RU2425150C1 - КАССЕТНАЯ ГЕНЕТИЧЕСКАЯ КОНСТРУКЦИЯ, ЭКСПРЕССИРУЮЩАЯ ТРИ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫЕ siPHK, ЭФФЕКТИВНО АТАКУЮЩИЕ ТРАНСКРИПТЫ ВИРУСА ИММУНОДЕФИЦИТА ЧЕЛОВЕКА И ГЕНА CCR5 С ПОМОЩЬЮ PHK-ИНТЕРФЕРЕНЦИИ - Google Patents
КАССЕТНАЯ ГЕНЕТИЧЕСКАЯ КОНСТРУКЦИЯ, ЭКСПРЕССИРУЮЩАЯ ТРИ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫЕ siPHK, ЭФФЕКТИВНО АТАКУЮЩИЕ ТРАНСКРИПТЫ ВИРУСА ИММУНОДЕФИЦИТА ЧЕЛОВЕКА И ГЕНА CCR5 С ПОМОЩЬЮ PHK-ИНТЕРФЕРЕНЦИИ Download PDFInfo
- Publication number
- RU2425150C1 RU2425150C1 RU2009142859/10A RU2009142859A RU2425150C1 RU 2425150 C1 RU2425150 C1 RU 2425150C1 RU 2009142859/10 A RU2009142859/10 A RU 2009142859/10A RU 2009142859 A RU2009142859 A RU 2009142859A RU 2425150 C1 RU2425150 C1 RU 2425150C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- hiv
- rna
- cartridge
- virus
- immunodeficiency virus
- Prior art date
Links
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 title claims abstract description 30
- 238000012228 RNA interference-mediated gene silencing Methods 0.000 title description 11
- 230000009368 gene silencing by RNA Effects 0.000 title description 11
- 101710149870 C-C chemokine receptor type 5 Proteins 0.000 title description 7
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 title description 5
- 108020004459 Small interfering RNA Proteins 0.000 claims abstract description 17
- 241000713772 Human immunodeficiency virus 1 Species 0.000 claims abstract description 15
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 claims abstract description 7
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 claims abstract description 6
- 101100438883 Homo sapiens CCR5 gene Proteins 0.000 claims abstract description 5
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 5
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 claims abstract description 4
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 23
- 208000031886 HIV Infections Diseases 0.000 claims description 12
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 8
- 101150111062 C gene Proteins 0.000 claims 1
- 206010061598 Immunodeficiency Diseases 0.000 claims 1
- 208000029462 Immunodeficiency disease Diseases 0.000 claims 1
- 230000007813 immunodeficiency Effects 0.000 claims 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 abstract description 15
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 abstract description 12
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 5
- 101150017501 CCR5 gene Proteins 0.000 abstract description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 abstract description 3
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 abstract description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 abstract description 2
- 230000036436 anti-hiv Effects 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 14
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 10
- 102100035875 C-C chemokine receptor type 5 Human genes 0.000 description 6
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 6
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 6
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 6
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 6
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 5
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 5
- 208000037357 HIV infectious disease Diseases 0.000 description 4
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 4
- 241000242739 Renilla Species 0.000 description 4
- 208000033519 human immunodeficiency virus infectious disease Diseases 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 108090000331 Firefly luciferases Proteins 0.000 description 3
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 3
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 3
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 3
- 108091034057 RNA (poly(A)) Proteins 0.000 description 3
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000012761 co-transfection Methods 0.000 description 3
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 3
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 3
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 3
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 3
- 208000030507 AIDS Diseases 0.000 description 2
- 108020005544 Antisense RNA Proteins 0.000 description 2
- 108090000204 Dipeptidase 1 Proteins 0.000 description 2
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 101000574648 Homo sapiens Retinoid-inducible serine carboxypeptidase Proteins 0.000 description 2
- 102000009572 RNA Polymerase II Human genes 0.000 description 2
- 108010009460 RNA Polymerase II Proteins 0.000 description 2
- 102100025483 Retinoid-inducible serine carboxypeptidase Human genes 0.000 description 2
- 108091081021 Sense strand Proteins 0.000 description 2
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 2
- 239000003443 antiviral agent Substances 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- 239000006225 natural substrate Substances 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 2
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 2
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 1
