JP7360594B2

JP7360594B2 - ワクチン製剤、並びに魚類のイリドウイルス感染症予防方法

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Publication number: JP7360594B2
Application number: JP2018234384A
Authority: JP
Inventors: 耕平福田; キティポンタナサクシリ; 良子高野
Original assignee: Kyoritsu Seiyaku Corp
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Priority date: 2017-12-28
Filing date: 2018-12-14
Publication date: 2023-10-13
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Description

本発明は、不活化されたイリドウイルスを抗原として含有し、一回当たり10^7.0 TCID₅₀以上投与する、マダイイリドウイルス病などの魚類イリドウイルス感染症に対するワクチン製剤、魚類のイリドウイルス感染症予防方法などに関連する。

収穫量を増大でき、比較的安価に安定供給できる点などから、多くの魚類で養殖が広く普及している。一方、養殖の場合、天然魚と比較して、飼育密度が高く環境条件も悪化しやすいため、感染症が発生・伝播しやすい。

魚類のイリドウイルス感染症として、例えば、マダイイリドウイルス病が知られている。マダイイリドウイルス病は、マダイイリドウイルス（Red sea bream iridoviral disease）によるウイルス感染症で、著しい貧血による鰓の褪色、脾臓の腫大などの症状を呈する致死性の高い疾患であり、養殖場での死亡率は20～60％に達する。1990年に西日本において養殖マダイで初めてその発生が確認され、それ以降各種養殖魚へも感染が拡大し、これまでにスズキ目を中心に30以上の魚種で発生が確認されている。

それに対し、本疾病に対する防除手段の一つとして、ホルマリン不活化ワクチン製剤が開発され、マダイ、ブリ属魚類、シマアジ、ヤイトハタ、チャイロマルハタ、クエ、マハタを対象に、そのワクチン製剤が既に上市されている。例えば、特許文献1には、特定の継代で得られたイリドウイルス株を不活化・調製された魚類用のイリドウイルス感染症ワクチンが記載されている。

一方、上記以外の魚種では、この上市されたホルマリン不活化ワクチン製剤のワクチン効果が低いことが明らかになってきており、これらの魚種に対して有効なワクチン開発が求められている。例えば、非特許文献1には、「イシダイでは他の魚種と比較して受動免疫による防御効果が低く、感染耐過魚の血清を用いた受動免疫試験において、・・・死亡率に有意差は認められなかった」点、及び「イシダイにおける感染防御には液性免疫だけでは不十分であり、細胞性免疫などの別の防御機構の関与が必要と考えられる」点などが言及されており、また、非特許文献2には、「イシダイやイシガキダイといったイシダイ属魚種に対するワクチン効果が低い」点、及び、「イシダイやイシガキダイに対する有効なワクチン開発を試みていくべき」である点などが言及されている。
特開2007-197454号公報松山知正ら、「海産5魚種におけるマダイイリドウイルス病に対する受動免疫の効果」、魚病研究 Fish Pathology, 51(1),32-35, 2016,3 河東康彦ら、「マダイイリドウイルス病」、魚病研究 Fish Pathology, 52(2),57-62, 2017,6

上述の通り、例えば、魚類のイリドウイルス感染症の一つであるマダイイリドウイルス病は、スズキ目を中心に30以上の魚種で発生が確認されている。しかし、マダイ、ブリ属魚類、シマアジ、ヤイトハタ、チャイロマルハタ、クエ、マハタ以外の魚種では、ホルマリン不活化ワクチン製剤のワクチン効果が低く、現状、それらの魚種での同疾病の有効な防除が難しい。

そこで、本発明は、マダイ、ブリ属魚類、シマアジ、ヤイトハタ、チャイロマルハタ、クエ、マハタ以外の魚種に対して、より有効なイリドウイルス感染症の防除手段を提供することなどを目的とする。

本発明者らは、マダイ、ブリ属魚類、シマアジ、ヤイトハタ、チャイロマルハタ、クエ、マハタ以外の魚種においても、ワクチン中の有効抗原量を高めることで、液性免疫を主体とした免疫でもイリドウイルス感染症を有効に防除できることを新規に見出した。

