RU2584599C2 - Синтез фукозилированных соединений - Google Patents
Синтез фукозилированных соединений Download PDFInfo
- Publication number
- RU2584599C2 RU2584599C2 RU2011129780/10A RU2011129780A RU2584599C2 RU 2584599 C2 RU2584599 C2 RU 2584599C2 RU 2011129780/10 A RU2011129780/10 A RU 2011129780/10A RU 2011129780 A RU2011129780 A RU 2011129780A RU 2584599 C2 RU2584599 C2 RU 2584599C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- fucose
- cell
- fucosyllactose
- gene
- coli
- Prior art date
Links
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 title description 29
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 title description 12
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 title description 9
- SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N D-mannomethylose Natural products CC1OC(O)C(O)C(O)C1O SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 69
- SHZGCJCMOBCMKK-DHVFOXMCSA-N L-fucopyranose Chemical compound C[C@@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O SHZGCJCMOBCMKK-DHVFOXMCSA-N 0.000 claims abstract description 65
- PNNNRSAQSRJVSB-SLPGGIOYSA-N Fucose Natural products C[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)C=O PNNNRSAQSRJVSB-SLPGGIOYSA-N 0.000 claims abstract description 48
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 43
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 claims abstract description 27
- 150000002482 oligosaccharides Chemical class 0.000 claims abstract description 27
- 108010019236 Fucosyltransferases Proteins 0.000 claims abstract description 21
- 102000006471 Fucosyltransferases Human genes 0.000 claims abstract description 20
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 20
- PTVXQARCLQPGIR-SXUWKVJYSA-N beta-L-fucose 1-phosphate Chemical compound C[C@@H]1O[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O PTVXQARCLQPGIR-SXUWKVJYSA-N 0.000 claims abstract description 14
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 13
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims abstract description 9
- 108010045674 Fucose-1-phosphate guanylyltransferase Proteins 0.000 claims abstract description 8
- 102100037047 Fucose-1-phosphate guanylyltransferase Human genes 0.000 claims abstract description 8
- 108010068561 Fructose-Bisphosphate Aldolase Proteins 0.000 claims abstract description 7
- 241000589989 Helicobacter Species 0.000 claims abstract description 6
- 241000588722 Escherichia Species 0.000 claims abstract description 5
- 241000588748 Klebsiella Species 0.000 claims abstract description 5
- 230000006652 catabolic pathway Effects 0.000 claims abstract description 5
- 108090000769 Isomerases Proteins 0.000 claims abstract description 4
- 241000186660 Lactobacillus Species 0.000 claims abstract description 4
- 229940039696 lactobacillus Drugs 0.000 claims abstract description 4
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 claims abstract description 3
- 241000235649 Kluyveromyces Species 0.000 claims abstract description 3
- 241000194036 Lactococcus Species 0.000 claims abstract description 3
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 claims abstract description 3
- 241000235648 Pichia Species 0.000 claims abstract description 3
- 241000235070 Saccharomyces Species 0.000 claims abstract description 3
- 241000194017 Streptococcus Species 0.000 claims abstract description 3
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 claims abstract description 3
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims abstract description 3
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 3
- AUNPEJDACLEKSC-ZAYDSPBTSA-N 3-fucosyllactose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2[C@H](OC(O)[C@H](O)[C@H]2O)CO)O[C@H](CO)[C@@H]1O AUNPEJDACLEKSC-ZAYDSPBTSA-N 0.000 claims description 23
- WJPIUUDKRHCAEL-UHFFFAOYSA-N 3FL Natural products OC1C(O)C(O)C(C)OC1OC1C(OC2C(C(O)C(O)C(CO)O2)O)C(CO)OC(O)C1O WJPIUUDKRHCAEL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 23
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N lactose group Chemical group OC1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O2)CO)[C@H](O1)CO GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 claims description 22
- 239000008101 lactose Substances 0.000 claims description 21
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 16
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 16
- HWHQUWQCBPAQQH-UHFFFAOYSA-N 2-O-alpha-L-Fucosyl-lactose Natural products OC1C(O)C(O)C(C)OC1OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC(C(O)CO)C(O)C(O)C=O HWHQUWQCBPAQQH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- HWHQUWQCBPAQQH-BWRPKUOHSA-N 2-fucosyllactose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@H]([C@H](O)CO)[C@H](O)[C@@H](O)C=O HWHQUWQCBPAQQH-BWRPKUOHSA-N 0.000 claims description 14
- SNFSYLYCDAVZGP-UHFFFAOYSA-N UNPD26986 Natural products OC1C(O)C(O)C(C)OC1OC1C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)OC(CO)C(O)C1O SNFSYLYCDAVZGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- 229940062827 2'-fucosyllactose Drugs 0.000 claims description 12
- RTVRUWIBAVHRQX-PMEZUWKYSA-N Fucosyllactose Chemical group C([C@H]1O[C@@H]([C@H]([C@@H](O[C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@@H]1O)O)OC)O[C@H]1OC[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O RTVRUWIBAVHRQX-PMEZUWKYSA-N 0.000 claims description 9
- 230000001588 bifunctional effect Effects 0.000 claims description 8
- 235000020256 human milk Nutrition 0.000 claims description 8
- 210000004251 human milk Anatomy 0.000 claims description 8
- 230000010307 cell transformation Effects 0.000 claims description 5
- 241000606125 Bacteroides Species 0.000 claims description 4
- BRHHWBDLMUBZQQ-JZEMXWCPSA-N Lactodifucotetraose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]([C@H](O)[C@H](O)CO)[C@H](C=O)O[C@@H]1[C@H](O[C@H]2[C@H]([C@H](O)[C@H](O)[C@H](C)O2)O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 BRHHWBDLMUBZQQ-JZEMXWCPSA-N 0.000 claims description 4
- LKOHREGGXUJGKC-UHFFFAOYSA-N Lactodifucotetraose Natural products OC1C(O)C(O)C(C)OC1OC1C(OC2C(C(O)C(O)OC2CO)OC2C(C(O)C(O)C(C)O2)O)OC(CO)C(O)C1O LKOHREGGXUJGKC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 241000283725 Bos Species 0.000 claims description 3
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 claims description 3
- 241000700159 Rattus Species 0.000 claims description 3
- VUDQSRFCCHQIIU-UHFFFAOYSA-N 1-(3,5-dichloro-2,6-dihydroxy-4-methoxyphenyl)hexan-1-one Chemical compound CCCCCC(=O)C1=C(O)C(Cl)=C(OC)C(Cl)=C1O VUDQSRFCCHQIIU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 241000219194 Arabidopsis Species 0.000 claims description 2
- 241000224495 Dictyostelium Species 0.000 claims description 2
- 241000255581 Drosophila <fruit fly, genus> Species 0.000 claims description 2
- 241000194033 Enterococcus Species 0.000 claims description 2
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 claims description 2
- 241000607768 Shigella Species 0.000 claims description 2
- 241000607734 Yersinia <bacteria> Species 0.000 claims description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 claims description 2
- 241000282465 Canis Species 0.000 claims 1
- 241000287826 Gallus Species 0.000 claims 1
- 241000282890 Sus Species 0.000 claims 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 17
- 102000001390 Fructose-Bisphosphate Aldolase Human genes 0.000 abstract description 5
- 102100040648 L-fucose kinase Human genes 0.000 abstract description 5
- 108010083136 fucokinase Proteins 0.000 abstract description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 abstract description 3
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 abstract description 3
- CJJCPDZKQKUXSS-JMSAOHGTSA-N fuculose Chemical compound C[C@@H]1OC(O)(CO)[C@H](O)[C@@H]1O CJJCPDZKQKUXSS-JMSAOHGTSA-N 0.000 abstract 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 46
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 39
- LQEBEXMHBLQMDB-JGQUBWHWSA-N GDP-beta-L-fucose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@H](C)O[C@@H]1OP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](N2C3=C(C(NC(N)=N3)=O)N=C2)O1 LQEBEXMHBLQMDB-JGQUBWHWSA-N 0.000 description 34
- 241001013691 Escherichia coli BW25113 Species 0.000 description 33
- LQEBEXMHBLQMDB-UHFFFAOYSA-N GDP-L-fucose Natural products OC1C(O)C(O)C(C)OC1OP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC1C(O)C(O)C(N2C3=C(C(N=C(N)N3)=O)N=C2)O1 LQEBEXMHBLQMDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 24
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 22
- PNNNRSAQSRJVSB-UHFFFAOYSA-N L-rhamnose Natural products CC(O)C(O)C(O)C(O)C=O PNNNRSAQSRJVSB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 21
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 19
- SHZGCJCMOBCMKK-PQMKYFCFSA-N L-Fucose Natural products C[C@H]1O[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O SHZGCJCMOBCMKK-PQMKYFCFSA-N 0.000 description 16
- 238000004809 thin layer chromatography Methods 0.000 description 16
- PTVXQARCLQPGIR-DHVFOXMCSA-N L-fucopyranose 1-phosphate Chemical compound C[C@@H]1OC(OP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O PTVXQARCLQPGIR-DHVFOXMCSA-N 0.000 description 12
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 12
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 12
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 10
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 10
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 108020005115 Pyruvate Kinase Proteins 0.000 description 9
- 102000013009 Pyruvate Kinase Human genes 0.000 description 9
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 9
- 229930027945 nicotinamide-adenine dinucleotide Natural products 0.000 description 9
- BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N nicotinamide-adenine dinucleotide Chemical compound C1=CCC(C(=O)N)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O2)N2C3=NC=NC(N)=C3N=C2)O)O1 BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N 0.000 description 9
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 9
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 9
- 241000606124 Bacteroides fragilis Species 0.000 description 8
- QZNPNKJXABGCRC-LFRDXLMFSA-N L-fuculose Chemical compound C[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)C(=O)CO QZNPNKJXABGCRC-LFRDXLMFSA-N 0.000 description 8
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 8
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 8
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 8
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 8
- 102000004357 Transferases Human genes 0.000 description 7
- 108090000992 Transferases Proteins 0.000 description 7
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 7
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 7
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 7
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 7
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 7
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 7
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 7
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 7
- DTBNBXWJWCWCIK-UHFFFAOYSA-K phosphonatoenolpyruvate Chemical compound [O-]C(=O)C(=C)OP([O-])([O-])=O DTBNBXWJWCWCIK-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 7
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000009471 action Effects 0.000 description 6
- 101150111848 fucA gene Proteins 0.000 description 6
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 6
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 6
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 6
- 229930029653 phosphoenolpyruvate Natural products 0.000 description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 101000885514 Arabidopsis thaliana Putative fucosyltransferase-like protein Proteins 0.000 description 5
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 5
- 241000590002 Helicobacter pylori Species 0.000 description 5
- PNNNRSAQSRJVSB-BXKVDMCESA-N aldehydo-L-rhamnose Chemical compound C[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)C=O PNNNRSAQSRJVSB-BXKVDMCESA-N 0.000 description 5
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 5
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 5
- 229940037467 helicobacter pylori Drugs 0.000 description 5
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 5
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 5
- NYHBQMYGNKIUIF-UUOKFMHZSA-N Guanosine Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O NYHBQMYGNKIUIF-UUOKFMHZSA-N 0.000 description 4
- LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N N-Butanol Chemical compound CCCCO LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 4
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 4
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 4
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 4
- 239000000287 crude extract Substances 0.000 description 4
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 4
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 4
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 4
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 4
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 4
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 4
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 4
- 108020003068 nitronate monooxygenase Proteins 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- 101710098620 Alpha-1,2-fucosyltransferase Proteins 0.000 description 3
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- MVMSCBBUIHUTGJ-GDJBGNAASA-N GDP-alpha-D-mannose Chemical compound C([C@H]1O[C@H]([C@@H]([C@@H]1O)O)N1C=2N=C(NC(=O)C=2N=C1)N)OP(O)(=O)OP(O)(=O)O[C@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O MVMSCBBUIHUTGJ-GDJBGNAASA-N 0.000 description 3
- 102000003855 L-lactate dehydrogenase Human genes 0.000 description 3
- 108700023483 L-lactate dehydrogenases Proteins 0.000 description 3
- 108090000301 Membrane transport proteins Proteins 0.000 description 3
- LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M Pyruvate Chemical compound CC(=O)C([O-])=O LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 3
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 3
- 210000000481 breast Anatomy 0.000 description 3
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 239000007857 degradation product Substances 0.000 description 3
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 3
- 108010001671 galactoside 3-fucosyltransferase Proteins 0.000 description 3
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 3
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 3
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 3
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 3
