RU2565827C2 - Способ получения вирусного антигена и вакцин - Google Patents
Способ получения вирусного антигена и вакцин Download PDFInfo
- Publication number
- RU2565827C2 RU2565827C2 RU2014101484/10A RU2014101484A RU2565827C2 RU 2565827 C2 RU2565827 C2 RU 2565827C2 RU 2014101484/10 A RU2014101484/10 A RU 2014101484/10A RU 2014101484 A RU2014101484 A RU 2014101484A RU 2565827 C2 RU2565827 C2 RU 2565827C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- stage
- virus
- enveloped
- viral
- equal
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 163
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 title claims abstract description 100
- 239000000427 antigen Substances 0.000 title claims abstract description 94
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 title claims abstract description 94
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 title claims abstract description 94
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 title claims abstract description 42
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims abstract description 154
- 239000003599 detergent Substances 0.000 claims abstract description 81
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims abstract description 53
- 239000012263 liquid product Substances 0.000 claims abstract description 50
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims abstract description 38
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 37
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 claims abstract description 28
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 25
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims abstract description 22
- 238000005352 clarification Methods 0.000 claims abstract description 21
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 96
- 230000009467 reduction Effects 0.000 claims description 31
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 claims description 26
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 claims description 25
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 claims description 25
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 21
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 21
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 21
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 claims description 18
- 238000011038 discontinuous diafiltration by volume reduction Methods 0.000 claims description 17
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims description 17
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 claims description 15
- 239000012530 fluid Substances 0.000 claims description 12
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 claims description 11
- 238000004191 hydrophobic interaction chromatography Methods 0.000 claims description 11
- GNFTZDOKVXKIBK-UHFFFAOYSA-N 3-(2-methoxyethoxy)benzohydrazide Chemical compound COCCOC1=CC=CC(C(=O)NN)=C1 GNFTZDOKVXKIBK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 244000309457 enveloped RNA virus Species 0.000 claims description 10
- -1 quaternary ammonium cations Chemical class 0.000 claims description 10
- 238000011210 chromatographic step Methods 0.000 claims description 9
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 claims description 8
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 claims description 8
- 230000003381 solubilizing effect Effects 0.000 claims description 8
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 claims description 7
- 241000450599 DNA viruses Species 0.000 claims description 6
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 claims description 5
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 claims description 5
- 238000011118 depth filtration Methods 0.000 claims description 5
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 claims description 5
- 230000001902 propagating effect Effects 0.000 claims description 5
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 4
- 208000037262 Hepatitis delta Diseases 0.000 claims description 4
- 241000724709 Hepatitis delta virus Species 0.000 claims description 4
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 claims description 4
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 claims description 4
- 241000711573 Coronaviridae Species 0.000 claims description 3
- 241000711950 Filoviridae Species 0.000 claims description 3
- 241000710831 Flavivirus Species 0.000 claims description 3
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 claims description 3
- 241000371980 Influenza B virus (B/Shanghai/361/2002) Species 0.000 claims description 3
- 241000713112 Orthobunyavirus Species 0.000 claims description 3
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 claims description 3
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 claims description 3
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 claims description 3
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 claims description 3
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 claims description 3
- 241000712891 Arenavirus Species 0.000 claims description 2
- 208000037797 influenza A Diseases 0.000 claims description 2
- 208000037798 influenza B Diseases 0.000 claims description 2
- 208000037799 influenza C Diseases 0.000 claims description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 claims 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 13
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 10
- 238000000926 separation method Methods 0.000 abstract description 5
- 230000006872 improvement Effects 0.000 abstract description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 abstract 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 65
- 101710154606 Hemagglutinin Proteins 0.000 description 61
- 101710093908 Outer capsid protein VP4 Proteins 0.000 description 61
- 101710135467 Outer capsid protein sigma-1 Proteins 0.000 description 61
- 101710176177 Protein A56 Proteins 0.000 description 61
- 239000000185 hemagglutinin Substances 0.000 description 61
- 229920001429 chelating resin Polymers 0.000 description 33
- LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M Cetrimonium bromide Chemical compound [Br-].CCCCCCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)C LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 31
- 230000007928 solubilization Effects 0.000 description 26
- 238000005063 solubilization Methods 0.000 description 26
- 102000005348 Neuraminidase Human genes 0.000 description 24
- 108010006232 Neuraminidase Proteins 0.000 description 24
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 22
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 18
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 18
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 17
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 17
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 12
- VEZXCJBBBCKRPI-UHFFFAOYSA-N beta-propiolactone Chemical compound O=C1CCO1 VEZXCJBBBCKRPI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 11
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 10
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 9
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 9
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 9
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 8
- 239000000463 material Substances 0.000 description 8
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 8
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 8
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 7
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 7
- 229960000380 propiolactone Drugs 0.000 description 7
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 7
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 6
- 230000008569 process Effects 0.000 description 6
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 6
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 5
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 5
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 description 5
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 5
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 5
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229940124873 Influenza virus vaccine Drugs 0.000 description 4
- 108010058846 Ovalbumin Proteins 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 4
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 4
- 238000002298 density-gradient ultracentrifugation Methods 0.000 description 4
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 4
- 238000011026 diafiltration Methods 0.000 description 4
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 description 4
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 4
- 230000001932 seasonal effect Effects 0.000 description 4
- 229940031626 subunit vaccine Drugs 0.000 description 4
- 229960004854 viral vaccine Drugs 0.000 description 4
- UHOVQNZJYSORNB-UHFFFAOYSA-N Benzene Chemical compound C1=CC=CC=C1 UHOVQNZJYSORNB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- FGUUSXIOTUKUDN-IBGZPJMESA-N C1(=CC=CC=C1)N1C2=C(NC([C@H](C1)NC=1OC(=NN=1)C1=CC=CC=C1)=O)C=CC=C2 Chemical compound C1(=CC=CC=C1)N1C2=C(NC([C@H](C1)NC=1OC(=NN=1)C1=CC=CC=C1)=O)C=CC=C2 FGUUSXIOTUKUDN-IBGZPJMESA-N 0.000 description 3
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101710085938 Matrix protein Proteins 0.000 description 3
- 101710127721 Membrane protein Proteins 0.000 description 3
- 108010034546 Serratia marcescens nuclease Proteins 0.000 description 3
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 3
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 3
- 108010065667 Viral Matrix Proteins Proteins 0.000 description 3
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- 229960003971 influenza vaccine Drugs 0.000 description 3
- 238000004460 liquid liquid chromatography Methods 0.000 description 3
- 229940092253 ovalbumin Drugs 0.000 description 3
- 229920000151 polyglycol Polymers 0.000 description 3
- 239000010695 polyglycol Substances 0.000 description 3
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 3
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 3
- QGLWBTPVKHMVHM-KTKRTIGZSA-N (z)-octadec-9-en-1-amine Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCCN QGLWBTPVKHMVHM-KTKRTIGZSA-N 0.000 description 2
- SHRYOWAOIIMOSO-UHFFFAOYSA-N 2-(octadecylamino)acetic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCCNCC(O)=O SHRYOWAOIIMOSO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M Chloride anion Chemical compound [Cl-] VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 244000060011 Cocos nucifera Species 0.000 description 2
- 235000013162 Cocos nucifera Nutrition 0.000 description 2
- 108010000912 Egg Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000002322 Egg Proteins Human genes 0.000 description 2
- QUSNBJAOOMFDIB-UHFFFAOYSA-N Ethylamine Chemical compound CCN QUSNBJAOOMFDIB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 2
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 2
- 125000005211 alkyl trimethyl ammonium group Chemical group 0.000 description 2
- POJWUDADGALRAB-UHFFFAOYSA-N allantoin Chemical compound NC(=O)NC1NC(=O)NC1=O POJWUDADGALRAB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960000686 benzalkonium chloride Drugs 0.000 description 2
- CADWTSSKOVRVJC-UHFFFAOYSA-N benzyl(dimethyl)azanium;chloride Chemical compound [Cl-].C[NH+](C)CC1=CC=CC=C1 CADWTSSKOVRVJC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 239000000306 component Substances 0.000 description 2
- 230000001143 conditioned effect Effects 0.000 description 2
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 2
- 238000000432 density-gradient centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 239000006167 equilibration buffer Substances 0.000 description 2
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 description 2
- 230000000951 immunodiffusion Effects 0.000 description 2
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 2
- 239000013067 intermediate product Substances 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 238000005374 membrane filtration Methods 0.000 description 2
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N methanol Natural products OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WSFSSNUMVMOOMR-NJFSPNSNSA-N methanone Chemical compound O=[14CH2] WSFSSNUMVMOOMR-NJFSPNSNSA-N 0.000 description 2
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 2
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 2
- 229950008882 polysorbate Drugs 0.000 description 2
- ZCCUUQDIBDJBTK-UHFFFAOYSA-N psoralen Chemical compound C1=C2OC(=O)C=CC2=CC2=C1OC=C2 ZCCUUQDIBDJBTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 238000013060 ultrafiltration and diafiltration Methods 0.000 description 2
- HXYCHJFUBNTKQR-RNFRBKRXSA-N (2R,3R)-heptane-1,2,3-triol Chemical compound CCCC[C@@H](O)[C@H](O)CO HXYCHJFUBNTKQR-RNFRBKRXSA-N 0.000 description 1
- SIDULKZCBGMXJL-UHFFFAOYSA-N 1-dimethylphosphoryldodecane Chemical compound CCCCCCCCCCCCP(C)(C)=O SIDULKZCBGMXJL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BHNQPLPANNDEGL-UHFFFAOYSA-N 2-(4-octylphenoxy)ethanol Chemical compound CCCCCCCCC1=CC=C(OCCO)C=C1 BHNQPLPANNDEGL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VXGRJERITKFWPL-UHFFFAOYSA-N 4',5'-Dihydropsoralen Natural products C1=C2OC(=O)C=CC2=CC2=C1OCC2 VXGRJERITKFWPL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QCVGEOXPDFCNHA-UHFFFAOYSA-N 5,5-dimethyl-2,4-dioxo-1,3-oxazolidine-3-carboxamide Chemical compound CC1(C)OC(=O)N(C(N)=O)C1=O QCVGEOXPDFCNHA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- POJWUDADGALRAB-PVQJCKRUSA-N Allantoin Natural products NC(=O)N[C@@H]1NC(=O)NC1=O POJWUDADGALRAB-PVQJCKRUSA-N 0.000 description 1
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 1
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 1
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 1
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 206010069767 H1N1 influenza Diseases 0.000 description 1
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 1
- 241000712431 Influenza A virus Species 0.000 description 1
- 241000713196 Influenza B virus Species 0.000 description 1
- 241000713297 Influenza C virus Species 0.000 description 1
- 208000002979 Influenza in Birds Diseases 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- REYJJPSVUYRZGE-UHFFFAOYSA-N Octadecylamine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCCN REYJJPSVUYRZGE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000009620 Orthomyxoviridae Infections Diseases 0.000 description 1
- 229920003171 Poly (ethylene oxide) Polymers 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 229920001214 Polysorbate 60 Polymers 0.000 description 1
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 230000001133 acceleration Effects 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 239000002168 alkylating agent Substances 0.000 description 1
- 229940100198 alkylating agent Drugs 0.000 description 1
- 229960000458 allantoin Drugs 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 206010064097 avian influenza Diseases 0.000 description 1
- 229910001423 beryllium ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 229960000074 biopharmaceutical Drugs 0.000 description 1
- OXJUJQDEISSCTB-UHFFFAOYSA-N but-3-en-2-imine Chemical compound CC(=N)C=C OXJUJQDEISSCTB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 1
- 238000009295 crossflow filtration Methods 0.000 description 1
- WOQQAWHSKSSAGF-WXFJLFHKSA-N decyl beta-D-maltopyranoside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](OCCCCCCCCCC)O[C@H](CO)[C@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 WOQQAWHSKSSAGF-WXFJLFHKSA-N 0.000 description 1
- GSVLCKASFMVUSW-UHFFFAOYSA-N decyl(dimethyl)phosphine oxide Chemical compound CCCCCCCCCCP(C)(C)=O GSVLCKASFMVUSW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 241001493065 dsRNA viruses Species 0.000 description 1
- 235000014103 egg white Nutrition 0.000 description 1
- 210000000969 egg white Anatomy 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 1
- SFNALCNOMXIBKG-UHFFFAOYSA-N ethylene glycol monododecyl ether Chemical compound CCCCCCCCCCCCOCCO SFNALCNOMXIBKG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 1
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 description 1
- 229930182470 glycoside Natural products 0.000 description 1
- 230000005484 gravity Effects 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 239000012160 loading buffer Substances 0.000 description 1
- 239000012533 medium component Substances 0.000 description 1
- CXKWCBBOMKCUKX-UHFFFAOYSA-M methylene blue Chemical compound [Cl-].C1=CC(N(C)C)=CC2=[S+]C3=CC(N(C)C)=CC=C3N=C21 CXKWCBBOMKCUKX-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229960000907 methylthioninium chloride Drugs 0.000 description 1
- 238000001471 micro-filtration Methods 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 244000005706 microflora Species 0.000 description 1
- UMWKZHPREXJQGR-UHFFFAOYSA-N n-methyl-n-(2,3,4,5,6-pentahydroxyhexyl)decanamide Chemical compound CCCCCCCCCC(=O)N(C)CC(O)C(O)C(O)C(O)CO UMWKZHPREXJQGR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GCRLIVCNZWDCDE-SJXGUFTOSA-N n-methyl-n-[(2s,3r,4r,5r)-2,3,4,5,6-pentahydroxyhexyl]nonanamide Chemical compound CCCCCCCCC(=O)N(C)C[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO GCRLIVCNZWDCDE-SJXGUFTOSA-N 0.000 description 1
- SBWGZAXBCCNRTM-CTHBEMJXSA-N n-methyl-n-[(2s,3r,4r,5r)-2,3,4,5,6-pentahydroxyhexyl]octanamide Chemical compound CCCCCCCC(=O)N(C)C[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO SBWGZAXBCCNRTM-CTHBEMJXSA-N 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000010412 perfusion Effects 0.000 description 1
- 230000000737 periodic effect Effects 0.000 description 1
- 229920001983 poloxamer Polymers 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000244 polyoxyethylene sorbitan monooleate Substances 0.000 description 1
- 229940068968 polysorbate 80 Drugs 0.000 description 1
- 229940068965 polysorbates Drugs 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 238000011045 prefiltration Methods 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 description 1
- 238000011027 product recovery Methods 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- NRHMKIHPTBHXPF-TUJRSCDTSA-M sodium cholate Chemical compound [Na+].C([C@H]1C[C@H]2O)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC([O-])=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 NRHMKIHPTBHXPF-TUJRSCDTSA-M 0.000 description 1
- 239000012798 spherical particle Substances 0.000 description 1
- 238000011146 sterile filtration Methods 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 201000010740 swine influenza Diseases 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
- C07K1/36—Extraction; Separation; Purification by a combination of two or more processes of different types
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
- C12N7/02—Recovery or purification
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
- C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
- C12N2760/16151—Methods of production or purification of viral material
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Virology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Настоящее изобретение относится к фармацевтической промышленности. Предложены способ получения вирусного антигена из оболочечного вируса и применение этого способа в производстве вакцинного препарата, содержащего указанный вирусный антиген. Предложенный способ включает получение и осветление жидкости, содержащей оболочечный вирус, получение концентрированного жидкого продукта, солюбилизацию оболочечного вируса, находящегося в концентрированном жидком продукте, отделение вирусного антигена и его очитку. При этом после стадии получения концентрированного жидкого продукта непосредственно следует стадия солюбилизации оболочечного вируса, присутствующего в концентрированном жидком продукте. Стадия солюбилизации осуществляется путем добавления детергента или смеси детергентов, содержащей катионный детергент. Предложенный способ выделения позволяет получить высокий выход выделенного вирусного антигена при минимальном количестве стадий, при этом получаемый вирусный антиген имеет высокую чистоту. Предложенный способ получения вирусного антигена может быть использован в фармацевтической промышленности для получения вакцинного препарата. 2 н. и 26 з.п. ф-лы, 2 ил., 9 табл., 4 пр.
