DE3783073T2

DE3783073T2 - Modifiziertes, durch mikroorganismen hergestelltes zellulose-gel und sein komplex mit tierischen zellen.

Info

Publication number: DE3783073T2
Application number: DE8787303507T
Authority: DE
Inventors: Yuzuru C O Central Researc Eto; Hiroshiro C O Central R Shibai; Satoshi C O Central Res Takano; Kunihiko C O Central Watanabe; Shigeru C O Central R Yamanaka
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 1986-04-22
Filing date: 1987-04-22
Publication date: 1993-04-29
Anticipated expiration: 2007-04-23
Also published as: EP0243151A2; DE3783073D1; EP0243151B1; EP0243151A3; US5558861A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Gel aus einer mikrobiell erzeugten Cellulose, in welchem ein gegenüber tierischen Zellen adhäsives Protein an die Cellulose gebunden ist, oder die Cellulose chemisch modifiziert ist.
Dieses Gel ist als Träger für Massenkulturen von tierischen Zellen oder als medizinischer Wundschutz wertvoll. Insbesondere ein Komplex, umfassend an dieses Gel gebundene oder in dem Gel adsorbierte tierische Zellen ist als medizinischer Wundschutz wertvoll.
Das Massenkulturverfahren unter Verwendung eines Trägers, an den tierische Zellen gebunden sind, ist weit verbreitet.
Als Trägermaterial können Kunststoffe und Glas als Blatt- oder Plattenträger, vernetzte Gelatine (Gell-Beads von KC Biological Co., USA), Polyacrylamid, an das geladene Gruppen gebunden sind (Biocarrier von Bio-Rad Co., USA), Polystyrol (Biosilon von Nunc Co., Dänemark), Dextran (Super-Beads von Flow Labs Co., USA), Cellulose-Granulate (DE-52 von Whatman Co., Großbritannien) und mit Kollagen beschichtetes Dextran (Cytodex von Pharmacia Co., Schweden) als körnige Träger und Celluloseacetat als Hohlfaser-Träger erwähnt werden.
Ein schützendes Material zum Schutz einer extern verletzten oder verbrannten Haut bei einem Unfall oder Mißgeschick, das das erneute Wachstum der Epidermis fördert und die Wunde heilt wird "Wundschutz" oder "künstliche Haut" (im folgenden als Wundschutz bezeichnet) genannt.
Bis jetzt wurde meist Gaze als Wundschutz verwendet, aber kürzlich wurde lyophilisierte Schweinehaut (LPS), die der Gaze in ihren Eigenschaften überlegen ist, verwendet. Diese ist ein Material des lebenden Körpers und ähnelt in ihrem Erscheinungsbild menschlicher Haut. Das Material ist weich, besitzt gegenüber einer Wunde gute Adhäsionseigenschaften, und ist, dadurch daß es das erneute Wachstum der Haut fördert, überlegen.
Weiterhin wurde kürzlich ein Wundschutz, der aus Kollagen besteht, auf den Markt gebracht. Dieser Wundschutz liegt in Form eines Vliesstoffes oder Films vor, oder ist mit einem Silikonfilm kombiniert, und dadurch charakterisiert, daß er keine antigenen Eigenschaften besitzt und sterilisierbar ist.
Darüberhinaus wurde ein Verbundmaterial aus einem Polyaminosäurenfilm und einem synthetischen Polymerfilm als Wundschutz vorgeschlagen. Dieser Wundschutz ist dadurch gekennzeichnet, daß er nicht durch eine Protease zersetzt wird.
Zusätzlich ist ein aus menschlichem Blut hergestellter Plasmafilm oder Fibrinfilm bekannt. Dieser Film besitzt ausgezeichnete Absorptionseigenschaften und reizt den menschlichen Körper nicht.
In einem anderen Fall wird ein Wundschutz unter Verwendung eines Films aus einer mikrobiell erzeugten Cellulose, die von dem Polymer auf Aminosäuren oder dem Protein verschieden ist, in dem Britischen Patent Nr. 2131.701 vorgeschlagen.
Gewöhnlich zur Massenkultur von tierischen Zellen verwendete Materialien führen zu Problemen, da die Adhäsion von tierischen Zellen und die Propagationsmenge der tierischen Zellen ungenügend sind. Weiterhin wurde ein Material, das einen blattförmigen oder plattenförmigen Träger mit ausgezeichneter Weichheit und dergleichen liefern könnte, noch nicht entwickelt.
Außerdem verursachen Materialien, die bis jetzt als Wundschutz verwendet wurden, folgende Probleme. Ein aus lyophilisierter Schweinehaut oder Kollagen hergestellter Wundschutz wird leicht durch eine Protease abgebaut, wird zersetzt und verursacht so Verunreinigungen. Demzufolge ist es nötig den Wundschutz öfters zu erneuern. Ein Film aus einer Polyaminosäure wird nicht durch eine Protease zersetzt, aber der Film muß durch einen geeigneten Träger wie einen Silikonfilm unterstützt werden, und der Herstellungsprozess ist kompliziert. Ein aus menschlichem Blut hergestellter Plasma- oder Fibrinfilm besitzt ausgezeichnete Eigenschaften, der Film ist jedoch nicht einfach erhältlich, da das Ausgangsmaterial teuer ist. Ein Film aus einer mikrobiell erzeugten Cellulose zeigt Probleme, da die Adhäsion an die Zellen der Epidermis schlecht ist, der Film sich leicht von der Wunde löst, Verunreinung verursacht, und das Nachwachsen der Haut nicht fördert.
Es ist deshalb ein vordringliches Ziel der vorliegenden Erfindung die Probleme, die mit den herkömmlichen Materialien verbunden sind, zu lösen, und ein mikrobiell erzeugtes Cellulose-Gel zu liefern, das zur Propagation von tierischen Zellen, die ausgezeichnete Adhäsion gegenüber Zellen der Epidermis besitzt, geeignet ist.
Gemäß einem Gesichtspunkt der vorliegenden Erfindung wird ein Gel aus einer modifizierten mikrobiell erzeugten Cellulose zur Verfügung gestellt, an die ein gegenüber tierischen Zellen adhäsives Protein physikalisch oder chemisch gebunden ist und/oder in der Wasserstoffatome von wenigstens einigen Hydroxylgruppen durch eine positiv oder negativ geladene organische Gruppe ersetzt sind.
Gemäß einem anderen Gesichtspunkt der vorliegenden Erfindung wird ein Verbundmaterial zur Verfügung gestellt, das tierische Zellen, die in dem oben erwähnten modifizierten mikrobiell erzeugten Cellulosegel adsorbiert, oder an dieses gebunden sind, umfaßt.
Gemäß einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein Verbundmaterial zur Verfügung gestellt, das ein Gel aus einer unmodifizierten, mikrobiell erzeugten Cellulose und tierischen Zellen, die in dem Gel adsorbiert oder an dieses gebunden sind, umfaßt.
Unter dem Ausdruck "mikrobiell erzeugte Cellulose" wird durch einen Mikroorganismus hergestellte Cellulose verstanden.
Unter dem Ausdruck "ein Gel von aus mikrobiell erzeugter Cellulose" wird eine feste kolloidale Lösung einer mikrobiell erzeugten Cellulose in einer physiologisch verträglichen Flüssigkeit, wie entionisiertem Wasser, Kochsalzlösung oder Glycerin, verstanden. Ein typisches Beispiel der physiologisch verträglichen Flüssigkeit ist entionisiertes Wasser.
Die mikrobiell erzeugte Cellulose kann gemäß den folgenden Verfahren erhalten werden.
Beliebige Mikroorganismen der Gattungen Acetobacter, Pseudomonas und Agrobacterium können als Cellulose produzierende Mikroorganismen verwendet werden. Z.B. kann Acetobacter aceti subspecies xylinum, ATCC 10821 erwähnt werden.