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 3
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 3
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 3
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- BSABBBMNWQWLLU-VKHMYHEASA-N (S)-lactaldehyde Chemical compound C[C@H](O)C=O BSABBBMNWQWLLU-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- HNSDLXPSAYFUHK-UHFFFAOYSA-N 1,4-bis(2-ethylhexyl) sulfosuccinate Chemical compound CCCCC(CC)COC(=O)CC(S(O)(=O)=O)C(=O)OCC(CC)CCCC HNSDLXPSAYFUHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101500000959 Bacillus anthracis Protective antigen PA-20 Proteins 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- MIKUYHXYGGJMLM-GIMIYPNGSA-N Crotonoside Natural products C1=NC2=C(N)NC(=O)N=C2N1[C@H]1O[C@@H](CO)[C@H](O)[C@@H]1O MIKUYHXYGGJMLM-GIMIYPNGSA-N 0.000 description 2
- NYHBQMYGNKIUIF-UHFFFAOYSA-N D-guanosine Natural products C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1C1OC(CO)C(O)C1O NYHBQMYGNKIUIF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001674329 Helicobacter pylori 26695 Species 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 2
- JVTAAEKCZFNVCJ-REOHCLBHSA-N L-lactic acid Chemical compound C[C@H](O)C(O)=O JVTAAEKCZFNVCJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 2
- 102000003939 Membrane transport proteins Human genes 0.000 description 2
- 240000009023 Myrrhis odorata Species 0.000 description 2
- 235000007265 Myrrhis odorata Nutrition 0.000 description 2
- KFEUJDWYNGMDBV-LODBTCKLSA-N N-acetyllactosamine Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](NC(=O)C)[C@H](O)O[C@H](CO)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 KFEUJDWYNGMDBV-LODBTCKLSA-N 0.000 description 2
- HESSGHHCXGBPAJ-UHFFFAOYSA-N N-acetyllactosamine Natural products CC(=O)NC(C=O)C(O)C(C(O)CO)OC1OC(CO)C(O)C(O)C1O HESSGHHCXGBPAJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000012550 Pimpinella anisum Nutrition 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 2
- 150000001299 aldehydes Chemical class 0.000 description 2
- PTVXQARCLQPGIR-KGJVWPDLSA-N alpha-L-fucose 1-phosphate Chemical compound C[C@@H]1O[C@@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O PTVXQARCLQPGIR-KGJVWPDLSA-N 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 2
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 2
- 230000001925 catabolic effect Effects 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 2
- GNGACRATGGDKBX-UHFFFAOYSA-N dihydroxyacetone phosphate Chemical compound OCC(=O)COP(O)(O)=O GNGACRATGGDKBX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 2
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- QGWNDRXFNXRZMB-UHFFFAOYSA-N guanidine diphosphate Natural products C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1C1OC(COP(O)(=O)OP(O)(O)=O)C(O)C1O QGWNDRXFNXRZMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940029575 guanosine Drugs 0.000 description 2
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 2
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 229940116871 l-lactate Drugs 0.000 description 2
- 229920006008 lipopolysaccharide Polymers 0.000 description 2
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 2
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 2
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- ZRSNZINYAWTAHE-UHFFFAOYSA-N p-methoxybenzaldehyde Chemical compound COC1=CC=C(C=O)C=C1 ZRSNZINYAWTAHE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 2
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 2
- 238000005375 photometry Methods 0.000 description 2
- BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N platinum Chemical compound [Pt] BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 2
- 101150090724 3 gene Proteins 0.000 description 1
- 125000001417 5'-guanylyl group Chemical group C=12N=C(N([H])[H])N([H])C(=O)C=1N=C([H])N2[C@@]1([H])[C@@](O[H])([H])[C@@](O[H])([H])[C@](C(OP(=O)(O[H])[*])([H])[H])([H])O1 0.000 description 1
- 108010077805 Bacterial Proteins Proteins 0.000 description 1
- SGHZXLIDFTYFHQ-UHFFFAOYSA-L Brilliant Blue Chemical compound [Na+].[Na+].C=1C=C(C(=C2C=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=2C(=CC=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=CC=1N(CC)CC1=CC=CC(S([O-])(=O)=O)=C1 SGHZXLIDFTYFHQ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 241000589875 Campylobacter jejuni Species 0.000 description 1
- 241000186145 Corynebacterium ammoniagenes Species 0.000 description 1
- 206010012735 Diarrhoea Diseases 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 241000283087 Equus Species 0.000 description 1
- 241001646716 Escherichia coli K-12 Species 0.000 description 1
- 229920002444 Exopolysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- QGWNDRXFNXRZMB-UUOKFMHZSA-N GDP Chemical compound C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O QGWNDRXFNXRZMB-UUOKFMHZSA-N 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 241001135301 Hypleurochilus fissicornis Species 0.000 description 1
- 102000004195 Isomerases Human genes 0.000 description 1
- 241001387858 Lentisphaera Species 0.000 description 1
- 239000007993 MOPS buffer Substances 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- OVRNDRQMDRJTHS-UHFFFAOYSA-N N-acelyl-D-glucosamine Natural products CC(=O)NC1C(O)OC(CO)C(O)C1O OVRNDRQMDRJTHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OVRNDRQMDRJTHS-RTRLPJTCSA-N N-acetyl-D-glucosamine Chemical compound CC(=O)N[C@H]1C(O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O OVRNDRQMDRJTHS-RTRLPJTCSA-N 0.000 description 1
- MBLBDJOUHNCFQT-LXGUWJNJSA-N N-acetylglucosamine Natural products CC(=O)N[C@@H](C=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO MBLBDJOUHNCFQT-LXGUWJNJSA-N 0.000 description 1
- 108010007843 NADH oxidase Proteins 0.000 description 1
- 206010033078 Otitis media Diseases 0.000 description 1
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 108010064851 Plant Proteins Proteins 0.000 description 1
- 206010057190 Respiratory tract infections Diseases 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000193998 Streptococcus pneumoniae Species 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- 101710137500 T7 RNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 241000607626 Vibrio cholerae Species 0.000 description 1
- 241000269370 Xenopus <genus> Species 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 1
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000002924 anti-infective effect Effects 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- SFZBBUSDVJSDGR-XWFYHZIMSA-N beta-D-Galp-(1->4)-[alpha-L-Fucp-(1->3)]-beta-D-GlcpNAc-(1->3)-beta-D-Galp Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@H]1[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@@H](CO)O[C@@H](O[C@H]2[C@H]([C@@H](CO)O[C@@H](O)[C@@H]2O)O)[C@@H]1NC(C)=O SFZBBUSDVJSDGR-XWFYHZIMSA-N 0.000 description 1
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 description 1
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 1
- SQVRNKJHWKZAKO-UHFFFAOYSA-N beta-N-Acetyl-D-neuraminic acid Natural products CC(=O)NC1C(O)CC(O)(C(O)=O)OC1C(O)C(O)CO SQVRNKJHWKZAKO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000975 bioactive effect Effects 0.000 description 1
- 230000006696 biosynthetic metabolic pathway Effects 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000022534 cell killing Effects 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- RPKLZQLYODPWTM-KBMWBBLPSA-N cholanoic acid Chemical compound C1CC2CCCC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@@H](CCC(O)=O)C)[C@@]1(C)CC2 RPKLZQLYODPWTM-KBMWBBLPSA-N 0.000 description 1
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 1
- 230000004186 co-expression Effects 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 239000013256 coordination polymer Substances 0.000 description 1
- 235000020247 cow milk Nutrition 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 230000007123 defense Effects 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 230000030609 dephosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006209 dephosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010511 deprotection reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- IJKVHSBPTUYDLN-UHFFFAOYSA-N dihydroxy(oxo)silane Chemical compound O[Si](O)=O IJKVHSBPTUYDLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012154 double-distilled water Substances 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 239000000147 enterotoxin Substances 0.000 description 1
- 238000007824 enzymatic assay Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 101150092956 fucP gene Proteins 0.000 description 1
- 150000008267 fucoses Chemical class 0.000 description 1
- 230000033581 fucosylation Effects 0.000 description 1
- 244000000075 gastric pathogen Species 0.000 description 1
- 238000003209 gene knockout Methods 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- -1 guanosine diphosphate activated L-fucose Chemical class 0.000 description 1
- 108010064833 guanylyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000028709 inflammatory response Effects 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 1
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 1
- 238000010829 isocratic elution Methods 0.000 description 1
- 238000006317 isomerization reaction Methods 0.000 description 1
- 101150066555 lacZ gene Proteins 0.000 description 1
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 230000037353 metabolic pathway Effects 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 1
- 239000007003 mineral medium Substances 0.000 description 1
- 150000002772 monosaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- 230000008823 permeabilization Effects 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 235000021118 plant-derived protein Nutrition 0.000 description 1
- 229910052697 platinum Inorganic materials 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 235000013406 prebiotics Nutrition 0.000 description 1
- 238000002953 preparative HPLC Methods 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 239000012474 protein marker Substances 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 238000004064 recycling Methods 0.000 description 1
- 238000006722 reduction reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- SQVRNKJHWKZAKO-OQPLDHBCSA-N sialic acid Chemical compound CC(=O)N[C@@H]1[C@@H](O)C[C@@](O)(C(O)=O)OC1[C@H](O)[C@H](O)CO SQVRNKJHWKZAKO-OQPLDHBCSA-N 0.000 description 1
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 1
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 1
- AWUCVROLDVIAJX-GSVOUGTGSA-N sn-glycerol 3-phosphate Chemical compound OC[C@@H](O)COP(O)(O)=O AWUCVROLDVIAJX-GSVOUGTGSA-N 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- OTNVGWMVOULBFZ-UHFFFAOYSA-N sodium;hydrochloride Chemical compound [Na].Cl OTNVGWMVOULBFZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011877 solvent mixture Substances 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 229940031000 streptococcus pneumoniae Drugs 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000001839 systemic circulation Effects 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 1
- 239000011573 trace mineral Substances 0.000 description 1
- 235000013619 trace mineral Nutrition 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 1
- 238000007039 two-step reaction Methods 0.000 description 1
- 229940118696 vibrio cholerae Drugs 0.000 description 1
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- 150000003722 vitamin derivatives Chemical class 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23L—FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; PREPARATION OR TREATMENT THEREOF
- A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/1048—Glycosyltransferases (2.4)
- C12N9/1051—Hexosyltransferases (2.4.1)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
- A23V2002/00—Food compositions, function of food ingredients or processes for food or foodstuffs
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Nutrition Science (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Polymers & Plastics (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
Группа изобретений относится к генетически модифицированной клетке для продуцирования фукозилированных олигосахаридов, способу ее получения и способу получения фукозилированных олигосахаридов. Генетически модифицированную клетку получают трансформированием клетки геном, кодирующим фукозокиназу, геном, кодирующим фукозо-1-фосфатгуанилилтрансферазу, геном, кодирующим фукозилтрансферазу. Катаболический путь для фукозы инактивирован в указанной клетке путем инактивации одного или нескольких генов, которые выбирают из группы, состоящей из гена фукозо-1-фосфат-альдолазы, гена фукозоизомеразы и гена фуколозокиназы. При этом клетка представляет собой микроорганизм, который выбирают из группы, состоящей из родов Escherichia, Klebsiella, Helicobacter, Bacillus, Lactobacillus, Streptococcus, Lactococcus, Pichia, Saccharomyces и Kluyveromyces. С использованием указанной генетически модифицированной клетки получают фукозилированные олигосахариды путем ее культивирования в подходящих условиях в среде, включающей фукозу и субстрат-акцептор, в котором субстрат-акцептор представляет собой моно-, ди- или олигосахарид или пептид. 3 н. и 6 з.п. ф-лы, 12 ил., 3 табл., 11 пр.
Description
Настоящее изобретение относится к способам получения фукозилированных соединений и связанных с ними клеток.
Женское молоко, состоящее из сложной смеси углеводов, белков, липидов, гормонов и микроэлементов, обеспечивает всеми необходимыми питательными веществами развитие младенцев. Кроме того, женское молоко содержит некоторые защитные вещества. Помимо иммуноглобулинов женское молоко содержит набор сложных олигосахаридов, обладающих защитными свойствами. Фракция олигосахаридов женского молока (НМО) включает, помимо основного углеводного компонента лактозы, более 130 различных сложных олигосахаридов. Это структурное разнообразие сложных олигосахаридов и присутствие их в большом количестве характерно только для человека. Напротив, в коровьем молоке обнаруживают только следовые количества значительно более сложных олигосахаридов, и вследствие этого в обычно применяемой молочной смеси не хватает указанных олигосахаридов.
Данные клинических исследований показывают, что у вскармливаемых грудью младенцев реже наблюдаются случаи диареи, респираторных заболеваний и отита среднего уха по сравнению с младенцами, вскормленными молочной смесью. Длительное время указанные защитные эффекты женского молока приписывали присутствию секретируемых иммуноглобулинов, однако, в настоящее время установлено, что НМО могут представлять собой главную линию защиты от патогенов для вскармливаемых грудью младенцев.
