RU2552486C2 - КАССЕТНАЯ ГЕНЕТИЧЕСКАЯ КОНСТРУКЦИЯ, ЭКСПРЕССИРУЮЩАЯ ДВЕ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫЕ siPHK, ЭФФЕКТИВНО АТАКУЮЩИЕ ТРАНСКРИПТЫ ВИЧ-1 СУБТИПА А У БОЛЬНЫХ В РОССИИ, НАПРАВЛЕННЫЕ НА мPHK ОБРАТНОЙ ТРАНСКРИТАЗЫ И ИНТЕГРАЗЫ, И ОДНУ siPHK, НАПРАВЛЕННУЮ НА мPHK ГЕНА CCR5 - Google Patents
КАССЕТНАЯ ГЕНЕТИЧЕСКАЯ КОНСТРУКЦИЯ, ЭКСПРЕССИРУЮЩАЯ ДВЕ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫЕ siPHK, ЭФФЕКТИВНО АТАКУЮЩИЕ ТРАНСКРИПТЫ ВИЧ-1 СУБТИПА А У БОЛЬНЫХ В РОССИИ, НАПРАВЛЕННЫЕ НА мPHK ОБРАТНОЙ ТРАНСКРИТАЗЫ И ИНТЕГРАЗЫ, И ОДНУ siPHK, НАПРАВЛЕННУЮ НА мPHK ГЕНА CCR5 Download PDFInfo
- Publication number
- RU2552486C2 RU2552486C2 RU2013102485/10A RU2013102485A RU2552486C2 RU 2552486 C2 RU2552486 C2 RU 2552486C2 RU 2013102485/10 A RU2013102485/10 A RU 2013102485/10A RU 2013102485 A RU2013102485 A RU 2013102485A RU 2552486 C2 RU2552486 C2 RU 2552486C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- hiv
- subtype
- genetic construct
- irna
- patients
- Prior art date
Links
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 title claims abstract description 35
- 108020004459 Small interfering RNA Proteins 0.000 title claims abstract description 28
- 241000713772 Human immunodeficiency virus 1 Species 0.000 title claims abstract description 24
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 title claims abstract description 20
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 title claims abstract description 14
- 108010061833 Integrases Proteins 0.000 title claims abstract description 6
- 101710149870 C-C chemokine receptor type 5 Proteins 0.000 title description 8
- 101150017501 CCR5 gene Proteins 0.000 claims abstract description 6
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 5
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 claims abstract description 4
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 8
- 101100438883 Homo sapiens CCR5 gene Proteins 0.000 claims description 4
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 abstract description 12
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 abstract description 6
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 5
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 abstract description 4
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 abstract description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 abstract description 3
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 abstract description 3
- 230000036436 anti-hiv Effects 0.000 abstract description 2
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 abstract description 2
- 101150108672 ccr gene Proteins 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 24
- 208000031886 HIV Infections Diseases 0.000 description 19
- 238000012228 RNA interference-mediated gene silencing Methods 0.000 description 17
- 230000009368 gene silencing by RNA Effects 0.000 description 17
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 17
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 13
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 10
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 9
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 8
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 8
- 102100035875 C-C chemokine receptor type 5 Human genes 0.000 description 7
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 7
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 7
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 6
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 5
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 5
- 208000037357 HIV infectious disease Diseases 0.000 description 4
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 4
- 241000242739 Renilla Species 0.000 description 4
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 4
- 208000033519 human immunodeficiency virus infectious disease Diseases 0.000 description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 108090000331 Firefly luciferases Proteins 0.000 description 3
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 3
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 3
- 108091034057 RNA (poly(A)) Proteins 0.000 description 3
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000012761 co-transfection Methods 0.000 description 3
- 238000013461 design Methods 0.000 description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 3
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 3
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 3
- 208000030507 AIDS Diseases 0.000 description 2
- 108020005544 Antisense RNA Proteins 0.000 description 2
- 108090000994 Catalytic RNA Proteins 0.000 description 2
- 102000053642 Catalytic RNA Human genes 0.000 description 2
- 108090000204 Dipeptidase 1 Proteins 0.000 description 2
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 101000574648 Homo sapiens Retinoid-inducible serine carboxypeptidase Proteins 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 102000009572 RNA Polymerase II Human genes 0.000 description 2
- 108010009460 RNA Polymerase II Proteins 0.000 description 2
- 102100025483 Retinoid-inducible serine carboxypeptidase Human genes 0.000 description 2
- 108091081021 Sense strand Proteins 0.000 description 2
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 2
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 2
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 2
