RU2571210C1 - Последовательность днк-аптамеров, связывающаяся с протеолитической субъединицей нейротоксина типа a clostridium botulinum - Google Patents
Последовательность днк-аптамеров, связывающаяся с протеолитической субъединицей нейротоксина типа a clostridium botulinum Download PDFInfo
- Publication number
- RU2571210C1 RU2571210C1 RU2014145288/10A RU2014145288A RU2571210C1 RU 2571210 C1 RU2571210 C1 RU 2571210C1 RU 2014145288/10 A RU2014145288/10 A RU 2014145288/10A RU 2014145288 A RU2014145288 A RU 2014145288A RU 2571210 C1 RU2571210 C1 RU 2571210C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- dna
- apt
- lcbonta
- aptamers
- protein
- Prior art date
Links
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 title claims abstract description 30
- 241000193155 Clostridium botulinum Species 0.000 title claims abstract description 13
- 239000002581 neurotoxin Substances 0.000 title claims abstract description 9
- 231100000618 neurotoxin Toxicity 0.000 title claims abstract description 9
- 101710138657 Neurotoxin Proteins 0.000 title claims abstract description 7
- 230000027455 binding Effects 0.000 title description 14
- 108030001720 Bontoxilysin Proteins 0.000 claims abstract description 44
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims abstract description 37
- 108091008102 DNA aptamers Proteins 0.000 claims abstract description 16
- 239000003053 toxin Substances 0.000 claims abstract description 14
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 claims abstract description 14
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims abstract description 12
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 claims abstract description 9
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 6
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 6
- 108091023037 Aptamer Proteins 0.000 claims description 44
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 36
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 36
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 claims description 27
- 108010057266 Type A Botulinum Toxins Proteins 0.000 claims description 20
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 20
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 claims description 19
- 239000004365 Protease Substances 0.000 claims description 19
- 241000193738 Bacillus anthracis Species 0.000 claims description 16
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 claims description 16
- 231100000518 lethal Toxicity 0.000 claims description 14
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 claims description 14
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 13
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 11
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 11
- 229940094657 botulinum toxin type a Drugs 0.000 claims description 7
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 claims description 6
- 102000011632 Caseins Human genes 0.000 claims description 4
- 108010076119 Caseins Proteins 0.000 claims description 4
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 claims description 3
- 238000007885 magnetic separation Methods 0.000 claims description 3
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 claims description 3
- 239000008267 milk Substances 0.000 claims description 3
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 claims description 3
- 229940065181 bacillus anthracis Drugs 0.000 claims description 2
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 claims description 2
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 claims 1
- 230000013777 protein digestion Effects 0.000 claims 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 4
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 22
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 19
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 18
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 18
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 16
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 14
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 14
- 230000005291 magnetic effect Effects 0.000 description 14
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 14
- 102000003712 Complement factor B Human genes 0.000 description 12
- 108090000056 Complement factor B Proteins 0.000 description 12
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 12
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 12
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 12
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 11
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 11
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 229940053031 botulinum toxin Drugs 0.000 description 9
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 9
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 9
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 8
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 8
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 8
- 239000000047 product Substances 0.000 description 8
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 description 7
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 7
- 229960003180 glutathione Drugs 0.000 description 7
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 7
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 7
- 102000004183 Synaptosomal-Associated Protein 25 Human genes 0.000 description 6
- 108010057722 Synaptosomal-Associated Protein 25 Proteins 0.000 description 6
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 6
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 6
- 230000035987 intoxication Effects 0.000 description 6
- 231100000566 intoxication Toxicity 0.000 description 6
- 238000000034 method Methods 0.000 description 6
- 239000011859 microparticle Substances 0.000 description 6
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 6
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 5
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 5
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 5
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 5
- 239000006249 magnetic particle Substances 0.000 description 5
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 5
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 5
- 208000003508 Botulism Diseases 0.000 description 4
- 102000016607 Diphtheria Toxin Human genes 0.000 description 4
- 108010053187 Diphtheria Toxin Proteins 0.000 description 4
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 4
- 108091006116 chimeric peptides Proteins 0.000 description 4
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 4
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 4
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 4
- 239000004005 microsphere Substances 0.000 description 4
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 4
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 4
- 238000011160 research Methods 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 4
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000005720 Glutathione transferase Human genes 0.000 description 3
- 108010070675 Glutathione transferase Proteins 0.000 description 3
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 3
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 3
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 3
- 239000012505 Superdex™ Substances 0.000 description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 238000004891 communication Methods 0.000 description 3
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 3
- 238000012869 ethanol precipitation Methods 0.000 description 3
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 3
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 3
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 3
- 238000002205 phenol-chloroform extraction Methods 0.000 description 3
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 5-bromo-4-chloro-3-indolyl beta-D-galactoside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CNC2=CC=C(Br)C(Cl)=C12 OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 0.000 description 2
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 2
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 2
- 108010037936 CCCGGG-specific type II deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 2
- 241001112696 Clostridia Species 0.000 description 2
- 241001198387 Escherichia coli BL21(DE3) Species 0.000 description 2
- 241001646719 Escherichia coli O157:H7 Species 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108060002716 Exonuclease Proteins 0.000 description 2
- 101000822797 Naja naja Long neurotoxin 5 Proteins 0.000 description 2
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 2
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 2
- 101710194807 Protective antigen Proteins 0.000 description 2
- 108010091769 Shiga Toxin 1 Proteins 0.000 description 2
- 108010090763 Shiga Toxin 2 Proteins 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 2
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 2
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 2
- 231100001103 botulinum neurotoxin Toxicity 0.000 description 2
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 2
- 238000003759 clinical diagnosis Methods 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 231100000655 enterotoxin Toxicity 0.000 description 2
- 102000013165 exonuclease Human genes 0.000 description 2
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 2
- 108091006047 fluorescent proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000034287 fluorescent proteins Human genes 0.000 description 2
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 2
- 238000001641 gel filtration chromatography Methods 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- 238000009830 intercalation Methods 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 2
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 2
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 230000006916 protein interaction Effects 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 2
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 235000021249 α-casein Nutrition 0.000 description 2
- BZTDTCNHAFUJOG-UHFFFAOYSA-N 6-carboxyfluorescein Chemical group C12=CC=C(O)C=C2OC2=CC(O)=CC=C2C11OC(=O)C2=CC=C(C(=O)O)C=C21 BZTDTCNHAFUJOG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 241000020089 Atacta Species 0.000 description 1
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- 230000004568 DNA-binding Effects 0.000 description 1
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 1
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 108010006035 Metalloproteases Proteins 0.000 description 1
- 102000005741 Metalloproteases Human genes 0.000 description 1
- 231100000757 Microbial toxin Toxicity 0.000 description 1
- 108010085220 Multiprotein Complexes Proteins 0.000 description 1
- 102000007474 Multiprotein Complexes Human genes 0.000 description 1
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 1
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 1
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 1
- 108010010677 Phosphodiesterase I Proteins 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical group OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091008103 RNA aptamers Proteins 0.000 description 1
- 102000000583 SNARE Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010041948 SNARE Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108010017898 Shiga Toxins Proteins 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 150000001540 azides Chemical class 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 1
- 238000005251 capillar electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 1
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- YTRQFSDWAXHJCC-UHFFFAOYSA-N chloroform;phenol Chemical compound ClC(Cl)Cl.OC1=CC=CC=C1 YTRQFSDWAXHJCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 238000011281 clinical therapy Methods 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 230000002498 deadly effect Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 239000000032 diagnostic agent Substances 0.000 description 1
- 229940039227 diagnostic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000013024 dilution buffer Substances 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 238000002866 fluorescence resonance energy transfer Methods 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 231100000636 lethal dose Toxicity 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 1
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 1
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 239000002858 neurotransmitter agent Substances 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 239000003973 paint Substances 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 230000000737 periodic effect Effects 0.000 description 1
- 210000002856 peripheral neuron Anatomy 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 229920000515 polycarbonate Polymers 0.000 description 1
- 239000004417 polycarbonate Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 230000006337 proteolytic cleavage Effects 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 239000002594 sorbent Substances 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 239000012536 storage buffer Substances 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000009897 systematic effect Effects 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000005945 translocation Effects 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- 238000011179 visual inspection Methods 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
Изобретение относится к биотехнологии, а именно к последовательности ДНК-аптамера, которая связывается с протеолитической субъединицей нейротоксина типа A Clostridium botulinum. Данная последовательность ДНК-аптамера состоит из одноцепочечной ДНК длиной 81 нуклеотид, выбранной из группы: APT/LCBONTA N10, представляющая собой CATACGTTCGACTGCTACCCTCCACTTTTGACGGCTTCCTCGGGATTATACGGCTA ACCGAGGGTGAGATGTACAGACTAG, или APT/LCBONTA N16, представляющая собой CATACGTTCGACTGCTACTCTGCTGGGATGGCCTAGCAGCCGATTATTGG GCTAAGCGGGCGTGTGAGATGTACAGACTAG. Данная последовательность ДНК-аптамера обладает высокой специфичностью в отношении протеолитической субъединицы (легкой цепи) токсина типа A Clostridium botulinum с константами аффинности соответственно 1,2·109 М-1, 1,3·109 М-1. Изобретение позволяет ингибировать протеолитическую активность легкой цепи BoNT/A с высокой эффективностью. 10 ил., 4 пр.