Gemäß der vorliegenden Erfindung erfolgt die Herstellung von durch Mikroorganismen hergestellter Cellulose durch Beimpfen eines gewöhnlichen Kultur-Nährmediums, umfassend eine Kohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle, anorganische Salze und wenn nötig, organische Spuren-Nährstoffe wie Aminosäuren und Vitamine, mit einem Cellulose produzierenden Mikroorganismus, und Stehenlassen oder leichtes Rühren des Kulturmediums unter Luftzufuhr. Als Kohlenstoffquelle können Glucose, Saccharose, Maltose, hydrolysierte Stärke und Melasse erwähnt werden. Weiterhin können Ethanol, Essigsäure, Zitronensäure oder dergleichen, allein oder in Kombination mit den obenerwähnten Kohlenstoffquellen verwendet werden. Als Stickstoffquelle können Ammoniumsalze, wie Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid und Ammoniumphosphat, Nitrate, Harnstoff und Pepton verwendet werden. Als organische Spuren-Nährstoffe können Aminosäuren, Vitamine, Fettsäuren und Nucleinsäuren, und Pepton, Casaminosäuren, Hefe-Extrakte und Soyabohnen-Proteolyseprodukte, die diese Spuren-Nährstoffe enthalten, genannt werden. Wenn ein Nährstoff- Defizienz-Mutant, der eine Aminosäure oder Ähnliches zum Wachstum benötigt, verwendet wird, ist es notwendig diese Nährstoffe zuzugeben. Als anorganisches Salz kann ein Salz der Phosphorsäure, ein Magnesiumsalz, ein Calciumsalz, ein Eisensalz und ein Mangansalz verwendet werden.
Übliche Kulturbedingungen können angewandt werden. Wenn das Kultivieren bei einem pH Wert von 2,5 bis 9 und einer Temperatur von 20 bis 40ºC für 1 bis 30 Tage durchgeführt wird, wird mikrobiell erzeugte Cellulose in der Oberflächenschicht des Kulturmediums erhalten.
Die so erhaltene, mikrobiell erzeugte Cellulose ist in Form eines Gels, das eine große Menge an Wasser enthält und eine Struktur besitzt, in der bandförmige Mikrofibrillen, die eine Breite von 100 bis 500 Å und eine Dicke von 10 bis 200 Å besitzen, miteinander verwickelt sind.
Der Wassergehalt der mikrobiell erzeugten Cellulose beträgt wenigstens 95% (Vol/Vol). Die mikrobiell erzeugte Cellulose wird leicht durch eine Cellulase zu Glucose zersetzt. Im besonderen wird bei Umsetzung einer Suspension der mikrobiell erzeugten Cellulose mit einer Konzentration von 0,1% (w/v) bei 30ºC für 24 Stunden mit einer 0,5% igen (w/v) Lösung einer Cellulase in einer 0,1 M Essigsäurepuffer-Lösung (EC 3.2.1.4 von Amano Pharmaceutical Co.) ersichtlich, daß ein Teil der mikrobiell erzeugten Cellulose abgebaut wird. Wenn der Überstand isoliert und mittels Papierchromatographie untersucht wird, werden Glucose, kleine Mengen an Cellobiose, Cellotriose und Cellooligosaccharide nachgewiesen. In einigen Fällen werden zusätzlich kleine Mengen an Fructose und Mannose nachgewiesen.
Die Art der in der vorliegenden Erfindung verwendeten, mikrobiell erzeugten Cellulose ist nicht besonders kritisch, solange sie die vorstehenden Eigenschaften besitzt.
Nicht nur die aus dem Kulturmedium isolierte, mikrobiell erzeugte Cellulose, sondern auch die mikrobiell erzeugte Cellulose, die bestimmte Verunreinigungen enthält, kann in der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Beispielsweise können in dem Kulturmedium zurückgebliebene Zucker, Salze, und Hefeextrakte in der mikrobiell erzeugten Cellulose enthalten sein. Zusätzlich können bestimmte Mengen an Mikroorganismenzellen in der mikrobiell erzeugten Cellulose enthalten sein.
Das Gel aus der durch den Fermentationsprozess erhaltenen, mikrobiell erzeugten Cellulose kann direkt nach Waschen oder nach Aufschließen des Gels durch Anwendung mechanischer Scherkräfte als Cellulose verwendet werden. Die Vorrichtung zum Ausüben mechanischer Scherung ist nicht besonders kritisch, die Zerkleinerung kann jedoch leicht durch Rotationszerkleinerungsvorrichtungen, Mischer oder dergleichen erreicht werden.
Das Gel aus der mikrobiell erzeugten Cellulose oder das zerkleinerte Gel kann einmal getrocknet werden und dann in einen gelartigen Zustand zurückgeführt werden. Das Trocknungsverfahren ist nicht besonders kritisch, jedoch muß das Trocknen bei Temperaturen, die die Cellulose nicht zersetzen, durchgeführt werden. Da die mikrobiell erzeugte Cellulose aus feinen Fasern mit vielen Hydroxylgruppen an der Oberfläche besteht, haften die Fasern während des Trocknens aneinander und verlieren die faserförmige Gestalt. Demgemäß wird zur Vermeidung des Auftretens dieses Phänomens und zur Erhaltung der Gestalt der feinen Fasern Gefriertrocknung oder Trocknung am kritischen Punkt bevorzugt angewendet.
Das Gel aus der mikrobiell erzeugten Cellulose kann zur Verstärkung, zur Änderung des spezifischen Gewichts, Immobilisierung, zur Modifizierung der Affinität, zur Verhinderung des Abgebens der flüssigen Komponente und dergleichen mit einem geeigneten Hilfsmaterial kombiniert werden. Als Hilfsmaterial zum Kombinieren sind zu nennen Vliestoffe oder andere Stoffe aus natürlichen Fasern wie Baumwolle, Wolle oder künstliche Fasern wie regenerierter Cellulose und Polyestern, Filme, Papierblätter und poröse Folien aus Polyethylen, Polyvinylalkohol und Silikonkautschuk, organische oder anorganische Granulate aus Aluminiumoxid, Glas und kristallinen Cellulosen, und wasserlösliche oder in polaren Lösungsmitteln lösliche Materialien oder hydrophile gelbildende Materialien wie Agar, Dextran, Polyacrylamid, Polyvinylpyrrolidon, Alginsäuresalze, Chitin, Hyaluronsäure, Curdlan, Polyacrylsäuresalze, Pullulan, Carrageenan, Glucomannan, Cellulosederivate und Polyethylenglycol.
Das Verfahren zur Ausbildung der Kombination lässt sich grob einteilen in ein Verfahren, in dem das Kultivieren derart durchgeführt wird, daß die Substanz, die kombiniert werden soll, dem Kulturmedium einverleibt wird und die mikrobiell erzeugte Cellulose an der Oberfläche oder im Inneren dieser Substanz ausgebildet wird, und ein Verfahren, in dem die mikrobiell erzeugte Cellulose, die durch Kultivieren in Form eines Gels erhalten wird, mit der zu kombinierenden Substanz getränkt oder verstärkt wird, oder der Gelfilm zerkleinert und dann mit der Substanz kombiniert wird.
Ein gegenüber tierischen Zellen adhäsives Protein wird physikalisch oder chemisch an die in der vorliegenden Erfindung verwendete mikrobiell erzeugte Cellulose gebunden, und/oder die mikrobiell erzeugte Cellulose wird chemisch modifiziert.
Als Verfahren zum physikalischen Binden des Proteins an die Cellulose kann ein Verfahren, in dem das Protein in der Oberfläche der mikrobiell erzeugten Cellulose adsorbiert wird, oder das Protein auf der Oberfläche der mikrobiell erzeugten Cellulose geliert wird, angewandt werden. Beispielsweise kann das Protein schon durch Eintauchen der mikrobiell erzeugten Cellulose in eine Lösung des Proteins, in der Cellulose adsorbiert werden. Darüberhinaus kann eine starke physikalische Bindung durch Adsorption der Cellulose in einer Proteinlösung und Gelieren oder Verfestigen des Proteins durch Ändern des pH- Wertes, der Temperatur, der Salzkonzentration, der Metallionenkonzentration oder dergleichen ausgebildet werden. Speziell im Falle von Kollagen ist es ausreichend den pH-Wert zu ändern, und im Falle von Gelatine die Temperatur zu senken. Vernetzung im Protein kann durch Verwendung von Glutaraldehyd oder Transglutaminase bewirkt werden.
Um die Bindefähigkeit an das Protein zu erhöhen, kann die mikrobiell erzeugte Cellulose mittels einem üblichen Verfahren in ein geeignetes Derivat umgewandelt werden, beispielsweise durch Verethern, Verestern, Pfropfen oder Deoxydation.