- NIOPZPCMRQGZCE-WEVVVXLNSA-N 2,4-dinitro-6-(octan-2-yl)phenyl (E)-but-2-enoate Chemical compound CCCCCCC(C)C1=CC([N+]([O-])=O)=CC([N+]([O-])=O)=C1OC(=O)\C=C\C NIOPZPCMRQGZCE-WEVVVXLNSA-N 0.000 description 1
- 235000014653 Carica parviflora Nutrition 0.000 description 1
- 108090000994 Catalytic RNA Proteins 0.000 description 1
- 102000053642 Catalytic RNA Human genes 0.000 description 1
- 241000243321 Cnidaria Species 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 1
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 1
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010061833 Integrases Proteins 0.000 description 1
- 241000254158 Lampyridae Species 0.000 description 1
- 102000007474 Multiprotein Complexes Human genes 0.000 description 1
- 108010085220 Multiprotein Complexes Proteins 0.000 description 1
- 241001045988 Neogene Species 0.000 description 1
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 1
- 108091092724 Noncoding DNA Proteins 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 241000254064 Photinus pyralis Species 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- 206010066901 Treatment failure Diseases 0.000 description 1
- 230000003044 adaptive effect Effects 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 239000003184 complementary RNA Substances 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 229920001519 homopolymer Polymers 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 description 1
- 238000000034 method Methods 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 101150091879 neo gene Proteins 0.000 description 1
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 230000001012 protector Effects 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 108091092562 ribozyme Proteins 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Abstract
Изобретение относится к областям медицинской и молекулярной генетики, а также к генотерапии. Описана кассетная генетическая конструкция на основе вектора GeneClip-U1-neo, продуцирующая три siPHK-ингибиторы репродукции вируса иммунодефицита человека 1 типа и гена CCR5 человека. Конструкция содержит фрагмент длиной 27 bр, соответствующий консервативному району домена обратной транскриптазы генома ВИЧ-1, фрагмент длиной 27 bp, соответствующий другому консервативному району домена обратной транскриптазы генома ВИЧ-1, а также 19 bp фрагмент, соответствующий мРНК гена CCR5. Изобретение позволяет получать более эффективные анти-ВИЧ препараты на основе интерферирующих РНК (siPHK), продуцируемые в клетках с помощью введенной кассетной генетической конструкции, содержащие палиндромы, предназначенные для образования продукции трех siPHK. Изобретение может быть использовано в медицине и научных исследованиях. 3 ил., 2 табл.
Description
Изобретение относится к областям медицинской и молекулярной генетики, а также к генотерапии, и связано с использованием ранее выявленных мишеней для РНК-интерференции в вирусе иммунодефицита человека 1 типа (ВИЧ-1) для создания кассетной генетической конструкции. Данная кассета экспрессирует две биологически активные siPHK, что приводит к атаке соответствующих мишеней в транскриптах вируса и мощному ингибированию его репродукции в клетках человека. Указанная кассетная генетическая конструкция экспрессируют шпильки РНК, которые in vivo процессируются в биологически активные siPHK. Последние эффективно доставляются в белковые комплексы, осуществляющие разрезание транскриптов вируса, чем и достигается ингибирование его репродукции. Кроме того, данная кассета экспрессирует и новую биологически активную siPHK, атакующую мРНК гена CCR5 человека. Указанный ген кодирует ко-рецептор, облегчающий проникновение вируса в Т-лимфоциты человека. Такая генетическая конструкция может быть использована в медицине для генотерапии СПИДа и ВИЧ-инфекции, а также в научных исследованиях для мощного подавления продукции ВИЧ.
В настоящее время основным подходом лечения СПИДа и ВИЧ-инфекции является назначение пациентам противовирусной химиотерапии, включающей препараты, действующие на ключевые ферменты ВИЧ-1 - обратную транскриптазу, интегразу, протеазу. Однако несмотря на большое количество разработанных препаратов, существует проблема эффективности применяемой противовирусной терапии. Основная причина, объясняющая неэффективность лечения - адаптивный мутагенез вируса, приводящий к появлению вариантов вирусов, обладающих устойчивостью к противовирусным препаратам. Серьезными проблемами являются также токсичность и высокая стоимость применяемых лекарственных средств.
Известно применение рибозимов и антисмысловых РНК для терапии ВИЧ-инфекции [Dorman N. And Lever A.M. (2001) RNA-based gene therapy for HIV infection. HIV Med., 2, 114-122; Michienzi A., Conti L., Varano В., Prislei S., Gessani S., and Bozzoni I. (1998) Inhibition of human immunodeficiency virus type 1 replication by nuclear chimeric anti-HIVribozymes in a human T lymphoblastoid cell line. Hum. Gene Ther., 9., 621-628; Veres G., Junker U., Baker J., Barske C, Kalfoglou C, lives H., Escaich S., Kaneshima H., and Bohnlein E. (1998) Comparative analisis of intracellularly expressed antisense RNAs as inhibitors of human immunodeficiency virus type 1 replication. J. Virol., 72, 1894-1901.], которые блокируют несколько генов ВИЧ, что снижает его активность.