- 239000003443 antiviral agent Substances 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 238000012350 deep sequencing Methods 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- 239000006225 natural substrate Substances 0.000 description 2
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 2
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 2
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 108091092562 ribozyme Proteins 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 2
- NIOPZPCMRQGZCE-WEVVVXLNSA-N 2,4-dinitro-6-(octan-2-yl)phenyl (E)-but-2-enoate Chemical compound CCCCCCC(C)C1=CC([N+]([O-])=O)=CC([N+]([O-])=O)=C1OC(=O)\C=C\C NIOPZPCMRQGZCE-WEVVVXLNSA-N 0.000 description 1
- 235000014653 Carica parviflora Nutrition 0.000 description 1
- 241000243321 Cnidaria Species 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 1
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 1
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 1
- 241000254158 Lampyridae Species 0.000 description 1
- 102000007474 Multiprotein Complexes Human genes 0.000 description 1
- 108010085220 Multiprotein Complexes Proteins 0.000 description 1
- 241001045988 Neogene Species 0.000 description 1
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 1
- 108091092724 Noncoding DNA Proteins 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 241000254064 Photinus pyralis Species 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- 206010066901 Treatment failure Diseases 0.000 description 1
- 230000003044 adaptive effect Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 238000010835 comparative analysis Methods 0.000 description 1
- 239000003184 complementary RNA Substances 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 229920001519 homopolymer Polymers 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 description 1
- 238000000034 method Methods 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 101150091879 neo gene Proteins 0.000 description 1
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Изобретение относится к областям медицинской и молекулярной генетики, а также к генотерапии. Описана генетическая конструкция, продуцирующая siPHK, которые являются ингибиторами репродукции вируса иммунодефицита человека 1 типа, субтипа А. Кассетная генетическая конструкция на основе вектора GeneClip-U1-neo, продуцирующая три siPHK - ингибиторы репродукции вируса иммунодефицита человека 1 типа и гена CCR5 человека. Конструкция anti-HIV-1R-anti-HIV-3R-anti-CCR5-8 содержит фрагмент длиной 30 bp, соответствующий консервативному району домена обратной транскриптазы генома ВИЧ-1 субтипа А у больных в России, фрагмент длиной 30 bp, соответствующий консервативному району домена интегразы генома ВИЧ-1 субтипа А у больных в России, а также 19 bp фрагмент, соответствующий мРНК гена CCR5. Техническим результатом предлагаемого изобретения является разработка эффективных анти-ВИЧ препаратов на основе интерферирующих РНК (siPHK), продуцируемых в клетках с помощью введенной кассетной генетической конструкции, содержащих палиндромы, предназначенные для образования продукции трех siPHK, две из которых направлены на мишени в клинических вариантах ВИЧ-1 субтипа А у больных в России, и тестированная с использованием невирусной системы. 3 ил., 3 табл., 2 пр.
Description
Изобретение относится к областям медицинской и молекулярной генетики, а также к генотерапии и связано с использованием ранее выявленных нами двух мишеней для РНК-интерференции в вирусе иммунодефицита человека 1 типа (ВИЧ-1) субтипа А для создания кассетной генетической конструкции. На основе детального анализа последовательности нуклеотидов в двух мишенях с помощью глубокого секвенирования генома ВИЧ-1 субтипа А у больных в России предложены последовательности соответствующих siPHK, предназначенные для эффективного подавления продукции данных клинических вариантов ВИЧ-1 в клетках человека.
Данная кассета экспрессируют две биологически активных анти-ВИЧ-1 siPHK, что приводит к атаке двух мишеней в транскриптах вируса и мощному ингибированию его репродукции в клетках человека. Указанная кассетная генетическая конструкция экспрессируют шпильки РНК, которые in vivo процессируются в биологически активные siPHK. Последние эффективно доставляются в белковые комплексы, осуществляющие разрезание транскриптов вируса, чем и достигается ингибирование его репродукции. Кроме того, данная кассета экспрессирует и биологически активную siPHK, атакующую мРНК гена CCR5 человека. Указанные ген кодирует ко-рецептор, облегчающий проникновение вируса в Т-лимфоциты человека. Такая генетическая конструкция может быть использована в медицине для генотерапии СПИДа и ВИЧ-инфекции, а также в научных исследованиях для мощного подавления продукции ВИЧ-1 субтипа А.
В настоящее время основным подходом лечения СПИДа и ВИЧ-инфекции является назначение пациентам противовирусной химиотерапии, включающей препараты, действующие на ключевые ферменты ВИЧ-1 - обратную транскриптазу, интегразу, протеазу. Однако, несмотря на большое количество разработанных препаратов, существует проблема эффективности применяемой противовирусной терапии. Основная причина, объясняющая неэффективность лечения - адаптивный мутагенез вируса, приводящий к появлению вариантов вируса, обладающих устойчивостью к противовирусным препаратам. Серьезными проблемами являются также токсичность и высокая стоимость применяемых лекарственных средств.