Многие из сложных НМО демонстрируют гомологию с гликоконъюгатами клеточной поверхности, такими как антиген тканей и групп крови системы Льюис × (Lex), Gal(β1-4)[Fuc-(α1-3)]GlcNAc(β1) (Newburg, 2001), который часто служит в качестве рецепторов патогенов. Таким образом, экскретируя растворимые ловушки, имитирующие структуры гликоконъюгатов клеточной поверхности, природа создала здесь эффективный механизм предупреждения инфекций. Например, было показано, что НМО могут радикально снижать вирулентность патогенных Escherichia coli (Cravioto et al., 1991), Vibrio cholerae (Coppa et al., 2006), Streptococcus pneumoniae (Andersson et al., 1986) или Campylobacter jejuni (Ruiz-Palacios et al., 2003), а также способны нейтрализовать токсины, подобные термостабильному энтеротоксину E.coli (Crane et al., 1994). Помимо упомянутых местных эффектов в кишечнике, НМО, попадая в системный кровоток, также способны вызывать системные эффекты у младенцев (Gnoth et al., 2001).
Влияние НМО на белково-углеводные взаимодействия, например на связывание селектин-лейкоцит, может модулировать иммунные ответы и снижать воспалительные ответы (Bode, 2006, Kunz & Rudloff, 2006).
Сложные олигосахариды представляют собой третий по величине компонент женского молока, после лактозы и жиров. Практически все они в совокупности имеют лактозу на восстанавливающем конце и несут фукозу и/или сиаловую кислоту на невосстанавливающем конце. Они построены из моносахаридов от 3 вплоть до 32 единиц, и большинство из них содержит фукозу от 1 до 15 единиц фукозы. Таким образом, фукозилированные олигосахариды демонстрируют высокий потенциал в качестве биоактивных компонентов продуктов питания с противоинфекционными и пребиотическими свойствами.
Фукозилтрансферазы (FucT), катализирующие перенос остатков фукозы от донора, гуанозин-дифосфат-активированной L-фукозы (GDP-L-фукоза), к некоторым молекулам-акцепторам, экспрессируются в животных, растениях, грибах и бактериях (Ма et al., 2006). Их характеризуют по месту присоединения фукозы, следовательно, различают α1,2, α1,3/4 и α1,6 FucT. Помимо FucT человека, которая исходно ответственна за биосинтез НМО и антигенов группы крови, описано несколько бактериальных FucT. Активность FucT наилучшим образом исследована для желудочного патогена человека Helicobacter pylori, у которого к его липополисахариду (LPS) присоединены фукозосодержащие антигены Льюиса (Wang et al,, 2000). Точная роль указанных структур антигенов Льюиса в процессе инфекции Н. pylori не ясна, но обсуждают роль молекулярной мимикрии в осуществлении обмана иммунной системы хозяина, адгезии и заселении (Bergman et al., 2006).
Благодаря мощному потенциалу НМО, выступающих в качестве способствующих укреплению здоровья биологически активных добавок, существует серьезная заинтересованность в их рентабельном широкомасштабном производстве. Получение с помощью катализа в процессах бактериальной ферментации представляет собой наиболее выгодный способ по сравнению с экстракцией НМО из женского молока и химическим синтезом, который представляет собой трудоемкий процесс и требует многочисленных стадий защиты и снятия защиты (Kretzschmar & Stahl, 1998). За последние десять лет были сообщения о нескольких попытках синтеза НМО с применением как ферментации с рекомбинантной E.coli, так и ферментативного превращения in vitro (Albermann et al., 2001, Dumon et al., 2006, Dumon et al., 2001, Dumon et al., 2004, Koizumi et al., 2000). Однако доступность донора, сахаронуклеотида GDP-фукозы, представляет собой узкое место в получении фукозилированных олигосахаридов. Эту высокоэнергетическую молекулу нельзя в настоящее время эффективно или рентабельно получить с помощью химического или энзиматического синтеза. Большинство публикаций сообщают о системах производства фукозилированных соединений на основе пула эндогенной GDP-фукозы E.coli, который, однако, чрезвычайно ограничен и применим только для индуцируемого синтеза содержащего фукозу экзополисахарида, колановой кислоты (Grant etal., 1970).
Например, Albermann et al. (2001) применили в энзиматическом синтезе рекомбинантные ферменты. GDP-β-L-фукозу получают путем превращения GDP-D-маннозы в ООР-4-кето-6-дезокси-D-маннозу. Полученное соединение под действием ОВР-4-кето-6-дезокси-D-манноза-3,5-эпимеразы-4-редуктазы превращают в GDP-β-L-фукозу, которую очищают с помощью препаративной HPLC.
Другой подход, предложенный Koizumi и соавторами для синтеза LeX из N-ацетиллактозамина (LacNAc), включает следующую комбинацию: образования GTP из добавленной GMP с помощью Corynebacterium ammoniagenes, синтез GDP-фукозы через GDP-маннозу и фукозилирование LacNAc путем оверэкспрессии α1,3-FucT H. pylori в разных штаммах E.coli (Koizumi et а1., 2000). Поскольку для этого подхода, связанного с бактериями, необходимо применять пермеабилизацию и, следовательно, уничтожение клеток, то не существует возможности с помощью указанного выбранного подхода осуществить продолжительный и крупномасштабный ферментационный процесс.
Все еще существует потребность в способах получения фукозилированных соединений, которые помогли бы преодолеть, по меньшей мере, некоторые из недостатков существующего уровня техники.
Одно из воплощений изобретения представляет собой способ получения генетически модифицированной клетки, обладающей способностью продуцировать фукозилированные соединения, включающий следующие стадии:
- трансформирование клетки для экспрессии фукозокиназы;
- трансформирование клетки для экспрессии фукозо-1-фосфатгуанилилтрансферазы;
- трансформирование клетки для экспрессии фукозилтрансферазы.
В соответствии со способом изобретения получают генетически модифицированную клетку. Ее трансформируют для экспрессии фукозокиназы, фукозо-1-фосфатгуанилилтрансферазы и фукозилтрансферазы.
Способы введения генов в клетку известны специалистам.
В предпочтительном воплощении, генетически модифицированная клетка представляет собой микроорганизм, которые выбирают из группы, состоящей из родов Escherichia, Klebsiella, Helicobacter, Bacillus, Lactobacillus, Streptococcus, Lactococcus, Pichia, Saccharomyces и Kluyveromyces.
В предпочтительном воплощении изобретения, активность фукозакиназы и фукозо-1-фосфатгуанилилтрансферазы объединяют в бифункциональном ферменте. Подходящие гены для трансформации, кодирующие фукозокиназу, фукозо-1-фосфатгуанилилтрансферазу, и/или бифункциональные гены, кодирующие фукозокиназу/фукозо-1-фосфатгуанилилтрансферазу, могут быть получены из родов Bacteroides, Lentisphaera, Ruminococcus, Solibacter, Arabidopsis, Oryza, Physcomitrella, Vitis, Danio, Bos, Equus, Macaco, Pan, Homo, Rattus, Mus и Xenopus.
Подходящие гены фукозилтрансферазы могут быть получены из организмов, которые выбирают из группы родов Helicobacter, Escherichia, Yersinia, Enterococcus, Shigella, Klebsiella, Salmonella, Bacteroides, Dictyostelium, Arabidopsis, Drosophila, Homo, Bos, Mus, Rattus, Gallus, Canis и Sus.
В зависимости от источника гена и клетки, примененной для экспрессии, для усиления экспрессии может быть полезна оптимизация кодонов.
Некоторые клетки имеют катаболический путь для фукозы. В этом случае рекомендуется инактивировать этот катаболический путь. Подходящие способы включают инактивацию одного или нескольких генов, которые выбирают из группы, состоящей из гена фукозо-1-фосфат-альдолазы, гена фукозоизомеразы и гена фуколозокиназы.
Подходящие соединения, производные фукозы, которые могут быть получены с помощью генетически модифицированных клеток настоящего изобретения, представляют собой фукозиллактозы, предпочтительно 2'-фукозиллактозу, 3-фукозиллактозу или лактодифукотетраозу.
Настоящее изобретение представляет собой синтез в клетке, который начинается с фукозы, вместо препаративного синтеза с рекомбинантными ферментами, начинающегося с GDP-D-маннозы, как описано у Albermann et al. (2001).
Дополнительное воплощение изобретения представляет собой генетически модифицированные клетка, получаемая по способу изобретения. Для получения фукозилированных соединений генетически модифицированную клетку изобретения культивируют в подходящих условиях культивирования в среде, включающей фукозу и субстрат-акцептор.
Подходящие субстраты-акцепторы представляют собой, например, моно-, ди- или олигосахарид или пептид, например, лактозу, 2'-фукозиллактозу или 3-фукозиллактозу.
Предпочтительные фукозилированные соединения, полученные с помощью способа получения, представляют собой фукозиллактозы, предпочтительно 2'-фукозиллактозу или 3-фукозиллактозу или лактодифукотетраозу.
В этом документе впервые сообщают об эффективном синтезе GDP-фукозы в E.coli из добавленной извне L-фукозы и, таким образом, о создании фукозного «реутилизационного» пути в E.coli. Однако этот подход также применен к другим легко культивируемым организмам, представляющим интерес для пищевой или фармацевтической промышленности (например, к Lactobacillus spp.). Применение указанного недавно открытого пути открывает совершенно новые перспективы получения олигосахаридов, помимо 2'-фукозиллактозу и 3-фукозиллактозу, в которых нет необходимости зависеть от дорогостоящего и трудоемкого получения GDP-фукозы (in vitro) или эндогенных, сложно регулируемых, биосинтетических путей образования GDP-фукозы (in vivo).
В так называемом «пути реутилизации фукозы» фукозу исходно фосфорилируют до фукозо-1-фосфата под действием фермента фукозокиназы. Фукозо-1-фосфат превращают в GDP-фукозу под действием фермента фукозо-1-Р-гуанилилтрансферазы. Недавно был описан первый бактериальный фермент, Fkp, обладающий обеими активностями, фукозокиназы и L-фукозо-1-Р-гуанилилтрансферазы (Coyne et al., 2005). Кишечная бактерия Bacteroides fragilis использует этот фермент для продукции GDP-фукозу, которая служит для навешивания остатков фукозы на полисахариды и гликопротеины капсулы.
Краткое описание чертежей
Фиг.1 раскрывает структуры исключительно сложных олигосахаридов женского молока (НМО) 2'-фукозиллактозы и 3-фукозиллактозы.
На фиг.2 приведена схема фотометрического анализа для определения активности Fkp в ферментативных реакциях, сопряженных с окислением NADH; Fkp = бифункциональная фукозокиназа / фукозо-1-фосфатгуанилилтрансфераза, РК=пируваткиназа, LDH = L-лактатдегидрогеназа, PEP=фосфоенолпируват.
На фиг.3 приведена схема фотометрического анализа для определения активности FucT в ферментативных реакциях, сопряженных с окислением NADH; NADH; FucT = фукозилтрансфераза, РК = пируваткиназа, LDH = L-лактатдегидрогеназа, PEP = фосфоенолпируват.
На фиг.4 показано образование белка после индукции. Дорожки 1-4: экспрессия растворимого Fkp (105,7 kDa) и/или FutAco (49,3 kDa) или FucT2 (35,9 kDa), в неочищенных экстрактах E.coli BW25113 bfucA (DE3) pCOLA-fkp-fucP (дорожка 1), Е.coli BW25113 bfucA (DE3) pET-futAco (дорожка 2), E. coli BW 25113 bfucA (DE3) pCOLA-fkp-fucP + pETfutAco (дорожка 3) и E. coli BW 25113 ΔfucA (DE3) pCOLA-fkp-fucP + pCAW55 (дорожка 4); дорожка 5: предварительно окрашенный белковый маркер «PageRuler™» («Fermentas», Германия); дорожки 6-9: экспрессия нерастворимого Fkp и/или FutAco или FucT2, в клеточном дебрисе, ресуспендированном в 6 М мочевине, из E. coli BW25113 ΔfucA (ВЕ3) pCOLA-fkp-fucP (дорожка 6), E. coli BW 25113 ΔfucA (DE3) pET-futAco (дорожка 7), E. coli BW 25113 ΔfucA (DE3) pCOLA-fkp-fucP + pETfotAco (дорожка 8) и E. coli BW 25113 ΔfucA (DE3) pCOLA-fkp-fucP + pCAW55 (дорожка 9).
На фиг.5 показана тонкослойная хроматография с радиометрическим детектированием (радио-TLC) 3Н-фукозы, проведенная в системе бутанол:ацетон:уксусная кислота:вода (35:35:7:23) и проанализированная с помощью радио-TLC детектора.
На фиг.6 показана радио-ТLС клеточного экстракта из E. coli BW 25113 ΔfucA (DE3) pCOLADuet-1 pETDuet-1, демонстрирующая фукозу и фукулезу и фукулозо-1-фосфат, однако, распад фукулозо-1-фосфаа ингибируется из-за генного нокаута (гена фукулозо- 1-фосфат-альдолазы (fucA}.
На фиг.7 показана радио-ТLС клеточного экстракта из E. coli BW 25113 ΔfucA (DE3) pCOLA-fkp-fucP, демонстрирующая накопление GDP-фукозы, продуцируемой бифункциональной фукозокиназой / фукозо-1-фосфатгуанилилтрансферазой, Fkp, из Bacteroides fragilis, а также фукозы и продуктов деградации фукулозы и фукулозо-1-фосфата.
