) a bélnyálkahártya állapotának javítására |
| KR20220012932A (ko) * | 2019-06-24 | 2022-02-04 | 유피엠-큄메네 코퍼레이션 | 나노피브릴 셀룰로스 하이드로겔 내에 진핵생물 세포를 포함하는 이식가능한 세포 조성물, 그 제조 방법 및 나노피브릴 셀룰로스의 용도 |
| CN110387060B (zh) * | 2019-07-15 | 2021-10-29 | 陕西科技大学 | 一种用于细胞培养的水下透明多孔纤维素纸基材料及其制备方法和应用 |
| EP3771470A1 (en) * | 2019-07-29 | 2021-02-03 | UPM-Kymmene Corporation | Medical hydrogel comprising nanofibrillar cellulose, tailored wound dressing, and methods for preparing thereof |
| US11826951B2 (en) | 2019-09-06 | 2023-11-28 | Cellink Ab | Temperature-controlled multi-material overprinting |
| EP3791864A1 (en) | 2019-09-13 | 2021-03-17 | UPM-Kymmene Corporation | Method for preparing pharmaceutical composition and pharmaceutical composition |
| EP3791858A1 (en) * | 2019-09-13 | 2021-03-17 | UPM-Kymmene Corporation | Injectable pharmaceutical formulation |
| US11131059B2 (en) * | 2019-11-15 | 2021-09-28 | Innovatech Engineering Llc | Nanocellulose composite sheet for use as dermatological treatment or medical device |
| US11617744B2 (en) | 2019-12-09 | 2023-04-04 | Nico Ventures Trading Limited | Moist oral compositions |
| US12433321B2 (en) | 2019-12-09 | 2025-10-07 | Nicoventures Trading Limited | Oral composition with beet material |
| US11826462B2 (en) | 2019-12-09 | 2023-11-28 | Nicoventures Trading Limited | Oral product with sustained flavor release |
| US11969502B2 (en) | 2019-12-09 | 2024-04-30 | Nicoventures Trading Limited | Oral products |
| US12439949B2 (en) | 2019-12-09 | 2025-10-14 | Nicoventures Trading Limited | Oral compositions with reduced water activity |
| US12439952B2 (en) | 2019-12-09 | 2025-10-14 | Nicoventures Trading Limited | Moist oral compositions |
| US12310959B2 (en) | 2019-12-09 | 2025-05-27 | Nicoventures Trading Limited | Oral compositions with reduced water content |
| US20220295861A1 (en) * | 2019-12-09 | 2022-09-22 | Nicoventures Trading Limited | Oral composition with nanocrystalline cellulose |
| US11872231B2 (en) | 2019-12-09 | 2024-01-16 | Nicoventures Trading Limited | Moist oral product comprising an active ingredient |
| US12491250B2 (en) * | 2019-12-09 | 2025-12-09 | Nicoventures Trading Limited | Oral composition with nanocrystalline cellulose |
| US11793230B2 (en) | 2019-12-09 | 2023-10-24 | Nicoventures Trading Limited | Oral products with improved binding of active ingredients |
| GB2592240B (en) | 2020-02-21 | 2022-03-23 | Advanced Biofuel Solutions Ltd | Waste processing system |
| JP2021136912A (ja) * | 2020-03-04 | 2021-09-16 | 国立大学法人東海国立大学機構 | 細胞の機能を変化させる方法 |
| JP7502888B2 (ja) * | 2020-04-20 | 2024-06-19 | 三洋化成工業株式会社 | 細胞培養基材用コーティング剤、細胞培養基材、細胞培養用キット及び細胞シートの生産方法 |
| EP4188468A1 (en) * | 2020-07-31 | 2023-06-07 | Ocean Tunicell AS | Biocompatible, injectable and in situ gelling hydrogels and preparation and applications of biocompatible, injectable and in situ gelling hydrogels based on cellulose nanofibrils for tissue and organ repair |
| CN112138215B (zh) * | 2020-09-26 | 2021-11-05 | 江苏大学 | 基于纳米纤维素的细胞生长因子缓释各向异性支架构建方法和应用 |
