RU2551235C2 - Гуманизированное моноклональное антитело, специфичное к синдекану-1 - Google Patents
Гуманизированное моноклональное антитело, специфичное к синдекану-1 Download PDFInfo
- Publication number
- RU2551235C2 RU2551235C2 RU2013139743/10A RU2013139743A RU2551235C2 RU 2551235 C2 RU2551235 C2 RU 2551235C2 RU 2013139743/10 A RU2013139743/10 A RU 2013139743/10A RU 2013139743 A RU2013139743 A RU 2013139743A RU 2551235 C2 RU2551235 C2 RU 2551235C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- antibody
- syndecan
- cells
- antibodies
- amino acid
- Prior art date
Links
- 108090000058 Syndecan-1 Proteins 0.000 title claims abstract description 41
- 102000003705 Syndecan-1 Human genes 0.000 title abstract description 39
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 37
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 29
- 102100035721 Syndecan-1 Human genes 0.000 claims abstract description 26
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims abstract description 22
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract description 14
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims abstract description 11
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 claims abstract description 10
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 claims abstract description 10
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 claims abstract description 9
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims abstract description 9
- 241001529936 Murinae Species 0.000 claims abstract description 8
- 230000004540 complement-dependent cytotoxicity Effects 0.000 claims abstract description 7
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims abstract description 7
- 230000028327 secretion Effects 0.000 claims abstract description 4
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 8
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 claims description 6
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 4
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims 2
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 claims 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 abstract description 9
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 9
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 abstract description 7
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 abstract description 4
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 abstract description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 abstract description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 abstract description 2
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 abstract 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 abstract 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 18
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 14
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 14
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 14
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 13
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 12
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 10
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 10
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 9
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 8
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 8
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 7
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 7
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 6
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 6
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 6
- 238000000034 method Methods 0.000 description 6
- 239000000047 product Substances 0.000 description 6
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 5
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 5
- 229940041181 antineoplastic drug Drugs 0.000 description 5
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 5
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 5
- NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 1-methylethyl 11-methoxy-3,7,11-trimethyl-2,4-dodecadienoate Chemical compound COC(C)(C)CCCC(C)CC=CC(C)=CC(=O)OC(C)C NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 4
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 4
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 4
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 4
- 210000004754 hybrid cell Anatomy 0.000 description 4
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 4
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 4
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 4
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 4
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 3
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000011729 BALB/c nude mouse Methods 0.000 description 3
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 3
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 3
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 3
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 3
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 3
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 230000001028 anti-proliverative effect Effects 0.000 description 3
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 3
- 238000004422 calculation algorithm Methods 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 3
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 3
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 3
- 230000006870 function Effects 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 3
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 3
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 3
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 3
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 3
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UZOVYGYOLBIAJR-UHFFFAOYSA-N 4-isocyanato-4'-methyldiphenylmethane Chemical compound C1=CC(C)=CC=C1CC1=CC=C(N=C=O)C=C1 UZOVYGYOLBIAJR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010032595 Antibody Binding Sites Proteins 0.000 description 2
- 241001198387 Escherichia coli BL21(DE3) Species 0.000 description 2
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 2
- 239000012163 TRI reagent Substances 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 2
- 230000000172 allergic effect Effects 0.000 description 2
- 208000030961 allergic reaction Diseases 0.000 description 2
- 208000010668 atopic eczema Diseases 0.000 description 2
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 2
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 2
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 239000013522 chelant Substances 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 230000004154 complement system Effects 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 2
- 239000002254 cytotoxic agent Substances 0.000 description 2
- 229940127089 cytotoxic agent Drugs 0.000 description 2
- 231100000599 cytotoxic agent Toxicity 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 2
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 2
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 2
- 244000144993 groups of animals Species 0.000 description 2
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 2
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 2
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 2
- 229940127121 immunoconjugate Drugs 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 2
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 2
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 2
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 2
- 239000012514 monoclonal antibody product Substances 0.000 description 2
- 229940126619 mouse monoclonal antibody Drugs 0.000 description 2
- 229920002704 polyhistidine Polymers 0.000 description 2
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 2
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 2
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CXNPLSGKWMLZPZ-GIFSMMMISA-N (2r,3r,6s)-3-[[(3s)-3-amino-5-[carbamimidoyl(methyl)amino]pentanoyl]amino]-6-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)-3,6-dihydro-2h-pyran-2-carboxylic acid Chemical compound O1[C@@H](C(O)=O)[C@H](NC(=O)C[C@@H](N)CCN(C)C(N)=N)C=C[C@H]1N1C(=O)N=C(N)C=C1 CXNPLSGKWMLZPZ-GIFSMMMISA-N 0.000 description 1
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100038740 Activator of RNA decay Human genes 0.000 description 1
- 241000272522 Anas Species 0.000 description 1
- 102100022005 B-lymphocyte antigen CD20 Human genes 0.000 description 1
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 208000024172 Cardiovascular disease Diseases 0.000 description 1
- 206010057248 Cell death Diseases 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102000001301 EGF receptor Human genes 0.000 description 1
- 108060006698 EGF receptor Proteins 0.000 description 1
- 102000009109 Fc receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010087819 Fc receptors Proteins 0.000 description 1
- 206010016654 Fibrosis Diseases 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- 108010014095 Histidine decarboxylase Proteins 0.000 description 1
- 102100037095 Histidine decarboxylase Human genes 0.000 description 1
- 101000897405 Homo sapiens B-lymphocyte antigen CD20 Proteins 0.000 description 1
- 101100369992 Homo sapiens TNFSF10 gene Proteins 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 108010058846 Ovalbumin Proteins 0.000 description 1
- 206010033128 Ovarian cancer Diseases 0.000 description 1
- 206010061535 Ovarian neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 208000005718 Stomach Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 108010076818 TEV protease Proteins 0.000 description 1
- 102000046283 TNF-Related Apoptosis-Inducing Ligand Human genes 0.000 description 1