Description
Изобретение относится к области биотехнологии, биоинженерии, биохимии и диагностической медицинской микробиологии.
Основными областями применения ДНК-аптамеров являются медицинские и биологические исследования, клиническая диагностика заболеваний, в том числе создание высокочувствительных и высокоэффективных систем детекция мишеней белковой природы, а также терапия заболеваний различной природы.
Токсины Clostridium botulinum представляют собой нейротоксины белковой природы, которые ответственны за развитие смертельно опасной интоксикации с преимущественно алиментарным путем инфицирования. Семейство ботулотоксинов содержит восемь (A-Η) серологически и биохимически отличных типов токсина [Dover Ν., Barash J.R., Hill K.K., Xie G., & Amon S.S. // Journal of Infectious Diseases. - 2014. - V. 209. - №. 2. - P. 192-202], секретируемых различными штаммами С. botulinum. Летальная доза (LD50) ботулотоксинов составляет 1-5 нг/кг массы тела. Также отмечены штаммы с одновременной комбинированной продукцией двух серотипов нейротоксинов [Montecucco С, Molgó J. // Current Opinion in Pharmacology. - 2005. -V.5, N.3. - P. 274-279.; Kukreja R, Singh BR. // Microbial Toxins: Current Research and Future Trends. - Caister Academic Press. - 2009. - ISBN 978-1-904455-44-8]. Основные типы ботулинических нейротоксинов, вызывающие заболевание у человека, представлены типами А, В и Е, из них наиболее тяжелые случаи интоксикации связаны с BoNT/A [Simpson L.L. // Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. - 2004. - V. 44. - P. 167-193].
Ботулинический нейротоксин продуцируется в форме неактивного единого пептида с молекулярной массой 150 кДа, активируемого посредством протеолитического расщепления трипсином или бактериальными протеазами на легкую цепь (LC), которая представляет собой Zn-зависимую металлопротеазу (50 кДа), и тяжелую цепь (НС), состоящую из связывающего и транслокационного доменов (100 кДа). Под действием легкой цепи токсина происходит расщепление белков группы SNARE (в том числе, SNAP-25), которое приводит к нарушению связывания нейротрансмиттерных везикул и их интеграцию в плазматическую мембрану периферических нейронов [Chen S, Barbieri JT. // J. Biol. Chem. - 2011. - V. 286. - №17. - P. 15067-15072]. Легкая и тяжелая цепи токсина связаны посредством дисульфидной связи и множества нековалентных взаимодействий между двумя пептидными цепями [Capek Р, Dickerson T.J. // Toxins. - 2010. - V. 2. - Р. 24-53].
В этиологии ботулизма можно выделить две общие категории: первичная интоксикация, при которой токсины попадают в организм алиментарным путем при употреблении в пищу продуктов питания, контаминированных вегетативной формой клостридий ботулизма, и первичная инфекция, за которой следует вторичная интоксикация, когда в организм попадают споровые формы клостридий, которые после прорастают в анаэробных условиях (в кишечнике или раневой поверхности), выделяя токсин. Инкубационный период развития симптомов ботулизма составляет от нескольких часов до пяти суток и зависит от типа и дозы токсина. Выздоровление наступает медленно и может потребовать подключения к аппарату искусственной вентиляции легких, наибольшие сроки восстановительного периода наблюдаются при интоксикации BoNT/A [Simpson L.L. // Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. - 2004. - V. 44. - P. 167-193].
Диагностика ботулизма на ранних этапах заболевания, а также определение токсина в подозрительных продуктах питания и своевременно примененная терапия обеспечивают благоприятный прогноз исхода заболевания. Для клинической диагностики и терапии ботулинической интоксикации могут быть успешно использованы ДНК-аптамеры - одноцепочечные олигнуклеотиды, которые благодаря образованию сложных трехмерных структур и пространственному расположению зарядов в молекуле имеют высокую аффинность в отношении заданных молекул. Направленный отбор аптамеров против выбранных мишеней осуществляется по технологии SELEX ("Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment") [US Patent 5567588] с применением различных модификаций технологии, таких как микромагнитная селекция в микрожидкостных каналах (M-SELEX) [Lou X., Qian J., Xiao Y., Viel L., Gerdon A.E., Lagally E.T., … & Soh H.T. // Proceedings of the National Academy of Sciences. - 2009. - V. 106. - №. 9. - P. 2989-2994], использование капиллярного элекрофореза (ECEEM) [Drabovich Α., Berezovski M., Krylov S.N. // Journal of the American Chemical Society. - 2005. - V. 127. - №. 32. - P. 11224-11225] и др.
Известны ДНК-аптамеры, специфичные к различным доменам ботулинического токсина типа А: протеолитический домен [US 20090186342; Fan M., McBurnett S.R., Andrew С.J., Allman A.M., Bruno J.G., & Kie, J.L. // Journal of biomolecular techniques: JBT. - 2008. - V.19. - №.5. - P. 311], тяжелая цепь ботулотоксина [Tok J.В.H., Fischer Ν.О. // Chemical CoMMunications. - 2008. - №.16. - P. 1883-1885] и готолоксин [US 20090186342; Wei F., Но C.M. // Analytical and bioanalytical chemistry. - 2009. - V. 393. - №. 8. - P. 1943-1948]. Все описанные аптамеры были получены с применением нативного токсина, его отдельных доменов, полученных разделением нативного белка, или токсоида, инактивированного формальдегидом. Специфичные к мишени аптамеры отделяли от неспецифичных олигонуклеотидов с использованием хроматографии высокого давления (HPLC) [US 20090186342; Wei F., Но С.M. // Analytical and bioanalytical chemistry. - 2009. - V. 393. - №.8. - P. 1943-1948.] или магносепарации [Fan M., McBurnett S.R., Andrews С.J., Allman A.M., Bruno J.G., & Kiel J.L. // Journal of biomolecular techniques: JBT. - 2008. - V. 19. - №.5. - P. 311; Tok J.В.H., Fischer N.O. // Chemical CoMMunications. - 2008. - №.16. - P. 1883-1885].
Наиболее актуально получение высокоспецифичных аптамеров к легкой цепи токсина, поскольку именно блокирование активных центров протеолитического домена способно инактивировать ботулинический токсин.