Als chemisches Bindungsverfahren wird gewöhnlich ein Verfahren angewendet, in dem Vernetzung durch Verwendung eines Epihalogenhydrins oder Halogencyans erreicht wird. Jedes Verfahren, das in der Lage ist, eine kovalente Bindung oder Vernetzung zwischen der Polysaccharidsubstanz und dem Protein auszubilden, kann verwendet werden.
Jedes Protein, das die Funktion besitzt, die Adhäsion von tierischen Zellen an das Gel der mikrobiell erzeugten Cellulose zu fördern, kann als das zu bindende Protein verwendet werden.
Beispielsweise können Kollagene der Typen I, II, III und IV, Atelokollagen (Handelsname, von Koken K.K., Japan geliefert), Fibronektin, und Laminin verwendet werden.
Chemische Modifizierung der mikrobiell erzeugten Cellulose wird durch Substituieren von Wasserstoffatomen von wenigstens einigen Hydroxylgruppen der Cellulose durch eine positiv oder negativ geladene organische Gruppe erreicht.
Die Einführung eines positiv geladenen Substituenten wird zur Kultivierung von tierischen Zellen bevorzugt. Bevorzugt wird ein Substituent verwendet, der Ammoniak, bei dem wenigstens ein Wasserstoff durch eine Alkylgruppe ersetzt ist, enthält, d.h. ein Substituent, der durch die folgenden Formeln (I) oder (II) repräsentiert ist:
In den Formeln (I) und (II) ist n eine ganze Zahl von 0 bis 8, und R&sub1;, R&sub2; und R&sub3; repräsentieren unabhangig ein Wasserstoffatom, eine Alkylgruppe, wie eine Methyl-, Ethyl- oder Propylgruppe, eine Arylgruppe, wie eine Phenyl- oder Naphthylgruppe, eine Aralkylgruppe, wie eine Benzylgruppe, eine Alkarylgruppe, eine Cycloalkylgruppe oder eine Alkoxyalkylgruppe, unter der Voraussetzung, daß der Fall, in dem alle Reste R&sub1;, R&sub2; und R&sub3; Wasserstoffatome sind, ausgeschlossen ist. Die Gruppen R&sub1;, R&sub2; und R&sub3; können eine Aminogruppe, eine Hydroxylgruppe oder dergleichen enthalten.
Als typische Beispiele der durch die Formeln (I) und (II) repräsentierten Substituenten können Aminoalkylgruppen wie eine Aminoethylgruppe, Dialkylaminoalkylgruppen wie eine Diethylaminoethylgruppe, Trialkylaminoalkylgruppen wie eine Triethylaminoethylgruppe, Dialkylhydroxyalkylaminoalkylgruppen wie eine Diethyl-(2-hydroxypropyl)-aminoethylgruppe, ein durch Umsetzung der Cellulose mit einem Epihalogenhydrin und einem Trialkoholamin, wie Triethanolamin, eingeführter Substituent, ein eingeführter Substituent gebildet durch Umsetzung der Cellulose mit einem quarternären Halogenhydrin, das durch Umsetzung eines Epihalogenhydrins mit einem tertiären Amin oder mit einem quarternären Amin-enthaltenden Epoxid erhalten wurde, eine Guanidinalkylgruppe, eine p-Aminobenzylgruppe und eine benzoylierte und/oder -naphthylierte Dialkylaminoalkylgruppe genannt werden.
Andere positiv geladene Substituenten als die genannten können verwendet werden, soweit sie sich in die Cellulose einführen lassen. Beispielsweise kann ein Verfahren angewendet werden, in dem die Cellulose schwach anionisiert wird, und ein geeignetes Kation, beispielsweise Polyethylenimin, in der schwach anionisierten Cellulose adsorbiert wird.
Als Methode zur Einführung eines negativ geladenen Substituenten kann ein Verfahren erwähnt werden, in welchem eine Carboxymethylgruppe, eine Carboxyethylgruppe, eine Phosphorsäuregruppe oder eine Schwefelsäuregruppe eingeführt wird.
Das erfindungsgemäße, modifizierte mikrobiell erzeugte Cellulosegel kann in verschiedenen Formen verwendet werden, das Gel wird aber vorzugsweise in Form eines blattähnlichen oder eines filmförmigen Körpers verwendet.
Die erfindungsgemäße modifizierte, mikrobiell erzeugte Cellulose kann als Träger zur Kultivierung tierischer Zellen, einschließlich menschlicher Epidermiszellen verwendet werden, wobei tierische Zellen in hoher Dichte und mit hoher Wachstumsgeschwindigkeit kultiviert werden können. Weiterhin kann die unmodifizierte, mikrobiell erzeugte Cellulose als Träger zur Kultivierung tierischer Zellen verwendet werden. Als die zu kultivierenden tierischen Zellen können alle adhäsiven Zellen von Tieren einschließlich der des Menschen angeführt werden, und einige nicht adhäsiven Zellen (Suspensionszellen), die an das erfindungsgemäße Gel gebunden werden können.
Ein normales Zellkultur-Medium, das 0 bis 50% Serum enthält, kann zur Kultivierung dieser tierischen Zellen verwendet werden. Eine gewöhnliche Zellkulturpetrischale oder Flasche aus Kunststoff kann als Kultivierungsvorrichtung verwendet werden, und wenn nötig kann eine mit einem Rotor ausgestattete Rollflasche verwendet werden.
Weiterhin kann das modifizierte oder unmodifizierte Gel der mikrobiell erzeugten Cellulose als Träger für Massenkulturen von tierischen Zellen verwendet werden.
Folglich kann das mikrobiell erzeugte Cellulosegel zur Herstellung von Interferon durch Fibroblasten, Interleukin-1 durch Mäuse-Makrophagen, Plasminogen-Aktivator durch menschliche Fibroblasten, eines onkolytischen Faktors durch humane Leukämie- Zellen, eines monoklonalen Antikörpers durch Hybridomazellen und anderer Polypeptide verwendet werden.
Zusätzlich ist ein Produkt, erhalten durch Kultivierung menschlicher Epidermiszellen, die im wesentlichen eine einzellige Schicht auf der blattförmigen, mikrobiell erzeugten Cellulose der vorliegenden Erfindung ausgebildet haben als Wundschutz oder künstliche Haut besonders wertvoll, um auf geschädigte Haut, wie verbrannte oder verletzte Haut, aufgebracht zu werden. Dieses Produkt der Kultur kann in relativ kurzer Zeit erhalten werden, und es ist ausreichend, daß das blattförmige Kulturprodukt auf die geschädigten Stellen aufgebracht wird, so daß die Zellschicht an der geschädigten Stelle haftet. Die Zellschicht, die aktiv ist, dient als Keimbildner für den Wiederaufbau der Epidermis, und bildet eine luftdurchlässige und zellundurchlässige, poröse, schützende Schicht, sobald das Cellulosegel auf der Oberseite der Oberfläche getrocknet ist. Im Falle der Herstellung und Anwendung einer derartigen künstlichen Haut gemäß herkömmlicher Technik, muß ein Verfahren angewendet werden, in dem die Epidermiszellen in mehreren Schichten auf einem Träger über eine lange Zeitspanne hinweg kultiviert werden (Howard Green und Olaniyi Kehinde, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1979, 76, 5665-8), die kultivierte Zellschicht von dem Träger durch ein beschwerliches Verfahren abgelöst wird, die Zellschicht so auf die Haut aufgebracht wird, daß die abgelöste Oberfläche (die aktive Seite) der Zellschicht an der betroffenen Stelle haftet, und die aufgebrachte Zellschicht mit einem schützenden Material wie einem Gazepolster bedeckt wird.
Die erfindungsgemäße, modifizierte mikrobiell erzeugte Cellulose ist als medizinischer Wundschutz ausgezeichnet, da die mikrobiell erzeugte Cellulose selbst ausgezeichnete Eigenschaften besitzt und starke Adhäsion an durch Modifizierung gebundene tierische Zellen hat und die modifizierte mikrobiell erzeugte Cellulose starke Adhäsion zu dem Gewebe der verwundeten Stelle besitzt.
Die vorliegende Erfindung wird nun mit Bezug auf folgende Beispiele detaillierter beschrieben.