Наиболее близким к данному изобретению являются генетические конструкции, обеспечивающие экспрессию siPHK внутри ВИЧ-инфицированных клеток организма (Патент РФ 2324738, "Генетическая конструкция на основе векторной плазмиды pEGFP-Nl, продуцирующая siPHK-ингибиторы репродукции вируса иммунодефицита человека 1 типа (ее варианты)".
Настоящее изобретение отличается тем, что в настоящей генетической конструкции экспрессируются не одна, а три siPHK, две из которых нацелены на две другие мишени в транскриптах вируса, а одна нацелена на мРНК гена CCR5 человека, кодирующего клеточный ко-рецептор, вовлеченный в проникновение вируса в Т-лимфоциты. Кроме того, в настоящей генетической конструкции используется другой исходный вектор.
Техническим результатом предлагаемого изобретения является использование двух ранее выявленных мишеней РНК-интреференции в вирусе (Заявка на патент РФ от 29.08.2008, регистрационный номер 2008134932) и одной новой мишени в мРНК CCR5, описываемой в настоящей Заявке, для получения большего эффекта подавления вируса. Данная кассетная генетическая конструкция содержит три палиндрома, предназначенных для образования "шпилек РНК". Экспрессия такой конструкции в клетках человека приводит к образованию трех интерферирующих РНК (siPHK). Предлагаемая генетическая конструкция кодируют биологически активные siPHK, которые были отобраны с помощью невирусной тест-системы с использованием культур клеток человека.
Представленный технический результат достигается путем создания кассетной генетической конструкции на базе вектора GeneClip™ U1 Neomycin (Ac. number AY745746), http://www.promega.com/pnotes/89/12416_21/12416_21.pdf.
Созданная генетическая конструкция длиной 195 bp содержат вставку ДНК, указанную в Таблице 1:
В таблице 1 указаны 19-27-нуклеотидные последовательности, соответствующие транскриптам вируса или мРНК CCR5. Строчными буквами жирным шрифтом в следующем порядке указаны области, соответствующие смысловой цепи мРНК вируса (2435..2461), ее антисмысловой цепи; смысловой цепи мРНК вируса (2304..2330), ее антисмысловой цепи; смысловой цепи мРНК гена CCR5 (47..65), ее антисмысловой цепи. Последовательности ДНК представлены в ориентации 5′-3′. Строчными буквами показаны тексты петель и спейсеров, содержащих искусственные сайты для рестриктаз EcoRI или BamHI (жирные строчные буквы). Петли образуются в транскрипте после отжига комплементарных областей палиндромов. Тексты генетических конструкций соответствуют штамму ВИЧ-1 подтипа A (HIV-1 subtype А), номер последовательности в GenBank - AF316544. Нумерация области гена CCR5 указана по последовательности GenBank - U54994. Указанная конструкция предназначена для поражения двух областей мРНК, кодирующих консервативные области обратной транскриптазы (RT) вируса и 5′ области мРНК гена CCR5 человека в области первых кодонов.
Указанную генетическую конструкцию тестировали с помощью невирусной системы. Данная система предназначена для количественной оценки биологической активности siPHK, которые образуются in vivo при экспрессии генетических конструкций. Она создана на базе вектора psiCHECK™-2 (Promega, номер последовательности в GenBank AY535007). Вектор содержит ген люциферазы светлячка и ген люциферазы коралла (Renilla). Указанные люцифезазы вызывают свечение разной длины волны и их экспрессию можно измерять с помощью люминометра. В 3′ концевую некодирующую область гена Renilla вставляли короткие области генома вируса (домены), соответствующие выбранным мишеням РНК-интерференции в транскриптах вируса. Домены получали с помощью химического синтеза олигонуклеотидов ДНК. В таблице 2 представлены тексты доменов, которые клонировали в векторе psiCHECK™-2 по сайтам рестриктаз XhoI и NotI.
В таблице 2 строчными буквами показаны области, содержащие сайты рестрикции эндонуклеаз XhoI и NotI, а также два спейсера между фрагментами генома HIV-1 и кДНК CCR5. Жирным шрифтом показаны области генома вируса и кДНК CCR5 длиной 28 bp каждая, которые соответствуют мишеням РНК-интерференции. Нумерация областей приведена согласно последовательности вируса (AF316544) и кДНК CCR5 (U54994) в следующем порядке: мишень anti-HIV-1, anti-HIV-2, anti-CCR5-8.