Известны РНК-аптамеры, ингибирующие активность легкой цепи ботулотоксина A [Chang Т.W., Blank M., Janardhanan P., Singh В.R., Mello С., Blind M., & Cai S. // Biochemical and biophysical research coMMunications. - 2010. - V. 396. - №.4. - P. 854-860], полученные в отношении рекомбинантного белка легкой цепи ботулотоксина А. Однако молекулы РНК подвержены деградации под действием РНКаз и не обладают достаточной стабильностью для прямого применения в качестве диагностических или терапевтических агентов.
Задачей изобретения является селекция аптамеров к протеолитическому домену нейротоксина ботулизма типа А, обладающих аффинностью и специфичностью в отношении легкой цепи ботулинического нейротоксина типа А, стабильностью при длительном хранении и способностью к ингибированию протеолитической активности легкой цепи ботулотоксина А.
Поставленная задача решается с использованием оптимизированной системы селекции аптамеров, основанной на применении химерного рекомбинантного полипептида, несущего в своем составе пептидную последовательность для иммобилизации данного полипептида на твердой фазе, отделенную от пептидной последовательности легкой субъединицы нейротоксина ботулизма типа А уникальной пептидной последовательностью, расшепляемой протеазой летальным фактором В. anthracis, что позволяет провести отбор аптамеров с высокой специфичностью к мишени в результате малого числа раундов селекции.
Также поставленная задача решается применением системы магносепарации в виде магнитных микрочастиц, покрытых глутатионом, на поверхности которых через взаимодействие с глутатион-S-трансферазой иммобилизируют химерный рекомбинатный полипептид для улучшения эффективности циклов отмывки и отделения комплекса протеолитический домен/аптамеры в раствор.
Также поставленная задача решается применением протеазы летального фактора В. anthracis для расщепления специфического для нее субстрата в составе химерного полипептида, что позволяет отделить от него рекомбинантный фрагмент ботулотоксина А, несущий специфически связанные аптамеры.
Также поставленная задача решается применением раундов негативной селекции библиотеки ДНК-олигонуклеотидов против белков, являющихся традиционными компонентами блокирующих растворов в классических реакциях иммуноанализа.
Также поставленная задача решается путем клонирования селектированных последовательностей ДНК в плазмидный вектор, определения их первичной структуры и проверки на специфическую активность в отношении протеолитического домена ботулотоксина А.
Также поставленная задача решается определением показателей константы аффинности селектированных индивидуальных последовательностей к протеолитическому домену ботулотоксина типа А С. botulinum.
Также задача решается расщеплением комбинированного полипептида, содержащего субстрат SNAP-25, протеазой легкой цепью ботулотксина А в присутствии селектированных аптамеров для определения способности одноцепочечных последовательностей ДНК к ингибированию протеолитической активности протеолитического домена ботулинического токсина типа А.
Техническим результатом изобретения являются последовательности одноцепочечных ДНК-аптамеров длиной 81 нуклеотид с молекулярной массой 28 кДа, специфически связывающие легкую цепь BoNT/A с константой аффинности не менее 109 М-1 и ингибирующие протеолитическую активность легкой цепи ботулотоксина типа А.
Предлагаемое техническое решение предусматривает сочетание раундов негативной и позитивной селекции, что существенно повышает специфичность отобранных последовательностей.
Также техническое решение предполагает применение расщепляемого химерного белка для осуществления этапов позитивной селекции, что позволяет выделить при отборе исключительно те аптамеры, которые связаны с последовательностью легкой цепи нейротоксина ботулизма типа А.
Также техническое решение предполагает использование иммобилизации химерного белка на поверхности магнитных микросфер, что позволяет повысить эффективность выделения комплекса аффинных аптамеров и белка-мишени.
Важным преимуществом предлагаемой системы позитивной селекции является возможность получения пула высокоаффинных ДНК-аптамеров с минимальным содержанием низкоаффинных молекул при применении малого количества раундов селекции. Принципиальная схема проведения анализа для первичного скрининга чувствительности и специфичности индивидуальных последовательностей аптамеров представлена на фиг. 5.
Изобретение осуществляют следующим образом.
Синтезируют комбинаторную библиотеку ДНК-олигонуклеотидов вида 5′-const1-N45-const2, где N45 - вариабельная область, состоящая из 45 нуклеотидов, а const1 и const2 - константные фланкирующие области длиной по 18 нуклеотидов, которые служат для связывания со специфическими праймерами, позволяющими амплифицировать пул олигонуклеотидов после этапов селекции. (фиг. 1). Негативную селекцию из комбинаторной библиотеки осуществляют в отношении белков бычьего сывороточного альбумина и α-казеина молока. Выбор данных белков-мишеней основан, в первую очередь, на предполагаемом использовании выбранных ДНК-аптамеров в составе тест-систем на основе иммуноанализа, сопряженного с ПЦР, таких как иммуно-аптамерная ПЦР, поскольку именно указанные выше белки чаще всего используют в качестве компонентов блокирующих растворов при проведении иммуноанализа. Разделение комплексов ДНК/белок и несвязавшихся с белком олигонуклеотидов осуществляют с применением гель-фильтрационной хроматографии на колонке с Superdex 200™ (GE Healthcare, Великобритания). Пул несвязавшихся олигонуклеотидов амплифицируют в ПЦР с применением праймеров: прямого ForFAM, меченного FAM по 5′-концу цепи, и обратного RevP, несущего на 5′-конце остаток фосфорной кислоты (фиг. 1). Двуцепочечный продукт ПЦР обрабатывают 5′-экзонуклеазой фага лямбда для получения одноцепочечных олигонуклеотидов. Деградацию цепи, фосфорилированной по 5′-концу, визуально контролируют электрофорезом в ПААГ по наличию в электрофореграмме единичной меченой FAM полосы одноцепочечной ДНК (фиг. 2). Против каждого белка проводят три раунда селекции с чередованием белка-мишени.
Позитивную селекцию проводят с использованием химерного белка GST/APT/LCBONTA, экспрессируемого с последовательности gst-apt-lcbonta (фиг. 3) в составе плазмидной конструкции pGST/APT/LCBONTA, созданной на основе конструкта pGST/APT/X [Заявка на получение патента RU 2013147132]. Для этого оптимизированную последовательность, кодирующую протеолитический домен BoNT/A, полученную синтетически путем проведения элонгации цепи ДНК в серии ПЦР-амплификаций, обрабатывают эндонуклеазами рестрикции BamHI и XhoI (Thermo, США) и клонируют в плазмиду pGST/APT/X, обработанную теми же эндонуклеазами. Полученная плазмида pGST/APT/LCBONTA кодирует экспрессионную конструкцию для синтеза химерного слитного белка, содержащего последовательность фрагмента глютатион-S-трансферазы, пептид RRKKVYPYPME, являющийся субстратом летального фактора В. anthracis, in vivo биотинилируемый пептид, а также легкую цепь ботулинического токсина типа А.
Трансформируют плазмидой pGST/APT/LCBONTA клетки E. coli BL21(DE3), получая тем самым продуцент химерного пептида GST/APT/LCBONTA. Проводят продукцию полипептида в течение 3 ч после индукции жидкой культуры добавлением IPTG. После окончания продукции клеточную биомассу собирают центрифугированием, суспендируют в лизирующем буфере, суспензию бактерий обрабатывают лизоцимом и ДНКазой и центрифугируют для получения осветленного лизата, содержащего полипептид GST/APT/LCBONTA в растворимой форме.
Очистку белка GST/APT/LCBONTA из лизата проводят на колонке с иммобилизованным глутатионом, белок элюируют добавлением буфера, содержащего глутатион. Дополнительную очистку белка и перевод его в буфер для расщепления протеазой летальным фактором В. anthracis осуществляют при помощи эксклюзионной хроматографии на колонке с Superdex 200. Чистоту препарата белка GST/APT/LCBONTA анализируют денатурирующим электрофорезом в полиакрил амид ном геле.