Известно применение рибозимов и антисмысловых РНК для терапии ВИЧ-инфекции [Dorman N. and Lever A.M. (2001) RNA-based gene therapy for HIV infection. HIV Med., 2, 114-122; Michienzi A., Conti L., Varano В., Prislei S., Gessani S., and Bozzoni I. (1998) Inhibition of human immunodeficiency virus type 1 replication by nuclear chimeric anti-HIV ribozymes in a human T lymphoblastoid cell line. Hum. Gene Ther., 9., 621-628; Veres G., Junker U., Baker J., Barske C., Kalfoglou C., Ilves H., Escaich S., Kaneshima H., and Bohnlein E. (1998) Comparative analysis of intracellularly expressed antisense RNAs as inhibitors of human immunodeficiency virus type 1 replication. J. Virol., 72, 1894-1901], которые блокируют несколько генов ВИЧ, что снижает его активность.
Наиболее близким к данному изобретению являются генетическая конструкция, обеспечивающая экспрессию siPHK внутри ВИЧ-инфицированных клеток организма (патент РФ №2425150, "Кассетная генетическая конструкция, экспрессирующая три биологически активные siPHK, эффективно атакующие транскрипты вируса иммунодефицита человека и гена CCR5 с помощью РНК-интерференции").
Настоящее изобретение отличается тем, что (1) в настоящей генетической конструкции в середине находится шпилька, кодирующая siPHK, направленную не на RT, а на Int; (2) шпилька, находящаяся в начале конструкции, направленная на RT, содержит две нуклеотидные замены, соответствующие вариантам данной мишени у больных в России. Т.о., предлагаемая конструкция экспрессирует две siPHK, которые нацелены на мишени в RT и Int в вариантах ВИЧ-1 субтипа А у больных в России, а одна siPHK - на мРНК гена CCR5 человека, кодирующего клеточный ко-рецептор, вовлеченный в проникновение вируса в Т-лимфоциты. Данные о мишенях РНК-интерференции ВИЧ-1 субтипа А в клинических вариантах вируса, выделенных у больных в России, получены с помощью капиллярного и глубокого секвенирования и депонированы в GenBank (accession numbers: КС681847-КС681888).
Техническим результатом предлагаемого изобретения является использование двух ранее выявленных мишеней РНК-интреференции в ВИЧ-1 (патент РФ 2385939) и одной мишени в мРНК CCR5 (Патент РФ 2425150) для подавления продукции вариантов вируса у больных в России. Данная кассетная генетическая конструкция содержит три палиндрома, предназначенные для образования шпилек РНК. Экспрессия такой конструкции в клетках человека приводит к образованию трех интерферирующих РНК (siPHK). Предлагаемая генетическая конструкция кодирует биологически активные siPHK, которые были отобраны с помощью невирусной тест-системы с использованием культур клеток человека.
Представленный технический результат достигается путем создания кассетной генетической конструкции на базе вектора GeneClip™U1 Neomycin (Ac. number AY 745746), http://www.promega.eom/pnotes/89/l12416 21/12416 21.pdf.
Созданная генетическая конструкция anti-HIV-1R-anti-HIV-3R-anti-CCR5-8 длиной 207 bp содержит вставку ДНК, указанную в Таблице 1.
Таблица 1.
Кассетная генетическая конструкция anti-HIV-1R-anti-HIV-3R-anti-CCR5-8, экспрессирующая три биологически активные siPHK
В Таблице 1 указаны 19-30 bp последовательности, соответствующие транскриптам вируса или мРНК CCR5. Строчными буквами жирным шрифтом в следующем порядке указаны области соответствующие: смысловой цепи мРНК обратной транскриптазы вируса, ее антисмысловой цепи; смысловой цепи мРНК Int вируса, ее антисмысловой цепи; смысловой цепи мРНК гена CCR5, ее антисмысловой цепи. Последовательности ДНК представлены в ориентации 5′-3′. Строчными буквами показаны тексты петель и спейсеров, содержащих искусственные сайты для рестриктаз EcoRI или BamHI (жирные строчные буквы). Петли образуются в транскрипте после отжига комплементарных областей палиндромов. Тексты генетической конструкции соответствуют мишеням в штаммах ВИЧ-1 субтипа А, выделенных у больных в России. Нумерация области гена CCR5 указана по последовательности GenBank - U54994. Указанная конструкция предназначена для поражения двух областей мРНК, кодирующих консервативные области обратной транскриптазы (RT) и интегразы (Int) вируса и 5′ области мРНК гена CCR5 человека в области первых кодонов. Затенены нуклеотидные замены в мишенях RT и Int, характерные для ВИЧ-1 субтипа А у больных в России.