Тестирование биологической активности кассеты проводят в экспериментах по ко-трансфекции культуральных клеток человека. При этом используют два препарата ДНК: кассетной генетической конструкции, содержащей промотор U1 РНК полимеразы II и кодирующую кодирующей три siPHK, а также ДНК -плазмиды, созданной на базе вектора psi-CHECK-2, содержащей три клонированных домена, соответствующих данным siPHK (мишеням РНК-интерференции) (Таблица 2). В клетках человека на генетических конструкциях экспрессируется вставка, содержащая палиндромы. Синтезированная РНК образует шпильки, которые является природным субстратом Дайсера, фермента, вырезающего 21 нуклеодидные дуплексы РНК из шпильки. Если Дайсер работает на дуплексе РНК длиной более 19 пар нуклеотидов (природный субстрат), то далее он, оставаясь связанным с двуспиральной siPHK, активно участвуют также и в ее "загрузке" в белковый комплекс RISC. В данном комплексе происходит "раскручивание" цепей siPHK и освобождение его от одной из них (от так называемой "passenger''-цепи). Если в комплексе остается антисмысловая siPHK, то она используется как "наводчик", узнающий комплементарную мишень в транскриптах клетки. После связывания комплекса с соответствующей мРНК происходит ее разрезание одним из его белков, что приводит к выключению экспрессии соответствующего гена вируса и нарушает его размножение в клетке-хозяине. В трансфецированных клетках мРНК Renilla, содержащая в 3′-некодирующей области испытываемую мишень РНК-интерференции, разрезается, что приводит к резкому снижению голубого свечения, вызываемого данной люциферазой (478 nm). Желто-зеленое свечение, вызываемое люциферазой светлячка Photinus pyralis (557 nm), кодируемой той же ДНК psiCHECK-2, служит внутренним контролем.
В настоящем исследовании использовали одиннадцать критериев для отбора последовательностей мишеней РНК-интерференции в мРНК гена CCR5. Они важны для того, чтобы именно антисмысловая цепь siPHK оставалась в комплексе RISC. Каждая из приведенных в Таблице 1 вставок в генетических конструкциях соответствует, по крайней мере, десяти из одиннадцати ниже перечисленных критериев, которые использовались для отбора коровых 19-нуклеотидних последовательностей siPHK:
- состав G/C 30-52%
- не менее 3 A/U в позициях 15-19 смысловой цепи
- отсутствие внутренних повторов
- А в позиции 19 смысловой цепи
- А в позиции 3 смысловой цепи
- U в позиции 10 смысловой цепи
- отсутствие G/C в позиции 19 смысловой цепи
- отсутствие G в позиции 13 смысловой цепи
- отсутствие гомополимерных трактов (А)4-5 или (Т)4-5 в смысловой цепи
- локализация мишени в консервативном районе генома вируса
- отсутствие гомологии с известными транскриптами генома человека.
Часть вышеперечисленных критериев отбора биологически активных siPHK опубликована [Reynolds A., Leake D., Boese Q., Scaringe S., Marshall W.S., Khvorova A. (2004) Rational siRNA design for RNA interference. Nature Biotechnol. 22, 326-330] и представлена на сайте http://www.dharmacon.com.
Приведенная в таблице 1 кассетная генетическая конструкция обеспечивают целенаправленное воздействие на мРНК вируса в клетках человека с помощью siPHK, продуцирующихся в клетках, а также на мРНК CCR5. Терапевтическим результатом такого воздействия является подавление репродукции ВИЧ-1 в клетках человека.
Для вируса иммунодефицита человека первого типа характерно быстрое возникновение и отбор мутантных вариантов, обладающих резистентностью к различным противовирусным препаратам. Для решения проблемы вирусной изменчивости получена кассетная генетическая конструкция, атакующая разные мишени и поэтому в значительной степени не зависящая от изменчивости вируса.
На фиг.1 приведена физическая карта вектора GeneClipU1-neo.
На фиг.2 приведена физическая карта вектора psiCHECK-2.
На фиг.3 представлены результаты проверки эффективности РНК-интерференции, вызываемой созданной кассетной генетической конструкцией на невирусной тест-системе.
Пример 1. Описание генетической конструкции и способа ее получения
Вектор GeneClipUl-neo зарегистрирован в GenBank (Accession # AC AY745746) имеет размер 4,758 kb (kilobases - тысяча пар оснований) и характеризуется тем, что содержит:
старт-сайт РНК полимеразы Т7: 1
U1 прмотор РНК полимеразы II человека: 46-438
10 bp спейсер: 439-448
U1 терминатор: 449-465
промотор РНК полимеразы SP6: 527-546
ранний энхансер/промотор вируса SV40: 798-1216
сигнал начала репликации вируса SV40: 1114-1179
ген neo: 1251-2045
синтетический поли(А): 2080-2128
ген β-лактамазы: 3080-3940
промотор РНК полимеразы Т7: 4742-3.