Проверяют эффективность выщепления белка-мишени (~53 кДа) из состава химерного полипептида. Для этого химерный полипептид (~82 кДа) обрабатывают протеазой летальным фактором В. anthracis в соотношении 1 мкг/10 мг белка при 30°С в течение 1 ч. Анализ продуктов расщепления проводят гель-электрофорезом в денатурирующих условиях в полиакриламидном геле (фиг. 4).
Раунд позитивной селекции осуществляют следующим образом: химерный белок GST/APT/LCBONTA иммобилизуют на магнитных частицах, покрытых глутатионом, за счет взаимодействия глутатион-S-трансферазы в составе химерного белка с глутатионом на поверхности магнитных частиц; проводят инкубацию подготовленных магнитных частиц, несущих химерную конструкцию, с пулом одноцепочечных олигонуклеотидов, подвергшихся предварительно негативной селекции; промывают магнитные частицы от несвязавшихся олигонуклеотидов потоком отмывающего раствора в трубке, пропущенной сквозь магнит; отделяют аптамеры, специфически связанные с белком-мишенью LC BoNT/A, от конструкта GST/APT/LCBONTA и микросфер, удерживаемых магнитом, в раствор обработкой комплекса протеазой летальным фактором Bacillus anthracis; отобранный пул олигонуклеотидов очищают методом фенол-хлороформной экстракции и концентрируют осаждением в этаноле, после чего проводят обогащение пула аптамеров амплификацией с использованием праймеров ForFAM и RevP (отжиг при 54°С, элонгация 15 с). Получение одноцепочечного продукта и контроль его образования проводят аналогично описанному на этапе негативной селекции. Проводят пять раундов позитивной селекции (фиг. 5).
Получают индивидуальные последовательности аффинных к LC BoNT/A аптамеров. Для этого пул олигонуклеотидов, прошедший все раунды селекции, амплифицируют с применением прямого ForP и обратного RevP праймеров (фиг. 1), фосфорилированных по 5′-концу. Двуцепочечный ПЦР-продукт лигируют в вектор pBluescriptII SK(-) (Agilent Technologies, США), расщепленный эндонуклеазой рестрикции SmaI (Thermo, США) и обработанный щелочной фосфатазой (Invitrogen, США). Полученной плазмидой трансформируют электрокомпетентные клетки Е. coli DH12S. Клетки высевают на плотную питательную среду, содержащую ампициллин, X-Gal и IPTG. По принципу бело-голубой селекции выбирают и отсевают колонии, содержащие вставку в составе плазмиды. Проверяют наличие искомой вставки в ПЦР со стандартными праймерами M13/pUC (фиг. 6). Колонии, содержащие вставку, соответствующую по размеру единичному аптамеру, подвергают амплификации с собственных праймеров ForFAM и RevP и получают одноцепочечные фрагменты методом, описанным выше.
Проводят скрининг индивидуальных последовательностей аффинных к протеолитическому домену BoNT/A аптамеров в отношении чувствительности и специфичности связывания с белком-мишенью и контрольной панелью рекомбинантных белков токсинов. Для этого индивидуальные последовательности инкубируют в лунках ПЦР-планшета, на поверхности которых иммобилизованы следующие белки: протеолитический домен BoNT/A (LC BoNT/A), рецептор-связывающий домен тяжелой цепи BoNT/A (НС 50 BoNT/A), рецептор-связывающий домен тяжелой цепи BoNT/B (НС 50 BoNT/B), летальный фактор В. anthracis (LF), протективный антиген В. anthracis (РА), шига-токсины энтерогеморрагической Е. coli O157:Н7 (Stx1 и Stx2), дифтерийный токсин (DT), стафилококковые энтеротоксины А и В (SEA и SEB), термолабильный токсин Е. coli (LT). Лунки планшета отмывают от свободных молекул ДНК, затем проводят ПЦР в режиме реального времени с применением интеркалирующего флуоресцентного красителя (фиг. 7).
Для последовательностей с наиболее выраженными свойствами чувствительности и специфичности определяют константу аффинности на приборе ProteOn™ XPR36 Protein Interaction Array System (Bio-Rad, США).
Выбранные аптамеры тестируют в отношении ингибирования протеолитической активности легкой цепи ботулотоксина типа А. Для этого используют рекомбинантный флуоресцентный субстрат, содержащий последовательности белков CFP и YFP, разделенные последовательностью SNAP-25, представляющей собой субстрат для протеазы легкой цепи ботулотоксина типа А. Данный субстрат может быть использован для исследования протеолитической активности ботулинического токсина во FRET-анализе. Исследуют ингибирование расщепления SNAP-25 при добавлении в раствор аптамеров к LC BoNT/A. Результат визуализируют электрофорезом в денатурирующих условиях (фиг. 8).
Проводят определение первичных последовательностей аптамеров, связывающихся с легкой цепью BoNTA и ингибирующих опосредованный ею протеолиз.
Изобретение иллюстрируют следующие графические материалы:
Фиг. 1. Последовательности ДНК, используемые для отбора молекул ДНК, для обогащения селектированного пула и для проведения амплификации полученных аптамерных последовательностей.
1) Последовательность олигонуклеотидной библиотеки, используемой в процессе селекции, где N45 - вариабельная область, const1 и const2 - константные области для отжига специфических праймеров;
2) Последовательности праймеров, используемых в реакциях обогащения библиотеки, для клонирования и наращивания количества последовательностей ДНК-аптамеров.
Фиг. 2. Расщепление обратной цепи ДНК при обработке двуцепочечного фрагмента 5′-экзонуклеазой фага лямбда.
1. Маркер молекулярной массы (50 bp DNA Ladder, New England BioLabs, США);
2. Двуцепочечный фрагмент ДНК;
3. Отрицательный контроль (амплификация без внесения целевой ДНК);
4. Одноцепочечный фрагмент ДНК, полученный после обработки ПЦР-продукта 5′-экзонуклеазой фага лямбда.
Изображение получено с использованием лазерного сканера Typhoon FLA 9500.
Фиг. 3. Последовательность gst-apt-lcbonta в составе плазмидной конструкции и экспрессируемый пептид GST/APT/LCBONTA.
Фиг. 4. Результат расщепления пептида GST/APT/LCBONTA в присутствии протеазы летального фактора В. anthracis.
1. Маркер молекулярной массы (PageRuler™ Prestained Protein Ladder #SM0671, Fermentas, США);
2. Химерный белок GST/APT/LCBONTA без добавления летального фактора В. anthracis;
3. Белок протеаза летальный фактор В. anthracis;
4. Химерный белок GST/APT/LCBONTA после обработки летальным фактором В. anthracis.
Фиг. 5. Принципиальная схема селекции ДНК-аптамеров, обладающих специфической активностью в отношении LC BoNT/A.
A) Схема негативной селекции аптамеров из исходной комбинаторной библиотеки олигонуклеотидов.
B) Схема позитивной селекции преселектированных аптамеров против LC BoNT/A.
Фиг. 6. Типичные результаты ПЦР со стандартными праймерами М13 отдельных выделенных колоний после клонирования селектированного пула ДНК в вектор pBluescriptII SK(-).
1. Маркер молекулярной массы (O′RangeRuler 100+500 bp DNA Ladder, Thermo Scientific, США);
2. Контроль (апмлификация исходной плазмиды pBluescriptll SK(-) со стандартными праймерами М13;
3. Отрицательный контроль (амплификация без внесения ДНК мишени);
4, 6, 7, 9. Результаты амплификации клонов, содержащих две копии вставки;
5, 8, 10. Результаты амплификации клонов, содержащих одну копию вставки, соответствующей 81 нуклеотиду.
Изображение получено с использованием лазерного сканера Typhoon FLA 9500.
Фиг. 7А. Принципиальная схема проведения анализа для первичного скрининга чувствительности и специфичности индивидуальных последовательностей аптамеров.
Фиг. 7В. Типичные результаты скрининга чувствительности и специфичности индивидуальных последовательностей аптамеров на примере последовательностей APT/LCBONTA N10, APT/LCBONTA N16.