Beispiel 1

Eine sterilisierte Petrischale mit einem Durchmesser von 15 cm wurde mit 100ml Kulturmedium beschickt, das 5g/dl Saccharose, 0,5g/dl Hefe-Extrakt (Difco), 0,5g/dl Ammoniumsulfat, 0,3g/dl KH&sub2;PO&sub4; und 0,05g/dl MgSO&sub4;*7H&sub2;O (pH= 5,0), enthielt, und bei 120ºC für 20min Dampf-sterilisiert worden war.
Das Kulturmedium wurde mit 2 Platinösen von Acetobacter aceti subspecies xylinum ATCC 10821, die bei 30ºC für 7 Tage in einer Test-Röhre mit Schräg-Agar Kulturmedium, das durch Zugabe von 2 g/dl Agar zu dem obengenannten Kulturmedium hergestellt wurde, angeimpft, und Kultivierung bei 30ºC ausgeführt. Bei Kultivierung für 2 Wochen bildete sich auf der Oberfläche der Kulturlösung ein Gelfilm mit einer Dicke von etwa 2mm, der ein celluloseartiges Polysaccharid enthielt.
Der so erhaltene Film wurde mit Wasser gewaschen, und für 30 min in eine 20 %ige, wässrige NaOH-Lösung bei 100ºC getaucht, wobei die Menge der Lösung 20 mal die des Gewichtes des Films war. Dieser Eintauchvorgang wurde weitere 2 mal wiederholt. Nach dem Eintauchvorgang wurde der Film mit einer 1n wässrigen HCl Lösung neutralisiert, und der Gelfilm in fließendem Wasser für einen Tag und eine Nacht gewaschen.
Nach dem Waschen wurden 200g des milchig-weiß transparenten Gelfilms (im weiteren kurz als "gewaschener Gelfilm" bezeichnet) mit 200g Wasser und 4g NaOH gemischt und die Mischung bei 70ºC für 1 Stunde gerührt. Dann wurde eine Lösung aus 12g Glycidyltrimethylammoniumchlorid in 40 ml Wasser der flüssigen Mischung zugegeben, und die Kationisierungsbehandlung bei 70ºC für 5 Stunden durchgeführt. Nach der Reaktion wurde die Lauge mit verdünnter Salzsäure neutralisiert, und der kationisierte Gelfilm mit Wasser gewaschen.
Der kationisierte Gelfilm wurde in eine Scheibe mit einem Durchmesser von 30 mm geschnitten und für 20 min in einer ausreichenden Menge Wasser bei 120ºC hitze-sterilisiert. Der sterilisierte kationisierte Gelfilm wurde in (a) einem 10% fötales Kälberserum enthaltenden MEM-Medium, (b) Dulbecco's modifiziertem MEM-Kulturmedium, (c) einem α-MEM-Kulturmedium, oder (d) einem RPMI-Kulturmedium ausreichend equilibriert, und dann in eine Petrischale mit einem Durchmesser von 30 mm aus Kunststoff überführt. Die Petrischale (a) wurde mit 4 ml eines 10% fötales Kälberserum enthaltenden MEM-Kulturmediums gefüllt, in dem 2x10&sup5; L-929 Zellen suspendiert waren, oder mit 4 ml eines 10% fötales Kälberserum enthaltenden MEM-Kulturmediums, in welchem 2x10&sup5; J-111 Zellen suspendiert waren. Die Petrischale (b) wurde mit 4 ml eines 10% fötales Kälberserum enthaltenden Dulbecco's modifizierten MEM-Kulturmediums, in welchem 2x10&sup5; 3T3 Swiss Albino-Zellen suspendiert waren, gefüllt, oder mit 4 ml eines 10% fötales Kälberserum enthaltenden Dulbecco's modifizierten Kulturmediums, in welchem 2x10&sup5; N-MSV-Balb/3T3 Zellen suspendiert waren. Die Petrischale (c) wurde mit 4ml eines 10% fötales Kälberserum enthaltenden α-MEM-Kulturmediums, in welchem 2x10&sup5; CHO Zellen suspendiert waren, gefüllt, und Petrischale (d) mit 4ml eines 10% fötales Kälberserum enthaltenden RPMI-Kulturmediums, in welchem 2x10&sup5; THP Zellen suspendiert waren. Stationäres Kultivieren wurde in einem Kohlendioxidgasinkubator, der auf 37ºC gehalten wurde, für 5 Tage durchgeführt. Nach Kultivierung wurde der kationisierte Gelfilm herausgenommen, mit Phosphat gepufferter Salzlösung ausreichend gewaschen, der Film für 20 min in einer 3%igen Trypsinlösung bei 37ºC behandelt, und die Zellschicht von der Oberfläche des Gelfilms mit Hilfe eines Gummi-Spatels losgelöst. Die Zahl lebender Zellen in der so erhaltenen Zellsuspension wurde gemäß des Trypan-Blau Färbeausschlußverfahrens bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt. Tabelle 1 Bewertung des kationisierten, durch das stationäre Kulturverfahren erhaltenen Gelfilms Zellen Adhärente Zellen Maus Menschl. J-111 Maus M-MSV-Balb/3T3 Maus 3T3 (Swiss albino) Hamster CHO Suspensionszellen Menschl. THP-1

Anmerkung:

A: Zahl der Zellen, die während Adhäsion an die Kunststoffpetrischale mit einem Durchmesser von 30 mm wachsen
B: Zahl der an dem nicht kationisierten gewaschenen Gelfilm haftenden Zellen
C: Zahl der Zellen die während Adhäsion an den kationisierten Gelfilm wachsen
Jede Zahl bedeutet die Zahl der Zellen pro Petrischale mit einem Durchmesser von 30 mm.

Beispiel 2

Der Gesamt-Stickstoffgehalt des in Beispiel 1 erhaltenen kationisierten Gelfilms wurde gemäß der Elementaranalysemethode und dem Kjeldahlverfahren bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 gezeigt. Tabelle 2 Elementaranalyseverfahren Kjeldahlverfahren N-Gehalt im gewaschenen Gelfilm vor Kationisierung N-Gehalt im Gelfim nach Kationisierung
Der gewaschene Gelfilm wurde getrocknet, und das Gewicht bestimmt. Dann wurde der Film pulverisiert und die Kationisierung unter den gleichen Bedingungen, wie in Beispiel 1 beschrieben, durchgeführt. Das Kationisierungsprodukt wurde anschließend gewaschen, getrocknet und das Gewicht bestimmt. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 3 gezeigt. Tabelle 3 Gewicht Trockenes Produkt des gewaschenen Gelfilms Trockenes Produkt des gewaschenen und kationisierten Gelfilms
Aus den vorstehenden Ergebnissen ist ersichtlich, daß der Substituent in etwa 0,8% der Hydroxylgruppen der Cellulose eingeführt war.