В данный вектор, который поставляется Promega в линейной форме, вставляют химически синтезированные олигонуклеотиды ДНК, которые соответствуют генетическим конструкциям, продуцирующим шпильки РНК (Таблица 1).
Вектор psiCHECK-2 зарегистрирован в GenBank (Accession # AY535007), имеет размер 6,27 kb и характеризуется тем, что содержит:
ранний энхансер/промотор вируса SV40: 7-425
химерный интрон: 489-621
промотор РНК полимеразы Т7: 666-684
ген люциферазы Relilla: 694-1629
полилинкер: 1636-1680
синтетический поли(А): 1688-1736
промотор HSK-TK: 1744-2496
ген люциферазы светлячка: 2532-4184
поздний сигнал поли(А) SV40: 4219-4440
ген β-лактамазы: 4587-5447.
В данном векторе в сайты XhoI и NotI полилинкера вставляют химически синтезированные олигонуклеотиды ДНК, которые соответствуют выбранным мишеням РНК-интерференции (Таблица 2).
Пример 2. Оценка эффективности РНК-интерференции, вызываемой созданными генетическими конструкциями в невирусной системе
Накануне проведения ко-трансфекции (за 18-20 часов) клетки НЕК293 рассевают в лунки 24-луночного планшета Nunc по 50 тыс.клеток в 500 мкл культуральной среды DMEM (ПанЭко), содержащей глютамин и сыворотку (полная среда), на лунку. В день эксперимента готовят пробы ДНК для ко-трансфекции при комнатной температуре следующим образом (на одну экспериментальную точку). В 200 мкл среды DMEM, не содержащей сыворотки (SFM), добавляют 100 ng ДНК генетической конструкции в векторе GeneClip-U1-neo (см. Таблицу 1) и 10 ng ДНК плазмиды, содержащей соответствующие клонированные домены в векторе psiCHECK-2 (см. Таблицу 2). После перемешивания добавляют 1 мкл свежеразмороженного реагента TransFast (Promega), встряхивают смесь и инкубируют ее 15 мин. Затем отсасывают среду из лунок с "сидящими" клетками, встряхивают пробирку со смесью ДНК-TransFast и сразу добавляют смесь в лунки с клетками. После инкубации 1 час при 37°С в СО2-инкубаторе добавляют в лунки по 600 мкл среды с сывороткой, перемешивают и нкубируют планшет 48-72 час.
Для измерения экспрессии люцифераз среду над клетками в лунках планшета отсасывают, добавляют 100 мкл раствора трипсина-ЭДТА (ПанЭко) на лунку, после 10 мин инкубации при 37°С в СО2-инкубаторе добавляют по 100 мкл полной среды, переносят полностью суспензию клеток в пробирку эппердорф на 0.5 мл, осаждают центрифугированием при комнатной температуре в центрифуге Eppendorf (5 мин - 2000 rpm), надосадочную жидкость отсасывают, суспендируют клетки в 70 мкл 1xPBS и проводят измерение свечения люцифераз светлячка и Renilla согласно рекомендациям к набору Dual-Luciferase Reporter Assay System (Promega) на люминометре Reporter Microplate Luminometer (Turner BioSystems). На фиг.3 показаны результаты испытания генетических конструкций на невирусной системе. Видно, что генетические конструкции специфически подавляют экспрессию мишеней на 60-96%.
