RU2587540C1 - Способ диагностики состояния иммунной системы пациента и набор праймеров, зондов и стандартных образцов для количественной оценки днк молекул trec, krec и количества геном эквивалентов днк - Google Patents
Способ диагностики состояния иммунной системы пациента и набор праймеров, зондов и стандартных образцов для количественной оценки днк молекул trec, krec и количества геном эквивалентов днк Download PDFInfo
- Publication number
- RU2587540C1 RU2587540C1 RU2015132823/15A RU2015132823A RU2587540C1 RU 2587540 C1 RU2587540 C1 RU 2587540C1 RU 2015132823/15 A RU2015132823/15 A RU 2015132823/15A RU 2015132823 A RU2015132823 A RU 2015132823A RU 2587540 C1 RU2587540 C1 RU 2587540C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- trec
- krec
- dna
- il17ra
- molecules
- Prior art date
Links
- 239000000523 sample Substances 0.000 title claims abstract description 30
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 title claims abstract description 26
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 37
- 101001019598 Homo sapiens Interleukin-17 receptor A Proteins 0.000 claims abstract description 34
- 102100035018 Interleukin-17 receptor A Human genes 0.000 claims abstract description 31
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 claims abstract description 25
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims abstract description 22
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims abstract description 22
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims abstract description 17
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims abstract description 17
- 238000010606 normalization Methods 0.000 claims abstract description 10
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 claims abstract description 9
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 9
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 claims abstract description 6
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 claims abstract description 5
- 239000012895 dilution Substances 0.000 claims abstract description 5
- 238000010790 dilution Methods 0.000 claims abstract description 5
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims abstract description 4
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 claims abstract description 4
- 239000013615 primer Substances 0.000 claims description 19
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 15
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 claims description 13
- 239000002987 primer (paints) Substances 0.000 claims description 11
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 7
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 claims description 6
- 238000007847 digital PCR Methods 0.000 claims description 4
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 claims description 4
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 claims description 3
- 238000001917 fluorescence detection Methods 0.000 claims description 3
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 claims description 3
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 claims description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 abstract description 6
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 6
- 238000001514 detection method Methods 0.000 abstract description 3
- 239000000969 carrier Substances 0.000 abstract 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 47
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 12
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 11
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 11
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 10
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 7
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 6
- 206010061598 Immunodeficiency Diseases 0.000 description 5
- 208000029462 Immunodeficiency disease Diseases 0.000 description 5
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 5
- 230000007813 immunodeficiency Effects 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 210000004296 naive t lymphocyte Anatomy 0.000 description 5
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 description 5
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 4
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 4
- 210000004160 naive b lymphocyte Anatomy 0.000 description 4
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 4
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 4
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 208000002491 severe combined immunodeficiency Diseases 0.000 description 4
- 108091008874 T cell receptors Proteins 0.000 description 3
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 3
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 3
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 3
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 3
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 3
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 3
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FTOAOBMCPZCFFF-UHFFFAOYSA-N 5,5-diethylbarbituric acid Chemical compound CCC1(CC)C(=O)NC(=O)NC1=O FTOAOBMCPZCFFF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091008875 B cell receptors Proteins 0.000 description 2
- 108020004638 Circular DNA Proteins 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101000946889 Homo sapiens Monocyte differentiation antigen CD14 Proteins 0.000 description 2
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 2
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100035877 Monocyte differentiation antigen CD14 Human genes 0.000 description 2
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 2
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 description 2
- 208000026935 allergic disease Diseases 0.000 description 2
- 230000007815 allergy Effects 0.000 description 2
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 2
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 2
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 2
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 2
- 238000010322 bone marrow transplantation Methods 0.000 description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 2
- 230000007969 cellular immunity Effects 0.000 description 2
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 description 2
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 2
- 230000004957 immunoregulator effect Effects 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 2
- 206010034674 peritonitis Diseases 0.000 description 2
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 2
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 2
- 230000002992 thymic effect Effects 0.000 description 2
- 206010010099 Combined immunodeficiency Diseases 0.000 description 1
- 208000002330 Congenital Heart Defects Diseases 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 1
- 238000007399 DNA isolation Methods 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 1
- 206010016717 Fistula Diseases 0.000 description 1
- 208000031886 HIV Infections Diseases 0.000 description 1
- 208000037357 HIV infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 102000006354 HLA-DR Antigens Human genes 0.000 description 1
- 108010058597 HLA-DR Antigens Proteins 0.000 description 1
- 201000002563 Histoplasmosis Diseases 0.000 description 1
- 101000917858 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-A Proteins 0.000 description 1
- 101000917839 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-B Proteins 0.000 description 1
- 241000701806 Human papillomavirus Species 0.000 description 1
- 206010021450 Immunodeficiency congenital Diseases 0.000 description 1
- 206010060786 Laryngomalacia Diseases 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 102100029185 Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-B Human genes 0.000 description 1
- 208000002720 Malnutrition Diseases 0.000 description 1
- 241000582786 Monoplex Species 0.000 description 1
- 108010002747 Pfu DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 206010035669 Pneumonia aspiration Diseases 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 241000219061 Rheum Species 0.000 description 1
- 201000009594 Systemic Scleroderma Diseases 0.000 description 1