Фиг. 8. Результаты скрининга аптамеров APT/LCBONTA N10, APT/LCBONTA N16 на наличие блокирующей активности в отношении LC BoNT/A с использованием рекомбинантного субстрата CFP-SNAP-25-YFP.
1. Маркер молекулярной массы (PageRuler Plus Prestained Protein Ladder, Thermo, США);
2. Рекомбинантный белок-субстрат CFP-SNAP-25-YFP;
3. Белок-субстрат CFP-SNAP-25-YFP, обработанный протеазой LC BoNT/A;
4. Белок-субстрат CFP-SNAP-25-YFP, обработанный протеазой LC BoNT/A в присутствии аптамера APT/LCBONTA N10;
5. Белок-субстрат CFP-SNAP-25-YFP, обработанный протеазой LC BoNT/A в присутствии аптамера APT/LCBONTA N16.
Фиг. 9. Первичные последовательности аптамеров, специфичных к LC BoNT/A.
Для лучшего понимания сущности изобретения ниже следуют примеры его конкретного выполнения.
Пример 1. Проведение раунда негативной селекции последовательностей ДНК из пула комбинаторной библиотеки олигонуклеотидов против БСА и казеина.
Бычий сывороточный альбумин, имеющий массу 69 кДа, в количестве 500 мкг растворяют в 1 мл буферного раствора, содержащего 20 мМ Трис-HCl, 50 мМ NaCl и 5 мМ EDTA (pH 7,4). К полученному раствору добавляют 20 мкг (4×1014 молекул) исходной комбинаторной библиотеки олигонуклеотидов. Таким образом, в смеси представлен молярный избыток белка по отношению к ДНК. Смесь инкубируют в течение 1 ч при температуре 37°С со встряхиванием на орбитальном шейкере. По окончании инкубации смесь разделяют при помощи эксклюзионной хроматографии на колонке, содержащей сорбент низкого давления Superdex 200™ (GE Healthcare, Великобритания), в буферном растворе состава 20 мМ Трис-HCl, 300 мМ NaCl, 5 мМ EDTA (pH 7,4), при скорости потока 0,5 мл/мин и идентифицируют фракции, содержащие молекулы ДНК, несвязавшиеся с молекулами белка, и молекулы ДНК, ассоциировавшие с белком.
Выделенный пул олигонуклеотидов, не связывающихся с БСА, доочищают с использованием метода фенол-хлороформной экстракции нуклеиновых кислот, затем концентрируют преципитацией ДНК этанолом в присутствии копреципитанта Pellet Paint® Co-Precipitant (Novagen, Германия) и амплифицируют с использованием ПЦР. Амплификацию проводят с использованием праймеров: прямого ForFAM, несущего в положении 5′ флуоресцентную метку карбоксифлуоресцеин, и обратного RevP, фосфорилированного по 5′-концу последовательности (температура отжига праймеров 54°С, время элонгации 15 с) (фиг. 1). В результате проведенной ПЦР получают двуцепочечный фрагмент, одна из цепей которого мечена FAM.
Для получения обогащенного пула одноцепочечных фрагментов ПЦР-продукт обрабатывают 5′-экзонуклеазой фага лямбда, которая расщепляет обратную фосфорилированную цепь фрагмента [Higuchi R.G., Ochman H. // Nucleic Acids Research. - 1989. - V. 17. - N. 14. - P. 5865]. Эффективность расщепления цепи контролируют проведением электрофореза в 10%-ном полиакриламидном геле, содержащем мочевину с последующим окрашиванием бромистым этидием, при этом наличие в пробе только полосы, флуоресцирующей зеленым, свидетельствует об успешном расщеплении обратной цепи фрагмента, а присутствие в пробе второй полосы с красным цветом флуоресценции свидетельствует о неуспешном или неполном расщеплении фосфорилированной цепи ДНК (фиг. 2)
Полученный пул одноцепочечных ДНК, истощенных на связывание с БСА, экстрагируют смесью фенол-хлороформ, концентрируют, используя преципитацию этанолом. Пул олигонуклеотидов, в количестве 20 мкг примешивают к 1 мл буферного раствора (20 мМ Трис-HCl, 50 мМ NaCl и 5 мМ EDTA, pH 7,4), содержащему 250 мкг α-казеина (молекулярная масса 20 кДа), что также составляет молярный избыток белка по отношению к ДНК. Инкубируют смесь 1 ч при 37°С, после чего разделяют гель-фильтрационной хроматографией и обогащают амплификацией, как описано выше.
Проводят еще 2 аналогичных раунда селекции для каждого белка-мишени.
Пример 2. Проведение раунда позитивной селекции последовательностей олигонуклеотидов против легкой цепи токсина типа А С. botulinum.
Выделенный из лизата культуры Е. coli BL21(DE3) растворимый химерный пептид GST/APT/LCBONTA иммобилизуют на поверхности магнитных микрочастиц, покрытых глутатионом. Для этого 100 мкл суспензии частиц Pierce™ Glutathione Magnetic Beads (Thermo, США) в пробирке объемом 1,5 мл помещают на магнитный штатив DynaMag™-2 Magnet (Invitrogen, США), отбирают жидкость. Сняв пробирку со штатива, ресуспендируют микрочастицы в 300 мкл буфера состава 125 мМ Трис, 150 мМ NaCl, pH 8,0. Вновь помещают пробирку в магнитный штатив и отбирают жидкость. Повторяют трижды, отмывая тем самым микрочастицы от буфера хранения.
Белок химерного конструкта GST/APT/LCBONTA приводят к конечной концентрации 1 мг/мл и объему 300 мкл буфером 125 мМ Трис-HCl рН 8.0, 150 мМ NaCl. Добавляют суспензию белка к изолированным с помощью магнитного стенда магнитным микрочастицам. Инкубируют суспензию при комнатной температуре в течение 1 ч, встряхивая пробирку на вортексе каждые 15 мин. По окончании инкубации помещают пробирку в магнитный штатив и отбирают супернатант. Пятикратно отмывают частицы 500 мкл того же буферного раствора. Ресуспендируют частицы в 300 мкл буфера. При необходимости хранят при +4°С, добавив к суспензии натрия азид до конечной концентрации 0,02%.
Перед добавлением пула аптамеров к магнитным микрочастицам помещают пробирку в магнитный штатив и отбирают супернатант. Добавляют суспензию одноцепочечных аптамеров, подвергшихся предварительной негативной селекции, в объеме 300 мкл (буферный раствор состава 20 мМ Трис-HCl, 50 мМ NaCl, 5 мМ EDTA, pH 7,4) с содержанием ДНК в растворе 50 мкг. Инкубируют суспензию на протяжении 1 ч при комнатной температуре при периодическом перемешивании на вортексе. Отмывают магнитные частицы от несвязавшихся молекул ДНК потоком буферного раствора объемом 300 мл состава 20 мМ Трис-HCl, 250 мМ NaCl, 5 мМ EDTA, рН 7,4, используя систему проточной магнитной сепарации MiniMACS™ Separator (Miltenyi Biotec, Германия). Удалив магнитное воздействие на частицы, несущие на своей поверхности химерный полипептид GST/APT/LCBONTA, связанный с аптамерами, собирают микросферы в чистую пробирку объемом 1,5 мл. Фиксируя магнитные микросферы, отбирают супернатант. Добавляют 300 мкл раствора протеазы летального фактора В. anthracis [патент РФ №2355769] с содержанием 5 мкг протезы в буфере 30 мМ Трис-HCl, рН 7.4. Выдерживают в течение 1 ч при температуре 30°С.Фиксируют частицы при помощи магнитного штатива, отбирают супернатант, содержащий отщепленный белок легкой цепи ботулотоксина А, несущий специфически связанные аптамеры. Пул олигонуклеотидов очищают методом фенол-хлороформной экстракции и концентрируют преципитацией этанолом, как описано выше (фиг. 5).