- 108700012411 TNFSF10 Proteins 0.000 description 1
- 102000005789 Vascular Endothelial Growth Factors Human genes 0.000 description 1
- 108010019530 Vascular Endothelial Growth Factors Proteins 0.000 description 1
- 108010084455 Zeocin Proteins 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 208000026935 allergic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000007815 allergy Effects 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000002001 anti-metastasis Effects 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 238000011319 anticancer therapy Methods 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000397 bevacizumab Drugs 0.000 description 1
- CXNPLSGKWMLZPZ-UHFFFAOYSA-N blasticidin-S Natural products O1C(C(O)=O)C(NC(=O)CC(N)CCN(C)C(N)=N)C=CC1N1C(=O)N=C(N)C=C1 CXNPLSGKWMLZPZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 238000010805 cDNA synthesis kit Methods 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 229910002091 carbon monoxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000032823 cell division Effects 0.000 description 1
- 230000012292 cell migration Effects 0.000 description 1
- 229960005395 cetuximab Drugs 0.000 description 1
- 238000012710 chemistry, manufacturing and control Methods 0.000 description 1
- OEYIOHPDSNJKLS-UHFFFAOYSA-N choline Chemical compound C[N+](C)(C)CCO OEYIOHPDSNJKLS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960001231 choline Drugs 0.000 description 1
- 238000011097 chromatography purification Methods 0.000 description 1
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 description 1
- 208000029742 colonic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 238000005138 cryopreservation Methods 0.000 description 1
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 description 1
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- IJKVHSBPTUYDLN-UHFFFAOYSA-N dihydroxy(oxo)silane Chemical compound O[Si](O)=O IJKVHSBPTUYDLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000003255 drug test Methods 0.000 description 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 1
- 230000029578 entry into host Effects 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 102000052116 epidermal growth factor receptor activity proteins Human genes 0.000 description 1
- 108700015053 epidermal growth factor receptor activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 230000004761 fibrosis Effects 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 230000015788 innate immune response Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 230000008611 intercellular interaction Effects 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 229920006008 lipopolysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 230000008774 maternal effect Effects 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 201000005299 metal allergy Diseases 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 238000000302 molecular modelling Methods 0.000 description 1
- 238000002887 multiple sequence alignment Methods 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- YOHYSYJDKVYCJI-UHFFFAOYSA-N n-[3-[[6-[3-(trifluoromethyl)anilino]pyrimidin-4-yl]amino]phenyl]cyclopropanecarboxamide Chemical compound FC(F)(F)C1=CC=CC(NC=2N=CN=C(NC=3C=C(NC(=O)C4CC4)C=CC=3)C=2)=C1 YOHYSYJDKVYCJI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 230000000771 oncological effect Effects 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 229940092253 ovalbumin Drugs 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 229960001972 panitumumab Drugs 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 238000002823 phage display Methods 0.000 description 1
- 210000001539 phagocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- CWCMIVBLVUHDHK-ZSNHEYEWSA-N phleomycin D1 Chemical compound N([C@H](C(=O)N[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)NCCC=1SC[C@@H](N=1)C=1SC=C(N=1)C(=O)NCCCCNC(N)=N)[C@@H](O[C@H]1[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)O[C@@H]1[C@H]([C@@H](OC(N)=O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)C=1N=CNC=1)C(=O)C1=NC([C@H](CC(N)=O)NC[C@H](N)C(N)=O)=NC(N)=C1C CWCMIVBLVUHDHK-ZSNHEYEWSA-N 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 210000002307 prostate Anatomy 0.000 description 1
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 108090000589 ribonuclease E Proteins 0.000 description 1
- 229960004641 rituximab Drugs 0.000 description 1
- 101150099588 rne gene Proteins 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000013515 script Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 230000000392 somatic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002594 sorbent Substances 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 210000004988 splenocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000012430 stability testing Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000008174 sterile solution Substances 0.000 description 1
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 1
- 201000000498 stomach carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 231100000048 toxicity data Toxicity 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 1
- 229960000575 trastuzumab Drugs 0.000 description 1
- 230000005748 tumor development Effects 0.000 description 1
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- 239000008215 water for injection Substances 0.000 description 1
- -1 when using it Chemical class 0.000 description 1
- NWONKYPBYAMBJT-UHFFFAOYSA-L zinc sulfate Chemical compound [Zn+2].[O-]S([O-])(=O)=O NWONKYPBYAMBJT-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229960001763 zinc sulfate Drugs 0.000 description 1
- 229910000368 zinc sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Данное изобретение относится к иммунологии, биотехнологии и медицине, а именно к области противоопухолевых лекарственных препаратов на основе моноклональных антител, и может быть использовано в медицине для лечения онкологических заболеваний. Предложено гуманизированное моноклональное антитело (MAb), специфичное к синдекану-1 (CD138), охарактеризованное аминокислотными и нуклеотидными последовательностями. Антитело по настоящему изобретению принадлежит изотипу IgG4 каппа, при этом константные фрагменты полностью человеческие и модифицированы введением участков IgG3, придающих антителу самостоятельную антитело-зависимую и комплемент-зависимую цитотоксичность, и аминокислотных замен, позволяющих увеличить время полужизни антитела. Вариабельные области представлены мышиными гипервариабельными и человеческими каркасными участками, обеспечивающими увеличение аффинности связывания с лигандом. Каждая цепь дополнительно содержит сигнальную секреторную последовательность на N-конце, отщепляющуюся при секреции из клеток-продуцентов. Нуклеотидные последовательности оптимизированы для увеличения продукции антитела в клетках млекопитающих. Настоящее изобретение может найти дальнейшее применение в терапии заболеваний, ассоциированных с CD138, в том числе злокачественных опухолей (рака). 1 з.п. ф-лы, 2 ил., 3 пр.
Description
Область техники, к которой относится изобретение
Данное изобретение относится к иммунологии, биотехнологии и медицине, а именно к области противоопухолевых лекарственных препаратов на основе моноклональных антител, и может быть использовано в медицине для лечения онкологических заболеваний.
Предшествующий уровень техники
Онкологические заболевания стоят на втором месте по смертности в мире после сердечно-сосудистых заболеваний [1]. За последние 10 лет число заболевших онкологическими заболеваниями, по разным данным, возросло на 15%. Ежегодно в России регистрируется более 490 тысяч новых пациентов, 2,5 миллиона находятся под наблюдением и более 290 тысяч больных ежегодно умирает от различных форм рака. Ввиду этого целесообразны разработка и создание безопасных, эффективных и доступных противоопухолевых препаратов.
Одним из типов противоопухолевых препаратов являются продукты биотехнологического синтеза - моноклональные антитела (Mab). Известен ряд фармакологических решений, в их числе Mab к рецептору эпидермального фактора роста, вазоэндотелиальному фактору роста, которые имеют доказанное значение для жизнедеятельности опухолевых клеток и малозначимы для функционирования нормальных клеток различных тканей организма [2].
В настоящее время в мире зарегистрировано и производится около десяти противоопухолевых препаратов на основе моноклональных антител, в частности Ритуксимаб (Mab к рецептору CD20), Трастузумаб (мишенью является рецептор HER2neu), Бевацизумаб (VEGF), Цетуксимаб и Панитумумаб (EGFR). Зарегистрированных препаратов, мишенью которых является поверхностный антиген синдекан-1 (CD138), в настоящее время не существует.
Белок синдекан-1 (CD138) [4] является перспективной мишенью противоопухолевой терапии моноклональными антителами: доказана важная роль данной молекулы в жизнедеятельности опухолевых клеток и показана ее малая значимость для функционирования нормальных клеток различных тканей организма [5].
Данная молекула обеспечивает межклеточные взаимодействия и взаимодействия между клетками и матриксом, адгезию и миграцию. Гиперэкспрессия CD138 была продемонстрирована в большинстве (около 90%) клеток различных опухолей, включая рак молочной железы, толстой кишки и желудка, предстательной железы и других эпителиальных злокачественных опухолей [6, 7]. Также описано такое явление, как потеря синдекана-1 с поверхности миеломных клеток с накоплением его в строме, как правило, в участках фиброза [8]. Показано, что при потере синдекана-1 миеломные клетки вступают в TRAIL - индуцированный апоптоз [9]. Функционально Синдекан-1 связан со способностью опухолевых клеток к инвазивному росту и метастазированию. В аспекте лечения злокачественных опухолей активность CD138 сопряжена с теми свойствами опухолевых клеток, которые практически не поддаются существующей терапии.