| MX2023015529A (es) | 2021-06-25 | 2024-03-05 | Nicoventures Trading Ltd | Productos orales y metodo de fabricacion. |
| CA3229908A1 (en) * | 2021-09-02 | 2023-03-09 | Darren James Martin | Injectable composition |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20070275458A1 (en) * | 2005-12-09 | 2007-11-29 | The Research Foundation Of State University Of New York | Three dimensional-BIO-mimicking active scaffolds |
Family Cites Families (38)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3783073T2 (de) | 1986-04-22 | 1993-04-29 | Ajinomoto Kk | Modifiziertes, durch mikroorganismen hergestelltes zellulose-gel und sein komplex mit tierischen zellen. |
| US5254471A (en) | 1986-10-06 | 1993-10-19 | Toray Industries, Inc. | Carrier for cell culture |
| US5405953A (en) * | 1993-08-03 | 1995-04-11 | Biocontrol Incorporated | Microfibrillated oxycellulose |
| US6602994B1 (en) | 1999-02-10 | 2003-08-05 | Hercules Incorporated | Derivatized microfibrillar polysaccharide |
| US7449180B2 (en) | 2001-02-06 | 2008-11-11 | John Kisiday | Macroscopic scaffold containing amphiphilic peptides encapsulating cells |
| WO2004007683A2 (en) | 2002-07-15 | 2004-01-22 | Massachusetts Institute Of Technology | Cellular reprogramming in peptide hydrogel and uses thereof |
| US20050037082A1 (en) * | 2003-08-13 | 2005-02-17 | Wan-Kei Wan | Poly(vinyl alcohol)-bacterial cellulose nanocomposite |
| US20080146701A1 (en) | 2003-10-22 | 2008-06-19 | Sain Mohini M | Manufacturing process of cellulose nanofibers from renewable feed stocks |
| US7704740B2 (en) * | 2003-11-05 | 2010-04-27 | Michigan State University | Nanofibrillar structure and applications including cell and tissue culture |
| CN100531685C (zh) * | 2005-07-20 | 2009-08-26 | 同济大学 | 一种组织工程血管及其体外构建方法 |
| JP2009502242A (ja) | 2005-07-20 | 2009-01-29 | サーモディクス，インコーポレイティド | ポリマーがコーティングされたナノフィブリル構造体、並びに細胞維持及び分化のための方法 |
| CN100355975C (zh) | 2005-08-19 | 2007-12-19 | 清华大学 | 一种天然纳米纤维的制备方法 |
| US8951551B2 (en) * | 2005-08-31 | 2015-02-10 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Multiribbon nanocellulose as a matrix for wound healing |
| WO2007066222A1 (en) | 2005-12-06 | 2007-06-14 | Albert Mihranyan | Cellulose gel formulations |
| EP2021283B1 (en) | 2006-05-04 | 2015-07-08 | Agency for Science, Technology and Research | Mechanically reversible gel |
| JP4998981B2 (ja) | 2006-06-20 | 2012-08-15 | 国立大学法人 東京大学 | 微細セルロース繊維 |
| US20080193536A1 (en) * | 2006-08-14 | 2008-08-14 | Alireza Khademhosseini | Cell-Laden Hydrogels |
| JP5030667B2 (ja) | 2007-05-29 | 2012-09-19 | 国立大学法人京都大学 | ミクロフィブリル化セルロース複合樹脂及びその製造方法 |
| JP2008308802A (ja) | 2007-06-18 | 2008-12-25 | Univ Of Tokyo | セルロースナノファイバーの製造方法 |
| US8834917B2 (en) | 2007-11-13 | 2014-09-16 | Jawaharlal Nehru Centre For Advanced Scientific Research | Nanoparticle composition and process thereof |
| CA2705369C (fr) | 2007-11-14 | 2016-10-18 | Ma.I.A Woundcare | Biomateriau permettant la delivrance controlee d'actifs |