- 206010042953 Systemic sclerosis Diseases 0.000 description 1
- 201000001322 T cell deficiency Diseases 0.000 description 1
- 208000027912 T-cell immunodeficiency Diseases 0.000 description 1
- 238000011316 allogeneic transplantation Methods 0.000 description 1
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 1
- 229940127219 anticoagulant drug Drugs 0.000 description 1
- 238000011225 antiretroviral therapy Methods 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 206010003246 arthritis Diseases 0.000 description 1
- 201000009807 aspiration pneumonia Diseases 0.000 description 1
- 229960002319 barbital Drugs 0.000 description 1
- 230000002146 bilateral effect Effects 0.000 description 1
- 230000023555 blood coagulation Effects 0.000 description 1
- 238000009534 blood test Methods 0.000 description 1
- 230000032823 cell division Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 208000028831 congenital heart disease Diseases 0.000 description 1
- 239000013068 control sample Substances 0.000 description 1
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 230000006806 disease prevention Effects 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 230000005670 electromagnetic radiation Effects 0.000 description 1
- 230000003890 fistula Effects 0.000 description 1
- 230000005714 functional activity Effects 0.000 description 1
- ZJYYHGLJYGJLLN-UHFFFAOYSA-N guanidinium thiocyanate Chemical compound SC#N.NC(N)=N ZJYYHGLJYGJLLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003394 haemopoietic effect Effects 0.000 description 1
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 208000033519 human immunodeficiency virus infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 description 1
- 230000001071 malnutrition Effects 0.000 description 1
- 235000000824 malnutrition Nutrition 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 210000003519 mature b lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000011278 mitosis Effects 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 230000009707 neogenesis Effects 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 208000015380 nutritional deficiency disease Diseases 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 1
- 230000009984 peri-natal effect Effects 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 208000028529 primary immunodeficiency disease Diseases 0.000 description 1
- 239000002096 quantum dot Substances 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 230000008707 rearrangement Effects 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 238000011476 stem cell transplantation Methods 0.000 description 1
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 1
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
- C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
- C40B40/00—Libraries per se, e.g. arrays, mixtures
- C40B40/04—Libraries containing only organic compounds
- C40B40/06—Libraries containing nucleotides or polynucleotides, or derivatives thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
- C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
- C40B70/00—Tags or labels specially adapted for combinatorial chemistry or libraries, e.g. fluorescent tags or bar codes
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Группа изобретений относиться к области медицины, а именно к иммунологии, и может быть использована для диагностики состояния иммунной системы пациента на основе оценки количества наивных Т и В клеток, экспрессирующих TREC и KREC. Для этого выделяют ДНК из анализируемого образца крови. Затем производят одновременную амплификацию участков молекул ДНК TREC, KREC и нормировочного локуса IL17RA, постоянно присутствующего в единичном экземпляре в каждом цикле амплификации, осуществляемой с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР), проводимой в общей емкости при одинаковых условиях для всех амплификациируемых молекул и с участием олигонуклеотидных флуоресцентно меченых зондов, несущих на 5′-конце флуорофоры и на 3′-конце нефлуоресцентный тушитель, комплементарных центральной части амплифицируемых фрагментов. Регистрируют полученные результаты посредством гибридизационно-флуоресцентной детекции и определяют в режиме реального времени абсолютное количество молекул TREC, KREC и нормировочного локуса IL17RA в анализируемом образце ДНК с помощью калибровочных кривых, построенных при амплификации стандартных образцов ДНК, взятых не менее чем в 4-х последовательно убывающих десятикратных разведениях известных концентраций. По результатам оценки их количества производят диагностику состояния иммунной системы пациента. Группа изобретений относится также к набору праймеров, зондов и стандартных образцов для оценки количества ДНК молекул TREC, KREC, IL17RA и количества геном эквивалентов ДНК. Использование данной группы изобретения позволяет определять количество TREC и KREC наивных Т и В клеток в образцах крови с применением набора заявленных праймеров. 2 н. и 3 з.п. ф-лы, 3 табл., 4 пр., 4 табл.
Description
Изобретение относится к области иммунологии и медицины и предназначено для осуществления диагностики состояния иммунной системы пациента с целью определения нарушения функций иммунной системы, в том числе наличие первичной и вторичной иммунной недостаточности, оценки эффективности методов лечения и применяемых лекарственных средств, прогнозирования эффективности профилактики заболеваний.
Контроль состояния иммунной системы пациента позволяет своевременно диагностировать нарушения иммунного статуса организма человека, оценивать эффективность методов лечения и лекарственных средств, а также противопоказания к их применению, прогнозировать развитие заболеваний и эффективность вакцинации и т.п., что имеет большое значение для различных областей медицины.
Известен экспресс-способ определения нарушения иммунного статуса организма человека путем проведения реакции лизиса эритроцитов барана 25% сывороткой крови человека с использованием эндогенных гетерофильных антител при температуре 37,0±0,5°С в течение 10 мин в присутствии 0,288 М NaCl в буферном растворе, посредством оценки иммунного статуса (патент RU 2422831, приоритет от 19.10.2009). Степень ингибирования лизиса определялась как разность показателей лизиса в контрольной пробе (с использованием стандартизированных эритроцитов барана в вероналовом солевом буфере) и в опытных пробах, содержащих возрастающие концентрации NaCl. Предлагаемый способ отличается относительной простотой и доступностью, а также сокращает время на проведение анализа до 25 минут, однако не обеспечивает достаточной точности и полноты диагностики нарушения иммунного статуса.
Известен способ диагностики спонтанной формы вторичной иммунной недостаточности у детей с первичным перитонитом, при котором в пробе венозной крови определяют относительное содержание активированных классических моноцитов с фенотипом CD14bright CD16-HLA-DR+ от общего количества моноцитов с фенотипом CD14bright методом многоцветной проточной цитометрии и при повышенном относительном содержании активированных классических моноцитов (более 68,8%) диагностируют спонтанную форму вторичной иммунной недостаточности (патент RU 2527332, приоритет от 24.05.20130). Предлагаемый способ позволяет повысить точность выявления особенностей иммунного ответа у детей с первичным перитонитом, однако, в силу своей специфичности, имеет ограниченное применение и требует проведения целого комплекса дополнительных исследований для получения более полной оценки состояния иммунной системы.
Известен способ оценки тяжести больных с постнекротическими свищами поджелудочной железы путем исследования крови больного, при котором оценку состояния больного производят на основе показателя клеточного иммунитета - иммунорегуляторного индекса (RU 2442162, приоритет от 02.07.2010). При проведении исследований определяют методом проточной цитометрии субпопуляционный состав лимфоцитов, рассчитывают соотношение CD3+4+ Т-хелперов к CD3+8+Т-цитоксическим лимфоцитам (иммунорегуляторный индекс) и при его уровне 0,5-0,3 оценивают состояние больного как тяжелое. Предложенный способ позволяет оценить уровень клеточного иммунитета больного и по полученным результатам определить состояние больного, однако, также имеет ограниченное применение и не обладает достаточной точностью.