Показана локализация CD138 на поверхности опухолевых клеток в форме, доступной для узнавания антителами [10]. Более того, имеются данные об эффективности вакцинации с использованием в качестве антигена CD138 [11].
Известны мышиные антитела к синдекану-1 - В-В4 (IgG1) [13], В-В2 (IgG2b), а также химерные [8, 14] - МП5 (IgG1κ) и конъюгаты таковых с метками [12] [3]. Такие соединения используют в исследовательских или диагностических целях, причем антитело выполняет лишь функцию нацеливания [8, 14]. Цитотоксическую функцию выполняют эффекторные молекулы, как правило, конъюгированные с антителом [16, 17, 18]. Мышиные и кроличьи Mab иммунная система человека воспринимает как чужеродные, за счет различий в константной части антител (СН, CL), и запускает против них иммунный ответ. Для применения у людей разрабатывают химерные антитела, константная часть которых - человека, а вариабельная (VH, VL) - мыши. С использованием данной модификации удается получить более безопасные Mab.
Известно рекомбинантное антитело к синдекану-1 (OC-46F2), созданное в результате in vitro селекции библиотеки для фагового дисплея (ETH-2-Gold) человеческих антител на клетках меланомы человека и дальнейшей экспрессии полученных генов в клетках млекопитающих [26]. Показано, что данное антитело ингибирует созревание сосудов и опухолевый рост в экспериментальной модели человеческой меланомы (на мышах), а также эффективно в терапевтическом плане в отношении экспериментальной модели человеческой карциномы рака яичника.
OC-46F2 представляет собой одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv) - гибридный белок из вариабельных фрагментов тяжелой (VH) и легкой (VL - лямбда) цепи иммуноглобулинов, соединенных коротким линкерным пептидом.
Данное соединение не содержит константные фрагменты антитела, вариабельные фрагменты молекулы обеспечивают только связывание с антигеном, что обуславливает показанное авторами сдерживающее действие. Однако для элиминации опухоли необходимо использование дополнительных действующих веществ, возможно, создание конъюгатов. Наблюдаем тот же недостаток, что и при использовании химерного антитела.
Прототипом предлагаемого изобретения является химерное моноклональное антитело к CD138 подкласса IgG4 [15]. Однако данное Mab обеспечивает лишь нацеливание цитотоксического агента, конъюгированного с ним (DM4).
Таким образом, описанные на сегодняшний день мышиные антитела к CD138 непригодны для применения у людей ввиду высокой иммуногенности, их используют для лабораторных целей, химерные MAb не обладают самостоятельным терапевтическим действием - их используют только в качестве нацеливающего агента, а также могут быть иммуногенны. Нельзя исключать и индивидуальную реакцию пациента на то или иное Mab. Кроме того, действующий агент, который нацеливают с использованием антитела, или продукты его распада, могут являться стрессорным фактором для организма, ввиду их структуры, возможности и периода распада данного вещества, характера соединений, на которое он распадается. Точная структура природных моноклональных антител человека к синдекану-1 не установлена.
Учитывая функциональную роль синдекана-1 в инвазивном росте и метастазировании опухолей, создание антител к нему, обладающих самостоятельной высокой цитотоксичностью, наряду с более высокой аффинностью и более низкой иммуногенностью, является актуальной задачей.
Данная задача решена предложенным изобретением.
Технический результат от использования предлагаемого антитела к CD138 выражается, как минимум, в увеличении спектра MAb к CD138, используемых в терапии опухолевых заболеваний, что позволяет проводить им лечение при индивидуальной непереносимости или плохой переносимости аналогов.
Технический результат от использования предлагаемого антитела к CD138 выражается в увеличении аффинности к антигену, и, соответственно, эффективности антитела. Указанный технический результат достигается гуманизацией антитела: использование каркасных участков человеческого антитела позволяет более точно сориентировать гипервариабельные участки, что увеличивает соответствие эпитопа и паратопа и, соответственно, аффинность.
Технический результат от использования предлагаемого антитела к CD138 также выражается в индукции цитотоксичности. Указанный технический результат достигается тем, что в константный фрагмент тяжелой цепи антитела типа IgG4 введены участки цепей IgG3, опосредующие антитело- и комплемент-зависимую цитотоксичность.
Технический результат от использования предлагаемого антитела к CD138 также выражается в уменьшении иммуногенности за счет гуманизации антитела.
Технический результат от использования предлагаемого антитела к CD138 также выражается в уменьшении стрессорного воздействия на организм противоопухолевого препарата, за счет того что действующим веществом является сама молекула моноклонального антитела - по природе белок, который впоследствии деградирует до аминокислот, т.е. при его использовании исключаются какие-либо последствия возможного невыведения из организма в течение какого-либо времени действующего агента (химического вещества небелковой природы), либо продуктов его распада.
Технический результат от использования предлагаемого антитела к CD138 также выражается в увеличении срока полужизни антитела, что достигается введением аминокислотных замен на С-конце константной части тяжелой цепи. Это позволяет уменьшать дозировки, осуществлять меньшее количество введений антитела, что может снизить стоимость лечения.
Также техническим результатом является получение высокого уровня экспрессии антитела в клетках млекопитающих за короткий срок за счет кодонной оптимизации кодирующих последовательностей, а также введенной сигнальной секреторной последовательности на N-конце тяжелой и легкой цепи, что позволяет удешевить и ускорить производство.
Сущность изобретения
Задачей данного изобретения являлось создание универсального моноклонального антитела - к CD138, приемлемого для терапии опухолевых заболеваний, обладающего высокой аффинностью к антигену (к CD138), низкой иммуногенностью и высокой цитотоксичностью, а также длительным периодом полужизни, которое можно получать в больших количествах за короткий промежуток времени.
Данная задача решена тем, что предложено моноклональное гуманизированное антитело к синдекану-1 (CD138), на основе IgG4, с введенными в CH фрагмент антитела участками IgG3, обуславливающими формирование антитело-зависимой и комплемент-зависимой цитотоксичности, с введенной сигнальной секреторной последовательностью на N-конце тяжелой и легкой цепи, отщепляющейся после секреции белков из клеток-продуцентов, а также аминокислотными заменами, увеличивающими период полужизни данного антитела; имеющее последовательность тяжелой цепи SEQ ID ΝΟ:1 и легкой цепи SEQ ID NO:2, закодированную в нуклеотидных последовательностях SEQ ID NO:3 и SEQ ID NO:4, кодонно оптимизированных для увеличенной экспрессии в клетках млекопитающих (СНО).