Beispiel 3

Eine Sakaguchi Flasche mit einem Volumen von 500 ml wurde mit 400 ml eines Kulturmediums der gleichen Zusammensetzung, wie in Beispiel 1 beschrieben, gefüllt und das Kulturmedium für 30 min bei 120ºC sterilisiert. Das Kulturmedium wurde mit einer Platinöse Acetobacter aceti subspecies xylinum ATCC 10821 angeimpft, und die Kultur wurde unter Schütteln 20 Tage lang auf 30ºC gehalten, um ein Saatmedium zu erhalten.
Eine Glassäule, die begast werden konnte, mit einem Volumen von 500 ml und einem Durchmesser von 4 cm, wurde unter sterilen Bedingungen mit 350 ml des oben genannten Kulturmediums gefüllt, und 50 ml des Saatmediums zugegeben. Kultivierung wurde bei 30ºC bei einer Belüftungsrate von 1/5 des Volumes der Säule/min für 2 Wochen durchgeführt, wobei ein kugeliges Pellet aus einer gelatinösen Cellulose, mit einem Durchmesser von 100 bis 200 um, erhalten wurde.
Das kugelige Pellet wurde gewaschen und in der gleichen Art und Weise, wie in Beispiel 1 beschrieben kationisiert.
Das so hergestellte, kationisierte kugelige Pellet wurde in einer angemessenen Menge destillierten Wassers suspendiert, und für 20 min bei 120ºC Hitze-sterilisiert. Das sterilisierte, kationisierte, kugelige Pellet wurde unter Verwendung eines Zentrifugalseparators wiedergewonnen und in einem 10% fötales Kälberserum enthaltenden MEM-Kulturmedium, Dulbecco's modifiziertem MEM-Kulturmedium oder einem α-MEM-Kulturmedium suspendiert. Nach ausreichender Equilibrierung wurde das kationisierte kugelige Pellet mittels eines Zentrifugalseparators gewonnen. Eine Rollflasche mit einem Gesamtvolumen von 90 ml wurde mit 8x10&sup5; so gesammelten, kationsierten kugeligen Pellets beschickt, und die Flasche mit 20 ml eines 10% fötales Kälberserum enthaltenden MEM Kulturmediums, in welchem 1x10&sup7; L-929 Zellen suspendiert waren, mit 20 ml eines 10% fötales Kälberserum enthaltenden MEM-Kulturmediums, in welchem 1x10&sup7; J-111 Zellen suspendiert waren, oder mit 20 ml eines 10% fötales Kälberserum enthaltenden Dulbecco's modifiziertem MEM Kulturmediums, in welchem 1x10&sup7; M-MSV-Balb/3T3 Zellen suspendiert waren, gefüllt. Roll-Kultivierung wurde bei 37ºC und 100 Upm für 5 Tage in der Gegenwart von Kohlendioxidgas durchgeführt. Nach Beendigung der Kultivierung wurden einige kationisierte, granuläre Pellets als Probe genommen, und die Zahl der Zellen, die an ein granuläres Pellet hafteten mittels eines optischen Mikroskops gemessen. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 4 gezeigt. Tabelle 4 Zellen M-MSV-Balb/3T3
Die Zahl A stellt die Zahl dar, die durch Suspendieren von 60 mg Cytodex-1 (von Pharmacia Co.) in 20 ml des Kulturmediums gemäß dem Handbuch über die Verwendung von Mikroträgern (von Pharmacia, Co.), Animpfen des Kulturmediums mit 4,0x10&sup6; Zellen und Kultivierung für 5 Tage erhalten wurden.
Die Zahl B stellt die Zahl dar, die bei Verwendung des kationsierten, granulären Pellets erhalten wurde.
Jede Zahl stellt die Zahl an Zellen dar, die an Partikeln haften, die in 1 ml enthalten sind.

Beispiel 4

Der in Beispiel 1 erhaltene, gewaschene Gelfilm wurde in eine Scheibe mit einem- Durchmesser von 30 mm geschnitten und in einer angemessenen Menge destillierten Wassers für 20 min bei 120ºC Hitze-sterilisert. Der sterilisierte, gewaschene Gelfilm wurde durch eine kleine Menge einer NaOH-Lösung neutralisiert und überführt in (e) eine flüssige Mischung, umfassend 1 ml fötales Kälberserum, 8 ml Vitrogen 100 (von Collagen Co., USA) und 1 ml 10-fach konzentriertes MEM-Kulturmedium oder (f) eine flüssige Mischung, umfassend 1 ml fötales Kälberserum, 8 ml Vitrogen 100 (von Collagen Co., USA) und 1 ml 10-fach konzentriertes Dulbecco's modifiziertes MEM-Kulturmedium. Der Gelfilm wurde in diesem Zustand über Nacht bei 4ºC stehengelassen und der mit Kollagen eguilibrierte Gelfilm in eine Kunststoffpetrischale mit einem Durchmesser von 30mm überführt. Das Kollagen wurde für 10min bei 37ºC geliert.
Die Petrischale [Kollagen behandelter Gelfilm (e)] wurde mit 4 ml MEM-Kulturmedium, das 2x10&sup5; darin suspendierte L-929 Zellen und 10% fötales Kälberserum enthielt oder mit 4 ml eines MEM-Kulturmediums, das 2x10&sup5; darin suspendierte J-111 Zellen und 10% fötales Kälberserum enthielt, gefüllt, und die Petrischale, die den Kollagen-behandelten Gelfilm (f) enthielt, wurde gefüllt mit 4 ml Dulbecco's modifiziertem MEM-Kulturmedium, das 2x10&sup5; darin suspendierte 3T3 Swiss Albino Zellen und 10% fötales Kälberserum enthielt, oder mit 4 ml Dulbecco's modifiziertem MEM-Kulturmedium, das 2x10&sup5; darin suspendierte M-MSV-Balb/3T3 Zellen und 10% fötales Kälberserum enthielt. Stationäres Kultivieren wurde in einem Kohlendioxidgasinkubator für 5 Tage bei 37ºC durchgeführt. Nach Beendigung der Kultivierung wurde der Kollagen behandelte Gelfilm herausgenommen und mit Phosphat gepufferter Salzlösung ausreichend gewaschen, und der Film bei 37ºC für 20 min mit einer 0,3%igen Trypsinlösung behandelt und die Zellen von der Oberfläche des mit Kollagen behandelten Gelfilms unter Verwendung eines Gummispatels abgelöst. Die Zahl der lebenden Zellen in der erhaltenen Zellsuspension wurde nach dem Trypan-Blau-Färbeausschlußverfahren gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 gezeigt. Tabelle 5 Bewertung des durch stationäres Kultivierungsverfahren erhaltenen kollagenbehandelten Gelfilms Zellen M-MSV-Balb/3T3 3T3 Swiss Albino

Anmerkung:

A: Zahl der in der Kunststoffpetrischale mit einem Durchmesser von 30 mm wachsenden Zellen
B: Zahl der wachsenden Zellen bei Verwendung des gewaschenen, nicht mit Kollagen behandelten Gelfilms
C: Zahl der in dem mit Kollagen behandelten, gewaschenen Gelfilm wachsenden Zellen
Jede Zahl stellt die Zahl der Zellen pro Petrischale mit einem Durchmesser von 30 mm dar.

Beispiel 5

Eine Mischung aus 200g des in Beispiel 1 erhaltenen gewaschenen Gelfilms, 200g Wasser und 4g NaOH wurde 2 Stunden lang bei 80ºC gerührt, und 10g 2-Bromoethylamin-hydrobromid der flüssigen Mischung über einen Zeitraum von 30 min zugegeben, und die Reaktion 6 Stunden lang bei 80ºC durchgeführt. Nach Beendigung der Reaktion wurde das Alkali mit verdünnter Salzsäure neutralisiert und der erhaltene aminoethylierte Gelfilm mit einer ausreichenden Menge Wasser gewaschen.