そこで、本発明では、(1)不活化されたイリドウイルスを抗原として含有し、一回当たり10^7.0 TCID₅₀以上投与する、魚類のイリドウイルス感染症に対するワクチン製剤、(2)抗原として、不活化されたイリドウイルスを10^8.0 TCID₅₀/mL以上の濃度で含有した、魚類のイリドウイルス感染症に対するワクチン製剤などを提供する。

不活化されたイリドウイルスを、抗原として一回当たり10^7.0 TCID₅₀以上投与することで、マダイ、ブリ属魚類、シマアジ、ヤイトハタ、チャイロマルハタ、クエ、マハタ以外の魚種、例えば、イシダイ属、サバ科、カジキ亜目などの魚種でも、マダイイリドウイルス病などのイリドウイルス感染症の発生・感染・伝播・蔓延を有効に予防できる。例えば、不活化されたイリドウイルスを10^8.0 TCID₅₀/mL以上の濃度で含有したワクチン製剤を0.1mL以上投与することで、10^7.0 TCID₅₀以上投与することができる。

培養細胞で増殖させたウイルスを用いた場合、即ち、前記イリドウイルスが培養細胞で増殖されたウイルスである場合、原則的に単クローン性のウイルスを抗原として用いることができる。そして、ウイルスを培養細胞で増殖させることで、比較的簡易かつ大量に、均一な品質の抗原を調製することができる。

但し、イリドウイルスを培養細胞で増殖させても、その増殖曲線がプラトーに達するとそれ以上ウイルス量が増加しなくなるため、通常の一般的方法によってその培養液中のイリドウイルスの濃度を、一回当たり10^7.0 TCID₅₀以上投与できる程度にまで高めることは非常に困難性が高い。

それに対し、例えば、イリドウイルスに対し高感受性の培養細胞で増殖させることにより、ウイルスの濃度を高めることができる。また、例えば、前記抗原として、前記イリドウイルスを培養細胞で増殖させた際の培養上清の濃縮液、若しくは前記培養液及び前記培養細胞を含有させることによっても、ワクチン製剤中におけるイリドウイルスの濃度を、一回当たり10^7.0 TCID₅₀以上投与できる程度にまで高めることができ、例えば、イシダイ属、サバ科、カジキ亜目などの魚種に対しても、マダイイリドウイルス病などのイリドウイルス感染症を有効に予防することが可能となる。

本発明により、マダイ、ブリ属魚類、シマアジ、ヤイトハタ、チャイロマルハタ、クエ、マハタ以外の魚種、例えば、イシダイ属、サバ科、カジキ亜目などの魚種でも、イリドウイルス感染症を有効に予防できる。

＜本発明に係るワクチン製剤について＞
本発明は、(1)不活化されたイリドウイルスを抗原として含有し、一回当たり10^7.0 TCID₅₀以上投与する、魚類のイリドウイルス感染症に対するワクチン製剤、(2)抗原として、不活化されたイリドウイルスを10^8.0 TCID₅₀/mL以上の濃度で含有した、魚類のイリドウイルス感染症に対するワクチン製剤などをすべて包含する。

このワクチン製剤では、抗原として、不活化処理されたイリドウイルスを用いる。イリドウイルスには、公知のものを広く採用でき、特に限定されない。魚類のイリドウイルスとして、イリドウイルス科メガロシスチスウイルス属（Megalocytivirus属）のイリドウイルス、例えば、マダイイリドウイルス、伝染性脾臓腎臓壊死ウイルス（ISKNV；Infectious spleen and kidney necrosis virus）などが挙げられる。例えば、公知の分離株を用いてもよいし、イリドウイルス感染症を発症した魚類から分離された分離株を用いてもよい。