Предложенное гуманизированное антитело к CD138 высокоаффинно связывается с гиперэкспрессированным на опухолевых клетках синдеканом-1 за счет гуманизации вариабельных фрагментов. Гипервариабельные участки полученных самостоятельно в результате иммунизации синдеканом-1 моноклональных антител мыши перенесены в наиболее структурно гомологичные по ключевым позициям акцепторные антитела человека, каркасные участки которых позволяют более точно сориентировать гипервариабельные участки в пространстве, что увеличивает соответствие эпитопа и паратопа и, соответственно, обеспечивает более высокую по сравнению с химерными антителами аффинность к мишени. На N-конце тяжелой и легкой цепей введена сигнальная секреторная последовательность, отщепляющаяся после секреции белков из клеток-продуцентов.
Конструкция предлагаемого антитела способна обеспечить его самостоятельный цитотоксический эффект по антитело-зависимому и комплемент-зависимому механизмам за счет оптимизации последовательности константного фрагмента (IgG4-IgG3 shifting), что обеспечивает привлечение клеток иммунной системы. Это позволяет отказаться от использования цитотоксического агента, т.е. от процедур выбора характера его использования в совокупности с Mab (присоединения или совместного использования), процедуры его конъюгации с антителом, поддержания активности обоих компонентов и других вытекающих последствий.
Антитела IgG4 не активируют комплемент, в то время как IgG3 способны активировать каскад протеолитических реакций, осуществляемых системой комплемента.
Предложенное моноклональное антитело к синдекану-1 (CD138) содержит участки IgG3 - введены аминокислотные замены в тяжелой цепи, что обеспечивает индукцию антитело-зависимой и комплемент-зависимой цитотоксичности, а также аминокислотные замены для увеличения периода полужизни антитела на С-конце константной части тяжелой цепи.
Кодонная оптимизация нуклеотидных последовательностей (SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4), кодирующих антитело согласно изобретению (тяжелые и легкие цепи), наряду с введением сигнальной секреторной последовательности, позволила получить до 2 грамм целевого белка на литр при трех днях культивирования клеток млекопитающих - продуцентов(СНО).
Полученное гуманизированное моноклональное антитело характеризуется значением Kd: 8,0*10-9.
Для испытания моноклонального антитела использовали мышей BALB/C Nude, у которых аллергическая реакция может быть более выражена, чем у стандартных лабораторных мышей. Однако аллергическая реакция не наблюдалась, что позволяет предполагать, что разработанный препарат будет достаточно безопасен с точки зрения побочных аллергических эффектов.
Результаты испытания препарата на моделях in vivo показали, что у лабораторных животных наблюдался регресс опухоли, отсутствие метастазирования; животные, получавшие препарат, имели большую продолжительность жизни.
Результаты данных испытаний препарата можно интерпретировать как предварительные данные по токсичности.
Способность индукции антипролиферативной и противометастазной активности показана на клетках линии А431.
Таким образом, предложенное гуманизированное антитело к CD138 обладает противоопухолевым эффектом за счет блокирования опосредованных синдеканом-1 функций (адгезия, миграция опухолевых клеток) и индукции цитотоксического иммунного ответа, т.е. не только сдерживает рост опухоли и миграцию клеток, но и способствует их элиминации естественным путем.
Таким образом, появляется возможность не только диагностики, но и терапии онкологических заболеваний моноклональным антителом к CD138, заявленным в изобретении за счет индукции антитело- и комплемент-зависимой цитотоксичности в отношении опухолей, в которых гиперэкспрессирован синдекан-1, благодаря внесению соответствующих аминокислотных замен в константные участки антитела человека (IgG4-IgG3 shifting). При использовании данного изобретения достигается высокая эффективность терапии, за счет увеличения аффинности антиген-связывающего участка моноклонального антитела к синдекану-1. За счет внесения соответствующих аминокислотных замен увеличено также время полужизни антитела после введения в организм пациента. Кодонная оптимизация тяжелой и легкой цепей, а также введение сигнальной секреторной последовательности на N-конце тяжелой и легкой цепей позволяет получать антитело в больших количествах за малые сроки в клетках млекопитающих.
Предлагаемое Mab является безопасным для человека с точки зрения побочных аллергических эффектов благодаря гуманизации.
Краткое описание графических материалов
Фигура 1. Электрофореграмма, показывающая экспрессию гена, кодирующего синдекан-1, в используемой клеточной линии миеломы SP 2.0
1) контроль качества синтеза кДНК, результат проведения ПЦР с праймерами KG3PDH;
2) положительный контроль, ПЦР с праймерами, специфическими к последовательности ДНК, кодирующей CD138, с использованием в качестве матрицы плазмидной ДНК, содержащей клонированный ген синдекана-1;
3) ПЦР на кДНК из клеток миеломы с использованием праймеров, специфических к ДНК, кодирующей синдекан-1;
4) контроль экспрессии - ПЦР с использованием праймеров, специфических к ДНК, кодирующей синдекан-1, на тотальной РНК из клеток миеломы;
5) маркер молекулярного веса 1 кb DNA Ladder (Fermentas).
Фигура 2. Динамика развития миеломы SP 2.0 в мышах BALB/C в трех группах животных. Черный столбик - показатели контрольной группы, серый - группы мышей, которым вводили 1 мг препарата гуманизированного моноклонального антитела, заштрихованный - группы мышей, которым вводили 0,1 мг препарата гуманизированного моноклонального антитела.
ПРИМЕРЫ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Пример 1. Получение моноклонального гуманизированного антитела к синдекану-1.
1.1. Получение синдекана-1
Ген, кодирующий синдекан-1, был синтезирован посредством химико-ферментативного синтеза [20] соответствующего гена двуступенчатым методом. Полученный ген был клонирован в векторе pET151/D-TOPO, обеспечивающем высокий уровень синтеза рекомбинантного белка, сшитого с полигистидиновой последовательностью, для удобства дальнейшей очистки с помощью металлохелатной хроматографии, в результате которой можно получить белок в виде отдельной аминокислотной последовательности, без полигистидина и каких-либо других примесей, благодаря наличию сайта для TEV-протеазы, в клетках E.coli BL21(DE3)Star, которые содержат мутированный ген rne (rne131), кодирующий усеченную форму РНКазы Е, что уменьшает внутриклеточное разрушение мРНК, приводя к увеличению ее ферментативной стабильности и, соответственно, продукции белка. Получили экспрессию данного гена в клетках E.coli BL21(DE3)Star.
Рекомбинантный белок выделяли из клеток штамма BL21[DE3]Star pET151sind-1, растворив клетки в лизирующем буфере. Проводили очистку синдекана-1 с помощью металлохелатной хроматографии.
Препарат рекомбинантного белка имел чистоту 95-97% и был использован для получения гибридомы, продуцирующей моноклональные антитела мыши к синдекану-1 и тестирования полученных моноклональных антител.
1.2. Иммунизация мышей линии Balb/c синдеканом-1
Была проведена иммунизация мышей линии Balb/c, в качестве антигена использовали очищенный рекомбинантный белок синдекан-1. При первичной иммунизации мышам вводили подкожно 50 мкг антигена в полном адъюванте Фрейнда (ПАФ). Через 28 дней анализировали уровень иммунного ответа на введенный антиген, оценивая титр специфических сывороточных антител с помощью иммунноферментного анализа (ИФА). Животным с максимальным значением иммунного ответа повторно вводили подкожно 30 мкг антигена в неполном адъюванте Фрейнда (НАФ) и оценивали уровень вторичного иммунного ответа через 21 день, затем за 4-5 дней до проведения соматической гибридизации вводили 30 мкг антигена в физиологическом растворе (ФР) внутрибрюшинно.