На фиг.8 показана радио-TLC клеточного экстракта из E. coli BW 25113 ΔfucA (DE3) pCOLA-fkp-fucP pET-futAco, демонстрирующая накопление 3-фукозиллактозы, продуцируемой фукозилтрансферазой Helicobacter pylori с оптимизированным кодоном через GDP-фукозу, обеспечиваемую бифункциональной фукозокиназой / фукозо-1-фосфатгуанилилтрансферазой (Fkp). Фукоза и продукты деградации фукулозы и фукулозо-1-фосфата присутствуют только в минимальном количестве; количество GDP-фукозы существенно снижено вследствие продукции 3-фукозиллактозы.
На фиг.9 показан HPAED-анализ клеточного лизата из негативного контрольного штамма E. coli BW 25113 ΔfucA (DE3) pCOLADuet-1 pETDuet-1, демонстрирующий наличие внутриклеточной L-фукозы, лактозы, глицерина и L-рамнозы, но отсутствие фукозиллактозы.
На фиг.10 показан клеточный лизат штамма E. coli BW 25113 ΔfucA (DE3) pCOLA-fkp-fucP pET-futAco, продуцирующий 3-фукозиллактозу (время удержания равно примерно 11 мин); кроме того, можно видеть пики L-фукозы, лактозы, глицерина и L-рамнозы.
На фиг.11 показан HPAED-анализ клеточного лизата из штамма E.coli BW 25113 ΔfucA (DE3) pCOLA-fkp-fucP pCAW55, демонстрирующий продукцию 2'-фукозиллактозы (время удержания равно примерно 22 мин). Кроме того, можно видеть L-фукозу, лактозу, глицерин и L-рамнозу.
На фиг.12а и b показан HPLC-анализ с электрохимической регистрацией экспрессии GDP-фукозы в E.coli JM109 (ВЕ3) ΔfucA (фиг.12а) и E.coli JM109 (DE3) ΔfucA pCOLA-fkp-fucP (фиг.12b).
Примеры
Это изобретение дополнительно объяснено следующими, нелимитирующими примерами:
Пример 1
Конструирование экспрессирующих плазмид и получение продуцирующих штаммов
Для успешного предотвращения деградации добавленной извне фукозы ген fucA, кодирующий ключевой фермент катаболизма, фукулозо-1-фосфат-альдолазу, должен быть удален из генома штамма BW 25113 E.coli. Для создания делеции fucA применяют методику, предложенную в работе (Datsenko & Wanner, 2000). Для экспрессии гетерологичного гена, с помощью Т7-промотора, индуцибельную Т7 RNA-полимеразу включают в несущий делецию штамм E.coli BW 25113 ΔfucA с помощью λDE3 набора для лизогенизации («Novagen»). Полученный штамм после этого называют E.coli BW 25113 ΔfucA (ВЕ3). Плазмиды pCOLA-fkp-fucP и pET-futAco конструируют с помощью pCOLADuet-1 и pETDuet-1 векторов экспрессии («Novagen»). Все праймеры, примененные для конструирования, перечислены в таблице 2. Ген fkp (код доступа в Банке генов AY 849806) амплифицируют с помощью PCR с праймерами flcp-NcoI-прямой и fkp-NotI-обратный, применяя геномную DNA Bacteroides fragilis ATCC 25285D. Ген fucP (код доступа в Банке генов СР 000948) Escherichia coli К12 амплифицируют из геномной DNA E.coli ТОР10 («Invitrogen», США), применяя праймеры FucP-NdeI-прямой и FucP-XhoI-обратный. Оба. fkp nfucP вставляют в первый и второй сайт множественного клонирования (MCS) pCOLADuet-1, соответственно, применяя указанные сайты рестрикциии. Полученную плазмиду обозначают как pCOLA-fkp-fucP. Ген futA (код доступа в Банке генов АЕ 000511) штамма 26695 Н. pylori был кодон-оптимизирован для экспрессии в E.coli и получен синтетическим способом в компании «GenScript Corporation» («Piscataway», NJ, США). Ген амплифицируют, применяя праймеры FutAco-Ncol-прямой и FutAco-BamHI-обратный, и вставляют в первый MCS pETDuet-1, получая pET-fritAco. Правильность вставки клонированных генов проверяют с помощь ретрикционного анализа и секвенирования с помощью рекомендованных праймеров pACYCDuetUPl, pET-Upstream, DuetDOWN-1, DuetUP2 и T7-Terminator, перечисленных в руководстве по применению векторов Duet «Duet Vectors Manual» («Novagen»). Плазмида pCAW55, содержащая ген fucT2, который кодирует α1,2-фукозилтрансферазу из Helicobacter pylori NCTC364 была предоставлена С. Albermann (Институт микробиологии, Университет Штутгарта) и основана на векторе pJOE2702 (Stumpp et al., 2000). Ген fucT2 был вставлен через сайты рестрикции NdeI/PstI и находился под контролем L-рамнозо-индуцибельного промотор rhaРBАD. Клетки E.coli BW 25113 ΔfucA (DE3) трансформируют вектором экспрессии путем электропорации (Dower et al., 1988). Все бактериальные штаммы, примененные в этом эксперименте, перечислены в таблице 1.
| Таблица 1 | ||
| Примененные бактериальные штаммы и плазмиды | ||
| Название | Соответствующая(соответствующие) характеристика(характеристики)* | Ссылки |
| Штаммы E.coli BW 25113 | Δ(araD-araB)567, ΔlacZ4787(::rrnB-3), лямбда-, rph-1, Δ(rhaD-rhaB)568, hsdR514 | (Datsenko & Wanner, 2000) |
| BW 25113 AfucA (DE3) | BW 25113 fucA мутант, несущий хромосомную копию ген RNA-полимеразы λDE3 Т7 | Настоящее исследование |
| BW 25113 ΔfucA (DE3)pCOLADuet-1 pETDuet-1 | Негативный контрольный штамм, содержащий пустые векторы, АрR, КаnR | Настоящее исследование |
| BW 25113 ΔfucA (DE3) pCOLA-fkp-fucP | KmR | Настоящее исследование |
| BW 25113 ΔfucA (DE3) pCOLA-fkp-fucP pET-futAco |
ApR, КmR | Настоящее исследование |
| BW 25113 ΔfucA (DE3) pCOLA-fkp-fucP pCAW55 | АрR, KmR | Настоящее исследование |
| Плазмиды | ||
| pCOLADuet-1 | КmR | «Novagen» |
| pETDuet-1 | AрR | «Novagen» |
| pCOLA-fkp-fucP | KmR | Настоящее исследование |
| pET-futAco | ApR | Настоящее исследование |
| pCAW55 | АрR | С. Albermann |
| * ApR, ампициллин-устойчивый, КmR, канамицин-устойчивый. | ||
| Таблица 2 | ||
| Праймеры | ||
| Название | Последовательность (5'→3') | Добавленный сайт рестрикции |
| Fkp-NcoI-прямой | AAGGAAACCATGGGCCAAAAACTACTATCTTTAC CGTCCAATCTGGTTCAGTC | Ncol |
| Fkp-NotI-обратный | AAGGAAATTGCGGCCGCATTATGATCGTGATACTT GGAATCCCTTATCAGATAACG |
NotI |
| FucP-NdeI-прямой | AAGGAATACATATGGGAAACACATCAATACAAAC GCAGAGTTACCGTGCGG | Ndel |
| FucP-XhoI-обратный | AAGGAAACTCGAGTCAGTTAGTTGCCGTTTGAGA ACGGAAACGGGCAAAG | Xhol |
| FutAco-NcoI-прямой | AAGGGAAACCATGGCTATGTTCCAGCCGCTGCTG GACGCGTTTATCGAGTCTGC | Ncol |
| FutAco-BamHI-обратный | AAGGGAAAGGATCCGGGTCCTATTACAGACCCAG TTTTTTCACCAG | BamHI |
| pACYCDuetUPl | GGATCTCGACGCTCTCCCT | |
| pET-Upstream-праймер | ATGCGTCCGGCGTAGA | |
| DuetDOWN-1-праймер | GATTATGCGGCCGTGTACAA | |
| DuetUP2-праймер | TTGTACACGGCCGCATAATC | |
| T7-Terminator-праймер | TATGCTAGTTATTGCTCAG | |
| *Сайты узнавания рестрикционных эндонуклеаз подчеркнуты. | ||
Пример 2
Условия культивирования и получение клеточных экстрактов Штаммы E.coli инокулируют в 10 мл 2xYT бульона (Sambrook & Russell, 2001), содержащего 100 мкг мл-1 ампициллина и/или 50 мкг мл-1 канамицина, и инкубируют в течение ночи в ротационном шейкере при 37°С. На следующий день, в 30 мл свежего 2xYT бульона, дополненного соответствующими антибиотиками, инокулируют 1/100 из выросшей в течение ночи культуры, и инкубируют при 37°С в ротационном шейкере с хорошей аэрацией. Когда оптическая плотность (ОD600 нм) культуры достигает значения, равного приблизительно 0,5, добавляют индукторы: изопропил-1-тио-β-D-галактопиранозид (IPTG) и/или L-рамнозу, в концентрации, равной 0,1 мМ и 0,1% соответственно. Культуры дополнительно инкубируют при 28°С в течение ночи (приблизительно 15 ч) при постоянном перемешивании. Для измерения активности фотометрическим способом отбирают аликвоту культуры клеток, клетки осаждают и ресуспендируют в пятикратном (масса/объем) 50 мМ Tris-HCl pH 7,5. Добавляют стеклянные шарики, по массе в четыре раза превышающие осадок клеток, и полученную суспензию перемешивают на вортексе два раза, каждый раз в течение пяти минут, и в промежутках хранят на льду в течение дополнительных пяти минут. Дебрис клеток удаляют центрифугированием (13200 rpm, 5 мин, 4°С) и полученный неочищенный экстракт хранят 4°С.
Для продуцирования фукозиллактозы in vivo, клетки промывают одним объемом, по отношению к объему культуры, солевого раствора с фосфатным буфером рН 7,4 (PBS) (Sambrook & Russell, 2001) и ресуспендируют в 30 мл модифицированной минеральной среды М9; по стандартной для М9 прописи (Sambrook & Russell, 2001), добавляют следующие соединения: 20 мМ L-фукозу, 20 мМ лактозу, 0,5% глицерин, 0,5 мМ гуанозин и 1x GIBCO MEM раствор витаминов (100Х) («Invitrogen», США). Индукторы, L-рамнозу (0,1%) и IPTG (0,1 мМ), также добавляют ко всем культурам не зависимо от того, какой штамм культивируют, для того, чтобы избежать различий в условиях культивирования. Снова, культуры инкубируют при 28°С в течение ночи (приблизительно 15 ч) при постоянном перемешивании. Культуры центрифугируют и супернатанты декантируют и хранят при -20°С. Клетки последовательно промывают с PBS, ресуспендируют в дистиллированной воде, и пермеабилизуют с помощью автоклавирования (100°С, 5 мин). Для удаления клеточного дебриса, образцы центрифугируют (8500 rpm, 30 мин) и прозрачный клеточный лизат хранят при -20°С.
Пример 3
SDS-PAGE (SDS-электрофорез в полиакриламидном геле)
Экспрессию гетерологичных белков контролируют с помощью SDS-PAGE (Sambrook & Russell, 2001). Экстракты белков готовили в 1x SDS-буфере для нанесения на гель, и полиакриламидные гели прокрашивали Кумаси бриллиантовым синим.
Пример 4
Энзиматические фотометрические анализы
Пример 4а
Для определения активности Fkp, фукозокиназную активность фермента измеряют по количеству ADP, возникающего из АТР, используемого в качестве субстрата пируваткиназой (РК) в процессе дефосфорилирования фосфоенолпирувата (PEP), при этом полученный пируват затем превращается в L-лактат под действием L-лактатдегидрогеназы (LDH), что сопровождается поглощением NADH. Соответствующие реакции суммированы на фиг.2. Реакцию проводили в 1000 мкл 65 мМ MOPS-буфера (рН 7,5) содержащего 10 мМ L-фукозу, 15 мМ PEP, 5 мМ MgSO4, по 0,2 мМ каждого АТР и NADH, и 5 U каждого РК и LDH. После добавления 25 мкл неочищенного экстракта, окисление NADH до NAD регистрируют по убыли поглощения при 340 нм, с помощью спектрофотометра V-630 Bio (JASCO GmbH, Германия).
Пример 4b
Аналогично, активность FucT (как показано на фиг.3) измеряют по появлению GDP (из донора GDP-L-фукозы), который фосфорилируется до GTP под действием РК при превращении PEP в пируват. LDH катализирует конечную реакцию восстановления пируват до L-лактата, сопровождающуюся поглощением NADH. Клеточные экстракты (25 мкл) тестируют в 1000 мкл реакционной смеси, содержащей 10 мМ лактозы, 100 мкМ GDP-L-фукозу, 5 мМ MgSO4, по 0,2 мМ каждого АТР и NADH, и по U каждого РК и LDH в 50 мМ Tris-HCl буфере (рН 7,5). Убыль NADH регистрируют при 340 нм.