Известны способы определения состояния иммунной системы пациента по определению количественного содержания Т-лимфоцитов и В-лимфоцитов (Иммунодефициты: принципы диагностики и лечения, Сетдикова Н.Х. и др., ФАРМУС ПРИНТ, М., 2006). Указанные способы имеют широкую область применения, но не обеспечивают достаточно точной оценки изначального состояния иммунной системы пациента, поскольку не учитывают качество и функциональную зрелость лимфоцитов, а количество лейкоцитов в момент проведения анализа может зависеть не только от общего состояния иммунной системы пациента, но и от наличия других факторов, влияющих на иммунную, систему, в том числе, от характера и интенсивности воздействия чужеродных антигенов и/или наличия вредных электромагнитных излучений, загрязнений атмосферы и прочих сопутствующих факторов, которые могут оказать негативное воздействие на иммунную реакцию.
С учетом данных причин более точную оценку состояния иммунной системы обеспечивает способы, основанные на определении количества наивных Т-лимфоцитов и В-лимфоцитов, т.е. клеток, еще не контактирующих с антигеном и не вступивших в иммунный ответ. Известно, что во время созревания в тимусе при перестройке генов T-клеточного рецептора в тимоцитах образуется последовательность кольцевой ДНК, или TREC (signal joint T-cell receptor rearrangement excision circle: sjTREC или TREC). TRECs представляют собой нехромосомные нереплицирующиеся кольцевые ДНК продукты рекомбинации вариабельных сегментов генов, кодирующих TCR а и b цепи, в процессе созревания Т-клеток, которая присутствует в наивных Т-лимфоцитах периферической крови. Предполагается, что эта нехромосомная кольцевая ДНК не реплицируется в митозе и в процессе деления клетки переходит лишь к одной из дочерних клеток. Измерение количества TREC методом количественной полимеразной цепной реакции позволяет выявить клетки, недавно вышедшие из тимуса, и, таким образом, оценить функциональную активность тимуса [Douek DC, McFarland RD, Keiser PH, Gage EA, Massey JM, Haynes BF, Polis MA, Haase AT, Feinberg MB, Sullivan JL, Jamieson BD, Zack JA, Picker LJ, Koup RA. Changes in thymic function with age and during the treatment of HIV infection. Nature. 1998 Dec 17; 396(6712):690-5].
Количественный анализ TREC активно применяется для оценки функции тимуса и неогенеза T-клеток. Он был использован для диагностики иммунодефицитов [Amariglio N, Lev A, Simon A, Rosenthal Е, Spirer Z, et al. (2010) Molecular assessment of thymus capabilities in the evaluation of T-cell immunodeficiency. Pediatr Res 67(2): 211-216], для неонатального скрининга ПИД у новорожденных [Puck JM (2007) SCID Newborn Screening Working Group. Population-based newborn screening for severe combined immunodeficiency: steps toward implementation. J Allergy Clin Immunol 120(4): 760-768] и как предиктор восстановления Т-клеточной функции после пересадки костного мозга [Roifman CM, Somech R, Grunebaum Е (2008) Matched unrelated bone marrow transplant for T+ combined immunodeficiency. Bone Marrow Transplant 41(11): 947-952]. Квантификация TREC с помощью real-time PCR и конструирование плазмиды, несущей фрагмент TREC, необходимой для построения калибровочной кривой, была описана Douek D.C, с соавторами еще в 1998 году. В дальнейшем различные варианты real-time PCR (моноплексные и мультиплексные с мишенью, отражающей количество геном эквивалентов в исследуемой ДНК) были предложены, для некоторых была проведена достаточно тщательная аналитическая и клиническая валидация.
Кроме того, определение количества TREC используют для оценки вклада тимопоэза в восстановление Т-клеточного пула на периферии после аллогенной трансплантации стволовых кроветворных клеток или костного мозга [Farge D, Henegar С, Carmagnat М, Daneshpouy М, Marjanovic Z, Rabian С, Ilie D, Douay C, Mounier N, Clave E, Bengoufa D, Cabane J, Marolleau JP, Gluckman E, Charron D, Toubert A. Analysis of immune reconstitution after autologous bone marrow transplantation in systemic sclerosis. Arthritis Rheum. 2005 May; 52(5):1555-63.].
В работе [Baker MW, Grossman WJ, Laessig RH, Hoffman GL, Brokopp CD, Kurtycz DF, Cogley MF, Litsheim TJ, Katcher ML, Routes JM. Development of a routine newborn screening protocol for severe combined immunodeficiency. J Allergy Clin Immunol. 2009 Sep; 124(3):522-7] Baker и др. пытались оценить возможность применения количественного анализа TREC в ДНК, выделенной из Guthrie - карточек (примерно 3 мкл крови). Авторы показали, что тест адекватен для выявления новорожденных детей с ПИД и в настоящее время он применяется для этих целей в штате Висконсин (США). Для анализа авторы использовали систему, предложенную в работе Douek DC, Vescio RA, Betts MR, Brenchley JM, Hill BJ, Zhang L, Berenson JR, Collins RH, Koup RA. Assessment of thymic output in adults after haematopoietic stem-cell transplantation and prediction of T-cell reconstitution. Lancet. 2000 May 27; 355(9218):1875-81.
Применение известных способов и тест-систем, использующих количественный анализ TREC, позволяет, до определенного уровня, повысить точность оценки количества наивных Т-лимфоцитов, однако этого уровня недостаточно для получения приемлемого уровня точности диагностики состояния иммунной системы. В связи с этим для повышения точности диагностики количественные методы дополняются иными методами, т.е. являются, по существу, «полуколичественными», но все равно не обеспечивают достаточной точности и способны выявлять только грубые отклонения от нормы. Кроме того, оценка состояния иммунной системы только по количеству наивных Т-лимфоцитов, без учета количества наивных В-лимфоцитов, в принципе не в состоянии обеспечить полную и точную диагностику состояния иммунной системы.