1.3. Получение гибридомы, синтезирующей моноклональные антитела, специфичные к синдекану-1
В качестве партнеров по слиянию использовали спленоциты иммунизированных мышей с титром сывороточных антител к белку синдекан-1 примерно 1:30000 и клетки мышиной миеломы sp2/0-Ag14 (АТСС, CRL-1581) в соотношении 2:1. Гибридизацию проводили с использованием раствора полиэтиленгликоля (Sigma) в соответствии со стандартной методикой. Селекцию стабильных гибридных клеток проводили путем культивирования на среде IMDM (Iscove-s Modified Dulbecco Medium, Sigma), содержащей 10% сыворотки FCI (HyClone) и HAT (Gibco). Отбор клонов гибридных клеток, секретирующих антитела, специфичные к заданным антигенам, проводили с помощью иммуноферментного анализа (ИФА). В результате первичного скрининга было отобрано 10 клонов гибридных клеток, продуцирующих моноклональные антитела к синдекану-1. После проведения пяти клонирований было получено 4 стабильных продуцирующих клона. Из каждой из клеточных линий была выделена мРНК, кодирующая тяжелые и легкие цепи антитела к синдекану-1.
1.4. Получение нуклеотидных последовательностей тяжелых и легких цепей гуманизированного антитела к синдекану-1
Из стабильных клонов гибридных клеток, продуцирующих мышиные моноклональные антитела к синдекану-1, была выделена РНК с использованием набора «TRI Reagent» производства фирмы «Sigma», США, по инструкции изготовителя. На 5-10х106 клеток использовали 1 мл лизирующего раствора «TRI Reagent». Синтез кДНК проводили с помощью набора Revert Aid® First Strand cDNA Synthesis Kit (производства фирмы «Fermentas», Литва).
Амплификацию генов, кодирующих вариабельные фрагменты мышиных антител, проводили методом ПЦР с использованием специфических праймеров (5' вырожденных праймеров для отжига на неизвестных VH и VL участках) и в качестве матрицы синтезированной кДНК. Наработку фрагментов ДНК для клонирования проводили методом ПЦР с использованием высокоточной, термоустойчивой ДНК-полимеразы Pfx. Полученные ПЦР-продукты были клонированы в векторе pGMT-easy с использованием набора Fast Ligation Kit, Fermentas и секвенированы ферментативным методом по Сенгеру.
Результаты секвенирования были использованы для получения гуманизированного моноклонального антитела.
Гуманизацию антитела проводили методом переноса выявленных (вычисленных с использованием компьютерных алгоритмов на полученных нуклеотидных последовательностях) гипервариабельных участков (CDR) вариабельного фрагмента мышиных антител, отвечающих за комплементарность антигену, на вариабельный фрагмент человека, помещали CDR между соответствующими каркасными участками, по результатам анализа баз данных и биоинформатического моделирования структурного сходства (аналогии) между антителами. Полученное гуманизированное антитело обладает специфичностью материнского мышиного антитела, но повышенной аффинностью за счет более подходящего пространственного расположения CDR, обусловленного каркасными участками.
Для молекулярной графики использовали программы: Insight II; Accelrys, СА. Моделирование конформационной гомологии между донорным мышиным антителом и человеческим акцепторным антителом проводили с использованием WAM (http://antibody.bath.ac.uk), SWISS-MODEL (http://www.expasy.org), INSIGHT-HOMOLOGY (Accelrys), COMPOSER (Tripos, МО) и GCG Wisconsin Package. Последовательности вариабельных фрагментов мышиных антител были аннотированы и пронумерованы с использованием баз данных Kabat и Chothia.
Информация о структуре вариабельных фрагментов учитывается в нумерации, разработанной Chothia [21], однако в данной нумерации не рассматриваются остатки аминокислот в вариабельных фрагментах антител. В соответствии с указанными выше данными для нумерации и аннотирования вариабельных фрагментов использовался модифицированный Kabat и Chothia алгоритм Abhinandan KR и Martin АС [22, 23]. При нумерации при этом учитывались не только исправленные данные множественных выравниваний последовательностей антител по Kabat и данные о структуре CDR по Chothia с учетом структуры FR, но и данные о VH/VL углах складывания в донорных и акцепторных антителах. Для автоматического аннотирования использовались программы с интерактивным web-интерфейсом: SeqTest (AbCheck) http://www.bioinf.org.uk/abs/seqtest.html, Abnum http://www.bioinf.org.uk/abs/abnum/, ручная корректировка и проверка проводились с использованием локальной версии базы данных Kabat http://www.kabatdatabase.com/index.html и программы KabatMan http://www.bioinf.org.uk/abs/simkab.html, средств IMGT http://imgt.cines.fr/ и данных множественного выравнивания последовательностей вариабельных фрагментов антител с использованием MUSCULE http://www.ebi.ac.uk/Tools/muscle/index.html и пакета программ FASTA http://fasta.bioch.virginia.edu/fasta_www2/fasta_http://down.shtml, структуры которых представлены в PDB на 2012 год, а также разработанных авторами изобретения нескольких Perl скриптов для автоматизации анализа данных. VH/VL углы складывания были рассчитаны и предсказаны исходя из алгоритма, предложенного Abhinandan [22]. Все необходимые расчеты, связанные с моделированием структуры белковых молекул, проводили с использованием Modeller и Swiss-Model.
Следующим шагом в гуманизации антител был выбор акцепторных вариабельных фрагментов антител человека для переноса. Правильный выбор акцепторного антитела человека практически на 100% гарантирует успешную гуманизацию антител, с Kd, достаточной для высокопрочного связывания с антигеном. С использованием методов молекулярного моделирования и описанных выше подходов была построена структурная модель вариабельного фрагмента мышиного моноклонального антитела против синдекана-1. С использованием полученных трехмерных моделей были определены наиболее гомологичные (особенно по ключевым позициям) последовательности акцепторных антител человека, при этом использовались только антитела со значением коэффициента «человечности» Н>1 (что потенциально может уменьшить НАНА ответ). На основании полученной модели рассчитали аминокислотные и, соответственно, нуклеотидные последовательности вариабельных фрагментов тяжелой и легкой (каппа) цепей антитела.
1.5. Получение гуманизированных моноклональных антител к синдекану-1
Для получения искомых свойств антител в константный фрагмент тяжелой цепи вводили участки IgG3, который обладает самой высокой степенью активации системы комплемента из всех изотипов, а также высокой аффинностью по отношению к связыванию с Fc рецептором фагоцитирующих клеток, в структуру константного фрагмента IgG4, что сообщило антителу способность индукции антитело-зависимой и комплемент-зависимой цитотоксичности. Также ввели аминокислотные замены 1M252Y, S254T, Т256Е, Н433К, N434F в область С-конца константного фрагмента IgG4 - для увеличения периода полужизни антитела.