Пример 5
Анализ олигосахаридов
Образцы анализируют с помощью высокоэффективной анионообменной хроматографии (HPAED), применяя импульсный амперометрический детектор «Decade II» от компании «Antec Leyden» (Нидерланды) и колонку «CarboPac PA20» («Dionex», Германия), соединенную системой HPLC («Shimadzu», Германия). Чувствительность детектора устанавливают на 50 мкА с приложенным импульсным потенциалом, равным 0,05 V. Моно-, ди- и олигосахариды элюируют 10 мМ гидроксидом натрия со скоростью элюции, равной 0,4 мл мин-1. После 30 мин изократического элюирования 10 мМ NaOH колонку промывают в течение 20 мин 200 мМ NaOH для получения постоянных времен удерживания и после этого регенерируют 10 мМ NaOH в течение 20 мин.
Пример 6
Введение Н-фукозы
Клетки E.coli BW 25113 ΔfucA (DE3) трансформируют векторами pCOLADuet-1, pETDuet-1, pCOLA-fkp-fucP и pET-futAco для создания следующих штаммов:
E.coli BW 25113 ΔfucA (DE3) pCOLADuet-1 pETDuet-1;
E.coli BW 25113 ΔfucA (DE3) pCOLA-fkp-fucP;
E.coli BW 25113 ΔfucA (DE3) pCOLA-fkp-fucP pET-futAco.
В экспериментах по введению, штамм E.coli BW 25113 ΔfucA (DE3) pCOLADuet-1 pETDuet-1 служит в качестве пустого вектора-контроля. Все три штамма затем применяют в экспериментах по введению меченой тритием фукозы. Для экспериментов по введению, клетки культивируют в 3 мл среды 2xYT, содержащей 20 мкл L-5,6-3Н-фукозы (40-60 Ci/ммоль и 1 MCi/мл), 50 мМ лактозу и 1 мМ IPTG. В соответствии с примененными векторами экспрессии среду 2xYT дополняют ампициллином (100 мкг мл-1) и/или канамицином (50 мкг мл-1). По 3 мл культуры E.coli инкубируют при комнатной температуре в течение ночи. Затем клетки собирают центрифугированием и отделяют от культуральной среды, полученные осадки клеток ресуспендируют в 200 мкл ddH2O и кипятят 5 мин. После охлаждения на льду в течение 10 мин клеточный дебрис собирают центрифугированием при 13000 rpm в течение 10 мин. Из полученных таким способом клеточных супернатантов E.coli по 20 мкл каждой культуры наносят на силикагелевые пластины для TLC («Silica gel 60»). Для проведения TLC на пластине, применяют смеси растворителей, состоящие из бутанола: ацетона: уксусной кислоты: воды (35:35:7:23). Затем проводят радио-TLC анализ с помощью радио-TLC детектора («Raytest»). Для определения Rf-величин нерадиоактивного контрольного материала платины для TLC опрыскивают раствором анисового альдегида (5 мл конц. H2SO4, 100 мл этанола, 1,5 мл уксусной кислоты, 2 мл анисового альдегида) и нагревают.
Пример 7
Создание эффективного пути «реутилизации» L-фукозы в E.coli. Поскольку в качестве субстрата-акцептора для фукозилтрансферазы применяют лактозу, дефицитный по β-галактозидазе (lacZ-) штамм E.coli BW 25113 был выбран для преодоления проблемы быстрой деградации лактозы (Datsenko & Wanner, 2000). L-Фукоза также может быть эффективно превращена диким типом E.coli путем изомеризации в фукулозу, путем фосфорилирования в фукулозо-1-фосфат и путем последующего ретроальдольного расщепления фукулозо-1-фосфата в глицерин-3-фосфат и L-лактальдегид. Для предупреждения деградации добавленной фукозы ген fucA, кодирующий ключевой катаболический фермент пути деградации фукозы фукулозо-1-фосфат-альдолазу (FucA), удаляют из геномного штамма E.coli BW 25113. Полученный штамм E.coli BW 25113 ΔfucA не способен расти как на фукозе, так и на лактозе в качестве единственного источника углерода на чашках с минимальной М9. Лизогенизация с рекомбинантным фагом λDE3 приводит к образованию штамма E.coli BW 25113 ΔfucA (DE3), для которого могут быть применены вектора экспрессии, стимулируемые Т7-промотором. Способность нуклеотидов активировать фукозу до GDP-фукозы очень ограничена в природе и также в течение длительного времени известна только у некоторых млекопитающих (человека, свиньи, мыши). Активация нуклеотидами фукозы опосредуется в этом случае двумя последовательными энзиматическими стадиями, сначала фосфорилирование фукозы до фукозо-1-фосфата, катализируемое фукозокиназой, и затем превращение фукозо-1-фосфата в GDP-фукозу, катализируемое гуанилилтрансферазой, соответственно. Хотя у млекопитающих путь реутилизации фукозы включает две отдельные ферментативные реакции, недавно обнаружены бактериальные и растительные белки, которые включают обе энзиматические активности. Гетерологичная экспрессия фукозокиназы человека в E.coli приводит только к едва детектируемой активности (Hinderlich et al., 2002). Биохимические исследования показали, что фукокиниза млекопитающих представляет собой высоко регулируемый фермент (Park et al., 1998). Для того чтобы изучить, не представляет ли собой Fkp, недавно открытый в В. Fragilis, более подходящий фермент для активации фукозы и для эффективного обеспечения GDP-фукозы в синтезе фукозилированных олигосахаридов в E.coli, мы амплифицировали ген из геномной DNA В. fragilis и клонировали его в бактериальный вектор экспрессии для гетерологичной экспрессии.
Для синтеза 2'- и 3-фукозиллактозы для совместной экспрессии выбирают следующие фукозилтрансферазы: ген futA из Н. pylori 26695 (Appelmelk et al., 1999), кодирующий α1,3-фукозилтрансферазу, и ген α1,2'-фукозилтрансферазы fucT2 из Н. pylori NCTC364 (Albermann et al., 2001). Перед началом процесса клонирования, частоту использования кодона futA оптимизируют для экспрессии в E.coli, и затем синтезируют ген в компании «GenScript corporation» (США). Полученный ген futAco вставляют в вектор экспрессии pETDuet-1, и экспрессию тестируют с коэкспрессией Fkp и FucP и без нее. Применяя стандартные условия для индукции, проводят совместную экспрессию Fkp, FucP и FutAco или FucT2. Образование белка проверяют после индукции с IPTG и/или L-рамнозой с помощью SDS-PAGE (смотри фиг.4), регистрируя явно выраженную продукцию растворимого белка Fkp, тогда как индукция локализованного в мембране белка фукозопермеазы (FucP), как ожидали, не была обнаружена в цитоплазме клетки, согласно SDS-PAGE. Однако было подтверждено, что генные продукты futAco и fucT2 прежде всего локализованы в тельцах включения, регистрируемая растворимая фракция была незначительной.
Пример 8
Фотометрическая регистрация энзиматтеской активности
Неочищенные экстракты, полученные из индуцированных культур, тестируют на фукозокиназную и фукозилтрансферазную активность, с помощью вспомогательных ферментов в сопряженном энзиматическом анализе, как описано выше. Очевидно, существует значительная базовая как NADH-оксидазная, так и/или фосфатазная активность в E.coli BW 25113 ΔfucA (DE3), которые ответственны за невоспроизводимые результаты и низкую определяемую фукозокиназную и фукозилтрансферазную активность различных штаммов. Вследствие этого, было решено определять энзиматическую активность, регистрируя образование внутриклеточного продукта (GDP-фукозы и фукозиллактозы).
Пример 9
Изучение утилизации введенной извне 3H-L-фукозы при образовании GDP-фукозы и 3-фукозиллактозы в рекомбинантной E.coli
Цель этого эксперимента заключается в подтверждении образования 3-фукозиллактозы из фукозы и лактозы через образование GDP-фукозы под действием бифункционального фермента Fkp пути реутилизации фукозы из Bacteroides fragilis. Негативные контрольные штаммы E.coli BW 25113 ΔfucA (DE3) pCOLADuet-1 pETDue-1, а также штаммы E.coli BW 25113 ΔfucA (DE3) pCOLA-fkp-fucP, экспрессирующие Fkp и фукозопермеазу, и штаммы E.coli BW 25113 ΔfucA (DE3) pCOLA-fkp-fucP pET-futAco, экспрессирующие Fkp, фукозопермеазу и α1,3-фукозилтрансферазу, обрабатывают, как описано выше. Клеточные экстракты, полученные из указанных штаммов, наносят на пластинку для TLC, которую проводят, как описано выше, и анализируют с помощью радио-TLC детектора. Кроме того, стандартную 3H-меченую L-фукозу наносят на пластинку для TLC и хроматографируют (см. фиг.5). Нерадиоактивные стандарты для L-фукозы и L-фукулозо-1-фосфата, GDP-L-фукозы, а также для 3-фукозиллактозы анализируют аналогичным способом с помощью TLC и последующего окрашивания раствором анисового альдегида (данные не приведены).
Результаты эксперимента с негативным контролем (смотри фиг.6) демонстрируют продукты первой и второй катаболических стадий метаболизма фукозы, т.е. L-фукулозу (полученную из фукозы под действием фукозоизомеразы) и L-фукулозо-1-фосфат (полученную из фукулозы под действием фуколозокиназы). Дальнейшую деградацию фукозы эффективно ингибируют нокдауном гена fucA, который кодирует фермент фукулозо-1-фосфат-альдолазу, катализирующую реакцию ретроальдольного расщепления фукулозо-1-фосфата до L-лактальдегида и дигидроксиацетонфосфата.
E.coli клетки, коэкспрессирующие бифункциональные фукозокиназу / фукозо-1-фосфатгуанилилтрансферазу, Fkp из Bacteroides fragilis демонстрируют образование GDP-фукозы (см. фиг.7), которая несомненно накапливается в клетках и может только минимально отклоняться в сторону других метаболических путей, продукты которых в противном случае могли бы появиться на радио-TLC.
Клеточные экстракты из штамма E.coli BW 25113 ΔfucA (DE3) pCOLA-fkp-fucP pET-futAco демонстрируют образование 3-фукозиллактозы, и только небольшое количество GDP-фукозы (см. фиг.8). Этот результат соответствует исходной цели эксперимента, а именно, продемонстрировать образование 3-фукозиллактозы через GDP-фукозу, которую поставляет бифункциональный фермент, Fkp, пути реутилизации из Bacteroides fragilis. Количество продуктов деградации фукозы, фукулозы и фукулозо-1-фосфата, также значительно снижается, благодаря потреблению GDP-фукозы при образовании фукозиллактозы и возникшему сдвигу равновесия реакции от фукулозо-1-фосфата и фукулозы к фукозе, которая постоянно выводится из реакции в результате образования GDP-фукозы.
Пример 10
Изучение образования 2'-фукозиллактозы и 3-фукозиллактозы под действием рекомбинантной E.coli
Штамм E.coli BW 25113 ΔfucA (БЕЗ), несущий pCOLA-fkp-fucP, а также ген futAco или fuсТ2 в отдельном векторе экспрессии, а также E.coli BW 25113 ΔfucA (DE3), несущий пустые векторы pCOLADuet-1 и pETDuet-1 (негативный контроль) растят в 2xYT бульоне, и экспрессию белка индуцируют с помощью IPTG и/или L-рамнозы течение 15 часов при 28°С. Клетки последовательно промывают PBS и ресуспендируют в модифицированной среде М9, дополненной L-фукозой, лактозой и гуанозином, IPTG и L-рамнозой. После фазы ферментации (28°С, 15 часов) клетки собирают, супернатанты объединяют, и клеточные лизаты получают, как описано выше.
Анализ с помощью HPAED показал, что времена удержания на примененной HPLC-колонке, равные приблизительно 3 мин для стандарта L-фукозы, приблизительно 17 мин для стандарта лактозы, приблизительно 11 мин для стандарта 3-фукозиллактозы и приблизительно 22 мин для примененного стандарта 2'-фукозиллактозы (данные не приведены). Глицерин, который в качестве источника углерода представляет собой часть культуральной среды, регистрировали со временем удержания равным приблизительно 1,5 мин, и индуктор, L-рамнозу, со временем удержания равным 5,5 мин. Оба вещества регистрировали внутриклеточно в ходе анализа клеточных лизатов.
Клеточные лизаты из E.coli BW 25113 ΔfucA (ВЕЗ) pCOLADuet-1 pETDuet-1 негативного контрольного штамма показали наличие внутриклеточной L-фукозы и лактозы, но, как ожидали, отсутствие фукозиллактозы (см. фиг.9). Помимо, вышеуказанных молекул при анализе обнаружили также внесенный в среду источник углерода глицерин и индуктор транскрипции L-рамнозу.