Известны способы и тест-системы, использующие для оценки количества наивных Т-лимфоцитов и наивных В-лимфоцитов, количественный анализ TREC и KREC - рекомбинационного кольца каппа-делеционного рецептора (kappa-deleting recombination excision circle), описанные в работах [Borte S, von 
U, Fasth A, Wang N, Janzi M, Winiarski J, Sack U, 
Q, Borte M, 
L. Neonatal screening for severe primary immunodeficiency diseases using high-throughput triplex real-time PCR. Blood. 2012 Mar 15; 119(11):2552-5], где предложено одновременное определение TREC и KREC, но в дуплексном варианте и только с использованием прибора 7500 Fast Real-Time PCR (Applied Biosystems). Авторы декларировали аналитическую чувствительность не менее 10 молекул TREC и KREC в реакции. Однако авторы не привели аналитических характеристик их варианта системы и также использовали только приборы ABI 7500 и ViiA7 от Applied Biosystems. Более того, работа содержит явные ошибки и разночтения. Так авторы используют праймеры и зонды для KREC, АСТВ и TREC. А в качестве стандартов используют плазмиды TREC, KREC и TRAC. В то же время авторы выставляют довольно низкие уровни отсечения - 15 TRECs/mkL и 10 KRECs/mkL для скрининга врожденных иммунодефицитов. Таким образом, описанный авторами способ и тест-система не могут быть использованы на практике без дальнейшего улучшения и соответствующей доработки.
Известны способы и тест-системы, использующие для оценки количества наивных Т-лимфоцитов и наивных В-лимфоцитов, количественный анализ TREC и KREC - рекомбинационного кольца каппа-делеционного рецептора (kappa-deleting recombination excision circle),
Известен способ определения репликативной истории субпопуляции Т-клеток или В-клеток на основе количественного анализа TREC и BREC - В-рецепторного эксционного кольца (В - cell receptor excision circle) с использованием полимеразной цепной реакции (ПЦР) (патент ЕР 1849877, приоритет от 24.04.2006). Предложенный способ, в отличие от предыдущего аналога, не содержит препятствий для практического использования, но также не обладает достаточной точностью, необходимой для диагностики состояния иммунной системы, т.к. в способе не оговорена необходимость одновременной амплификации молекул ДНК TREC, KREC с помощью ПЦР, проводимой в общей емкости при одинаковых условиях для всех амплификациируемых молекул, что снижает сопоставимость получаемой информации и, соответственно, ее ценность для последующего анализа. Кроме того, отсутствует точный контроль за количеством циклов амплификации, что также сказывается на точности результатов анализа и не позволяет вносить соответствующие поправки.
Известно, что основной набор для ПЦР включает фрагмент ДНК, который требуется амплифицировать, праймеры, Taq-полимеразу или иную ДНК-полимеразы, буферный раствор и зонды (патент RU 2532853, приоритет от 11.03.2009). При этом, выбор праймеров и зондов определяется, прежде всего, выбором объекта, присутствие или отсутствие которого необходимо обнаружить, и выбором метода детектирования, в соответствии с которыми для каждого способа анализа нуклеиновых кислот с использованием ПЦР формируют набор, включающий праймеры и зонды, в состав которых могут также включаться биологические объекты для обеспечения внутреннего положительного или отрицательного контроля, используемые в качестве образцов стандартов. Так, в изобретении по патенту RU 2532853 при реализации способа определения целевой нуклеиновой кислоты для внутреннего положительного контроля предлагается использовать плазмидную ДНК или продукт ПЦР, когда целевой нуклеиновой кислотой является ДНК. Известны наборы праймеров и зондов с детектируемыми флуоресцентными метками, используемые для различных объектов, например, для амплификации вируса папилломы человека (патент RU 2530550, приоритет от 30.09.2009), идентификации гистоплазмоза и т.п., в том числе и для амплификации TREC и BREC (ЕР 1849877, приоритет от 24.04.2006). Однако известные способы не обеспечивают достаточной для клинической практики точности определения TREC и KREC в образцах крови.
Задачей настоящего изобретения является создание способа диагностики состояния иммунной системы пациента, позволяющего на основе оценки количества TREC и KREC наивных Т и В клеток, в образцах крови и выбранного для него набора праймеров и зондов повысить точность диагностики состояния иммунной системы пациента до необходимого в клинической практике уровня при сокращении времени проведения анализа и обеспечении возможности автоматической интерпретации полученных результатов.
Решение указанной задачи обеспечивается тем, что в отличие от известных способов диагностики состояния иммунной системы пациента на основе оценки количества наивных Т и В клеток, экспрессирующих TREC и KREC, новым является то, что выделяют ДНК из анализируемого образца крови, затем производят одновременную амплификацию участков молекул ДНК TREC, KREC и нормировочного локуса IL17RA, постоянно присутствующего в единичном экземпляре в каждом цикле амплификации, осуществляемой с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР), проводимой в общей емкости при одинаковых условиях для всех амплификациируемых молекул и с участием олигонуклеотидных флуоресцентно меченых зондов, несущих на 5′-конце флуорофоры и на 3′-конце не флуоресцентный тушитель, комплементарных центральной части амплифицируемых фрагментов, регистрируют полученные результаты посредством гибридизационно-флуоресцентной детекции, определяют в режиме реального времени абсолютное количество молекул TREC, KREC и нормировочного локуса IL17RA в анализируемом образце ДНК с помощью калибровочных кривых, построенных при амплификации стандартных образцов ДНК, взятых не менее чем в 4-х последовательно убывающих десятикратных разведениях известных концентраций, и по результатам оценки их количества производят диагностику состояния иммунной системы пациента.
Кроме того, стандартный образец ДНК представляет собой рекомбинантную плазмиду, несущую последовательность амплифицируемого фрагмента ДНК, точная концентрация которой измерена с помощью цифровой ПЦР с соответствующими праймерами и олигонуклеотидными пробами.
Кроме того, количество копий молекул ДНК TREC, KREC рассчитывается на 105 ядер содержащих клеток лейкоцитов с учетом внутреннего контроля, осуществляемого нормировочным локусом IL17RA, по формулам:
количество TREC = (количество копий TREC/количество копий IL17RA)*200000;
количество KREC = (количество копий KREC/количество копий IL17RA)*200000.
Кроме того, аналитическая чувствительность ПЦР в режиме реального времени составляет не менее 7 молекул ДНК TREC, KREC или IL17RA в реакции.
Кроме того, решение указанной задачи обеспечивается набором праймеров, зондов и стандартных образцов для оценки количества ДНК молекул TREC, KREC, IL17RA и количества геном эквивалентов ДНК, включающим:
олигонуклеотидные праймеры и пробы для амплификации при помощи одной triplex-ПЦР в реальном времени молекул ДНК TREC, KREC и IL17RA, соответственно,
и набор стандартных плазмидных ДНК образцов для TREC, KREC и IL17RA с концентраций 104, 103, 102, 5 копий на мл.