Claims (1)
- Кассетная генетическая конструкция anti-HIV-1-anti-HIV-2-anti-CCR5-8 на основе вектора GeneClip-U1-neo, содержащего вставку в области одноцепочечных кончиков, указанных на рис.1, продуцирующая три siPHK-ингибиторы репродукции вируса иммунодефицита человека 1 типа и экспрессии гена CCR5 человека и содержащая два фрагмента генома ВИЧ-1 длиной 27 bp каждый, соответствующие двум консервативным районам домена обратной транскриптазы генома ВИЧ-1 (область вируса 2435..2461 показана в первой строке, а его область 2304..2330 - во второй строке), а также 19 bp область, соответствующую гену CCR5 (47..65, приведена в третьей строке):
5′AAACATCAGAAAGAACCTCCATTCCTTttcaagagaAAGGAATGGAGGTTCTTTCTGATGTTTgcgaattctgCAGAAATAGTGATCTACCAATACATGGactgtccttcCCATGTATTGGTAGATCACTATTTCTGatggatcctcGGAACAAGATGGATTATCActtcctgtcaTGATAATCCATCTTGTTCC 3′,
где строчными буквами показаны области петель между частями палиндромов, способными образовать двуспиральные дуплексы.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2009142859/10A RU2425150C1 (ru) | 2009-11-23 | 2009-11-23 | КАССЕТНАЯ ГЕНЕТИЧЕСКАЯ КОНСТРУКЦИЯ, ЭКСПРЕССИРУЮЩАЯ ТРИ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫЕ siPHK, ЭФФЕКТИВНО АТАКУЮЩИЕ ТРАНСКРИПТЫ ВИРУСА ИММУНОДЕФИЦИТА ЧЕЛОВЕКА И ГЕНА CCR5 С ПОМОЩЬЮ PHK-ИНТЕРФЕРЕНЦИИ |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2009142859/10A RU2425150C1 (ru) | 2009-11-23 | 2009-11-23 | КАССЕТНАЯ ГЕНЕТИЧЕСКАЯ КОНСТРУКЦИЯ, ЭКСПРЕССИРУЮЩАЯ ТРИ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫЕ siPHK, ЭФФЕКТИВНО АТАКУЮЩИЕ ТРАНСКРИПТЫ ВИРУСА ИММУНОДЕФИЦИТА ЧЕЛОВЕКА И ГЕНА CCR5 С ПОМОЩЬЮ PHK-ИНТЕРФЕРЕНЦИИ |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2009142859A RU2009142859A (ru) | 2011-05-27 |
| RU2425150C1 true RU2425150C1 (ru) | 2011-07-27 |
Family
ID=44734465
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2009142859/10A RU2425150C1 (ru) | 2009-11-23 | 2009-11-23 | КАССЕТНАЯ ГЕНЕТИЧЕСКАЯ КОНСТРУКЦИЯ, ЭКСПРЕССИРУЮЩАЯ ТРИ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫЕ siPHK, ЭФФЕКТИВНО АТАКУЮЩИЕ ТРАНСКРИПТЫ ВИРУСА ИММУНОДЕФИЦИТА ЧЕЛОВЕКА И ГЕНА CCR5 С ПОМОЩЬЮ PHK-ИНТЕРФЕРЕНЦИИ |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2425150C1 (ru) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2552486C2 (ru) * | 2013-01-21 | 2015-06-10 | Федеральное Государственное Бюджетное Учреждение Науки Институт Молекулярной Биологии Им. В.А. Энгельгардта Российской Академии Наук (Имб Ран) | КАССЕТНАЯ ГЕНЕТИЧЕСКАЯ КОНСТРУКЦИЯ, ЭКСПРЕССИРУЮЩАЯ ДВЕ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫЕ siPHK, ЭФФЕКТИВНО АТАКУЮЩИЕ ТРАНСКРИПТЫ ВИЧ-1 СУБТИПА А У БОЛЬНЫХ В РОССИИ, НАПРАВЛЕННЫЕ НА мPHK ОБРАТНОЙ ТРАНСКРИТАЗЫ И ИНТЕГРАЗЫ, И ОДНУ siPHK, НАПРАВЛЕННУЮ НА мPHK ГЕНА CCR5 |
| RU2552607C2 (ru) * | 2012-09-27 | 2015-06-10 | Федеральное Государственное Бюджетное Учреждение Науки Институт Молекулярной Биологии Им. В.А. Энгельгардта Российской Академии Наук (Имб Ран) | КАССЕТНАЯ ГЕНЕТИЧЕСКАЯ КОНСТРУКЦИЯ, ЭКСПРЕССИРУЮЩАЯ ДВЕ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫЕ siPHK, ЭФФЕКТИВНО АТАКУЮЩИЕ ТРАНСКРИПТЫ ВИЧ-1 СУБТИПА А У БОЛЬНЫХ В РОССИИ, И ОДНУ siPHK, НАПРАВЛЕННУЮ НА мРНК ГЕНА CCR5 |