HPAED-анализ клеточного лизата из штамма E.coli BW 25113 ΔfucA (DE3) pCOLA-fkp-fucP pET-futAco, коэкспрессирующего ген fkp B.fragilis и ген фукозопермеазы E.coli в комбинации с геном α1,3-фукозилтрансферазы из Helicobacter pylori с оптимизированным кодоном, показал внутриклеточное образование 3-фукозиллактозы (пик приблизительно на 11 мин, см. фиг.10). L-фукоза и лактоза, как глицерин и L-рамноза, также представляют собой компоненты клеточного лизата.
Клеточный лизат из штамма E.coli BW 25113 ΔfucA (DE3) pCOLA-fkp-fucP pCAW55 продемонстрировал внутриклеточное образование 2'-фукозиллактозы (см. фиг.11), благодаря коэкспрессии α1,2-фукозилтрансферазы FucT2. Кроме того, L-фукозу, лактозу, глицерин и L-рамнозу можно видеть в клеточном лизате, точно также как в клеточном лизате из негативного контроля и из продуцирующего 3-фукозиллактозу штамма E.coli BW 25113 ΔfucA (DE3) pCOLA-fkp-fucP pET-futAco.
Указанные результаты ясно демонстрируют образование 3- и 2'-фукозиллактозы в рекомбинантных клетках E.coli из добавленных извне L-фукозы и лактозы. С помощью гетерологичной экспрессии белка Fkp из В. fragilis, катализирующего двухстадийную реакцию фосфорилирования фукозы и переноса гуанилила на фукозо-1-фосфата, получают эффективное образование GDP-фукозы. α1,3-фукозилтрансфераза FutAco с оптимизированным кодоном, исходно полученная из Helicobacter pylori, или α1,2-фукозилтрансфераза FucT2 из Helicobacter pylori, соответственно, могут превращать поставляемую таким путем GDP-фукозу в 2'- и 3-фукозиллактозу.
Пример 11
Экспрессия GDP-фукозы в клетках E.coli JM109
Увеличение внутриклеточного содержания GDP-фукозы в результате экспрессии Fkp было показано путем параллельной культивации штамма E.coli, экспрессирующего Fkp из плазмиды, и штамма E.coli, не содержащего копии Fkp. Штамм E.coli JM109 (DE3) ΔfucA в этом случае применяют в качестве контрольного штамма без Fkp. Штамм, экспрессирующий Fkp, представлял собой тот же штамм E.coli JM109 (DE3) ΔfucA, на этот раз содержащий плазмиду pCOLA-fkp-fucP, и, следовательно, несущий гены, кодирующие фукозокиназу / фукозо-1-фосфатгуанилилтрансферазу, Fkp, и фукозопермеазу, FucP. Поскольку гены были клонированы в сайты множественного клонирования (MCS) 1 и 2 вектора pCOLADuet-1 («Novagen», UK), экспрессия обоих генов может быть индуцирована добавлением IPTG, поскольку оба MCS фланкированы Т7-промотором/оператором на 5'-стороне.
Оба штамма культивируют в двойном повторе в 30 мл 2YT среды, дополненной канамицином для штамма с pCOLA-fkp-fucP для сохранения плазмиды, при 37°С и 220 rpm. Индукцию экспрессии Fkp начинают при OD600=0,5 добавлением 1 мМ IPTG и к обоим штаммам добавляют 20 мМ фукозу и затем культивируют дополнительные 3 часа при 37°С и 220 rpm. Клетки осаждают центрифугированием, и осадки ресуспендируют в дистиллированной воде (5 масс/объем). Указанные клеточные суспензии инкубируют при 95°С течение 10 минут для лизирования клеток. Клеточный дебрис удаляют центрифугированием и супернатанты анализируют с помощью HPLC.
HPLC-анализ проводят путем электрохимической регистрации с помощью импульсного амперометрического детектора «Decade II» (Antec Leyden, Нидерланды). 20 мМ гидрохлорида натрия + 825 мМ ацетата натрия применяют в качестве элюента на колонке «CarboPac PA20» («Dionex», США). GDP-фукозу элюируют со временем удержания, равным 16,0 минут.
Таблица 3: Содержание внутриклеточной GDP-фукозы в E.coli JM109 (DE3) ΔfucA с экспрессией и без экспрессии фукозокиназы / фукозо-1-фосфатгуанилилтрансферазы, Fkp, из pCOLA-fkp-fucP.
| Штамм | Содержание GDP-фукозы [мкМ] |
| E.coli JM109 (DE3) ΔfucA | Не детектируется |
| E.coli JM109 (DE3) ΔfucA pCOLA-fkp-fucP | 369 мкМ |
На фиг.12а показан HPLC-анализ клетки E.coli JM109 (DE3) ΔfucA для экспрессии GDP-фукозы без экспрессии белка FKP.
Фиг.12b представляет собой анализ клеток Е, coli JM109 (DE3) ΔfucA pCOLA-fkp-fucP, коэкспрессирующих белок Fkp вместе с импортером фукозы FucP. Пик на 16,0 мин соответствует GDP-фукозе, как подтверждено с помощью достоверного стандарта.
Ссылки
Albermann, С., W.Piepersberg & U.F.Wehmeier, (2001) Synthesis of the milk oligosaccharide 2'-fucosyllactose using recombinant bacterial enzymes. Carbohydr Res 334: 97-103.
Andersson, В., O.Porras, L.A.Hanson, T.Lagergard & C.Svanborg-Eden, (1986) Inhibition of attachment of Streptococcus pneumoniae and Haemophilus influenzae by human milk and receptor oligosaccharides. JInfect Dis 153: 232-237.
Appelmelk, В.J., S.L.Martin, M.A.Monteiro, C.A.Clayton, A.A.McColm, P.Zheng, T.Verboom, J.J.Maaskant, D.H. van den Eijnden, C.H.Hokke, M.B.Perry, C.M.Vandenbroucke-Grauls & J.G.Kusters, (1999) Phase variation in Helicobacter pylori lipopolysaccharide due to changes in the lengths of poly(C) tracts in alpha3-rucosyltransferase genes. Infect Immun 67: 5361-5366.
Appelmelk, В.J., M.C.Martino, E.Veenhof, M.A.Monteiro, J.J.Maaskant, R.Negrini, F.Lindh, M.Perry, G.Del Giudice & C.M.Vandenbroucke-Grauls, (2000) Phase variation in H type I and Lewis a epitopes of Helicobacter pylori lipopolysaccharide. Infect Immun 68: 5928-5932.
Bergman, M., G. Del Prete, Y. van Kooyk & B.Appelmelk, (2006) Helicobacter pylori phase variation, immune modulation and gastric autoimmunity. Nat Rev Microbiol 4:151-159.
Bode, L., (2006) Recent advances on structure, metabolism, and function of human milk oligosaccharides. JNutr 136: 2127-2130.
Coppa, G.V., L.Zampini, T.Galeazzi, B.Facinelli, L.Fen-ante, R.Capretti & G.Orazio (2006) Human milk oligosaccharides inhibit the adhesion to Caco-2 cells ofdian-heal pathogens: Escherichia coli. Vibrio cholerae, and Salmonella fyris. Pediatr Res 59: 377-382.
Coyne, M.J., B.Reinap, M.M.Lee & L.E.Comstock, (2005) Human symbionts use a host-like pathway for surface fucosylation. Science 307: 1778-1781.
Crane, J.K., S.S.Azar, A.Stam & D.S.Newburg, (1994) Oligosaccharides from human milk block binding and activity of the Escherichia coli heat-stable enterotoxin (STa) in T84 intestinal cells. JNutr 124: 2358-2364.
Cravioto, A., A.Tello, H.Villafan, J.Ruiz, S. del Vedovo & J.R.Neeser, (1991) Inhibition of localized adhesion of enteropathogenic Escherichia coli to HEp-2 cells by immunoglobulin and oligosaccharide fractions of human colostrum and breast milk. J Infect Dis 163: 1247-1255.
Datsenko, К.А. & B.L.Wanner, (2000) One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proc NatlAcadSci USA 97: 6640-6645.
Dower, W.J., J.F.Miller & C.W.Ragsdale, (1988) High efficiency transformation of E.coli by high voltage electroporation. Nucleic Acids Res 16: 6127-6145.
Dumon, С., С.Bosso, J.P.Utille, A.Heyraud & E.Samain, (2006) Production of Lewis x tetrasaccharides by metabolically engineered Escherichia coli. Chembiochem 7: 359-365.
Dumon, С., В.Priem, S.L.Martin, A.Heyraud, C.Bosso & E.Samain, (2001) In vivo fucosylation of lacto-N-neotetraose and lacto-N-neohexaose by heterologous expression of Helicobacter pylori alpha-1,3 fucosyltransferase in engineered Escherichia coli. Glycoconj.718:465-474.
Dumon, С., E.Samain & В.Priem, (2004) Assessment of the two Helicobacter pylori alpha-1,3-fucosyltransferase ortholog genes for the large-scale synthesis of LewisX human milk oligosaccharides by metabolically engineered Escherichia coli. Biotechnol Prog 20: 412-419.
Ge, Z., N.W.Chan, M.M.Palcic & D.E.Taylor, (1997) Cloning and heterologous expression of an alphal,3-fucosyltransferase gene from the gastric pathogen Helicobacter pylori. JBiol Chem 272: 21357-21363.
Gnoth, M.J., S.Rudloff, C.Kunz & R.K.Kinne, (2001) Investigations of the in vitro transport of human milk oligosaccharides by a Caco-2 monolayer using a novel high performance liquid chromatography-mass spectrometry technique. J Biol Chem 276: 34363-34370.
Grant, W.D., I.W.Sutherland & J.F.Wilkimson, (1970) Control of colanic acid synthesis. J Bacterial 103: 89-96.
Hinderlich S, Berger, M., Blume, A., Chen, H., Ghaderi, D. & Bauer, C. (2002) Identification of human L-fucose kinase amino acid sequence. Biochem. Biophys. Res. Commun. 294, 650-654.
Koizumi, S., T.Endo, K.Tabata, H.Nagano, J.Ohnishi & A.Ozaki, (2000) Large-scale production of GDP-fucose and Lewis X by bacterial coupling. J Ind Microbiol Biotechnol 25:213-217.
Kretzschmar, G. & W.Stahl, (1998) Large scale synthesis of linker-modified sialyl-Lewis(X), Lewis(X) and N-acetyllactosamine. Tetrahedron 54: 6341-6358.
Kunz, C. & S.Rudloff, (2006) Health promoting aspects of milk oligosaccharides. Int Dairy J 16: 1341-1346.
Li, M., X.W.Liu, J.Shao, J.Shen, Q.Jia, W.Yi, J.K.Song, R.Woodward, C.S.Chow & P.G.Wang, (2008) Characterization of a novel alpha 1,2-fucosyltransferase of Escherichia coli O128:b12 and functional investigation of its common motif. Biochemistry 47: 378-387.
Ma, В., J.L.Simala-Grant & D.E.Taylor, (2006) Fucosylation in prokaryotes and eukaryotes. Glycobiology 16: 158R-184R.
Martin, S.L., M.R.Edbrooke, T.C.Hodgman, D.H. van den Eijnden & M.I.Bird, (1997) Lewis X biosynthesis in Helicobacter pylori. Molecular cloning of an alpha(1,3)-fucosyltransferase gene. JBiol Chem 272: 21349-21356.
Newburg, D.S., (2001) Bioactive components of human milk: evolution, efficiency, and protection. Adv Exp MedBiol 501: 3-10.
Newburg, D.S. & S.H.Neubauer, (1995) Carbohydrates in milk. In: Handbook of Milk Composition. R.G.Jensen (ed). San Diego, CA: Academic Press, pp.273-349.
Rasko, D.A., G.Wang, M.M.Palcic & D.E.Taylor, (2000) Cloning and characterization of the alpha(1,3/4) fucosyltransferase of Helicobacter pylori. J Biol Chem 275:4988-4994.
Ruiz-Palacios, G.M., L.E.Cervantes, P.Ramos, B.Chavez-Munguia & D.S.Newburg, (2003) Campylobacter jejuni binds intestinal H(0) antigen (Fuc alpha 1, 2Gal beta 1, 4GlcNAc), and fucosyloligosaccharides of human milk inhibit its binding and infection. J Biol Chem 278:14112-14120.
Sambrook, J. & D.W.Russell, (2001) Molecular cloning: a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY.
Stumpp, Т., В.Wilms & J.Altenbuchner, (2000) Ein neues L-Rhamnose-induzierbares Expressionssystem fur Escherichia coli. BIOspektrum 6: 33-36.
Wang, G., Z.Ge, D.A.Rasko & D.E.Taylor, (2000) Lewis antigens in Helicobacter pylori: biosynthesis and phase variation. Mol Microbiol 36: 1187-1196.
Wang, G., D.A.Rasko, R.Sherbume & D.E.Taylor, (1999) Molecular genetic basis for the variable expression of Lewis Y antigen in Helicobacter pylori: analysis of the alpha (1,2) fucosyltransferase gene. Mol Microbiol 31: 1265-1274.