Одновременная амплификация участков молекул ДНК TREC, KREC и нормировочного локуса IL17RA, постоянно присутствующего в единичном экземпляре в каждом цикле амплификации, осуществляемой с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) и проводимой в общей емкости при одинаковых условиях для всех амплификациируемых молекул позволяет повысить точность проводимых измерений и достоверность результатов анализа, а также сократить время проведения анализа.
Использование олигонуклеотидных флуоресцентно меченых зондов несущих на 5′-конце флуорофоры и на 3′-конце не флуоресцентный тушитель, комплементарных центральной части амплифицируемых фрагментов, облегчает процесс детектирования.
Использование для регистрации полученных результатов гибридизационно-флуоресцентной детекции и определение в режиме реального времени абсолютного количества молекул ДНК TREC, KREC и нормировочного локуса IL17RA в анализируемом образце ДНК с помощью калибровочных кривых, построенных при амплификации стандартных образцов ДНК, взятых в 4-х последовательно убывающих десятикратных разведениях известных концентраций, позволяет повысить точность и достоверность результатов количественного анализа.
Использование оценки абсолютного количества молекул ДНК TREC, KREC и нормировочного локуса IL17RA в анализируемом образце ДНК повышает достоверность диагностики состояния иммунной системы пациента, а также сокращает время проведения диагностики.
Применение предложенных стандартных образцов ДНК позволяет повысить точность и достоверность результатов количественного анализа.
Использование в качестве нормировочного локуса гена IL17RA позволяет исключить ошибки при определении количества циклов амплификации.
Использование предложенного набора праймеров, зондов и стандартных образцов для оценки количества ДНК молекул TREC, KREC, IL17RA и количества геном эквивалентов ДНК, включающего:
олигонуклеотидные праймеры и пробы для амплификации при помощи одной triplex-ПЦР в реальном времени молекул ДНК TREC, KREC и IL17RA, соответственно,
и набор стандартных плазмидных ДНК образцов для TREC, KREC и IL17RA с концентраций 104, 103, 102, 5 копий на мл,
обеспечивает оптимизацию реализации способа и получение заявленного технического результата.
Результаты исследований иллюстрируются графическими изображениями:
Фиг. 1 - результаты квантификации стандартной ДНК TREC;
Фиг. 2 - результаты квантификации стандартной ДНК KREC;
Фиг. 3 - результаты квантификации стандартной ДНК IL17RA;
Фиг. 4 - таблица стандартов и калибраторов.
Предлагаемый способ диагностики может быть реализован на базе существующего уровня техники следующей последовательностью действий.
Первоначально производят взятие проб исследуемого материала. Материалом для исследования могут являться образцы крови в жидком виде или сухие пятна крови на бумаге, например периферическая кровь (ПК) больных с подозрением на иммунодефицит или сухие пятна крови новорожденных на любом подходящем носителе. Взятие ПК осуществляется в пробирки с ЭДТА (антикоагулянт, препятствующий свертыванию крови) в конечной концентрации 2 мг/мл. ПК берут из вены обычным способом.
Для выделения ДНК используют наборы «АмплиПрайм РИБО-преп» (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора) или любые другие с близкими характеристиками.
Например, метод выделения ДНК может быть основан на лизисе образцов (кровь или сухие пятна крови на бумаге) в 4 М растворе гуанидинтиоционата, и осаждении нуклеиновых кислот изопропанолом в присутствии соосадителя, с последующими отмывками этанолом, растворении осадка ДНК в 50 мкл воды.
В качестве нормировочного локуса используют ген IL17RA, позволяющий получить наиболее точные данные о процессе амплификации.
Амплификацию осуществляют с участием олигонуклеотидных флуоресцентно меченых зондов типа TaqMan, несущих на 5′-конце флуорофоры (FAM, HEX, ROX и др.) и на 3′-конце не флуоресцентный тушитель (BHQ, FTQ и др.).
Праймеры и зонды для ПЦР подобраны с учетом структур TREC и KREC таким образом, чтобы исключить отжиг на матрице геномной ДНК (перестроенной и не перестроенной в Т и В клетках), а также с учетом минимизации образумых в мультиплексной реакции праймер-димеров.
Для повышения чувствительности и специфичности ПЦР был применен «горячий старт», который обеспечивается использованием химически модифицированной Taq-полимеразы.
Оптимальную температуру отжига праймеров и зондов подбирали экспериментально с использованием режима «градиент температур», оптимальная температура составила 62°С.
Пример 1. Получение стандартных плазмидных образцов.
Фрагменты TREC, KREC и гена IL17RA для конструирования стандартных образцов амплифицировали с помощью праймеров:
в следующих условиях: реакционная смесь ПЦР объемом 50 мкл содержала: 1х буфер для Taq-полимеразы (65 мМ Tris-HCl (рН 8,9); 16 мМ (NH4)2SO4; 0,05% Tween 20; 3,5 мМ MgCl2), 0,2 мМ дНТФ, 50 нг геномной ДНК человека, 1 е.а. Taq-полимеразы (Биосан), 0,5 е.а. Pfu-полимеразы (Биосан). Амплификацию проводили в амплификаторе «Терцик» (ДНК-технология) согласно следующей программе: 3 мин при 95°С начальной денатурации, 35 циклов: 10 с при 95°С для денатурации, 10 с при 60°С для гибридизации праймеров, 40 с при 72°С для элонгации.
Продукты амплификации с праймерами TREC3/TREC4 длиной 1192 п.н., IL17-Ra3/IL17-Ra4 длиной 455 п.н. и bp и KREC3/KREC4 длиной 482 п.н. гидролизовали эндонуклеазой рестрикции HindIII (Сибэнзим, Новосибирск) и лигировали с вектором pBluscriptII SK(+), гидролизованным той же эндонуклеазой, в течение 3-х часов с 100 ед. акт. Т4 ДНК-лигазы (Биосан). Лигазной смесью трансформировали компетентные клетоки Е. coli штамма XL1-Blue (Stratagene). У плазмиды клонов, отобранных по результатам рестрикционного анализа, для подтверждения структуры определяли нуклеотидную последовательность вставки, секвенировали методом Сенгера.