В Таблице 2 представлены отличия в мишенях вируса из базы данных - HIV-1 subtype А, номер последовательности в GenBank - AF316544, изолят ВИЧ-1 субтипа А из Конго; и в клинических вариантах вируса субтипа А, выделенных у больных в России.
Таблица 2.
Мишени РНК-интерференции anti-HIV-1R и anti-HIV-3R у больных а России, соответствующие областям RT и Int
В мишенях, направленной на мРНК обратной транскриптазы и интегразы, выявлены отличия, характерные для генома вируса у больных в России (затенением указаны по две позиции нуклеотидных замен). Известно, что даже единичные отличия между мишенью и siPHK могут существенно ослабить эффективность РНК-интерференции. Следовательно, знание последовательности нуклеотидов в мишенях клинических вариантов ВИЧ-1 субтипа А позволяет создать генетические конструкции, эффективно поражающие транскрипты вируса и его продукцию у больных.
Указанную генетическую конструкцию тестировали с помощью невирусной системы. Данная система предназначена для количественной оценки биологической активности siPHK, которые образуются in vivo при экспрессии генетических конструкций. Она создана на базе вектора psiCHECK™-2 (Promega, номер последовательности в GenBank AY535007). Вектор содержит ген люциферазы светлячка и ген люциферазы коралла (Renilla). Указанные люцифезазы вызывают свечение разной длины волны, и их экспрессию можно измерять с помощью люминометра. В 3′ концевую некодирующую область гена Renilla вставляли короткие области генома вируса (домены), соответствующие выбранным мишеням РНК-интерференции в транскриптах вируса. Домены получали с помощью химического синтеза олигонуклеотидов ДНК. В Таблице 2 представлены тексты доменов, которые клонировали в векторе psiCHECK™-2 по сайтам рестриктаз XhoI и NotI.
Таблица 3.
Мишени РНК-интерференции, клонированные в векторе psiCHECK-2 для тестирования ее эффективности в невирусной системе
В Таблице 3 строчными буквами показаны области, содержащие сайты рестрикции эндонуклеаз XhoI и NotI, а также два спейсера между фрагментами генома HIV-1 (мишени HIV-1R и HIV-3R) и кДНК CCR5. Жирным шрифтом показаны области генома клинических вариантов вируса в России и кДНК CCR5, которые соответствуют мишеням РНК-интерференции.
Тестирование биологической активности кассеты проводят в экспериментах по ко-трансфекции культуральных клеток человека. При этом используют два препарата ДНК: кассетной генетической конструкции, содержащей промотор U1 РНК полимеразы II и кодирующей три siPHK, а также ДНК-плазмиды, созданной на базе вектора psi-CHECK-2, содержащей три клонированных домена, соответствующих данным siPHK (мишеням РНК-интерференции) (Таблица 3). В клетках человека на генетических конструкциях экспрессируется вставка, содержащая палиндромы. Синтезированная РНК образует шпильки, которые являются природным субстратом Дайсера, фермента, вырезающего 21 нуклеодидный дуплекс РНК из шпильки. Если Дайсер работает на дуплексе РНК длиной более 19 пар нуклеотидов (природный субстрат), то далее он, оставаясь связанным с двуспиральной siPHK, активно участвует также и в ее "загрузке" в белковый комплекс RISC. В данном комплексе происходит "раскручивание" цепей siPHK и освобождение его от одной из них (от так называемой "passenger"-цепи). Если в комплексе остается антисмысловая siPHK, то она используется как "наводчик", узнающий комплементарную мишень в транскриптах клетки. После связывания комплекса с соответствующей мРНК происходит ее разрезание одним из его белков, что приводит к выключению экспрессии соответствующего гена вируса и нарушает его размножение в клетке-хозяине. В трансфецированных клетках мРНК Renilla, содержащая в 3′-некодирующей области испытываемую мишень РНК-интерференции, разрезается, что приводит к резкому снижению голубого свечения, вызываемого данной люциферазой (478 nm). Желто-зеленое свечение, вызываемое люциферазой светлячка Photinus pyralis (557 nm), кодируемой той же ДНК psiCHECK-2, служит внутренним контролем.