Наращивают селектированный пул аптамеров с помощью ПЦР-амплификации с использованием прямого праймера ForFAM и обратного праймера RevP (фиг. 1). Получают одноцепочечный продукт обработкой способом, описанным выше, контроль удаления комплементарной цепи ДНК осуществляют при помощи электрофореза в ПААГ (фиг. 2).
Полученный обогащенный пул ДНК-аптамеров используют для осуществления дальнейших раундов селекции.
Всего проводят пять раундов позитивной селекции.
Пример 3. Получение индивидуальных последовательностей олигонуклеотидов, подвергшихся негативной селекции.
Фрагменты для клонирования в коммерческий вектор pBluescriptll SK(-) (Agilent Technologies, США) нарабатывают на основе пула селектированных олигонуклеотидов при помощи ПЦР с использованием прямого и обратного фосфорилированных праймеров ForP и RevP (отжиг праймеров при 54°С, элонгация 15 с) (фиг. 1). Плазмиду pBluescriptll SK(-) обрабатывают эндонуклеазой рестрикции SmaI в буфере Tango (Thermo, США), после чего обрабатывают щелочной фосфатазой (Invitrogen, США). Фосфорилированные двуцепочечные фрагменты ДНК лигируют в подготовленную плазмиду.
Электрокомпетентные клетки E. coli DH12S трансформируют подготовленной ранее плазмидой pBluescriptll SK(-), содержащей вставки селектированных последовательностей, применив электротрансформацию (прибор Eppendorf Electroporator 2510 (Eppendorf, Германия), режим 1,7 кB). Трансформированные клетки высевают на плотную среду с 2xYT-агаром, содержащим 50 мкг/мл ампициллина, 80 мкг/мл X-Gal и 20 мМ IPTG, и выращивают в течение ночи при 37°С.
Единичные колонии, потенциально содержащие вектор со вставкой (по принципу бело-голубой селекции [Ullmann A, Jacob F, Monod J. // J Mol Biol. - 1967. - V. 24. - N. 2. - P. 339-343.]) верифицируют на наличие единичного встроенного фрагмента ДНК искомой длины в плазмиде с помощью ПЦР со стандартными прямым и обратным праймерами M13/pUC (Fermentas, США) (фиг. 6). Наращивают количество копий индивидуальных последовательностей клонированных фрагментов ДНК амплификацией с использованием праймеров ForFAM и RevP (фиг. 1). Получают одноцепочечный продукт для каждого из клонов обработкой 5′-экзонуклеазой фага лямбда с визуальным контролем в электрофорезе (фиг. 2). Таким образом получают клонированные одноцепочечные индивидуальные последовательности из 500 бактериальных клонов.
Пример 4. Скрининг чувствительности и специфичности индивидуальных селектированных последовательностей в отношении протеолитического домена ботулотоксина типа А и панели контрольных рекомбинантных белков токсинов.
На поликарбонатном 96-луночном ПЦР-планшете с высокосвязывающей поверхностью (Corning, США) иммобилизуют белки: протеолитический домен BoNT/A (LC BoNT/A), рецептор-связывающий домен тяжелой цепи BoNT/A (НС 50 BoNT/A), рецептор-связывающий домен тяжелой цепи BoNT/B (НС 50 BoNT/B), летальный фактор В. anthracis (LF), протективный антиген В. anthracis (РА), шига-токсины Stx1 и Stx2 энтерогеморрагической Е. coli O157:Н7, дифтерийный токсин (DT), стафилококковые энтеротоксины А и В (SEA и SEB), термолабильный токсин Е. coli (LT). Первый вертикальный ряд планшета (8 лунок) не содержит белки и его лунки служат в качестве отрицательных контрольных проб. Начиная со второго вертикального ряда вносят рекомбинатные белки из исследуемой панели в количестве 0,5 мкг/лунку в фосфатно-солевом буфере, рН 7,4 (ФСБ) в объеме 50 мкл. Инкубируют планшет на протяжении часа при 37°С при встряхивании на орбитальном шейкере. По окончании инкубации трижды отмывают лунки планшета ФСБ, содержащим 0,05% Tween-20. Свободные валентности планшета блокируют буфером, состоящим из обезжиренного (содержание жира 0,5%) молока с добавлением 3% БСА, в объеме 200 мкл/лунку в течение 40 минут при 37°С на орбитальном шейкере. Отмывку производят трижды ФСБ с 0,05% Tween-20.
Затем в лунки горизонтальных рядов планшета вносят одноцепочечную ДНК индивидуальных аптамеров в объеме 50 мкл и количестве 0,2 мкг/лунку. В первый и второй горизонтальные ряды в качестве контроля сравнения вносят исходную комбинаторную библиотеку. В последующие горизонтальные ряды вносят ДНК аптамеров (в 2 ряда по 12 лунок). Таким образом, каждая проба исследуется в двух повторностях (фиг. 7А). Буфер для разведения ДНК содержит 20 мМ Трис-HCl, 50 мМ NaCl, 5 мМ EDTA, pH 7,4. Инкубируют планшет с ДНК в течение 1 ч при 37°С. Отмывку от несвязавщихся молекул ДНК производят раствором, содержащим 20 мМ Трис-HCl, 300 мМ NaCl, 5 мМ EDTA, pH 7,4 пятикратно.
Контролируют реакцию связывания ДНК с белками в ПЦР в режиме реального времени. Для этого в лунки планшета вносят амплификационную смесь, содержащую флуоресцентный интеркалирующий краситель SYBR-Green I (ЗАО "Синтол", Россия) с добавлением праймеров ForP и RevP (фиг. 1). Амплификацию проводят в режиме: температура отжига праймеров 54°С, время элонгации 10 с, детекцию сигнала проводят по каналу SYBR 1(FAM) (прибор IQ™5, Bio-Rad, США) (фиг. 7В).
По результатам предварительного скрининга выделяют 2 индивидуальных клона аптамеров (APT/LCBONTA N10, N16) (фиг. 9), проявившие наибольшую специфическую активность в отношении LC BoNT/A, и вместе с тем не выявляющие неспецифические взаимодействия с другими рекомбинантными белками токсинов, присутствующими в использованной скрининговой панели.
Для указанных последовательностей определяют константы аффинности с использованием системы ProteOn™ XPR36 Protein Interaction Array System (Bio-Rad, США): APT/LCBONTA N10 - 1,2·109 М-1, APT/LCBONTA N16 - 1,3·109 M-1.
Пример 5. Проверка наличия ингибирующей активности селектированных аптамеров в отношении протеолитического домена ботулинического токсина типа А.
Для проверки способности ингибирования протеолитической активности легкой цепи ботулотоксина аптамерами, получают рекомбинантный конструкт, который содержит флуоресцентные белки CFP и YFP, разделенные субстратом для легкой цепи ботулотоксина А - SNAP-25.
В микропробирки вносят 100 мкл смеси флуоресцентного белка CFP-SNAP-25-YFP и рекомбинантного белка LC BoNT/A (в соотношении 1 мкг субстрата к 100 мкг протеазы) в присутствии одноцепочечной ДНК индивидуальных клонов аптамеров (в количестве 50 мкг на 100 мкг протеазы). Инкубируют смесь в течение 1 ч при 30°С. В качестве контроля используют смесь субстрата с протеазой без добавления аптамера.
Контроль эффективности ингибирования протеазы проводят электрофоретически в денатурирующих условиях в 10%-ном полиакриламидном геле в присутствии мочевины и SDS. Окрашивание геля осуществляют кумасси R-250 по стандартной методике. На электрофореграмме полосы с молекулярной массой ~50 кДа соответствуют нерасщепленному субстрату CFP-SNAP-25-YFP, который при воздействии протеазы ботулотоксина А расщепляется на две части с молекулярной массой ~27 кДа и ~23 кДа.