これらの分離株を培養細胞に感染させることで、そのイリドウイルス分離株を増殖させることができる。例えば、培養細胞の培養液中にウイルス液を加えて培養細胞にウイルスを感染させ、感染の数日後、培養細胞と培養液を回収し、その培養上清をウイルス液としてまた培養細胞に加える作業を繰り返すことで、そのウイルス株を継代・増殖させることができ、ワクチン用の抗原を調製することができる。培養細胞には、公知の細胞株、例えば、GF細胞、BF-2細胞などを用いることができる。

例えば、イリドウイルス株を培養細胞で増殖させることで、イリドウイルスを抗原として含有し、前記イリドウイルスが培養細胞で増殖されたウイルスであるワクチン製剤の原液を調製することができる。

一回当たり10^7.0 TCID₅₀以上（例えば、10^7.0 TCID₅₀～10¹⁰ TCID₅₀、以下同じ）投与するために、高濃度の抗原を調製する必要がある。そのために、例えば、イリドウイルスに対し高感受性の培養細胞でイリドウイルス株を増殖させ、ウイルスを通常よりも高発現させることで、高濃度抗原を調製してもよい。イリドウイルスに対し高感受性の培養細胞は、公知の方法、例えば、マダイイリドウイルスに対して感受性の高い魚種（例えば、マダイ、イシダイ、イシガキダイ、バラムンディなどのシーバス類など）から採取した組織・細胞を播種して培養し、各細胞を単クローン化して継代するとともに、その各培養細胞にイリドウイルス株を感染させ、ウイルス増殖性の高い培養細胞株を選抜することで、イリドウイルスに対し高感受性の培養細胞株を比較的定常的に樹立できる。また、イリドウイルスに対し高感受性の培養細胞として、マダイイリドウイルスに対して感受性の高い魚種の体外受精卵（胚細胞）又はそれ由来の培養細胞などを採用してもよい。

また、例えば、イリドウイルスを培養細胞で増殖させた際の培養上清を濃縮することで、高濃度抗原を調製してもよい。濃縮手段は、遠心限外ろ過など、公知の手段を広く採用できる。例えば、イリドウイルスを含有した培養上清を濃縮して10^8.0 TCID₅₀/mL以上（例えば、10^8.0 TCID₅₀～10¹¹ TCID₅₀、以下同じ）のワクチン製剤（の原液）を調製し、その溶液を0.1mL以上投与することで、イリドウイルスを一回当たり10^7.0 TCID₅₀以上投与することができる。

また、高濃度抗原を調製するために、イリドウイルスを培養細胞で増殖させた際の培養液及び培養細胞をワクチン製剤（の原液）として用いてもよい。培養液だけでなく有効量の培養細胞も含有させることで、即ち、有効抗原として、イリドウイルスを含有した培養液、及び、感染中のイリドウイルスを含有した培養細胞の両者を含有させることで、10^8.0 TCID₅₀/mL以上のワクチン製剤（の原液）を調製することができ、その溶液を0.1mL以上投与することで、イリドウイルスを一回当たり10^7.0 TCID₅₀以上投与することができる。

このように、前記抗原として、(1)前記イリドウイルスを培養細胞で増殖させた際の培養上清の濃縮液、若しくは(2)前記イリドウイルスを培養細胞で増殖させた際の前記培養液及び前記培養細胞、を含有したワクチン製剤とすることにより、高濃度抗原として、イリドウイルスを一回当たり10^7.0 TCID₅₀以上投与することが可能となる。

本発明に係る抗原は、不活化抗原であってもよい。イリドウイルスの不活化は、例えば、本発明に係る高濃度抗原含有液に対し、物理的処理(紫外線照射、X線照射、熱処理、超音波処理など)、化学的処理(ホルマリンなどによる処理、クロロホルム・アルコールなどによる有機溶媒処理、酢酸などの弱酸による酸処理、塩素・水銀などによる処理)などの処理を施すことにより、行うことができる。