Beispiel 6

Eine Mischung, umfassend 200g des in Beispiel 1 erhaltenen gewaschenen Gelfilms, 200g Wasser und 3,5g NaOH wurde 1 Stunde lang bei 80ºC gerührt und 15g 2-Dimethylaminoethyl-hydrochlorid und 40ml Wasser der flüssigen Mischung zugegeben und die Reaktion 6 Stunden lang bei 80ºC durchgeführt. Nach Beendigung der Reaktion wurde das Alkali mit verdünnter Salzsäure neutralisiert und der erhaltene diethylaminoethylierte Gelfilm mit einer angemessenen Menge Wasser gewaschen.

Beispiel 7

Eine Mischung, umfassend den in Beispiel 1 erhaltenen gewaschenen Gelfilm, 100g Wasser und 2g NaOH ließ man 1 Stunde lang bei 70ºC stehen. Danach wurden 5g Epichlorhydrin der flüssigen Mischung zugegeben und die Mischung für weitere 5 Stunden bei 80ºC stehen gelassen. Der behandelte Gelfilm wurde gewaschen und in eine Scheibe von 30 mm Durchmesser geschnitten. Der Film wurde 20 min lang in destilliertem Wasser bei 120ºC lang Hitze-sterilisiert. Dann wurden 3 ml Vitrogen 100 (von Collagen Co., USA), 5 ml Wasser und 1 ml 10-fach konzentriertes MEM-Kulturmedium dem Gelfilm zugegeben und man ließ den Film in diesem Zustand für einen Tag und eine Nacht bei 40ºC zur Ausbildung kovalenter Bindungen zwischen dem Gel-Cellulose-Film und dem Kollagen stehen.

Beispiel 8

Der in Beispiel 1 erhaltene gewaschene Gelfilm (100g) wurde in 1 l Wasser gegeben und der pH-Wert mittels 10n NaOH auf 11,5 eingestellt. Während 20g Bromcyan langsam zugegeben wurden, ließ man 10n NaOH so zutropfen, daß der pH-Wert nicht unter etwa 11,5 sank. Die Reaktion wurde 1 Stunde lang bei 30ºC durchge-führt. Das erhaltene aktivierte Gel wurde für drei Stunden unter fließendem Wasser gewaschen. Das aktivierte Gel wurde 2 Stunden lang mit einer Lösung aus 500 mg Kollagen in 10 ml Wasser bei 20ºC umgesetzt. Nach der Reaktion wurde das mit Kollagen verbundene Gel in fließendem Wasser gewaschen. Das Gel wurde 24 Stunden lang bei Raumtemperatur in Tris/HCl-Puffer mit einem pH- Wert von 8 getaucht, um überschüssiges Bromcyan zu blockieren. Der Tris/HCl-Puffer wurde unter fließendem Wasser ausgewaschen.

Beispiel 9

Eine Mischung umfassend 100g des in Beispiel 1 erhaltenen gewaschenen Gelfilms, 100g Wasser und 3g NaOH wurde 1 Stunde lang bei 60ºC gerührt. Danach wurden 100 ml einer 1%-igen, wässrigen Lösung von Chloressigsäure mit einem, mit NaOH eingestellten pH-Wert von 12, der flüssigen Mischung zugegeben, und die Reaktion für 4 Stunden bei 90ºC durchgeführt. Nach der Reaktion wurde das Alkali mit verdünnter Salzsäure neutralisiert und der erhaltene carboxymethylierte Gelfilm mit einer angemessenen Menge Wasser gewaschen.

Beispiel 10

Toxizitäts- und Pyrogentest des in Beispiel 1 erhaltenen gewaschenen Gelfilms.

100g des in Beispiel 1 erhaltenen, gewaschenen Gelfilms wurden 24 Stunden lang bei 37ºC in 900ml einer physiologischen Salzlösung getaucht. Die Flüssigkeit wurde nach dem Eintauchen den folgenden Tests unterworfen. Physiologische Salzlösung vor dem Eintauchen wurde als Kontrolle verwendet.

(1) Test für akute Toxizität

Die Probenflüssigkeit wurde intravenös, in einer Menge von 50 ml/kg in 10 Mäuse mit einem Körpergewicht von 18 bis 21g injiziert. Gewichtsänderungen wurden täglich, über einen Zeitraum von 5 Tagen gemessen. Kein deutlicher Unterschied wurde zwischen der Probenflüssigkeit und der Kontrolle beobachtet.

(2) Pyrogentest

Die Probenflüssigkeit wurde intravenös in einer Menge von 10 ml/kg in 3 Kaninchen mit einem Körpergewicht von 1,7 bis 1,9 kg injiziert. Die Körpertemperatur wurde 3 mal in Intervallen von 1 Stunde gemessen. Temperaturerhöhung wurde nicht beobachtet.

(3) Test zur Bestimmung von Endotoxin

Endotoxin in der Probenflüssigkeit wurde unter Verwendung von Pyrodick (Reagenz zur Bestimmung von Endotoxin durch Kolorimetrie; von Seikagaku Kogyo K.K.) bestimmt. Endotoxin wurde überhaupt nicht nachgewiesen.

Beispiel 11

Zell-Kultur-Test unter Verwendung von in den Beispielen 1, 4, 5, 6, 7, 8 und 9 erhaltenen Gelfilmen.

Jeder der in den Beispielen 1, 4, 5, 6, 7, 8 und 9 erhaltenen Gelfilme wurde in eine Scheibe mit einem Durchmesser von 30 mm geschnitten. Der Film wurde bei 120ºC 20 min lang Hitze-sterilisiert oder UV-sterilisiert. Der sterilisierte Gelfilm wurde ausreichend mit 10% fötales Kälberserum enthaltendem MEM-Kulturmedium equilibriert und in eine Kunststoffpetrischale mit einem Durchmesser von 30 mm gelegt. Danach wurde die Petrischale mit 4 ml eines MEM-Kulturmediums, das 2x10&sup5; suspendierte L-929 Zellen und 10% fötales Kälberserum enthielt, gefüllt und in einem Kohlendioxidgas-Inkubator für 5 Tage bei 37ºC stationär kultiviert. Nach Kultivierung wurde der Gelfilm herausgenommen, mit Phosphat gepufferter Salzlösung 20 min lang bei 37ºC gewaschen und mit 4ml einer 0,3% igen Trypsinlösung behandelt. Die Zellen wurden von der Oberfläche des kationisierten Gelfilms mittels eines Gummispatels abgelöst. Die Zahl der lebenden Zellen in der erhaltenen Zellsuspension wurde mittels des Trypan-Blau-Färbeausschlußtests gemessen. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 6 gezeigt. Tabelle 6 Kultivierung von L-929 Zellen unter Verwendung eines mit verschiedenen Verfahren behandelten Gelfilms Behandlung des Gelfilms Zahl der Zellen* Unbehandelt (gewaschener Gelfilm) Kollagenbehandlung (Beispiel 4) Kollagen-Vernetzung (Beispiel 7) Kationisierung (Beispiel 1) Aminoethylierung (Beispiel 5) DEAE Umsetzng (Beispiel 6) Carboxymethylierung (Beispiel 9) Kollagen Vernetzung (Beispiel 8) Kationisierung und Kollagen Behandlung**

Anmerkung:

* : Zahl lebender Zellen, wiedergewonnen von einem Gelfilm mit einem Durchmesser von 30 mm
** : der in Beispiel 1 erhaltene kationisierte Gelfilm wurde der Kollagenbehandlung gemäß dem in Beispiel 3 beschriebenen Verfahren unterworfen

Beispiel 12

Ein gewaschener Gelfilm, ein kationisierter, gewaschener Gelfilm und ein kationisierter und mit Kollagen behandelter Gelfilm wurden unter sterilen Bedingungen nach den in den Beispielen 1 und 4 beschriebenen Verfahren erhalten. Jeder mikrobiell erzeugte Cellulosegelfilm wurde in eine Scheibe mit einem Durchmesser von 2 cm geformt. Einer 6 Wochen alten SD Ratte mit einem Körpergewicht von 250g wurden die Haare vom Rücken entfernt. Die runde Hautfläche wurde mit einer Wunde experimentell mit einem Durchmesser von 1 bis 2 cm und einer Tiefe von durchschnittlich etwa 0,5 bis etwa 1 mm versehen, die Wunde mit einem chirurgischen Faden vernäht und Gaze darauf gelegt. Nach 10 Tagen wurde das Nachwachsen der Haut in der Wunde untersucht. Jeder Gelfilm war der als Kontrolle verwendeten Vaselin-Gaze überlegen. Bei Verwendung des kationisierten Gelfilms und des kationisierten und mit Kollagen behandelten Gelfilms war die Haftung an das Gewebe der verletzten Stelle besonders gut. Nach 20 Tagen fiel jeder Film von der Oberfläche der Haut ab.