| JP5260033B2 (ja) | 2007-11-27 | 2013-08-14 | 花王株式会社 | 食後ｇｉｐ及び／又は食後インスリン分泌抑制剤 |
| DE102008014735A1 (de) | 2008-03-18 | 2009-09-24 | Studiengesellschaft Kohle Mbh | Verfahren zur Depolymerisation von Zellulose |
| SE0800807L (sv) | 2008-04-10 | 2009-10-11 | Stfi Packforsk Ab | Nytt förfarande |
| AT506657A1 (de) | 2008-04-14 | 2009-10-15 | Chemiefaser Lenzing Ag | Cellulosebasiertes hydrogel und verfahren zu seiner herstellung |
| JP5386866B2 (ja) | 2008-06-30 | 2014-01-15 | 国立大学法人京都大学 | ナノファイバーシート |
| JP2010013604A (ja) * | 2008-07-07 | 2010-01-21 | Toray Ind Inc | セルロース分散体 |
| US20100065236A1 (en) * | 2008-09-17 | 2010-03-18 | Marielle Henriksson | Method of producing and the use of microfibrillated paper |
| US9861096B2 (en) | 2008-10-01 | 2018-01-09 | Cornell University | Biodegradable chemical delivery system |
| US20110198282A1 (en) * | 2008-10-07 | 2011-08-18 | The Research Foundation Of State University Of New York | High flux high efficiency nanofiber membranes and methods of production thereof |
| CN101392246A (zh) * | 2008-10-29 | 2009-03-25 | 东北电力大学 | 一种利用细菌纤维素膜做载体固定化白腐真菌的方法 |
| WO2010065908A2 (en) | 2008-12-05 | 2010-06-10 | Catchmark Jeffrey M | Degradable biomolecule compositions |
| FI124724B (fi) | 2009-02-13 | 2014-12-31 | Upm Kymmene Oyj | Menetelmä muokatun selluloosan valmistamiseksi |
| US9192655B2 (en) * | 2009-03-12 | 2015-11-24 | New Jersey Institute Of Technology | System and method for a hydrogel and hydrogel composite for cartilage repair applications |
| HUE035151T2 (en) | 2009-03-30 | 2018-05-02 | Fiberlean Tech Ltd | Process for the preparation of nano-fiber cellulose gels |
| JP5243371B2 (ja) | 2009-09-07 | 2013-07-24 | 第一工業製薬株式会社 | ゲル状組成物 |
| US8940337B2 (en) | 2009-12-30 | 2015-01-27 | Axcelon Biopolymers Corporation | Transparent bacterial cellulose nanocomposite hydrogels |
| FI123988B (fi) | 2010-10-27 | 2014-01-31 | Upm Kymmene Corp | Soluviljelymateriaali |
-
2010
- 2010-10-27 FI FI20106121A patent/FI123988B/fi active IP Right Grant
-
2011
- 2011-10-26 DK DK11785713.6T patent/DK2633032T3/en active
- 2011-10-26 JP JP2013535475A patent/JP2013541956A/ja active Pending
- 2011-10-26 EP EP11785714.4A patent/EP2633033B1/en active Active
- 2011-10-26 DK DK15155375T patent/DK2975115T3/da active
- 2011-10-26 ES ES11785715.1T patent/ES2565958T3/es active Active
- 2011-10-26 CN CN201710872909.XA patent/CN107557330B/zh active Active
- 2011-10-26 ES ES11785713.6T patent/ES2537268T3/es active Active
- 2011-10-26 US US13/881,959 patent/US10612003B2/en active Active
- 2011-10-26 CN CN2011800627192A patent/CN103354834A/zh active Pending
- 2011-10-26 AU AU2011322363A patent/AU2011322363B2/en active Active
- 2011-10-26 PL PL15155375T patent/PL2975115T3/pl unknown
- 2011-10-26 EP EP11785713.6A patent/EP2633032B1/en active Active
- 2011-10-26 DK DK11785715.1T patent/DK2632493T3/da active
- 2011-10-26 SG SG2013030721A patent/SG189966A1/en unknown
- 2011-10-26 US US13/881,973 patent/US20140010790A1/en not_active Abandoned