例えば、高濃度抗原含有液にホルマリンを0.01～2.0％、より好適には0.05～1.0％の容量濃度で添加し、培養菌液を4～30℃で、1～10日間感作することにより、ホルマリンによる不活化を行うことができる。また、例えば、不活化処理後に、緩衝液などで洗浄してホルマリンなどの不活化剤を除去したり、中和剤を添加して中和したりしてもよい。

上記のように、例えばワクチン製剤を一回当たり0.1mL投与する場合、そのワクチン製剤中のイリドウイルスの濃度を、10^8.0 TCID₅₀/mL以上に調製することで、イリドウイルスを一回当たり10^7.0 TCID₅₀以上投与することができる。本発明に係るワクチン製剤中のイリドウイルスの濃度には、例えば、不活化前のウイルス感染価を指標として用いてもよく、ワクチン製剤中の不活化イリドウイルス量を直接的に測定して得た値に相当する感染価を指標として用いてもよい。なお、不活化イリドウイルス量は、例えば、ELISA法、タンパク質定量法などで直接的に測定することにより推量することができる。

本発明に係るワクチン製剤は、ウイルス抗原以外の総タンパク量が0.1％以下（1.0mg/mL以下）であるものであってもよい。イリドウイルスを培養細胞で増殖する際、その培養液に血清などを添加する場合がある。その場合、ワクチン製剤（の原液）にも、それらの夾雑タンパク質が残留するため、例えば、限外ろ過など公知の手段で、それらの夾雑タンパク質を除外したものをワクチン製剤（の原液）として用いてもよい。血清由来などの夾雑タンパク質を除外して、製剤中の総タンパク量を、例えば0.1mg/mL以下に抑えることにより、抗原濃度を高め、ワクチン効果をより高くできる可能性があるほか、それらの夾雑タンパク質を原因とした副作用などの発生リスクを軽減できる。

本発明に係るワクチン製剤は、アジュバントを含有していてもよい。

アジュバントには、公知のものを広く用いることができる。例えば、動物油(スクアレンなど)又はそれらの硬化油、植物油(パーム油、ヒマシ油など)又はそれらの硬化油、無水マンニトール・オレイン酸エステル、流動パラフィン、ポリブテン、カプリル酸、オレイン酸、高級脂肪酸エステルなどを含む油性アジュバント、PCPP、サポニン、グルコン酸マンガン、グルコン酸カルシウム、グリセロリン酸マンガン、可溶性酢酸アルミウム、サリチル酸アルミニウム、アクリル酸コポリマー、メタクリル酸コポリマー、無水マレイン酸コポリマー、アルケニル誘導体ポリマー、水中油型エマルジョン、第四級アンモニウム塩を含有するカチオン脂質などの水溶性アジュバント、水酸化アルミニウム(ミョウバン)、水酸化ナトリウムなどの沈降性アジュバント、コレラ毒素、大腸菌易熱性毒素などの微生物由来毒素成分、その他、ベントナイト、ムラミルジペプチド誘導体、インターロイキンなどが挙げられる。また、これらを混合したものでもよい。

また、本発明に係るワクチン製剤は、目的・用途などに応じて、緩衝剤、等張化剤、無痛化剤、防腐剤、抗菌剤、抗酸化剤、pH調節剤、分散剤、芳香剤、着色剤、消泡剤などが適宜添加されていてもよい。

緩衝剤の好適な例として、例えば、リン酸塩、酢酸塩、炭酸塩、クエン酸塩酒石酸塩、トリスヒドロキシメチルアミノメタン、HEPESなどの緩衝液などを用いることができる。

等張化剤の好適な例として、例えば、塩化ナトリウム、グリセリン、D-マンニトールなどを用いることができる。

無痛化剤の好適な例として、例えば、ベンジルアルコールなどを用いることができる。

防腐を目的とした薬剤の好適な例として、例えば、チメロサール、パラオキシ安息香酸エステル類、フェノキシエタノール、クロロブタノール、ベンジルアルコール、フェネチルアルコール、デヒドロ酢酸、ソルビン酸、その他、各種防腐剤、抗生物質、合成抗菌剤などを用いることができる。