Beispiel 13

Ein sterilisierter, gewaschener Gelfilm, ein nach dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren erhaltener, kationisierter Gelfilm und ein in Beispiel 4 erhaltener, mit Kollagen behandelter kationisierter Gelfilm, wurde jeweils in eine Scheibe mit einem Duchmesser von 30 mm geschnitten und ausreichend in 10% fötales Kälberserum enthaltendem Dulbecco's modifiziertem MEM- Kulturmedium equilibriert, und der Film in eine Kunststoffpetrischale mit einem Durchmesser von 30 mm gelegt. Die Petrischale wurde mit 2 ml 10% fötales Kälberserum enthaltendem Dulbecco's modifziertem MEM-Kulturmedium, in welchem 3,5x10&sup5; Maus-3T3 Zellen suspendiert waren, die mit γ-Strahlen von 8000 Röntgen bestrahlt wurden, gefüllt, und die Petrischale 6 Stunden lang in einen Kohlendioxidgasinkubator bei 37ºC stehengelassen. Nach Entfernen des Kulturmediums wurde die Petrischale mit einem Kulturmedium für menschliche epidermale Keratinozyten (nach dem Verfahren von Green et al. hergestellt) gefüllt, das hauptsächlich aus 2 ml, 10% fötales Kälberserum enthaltendem Dulbecco's modifiziertem MEM-Kulturmedium bestand, in dem 2x10&sup5; menschliche epidermale Keratinozyten, die gemäß dem Verfahren von Green et al. (Howard Green and Olaniyi Kehinde, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1979, 76, 5665-8) kultiviert wurden, suspendiert waren, und die Kultivierung wurde in einem Kohlendioxidgasinkubator für 5 Tage bei 37ºC durchgeführt. Nach Kultivierung wurde die Zahl der auf dem Gelfilm gewachsenen menschlichen epidermalen Keratinozyten unter Verwendung eines Mikroskops bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 7 gezeigt. Tabelle 7 Kultivierung menschlicher epidermaler Keratinozyten-Zellen unter Verwendung von Gelfilmen Gelfilm Zellzahl Gewaschener Gelfilm Kationisierter Gelfilm Kationisierter und mit Kollagen behandelter Gelfilm

Anmerkung:

*: der Wert in Klammern zeigt die Zahl der Zellen, die erhalten werden, wenn menschliche epidermale Keratinozyten-Zellen unter Verwendung des Gelfilms, an dem mit γ- Strahlen behandelte Maus-3T3 Zellen nicht haften, kultiviert werden.
Nachdem die Zellen 5 Tage lang in der oben genannten Art und Weise unter Bildung einer im wesentlichen einzelligen Schicht kultiviert worden waren, wurde die Kultivierung für 10 Tage weitergeführt. Die Bildung von deutlichen Mehrfachschichten wurde mittels mikroskopischer Beobachtung bestätigt.

Beispiel 14

Ein gewaschener sterilisierter Gelfilm, ein nach dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren erhaltener kationisierter Gelfilm, und ein nach dem in Beispiel 4 beschriebenen Verfahren mit Kollagen behandelter kationisierter Gelfilm wurden jeweils in eine Scheibe mit einem Durchmesser von 30 mm geschnitten, ausreichend in Dulbecco's modifiziertem MEM-Kulturmedium equilibriert und in eine Petrischale mit einem Durchmesser von 30 mm gelegt. Die Petrischale wurde mit einem Kulturmedium für menschliche epidermale Keratinozyten [nach dem Verfahren von Green et al. hergestellt (Howard Green and Olaniyi Kahinde, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1976, 76, 5665-8)], das hauptsächlich aus 2 ml, 10% fötales Kälberserum enthaltendem Dulbecco's modifiziertem MEM-Kulturmedium bestand, in dem 2x10&sup5; oder 4x10&sup6; menschliche epidermale Keratinozyten-Zellen suspendiert waren. Die Petrischale wurde für 6 Stunden bei 37ºC in einem Kohlendioxidgas-Inkubator stehengelassen, um Adhäsion der menschlichen epidermalen Keratinozyten-Zellen an die Gelmembran zu ermöglichen. Tabelle 8 Gelfilm Zahl der an dem Gelfilm haftenden Zellen Gewaschener Gelfilm Kationisierter Gelfilm Kationisierter und mit Kollagen behandelter Gelfilm

Anmerkung:

* : Zahl der in der zugesetzten Suspension enthaltenen Zellen

Beispiel 15

Der in Beispiel 6 erhaltene diaminoethylierte Gelfilm wurde für 3 Stunden bei 50ºC in eine 0,5%ige wassrige Lösung aus Natriumalginat getaucht, um den Film mit Natriumalginat zu imprägnieren. Die Oberfläche wurde leicht mit Wasser gewaschen, um überschüssiges Natriumalginat zu entfernen. Daraufhin wurde der Film für 30 min bei Raumtemperatur in eine 0,1 m wässrige Calciumchloridlösung getaucht, wobei ein Teil des Natriumalginats in dem diethylaminoethylierten Gelfilm geliert wurde. Der Film wurde gewaschen, und tierische Zellen in der gleichen Art und Weise, wie in Beispiel 11 beschrieben kultiviert. Die Zahl der auf der Oberfläche wachsenden Zellen betrug 3,0x10&sup6;.
An dem diethylaminoethylierten Gelfilm, dem mit Natriumalginat imprägnierten, in dem das Natriumalginat dann geliert wurde, an dem nicht mit Natriumalginat imprägnierten Gelfilm und einem Calciumalginat-Gel, das durch Gelieren einer 0,5%igen wässrigen Lösung von Natriumalginat in einer 0,1m wässrigen Lösung von Calciumchlorid gebildet wurde, wurde jeweils unter Verwendung eines Rheometers die Gelfestigkeit gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 9 gezeigt. Tabelle 9 (Gelfestigkeit g/cm²) Diethylaminoethylierter Gelfilm, der mit Natriumalginat imprägniert und nachfolgend geliert wurde Diethylaminoethylierter Gelfilm Gel aus Calciumalginat
Wie aus den vorhergehenden Ergebnissen ersichtlich, wurde durch Imprägnierung des cyanoethylaminoethylierten Films mit Natriumalginat mit nachfolgendem Gelieren des Natriumalginats ein guter Verstärkungseffekt erreicht, ohne einen negativen Effekt auf die Kultivierung tierischer Zellen zu zeitigen.