В настоящем исследовании использовали одиннадцать критериев для отбора последовательностей мишеней РНК-интерференции в мРНК гена CCR5. Они важны для того, чтобы именно антисмысловая цепь siPHK оставалась в комплексе RISC. Каждая из приведенных в Таблице 1 вставок в генетических конструкциях соответствует, по крайней мере, десяти из одиннадцати ниже перечисленных критериев, которые использовались для отбора коровых 19-нуклеотидных последовательностей siPHK:
- состав G/C 30-52%,
- не менее 3 A/U в позициях 15-19 смысловой цепи,
- отсутствие внутренних повторов,
- А в позиции 19 смысловой цепи,
- А в позиции 3 смысловой цепи,
- U в позиции 10 смысловой цепи,
- отсутствие G/C в позиции 19 смысловой цепи,
- отсутствие G в позиции 13 смысловой цепи,
- отсутствие гомополимерных трактов (А)4-5 или (Т)4-5 в смысловой цепи,
- локализация мишени в консервативном районе генома вируса,
- отсутствие гомологии с известными транскриптами генома человека.
Часть вышеперечисленных критериев отбора биологически активных siPHK опубликована [Reynolds A., Leake D., Boese Q., Scaringe S., Marshall W.S., Khvorova A. (2004) Rational siRNA design for RNA interference. Nature Biotechnol. 22, 326-330] и представлена на сайте http://www.dharmacon.com.
Приведенная в Таблице 1 кассетная генетическая конструкция обеспечивают целенаправленное воздействие на мРНК вариантов вируса в России с помощью соответствующих двух siPHK, а также на мРНК CCR5. Терапевтическим результатом такого воздействия является подавление репродукции вариантов ВИЧ-1 субтипа А у больных в России.
Для вируса иммунодефицита человека первого типа характерно быстрое возникновение и отбор мутантных вариантов, обладающих резистентностью к различным противовирусным препаратам. Для решения проблемы вирусной изменчивости получена кассетная генетическая конструкция, атакующая разные мишени и поэтому в значительной степени не зависящая от изменчивости вируса.
На фиг.1 приведена физическая карта вектора GeneClipU1-neo.
На фиг.2 приведена физическая карта вектора psiCHECK-2.
На фиг.3 представлены результаты проверки эффективности РНК-интерференции, вызываемой созданной кассетной генетической конструкцией на невирусной тест-системе.
Пример 1. Описание генетической конструкции и способа ее получения
Вектор GeneClipU1-neo зарегистрирован в GenBank (Accession # AC AY745746), имеет размер 4,758 kb (kilobases - тысяча пар оснований) и характеризуется тем, что содержит:
старт-сайт РНК полимеразы Т7: 1
U1 промотор РНК полимеразы II человека: 46-438
10 bp спейсер: 439-448
U1 терминатор: 449-465
промотор РНК полимеразы SP6: 527-546
ранний энхансер/промотор вируса SV40: 798-1216
сигнал начала репликации вируса SV40: 1114-1179
ген neo: 1251-2045
синтетический поли(А): 2080-2128
ген β-лактамазы: 3080-3940
промотор РНК полимеразы Т7: 4742-3.
В данный вектор, который поставляется Promega в линейной форме, вставляют химически синтезированные олигонуклеотиды ДНК, которые соответствуют генетическим конструкциям, продуцирующим шпильки РНК (Таблица 1).
Вектор psiCHECK-2 зарегистрирован в GenBank (Accession # AY535007), имеет размер 6,27 kb и характеризуется тем, что содержит:
ранний энхансер/промотор вируса SV40: 7-425
химерный интрон: 489-621
промотор РНК полимеразы Т7: 666-684
ген люциферазы Relilla: 694-1629
полилинкер: 1636-1680
синтетический поли(А): 1688-1736
промотор HSK-TK: 1744-2496
ген люциферазы светлячка: 2532-4184
поздний сигнал поли(А) SV40: 4219-4440
ген β-лактамазы: 4587-5447.
В данном векторе в сайты XhoI и NotI полилинкера вставляют химически синтезированные олигонуклеотиды ДНК, которые соответствуют выбранным мишеням РНК-интерференции (Таблица 2).
Пример 2. Оценка эффективности РНК-интерференции, вызываемой созданными генетическими конструкциями в невирусной системе
Накануне проведения ко-трансфекции (за 18-20 часов) клетки НЕК293 рассевают в лунки 24-луночного планшета Nunc - по 50 тыс. клеток в 500 мкл культуральной среды DMEM (ПанЭко), содержащей глютамин и сыворотку (полная среда), на лунку. В день эксперимента готовят пробы ДНК для ко-трансфекции при комнатной температуре следующим образом (на одну экспериментальную точку). В 200 мкл среды DMEM, не содержащей сыворотки (SFM), добавляют 100 ng ДНК генетической конструкции в векторе GeneClip-U1-neo (см. Таблицу 1) и 10 ng ДНК плазмиды, содержащий соответствующие клонированные домены в векторе psiCHECK-2 (см. Таблицу 2). После перемешивания добавляют 1 мкл свежеразмороженного реагента TransFast (Promega), встряхивают смесь и инкубируют ее 15 мин. Затем отсасывают среду из лунок с "сидящими" клетками, встряхивают пробирку со смесью ДНК-TransFast и сразу добавляют смесь в лунки с клетками. После инкубации 1 час при 37°C в CO2-инкубаторе добавляют в лунки по 600 мкл среды с сывороткой, перемешивают и инкубируют планшет 48-72 час.