抗酸化剤の好適な例として、例えば、亜硫酸塩、アスコルビン酸などを用いることができる。

pH調節剤の好適な例として、例えば、塩酸、炭酸、酢酸、クエン酸、リン酸、ホウ酸、硫酸などの酸、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム、水酸化マグネシウムなどのアルカリ金属水酸化物、炭酸ナトリウムなどのアルカリ金属炭酸塩又は炭酸水素塩、酢酸ナトリウムなどのアルカリ金属酢酸塩、クエン酸ナトリウムなどのアルカリ金属クエン酸塩、トロメタモールなどの塩基、モノエタノールアミン、ジイソプロパノールアミンなどを用いることができる。

分散剤の好適な例として、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ポリソルベート80（TWEEN80）などを用いることができる。

芳香剤の好適な例として、例えば、レモン、オレンジ、グレープフルーツなどの柑橘系香料、ペパーミント、スペアミント、メントール、パイン、チェリー、フルーツ、ヨーグルト、コーヒーなどを用いることができる。

着色剤の好適な例として、例えば、カラメル色素、クチナシ色素、アントシアニン色素、アナトー色素、パプリカ色素、紅花色素、紅麹色素、カロチン色素、カロチノイド色素、フラボノイド色素、コチニール色素、アマランス（赤色2号）、エリスロシン（赤色3号）、アルラレッドAC（赤色40号）、ニューコクシン（赤色102号）、フロキシン（赤色104号）、ローズベンガル（赤色105号）、アシッドレッド（赤色106号）、タートラジン（黄色4号）、サンセットイエローFCF（黄色5号）、ファストグリーンFCF（緑色3号）、ブリリアントブルーFCF（青色1号）、インジゴカルミン（青色2号）、銅クロロフィル、銅クロロフィリンナトリウムなどを用いることができる。

消泡剤の好適な例として、例えば、ジメチコーン、シメチコン、シリコーンエマルション、ソルビタンセスキオレエート、ノニオン系物質などを用いることができる。

上記の他、本製剤には、補助成分、例えば、保存・効能の助剤となる光吸収色素(リボフラビン、アデニン、アデノシンなど)、安定化のためのキレート剤・還元剤(ビタミンC、クエン酸など)、炭水化物(ソルビトール、ラクトース、マンニトール、デンプン、シュークロース、グルコース、デキストランなど)、カゼイン消化物、各種ビタミンなどが含有させてもよい。

ワクチン製剤の剤型などについては、公知のものを採用でき、特に限定されない。例えば、液体製剤として用いてもよい。

その他、このワクチン製剤は、他の疾患に対する一又は複数のワクチンとの混合ワクチン製剤であってもよい。

＜本発明に係る魚類のイリドウイルス感染症予防方法について＞
本発明は、不活化されたイリドウイルスを、抗原として一回当たり10^7.0 TCID₅₀以上投与する魚類のイリドウイルス感染症予防方法を広く包含する。

上述の高濃度抗原を魚類に投与することにより、広範の魚種において、マダイイリドウイルス病などのイリドウイルス感染症の発生・感染・伝播・蔓延を有効に予防できる。

本発明は、マダイ、ブリ属魚類、シマアジ、ヤイトハタ、チャイロマルハタ、クエ、マハタ以外のイリドウイルスに感染しうる魚種に広く適用可能である。適用対象となる魚類として、例えば、イシダイ属魚類（例えば、イシダイ、イシガキダイなど）、サバ科魚類（例えば、マグロ・キハダマグロ・ビンナガ・メバチなどのマグロ属魚類、スマなどのスマ属魚類、サバなどのサバ属魚類、カツオなどのカツオ属魚類など）、カジキ亜目魚類（メカジキなどのメカジキ科魚類、マカジキなどのマカジキ科魚類）などが挙げられる。