Description
Область техники изобретения
Настоящее изобретение принадлежит к области фармацевтической промышленности и относится к способу получения фармацевтической композиции, содержащей вирусный антиген из оболочечного вируса.
Описание уровня техники изобретения
В настоящее время вирусы, которые используют для производства фармацевтических композиций, таких как вакцинные препараты или их промежуточные формы, размножают в системах культивирования на основе яиц или на основе клеток. Независимо от соответствующей используемой системы, обработка вирусных антигенов из каждой системы культивирования является очень важным и решающим шагом в производстве фармацевтических композиций, таких как вакцинные препараты. Что касается системы на основе яиц, основным требованием обработки является достаточное удаление яично-эмбриональных белков, таких как овальбумин, а что касается системы на основе клеток, обработка должна соответствовать таким требованиям, как значительное уменьшение количества ДНК клеток-хозяев и белков клеток-хозяев. Кроме того, не относящиеся к продукту вирусы должны быть в значительной степени удалены.
Что касается очистки вирусных белков, в EP 1982727 A1 раскрыт способ очистки вирусного мембранного белка, включающий стадии отделения клеток, микроносителей и клеточных агломератов от культуральной среды путем осаждения, проведения химической инактивации указанного осадка и солюбилизации указанного осадка, добавления холата натрия, центрифугирования смеси, уменьшения количества детергента путем обработки амберлитом и проведения аффинной хроматографии с последующим элюированием целевого белка.
В US 2011/0014230 A1 описан способ получения вакцинных антигенов, включающий, главным образом, стадию инактивации очищенных вирионов с последующим расщеплением указанных вирионов при помощи детергента.
В US 2009/0060950 A1 раскрыт способ получения противовирусных вакцин, включающий стадии размножения вируса в клетке, накопления указанного вируса в клеточном супернатанте, инактивации указанного вируса, очистки его ультрацентрифугированием в градиенте плотности и обработки его детергентом.
В US 4327182 раскрыт способ получения очищенной субъединичной вакцины против гриппа с использованием метода мембранной фильтрации.
В US 6048537 описан способ получения очищенных антигенов вируса гриппа, включающий стадии концентрирования, очистки и фрагментации.
Другими документами, которые относятся к способам очистки, являются US 2010/0119552 A1; US 2010/0158944 A1; Kalbfuss et al., 2007, Biotech & Bioeng. Vol. 96, No. 5, pp 932-944; Onions et al., 2010, Biologicals, Vol.38, pp 544-551; US 2008/0118970; WO 03/097797; Goerke et al., 2005, Biotechnology and Bioengeneering, Vol. 91, No. 1, pp 12-21; Krober et al., Chem. Eng. Technology 2010, Vol. 33, pp 941-959 и WO 2010/052214 A2.
Несмотря на описанные выше способы, по-прежнему существует потребность и, следовательно, задача создания усовершенствованного способа получения вирусного антигена, в частности, препарата вирусного антигена, и конкретно, фармацевтической композиции, такой как вакцина. В частности, существует необходимость в способе получения, обеспечивающем высокий выход продукта при относительно низкой стоимости производства, который не зависит от штамма вируса, для которого необходимо лишь минимальное количество стадий и который при этом соответствует строгим требованиям низкого содержания ДНК и белков клеток-хозяев, а также посторонних веществ.
Сущность изобретения
Настоящее изобретение относится к следующим аспектам, объектам и предпочтительным вариантам осуществления, которые, соответственно, отдельно или в сочетании, способствуют достижению цели настоящего изобретения:
(1) Способ получения вирусного антигена из оболочечного вируса, включающий следующие стадии в указанном порядке:
a) обеспечение жидкости, содержащей оболочечный вирус,
b) осветление жидкости, содержащей указанный оболочечный вирус, приводящее к получению жидкого продукта, содержащего указанный оболочечный вирус,
c) уменьшение объема жидкого продукта, полученного после стадии b), для получения концентрированного жидкого продукта,
d) солюбилизация оболочечного вируса, присутствующего в жидком продукте, путем добавления детергента или смеси детергентов, содержащей или состоящей из катионного детергента, к концентрированному жидкому продукту, полученному на стадии c),
e) отделение вирусных ядер от композиции, полученной после стадии d),
f) необязательно, удаление катионного детергента из композиции, полученной после стадии e),
и
g) очистка вирусного антигена,
при этом за стадией c) непосредственно следует стадия d).
В предпочтительном варианте осуществления основную стадию очистки, в частности, основную стадию очистки, направленную на очистку оболочечного вируса, предпочтительно хроматографию, не проводят до стадии e). После стадии e) проводят основную стадию очистки. Эта основная стадия очистки, имеющая место после стадии e), направлена на очистку вирусного антигена. Она не направлена на очистку целого вируса или целых вирионов, соответственно. Что касается определения термина «основная стадия очистки» (или «основной способ очистки», соответственно), ссылка делается на определение, приведенное в другом разделе данного документа.
В следующем предпочтительном варианте осуществления единственную выполняемую стадию хроматографии выполняют на стадии g).
В следующем предпочтительном варианте осуществления центрифугирование в градиенте плотности (например, ультрацентрифугирование в градиенте плотности, например, ультрацентрифугирование в градиенте сахарозы) не проводят до стадии e).
В следующем варианте осуществления можно применять дополнительную стадию инактивации вируса, такую как стадия химической инактивации вируса, и/или дополнительную стадию удаления вируса. Тем не менее, вполне возможно, что при применении настоящего изобретения использование такой дополнительной стадии инактивации вируса и/или дополнительной стадии удаления вируса не является необходимым для достижения достаточной инактивации любых патогенов и достаточной очистки, то есть, для достижения инактивации и очистки, которые отвечают соответствующим предписаниям. Это является преимуществом, поскольку пропуск такой дополнительной стадии инактивации вируса и/или дополнительной стадии удаления вируса также способствует усовершенствованию способа, например, с точки зрения минимизации стресса, которому подвергаются желаемые вирусные антигены, и/или уменьшения продолжительности процесса. Однако если проводят дополнительную стадию инактивации вируса, такую как стадия химической инактивации вируса, и/или дополнительную стадию удаления вируса, эту стадию/и не проводят между стадиями c) и d). Как описано в другом разделе, непосредственное следование за стадией c) стадии d), среди прочего, способствует повышению выхода вирусного антигена. В другом аспекте указанную дополнительную стадию инактивации вируса и/или дополнительную стадию удаления вируса не проводят до стадии e). В следующем варианте осуществления указанную дополнительную стадию инактивации и/или дополнительную стадию очистки, например, проводят после стадии g). Кроме того, если проводят такую дополнительную стадию инактивации вируса и/или дополнительную стадию удаления вируса, концентрация химических веществ, необходимая и используемая для получения конечного продукта, который отвечает предписаниям, ниже по сравнению с концентрацией химических веществ, обычно необходимой и используемой для получения конечного продукта, который отвечает предписаниям. Это может быть выгодно, например, с точки зрения уменьшения создаваемого стресса и химических модификаций применительно к вирусным антигенам. Это может стать дополнительным преимуществом для эффективности продукта и, возможно, стабильности продукта.
В соответствии с настоящим изобретением, термин «очистка вирусного антигена» означает основные способы очистки или основные стадии очистки, такие способы очистки, как хроматография или ультрацентрифугирование в градиенте плотности. В одном варианте осуществления основной способ очистки не включает селективную мембранную фильтрацию. Используемой хроматографией может быть ионообменная хроматография, хроматография гидрофобного взаимодействия, комбинированная хроматография, псевдоаффинная хроматография, аффинная хроматография, жидкостно-жидкостная хроматография и тому подобное. В соответствии с настоящим изобретением, термин «основной способ очистки» или «основная стадия очистки» относится к способам, которые являются основными способами очистки, используемыми для очистки (конечного) желаемого продукта. Иными словами, основные способы/стадии очистки направлены на специфическую очистку (конечного) желаемого продукта. В настоящем изобретении, например, указанный (конечный) желаемый продукт представляет собой вирусный антиген, который нужно очистить, но не целый оболочечный вирус до солюбилизации. Другие способы, которые не являются «основным способом очистки», могут служить различным целям, например, цели осветления, цели концентрирования или цели осаждения, иногда с сопутствующим эффектом дополнительной очистки желаемого (конечного) продукта. Результатом применения такой стадии способа, не являющейся «основной стадией очистки» или «основным способом очистки», является то, что эффект очистки желаемого (конечного) продукта после осуществления такого способа/стадии ниже по сравнению с эффектом очистки, который достигается при осуществлении «основного способа/стадии очистки». После проведения основной стадии очистки, предпочтительно, не проводят дополнительные стадии очистки (например, в целях выполнения соответствующих предписаний, вследствие того, что примеси все еще присутствуют в композиции). Стадии удаления вируса и инактивации, такие как стадии химической инактивации, не рассматриваются в качестве основных стадий очистки с этой точки зрения. В соответствии с настоящим изобретением, такие «основные стадии/способы очистки» не проводят до стадии e).
(2) Способ по пункту (1), отличающийся тем, что после стадии d) и до стадии g) удаляют детергент, который был добавлен на стадии d).
В одном варианте осуществления не используют стадию хроматографии для удаления детергента.
(3) Способ по пункту (1) или (2), отличающийся тем, что коэффициент уменьшения объема на стадии c) составляет по меньшей мере 4, предпочтительно по меньшей мере 5.
В предпочтительном варианте осуществления коэффициент уменьшения объема составляет по меньшей мере 4, предпочтительно по меньшей мере 5, или по меньшей мере 9, более предпочтительно по меньшей мере 12, даже более предпочтительно по меньшей мере 13, или по меньшей мере 15, и наиболее предпочтительно по меньшей мере 20, или по меньшей мере 25. Типичный максимальный коэффициент уменьшения объема составляет 30, 35, 40 или 45.
В одном варианте осуществления уменьшение объема на стадии c) проводят на одной единственной стадии. В соответствии с настоящим изобретением, выражение «одна единственная стадия» означает, что проводят только одну стадию уменьшения объема, и эту единственную стадию уменьшения объема не повторяют.
(4) Способ по любому из пунктов (1)-(3), отличающийся тем, что конечная концентрация катионного детергента составляет по меньшей мере примерно 2000 мкг/мл, также предпочтительно по меньшей мере примерно 2500 мкг/мл, также предпочтительно по меньшей мере примерно 3000 мкг/мл, также предпочтительно по меньшей мере примерно 3500 мкг/мл, также предпочтительно по меньшей мере примерно 4000 мкг/мл, также предпочтительно по меньшей мере примерно 4500 мкг/мл, также предпочтительно по меньшей мере примерно 5000 мкг/мл, также предпочтительно по меньшей мере примерно 5500 мкг/мл и также предпочтительно по меньшей мере примерно 6000 мкг/мл.
(5) Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что катионный детергент имеет в основе катионы четверичного аммония, такие как цетилтриметиламмоний бромид или другие соли алкилтриметиламмония, соли алкиламина, такие как стеариламиноацетат или кокосовый алкиламиноацетат, бензалкония хлориды и бромиды, например, бензэтония хлорид или метилбензэтония хлорид, стеариламинполигликолевый эфир или олеиламинполигликолевый эфир, предпочтительно, катионный детергент представляет собой цетилтриметиламмоний бромид (CTAB).
В следующем варианте осуществления детергент представляет собой смесь детергентов, которая включает, в качестве детергентов, катионный детергент, описанный в данном документе, предпочтительно CTAB, и неионный детергент, описанный в данном документе, предпочтительно член семейства Tween, предпочтительно Tween-80.
(6) Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что за стадией b) непосредственно следует стадия c), за которой непосредственно следует стадия d).
В следующем варианте осуществления за стадией d) непосредственно следует стадия e).
(7) Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что не происходит замены детергента.
(8) Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что нуклеазу или другой расщепляющий ДНК фермент, предпочтительно бензоназу®, не добавляют до стадии d), предпочтительно нуклеазу не добавляют на всех стадиях способа.