Park, S.H., I.Pastuszak, R.Drake & A.D.Elbein, (1998). Purification to apparent homogenicity and properties of pig kidney L-fucose kinase. JBiol Chem 273: 5685-5691.
Claims (9)
1. Способ получения генетически модифицированной клетки, обладающей способностью продуцировать фукозилированные олигосахариды, включающий следующие стадии:
- трансформирование клетки геном, кодирующим фукозокиназу;
- трансформирование клетки геном, кодирующим фукозо-1-фосфатгуанилилтрансферазу;
- трансформирование клетки геном, кодирующим фукозилтрансферазу,
в котором генетически модифицированная клетка представляет собой микроорганизм, который выбирают из группы, состоящей из родов Escherichia, Klebsiella, Helicobacter, Bacillus, Lactobacillus, Streptococcus, Lactococcus, Pichia, Saccharomyces и Kluyveromyces, и
в котором катаболический путь для фукозы инактивирован в указанной клетке путем инактивации одного или нескольких генов, которые выбирают из группы, состоящей из гена фукозо-1-фосфат-альдолазы, гена фукозоизомеразы и гена фуколозокиназы.
- трансформирование клетки геном, кодирующим фукозокиназу;
- трансформирование клетки геном, кодирующим фукозо-1-фосфатгуанилилтрансферазу;
- трансформирование клетки геном, кодирующим фукозилтрансферазу,
в котором генетически модифицированная клетка представляет собой микроорганизм, который выбирают из группы, состоящей из родов Escherichia, Klebsiella, Helicobacter, Bacillus, Lactobacillus, Streptococcus, Lactococcus, Pichia, Saccharomyces и Kluyveromyces, и
в котором катаболический путь для фукозы инактивирован в указанной клетке путем инактивации одного или нескольких генов, которые выбирают из группы, состоящей из гена фукозо-1-фосфат-альдолазы, гена фукозоизомеразы и гена фуколозокиназы.
2. Способ по п.1, в котором ген, кодирующий фукозилтрансферазу получают из организма, который выбирают из группы, состоящей из родов Helicobacter, Escherichia, Yersinia, Enterococcus, Shigella, Klebsiella, Salmonella, Bacteroides, Dictyostelium, Arabidopsis, Drosophila, Homo, Bos, Mus, Rattus, Gallus, Canis и Sus.
3. Способ по п.1, в котором фукозилированный олигосахарид представляет собой фукозиллактозу, предпочтительно 2′-фукозиллактозу, 3-фукозиллактозу или лактодифукотетраозу.
4. Способ по п.1, в котором фукозокиназу и фукозо-1-фосфатгуанилилтрансферазу объединяют в бифункциональный фермент, полученный из Bacteroides.
5. Способ по п. 1, в котором фукозилированный олигосахарид представляет собой человеческий молочный олигосахарид.
6. Генетически модифицированная клетка для продуцирования фукозилированных олигосахаридов, полученная способом по любому из пп. 1-5.
7. Способ получения фукозилированных олигосахаридов, включающий стадии культивирования клетки по п.6 в подходящих условиях культивирования в среде, включающей фукозу и субстрат-акцептор, в котором субстрат-акцептор представляет собой моно-, ди- или олигосахарид или пептид.
8. Способ по п.7, в котором субстрат-акцептор представляет собой лактозу, 2′-фукозиллактозу или 3-фукозиллактозу.
9. Способ по п.7, в котором фукозилированный олигосахарид представляет собой фукозиллактозу, предпочтительно 2′-фукозиллактозу или 3-фукозиллактозу или лактодифукотетраозу.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP08172267.0 | 2008-12-19 | ||
| EP08172267 | 2008-12-19 | ||
| PCT/EP2009/067531 WO2010070104A1 (en) | 2008-12-19 | 2009-12-18 | Synthesis of fucosylated compounds |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2011129780A RU2011129780A (ru) | 2013-01-27 |
| RU2584599C2 true RU2584599C2 (ru) | 2016-05-20 |
Family
ID=40550215
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2011129780/10A RU2584599C2 (ru) | 2008-12-19 | 2009-12-18 | Синтез фукозилированных соединений |
Country Status (14)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US20110300584A1 (ru) |
| EP (1) | EP2379708B1 (ru) |
| JP (1) | JP5726751B2 (ru) |
| CN (1) | CN102257128A (ru) |
| AU (1) | AU2009329543B2 (ru) |
| BR (1) | BRPI0923433B1 (ru) |
| CO (1) | CO6362044A2 (ru) |
| IN (1) | IN2011MU01050A (ru) |
| MX (1) | MX2011006371A (ru) |
| MY (1) | MY183602A (ru) |
| NZ (1) | NZ593448A (ru) |
| RU (1) | RU2584599C2 (ru) |
| SG (1) | SG171814A1 (ru) |
| WO (1) | WO2010070104A1 (ru) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2790445C2 (ru) * | 2016-10-29 | 2023-02-21 | Хр. Ханзен ХМО ГмбХ | Улучшенный способ получения фукозилированных олигосахаридов |
| US12060593B2 (en) | 2017-07-07 | 2024-08-13 | Chr. Hansen HMO GmbH | Fucosyltransferases and their use in producing fucosylated oligosaccharides |
Families Citing this family (59)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ES2660698T3 (es) | 2009-06-08 | 2018-03-23 | Jennewein Biotechnologie Gmbh | Síntesis de HMO |
| AU2015215937B2 (en) * | 2010-07-12 | 2017-03-16 | Inbiose N.V. | Metabolically engineered organisms for the production of added value bio-products |
| PL2944690T3 (pl) * | 2010-10-11 | 2018-05-30 | Jennewein Biotechnologie Gmbh | Nowe fukozylotransferazy i ich zastosowanie |
| CN102120999A (zh) * | 2010-12-17 | 2011-07-13 | 天津科技大学 | 利用基因工程菌株耦合发酵合成人乳岩藻糖基化寡糖的方法 |
| SG10202110501RA (en) | 2010-12-31 | 2021-11-29 | Abbott Lab | Methods For Decreasing The Incidence Of Necrotizing Enterocolitis In Infants, Toddlers, Or Children Using Human Milk Oligosaccharides |
| ES2708924T3 (es) * | 2010-12-31 | 2019-04-12 | Abbott Lab | Procedimientos de uso de oligosacáridos de la leche humana para mejorar la salud respiratoria de las vías respiratorias |
| WO2012092159A1 (en) | 2010-12-31 | 2012-07-05 | Abbott Laboratories | Methods for reducing the incidence of oxidative stress using human milk oligosaccharides, vitamin c and anti-inflammatory agents |
| EP3510873A1 (en) | 2010-12-31 | 2019-07-17 | Abbott Laboratories | Nutritional compositions comprising human milk oligosaccharides and nucleotides and uses thereof for treating and/or preventing enteric viral infection |
| BR112013016587A2 (pt) | 2010-12-31 | 2016-09-27 | Abbott Lab | formulações nutricionais incluindo oligossacarídeos de leite humano e antioxidantes e usos das mesmas |
| CN110051676A (zh) | 2010-12-31 | 2019-07-26 | 雅培制药有限公司 | 用于调节炎症的人乳寡糖 |
| NZ612455A (en) | 2010-12-31 | 2015-02-27 | Abbott Lab | Human milk oligosaccharides to promote growth of beneficial bacteria |
| ES2439507T3 (es) * | 2011-01-20 | 2014-01-23 | Jennewein Biotechnologie Gmbh | Fucosiltransferasas novedosas y sus aplicaciones |
| DE12746649T1 (de) * | 2011-02-16 | 2016-09-29 | Glycosyn LLC | Biosynthese menschlicher milcholigosaccaride in manipulierten Bakterien |
| JP5881035B2 (ja) * | 2011-03-17 | 2016-03-09 | 国立研究開発法人産業技術総合研究所 | 酵母を用いた糖ヌクレオチドの合成法 |
| WO2012127045A1 (en) | 2011-03-23 | 2012-09-27 | Glycode | A yeast recombinant cell capable of producing gdp-fucose |
| NL2007268C2 (en) | 2011-08-16 | 2013-02-19 | Friesland Brands Bv | Nutritional compositions comprising human milk oligosaccharides and uses thereof. |
| BR112014004772A2 (pt) | 2011-08-29 | 2017-03-21 | Abbott Lab | oligossacarídeos do leite humano para evitar danos e/ou promover a cura do trato gastrointestinal |
| EP3517631B9 (en) * | 2011-12-16 | 2023-10-04 | Inbiose N.V. | Mutant microorganisms to synthesize ph sensitive molecules and organic acids |
| US9029136B2 (en) | 2012-07-25 | 2015-05-12 | Glycosyn LLC | Alpha (1,2) fucosyltransferases suitable for use in the production of fucosylated oligosaccharides |
| EP2900829B1 (en) | 2012-09-25 | 2019-06-26 | Glycom A/S | Glycoconjugate synthesis |
| EP2728009B1 (en) * | 2012-10-31 | 2017-07-26 | Jennewein Biotechnologie GmbH | Process for producing monosaccharides |
| CN104812768B (zh) * | 2012-11-13 | 2019-06-21 | 格礼卡姆股份公司 | 晶体3-o-岩藻糖基乳糖 |
| WO2014086373A1 (en) | 2012-12-07 | 2014-06-12 | Glycom A/S | Crystallisation of human milk oligosaccharides (hmo) |
| US10364449B2 (en) | 2013-09-06 | 2019-07-30 | Glycom A/S | Fermentative production of oligosaccharides |
| DK3041946T4 (en) | 2013-09-06 | 2025-11-03 | Glycom As | Fermentative production of oligosaccharides |
| EP3572520A1 (en) | 2013-09-10 | 2019-11-27 | Jennewein Biotechnologie GmbH | Production of oligosaccharides |
| DK2896628T3 (en) | 2014-01-20 | 2019-01-14 | Jennewein Biotechnologie Gmbh | Process for Effective Purification of Neutral Milk Oligosaccharides (HMOs) from Microbial Fermentation |
| ES2968677T3 (es) | 2014-06-11 | 2024-05-13 | Glycom As | Separación de 2-O-fucosil-lactosa de caldo de fermentación |
| US11926858B2 (en) | 2014-06-27 | 2024-03-12 | Glycom A/S | Oligosaccharide production |
| WO2015197082A1 (en) | 2014-06-27 | 2015-12-30 | Glycom A/S | Oligosaccharide production |
| SG10201808050YA (en) * | 2014-07-14 | 2018-10-30 | Basf Se | BIOTECHNOLOGICAL PRODUCTION OF LNT, LNnT AND THE FUCOSYLATED DERIVATIVES THEREOF |
| US10676770B2 (en) | 2014-12-16 | 2020-06-09 | Glycom A/S | Separation of 2′-FL from a fermentation broth |
| EP3390652B1 (en) | 2015-12-18 | 2024-12-04 | Glycom A/S | Fermentative production of oligosaccharides |
| KR20240016454A (ko) | 2016-08-31 | 2024-02-06 | 올리고사이언스 바이오테크놀로지 게엠베하 | 송아지 비육에서 인간 모유 올리고당류의 용도 |
| EP3315610B1 (en) * | 2016-10-29 | 2020-12-16 | Jennewein Biotechnologie GmbH | Process for the production of fucosylated oligosaccharides |
| US11142541B2 (en) | 2017-06-30 | 2021-10-12 | Glycom A/S | Purification of oligosaccharides |
| WO2019012461A1 (en) | 2017-07-12 | 2019-01-17 | Glycom A/S | AMORPHOUS MIXTURE COMPRISING A NEUTRAL MONO- OR OLIGOSACCHARIDE AND A NON-GLUCIDIC ACID COMPONENT |
| EP3691658A4 (en) | 2017-10-04 | 2021-06-23 | The Regents of The University of California | IMMUNOMODULATOR OLIGOSACCHARIDES |
| EP3486326A1 (en) | 2017-11-21 | 2019-05-22 | Jennewein Biotechnologie GmbH | Method for the purification of n-acetylneuraminic acid from a fermentation broth |
| EP3494807A1 (en) | 2017-12-11 | 2019-06-12 | Jennewein Biotechnologie GmbH | Spray-dried sialyllactose |
| PL3494804T3 (pl) | 2017-12-08 | 2025-10-06 | Chr. Hansen HMO GmbH | Suszona rozpyłowo 3-fukozylolaktoza |
| CN111447845B (zh) | 2017-12-08 | 2022-10-28 | 科汉森母乳低聚糖股份有限公司 | 喷雾干燥的唾液酸乳糖 |
| EP3494805B1 (en) | 2017-12-08 | 2025-08-13 | Chr. Hansen HMO GmbH | Spray-dried tetrasaccharides |
| ES3040419T3 (en) | 2017-12-08 | 2025-10-30 | Chr Hansen Hmo Gmbh | Spray-dried lacto-n-fucopentaose |
| PL3524067T3 (pl) | 2018-02-08 | 2025-06-09 | Chr. Hansen HMO GmbH | Suszona rozpyłowo mieszanina oligosacharydów mleka ludzkiego |