Для измерения экспрессии люцифераз среду над клетками в лунках планшета отсасывают, добавляют 100 мкл раствора трипсина-ЭДТА (ПанЭко) на лунку, после 10 мин инкубации при 37°C в CO2-инкубаторе добавляют по 100 мкл полной среды, переносят полностью суспензию клеток в пробирку эппердорф на 0.5 мл, осаждают центрифугированием при комнатной температуре в центрифуге Eppendorf (5 мин - 2000 rpm), надосадочную жидкость отсасывают, суспендируют клетки в 70 мкл 1xPBS и проводят измерение свечения люцифераз светлячка и Renilla согласно рекомендациям к набору Dual-Luciferase Reporter Assay System (Promega) на люминометре Reporter Microplate Luminometer (Turner BioSystems). На фиг.3 показаны результаты испытания генетических конструкций на невирусной системе. Видно, что генетические конструкции специфически подавляют экспрессию мишеней на 60-96%.
Краткое описание чертежей
На фиг.1 приведена физическая карта вектора, который использовался для создания кассетной генетической конструкции, вызывающей РНК-интерференцию, направленную против транскриптов вируса и мРНК CCR5. Указаны ген устойчивости к ампициллину (Амп), сайт полиаденилирования и энхансер SV40.
На фиг.2 приведена физическая карта вектора, который использовался в невирусной системе для количественной оценки эффективности РНК-интерференции, вызываемой созданной кассетной генетической конструкцией. Указаны ген устойчивости к ампициллину (Амп), сайт полиаденилирования и энхансер SV40.
На фиг.3 представлены данные испытания конструкции в невирусной системе. Приведены данные в % к эффекту генетической конструкции anti-HIV-1R-anti-HIV-3R-anti-CCR5-8 к исходному вектору GeneClip-U1-neo, не содержащему вставки или содержащему "рандомизированную" последовательность (rand.) мишеней; HIV-1R - мишень, соответствующая области RT у больных в России; HIV-3R - мишень, соответствующая области Int у больных в России; 1R-3R-CCR5 - мишени для двух вышеуказанных siPHK и для siPHK, направленной на мРНКгена CCR5.
Claims (1)
- Кассетная генетическая конструкция anti-HIV-1R-anti-HIV-3R-anti-CCR5-8 на основе вектора GeneClip-U1-neo, содержащего вставку, указанную в Таблице 1, продуцирующая три siPHK - ингибиторы репродукции вируса иммунодефицита человека 1 типа, субтипа А, и экспрессии гена CCR5 человека - и содержащая два фрагмента генома ВИЧ-1 субтипа А, выявленного у больных в России, соответствующие консервативным районам домена обратной транскриптазы и интегразы, а также 19 bp область, соответствующую гену CCR5 (приведена в третьей строке):
где строчными буквами показаны области петель между частями палиндромов, способными образовать двуспиральные дуплексы.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2013102485/10A RU2552486C2 (ru) | 2013-01-21 | 2013-01-21 | КАССЕТНАЯ ГЕНЕТИЧЕСКАЯ КОНСТРУКЦИЯ, ЭКСПРЕССИРУЮЩАЯ ДВЕ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫЕ siPHK, ЭФФЕКТИВНО АТАКУЮЩИЕ ТРАНСКРИПТЫ ВИЧ-1 СУБТИПА А У БОЛЬНЫХ В РОССИИ, НАПРАВЛЕННЫЕ НА мPHK ОБРАТНОЙ ТРАНСКРИТАЗЫ И ИНТЕГРАЗЫ, И ОДНУ siPHK, НАПРАВЛЕННУЮ НА мPHK ГЕНА CCR5 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2013102485/10A RU2552486C2 (ru) | 2013-01-21 | 2013-01-21 | КАССЕТНАЯ ГЕНЕТИЧЕСКАЯ КОНСТРУКЦИЯ, ЭКСПРЕССИРУЮЩАЯ ДВЕ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫЕ siPHK, ЭФФЕКТИВНО АТАКУЮЩИЕ ТРАНСКРИПТЫ ВИЧ-1 СУБТИПА А У БОЛЬНЫХ В РОССИИ, НАПРАВЛЕННЫЕ НА мPHK ОБРАТНОЙ ТРАНСКРИТАЗЫ И ИНТЕГРАЗЫ, И ОДНУ siPHK, НАПРАВЛЕННУЮ НА мPHK ГЕНА CCR5 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2013102485A RU2013102485A (ru) | 2014-08-10 |