Секвенирование было выполнено на автоматическом секвенаторе ABI 3130XL Genetic Analyzer (Applied Biosystems, США) с использованием набора Big dye 3.1 (Центр коллективного пользования «Геномика», ИХБФМ СО РАН). Плазмидные ДНК (pST-TREC, pST-KREC и pST-IL17RA) выделяли из 100 мл ночной культуры в среде LB с помощью QIAGEN Plasmid Midi Kit (QIAGEN) согласно инструкции фирмы производителя. Концентрацию полученных стандартных плазмидных ДНК определяли спектрофотометрически и флюорометрически (набор Qubit™ BR, Invitrogen). 2 мкг ДНК подвергали гидролизу эндонуклеазой рестрикции EcoRI для линеаризации. Полученные линейные стандарты разводили до концентрации 107-101 копий плазмидной ДНК на мкл в стерильном буфере, содержащем 10 мМ TrisHCl рН 7.6 и ДНК фага лямбда 5 нг на мкл. Концентрацию ДНК в полученных стандартах уточняли с использованием цифровой ПЦР на платформе QX100™ Droplet Digital™ PCR System (BioRad, Hercules, CA) согласно инструкциям производителя. Образцы стандартных образцов 8 мкл смешивали с 2Х ПЦР смесью и праймерами и зондами. Капли формировали с помощью Droplet Generator (DG) используя 70 µL DG Oil на лунку картриджа DG8 и 20 µL полной PCR смеси. Полученные капли (40 µL) переносили в 96-луночный ПЦР планшет, запечатывали и проводили ПЦР. Далее флуоресцентный сигнал, генерируемый в процессе гидролиза Taqman проб в каплях, был считан с помощью Droplet Reader, концентрация молекул TREC, KREC и IL17RA была определена с помощью математического обеспечения QuantaSoft. Концентрация полученных стандартных образцов было скорректирована с учетом данных цифровой ПЦР.
Пример 2. Аналитическая характеризация разработанной системы для количественного анализа TREC и KREC.
Для проверки специфичности использовались ДНК клеточных линий нелимфоидного происхождения, несущих неперестроенные Т и В клеточные рецепторы, а именно - HEK293, HeLa, Н460, а также образцы ДНК из мочи и слюны. По результатам проведенного тестирования специфичность составила 100%.
Линейный диапазон количественного определений копийности TREC, KREC и IL17RA определялся с помощью ПЦР на разведениях стандартных плазмид от 109 коп/мл до 103 коп/мл, при этом обращалось внимание на коэффициент R2 и разброс значений Ct для повторов. Было показано, что в области концентраций от 109 коп/мл до 5×104 коп/мл для всех трех мишеней наблюдается линейный диапазон изменения Ct от концентрации с коэффициентом корреляции R2 не хуже 0.98. Наименьшее количество копий, надежно детектируемых в одной ПЦР реакции объемом 25 мкл было: 10 для TREC, 5 для KREC и 5 для IL17RA.
Пример 3. Определение референсных значений для TREC и KREC в зависимости от возраста
Определение референсных значений для TREC и KREC в зависимости от возраста осуществляется на основе анализа ДНК достаточно представительной выборки соответствующей возрастной группы (50-60 чел.) людей одного поколения, имеющих нормальные иммунологические параметры, с использованием известных методов и оборудования. В качестве примера определения референсных значений для TREC и KREC в зависимости от возраста ниже приведены данные для детей возраста 0-17 лет, для получения которых использовали ДНК группы 56 здоровых (29 мальчиков и 27 девочек) с нормальными иммунологическими параметрами (Таблица 1). Для определения референсных значений для TREC и KREC у взрослых были использованы те же клинико-лабораторные и статистические подходы, что и у детей.
Полученные референсные значения приведены в Таблицах 2 и 3.
Пример 4. Клинические примеры
Пациент №1
Мальчик 4-х месяцев с диагнозом двусторонняя аспирационная пневмония, врожденный порок сердца (тетрада Фалло), состояние после наложения подключично-легочного анастамоза слева, ларингомаляция, хронический микроаспирационный синдром, недостаточность питания смешанного генеза, последствия перинатального поражения ЦНС. Концентрация TREC - на момент обследования показатели 4,04×104 копий, концентрация KREC 1,38×104 копий. Дальнейшая оценка состояния иммунной системы методом проточной цитометрии свидетельствует о течении иммунодефицита, связанного с другими уточненными значительными дефектами.
Пациент №2
Девочка 17 лет. Концентрация TREC 1,04×104 копий, концентрация KREC - на момент обследования показатели 3,18×102 копий. Дальнейшие исследования иммунной системы методом проточной цитометрии свидетельствует о снижении выхода в периферическую кровь зрелых В-лимфоцитов. Диагноз после генетического исследования: общая вариабельная иммунодефицитная недостаточность (ОВИН).
Пациент №3
Мальчик, 1 месяц. Концентрация TREC в крови из полости сердца 1,81×103 копий, концентрация KREC в крови из полости сердца 1,89×10 копий, что указывает на высокую вероятность прижизненного течения тяжелого комбинированного иммунодефицита с низким содержанием Т- и В-клеток. Посмертный диагноз после генетического исследования: тяжелый комбинированный иммунный дефицит с низким содержанием Т- и В-клеток.
Пациент №4
Мужчина 36 лет, носитель ВИЧ с возраста 30 лет. Последние несколько месяцев состояние здоровья резко ухудшилось, самочувствие страдает. Показатели общего анализа крови в пределах возрастных норм. Концентрация TREC в крови на момент обследования составляет 4,11×101 копий, концентрация KREC 2,33×103 копий. Дальнейшее обследование методом проточной цитометрии показало крайне низкое содержание субпопуляции Т-хелперов, что, в свою очередь, требует незамедлительного проведения антиретровирусной терапии.
Использование группы изобретений позволяет повысить достоверность диагностики состояния иммунной системы пациента, уменьшить ошибки определения концентрации молекул TREC и KREC, особенно в области низких значений, а также уменьшить количество необходимых для анализа реакций за счет мультиплексирования.