Аптамеры APT/LCBONTA N10 и APT/LCBONTA N16 частично ингибируют расщепление естественного субстрата SNAP-25 протеазой ботулотоксина типа А (фиг. 8).
Перечень последовательностей к заявке на получение патента «Последовательность ДНК-аптамеров, связывающаяся с протеолитической субъединицей нейротоксина типа А Clostridium botulinum"
А) Последовательность gst-apt-lcbonta в составе плазмиды pGST/APT/LCBONTA
В) Аминокислотная последовательность химерного пептида GST/APT/LCBONTA
С) Последовательности ДНК-аптамеров, связывающиеся с протеолитической субъединицей нейротоксина типа A Clostridium botulinum
Перечень последовательностей к заявке на получение патента «Последовательность ДНК-аптамеров, связывающаяся с протеолитической субъединицей нейротоксина типа А Clostridium botulinum”
А) Последовательность gst-apt-lcbonta в составе плазмиды pGST/APT/LCBONTA
TCT CGA TCC CGC GAA ATT AAT ACG ACT CAC TAT AGG GGA ATT GTG AGC GGA TAA CAA TTC CCC TCT AGA AAT AAT TTT GTT TAA CTT TAA GAA GGA GAT ATA CAT ATG TCC CCT ATA CTA GGT TAT TGG AAA ATT AAG GGC CTT GTG CAA CCC ACT CGA CTT CTT TTG GAA TAT CTT GAA GAA AAA TAT GAA GAG CAT TTG TAT GAG CGC GAT GAA GGT GAT AAA TGG CGA AAC AAA AAG TTT GAA TTG GGT TTG GAG TTT CCC AAT CTT CCT TAT TAT ATT GAT GGT GAT GTT AAA TTA ACA CAG TCT ATG GCC ATC ATA CGT TAT ATA GCT GAC AAG CAC AAC ATG TTG GGT GGT TGT CCA AAA GAG CGT GCA GAG ATT TCA ATG CTT GAA GGA GCG GTT TTG GAT ATT AGA TAC GGT GTT TCG AGA ATT GCA TAT AGT AAA GAC TTT GAA ACT CTC AAA GTT GAT TTT CTT AGC AAG CTA CCT GAA ATG CTG AAA ATG TTC GAA GAT CGT TTA TGT CAT AAA ACA TAT TTA AAT GGT GAT CAT GTA ACC CAT CCT GAC TTC ATG TTG TAT GAC GCT CTT GAT GTT GTT TTA TAC ATG GAC CCA ATG TGC CTG GAT GCG TTC CCA AAA TTA GTT TGT TTT AAA AAA CGT ATT GAA GCT ATC CCA CAA ATT GAT AAG TAC TTG AAA TCC AGC AAG TAT ATA GCA TGG CCT TTG CAG GGC TGG CAA GCC ACG TTT GGT GGT GGC GAC CAT CCT CCG AAA TCT GGC GAA GAT CTG GGT GGC GGT AGC GGT CGC CGT AAG AAA GTT TAC CCG TAT CCG ATG GAA GGT GGC GGT AGC GGT GGC CTG AAC GAC ATC TTC GAA GCT CAG AAG ATC GAA TGG CAC GAG GAT CCG GGT CTG CCG TTC GTG AAC AAG CAG TTC AAC TAC AAG GAC CCG GTG AAC GGT GTG GAC ATC GCT TAC ATC AAG ATC CCG AAC GCT GGT CAG ATG CAG CCG GTT AAG GCG TTC AAG ATC CAC AAC AAG ATC TGG GTG ATC CCG GAG CGT GAC ACC TTC ACC AAC CCG GAG GAA GGC GAC CTG AAC CCG CCA CCG GAA GCG AAG CAG GTT CCG GTG AGC TAC TAT GAC AGC ACC TAC CTG AGC ACC GAC AAC GAG AAG GAC AAC TAC CTG AAG GGT GTC ACC AAG CTG TTC GAG CGC ATC TAC AGC ACC GAC CTG GGT CGC ATG CTG CTC ACC AGC ATC GTG CGT GGC ATC CCG TTC TGG GGT GGC AGC ACC ATC GAC ACC GAG CTG AAG GTG ATC GAC ACC AAC TGC ATC AAC GTG ATC CAG CCG GAC GGC AGC TAC CGC AGC GAA GAG CTG AAC CTG GTG ATC ATT GGT CCG AGC GCT GAC ATC ATT CAG TTC GAG TGC AAG AGC TTC GGC CAC GAG GTT CTG AAC CTG ACG CGC AAC GGT TAC GGC AGC ACC CAG TAC ATC CGC TTC AGC CCA GAC TTC ACC TTC GGC TTC GAA GAG AGC CTG GAG GTC GAC ACC AAC CCG CTG CTC GGT GCT GGC AAG TTC GCG ACC GAC CCG GCT GTG ACC CTG GCT CAC GAG CTG ATC CAC GCT GGC CAC CGC CTG TAC GGC ATC GCG ATC AAC CCG AAC CGT GTG TTC AAG GTG AAC ACC AAC GCC TAC TAT GAG ATG AGC GGC CTG GAG GTG AGC TTC GAG GAA CTG CGC ACC TTC GGT GGC CAC GAC GCG AAG TTC ATC GAC AGC CTG CAG GAG AAC GAG TTC CGT CTG TAC TAT TAC AAC AAG TTC AAG GAC ATC GCG AGC ACC CTG AAC AAG GCT AAG AGC ATC GTT GGT ACC ACT GCG AGC CTG CAG TAC ATG AAG AAC GTG TTC AAG GAG AAG TAC CTC CTG AGC GAG GAT ACC AGC GGC AAG TTC AGC GTG GAC AAG CTG AAG TTC GAC AAG CTG TAC AAA ATG TTA ACA GAG ATT TAC ACA GAG GAT AAC TTC GTT AAG TTC TTT AAG GTG CTG AAC CGC AAG ACC TAC CTG AAC TTC GAC AAG GCC GTG TTC AAG ATC AAC ATC GTT CCG AAG GTG AAC TAC ACC ATC TAC GAC GGC TTC AAC CTG CGC AAC ACC AAC CTG GCT GCG AAC TTC AAC GGT CAG AAC ACC GAG ATC AAC AAT ATG AAC TTC ACC AAG CTG AAG AAC TAA GAG CTCC GTC GAC AAG CTT GCG GCC GCA CTC GAG CAC CAC CAC CAC CAC CAC TGA
B) Аминокислотная последовательность химерного пептида GST/APT/LCBONTA
Met S P I L G Y W K I K G L V Q P T R L L L E Y L E E K Y E E H L Y E R D E G D K W R N K K F E L G L E F P N L P Y Y I D G D V K L T Q S Met A I I R Y I A D K H N Met L G G C P K E R A E I S Met L E G A V L D I R Y G V S R I A Y S K D F E T L K V D F L S K L P E Met L K Met F E D R L C H K T Y L N G D H V T H P D F Met L Y D A L D V V L Y Met D P Met C L D A F P K L V C F K K R I E A I P Q I D K Y L K S S K Y I A W P L Q G W Q A T F G G G D H P P K S G E D L G G G S G R R K K V Y P Y P Met E G G G S G G L N D I F E A Q K I E W H E D P G L P F V N K Q F N Y K D P V N G V D I A Y I K I P N A G Q Met Q P V K A F K I H N K I W V I P E R D T F T N P E E G D L N P P P E A K Q V P V S Y Y D S T Y L S T D N E K D N Y L K G V T K L F E R I Y S T D L G R Met L L T S I V R G I P F W G G S T I D T E L K V I D T N C I N V I Q P D G S Y R S E E L N L V I I G P S A D I I Q F E C K S F G H E V L N L T R N G Y G S T Q Y I R F S P D F T F G F E E S L E V D T N P L L G A G K F A T D P A V T L A H E L I H A G H R L Y G I A I N P N R V F K V N T N A Y Y E Met S G L E V S F E E L R T F G G H D A K F I D S L Q E N E F R L Y Y Y N K F K D I A S T L N K A K S I V G T T A S L Q Y Met K N V F K E K Y L L S E D T S G K F S V D K L K F D K L Y K Met L T E I Y T E D N F V K F F K V L N R K T Y L N F D K A V F K I N I V P K V N Y T I Y D G F N L R N T N L A A N F N G Q N T E I N N Met N F T K L K N Stop
С) Последовательности ДНК-аптамеров, связывающиеся с протеолитической субъединицей нейротоксина типа А Clostridium botulinum
| APT/LCBONTA N10 | CA-TAC-GTT-CGA-CTG-CTA-C CCTCCACTTTTGACGGCTTCCTCGGGATTATACGGCTAACCGAGG GT-GAG-ATG-TAC-AGA-CTA-G |
| APT/LCBONTA N16 | CA-TAC-GTT-CGA-CTG-CTA-C TСTGCTGGGATGGCCTAGCAGCCGATTATTGGGCTAAGCGGGCGT GT-GAG-ATG-TAC-AGA-CTA-G |
Claims (1)