(9) Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что оболочечный вирус выбран из группы, состоящей из оболочечных РНК вирусов, оболочечных ДНК вирусов или оболочечных ретровирусов, при этом оболочечные РНК вирусы включают флавивирусы, тогавирусы, коронавирусы, вирусы гепатита D, филовирусы, рабдовирусы, буньявирусы, ортомиксовирусы, парамиксовирусы и аренавирусы, и оболочечные ДНК вирусы включают гепаднавирусы, вирусы герпеса и поксвирусы, предпочтительно, оболочечный вирус выбран из оболочечных РНК вирусов, более предпочтительно, оболочечный вирус представляет собой ортомиксовирус, наиболее предпочтительно вирус гриппа, такой как вирус гриппа A, B или C.
(10) Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что жидкость на стадии a) получена из культуры для размножения оболочечного вируса на основе клеток или культуры для размножения оболочечного вируса на основе яиц.
(11) Способ по пункту (10), отличающийся тем, что культура для размножения оболочечного вируса на основе клеток содержит клетки клеточной линии млекопитающего, предпочтительно клеточной линии животного.
(12) Способ по любому из пунктов (10) или (11), отличающийся тем, что клетки клеточной линии млекопитающего выбраны из группы, состоящей из Vero, PerC6, BHK, 293, COS, PCK, MRC-5, MDCK, MDBK и WI-38, предпочтительно, клетки представляют собой клетки MDCK.
(13) Способ по любому из пунктов (10)-(12), отличающийся тем, что клетки культивируют как адгезивные клетки.
(14) Способ по пункту (10), отличающийся тем, что культура для размножения оболочечного вируса на основе яиц включает куриные яйца.
(15) Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что жидкость на стадии a) получают с использованием одноразового биореактора.
Использование одноразового биореактора может способствовать дальнейшему усовершенствованию способа по настоящему изобретению по сравнению с общепринятыми способами, например, в отношении самого полученного продукта, например, с точки зрения качества и/или чистоты. Это, в частности, является преимуществом, если способ применяют в крупном масштабе, например, в промышленных масштабах.
(16) Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что стадию осветления b) проводят с применением метода, выбранного из группы, состоящей из центрифугирования, проточной фильтрации вдоль потока и глубинной фильтрации.
В одном варианте осуществления условия центрифугирования соответствуют, например, равно или менее чем 10000 g RCF (относительной центробежной силы) в течение менее чем 2 мин, предпочтительно, равно или менее чем 3000 g RCF в течение равно или менее чем 2 мин, более предпочтительно, равно или менее чем 500 g RCF в течение равно или менее чем 2 мин, даже более предпочтительно, равно или менее чем 300 g RCF в течение равно или менее чем 2 мин. В соответствии с настоящим изобретением, «g» относится к стандартному ускорению, вследствие силы тяжести на поверхности земли.
В одном варианте осуществления для проточной фильтрации вдоль потока размер пор микрофильтрационных мембран составляет, например, по меньшей мере 0,2 мкм, предпочтительно по меньшей мере 0,45 мкм, и даже более предпочтительно по меньшей мере 0,65 мкм.
В одном варианте осуществления для глубинной фильтрации, например, используют фильтры 0,2 мкм-7 мкм. Кроме того, в целях дальнейшего повышения выхода продукта и/или предотвращения засорения фильтра можно использовать предварительный фильтр.
(17) Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что стадию концентрирования c) проводят, применяя метод, выбранный из группы, состоящей из проточной фильтрации вдоль потока (TFF), ультрацентрифугирования и осаждения. TFF представляет собой TFF ультрафильтрацию или TFF ультрафильтрацию и диафильтрацию на одной стадии (TFF ультрафильтрация/диафильтрация).
В одном варианте осуществления, если для стадии c) используют проточную фильтрацию вдоль потока, порог отсечения по молекулярной массе ультрафильтрационных мембран может, например, быть равен или менее чем 1000 кДа, предпочтительно равен или менее чем 750 кДа, более предпочтительно равен или менее чем 500 кДа, даже более предпочтительно равен или менее чем 300 кДа и наиболее предпочтительно 100-300 кДа. В предпочтительном варианте осуществления порог отсечения по молекулярной массе ультрафильтрационных мембран составляет не менее чем 50 кДа.
В предпочтительном варианте осуществления при применении проточной фильтрации вдоль потока на стадии c) уменьшение объема находится в диапазоне 5-40 раз, предпочтительно объем уменьшается более чем в 10 раз, более предпочтительно объем уменьшается более чем в 15 раз. Предпочтительно, чтобы объем уменьшался не более чем в 30 раз. Это может приводить к улучшению результатов следующих стадий обработки.
В одном варианте осуществления, если для стадии c) используют ультрацентрифугирование, условия ультрацентрифугирования могут соответствовать, например, 30000 g-200000 g в течение более чем 10 мин. В предпочтительном варианте осуществления при применении ультрацентрифугирования на стадии c) объем при ультрацентрифугировании уменьшается более чем в 10 раз, предпочтительно более чем в 20 раз, более предпочтительно более чем в 30 раз, даже более предпочтительно более чем в 40 раз.
В одном варианте осуществления, если концентрирование проводят путем осаждения, подходящие химические вещества известны специалистам в данной области и могут, например, представлять собой соль, метиловый и этиловый спирт, и полиэтиленгликоль в соответствующей концентрации. Подходящие химические вещества в соответствующей концентрации осаждают продукт, например, частицы, содержащие вирусный антиген, но не оказывают или оказывают минимальный отрицательный эффект на указанные вирусные антигены. Химические вещества выбирают таким образом, что они не вступают в реакцию с (конечным) желаемым продуктом, например, вирусными антигенами. В предпочтительном варианте осуществления при применении осаждения на стадии c) объем уменьшается более чем в 10 раз, предпочтительно более чем в 20 раз, более предпочтительно более чем в 30 раз, даже более предпочтительно более чем в 40 раз.
(18) Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что на стадии d) солюбилизацию проводят в течение периода времени и при температуре, которые достаточны для солюбилизации практически всех оболочечных вирусов, присутствующих в жидком продукте.
Как правило, период времени и температура, достаточные для солюбилизации практически всех оболочечных вирусов, могут быть определены специалистом в данной области. В одном варианте осуществления период времени составляет от 0,2 ч до 20 ч при температуре выше 0°C, предпочтительно при температуре от 2°C до 30°C, предпочтительно период времени составляет от 0,5 ч до 6,0 ч при температуре 2-25°C, и более предпочтительно при температуре 2-8°C.
(19) Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что, в случае ее проведения, стадию e) проводят, применяя способ, выбранный из группы, состоящей из ультрацентрифугирования и проточной фильтрации вдоль потока.
В одном варианте осуществления, если на стадии e) используют ультрацентрифугирование, условия ультрацентрифугирования для осаждения предпочтительно соответствуют 30000 g - 200000 g в течение более чем 10 мин, предпочтительно более чем 60000 g в течение более чем 30 мин, более предпочтительно более чем 90000 g в течение более чем 30 мин, даже более предпочтительно более чем 120000 g в течение более чем 30 мин.
В одном варианте осуществления, если на стадии e) используют проточную фильтрацию вдоль потока, порог отсечения по молекулярной массе ультрафильтрационных мембран предпочтительно составляет более чем 100 кДа и более предпочтительно, более чем 300 кДа. Кроме того, порог отсечения по молекулярной массе мембран предпочтительно составляет не более чем 500 кДа.
(20) Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что стадию f) проводят, применяя хроматографию, предпочтительно, хроматографию выбирают из группы, состоящей из ионообменной хроматографии, хроматографии гидрофобного взаимодействия, аффинной хроматографии, комбинированной хроматографии, псевдоаффинной хроматографии, жидкостно-жидкостной хроматографии и эксклюзионной хроматографии, более предпочтительно, хроматографию выбирают из группы, состоящей из ионообменной хроматографии, хроматографии гидрофобного взаимодействия, псевдоаффинной хроматографии, аффинной хроматографии и эксклюзионной хроматографии.
(21) Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что вирусный антиген является частью оболочечного вируса, предпочтительно вирусный антиген представляет собой вирусный белок, и более предпочтительно вирусный антиген представляет собой вирусный белок, такой как вирусный поверхностный белок.
(22) Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что вирусный белок представляет собой вирусный поверхностный белок HA и/или NA из вируса гриппа. В другом варианте осуществления вирусный белок представляет собой белок M из вируса гриппа.
(23) Способ по любому из предшествующих пунктов, включающий дополнительную стадию формулирования полученного вирусного антигена в фармацевтическую композицию.
(24) Способ по пункту (23), отличающийся тем, что фармацевтическая композиция представляет собой вакцинный препарат или его промежуточную форму, предпочтительно фармацевтическая композиция представляет собой вакцину против оболочечного вируса, более предпочтительно, фармацевтическая композиция представляет собой вакцину против вируса гриппа.
(25) Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что стадия g) включает применение композиции, имеющей проводимость в диапазоне от равно или более чем 3,0 до менее чем 5,0 мсек/см, предпочтительно от равно или более чем 3,5 до равно или менее чем 4,7 мсек/см, даже более предпочтительно в диапазоне от равно или более чем 3,6 до равно или менее чем 4,65 мсек/см, в условиях температуры 25°C.
В предпочтительном варианте осуществления стадия g) включает стадию хроматографии, такой как ионообменная хроматография, и композиция, имеющая вышеуказанную проводимость, представляет собой буфер, например, буфер для нанесения и/или буфер для уравновешивания, содержащий соль, который подходит для использования в сочетании с соответствующим используемым хроматографическим методом.
Проводимость композиции можно измерять любым подходящим методом, известным специалисту в данной области, например, с использованием электронных устройств, таких как измеритель проводимости.
(26) Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что стадия g) включает применение композиции, имеющей молярную концентрацию в диапазоне от равно или более чем 1,0 M до равно или менее чем 3,5 M, предпочтительно в диапазоне от равно или более чем 1,0 M до равно или менее чем 3,0 M, более предпочтительно в диапазоне от равно или более чем 1,5 M до равно или менее чем 3,0 M, и даже более предпочтительно в диапазоне от равно или более чем 1,5 M до равно или менее чем 2,6 M, в условиях температуры 25°C.
В предпочтительном варианте осуществления стадия g) включает стадию хроматографии, такой как хроматография гидрофобного взаимодействия, и композиция, имеющая вышеуказанную молярную концентрацию, представляет собой буфер, например, буфер для нанесения и/или буфер для уравновешивания, содержащий соль, который подходит для использования в сочетании с соответствующим используемым хроматографическим методом.
Молярную концентрацию можно измерять любым подходящим методом, известным специалисту в данной области.
Использование композиции, описанной в пунктах (25) и/или (26), может еще больше способствовать усовершенствованию способа получения вирусного антигена, в частности, с точки зрения выхода вирусного антигена.
(27) Применение способа производства вакцинного препарата, содержащего вирусный антиген, полученный из культуры для размножения оболочечного вируса на основе клеток, включающего следующие стадии в указанном порядке:
i) уменьшение объема жидкого продукта, содержащего оболочечный вирус, полученный из культуры для размножения оболочечного вируса на основе клеток, тем самым, получение концентрированного жидкого продукта, и
ii) солюбилизация оболочечного вируса, присутствующего в жидком продукте, путем добавления детергента или смеси детергентов, содержащей катионный детергент, к концентрированному жидкому продукту, полученному на стадии i),
при этом за стадией i) непосредственно следует стадия ii), и
при этом уменьшение ДНК клеток-хозяев, присутствующей в вакцинном препарате, составляет по меньшей мере 2,5 log, предпочтительно по меньшей мере 3,0 log, более предпочтительно по меньшей мере 3,5 log, даже более предпочтительно по меньшей мере 4,0 log.
Уменьшение на по меньшей мере 2,5 log ДНК клеток-хозяев в вакцинном препарате достигается путем сочетания только стадий i) и ii), в лучшем случае, дополнительно, стадий b), e), f) и/или g) пункта (1). В любом случае, дополнительные относящиеся к ДНК стадии, в частности, стадии обработки ДНК-расщепляющим ферментом и удаляющая ДНК хроматография (аффинная хроматография, гель-хроматография и тому подобное), и/или стадии инактивации, необязательно или даже совсем не нужно проводить для достижения вышеуказанного уменьшения содержания ДНК клеток-хозяев. В случае проведения дополнительных относящихся к ДНК стадий и/или стадий инактивации, эти стадии (и, таким образом, способ в целом) можно проводить существенно усовершенствованным образом, например, с точки зрения экономичности способа, поскольку, например, требуется значительно более низкое количество расщепляющего ДНК фермента или композиции для инактивации, чтобы достичь вышеуказанного уменьшения содержания компонентов клеток-хозяев.
Что касается терминов «вакцинный препарат», «вирусный антиген», «на основе клеток», «жидкий продукт», «оболочечный вирус» и «детергент», делается ссылка на спецификацию.
В предпочтительном варианте осуществления до стадии i) из жидкого продукта, содержащего оболочечный вирус, удаляют клеточный детрит и/или микроносители.
(28) Применение по пункту (27), отличающееся тем, что стадии i) и ii) соответствуют стадиям c) и d), описанным в вышеприведенных пунктах.
(29) Применение по пункту (27) или (28), отличающееся тем, что до стадии i) проводят стадии a) и b), описанные в вышеприведенных пунктах, и после стадии ii) проводят стадии e), f) и/или g), описанные в вышеприведенных пунктах.
Подробное описание изобретения
Настоящее изобретение далее будет описано более подробно с помощью предпочтительных вариантов осуществления и примеров, которые, однако, приведены исключительно для иллюстративных целей и никоим образом не должны рассматриваться как ограничивающие объем настоящего изобретения.
Вирусы, которые используют для получения фармацевтических композиций, таких как вакцинные препараты или их промежуточные формы, можно размножать в системах либо на основе клеток, либо на основе яиц. В зависимости от соответствующей используемой системы указанные фармацевтические композиции обычно классифицируют либо как композиции на основе яиц, либо как композиции на основе клеток. Для вакцинных препаратов или вакцин основным требованием обработки является достаточное удаление примесей, например, в случае систем размножения вируса на основе яиц, яично-эмбриональных белков, таких как овальбумин, а также удаление не относящихся к продукту вирусов, а в случае систем размножения вируса на основе клеток, в процессе обработки должны быть выполнены дополнительные требования, такие как значительное снижение количества ДНК клеток-хозяев и белков клеток-хозяев.