| RU2607381C1 (ru) * | 2015-06-22 | 2017-01-10 | Федеральное Государственное Бюджетное Учреждение Науки Институт Молекулярной Биологии Им. В.А. Энгельгардта Российской Академии Наук (Имб Ран) | Кассетная генетическая конструкция, экспрессирующая две биологически активные siPHK, эффективно атакующие мишени в мРНК обратной транскриптазы ВИЧ-1 субтипа А у больных в России, и одну siPHK, направленную на мРНК гена CCR5 |
| RU2630644C1 (ru) * | 2016-10-04 | 2017-09-11 | Федеральное Государственное Бюджетное Учреждение Науки Институт Молекулярной Биологии Им. В.А. Энгельгардта Российской Академии Наук (Имб Ран) | Кассетная генетическая конструкция, экспрессирующая две биологически активные siPHK, эффективно атакующие мишени в мРНК генов vpu и env ВИЧ-1 субтипа А у больных в России, и одну siPHK, направленную на мРНК гена CCR5 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2324738C2 (ru) * | 2006-06-16 | 2008-05-20 | Федеральное государственное учреждение науки "Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФГУН ГНЦ ВБ "Вектор" Роспотребнадзора) | ГЕНЕТИЧЕСКАЯ КОНСТРУКЦИЯ НА ОСНОВЕ ВЕКТОРНОЙ ПЛАЗМИДЫ pEGFP-N1, ПРОДУЦИРУЮЩАЯ siPHK-ИНГИБИТОРЫ РЕПРОДУКЦИИ ВИРУСА ИММУНОДЕФИЦИТА ЧЕЛОВЕКА 1 ТИПА (ЕЕ ВАРИАНТЫ) |
-
2009
- 2009-11-23 RU RU2009142859/10A patent/RU2425150C1/ru active
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2324738C2 (ru) * | 2006-06-16 | 2008-05-20 | Федеральное государственное учреждение науки "Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФГУН ГНЦ ВБ "Вектор" Роспотребнадзора) | ГЕНЕТИЧЕСКАЯ КОНСТРУКЦИЯ НА ОСНОВЕ ВЕКТОРНОЙ ПЛАЗМИДЫ pEGFP-N1, ПРОДУЦИРУЮЩАЯ siPHK-ИНГИБИТОРЫ РЕПРОДУКЦИИ ВИРУСА ИММУНОДЕФИЦИТА ЧЕЛОВЕКА 1 ТИПА (ЕЕ ВАРИАНТЫ) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2552607C2 (ru) * | 2012-09-27 | 2015-06-10 | Федеральное Государственное Бюджетное Учреждение Науки Институт Молекулярной Биологии Им. В.А. Энгельгардта Российской Академии Наук (Имб Ран) | КАССЕТНАЯ ГЕНЕТИЧЕСКАЯ КОНСТРУКЦИЯ, ЭКСПРЕССИРУЮЩАЯ ДВЕ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫЕ siPHK, ЭФФЕКТИВНО АТАКУЮЩИЕ ТРАНСКРИПТЫ ВИЧ-1 СУБТИПА А У БОЛЬНЫХ В РОССИИ, И ОДНУ siPHK, НАПРАВЛЕННУЮ НА мРНК ГЕНА CCR5 |
| RU2552486C2 (ru) * | 2013-01-21 | 2015-06-10 | Федеральное Государственное Бюджетное Учреждение Науки Институт Молекулярной Биологии Им. В.А. Энгельгардта Российской Академии Наук (Имб Ран) | КАССЕТНАЯ ГЕНЕТИЧЕСКАЯ КОНСТРУКЦИЯ, ЭКСПРЕССИРУЮЩАЯ ДВЕ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫЕ siPHK, ЭФФЕКТИВНО АТАКУЮЩИЕ ТРАНСКРИПТЫ ВИЧ-1 СУБТИПА А У БОЛЬНЫХ В РОССИИ, НАПРАВЛЕННЫЕ НА мPHK ОБРАТНОЙ ТРАНСКРИТАЗЫ И ИНТЕГРАЗЫ, И ОДНУ siPHK, НАПРАВЛЕННУЮ НА мPHK ГЕНА CCR5 |
| RU2607381C1 (ru) * | 2015-06-22 | 2017-01-10 | Федеральное Государственное Бюджетное Учреждение Науки Институт Молекулярной Биологии Им. В.А. Энгельгардта Российской Академии Наук (Имб Ран) | Кассетная генетическая конструкция, экспрессирующая две биологически активные siPHK, эффективно атакующие мишени в мРНК обратной транскриптазы ВИЧ-1 субтипа А у больных в России, и одну siPHK, направленную на мРНК гена CCR5 |
| RU2630644C1 (ru) * | 2016-10-04 | 2017-09-11 | Федеральное Государственное Бюджетное Учреждение Науки Институт Молекулярной Биологии Им. В.А. Энгельгардта Российской Академии Наук (Имб Ран) | Кассетная генетическая конструкция, экспрессирующая две биологически активные siPHK, эффективно атакующие мишени в мРНК генов vpu и env ВИЧ-1 субтипа А у больных в России, и одну siPHK, направленную на мРНК гена CCR5 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2009142859A (ru) | 2011-05-27 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US9163241B2 (en) | Cell-type specific aptamer-siRNA delivery system for HIV-1 therapy | |