本発明に係る不活化ワクチン製剤の投与方法として、例えば、注射法を採用することができる。

一回当たり10^7.0 TCID₅₀以上投与するために、例えば、不活化処理前のイリドウイルスの濃度を10^8.0 TCID₅₀/mL以上に調製した不活化ワクチン製剤を0.1mL以上、筋肉内又は腹腔内に投与してもよい。また、魚種ごと又は個体ごとのサイズなどに応じて、例えば、一回当たり10^7.0 TCID₅₀以上投与できるようにウイルス濃度を適宜調整した上で、若しくは不活化処理前のイリドウイルスの濃度を10^8.0 TCID₅₀/mL以上に調製した上で、その不活化ワクチン製剤を0.05mL～5.0mL、より好適には0.05～3.0mL、最も好適には0.05～1.5mLの範囲で投与してもよい。不活化処理前のイリドウイルスの濃度を10^8.0 TCID₅₀/mL以上に調製する方法は、上述の通りである。

不活化ワクチン製剤の投与回数は、その作用が持続する限り１回でよいが、対象魚類の大きさ、ワクチン効果の度合いなどに応じて、1～60日間隔で複数回投与してもよい。例えば、一回当たり10^7.0 TCID₅₀以上を1回又は1～60日間隔で2回投与することが好適である。

＜本発明に係る魚類のイリドウイルス感染症に対するワクチン製剤製造のための使用について＞
本発明は、不活化されたイリドウイルスを抗原として含有し、一回当たり10^7.0 TCID₅₀以上投与する、魚類のイリドウイルス感染症に対するワクチン製剤の製造のための、前記イリドウイルスの使用を広く包含する。

例えば、10^8.0 TCID₅₀/mL以上の濃度の不活化されたイリドウイルスを使用することで、一回当たり10^7.0 TCID₅₀以上投与する、魚類のイリドウイルス感染症に対するワクチン製剤を製造することができる。使用するイリドウイルス及びその濃度、製造されるワクチン製剤の目的・用法・用量・抗原以外の含有成分などは上記と同様である。

実施例1では、マダイイリドウイルスを培養細胞で増殖させた際の培養液とその培養細胞の両者を含有した不活化抗原をイシダイに接種して免疫した場合における、マダイイリドウイルス病に対する予防効果を検証した。

抗原として、細胞混入抗原を調製した。付着細胞であるGF細胞にマダイイリドウイルスRIE-124株を感染させた後、その細胞と培養液をそれぞれ分取し、混合した。この細胞には感染中のマダイイリドウイルスが含有されており、培養液にはマダイイリドウイルスが含有されている。分取した細胞混入培養液にホルマリンを0.1％の濃度で添加して不活化し、「細胞混入抗原」の試料とした。この試料のイリドウイルスの濃度は10^8.04 TCID₅₀/mLであった。なお、用いたRIE-124株は、平成24年8月、愛媛県のマダイ養殖場で罹患魚の脾臓を採取し、そこから培養細胞で分離・継代して得た単クローン性のマダイイリドウイルス株である。

陽性対照として、通常の培養上清抗原を調製した。上記と同様、マダイイリドウイルスRIE-124株をGF細胞に感染させた後、その培養上清を得た。この培養上清には、マダイイリドウイルスが含有されている。その培養上清にホルマリンを0.1％の濃度で添加して不活化し、「培養上清抗原」の試料とした。この試料のイリドウイルスの濃度は10^7.25 TCID₅₀/mLであった。

平均体重22.1gのイシダイ稚魚90尾を準備し、30尾ずつ三群に分け、それぞれ群ごとに試験水槽に入れて飼育した。

三群のうち、第一群のイシダイに細胞混入抗原を、第二群には通常の培養上清抗原を、それぞれ0.1mLずつ非麻酔下で腹腔内に注射して免疫し、14日間、飼育水温25℃下で飼育観察した。なお、第三群では、対照として、抗原を投与せずに、同様の条件下で飼育観察した。

続いて、攻撃用株としてマダイイリドウイルスRIE12-1株を準備し、免疫の14日後、各イシダイに麻酔下で10^0.5 TCID₅₀/尾、腹腔内注射した。そして、攻撃後28日間、同様の条件下で飼育観察を続けた。なお、攻撃時のイシダイの平均体重は31.0gであった。