В контексте настоящего изобретения неожиданно было обнаружено, что сочетание конкретных стадий способа, выполняемых в определенном порядке, создает усовершенствованный способ по сравнению с общепринятыми способами, например, в отношении самого процесса, например, с точки зрения упрощения всего процесса, и/или в отношении получаемых продуктов, например, с точки зрения качества, выхода и/или чистоты. Применяя способ по настоящему изобретению, можно получать указанные полезные и удивительные эффекты при условии, что способ включает стадию уменьшения объема жидкого продукта, содержащего размноженные вирусы, что приводит к концентрированию вируса (также называемого вирусными частицами) и других составляющих в указанном жидком продукте, и стадию солюбилизации, на которой происходит солюбилизация вируса, присутствующего в уменьшенном объеме жидкого продукта. В частности, и в отличие от способов предшествующего уровня техники, стадия очистки, присутствующая в способе по настоящему изобретению, имеет место только после завершения стадии солюбилизации и, кроме того, ее применяют к вирусному антигену, вместо того, чтобы применять к целым вирусным частицам. Таким образом, благодаря применению способа по настоящему изобретению, можно избежать больших потерь продукта, трудоемкой, продолжительной и дорогостоящей стадии(й) очистки, предназначенной для, и направленной на очистку целых вирусных частиц до солюбилизации, при этом получая композиции с удовлетворительными чистотой и выходом. Более того, стадии солюбилизации непосредственно предшествует стадия уменьшения объема. Не желая быть связанными какой-либо теорией, авторы изобретения считают, что эти стадии, то есть, стадия солюбилизации, непосредственно следующая за стадией уменьшения объема, могут способствовать преимуществам способа, поскольку стадия концентрирования c) может увеличивать концентрацию ДНК клеток-хозяев, что, в свою очередь, может быть выгодным с точки зрения эффективности осаждения.
Удивительно, и в отличие от общепринятых способов получения фармацевтических композиций, таких как вакцины, содержащие вирусный антиген, способ по настоящему изобретению представляет собой усовершенствованный, надежный способ, позволяющий получать повышенный выход продукта, и в то же время требующий меньшее число стадий способа по сравнению с общепринятыми способами. Это сокращенное число необходимых стадий способа дополнительно способствует повышению надежности способа, а также снижению производственных затрат и времени, обычно необходимого для получения вакцинных композиций. Это особенно полезно в случае пандемической или сезонной вспышки вирусной инфекции, такой как грипп, поскольку появляется необходимость в быстром производстве и выпуске пандемической или сезонной вакцины на рынок, и еще более полезно в случае, если вакцины производят с использованием культуральных систем для размножения вируса на основе яиц, которые, как известно, занимают очень много времени.
Более того, с уменьшением числа стадий в способе, применяемом к фармацевтической композиции, уменьшается стресс, налагаемый на присутствующий вирус и вирусные антигены, что может приводить к повышению эффективности и стабильности конечного продукта (например, вакцины) и его промежуточных форм.
Кроме того, с применением способа по настоящему изобретению, несмотря на снижение количества стадий в способе по сравнению с общепринятыми способами, можно производить вакцинные препараты, которые отвечают конкретным административным требованиям относительно допустимого максимального количества примесей белка и ДНК. Например, для вакцинных препаратов против гриппа максимальное допустимое количество в настоящее время (2011) составляет 120 мкг белка, не являющегося гемагглютинином, (HA)/дозу и 10 нг ДНК/дозу (в этом случае, 1 доза соответствует 500 мкл вакцинного препарата). Дополнительным преимуществом способа по настоящему изобретению является то, что его можно применять независимо от вируса, который размножают в системе на основе клеток или на основе яиц. Таким образом, например, если для размножения вирусов используют систему на основе клеток, способ по настоящему изобретению обеспечивает значительное уменьшение примесей ДНК клеток-хозяев, а если для размножения вирусов используют систему на основе яиц, способ обеспечивает уменьшение примесей, связанных с культивированием в яйце.
Благодаря повышенному выходу полученного вирусного антигена, большее число доз вакцины можно получать на производственную партию. Это может, например, быть особенно полезным в случае повышенного спроса на вакцинные препараты, что происходит, например, при сезонных вспышках гриппа.
Типичной и полезной вакциной, о которой идет речь, является вакцина против гриппа, в частности, субъединичная вакцина.
Кроме того, способ по настоящему изобретению можно применять с различными штаммами вируса, это означает, что способ является менее зависимым от штамма. Это особенно важно при использовании вирусов, у которых наблюдается постоянный дрейф и изменчивость генома, таких как вирусы гриппа.
В целом, способ по настоящему изобретению может представлять собой значительно усовершенствованный способ, например, с точки зрения надежности, выхода продукта, времени и затрат на производство, а также примесей, присутствующих в конечном продукте или его промежуточных формах.
Таким образом, в одном аспекте настоящее изобретение относится к способу получения вирусного антигена из оболочечного вируса, включающему следующие стадии в указанном порядке:
a) обеспечение жидкости, содержащей оболочечный вирус,
b) осветление жидкости, содержащей указанный оболочечный вирус, с получением жидкого продукта, содержащего указанный оболочечный вирус,
c) уменьшение объема жидкого продукта, полученного после стадии b), с получением концентрированного жидкого продукта,
d) солюбилизация оболочечного вируса, присутствующего в жидком продукте, путем добавления детергента или смеси детергентов, содержащей катионный детергент, к концентрированному жидкому продукту, полученному на стадии c),
e) отделение вирусных ядер от композиции, полученной после стадии d),
f) необязательно, удаление катионного детергента из композиции, полученной после стадии e),
и
g) очистка вирусного антигена,
при этом за стадией c) непосредственно следует стадия d).
Вирусный антиген получают из оболочечного вируса. Эти оболочечные вирусы могут быть любыми оболочечными ДНК или РНК вирусами, с одно- или двухцепочечным геномом, смысловым или антисмысловым, непрерывным или сегментированным. Например, вирусы выбирают из группы оболочечных РНК вирусов, оболочечных ДНК вирусов или ретровирусов, при этом группа оболочечных РНК вирусов включает флавивирусы, тогавирусы, коронавирусы, вирусы гепатита D, филовирусы, рабдовирусы, буньявирусы, ортомиксовирусы, парамиксовирусы и аренавирусы, и при этом группа оболочечных ДНК вирусов включает гепаднавирусы, вирусы герпеса и поксвирусы. В предпочтительном варианте осуществления вирусы выбирают из группы оболочечных РНК вирусов, включающей вирусы гепатита D, ортомиксовирусы и парамиксовирусы, особенно предпочтительным оболочечным РНК вирусом является ортомиксовирус, такой как вирус гриппа A, вирус гриппа B или вирус гриппа C.
На стадии a) способа по настоящему изобретению получают жидкость, содержащую описанный выше оболочечный вирус. Эту жидкость получают из культуры для размножения вируса на основе клеток или культуры для размножения вируса на основе яиц. Как известно специалисту в данной области, вирусы, такие как описанные выше оболочечные вирусы, можно размножать в системах культивирования на основе клеток или в системах культивирования на основе яиц. Подходящие клеточные линии, которые используют для размножения вирусов, таких как вирус гриппа, как правило, получены от млекопитающих и, таким образом, представляют собой клеточные линии млекопитающих, предпочтительно клеточные линии животных. Подходящие клеточные линии животных известны специалистам в данной области и могут включать линии клеток хомяка, крупного рогатого скота, приматов (включая человека и обезьян) и собаки. В некоторых вариантах осуществления клетки клеточной линии млекопитающих выбирают из группы, состоящей из Vero, PerC6, BHK, 293, COS, PCK, MRC-5, MDCK, MDBK и WI-38, предпочтительно, клетки представляют собой клетки MDCK. Вирусы можно выращивать на клетках любым подходящим способом, известным специалистам в данной области. Например, вирусы можно выращивать в культуре адгезивных клеток или в культуре суспензионных клеток. В одном варианте осуществления клетки выращивают на микроносителях. В другом варианте осуществления клетки также можно адаптировать для выращивания в суспензии. Для систем культивирования на основе клеток можно использовать любую подходящую среду. В предпочтительном варианте осуществления клетки культивируют в бессывороточной и/или безбелковой среде. Для размножения вирусов на основе клеток, как правило, вирус или препарат живого вируса, соответственно, инокулируют в клеточную культуру, где он размножается. Размножение вирусов можно осуществлять в периодическом режиме или в периодическом режиме с подпиткой, или в перфузионном режиме. Через 2-5 дней при 25-37°C размножение вируса, как правило, прекращается. Содержащую вирус жидкость, находящуюся в биореакторе для размножения вируса, можно непосредственно использовать для процесса очистки или переносить в отдельную емкость. Затем содержащую вирус жидкость в отдельной емкости используют для процесса очистки вакцины.
Альтернативно, вирусы можно размножать в системах на основе яиц. В процессе производства на основе яиц, как правило, рабочий посевной материал вируса инъецируют в куриные яйца с эмбрионами. Вирусы начинают размножаться в аллантоисной жидкости (яичном белке) яйца, увеличивая количество вируса. Через два-три дня инкубации яйца охлаждают до 2-8°C и аллантоисную жидкость из отдельных яиц собирают и объединяют с использованием ручной или автоматизированной системы вакуумного харвестера. Собранная содержащая вирус аллантоисная жидкость представляет собой содержащую вирус жидкость на основе яиц, и затем ее используют в последующем процессе очистки.
В зависимости от системы культивирования, используемой для размножения вируса, жидкость, содержащая размноженные вирусные частицы, может иметь различные примеси. Например, потенциальными примесями, присутствующими в культуре на основе яиц, являются яичный белок, такой как яичный альбумин, или антибиотики, тогда как типичной примесью, присутствующей в культуре на основе клеток, является остаточная ДНК клеток-хозяев. Преимуществом является то, что способ по настоящему изобретению не ограничен с точки зрения системы, используемой для размножения вируса; напротив, благоприятного эффекта можно достичь при использовании жидкости, содержащей вирусы, размноженные в системах культивирования на основе клеток, а также в системах культивирования на основе яиц.
Жидкость на стадии a) можно получать с использованием одноразового биореактора. При использовании такого одноразового биореактора, например, сам полученный продукт может быть улучшен, например, с точки зрения качества и/или чистоты. Это, в частности, является преимуществом, если способ применяют в крупном масштабе, например, в промышленных масштабах.
Жидкость, содержащую оболочечный вирус, проводят через стадию осветления. Стадию осветления применяют к жидкости, содержащей вирусные частицы, но не к осажденному центрифугированием или иным образом осажденному материалу. В соответствии с настоящим изобретением, целью данной стадии осветления является удаление частиц из жидкости, таких как клеточный детрит, белковые примеси и/или вспомогательный материал, используемый для выращивания клеток, такой как микроносители. В соответствии с настоящим изобретением, стадия осветления, например, удаляет частицы из жидкости, но сохраняет более 80% вирусных антигенов из оболочечного вируса. Белковые примеси могут, например, представлять собой аллантоин, коллаген и/или альбумин, такой как овальбумин. Для осветления можно использовать любые подходящие средства или способы, известные специалисту в данной области. В частности, можно использовать проточную фильтрацию вдоль потока (TFF), глубинную фильтрацию или центрифугирование. Вследствие этого, параметры каждого из применяемого, соответственно, способа (TFF, глубинная фильтрация, центрифугирование) выбирают таким образом, чтобы указанная выше цель была достигнута. Как правило, с учетом данной цели, указанные параметры для каждого из соответствующих способов известны специалисту в данной области. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения при применении центрифугирования можно использовать центробежную силу, равную или меньшую чем 10000 g, в течение периода времени, равного или меньшего чем 2 минуты (мин). Использование меньшей центробежной силы в течение периода времени, равного или меньшего чем 2 минуты, на данной стадии осветления, например, равной или меньшей чем 1000 g, предпочтительно равной или меньшей чем 500 g, более предпочтительно равной или меньшей чем 300 g, еще больше способствует благоприятным эффектам настоящего изобретения, например, может способствовать дополнительному увеличению выхода вирусного антигена. Что касается дополнительных параметров при применении центрифугирования, а также что касается параметров для проточной фильтрации вдоль потока или глубинной фильтрации, они описаны в другом разделе данной спецификации.
В соответствии с настоящим изобретением, полученную осветленную жидкость называют «жидким продуктом».
Одним из ключевых аспектов способа по настоящему изобретению является уменьшение объема осветленной жидкости, содержащей размноженные вирусные частицы, за которым непосредственно следует стадия солюбилизации/обработки детергентом вирусных частиц, присутствующих в имеющем меньший объем, концентрированном жидком продукте. Неожиданно было обнаружено, что это уменьшение объема, за которым непосредственно следует обработка вирусных частиц детергентом, как описано в другом разделе данного документа, приводит к лучшему извлечению и, таким образом, более высокому выходу вирусного антигена. Более того, неожиданно было установлено, что, если размножение вируса проводили с использованием систем на основе клеток, можно было достичь непредвиденно более существенного снижения количества ДНК клеток-хозяев.
В соответствии с настоящим изобретением, термин «непосредственно следует» означает, что, например, никаких стадий обработки или никаких специальных стадий активной очистки не проводят между стадиями c) и d). Это означает, что, например, никаких стадий обработки не применяют к жидкому продукту между стадиями c) и d), например, не проводят стадии инактивации или очистки. Это также может означать, что никаких дополнительных реагентов не отбирают или не добавляют к жидкому продукту между стадиями c) и d). В другом аспекте за стадией b) непосредственно следует стадия c), за которой непосредственно следует стадия d). Это может дополнительно способствовать усилению способа по настоящему изобретению, например, с точки зрения простоты или с точки зрения сокращения времени и снижения расходов, при этом сохраняется высокая степень извлечения продукта (вирусного антигена), выход и/или чистота.