Claims (5)
1. Способ диагностики состояния иммунной системы пациента на основе оценки количества наивных Т и В клеток, экспрессирующих TREC и KREC, при котором выделяют ДНК из анализируемого образца крови, затем производят одновременную амплификацию участков молекул ДНК TREC, KREC и нормировочного локуса IL17RA, постоянно присутствующего в единичном экземпляре в каждом цикле амплификации, осуществляемой с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР), проводимой в общей емкости при одинаковых условиях для всех амплификациируемых молекул и с участием олигонуклеотидных флуоресцентно меченых зондов, несущих на 5′-конце флуорофоры и на 3′-конце не флуоресцентный тушитель, комплементарных центральной части амплифицируемых фрагментов, регистрируют полученные результаты посредством гибридизационно-флуоресцентной детекции, определяют в режиме реального времени абсолютное количество молекул TREC, KREC и нормировочного локуса IL17RA в анализируемом образце ДНК с помощью калибровочных кривых, построенных при амплификации стандартных образцов ДНК, взятых не менее чем в 4-х последовательно убывающих десятикратных разведениях известных концентраций, и по результатам оценки их количества производят диагностику состояния иммунной системы пациента.
2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что стандартный образец ДНК представляет собой рекомбинантную плазмиду, несущую последовательность амплифицируемого фрагмента ДНК, точная концентрация которой измерена с помощью цифровой ПЦР с соответствующими праймерами и олигонуклеотидными пробами,
3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что количество копий молекул ДНК TREC, KREC рассчитывается на 105 ядер содержащих клеток лейкоцитов с учетом внутреннего контроля, осуществляемого нормировочным локусом IL17RA, по формулам:
количество TREC = (количество копий TREC/количество копий IL17RA)*200000;
количество KREC = (количество копий KREC/количество копий IL17RA)*200000.
количество TREC = (количество копий TREC/количество копий IL17RA)*200000;
количество KREC = (количество копий KREC/количество копий IL17RA)*200000.
4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что аналитическая чувствительность ПЦР в режиме реального времени составляет не менее 7 молекул ДНК TREC, KREC или IL17RA в реакции.
5. Набор праймеров, зондов и стандартных образцов для оценки количества ДНК молекул TREC, KREC, IL17RA и количества геном эквивалентов ДНК, включающий:
олигонуклеотидные праймеры и пробы для амплификации при помощи одной triplex-ПЦР в реальном времени молекул ДНК TREC, KREC и IL17RA, соответственно,
и набор стандартных плазмидных ДНК образцов для TREC, KREC и IL17RA с концентраций 104, 103, 102, 5 копий на мл.
олигонуклеотидные праймеры и пробы для амплификации при помощи одной triplex-ПЦР в реальном времени молекул ДНК TREC, KREC и IL17RA, соответственно,
и набор стандартных плазмидных ДНК образцов для TREC, KREC и IL17RA с концентраций 104, 103, 102, 5 копий на мл.
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2015132823/15A RU2587540C1 (ru) | 2015-08-06 | 2015-08-06 | Способ диагностики состояния иммунной системы пациента и набор праймеров, зондов и стандартных образцов для количественной оценки днк молекул trec, krec и количества геном эквивалентов днк |
| PCT/RU2016/000514 WO2017023194A1 (ru) | 2015-08-06 | 2016-08-05 | Способ диагностики иммунной системы и набор для оценки днк молекул trec, krec и количество геном эквивалентов днк |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2015132823/15A RU2587540C1 (ru) | 2015-08-06 | 2015-08-06 | Способ диагностики состояния иммунной системы пациента и набор праймеров, зондов и стандартных образцов для количественной оценки днк молекул trec, krec и количества геном эквивалентов днк |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2587540C1 true RU2587540C1 (ru) | 2016-06-20 |
Family
ID=56132227
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2015132823/15A RU2587540C1 (ru) | 2015-08-06 | 2015-08-06 | Способ диагностики состояния иммунной системы пациента и набор праймеров, зондов и стандартных образцов для количественной оценки днк молекул trec, krec и количества геном эквивалентов днк |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2587540C1 (ru) |
| WO (1) | WO2017023194A1 (ru) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2645089C1 (ru) * | 2017-01-09 | 2018-02-15 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки институт иммунологии и физиологии Уральского отделения РАН | Способ экстракции днк, пригодной для проведения количественной пцр в реальном времени, из сухих пятен крови новорожденных |
| RU2699189C1 (ru) * | 2018-05-07 | 2019-09-03 | Общество с ограниченной ответственностью "НуклеоГен" | Набор олигонуклеотидных праймеров и зондов и способ количественного выявления кокковой микрофлоры методом LAMP |
| RU2756979C2 (ru) * | 2019-12-17 | 2021-10-07 | Федеральное бюджетное учреждение науки "Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Пастера Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека" (ФБУН НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера) | Способ лабораторной персонифицированной диагностики состояния иммунитета новорожденных и набор олигодезоксирибонуклеотидных праймеров и флуоресцентно меченных зондов |
| RU2807806C1 (ru) * | 2022-12-08 | 2023-11-21 | Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Томский национальный исследовательский медицинский центр Российской академии наук" | Рекомбинантная плазмидная ДНК pGEM-TCRAC-sjTREC- sjKREC, содержащая нуклеотидные последовательности локуса гена Т-лимфоцитарного α-рецептора и сигнальные фрагменты эксцизионных колец Т- и В-клеточного рецепторов |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108913770A (zh) * | 2018-07-31 | 2018-11-30 | 朱智 | 一种利用数字PCR技术的新生儿TRECs和KRECs基因拷贝数检测试剂盒及其应用 |
| CN108977529A (zh) * | 2018-07-31 | 2018-12-11 | 朱智 | 一种利用数字PCR技术的新生儿TRECs和KRECs基因拷贝数检测试剂盒及其应用 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1849877A1 (en) * | 2006-04-24 | 2007-10-31 | Erasmus University Medical Center Rotterdam | Replicative history of T-and B-cell subsets |