Соединили последовательности вычисленных вариабельного и константного фрагментов тяжелой цепи в одну аминокислотную последовательность, добавив на N-конце сигнальную секреторную последовательность (SEQ ID NO:1). Соединили последовательности вычисленных вариабельного и константного фрагментов легкой каппа цепи в одну аминокислотную последовательность, добавив на N-конце сигнальную секреторную последовательность (SEQ ID NO:2).
Перевели аминокислотные последовательности белка в нуклеотидные, оптимизировав последние для увеличения продукции данного антитела в клетках млекопитающих (СНО) с помощью программы на сайте http://www.encorbio.com/protocols/Codon.htm.
В результате был получен окончательный вариант нуклеотидных последовательностей (SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4), кодирующих гуманизированное моноклонального антитело к синдекану-1 (SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2), и синтезировали их с использованием химического синтеза. Синтезированные фрагменты клонировали в плазмидный вектор pUC57 для наработки, затем переклонировали в вектор pcDNA3.1+ для трансфекции клеток млекопитающих.
Трансфекцию клеток млекопитающих созданными плазмидами проводили методом кальций-фосфатного осаждения.
Для проведения трансформации клеток млекопитающих (СНО) плазмидными ДНК клетки высевали в 12-луночные планшеты (Costar, США) с плотностью посева 5×104 кл/см2. На следующий день для синхронизации клеточных делений культуральную среду заменяли. Через три часа к клеткам добавляли плазмидную ДНК, осажденную фосфатом кальция. Для приготовления осадка 250 мкл раствора, содержащего 50 мкг ДНК в 250 мМ CaCl2, медленно смешивали с 250 мкл раствора (1,64% NaCl, 1,13% HEPES рН 7,12 и 0,04% Na2HPO4). После 24 часов инкубации при 37°С в атмосфере 5% СО2 среду заменяли на аналогичную, но содержащую 2 антибиотика: 80 мкг/мл зеоцин и 2 мкг/мл бластицидин S для селекции клонов, содержащих обе трансформированные плазмиды и, следовательно, экспрессирующих полноразмерные гуманизированные антитела, селекцию проводили в течение 20 суток, в лунках, содержащих живые клетки, меняли среду (при этом предыдущую культуральную среду не выливали, а использовали для определения количества секретируемых антител методом ИФА), а еще через сутки клетки снимали с подложки и проводили анализ на экспрессию трансформированных генов. Анализ эффективности трансфекции проводили на проточном цитофлуориметре EPICS XL Beckman Coulter (Beckman Coulter, США).
Уровень гуманизированных антител в культуральной среде полученных стабильных трансфектом линии СНО оценивали с использованием стандартного твердофазного ИФА.
В результате 6 клонирований были получены стабильные трансфектомы СНО, которые накапливали для криоконсервирования и наработки опытной партии антител. Продуктивность созданных трансфектом СНО, экспрессирующих антитела к синдекану-1, составила 500 мкг/107 клеток/день.
1.6. Культивирование клеток-продуцентов гуманизированного моноклонального антитела к синдекану-1
Культивирование клеток-продуцентов осуществляли с использованием биореакторов BIOSTAT® Bplus и автоклавированной среды IMDM с добавлением 45 г DFBS (0,5%) и 25,8 г (100 мМ) сульфата цинка семиводного (ZnSO4 x 7H2O) на 9 л среды. Задавали рабочий режим: температура 37ºC, pH 6,9-7,2, концентрация кислорода 50% насыщения воздуха. После достижения заданного режима производили засев биореактора, для чего в асептичных условиях в него вводили посевной материал. Время культивирования составляло 3 суток.
По окончании культивирования культуральную жидкость фильтровали через стерильную капсулу «Sartopure» («Sartorius», Германия), с диаметром пор 1,2 мкм, со скоростью 1 л/мин. Затем осветленную жидкость концентрировали на системе Viva Flow 200 («Sartorius», Германия) с использованием фильтра на 50 кДа. Концентрирование проводили до достижения общего объема - 200 мл.
1.7. Очистка полученного гуманизированного моноклонального антитела к синдекану-1
Хроматографическую очистку проводили в два этапа с использованием стерильных растворов. На первом этапе использовали систему BioLogic DuoFlow Pathfinder (Bio-Rad) с автоматическим коллектором фракций BioFrac и полупрепаративную хроматографическую колонку YMC TriArt, 250х4,6 мм, сорбент С18. Перед началом работы колонку уравновешивали с помощью 200 мл буфера (1 кг воды для инъекций и 1 г кислоты трифторуксусной) в ручном режиме через насос хроматографа на скорости 2 мл/мин.
Подготовленный материал в объеме 200 мл вносили в хроматограф через насос хроматографа на скорости 0,5 мл/мин. Элюцию производили буфером (2 кг ацетонитрила, 2 г кислоты трифторуксусной) со скоростью 0,5 мл в минуту. Собирали фракцию в максимуме поглощения при 260 нм. Объем фракции составил примерно 500 мл.
Второй этап очистки выполняли с использованием гель-хроматографической колонки BioSil SEC 125-5, 300x7,8 мм. Предварительно колонку уравновешивали 0,02 М PBS-буфером. Полученный материал вносили в хроматограф через насос хроматографа на скорости 0,5 мл/мин. Элюцию производили буфером (0,6 М раствор NaCl) с градиентом концентрации от 0,1 до 0,6 М. Собирали фракцию, имеющую поглощение при А280 нм не менее 3.4 оптических единиц. Фракцию собирали во флаконы. Объем получаемого раствора составил примерно 1 л с концентрацией антитела 2 мг на 1 мл.
Было проведено измерение Kd полученного антитела, изучено его влияние на модельные клеточные линии (антипролиферативная активность) и ксенографтные опухолевые модели (ингибирование развития опухоли). Оказалось, что созданное антитело обладает достаточно большой аффинностью (Kd =8,0*10-9).
Пример 2. Изучение противоопухолевого эффекта гуманизированного моноклонального антитела к синдекану-1 на модели миеломы Sp2.0
В качестве модели использовали клеточную линию миеломы SP2.0, сингенную с мышами BALB/C, предварительно показав в ней экспрессию гена, кодирующего синдекан-1 (Фиг.1). Для этого из культуры клеток была выделена РНК и проведен синтез и анализ кДНК.
Мышам линии BALB/c NUDE прививались клетки опухоли SP2.0: подкожно в нижнюю часть спины было введено 500 000 клеток опухоли SP2.0 на одно животное. Использовалось 3 группы животных: 2 опытные и 1 контрольная.
После животным вводили моноклональное антитело 1 раз в неделю в течение 5 недель в дозе 1 мг и 0,1 мг начиная с 6 дня после введения опухолевых клеток, когда размер опухоли составил >200+/-23 мм3. Размер опухоли (шарообразной формы) определяли дважды в неделю в течение 36 дней с использованием штангенциркуля по формуле: V(опухоли)=π/6*длина*ширина2, где длина>ширина.