結果を図1に示す。図1は、細胞混入抗原で免疫した場合におけるイシダイの生残率を示すグラフである。図中、横軸は攻撃した日からの日数を、縦軸は生残率（％）を、それぞれ表す。図中、「細胞混入抗原」は上記細胞混入抗原で免疫した場合の結果を、「培養上清抗原」は上記通常の培養上清抗原で免疫した場合の結果を、「無投与（対照）」は抗原で免疫しなかった場合の結果を、それぞれ表す。

図1に示す通り、無投与の場合におけるウイルス攻撃後の生残率は0％であり、通常の培養上清抗原で免疫した場合でも生残率6.7％であったのに対し、細胞混入抗原で免疫した場合には、生残率が53.3％であり、顕著に高かった。この結果より、細胞混入抗原が、通常の培養上清抗原と比較して、イシダイ属魚類のイリドウイルス病の予防に顕著に有効であることが示された。

実施例2では、不活化されたマダイイリドウイルスの高濃度抗原をイシダイに接種して免疫した場合における、マダイイリドウイルス病に対する予防効果を検証した。

以下の三種類の抗原を以下の通り調製した。

(1)通常抗原（1倍）：実施例1と同様、マダイイリドウイルスRIE-124株をGF細胞に感染させた後、遠心分離してその培養上清を得て、その培養上清にホルマリンを0.1％の濃度で添加して不活化し、「通常抗原（1倍）」の試料とした。この試料のイリドウイルスの濃度は10^7.34 TCID₅₀/mLであった。

(2)濃縮抗原（5倍）：(1)と同様の培養上清を100kDa遠心限外ろ過によって五倍濃縮した濃縮液にホルマリンを0.1％の濃度で添加して不活化し、「濃縮抗原（5倍）」の試料とした。この試料のイリドウイルスの濃度は10^8.04 TCID₅₀/mLであった。

(3)細胞混入抗原：実施例1と同様、GF細胞にマダイイリドウイルスRIE-124株を感染させた後、その細胞と培養液をそれぞれ分取・混合し、その細胞混入培養液にホルマリンを0.1％の濃度で添加して不活化し、「細胞混入抗原」の試料とした。この試料のイリドウイルスの濃度は10^8.24 TCID₅₀/mLであった。

平均体重9.4gのイシダイ稚魚60尾を準備し、15尾ずつ四群に分け、それぞれ群ごとに試験水槽に入れて飼育した。

四群のうち、第一群のイシダイには(1)の通常抗原を、第二群には(2)の濃縮抗原を、第三群には(3)の細胞混入抗原を、それぞれ0.1mLずつ腹腔内に注射して免疫し、14日間、飼育水温25℃下で飼育観察した。なお、第四群では、対照として、抗原を投与せずに、同様の条件下で飼育観察した。

続いて、攻撃用株としてマダイイリドウイルスRIE12-1株を準備し、免疫の14日後、各イシダイに麻酔下で10^0.5 TCID₅₀/尾、腹腔内注射した。そして、攻撃後20日間、同様の条件下で飼育観察を続けた。なお、攻撃時のイシダイの平均体重は15.6であった。

結果を図2に示す。図2は、各抗原で免疫した場合におけるイシダイの生残率を示すグラフである。図中、横軸は攻撃した日からの日数を、縦軸は生残率（％）を、それぞれ表す。図中、「濃縮抗原（5倍）」は上記濃縮抗原で免疫した場合の結果を、「細胞混入抗原」は上記細胞混入抗原で免疫した場合の結果を、「通常抗原（1倍）」は上記通常抗原で免疫した場合の結果を、「無投与（対照）」は抗原で免疫しなかった場合の結果を、それぞれ表す。