| RU2552486C2 true RU2552486C2 (ru) | 2015-06-10 |
Family
ID=51354760
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2013102485/10A RU2552486C2 (ru) | 2013-01-21 | 2013-01-21 | КАССЕТНАЯ ГЕНЕТИЧЕСКАЯ КОНСТРУКЦИЯ, ЭКСПРЕССИРУЮЩАЯ ДВЕ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫЕ siPHK, ЭФФЕКТИВНО АТАКУЮЩИЕ ТРАНСКРИПТЫ ВИЧ-1 СУБТИПА А У БОЛЬНЫХ В РОССИИ, НАПРАВЛЕННЫЕ НА мPHK ОБРАТНОЙ ТРАНСКРИТАЗЫ И ИНТЕГРАЗЫ, И ОДНУ siPHK, НАПРАВЛЕННУЮ НА мPHK ГЕНА CCR5 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2552486C2 (ru) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2650774C1 (ru) * | 2017-01-31 | 2018-04-17 | Федеральное Государственное Бюджетное Учреждение Науки Институт Молекулярной Биологии Им. В.А. Энгельгардта Российской Академии Наук (Имб Ран) | Эффективные мишени РНК-интерференции в геноме ВИЧ-1 и субстраты Дайсера, предназначенные для их поражения |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20080003658A1 (en) * | 2001-09-13 | 2008-01-03 | Xiao-Feng Qin | Method for expression of small antiviral rna molecules within a cell |
| RU2385939C1 (ru) * | 2008-08-29 | 2010-04-10 | Учреждение Российской академии наук Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН | Генетические конструкции, атакующие шесть новых мишеней рнк-интерференции в транскриптах вируса иммунодефицита человека 1 типа и подавляющие репродукцию вируса в клетках человека |
| RU2425150C1 (ru) * | 2009-11-23 | 2011-07-27 | Учреждение Российской академии наук Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН | КАССЕТНАЯ ГЕНЕТИЧЕСКАЯ КОНСТРУКЦИЯ, ЭКСПРЕССИРУЮЩАЯ ТРИ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫЕ siPHK, ЭФФЕКТИВНО АТАКУЮЩИЕ ТРАНСКРИПТЫ ВИРУСА ИММУНОДЕФИЦИТА ЧЕЛОВЕКА И ГЕНА CCR5 С ПОМОЩЬЮ PHK-ИНТЕРФЕРЕНЦИИ |
-
2013
- 2013-01-21 RU RU2013102485/10A patent/RU2552486C2/ru active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20080003658A1 (en) * | 2001-09-13 | 2008-01-03 | Xiao-Feng Qin | Method for expression of small antiviral rna molecules within a cell |
| RU2385939C1 (ru) * | 2008-08-29 | 2010-04-10 | Учреждение Российской академии наук Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН | Генетические конструкции, атакующие шесть новых мишеней рнк-интерференции в транскриптах вируса иммунодефицита человека 1 типа и подавляющие репродукцию вируса в клетках человека |
| RU2425150C1 (ru) * | 2009-11-23 | 2011-07-27 | Учреждение Российской академии наук Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН | КАССЕТНАЯ ГЕНЕТИЧЕСКАЯ КОНСТРУКЦИЯ, ЭКСПРЕССИРУЮЩАЯ ТРИ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫЕ siPHK, ЭФФЕКТИВНО АТАКУЮЩИЕ ТРАНСКРИПТЫ ВИРУСА ИММУНОДЕФИЦИТА ЧЕЛОВЕКА И ГЕНА CCR5 С ПОМОЩЬЮ PHK-ИНТЕРФЕРЕНЦИИ |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2650774C1 (ru) * | 2017-01-31 | 2018-04-17 | Федеральное Государственное Бюджетное Учреждение Науки Институт Молекулярной Биологии Им. В.А. Энгельгардта Российской Академии Наук (Имб Ран) | Эффективные мишени РНК-интерференции в геноме ВИЧ-1 и субстраты Дайсера, предназначенные для их поражения |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2013102485A (ru) | 2014-08-10 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US8318921B2 (en) | Triggered RNAi | |