| AU2019362595B2 (en) | 2018-10-18 | 2024-12-19 | Basf Se | Crystalline form II of 2'-O-fucosyllactose, process for its preparation, nutritional, cosmetic or pharmaceutical formulation containing the same |
| SG11202106234SA (en) | 2018-12-19 | 2021-07-29 | Basf Se | Method for separating biomass from a solution comprising biomass and at least one oligosaccaride |
| WO2021019104A2 (en) | 2019-09-18 | 2021-02-04 | Basf Se | A production host for producing human milk oligosaccharides |
| CN110672756B (zh) * | 2019-11-07 | 2020-12-29 | 江南大学 | 一种奶粉中2’-岩藻糖基乳糖含量的检测方法 |
| WO2021094133A2 (en) | 2019-11-13 | 2021-05-20 | Basf Se | Enzymatic hydrolysis of 2',3-difucosyllactose |
| JP2023506284A (ja) | 2019-12-19 | 2023-02-15 | ビーエーエスエフ ソシエタス・ヨーロピア | ファインケミカルを生成する際の空時収率、炭素変換効率、及び炭素基質適応性の増加 |
| EP3848471A1 (en) | 2020-01-10 | 2021-07-14 | Chr. Hansen HMO GmbH | Sequential fermentative production of oligosaccharides |
| EP4118089A4 (en) | 2020-03-12 | 2024-05-01 | Glycom A/S | CRYSTALLIZATION OF 2'-FL |
| EP3922727A1 (en) | 2020-06-12 | 2021-12-15 | Basf Se | Method for separating biomass from a solution comprising biomass and at least one aroma compound |
| WO2021250191A1 (en) | 2020-06-12 | 2021-12-16 | Basf Se | Improved demineralization of fermentation broths and purification of fine chemicals such as oligosaccharides |
| WO2022013143A1 (en) | 2020-07-13 | 2022-01-20 | Glycom A/S | Oligosaccharide production |
| EP4341277A1 (en) | 2021-05-17 | 2024-03-27 | DSM IP Assets B.V. | Microbial strain expressing an invertase/sucrose hydrolase |
| MX2023013735A (es) | 2021-05-20 | 2024-02-07 | Chr Hansen As | Produccion fermentativa secuencial de oligosacaridos. |
| AU2023331862A1 (en) | 2022-08-29 | 2025-02-13 | Chr. Hansen A/S | Process for the production of a purified human milk oligosaccharide derived from a microbial fermentation process |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2125092C1 (ru) * | 1991-10-15 | 1999-01-20 | Дзе Скриппс Рисерч Инститьют | Способ получения фукозилированного углевода, способ получения фукозилированной сиалилированной углеводной молекулы, реакционная система in vitro |
| FR2840920A1 (fr) * | 2002-06-18 | 2003-12-19 | Biochimie Appliquee Soc | Nouveau microorganisme de la famille des enterobacteriaceae |
| WO2007101862A1 (en) * | 2006-03-09 | 2007-09-13 | Centre National De La Recherche Scientifique (Cnrs) | Method of producing sialylated oligosaccharides |
| US7326770B2 (en) * | 2004-01-22 | 2008-02-05 | Neose Technologies, Inc. | H. pylori fucosyltransferases |
Family Cites Families (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6238894B1 (en) | 1998-11-04 | 2001-05-29 | Diane Taylor | α1,2 fucosyltransferase |
| MXPA01004982A (es) | 1998-11-18 | 2004-09-27 | Neose Technologies Inc | Manufactura de bajo costo de oligosacaridos. |
| US20040058418A1 (en) * | 2000-04-11 | 2004-03-25 | Tetsuo Endo | Alpha 1,2-fucosyltransferase and process for producing fucose-containing complex carbohydrate |
| KR100787073B1 (ko) | 2000-06-28 | 2007-12-21 | 글리코파이, 인크. | 변형된 당단백질의 제조방법 |
| US20020132320A1 (en) | 2001-01-10 | 2002-09-19 | Wang Peng George | Glycoconjugate synthesis using a pathway-engineered organism |
| WO2003018794A1 (fr) * | 2001-08-24 | 2003-03-06 | Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. | $g(a)-1,2-fucosyle transferase et adn codant pour celle-ci |
| CA2548140A1 (en) * | 2003-12-05 | 2005-06-23 | University Of Massachusetts | Oligosaccharide compositions and use thereof in the treatment of infection |
| US20080145899A1 (en) * | 2004-09-17 | 2008-06-19 | Neose Technologies Inc | Production of Oligosaccharides By Microorganisms |
| EP1899452B1 (en) * | 2005-06-17 | 2010-10-20 | Ajinomoto Co., Inc. | A method for producing an l-amino acid using a bacterium of the enterobacteriaceae family with enhanced expression of the fucpikur operon |
| US20070221747A1 (en) | 2006-03-22 | 2007-09-27 | Siemens Vdo Automotive Corporation | Super imposed signal for an actuator and heater of a fuel injector |
| JP2010519930A (ja) * | 2007-03-07 | 2010-06-10 | グライコフィ， インコーポレイテッド | 糖タンパク質の修飾フコシル化を用いる産生 |
-
2009
- 2009-12-18 NZ NZ593448A patent/NZ593448A/en unknown
- 2009-12-18 SG SG2011037785A patent/SG171814A1/en unknown
- 2009-12-18 BR BRPI0923433-0A patent/BRPI0923433B1/pt active IP Right Grant
- 2009-12-18 RU RU2011129780/10A patent/RU2584599C2/ru active
- 2009-12-18 US US13/140,548 patent/US20110300584A1/en not_active Abandoned
- 2009-12-18 AU AU2009329543A patent/AU2009329543B2/en active Active
- 2009-12-18 CN CN200980151270XA patent/CN102257128A/zh active Pending
- 2009-12-18 WO PCT/EP2009/067531 patent/WO2010070104A1/en not_active Ceased
- 2009-12-18 MX MX2011006371A patent/MX2011006371A/es active IP Right Grant
- 2009-12-18 MY MYPI2011002757A patent/MY183602A/en unknown
- 2009-12-18 EP EP09797036.2A patent/EP2379708B1/en active Active
- 2009-12-18 JP JP2011541476A patent/JP5726751B2/ja active Active
-
2011
- 2011-06-17 CO CO11076212A patent/CO6362044A2/es unknown
-
2012
- 2012-03-30 IN IN1050MU2011 patent/IN2011MU01050A/en unknown
-
2019
- 2019-06-13 US US16/440,777 patent/US11390855B2/en active Active
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2125092C1 (ru) * | 1991-10-15 | 1999-01-20 | Дзе Скриппс Рисерч Инститьют | Способ получения фукозилированного углевода, способ получения фукозилированной сиалилированной углеводной молекулы, реакционная система in vitro |
| FR2840920A1 (fr) * | 2002-06-18 | 2003-12-19 | Biochimie Appliquee Soc | Nouveau microorganisme de la famille des enterobacteriaceae |
| US7326770B2 (en) * | 2004-01-22 | 2008-02-05 | Neose Technologies, Inc. | H. pylori fucosyltransferases |
| WO2007101862A1 (en) * | 2006-03-09 | 2007-09-13 | Centre National De La Recherche Scientifique (Cnrs) | Method of producing sialylated oligosaccharides |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| ALBERMANN C. ET AL. Synthesis of the milk oligosaccharide 2'-fucosyllactose using recombinant bacterial enzymes, Carbohydr Res., 2001 Aug, Vol. 334, No. 2, p. 97-103. COYNE M.J. ET AL. Human symbionts use a host-like pathway for surface fucosylation, Science, 2005 Mar 18, Vol. 307, N. 5716. * |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2790445C2 (ru) * | 2016-10-29 | 2023-02-21 | Хр. Ханзен ХМО ГмбХ | Улучшенный способ получения фукозилированных олигосахаридов |
| RU2818835C2 (ru) * | 2017-07-07 | 2024-05-06 | Хр. Ханзен ХМО ГмбХ | Фукозилтрансферазы и их применение для получения фукозилированных олигосахаридов |
| US12060593B2 (en) | 2017-07-07 | 2024-08-13 | Chr. Hansen HMO GmbH | Fucosyltransferases and their use in producing fucosylated oligosaccharides |
| RU2810729C2 (ru) * | 2019-06-12 | 2023-12-28 | Хр. Ханзен ХМО ГмбХ | Продукция фукозилированных олигосахаридов в bacillus |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| NZ593448A (en) | 2012-06-29 |
| BRPI0923433B1 (pt) | 2021-06-01 |
| MX325472B (ru) | 2014-11-20 |
| US20110300584A1 (en) | 2011-12-08 |
| MX2011006371A (es) | 2011-09-27 |
| EP2379708A1 (en) | 2011-10-26 |
| RU2011129780A (ru) | 2013-01-27 |
| AU2009329543B2 (en) | 2015-04-16 |
| WO2010070104A1 (en) | 2010-06-24 |
| JP5726751B2 (ja) | 2015-06-03 |
| HK1159173A1 (zh) | 2012-07-27 |
| SG171814A1 (en) | 2011-07-28 |
| BRPI0923433A2 (pt) | 2015-08-11 |
| CO6362044A2 (es) | 2012-01-20 |
| IN2011MU01050A (ru) | 2011-12-30 |
| JP2012512643A (ja) | 2012-06-07 |
| US20190382737A1 (en) | 2019-12-19 |
| US11390855B2 (en) | 2022-07-19 |
| CN102257128A (zh) | 2011-11-23 |
| AU2009329543A1 (en) | 2010-06-24 |
| EP2379708B1 (en) | 2016-04-27 |
| MY183602A (en) | 2021-03-02 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RU2584599C2 (ru) | Синтез фукозилированных соединений | |
| RU2517602C2 (ru) | Синтез нмо | |
| JP2024010049A (ja) | シアリルトランスフェラーゼ及びシアリル化オリゴ糖の生産におけるその使用 | |
| JP2022105119A (ja) | 取り込み／排出を改変した微生物宿主におけるヒトミルクオリゴ糖の生産 | |
| Li et al. | Pathway optimization of 2′-fucosyllactose production in engineered Escherichia coli | |
| Sugita et al. | Transporter engineering enables the efficient production of lacto-N-triose II and lacto-N-tetraose in Escherichia coli | |
| US20020132320A1 (en) | Glycoconjugate synthesis using a pathway-engineered organism | |
| Silvério et al. | Biocatalytic approaches using lactulose: end product compared with substrate | |
| AU2015315110A1 (en) | Alpha (1,3) fucosyltransferases for use in the production of fucosylated oligosaccharides | |
| Li et al. | Efficient biosynthesis of 2′-fucosyllactose using an in vitro multienzyme cascade | |
| Fang et al. | Enzymatic synthesis of human milk fucosides α1, 2‐Fucosyl para‐Lacto‐N‐Hexaose and its isomeric derivatives | |
| CN117157396A (zh) | 唾液酸化的二糖和/或寡糖的细胞生产 | |
| Agarwal et al. | Characterization of a novel amylosucrase gene from the metagenome of a thermal aquatic habitat, and its use in turanose production from sucrose biomass | |
| WO2022242860A1 (en) | Sequential fermentative production of oligosaccharides | |
| Nishimoto | Large scale production of lacto-N-biose I, a building block of type I human milk oligosaccharides, using sugar phosphorylases | |
| Liang et al. | Efficient biosynthesis of difucosyllactose via de novo GDP-L-fucose pathway in metabolically engineered Escherichia coli | |
| Bastida et al. | Heterologous Over‐expression of α‐1, 6‐Fucosyltransferase from Rhizobium sp.: Application to the Synthesis of the Trisaccharide β‐d‐GlcNAc (1→ 4)‐[α‐l‐Fuc‐(1→ 6)]‐d‐GlcNAc, Study of the Acceptor Specificity and Evaluation of Polyhydroxylated Indolizidines as Inhibitors | |
| KR101123062B1 (ko) | 우리딘 5'-디인산-ｎ-아세틸갈락토사민의 제조법 | |
| Duan et al. | Functional characterization of the UDP-xylose biosynthesis pathway in Rhodothermus marinus | |
| Gupta et al. | Glycogenomics of Mycobacterium tuberculosis | |
| Wang et al. | Structural and genetic characterization of the Escherichia coli O180 O antigen and identification of a UDP-GlcNAc 6-dehydrogenase | |
| HK1159173B (en) | Synthesis of fucosylated compounds | |
| Havrdová | Production of human milk oligosaccharides in the cell factory of E. coli | |
| WO2025045721A1 (en) | N-acetylglucosaminyltransferase enzymes with altered substrate specificity and their use in fermentative oligosaccharide production | |
| Kajiwara et al. | A CMP-N-acetylneuraminic acid synthetase purified from a marine bacterium, Photobacterium leiognathi JT-SHIZ-145 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PD4A | Correction of name of patent owner |