Инактивация приводит к устранению инфекционности вируса и ее, как правило, проводят путем обработки вирусов эффективным количеством одного или более из следующих химических средств: детергенты, формальдегид, β-пропиолактон, метиленовый синий, псорален, карбоксифуллерен (C60), бинарный этиламин, ацетилэтиленимин или их сочетания. Другие способы инактивации известны специалисту в данной области и включают, например, обработку вируса физическими средствами, такими как гамма-облучение и/или УФ-свет.
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения не проводят инактивацию путем применения того же детергента, который используют для солюбилизации оболочечного вируса (стадия d)). В других вариантах осуществления настоящего изобретения не проводят инактивацию, в частности, инактивацию, включающую обработку вируса формальдегидом, β-пропиолактоном и/или УФ-светом (таким как УФ-C), предпочтительно, формальдегидом и/или β-пропиолактоном, до стадии d). В другом аспекте можно применять стадию инактивации вирусов после стадии солюбилизации оболочечного вируса, то есть, после стадии d). В еще одном аспекте совсем никакой стадии инактивации не проводят на протяжении стадий a)-f). Это может дополнительно способствовать усилению способа по настоящему изобретению, например, с точки зрения расходов и/или трудозатрат. Иногда β-пропиолактон также используют для инактивации остаточной ДНК клеток-хозяев, которая может присутствовать, если размножение вируса проводили в системах на основе клеток. Однако β-пропиолактон является алкилирующим средством, которое алкилирует не только ДНК, но и продукты-антигены (вирусные антигены), и вследствие этого может отрицательно влиять на качество, например, с точки зрения стабильности и/или иммуногенности, указанных антигенов. Вследствие этого, преимуществом способа по настоящему изобретению является то, что, как это ни удивительно, но, несмотря на отказ от использования таких средств инактивации, как β-пропиолактон, требование о пределах максимально допустимого количества примесей ДНК клеток-хозяев в конечном продукте (таком как вакцинный препарат) может быть выполнено.
Концентрирование жидкого продукта на этапе c) можно осуществлять подходящими методами. Указанные методы направлены на уменьшение объема жидкого продукта. Целью данной стадии не является специфическая очистка вирусных частиц, то есть, эта стадия не является основной стадией очистки. Скорее, цель применения данной стадии заключается в уменьшении объема жидкого продукта, содержащего частицы оболочечного вируса, для получения концентрированного жидкого продукта.
Во время стадии уменьшения объема может случиться так, что мелкие примеси отделяются от жидкого вирусного продукта. Мелкие примеси могут быть любыми материалами, такими как молекулы, частицы или компоненты среды, имеющими размер, который меньше чем размер оболочечного вируса, предпочтительно менее чем примерно 1000 кДа, более предпочтительно, менее чем примерно 500 кДа, даже более предпочтительно, менее чем примерно 300 кДа. Это отделение мелких примесей, если оно имеет место, основано только на размере отделяемых примесей, но не на плотности примесей. Отделение примесей, основанное не только на размере указанных примесей, но также и на плотности указанных примесей, имеет место при осуществлении способов очистки, которые включают применение градиентов, например, градиентного центрифугирования. Примером градиентного центрифугирования является ультрацентрифугирование в градиенте сахарозы. Стадия уменьшения объема, например, способствует получению более высокого выхода вирусных антигенов и/или лучшего удаления ДНК клеток-хозяев.
В предпочтительном варианте осуществления объем можно уменьшать путем применения TFF ультрафильтрации или TFF ультрафильтрации и диафильтрации на одной стадии (TFF ультрафильтрация/диафильтрация), ультрацентрифугирования или осаждения, предпочтительно, для уменьшения объема используют TFF ультрафильтрацию. Вследствие этого, параметры каждого из применяемого, соответственно, способа концентрирования (TFF, TFF ультрафильтрация/диафильтрация, ультрацентрифугирование или осаждение) выбирают так, чтобы была достигнута указанная выше цель, то есть, уменьшение объема и концентрирование вирусных частиц. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения уменьшения объема достигают, применяя TFF ультрафильтрацию/диафильтрацию с использованием мембран с порогом отсечения 50-1000 кДа, предпочтительно мембран с порогом отсечения 100-300 кДа и предпочтительно не менее чем 50 кДа.
В одном варианте осуществления, если для уменьшения объема используют ультрацентрифугирование, условия ультрацентрифугирования могут, например, соответствовать 30000 g - 200000 g RCF в течение более чем 10 мин.
В одном варианте осуществления, если концентрирование проводят, используя осаждение, подходящие химические вещества известны специалисту в данной области и могут, например, представлять собой соль, метиловый и этиловый спирт, и полиэтиленгликоль в соответствующих концентрациях. Подходящие химические вещества в соответствующей концентрации осаждают продукт, например, частицы, содержащие вирусный антиген, но не оказывают или оказывают минимальный отрицательный эффект на указанные вирусные антигены. Химические вещества выбирают таким образом, что они не вступают в реакцию с нужными антигенами, например, вирусными антигенами, и не изменяют иммуногенность нужных антигенов.
Также предпочтительно, если стадию уменьшения объема на стадии c) не проводят с использованием метода центрифугирования в градиенте плотности, такого как ультрацентрифугирование в градиенте сахарозы. Ультрацентрифугирование в градиенте является дорогостоящей и трудоемкой стадией способа, требующей высокого уровня обслуживания, и сама операция стоит дорого. Таким образом, за счет отказа от стадии ультрацентрифугирования в градиенте сам способ может быть усилен, например, с точки зрения снижения производственных расходов и трудозатрат.
В одном варианте осуществления коэффициент уменьшения объема составляет по меньшей мере 4, предпочтительно по меньшей мере 5, или по меньшей мере 9, также предпочтительно по меньшей мере 12, также предпочтительно по меньшей мере 13, или по меньшей мере 15, и также предпочтительно по меньшей мере 20, или по меньшей мере 25. Типичный максимальный коэффициент уменьшения объема составляет 30, 35, 40 или 45. В настоящем изобретении было установлено, что уменьшение объема с коэффициентом, указанным в данном документе, особенно в сочетании с детергентом в концентрации, указанной ниже, дополнительно способствует повышению выхода вирусного антигена. Кроме того, если для размножения вируса используют систему на основе клеток, можно достичь неожиданно более существенного уменьшения количества ДНК клеток-хозяев, например, уменьшения на по меньшей мере 2,5 log.
Эту концентрированную жидкость в уменьшенном объеме, содержащую частицы оболочечного вируса, непосредственно подвергают стадии солюбилизации. Вирусные антигены могут присутствовать в различных формах, таких как крупные частицы, или в агрегатах и/или прикрепленные к клеткам и клеточному дебрису, нитевидные формы вируса, неповрежденные и свободные сферические частицы вируса, вирусные фрагменты и свободные вирусные антигены, не связанные с вирусом. Стадию солюбилизации проводят для того, чтобы высвободить вирусные антигены из различных структур.
Солюбилизацию оболочечного вируса, присутствующего в жидком продукте, проводят путем добавления детергента или смеси детергентов, содержащей или состоящей из катионного детергента, к жидкому продукту, полученному после стадии c). Катионные детергенты известны специалисту в данной области и имеют в основе катионы четверичного аммония, такие как цетилтриметиламмоний бромид или другие соли алкилтриметиламмония, соли алкиламина, такие как стеариламиноацетат или кокосовый алкиламиноацетат, бензалкония хлориды и бромиды, например, бензэтония хлорид или метилбензэтония хлорид, стеариламинполигликолевый эфир или олеиламинполигликолевый эфир, при этом CTAB (цетилтриметиламмоний бромид) является предпочтительным. Более предпочтительно, если используют смесь из по меньшей мере двух детергентов. Предпочтительно, смесь детергентов содержит или состоит из катионных и неионных детергентов. Предпочтительно, смесь детергентов содержит или состоит из катионного детергента, предпочтительно CTAB, и неионного детергента, такого как алкилполиэтиленоксид, алкилполигликозид, включая: октилгликозид и децилмальтозид, например, сурфактанты нонидет P10 или нонидет P40, MEGA-8, -9 или -10, Triton X 100 и родственные детергенты или полисорбаты, такие как детергенты семейства Tween, например, Tween 20, Tween 40, Tween 60, Tween 80, APO-10, APO-12, C8E6, C10E6, C12E6, C12E8, C12E9, C12E10, C16E12, C16E21, гептан-1,2,3-триол, люброл PX, семейство генаполов, n-додецил-b-D-глюкопиранозид, тезит, семейство плюроников и так далее; предпочтительно, используют полисорбат, такой как полисорбат 80.
В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения несколько детергентов добавляют в виде премикса (это означает, что они находятся в смеси) или добавляют отдельно, но одновременно или непосредственно один за другим. Предпочтительно не проводить замену детергентов, когда первый детергент удаляют, прежде чем добавить второй детергент.
Общее количество, то есть конечная концентрация катионного детергента(ов), предпочтительно CTAB, является высокой, это означает, что она выше, чем конечная концентрация, обычно используемая для целей солюбилизации. Таким образом, конечная концентрация составляет по меньшей мере примерно 2000 мкг/мл, также предпочтительно по меньшей мере примерно 2500 мкг/мл, также предпочтительно по меньшей мере примерно 3000 мкг/мл, также предпочтительно по меньшей мере примерно 3500 мкг/мл, также предпочтительно по меньшей мере примерно 4000 мкг/мл, также предпочтительно по меньшей мере примерно 4500 мкг/мл, также предпочтительно по меньшей мере примерно 5000 мкг/мл, также предпочтительно по меньшей мере примерно 5500 мкг/мл и также предпочтительно по меньшей мере примерно 6000 мкг/мл. Возможное максимальное количество катионного детергента(ов) составляет примерно 8000 мкг/мл, также предпочтительно примерно 7000 мкг/мл, также предпочтительно примерно 6000 мкг/мл. Особенно предпочтительными диапазонами являются примерно 4000 мкг/мл - примерно 6000 мкг/мл, примерно 4500 мкг/мл - примерно 6000 мкг/мл, примерно 4000 мкг/мл - примерно 5000 мкг/мл, примерно 4500 мкг/мл - примерно 5000 мкг/мл.
Общее количество, то есть конечная концентрация неионного детергента(ов), предпочтительно полисорбата, составляет по меньшей мере примерно 300 мкг/мл, также предпочтительно по меньшей мере примерно 500 мкг/мл, также предпочтительно по меньшей мере примерно 800 мкг/мл, также предпочтительно по меньшей мере примерно 900 мкг/мл, также предпочтительно по меньшей мере примерно 1000 мкг/мл, также предпочтительно по меньшей мере примерно 1200 мкг/мл, также предпочтительно по меньшей мере примерно 1400 мкг/мл, также предпочтительно по меньшей мере примерно 1800 мкг/мл. Предпочтительное максимальное количество неионного детергента(ов) составляет примерно 4000 мкг/мл, также предпочтительно примерно 3000 мкг/мл, также предпочтительно примерно 2000 мкг/мл. Особенно предпочтительными диапазонами являются примерно 300 мкг/мл - примерно 1500 мкг/мл, примерно 300 мкг/мл - примерно 1100 мкг/мл, примерно 900 мкг/мл - примерно 1500 мкг/мл, примерно 900 мкг/мл - примерно 1200 мкг/мл.
В следующем варианте осуществления коэффициент уменьшения в объеме жидкого вирусного продукта составляет по меньшей мере 20 в присутствии конечной концентрации катионного детергента по меньшей мере 5000 мкг/мл, или коэффициент уменьшения в объеме продукта составляет по меньшей мере 15 в присутствии конечной концентрации катионного детергента по меньшей мере 4000 мкг/мл, или коэффициент уменьшения в объеме продукта составляет по меньшей мере 10 в присутствии конечной концентрации катионного детергента по меньшей мере 2500 мкг/мл. При применении данных условий можно достичь особенно полезных результатов с точки зрения выхода продукта. Кроме того, если для размножения вируса используют систему на основе клеток, в дополнение к повышенному выходу продукта можно добиться более существенного уменьшения примесей ДНК клеток-хозяев.
Солюбилизацию можно проводить в условиях, подходящих для достижения солюбилизации практически всех, предпочтительно всех вирусных частиц, присутствующих в концентрированном жидком продукте. В предпочтительном варианте осуществления солюбилизацию проводят путем инкубации концентрированного вирусного продукта в течение периода времени от 0,2 ч до 20 ч при температуре выше 0°C, предпочтительно при температуре от 2°C до 30°C, предпочтительно в течение периода времени от 0,5 ч до 6,0 ч при температуре 2-25°C, более предпочтительно при температуре 2-8°C.
При использовании для размножения вируса системы на основе клеток, предпочтительно не добавлять нуклеазу, например, ДНКазу, такую как бензоназа®, до стадии d), или на протяжении всех стадий от a) до f). В способах предшествующего уровня техники жидкость, содержащую вирус, или жидкий продукт обрабатывают нуклеазой и/или β-пропиолактоном (BPL), и/или используют зональное ультрацентрифугирование, и/или выполняют стадии хроматографии, чтобы разрушить и/или удалить нуклеиновые кислоты клеток-хозяев, и, таким образом, свести к минимуму примеси ДНК клеток-хозяев. Например, в случае способов очистки вируса гриппа часто нужно добиться уменьшения более чем на 4 log количества ДНК клеток-хозяев для выполнения административных предписаний. В настоящее время неожиданно обнаружено, что путем применения способа по изобретению можно добиться достаточно большого уменьшения количества ДНК клеток-хозяев для выполнения административных предписаний, даже без обработки нуклеазой, например, обработки бензоназой®. Это значительно усиливает способ с точки зрения экономической эффективности и времени. Кроме того, обработка BPL не требуется и ее можно ограничивать случаями, когда это желательно, если таковые имеются. В конкретных вариантах осуществления обработку BPL не проводят до стадии d), в некоторых вариантах осуществления обработку BPL не проводят совсем.