Получили следующие результаты: при введении гуманизированного моноклонального антитела к синдекану-1 мышам с привитыми клетками миеломы Sp2.0 происходит достоверное подавление роста опухоли (Фиг.2). Использование препарата моноклонального антитела к синдекану-1 позволило снизить объем опухоли на 50% на 5 неделю эксперимента.
Пример 3. Изучение противоопухолевого эффекта гуманизированного моноклонального антитела к синдекану-1 на примере изучения цитотоксичности на клетках человека линии А431
Изучали противоопухолевый эффект гуманизированного моноклонального антитела к синдекану-1. Мышам линии BALB/c NUDE подкожно в области бока было введено 107 (300 мкл) человеческих клеток линии А431. После животным было введено моноклональное антитело в дозе 50 мг/кг веса и контрольное моноклональное антитело против овальбумина в дозе 50 мг/кг веса.
Моноклональное антитело вводилось дважды в неделю внутрибрюшинно в объеме 200 мкл начиная с 6 дня после введения опухолевых клеток, когда размер опухоли составил >250+/-23 мм3. Размер опухоли (шарообразной формы) определяли дважды в неделю в течение 36 дней с использованием штангенциркуля по формуле: V(опухоли)=π/6*длина*ширина2, где длина>ширина. Также оценивалась выживаемость животных, составляющая процент выживших животных относительно изначального размера группы на данную временную точку.
Получили следующие показатели: активация моноклональным антителом комплемент-зависимого цитолиза клеток линии А431 происходит в концентрации 0,3 мкг/мл, что является хорошим показателем, а максимальная антипролиферативная активность на клетках линии А431 осуществляется в концентрации 0,2 мкг/мл.
Литература
1. World Health Statistics 2012, http://www.who.int/healthinfo/EN_WHS2012_Full.pdf.
2. Жуков Н.В., Тюляндин С.А. Целевая терапия в лечении солидных опухолей; практика противоречит теории / Биохимия 2008, Т.73, вып.5, с751-768.
3. Gattei V, Godeas С, Degan M, Rossi FM, Aldinucci D, Pinto A. Characterization of anti-CD138 monoclonal antibodies as tools for investigating the molecular polymorphism of syndecan-1 in human lymphoma cells. Br J Haematol. 1999 Jan;104(l):152-62.
4. Wijdenes J, Dore JM, Clement C, Vermot-Desroches С (2003). "CD138". J. Biol. Regul. Homeost. Agents 16 (2): 152-5.
5. W. Wu 2007.
6. Rousseau et al. EJNMMI Research 2011.
7. Bayer-Garner I.B., Sanderson R.D., Dhodapkar M.V. et al. Syndecan-1 (CD138) immunoreactivity in bone marrow biopsies of multiple myeloma: shed syndecan-1 accumulates in fibrotic regions. Mod Pathol 2001;14:1052-8.
8. Байков B.B.. ТРУДНОСТИ МОРФОЛОГИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКИ МНОЖЕСТВЕННОЙ МИЕЛОМЫ. Москва, ОНКОГЕМАТОЛОГИЯ 2'2007, стр.10-15
9. Wu YH, Yang С Y, Chien WL, Lin KI, Lai MZ. Removal of syndecan-1 promotes TRAIL-induced apoptosis in myeloma cells. J Immunol. 2012 Mar 15;188(6):2914-21. Epub 2012 Feb 3.
10. Wu W. с соавторами в 2010.
11. Bae J, Tai YT, Anderson КС, Munshi NC. 2011.
12. Clinical Trials. gov identifier: NCT01296204.
13. Wijdenes J., Vooijs W.C., Clement C. et al. A plasmacyte selective monoclonal antibody (B-B4) recognizes syndecan-1. Br J Haematol 1996; 94:318-23.
14. Ковригина A.M., Пробатова Н.А. ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНАЯ ДИАГНОСТИКА НЕХОДЖКИНСКИХ В-КЛЕТОЧНЫХ ЛИМФОМ. Москва, ОНКОГЕМАТОЛОГИЯ 2'2007, стр.6.
15. WO 2009080829 (A1) - AGENTS TARGETING CD138 AND USES THEREOF (23.12.2008).
16. WO 2009080832 (A1) - METHODS AND AGENTS FOR IMPROVING TARGETING OF CD138 EXPRESSING TUMOR CELLS (23.12.2008).
17. WO 2009080830 (A1) - IMMUNOCONJUGATES TARGETING CD138 AND USES THEREOF (23.12.2008).
18. WO 2010128087 (A2) - USES OF IMMUNOCONJUGATES TARGETING CD138 (5.05.2010).
19. Sato Ν, Kinbara M, Kuroishi Τ, Kimura К, Iwakura Y, Ohtsu H, Sugawara S, Endo Y Clin. Lipopolysaccharide promotes and augments metal allergies in mice, dependent on innate immunity and histidine decarboxylase. Exp Allergy: 2007, May; 37(5): 743-751.
20. Young L, Dong Q., Two step total gene synthesis method. Nucleic Acid Research: 32, e59, 2004.
21. Chothia C, Lesk AM. Canonical structures for the hypervariable regions of immunoglobulins. J Mol Biol. 1987 Aug 20; 196(4): 901-17.
22. Abhinandan К R and Martin A C. Analysis and Prediction of VH/VL Packing in Antibodies, Protein Engineering Design and Selection. 2010.
23. Abhinandan KR, Martin AC. Analysis and improvements to Kabat and structurally correct numbering of antibody variable domains. Mol Immunol. 2008 Aug; 45(14): 3832-9.
24. Jason et al. 2009.
25. Points to Consider in the Manufacture and Testing of Monoclonal Antibody Products for Human Use, FDA, 1997, Guidance for Industry for the Submission of Chemistry, Manufacturing and Controls Information for a Therapeutic Recombinant DNA-derived Product or a Monoclonal Antibody Product for In Vivo Use, CBER/CDER, FDA, August, 1996, International Conference on Harmonisation; Final Guideline on Stability Testing of Biotechnological/Biological Products, July 10, 1996.
26. Orecchia P, Conte R, Balza E, Petretto A, Mauri P, Mingari MC, Carnemolla B. A novel human anti-syndecan-1 antibody inhibits vascular maturation and tumour growth in melanoma. Eur J Cancer. 2013 May; 49(8):2022-33. doi: 10.1016/j.ejca.2012.12.019. Epub 2013 Jan 24.
Claims (2)
1. Моноклональное антитело изотипа IgG4, специфичное к синдекану-1 (CD138), представленное двумя тяжелыми и двумя легкими цепями, каждая из которых содержит вариабельный фрагмент и константный фрагмент, для терапии опухолевых заболеваний, отличающееся тем, что содержит участки IgG3 в константном фрагменте, вариабельный фрагмент представлен мышиными, гипервариабельными, участками и человеческими, каркасными, участками, константный фрагмент полностью человеческий и содержит аминокислотные замены на С-конце для увеличения времени полужизни, каждая цепь дополнительно содержит сигнальную секреторную последовательность на N-конце, отщепляющуюся при секреции из клеток-продуцентов, тяжелая цепь представлена аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:1, закодированной нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO:3, легкая цепь - каппа и представлена аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:2, закодированной нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO:4, причем нуклеотидные последовательности кодонно оптимизированы для экспрессии в клетках млекопитающих, антитело используют в качестве самостоятельного действующего вещества.