- Последовательность ДНК-аптамера, связывающаяся с протеолитической субъединицей нейротоксина типа A Clostridium botulinum, состоящая из одноцепочечной ДНК длиной 81 нуклеотид, выбранной из группы: APT/LCBONTA N10, представляющая собой CATACGTTCGACTGCTACCCTCCACTTTTGACGGCTTCCTCGGGATTATACGGCTA ACCGAGGGTGAGATGTACAGACTAG, или APT/LCBONTA N16, представляющая собой CATACGTTCGACTGCTACTCTGCTGGGATGGCCTAGCAGCCGATTATTGG GCTAAGCGGGCGTGTGAGATGTACAGACTAG, обладает высокой специфичностью в отношении протеолитической субъединицы (легкой цепи) токсина типа A Clostridium botulinum с константами аффинности соответственно: 1,2·109 М-1, 1,3·109 М-1, образует трехмерные структуры, способна ингибировать протеолитическую активность легкой цепи BoNT/A, отобрана с применением комбинации негативной селекции против белков бычьего сывороточного альбумина и α-казеина молока и позитивной селекции в отношении рекомбинантного белка легкой цепи ботулинического токсина типа А с использованием системы магносепарации в совокупности с выщеплением белка-мишени, аффинно связанного со специфичными аптамерами, из состава химерного рекомбинантного полипептида при помощи протеазы летального фактора Bacillus anthracis.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2014145288/10A RU2571210C1 (ru) | 2014-11-12 | 2014-11-12 | Последовательность днк-аптамеров, связывающаяся с протеолитической субъединицей нейротоксина типа a clostridium botulinum |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2014145288/10A RU2571210C1 (ru) | 2014-11-12 | 2014-11-12 | Последовательность днк-аптамеров, связывающаяся с протеолитической субъединицей нейротоксина типа a clostridium botulinum |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2571210C1 true RU2571210C1 (ru) | 2015-12-20 |
Family
ID=54871285
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2014145288/10A RU2571210C1 (ru) | 2014-11-12 | 2014-11-12 | Последовательность днк-аптамеров, связывающаяся с протеолитической субъединицей нейротоксина типа a clostridium botulinum |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2571210C1 (ru) |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20090186342A1 (en) * | 2006-05-12 | 2009-07-23 | Pronucleotein Biotechnologies, Llc | Methods of producing competitive aptamer fret reagents and assays |
| RU2410432C1 (ru) * | 2009-11-23 | 2011-01-27 | Государственное учреждение Научно-исследовательский институт физико-химической биологии имени А.Н. Белозерского Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова | Модифицированные днк аптамеры, ингибирующие активность тромбина |
| WO2013027063A1 (en) * | 2011-08-24 | 2013-02-28 | Altermune Technologies, Llc | Chemically programmable immunity |
-
2014
- 2014-11-12 RU RU2014145288/10A patent/RU2571210C1/ru active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20090186342A1 (en) * | 2006-05-12 | 2009-07-23 | Pronucleotein Biotechnologies, Llc | Methods of producing competitive aptamer fret reagents and assays |
| RU2410432C1 (ru) * | 2009-11-23 | 2011-01-27 | Государственное учреждение Научно-исследовательский институт физико-химической биологии имени А.Н. Белозерского Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова | Модифицированные днк аптамеры, ингибирующие активность тромбина |
| WO2013027063A1 (en) * | 2011-08-24 | 2013-02-28 | Altermune Technologies, Llc | Chemically programmable immunity |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| CHANG T.W. ET AL., In vitro selection of RNA aptamers that inhibit the activity of type A botulinum neurotoxin, Biochem Biophys Res Commun., 2010, v. 396, no.4, p. 854-860. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Tschowri et al. | Tetrameric c-di-GMP mediates effective transcription factor dimerization to control Streptomyces development | |
| Krieger et al. | The structural basis of T4 phage lysis control: DNA as the signal for lysis inhibition | |
| US20180223262A1 (en) | Recombinant k1-5 bacteriophages and uses thereof | |
| Gadwal et al. | C-terminal processing of GlyGly-CTERM containing proteins by rhombosortase in Vibrio cholerae | |
| Flores-Kim et al. | WhyD tailors surface polymers to prevent premature bacteriolysis and direct cell elongation in Streptococcus pneumoniae | |
| ES2736474T3 (es) | Un método para detectar un microorganismo en una muestra mediante un método de detección basado en fluorescencia usando SOMAmers | |
| RU2737829C1 (ru) | Последовательность ДНК-аптамера, связывающаяся с пептидогликан-ассоциированным липопротеином Legionella pneumophila | |
| Ward et al. | Identification of cellular targets of a series of boron heterocycles using TIPA II—A sensitive target identification platform | |
| Kudryakova et al. | Structural and functional properties of antimicrobial protein L5 of Lysоbacter sp. XL1 | |
| Zhao et al. | Engineering the bacteriophage 80 alpha endolysin as a fast and ultrasensitive detection toolbox against Staphylococcus aureus | |
| RU2571210C1 (ru) | Последовательность днк-аптамеров, связывающаяся с протеолитической субъединицей нейротоксина типа a clostridium botulinum | |
| Huang et al. | Functional nucleic acids for detecting bacteria | |
| KR20140129221A (ko) | 리신과 기타 리보솜 비활성화 단백질의 검출을 위한 방법과 시스템 | |
| Thepparit et al. | Interaction of Rickettsia felis with histone H2B facilitates the infection of a tick cell line | |
| US20190309265A1 (en) | Recombinant b11 bacteriophages and uses thereof | |
| Lee et al. | Comparison of DNA/RNA yield and integrity between PMAP36-mediated and other bacterial lysis methods | |
| Markley et al. | An Escherichia coli-based bioengineering strategy to study streptolysin S biosynthesis | |
| Selvam et al. | Isolation and characterization of ssDNA aptamers against BipD antigen of Burkholderia pseudomallei | |
| JP2003061665A (ja) | 芽胞形成菌の検出方法 | |
| Jones et al. | A simplified protocol for high-yield expression and purification of bacterial topoisomerase I | |
| RU2566551C1 (ru) | ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ ДНК-АПТАМЕРОВ, СВЯЗЫВАЮЩАЯСЯ С БАКТЕРИЯМИ Escherichia coli O157:H7 | |
| Dowah | Identification of the receptor binding proteins for Clostridium difficile Bacteriophages | |
| RU2549463C1 (ru) | Способ определения ботулинического нейротоксина типа а на основе иммунодетекции, сопряженной с полимеразной цепной реакцией | |
| JP6045025B2 (ja) | 抗菌剤のスクリーニング方法 | |
| Kever et al. | Identification of Gip as a novel phage-encoded gyrase inhibitor protein featuring a broad activity profile |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PD4A | Correction of name of patent owner |