Beispiel 16

Der in Beispiel 1 erhaltene kationisierte Gelfilm wurde für 24 Stunden bei 30ºC in eine 7%-ige wässrige Lösung von Polyvinylalkohol (mit einem durchschnittlichen Polymerisationsgrad von 2000) zur Imprägnierung des Films mit Polyvinylalkohol getaucht. Die Oberfläche des Films wurde zur Entfernung überschüssigen Polyvinylalkohols leicht mit Wasser gewaschen.
Der Film wurde für eine Stunde in einer bei -20ºC gehaltenen Atmosphäre und dann in einer bei Raumtemperatur gehaltenen Atmosphäre stehengelassen, um einen Teil des Polyvinylalkohols zu gelieren. Der Film wurde bei Raumtemperatur gewaschen, und die Kultivierung von tierischen Zellen in der gleichen Art und Weise, wie in Beispiel 11 beschrieben, durchgeführt. Die Zahl der auf der Oberfläche wachsenden Zellen betrug 3,1x10&sup6;.
An dem katiönisierten Gelfilm, der mit Polyvinylalkohol imprägniert und nachfolgend geliert wurde, dem nicht mit Polyvinylalkohol imprägnierten kationisierten Gelfilm und einem Polyvinylalkohol-Gel, das durch einstündiges Stehenlassen einer 7%-igen wässrigen Lösung von Polyvinylalkohol allein in einer auf &supmin;40ºC gehaltenen Umgebung und anschließendes Stehenlassen in einer auf Raumtemperatur gehaltenen Umgebung erhalten wurde, wurde jeweils unter Verwendung eines Rheometers die Gelfestigkeit gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 10 gezeigt. Tabelle 10 Gelfestigkeit (g/cm²) Mit Polyvinylalkohol imprägnierter, nachfolgend gelierter, kationisierter Gelfilm Kationsierter Gelfilm Gel aus Polyvinylalkohol
Wie aus den vorstehenden Ergebnissen ersichtlich ist, wird durch Imprägnierung des kationisierten Gelfilms mit Polyvinylalkohol, und nachfolgendem Gelieren des Polyvinylalkohols ein guter, verstärkender Effekt erhalten, ohne einen negativen Effekt auf die Kultivierung tierischer Zellen zu zeitigen.

Beispiel 17

Von allen 6 Gelen, deren Gelfestigkeit in Beispiel 15 und 16 gemessen wurde, wurde die ausgeschwitzte Menge der flüssigen Komponente gemessen. Dabei wurde jedes Gel zwischen zwei Filterpapiere gelegt, während 10 min ein Druck von 10 g/cm² darauf ausgeübt, und das Verhältnis der ausgeschwitzten Flüssigkeit bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 11 gezeigt. Tabelle 11 Verhältnis (%) von Exudat zu ursprünglichem Gel Diethylaminoethylierter Gelfilm, imprägniert mit Natriumalginat, und nachfolgend geliert Diethylaminethylierter Gelfilm Calciumalginat Gel Mit Polyvinylalkohol, gefolgt von Gelieren imprägnierter kationisierter Gelfilm Kationsierter Gelfilm Polyvinylalkohol-Gel
Aus den in Tabelle 11 gezeigten Ergebnissen ist ersichtlich, daß durch Imprägnierung des chemisch modifizierten, mikrobiell erzeugten Cellulosegelfilms der vorliegenden Erfindung mit Nätriumalginat oder Polyvinylalkohol das Ausschwitzen der flüssigen Komponenten verhindert werden konnte.

Claims

1. Gel aus einer mikrobiell erzeugten Cellulose, dadurch gekennzeichnet, daß die mikrobiell erzeugte Cellulose modifiziert wird durch (1) physikalisches oder chemisches Binden eines gegenüber tierischen Zellen adhäsiven Proteins an die Cellulose; (2) Substituieren von Wasserstoffatomen von wenigstens einigen Hydroxylgruppen der Cellulose durch eine positiv oder negativ geladene organische Gruppe; oder (3) Substituieren von Wasserstoffatomen von wenigstens einigen Hydroxylgruppen der Cellulose durch eine positiv oder negativ geladene organische Gruppe und weiter physikalisches oder chemisches Binden eines gegenüber tierischen Zellen adhäsiven Proteins an die Cellulose.

2. Gel aus einer mikrobiell erzeugten Cellulose nach Anspruch 1, worin die positiv geladene organische Gruppe durch die folgende Formel (I) oder (II) repräsentiert wird:

worin n eine ganze Zahl von 0 bis 8, und R&sub1;, R&sub2; und R&sub3; unabhängig voneinander ein Wasserstoffatom oder einen Alkyl-, Aryl-, Aralkyl-, Alkaryl-, Cycloalkyl- oder Alkoxyalkylrest bedeuten, unter der Voraussetzung, daß der Fall, in dem alle Reste R&sub1;, R&sub2; und R&sub3; ein Wasserstoffatom darstellen, ausgeschlossen ist.

3. Gel aus einer mikrobiell erzeugten Cellulose nach Anspruch 1, worin die negativ geladene organische Gruppe ausgewählt ist unter einer Carboxyethylgruppe, einer Carboxymethylgruppe, einer Phosphorsäuregruppe und einer Schwefelsäuregruppe.

4. Gel aus einer mikrobiell erzeugten Cellulose nach Anspruch 1, oder Anspruch 2 oder 3, worin das für tierische Zellen adhäsive Protein ausgewählt ist unter Kollagen, Fibronectin, Laminin und Gelatine.

5. Gel aus einer mikrobiell erzeugten Cellulose nach Anspruch 1 oder 4, worin das chemische Binden Vernetzung durch ein Epihalogenhydrin oder Halogencyan ist.

6. Gel aus einer mikrobiell erzeugten Cellulose nach einem der Ansprüche 1 bis 5, worin wenigstens ein Mitglied ausgewählt unter Enzymen, Bakteriostatika, antibakteriellen Mitteln, Chemotherapeutika, Koagulantien und Antikoagulantien chemisch oder physikalisch gebunden ist.

7. Gel aus einer mikrobiell erzeugten Cellulose nach einem der Ansprüche 1 bis 6, das mit einem Hilfsmaterial kombiniert ist.

8. Kombination aus einem Gel einer mikrobiell erzeugten Cellulose mit an das Gel der mikrobiell erzeugten Cellulose gebundenen oder in dem Gel adsorbierten tierischen Zellen, dadurch gekennzeichnet, daß die mikrobiell erzeugte Cellulose eine modifizierte mikrobiell erzeugte Cellulose gemäß einem der vorhergehenden Ansprüchen ist.

9. Kombination nach Anspruch 8, worin die gebundenen oder adsorbierten tierischen Zellen adhärente tierische Zellen sind.

10. Kombination nach Anspruch 9, worin die adhärenten tierischen Zellen menschliche epidermale Zellen sind.

11. Kombination nach Anspruch 10, worin die menschlichen epidermalen Zellen im wesentlichen in dem Zustand einer einzelligen Schicht auf dem Gel der mikrobiell erzeugten Cellulose kultiviert werden.

12. Kombination nach Anspruch 8, worin die gebundenen oder adsorbierten tierischen Zellen nicht adhärente tierische Zellen sind.

13. Kombination eines Gels aus mikrobiell erzeugter Cellulose mit tierischen Zellen, die an das Gel gebunden oder in diesem adsorbiert sind.

14. Kombination nach Anspruch 13, worin wenigstens ein Mitglied, ausgewählt unter Enzymen, Bakteriostatika, antibakteriellen Mitteln, Chemotherapeutika, Koagulantien und Antikoagulantien chemisch oder physikalisch gebunden ist.

15. Kombination nach Anspruch 13 oder 14, worin das Gel aus der microbiell erzeugten Cellulose weiter mit einem Hilfsmaterial kombiniert ist.

16. Kombination nach einem der Ansprüche 13 bis 15, worin die gebundenen oder adsorbierten tierischen Zellen adhärente tierische Zellen sind.

17. Kombination nach Anspruch 16, worin die adhärenten tierischen Zellen menschliche epidermale Zellen sind.

18. Kombination nach Anspruch 17, worin die menschlichen epidermalen Zellen im wesentlichen im Zustand einer einzelligen Schicht auf dem Gel der mikrobiell erzeugten Cellulose kultiviert werden.

19. Kombination nach einem der Anspjrüche 13 bis 15, worin die gebundenen oder adsorbierten tierischen Zellen nicht adhärente tierische Zellen sind.