2. Антитело по п. 1, отличающееся тем, что обладает самостоятельной антитело-зависимой и комплемент-зависимой цитотоксичностью.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2013139743/10A RU2551235C2 (ru) | 2013-08-26 | 2013-08-26 | Гуманизированное моноклональное антитело, специфичное к синдекану-1 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2013139743/10A RU2551235C2 (ru) | 2013-08-26 | 2013-08-26 | Гуманизированное моноклональное антитело, специфичное к синдекану-1 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2013139743A RU2013139743A (ru) | 2015-03-20 |
| RU2551235C2 true RU2551235C2 (ru) | 2015-05-20 |
Family
ID=53285327
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2013139743/10A RU2551235C2 (ru) | 2013-08-26 | 2013-08-26 | Гуманизированное моноклональное антитело, специфичное к синдекану-1 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2551235C2 (ru) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2647771C2 (ru) * | 2016-04-26 | 2018-03-19 | Общество с ограниченной ответственностью "Орексал" (ООО "Орексал") | Способ получения рекомбинантного орексина а человека, плазмидная днк, штамм-продуцент |
| JP2018530993A (ja) * | 2015-07-20 | 2018-10-25 | ウラジーミロヴィチ ドゥホフリノフ，イリヤー | シンデカン−１に特異的なヒト化モノクローナル抗体 |
| RU2746314C2 (ru) * | 2016-06-09 | 2021-04-12 | Пеликан Терапьютикс, Инк. | Антитела анти-tnfrsf25 |
| RU2757813C2 (ru) * | 2016-06-23 | 2021-10-21 | Цзянсу Хэнжуй Медицин Ко., Лтд. | Антитело против lag-3, его антигенсвязывающий фрагмент и их фармацевтическое применение |
-
2013
- 2013-08-26 RU RU2013139743/10A patent/RU2551235C2/ru active
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| ORECCHIA P. et al. "A novel human anti-syndecan-1 antibody inhibits vascular maturation and tumour growth in melanoma." European Journal of Cancer (январь 2013); 49: 2022-2033. GATTEI V et al., "Characterization of anti-CD138 monoclonal antibodies as tools for investigating the molecular polymorphism of syndecan-1 in human lymphoma cells." Br J Haematol. (1999); 104:152-62. * |
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2018530993A (ja) * | 2015-07-20 | 2018-10-25 | ウラジーミロヴィチ ドゥホフリノフ，イリヤー | シンデカン−１に特異的なヒト化モノクローナル抗体 |
| EP3325511A4 (en) * | 2015-07-20 | 2019-04-10 | Dukhovlinov, Ilya Vladimirovich | HUMANIZED MONOCLONAL SPECIFIC ANTIBODIES AGAINST SYNDECAN-1 |
| RU2647771C2 (ru) * | 2016-04-26 | 2018-03-19 | Общество с ограниченной ответственностью "Орексал" (ООО "Орексал") | Способ получения рекомбинантного орексина а человека, плазмидная днк, штамм-продуцент |
| RU2746314C2 (ru) * | 2016-06-09 | 2021-04-12 | Пеликан Терапьютикс, Инк. | Антитела анти-tnfrsf25 |
| RU2757813C2 (ru) * | 2016-06-23 | 2021-10-21 | Цзянсу Хэнжуй Медицин Ко., Лтд. | Антитело против lag-3, его антигенсвязывающий фрагмент и их фармацевтическое применение |
| US11155617B2 (en) | 2016-06-23 | 2021-10-26 | Jiangsu Hengrui Medicine Co., Ltd. | LAG-3 antibody, antigen-binding fragment thereof, and pharmaceutical application thereof |
| US11981733B2 (en) | 2016-06-23 | 2024-05-14 | Jiangsu Hengrui Medicine Co., Ltd. | LAG-3 antibody, antigen-binding fragment thereof, and pharmaceutical application thereof |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2013139743A (ru) | 2015-03-20 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US12447208B2 (en) | Anti-CTLA4 monoclonal antibody or its antigen binding fragments, pharmaceutical compositions and uses | |
| RU2611685C2 (ru) | Гуманизированное моноклональное антитело, специфичное к синдекану-1 | |
| CN108779179B (zh) | Cd47抗体、其抗原结合片段及其医药用途 | |
| US20230250168A1 (en) | Anti-human claudin 18.2 antibody and application thereof | |
| JP2022509930A (ja) | 抗ｃｄ７３抗体、その抗原結合フラグメントおよびそれらの使用 | |
| JP2018530993A6 (ja) | シンデカン−１に特異的なヒト化モノクローナル抗体 | |
| JP2018529351A (ja) | ヒトｃｄ４０に特異的に結合するアンタゴニスト抗体及び使用方法 | |
| WO2019091449A1 (zh) | Cd96抗体、其抗原结合片段及医药用途 | |
| US20240174760A1 (en) | Nanobody targeting bcma and application thereof | |
| JP7495409B2 (ja) | 改善された抗ｆｌｔ３抗原結合タンパク質 | |
| CA3125120A1 (en) | Antibody fusion protein, preparation method therefor and application thereof | |
| CA3022308A1 (en) | Humanized anti-basigin antibodies and the use thereof | |
| US20230203167A1 (en) | Anti-pd-l1 and pd-l2 antibody and derivatives and use thereof | |
| RU2551235C2 (ru) | Гуманизированное моноклональное антитело, специфичное к синдекану-1 | |
| WO2023143535A1 (zh) | 一种靶向il-18bp的抗体及其应用 | |
| JP6410711B2 (ja) | 繋留軽鎖を有する結合タンパク質 | |
| JP2025015580A (ja) | 免疫ｐｅｔ撮像のための放射標識されたｍｅｔ結合タンパク質 | |
| CN109879966B (zh) | 基于鼠源cd19抗体的人源化设计及表达验证 | |
| JP7466930B2 (ja) | 抗ｃｄ１３７抗体およびその使用 | |
| RU2768737C1 (ru) | Гуманизированное антитело 6h8hu, связывающееся с опухолевым антигеном prame, фрагменты днк, кодирующие указанное антитело и антигенсвязывающий фрагмент антитела | |
| RU2761876C1 (ru) | Гуманизированное антитело 5d3hu, связывающееся с опухолевым антигеном prame, фрагменты днк, кодирующие указанное антитело и антигенсвязывающий фрагмент антитела | |
| TW202542202A (zh) | 抗體、抗原結合片段及其醫療用途 | |
| JP2025531360A (ja) | 分離した抗原結合タンパク質及びその使用 | |
| CN121159699A (zh) | 抗Trop2/CD3的双特异性抗体及其应用 | |
| HK1232893B (en) | Anti-ctla4 monoclonal antibody or antigen binding fragment thereof, medicinal composition and use |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| HE4A | Notice of change of address of a patent owner |
Effective date: 20180905 |
|
| PD4A | Correction of name of patent owner | ||
| PC41 | Official registration of the transfer of exclusive right |
Effective date: 20200127 |