- 2011-10-26 RU RU2013122757/10A patent/RU2597978C2/ru active
- 2011-10-26 WO PCT/FI2011/050941 patent/WO2012056111A2/en not_active Ceased
- 2011-10-26 US US13/881,982 patent/US9631177B2/en active Active
- 2011-10-26 PL PL11785713T patent/PL2633032T3/pl unknown
- 2011-10-26 EP EP15155375.7A patent/EP2975115B1/en active Active
- 2011-10-26 ES ES15155375T patent/ES2759257T3/es active Active
- 2011-10-26 WO PCT/FI2011/050939 patent/WO2012056109A2/en not_active Ceased
- 2011-10-26 WO PCT/FI2011/050940 patent/WO2012056110A2/en not_active Ceased
- 2011-10-26 BR BR112013010377-9A patent/BR112013010377B1/pt active IP Right Grant
- 2011-10-26 EP EP11785715.1A patent/EP2632493B1/en active Active
- 2011-10-26 JP JP2013535476A patent/JP6321961B2/ja active Active
- 2011-10-26 CA CA2815276A patent/CA2815276C/en active Active
-
2013
- 2013-04-24 IL IL225923A patent/IL225923B/en active IP Right Grant
-
2017
- 2017-12-15 JP JP2017241022A patent/JP6448755B2/ja active Active
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20070275458A1 (en) * | 2005-12-09 | 2007-11-29 | The Research Foundation Of State University Of New York | Three dimensional-BIO-mimicking active scaffolds |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| CHERIAN B.M. ET AL. Isolation of nanocellulose from pineapple leaf fibres by steam explosion // Carbohydrate Polymers 2010, 81, pp. 720-725. * |
| CHERIAN B.M. ET AL. Isolation of nanocellulose from pineapple leaf fibres by steam explosion // Carbohydrate Polymers 2010, 81, pp. 720-725. DEGUCHI S. ET AL. Preparation and characterization of nanofibrous cellulose plate as a new solid support for microbial culture // Soft Matter, 2007, 3, pp. 1170-1175;US 20070275458 A1, 29.11.2007. БАРМАШЕВА А.А. И ДР. Культивирование стромальных клеток костного мозга крысы на коллагене I типа разного происхождения // Клеточная трансплантология и тканевая инженерия, Том * |
| DEGUCHI S. ET AL. Preparation and characterization of nanofibrous cellulose plate as a new solid support for microbial culture // Soft Matter, 2007, 3, pp. 1170-1175; * |
| БАРМАШЕВА А.А. И ДР. Культивирование стромальных клеток костного мозга крысы на коллагене I типа разного происхождения // Клеточная трансплантология и тканевая инженерия, Том IV, N 4, 2009, c. 41-47. * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2018191244A1 (en) * | 2017-04-10 | 2018-10-18 | TheWell Bioscience | Hydrogel for cell culture and biomedical applications |
| US10603406B2 (en) | 2017-04-10 | 2020-03-31 | TheWell Bioscience | Hydrogel for cell culture and biomedical applications |
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RU2597978C2 (ru) | Материал для культур клеток, полученный из растений | |
| FI125965B (en) | Three-dimensional cell culture | |
| JP7497981B2 (ja) | 増殖細胞のための支持的ナノフィブリルセルロース足場 | |
| HK1188466B (en) | Plant derived cell culture material | |
| RU2772470C2 (ru) | Поддерживающий каркас на основе нанофибриллярной целлюлозы для растущих клеток |