После стадии d) можно проводить стадию e) отделения вирусных ядер, полученных после стадии d), от композиции. Отделение вирусных ядер можно проводить любым подходящим методом, который приводит к указанному желаемому результату.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения эту стадию отделения проводят путем осаждения вирусных ядер, например, ультрацентрифугированием (однако в предпочтительном варианте осуществления не ультрацентрифугированием в градиенте плотности). Вирусные поверхностные белки, например, белки (поверхностные) вируса гриппа, такие как HA, NA (нейраминидаза) или белок M, остаются в супернатанте и могут быть подвергнуты дальнейшим стадиям способа, чтобы в конечном итоге получить противовирусную субъединичную вакцину. Например, условия центрифугирования, выбираемые для осаждения вирусных ядер, известны специалисту в данной области. Например, ультрацентрифугирование можно проводить либо в периодическом режиме, либо в непрерывном режиме, и применяемые условия ультрацентрифугирования соответствуют от 30000 g в течение более чем 10 минут (мин) до 200000 g в течение более чем 10 мин, соответственно, при подходящей температуре, например, при 2-25°C, более предпочтительно при 2-8°C. В одном варианте осуществления условия ультрацентрифугирования для осаждения полученных вирусных ядер соответствуют 100000 g в течение 30 мин при температуре в диапазоне 2-8°C.
В следующем варианте осуществления после стадии d) и до стадии g) детергент из стадии d) можно удалять. Это удаление детергента можно выполнять любым способом, подходящим для этой цели, например, путем обработки амберлитом или TFF. При использовании обработки амберлитом, и после проведения стадии e), в предпочтительном варианте осуществления амберлит добавляют к супернатанту, собранному после осаждения вирусных ядер, при соотношении массы амберлита и массы катионных детергентов примерно 100:1, инкубируют при подходящей температуре, например, температуре в диапазоне 2-8°C, в течение подходящего времени, например, в течение 8-24, предпочтительно в течение 16 часов. Затем амберлит удаляют любым подходящим методом, известным специалисту в данной области, например, с использованием общепринятой проточной фильтрации/тупиковой фильтрации, сит или TFF. При использовании фильтра, его следует выбирать таким образом, чтобы он был способен удерживать частицы крупнее, чем 5 мкм или крупнее чем 7 мкм. Кроме того, амберлит можно удалять при помощи сит. Отверстия соответствующих сит находятся в диапазоне 30-200 мкм, предпочтительно менее чем 150 мкм, более предпочтительно менее чем 100 мкм, даже более предпочтительно примерно 50 мкм. В одном варианте осуществления для удаления детергента(ов) не используют хроматографию.
Наконец, на стадии g), которая является основной стадией очистки или основным способом очистки, соответственно, вирусный антиген очищают. В соответствии с настоящим изобретением, термин «вирусный антиген» означает часть вируса, предпочтительно оболочечного вируса, которая способна вызывать иммунный ответ у субъекта против указанного антигена. Предпочтительно, вирусный антиген представляет собой вирусный белок. Предпочтительно, вирусный мембранный белок представляет собой мембранный белок, такой как HA, NA или белок M, предпочтительно вирусный мембранный белок представляет собой HA и/или NA.
Очистку вирусного антигена можно проводить любым методом, подходящим для специфической очистки вирусного антигена из композиции, полученной после стадии e), или, в случае проведения стадии f), после стадии f). Предпочтительными методами очистки являются такие методы очистки, как хроматографические методы, например, ионообменная хроматография, хроматография гидрофобного взаимодействия, псевдоаффинная хроматография, аффинная хроматография, эксклюзионная хроматография, жидкостно-жидкостная хроматография и тому подобное. В одном варианте осуществления предпочтительными методами очистки являются ионообменная хроматография и хроматография гидрофобного взаимодействия.
Способ по настоящему изобретению можно использовать как часть общего производственного процесса получения противовирусного вакцинного препарата, предпочтительно противовирусной вакцины, более предпочтительно вакцины против вируса гриппа, такой как субъединичная вакцина.
Настоящее изобретение, кроме того, относится к способу по настоящему изобретению, который используют в производстве вакцины, предпочтительно в производстве вакцины против гриппа. Произведенная вакцина может быть субъединичной вакциной.
Настоящее изобретение, кроме того, относится к способу, описанному в данном документе, также включающему дополнительную стадию формулирования полученного очищенного вирусного антигена в фармацевтическую композицию, при этом, предпочтительно, фармацевтическая композиция представляет собой вакцинный препарат или его промежуточную форму. В особенно предпочтительном варианте осуществления фармацевтическая композиция представляет собой вакцину против гриппа. Эта дополнительная стадия(и) представляет(ют) собой стадию(и), которую, возможно, придется проводить для получения фармацевтической композиции. Такой стадией может, например, быть стадия инактивации вируса, такая как стадия облучения, например, стадия облучения УФ-C. Как правило, такая стадия гарантирует, что вирусный антиген является неактивным и свободным от активных загрязняющих вирусов. Чтобы свести к минимуму загрязнение микроорганизмами, например, может понадобиться проведение фильтрования для уменьшения микрофлоры. Кроме того, например, если вирусный антиген должен быть сформулирован в противовирусную вакцину, может случиться так, что потребуется добавлять адъювант(ы) в определенной концентрации. Еще одной дополнительной стадией может быть добавление дополнительного вирусного антигена, например, вирусного антигена, полученного из другого вирусного штамма. Еще одной дополнительной стадией может быть добавление буфера и/или включение консерванта. Еще одной дополнительной стадией может быть стадия осветления или стадия стерильной фильтрации.
В соответствии с настоящим изобретением, термин «фармацевтическая композиция» означает композицию, которую можно принимать внутрь или использовать на поверхности тела для предотвращения, диагностики, облегчения, терапии или лечения заболевания у человека или животных. Предпочтительно, такая фармацевтическая композиция представляет собой вакцинный препарат или его промежуточный продукт, более предпочтительно, вакцинный препарат против оболочечного вируса, такой как вакцинный препарат против вируса гриппа, включая, например, сезонный, пандемический или эпидемический вакцинный препарат против вируса гриппа. Примерами пандемического или эпидемического вакцинного препарата против вируса гриппа являются вакцинные препараты против птичьего, человеческого или свиного вируса гриппа.
Настоящее изобретение также относится к применению способа производства вакцинного препарата, содержащего вирусный антиген из культуры для размножения оболочечного вируса на основе клеток, включающего следующие стадии в указанном порядке:
i) уменьшение объема жидкого продукта, содержащего оболочечный вирус, полученный из культуры для размножения оболочечного вируса на основе клеток, тем самым получение концентрированного жидкого продукта, и
ii) солюбилизация оболочечного вируса, присутствующего в жидком продукте, путем добавления детергента или смеси детергентов, содержащей катионный детергент, к концентрированному жидкому продукту, полученному на стадии а),
при этом за стадией i) непосредственно следует стадия ii), и
при этом уменьшение количества ДНК клеток-хозяев, присутствующих в вакцинном препарате, составляет по меньшей мере 2,5 log, предпочтительно по меньшей мере 3,0 log, более предпочтительно по меньшей мере 3,5 log. Что касается терминов «вакцинный препарат», «вирусный антиген», «на основе клеток», «жидкий продукт», «оболочечный вирус» и «детергент», делается ссылка на спецификацию. Неожиданно было обнаружено, что благодаря использованию вышеуказанного способа в производстве вакцинного препарата загрязнение ДНК клеток-хозяев можно значительно уменьшить.
В предпочтительном варианте осуществления стадии i) и ii) соответствуют стадиям c) и d), определенным на протяжении всей спецификации.
В следующем варианте осуществления до стадии i) проводят стадии a) и b), определенные на протяжении всей спецификации, и после стадии ii) проводят стадии e) и f), определенные на протяжении всей спецификации.
Описание фигур
Фиг.1: На данной фигуре показан эффект концентрации CTAB и общего коэффициента концентрирования, то есть, конечной концентрации продукта после добавления детергента CTAB, на выход основного поверхностного антигена HA. Фиг.1 является примером многих результатов и графиков.
Фиг.2: На данной фигуре показан эффект концентрации CTAB и общего коэффициента концентрирования, то есть, конечной концентрации продукта после добавления детергента CTAB, на уменьшение количества ДНК. Фигура 2 является примером многих результатов и графиков.
Примеры
Пример 1
Данный пример демонстрирует, каким образом перевести собранный вирус гриппа в частично очищенный промежуточный продукт вирусных поверхностных антигенов гемагглютинина (HA) и нейраминидазы (NA) с минимальной потерей продукта и с уменьшением более чем на три логарифма содержания ДНК клеток-хозяев. Полученный промежуточный продукт будет дополнительно очищен с помощью хроматографии.
Общий обзор стадий способа приведен в следующей далее схеме производственного процесса:
Вирус гриппа размножали в клетках MDCK. Собранные жидкости осветляли центрифугированием при 3220 g в течение 8 мин. Осветленный продукт концентрировали примерно в 4-13,7 раз при помощи TFF с использованием 100-300 кДа кассеты. Осветленный и концентрированный продукт солюбилизировали с помощью 2400-3000 мкг/мл CTAB и 600-900 мкг/мл Tween-80 при 2-8°C. Осветленный, концентрированный и солюбилизированный продукт центрифугировали при 100000 g в течение 30 мин при 2-8°C. Супернатант собирали. В собранный супернатант добавляли амберлит при соотношении массы амберлита и массы CTAB, равном 100:1. После инкубации при 2-8°C в течение 16 ч добавленный амберлит удаляли фильтрованием суспензии через 5-мкм фильтры. Фильтрат представлял собой частично очищенный промежуточный продукт вирусных поверхностных антигенов гемагглютинина (HA) и нейраминидазы (NA). Количество HA определяли простой радиальной иммунодиффузией (SRD) и ДНК измеряли с помощью количественной полимеразной цепной реакции в реальном времени (кПЦР).
Результаты представлены далее.
Выход HA из A/Uruguay X-175C, осветление при 3220 g в течение 8 мин, 10× концентрирование с использованием 300 кДа кассеты, солюбилизация при 900 мкг/мл Tween-80 и 3000 мкг/мл CTAB, центрифугирование при 100000 g в течение 30 мин и обработка продукта амберлитом. После поправки на разведение, произошедшее во время солюбилизации, общий коэффициент концентрирования составил 4×.
| Образец | HA [мкг/мл] | Общий выход HA [%] |
| Продукт | 32 | |
| Фильтрат осветленного, 10× концентрированного, солюбилизированного, центрифугированного, обработанного амберлитом продукта. Общий коэффициент концентрирования равен 4 | 120 | 92% |
Выход HA из B/Malysia/2506/2004WT, условия осветления: 300 g в течение 2 мин, 4× концентрирование с использованием 100 кДа кассеты, солюбилизация при 600 мкг/мл Tween-80 и 2400 мкг/мл CTAB, центрифугирование при 100000 g в течение 30 мин и обработка продукта амберлитом. После поправки на разведение, произошедшее во время солюбилизации, общий коэффициент концентрирования составил 1,8×.
| Образец | HA [мкг/мл] | Общий выход HA [%] |
| Продукт | 25 | 100% |
| Осветленный и 4× концентрированный (100 кДа) продукт | 93,5 | 94% |
| Фильтрат осветленного, концентрированного, солюбилизированного, центрифугированного, обработанного амберлитом продукта. Общий коэффициент концентрирования равен 1,8× | 42 | 93% |
Выход HA из A/California X-179A, условия осветления: 300 g в течение 2 мин, 13,7× концентрирование с использованием 100 кДа кассеты, солюбилизация: 900 мкг/мл Tween-80 и 3000 мкг/мл CTAB, центрифугирование при 100000 g в течение 30 мин и обработка продукта амберлитом. После поправки на разведение, произошедшее во время солюбилизации, общий коэффициент концентрирования составил 4,8×.
| Образец | HA [мкг/мл] | Общий выход HA [%] | ДНК [нг/мл] | ДНК Log уменьшения |
| Продукт | 25 | 100% | 72513 | 0 |
| Осветленный и 13,7× концентрированный (100 кДа) продукт | 292 | 85% | 42187 | 1,4 |
| Фильтрат осветленного, концентрированного, солюбилизированного, центрифугированного, обработанного амберлитом продукта. Общий коэффициент концентрирования равен 4,8× | 112 | 93% | 53 | 3,8 |
Пример 2
Пример 2 демонстрирует, что антигены HA и NA фильтрата осветленного, концентрированного, солюбилизированного, обработанного амберлитом продукта можно в достаточной степени очищать ионообменной хроматографией, так что в нем общий белок (ОБ)/100 мкг HA составляет менее чем 240 мкг/100 мкг HA, и в нем ДНК клеток-хозяев составляет менее чем 20 нг/100 мкг HA. Антиген NA очищается вместе с антигенами HA.
Вирус гриппа размножали в клетках MDCK. Собранные жидкости осветляли центрифугированием при 300 g в течение 2 мин или 3220 g в течение 8 минут. Осветленные продукты концентрировали примерно в 10 раз при помощи TFF с использованием 300 кДа кассеты. Осветленные и концентрированные продукты солюбилизировали с помощью 3000 мкг/мл CTAB и 900 мкг/мл Tween-80 при 2-8°C. Осветленные, концентрированные и солюбилизированные продукты центрифугировали при 100000 g в течение 30 мин при 2-8°C. Супернатанты собирали. В собранные супернатанты добавляли амберлит при соотношении массы амберлита и массы CTAB, равном 100:1. После инкубации при 2-8°C в течение 16 ч добавленный амберлит удаляли пропусканием суспензии через 5-мкм глубинные фильтры. Фильтрат кондиционировали перед нанесением на хроматографические колонки Capto® Q. После промывания буфером для нанесения антигены HA и NA элюировали. Протекший через колонку буфер после промывания и элюат собирали по фракциям. На основании УФ-сигнала несколько фракций были выбраны для анализа HA-SRD, NA, ДНК, общего белка. Результаты приведены ниже.
| Capto Q | ||||||
| Штамм | Проводимость нанесенного материала и буфера для уравновешивания | pH нанесенного материала и буфера для уравновешивания | Выход HA в собранных элюированных фракциях | Общий белок, мкг/100 мкг HA | ДНК, нг/100 мкг HA | NA |
| A/California X-179A | 6 | 8 | 45% | 104 | 4 | Не измерено |
| A/California X-175C | 5 | 7,3 | 55% | 208 | Не измерено | |
| A/California X-179A | 4,65 | 8 | 92% | 225 | ≥1 | Присутствует |
| A/California X-179A | 3,6 | 8 | 91% | 189 | ≥1 | Присутствует |
| A/California X-179A | 3,9 | 8 | 85% | 189 | ≥1 | Присутствует |
Как можно видеть, на выход HA из A/California влияла проводимость. Если проводимость находилась в диапазоне 3,6-4,65 мсек/см, выход HA составлял 85%-92%. Принимая во внимание выход HA из препарата, наносимого на колонку на стадии хроматографии, на стадиях осветления, концентрирования, солюбилизации и обработки амберлитом, общий выход HA может составлять примерно 80% в случае A/California. NA очищался вместе с антигенами HA. Содержание ДНК и ОБ клеток-хозяев соответствовало спецификации для них.