| US8497364B2 (en) | Triggered RNAi | |
| US9506064B2 (en) | Cell-type specific aptamer-siRNA delivery system for HIV-1 therapy | |
| Nishitsuji et al. | Effective suppression of human immunodeficiency virus type 1 through a combination of short-or long-hairpin RNAs targeting essential sequences for retroviral integration | |
| EP1931806B1 (en) | Pkr activation via hybridization chain reaction | |
| US8067572B2 (en) | Hybrid interfering RNA | |
| JP7017247B2 (ja) | がんを処置するための組み合わせベクターおよび方法 | |
| US20170283802A1 (en) | Design of nucleic acid binding molecules with non-watson crick and non-canonical pairing based on artificial mutation consensus sequences to counter escape mutations | |
| US9222090B2 (en) | RNA interference target for treating AIDS | |
| CN107365785A (zh) | 一种调控细胞内NF‑κB活性的基因表达载体及其调控方法和应用 | |
| EP1799824A2 (en) | Nucleic acids against viruses, in particular hiv | |
| RU2425150C1 (ru) | КАССЕТНАЯ ГЕНЕТИЧЕСКАЯ КОНСТРУКЦИЯ, ЭКСПРЕССИРУЮЩАЯ ТРИ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫЕ siPHK, ЭФФЕКТИВНО АТАКУЮЩИЕ ТРАНСКРИПТЫ ВИРУСА ИММУНОДЕФИЦИТА ЧЕЛОВЕКА И ГЕНА CCR5 С ПОМОЩЬЮ PHK-ИНТЕРФЕРЕНЦИИ | |
| JP4545091B2 (ja) | Ｃ型肝炎ウイルスの働きを阻害するオリゴリボヌクレオチドまたはペプチド核酸 | |
| RU2385939C1 (ru) | Генетические конструкции, атакующие шесть новых мишеней рнк-интерференции в транскриптах вируса иммунодефицита человека 1 типа и подавляющие репродукцию вируса в клетках человека | |
| RU2552486C2 (ru) | КАССЕТНАЯ ГЕНЕТИЧЕСКАЯ КОНСТРУКЦИЯ, ЭКСПРЕССИРУЮЩАЯ ДВЕ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫЕ siPHK, ЭФФЕКТИВНО АТАКУЮЩИЕ ТРАНСКРИПТЫ ВИЧ-1 СУБТИПА А У БОЛЬНЫХ В РОССИИ, НАПРАВЛЕННЫЕ НА мPHK ОБРАТНОЙ ТРАНСКРИТАЗЫ И ИНТЕГРАЗЫ, И ОДНУ siPHK, НАПРАВЛЕННУЮ НА мPHK ГЕНА CCR5 | |
| RU2630644C1 (ru) | Кассетная генетическая конструкция, экспрессирующая две биологически активные siPHK, эффективно атакующие мишени в мРНК генов vpu и env ВИЧ-1 субтипа А у больных в России, и одну siPHK, направленную на мРНК гена CCR5 | |
| RU2552607C2 (ru) | КАССЕТНАЯ ГЕНЕТИЧЕСКАЯ КОНСТРУКЦИЯ, ЭКСПРЕССИРУЮЩАЯ ДВЕ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫЕ siPHK, ЭФФЕКТИВНО АТАКУЮЩИЕ ТРАНСКРИПТЫ ВИЧ-1 СУБТИПА А У БОЛЬНЫХ В РОССИИ, И ОДНУ siPHK, НАПРАВЛЕННУЮ НА мРНК ГЕНА CCR5 | |
| RU2607381C1 (ru) | Кассетная генетическая конструкция, экспрессирующая две биологически активные siPHK, эффективно атакующие мишени в мРНК обратной транскриптазы ВИЧ-1 субтипа А у больных в России, и одну siPHK, направленную на мРНК гена CCR5 | |
| US20110008885A1 (en) | Linear double-stranded rna molecule interfering with different target genes | |
| JP2015109842A (ja) | Ｃ型肝炎ウイルスの働きを阻害するオリゴリボヌクレオチドまたはペプチド核酸 | |
| CN104357444A (zh) | 一种使牛trim5α基因沉默的siRNA及其应用 | |
| JP4228071B2 (ja) | Ｃ型肝炎ウイルスのタンパク質合成及び／又はｃ型肝炎ウイルスの複製を抑制することができる二本鎖オリゴヌクレオチド | |
| RU2650774C1 (ru) | Эффективные мишени РНК-интерференции в геноме ВИЧ-1 и субстраты Дайсера, предназначенные для их поражения | |
| JP4505566B2 (ja) | 肺癌治療剤 | |
| Ren et al. | Construction, modification and evaluation of apolipoprotein AI promoter-driven shRNA expression vectors against hTERT |