| RU2522801C2 (ru) * | 2012-09-27 | 2014-07-20 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Научно-исследовательский институт клинической иммунологии" Сибирского отделения Российской академии медицинских наук (ФГБУ "НИИКИ" СО РАМН) | Способ определения уровня транскрипции гена, кодирующего хемокин ccl2 (мср-1) человека и набор для его осуществления |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP2768982A4 (en) * | 2011-10-21 | 2015-06-03 | Adaptive Biotechnologies Corp | QUANTIFICATION OF ADAPTIVE IMMUNOCELL GENOMES IN A COMPLEX MIX OF CELLS |
-
2015
- 2015-08-06 RU RU2015132823/15A patent/RU2587540C1/ru active
-
2016
- 2016-08-05 WO PCT/RU2016/000514 patent/WO2017023194A1/ru not_active Ceased
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1849877A1 (en) * | 2006-04-24 | 2007-10-31 | Erasmus University Medical Center Rotterdam | Replicative history of T-and B-cell subsets |
| RU2522801C2 (ru) * | 2012-09-27 | 2014-07-20 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Научно-исследовательский институт клинической иммунологии" Сибирского отделения Российской академии медицинских наук (ФГБУ "НИИКИ" СО РАМН) | Способ определения уровня транскрипции гена, кодирующего хемокин ccl2 (мср-1) человека и набор для его осуществления |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| BORTE S. et al. Neonatal screening for severe primary immunodeficiency diseases using high-throughput triplex real-time PCR // March 15, 2012; Blood: 119 (11), р.2552-2555. БЛИНОВА Е.А. Количество TREC в периферических Т-лимфоцитах человека в норме и при иммунопатологических состояниях // Автореферат кбн, Новосибиркск, 2012, [он-лайн], [найдено 10.12. 2015]. Найдено из Интернет: < URL:http://medical-diss.com/medicina/kolichestvo-trec-v-perifericheskih-t-limfotsitah-cheloveka-v-norme-i-pri-immunopatologicheskih-sostoyaniyah. * |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2645089C1 (ru) * | 2017-01-09 | 2018-02-15 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки институт иммунологии и физиологии Уральского отделения РАН | Способ экстракции днк, пригодной для проведения количественной пцр в реальном времени, из сухих пятен крови новорожденных |
| RU2699189C1 (ru) * | 2018-05-07 | 2019-09-03 | Общество с ограниченной ответственностью "НуклеоГен" | Набор олигонуклеотидных праймеров и зондов и способ количественного выявления кокковой микрофлоры методом LAMP |
| RU2756979C2 (ru) * | 2019-12-17 | 2021-10-07 | Федеральное бюджетное учреждение науки "Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Пастера Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека" (ФБУН НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера) | Способ лабораторной персонифицированной диагностики состояния иммунитета новорожденных и набор олигодезоксирибонуклеотидных праймеров и флуоресцентно меченных зондов |
| RU2807806C1 (ru) * | 2022-12-08 | 2023-11-21 | Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Томский национальный исследовательский медицинский центр Российской академии наук" | Рекомбинантная плазмидная ДНК pGEM-TCRAC-sjTREC- sjKREC, содержащая нуклеотидные последовательности локуса гена Т-лимфоцитарного α-рецептора и сигнальные фрагменты эксцизионных колец Т- и В-клеточного рецепторов |
| RU2822204C1 (ru) * | 2023-11-16 | 2024-07-03 | Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Томский национальный исследовательский медицинский центр Российской академии наук" | Способ количественной оценки Т и В-лимфоцитов по содержанию эксцизионных колец TREC и KREC в образцах ДНК с помощью цифровой полимеразной цепной реакции |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2017023194A1 (ru) | 2017-02-09 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Bianchi et al. | PCR quantitation of fetal cells in maternal blood in normal and aneuploid pregnancies | |
| JP4245666B2 (ja) | 非侵入性の出生前診断 | |
| RU2587540C1 (ru) | Способ диагностики состояния иммунной системы пациента и набор праймеров, зондов и стандартных образцов для количественной оценки днк молекул trec, krec и количества геном эквивалентов днк | |
| AU2021290268A1 (en) | Immunorepertoire normality assessment method and its use | |
| JPH05501612A (ja) | 胎児ｄｎａ単離および検出のための非侵入性方法 | |
| CN106521023B (zh) | 一种检测中国人HPFH和δβ-地中海贫血的试剂盒及方法 | |
| Turner et al. | Detection of fetal Rhesus D gene in whole blood of women booking for routine antenatal care | |
| Willer et al. | Association between microchimerism and multiple sclerosis in Canadian twins | |
| Zhong et al. | Direct quantification of fetal cells in maternal blood by real‐time PCR | |
| CN108977529A (zh) | 一种利用数字PCR技术的新生儿TRECs和KRECs基因拷贝数检测试剂盒及其应用 | |
| Illanes et al. | Detection of cell‐free fetal DNA in maternal urine | |
| Cole et al. | Prenatal testing for Duchenne and Becker muscular dystrophy | |
| KR20120140069A (ko) | 단순포진 바이러스 1형 및 2형의 진단을 위한 프라이머 및 프로브, 이를 이용한 검사 방법 및 이를 포함하는 검사 키트 | |
| Spence et al. | Molecular analysis of the RhD genotype in fetuses at risk for RhD hemolytic disease | |
| Hehnly et al. | Cytomegalovirus infections in infants in Uganda: Newborn-mother pairs, neonates with sepsis, and infants with hydrocephalus | |
| CN105821152B (zh) | 冠心病生物标志物 | |
| Jauniaux et al. | Very early prenatal diagnosis on coelomic cells using quantitative fluorescent polymerase chain reaction | |
| Skinner et al. | Fetal DNA in maternal circulation of first-trimester spontaneous abortions | |
| CN107190074B (zh) | hsa_circRNA_103127在唐氏综合征的诊断、治疗及预后中的应用 | |
| RU2786211C1 (ru) | Способ лабораторной персонифицированной диагностики состояния иммунитета пациентов и набор олигодезоксирибонуклеотидных праймеров, и флуоресцентно меченых зондов, и стандартных образцов | |
| RU2756979C2 (ru) | Способ лабораторной персонифицированной диагностики состояния иммунитета новорожденных и набор олигодезоксирибонуклеотидных праймеров и флуоресцентно меченных зондов | |
| JP2008182993A (ja) | 遺伝子検査結果判定法およびプログラムおよびその装置 | |
| CN107190073B (zh) | hsa_circRNA_104907在唐氏综合征的诊断、治疗及预后中的应用 | |
| RU2831410C1 (ru) | Способ выявления РНК вируса Bandavirus dabieense (SFTSV) методом ОТ-ПЦР в реальном времени | |
| RU2779085C1 (ru) | Способ выявления предрасположенности к развитию метаболического синдрома в виде ожирения у школьников 7-10 лет |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| HE4A | Change of address of a patent owner |
Effective date: 20191204 |
|
| TC4A | Change in inventorship |
Effective date: 20200211 |