В случае A/Uruguay выход HA составлял 55%, если проводимость была 5 мсек/см при pH 7,3. Принимая во внимание выход HA из препарата, наносимого на колонку на стадии хроматографии, на стадиях осветления, концентрирования, солюбилизации и обработки амберлитом, общий выход HA может составлять примерно 50% в случае A/Uruguay. Антиген NA не измеряли. Содержание ОБ соответствовало спецификации для него. ДНК клеток-хозяев не измеряли. При понижении проводимости, как в случае A/California, выход HA для A/Uruguay, как ожидается, также увеличится.
Пример 3
Пример 3 демонстрирует, что антигены HA и NA фильтрата осветленного, концентрированного, солюбилизированного, обработанного амберлитом продукта можно в достаточной степени очищать хроматографией гидрофобного взаимодействия так, что в нем общий белок /100 мкг HA составляет менее чем 240 мкг/мл и содержание в нем ДНК клеток-хозяев составляет менее чем 20 нг/100 мкг HA. Антиген NA очищается вместе с антигенами HA.
Препарат осветленного, концентрированного, солюбилизированного, обработанного амберлитом продукта был таким же, как препарат в примере 2. Фильтрат кондиционировали перед нанесением на колонки для хроматографии гидрофобного взаимодействия (HIC). После промывания буфером для нанесения, антигены HA и NA элюировали. Протекший через колонку буфер после промывания и элюат собирали по фракциям. На основании УФ-сигнала несколько фракций были выбраны для анализа HA-SRD, NA, ДНК, общего белка. Результаты приведены ниже.
| HIC | ||||||
| Штамм | Концентрация соли в нанесенном материале и буфере для уравновешивания | pH нанесенного материала и буфера для уравновешивания |
Выход HA в собранных элюированных фракциях | Общий белок, мкг/100 мкг HA | ДНК нг/100 мкг HA | NA |
| A/California X-179A | 2,3M | 7,4 | 68% | 152 | 19 | Присутствует |
| A/Uruguay X-175C |
2,6M | 7,4 | 91% | 88 | 15 | Присутствует |
| B/Malaysia | 1,5M | 7,4 | 73% | 202 | 8 | Присутствует |
| B/Malaysia | 1,7M | 7,4 | 68% | 118 | 15 | Присутствует |
| B/Malaysia | 2,0M | 7,4 | 71% | 180 | 9 | Присутствует |
Как можно видеть, выход HA в случае A/California при использовании хроматографии гидрофобного взаимодействия составил 68%-91% в тестируемых условиях. Концентрация соли влияла на выход HA. Принимая во внимание выход HA из препарата, наносимого на колонку на стадии хроматографии, на стадиях осветления, концентрирования, солюбилизации и обработки амберлитом, общий выход HA может составлять примерно 60-80% в случае A/California. NA очищался вместе с антигенами HA. Содержание ДНК и ОБ клеток-хозяев соответствовало спецификации для них.
В случае B/Malaysia выход HA составлял примерно 70%, если используемая концентрация соли была 1,5-2,0M при pH 7,4. Принимая во внимание выход HA из препарата, наносимого на колонку на стадии хроматографии, на стадиях осветления, концентрирования, солюбилизации и обработки амберлитом, общий выход HA составлял 60% в случае B/Malaysia. Антиген NA очищался вместе с антигенами HA. Содержание ДНК и ОБ клеток-хозяев соответствовало спецификации для них.
Пример 4
Метод и материалы
Вирус гриппа размножали в клетках MDCK. Продукты осветляли центрифугированием при 300 g в течение 2 мин или 3220 g в течение 8 мин. Осветленные продукты концентрировали в различное количество раз при помощи TFF с использованием 100-300 кДа кассеты. Осветленные и концентрированные продукты солюбилизировали с помощью 600-3000 мкг/мл CTAB и 300-900 мкг/мл Tween-80 при 2-8°C. Осветленные, концентрированные и солюбилизированные продукты центрифугировали при 100000 g в течение 30 мин при 2-8°C. Супернатанты собирали. В собранные супернатанты добавляли амберлит при соотношении массы амберлита и массы CTAB, равном 100:1. После инкубации при 2-8°C в течение 16 ч добавленный амберлит удаляли пропусканием суспензии через 5-мкм глубинные фильтры. В фильтрате определяли количество HA-SRD (в анализе простой радиальной иммунодиффузии), проводили анализ на NA, ДНК и общий белок.
Пример 4.1
Данный пример демонстрирует, что сочетание высокого коэффициента концентрирования и высокой концентрации катионного детергента является предпочтительным как для выхода антигена, так и для удаления ДНК клеток-хозяев. Используемым штаммом был B/Brisbane. После осветления и концентрирования продукт инкубировали в присутствии детергентов при различных условиях. Варьировали концентрацию детергентов, время инкубации и коэффициенты концентрирования. Эффект концентрации CTAB и коэффициентов концентрирования на выход основного поверхностного антигена HA и уменьшение количества ДНК показан на фиг.1 и фиг.2. Как можно видеть, повышение концентрации катионных детергентов и коэффициента концентрирования является полезным как для выхода продуктов (фиг.1), так и для уменьшения количества ДНК клеток-хозяев (фиг.2).
Пример 4.2
Данный пример демонстрирует, что как высокого выхода продукта из B/Florida/4/2006, так и значительного уменьшения количества ДНК клеток-хозяев можно добиться путем использования 3000 мкг/мл CTAB и 900 мкг/мл Tween-80 с последующим центрифугированием при 100000 g в течение 30 мин.
| Образец и описание | ДНК [нг/мл] | ДНК, Log уменьшения | SRD [мкг/мл] | Выход HA | Примечание |
| Осветленный и 8,4× концентрированный продукт | 26349 | 42 | |||
| Солюбилизированный при 3000 мкг/мл CTAB и 900 мкг/мл Tween 80, центрифугированный и обработанный амберлитом | 1 | 4,0 | 23 | ≥95% | 2,5× разведенный |
Пример 4.3
Данный пример демонстрирует, что как высокого выхода продукта из A/Wisconsin, так и значительного уменьшения количества ДНК клеток-хозяев можно добиться путем использования 3000 мкг/мл CTAB и 900 мкг/мл Tween-80 с последующим центрифугированием при 100000 g в течение 30 мин.
| Образец и описание | ДНК [нг/мл] | ДНК, Log уменьшения | SRD [мкг/мл] | Выход HA | Примечание |
| Осветленный и 8,4x концентрированный продукт | 32895 | 258 | |||
| Солюбилизированный при 3000 мкг/мл CTAB и 900 мкг/мл Tween 80, центрифугированный и обработанный амберлитом | 2 | 3,8 | 97 | 94% | 2,5x разведенный |
Пример 4.4
Данный пример демонстрирует, что как высокого выхода продукта из A/Victoria, так и значительного уменьшения количества ДНК клеток-хозяев можно добиться путем использования 3000 мкг/мл CTAB и 900 мкг/мл Tween-80 с последующим центрифугированием при 100000 g в течение 30 мин.
| Образец и описание | ДНК [нг/мл] | ДНК, Log уменьшения | SRD [мкг/мл] | Выход HA | Примечание |
| Осветленный и 10,2× концентрированный продукт | 37417 | 185 | |||
| Солюбилизированный при 3000 мкг/мл CTAB и 900 мкг/мл Tween 80, центрифугированный и обработанный амберлитом | 5 | 3,5 | 87 | ≥95% | 2,5× разведенный |
Пример 4.5
Данный пример демонстрирует, что как высокого выхода продукта из A/California, так и значительного уменьшения количества ДНК клеток-хозяев можно добиться путем использования 3000 мкг/мл CTAB и 900 мкг/мл Tween-80 с последующим центрифугированием при 100000 g в течение 30 мин.
| Образец и описание | ДНК [нг/мл] | ДНК, Log уменьшения | SRD [мкг/мл] | Выход HA | Примечание |
| Осветленный и 13,7× концентрированный продукт | 42187 | 292 | |||
| Солюбилизированный при 3000 мкг/мл CTAB и 900 мкг/мл Tween 80, центрифугированный и обработанный амберлитом | 53 | 2,5 | 112 | 96% | 2,5× разведенный |
Claims (28)
1. Способ получения вирусного антигена из оболочечного вируса, включающий следующие стадии в указанном порядке:
a) обеспечение жидкости, содержащей оболочечный вирус,
b) осветление жидкости, содержащей указанный оболочечный вирус, приводящее к получению жидкого продукта, содержащего указанный оболочечный вирус,
c) уменьшение объема жидкого продукта, полученного после стадии b), для получения концентрированного жидкого продукта,
d) солюбилизация оболочечного вируса, присутствующего в жидком продукте, путем добавления детергента или смеси детергентов, содержащей катионный детергент, к концентрированному жидкому продукту, полученному на стадии с), что приводит к распадению вирусных частиц на вирусные поверхностные белки и вирусные ядра,
e) отделение вирусных ядер от композиции, полученной после стадии d), и
f) необязательно, удаление катионного детергента из композиции, полученной после стадии е),
и
g) очистка вирусного антигена,
при этом за стадией с) непосредственно следует стадия d).
a) обеспечение жидкости, содержащей оболочечный вирус,
b) осветление жидкости, содержащей указанный оболочечный вирус, приводящее к получению жидкого продукта, содержащего указанный оболочечный вирус,
c) уменьшение объема жидкого продукта, полученного после стадии b), для получения концентрированного жидкого продукта,
d) солюбилизация оболочечного вируса, присутствующего в жидком продукте, путем добавления детергента или смеси детергентов, содержащей катионный детергент, к концентрированному жидкому продукту, полученному на стадии с), что приводит к распадению вирусных частиц на вирусные поверхностные белки и вирусные ядра,
e) отделение вирусных ядер от композиции, полученной после стадии d), и
f) необязательно, удаление катионного детергента из композиции, полученной после стадии е),
и
g) очистка вирусного антигена,
при этом за стадией с) непосредственно следует стадия d).
2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что стадию очистки, направленную на специфическую очистку оболочечного вируса, не проводят до стадии d).
3. Способ по п. 1 или 2, отличающийся тем, что единственную стадию хроматографии, которую проводят, проводят на стадии g).
4. Способ по п. 1 или 2, отличающийся тем, что ультрацентрифугирование в градиенте плотности и/или хроматографию не проводят до стадии d).
5. Способ по п. 1 или 2, отличающийся тем, что проводят стадию инактивации и/или стадию удаления вируса.
6. Способ по п. 1 или 2, отличающийся тем, что коэффициент уменьшения объема на стадии с) составляет по меньшей мере 4, предпочтительно по меньшей мере 5.
7. Способ по п. 1 или 2, отличающийся тем, что конечная концентрация катионного детергента составляет по меньшей мере 2000 мкг/мл.
8. Способ по п. 1 или 2, отличающийся тем, что катионный детергент имеет в основе катионы четверичного аммония.
9. Способ по п. 1 или 2, отличающийся тем, что за стадией b) непосредственно следует стадия с), за которой непосредственно следует стадия d).
10. Способ по п. 1 или 2, отличающийся тем, что не происходит замены детергента.
11. Способ по п. 1 или 2, отличающийся тем, что нуклеазу или другой расщепляющий ДНК фермент не добавляют до стадии d), предпочтительно, нуклеазу не добавляют на всех стадиях способа.
12. Способ по п. 1 или 2, отличающийся тем, что оболочечный вирус выбран из группы, состоящей из оболочечных РНК вирусов, оболочечных ДНК вирусов или оболочечных ретровирусов, при этом оболочечные РНК вирусы включают флавивирусы, тогавирусы, коронавирусы, вирусы гепатита D, филовирусы, рабдовирусы, буньявирусы, ортомиксовирусы, парамиксовирусы и аренавирусы, и оболочечные ДНК вирусы включают гепаднавирусы, вирусы герпеса и поксвирусы, предпочтительно, оболочечный вирус выбран из оболочечных РНК вирусов, более предпочтительно, оболочечный вирус представляет собой ортомиксовирус, наиболее предпочтительно вирус гриппа, такой как вирус гриппа А, В или С.
13. Способ по п. 1 или 2, отличающийся тем, что жидкость на стадии а) получена из культуры для размножения оболочечного вируса на основе клеток или культуры для размножения оболочечного вируса на основе яиц.
14. Способ по п. 13, отличающийся тем, что культура для размножения оболочечного вируса на основе клеток содержит клетки клеточной линии животного, предпочтительно клеточной линии млекопитающего.
15. Способ по п. 14, отличающийся тем, что клетки культивируют как адгезивные клетки.
16. Способ по п. 13, отличающийся тем, что культура для размножения оболочечного вируса на основе яиц включает куриные яйца.
17. Способ по любому из пп. 1, 2, 14-16, отличающийся тем, что жидкость на стадии а) получают с использованием одноразового биореактора.
18. Способ по любому из пп. 1, 2, 14-16, отличающийся тем, что стадию b) проводят с применением метода, выбранного из группы, состоящей из центрифугирования, проточной фильтрации вдоль потока и глубинной фильтрации.