| US8497364B2 (en) | Triggered RNAi | |
| US20080214488A1 (en) | TRIGGERED RNAi | |
| US20170283802A1 (en) | Design of nucleic acid binding molecules with non-watson crick and non-canonical pairing based on artificial mutation consensus sequences to counter escape mutations | |
| JP2010029212A (ja) | Ｃ型肝炎ウイルスの働きを阻害するオリゴリボヌクレオチドまたはペプチド核酸 | |
| US9222090B2 (en) | RNA interference target for treating AIDS | |
| EP1799824A2 (en) | Nucleic acids against viruses, in particular hiv | |
| RU2425150C1 (ru) | КАССЕТНАЯ ГЕНЕТИЧЕСКАЯ КОНСТРУКЦИЯ, ЭКСПРЕССИРУЮЩАЯ ТРИ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫЕ siPHK, ЭФФЕКТИВНО АТАКУЮЩИЕ ТРАНСКРИПТЫ ВИРУСА ИММУНОДЕФИЦИТА ЧЕЛОВЕКА И ГЕНА CCR5 С ПОМОЩЬЮ PHK-ИНТЕРФЕРЕНЦИИ | |
| RU2385939C1 (ru) | Генетические конструкции, атакующие шесть новых мишеней рнк-интерференции в транскриптах вируса иммунодефицита человека 1 типа и подавляющие репродукцию вируса в клетках человека | |
| Moelling et al. | Silencing of HIV by hairpin-loop-structured DNA oligonucleotide | |
| RU2630644C1 (ru) | Кассетная генетическая конструкция, экспрессирующая две биологически активные siPHK, эффективно атакующие мишени в мРНК генов vpu и env ВИЧ-1 субтипа А у больных в России, и одну siPHK, направленную на мРНК гена CCR5 | |
| RU2552607C2 (ru) | КАССЕТНАЯ ГЕНЕТИЧЕСКАЯ КОНСТРУКЦИЯ, ЭКСПРЕССИРУЮЩАЯ ДВЕ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫЕ siPHK, ЭФФЕКТИВНО АТАКУЮЩИЕ ТРАНСКРИПТЫ ВИЧ-1 СУБТИПА А У БОЛЬНЫХ В РОССИИ, И ОДНУ siPHK, НАПРАВЛЕННУЮ НА мРНК ГЕНА CCR5 | |
| RU2552486C2 (ru) | КАССЕТНАЯ ГЕНЕТИЧЕСКАЯ КОНСТРУКЦИЯ, ЭКСПРЕССИРУЮЩАЯ ДВЕ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫЕ siPHK, ЭФФЕКТИВНО АТАКУЮЩИЕ ТРАНСКРИПТЫ ВИЧ-1 СУБТИПА А У БОЛЬНЫХ В РОССИИ, НАПРАВЛЕННЫЕ НА мPHK ОБРАТНОЙ ТРАНСКРИТАЗЫ И ИНТЕГРАЗЫ, И ОДНУ siPHK, НАПРАВЛЕННУЮ НА мPHK ГЕНА CCR5 | |
| RU2607381C1 (ru) | Кассетная генетическая конструкция, экспрессирующая две биологически активные siPHK, эффективно атакующие мишени в мРНК обратной транскриптазы ВИЧ-1 субтипа А у больных в России, и одну siPHK, направленную на мРНК гена CCR5 | |
| JP2015109842A (ja) | Ｃ型肝炎ウイルスの働きを阻害するオリゴリボヌクレオチドまたはペプチド核酸 | |
| CN102965372A (zh) | 一种干涉GDF9基因表达的 siRNA及其应用 | |
| RU2650774C1 (ru) | Эффективные мишени РНК-интерференции в геноме ВИЧ-1 и субстраты Дайсера, предназначенные для их поражения | |
| Ren et al. | Construction, modification and evaluation of apolipoprotein AI promoter-driven shRNA expression vectors against hTERT | |
| WO2006090906A1 (ja) | RNAi耐性ウイルス株を克服する新手法 | |
| WO2024154163A1 (en) | Product comprising an aptamer conjugated to the edited mirna mir-589-3p and medical uses thereof | |
| JP5263729B2 (ja) | ネコ伝染性腹膜炎ウイルス（ｆｉｐｖ）の予防及び治療剤 | |
| Lim | Promoter targeted siRNAs induce transcriptional gene silencing (TGS) in Simian Immunodeficiency Virus (SIV) | |
| CA2700522A1 (en) | Novel hiv targets | |
| JP2013223426A (ja) | Ｒｒｍ２のアンタゴニストを有効成分として含有するｃ型肝炎治療剤 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PD4A | Correction of name of patent owner | ||
| PC41 | Official registration of the transfer of exclusive right |
Effective date: 20170227 |