図2に示す通り、無投与の場合でも生残率が33.3％であり、また、通常抗原で免疫した場合でも生残率が53.3％と、無投与群と比較して、若干の生残率の向上が観察されたが、濃縮抗原及び細胞混入抗原で免疫した群の生残率は、両方とも73.3％であり、通常抗原で免疫した群と比較して、顕著に生残率が高かった。この結果より、濃縮抗原及び細胞混入抗原が、通常の培養上清抗原と比較して、イシダイ属魚類のマダイイリドウイルス病の予防に顕著に有効であることが示され、また、一回当たりの有効抗原量を10^7.0 TCID₅₀以上とすることで、イシダイ属魚類などのマダイイリドウイルス病を有効に予防できることが示唆された。

実施例3では、50倍濃縮したマダイイリドウイルスの高濃度抗原をイシダイに接種して免疫した場合における、マダイイリドウイルス病に対する予防効果を検証した。

実施例2で得た培養上清を500kDa遠心限外ろ過によって50倍濃縮し、PBSでバッファー交換して夾雑タンパク質を除去した後、ホルマリンを0.1％の濃度で添加して不活化し、「濃縮抗原（50倍）」の試料とした。この試料のイリドウイルスの濃度は10^9.04 TCID₅₀/mLであった。

また、実施例2で得た培養上清にホルマリンを0.1％の濃度で添加して不活化し、「通常抗原（1倍）」の試料とした。

平均体重8.4gのイシダイ稚魚60尾を準備し、20尾ずつ三群に分け、それぞれ群ごとに試験水槽に入れて飼育した。

三群のうち、第一群のイシダイに濃縮抗原（50倍）を、第二群には通常抗原（1倍）を、それぞれ0.1mLずつ非麻酔下で腹腔内に注射して免疫し、14日間、飼育水温25℃下で飼育観察した。なお、第三群では、対照として、抗原の代わりにPBSを投与し、同様の条件下で飼育観察した。

続いて、攻撃用株としてマダイイリドウイルスRIE12-1株を準備し、免疫の14日後、各イシダイに10^0.5 TCID₅₀/尾、腹腔内注射した。そして、攻撃後27日間、同様の条件下で飼育観察を続けた。

結果を図3に示す。図3は、50倍濃縮抗原で免疫した場合におけるイシダイの生残率を示すグラフである。図中、横軸は攻撃した日からの日数を、縦軸は生残率（％）を、それぞれ表す。図中、「濃縮抗原（50倍）」は50倍濃縮抗原で免疫した場合の結果を、「通常抗原（1倍）」は通常抗原（1倍）で免疫した場合の結果を、「PBS（対照）」は抗原の代わりにPBSを投与した場合の結果を、それぞれ表す。

図3に示す通り、通常の濃度の抗原で免疫した場合の生残率は10％で、陰性対照であるPBS投与の場合（15％）と同等の値であったのに対し、50倍濃縮した高濃度抗原で免疫した場合の生残率は85％であり、顕著に高かった。この結果より、高濃度抗原が、通常の濃度の抗原と比較して、イシダイ属魚類のイリドウイルス病の予防に顕著に有効であることが示された。

実施例1において、細胞混入抗原で免疫した場合におけるイシダイの生残率を示すグラフ。実施例2において、濃縮抗原又は細胞混入抗原で免疫した場合におけるイシダイの生残率を示すグラフ。実施例3において、50倍濃縮抗原で免疫した場合におけるイシダイの生残率を示すグラフ。

Claims

イリドウイルスを培養細胞で増殖させた際の培養液及び前記培養細胞を含有し、不活化されたイリドウイルスを抗原として10^8.0 TCID₅₀/mL以上の濃度で含有し、一回当たり10^7.0 TCID₅₀以上投与する、魚類のイリドウイルス感染症に対するワクチン製剤。
対象がイシダイ属魚種である請求項1記載のワクチン製剤。
イリドウイルスを培養細胞で増殖させた際の培養液及び前記培養細胞を含有し、不活化されたイリドウイルスを抗原として10^8.0 TCID₅₀/mL以上の濃度で含有し、一回当たり10^7.0 TCID₅₀以上投与する、魚類のイリドウイルス感染症予防方法。