19. Способ по любому из пп. 1, 2, 14-16, отличающийся тем, что стадию с) проводят, применяя метод, выбранный из группы, состоящей из проточной фильтрации вдоль потока, ультрацентрифугирования и осаждения.
20. Способ по любому из пп. 1, 2, 14-16, отличающийся тем, что стадию е) проводят, применяя метод, выбранный из группы, состоящей из ультрацентрифугирования и проточной фильтрации вдоль потока.
21. Способ по любому из пп. 1, 2, 14-16, отличающийся тем, что стадию g) проводят, применяя хроматографию, предпочтительно хроматографию, выбранную из группы, состоящей из ионообменной хроматографии, хроматографии гидрофобного взаимодействия, аффинной хроматографии и эксклюзионной хроматографии.
22. Способ по любому из пп. 1, 2, 14-16, отличающийся тем, что вирусный антиген представляет собой часть оболочечного вируса, предпочтительно вирусный антиген представляет собой вирусный белок.
23. Способ по п. 22, отличающийся тем, что вирусный белок представляет собой НА и/или NA из вируса гриппа.
24. Способ по любому из пп. 1, 2, 14-16 или 23, включающий дополнительную стадию формулирования полученного вирусного антигена в виде фармацевтической композиции.
25. Способ по п. 24, отличающийся тем, что фармацевтическая композиция представляет собой вакцинный препарат или его промежуточную форму, предпочтительно, фармацевтическая композиция представляет собой вакцину против гриппа.
26. Способ по любому из пп. 1, 2, 14-16, 23 или 25, отличающийся тем, что стадия g) включает использование композиции, имеющей проводимость в диапазоне от равно или более чем 3,0 до менее чем 5,0 мсек/см, предпочтительно от равно или более чем 3,5 до равно или менее чем 4,7 мсек/см, даже более предпочтительно в диапазоне от равно или более чем 3,6 до равно или менее чем 4,65 мсек/см, в условиях температуры 25°C.
27. Способ по любому из пп. 1, 2, 14-16, 23 или 25, отличающийся тем, что стадия g) включает использование композиции, имеющей молярную концентрацию в диапазоне от равно или более чем 1,0 М до равно или менее чем 3,5 М, предпочтительно в диапазоне от равно или более чем 1,0 М до равно или менее чем 3,0 М, более предпочтительно в диапазоне от равно или более чем 1,5 М до равно или менее чем 3,0 М, и даже более предпочтительно в диапазоне от равно или более чем 1,5 М до равно или менее чем 2,6 М, в условиях температуры 25°C.
28. Применение способа получения вирусного антигена, полученного из оболочечного вируса, в производстве вакцинного препарата, содержащего указанный вирусный антиген, где указанный способ включает следующие стадии в указанном порядке:
i) уменьшение объема жидкого продукта, содержащего оболочечный вирус, полученный из культуры для размножения оболочечного вируса на основе клеток, тем самым получение концентрированного жидкого продукта, и
ii) солюбилизация оболочечного вируса, присутствующего в жидком продукте, путем добавления детергента или смеси детергентов, содержащей катионный детергент, к концентрированному жидкому продукту, полученному на стадии i),
при этом за стадией i) непосредственно следует стадия ii), и
при этом уменьшение ДНК клеток-хозяев, присутствующей в вакцинном препарате, составляет по меньшей мере 2,5 log.
i) уменьшение объема жидкого продукта, содержащего оболочечный вирус, полученный из культуры для размножения оболочечного вируса на основе клеток, тем самым получение концентрированного жидкого продукта, и
ii) солюбилизация оболочечного вируса, присутствующего в жидком продукте, путем добавления детергента или смеси детергентов, содержащей катионный детергент, к концентрированному жидкому продукту, полученному на стадии i),
при этом за стадией i) непосредственно следует стадия ii), и
при этом уменьшение ДНК клеток-хозяев, присутствующей в вакцинном препарате, составляет по меньшей мере 2,5 log.
Applications Claiming Priority (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US201161509630P | 2011-07-20 | 2011-07-20 | |
| EP11174660 | 2011-07-20 | ||
| EP11174660.8 | 2011-07-20 | ||
| US61/509,630 | 2011-07-20 | ||
| PCT/EP2012/063045 WO2013010797A1 (en) | 2011-07-20 | 2012-07-04 | Process for producing viral antigen and vaccines |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2014101484A RU2014101484A (ru) | 2015-07-27 |
| RU2565827C2 true RU2565827C2 (ru) | 2015-10-20 |
Family
ID=45094875
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2014101484/10A RU2565827C2 (ru) | 2011-07-20 | 2012-07-04 | Способ получения вирусного антигена и вакцин |
Country Status (12)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP2734619B1 (ru) |
| JP (1) | JP6275641B2 (ru) |
| KR (2) | KR20140038530A (ru) |
| CN (1) | CN103827296B (ru) |
| AU (1) | AU2012286098C1 (ru) |
| BR (1) | BR112014001049A2 (ru) |
| CA (1) | CA2841604C (ru) |
| ES (1) | ES2653197T3 (ru) |
| MX (1) | MX2014000753A (ru) |
| RU (1) | RU2565827C2 (ru) |
| TW (1) | TW201311896A (ru) |
| WO (1) | WO2013010797A1 (ru) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2807176C2 (ru) * | 2018-11-15 | 2023-11-10 | БАЙЕР ХелсКер ЛЛСи | Способы инактивации вируса для непрерывного получения антител |
Families Citing this family (15)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109568573A (zh) * | 2014-12-12 | 2019-04-05 | 普莱柯生物工程股份有限公司 | 疫苗组合物及其制备方法和应用 |
| DK3728287T3 (da) | 2017-12-19 | 2024-06-10 | CSL Behring Lengnau AG | Proteinoprensning og virusinaktivering med alkylglycosider |
| JP7360594B2 (ja) * | 2017-12-28 | 2023-10-13 | 共立製薬株式会社 | ワクチン製剤、並びに魚類のイリドウイルス感染症予防方法 |
| US11529413B2 (en) | 2018-06-12 | 2022-12-20 | Kbio Holdings Limited | Virus and antigen purification and conjugation |
| CN112566494B (zh) | 2018-06-12 | 2023-05-23 | Kbio控股有限公司 | 病毒和抗原纯化和偶联 |
| US11696948B2 (en) | 2018-06-12 | 2023-07-11 | Kbio Holdings Limited | Vaccines formed by virus and antigen conjugation |
| US11690907B2 (en) | 2018-06-12 | 2023-07-04 | Kbio Holdings Limited | Vaccines formed by virus and antigen conjugation |
| CN112384615A (zh) * | 2018-07-04 | 2021-02-19 | 普罗拜奥根股份公司 | 用于纯化包膜病毒的方法 |
| MX2021005685A (es) | 2018-11-15 | 2021-07-07 | Bayer Healthcare Llc | Metodos de inactivacion virica para la fabricacion continua de anticuerpos. |
| RU2710239C1 (ru) * | 2019-06-14 | 2019-12-25 | Федеральное государственное унитарное предприятие "Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт вакцин и сывороток и предприятие по производству бактерийных препаратов" Федерального медико-биологического агентства | Способ получения антигена или антигенов для производства противогриппозной вакцины и вакцина на его основе |
| EP4054630A2 (en) * | 2019-11-07 | 2022-09-14 | Seqirus UK Limited | Compositions and methods for producing a viral vaccine with reduced particle size |
| WO2021221338A1 (ko) * | 2020-04-29 | 2021-11-04 | 에스케이바이오사이언스(주) | 일회용 배양 공정 시스템을 이용한 인플루엔자 바이러스 생산 방법 및 인플루엔자 바이러스 항원 정제 조건 신속 확인 시험 |
| KR102546626B1 (ko) * | 2020-04-29 | 2023-06-21 | 에스케이바이오사이언스(주) | 인플루엔자 바이러스 항원 정제 조건 신속 확인 시험 |
| CN112309502B (zh) * | 2020-10-14 | 2024-09-20 | 深圳市新合生物医疗科技有限公司 | 一种计算肿瘤新抗原负荷的方法及系统 |
| JP2023141423A (ja) * | 2022-03-24 | 2023-10-05 | 国立大学法人 東京大学 | ウイルスの精製方法 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1987002250A1 (en) * | 1984-11-01 | 1987-04-23 | Bror Morein | A process for preparing immunogenic complex |
| RU2283139C1 (ru) * | 2005-03-21 | 2006-09-10 | Федеральное государственное унитарное предприятие "Научно-производственное объединение по медицинским иммунобиологическим препаратам "Микроген" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Способ получения антигенов для вакцины против вирусов гриппа |
| EP1982727A1 (en) * | 2007-04-17 | 2008-10-22 | Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. | Method for purification of viral proteins |
| WO2009115917A2 (en) * | 2008-03-18 | 2009-09-24 | Novartis Ag | Improvements in preparation of influenza virus vaccine antigens |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4140762A (en) * | 1974-01-14 | 1979-02-20 | Sandoz Ltd. | Influenza sub-unit vaccine |
| US4240762A (en) * | 1979-03-12 | 1980-12-23 | Johnston Pump Company | Seal-aligning rigid coupling assembly |
| CA2807534A1 (en) * | 2003-02-25 | 2005-02-17 | Medimmune Vaccines, Inc. | Methods of producing influenza vaccine compositions |
| CA2696090C (en) * | 2007-08-28 | 2017-06-13 | Baxter International Inc. | Method for producing viral vaccines |
| CA2738024A1 (en) * | 2008-09-24 | 2010-04-01 | Medimmune, Llc | Methods for purification of viruses |
| CN103952376A (zh) * | 2008-09-24 | 2014-07-30 | 米迪缪尼有限公司 | 培养细胞、增殖和纯化病毒的方法 |
| GB0918830D0 (en) * | 2009-10-27 | 2009-12-09 | Glaxosmithkline Biolog Niederl | Process |
-
2012
- 2012-07-04 EP EP12734892.8A patent/EP2734619B1/en active Active
- 2012-07-04 KR KR1020147001348A patent/KR20140038530A/ko not_active Ceased
- 2012-07-04 ES ES12734892.8T patent/ES2653197T3/es active Active
- 2012-07-04 CA CA2841604A patent/CA2841604C/en not_active Expired - Fee Related
- 2012-07-04 MX MX2014000753A patent/MX2014000753A/es not_active Application Discontinuation
- 2012-07-04 BR BR112014001049A patent/BR112014001049A2/pt not_active IP Right Cessation
- 2012-07-04 RU RU2014101484/10A patent/RU2565827C2/ru not_active IP Right Cessation
- 2012-07-04 KR KR1020167020663A patent/KR20160096215A/ko not_active Withdrawn
- 2012-07-04 AU AU2012286098A patent/AU2012286098C1/en not_active Ceased
- 2012-07-04 CN CN201280035724.9A patent/CN103827296B/zh not_active Expired - Fee Related
- 2012-07-04 WO PCT/EP2012/063045 patent/WO2013010797A1/en not_active Ceased
- 2012-07-04 JP JP2014520591A patent/JP6275641B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2012-07-19 TW TW101126141A patent/TW201311896A/zh unknown
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1987002250A1 (en) * | 1984-11-01 | 1987-04-23 | Bror Morein | A process for preparing immunogenic complex |
| RU2283139C1 (ru) * | 2005-03-21 | 2006-09-10 | Федеральное государственное унитарное предприятие "Научно-производственное объединение по медицинским иммунобиологическим препаратам "Микроген" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Способ получения антигенов для вакцины против вирусов гриппа |
| EP1982727A1 (en) * | 2007-04-17 | 2008-10-22 | Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. | Method for purification of viral proteins |
| WO2009115917A2 (en) * | 2008-03-18 | 2009-09-24 | Novartis Ag | Improvements in preparation of influenza virus vaccine antigens |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2807176C2 (ru) * | 2018-11-15 | 2023-11-10 | БАЙЕР ХелсКер ЛЛСи | Способы инактивации вируса для непрерывного получения антител |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP2734619A1 (en) | 2014-05-28 |
| MX2014000753A (es) | 2014-05-07 |
| BR112014001049A2 (pt) | 2017-02-21 |
| WO2013010797A1 (en) | 2013-01-24 |
| TW201311896A (zh) | 2013-03-16 |
| RU2014101484A (ru) | 2015-07-27 |
| ES2653197T3 (es) | 2018-02-06 |
| KR20160096215A (ko) | 2016-08-12 |
| CN103827296B (zh) | 2016-11-16 |
| JP2014524747A (ja) | 2014-09-25 |
| KR20140038530A (ko) | 2014-03-28 |
| JP6275641B2 (ja) | 2018-02-07 |
| CA2841604C (en) | 2020-01-21 |
| CN103827296A (zh) | 2014-05-28 |
| EP2734619B1 (en) | 2017-09-06 |
| AU2012286098C1 (en) | 2016-09-15 |
| CA2841604A1 (en) | 2013-01-24 |
| AU2012286098A1 (en) | 2014-01-23 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RU2565827C2 (ru) | Способ получения вирусного антигена и вакцин | |
| AU2012286098B2 (en) | Process for producing viral antigen and vaccines | |
| US10329536B2 (en) | Methods for producing an active constituent of a pharmaceutical or a diagnostic agent in an MDCK cell suspension culture | |
| JP5264843B2 (ja) | 細胞培養におけるインフルエンザウイルスの複製の方法、および本方法によって入手可能なインフルエンザウイルス | |
| CN101790381B (zh) | 生产病毒疫苗的方法 | |
| KR19980081114A (ko) | 인플루엔자 백신 | |
| NZ532203A (en) | Cell culture system in which cell growth and virus multiplication occur concurrently | |
| WO2015071177A1 (en) | Removal of residual cell culture impurities | |
| JP6851827B2 (ja) | 細胞培養中でのウイルスの大規模製造 | |
| EP3234113B1 (en) | A method for a large scale virus purification | |
| US20110293660A1 (en) | Novel method | |
| KR101581228B1 (ko) | 바이러스의 증식을 위한 ２-단계 온도 프로파일 | |
| HK1194763A (en) | Process for producing viral antigen and vaccines | |
| US20230220356A1 (en) | Compositions and methods for producing a viral vaccine with reduced particle size |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20170705 |